CN107110862A - 结核分枝杆菌蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis)蛋白及其免疫活性片段(肽或模拟表位肽)。具体地，本发明涉及一组结核分枝杆菌蛋白及其肽，其具有高度抗原性并且是结核分枝杆菌临床菌株特有的。因此，本发明进一步涉及这些结核分枝杆菌蛋白或肽在诊断、治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染中的用途。

Description

结核分枝杆菌蛋白
技术领域
本发明涉及结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis)蛋白及其免疫活性片段(肽或模拟表位肽)。具体地，本发明涉及一组结核分枝杆菌蛋白及其肽，其具有高度抗原性并且是结核分枝杆菌临床菌株特有的。因此，本发明进一步涉及这些结核分枝杆菌蛋白或肽在诊断、治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染中的用途。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis)复合体的成员引起的普遍传染病。大多数结核分枝杆菌复合体感染是无症状或潜伏的。然而，约十分之一的潜伏性感染最终会发展为活动性疾病(通常为肺结核)，如果不进行治疗，其对超过50％个体是致命的。
结核分枝杆菌复合体感染的有效实验室诊断是控制结核病传播的一个关键方面。此外，快速和可靠的诊断能够允许及时实施正确治疗方案。
传统上，已经通过使用显微镜检查(使用酸快杆菌(AFB)染色)或微生物培养在体液中展示分枝杆菌来诊断结核分枝杆菌复合体感染。然而，样本必须含有高浓度的分枝杆菌(即5至10000/ml)，以便得到可靠的显微镜检查，且基于培养的诊断是缓慢的。
诊断结核分枝杆菌复合体感染的新方法涉及检测与感染相关的免疫应答。与其他分枝杆菌一样，结核分枝杆菌刺激CD4+和CD8+T细胞以及其他免疫细胞，以引发强烈的1型促炎样反应，包括分泌细胞因子如干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子TNF)-α。IFN-γ释放测定(IGRAs)可用于检测这种迟发型超敏反应(DTH)应答。IGRAS所基于的原则为：致敏(感染)个体的T细胞在再次遇到结核分枝杆菌抗原时产生IFN-γ。用于结核分枝杆菌的市售IGRAs包括原始的QuantiFERON-TB及其增强型QuantiFERON-TB Gold和QuantiFERON-TB GoldIn-Tube测定(Cellestis International，Carnegie，Australia)，酶联免疫斑点(ELISPOT)T SPOT-TB测定(Oxford Immunotec，Oxford，United Kingdom)和各种兽医专业设备(Prionics，Schlieren-Zurich，Switzerland)。
这些IGRAs的显著优点是它们对结核分枝杆菌复合体感染的特异性较高。这是它们通过使用在差异区(RD)1编码的特异性结核分枝杆菌抗原实现的，所述差异区是在卡介苗(BCG)疫苗和大多数环境分枝杆菌中不存在的基因组片段。IGRAs中使用的RD1抗原包括ESAT6和CFP10。尽管基于对这些抗原的免疫应答的诊断是有效的，但是仍然需要开发用于诊断测试的新的替代抗原。例如，重要的是，用于诊断测试中的抗原不同于在疫苗中使用的抗原，以避免在接种的受试者中获得假阳性结果。特别是ESAT6，其具有被包含在结核分枝杆菌疫苗中的潜力。当然，也可将有效的新抗原用于疫苗中，以预防或治疗结核分枝杆菌复合体感染。
发明内容
本发明人令人惊讶地鉴定了在结核分枝杆菌的诊断测试中特别有用的许多结核分枝杆菌抗原及其片段。所鉴定的抗原含有分别与人白细胞抗原(HLA)分子或抗体有效结合的许多T细胞和/或B细胞表位。因此，所述抗原和片段可用于检测抗结核分枝杆菌免疫应答，从而确定个体中是否存在结核分枝杆菌复合群感染。抗原和片段还能够在个体中诱导免疫应答，因此可以用于预防性或治疗性疫苗接种。
因此，本发明提供了诊断受试者中结核分枝杆菌复合体感染的方法，包括体外检测对以下一个或多个选项的免疫应答：(a)Rv0840c(SEQ ID NO：6)或其一种或多种片段；(b)TBFG_13463(SEQ ID NO：1)或其一种或多种片段；(c)Rv1677(SEQ ID NO：7)或其一种或多种片段；(d)Rv2654c(SEQ ID NO：3)或其一种或多种片段；(e)Rv3845(SEQ ID NO：4)或其一种或多种片段；(f)Rv1495(SEQ ID NO：5)或其一种或多种片段；和(g)Mtub2_17866(SEQID NO：2)或其一种或多种片段。
本发明还提供：
-用于诊断受试者中结核分枝杆菌复合体感染的试剂盒，其包含一种或多种本发明所述的片段；
-包含如上定义的(a)至(g)中的一种或多种的组合物，用于在受试者中治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染；和
-在受试者中治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染的方法，包括用如上定义的(a)至(g)中的一种或多种向受试者给药。
附图说明
图1显示了各组血清(对照，LTBI，活动性TB和治愈TB)对本发明蛋白质的选定B细胞表位池的反应性。
图2A显示了在T-SPOT测定中的A组，B组和A组/B组max的比较，其中n＝183(87个TB阳性，96个健康供体)。
图2B显示了通过ROC分析计算的T-SPOT.TB测定中A组/B组max的灵敏度和特异性，其中n＝183(87个TB阳性，96个健康供体)
图3显示了T-SPOT测定中CD4/CD8表位池和相应肽文库的比较。A-Rv1495，B-TBFG_13463，C-Rv3845(87个TB阳性供体)。
图4显示了T-SPOT.TB测定中的肽文库性能。A-Mtub2_17866，B-Rv2654c，C-Rv1677，D-Rv0840c.(87个TB阳性供体)。
图5显示了TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677CD4/CD8表位池max和TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677肽文库max的比较(n＝183；TB Pos＝87)。
图6显示了使用包含所有CD4/CD8表位池(TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677)的组合表位池的T-SPOT.TB测定的ROC曲线。
图7显示了用Rv0840c肽文库替换ESAT-6(n＝183；87个TB阳性)。
图8显示用Rv0840c肽文库替换CPF10(n＝183；87个TB阳性)。
图9显示了将Rv0840c加入A组和B组中的T-SPOT.TB测定。更具体地，图8显示了A组/B组max和A组/B组/Rv0840c肽文库max的ROC曲线的比较。
序列表说明
SEQ ID NO：1是TBFG_13463的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是Mtub2_17866的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是Rv2654c的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是Rv3845的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是Rv1495的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是Rv0840c的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是Rv1677的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8至10是衍生自TBFG_13463的HLA II类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11和12是衍生自Mtub2_17866的HLA II类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13至19是衍生自Rv0840c的HLA II类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20至24是衍生自Rv3845的HLA II类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25至27是衍生自Rv2654c的HLA II类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28至33是衍生自Rv1677的HLA II类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34至40是衍生自Rv1495的HLA II类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41至48是衍生自TBFG_13463的HLAI类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49至52是衍生自Mtub2_17866的HLA I类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53至58是来自Rv2654c的HLA I类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：59至64是衍生自Rv3845的HLA I类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：65至69是衍生自Rv1495的HLA I类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：70至87是衍生自Rv0840c的HLA I类表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：88至100是来自TBFG_13463的B细胞表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：101至103是来自Mtub2_17866的B细胞表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：104是来自Rv2654c的B细胞表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：105至112是来自Rv3845的B细胞表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：113至120是来自Rv1495的B细胞表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：121至136是来自Rv0840c的B细胞表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：137至141是来自Rv1677的B细胞表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO：142至145是来源于TBFG_13463的又一T细胞表位。
SEQ ID NO：146是衍生自Mtub2_17866的又一T细胞表位。
SEQ ID NO：147和148是来自Rv2654c的又一T细胞表位。
SEQ ID NO：149至152是来自Rv3845的又一T细胞表位。
SEQ ID NO：153是衍生自Rv1495的又一T细胞表位。
SEQ ID NO：154至157是来自Rv0840c的又一T细胞表位。
具体实施方式
应当理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需要来定制。还应当理解，本申请使用的术语仅是为了描述本发明的具体实施例的目的，而不是出于限制性的目的。
此外，除非内容另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一”，“一个”和“该”均包括复数指代对象。因此，例如，提及“一个片段”时包括复数个“片段”，提及“一个细胞”时包括两个或更多个这样的细胞，提及“一个受试者”时包括两个或更多个这样的受试者等。
本申请在上文或下文中引用的所有出版物、专利和专利申请，均通过引用方式整体并入本申请。
发明方法
本发明人已经鉴定了能够触发对结核分枝杆菌的免疫应答的结核分枝杆菌抗原及其片段。因此，这些抗原可用于诊断受试者中结核分枝杆菌复合体感染的方法。所述抗原还可以用于治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染(M.tuberculosis复合体感染)，例如通过疫苗接种。结核分枝杆菌复合体包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，包括卡介苗)，田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)，卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canettii)，山羊分枝杆菌(Mycobacterium caprae)，海豹分枝杆菌(Mycobacterium pinnipedii)，分枝杆菌Mycobacterium suricattae和分枝杆菌Mycobacterium mungi中的一种或多种。结核分枝杆菌复合体优选包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
本发明提供了用于诊断受试者中的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合体感染的方法，包括体外检测对以下一个或多个选项的免疫应答：(a)Rv0840c(SEQIDNO：6)或其一种或多种片段；(b)TBFG_13463(SEQIDNO：1)或其一种或多种片段；(c)Rv1677(SEQIDNO：7)或其一种或多种片段；(d)Rv2654c(SEQIDNO：3)(e)Rv3845(SEQIDNO：4)或其一种或多种片段；(f)Rv1495(SEQIDNO：5)或其一种或多种片段；和(g)Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)或其一种或多种片段。例如，所述方法可以包括体外检测对(a)至(g)中的至少1种，至少2种，至少3种，至少4种，至少5种或至少6种的免疫应答。
在上述(a)至(g)的定义中，可以体外检测对(a)至(g)中的一种或多种的任何组合的免疫应答。例如，对于(a)至(g)的每个定义，可以在体外检测如下各项的免疫应答：(a)；(b)；(c)；(d)；(e)；(f)；(g)；(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)和(f)；(a)和(g)；(b)和(c)；(b)和(d)；(b)和(e)；(b)和(f)；(b)和(g)；(c)和(d)；(c)和(e)；(c)和(f)；(c)和(g)；(d)和(e)；(d)和(f)；(d)和(g)；(e)和(f)；(e)和(g)；(f)和(g)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(b)和(e)；(a)、(b)和(f)；(a)、(b)和(g)；(a、)、(c)和(d)；(a)、(c)和(e)；(a)、(c)和(f)；(a)、(c)和(g)；(a)、(d)和(e)；(a)、(d)和(f)；(a)、(d)和(g)；(a)、(e)和(f)；(a)、(e)和(g)；(a)、(f)和(g)；(b)、(c)和(d)；(b)、(c)和(e)；(b)、(c)和(f)；(b)、(c)和(g)；(b)、(d)和(e)；(b)、(d)和(f)；(b)、(d)和(g)；(b)、(e)和(f)；(b)、(e)和(g)；(b)、(f)和(g)；(c)、(d)和(e)；(c)、(d)和(f)；(c)、(d)和(g)；(c)、(e)和(f)；(c)、(e)和(g)；(c)、(f)和(g)；(d)、(e)和(f)；(d)、(e)和(g)；(d)、(f)和(g)；(e)、(f)和(g)；(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(c)和(f)；(a)、(b)、(c)和(g)；(a)、(b)、(d)和(e)；(a)、(b)、(d)和(f)；(a)、(b)、(d)和(g)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(f)和(g)；(a)、(c)、(d)和(e)；(a)、(c)、(d)和(f)；(a)、(c)、(d)和(g)；(a)、(c)、(e)和(f)；(a)、(c)、(e)和(g)；(a)、(c)、(f)和(g)；(a)、(d)、(e)和(f)；(a)、(d)、(e)和(g)；(a)、(d)、(f)和(g)；(a)、(e)、(f)和(g)；(b)、(c)、(d)和(e)；(b)、(c)、(d)和(f)；(b)、(c)、(d)和(g)；(b)、(c)、(e)和(f)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(c)、(f)和(g)；(b)、(d)、(e)和(f)；(b)、(d)、(e)和(g)；(b)、(d)、(f)和(g)；(b)、(e)、(f)和(g)；(c)、(d)、(e)和(f)；(c)、(d)、(e)和(g)；(c)、(d)、(f)和(g)；(c)、(e)、(f)和(g)；(d)、(e)、(f)和(g)；(a)、(b)、(c)、(d)和(e)；(a)、(b)、(c)、(d)和(f)；(a)、(b)、(c)、(d)和(g)；(a)、(b)、(c)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)、(e)和(g)；(a)、(b)、(c)、(f)和(g)；(a)、(b)、(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(d)、(e)和(g)；(a)、(b)、(d)、(f)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)和(g)；(a)、(c)、(d)、(e)和(f)；(a)、(c)、(d)、(e)和(g)；(a)、(c)、(d)、(f)和g)；(a)、(c)、(e)、(f)和(g)；(a)、(d)、(e)、(f)和(g)；(b)、(c)、(d)、(e)和(f)；(b)、c)、(d)、(e)和(g)；(b)、(c)、(d)、(f)和(g)；(b)、(c)、(e)、(f)和(g)；(b)、(d)、(e)、(f)和(g)；(c)、(d)、(e)、(f)和g)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(g)；(a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(g)；(a)、(b)、(c)、(e)、(f)和(g)；(a)、(b)、(d)、(e)、(f)和(g)；(a)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)；(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)；或者(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)。可以从该列表中独立选择(a)至(g)的组合。
该方法优选包括体外检测对以下的免疫应答：(i)Rv0840c(SEQ ID NO：6)或其一种或多种片段；(ii)TBFG_13463(SEQ ID NO：1)或其一种或多种片段；(iii)Rv1677(SEQ IDNO：7)或其一种或多种片段；(iv)Rv3845(SEQ ID NO：4)或其一种或多种片段；和(v)Rv2654c(SEQ ID NO：3)或其一种或多种片段。在上述(i)至(v)的定义中，可以在体外检测对(i)至(iv)中的一种或多种的任何组合的免疫应答。例如，对于(i)至(iv)的每个定义，可以在体外检测对以下的免疫应答：(i)；(ii)；(iii)；(iv)；(v)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iv和(v)；(i)、(ii)和(iii)；(i)、(ii)和(iv)；(i)、(ii)和(v)；(i)、(iii)和(iv)；(i)、(iii)和(v)；(i)、(iv)和(v)；(ii)、(iii)和(iv)；(ii)、(iii)和(v)；(ii)、(iv)和(v)；(iii)、(iv)和(v)；(i)、(ii)、(iii)和(iv)；(i)、(ii)、(iii)和(v)；(i)、(ii)、(iv)和(v)；(i)、(iii)、(iv)和(v)；(ii)、(iii)、(iv)和(v)；or(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)。可以独立地从该列表中选择(i)至(v)的组合。
该方法可以包括体外检测对以下的免疫应答(i)Rv0840c(SEQ ID NO：6)或其一种或多种片段；(ii)TBFG_13463(SEQ ID NO：1)或其一种或多种片段；(iii)Rv1677(SEQ IDNO：7)或其一种或多种片段；和(iv)Rv2654c(SEQ ID NO：3)。
在一个方面，所述方法包括体外检测对Rv0840c(SEQ ID NO：6)或其一种或多种片段的免疫应答。
片段
Rv0840c(SEQ ID NO：6)、TBFG_13463(SEQ ID NO：1)、Rv1677(SEQ ID NO：7)、Rv2654c(SEQ IDNO：3)、Rv3845(SEQ IDNO：4)、Rv1495 SEQ ID NO：5)或Mtub2_17866(SEQID NO：2)的片段可以是包含五个或更多个氨基酸(通过在亲本序列的N端和/或C端截短而衍生)的序列。例如，该片段包含的氨基酸个数可以是约5或更多，约6或以上、约7或以上、约8或以上、约9或以上、约10或以上、约11或以上、约12或以上、约13或以上、约14或以上、约15或以上、约16或以上、约17或以上、约18或以上、约19或以上、约20或以上、约21或以上、约22或以上、约23或以上、约24或以上、约25或以上、约26或以上，或约27或以上。该片段的长度可以是约5个至约27个、约6个至约26个、约7个至约25个、约8个至约24个、约9个至约23个、约10个至约22个、约11个至约21个、约12个至约20个、约13个至约19个、约14个至约18个、约12个至约18个、约12个至约15个、约15个至约18个、约13个至约17个、约14个至约16个、约5个至约10个、约10个至约15个、约15个至约20个、约20个至约25，或约10个至约20个氨基酸。
该片段可以从母体蛋白质化学衍生，例如通过蛋白水解切割，或者可以在文义上从母体蛋白质衍生，例如通过利用母体蛋白质的氨基酸序列，并基于该序列进行片段合成。该片段可以使用本领域熟知的方法合成。
术语“片段”不仅包括含有通过肽(-CO-NH-)键连接的氨基酸残基的分子，而且包括肽键反转的分子。这样的逆反转模拟肽可以使用本领域已知的方法制备，例如如Meziereet al(1997)J.Immunol.159，3230-3237中所述。该方法涉及制备含有涉及主链变化而非侧链取向变化的伪肽。Meziere等人(1997)的文献显示，至少对于MHC II类和T辅助细胞应答，这些伪肽是有用的。含有NH-CO键而非CO-NH肽键的逆反转肽对蛋白水解的抗性高得多。
类似地，在使用了能在氨基酸残基碳原子之间保留间隔的适当衔接子部分时，特别优选地，如果衔接子部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同的平面性时，可以省去肽键。还应当理解，可以方便地封闭该片段的N端或C端，以便帮助降低对外切蛋白水解消化的易感性。例如，可以通过与羧酸反应来进行保护肽的N端氨基，并且可以通过与胺反应来保护肽的C端羧基。还可以在该片段的N端和/或C端添加一个或多个额外的氨基酸残基，例如用于增加片段的稳定性。其他修饰的示例包括糖基化和磷酸化。另一种可能的修饰是R或K的侧链胺上的氢可以被亚甲基(-NH2→-NH(Me)或-N(Me)2)取代。
Rv0840c(SEQ ID NO：6)、TBFG_13463(SEQIDNO：1)、Rv1677(SEQIDNO：7)、Rv2654c(SEQIDNO：3)、Rv3845(SEQIDNO：4)、Rv1495SEQIDNO：5)或Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)的片段也可以包括延长或缩短片段的体内半衰期的片段变体。能够延长本发明所述片段的半衰期的变体的示例包括片段的类肽类似物、片段的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合体。该片段还可以包含该片段的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽，大大减少了这种药剂在正常代谢过程中的任何不希望的分解，减少了需要给药的剂量及其给药频率。还可以使用亲本蛋白的D-氨基酸形式。
本发明提供的片段可以衍生自：由编码亲本蛋白链的初级转录物经选择性剪接产生的mRNA所编码的亲本蛋白剪接变体。该片段还可以衍生自母体蛋白的氨基酸突变体、糖基化变体和其他共价衍生物，其至少保留了母体蛋白的MHC结合性质或抗体结合性质。示例性衍生物包括本发明的片段通过取代方式、化学方式、酶促方式或其它合适方式用除天然氨基酸以外的部分共价修饰的分子。
该方法可以包括体外检测对选自以下各项的免疫应答：Rv0840c(SEQ ID NO：6)、TBFG_13463(SEQ ID NO：1)、Rv1677(SEQ ID NO：7)、Rv2654c(SEQ ID NO：3)、Rv3845(SEQID NO：4)、Rv1495(SEQ ID NO：5)或Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)。例如，所述方法可以包括对选自Rv0840c(SEQ ID NO：6)、TBFG_13463(SEQ ID NO：1)、Rv1677(SEQ ID NO：7)、Rv2654c(SEQ ID NO：3)、Rv3845(SEQ ID NO：4)、Rv1495(SEQ ID NO：5)或Mtub2_17866(SEQIDNO：2)中的2个或以上、2个或以上、4个或以上、5个或以上、6个或以上、7个或以上、8个或以上、9个或以上、10个或以上、11个或以上、12个或以上、13 or more 14个或以上、15个或以上、16个或以上、17个或以上、18个或以上、19个或以上、20个或以上、25个或以上或30个或以上的片段的免疫应答进行体外检测。如果该方法包括检测对衍生自特定蛋白质的两个或更多个片段的免疫应答，则衍生自该蛋白质的所有片段可以彼此相同。可选地，衍生自该蛋白的部分或所有片段可以各不相同。例如，如果该方法包括检测对源自Rv0840c(SEQ IDNO：6)的3个片段的免疫应答，则3个片段可以是(i)3个相同片段；(ii)2个相同片段和1个不同片段；或(iii)3个不同片段。
在一些方面，本发明的方法包括体外检测对一个或多个片段池的免疫应答。下文将详细描述片段池。
样本
使用获自受试者的样本对上述(a)至(g)中的一种或多种的免疫应答进行体外检测。样本可以是体液，例如血液、血浆、血清、痰或其它呼吸分泌物、唾液、尿液或脑脊液。样本优选是血液、血浆、血清或痰或其它呼吸分泌物。可选地，样本可以是组织样本，例如活检切片或抽吸物。例如，样本可以是淋巴结抽吸物，或从结核病变(例如肉芽肿)内部或周围采集的样本。在另一方面，样本可以来源于体液或组织样本，例如细胞裂解物。
受试者
本发明的方法可以用于在任何合适的受试者中诊断结核分枝杆菌复合体感染。受试者通常是人类受试者。可选地，受试者可以是生产出的另一种动物或哺乳动物，例如：商业上饲养的动物，例如马、牛、绵羊或猪；实验动物，例如小鼠或大鼠；宠物动物例如猫、狗、兔或豚鼠；或其他动物，例如鸟或灵长类动物。
免疫应答
体外检测的免疫应答可以是由(a)至(g)中的一种或多种触发的任何应答。免疫应答可以由任何类型的免疫细胞介导。例如，免疫应答可以由T细胞、B细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、先天淋巴细胞(ILC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞和/或胸腺细胞。免疫应答优选是T细胞应答。T细胞应答优选是细胞因子分泌，更优选是IFN-γ(IFNγ)分泌。T细胞应答可以是T细胞增殖。可选地，免疫应答可以是B细胞应答。B细胞应答可以是B细胞增殖或抗体产生或分泌。免疫应答优选产生针对如上所定义的(a)至(g)中的一种或多种的抗体。测量T细胞增殖、B细胞增殖、细胞因子分泌和抗体分泌或产生的方法是本领域熟知的。
免疫应答可以在体外发生。优选地，免疫应答是体外细胞介导的免疫(CMI)应答。如下文更详细描述地，CMI应答是不涉及抗体的免疫应答。相反，CMI应答可以涉及响应于抗原的吞噬细胞活化、细胞毒性T细胞活化、各种细胞因子产量的增加和/或各种细胞因子的释放。用于检测体外CMI应答的方法是本领域已知的，并且在下文更详细地描述。
可选地，免疫应答可以在体内发生。例如，可以在体内产生针对如上定义的(a)至(g)中的一种或多种的抗体，但是使用本发明的方法在体外检测。例如，可以在受试者体内产生抗体，并通过样本(例如血液样本)从受试者取得抗体。然后可以使样本(和抗体)与如上所定义的(a)至(g)中的一种或多种接触，以便检测抗体的存在和/或定量抗体，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA在下面的实施例1至3中更详细地描述。也可以在体外测量体内T细胞增殖和B细胞增殖。例如，可以使来自受试者的血液样本与(a)至(g)中的一种或多种接触，并测量抗原特异性T细胞和/或B细胞的普遍性。
本发明的方法可以检测免疫应答是否存在。对如上定义的(a)至(g)中的一种或多种存在免疫应答，可以表明受试者感染结核分枝杆菌。对上述(a)至(g)中的一种或多种没有免疫应答，可以表明受试者未被结核分枝杆菌感染。在涉及对上文定义的(a)至(g)中的两种或更多种的免疫应答的检测方法中，对(a)至(g)中的一种或多种存在免疫应答可以表明存在感染，如下面更详细讨论。
CMI应答测定
细胞介导免疫(CMI)应答通常用于定义个体的免疫状态。通常，在临床免疫学领域中，术语CMI应答包括体内皮肤测试、淋巴细胞增殖测定和对在特定抗原存在下由外周血单核细胞(PBMC)产生的细胞因子的体外检测。本发明的方法可以包括检测体外细胞介导的免疫应答。特别地，可以检测对蛋白质和肽或本发明的基于细胞因子的体外CMI应答。该测定在下文中称为“CMI测定”。
免疫系统的细胞能够在抗原刺激后产生免疫效应分子，例如细胞因子。CMI测定包括将细胞样本与抗原一起培养，并测量免疫效应分子(例如细胞因子)是否存在或其量，以指示个体对指定抗原产生细胞介导免疫应答的能力。用于CMI测定的细胞包括淋巴细胞(特别是T细胞)和抗原呈递细胞(APC)的分离群。APC参与加工抗原，以便后者可被每个T细胞表面上的T细胞受体识别。抗原识别可诱导细胞因子产生。可以用流式细胞术鉴定产生细胞因子的细胞。流式细胞术可用于量化细胞因子产生细胞的频率和/或细胞产生细胞因子的量。抗原诱导的细胞因子可以释放到测定培养基中，并通过例如ELISA方法直接检测，或者使用酶联免疫斑点测定(ELISPOT)根据分泌细胞因子的T细胞的频率来定量。本发明的方法优选包括ELISPOT。
酶联免疫斑点测定(ELISPOT)，也称为过滤免疫斑点测定，其最初开发是用于检测和定量个体抗体分泌B细胞。在开发时，该技术为常规噬斑形成细胞测定提供了快速和通用的替代方式。最近的改进已经提高了ELISPOT的灵敏度，由此可以检测到少至每秒产生100分子特异性蛋白质的细胞。这使得ELISPOT测定比常规ELISA测定更加灵敏。ELISPOT测定利用了在蛋白质分泌细胞的邻近周围环境中指定蛋白质细胞产物(例如细胞因子)的相对高浓度。使用高亲和力抗体捕获和检测这些细胞产物。ELISPOT测定的综述见CurrentProtocols in Immunology，Unit 6.19pages 6.19.1-8。
ELISPOT测定通常包括六个步骤：(1)将纯化的细胞因子特异性抗体涂覆到膜底(membrane-backed)的微量滴定板上；(2)封闭平板以防止对任何其他蛋白质的非特异性吸收；(3)用适当的试剂培养细胞因子分泌细胞；(4)去除细胞和试剂；(5)加入带标记的第二抗细胞因子抗体；和(6)检测膜上的抗体-细胞因子复合体。
本发明的方法优选包括T-SPOT.TB测定(Oxford Immunotec，Oxford，UnitedKingdom)。T-SPOT.TB测定法是ELISPOT测定技术的简化变形。T-SPOT.TB测定设计用于检测对结核分枝杆菌特异性抗原刺激做出响应的效应T细胞。该测定枚举个体激活的TB特异性T细胞。它适用于所有面临潜伏性TB感染(LTBI)风险或怀疑患有结核病的患者，不论年龄、性别、种族、治疗或免疫状态。使用两个单独的抗原组，其模拟充分表征的RD1蛋白ESAT-6和CFP10，用于优化测试灵敏度。
结核分枝杆菌蛋白
在一些方面中，本发明的方法还包括检测一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白。所述一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白可以是任何结核分枝杆菌蛋白。许多结核分枝杆菌蛋白是本领域公知的。所述一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白可以包含RD1蛋白。RD1蛋白可以包含CFP-10和ESAT-6中的一种或两种。
片段池
本发明的方法可以包括体外检测对一个或多个片段库的免疫应答，其中每个库包含衍生自TBFG_13463(SEQ ID NO：1)、Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)、Rv2654c(SEQ ID NO：3)、Rv3845(SEQ ID NO：4)、Rv1495(SEQ ID NO：5)、Rv0840c(SEQ ID NO：6)或Rv1677(SEQID NO：7)的两个或更多个片段。例如，每个池可以包含3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个，或250个或更多个来自TBFG_13463(SEQ ID NO：1)、Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)、Rv2654c(SEQ ID NO：3)、Rv3845(SEQ ID NO：4)、Rv1495(SEQ ID NO：5)、Rv0840c(SEQ IDNO：6)或Rv1677(SEQ ID NO：7)的片段。
该方法可以包括体外检测对一种或多种，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种，七种或更多种，八种或更多种，9种或更多种，10种或更多种，11个或更多个，12个或更多个，13个或更多个，或14个或更多个如上定义的片段库。当所述方法包括体外检测对两个或更多个片段库的免疫应答时，每个库可以包含衍生自选自TBFG_13463(SEQ ID NO：1)，Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)，Rv2654c(SEQ ID NO：3)，Rv3845(SEQ ID NO：4)，Rv1495(SEQ ID NO：5)，Rv0840c(SEQ ID NO：6)和Rv1677(SEQ ID NO：7)。当所述方法包括体外检测对三个或更多个片段池的免疫应答时，每个池可以包含源自不同蛋白质的片段。可选地，部分或所有池可包含衍生自相同蛋白的片段。例如，如果所述方法包括体外检测对三个片段池的免疫应答，则所有池可以包含衍生自相同蛋白质的片段。可选地，所述池中的两个可包含衍生自相同蛋白的片段，第三个池可包含衍生自不同蛋白的片段，或三个池可各自包含衍生自不同蛋白的片段。如果两个或更多个池中的任一个来源于相同的蛋白质，则所述池可以包含相同或不同的片段。
如下所述，所述方法还可以包括体外检测对一个或多个蛋白片段文库和/或一个或多个表位池的免疫应答。当所述方法包括检测对一个或多个蛋白质片段文库和一个或多个表位池的体外免疫应答时，蛋白质片段文库中包含的片段可以与表位池中包含的片段来自相同的蛋白质或来自两种或更多种不同的蛋白质。
蛋白片段库
在本发明的一个方面，池中的片段形成蛋白质片段文库。蛋白质片段文库包含衍生自亲本蛋白(对本发明而言为TBFG_13463(SEQ ID NO：1)、Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)、Rv2654c(SEQ ID NO：3)、Rv3845(SEQ ID NO：4)、Rv1495(SEQ ID NO：5)、Rv0840c(SEQ IDNO：6)或Rv1677(SEQ ID NO：7))的多个片段，所述片段共同占亲本蛋白序列的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。在本发明中，池中的片段优选形成一个包含衍生所述片段的蛋白质的至少80％序列的蛋白质片段文库。更优选地，库中的片段形成一个包含衍生所述片段的蛋白质的整个序列的蛋白质片段文库。
蛋白质片段文库可以包含能够刺激CD4+和/或CD8+T细胞的片段。优选地，蛋白质片段文库包含能够刺激CD4+和CD8+T细胞的片段。本领域已知用于刺激的最佳片段大小对于CD4+和CD8+T细胞是不同的。由约9个氨基酸(9mer)组成的片段通常仅刺激CD8+T细胞，由约20个氨基酸(20mer)组成的片段通常仅刺激CD4+T细胞。广义地说，这是因为CD8+T细胞倾向于基于序列识别其抗原，而CD4+T细胞倾向于基于更高水平的结构识别其抗原。然而，由约15个氨基酸(15mer)组成的片段可以刺激CD4+和CD8+T细胞。因此，蛋白质片段文库优选包含的片段长度为约15个氨基酸，例如约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸或约18个氨基酸。
池中的所有片段可以具有相同的长度。可选地，池可包含不同长度的片段。片段长度如上所述。
蛋白质片段文库可以包含序列重叠的片段。因此，每个池可以包括序列重叠的片段。所述序列中重叠的氨基酸可以是一个或多个，例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、10个或更多个、11个或更多、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个或20个或更多个。优选地，所述序列中重叠的氨基酸为9个或更多个，例如10个或更多个、11个或更多个或12个或更多个，因为这使包含能够刺激CD8+T细胞的9mer片段数量最大化。更优选地，序列重叠11个氨基酸。池中的所有重叠片段可以重叠相同数目的氨基酸。可选地，池中可包含序列中以不同数量氨基酸重叠的片段。
蛋白质片段文库可以包含长度为12至18(例如12至15、15至18、13至17或14至16)个氨基酸且具有9至12(例如9至11或10至12)个氨基酸重叠的片段。例如，蛋白质片段文库可以包含如下片段：(i)长度为14个氨基酸且有9、10或11个氨基酸重叠；(ii)长度为15个氨基酸且有9、10或11个氨基酸重叠；或(iii)长度为16个氨基酸且有9、10或11个氨基酸重叠。蛋白质片段文库优选包含长度为15个氨基酸且有11个氨基酸重叠的片段。
片段的一般性质如上所述。
表位池
表位是抗原中被免疫系统识别的部分。具体地，表位是抗原中被抗体、B细胞或T细胞识别的部分。因此，T细胞表位是抗原中被T细胞识别的部分。由于T细胞通过T细胞受体(TCR)识别抗原，所以T细胞表位可以是抗原中与T细胞受体结合(即被识别)的部分。类似地，B细胞表位是抗原中被B细胞识别的部分。由于B细胞通过B细胞受体(BCR)识别抗原，因此B细胞表位可以是抗原中与B细胞受体结合(即被识别)的部分。
可以通过测试完整和片段化的天然蛋白质或重组抗原蛋白质来分别鉴别BCR或TCR表位，从而识别BCR或TCR。还可以使用计算机模拟方法，鉴定B细胞和T细胞表位，例如本实施例。可以通过测试具有抗原性表位序列的肽来验证计算机模拟表位识别的结果。测试抗原性的方法是本领域熟知的。例如，可以通过ELISA来筛选来自受试者的血液样本中针对表位的抗体的存在。
在本发明的一个方面中，池中的一个或多个片段包含衍生该片段的蛋白质的T细胞表位或B细胞表位。这形成了“表位池”。一个或多个片段可以包含T细胞表位和B细胞表位。类似地，一个或多个片段可以包含一个或多个(例如两个、三个或四个)T细胞表位和/或一个或多个(例如两个、三个或四个)B细胞表位。如果片段包含多于一个T细胞或B细胞表位，那么所述表位可以相同或不同。T细胞表位可以是CD4+T细胞表位或CD8+T细胞表位。可选地，T细胞表位可以是CD4+细胞和CD8+T细胞两者的表位。
表4列出了本发明的示例性CD4+T细胞表位。表5列出了本发明的示例性CD8+T细胞表位。表6列出了本发明的示例性B细胞表位。池中的一个或多个片段可以包含这些表位中的任一个。池中的一个或多个片段可以包含任意数量及任何组合的所述表位。
片段的一般性质如上所述。此外，如上文所述的关于形成蛋白质片段文库的片段，包含T细胞表位或B细胞表位的片段可以是约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸或约18个氨基酸。片段的长度优选为约15个氨基酸。可选地，所述片段的长度可以是至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个氨基酸。池中的所有片段可以具有相同的长度，或者池可以包括不同长度的片段。
包含T细胞表位或B细胞表位的片段可以具有重叠序列，即每个库可以包含序列重叠的片段。所述序列可以重叠至少一个，例如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸。优选地，所述序列重叠了9个或更多个氨基酸，例如10个或更多个，11个或更多个，或12个或更多个氨基酸。最优选地，序列重叠11个氨基酸。池中的所有重叠片段可以重叠相同数目的氨基酸。可选地，库可包含序列以不同数目氨基酸发生重叠的片段。
包含T细胞表位或B细胞表位的片段可以是12至18(例如12至15、15至18、13至17或14至16)个氨基酸的长度和/或重叠9至12(例如9至11或10至12)个氨基酸。例如，所述片段可以是：(i)长度为14个氨基酸并且重叠9、10或11个氨基酸，(ii)长度为15个氨基酸并且重叠9、10或11个氨基酸，或者)长度为16个氨基酸并且重叠9、10或11个氨基酸。在一些情况下，片段的长度优选为15个氨基酸，并且重叠11个氨基酸。
细胞
在一个方面，本发明的方法包括使从受试者获得的免疫细胞群与如上所定义的(a)至(g)中的一种或多种相接触。所述(a)至(g)中的一种或多种可以包含如上所述的一个或多个蛋白片段文库和/或一个或多个表位池。
该细胞群通常与足量的(a)至(g)中的一种或多种接触，以产生对(a)至(g)中的一种或多种的免疫应答。该细胞群可以与任何量的(a)至(g)中的一种或多种接触，例如(a)至(g)中的一种或多种的约1ng/ml、约5ng/ml、约10ng/ml、约50ng/ml、约100ngml、约500ng/ml、约1μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μgml、约500μg/ml、1mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml、约100mgml或约500mg/ml。
该免疫细胞群可以包含选自T细胞、B细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、先天淋巴细胞(1LC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞和胸腺细胞等的一种或多种类型免疫细胞。该免疫细胞群可以包含所有这些类型的免疫细胞。在一个方面，该免疫细胞群包含T细胞。优选地，该免疫细胞群包含T细胞和抗原呈递细胞，例如B细胞、树突细胞或巨噬细胞。在另一方面，免疫细胞群包含B细胞。
该免疫细胞群可以进一步与如上所定义的一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触。该免疫细胞群可以与足量的一种或多种结核分枝杆菌蛋白质接触以产生对该一种或多种蛋白质的免疫应答。例如，细胞群可以接触约1ng/ml、约5ng/ml、约10ng/ml、约50ng/ml、约100ng/ml、约500ng/ml、约1μg//ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约500μg/ml、1mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml、约100mg ml或约500mg/ml的一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白。例如，免疫细胞群可以进一步与两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白接触。如果细胞群与两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触，则细胞群可以同时或依次地与两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触。此外，可以使细胞群与(a)至(g)中的一个或一个以上选项，或者两个或两个以上选项，以及一个或一个以上选项或两个或两个以上选项的结核分枝杆菌蛋白同时或依次接触。细胞群可以与相同或不同量的两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触。结核分枝杆菌蛋白质的量如上所述。
在另一方面，本发明的方法包括体外检测对如上所定义的(a)至(g)中的两种或更多种的免疫应答，其中相同的免疫细胞群与(a)至(g)中的两种或更多种接触。所述(a)至(g)中的两种或更多种可以包含一个或多个蛋白片段文库和/或一个或多个如上所述的表位池。细胞群可以同时或依序地与(a)至(g)中的两种或更多种接触。细胞群可以与相同或不同量的(a)至(g)中的两种或更多种接触。(a)至(g)的量如上所述。
在这方面，免疫细胞群体可以进一步与一种或多种如上定义的额外的结核分枝杆菌蛋白质接触。例如，免疫细胞群体可以进一步与两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白接触。如果细胞群与两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触，则细胞群可以同时或依序地与两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触。此外，可以使细胞群与(a)至(g)中的一种或多种或两种或更多种以及一种或多种或两种或更多种结核分枝杆菌蛋白同时或依次接触。细胞群可以与相同或不同量的两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触。结核分枝杆菌蛋白质的量如上所述。
在另一方面，本发明的方法包括体外检测对如上所定义的(a)至(g)中的两种或更多种的免疫应答，其中(a)至(g)中的两种或更多种中的每一种与不同的免疫细胞群接触。(a)至(g)中的两种或更多种可以包含一个或多个蛋白片段文库和/或一个或多个如上所述的表位库。每个免疫细胞群可以包含相同类型或不同类型的免疫细胞。可选地，每个免疫细胞群体可以包含一种或多种不同类型的免疫细胞。示例性免疫细胞如上文详述。此外，(a)至(g)中的两种或更多种可以与不同的免疫细胞群同时或依序地接触。每个不同的细胞群可以与相同或不同量的(a)至(g)中的两种或更多种接触。(a)至(g)的量如上所述。
在该另一方面，所述方法可以进一步包括体外检测对如上定义的一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白的免疫应答，其中每种额外的结核分枝杆菌蛋白与不同的免疫细胞群体接触。例如，两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质可以各自与不同的免疫细胞群体接触。每个免疫细胞群可以包含相同类型或不同类型的免疫细胞。可选地，每个免疫细胞群体可以包含不同类型或不同类型的免疫细胞。示例性免疫细胞在上文详述。此外，两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白可以与不同的免疫细胞群同时或依序地接触。每个不同的细胞群可以与相同或不同量的两种或更多种额外的结核分枝杆菌蛋白质接触。结核分枝杆菌蛋白质的量如上所述。
接触可以以任何合适的体积进行。样本的典型体积为约10μl至约1ml，优选约50μl至约500μl，更优选约100μl至约200μl。通常，细胞与(a)至(g)中的一种或多种(及可选地一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白)接触的时间长度为约5分钟至约50小时，例如约10分钟至约40小时，约20分钟至约30小时，约30分钟至约20小时，约45分钟至约12小时，约1小时至约6小时，优选约10分钟至约2小时。细胞可以与抗原接触过夜。
细胞可以在任何合适的温度下与抗原接触。合适的温度通常在作为所述细胞来源的人或动物正常体温的相同范围内。通常，培养在约4℃至约38℃、优选约20℃至约38℃、更优选约37℃的固定温度下进行。
细胞通常存在于孔中。细胞优选存在于平板的孔中，其优选为膜底的板。样本更优选存在于标准96或384孔板的孔中。这样的板可从Fisher Scientific、VWR Suppliers、Nunc、Starstedt或Falcon商购得到。所述孔的容量通常为约25μl至约250μl、约30μl至约200μl、约40μl至约150μl或约50至100μl。从受试者获得的细胞在用于所述方法之前可以进行培养。这允许每个待测定的样本中存在相等数量的贴壁细胞。可选地，如果所述细胞被固定或捕获，则可在接种前计数所述细胞，例如新鲜血细胞。用于培养细胞的技术是本领域技术人员公知的。细胞通常在37℃，5％CO2的标准条件下在补充有血清的培养基中培养。
细胞可以在任何合适的烧瓶或容器中培养，然后转移到孔中。通常在孔中培养细胞。细胞优选在包含两个或更多个孔的平板中培养，例如标准96或384孔板。将细胞与标记物共培养，通常包括用包含标记物的合适溶液替换每个孔中的培养基。合适的溶液是本领域技术人员公知的。
结果解释
如上所述，本发明的方法包括体外检测对一种或多种结核分枝杆菌抗原的免疫应答。检测到免疫应答则表明受试者患有结核分枝杆菌复合体感染。检测不到(或检测到不存在)免疫应答表明受试者不存在结核分枝杆菌复合体感染。因此，本发明的方法优选包括体外检测是否存在对一种或多种结核分枝杆菌抗原的免疫应答。
换句话说，检测到(或存在)对一种或多种结核分枝杆菌抗原的免疫应答的检测，表明受试者患有结核分枝杆菌复合体感染。检测不到(或缺乏)对一种或多种结核分枝杆菌抗原的免疫应答，表明受试者不存在结核分枝杆菌复合体感染。
可以应用不同的标准来确定阳性测试结果(即，受试者中结核分枝杆菌复合体感染的存在)。首先，如果检测到对上文定义的(a)至(g)中的任何一种或多种的免疫应答，则获得阳性测试结果。其次，如果检测到对上文定义的(a)至(g)中的任何一种或多种的免疫应答，并且检测到对上文定义的任何一种或多种额外的结核分枝杆菌抗原的免疫应答，则获得阳性测试结果。如上所述，可以在相同或不同的细胞群中检测到(或未检测到)对(a)至(g)中的一种或多种的免疫应答和(在适用的情况下)对一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白的免疫应答。
在一个优选的实施例中，本发明提供了用于确定受试者是否具有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis或M.tuberculosis)复合体感染的方法，包括在体外检测对以下一个或多个选项的免疫应答的是否存在：(a)Rv0840c(SEQ ID NO：6)或其一个或多个片段；(b)TBFG_13463(SEQ ID NO：1)或其一个或多个片段；(c)Rv1677(SEQ ID NO：7)或其一个或多个片段；(d)Rv2654c(SEQ ID NO：3)或其一个或多个片段；(e)Rv3845(SEQ ID NO：4)或其一个或多个片段；(f)Rv1495(SEQ ID NO：5)或其一个或多个片段；和(g)Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)或其一个或多个片段，其中免疫应答的存在表明受试者具有结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合体感染，而免疫应答的缺失表明受试者不具有结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合体感染。
试剂盒
本发明还涉及一种适用于本发明治疗中的本申请所述组分的组合，其形式为包装在容器中的试剂盒。
具体地，本发明提供了用于诊断受试者的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合体感染的试剂盒，其包含以下各项中的一种或多种：(a)Rv0840c(SEQ ID NO：6)或其一个或多个片段；(b)TBFG_13463(SEQ ID NO：1)或其一个或多个片段；(c)Rv1677(SEQ ID NO：7)或其一个或多个片段；(d)Rv2654c(SEQ ID NO：3)或其一个或多个片段；(e)Rv3845(SEQ IDNO：4)或其一个或多个片段；(f)Rv1495(SEQ ID NO：5)或其一个或多个片段；和(g)Mtub2_17866(SEQ ID NO：2)或其一个或多个片段。优选地，试剂盒包含一个或多个如上所述的蛋白质片段文库或表位池相关的片段。
试剂盒可以进一步包括用于检测免疫应答的工具。例如，试剂盒可以包含用于进行ELISA或ELISPOT的部分或全部必需设备或试剂。特别地，试剂盒可以包含一个或多个标准96或384孔的平底板或膜底(membrane-backed)板。试剂盒可以包含用于涂覆相关板和/或用于封闭板以防止非特异性吸收的一种或多种必需的试剂。试剂盒可以包含用于检测细胞因子或其它免疫产物的一种或多种标记的抗体。试剂盒可以包含用于检测标记的抗体的一种或多种检测试剂。
药物，方法和治疗用途
本发明提供了包含如上定义的(a)至(g)中的一种或多种的组合物，其用于在受试者中治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染。本发明额外提供了治疗或预防受试者的结核分枝杆菌复合体感染的方法，包括向受试者施用如上定义的(a)至(g)中的一种或多种。
结核分枝杆菌复合体感染可以是活动性或潜伏性感染。
合适的组合物制剂可以使用标准药物制剂化学和方法进行，所有这些对于本领域技术人员是容易获得的。
例如，(a)至(g)中的一种或多种可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体组合。助剂，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可存在于赋形剂或赋形剂中。这些赋形剂、媒介物和助剂通常是不会在接受组合物的个体中诱导免疫应答且其给药不会引起不适当毒性的药物。药学上可接受的赋形剂包括但不限于：液体，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油、硫代甘油和乙醇。其中也可包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。药学上可接受的赋形剂、媒介物和助剂的详细讨论可参见在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
所述组合物可以以适于推注给药或连续给药的形式制备、包装或销售。可注射组合物可以以单位剂型形式制备、包装或销售，例如在含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性载体中的乳液、糊剂，和可植入的持续释放或可生物降解的制剂。所述组合物还可以包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠外施用的组合物的一个实施例中，活性成分以干燥(例如粉末或颗粒)形式提供，用于在用合适的载体(例如无菌无热原的水)复原之后，在胃肠外施用复原的组合物。组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知的技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包含其它成分，例如本申请所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这样的无菌可注射制剂可以使用肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂制备，例如水或1，3-丁二醇。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液，等渗氯化钠溶液和固定油例如合成的单甘油酯或二甘油酯。
其它可用于肠胃外给药的组合物包括包含微晶形式、脂质体制剂形式、或作为可生物降解的聚合物系统的组分形式的活性成分的组合物。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水性材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可选地，(a)至(g)中的一种或多种可以用颗粒载体包封、吸附或结合。合适的颗粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的颗粒载体，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的PLG微粒。参见例如Jeffery et al.(1993)Pharm.Res.10：362-368。也可以使用其他颗粒系统和聚合物，其中聚合物例如是聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，以及这些分子的偶联物。
组合物的制剂将取决于多种因素，例如组合物中物质的性质和给药方法。组合物可以以多种剂型给药。其可以通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、经皮、皮内、骨内途径或通过输注技术给药。医生能够确定每个特定个体所需的给药途径。
所施用的组合物将包含有效但不会引起不良反应的合适浓度的(a)至(g)中的一种或多种。通常，组合物中每种蛋白质的浓度将在0.03至200nmol/ml的范围内。更优选在0.3至200nmol/ml、3至180nmol/ml、10至150nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范围内。所述组合物应具有大于95％或98％的纯度，或至少99％的纯度。
组合物还可以包含佐剂。佐剂优选为以足以增强(a)至(g)中的一种或多种的效果的量施用。佐剂或其它治疗剂可以是增强(a)至(g)中的一种或多种的效果的试剂。例如，其它药剂可以是增强对(a)至(g)中的一种或多种的反应的免疫调节分子或佐剂。
在一个实施例中，(a)至(g)中的一种或多种与一种或多种其它治疗剂组合使用。药剂可以分开、同时或依次给药。它们可以在与(a)至(g)中的一种或多种相同或不同的组合物中给药。因此，在本发明的方法中，受试者也可以用额外的治疗剂治疗。
因此，组合物可以与(a)至(g)中的一种或多种以及一种或多种其它治疗性分子一起配制。作为组合治疗的一部分，(a)至(g)中的一种或多种可以可选地与一种或多种其它治疗组合物同时、依序或分开使用。
佐剂的非限制性示例包括明矾、单磷酰脂质、寡核苷酸、霍乱毒素和弗氏(Freund’s)不完全佐剂。
(a)至(g)中的一种或多种可以通过如上所述的任何合适的方法给药。(a)至(g)中的一种或多种的合适量可以凭经验确定，但通常在以下给出的范围内。为了预防结核分枝杆菌复合体感染，单次施用组合物可能足以对患者具有有益效果。然而，应当理解，如果将组合物多次施用于受试者，则有益效果可以更大，在这种情况下，典型的给药方案可以是例如每6个月内在2-4周中每周一次或两次，或每四至六个月内在一周中一天一次。
给药剂量将取决于许多因素，包括组合物的性质、给药途径，和给药方案的安排和时机。合适的剂量可以是每次给药至多15μg、至多20μg、至多25μg、至多30μg、至多50μg、至多100μg、至多500μg或更高的量级。合适的剂量可以小于15μg，但至少1ng，或至少2ng，或至少5ng，或至少50ng，或至少100ng，或至少500ng，或至少1μg，或至少10μg。对于一些分子，所使用的剂量可以更高，例如至多1mg，至多2mg，至多3mg，至多4mg，至多5mg或更高。这样的剂量可以在液体制剂中提供，其浓度宜为是允许通过所选择的途径给药的适当体积。
在组合物中待施用的一种或多种(a)至(g)的剂量可以根据各种参数确定，特别是：根据待治疗的受试者的年龄、体重和症状；给药途径；和所需的方案。医生将能够确定任何特定受试者的所需给药途径和剂量。根据特定抑制剂的活性、待治疗的受试者的年龄、体重和症状以及给药的频率和途径，典型的每日剂量为约0.1至50mg/kg体重。剂量可以以单一剂量提供或者多个剂量提供，例如以规律的间隔提供，例如每小时施用2、3或4个剂量。
本发明的组合物或如上所定义的(a)至(g)可以在一天内向受试者给药。可选地，如上定义的本发明(a)至(g)的组合物可以在至少两天，例如至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天或至少10天。所述给药时机之间的间隔可以是1至28天，例如3至25天、6至22天、9至18天或12至15天。优选地，给药时机之间的间隔为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。
如果用于为受试者治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染的方法包括向受试者施用如上定义的(a)至(g)中的两种或更多种，则(a)至(g)中的两种或更多种中的每一种可以单独或组合向受试者给药。
如上定义的本发明的组合物或(a)至(g)可以施用于任何合适的受试者。受试者通常是人类受试者。受试者可以是上文所述诊断方法中提及的任何动物或哺乳动物。
受试者可以是婴儿、青少年或成人。受试者可以已知患有结核病或怀疑患有结核病。受试者可以易患结核病或处于结核病的风险中。例如，受试者可能是遗传性易感染结核病，生活于高风险区域或具有弱化免疫系统。受试者可能感染了HIV或患有AIDS。
本发明可以与治疗预防结核病的其它手段和物质组合使用。在一些情况下，如上定义的本发明的组合物或(a)至(g)可以与旨在用于治疗结核病或改善结核病症状的其他物质同时、依序或分开施用，或用于提供疼痛缓解。如上定义的组合物或(a)至(g)可以与用于结核病的现有治疗组合使用，并且可以例如与所述治疗简单混合。因此，本发明可用于增加现有疾病疗法的功效。
实施例
实施例1
使用NeutraCorp平台分析结核分枝杆菌基因组
使用由Proxagen开发的免疫信息平台(TradeMark：BG Per.No.85788，27/08/2013)分析结核分枝杆菌的基因组。分析从临床分离物获得的基因组以坚定免疫原性蛋白质抗原。
从GOLD数据库中获得了总共44个MTB完整基因组。
表1：采用MTB菌株基因组列表
结核分枝杆菌基因组和蛋白质选择的分析
使用NeutraCorp(TradeMark：BG Per.No.85788，27/08/2013)免疫信息平台，我们充分分析了MTB基因组以鉴定所有可能具有抗原特性的蛋白质片段，无论是T细胞表位还是连续B细胞表位。
在每个基因组中，选择具有模拟亲和力高于理论值1％的至少1种可用表位(T和B细胞表位)的蛋白质。分析了这些蛋白质中针对与易感性或保护相关的HLA-DR等位基因或等位基因组的T细胞表位的存在，从而如表2所示地发展TB.
表2
选择对于TB保护相关的HLA相关等位基因或等位基因组具有显著较高的表位数量(对于所有等位基因，＞每种蛋白质的表位平均值的3SD)的蛋白。
使用EGM2软件(Nucl.Acids Res.2011 doi：10.1093/nar/gkr1261)对所有鉴定后的蛋白质进行同源性分析。选择在超过20个常见临床应变基因组中存在的蛋白质。
由此得到如表3所示的7种蛋白质的列表。
表3
最终T细胞表位鉴定和肽设计
使用免疫信息平台NeutraCorpTM(商标：BG Per.No.85788，27/08/2013)筛选鉴定得到的7种蛋白质序列，以鉴定和设计T细胞表位。
具体地，在在所有7种蛋白质中的潜在的蛋白质序列中鉴定了高亲和力T细胞表位(与任何HLA I类和II类等位基因的最佳结合肽的1％的亲和力相等)。选择含有多表位和/或HLA混杂片段的蛋白质区域作为用于T细胞分析的潜在反应物。总共将33个肽设计为II类HLA分子的T细胞表位(表4)。
表4
将总共47种肽设计为针对I类HLA分子的T细胞表位(表5)。
表5
最终B细胞表位识别和肽设计。
使用开发的免疫信息平台NeutraCorpTM(商品名：BG Per.No.85788，of 27/08/2013)筛选鉴定的7种蛋白质的线性B细胞表位的存在。
对于连续的B细胞表位，在线性蛋白质序列蛋白质中鉴定出长度为7个氨基酸的与抗体潜在反应的蛋白质区域。含有多于一个鉴定片段的热点的蛋白质序列的区域被认为只有一个。设计了每种蛋白质的潜在片段。
对于不连续的B细胞表位预测和肽模拟表位设计，我们首先通过使用Swiss-Prot仪器通过同源模型确定6种蛋白质的3D结构。使用开发的免疫信息平台的Neutracorp模块和沿3D结构鉴定的潜在抗原性部分，来评估3D模型。在鉴定了构成不连续B细胞表位的不同片段之后，随后的步骤是设计模拟整个B细胞表位的结构的肽(也称为模拟表位)。为此，对于每个不连续B细胞表位，手动检测3D蛋白质结构模型，由此能够对包括在表位中的不同线性片段进行空间鉴定。确定单个片段的距离和取向，并且引入甘氨酸和脯氨酸的合适间隔物，以允许不同线性部分之间具有适当距离和角度。
在蛋白质序列和结构上设计了总共48个作为B细胞抗原的肽表位和模拟表位(表6)
表6
肽合成
通过标准Fmoc化学(Espikem，Prato，Italy)对所鉴定的游离末端肽进行化学合成。产生的肽的纯度＞90％。
用血清生物库筛选合成肽库以检验所选MTB蛋白的抗原性
可用于Proxagen的结核病(TB)患者血清库和对照是通过欧盟地区竞争力项基金的结果可用于“Development of a rapid test prototype for the diagnosis ofactive tuberculosis(开发用于诊断活动性结核病的快速测试原型)”(项号BG161PO003-1.1.01-0220，28/12/2011)。
测试来自以下组的血清样本以炎症所鉴定的蛋白质和片段的免疫原性：
-健康对照(N＝60)
-活动性TB(N＝50)
-治愈TB(N＝10)
通过多肽ELISA测定的标准操作程序测试肽ID#88-ID#136。
流程：
a.试剂
-无菌PBS 1X
-涂覆缓冲液-Na2CO3/NaHCO3pH 9.3
-洗涤缓冲液-PBS 1x
-封闭缓冲液-PBS+BSA 1％
-测定缓冲液-PBS+BSA 1％
-辣根过氧化物酶偶联(HRP)抗人IgG(Zymed)
-底物-(0.04mg/ml邻苯二胺(Sigma)
-终止液-1N H2SO4
-显色缓冲液-UREA+H2O2片剂(Sigma)
b.涂覆ELISA板：
-用涂覆缓冲液中将肽稀释至1μg/ml。
-转移每孔50μl稀释的肽到ELISA板中。
-将板密封，并在室温下培养1小时并在4℃下过夜。
c.封闭板：
-每孔加入200μl封闭液(PBS+BSA 1％)；
-在室温下培养1小时；
-洗涤ELISA板的内容物。
d.ELISA步骤1：添加样品
-按1：100以测定缓冲液(PBS+BSA 1％)稀释池血清；
-按照方案在每个待测ELISA板中转移50μl稀释的血清；
-在37℃下培养2小时；
-用PBS(200μl/孔)洗涤3次。
e.ELISA步骤2：稀释抗体偶联物并加入ELISA板
-按1∶4000以测定缓冲液(PBS+BSA 1％)稀释HRP-抗人IgG；
-按照方案，使用多通道移液器以50μl/孔转移至ELISA板；
-在室温下培养1小时；
-用洗涤缓冲液(200μl/孔)洗涤5次。
f.ELISA步骤3：加入底物并读取板
-制备显色缓冲液，在20毫升dH2O中加入1片UREA；
-制备底物缓冲液，在20ml显色缓冲液中加入1片OPD；
-加入50μl/孔的底物缓冲液，并在室温下在黑暗中培养15分钟；
-用50μl 1N硫酸终止反应；
-使用ELISA板分析仪读取在492nm处的吸光度。
结果：
图1显示了用不同组血清获得的结果。当来自6种蛋白质的表位组用作抗原时，活动性TB受试者比其他组具有显著更高的抗体水平。这证明了该试剂的抗原性及其在诊断试验中的应用。
实施例2
扩展抗原性筛选
为了证实通过免疫生物信息学分析鉴定的B细胞表位肽的抗原性，在来自具有微生物学确认的活动性结核分枝杆菌复合体感染的受试者的血清，具有IGRA证实的潜伏性结核分枝杆菌复合体感染(LTBI)的受试者的血清，和健康对照受试者的血清中，通过ELISA筛选针对如SEQ ID NO：88至SEQ ID NO：141所示的肽的抗体的存在。
ELISA方法流程：
a.试剂
-无菌PBS 1X
-涂覆缓冲液-Na2CO3/NaHCO3pH 9.3
-洗涤缓冲液-PBS 1x
-封闭缓冲液-PBS+BSA 1％
-测定缓冲液-PBS+BSA 1％
-辣根过氧化物酶偶联(HRP)抗人IgG(Zymed)
-底物-(0.04mg/ml邻苯二胺(Sigma)
-终止液-1N H2SO4
-显色缓冲液-UREA+H2O2片剂(Sigma)
b.涂覆ELISA板：
-用涂覆缓冲液中将肽稀释至1μg/ml。
-转移每孔50μl稀释的肽到ELISA板中。
-将板密封，并在室温下培养1小时并在4℃下过夜。
c.封闭板：
-每孔加入200μl封闭液(PBS+BSA 1％)；
-在室温下培养1小时；
-洗涤ELISA板的内容物。
d.ELISA步骤1：添加样品
-按1：100以测定缓冲液(PBS+BSA 1％)稀释池血清；
-按照方案在每个待测ELISA板中转移50μl稀释的血清；
-在37℃下培养2小时；
-用PBS(200μl/孔)洗涤3次。
e.ELISA步骤2：稀释抗体偶联物并加入ELISA板
-按1∶4000以测定缓冲液(PBS+BSA 1％)稀释HRP-抗人IgG；
-按照方案，使用多通道移液器以50μl/孔转移至ELISA板；
-在室温下培养1小时；
-用洗涤缓冲液(200μl/孔)洗涤5次。
f.ELISA步骤3：加入底物并读取板
-制备显色缓冲液，在20毫升dH2O中加入1片UREA；
-制备底物缓冲液，在20ml显色缓冲液中加入1片OPD；
-加入50μl/孔的底物缓冲液，并在室温下在黑暗中培养15分钟；
-用50μl 1N硫酸终止反应；
-使用ELISA板分析仪读取在492nm处的吸光度。
结果
表21显示了通过ELISA测试得到的每种肽/血清组合的光密度(OD数据)，以建立B细胞表位肽(SEQ ID NO：88至SEQ ID NO：141)的抗原性和初步灵敏度数据。
OD数据是含有肽的(即测试)孔的一式两份的每个单一血清的反应性减去不含肽(即阴性对照)孔中的相同血清的基础反应性的绝对值。
通过建立对照的第99百分位数或平均值+3SD，可以定义截断值，截断值提供了来自具有微生物学确认的活动性结核分枝杆菌复合体感染(活动性TB血清)的受试者的测试血清中的每种肽的反应性的阳性评分。这允许确定每种肽或来自单一蛋白质的每一肽组合的活动性TB血清的反应性。更详细如下：
·TB与对照的Mann-Whitney检验p值，提供了每个肽的结果的一般意义上的显著性；
·对照数据分布的第99百分位数截断值，提供了一个简单的截止阈值，高于该截止阈值时活动性结核病血清被认为是阳性；
·对照数据分布的平均值+3SD截断值，提供了理论上＜1％误差率的更保守的截断值；
·使用99th％截断值在受试TB中得到的N个阳性，显示了每个肽在活动性结核病血清中根据第99百分位数截断值得到的阳性结果数量；
·在99th％截断值下的TB中的％阳性，显示了根据第99百分位截断值具有阳性结果的活动性TB血清的百分比；
·使用平均值+3SD为截断值得到的受试TB中的N个阳性，显示了每个肽在活动性TB血清中根据根据平均值+3SD截断值得到阳性结果的数量；
·平均值+3SD为截断值下的TB中的％阳性，显示了根据平均值+3SD具有阳性结果的活动性TB血清的百分比；
·N个阳性＞TB平均值，显示了OD值大于该肽的所有活动性TB血清(实质上是肽的最高反应血清)的平均(平均值)OD的活动性TB血清的数量；和
·％阳性＞TB平均值，显示OD值大于该肽的所有活动性TB血清(实质上是肽的最高反应血清)的平均(平均值)OD的活动性TB血清的百分比。
对于每种蛋白质，已经计算了包含所有衍生自该蛋白质的肽的组的假设性能。由于已使用平均+3SD截断值和活动性TB血清的平均OD(即始终阳性结果)对此进行计算，因此没有显示对照血清的假设性能。
表20中的OD值，显示与对照受试者(即健康个体或具有LTBI的受试者)相比，具有活动性结核分枝杆菌复合体感染的受试者中对SEQ ID NO：88至SEQ ID NO：141的抗体水平显著更高。这些结果证实了SEQ ID NO：88至SEQ ID NO：141的肽的抗原性。
此外，该结果证明SEQ ID NO：88至SEQ ID NO：141的肽可以单独或以蛋白质组来使用，用于鉴定来自具有活动性结核分枝杆菌复合感染的受试者的血清，即诊断活动性结核分枝杆菌复合体感染。
实施例3
多肽ELISA
基于对多肽的反应性的诊断测试，通常比基于对单个肽的反应性的测试更灵敏，因为可能存在响应性的个体变化，这是由于例如。遗传背景。因此，筛选在实施例2中筛选的包含肽的肽与大量对照(IGRA阴性和/或IGRA阳性)血清，来自具有活动性结核分枝杆菌复合体感染的患者的血清(活动性TB)和来自从结核分枝杆菌复合体感染中治愈超过24个月的患者的血清(治愈TB)。每组中的样品数如下：
-健康对照(IGRA阴性)(N＝74)；
-MTB感染的健康对照(LTBI、IGRA阳性且没有活动性TB的其他迹象)(N＝30)；
-活动性TB(N＝66)；
-治愈TB(N＝10)。
需要选择实施例2中筛选的最佳性能肽以包括在肽池中。特别地，可以包括在多肽ELISA的单个孔中的肽的数目限于约15-20，因为包含太多肽可能在吸收步骤期间引入对结合位点的竞争。因此，选择来自实施例2的最具反应性的肽，以及提供与活动性TB血清互补反应性的肽，从而优化灵敏度。具体地，所述池由SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115、SEQID NO：122、SEQ ID NO：129、和SEQ ID NO：134组成。
根据实施例2进行ELISA程序，但是用肽池而不是单个肽来涂覆平板。
结果
表7显示了用该肽池测试的每种血清的光密度(OD数据)。OD数据是含有多肽的(即测试)孔的一式两份的每个单一血清的反应性减去血清模拟值的的绝对值。
表8显示了表7中所含的描述性数据的描述性统计，描述了各种截断值，以及Mann-Whitney比较的结果。由于数据集足够大，所示百分比可以解释为初步灵敏度和特异性数据。
表7
表8
实施例4
候选T细胞抗原的鉴定
1.介绍
该研究是一项早期可行性研究，旨在确定用于T-SPOT.TB测定的潜在新抗原，并计算其是否可以取代ESAT-6和CFP10抗原或添加到测定中，并增加当前T-TB测定的灵敏度。为了实现这一点，在.TB测定中用87个TB确认的供体和96个健康供体筛选了一组新的TB抗原。
2.方法
在T-SPOT.TB测定中，使用T-SPOT.TB A组(PA)、T-SPOT.TB B组(PB)和24种替代性TB抗原，测试从TB确认(通过MTB/RIF测定确认)供体和健康供体中分离的外周血单核细胞(PBMC)。MTB/RIF测定是由Cepheid生产的结核病的核酸扩增试验。它得到世界卫生组织的支持，用于结核病流行国家，称在培养确认TB供体中的敏感性为92.2％(675/732)，在无结核病的供体中具有99.2％的特异性(604/609)，Boehme，C.(2011)。
测试的抗原列于表9中。
表9
抗原 肽数量
T-SPOT.TB A组 -
T-SPOT.TB B组 -
Massi池CD4+8 91
CD4/CD8表位池TBFG_13463 15
CD4/CD8表位池Mtub2_17866 7
CD4/CD8表位池Rv2654c 11
CD4/CD8表位池Rv3845 15
CD4/CD8表位池Rv1495 12
CD4/CD8表位池Rv0840c 25
CD4/CD8表位池Rv1677 6
Rv2654c肽文库 18
TBFG_13463肽文库 30
Rv0840c肽文库 69
Rv3845肽文库 27
Rv1677肽文库 43
Rv1495肽文库 24
Mtub2_17866肽文库 12
每个表位池中的CD4/CD8表位列于表10至16中。
表10：CD4/CD8表位池TBFG_13643
AALVGYLSVPQGWT
QALGWLPMQDIDAAA
RPFMMPHTPSGGAA
DTHGATSDFW
HGATSDFW
GPVAAGLGRAAL
VGYLSVPQGW
TEAEPNQALGWLPM
EPNQALGWLPM
AEAAAQPSHALGWL
LPIEEIDAAASD
GEVSSSPQLPPRPF
SSSPQLPPRPFMM
RPFMMPHTPSG
FMMPHTPSGG
表11：CD4/CD8表位池Mtub2_17866
GGITWRVAATSARSA
GHYGLATWFTRMDAMTAPT
STRRTCNHGGITWR
ITWRVAATSARSAR
ATTHPEAGHYGL
EAGHYGLATWF
HYGLATWFTR
表12：CD4/CD8表位池Rv2654c
DELVGGPPVEASAA
GAWRTAAVELARALVRAVAESHGV
ELARALVRAV
AAVLFAATAAAAAA
HALAARTLAAA
TLLAAADELV
AALAGDAAGAW
RTAAVELARALV
AESHGVAAVLFAA
VLFAATAAAAAV
ATAAAAAVDR
表13：CD4/CD8表位池Rv3845
MDRVRRVVTDRDSGAGA
PQLAAFYHRLMTTQRHC
ATIAVARKLAERT
RPYQLRDTNGDPV
AHYHVDTRTHPHN
RRTDPQLAAFYHR
QLAAFYHRL
HTQATIAVARK
ATIAVARKLAER
RTRVTITTGRPY
TITTGRPYQLR
KELIDAHYHVDTR
DTRTHPHNRAHT
RAHTDTMQNSK
TMQNSKPAR
表14：CD4/CD8表位池Rv1495
QVYRCDLGYGAKPWLIVSNNARNRHTA
QVYRCDLGYGAKPWLIV
DLGYGAKPWLI
KPWLIVSNNARNRHTA
ADVVAVRLTTTRRTIP
PTWVAMGPSDPLT
TGYVNADNIETLGK
ATMNKINTALATALGL
VYRCDLGYGAKPW
LTTTRRTIPTWVA
YLGEVTPATMNKI
ALATALGLPW
表15：CD4/CD8表位池Rv0840c
表16：CD4/CD8表位池Rv1677
SRLIGALTVVAIIVTACGSQPK
APVVGQVAASHPEV
PEVTFVGVAGLDQVP
QEFVNKYPVKTFTQLADTD
SVWANFGVTQQPA
VDVVRGRMSQDELTRRVTALTSR
Massi pool CD4+8包含用于TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677的CD4/CD8表位池中的所有CD4/CD8表位。用于TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677的肽文库含有具有11个氨基酸重叠并涵盖用于表位选择的蛋白质的完整氨基酸序列的15聚体。
3.结果
3.1供体
3.1.1 TB阳性供体
在开普敦大学，以T-SPOT测定测试了120个供体。TB感染状态由GeneXpert MTB/RIF测定确认。120个供体中有93个是GeneXpert阳性(8/120 GeneXpert阴性和19/120个未经GeneXpert测试)。在93个GeneXpert阳性供体中，4/93个供体具有低细胞计数(＜2.0x106个细胞/mL)，2/93个供体具有高阴性对照(＞10个点)。因此，排除这些供体。剩余的87个TB阳性供体用于本实施例中。
3.1.2健康供体
在Oxford Immunotec(UK)以T-SPOT测定测试了107名健康供体。11个供体因为结核病感染的风险较高而被排除在这个组之外(8个供体由于出生地在TB流行地区或在国外TB流行地区的停留时间而被排除，1个供体由于与TB感染个体的紧密接触而被排除，且2个供体由于在先前T-SPOT.TB测定中的阳性反应历史而被排除)。其余96个供体被纳入分析中。
由于抗原短缺，不是所有的96个供体都用所有17种抗原进行测试。用每种抗原测试的数目列于表17中。
表17
抗原 受试健康供体数量
A组 96
B组 96
Massi池CD4+8 96
CD4/CD8表位池TBFG_13463 92
TBFG_13463肽文库 80
CD4/CD8表位池Mtub2_17866 94
Mtub2_17866文库 95
CD4/CD8表位池Rv2654c 96
Rv2654c肽文库 95
CD4/CD8表位池Rv3845 95
Rv3845文库 93
CD4/CD8表位池Rv1495 94
Rv1495文库 96
CD4/CD8表位池Rv0840c 93
Rv0840c肽文库 93
CD4/CD8表位池Rv1677 93
Rv1677文库 96
3.2受试者操作特性(ROC)曲线
使用GraphPad Prism 6软件分析数据。将来自健康供体的归一化点计数绘制为对照值。将来自TB确认供体的归一化点计数绘制为患者值。
当前的T-SPOT.TB测定，利用来自A组或B组的max点计数作为测定读出数，例如：供体1，A组＝4个点，B组＝10个点，则T-SPOT.TB测试结果＝10个斑点。当使用不同的抗原组合时，应用该分析来计算测定性能。其用途在列出的抗原后以术语Max表示。
3.3统计分析
使用MedCalc软件比较ROC曲线。使用Hanley和McNeil方法(Hanley，J，McNeil BJ.(1983))比较来自同组患者的曲线之间的曲线下面积(AUC)的差异(p＜0.05＝曲线之间有显著差异)。
3.4 T-SPOT.TB测定性能
当前T-SPOT.TB测定性能的ROC曲线显示在图2A中。A组/B组max值(max)在不同截断值下的测定灵敏度和特异性显示于图2B中。在该研究中的T-SPOT.TB测定性能，在6个点的截断值下为94.2％灵敏度和97.9％特异性。这些性能数据与以前在美国T-SPOT.TB测定包装插页上公布的性能相仿(灵敏度＝95.6％(175/183)，特异性＝97.1％(297/306)，PI-TB-US-V4，2013年3月)。2/96个健康供体用A组/B组抗原测试为阳性，这些供体被安排在T-SPOT.TB测定中重新测试以证实该结果。将截断值降低至3个点不会影响灵敏度，但是会将测定的特异性降低至87.5％。
3.5 CD4/CD8选择的表位与涵盖整个蛋白质序列的肽文库的比较
在该研究的此方面中，合成了在计算机模拟中鉴定为Mtb基因组的潜在CD4/CD8表位的肽序列，并根据其来源的Mtb蛋白进行合并。与此同时，获取Mtb蛋白序列的拷贝，合成肽库(具有11个氨基酸重叠的15聚体)并针对每种蛋白质进行合并。在T-SPOT.TB测定中，与A组和B组对比测试了这两个肽组。结果示于图3和图4中。
图3比较了Rv1495、TBFG_13463和Rv3845的CD4/CD8表位池与肽文库。ROC曲线的统计比较，显示了CD4/CD8表位池和A中的相应肽文库之间存在性能显著差异(p＝0.0267)。在这种情况下，肽文库优于其相应的CD4/CD8表位池。在B和C中，CD4/CD8表位集合与其相应的蛋白质文库之间在性能上没有显著差异(分别为p＝0.3208和p＝0.1850)。
图4显示Mtub2_17866、Rv2654c、Rv1677和Rv0840C肽文库的ROC曲线。表18显示了在使用不同截断值(n＝180；TB阳性＝87；健康供体＝93)的T-SPOT.TB中的Rv0840c的敏感性和特异性。
表18
表19总结了使用6点截断值的TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677 CD4/CD8表位池和肽文库以及Massi池CD4+8的个体敏感性和特异性。
表19
图5显示了TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677CD4/CD8表位库max和TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677肽库max的比较。根据上述“max”的定义，在T-SPOT.TB测定中单独测试每个表位库和肽文库。CD4/CD8表位库max和肽库max之间存在显著差异(p＝0.0033)。
图6显示了包含所有CD4/CD8表位库(TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677)的单一合并表位库的结果。
3.6替换A组(ESAT-6)或B组(CFP10)
在研究开始时提出的主要问题之一，是关于是否可以替换目前用于T-SPOT.TB测定中的ESAT-6(A组)或CFP10(B组)池之一，而不影响测定。在该分析中，ESAT-6和CFP10已经用Rv0840c肽文库代替，其结果绘制为ROC曲线。图7显示了替换ESAT-6的结果。图8显示了替换CFP10的结果。可以看出，当用Rv0840c肽文库替换ESAT-6或CFP10时，灵敏度和特异性高。
3.7在当前T-SPOT.TB测定中加入抗原以增加测定灵敏度
本研究开始时提出的最后一个问题，是确定在目前的T-SPOT.TB测定中加入抗原是否可以增加T-SPOT.TB测定的灵敏度。使用在研究中产生的数据和上述“max”分析，已经确定了将肽文库加入到T-SPOT.TB测定中的结果。图9显示了A组/B组max和A组/B组/Rv0840c肽文库max的ROC曲线的比较。表20总结了A组/B组max和A组/B组/Rv084c肽文库max的敏感性和特异性。
表20：向A组和B组中添加Rv0840c的T-SPOT.TB测定的Max分析。
在T-SPOT.TB测定中包括Rv0840c的结果是，检测到了当前T-SPOT.TB测定无法检测到的另外2个TB确认供体。包括Rv0840c的情形，将T-SPOT.TB测定的灵敏度提高至96.5％(84/87)。
4.结论
该研究是早期可行性研究，其设计目的在于，鉴定潜在候选抗原以替代T-SPOT.TB测定中的ESAT-6和CFP10抗原和/或提高当前T-SPOT.TB测定的灵敏度。在T-SPOT.TB测定中，使用A组、B组、TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677CD4/CD8表位池和TBFG_13463、Mtub2_17866、Rv2654c、Rv3845、Rv1495、Rv0840c和Rv1677肽文库，测试了87个TB阳性供体和多达96个健康供体。
肽文库和CD4/CD8表位池在T-SPOT.TB测定中均实现了良好的特异性。在一些情况下，肽文库(15mer/11个氨基酸重叠)优于相应的CD4/CD8表位池。结果显示，Rv0840c肽文库尤其是一种提高当前T-SPOT.TB测定灵敏度或替代ESAT-6或CFP10的潜力候选物。
本发明的其他方面
1)来源于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)并且包含至少一种T细胞或B细胞表位的7种蛋白质中的任何一种单独或与其他结核分枝杆菌蛋白组合，作为生物标志物用于在体外测定中检测结核分枝杆菌感染或疾病的用途，所述蛋白选自SeqID#1至#7。
2)根据项1所述的用途，其中7种蛋白质中的任意T细胞表位单独或与其他蛋白抗原组合，作为生物标志物用于在体外测定中检测结核分枝杆菌感染或疾病，所述蛋白质表位选自SeqID#8至#87
3)根据项1所述的用途，其中所述7个蛋白质中的任意B细胞表位(连续或不连续)或任何模拟表位用做单抗原，单独或与其它蛋白质抗原组合用作生物标志物，用于在体外测定中检测结核分枝杆菌感染或疾病，所述蛋白质表位选自SeqID#88至#136。
4)根据项1、2和3所述的用途，其中所述蛋白质的同源物或直系同源物的使用形式为整体、部分、片段或序列同源性等于或大于80％的同源片段。同源性定义如下：
在优化比对之后与项1-3中的所述一种或多种蛋白质相比具有至少80％相似性的氨基酸序列；或
包含B细胞和/或T细胞表位(seqID#8-136)或其化学类似物的如项1-3中所定义的蛋白质和肽的肽片段；
5)根据项1-4所述的用途，其用于在体外测定中检测受试者的结核分枝杆菌感染。
6)根据项5所述的用途，其中所述分枝杆菌种选自：分支杆菌M.tuberculosis、分支杆菌M.bovis、分支杆菌M.bovis BCG、分支杆菌M.africanum、分支杆菌M.canetti、分支杆菌M.caprae、分支杆菌M.microti、分支杆菌M.pinnipedii、分支杆菌M.avium、分支杆菌M.avium paratuberculosis、分支杆菌M.avium silvaticum、分支杆菌M.avium″hominissuis″、分支杆菌M.colombiense、分支杆菌M.asiaticum、分支杆菌M.gordonae、分支杆菌M.gastri、分支杆菌M.kansasii、分支杆菌M.hiberniae、分支杆菌M.nonchromogenicum、分支杆菌M.terrae、分支杆菌M.triviale、分支杆菌M.ulcerans、分支杆菌M.pseudoshottsii、分支杆菌M.shottsii、分支杆菌M.triplex、分支杆菌M.genavense、分支杆菌M.florentinum、分支杆菌M.lentiflavum、分支杆菌M.palustre、分支杆菌M.kubicae、分支杆菌M.parascrofulaceum、分支杆菌M.heidelbergense、分支杆菌M.interjectum、分支杆菌M.simiae、分支杆菌M.branderi、分支杆菌M.cookii、分支杆菌M.celatum、分支杆菌M.bohemicum、分支杆菌M.haemophilum、分支杆菌M.malmoense、分支杆菌M.szulgai、分支杆菌M.leprae、分支杆菌M.lepraemurium、分支杆菌M.lepromatosis、分支杆菌M.africanum、分支杆菌M.botniense、分支杆菌M.chimaera、分支杆菌M.conspicuum、分支杆菌M.doricum、分支杆菌M.farcinogenes、分支杆菌M.heckeshornense、分支杆菌M.intracellulare、分支杆菌M.lacus、分支杆菌M.marinum、分支杆菌M.monacense、分支杆菌M.montefiorense、分支杆菌M.murale、分支杆菌M.nebraskense、分支杆菌M.saskatchewanense、分支杆菌M.scrofulaceum、分支杆菌M.shimoidei、分支杆菌M.tusciae、分支杆菌M.xenopi、分支杆菌M.intermedium、分支杆菌M.abscessus、分支杆菌M.chelonae、分支杆菌M.bolletii、分支杆菌M.fortuitum、分支杆菌M.fortuitum subsp.acetamidolyticum、分支杆菌M.boenickei、分支杆菌M.peregrinum、分支杆菌M.porcinum、分支杆菌M.senegalense、分支杆菌M.septicum、分支杆菌M.neworleansense、分支杆菌M.houstonense、分支杆菌M.mucogenicum、分支杆菌M.mageritense、分支杆菌M.brisbanense、分支杆菌M.cosmeticum、分支杆菌M.parafortuitum、分支杆菌M.austroafricanum、分支杆菌M.diernhoferi、分支杆菌M.hodleri、分支杆菌M.neoaurum、分支杆菌M.frederiksbergense、分支杆菌M.aurum、分支杆菌M.vaccae、分支杆菌M.chitae、分支杆菌M.fallax、分支杆菌M.Confluentis、分支杆菌M.flavescens、分支杆菌M.madagascariense、分支杆菌M.phlei、分支杆菌M.smegmatis、分支杆菌M.goodii、分支杆菌M.wolinskyi、分支杆菌M.thermoresistibile、分支杆菌M.gadium、分支杆菌M.komossense、分支杆菌M.obuense、分支杆菌M.sphagni、分支杆菌M.agri、分支杆菌M.aichiense、分支杆菌M.alvei、分支杆菌M.arupense、分支杆菌M.brumae、分支杆菌M.canariasense、分支杆菌M.chubuense、分支杆菌M.conceptionense、分支杆菌M.duvalii、分支杆菌M.elephantis、分支杆菌M.gilvum、分支杆菌M.hassiacum、分支杆菌M.holsaticum、分支杆菌M.immunogenum、分支杆菌M.massiliense、分支杆菌M.moriokaense、分支杆菌M.psychrotolerans、分支杆菌M.pyrenivorans、分支杆菌M.vanbaalenii、分支杆菌M.pulveris、分支杆菌M.arosiense、分支杆菌M.aubagnense、分支杆菌M.caprae、分支杆菌M.chlorophenolicum、分支杆菌M.fluoroanthenivorans、分支杆菌M.kumamotonense、分支杆菌M.novocastrense、分支杆菌M.parmense、分支杆菌M.phocaicum、分支杆菌M.poriferae、分支杆菌M.rhodesiae、分支杆菌M.seoulense和分支杆菌M.tokaiense。
7)根据项5和6所述的用途，其中所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌复合体中的任一种。
8)根据项5-7所述的用途，其中所述受试者是人。
9)根据项5-7所述的用途，其中所述受试者是非人动物。
10)编码根据项1所述的蛋白或根据项2和3所述的肽的分离的核酸分子。
11)包含根据项10所述的核酸分子的载体。
12)包含容器的试剂盒，所述容器包含至少一种根据第1、2、3、10、11项所述的蛋白质或肽或衍生的核酸序列
13)用于体外诊断受试者或动物中的分枝杆菌属物种感染的方法，所述方法包括在存在至少一种针对项1和2选择的生物标志物的情况下，培养包含来自所述受试者的淋巴细胞的血液样品。
14)用于通过对根据项1、3所述的蛋白质、肽或模拟表位的抗体特异性检测进行体外诊断的方法。
15)用于治疗或预防分枝杆菌种感染的疫苗，所述疫苗包含根据项1-4所选定的至少一种试剂或由其组成。
序列表
<110> 牛津免疫科技有限公司
<120> 结核分枝杆菌蛋白
<130> N406089WO
<150> BG 111804
<151> 2014-08-15
<150> BG 112045
<151> 2015-06-30
<160> 157
<170> PatentIn version 3.5
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Gly Ile Thr Trp Arg Val Ala Ala Thr Ser Ala Arg Ser Ala Arg Ser
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Pro
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Thr Gly Asp Ala Ala Ala Ala Thr Gln Val Pro Ala Gly Gln Thr Val
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Gly Gly Ile Thr Trp Arg Val Ala Ala Thr Ser Ala Arg Ser Ala
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Gly His Tyr Gly Leu Ala Thr Trp Phe Thr Arg Met Asp Ala Met Thr
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Ala Pro Thr
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His Ser Trp Gly Gly Met Leu Ala Gln Gln Tyr Val Leu Asp Lys Ala
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Ser Asp Phe Arg Ile Val Gly Asn Val Arg Asp Trp Asp
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Ala
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Cys
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<213> Mycobacterium tuberculosis
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Ser Arg Leu Ile Gly Ala Leu Thr Val Val Ala Ile Ile Val Thr Ala
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Cys Gly Ser Gln Pro Lys
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Val
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Leu Pro Ile Glu Glu Ile Asp Ala Ala Ala Ser Asp
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Gly Glu Val Ser Ser Ser Pro Gln Leu Pro Pro Arg Pro Phe Met Met
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Arg Pro Phe Met Met Pro His Thr Pro Ser Gly Gly
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Glu Ala Gly His Tyr Gly Leu Ala Thr Trp Phe Thr Arg
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Ala Ala Leu Ala Gly Asp Ala Ala Gly Ala Trp
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<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 63
Asp Thr Arg Thr His Pro His Asn Arg Ala His Thr
1 5 10
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 64
Arg Ala His Thr Asp Thr Met Gln Asn Ser Lys Pro Ala Arg
1 5 10
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 65
Val Tyr Arg Cys Asp Leu Gly Tyr Gly Ala Lys Pro Trp Leu Ile
1 5 10 15
<210> 66
<211> 14
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 66
His Thr Ala Asp Val Val Ala Val Arg Leu Thr Thr Thr Arg
1 5 10
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 67
Leu Thr Thr Thr Arg Arg Thr Ile Pro Thr Trp Val Ala
1 5 10
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 68
Tyr Leu Gly Glu Val Thr Pro Ala Thr Met Asn Lys Ile
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 69
Ala Leu Ala Thr Ala Leu Gly Leu Pro Trp
1 5 10
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 70
Gly Thr Ile Ala Val Pro Gly Gly Arg Val Trp Phe Gln Arg
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 71
Leu Pro His Asn Tyr Leu Ala Pro Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 72
Asn Ser Ala Cys Pro Ser Asp Val Asp Leu Trp Thr Met Asn Arg
1 5 10 15
<210> 73
<211> 14
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 73
Ala Glu Met Ala Thr Val Ala Glu Ala Leu Ala Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 74
Ala Glu Ala Leu Ala Leu Thr Arg Phe His Ile Phe Ser
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 75
Leu Thr Arg Phe His Ile Phe Ser His Ser Trp
1 5 10
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 76
Gly Met Leu Ala Gln Gln Tyr Val Leu Asp Lys
1 5 10
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 77
Leu Thr Ile Ala Asn Ser Thr Ala Ser Ile Pro Glu Phe Ser Ala
1 5 10 15
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 78
Ile Pro Glu Phe Ser Ala Ser Leu Val Ser Leu Lys
1 5 10
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 79
His Ser Ala Glu Tyr Gln Ala Ala Ile Arg Thr Trp
1 5 10
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 80
Arg Thr Trp Asn Glu Thr Tyr Leu Cys Arg Thr Arg Pro Trp
1 5 10
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 81
Glu Thr Tyr Leu Cys Arg Thr Arg Pro Trp Pro Arg
1 5 10
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 82
Arg Pro Trp Pro Arg Glu Leu Thr Glu Ala Phe Ala Asn Met
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 83
Thr Glu Ala Phe Ala Asn Met Gly Thr Glu Ile Phe
1 5 10
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 84
Phe Glu Thr Met Phe Gly Pro Ser Asp Phe Arg Ile
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 85
Leu Glu Phe Phe Glu Ser Ser Ser His Met Pro Phe
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 86
Met Pro Phe Ile Glu Glu Pro Ala Arg Phe
1 5 10
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 87
Asp Arg Val Met Arg Glu Phe Leu Arg Leu His Asp Ile
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 88
Ala Asn Leu Ala Ala Gly Thr Glu Ala Glu Pro Asn
1 5 10
<210> 89
<211> 20
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 89
Ala Ala Ala Ser Asp Asp Gly Glu Val Ser Ser Ser Pro Gln Leu Pro
1 5 10 15
Pro Arg Pro Phe
20
<210> 90
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 90
Ala Ala Gly Thr Glu Ala Glu Pro Asn Gln Ala Leu Gly
1 5 10
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 91
Asp Ile Asp Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Gln Pro Ser His Ala
1 5 10 15
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 92
Glu Ile Asp Ala Ala Ala Ser Asp Asp Gly Glu Val
1 5 10
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 93
Phe Met Met Pro His Thr Pro Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 94
Gly Glu Val Ser Ser Ser Pro Gln Leu Pro Pro Arg Pro Phe Met Met
1 5 10 15
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 95
Gly Thr Glu Ala Glu Pro Asn Gln Ala Leu Gly
1 5 10
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 96
Gly Trp Thr Glu Ala Asn Gln Ala Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 97
Met Thr Ile Asn Asn Gln Phe Asp Asp Ala Asp Thr His Gly Ala
1 5 10 15
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 98
Ser Val Pro Gln Gly Trp Thr Glu Ala Asn Gln
1 5 10
<210> 99
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 99
Thr Ile Asn Asn Gln Phe Asp Asp Ala Asp Thr His Gly
1 5 10
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 100
Trp Leu Pro Met Gln Asp Ile Asp Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 101
Lys Ser Thr Arg Arg Thr Cys Asn His Gly Gly
1 5 10
<210> 102
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 102
Val Ala Ala Thr Ser Ala Arg Ser Ala Arg Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 103
Met Ile Asp Asp Arg His Lys Ser Thr Arg Arg Thr
1 5 10
<210> 104
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 104
Ala Ala Leu Ala Gly Asp Ala Ala Gly Ala Trp Arg Thr
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 105
Ala Gly Arg Arg Thr Asp Pro Gln Leu Ala
1 5 10
<210> 106
<211> 22
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 106
Asp Thr Arg Thr His Pro His Asn Arg Ala His Thr Asp Thr Met Gln
1 5 10 15
Asn Ser Lys Pro Ala Arg
20
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 107
Gly Asp Pro Val Thr Ala Arg Gly Ala Lys Glu
1 5 10
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 108
Pro Leu Ala Gly Arg Arg Thr Asp Pro Gln Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 109
Arg Asp Thr Asn Gly Asp Pro Val Thr Ala Arg Gly
1 5 10
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 110
Arg Val Val Thr Asp Arg Asp Ser Gly Ala Gly Ala Leu
1 5 10
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 111
Thr Thr Gly Arg Pro Tyr Gln Leu Arg Asp Thr Asn Gly Asp Pro Val
1 5 10 15
Thr
<210> 112
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 112
Val Ala Arg Lys Leu Ala Glu Arg Thr Arg Val Thr Ile
1 5 10
<210> 113
<211> 16
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 113
Ala Met Gly Pro Ser Asp Pro Leu Thr Gly Tyr Val Asn Ala Asp Asn
1 5 10 15
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 114
Cys Asp Leu Gly Tyr Gly Ala Lys Pro Trp Leu Ile Val
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 115
Met Asn Ala Pro Leu Arg Gly Gln Val Tyr Arg
1 5 10
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 116
Ser Asn Asn Ala Arg Asn Arg His Thr Ala Asp
1 5 10
<210> 117
<211> 25
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 117
Leu Arg Gly Gln Val Tyr Gly Gly Glu Val Thr Pro Ala Thr Met Asn
1 5 10 15
Lys Ile Asn Gly Gly Val Ser Asn Asn
20 25
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 118
Leu Gly Tyr Arg Cys Asp Leu Gly Tyr Gly Ala Lys Gly Arg Leu Thr
1 5 10 15
Thr
<210> 119
<211> 20
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 119
Thr Thr Thr Arg Arg Thr Ile Pro Thr Trp Val Ala Met Gly Pro Ser
1 5 10 15
Asp Pro Leu Thr
20
<210> 120
<211> 18
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 120
Tyr Arg Cys Asp Gly Gly Gly Asp Gly Thr Leu Gly Lys Asp Glu Leu
1 5 10 15
Gly Asp
<210> 121
<211> 22
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 121
Met Glu Gly Thr Ile Ala Val Pro Gly Gly Arg Val Trp Phe Gln Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Asn Ser Ala
20
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 122
Met Gln Arg Ile Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Arg Arg Leu Ser Asp
1 5 10 15
Glu
<210> 123
<211> 26
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 123
Val Ser Leu Lys Ser Cys Leu Asp Val Ala Thr Arg Ser Ala Ile Asp
1 5 10 15
Arg Pro Glu Tyr Gln Ala Ala Ile Arg Thr
20 25
<210> 124
<211> 16
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 124
Glu Thr Tyr Leu Cys Arg Thr Arg Pro Trp Pro Arg Glu Leu Thr Glu
1 5 10 15
<210> 125
<211> 22
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 125
Met Glu Gly Thr Ile Ala Val Pro Gly Gly Arg Val Trp Phe Gln Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Asn Ser Ala
20
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 126
Met Gln Arg Ile Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Arg Arg Leu Ser Asp
1 5 10 15
Glu
<210> 127
<211> 26
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 127
Val Ser Leu Lys Ser Cys Leu Asp Val Ala Thr Arg Ser Ala Ile Asp
1 5 10 15
Arg Pro Glu Tyr Gln Ala Ala Ile Arg Thr
20 25
<210> 128
<211> 16
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 128
Glu Thr Tyr Leu Cys Arg Thr Arg Pro Trp Pro Arg Glu Leu Thr Glu
1 5 10 15
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 129
Asp Val Ala Thr Arg Ser Ala Ile Asp Arg His Glu
1 5 10
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 130
Gly Asn Val Arg Asp Trp Asp Val Val Asp Arg
1 5 10
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 131
Gly Arg Val Trp Phe Gln Arg Ile Gly Gly Gly Pro Gly Arg Pro Leu
1 5 10 15
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 132
His Met Arg Glu Met Gln Gly Arg Ile Ala Gly Ser
1 5 10
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 133
Met Arg Glu Met Gln Gly Arg Ile Ala Gly Ser Arg
1 5 10
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 134
Gln Leu Gly Cys Gly Asn Ser Ala Cys Pro Ser Asp
1 5 10
<210> 135
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 135
Gln Gln Tyr Val Leu Asp Lys Ala Pro Asp Ala Val Ser
1 5 10
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 136
Arg Glu Met Gln Gly Arg Ile Ala Gly Ser Arg
1 5 10
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 137
Thr Ala Cys Gly Ser Gln Pro Lys Ser Gln Pro Ala Val Ala Pro Thr
1 5 10 15
<210> 138
<211> 18
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 138
Thr Gln Val Pro Ala Gly Gln Thr Val Pro Ala Gln Leu Gln Phe Ser
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 139
<211> 14
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 139
Ser Ala Lys Thr Leu Asp Gly His Asp Phe His Gly Glu Ser
1 5 10
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 140
Met Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Pro Val Lys Thr Phe Thr Gln
1 5 10 15
<210> 141
<211> 21
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 141
Asn Phe Gly Val Thr Gln Gln Pro Ala Tyr Ala Phe Val Asp Pro His
1 5 10 15
Gly Asn Val Asp Val
20
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 142
His Gly Ala Thr Ser Asp Phe Trp
1 5
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 143
Glu Pro Asn Gln Ala Leu Gly Trp Leu Pro Met
1 5 10
<210> 144
<211> 13
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 144
Ser Ser Ser Pro Gln Leu Pro Pro Arg Pro Phe Met Met
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 145
Phe Met Met Pro His Thr Pro Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 146
His Tyr Gly Leu Ala Thr Trp Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 147
Glu Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Ala Val
1 5 10
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 148
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Val Asp Arg
1 5 10
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 149
Gln Leu Ala Ala Phe Tyr His Arg Leu
1 5
<210> 150
<211> 12
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 150
Ala Thr Ile Ala Val Ala Arg Lys Leu Ala Glu Arg
1 5 10
<210> 151
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 151
Thr Ile Thr Thr Gly Arg Pro Tyr Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 152
Thr Met Gln Asn Ser Lys Pro Ala Arg
1 5
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 153
Asp Leu Gly Tyr Gly Ala Lys Pro Trp Leu Ile
1 5 10
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 154
Gly Gly Arg Val Trp Phe Gln Arg
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 155
Asp Val Asp Leu Trp Thr Met Asn Arg
1 5
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 156
Thr Val Ala Glu Ala Leu Ala Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 157
Ser Thr Ala Ser Ile Pro Glu Phe Ser Ala
1 5 10

Claims (32)

1.用于在受试者中诊断结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis)复合体感染的方法，包括体外检测对以下一个或多个选项的免疫应答：(a)Rv0840c(SEQ ID NO:6)或其一种或多种片段；(b)TBFG_13463(SEQ ID NO:1)或其一种或多种片段；(c)Rv1677(SEQ ID NO:7)或其一种或多种片段；(d)Rv2654c(SEQ ID NO:3)或其一种或多种片段；(e)Rv3845(SEQ ID NO:4)或其一种或多种片段；(f)Rv1495(SEQ IDNO:5)或其一种或多种片段；和(g)Mtub2_17866(SEQ ID NO:2)或其一种或多种片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括体外检测对以下一个或多个选项的免疫应答：(i)Rv0840c(SEQ ID NO:6)或其一种或多种片段；(ii)TBFG_13463(SEQ ID NO:1)或其一种或多种片段；(iii)Rv1677(SEQ ID NO:7)或其一种或多种片段；(iv)Rv3845(SEQID NO:4)或其一种或多种片段；和(v)Rv2654c(SEQ ID NO:3)或其一种或多种片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括体外检测对Rv0840c(SEQ ID NO:6)或其一种或多种片段的免疫应答。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，进一步包括：体外检测对一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白的免疫应答。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白包括RD1蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RD1蛋白为CFP-10或ESAT-6。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，包括体外检测对一种或多种片段池的免疫应答，其中每个所述片段池包括衍生自以下各项的两个或两个以上片段：TBFG_13463(SEQ ID NO:1)、Mtub2_17866(SEQ ID NO:2)、Rv2654c(SEQ ID NO:3)、Rv3845(SEQID NO:4)、Rv1495(SEQ ID NO:5)、Rv0840c(SEQ ID NO:6)或Rv1677(SEQ ID NO:7)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，片段池中的所述片段形成的蛋白片段文库包含衍生所述片段的蛋白的至少80％序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，片段池中的所述片段形成的蛋白片段文库包含衍生所述片段的蛋白的全部序列。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，每个片段池包括序列重叠的片段。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述序列重叠11个氨基酸。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述一种或多种片段或所述两种或以上片段的长度为15个氨基酸。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述片段中的一种或多种包括衍生所述片段的蛋白的T细胞表位或B细胞表位。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述T细胞表位为CD4表位。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述T细胞表位为CD8表位。
16.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述免疫应答为体外细胞介导的免疫应答。
17.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述免疫应答为T细胞应答。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述T细胞应答是细胞因子分泌或T细胞增殖。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述细胞因子分泌是干扰素γ(IFNγ)分泌。
20.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答为B细胞应答。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述B细胞应答是抗体分泌或B细胞增殖。
22.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是针对如权利要求1所述的(a)至(g)中的一项或多项而生产抗体。
23.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括酶联免疫斑点检测(ELISPOT)。
24.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括将取自患者的免疫细胞种群与如权利要求1所述的(a)至(g)中的一项或多项接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法包括：体外检测对如权利要求1所述的(a)至(g)中的两个或两个以上选项的免疫应答，且将相同的所述免疫细胞种群与所述的(a)至(g)中的两个或两个以上选项相接触。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞种群还与如权利要求4至6中所述的一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白相接触。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法包括：体外检测对如权利要求1所述的(a)至(g)中的两个或两个以上选项的免疫应答，且将所述的(a)至(g)中的两个或两个以上选项中的每一种与不同的所述免疫细胞种群相接触。
28.根据权利要求24或27所述的方法，其特征在于，体外检测对如权利要求4至6中所述的一种或多种额外的结核分枝杆菌蛋白的免疫应答，且将每种所述额外的结核分枝杆菌蛋白与不同的所述免疫细胞种群相接触。
29.用于在受试者中诊断结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis)复合体感染的试剂盒，包括如权利要求8至15中任一项所述片段中的一种或多种。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测所述免疫应答的途径。
31.包含根据权利要求1所述的(a)至(g)中的一种或多种的组合物，用于在受试者中治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染。
32.用于在受试者中治疗或预防结核分枝杆菌复合体感染的方法，包括用根据权利要求1所述的(a)至(g)中的一个或多个选项向所述受试者给药。
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