RS60937B1 - Tri-segmentirani arenavirusi kao vektori za vakcinu - Google Patents

Tri-segmentirani arenavirusi kao vektori za vakcinu

Info

Publication number
RS60937B1
RS60937B1 RS20201251A RSP20201251A RS60937B1 RS 60937 B1 RS60937 B1 RS 60937B1 RS 20201251 A RS20201251 A RS 20201251A RS P20201251 A RSP20201251 A RS P20201251A RS 60937 B1 RS60937 B1 RS 60937B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
arenavirus
segment
tri
segmented
utr
Prior art date
Application number
RS20201251A
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel David Pinschewer
Doron Merkler
Sandra Margarete Kallert
Mario Kreutzfeldt
Abdelrahman Stephanie Gabrielle Darbre
Nicolas Jean Page
Original Assignee
Univ Geneve
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54545130&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60937(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Geneve filed Critical Univ Geneve
Publication of RS60937B1 publication Critical patent/RS60937B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/10011—Arenaviridae
    • C12N2760/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/10011—Arenaviridae
    • C12N2760/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/10011—Arenaviridae
    • C12N2760/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/10011—Arenaviridae
    • C12N2760/10061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/10062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/80—Vectors comprising a special translation-regulating system from vertebrates
    • C12N2840/85—Vectors comprising a special translation-regulating system from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
TRI-SEGMENTIRANI ARENAVIRUSI KAO VEKTORI ZA VAKCINU
[0001] Ova prijava zahteva prioriteta U.S. privremene prijave br. 62/079,493 koja je podneta 13 novembra, 2014.
1. UVOD
[0002] Predmetna prijava se odnosi na arenaviruse sa rearanžmanima u regionima otvorenog okvira čitanja ("ORF") u njihovim genomima. Posebno, ovde se opisuje modifikovani arenavirusni genomski segment, pri čemu je arenavirusni genomski segment modifikovan (dobijen inženjeringom) da nosi virusni ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu. Takođe su ovde opisane tri-segmentirane arenavirusne partikule koje se sastoje iz jednog L segmenta i dva S segmenta ili dva L segmenta i jednog S segmenta. Arenavirus, koji se ovde opisuje može da bude pogodan za vakcine i/ili lečenje bolesti i/ili za upotrebu u imunoterapijama.
2. STANJE TEHNIKE
2.1 Ispitivanje virusa limfocitnog horiomeningitisa i bolesti kod čoveka
[0003] Virus limfocitnog horiomeningitisa (LCMV), član familije arenaviridae, je prototipski mišji model virusa kod istraživanja virusnih infekcija. Od njegove izolacije tokom 1930-tih (Rivers i McNair Scott, 1935, Science, 81(2105): 439-440) ispitivanja u kojima se ovaj virus koristi su otkrila mnoge ključne koncepte u imunologiji i patogenezi virusa (pregled je predstavljen u Zinkemagel, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:1-5; Oldstone, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:83-117). LCMV je opsežno korišćen za ispitivanje molekularne biologije virusa i imunskih odgovora posebno u kontekstu uporne infekcije. Prirodni domaćin LCMV su miševi, međutim, nekoliko izveštaja je otkrilo da LCMV bi takođe mogao da bude zanemareni humani patogen (Barton, 1996, Clin. Infect. Dis, 22(1):197; Wright et al., 1997, Pediatrics 100(1): E9). Osim toga, brojni drugi članovi arenavirusne familije pronađeni su u populacijama glodara širom sveta. Pored arenavirusa starog sveta Lassa virusa (LASV), koji može da se pronađe u Africi, nekoliko arenavirusa Novog sveta sličnih Junin (JUNV), Guanarito ili Machupo su rasprostranjeni u raznolikim populacijama glodara Južne Amerike (Johnson et al., 1966, Am J Trop Med Hyg, 15(1): 103-106; Tesh et al., 1993, Am J Trop Med Hyg 49(2):227-235; Mills et al., 1994, Trop Med Hyg 51(5): 554-562). Nakon prenošenja na ljude, mnogi od ovih virusa mogu da uzrokuju virusnu hemoragijsku groznicu koja je povezana sa visokim mortalitetom (Geisbert and Jahrling, 2004, Nat Med 10(12 Suppl): S110-121).
2.2 Genomska organizacija virusa limfocitnog horiomeningitisa
[0004] Arenavirusi su virusi sa arc omotačima. Njihov genom se sastoji iz dva segmenta jednolančane RNK negativnog smisla (L: 7.2 kb, S: 3.4 kb). Svaki segment kodira za dva virusna gena u suprotnim orijentacijama. Kratak segment (S segment) kodira prekursor virusnog glikoproteina (GP) (GP-C; 75 kDa) i nukleoprotein (NP; 63 kDa) (Salvato et al., 1988, Virology 164(2): 517-522). Duži segment (L segment) eksprimira RNK-zavisnu RNK polimerazu (RdRp; L protein; približno 200 kDa) i protein Z matriksa (protein Z), „RING finger“ protein (11 kDa) (Sl.1A) (Salvato et al., 1988, Virology 164(2): 517-522). GP prekursor GP-C se post-translaciono cepa u GP-1 i GP-2, koji ostaju ne-kovalentno povezani (Buchmeier and Oldstone 1979, Virology 99(1): 111-120). Trimeri GP-1 i GP-2 su sastavljeni kao šiljci na površini viriona i ključni su za posredovanje ulaza u ćelije domaćina interakcijom sa receptorima na ćelijskoj površini. Dugo se tvrdilo da je vezivanje i ulaz virusa u ćelije domaćina posredstvom interakcije LCMV GP sa ćelijskim receptorom α-Distroglikanom kao jednim ćelijskim receptorom za LCMV (Cao et al., 1998, Science, 282(5396):2079-2081). Nedavno su se pojavilia tri dodatna humana molekula (Axl i Tyro3 iz TAM familije i intraćelijski adhezioni molekul 3 specifičan za dendritične ćelije-koji hvata neintegrin) su postavljeni kao dodatni receptori za LCMV i LASV, u bliskoj vezi sa LCMV, koji omogućava ulaz LCMV u ćelije nezavisno od α-Distroglikana (Shimojima i Kawaoka 2012, J Vet Med, 74(10):1363-1366; Shimojima et al., 2012, J Virol 86(4):2067-2078). NP se vezuje za virusnu RNK, čime se obrazuje nukleokapsid, koji služi kao matrica za virusni L protein. Nukleokapsid koji je povezan sa virusnim L proteinom obrazuje takozvani ribonukleoproteinski kompleks, koji je aktivan i u replikaciji i transkripciji i predstavlja minimalnu jedinicu virusne infektivnosti. Pokazano je da, NP i L protein su minimalni faktori sa trans delovanjem koji su neophodni za transkripciju i replikaciju virusne RNK (Lee et al., 2000, J Virol 74(8): 3470-3477). Dva gena na svakom segmentu su razdvojena sa ne-kodirajućim intergenskim regionom (IGR) i ograničena su sa 5’ i 3’ netranslatirajućim regionima (UTR). IGR obrazuje stabilnu strukturu ukosnice i pokazano je da je uključeno u obrazovanje strukturno zavisne terminacije transkripcije virusne iRNK (Pinschewer et al., 2005, J Virol 79(7): 4519-4526). Terminalni nukleotidi UTR pokazuju visok strepen komplementarnosti, što za rezultat ima obrazovanje sekundarnih struktura. Ove „panhandle“ strukture su poznate da služe kao virusni promotori za transkripciju i replikaciju, i njihovu analizu sa mutagenezom koja je usmerena prema mestu je otkrilo sekvence - i zavisnost od strukture, ne tolerišući pri tome ni manje promene u sekvenci (Perez and de la Torre, 2003, Virol 77(2): 1184-1194).
2.3 Reverzni genetički sistem
[0005] Izolovane i prečišćene RNK virusa negativnog lanca slične LCMV ne mogu direktno da služe kao iRNK tj., ne mogu da se translatiraju u proteine kada se uvedu u ćelije. Shodno tome, transfekcija ćelija sa virusnom RNK ne vodi do proizvodnje infektivnih virusnih partikula. Da bi se dobile infektivne virusne partikule RNK virusa negativnih lanaca iz cDNK u kultivisanim permisivnim ćelijama, segment(i) virusne RNK moraju da budu trans-dopunjeni sa minimalnim faktorima koji su potrebni za transkripciju i replikaciju. Uz pomoć sistema minigenoma koji je objavljen pre nekoliko godina, virusni elementi koji imaju cis-delovanje i faktori sa trans delovanjem koji su uključeni u transkripciju, replikaciju i obrazovanje virusnih partikula mogu konačno da budu analizirane (Lee et al., 2000, J Virol 74(8): 3470-3477; Lee et al., 2002, J Virol 76(12): 6393-6397; Perez and de la Torre 2003, J Virol 77(2): 1184-1194; Pinschewer et al., 2003, J Virol 77(6): 3882-3887; Pinschewer et al., 2005, J Virol 79(7): 4519-4526.). Takođe za druge arenaviruse slične LASV i Tacaribe virusni reverzni genetički sistemi su uspostavljeni (Lopez et al., 2001, J Virol 75(24): 12241-12251; Hass et al., 2004, J Virol 78(24): 13793-13803). Dve objave su pokazale oporavak infektivnog LCMV u potpunosti od cDNK upotrebom pol-I/-II ili T7/pol-II-vođenih plazmida, redom (koji su naznačeni sa "virusnim spasavanjem") (Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A 103(12): 4663-4668; Sanchez and de la Torre, 2006, Virology 350(2): 370-380).
2.4 Rekombinantni LCMV koji eksprimira gene od interesa
[0006] Generacija rekombinantnih RNK virusa sa negativnim lancem koji eksprimiraju strane gene od interesa se sprovodi već duže vreme. Različite strategije su objavljene za druge viruse (Garcia-Sastre et al., 1994, J Virol 68(10): 6254-6261; Percy et al., 1994, J Virol 68(7): 4486-4492; Flick and Hobom, 1999, Virology 262(1): 93-103; Machado et al., 2003, Virology 313(1): 235-249). U prošlosti je pokazano da je moguće uvesti dodatne strane gene u genom bi-segmentiranih LCMV partikula (Emonet et al., 2009, PNAS, 106(9):3473-3478). Dva strana gena od interesa su insertovana u bisegmentirani genom LCMV, pri čemu se dobijaju tri-segmentirane LCMV partikule (r3LCMV) sa dva S segmenta i jednim L segmentom. U tri-segmentiranom virusu, objavljeno od strane Emonet et al., (2009), oba NP i GP su držana u njihovim respektivnim prirodnim položajima u S segmentu i prema tome su eksprimirana pod njihovim prirodnim promotorima u bočnom UTR (Sl. 1B). Međutim, predmetna prijava otkriva da tri-segmentirana LCMV partikula koja je prikazana od strane Emonet et al., se sastavlja predominantno u bi-segmentirane partikule (tj., arenavirus pakuje samo jedan umesto dva S segmenta), što rezultira oslabljenim rastom i snažnim selekcionim pritiskom da se rekombinuju dva S segmenta. Kao što je dalje prikazano u predmetnom pronalasku, takva rekombinacija je reprodukibilno pronađena i rezultuje u reverziji fenotipa ka virusu divljeg tipa i gubitku transgena.
2.5 Arenavirus koji je defektan za replikaciju
[0007] Nedavno je pokazano da infektivna arenavirusna partikula može da bude konstruisana da sadrži genom sa sposobnostima za umnožavanje i eksprimiranje njegovog genetičkog materijala u inficiranim ćelijama ali nisu sposobne da proizvedu dalje potomstvo kod normalnih, ćelija koje nisu pod uticajem genetičkog inženjeringa (tj., infektivna, arenavirusna partikula koja je deficijentna za replikaciju) (Međunarodna objava br.: WO 2009/083210 A1 i Međunarodna objava br.: WO 2014/140301 A1).
3. SUŠTINA PRONALASKA
[0008] Predmetna prijava, se odnosi na arenaviruse sa rearanžmanima u njihovim ORF-a u njihovim genomima. Posebno, predmetna prijava se odnosi na arenavirusni genomski segment koji je konstruisan da nosi arenavirusni ORF u položaju koji nije položaj u divljem tipu. Predmetna prijava takođe obezbeđuje tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta ili dva L segmenta i jednog S segmenta koji se ne rekombinuju u bi-segmentiranu arenavirusu partikulu koja je kompetentna za replikaciju. Predmetna prijava pokazuje da trisegmentirana arenavirusna partikula može da bude konstruisana tako da unapredi genetičku stabilnost i da osigura trajnu ekspresiju transgena.
[0009] Pronalazak obezbeđuje tri-segmentiranu infektivnu i kompetentnu za replikaciju arenavirusnu partikulu koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta, pri čemu jedan od dva S segmenta je izabran iz grupe koja se sastoji iz:
(i) S segmenta, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) S segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) S segment, pri čemu ORF koji kodira L je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i
(vi) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR, pri čemu tri-segmentirana virusna partikula sadrži dva heterologna ORF-a.
[0010] Pronalazak obezbeđuje tri-segmentiranu infektivnu i kompetentnu za replikaciju arenavirusnu partikulu koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta, pri čemu jedan od dva L segmenta je izabran iz grupe koja se sastoji iz:
(i) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) L segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i
(vi) L segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR, pri čemu tri-segmentirana virusna partikula sadrži dva heterologna ORF-a.
[0011] Dalje, pronalazak obezbeđuje cDNK iz genoma iz tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje DNK ekspresioni vektor koji se sastoji iz cDNK.
[0012] Dalje, postupak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji iz tri-segmentirane arenavirusne partikule, cDNK, ili vektora iz pronalaska.
[0013] Dalje, pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska, pri čemu postupak obuhvata:
(i) transfekciju u ćeliju domaćina jednu ili više cDNK iz jednog L segmenta i dva S segmenta;
(ii) održavanja ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i
(iii) sakupljanja arenavirusne partikule.
[0014] Dalje, pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska, pri čemu postupak obuhvata:
(i) transfekciju u ćeliju domaćina jednu ili više cDNK iz dva L segmenta i jednog S segmenta;
(ii) održavanja ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i
(iii) sakupljanja arenavirusne partikule.
[0015] Dalje, pronalazak obezbeđuje vakcinu koja se sastoji iz tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosača.
[0016] Konačno, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji iz tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosača.
[0017] U određenim izvođenjima, virusni vektor kao što je ovde obezbeđeno je infektivan, tj., sposoban je za ulazak u ili ubrizgavanje svog genetskog materijala u ćeliju domaćina. U određenim specifičnijim izvođenjima, virusni vektor kao što je ovde obezbeđeno je infektivan, tj., sposoban je za ulazak u ili ubrizgavanje svog genetskog materijala u ćeliju domaćina nakon čega sledi umnožavanje i ekspresija njegove genetičke informacije unutar ćelije domaćina. U određenim primerima, virusni vektor je infektivan, deficijentan za replikaciju arenavirusni virusni vektor koji je konstruisan da sadrži genom sa sposobnošću umnožavanja i eksprimiranja njegove genetičke informacije u inficiranim ćelijama ali nije sposoban dalje da proizvede potomstvo infektivnih partikula u normalnim, ćelijama koje nisu dobijene genetičkim inženjeringom. U određenim izvođenjima, infektivni arenavirusni virusni vektor je kompetentan za replikaciju i sposoban je dalje da proizvodi potomstvo infektivnih partikula u normalnim, ćelijama koje nisu dobijene genetičkim inženjeringom. U određenim specifičnijim izvođenjima, takav virusni vektor koji je kompetentan za replikaciju je atenuisan u odnosu na virus divljeg tipa iz koga je dobijen virusni vektor koji je kompetentan za replikaciju.
3.1 Ne-prirodni otvoreni okvir čitanja
[0018] U određenim izvođenjima, genomski segment je konstruisan da nosi virusni ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu. U nekim izvođenju, arenavirusni genomski segment je izabran iz grupe koja se sastoji iz:
(i) S segmenta, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) S segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(vi) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(vii) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(viii) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ix) L segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(x) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(xi) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i
(xii) L segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
[0019] U nekim izvođenjima, arenavirusni 3 ’UTR je 3’ UTR arenavirusnog S segmenta ili arenavirusnog L segmenta. U određenim izvođenjima, arenavirusni 5’ UTR je 5’ UTR arenavirusnog S segmenta ili arenavirusnog L segmenta.
[0020] Ovde je takođe obezbeđena izolovana cDNK ovde obezbeđenog arenavirusnog genomskog segmenta. Ovde je takođe obezbeđen, DNK ekspresioni vektor koji se sastoji iz cDNK arenavirusnog genomskog segmenta.
[0021] Ovde je takođe obezbeđena, ćelija domaćina koja se sastoji iz arenavirusnog genomskog segmenta, cDNK arenavirusnog genomskog segmenta, ili vektor koji se sastoji iz cDNK arenavirusnog genomskog segmenta.
[0022] Ovde je takođe prikazana, arenavirusna partikula koja se sastoji iz arenavirusnog genomskog segmenta i drugog arenavirusnog genomskog segmenta tako da arenavirusna partikula obuhvata S segment i L segment.
[0023] U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula je infektivna i kompetentna za replikaciju. U nekim izvođenjima, arenavirusna partikula je atenuisana. U drugim primerima, arenavirusna partikula je infektivna ali nije sposobna da dalje proizvodi infektivno potomstvo u ne-komplementarnim ćelijama.
[0024] U određenim izvođenjima, najmanje jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen ili je funkcionalno inaktivisan.
[0025] U određenim izvođenjima, najmanje jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein i L protein je izbačen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugim izvođenjima, samo jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein i L protein je izbačen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U specifičnijem izvođenju, ORF koji kodira GP je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugim izvođenjima, ORF koji kodira NP je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U nekim izvođenjima, ORF koji kodira Z protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugim izvođenjima, ORF koji kodira L protein je izbačen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0026] U određenim izvođenjima, heterologni ORF kodira reporterski protein. U nekim izvođenjima, heterologni ORF kodira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, tumora, ili alergena. U drugim izvođenjima, heterologni ORF koji kodira antigen je izabran od antigena virusa humane imunodeficijencije, antigena virusa hepatitisa C, površinskog antigena hepatitisa B, antigena varičela zoster virusa, antigena citomegalovirusa, antigena poreklom mycobacterium tuberculosis, i antigena koji su povezani su tumorom.
[0027] U određenim izvođenjima, rast ili infektivnost arenavirusne partikule nije pogođena sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0028] Ovde je takođe obezbeđen postupak za proizvodnju arenavirusnog genomskog segmenta. U određenim izvođenjima, postupak obuhvata prepisivanje cDNK arenavirusnog genomskog segmenta.
[0029] Ovde je takođe prikazan postupak za dobijanje arenavirusne partikule. U određenim izvođenjima postupak za dobijanje arenavirusne partikule obuhvata:
(i) transfekciju u ćeliju domaćina cDNK arenavirusnog genomskog segmenta;
(ii) transfekciju u ćeliju domaćina plazmida koji se sastoji iz cDNK drugog arenavirusnog genomskog segmenta;
(iii) održavanja ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i
(iv) sakupljanja partikula arenavirusa.
[0030] U određenim izvođenjima, transkripcija L segmenta i S segmenta se izvodi pomoću bidirekcionog promotora.
[0031] U određenim izvođenjima, postupak dalje sadrži transfekciju u ćeliju domaćina jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju polimerazu arenavirusa. U još specifičnijim izvođenjima, polimeraza je L protein. U drugim izvođenjima, postupak dalje sadrži transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju NP.
[0032] U određenim izvođenjima, transkripcija L segmenta, i S segmenta su svaki pod kontrolom promotora koji je izabran iz grupe koja obuhvata:
(i) promotor RNK polimeraze I;
(ii) promotor RNK polimeraze II; i
(iii) promotor T7.
[0033] U drugom primeru, ovde je obezbeđena vakcina koja se sastoji iz arenavirusne partikule, pri čemu najmanje jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen ili je funkcionalno inaktivisan; ili pri čemu najmanje jedan ORF koji kodira GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz drugog organizma koji nije arenavirus; ili pri čemu samo jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U specifičnijim izvođenjima, vakcina dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0034] U drugom primeru, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz arenavirusne partikule, pri čemu najmanje jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen ili je funkcionalno inaktivisan; ili pri čemu najmanje jedan od ORF koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz drugog organizma koji nije arenavirus; ili pri čemu samo jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U specifičnijim izvođenjima, farmaceutski prihvatljiv nosač dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0035] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segment ili arenavirusna partikula je dobijena od LCMV. U nekim izvođenjima, arenavirusni genomski segment ili arenavirusna partikula je dobijena od LCMV MP soja, soja Armstrong, ili soja Armstrong Klon 13 . U drugim sojevima, arenavirusni genomski segment ili arenavirusna partikula je dobijena od Junin virusne vakcine Candid #1, ili Junin virusne vakcine soja XJ Klon 3.
3.2 Tri-segmentirani arenavirus
[0036] U jednom aspektu, ovde je obezbeđena tri-segmentirana arenavirusna partikula koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta. U nekim izvođenjima, propagacija tri-segmentirane arenavirusne partikule ne dovodi do kompetentne za replikaciju bi-segmentirane viralne partikule posle 70 dana uporne infekcije kod miševa kojima nedostaje receptor interferona tipa I, receptor interferona tipa II i gena za aktivaciju rekombinacije 1 (RAG1), i koji su bili inficirani sa 10<4>PFU tri-segmentirane arenavirusne partikule. U određenim izvođenjima, inter-segmentalna rekombinacija dva S segmenta, ujedinjujući dva arenavirusna ORF-a na jednom umesto dva razdvojena segmenta, ukida aktivnost virusnog promotora.
[0037] U drugom aspektu, ovde je obezbeđena tri-segmentirana arenavirusna partikula koja sadrži dva L segmenta i jedan S segment. U određenim izvođenjima, propagacija tri-segmentirane arenavirusne partikule ne dovodi do kompetentne za replikaciju bi-segmentirane virusne partikule posle 70 dana uporne infekcije kod miševa kojima nedostaje receptor interferona tipa I, receptor interferona tipa II i gena za aktivaciju rekombinacije 1 (RAG1), i koji su bili inficirani sa 10<4>PFU trisegmentirane arenavirusne partikule. U određenim izvođenjima, inter-segmentalna rekombinacija dva L segmenta, ujedinjujući dva arenavirusna ORF-a na jednom umesto dva razdvojena segmenta, ukida aktivnost virusnog promotora.
[0038] U određenim izvođenjima, jedan od dva S segmenta je izabran iz grupe koja obuhvata:
(i) S segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR
(ii) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) S segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i (vi) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
[0039] U određenim izvođenjima, jedan od dva L segmenta je izabran iz grupe koja obuhvata:
(i) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) L segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i
(vi) L segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
[0040] U određenim izvođenjima, 3’ UTR tri-segmentirane arenavirusne partikule je 3’ UTR arenavirusnog S segmenta ili arenavirusnog L segmenta. U drugim izvođenjima, 5’ UTR trisegmentirane arenavirusne partikule je 5’ UTR arenavirusnog S segmenta ili arenavirusnog L segmenta.
[0041] U određenim izvođenjima, dva S segmenta sadrže jedan ili dva heterologna ORF-a iz organizma koji nije arenavirus.
[0042] U određenim izvođenjima, dva L segmenta sadrže jedan ili dva heterologna ORF-a iz organizma koji nije arenavirus.
[0043] U određenim izvođenjima, heterologni ORF kodira antigen koji se dobija iz infektivnog organizma, tumora, ili alergena. U drugim izvođenjima, heterologni ORF koji kodira antigen je izabran iz antigena virusa humane imunodeficijencije, antigena virusa hepatitisa C, površinskog antigena hepatitisa B, antigena virusa varičela zoster, antigena citomegalovirusa, antigena mycobacterium tuberculosis, i antigena koji su povezani sa tumorom.
[0044] U određenim izvođenjima, najmanje jedan heterologni ORF kodira fluorescentni protein. U drugim izvođenjima fluorescentni protein je zeleni fluorescentni protein (GFP) ili crveni fluorescentni protein (RFP).
[0045] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula sadrži sva četiri arenavirusna ORF-a. U nekim izvođenjima tri-segmentirana arenavirusna partikula je infektivna i kompetentna je za replikaciju.
[0046] U određenim primerima, tri-segmentiranoj arenavirusnoj partikuli nedostaje jedan ili više od četiri arenavirusna ORF-a. U drugim primerima, tri-segmentirana arenavirusna partikula je infektivna ali nije sposobna dalje da proizvodi infektivno potomstvo u ne-komplementarnim ćelijama.
[0047] U određenim primerima, tri-segmentiranoj arenavirusnoj partikuli nedostaje jedan od četiri arenavirusna ORF-a, pri čemu tri-segmentirana arenavirusna partikula je infektivna ali nije sposobna dalje da proizvodi infektivno potomstvo u ne-komplementarnim ćelijama.
[0048] U nekim primerima, tri-segmentiranoj arenavirusnoj partikuli nedostaje GP ORF.
[0049] U daljem aspektu, ovde je obezbeđena tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta. U određenim izvođenjima, prvi S segment je dizajniran da nosi ORF koji kodira GP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR i ORF koji kodira prvi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR. U nekim izvođenjima, drugi S segment je dizajniran da nosi ORF koji kodira NP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR i ORF koji kodira drugi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR.
[0050] U još drugom aspektu, ovde je obezbeđena, tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta. U određenim izvođenjima, prvi S segment je dizajniran da nosi ORF koji kodira GP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR i ORF koji kodira prvi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR. U nekim izvođenjima, drugi S segment je dizajniran da nosi ORF koji kodira NP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR i ORF koji kodira drugi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
[0051] U određenim izvođenjima, gen od interesa kodira antigen koji se dobija od infektivnog organizma, tumora, ili alergena. U drugim izvođenjima, gen od interesa kodira antigen koji je izabran od antigena virusa humane imunodeficijencije, antigena virusa hepatitisa C, površinskog antigena hepatitisa B, antigena virusa varičela zoster, antigena citomegalovirusa, antigena poreklom iz mycobacterium tuberculosis, i antigena koji su povezani sa tumorom. U još drugom izvođenju, najmanje jedan gen od interesa kodira fluorescentni protein. U specifičnom izvođenju, fluorescentni protein je GFP ili RFP.
[0052] Ovde je takođe obezbeđena izolovana cDNK genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule. Ovde je takođe obezbeđen, DNK ekspresioni vektor koji se sastoji iz cDNK genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule. Ovde su takođe obezbeđeni jedan ili više DNK ekspresionih vektora koji obuhvataju ili individualno ili u njihovoj ukupnosti cDNK tri-segmentiranog arenavirusa.
[0053] Ovde je takođe obezbeđena, ćelija domaćina koja sadrži tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu, cDNK genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule, ili vektor koji se sastoji iz cDNK genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule.
1
[0054] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula je atenuirana
[0055] Ovde je takođe obezbeđen postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule. U određenim izvođenjima postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule obuhvata: (i) transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više cDNK molekula iz jednog L segmenta i dva S segmenta;
(ii) održavanja ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i
(iii) sakupljanja arenavirusne partikule.
[0056] Ovde je takođe obezbeđen postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule. U određenim izvođenjima postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule obuhvata: (i) transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više cDNK molekula iz dva L segmenta i jednog S segmenta;
(ii) održavanje ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za obrazovanje virusa; i
(iii) sakupljanje arenavirusne partikule.
[0057] U određenim izvođenjima, transkripcija jednog L segmenta i dva S segmenta se izvodi pomoću bidirekcionog promotora. U nekim izvođenjima, transkripcija dva L segmenta i jednog S segmenta se izvodi upotrebom bidirekcionog promotora.
[0058] U određenim izvođenjima, postupak dalje obuhvata transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju polimerazu arenavirusa. U još specifičnijim izvođenjima, polimeraza je L protein. U drugim izvođenjima, postupak dalje obuhvata transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju NP protein.
[0059] U određenim izvođenjima, transkripcija jednog L segmenta, i dva S segmenta su svaki pod kontrolom promotora koji je izabran iz grupe koja obuhvata:
(i) promotor RNK polimeraze I;
(ii) promotor RNK polimeraze II; i
(iii) promotor T7.
[0060] U određenim izvođenjima, transkripcija dva L segmenta, i jednog S segmenta su svaka pod kontrolom promotora koji je izabran iz grupe koja obuhvata:
(i) promotor RNK polimeraze I;
(ii) promotor RNK polimeraze II; i
(iii) promotor T7.
[0061] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikla je istog tropizma kao bisegmentirana arenavirusna partikula. U drugim primerima, tri-segmentirana arenavirusna partikula je deficijentna za replikaciju.
[0062] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena vakcina koja sadrži tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0063] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži trisegmentiranu arenavirusnu partikulu i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0064] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula je dobijena iz LCMV. U nekim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula je dobijena iz LCMV MP soja, Armstrong soja, ili Armstrong Klon 13 soja. U drugim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula je dobijena od Junin virus vakcine Candid #1, ili Junin virus vakcine XJ Klon 3 soja.
3.3 Konvencije i Skraćenice
4. KRATAK OPIS SLIKA
[0065]
Slika 1: Rekombinantni tri-segmentirani virusi pokazuju narušen rast u poređenju sa divljim tipom LCMV nezavisno od položaja GP ORF u genomu. (A-C) Šematski prikaz organizacije genoma bi- i trisegmentiranog LCMV. Bi-segmentirani genom LCMV divljeg tipa se sastoji iz jednog S segmenta koji kodira GP i NP i jednog L segmenta koji kodira za Z protein i L protein (A). Oba segmenta su ograničena sa odgovarajućim 5’ i 3’ UTR-a. Genom rekombinantnih tri-segmentiranih LCMV-a (r3LCMV) sastoji se iz jednog L i dva S segmenta sa jednim položajem gde da se insertuje gen od interesa (ovde GFP) u svaki od S segmenata. (B) r3LCMV- GFP<natural>(nat) ima sve virusne gene u njihovom prirodnom položaju pri čemu GP ORF u r3LCMV-GFP<artificial>(art) je veštački suprotstavljen sa i eksprimira se pod kontrolom 3’ UTR (C). (D) Kinetike rasta naznačenih virusa u BHK-21 ćelijama, koji je inficiran na multiplicitetu infekcije (moi) od 0.01 (divlji tip LCMV: sivi trouglići; r3LCMV-GFPnat: crni kružići; r3LCMV-GFart: beli kvadratići). Supernatant je uziman u naznačenim vremenskim tačkama posle infekcije i virusni titri su određivani „focus forming assay“. Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM tri replikata po grupi. Barovi greške su sakriveni u veličini simbola.
Slika 2: Preparati tri-segmeniranog virusa koji sadrže većinu bi-segmentiranih deficijentnih za replikaciju partikula (r2LCMV). (A) r2LCMV (beli barovi), r3LCMV-GFPIRFP<art>(crni barovi, GFP-GP, RFP-NP) i r3LCMV-GFP/RFP<nat>(sivi barovi, GP-GFP, RFP-NP) koje su gajene u divljem tipu BHK-21 ćelija i infektivnost supernatanta je određena na divljem tipu ne-komplementarnih BHK-21 ćelija (BHK21), GP-eksprimirajućim (BHK-GP) ili NP-eksprimirajućim (BHK-NP) BHK-21 ćelijama. Titri na BHK-21 i BHK-GP ćelijama su određeni bojenjem NP-pozitivnih virusnih mesta od interesa. Titri na NP-komplementarnim BHK-21 ćelijama su određeni brojanjem GP-pozitivnih mesta od interesa. Titri su normalizovani sa srednjom vrednosti titra koja je dobijena kada je ispitana na BHK-21 ćelijama, i prema tome su eksprimirane kao njihov umnožak. Barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM šest replikata po grupi. ns.: nije statistički značajno (p ≥ 0.05); **: p < 0.01 sa 1-way ANOVA koji prati Dunnett-ov post-test upotrebom r2LCMV kao reference. (B) r2LCMV (levi grafik plot) ili r3LCMV-GFP/RFP<art>(srednji i desni grafik) su gajeni na divljem tipu BHK-21 ćelija (BHK21; levi i srednji grafik ) ili BHK-21 ćelijama koje eksprimiraju (BHK-NP, desni grafik) i fluorescencija je procenjena 12 h posle infekcije sa protočnom citometrijom. r2LCMV inficirane ćelije su korišćene kao kontrola za postavljanje gejtova. Jedan reprezentativni grafik po stanju je prikazan. (C) Kvantifikovanje GFP+, RFP+ ili GFP+RFP+ dvostruko pozitivnih ćelija 12 h posle infekcije sa r3LCMV-GFP/RFP<art>na BHK-21 ili BHK-NP ćelijama. Barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM tri replikata po grupi. ns.: nije statistički značajno (p ≥ 0.05); ***: p < 0.001 sa neuparenim dvosmernim studentovim t testom.
Slika 3: Dizajn i kinetike rasta rekombinantnih tri-segmentiranih virusa koji nose parcijalno kodonoptimizovani GP ORF ili genetički tag u IGR S segmenta. (A) Šematski prikaz genetski modifikovanog S segmenta pri čemu 255 C-terminalni bazni parovi GP su kodon-optimizovani i NP je zamenjen za GFP (GP ORF je naznačen sa "WE/WET"). Kinetike rasta tri-segmentiranog r3LCMV-WEWET/GFP<nat>koji se sastoji iz dva S i jednog L segmenta kao što je detaljno prikazano na Sl.1B, sa modifikacijom S segmenta koji nosi GP kao što je prikazano pod (A) su sprovedeni na BHK-21 ćelijama. Supernatant je uziman u naznačenim vremenskim tačkama posle infekcije na moi = 0.01 i virusni titri su određivani sa „focus forming assay“ (B). Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM tri replikata po grupi. Barovi greške su sakriveni u veličini simbola. (C) Šematski prikaz S segmenta koji kodira NP pri čemu jedan bazni par IGR je uklonjen da bi se genetički "tagovao" ovaj ne-kodirajući RNK element. Uklonjeni G ostatak (naznačen sa strelicom) se nalazi izvan kritične strukture petlja
1
drška IGR. Komparativne kinetike rasta tri-segmentiranih virusa sa ili bez genetičkog taga u IGR S segmenta koji kodira NP (r3LCMV-GFPnat: crni kružići; r3LCMV-GFP<nat>IGR*: beli kružići) su izvedeni na BHK-21 ćelijama na moi od 0.01. Supernatant je sakupljen na naznačenim vremenskim tačkama posle infekcije i virusni titri su određeni sa „focus forming“ testom. Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM tri replikata po grupi. Reprezentativni podaci jednog od dva nezavisna eksperimenta su prikazani.
Slika 4: r3LCMV-GFP<nat>ali ne r3LCMV-GFP<art>uporna infekcija kod imunodeficijentnih miševa dostiže nivoe viremije koji su ekvivalentni sa bi-segmentiranim virusom divljeg tipa i rezultuje u gubitku ekspresije GFP. (A) AGRAG miševi su intravenozno inficirani sa 1x10<4>PFU od r3LCMV-GFP<nat>(crni kružići), r3LCMV-GFP<art>(beli kvadrati) kontrolnog bi-segmentiranog r2LCMV (sivi trouglići) i viremija je praćena tokom vremena. Simboli predstavljaju srednju vrednost ±SEM 3-7 miševa po grupi. (B) nat LCMV viremija u danu 127 posle intravenozne infekcije AGRAG miševa sa 1x10<4>PFU r3LCMV-GFP ili r3LCMV-GFP<art>je prikazana. Testovi imunofokusiranja su izvedeni da bi se detektovao ili nukleoprotein NP (sivi kružići) ili GFP (beli kružići). Simboli predstavljaju individualne miševe. ns.: nije statistički značajno (p ≥ 0.05); ***: p < 0.001 (neuparen dvosmerni studentov t test). (C-E) Krv nat
iz AGRAG miševa koji su inficirani sa r3LCMV-GFP , r3LCMV-GFP<art>ili r2LCMV je analizirana u danu 120 nakon infekcije sa protočnom citometrijom za prisustvo GFP+ ćelija. Monociti i Makrofagi su identifikovani upotrebom strategije postavljanja gejtova kao što je naznačeno u (C). Jedan primer FACS grafika za svaku grupu i jedan primer histograma koji se preklapaju ekspresiju GFP je prikazana u (D). (E) Kvantifikovanje GFP+ populacije unutar populacije CD11b+GR1-monocita/makrofaga. Simboli predstavljaju individualne miševe.
Slika 5: r3LCMV-GFP<nat>uporna infekcija miševa rezultuje u rekombinaciji S-segmenta i gubitku funkcionalnih transgena pune dužine. Virusna RNK je izolovana iz seruma AGRAG miševa u danu 127 nakon intravenozne infekcije sa 1x10<4>PFU r3LCMV-GFP<nat>ili r3LCMV-GFPart . Virusna RNK je reverzno transkribovana i cDNK koja nosi oba NP kao i GP sekvence je umožena pomoću PCR sa odgovarajućim prajmerima koji su specifični za gen. (A) Elektroforeza DNK PCR proizvoda koji su dobijeni nakon (+RT, trake 1-8) sa ili bez prethodne reverzne transkripcije matrice RNK (-RT, negativna kontrola, trake 9-12). Serum netretirane životinje se uzima kao odvojena negativna kontrola (n, traka 8) i plazmidna DNK koja kodira LCMV S segment divljeg tipa kao pozitivna kontrola (p, traka 17). Amplikoni traka 1-3 su izloženi Sanger-ovom sekvenciranju. (B) Representativna sekvenca cDNK koja je dobijena iz životinje #3 (r3LCMV-GFP<nat>#3) je pokazala da rekombinantni S segment koji kombinuje NP i GP sekvence, dva IGRs (masnim slovima) i C-terminalnu GFP porciju (naznačeno sivom bojom) (SEQ ID NO: 17). (C) Šematski prikaz tri rekombinantne sekvence virusnog S segmenta izolovane u danu 127 posle infekcije, svaka od njih dominira virusnom populacijom u jednom reprezentativnom AGRAG mišu. Tagovani IGR koji je poreklom od S segmenta koji nosi NP je obeležen sa zvezdicom (*). Potez koji je sekvenciran je naznačen sa dvostrukom strelicom (<-->). Oznake dužine baznog para (bp) opisuju gore navedeni ostatak GFP i prekinute (skraćene) IGR elemente.
Slika 6: Kinetike rasta rekombinantnog virusa sa dva IGR-a na S segmentu su slične sa bisegmentiranim virusom. BHK-21 ćelije su inficirane na mulltiplicetu infekcije (eng. „moi“) od 0.01 sa ili bi-segmentiranimm LCMV (sivi trouglići) koji nose S segment divljeg tipa, sa tri-segmentiranim r3LCMV-GFP<nat>(crni kružići) ili sa r2LCMV_2IGRs (beli dijamanti) koji nose jedan S segment koji odgovara rekombinantnom proizvodu koji je dobijen iz inficiranog AGRAG miša (uporediti Sl. 5). Supernatant je uziman u naznačenim vremenskim tačkama i virusni titri su određivani sa „focus forming assay“. Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM tri replikata po grupi. Barovi greške su sakriveni i sakriveni su u veličini simboola. ns.: nije statistički značajno (p ≥ 0.05); ***: p < 0.001 (1-way ANOVA koju prati Bonferronijev post-test za višestruka poređenja).
Slika 7: Model za događaje rekombinacije koji su odgovorni za gubitak r3LCMV-GP<nat>transgena i postulirani mehanizam r3LCMV-GP<art>genetičke stabilnosti. Ovaj model se zasniva na podacima sekvence kraja transkripcije LCMV (Meyer and Southern, 1993, J Virol, 67(5):2621-2627) kombinovano sa reverznim genetičkim dokazom za IGR kao signalom za terminaciju transkripcije (Pinschewer et al., 2005, J Virol, 79(7):4519-4526). Zajedno, ova otkrića ukazuju na pauziranje polimeraze koje zavisi od strukture kada se kompletira struktura ukosnice IGR. Utvrđeno je da ostatak GFP između dva IGR-a u rekombinovanim S segmentima potiče iz ili jednog ili oba S segmenta, što podržava model da polimeraza premešta matricu (takođe je naznačeno sa izbor kopije) koje se pojavljuje kada polimeraza pauzira, ili tokom sinteze genoma ili antigenoma (ispod scenariji A i B, redom). (A) Tokom sinteze antigenoma RNK zavisna RNK polimeraza (RdRp) inicira na 3’UTR matrice genomskog S segmenta i nakon toga čita na NP ORF i IGR. Na kraju IGR polimeraza pauzira zbog sekundarne strukture ("pauziranje polimeraze koje je zavisno od strukture"). Zastoj polimerze olakšava odabir kopije i nastavak replikacije RNK na alternativnoj matrici (ovde: GP-kodirajući S segment genoma). Promena matrice mora da se desi uzvodno od GP stop kodona, i očigledno je najverovatnije da cilja sekvenca koje su bliske ili u bazi IGR ukosnice. Nastavljajući sa čitanjem kroz C-kraj GFP od druge matrice, polimeraza nakon toga sintetiše drugi IGR, GP ORF i 5’UTR. (B) Tokom sinteze genoma RdRp inicira RNK sintezu na 3’ kraju matrice antigenomskog S segmenta koji sadrži GP, sintetiše 5’UTR, GP i većinu ili sve od IGR, nakon čega sledi strukturno zavisno pauziranje polimeraze. Događa se izbor kopije, prelazak u C-terminalnu porciju GFP ORF blizu IGR ili S segmenta koji sadrži NP. Prema tome replikacija dodaje fragment GFP, koji prati IGR u punoj dužini, NP i 3’UTR. (C - D) Prelazak matrica analogno sa scenarijumima (A) i (B) može takođe da se dogodi tokom sinteze genoma ili antigenoma r3LCMV-GFP<art>. Ovaj postupak može takođe da kombinuje NP i GP ORFs u jednom RNK segmentu. Kasniji je, međutim, dobijen iz dva 3’ UTR-a umesto 3’UTR i 5’UTR, koji samo zajedno obrazuju funkcionalni virusni promotor. Takvi molekuli mogu, prema tome da ne budu umnoženi sa RdRp i prema tome da ne obrazuju rekombinantni virus koji je kompetentan za replikaciju.
Slika 8: Dobijen je r3LCMV-OVA<art>vektor vakcine sa organizacijom genoma koja je analogna sa r3LCMV-GFP<art>(videti Sl.1C) ali sa dva ovalbuminska (OVA) gena umesto odgovarajućih GFP gena u krajnjem virusu. C57BL/6 miševi su imunizovani intramuskularno (i.m.) sa ili 10<4>PFU r3LCMV-OVA<art>ili sa 10<8>partikula deficijentnog za replikaciju E1-uklonjenog adenovirusnog 5-zasnovanog vektora koji eksprimira OVA. 8 dana kasnije životinje su eutanizovane i odgovor T ćelija koji se pokreće u odgovoru na vakcinaciju je analiziran. A: Učestalost OVA-specifičnih CD8<+>T ćelija u slezini je određen upotrebom SIINFEKL peptidima-napunjenim tetramerima MHC klase I. Učestalosti epitop-specifičnih ćelija su određivane između B220-negativnih CD8<+>limfocita. B: Funkcionalnost OVA-specifičnih CD8<+>T ćelija je analizirana sa intraćelijskim testovima za citokine upotrebom SIINFEKL peptida za restimulaciju. Barovi predstavljaju srednju vrednost /-SEM pet miševa po grupi. *: p<0.05; **: p>0.01 sa neuparenim dvosmernim student-ovim t testom.
Slika 9: Trisegmentirani LCMV indukuje polifunkcionalne memorijske CD8<+>T ćelije. C57BL/6 miševi su inficirani i.v. sa 1x10<5>PFU r3LCMV-OVA ili 1x10<8>PFU rAd-OVA. Slezine su uzimane 25 dana posle infekcije i funkcionalnost OVA-specifičnih CD8<+>T ćelija je analizirana sa intraćelijskim bojenjem citokina. Profil citokina (IFN-γ, TNF-α i IL-2) OVA-specifičnih T ćelija indukovan sa r3LCMV-OVA (crni barovi) ili rAd-OVA (beli barovi) je prikazan kao procenat CD8<+>T ćelija (A) ili kao apsolutni brojevi po slezini (B). Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM pet miševa po grupi. Neuparen dvosmerni studentov t test je korišćen za statističku analizu, dobijene p vrednosti su ispravljene za
1
višestruka poređenja množenjem sa brojem poređenja (n=7). Prikazan je jedan predstavnik dva slična eksperimenta.
Slika 10: Antigen-kodirajući LCMV indukuje specifične T ćelijske odogovore prema stranim i autoantigenima. C57BL/6 miševi su inficirani i.v. sa 1x10<5>PFU r3LCMV koji kodira za pacovski, humani ili mišji Her2 peptid (A, B i C, redom). Slezine su uzete devet dana posle infekcije i indukcija funkcionalnih antigen-specifičnih CD8<+>T ćelija je analizirana sa intraćelijskim bojenjem citokina i protočnom citometrijom. Profil citokina (IFN-γ, TNF-α i IL-2) za Her2- specifične CD8<+>T ćelije indukovane sa r3LCMV je prikazan u % CD8<+>T ćelija. Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM tri miša po grupi.
Slika 11: Interferon-α je indukovan nakon r3LCMV infekcije ali ne nakon infekcije sa rekombinantnim Adeno- ili Vacciniavirusom. C57BL/6 miševi su inficirani i.v. sa 1x10<5>PFU r3LCMV-OVA, 1x10<8>PFU rAd-OVA ili 1x10<6>PFU rVaccOVA. Krv je sakupljena u naznačenim vremenskim tačkama posle infekcije i nivoi Interferona-a u serumu su određeni pomoću ELISA. Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM četiri miša po grupi. ***: p < 0.001 (2-smerna ANOVA koju prati Bonferroni-jev post-test za višestruka poređenja). Reprezentativni podaci iz jednog od dva nezavisna eksperimenta su prikazani.
Slika 12: Rast ćelijske kulture r3JUNV-GFP<art>u poređenju sa r3JUNV-GFP<nat>i r2JUNV-wt. r3JUNV-GFP<art>i r3JUNV-GFP<nat>su konstruisani analogno sa određenim r3LCMV vektorima što je šematski prikazano na Slici 1. Da se uporede njihova svojstva rasta ćelijske kulture 293T ćelije su inficirane multiplicitetom infekcije od (MOI) 0.01 sa r2LCMV-wt, r3JUNV-GFP<art>, i r3JUNV-GFP<nat>, i supernatant je sakupljen u naznačenim vremenskim tačkama. Infektivne jedinice (FFU) u supernatantu su određene testom imunofokusiranja. Simboli i barovi predstavljaju srednju vrednost ±SEM tri replikata po grupi i skriveni su u veličini simbola.
Slika 13: Trisegmentirani JUNV su dramatično atenuirani in vivo i samo dovode do detektabilne viremije po gubitku GFP. (A) AGRAG miševi su inficirani i.v. sa 7x10<4>PFU r3JUNV-GFP<nat>(sivi kvadratići), r3JUNV-GFP<art>(beli trouglovi) ili kontrolnim bi-segmentiranim r2JUNV sojem Candid#1 (crni kružići), i viremija je praćena tokom vremena. Simboli predstavljaju individualne miševe (n=3-7 po grupi). (B) JUNV viremija je određena u danu 120 posle intravenozne infekcije AGRAG miševa sa 7x10<4>PFU od r3JUNV-GFP<nat>ili r3JUNV-GFP<art>. Testovi imunofokusiranja su sprovedeni da bi se detektovao ili nukleoprotein NP (sivi kružići) ili GFP (beli kružići). Virusni štokovi koji su korišćeni za inokulisanje miševa su u testu korišćeni kao kontrola bojenja. Simboli predstavljaju, redom, individualne miševe i inokulume.
Slika 14: Homologne i heterologne „prime-boost“ kombinacije trisegmentiranog LCMV- i JUNV-zasnovanih vektora vakcine uključuju jake P1A autoantigen-specifične CD8<+>T ćelijske odgovore. (A) U danu 0 i 35 eksperimentalni BALB/c miševi su imunizovani sa 8.5x10<4>PFU r3JUNV-P1A<art>(r3JUNV-P1A) i r3LCMV-P1A<art>(r3LCMV-P1A) intravenozno u homolognim ili heterolognim kombinacijama naznačenim na grafikonu. Epitop-specifične CD8<+>T ćelije su bojene upotrebom P1A epitopnapunjenim MHC klasa I tetramerima u kombinaciji sa anti-CD8a antitelom. Učestalost ćelija koje vezuju P1A-tetramer unutar CD8<+>T ćelijskog kompartmenta u perifernoj krvi (A) i apsolutni broj P1A tetramer-binding CD8<+>T ćelija po mililitru periferne krvi koje vezuju P1A tetramer (B) je izračunat. Simboli predstavljaju srednju vrednost+/-SEM od 3-5 miševa po grupi u vremenskoj tački.
1
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0066] Pronalazak obezbeđuje tri-segmentiranu infektivnu i kompetentnu za replikaciju arenavirusnu partkulu koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta, pri čemu jedan od dva S segmenta je izabran iz grupe koja obuhvata:
(i) S segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) S segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) S segment, pri čemu ORF koji kodira L je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i
(vi) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR, pri čemu tri-segmentirana virusna partikula sadrži dva heterologna ORFs-a.
[0067] Pronalazak obezbeđuje tri-segmentiranu infektivnu i kompetentnu za replikaciju arenavirusnu partikulu koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta, pri čemu jedan od dva L segmenta je izabran iz grupe koja se sastoji od:
(i) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i
(vi) L segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR, pri čemu tri-segmentirana virusna partikula sadrži dva heterologna ORF-a.
[0068] Dalje, pronalazak obezbeđuje cDNK genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje DNK ekspresioni vektor koji se sastoji iz cDNK.
[0069] Dalje, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu, cDNK, ili vektor iz pronalaska.
[0070] Dalje, pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska, pri čemu postupak obuhvata:
(i) transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više cDNK molekula iz jednog L segmenta i dva S segmenta;
(ii) održavanje ćelije domaćina pod uslovima koji su odgovarajući za obrazovanje virusa; i (iii) sakupljanje arenavirusne partikule.
[0071] Dalje, pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska, pri čemu postupak obuhvata:
(i) transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više cDNK iz dva L segmenta i jednog S segmenta; (ii) održavanja ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i
(iii) sakupljanja arenavirusne partikule.
[0072] Dalje, pronalazak obezbeđuje vakcinu koja sadrži tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
1
[0073] Konačno, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji iz tri-segmentirane arenavirusne partikule iz pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosača.
4.1 Arenavirusi sa otvorenim okvirom čitanja u neprirodnom položaju
[0074] Ovde su obezbeđeni arenavirusi sa rearanžmanima u njihovim ORF-a. U određenim izvođenjima, takvi arenavirusi su kompetentni za replikaciju i infektivni su. Genomske sekvence takvih arenavirusa su ovde obezbeđene. U jednom aspektu, ovde je obezbeđen genomski segment arenavirusa, pri čemu genomski segment arenavirusa je dizajniran da nosi arenavirusni ORF u položaju koji nije položaj u kome je respektivni gen pronađen kod virusa koji su izolovani iz divljine, kao što je LCMV-MP (videti SEQ ID NO-i: 4 i 5) (ovde je naznačen sa "pozicija u divljem tipu") ORF (tj., ne-prirodan položaj). U jednom izvođenju, arenavirusna partikula je LCMV.
[0075] Genomski segmenti divljeg tipa arenavirusa i ORF-i su poznati u oblasti tehnike. Posebno, genom arenavirusa se sastoji iz S segmenta i L segmenta. S segment nosi ORF-e koji kodiraju GP i NP. L segment kodira L protein i Z protein. Oba segmenta su ograničena sa odgovarajučim 5’ i 3’ UTR-ima (videti Sliku 1A). Ilustrativni genomski segmenti divljeg tipa arenavirusa su obezbeđeni u SEQ ID NOs: 1-10.
[0076] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segment može da bude dizajniran da nosi dva ili više arenavirusna ORF-a u položaju koji nije položaj u divljem tipu. U drugim izvođenjima, arenavirusni genomski segment može da bude dizajniran da nosi dva arenavirusna ORF-a, ili tri arenavirusna ORF-a, ili četiri arenavirusna ORF-a u položaju koji nije položaj u divljem tipu.
[0077] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segment može da bude:
(i) arenavirusni S segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR; (ii) arenavirusni S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) arenavirusni S segment, pri čemu ORF koji kordira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) arenavirusni S segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; (v) arenavirusni S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(vi) arenavirusni S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(vii) arenavirusni L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR; (viii) arenavirusni L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR; (ix) arenavirusni L segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(x) arenavirusni L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
1
(xi) arenavirusni L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i (xii) arenavirusni L segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
[0078] U određenim izvođenjima, ORF koji se nalazi u ne-prirodnom položaju arenavirusnog genomskog segmenta koji se ovde opisuje može da bude pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR ili arenavirusnog 5’ UTR. U specifičnijim izvođenjima, arenavirusni 3’ UTR je 3’ UTR arenavirusnog S segmenta. U drugom specifičnom izvođenju, arenavirusni 3’ UTR je 3’UTR arenavirusnog L segmenta. U specifičnijim izvođenjima, arenavirusni 5’ UTR je 5’ UTR arenavirusnog S segmenta. U drugim specifičnim izvođenjima, 5’ UTR je 5’ UTR L segmenta.
[0079] U drugim izvođenjima, ORF koji se nalazi u ne-prirodnom položaju arenavirusnog genomskog segmenta koji se ovde opisuje može da bude pod kontrolom arenavirusne konzervisane terminalne sekvence elementa i 3’-terminalni 19-20- nt regioni) (videti npr., Perez & de la Torre, 2003, J Virol.
77(2): 1184-1194).
[0080] U određenim izvođenjima, ORF koji se nalazi u ne-prirodnom položaju arenavirusnog genomskog segmenta može da bude pod kontrolom promotorskog elementa 5’ UTR (videti npr., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). U drugom izvođenju, ORF koji se nalazi u ne-prirodnom položaju arenavirusnog genomskog segmenta može da bude pod kontrolom promotorskog elementa 3’ UTR (videti npr., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). U specifičnijim izvođenjima, promotorski element 5’ UTR je 5’ UTR promotorski element S segmenta ili L segmenta. U drugom specifičnom izvođenju, promotorski element 3’ UTR je 3’ UTR promotorskog elementa S segmenta ili L segmenta.
[0081] U određenim izvođenjima, ORF koji se nalazi u ne-prirodnom položaju arenavirusnog genomskog segmenta može da bude pod kontrolom prekinutog arenavirusnog 3’ UTR ili prekinutog arenavirusnog 5’ UTR (videti npr., Perez & de la Torre, 2003, J Virol.77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). U specifičnijim izvođenjima, prekinuti 3’ UTR je 3’ UTR arenavirusnog S segmenta ili L segmenta. U specifičnijim izvođenjima, prekinuti 5’ UTR je 5’ UTR arenavirusnog S segmenta ili L segmenta.
[0082] Takođe je ovde prikazana, arenavirusna partikula koja se sastoji iz prvog genomskog segmenta koji je konstruisan da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu i drugi arenavirusni genomski segment tako da arenavirusna partikula sastoji se iz S segmenta i L segmenta. U specifičnim primerima, ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu je jedan od arenavirusnog ORFa.
[0083] U određenim specifičnim primerima, arenavirusna partikula može da sadrži puni komplement od sva četiri arenavirusna ORF-a. U specifičnim primerima, drugi arenavirusni genomski segment je konstruisan da nosi ORF u položaju koji nije žpoložaj ORF u divljem tipu. U drugim specifičnim primerima, drugi arenavirusni genomski segment može da bude genomski segment divljeg tipa (tj., sadrži ORF-e na segmentu u položaju u divljem tipu).
[0084] U određenim primerima, prvi arenavirusni genomski segment je L segment i drugi arenavirusni genomski segment je S segment. U drugim primerima, prvi arenavirusni genomski segment je S segment i drugi arenavirusni genomski segment je L segment.
[0085] Ne-ograničavajući primeri arenavirusne partikule sastoje se iz genomskog segmenta sa ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu i drugog genomskog segmenta su ilustrovani u Tabeli 1.
1
Tabela 1
[0086] Takođe ovde je prikazana, cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koja je modifikovana da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF divljeg tipa. U specifičnijim primerima, ovde je prikazana cDNK ili skup cDNK molekula arenavirusnog genoma kao što je predstavljeno u Tabeli 1.
[0087] U određenim izvođenjima, cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koja je modifikovana da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF divljeg tipa je deo ili je uključena u DNK ekspresioni vektor. U specifičnom izvođenju, cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koji je dizajniran da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF divljeg tipa je deo ili je uključen u DNK ekspresioni vektor koji olakšava proizvodnju arenavirusnog genomskog segmenta kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, ovde opisana cDNK može da bude uključena u plazmid. Detaljniji opis cDNK ili nukleinskih kiselina i ekspresionih sistema su obezbeđeni u Odeljku 4.5.1. Postupci za proizvodnju cDNK su rutinski i
2
uobičajeni postupci molekularne biologije i DNK manipulacije i proizvodnje. Bilo koji postupak kloniranja koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike može da se koristi. Takvi postupci su dobro poznati i dostupni su stručnjaku iz oblasti tehnike u laboratorijskim priručnicima kao što je, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001).
[0088] U određenim izvođenjima, cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koja je modifikovana da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu je uvedena (npr., transfektovana) u ćeliju domaćina. Prema tome, u nekim ovde obezbeđenim izvođenjima, je ćelija domaćina koja obuhvata cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koji je modifikovan da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu (tj., cDNK genomskog segmenta). U drugim izvođenjima, ovde opisana cDNK je deo ili može da bude uključena u DNK ekspresiono vektor i da se uvede u ćeliju domaćina. Prema tome, u nekim ovde obezbeđenim izvođenjima je ćelija domaćina koja obuhvata ovde opisanu cDNK koja je uključena u vektor. U drugim izvođenjima, ovde opisani arenavirusni genomski segment je uveden u ćeliju domaćina.
[0089] U određenim izvođenjima, ovde je opisan postupak za proizvodnju arenavirusnog genomskog segmenta, pri čemu postupak obuhvata transkribovanje cDNK genomskog segmenta arenavirusa. U određenim izvođenjima, protein virusne polimeraze može da bude prisutan tokom transkripcije arenavirusnog genomskog segmenta in vitro ili in vivo.
[0090] U određenim izvođenjima transkripcija arenavirusnog genomskog segmenta se izvodi korišćenjem bi-direkcionog promotora. U drugim izvođenjima, transkripcija arenavirusnog genomskog segmenta se izvodi upotrebom bi-direkcione ekspresione kasete (videti npr., Ortiz-Riaño et al., 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188). U specifičnijim izvođenjima bi-direkciona ekspresiona kaseta sadrži oba promotora za polimerazu I i polimerazu II koji čitaju sa suprotnih strana u dva kraja insertovanog arenavirusnog genomskog segmenta, redom. U još specifičnijim izvođenjima bi-direkciona ekspresiona kaseta sa pol-I i pol-II promotorima čita sa suprotnih strana u L segment i S segment [0091] U drugim izvođenjima, transkripcija ovde opisane cDNK arenavirusnog genomskog obuhvata promotor. Specifični primeri promotora uključuju promotor RNK polimeraze I, promotor RNK polimeraze II, promotor RNK polimeraze III, T7 promotor, SP6 promotor ili T3 promotor.
[0092] U određenim izvođenjima, postupak za proizvodnju arenavirusnog genomskog segmenta može dalje da se sastoji iz uvođenja u ćeliju domaćina cDNK arenavirusnog genomskog segmenta. U određenim izvođenjima, postupak za proizvodnju arenavirusnog genomskog segmenta može dalje da obuhvati uvođenje u ćeliju domaćina cDNK arenavirusnog genomskog segmenta, pri čemu ćelija domaćina eksprimira sve druge komponente za proizvodnju arenavirusnog genomskog segmenta; i prečišćavanje arenavirusnog genomskog segmenta iz supernatanta ćelije domaćina. Takvi postupci su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.
[0093] Ovde su obezbeđene ćelijske linije, kulture i postupci za kultivaciju ćelija inficiranih sa nukleinskim kiselinama, vektorima, i ovde obezbeđenim kompozicijama. Detaljniji opis nukelinskih kiselina, sistema vektora i ćelijskih linija koje se ovde opisuju je obezbeđen u Odeljku 4.5.
[0094] U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula kao što je ovde opisano rezultuje u infektivnoj i kompetentnoj za replikaciju arenavirusnoj partikuli. U specifičnim izvođenjima, ovde opisana arenavirusna partikula je atenuirana. U određenom izvođenju, arenavirusna partikula je atenuirana tako da virus ostaje, bar delom, sposoban da se širi i može da se replicira in vivo, ali može da stvori samo niske količine virusa što dovodi do subkliničkih nivoa infekcije koje su ne-patogene. Takvi atenuirani virusi mogu da se koriste kao imunogena kompozicija. Ovde su obezbeđene, imunogene kompozicije koje sadrže arenavirus sa ORF u ne-prirodnom položaju kao što je opisano u Odeljku 4.7.
4.1.1 Arenavirusna partikula koja je defektna za replikaciju sa otvorenim okvirom čitanja u neprirodnom položaju
[0095] U određenim primerima, ovde je prikazana arenavirusna partikula u kojoj (i) ORF je u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; i (ii) ORF koji kodira GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen ili je funkcionalno inaktiviran tako da dobiveni virus ne može dalje da proizvodi potomstvo infektivnih virusnih partikuča. Arenavirusna partukula koja se sastoji iz genetski modifikovanog genoma u kome jedan ili više ORFa je bio uklonjen ili je funkcionalno inaktivnisan može da se proizvede u komplementarnim ćelijama (tj., ćelije koje eksprimiraju arenavirusni ORF koji je bio uklonjen ili funkcionalno inaktiviran). Genetski materijal dobijene arenavirusne partikule može se preneti nakon infekcije domaćina u ćeliju domaćina, pri čemu genetski materijal može da bude eksprimiran i umnožen. Dodatno, genom ovde opisane genetički modifikovane arenavirusne partikule može da kodira heterologni ORF iz organizma koji nije arenavirusna partikula.
[0096] U određenim primerima, najmanje jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugom primeru, najmanje jedan ORF, najmanje dva ORF-a, najmanje tri ORF-a, ili najmanje četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein i L protein mogu da budu uklonjeni i zamenjeni sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U specifičnim primerima, samo jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirusna partikula. U specifičnijim primerima, ORF koji kodira GP arenavirusnog genomskog segmenta je uklonjen. U drugom specifičnom primeru, ORF koji kodira NP arenavirusnog genomskog segmenta je uklonjen. U specifičnijim primerima, ORF koji kodira Z protein arenavirusnog genomskog segmenta je uklonjen. U još drugom specifičnom primeru, ORF koji kodira L protein je uklonjen.
[0097] Prema tome, u određenim primerima, ovde prikazana arenavirusna partikula sastoji se iz genomskog segmenta koji (i) je dizajniran da nosi ORF u ne-prirodnom položaj; (ii) ORF koji kodira GP, NP, Z protein, ili L protein je uklonjen; (iii) ORF koji je uklonjen je zamenjen sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0098] U određenim primerima, heterologni ORF je 8 do 100 nukleotida u dužini, 15 do 100 nukleotida u dužini, 25 do 100 nukleotida u dužini, 50 do 200 nukleotida u dužini, 50 do 400 nukleotida u dužini, 200 do 500 nukleotida u dužini, ili 400 do 600 nukleotida u dužini, 500 do 800 nukleotida u dužini. U drugim primerima, heterologni ORF je 750 do 900 nukleotida u dužini, 800 do 100 nukleotida u dužini, 850 do 1000 nukleotida u dužini, 900 do 1200 nukleotida u dužini, 1000 do 1200 nukleotida u dužini, 1000 do 1500 nukleotida ili 10 do 1500 nukleotida u dužini, 1500 do 2000 nukleotida u dužini, 1700 do 2000 nukleotida u dužini, 2000 do 2300 nukleotida u dužini, 2200 do 2500 nukleotida u dužini, 2500 do 3000 nukleotida u dužini, 3000 do 3200 nukleotida u dužini, 3000 do 3500 nukleotida u dužini, 3200 do 3600 nukleotida u dužini, 3300 do 3800 nukleotida u dužini, 4000 nukleotida do 4400 nukleotida u dužini, 4200 do 4700 nukleotida u dužini, 4800 do 5000 nukleotida u dužini, 5000 do 5200 nukleotida u dužini, 5200 do 5500 nukleotida u dužini, 5500 do 5800 nukleotida u dužini, 5800 do 6000 nukleotida u dužini, 6000 do 6400 nukleotida u dužini, 6200 do 6800 nukleotida u dužini, 6600 do 7000 nukleotida u dužini, 7000 do 7200 nukleotida u dužinama, 7200 do 7500 nukleotida u dužini, ili 7500 nukleotida u dužini. U nekim primerima, heterologni ORF kodira peptid ili polipeptid koji je 5 do 10 aminokiselina u dužini, 10 do 25 aminokiselina u dužini, 25 do 50 aminokiselina u dužini, 50 do 100 aminokiselina u dužini, 100 do 150 aminokiselina u dužini, 150 do 200 aminokiselina u dužini, 200 do 250 aminokiselina u dužini, 250 do 300 aminokiselina u dužini, 300 do 400 aminokiselina u dužini, 400 do 500 aminokiselina u dužini, 500 do 750 aminokiselina u dužini, 750 do 1000 aminokiselina u dužini, 1000 do 1250 aminokiselina u dužini, 1250 do 1500 aminokiselina u dužini, 1500 do 1750 aminokiselina u dužini, 1750 do 2000 aminokiselina u dužini, 2000 do 2500 aminokiselina u dužini, ili više od 2500 ili više aminokiselina u dužini. U nekim primerima, heterologni ORF kodira polipeptid koji ne prelazi 2500 aminokiselina u dužini. U specifičnim primerima heterologni ORF ne kodira stop kodon. U određenim primerima, the heterologni ORF je optimizovan za kodon. U određenim primerima nukleotidna kompozicija, kompozicija nukleotidnog para ili oba mogu da budu optimizovani. Postupci za takve optimizacije su poznati u oblasti i mogu se primeniti za optimizaciju heterolognog ORF.
[0099] Bilo koji heterologni ORF iz organizma koji nije arenavirus može da bude uključen u arenavirusni segment genoma. U jednom primeru, heterologni ORF kodira reporterski protein. Detaljniji opis reporterskih proteina je predstavljen u Odeljku 4.3. U drugom primeru, heterologni ORF kodira antigen za infektivni patogen ili antigen koji je povezan sa bilo kojom bolesti koja je sposobna za izazivanje imunog odgovora. U specifičnim primerima antigen je izveden iz infektivnog organizma, tumora (tj., kancera), ili alergena. Detaljniji opis heterolognih ORF-a je opisan u Odeljku 4.3.
[0100] U određenim primerima, rast i infektivnost arenavirusne partikule nije pogođena heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0101] Postupci koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike mogu da se koriste da bi se proizvela arenavirusna čestica koja se sastoji arenavirusnog segmenta genoma koji je dizajniran da nosi ORF arenavirusa u položaju koji nije položaj koja se karakteriše za divlji tip. Na primer, postupci reverzne genetike mogu da se koriste za dobijanje takve arenavirusne čestice. U drugim primerima, arenavirusna čestica koja ima defekt za replikaciju (tj., arenavirusni genomski segment koji je dizajniran da nosi ORF arenavirusa u položaju koji ne predstavlja položaj koji se karakteriše za divlji tip, gde ORF koji kodira GP, NP, Z protein, L protein, je uklonjen) može se proizvesti u komplementarnoj ćeliji.
[0102] U određenim primerima, arenavirusni genomski segment ili arenavirusna čestica koja se koristi prema predmetnom pronalasku mogu da budu Virusi starog sveta, na primer, LCMV.
[0103] U određenim primerima, predmetna prijava se odnosi na arenavirusnu česticu kao što je ovde opisano koja je pogodna za upotrebu kao vakcina i postupci upotrebe takve arenavirusne čestice u vakcinaciji i lečenju ili prevenciji, na primer, infekcija ili kancera. Detaljniji opis postupaka upotrebe ovde opisane arenavirusne čestice je obezbeđen u Odeljku 4.6.
[0104] U određenim primerima, ovde je obezbeđen komplet koji obuhvata, u jednom ili više kontejnera, jednu ili više ovde opisanih molekula cDNK. U specifičnom primeru, komplet sadrži, u jednom ili dva ili više kontejnera arenavirusni genomski segment ili arenavirusnu česticu kao što je ovde opisano. Komplet može dalje sa sadrži jedan ili više od sledećih: ćeliju domaćina koja je pogodna za spašavanje arenavirusnog genomskog segmenta ili arenavirusne čestice, reagenasa pogodnih za transfekciju plazmidne cDNK u ćeliju domaćina, pomoćnički virus, plazmide koji kodiraju viralne proteine i/ili jedan ili više prajmera specifičnih za modifikovani arenavirusni genomski segment ili arenavirusnu česticu ili molekule cDNK od istog.
[0105] U određenim primerima, predmetna prijava se odnosi na arenavirusnu česticu kao što je ovde opisano koja je pogodna za upotrebu kao farmaceutska kompozicija i postupke za upotrebu takve arenavirusne čestice u vakcinaciji i lečenju ili prevenciji, na primer, infekcija i kancera. Detaljniji opis postupaka upotrebe ovde opisane arenavirusne čestice je obezbeđen u Odeljku 4.7.
2
4.2 Arenavirusna čestica koja se sastoji iz tri segmenta
[0106] Ovde su obezbeđene partikule arenavirusa iz tri segmenta sa rearanžmanima u njihovim ORF-ima. U jednom aspektu, ovde je obezbeđena čestica arenavirusa iz tri segmenta koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta ili dva L segmenta i jednog S segmenta. U određenim izvođenjima, čestica arenavirusa iz tri-segmenta ne rekombinuje se u bi-segmentiranu česticu arenavirusa kompetentnu za replikaciju. Određenije, u određenim izvođenjima, dva od genomskih segmenata (npr, dva S segmenta ili dva L segmenta, redom) ne mogu da se rekombinuju na način da se dobiije jedan viralni segment koji može da zameni dva parentalna segmenta. U specifičnim izvođenjima, čestica arenavirusa iz tri segmenta sadrži ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu. U još drugom specifičnom izvođenju, čestica arenavirusa iz tri-segmenta sadrži sva četiri ORF-a arenavirusa. Prema tome, u određenim izvođenjima, čestica arenavirsa iz tri-segmenta je kompletentna za replikaciju i infektivna. U drugim primerima, čestici arenavirusa iz tri-segmenta nedostaje jedan od četiri ORF-a arenavirusa. Prema tome, u određenim primerima, čestica arenavirusa iz tri-segmenta je infektivna ali nije sposobna dalje da proizvodi infektivno potomstvo u ne-komplementarnim ćelijama.
[0107] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira GP, NP, Z protein, ili L protein ovde opisane čestice arenavirusa iz tri-segmenta može dalje da bude pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR ili arenavirusnog 5’ UTR. U određenijim izvođenjima, tri-segmentirani arenavirusni 3’ UTR je 3’ UTR arenavirusnog S segmen(a)ta. U drugom specifičnom izvođenju, tri-segmentirani arenavirusni 3’ UTR je 3’ UTR trisegmentiranog arenavirusnog L segmen(a)ta. U određenim izvođenjima, tri-segmentirani arenavirusni 5’ UTR je 5’ UTR arenavirusnog S segmen(a)ta. U drugim specifičnim izvođenjima, 5’ UTR je 5’ UTR L segmen(a)ta.
[0108] U drugim izvođenjima, ORF koji kodiraju GP, NP, Z protein, ili L protein ovde opisane trisegmentirane arenavirusne čestice mogu da budu pod kontrolom arenavirusnog konzervisanog elementa kraja sekvence i 3’-kraj regiona 19-20-nt) (videti npr., Perez & de la Torre, 2003, J Virol.
77(2): 1184-1194).
[0109] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira GP, NP, Z protein ili L protein tri-segmentirane arenavirusne čestice mogu da budu pod kontrolom promotorskog elementa 5’ UTR (videti npt., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). U drugom izvođenju, ORF koji kodira GP, NP Z protein, L protein tri-segmentirane arenavirusne čestice može da bude pod kontrolom promotorskog elementa 3’ UTR (videti npr., Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). U određenijim izvođenjima, promotorski element 5’ UTR je 5’ UTR promotorski element S segmen(a)ta ili L segmen(a)ta. U drugom specifičnom izvođenju, promotorski element 3’ UTR je 3’ UTR je promotorski element S segmen(a)ta ili L segmen(a)ta.
[0110] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira GP, NP, Z protein ili L protein tri-segmentirane arenavirusne čestice mogu da budu pod kontrolom prekinutog arenavirusnog 3’ UTR ili prekinutog arenavirusnog 5’ UTR (videti npr., Perez & de la Torre, 2003, J Virol.77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). U određenijim izvođenjima, prekinuti 3’ UTR je 3’ UTR arenavirusnog S segmenta ili L segmenta. U određenijim izvođenjima, prekinuti 5’ UTR je 5’ UTR arenavirusnog S segmen(a)ta ili L segmen(a)ta.
[0111] Ovde je takođe obezbeđena, cDNK tri-segmentirane arenavirusne partikule. U određenijim izvođenjima, ovde je obezbeđena DNK nukleotidna sekvenca ili set DNK nukleotidnih sekvenci koje kodiraju tri-segmentiranu arenavirusnu česticu kao što je u nastavku prikazano u Tabeli 2 ili Tabeli 3.
[0112] U određenim izvođenjima, nukleinske kiseline koje kodiraju tri-segmentirani arenavirusni genom su deo ili su uključeni u jedan ili više DNK ekspresionih vektora. U određenom izvođenju, nukleinske kiseline koje kodiraju genom tri-segmentirane arenavirusne čestice su deo ili su uključene u jedan ili više DNK ekspresionih vektora koji olakšavaju proizvodnju tri-segmentirane arenavirusne čestice kao što je ovde opisano. U određenom izvođenju, ovde opisana cDNK može da bude uključena u plazmid. Detaljniji opis cDNK i sistema za ekspresiju obezbeđen je u Odeljku 4.5.1. Postupci za proizvodnju cDNK rutinske i konvencionalne postupke molekularne biologije i DNK manipulacije i proizvodnje. Bilo koji postupak koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike može da se koristi. Takvi postupci su dobro poznati i dostupni su stručnjaku iz oblasti tehnike u laboratorijskim priručnicima kao što su, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001).
[0113] U određenim izvođenjima, cDNK tri-segmentiranog arenavirusa je uključena (npr., transfektovana) u ćeliju domaćina. Prema tome, u nekim ovde obezbeđenim izvođenjima, je ćelija domaćina koja sadrži cDNK tri-segmentirane arenavirusne čestice (tj., cDNK genomskih segmenata trisegmentirane arenavirusne čestice). U drugim izvođenjima, ovde opisana cDNK koja je deo ili može da bude uključena u DNK ekspresioni vektor i uključena je u ćeliju domaćina. Prema tome, u nekim izvođenjima, ovde je obrzbeđena ćelija domaćina koja sadrži cDNK koja se ovde opisuje koja je uključena u vektor. U drugim izvođenjima, tri-segmentirani arenavirusni genomski segmenti (tj., L segment i/ili S segment ili segmenti) koji se ovde opisuju su uvedeni u ćeliju domaćina.
[0114] U određenim izvođenjima, ovde je opisan postupak za proizvodnju tri-segmentirane arenavirusne čestice, pri čemu postupak obuhvata transkribovanje cDNK sa tri-segmentirane arenavirusne čestice. U određenim izvođenjima, viralni protein polimeraze može da bude prisutan tokom transkripcije tri-segmentirane arenavirusne čestice in vitro ili in vivo. U određenim izvođenjima, transkripcija arenavirusnog genomskog segmenta se izvodi korišćenjem bi-direkcionog promotora.
[0115] U drugim izvođenjima, transkripcija arenavirusnog genomskog segmenta se izvodi upotrebom bi-direkcione ekspresione kasete (videti npr., Ortiz-Riaño et al., 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188). U više specifičnim izvođenjima bi-direkciona ekspresiona kaseta sadrži, redom, pomotor za polimeazu I i polimerazu II koji se čita sa suprotnih strana u dva kraja insertovanog arenavirusnog genomskog segmenta.
[0116] U drugim izvođenjima, transkripcija cDNK sa ovde opisanog arenavirusnog genomskog segmenta obuhvata promotor. Specifični primeri promotora uključuju promotor za RNK polimerazu I, promotor za RNK polimerazu II, promotor za RNK polimerazu III, pomotor T7, promotor SP6 ili promotor T3.
[0117] U određenim izvođenjima, postupak za proizvodnju tri-segmentirane arenavirusne čestice dalje može da sadrži uvođenje u ćeliju domaćina cDNK tri-segmentirane arenavirusne čestice. U određenim izvođenjima, postupak za proizvodnju tri-segmentirane arenavirusne čestice dalje može da sadrži uvođenje u ćeliju domaćina cDNK tri-segmentirane arenavirusne čestice, pri čemu ćelija domaćina eksprimira sve druge komponente za proizvodnju tri-segmentirane arenavirusne čestice; i prečišćavanje tri-segmentirane arenavirusne čestice iz supernatanta ćelije domaćina. Takvi postupci su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.
[0118] Ovde su obezbeđene ćelijske linije, kulture i postupci za kultivaciju ćelija inficiranih sa nukleinskim kiselinama, vektorima, i ovde obezbeđenim kompozicijama. Detaljniji opis nukleinskih kiselina, vektorskih sistema i ovde opisanih ćelijskih linija je obezbeđen u Odeljku 4.5.
2
[0119] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna čestica kao što je ovde opisana rezultuje u infektivnoj i arenavirusnoj čestici koja je kompetentna za replikaciju. U specifičnim izvođenjima, ovde opisana čestica arenavirusa je atenuisana. U određenom izvođenju, trisegmentirana čestica arenavirusa je atenuisana tako da virus ostaje, bar delom, kompetentan za replikaciju i može da se replicira in vivo, ali može da generiše samo niske količine virusa pri čemu se razvijaju subklinički nivoi infekcije koji su ne-patogeni. Takvi atenuisani virusi mogu da se koriste u obliku imunogene kompozicije.
[0120] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana čestica arenavirusa je istog tropizma kao i bisegmentirana čestica arenavirusa.
[0121] Takođe je obezbeđen komplet koji sadrži, u jednom ili više kontejnera, jednu ili više ovde opisanih molekula cDNK. U specifičnom izvođenju, komplet sadrži, u jednom ili dva ili više kontejnera tri-segmentiranu česticu arenavirusa kao što je ovde opisano. Komplet dalje može da sadrži jedan ili više od sledećih: ćeliju domaćina koja je pogodna za dobijanje tri-segmentirane čestice arenavirusa, reagense koji su pogodni za transfekciju plazmidne cDNK u ćeliju domaćina, pomoćnički virus, plazmide koji kodiraju viralne proteine i/ili jedan ili više oligonukleotidnih prajmera koji su specifični za modifikovani arenavirusni genomski segment ili česticu arenavirusa ili nukleinske kiseline koje istu kodiraju.
[0122] Ovde su takođe obezbeđene imunogene kompozicije koje sadrže tri-segmentiranu česticu arenavirusa kao što je opisano u Odeljku 4.6 i 4.7.
4.2.1 Tri-segmentirana čestica arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta
[0123] U jednom aspektu, ovde je obezbeđena tri-segmentirana čestica arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta. U određenim izvođenjima, širenje tri-segmentirane čestice arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta ne dovodi do bi-segmentirane virusne čestice koja je kompetentna za replikaciju. U specifičnim izvođenjima, širenje tri-segmentirane arenavirusne čestice koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta ne dovodi do bi-segmentirane virusne čestice koja je kompetentna za replikaciju posle najmanje 10 dana, najmanje 20 dana, najmanje 30 dana, najmanje 40 dana, najmanje 50 dana, najmanje 60 dana, najmanje 70 dana, najmanje 80 dana, najmanje 90 dana, ili najmanje 100 dana uporne infekcije kod miševa kojima nedostaje tip I receptor za interferon, tip II receptor za interferon i gen za aktivaciju rekombinacije (RAG1), i koji su inficirani sa 10<4>PFU trisegmentirane čestice arenavirusa (videti Odeljak 4.8.13). U drugim izvođenjima, širenje trisegmentirane čestice arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta does ne dovodi do bisegmentirane viralne čestice koja je kompetenta za replikaciju posle najmanje 10 pasaža, najmanje 20 pasaža, najmanje 30 pasaža, najmanje 40 pasaža, ili najmanje 50 pasaža.
[0124] Tri-segmentirana čestica arenavirusa koja sadrži sva tri virusna gena respektivno, u njihovom određenom položaju u divljem tipu je poznata u oblasti tehnike (npr., Emonet et al., 2011 J. Virol., 85(4):1473; Popkin et al., 2011, J. Virol, 85(15):7928). Posebno, tri-segmentirani genom arenavirusa se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta, u kojima je heterologni ORF (npr., GFP) insertovan u jednom položaju na svakom S segmentu. Određenije, jedan S segment kodira redom, GP i GFP. Drugi S segment kodira redom, GFP i NP. L segment kodira L protein i Z protein. Svi segmenti su respektivno ograničeni sa 5’ i 3’ UTR-a.
[0125] U određenim izvođenjima, inter-segmentalna rekombinacija dva S segmenta od trisegmentirane čestice arenavirusa, ove je obezbeđena, koja ujedinjuje dva arenaviralna ORF-a u jedan umesto dva odvojena segmenta rezultuje u ne funkcionalnom promotoru (tj., genomski segment
2
strukture: 5’ UTR-----------5’ UTR ili 3’ UTR------------3’ UTR), pri čemu svaki UTR koji obrazuje jedan kraj genoma je invertovana ponovljena sekvenca drugog kraja u istom genomu.
[0126] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana partikula arenavirusa sadrži jedan L segment i dva S segmenta dizajnirana je da nosi ORF arenavirusa u položaju koji nije položaj u ORF u divljem tipu. Trisegmentirana partikula arenavirusa može da sadrži jedan L segment i dva S segmenta i inženjeringom je dobijeno da nosi dva ORFs arenavirusa, ili tri ORFs arenavirusa, ili četiri ORFs arenavirusa, ili pet ORFs arenavirusa, ili šest ORFs arenavirusa u položaju koji nije položaj u divljem tipu. U specifičnim izvođenjima, tri-segmentirana partikula arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta sadrži komplement pune dužine sva četiri ORFs arenavirusa. Prema tome, u nekim izvođenjima, trisegmentirana partikula arenavirusa je infektivna i kompetentna za replikaciju tri-segmentirana partikula arenavirusa. U specifičnim izvođenjima, dva S segmenta od tri-segmentirane partikule arenavirusa dobiveni inženjeringom da nose jedan od njihovih ORFs u položaju koji nije položaj u divljem tipu. U više specifičnim izvođenjima, dva S segmenta sadrže komplement pune dužine ORF-a S segmenta. U određenim specifičnim izvođenjima, L segment je dobiven inženjeringom da nosi ORF u položaju koji nije položaj u divljem tipu ili L segment može da bude genomski segment divljeg tipa.
[0127] U određenim izvođenjima, jedan od dva S segmenata mogu da budu:
(i) S segment arenavirusa, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) S segment arenavirusa, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) S segment arenavirusa, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) S segment arenavirusa, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) S segment arenavirusa, pri ćemu ORF koji kodira L je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
i (vi) S segment arenavirusa, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
[0128] U određenim primerima, tri-segmentirana partikula arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta može da sadrži duplikat ORF (tj., dva ORF-a S segmenta divljeg tipa npr., GP ili NP). U specifičnim primerima, tri-segmentirana partikula arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta može da sadrži jedan ORF u duplikatu (npr., (GP, GP)) ili dva ORFs u duplikatima (npr., (GP, GP) i (NP, NP)).
[0129] Tabela 2A, u tekstu ispod, je ilustracija organizacije genoma tri-segmentirane partikule arenavirusa koja sadrži jedan L segment i dva S segmenta, pri čemu intersegmentalna rekombinacija dva S segmenta u tri-segmentirani arenavirusni genom ne dovodi do bi-segmentirane virane partikule koja je kompetentna za replikaciju i ukida arenaviralnu aktivnost promotora (tj., dobijeni rekombinovani S segment je sastavljen iz dva 3’UTRs umesto 3’ UTR i 5’ UTR).
Tabela 2A
2
(nastavak)
2
[0130] U određenim izvođenjima, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; IGR između položaja dva i tri može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; i IGR između položaja pet i šest može da bude arenavirusni L segment IGR. U specifičnom izvođenju, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni S segment IGR; IGR između položaja dva i tri može da bude arenavirusni S segment IGR; i IGR između položaja pet i šest može da bude arenavirusni L segment IGR. U određenim izvođenjima, druge kombinacije su takođe moguće. Na primer, tri-segmentirana arenavirusna partikula se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta, pri čemu intersegmentalna rekombinacija dva S segmenta u tri-segmentiranom arenavirusnom genomu ne rezultuje u kompetentnoj za replikaciju bi-segmentiranoj viralnoj partikuli i ukida arenaviralnu aktivnost promotora (tj., dobijeni rekombinantni S segment je sastavljen iz dva 5’UTR-a umesto 3’ UTR i 5’ UTR).
[0131] U određenim izvođenjima, intersegmentalna rekombinacija S segmenta i L segmenta u trisegmentalnoj arenavirusnoj partikuli se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta, obnavlja funkcionalni segment sa dva viralna gena na samo jednom segmentu umesto na dva odvojena segmenta. U drugim izvođenjima, intersegmentalna rekombinacija S segmenta i L segmenta u trisegmentalnoj arenavirusnoj partikuli se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta ne rezultuje u ompetentnoj za replikaciju bi-segmentiranoj viralnoj partikuli.
[0132] Tabela 2B, u tekstu ispod, je ilustracija organizacije genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta, pri čemu intersegmentalna rekombinacija S segmenta i L segmenta u tri-segmentiranom arenavirusnom genomu ne rezultuje u kompetentnoj za replikaciju bi-segmentiranoj viralnoj partikuli i ukida arenaviralnu aktivnost promotora (tj., dobijeni rekombinantni S segment se sastoji iz dva 3’UTR-a umesto 3’ UTR i 5’ UTR).
2
Tabela 2B
[0133] U određenim izvođenjima, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; IGR između položaja dva i tri može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; i IGR između položaja pet i šest može da bude arenavirusni L segment IGR. U specifičnom izvođenju, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni S segment IGR; IGR između položaja dva i tri može da bude arenavirusni S segment IGR; i IGR između položaja pet i šest može da bude arenavirusni L segment IGR. U određenim izvođenjima, takođe su moguće druge kombinacije. Na primer, tri-segmentirana arenavirusna čestica koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta, pri čemu intersegmentalna rekombinacija dva S segmenta u tri-segmentirani arenavirusni genom ne dovodi do bi-segmentirane viralne partikule koja je kompetentna za replikaciju i ukida arenaviralnu aktivnost promotora (tj., dobijeni rekombinantni S segment je sastavljen iz dva 5’UTRs umesto 3’ UTR i 5’ UTR).
[0134] U određenim izvođenjima, stručnjak iz oblasti tehnike može da konstruiše arenavirusni genom sa organizacijom kao što je ilustrovano na Tabeli 2A ili 2B i kao što je ovde opisano, i zatim da koristii test kao što je opisano u Odeljku 4.8 da se odredi da li tri-segmentirana arenavirusna partikula je genetički stabilna, tj., ne dobija se bi-segmentirana viralna partikula koja je kompetentna za replikaciju kao što je ovde razmotreno.
4.2.2 Tri-segmentirana Arenavirusna Partikula koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta [0135] U jednom aspektu, ovde je obezbeđena tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta. U određenim izvođenjima, propagacija tri-segmentirane arenavirusne partikule koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta ne rezultuje bisegmentiranoj viralnoj partikuli koja je kompetentna za replikaciju. U specifičnim izvođenjima, propagacija tri-segmentirane arenavirusne partikule koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta ne rezultuje u bi-segmentiranoj viralnoj partikuli koja je kompetentna za replikaciju posle najmanje 10 dana, najmanje 20 dana, najmanje 30 dana, najmanje 40 dana, ili najmanje 50 dana, najmanje 60 dana, najmanje 70 dana, najmanje 80 dana, najmanje 90 dana, najmanje 100 dana perzistencije kod miševa kojima nedostaje receptor za tip I interferona, receptot tip II interferona i gen za aktivaciju rekombinacije (RAG1), i koji su inficirani sa 10<4>PFU tri-segmentirane arenavirusne partikule (videti Odeljak 4.8.13). U drugim izvođenjima, propagacija tri-segmentirane arenavirusne partikule koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta ne rezultuje u bi-segmentiranoj viralnoj partikuli koja je kompetentna za replikaciju posle najmanje 10 pasaža, 20 pasaža, 30 pasaža, 40 pasaža, ili 50 pasaža.
[0136] U određenim izvođenjima, inter-segmentalna rekombinacija dva L segmenta od trisegmentirane arenavirusne partikule, koja je ovde obezbeđena, koja spaja dva arenaviralna ORFs u jedan umesto dva odvojena segmenta rezultuje u ne funkcionalnom promotoru (tj., genomski segment strukture: 5’ UTR-----------5’ UTR ili 3’ UTR------------3’ UTR), pri čemu svaki UTR koji obrazuje jedan kraj genoma je invertovana ponovljena sekvenca drugog kraja istog genoma.
[0137] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta je inženjeringom dobijena da nosi arenavirusni ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu. Tri-segmentirana arenavirusna partikula može da se sastoji iz dva L segmenta i jednog S sgmenta i inženjeringom je dobijena sa nosi dva ORF-a arenavirusa, ili tri ORF-a arenavirusa, ili četiri ORF-a arenavirusa, ili pet ORF-a arenavirusa, ili šest ORF-a arenavirusa u položaju koji nije položaj u divljem tipu. U specifičnim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta sadrži komplement pune dužine od sva četiri arenavirusna ORF-a. Prema tome, u nekim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula je infektivna i kompetentna za replikaciju tri-segmentirana arenavirusna partikula. U specifičnim izvođenjima, dva L segmenta od tri-segmentirane arenavirusne partikule je inženjeringom dobijena da nosi jedan od njihovih ORF-a u položaju koji nije položaj u divljem tipu. U specifičnijim izvođenjima, dva L segmenta sadrže komplement pune dužine ORF-a L segmenta. U određenim specifičnim izvođenjima, S segment je dobijen inženjeringom da nosi jedan od njihovih ORF-a u položaju koji nije položaj divljeg tipa ili S segment može da bude genomski segment divljeg tipa.
[0138] U određenim izvođenjima, jedan od dva L segmenata mogu da budu:
(i) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(ii) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iii) L segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR;
(iv) L segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR;
(v) L segment, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR; i
(vi) L segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
1
[0139] U određenim primerima, tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta može da sadrži duplikat ORF (tj., dva L segment ORF-a divljeg tipa npr., Z protein ili L protein). U specifičnim primerima, tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta mogu da sadrže jedan dupliciran ORF (npr., (Z protein, Z protein)) ili dva duplicirana ORF-a (npr., (Z protein, Z protein) i (L protein, L protein)).
[0140] Tabela 3, u tekstu ispod, je ilustracija organizacije genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta, pri čemu intersegmentalna rekombinacija dva L segmenta u tri-segmentiranom arenavirusnog genomomu ne rezultuje u kompetentnoj za replikaciju bi-segmentirane viralne partikule i ukida arenaviralnu aktivnost promotora (tj., verovatno rezultujući rekombinantni L segment može da bude sačinjen iz dva 3’UTR-a ili dva 5’ UTR-a umesto 3’ UTR i 5’ UTR). Na osnovu Tabele 3 slične kombinacije mogu da budu predviđene za dobijanje arenavirusne partikule koja je sačinjena iz 5’ UTR-a umesto 3’ UTR i 5’ UTR.
Tabela 3
nastavak
2
(nastavak)
[0141] U određenim izvođenjima, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; IGR između položaja dva i tri može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; i IGR između položaja pet i šest može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR. U specifičnom izvođenju, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni L segment IGR; IGR između položaja dva i tri može da bude arenavirusni L segment IGR; i IGR između položaja pet i šest može da bude arenavirusni S segment IGR. U određenim izvođenjima, druge kombinacije su takođe moguće.
[0142] U određenim izvođenjima intersegmentalna rekombinacija L segmenta i S segmenta iz trisegmentirane arenavirusne partikule koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta uspostavlja funkcionalni segment sa dva viralna gena na samo jednom segmentu umesto dva odvojena segmenta. U drugim izvođenjima, intersegmentalna rekombinacija L segmenta i S segmenta u tri-segmentalnu arenavirusu partikulu koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta ne rezultuje u kompetentnoj za replikaciju bi-segmentiranoj viralnoj partikuli..
[0143] Tabela 3B, u tekstu ispod, je ilustracija organizacije genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta, pri čemu intersegmentalna rekombinacija L segmenta i S segmenta u tri-segmentiranom arenavirusnom genomu ne rezultuje u kompetentnoj za replikaciju bi-segmentiranoj viralnoj partikuli i ukida aktivnost arenaviralnog promotora (tj., dobijeni rekombinantni S segment je sastavljen iz dva 3’UTR-a umesto 3’ UTR i 5’ UTR).
Tabela 3B
(nastavak)
[0144] U određenim izvođenjima, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; IGR između položaja dva i tri može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR; i IGR između položaja pet i šest može da bude arenavirusni S segment ili L segment IGR. U specifičnom izvođenju, IGR između položaja jedan i položaja dva može da bude arenavirusni L segment IGR; IGR između položaja dva ili tri može da bude arenavirusni L segment IGR; i IGR između
4
položaja pet i šest može da bude arenavirusni S segment IGR. U određenim izvođenjima, druge kombinacije su takođe moguće.
[0145] U određenim izvođenjima, stručnjak iz oblasti tehnike može da konstruiše arenavirusni genom sa organizacijom kako je ilustrovana u Tabeli 3A ili 3B i kao što je ovde opisana, i onda upotreba testa kao što se opisuje u Odeljku 4.8 da bi se odredilo da li je tri-segmentirana arenavirusna partikula genetički stabilna, tj., ne rezultuje u kompetentnoj za replikaciju bi-segmentiranoj viralnoj partikuli kao što se ovde razmatra.
4.2.3 Tri-segmentirana Arenavirusna Partikula sa oštećenjem u replikaciji
[0146] U određenim primerima, ovde je obezbeđena tri-segmentirana arenavirusna partikula u kojoj (i) ORF je u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; i (ii) ORF koji kodira GP, NP, Z protein, ili L je uklonjen ili je funkcionalno inaktivisan tako da dobijeni virus ne može dalje da proizvodi infektivne virusne partikule potomstva (tj., ima oštećenje u replikaciji). U određenim primerima, treći segment arenavirusa može da bude S segment. U drugim primerima, treći segment arenavirusa može da bude L segment. U specifičnijim primerima, treći segment arenavirusa može da se dobije inženjeringom da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu ili treći segment arenavirusa može da bude genomski segment divljeg tipa arenavirusa. U još specifičnijim primerima, trećem segmentu arenavirusa nedostaje arenavirusni ORF koji kodira GP, NP, Z protein, ili L protein.
[0147] U određenim izvođenjima, tri-segmentirani genomski segment može da bude S ili hibid L segmenta (tj., genomski segment koji može da bude kombinacija S segmenta i L segmenta). U drugim izvođenjima, hibidni segment je S segment koji se sastoji iz L segmenta IGR. U drugom izvođenju, hibridni segment je L segment koji se sastoji iz S segmenta IGR. U drugim izvođenjima, hibridni segment je S segment UTR sa i L segmentom IGR. U drugom izvođenju, hibridni segment je L segment UTR sa S segmentom IGR. U specifičnim izvođenjima, hibridni segment je S segment 5’ UTR sa L segmentom IGR ili S segment 3’ UTR sa L segmentom IGR. U drugim specifičnim izvođenjima, hibridni segment je L segment 5’ UTR sa S segmentom IGR ili L segment 3’ UTR sa S segmentom IGR.
[0148] Trisegmentirana partikula arenavirusa koja se sastoji iz genetički modifikovanog genoma u kome je jedan ili više ORF-a uklonjeno ili funkcionalno inaktivisano može da bude proizveden u komplementarnim ćelijama (tj., ćelije koje eksprimiraju arenavirusni ORF koji je uklonjen ili funkciono inaktivisan). Genetički materijal dobijene arenavirusne partikule može da se prenese nakon infekcije ćelije domaćina u ćeliju domaćina, pri čemu genetički materijal može da bude eksprimiran i umnožen. Dodatno, genom genetički modifikovane arenavirusne partikule koji je ovde opisuje mogu da kodiraju heterologni ORF iz organizma koji nije arenavirusna partikula.
[0149] U određenim primerima, najmanje jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organzima koji nije arenavirus. U drugom primeru, najmanje jedan ORF, najmanje dva ORF-a, najmanje tri ORF-a, najmanje četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein i L protein mogu da budu uklonjeni i zamenjeni sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U specifičnim primerima, samo jedan od četiri ORF-a koji kodiraju GP, NP, Z protein, i L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije partikula arenavirusa. U specifičnijim primerima, ORF koji kodira GP arenavirusnog genomskog segmenta je uklonjen. U drugom specifičnom primeru, ORF koji kodira NP arenavirusnog genomskog segmenta je uklonjen. U specifičnijim primerima, ORF koji kodira Z protein arenavirusnog genomskog segmenta je uklonjen. U još drugom specifičnom primeru, ORF koji kodira L protein je uklonjen.
[0150] U određenim primerima, ovde je prikazana tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta u kojima (i) ORF se nalazi u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; i (ii) ORF koji kodira GP ili NP je uklonjen ili je funkcionalno inaktivisan, tako da je dobiveni virus defektan u replikaciji i nije infektivan. U specifičnom primeru, jedan ORF je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugim specifičnim primerima, dva ORF-a su uklonjena i zamenjena su sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugim specifičnim primerima, tri ORF-a su uklonjena i zamenjena su sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U specifičnim primerima, ORF koji kodira GP je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugim specifičnim primerima, ORF koji kodira NP je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U još drugim specifičnim primerima, ORF koji kodira NP i ORF koji kodira GP su uklonjeni i zamenjeni su sa jednim ili dva heterologna ORF-a iz organizma koji nije arenavirusna partikula Prema tome, u određenim izvođenjima tri-segmentirana arenavirusna partikula se sastoji iz (i) jednog L segmenta i dva S segmenta; (ii) ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; (iii) jedan ili više heterolognih ORF-a iz organizma koji nije arenavirus.
[0151] U određenim primerima, ovde je obezbeđen tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta u kojima (i) ORF je u položaju koji nije položaj ORF koji je prisutan u divljem tipu; i (ii) ORF koji kodira Z protein, i/ili L protein je uklonjen ili funkcionalno inaktivisan, tako da je dobijeni virus defektan za replikaciju i nije infektivan. U specifičnom primeru, jedan ORF je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugom specifičnom primeru, dva ORF-a su uklonjena i zamenjena sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U specifičnim primerima, ORF koji kodira Z protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U drugim specifičnim primerima, ORF koji kodira L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus. U još drugim specifičnim primerima, ORF koji kodira Z protein i ORF koji kodira L protein je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirusna partikula. Prema tome, u određenim izvođenjima tri-segmentirana arenavirusna partikula se sastoji iz (i) dva L segmenta i jednog S segmenta; (ii) ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; (iii) heterologni ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0152] Prema tome, u određenim primerima, tri-segmentirana arenavirusna partikula koja je ovde prikazana sastoji se tri-segmentirane arenavirusne partikule (tj., jedan L segment i dva S segmenta ili dva L segmenta i jednog S segmenta) koji i) je dobijen inženjeringom da nosi ORF u ne-prirodnom položaju; ii) ORF koji kodira GP, NP, Z protein, ili L protein je uklonjen); iii) ORF koji je uklonjen je zamenjen sa jednim ili više heterolognim ORF-a iz organizma koji nije arenavirus.
[0153] U određenim primerima, heterologni ORF je 8 do 100 nukleotida u dužini, 15 do 100 nukleotida u dužini, 25 do 100 nukleotida u dužini, 50 do 200 nukleotida u dužini, 50 do 400 nukleotida u dužini, 200 do 500 nukleotida u dužini, ili 400 do 600 nukleotida u dužini, 500 do 800 nukleotida u dužini. U drugim primerima, heterologni ORF je 750 do 900 nukleotida u dužini, 800 do 100 nukleotida u dužini, 850 do 1000 nukleotida u dužini, 900 do 1200 nukleotida u dužini, 1000 do 1200 nukleotida u dužini, 1000 do 1500 nukleotida ili 10 do 1500 nukleotida u dužini, 1500 to 2000 nukleotida u dužini, 1700 do 2000 nukleotida u dužini, 2000 do 2300 nukleotida u dužini, 2200 do 2500 nukleotida u dužini, 2500 do 3000 nukleotida u dužini, 3000 do 3200 nukleotida u dužini, 3000 do 3500 nukleotida u dužini, 3200 do 3600 nukleotida u dužini, 3300 do 3800 nukleotida u dužini, 4000 nukleotida do 4400 nukleotida u dužini, 4200 do 4700 nukleotida u dužini, 4800 do 5000 nukleotida u dužini, 5000 do 5200 nukleotida u dužini, 5200 do 5500 nukleotida u dužini, 5500 do 5800 nukleotida u dužini, 5800 do 6000 nukleotida u dužini, 6000 do 6400 nukleotida u dužini, 6200 do 6800 nukleotida u dužini, 6600 do 7000 nukleotida u dužini, 7000 do 7200 nukleotida u dužini, 7200 do 7500 nukleotida u dužini, ili 7500 nukleotida u dužini. U nekim primerima, heterologni ORF kodira peptid ili polipeptid koji je 5 do 10 aminokiselina u dužini, 10 do 25 aminokiselina u dužini, 25 do 50 aminokiselina u dužini, 50 do 100 aminokiselina u dužini, 100 do 150 aminokiselina u dužini, 150 do 200 aminokiselina u dužini, 200 do 250 a aminokiselina u dužini, 250 do 300 aminokiselina u dužini, 300 do 400 aminokiselina u dužini, 400 do 500 aminokiselina u dužini, 500 do 750 aminokiselina u dužini, 750 do 1000 aminokiselina u dužini, 1000 do 1250 aminokiselina u dužini, 1250 do 1500 aminokiselina u dužini, 1500 do 1750 aminokiselina u dužini, 1750 do 2000 aminokiselina u dužini, 2000 do 2500 aminokiselina u dužini, ili više od 2500 ili više aminokiselina u dužini. U nekim primerima, heterologni ORF kodira polipeptid koji ne prelazi preko 2500 aminokiselina u dužini. U specifičnim primerima heterologni ORF ne sadrži stop kodon. U određenim primerima, heterologni ORF je optimizovan u kodonu. U određenim primerima, kompozicija nukleotida, kompozicija nukleotidnog para ili oba mogu da budu optimizovana. Postupci za takve optimizacije su poznati u oblasti tehnike i mogu da se primene da optimizuju heterologni ORF.
[0154] Bilo koji heterologni ORF iz organizma koji nije arenavirus može da bude uključen u trisegmentiranu arenavirusnu partikulu. U jednom primeru, heterologni ORF koji kodira reporterski protein. Detaljniji opis reporterskih proteina je opisan u Odeljku 4.3. U drugom primeru, heterologni ORF kodira antigen za infektivni patogen ili antigen koji je povezan sa bilo kojom bolesti i gde je antigen sposoban da pokreće imunski odgovor. U specifičnim primerima, antigen je dobijen iz infektivnog organizma, tumora (tj., kancera), ili alergena. Detaljniji opis heterolognih ORF-a je opisan u Odeljku 4.3
[0155] U određenim primerima, rast i infektivnost arenavirusne partikule nije pogođen sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0156] Postupci koji su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike mogu da se koriste da bi se proizvela arenavirusna partikula koja se sastoji iz arenavirusnog genomskog segmenta koji je dobijen inženjeringom da nosi arenavirusni ORF u položaju koji nije položaj koji je prisutan u divljem tipu. Na primer, postupci reverzne genetike mogu da se koriste za dobijanje takve arenavirusne partikule. U drugim primerima, arenavirusna čestica koja je defektna za replikaciju (tj., arenavirusni genomski segment koji je dobijen inženjeringom da nosi arenavirusni ORF u položaju koji nije položaj u divljemtipu, pri čemu ORF koji kodira GP, NP, Z protein, L protein, je uklonjen) može da bude proizveden u komplementarnoj ćeliji.
[0157] U određenim primerima, tri-segmentirana arenavirusna partikula koja se koristi prema predmetnoj prijavi mogu da budu virusi starog sveta, na primer, LCMV.
[0158] U određenim primerima, predmetna prijava se odnosi na arenavirusnu partikulu kao što je ovde opisano za upotrebu kao vakcina i postupci za upotrebu takve arenavirusne partikule u vakcinaciji i lečenju ili prevenciji, na primer, infekcija i kancera. Detaljniji opis postupaka za upotrebu arenavirusne partikule koja se ovde opisuje je obezbeđen u Opisu 4.6.
[0159] U određenim primerima, predmetna prijava se odnosi na arenavirusnu partikulu kao što se ovde opisuje koja je pogodna za upotrebu kao farmaceutska kompozicija i postupci za upotrebu takve arenavirusne partikule u vakcinaciji i lečenju ili prevenciji, na primer, infekcija ili kancera. Detaljniji opis postupaka za upotrebu arenavirusne partikule koja se ovde opisuje je obezbeđen u Opisu 4.6.
4.3 Arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF
[0160] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, i odgovarajuća arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula može da sadrži heterologni ORF. U drugim izvođenjima, arenavirusni genomski segment i odgovarajuća arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula može da sadrži gen od interesa. U specifičnijim izvođenjima, heterologni ORF ili gen od interesa kodira antigen. U specifičnijim izvođenjima, heterologni ORF ili gen od interesa kodira reporterski protein ili fluorescentni protein.
[0161] Arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula može da sadrži jedan ili više heterolognih ORF-a ili jedan ili više gena od interesa. Arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula može da sadrži najmanje jedan heterologni ORF, najmanje dva heterologna ORF-a, najmanje tri heterologna ORF-a, ili više heterolognih ORF-a. Arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula mogu da sadrže najmanje jedan gen od interesa, najmanje dva gena od interesa, najmanje tri gena od interesa, ili više gena od interesa.
[0162] Širok izbor antigena može da bude eksprimiran pomoću arenavirusnog genomskog segmenta, arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule iz predmetne prijave. U jednom izvođenju, heterologni ORF kodira antigen infektivnog patogena ili antigen koji je povezan sa bilo kojom bolesti koji je sposoban da pokrene imuni odgovor. U određenim izvođenjima, heterologni ORF može da kodira antigen koji je dobiven od virusa, bakterije, gljivice, parazita, ili može da bude eksprimiran u tumoru ili bolesti koja je povezana sa tumorom (tj., kancer), autoimunoj bolesti, degenerativnoj bolesti, naslednoj bolesti, zavisnosti od supstanci, gojaznosti, ili alergijskoj bolesti.
[0163] U nekim izvođenjima, heterologni ORF kodira virusni antigen. Ne-ograničavajući primeri virusnih antigena uključuju antigene poreklom iz adenoviridae (npr., mastadenovirus i aviadenovirus), herpesviridae (npr., herpes simpleks virus 1, herpes simpleks virus 2, herpes simpleks virus 5, herpes simpleks virus 6, Epstein-Barov virus, HHV6-HHV8 i citomegalovirus), leviviridae (npr., levivirus, enterobacteria phase MS2, allolevirus), poxyiridae (npr., chordopoxyirinae, parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporiipoxvirus, suipoxvirus, molluscipoxvirus, i entomopoxyirinae), papovaviridae (nor., polyomavirus i papillomavirus), paramyxoviridae (npr., paramyxovirus, parainfluenza virus 1, mobillivirus (npr., viirus boginja), rubulavirus (npr., virus zauški), pneumonovirinae (npr., pneumovirus, humani respiratorni sincicijalni virus), humani respiratorni sincicijalni virus i metapneumovirus (npr., ptičji pneumovirus i humani metapneumovirus), picornaviridae (npr., enterovirus, rhinovirus, hepatovirus (npr., humani hepatitis A virus), kardiovirus, i apthovirus), reoviridae (npr., orthoreovirus, orbivirus, rotavirus, cypovirus, fijivirus, phytoreovirus, i oryzavirus), retroviridae (npr., sisarski retrovirusi tipa B, sisarski retrovirusi tipa C, ptičji retrovirusi tipa C, tip D grupe retrovirusa, BLV-HTLV retrovirusi, lentivirus (npr. virus humane imunodeficijencije (HIV) 1 i HIV-2 (npr., HIV gp160), spumavirus), flaviviridae (npr., hepatitis C virus, virus denga, virus Zapadnog Nila), hepadnaviridae (npr., hepatitis B virus), togaviridae (npr., alphavirus (npr., sindbis virus) i rubivirus (npr., virus rubele)), rhabdoviridae (npr., vesiculovirus, lyssavirus, ephemerovirus, cytorhabdovirus, i necleorhabdovirus), arenaviridae (npr., arenavirus, virus limfocitnog horiomeningitisa, Ippy virus, i lassa virus), i coronaviridae (npr., coronavirus i torovirus). U specifičnom izvođenju virusni antigen, je HIV gp120, gp41, HIV Nef, RSV F glikoprotein, RSV G glikoprotein, HTLV tax, glikoprotein herpes simpleks virusa (npr., gB, gC, gD, i gE) ili površinski antigen hepatitisa B, protein E virusa hepatitis C ili protein bodlja koronavirusa. U jednom izvođenju, virusni antigen nije HIV antigen.
[0164] U drugim izvođenjima, heterologni ORF kodira bakterijski antigen (npr., bakterijski protein omotača). U drugim izvođenjima, heterologni ORF kodira antigen parazita (npr., antigen protozoe). U još drugim izvođenjima, heterologna nukleotidna sekvenca kodira gljivični antigen.
[0165] Ne-ograničavajući primeri bakterijskih antigena uključuju antigene iz bakterija familije Aquaspirillum, Azospirillum familije, Azotobacteraceae familije, Bacteroidaceae familije, Bartonella vrsta, Bdellovibrio familije, Campylobacter vrsta, Chlamydia vrsta (npr., Chlamydia pneumoniae), Clostridium, Enterobacteriaceae familije (npr., Citrobacter vrsta, Edwardsiella, Enterobacter aerogenes, Envinia vrsta, Escherichia coli, Hafnia vrsta, Klebsiella vrsta, Morganella vrsta, Proteus vulgaris, Providencia, Salmonella vrsta, Serratia marcescens, i Shigella flexneri), Gardinella familije, Haemophilus influenzae, Halobacteriaceae familije, Helicobacter familije, Legionallaceae familije, Listeria vrsta, Methylococcaceae familije, mikobakterija (npr., Mycobacterium tuberculosis), Neisseriaceae familje, Oceanospirillum familije, Pasteurellaceae familije, Pneumococcus vrsta, Pseudomonas vrsta, Rhizobiaceae familije, Spirillum familije, Spirosomaceae familije, Staphylococcus (npr., rezistentan na meticilin Staphylococcus aureus i Staphylococcus pyrogenes), Streptococcus (npr., Streptococcus enteritidis, Streptococcus fasciae, i Streptococcus pneumoniae), Vampirovibr Helicobacter familija, Yersinia familija, Bacillus antracis i Vampirovibrio familija.
[0166] Ne-ograničavajući primeri parazitnih antigena uključuju antigene iz parazita kao što su ameba, parazit koji prenosi malariju, Plasmodium, Trypanosoma cruzi. Ne-ograničavajući primeri gljivičnih antigena uključuju antigene iz gljivice vrste Absidia (npr., Absidia corymbifera i Absidia ramosa), Aspergillus species, (npr., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, i Aspergillus terreus), Basidiobolus ranarum, Blastomyces dermatitidis, Candida vrsta (npr., Candida albicans, Candida glabrata, Candida kern, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii, Candida rugosa, Candida stellatoidea, i Candida tropicalis), Coccidioides immitis, Conidiobolus species, Cryptococcus neoforms, Cunninghamella vrste, dermatophytes, Histoplasma capsulatum, Microsporum gypseum, Mucor pusillus, Paracoccidioides brasiliensis, Pseudallescheria boydii, Rhinosporidium seeberi, Pneumocystis carinii, Rhizopus vrste (npr., Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae, i Rhizopus microsporus), Saccharomyces species, Sporothrix schenckii, zygomycetes, i klase kao što su Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes, i Oomycetes.
[0167] U nekim izvođenjima, heterologni ORF kodira tumorski antigen ili antigen koji je povezan sa tumorom. U nekim izvođenjima, tumorski antigen ili antigen koji je povezan sa tumorom uključuje antigene iz bolesti koje su povezane sa tumorom uključujući akutnu limfoblastnu leukemiju, akutnu mieloidnu leukemiju, adrenokortikalni karcinom, dečiji adrenokortikalni karcinom, AIDS-povezane kancere, Kapošijev Sarkom, analni kancer, kancer slepog creva, astrocitome, atipični teratoidni/rabdoidni tumor, karcinom bazalnih ćelija, karcinom žučnih puteva, ekstrahepatični (videti holangiokarcinom), kancer bešike, osteosarkom kosti/maligni fibrozni histiocitom, gliom moždanog stabla, kancer mozga, tumor mozga, cerebelarni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom tumor mozga, ependimom, meduloblastom, supratentorialni primitivni neuroektodermalni tumori, gliom vizuelnog puta i hipotalamusa, kancer grudi, bronhijalni adenomi/karcinoidi, burkitov limfom, karcinoidni tumor, karcinoidni gastrointestinalni tumor, karcinom nepoznatog primarnog, limfom centralnog nervnog sistema, primarni, cerebelarni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom, cervikalni kancer, kanceri u detinjstvu, hronični bronhitis, hronična limfocitna leukemija, hronična mijelogena leukemija, hronični mijeloproliferativni poremećaji, kancer debelog creva, kutanozni T-ćelijski limfom, dezmoplastični tumor malih okruglih ćelija, emfizem, kancer endometrijuma, ependimom, kancer jednjaka, ewing-ov sarkom u Ewing-ovoj familiji tumora, ekstrakranijalni tumor germinativnih ćelija, ekstragonadalni tumor germinativnih ćelija, ekstrahepatični kancer žučnih puteva, intraokularni melanom, retinoblastom, kancer žučne kese, gastrični (stomak) kancer, gastrointestinalni karcinoidni tumor, gastrointestinalni stromalni tumor, tumor germinativnih ćelija: ekstrakranijalni, ekstragonadalni, ili gestacijski trofoblastni tumor jajnika, gliom moždanog stabla, gliom, cerebralni astrocitom u detinjstvu, vizuelnog puta i hipotalamusa u detinjstvu, karcinoid želuca, leukemija dlakastih ćelija, kancer glave i vrata, kancer srca, hepatoćelijski (jetra) kancer, Hodčkinov limfom, hipofaringealni kancer, gliom hipotalamusnih i vizuelnih puteva, intraočni melanom, karcinom ćelija ostrvaca (endokrini pankreas), Kapošijev sarkom, kancer bubrega (kancer ćelija bubrega), kancer larinksa, akutni limfoblastni limfom, akutna limfocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija, hronična limfocitna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, kacer usne i oralne šupljine, liposarkom, kancer jetre (primarni), kancer pluća, ne-sitnih ćelija, malih ćelija, AIDS-povezanog limfoma, Burkittov limfom, kutanozni limfom T-ćelija, Hodčkinov limofom, ne-Hodčkinov limfom, limfom, primarnog centralnog nervnog sistema, makroglobulinemija, Waldenström, kancer muške dojke, maligni fibrozni histiocitom kostiju/osteosarkoma, meduloblastom, melanom, intraokularni (oko), kancer merkelovih ćelija, mezoteliom, adultni maligni, mezoteliom, metastatski skvamozni kancer vrata sa okultnim primarnim, kancer usta, sindrom multiple endokrine neoplazije, multipli mijelom/neoplazma plazma ćelija, mikozni fungoidi (kožni limfom T ćelija), mijelodisplatični sindromi, mijelodisplastični/mijeloproliferativni poremećaji, mijelogena leukemija, hronična, mijeloidna leukemija, adultna akutna, mijeloidna leukemija, akutna u detinjstvu, mijelom, multiple (kancer kostne srži), mijeloproliferativni poremećaji, hronični, kancer nazalne šupljine i paranazalnog sinusa, nazofaringealni karcinom, neuroblastom, kancer ne-sitnoćelijskih ćelija pluća, oligodendrogliom, oralni kancer, orofaringealni kancer, osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom kosti, kancer ovarijuma, kancer epitela ovarijuma (površinski epitelijalni-stromalni tumor), tumor germinativnih ćelija ovarijuma, tumor ovarijuma niskog malignog potencijala, kancer pankreasa, ćelija ostrvaca, paranazalnog sinusa i kancer nazalne šupljine, paratiroidni kancer, kancer penisa, kancer ždrela, feohromocitom, pinealni astrocitom, pinealni germinom, pineoblastom i supratentorijalni primitivni neuroektodermalni tumori, adenom hipofize, neoplazija plazma ćelije/multipli mijelom, pleuropulmonarni blastom, limfom primarnog centralnog nervnog sistema, kancer prostate, rektalni kancer, karcinom bubrežnih ćelija (kancer bubrega), bubrežnog pelvisa i uretre, kancer tranzicionih ćelija, retinoblastom, rabdomiosarkom, u detinjstvu, kancer pljuvačne žlezde, sarkom, Ewing-ova familija tumora, Kapošijev sarkom, sarkom mekih tkiva, sarkom uterusa, sézary-jev melanom), kancer kože (melanoma), karcinom merkelovih ćelija kože, kancer malih ćelija pluća, kancer tankog creva, sarkom mekog tkiva, karcinom skvamoznih ćelija – videti kancer kože (ne-melanom), skvamozni kancer vrata sa okultnim primarnim, metastatskim, kancerom stomaka, supratentorijalnim primitivnim neuroektodermalnim tumorom, limfomom T-ćelija, kutanoznim - videti Mycosis Fungoides i Sezary-jev sindrom, kancer testisa, kancer grla, timom i karcinom timusa, kancer tiroidee, dečiji kancer tranzicionih ćelija bubrežne karlice i uretre, gestacijski trofoblastni tumor, nepoznato primarno mesto, karcinom, adulta nepoznatog primarnog mesta, dečiji kancer, uretre i bubrežne karlice, tranzicioni ćelijski kancer, karcinom uretre, kancer uterusa, endometrijalni sarkom uterusa, bronhijalni tumor, embrionalni tumor centralnog nervnog sistema; dečiji hordom, kolorektalni kancer, kraniofaringiom, ependimoblastom, histiocitoza langerhansovih ćelija, akutna limfoblastna leukemija, akutna mijeloidna leukemija (adultna / dečija), kancer malih ćelija pluća, meduloepiteliom, kancer oralne šupljine, papilomatoza, pinealni parenhimalni tumori intermedijerne diferencijacije, tumor hipofize, karcinom respiratornog trakta koji uključuje NUT gen na hromozomu 15, tumor kičmene moždine, timom, tiroidni kancer, vaginalni kancer; kancer vulve, i Wilms-ov Tumor.
[0168] Ne-ograničavajući primeri tumora ili antigena povezanih sa tumorom uključuju Adipofilin, AIM-2, ALDH1A1, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, cyclin D1, DKK1, ENAH (hMena), EpCAM, EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDOl, IGF2B3, IL13Ralfa2, Intestinalnu karboksil esterazu, alfa-fetoprotein, Kalikrein 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53, PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE- 1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernin 1, SOX10, STEAP1, survivin, Telomerazu, VEGF, ili WT1, EGF-R, CEA, CD52, gp 100 protein, MELANA/MART1, NY-ESO-1, p53 MAGE1, MAGE3 i CDK4, alfa-aktinin-4, ARTC1, BCR-ABL fuzioni protein (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-katenin, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, dek-can fuzioni protein, EFTUD2, elongacioni faktor 2, ETV6-AML1 fuzioni protein, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, LDLR-fukoziltransferazaAS fuzioni protein, NFYC, OGT, OS-9, pml-RARalfa fuzioni protein, PRDX5, PTPRK, K-ras, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SYT-SSX1 or -SSX2 fuzioni protein, TGF-betaRII, Triosefosofat izomeraza, Lengsin, M-CSF, MCSP, ili mdm-2.
[0169] U nekim izvođenjima, heterologni ORF kodira antigen respiratornog patogena. U specifičnom izvođenju, respiratorni patogen je virus kao što je RSV, koronavirus, humani metapneumovirus, virus parainfluence, hendra virus, nipah virus, adenovirus, rinovirus, ili PRRSV. Ne-ogrančavajući primeri respiratornih virusnih antigena uključuju respiratorni sincicijalni virus F, G i M2 proteine, koronavirus
4
(SARS, HuCoV) proteine u obliku bodlji (S), fuzione proteine humanog metapneumovirusa, fuzione i hemaglutininske proteine virusa parainfluence (F, HN), Hendra virus (HeV) i Nipah virus (NiV) glikoproteine vezivanja (G i F), proteine kapsida Adenovirusa, proteine Rhinovirus-a, i PRRSV divljeg tipa ili modifikovane GP5 i M proteine.
[0170] U specifičnom izvođenju, respiratorni patogen je bakterija kao što je Bacillus anthracis, mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis, streptococcus pneumoniae, yersinia pestis, staphylococcus aureus, Francisella tularensis, legionella pneumophila, chlamydia pneumoniae, pseudomonas aeruginosa, neisseria meningitides, i haemophilus influenzae. Ne-ograničavajući primeri respiratornih bakterijskih antigena uključuju Bacillus anthracis zaštitni antigen PA, Mycobacterium tuberculosis mikobakterijski antigen 85A i protein toplotnog šoka (eng. heat shock protein) (Hsp65), Bordetella pertussis pertussis toksoid (PT) i filamentozni hemaglutinin (FHA), Streptococcus pneumoniae sortaza A i površinski adhezin A (PsaA), Yersinia pestis F1 i V podjedinice, i proteini iz Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitides, i Haemophilus influenzae.
[0171] U nekim izvođenjima, heterologni ORF kodira T-ćelijski epitop. U drugim izvođenjima, heterologni ORF kodira citokin ili faktor rasta.
[0172] U drugim izvođenjima, heterologni ORF kodira antigen koji je eksprimiran u autoimunoj bolesti. U specifičnijim izvođenjima, može da bude dijabetes tipa I, multiple skleroza, reumatoidni artritis, eritemski lupus, i psorijaza. Ne-ograničavajući primeri antigena autoimune bolesti uključuju Ro60, dsDNK, ili RNP .
[0173] U drugim izvođenjima, ORF kodira antigen koji je eksprimiran u alergijskoj bolesti. U specifičnijim izvođenjima, alergijska bolest može da uključi ali nije ograničena na sezonski i višegodišnji rinokonjunktivitis, astmu, i ekscem. Ne-ograničavajući primeri antigena alergene uključuju Bet v 1 i Fel d 1.
[0174] U drugim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula dalje sadrži reporterski protein. Reporterski protein je sposoban za ekspresiju istovremeno kao antigen koji se ovde opisuje. Idealno, ekspresija je vidljiva pod normalnom svetlosti ili drugim talasnim dužinama svetlosti. U određenim izvođenjima, intenzitet efekat koji je dobiven sa reporterskim proteinom i može da se koristi za direktno merenje i praćenje arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule.
[0175] Reporterski geni će brzo biti prepoznati od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula je fluorescentni protein. U drugim izvođenjima, reporterski gen je GFP. GFP emituje svetlo zelenu svetlost kada se izlože UV ili slično plavoj boji.
[0176] Ne-ograničavajuči primeri reporterskih proteina uključujući različite enzime, kao što su, ali ne na β-galaktozidaza, hloramfenikol acetiltransferaza, neomicin fosfotransferaza, luciferaza ili RFP.
[0177] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF ima poželjna svojstva za potrebu kao vektor za vakcinaciju (videti npr., Odeljak 4.6). U drugom izvođenju, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF je sposobna za indukovanje imunskog odgovora kod domaćina (npr., miša zeca, koze, majmuna, čoveka). U drugim primerima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF koja se ovde opisuje indukuje urođeni imunski odgovor. U drugim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF indukuje adaptivni imunski odgovor. U specifičnijim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF i urođenog i adaptivnog imunskog odgovora.
[0178] U drugom izvođenju, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF indukuje T ćelijski odgovor. U još specifičnijim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF indukuje CD8<+>T ćelijski odgovor. U drugim izvođenjima, arenavirusna partikula koja nosi strani gen od interesa indukuje potentan CD8<+>T ćelijski odgovor visoke učestalosti i funkcionalnosti. U drugim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena indukuje CD8<+>T ćelije specifične za jedan ili višestruke epitope odgovarajućeg stranog gena od interesa.
[0179] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF može da indukuje diferencijaciju T pomoćničku 1, obrazovanje memorijskih CD4<+>T ćelija i/ili pokretanje trajnih odgovora antitela. Ova antitela mogu da budu neutralizujuća, opsonizujuća, toksična prema tumorskim ćelijama ili imaju druge poželjne biološke odgovore. U drugim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira heterologni ORF ima jak tropizam za dendritične ćelije i aktivira ih nakon infekcije. Ovo potencira prezentovanje antigena od strane antigen prezentujućih ćelija.
[0180] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segment, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena indukuje niske ili nedetektabilne titre neutralizujućih antitela protiv LCMV i visoko zaštitne odgovore neutralizujućih antitela prema odgovarajućem stranom transgenu. U nekim izvođenjima, arenavirusni bočni lanac koji obrazuje partikulu ili tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena ima nizak kapacitet za indukovanje imuniteta prema komponentama arenaviralnog bočnog lanca.
4.4 Dobijanje arenavirusne partikule i tri-segmentirana arenavirusna partikula
[0181] Generalno, arenavirusne partikule mogu da budu rekombinantno proizvedene korišćenjem standardnih postupaka reverzne genetike kao što je opisano za LCMV (videti Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668; Sanchez et al., 2006, Virology 350:370; Ortiz-Riano et al., 2013, J Gen Virol.94:1175-88). Da bi se dobile ovde obezbeđene arenavirusne partikule, ovi postupci mogu da se primene kao što je opisano u tekstu ispod. Genom virusa može da bude modifikovan kao što je opisano redom u Odeljku 4.1 i Odeljku 4.2.
4.4.1 Ne-prirodnan položaj otvorenog okvira čitanja
[0182] Dobijanje arenavirusne partikule koja se sastoji iz genomskog segmenta koji je modifikovan da nosi virusni ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu može rekombinantno da bude proizveden bilo kojim reverzno genetičkim postupcima koji su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike. (i) Infektivna i kompetentna za replikaciju arenavirusna partikula
[0183] U određenim izvođenjima, postupak dobijanja arenavirusne partikule sadrži (i) transfekciju u ćeliju domaćina cDNK prvog arenavirusnog genomskog segmenta; (ii) transfekciju u ćeliju domaćina cDNK drugog arenavirusnog genomskog segmenta; (iii) transfekciju u ćeliju domaćina plazmida koji eksprimiraju arenavirusne minimalme faktore sa trans-delovanjem NP i L; (iv) održavanje ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i (v) sakupljanja arenavirusne partikule. U određenim specifičnijim izvođenjima, cDNK se nalazi u plazmidu.
[0184] Jednom kada je dobijena iz cDNK, arenavirusne partikule (tj., infektivne i kompetentne za replikaciju) mogu da se propagiraju. U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula može da bude propagirana u bilo kojoj ćeliji domaćina koja omogućava da virus raste do titara koji omogućavaju upotrebe virusa kao što je ovde opisano. U jednom izvođenju, ćelija domaćina omogućava arenavirusnoj partikuli da raste do titara koji su uporedivi sa onim koji su određeni za odgovarajući divlji tip.
[0185] U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula može da bude propagirana u ćelijama domaćina. Specifični primeri ćelija domaćina koji mogu da se koriste uključuju BHK-21, HEK 293, VERO ili druge. U specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula može da bude propagirana u ćelijskoj liniji.
[0186] U određenim izvođenjima, ćelije domaćina su držane u kulturi i transfektovane su sa jednim ili više plazmida. Plazmidi eksprimiraju arenavirusne genomske segmente koji treba da se dobiju pod kontrolom jedne ili više ekspresione kasete koje su pogodne za eksprimiranje u sisarskim ćelijama, npr., koja se sastoji iz promotora polimeraze I i terminatora.
[0187] Plazmidi koji mogu da se koriste za dobijanje arenavirusne partikule mogu da uključe: i) plazmid koji kodira S genomski segment npr., pol-I S, ii) plazmid koji kodira L genomski segment npr., pol-I L. U određenim izvođenjima, plazmid koji kodira polimerazu arenavirusa koja usmerava unutarćelijsku sintezu virusnih L i S segmenata može da bude uključen u smešu za transfekciju. Na primer, plazmid koji kodira L protein i/ili plazmid koji kodira NP (pC-L i pC-NP, redom) može da bude prisutan. L protein i NP su minimalni faktori sa trans-delovanjem koji su neophodni za transkripciju virusne RNK i replikacije. Alternativno, unutarćelijska sinteza virusnih L i S segmenata, zajedno sa NP i L proteinom može da se izvede korišćenjem ekspresione kasete sa promotorima za pol-I i pol-II koji čitaju sa suprotnih krajeva u L i S segment cDNK dva različita plazmida, redom.
[0188] U određenim izvođenjima, arenavirusni genomski segmenti se nalaze pod kontrolom promotora. Obično, ekspresione kasete vođene RNK polimerazom I, kasete vođene RNK polimerazom II ili kasete vođene RNK polimerazom T7 bakteriofaga mogu da se koriste. U određenim izvođenjima, plazmidi koji kodiraju arenavirusne genomske segmente mogu da budu isti, tj., genomska sekvenca i faktori sa trans delovanjem mogu da se transkribuju sa promotora iz jednog plazmida. Specifični primeri promotora uključuju promotor za RNK polimerazu I, promotor za RNK polimerazu II, promotor za RNA polimerazu III, T7 promotor, SP6 promotor ili T3 promotor.
[0189] Dodatno, mogu sadržati sisarski selekcioni marker, npr., rezistenciju na puromicin, pod kontrolom ekspresione kasete koja je odgovarajuća za ekspresiju gena u sisarskim ćelijama, npr., ekspresiona kaseta polimeraze II kao što je navedeno gore u tekstu, ili transkripti virusnih gena su praćeni unutrašnjim mestom ulaska ribozoma, kao što je virus encefalomiokarditisa, koji prati sisarski marker rezistencije. Za proizvodnju u E.coli, plazmid dodatno ima bakterijski selekcioni marker, kao što je kaseta za rezistenciju na ampicilin.
[0190] Transfekcija ćelije domaćina sa plazmidima može da se izvede upotrebom bilo koje od uobičajeno korišćenih strategija kao što je kalcijum-fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija. Nekoliko dana kasnije odgovarajući selekcioni agens, npr., puromicin, je dodat u titriranim koncentracijama. Preživeli klonovi su izolovani i subklonirani u skladu sa standardnim postupcima, i klonovi sa visokom ekspresijom su identifikovani korišćenjem postupaka
4
„Western blot“ ili protočne citometrije sa antitelima koja su usmerena protiv virusnih proteina od interesa.
[0191] Za dobijanje ovde opisane arenavirusne partikule, predviđeni su sledeći postupci. Prvi dan: ćelije, obično 80% konfluentne M6 u bunarićima ploča, su transfektovane sa smešom plazmida, kao što je opisano gore u tekstu. Za ovo se može iskoristiti bilo koja uobičajena strategija kao što je kalcijum-fosfat, protokoli zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija.
[0192] 3-5 dana kasnije: Supernatant kulture (priprema za vektor arenavirusa) je sakupljen, alikvotiran i skladišten je na 4 °C, -20 °C, ili -80 °C, u zavisnosti od toga koliko dugo arenavirusni vektor treba da se skladišti pre upotrebe. Infektivni titar preparata arenavirusnog vektora je procenjen sa testom imunofokusiranja. Alternativno, transfektovane ćelije i supernatanti mogu da se pasažiraju u veće posude (npr., T75 posuda za tkivnu kulturu) u 3-5 danu posle transfekcije, i supernatant kulture je sakupljen do pet dana posle izvršenog pasaža.
[0193] Predmetna prijava se dalje odnosi na ekspresiju heterolognih ORF, pri čemu plazmid koji kodira genomski segment je modifikovan do uključenog heterolognog ORF. Heterologni ORF može da bude uključen u plazmid upotrebom restrikcionih enzima.
(ii) Infektivna, defektna za replikaciju arenavirusna partikula
[0194] Infektivne, defektne za replikaciju arenavirusne partikule mogu da budu spasene kao što je opisano gore u tekstu. Međutim, jednom kada se dobiju iz cDNK, ovde prikazani infektivni, deficijentni za replikaciju arenavirusi mogu da se propagiraju u komplementarnim ćelijama. Komplementarne ćelije su ćelije koje obezbeđuju funkcionalnost koja je eliminisana iz deficijentnog za replikaciju arenavirusa modifikovanjem njegovog genoma (npr., ukolko ORF koji kodira GP protein je uklonjen ili je funkcionalno inaktivniran, komplementarna ćelija obezbeđuje GP protein).
[0195] Zahvaljujući uklanjanju ili funkcionalnoj inaktivaciji jednog ili više ORF u arenavirusnim vektorima (ovde će uklanjanje glikoproteina, GP, biti uzeto kao primer), arenavirusni vektori mogu da se dobiju i prošire u ćelijama koje obezbeđuju in trans ukonjene virusne gene, npr., GP u predmetnom primeru. Takva komplementarna ćelijska linija, od sada se naziva C-ćelije, je dobijena transfekcijom ćelijske linije kao što je BHK-21, HEK 293, VERO ili drugih sa jednim ili više plazmida za ekspresiju virusnih gena od interesa (komplementarni plazmid, naznačen sa C-plazmid). C-plazmidi eksprimiraju virusne gene koji su uklonjeni u arenavirusnom vektoru koji treba da se dobiju pod kontrolom jedne ili više ekspresionih kaseta koje su pogodne za ekspresiju u sisarskim ćelijama, npr., promotor za sisarsku polimerazu II kao što je EF1 alfa promotor sa signalom za poliadenilaciju. Dodatno, komplementarni plazmid ima sisarski selekcioni marker, npr., rezistenciju na puromicin, pod kontrolom ekspresione kasete koja je pogodna za gensku ekspresiju u sisarskim ćelijama, npr., ekspresiona kaseta za polimerazu II kao što je opisano gore u tekstu, ili transkripti virusnog gena koji su praćeni sa unutrašnjim mestom za ulazak u ribozom, kao što je virus encefalomiokarditisa, koje prati sisarski marker za rezistenciju. Za proizvodnju u E. coli, plazmid dodatno ima bakterijski selekcioni marker, kao što je kaseta koja je rezistentna na ampicilin.
[0196] Ćelije koje mogu da se koriste, npr., BHK-21, HEK 293, MC57G ili druge, su držane u kulturi i transfektovane su sa komplementarnim plazmidima korišćenjem bilo koje od uobičajeno korišćenih strategija kao što su kalcijum-fosfat, protokoli zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija. Nekoliko dana kasnije odgovarajući sekecioni agens, npr., puromicin, se dodaje u titriranim koncentracijama. Preživeli klonovi su izolovani u subklonirani u skladu sa standardnim postupcima, i visoko eksprimirajući C-ćelijski klonovi su identifikovani korišćenjem postupaka „Western blot“ ili protočne citometrije sa antitelima koja su usmerena protiv virusnih proteina od interesa. Kao alternativa upotrebe stabilno trensfektovanih C-ćelija prolazna transfekcija normalnih ćelija može da dopuni virusne gene koji nedostaju u svakom od koraka gde će se koristiti C-ćelije u tekstu ispod. Dodatno, pomoćnički virus može da se koristi da se obezbedi funkcionalnost koja nedostaje in trans.
[0197] Plazmidi mogu da budu dva tipa: i) dva plazmida, koja su naznačena sa TF-plazmidi za eksprimiranje unutarćelijski u C-ćelijama minimalnih faktora arenavirusa sa trans delovanjem, koji je dobijen od npr., NP i L proteina LCMV u predmetnom primeru; i ii) plazmidi, koji su naznačeni kao GS-plazmidi, za eksprimiranje unutarćelijski u C-ćelijama genomskih segmenata arenavirusnog vektora, npr., segmenata sa dizajniranim modifikacijama. TF-plazmidi eksprimiraju NP i L proteine određenog arenavirusnog vektora pod kontrolom ekspresione kasete koja je pogodna za ekspresiju proteina u sisarskim ćelijama, obično npr., pomotor za sisarsku polimerazu II kao što je CMV ili EF1alfa promotor, bilo koji od njih poželjno u kombinaciji sa signalom za poliadenilaciju. GS-plazmidi eksprimiraju male (S) i velike (L) genomske segmente vektora. Obično, ekspresione kasete koje su vođene polimerazom I ili ekspresione kasete koje su vođene RNK polimerazom T7 bakteriofaga (T7-) mogu da se koriste, poslednja preferencijalno sa 3 ’-terminalnim ribozimom za obradu primarnog transkripta da se dobije ispravan kraj. U slučaju upotrebe sistema koji je zasnovan na T7, ekspresija T7 u C-ćelijama mora da bude obezbeđena ili uključujući u postupak dobijanja dodatnog ekspresionog plazmida, koji je konstruisan analogno sa TF-plazmidima, pri čemu obezbeđene T7, ili C-ćelije su konstruisane da dodatno eksprimiraju T7 na stabilan način. U određenim izbođenjima, TF i GS plazmidi mogu da budu isti, tj., genomska sekvenca i faktori sa trans delovanjem mogu da budu transkribovani sa promotora T7, poll i polII iz jednog plazmida.
[0198] Za dobijanje arenavirusnog vektora, mogu da se koriste sledeći postupci. Prvi dan: C-ćelije, obično 80% konfluentne u bunarićima ploča M6, su tranfektovane sa smešom dva TF-plazmida plus dva GS-plazmida. U određenim izvođenjima, TF i GS plazmidi mogu da budu isti, tj., genomska sekvenca i faktori sa trans delovanjem mogu da budu transkribovani sa promotora T7, poll i polII iz jednog plazmida. Za ovo se može iskoristiti bilo koja od najčešće korišćenih strategija kao što je kalcijum-fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija.
[0199] 3-5 dana kasnije: Supernatant kulture (preparat arenavirusnog vektora) je sakupljen, alikvotiran i skladišten je na 4 °C, -20 °C ili -80 °C u zavisnosti od toga koliko dugo arenavirusni vektor treba da se skladišti pre upotrebe. Zatim, priprema infektivnog titra arenavirusnog vektora se procenjuje testom imunofokusiranja na C-ćelije. Alternativno, transfektovane ćelije i supernatant mogu da se pasažiraju u veće posude (npr., T75 posuda za kulturu tkiva) u danu 3-5 posle transfekcije, i supernatant kulture je sakupljen do pet dana posle pasažiranja.
[0200] Opis se dalje odnosi na ekspresiju antigena u ćelijskog kulturi pri čemu je ćelijska kultura inficirana sa infektivnim, deficijentnim za replikaciju arenavirusom koji eksprimira antigen. Kada se koristi za ekspresiju antigena u kultivisanim ćelijama, mogu da se koriste sledeća dva postupka:
[0201] i) Ćelijski tip od interesa je inficiran sa preparatom arenavirusnog vektora koji je ovde opisan na multiplicitetu infekcije (MOI) jedan ili više, npr., dva, tri ili četiri, što dovodi do proizvodnje antigena u svim ćelijama već ubrzo nakon infekcije.
[0202] ii) Alternativno, niži MOI može da se koristi i individualni ćelijski klonivi mogu da budu izabrani za njihov nivo virusom vođene ekspresije antigena. Nakon toga, individualni klonovi mogu beskonačno da budu prošireni zbog ne-citolitične prirode arenavirusnih vektora. Bez obzira na pristup, antigen nakon toga može da bude preuzet (i prečišćen) ili iz supernatanta kulture ili iz samih ćelija, u zavisnosti od svojstava proizvedenog antigena. Međutim, pronalazak nije ograničen na ove dve strategije, i bilo koji načini pokretanja ekspresije antigena pomoću infektivnih, deficijentnih za replikaciju arenavirusa kao vektora može da se razmatra.
4
4.4.2 Dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule
[0203] Trisegmentirana arenavirusna partikula može rekombinantno da bude proizvedena pomoću postupaka reverzne genetike koji su poznati iz oblasti tehnike, na primer kao što je opisano od strane Emonet et al., 2008, PNAS, 106(9):3473-3478; Popkin et al., 2011, J. Virol., 85 (15):7928-7932. Dobijenje ovde obezbeđene tri-segmentirane arenavirusne partikule može da bude modifikovano kao što je opisano u Odeljku 4.2.
(i) Infektivna i kompetentna za replikaciju tri-segmentirana arenavirusna partikula
[0204] U određenim izvođenjima, postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule obuhvata (i) transfekciju u ćeliju domaćina cDNK jednog L segmenta i dva S segmenta ili dva L segmenta i jednog S segmenta; (ii) transfekciju plazmida u ćeliju domaćina koji eksprimiraju minimalne arenavirusne faktore NP i L sa trans delovanjem; (iii) održavanje ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i (iv) sakupljanje arenavirusne partikule.
[0205] Jednom kada je dobijen sa cDNK, tri-segmentirana arenavirusna partikula (tj., infektivna i kompetentna za replikaciju) može da bude propagirana. U određenim izvođenjima tri-segmentirana arenavirusna partikula može da bude propagirana u bilo kojoj ćeliji domaćina koji omogućava virusu da raste do titara koji omogućavaju upotrebe virusa kao što se ovde opisuje. U jednom izvođenju, ćelija domaćina omogućava tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu da raste do titara koji su uporedivi sa onim koji su određeni za odgovarajući divlji tip.
[0206] U određenim izvođenjima, tri-segmentirana arenavirusna partikula može da bude propagirana u ćelijama domaćina. Specifični primeri ćelija domaćina koji mogu da se koriste uključuju BHK-21, HEK 293, VERO ili druge. U specifičnom izvođenju, tri-segmentirana arenavirusna partikula može da bude propagirana u ćelijskog liniji.
[0207] U određenim izvođenjima, ćelije domaćina su držane u kulturi i transfektovane su sa jednim ili više plazmida. Plazmidi eksprimiraju arenavirusne genomske segmente koji treba da se dobiju pod kontrolom jedne ili više ekspresionih kaseta koje su pogodne za ekspresiju sisarskih ćelija, npr., koja se sastoji iz promotora polimeraze I i terminatora.
[0208] U specifičnim izvođenjima, ćelije domaćina su držane u kulturi i transfektovane su sa jednim ili više plazmida. Plazmidi eksprimiraju virusne gene koji treba da se dobiju pod kontrolom jedne ili više ekspresionih kaseta koje su pogodne za ekspresiju u sisarskim ćelijama, npr., sastoje se iz promotora za polimerazu I i terminatora.
[0209] Plazmidi koji mogu da se koriste za dobijanje tri-segmentiranog arenavirusa sastoje se iz jednog L segmenta i dva S segmenta mogu da uključe: i) dva plazmida pri čemu svaki kodira S genomski segment npr., pol-I S, ii) plazmid koji kodira L genomski segment npr., pol-I L. Plazmidi koji su neophodni tri-segmentirane arenaviruse koji se sastoje iz dva L segmenta i jednog S segmenta sa: i) dva plazmida gde svaki korira L genomski segment npr., pol-L, ii) plazmid koji kodira S genomski segment npr., pol-I S.
[0210] U određenim izvođenjima, plazmidi koji kodiraju polimerazu arenavirusa koja usmerava unutarćelijsku sintezu virusnih L i S segmenata mogu da budu uključeni u smešu za transfekciju. Na primer, plazmid koji kodira L protein i plazmid koji kodira NP (pC-L i pC-NP, redom). L protein i NP su minimalni faktori sa trans-delovanjem koji su neophodni za transkripciju virusne RNK i replikaciju. Alternativno, unutarćelijska sinteza L i S segmenata, zajedno sa NP i L proteinom može da se izvede
4
upotrebom ekspresione kasete sa promotorima pol-I i pol-II koje čitaju sa suprotinih strana u L i S segmente cDNK dva različita plazmida, redom.
[0211] Dodatno, plazmidi sadrže sisarski selekcioni marker, npr., rezistenciju na puromicin, pod kontrolom ekspresione kasete koja je pogodna za ekspresiju gena u sisarskim ćelijama, npr., ekspresiona kaseta za polimerazu II kao što je gore navedeno, ili transkripti virusnih gena koje prate untrašnje mesto ulaza ribozoma, kao što je za virus encefalomiokarditisa, koje prati sisarski marker rezistencije. Za proizvodnju u E.coli, plazmid dodatno sadrži bakterijski selekcioni marker, kao što je kaseta koja je rezistentna na ampicilin.
[0212] Transfekcija BHK-21 ćelija sa plazmidima može da se izvede korišćenjem bilo koje od uobičajeno korišćenih strategija kao što je kalcijum-fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija. Nekoliko dana kasnije odgovarajući selekcioni agens, npt., puromicin, se dodaje u titriranim koncentracijama. Preživeli klonovi su izolovani i subklonirani prema standardnim postupcima, i klonovi sa visokim ekspirmiranjem su identifikovani korišćenjem postupaka „Western blot“ ili protočne citometrije sa antitelima koja su usmerena protiv virusnih proteina od interesa.
[0213] Uobičajeno, ekspresione kasete vođene RNK polimerazom I, kasete vođene RNK polimerazom II ili kasete koje su vođene RNK polimerazom T7 bakteriofaga mogu da se koriste, , poslednja preferencijalno sa 3’-terminalnim riboziom za obradu primarnog transkripta da se dobije ispravan kraj. U određenim izvođenjima, plazmidi koji kodiraju arenavirusne genomske segmente mogu da budu isti, tj., genomska sekvenca i faktori sa trans delovanjem mogu da budu transkribovani sa promotora T7, poll i polII sa jednog plazmida.
[0214] Da dobijanje arenavirusa tri-segmentiranog arenavirusnog vektora, predviđeni su sledeći postupci. Prvi dan: ćelije, obično 80% konfluentne u bunarićima M6 ploča, su transfektovani sa smešom plazmida kao što je opisano gore u tekstu. Za ovo se mogu iskoristiti bilo koje uobičajeno korišćene strategije kao što su kalcijum-fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija.
[0215] 3-5 dana kasnije: Supernatant kulture (preparat arenavirusnog vektora) je sakupljen, alikvotiran i skladišten je na 4 °C, -20 °C, ili -80 °C, u zavisnosti od toga koliko dugo arenavirusni vektor treba da bude skladišten pre upotrebe. Priprema infektivnog titra arenavirusnog vektora je procenjena pomoću testa imunofokusiranja. Alternativno, transfektovane ćelije i supernatant mogu da se pasažiraju u veću posudu (npr., T75 posuda za kulturu tkiva) u danu 3-5 posle transfekcije, i supernatant kulture je sakupljen do pet dana posle pasažiranja.
[0216] Predmetna prijava se dalje odnosi na eksprimiranje heterolognog ORF i/ili gena od interesa, pri čemu plazmid koji kodira genomski segment je modifikovan da uključi heterologni ORF i/ili gen od interesa. Heterologni ORF i/ili gen od interesa može da bude uključen u plazmid upotrebom restrikcionih enzima.
(ii) Infektivna, tri-segmentirana arenavirusna partikula defektna za replikaciju
[0217] Infektivne, defektne za replikaciju tri-segmentirane arenavirusne partikule mogu da se dobiju kao što se opisuje gore u tekstu. Međutim, jednom kada se dobiju sa cDNK, infektivni, ovde opisani deficijentni za replikaciju arenavirusi mogu da se propagiraju u komplementarnim ćelijama. Komplementarne ćelije su ćelije koje obezbeđuju funkcionalnost koja je uklonjena iz arenavirusa deficijentnog za replikaciju modifikovanjem njegovog genoma (npr., ukoliko ORF koji kodira GP protein je uklonjen ili je funkcionalno inaktiviran, komplementarna ćelija obezbeđuje GP protein).
4
[0218] Zbog uklanjanja ili funkcionalne inaktivacije jednog ili više ORF-a u arenavirusnim vektorima (ovde uklanjanje glikoproteina, GP, će biti uzeto kao primer), arenavirusni vektori mogu da se dobiju i prošire u ćelijama koje obezbeđuju in trans uklonjene virusne gene, npr., GP u predmetnom primeru. Takva komplementarna ćelijska linija, ovde naznačena sa C-ćelije, je dobijena transfekcijom sisarske ćelijske linije kao što je BHK-21, HEK 293, VERO ili druge (ovde BHK-21 će biti uzeta kao primer) sa jednim ili više plazmida za ekspresiju virusnih gena od interesa (komplementarni plazmid, naznačen kao C-plazmid). C-plazmidi eksprimiraju virusne gene koji su uklonjeni u arenavirusnom vektoru koji treba da se dobije pod kontrolom jedne ili više ekspresionih kaseta koje su pogodne za eksprimiranje u sisarskim ćelijama, npr., promotor za sisarsku polimerazu II kao što je CMV ili EF1alfa promotor sa signalom za poliadenilaciju. Dodatno, komplementarni plazmid ima sisarski selekcioni marker, npr., rezistenciju na puromicin, pod kontrolom ekspresione kasete koja je pogodna ekspresiju gena u sisarskim ćelijama, npr., ekspresiona kaseta polimeraze II kao što je gore navedeno, ili transkripti virusnih gena su praćeni unutrašnjim mestom ulaza u ribozom kao što je kod virusa encefalomiokarditisa, koga prati sisarski marker rezistencije. Za proizvodnju u E. coli, plazmid dodatno sadrži bakterijski selekcioni marker, kao što je kaseta koja je rezistentna na ampicilin.
[0219] Ćelije koje mogu da se koriste, npr., BHK-21, HEK 293, MC57G ili druge, se drže u kulturi i transfektovane su sa komplementarnim plazmidima korišćenjem bilo koje od strategija koje se obično koriste kao što su kalcijum-fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija. Nekoliko dana kasnije pogodan selekcioni agens, npr., puromicin, je dodat u titriranim koncentracijama. Preživeli klonovi su izolovani i subklonirani prema standardnim postupcima, i visoko eksprimirajući C-ćelijski klonovi su identifikovani pomoću postupaka „Western blot“ ili protočna citometrija sa antitelima koja su usmerena protiv virusnih proteina od interesa. Kao alternativa upotrebi stabilno transfektovanih C-ćelija prolazna transfekcija normalnih ćelija može da dopuni virusne gene koji nedostaju u svakom od koraka gde će se koristiti C-ćelije u tekstu ispod. Dodatno, pomoćnički virus može da se koristi da obezbedi funkcionalnost koja nedostaje in trans.
[0220] Mogu da se koriste plazmidi dva tipa: i) dva plazmida, koji su naznačeni sa TF-plazmidi za eksprimiranje unutarćelijski u C-ćelijama minimalnih faktora sa trans delovanjem arenavirusa, koji je dobijen od npr., NP i L proteina LCMV u predmetnom primeru; i ii) plazmidi, koji su naznačeni sa GS-plazmidi, za eksprimiranje unutarćelijski u C-ćelijama genomskih segmenata arenavirusnog vektora, npr., segmenti sa dizajniranim modifikacijama. TF-plazmidi eksprimiraju NP i L proteine određenih arenavirusni vektora pod kontrolom ekspresione kasete koja je pogodna za ekspresiju proteina u sisarskim ćelijama, obično npr., promotor sisarske polimeraze II kao što je CMV ili EF1alfa promotor, bilo koji od njih preferencijalno u kombinaciji sa signalom za poliadenilaciju. GS-plazmidi eksprimiraju male (S) i velike (L) genomske segmente vektora. Obično, ekspresione kasete koje su vođene polimerazom I ili ekspresione kasete koje su vođene RNK polimerazom T7 bakteriofaga (T7-) mogu da se koriste, kasniji preferencijalno sa 3 ’-terminalnim ribozimom za obradu primarnog transkripta da se dobije ispravan kraj. U slučaju sistema koji je zasnovan na T7, ekspresija T7 u C-ćelijama mora da bude obezbeđena ili uključivanjem postupka za dobijanje dodatnog ekspresionog plazmida, koji je kontruisan analogno sa TF-plazmidima, pri čemu se dobijaju T7, ili C-ćelije su konstruisane da dodatno eksprimiraju T7 na stabilan način. U određenim izvođenjima, TF i GS plazmidi mogu da budu isti, tj., genomska sekvenca i faktori koji imaju trans delovanje mogu da se transkribuju sa promotorima T7, poll i polII iz jednog plazmida.
[0221] Za dobijanje arenavirusnog vektora, mogu da se koriste sledeći postupci. Prvi dan: C-ćelije, obično 80% konfluentne u bunarićima M6-ploča, su transfektovane sa smešom dva TF-plazmida plus dva GS-plazmida. U određenim izvođenjima, TF i GS plazmidi mogu da budu isti, tj., genomska sekvenca i faktori sa transdelovanjem mogu da budu transkribovani sa promotora T7, poll i polII iz jednog plazmida. Za ovo može da se koristi bilo koja od uobičajno korišćenih strategija kao što je kalcijum-fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektropermeabilizacija.
4
[0222] 3-5 dana kasnije: Supernatant kulture (dobijanje arenavirusnog vektora) je sakupljen, alikvotiran i skladišten je na 4 °C, -20 °C ili -80 °C u zavisnosti od toga kolko dugo arenavirusni vektor treba da se skladišti pre upotrebe. Zatim priprema infektivnog titra arenavirusnog vektora je ispitan testom imunofokusiranja na C-ćelijama. Alternativno, transfektovane ćelije i supernatant mogu da se pasažiraju u veću posudu (npr., T75 posuda za tkivnu kulturu) u danu 3-5 posle transfekcije, i supernatant kulture je sakupljen do pet dana posle pasažiranja.
[0223] Opis se dalje odnosi na eksprimiranje antigena u ćelijskoj kulturi pri čemu je ćelijska kultura inficirana sa infektivnim, deficijentnim za replikaciju tri-segmentiranim arenavirusom koji eksprimira antigen. Kada je korišćen za ekpresiju CMV antigena u kultivisanim ćelijama, mogu da se koriste sledeća dva postupka:
[0224] i) Tip ćelije od interesa je inficiran sa preparatom arenavirusnog vektora koji se ovde opisuje na multiplicitetu infekcije (MOI) od jedan ili više, npr., dva, tri ili četiri, što dovodi do proizvodnje antigena u svim ćelijama odmah nakon infekcije.
[0225] ii) Alternativno, niži MOI može da se koristi i individualni ćelijski klonovi mogu da budu izabrani za njihov nivo virusom pokrenute ekspresije antigena. Nakon toga individualni klonovi mogu se beskonačno proširiti zahvaljujući ne-citolotičkoj prirodi arenavirusnih vektora. Bez obzira na pristup, antigen nakon toga može da se sakupi (i prečisti) ili iz supernatanta kulture ili iz samih ćelija, u zavisnosti od svojstava proizvedenog antigena. Međutim, pronalazak nije ograničen na ove dve strategije, i drugi načini pokretanja ekspresije CMV antigena korišenjem infektivnih, deficijentnih za replikaciju arenavirusa kao vektora može da bude uzeto u razmatranje.
4.5 Nukleinske kiseline, vektorski sistemi i ćelijske linije
[0226] U određenim izvođenjima, ovde su obezbeđeni cDNK koji sadrže ili se sastoje iz arenavirusnog genomskog segmenta ili tri-segmentirane arenavirusne partikule kao što je opisano redom u Odeljku 4.1 i Odeljku 4.2.
4.5.1 Ne-prirodni položaj otvorenog okvira čitanja
[0227] U jednom izvođenju, ovde su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju arenavirusni genomski segment kao što je opisano u Odeljku 4.1. U specifičnijim primerima, ovde je prikazana DNK nukleotidna sekvenca ili set DNK nukleotidnih sekvenci kao što je predstavljeno u Tabeli 1. Ćelije domaćina koje sadrže takve nukleinkse kiseline su takođe obezbeđene u Odeljku 4.1.
[0228] U specifičnim izvođenjima, ovde je obezbeđena cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koji je modifikovan da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu, pri čemu arenavirusni genomski segment kodira heterologni ORF kao što je opisano u Odeljku 4.1.
[0229] U jednom izvođenju, obezbeđen je sistem DNK ekspresionog vektora koji kodira arenavirusni genomski segment koji je modifikovan da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu. Specifično, ovde je prikazan sistem DNK ekspresionog vektora pri čemu jedan ili više vektora kodira dva arenavirusna genomska segmenta, naime, L segment i S segment, ovde opisane arenavirusne partikule. Takav vektorski sistem može da kodira (jedan ili više odvojenih molekula DNK).
[0230] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena cDNK arenavirusnog S segmenta koji je modifikovan da nosi ORF u položaju koji nije položaj u divljem tipu koji je deo ili je uključen u ekspresioni sistem DNK. U drugim izvođenjima, cDNK arenavirusnog L segmenta koja je modifikovana da nosi ORF u
4
položaju koji nije položaj u divljem tipu je deo ili je uključena u ekspresioni sistem DNK. U određenim primerima, je cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koji je modifikovan da nosi (i) ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; i (ii) i ORF koji kodira GP, NP, Z protein, ili L protein koji je uklonjen i zamenjen je sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0231] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđena cDNK može da se dobije od određenog soja LCMV. Sojevi LCMV uključuju Klon 13, MP soj, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN i njihove derivate. U specifičnim izvođenjima, cDNK je dobijena iz LCMV Klona 13. U drugim specifičnim izvođenjima, cDNK je dobijena iz LCMV MP soja.
[0232] U određenim izvođejnima, vektor koji je generisan da kodira arenavirusnu partikulu ili trisegmentiranu arenavirusnu partikulu kao što se ovde opisuje može da bude zasnovan na specifičnom soju LCMV. Sojevi LCMV uključuju Klon 13, MP soj, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN i njihove derivate. U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula kao što se ovde opisuje može da bude zasnovana na LCMV Klonu 13. U drugim izvođenjima, vektor koji je generisan da kodira arenavirusnu partikulu ili tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu kao što je ovde opisan LCMV MP soj. Sekvenca S segmenta LCMV Klona 13 je naznačena sa SEQ ID NO: 2. U određenim izvođenjima, sekvenca S segmenta LCMV Klona 13 je sekvenca koja je predstavljena u SEQ ID NO: 1. Sekvenca L segmenta LCMV Klona 13 je naznačena sa SEQ ID NO: 5. Sekvenca S segmenta LCMV soja MP je naznačena sa SEQ ID NO: 53. Sekvenca L segmenta LCMV soja MP je naznačena sa SEQ ID NO: 4.
[0233] U određenom izvođenju, ovde je obezbeđena ćelija, pri čemu ćelija sadrži cDNK ili vektorski sistem koji je opisan gore u ovom odeljku. Ćelijske linije koje su poreklom iz takvih ćelija, kulture koje se sastoje iz takvih ćelija, postupci za kultivaciju takvih inficiranih ćelija su ovde takođe obezbeđeni. U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđena ćelija, pri čemu ćelija sadrži cDNK arenavirusnog genomskog segmenta koji je modifikovan da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu. U nekim izvođenjima, ćelija se sastoji iz S segmenta i/ili L segmenta.
4.5.2 Tri-segmentirana arenavirusna partikula
[0234] U jednom izvođenju, ovde su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu kao što je opisano u Odeljku 4.2. U specifičnijim izvođenjima, ovde je obezbeđena DNK nukleotidna sekvenca ili set DNK nukleotidnih sekvenci, na primer, kao što je predstavljeno u Tabeli 2 ili Tabeli 3. Ćelije domaćina koje sadrže takve nukleinske kiseline su takođe obezbeđene u Odeljku 4.2.
[0235] U specifičnim izvođenjima, ovde je obezbeđena cDNK koja se sastoji iz cDNK tri-segmentirane arenavirusne partikule koja je modifikovana da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu. U drugim izvođenjima, cDNK tri-segmentirane arenavirusne partikule koja je modifikovana da (i) nosi arenavirusni ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; i (ii) pri čemu tri-segmentirana arenavirusna partikula kodira heterologni ORF kao što je opisano u Odeljku 4.2.
[0236] U jednom izvođenju, ovde je obezbeđen sistem DNK ekspresionog vektora koji zajedno kodira tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu kao što je ovde opisano. Specifično, ovde je obezbeđen sistem DNK ekspresionog vektora pri čemu jedan ili više vektora kodiraju tri arenavirusna genomska segmenta, naime, jedan L segment i dva S segmenta ili dva L segmenta i jedan S segment ovde opisane tri-segmentirane arenavirusne partikule. Takav vektorski sistem može da kodira (jedan ili više odvojenih DNK molekula).
[0237] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena cDNK arenavirusnih S segmenata koja je modifikovana da nosi ORF u položaju koji nije položaj divljeg tipa, i deo je ili je uključena u sistem ekspresije DNK. U drugim izvođenjima, cDNK arenavirusnih L segmenata koja je modifikovana da nosi ORF u položaju koji nije položaj u divljem tipu je deo ili je uključena u sistem ekspresije DNK. U određenim primerima, je cDNK tri-segmentirane arenavirusne partikule koja je modifikovana da nosi (i) ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu; i (ii) ORF koji kodira GP, NP, Z protein, ili L protein je bio uklonjen i zamenjen sa heterolognim ORF iz organizma koji nije arenavirus.
[0238] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđena cDNK može da se dobije iz određenog soja LCMV. Sojevi LCMV uključuju Klon 13, MP strain, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN i njihove derivate. U specifičnim izvođenjima, cDNK je dobijena iz LCMV Klona 13. U drugim specifičnim izvođenjima, cDNK je dobijena iz LCMV MP soja.
[0239] U određenim izvođenjima, vektor koji je generisan za kodiranje arenavirusne partikule ili trisegmentirane arenavirusne partikule kao što se ovde opisuje može da bude zasnovan na specifičnom soju LCMV. Sojevi LCMV uključuju Klon 13, MP soj, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN i njihove derivate. U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula kao što je ovde opisano može da bude zasnovana na LCMV Klon 13. U drugim izvođenjima, vektor koji je generisan da kodira arenavirusnu partikulu ili tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu kao što se ovde opisuje LCMV MP soj. Sekvenca S segmenta LCMV Klona 13 je naznačena kao SEQ ID NO: 2. U određenim izvođenjima, sekvenca S segmenta LCMV Klona 13 je sekvenca koja je predstavljena u SEQ ID NO: 1. Sekvenca L segmenta LCMV Klona 13 je naznačena kao SEQ ID NO: 5. Sekvenca S segmenta LCMV soja MP je naznačena kao SEQ ID NO: 53. Sekvenca L segmenta LCMV soja MP je naznačena kao SEQ ID NO: 4.
[0240] U drugom izvođenju, obezbeđena je ćelija, pri čemu ćelija sadrži cDNK ili sistem vektora koji se opsuje gore u tekstu u ovom odeljku. Ćelijske linije koje su dobijene iz takvih ćelija, kulture koje se sastoje iz takvih ćelija, postupci za kultivaciju takvih inficiranih ćelija infected ovde su takođe obezbeđeni. U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđena ćelija, pri čemu ćelija sadrži cDNK trisegmentirane arenavirusne partikule. U nekim izvođenjima, ćelija sadrži S segment i/ili L segment.
4.6 Postupci za upotrebu
[0241] Vakcine su bile uspešne za prevenciju i/ili lečenje infektivnih bolesti, kao što su one za polio virus i boginje. Međutim, terapeutska imunizacija u postavci uspostavljene, hronične bolesti, uključujući i hronične infekcije i kancer je bila manje uspešna. Sposobnost da se dobije arenavirusna partikula i/ili tri-segmentirana arenavirusna partikula predstavlja novu strategiju vakcina.
[0242] U jednom izvođenju, postupci za lečenje infekcije i/ili kancera kod subjekta obuhvataju davanje subjektu jedne ili više tipova arenavirusnih partikula ili tri-segmentirane arenavirusne partikule, kao što je ovde opisano ili njegovu kompoziciju. U specifičnom izvođenju, postupak za lečenje infekcije i/ili kancera koji se ovde opisuje obuhvata davanje subjektu kome je potrebno efikasne količine jedne ili više arenavirusnih partikula ili tri-segmentiranih arenavirusnih partikula, koje se ovde opisuju ili njihove kompozicije. Subjekat može da bude sisar, kao što je ali bez ograničenja na humano biće, miš, pacov, zamorac, domaća životinja, kao što je, ali bez ograničenja na, kravu, konja, ovcu, svinju, kozu, mačku, psa, hrčka, magarca. U specifičnom izvođenju, subjekat je čovek. Humani subjekat može da bude muškarac, žena, adulti, deca, seniori (65 i stariji), i oni sa brojnim bolestima (tj., a polimorbidni subjekti). U određenim izvođenjima, subjekti su oni čija je bolest napredovala posle tretmana sa hemoterapijom, terapijom zračenjem, operacijom, i/ili biološkim agensima.
1
[0243] U drugom izvođenju, postupci za indukovanje imunskog odgovora protiv antigena koji je poreklom iz infektivnog organizma, tumora, ili alergena kod subjekta obuhvata davanje subjektu arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, tumora, ili alergena ili njegovu kompoziciju.
[0244] U drugom izvođenju, subjekti kojima arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, tumora, ili ovde opisanog alergena ili njegove kompozicije se daje, koji su podložni, ili se nalaze u riziku da razviju infekciju, da razviju kancer ili alergiju, ili ispolje pre-kancerozno oštećenje tkiva. U drugom specifičnom izvođenju, subjekti kojima se daje arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, tumora, ili ovde opisanog alergena ili njegova kompozicija koji su inficirani sa, ili su podložni da razviju, ili su u riziku da dobiju, ili im je postavljena dijagnoza infekcije, kancera, pre-kanceroznog tkivnog oštećenja, ili alergije.
[0245] U drugom izvođenju, subjekti kojima je arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, tumora, ili ovde opisanog alergena ili njegova kompozicija se daje onima koji pate od, koji su podložni, ili se nalaze u riziku za razvijanje, infekcije, kancera, pre-kancerozne lezije, ili alergije u plućnom sistemu, centralnom nervnom sistemu, limfnom sistemu, gastrointestinalnom sistemu, ili cirkulatornom sistemu između ostalih. U specifičnom izvođenju, subjekti kojima arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, tumora, ili ovde opisanog alergena ili njegova kompozicija se daje onima koji pate od, koji su podložni, ili su u riziku da razviju, infekciju, kancer, ili alergiju u jednom ili više organa u telu, uključujući ali bez ograničenja na mozak, jetru, pluća, oči, uši, creva, jednjak, uterus, nazofarinks ili pljuvačne žlezde.
[0246] U drugom izvođenju, subjekti kojima je arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancer, ili ovde opisan antigen ili njegova kompozicija se daje subjektu koji pati od simptoma uključujući ali bez ograničenja na temperaturu, noćna znojenja, umor, malaksalost, uznemirenost, upaljeno grlo, otečene žlezde, bol u zglobu, bol u mišiću, gubitak apetita, gubitak težine, diareja, čirevi u gastrointestinalnom traktu, krvarenje u gastrointestinalnom traktu, kratak dah, pneumonija, čirevi u ustima, problemi sa vidom, hepatitis, žutica, encefalitis, napadi, koma, pruritis, eritem, hiperpigmentacija, promene u limfnom čvoru, ili gubitak sluha.
[0247] U drugom izvođenju, arenavirus ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija se daje subjektu bilo koje starosne grupe koji pati od, ili je podložan za, ili se nalazi u riziku od razvijanja, infekcije, kancera, ili alergije. U specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija se daje subjektu sa narušenim imunskim sistemom, trudnom subjektu, subjektu koji je podvrgnut transplantaciji organa ili kostne srži, subjekat koji uzima imunosupresivne lekove, subjekat koji je podvrgnut hemodijalizi, subjekat koji ima kancer, ili subjekat koji pati od, ili je podložan, ili se nalazi u riziku razvijanja, infekcije, kancera, ili alergije. U specifičnijem izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija se daje subjektu koji je dete od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17 godina starosti koji pate od, su podložni, ili se nalaze u riziku od razvijanja, infekcije, kancera, ili alergije. U još drugom specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili ovde opisanog alergena ili njegove kompozicije se daje subjektu koji pati od, ili je podložan
2
za, ili je u riziku da razvije, infekciju, kancer ili alergiju. U još drugom specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili ovde opisanog alergena ili njegova se kompozicija se daje subjektu koji je odjoče od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci starosti koji pati od, ili je podložan za, ili se nalazi u riziku da razvije, infekciju, kancer, ili alergiju. U još drugom specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancer, ili ovde opisani alergen ili njegova kompozicija se daje starijem subjektu koji pati od, je podložan, ili se nalazi u riziku da razvije, infekciju, kancer, ili alergiju. U specifičnijem izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili ovde opisanog alergena ili njegove kompozicije se daje subjektu koji je stariji subjekt starosti od 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 godina.
[0248] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili ovde opisanog alergena ili njegove kompozicije se daje subjektima koji se nalaze u povećanom riziku od diseminovane infekcije, kancera, ili alergije. U specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili ovde opisan alergen ili njegova kompozicija se daju subjektima u neonatalnom periodu sa neonatalnim i prema tome nezerelim imunskim sistemom.
[0249] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija se daje subjektu koji ima neaktivnu infekciju, kancer, ili alergiju. U specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentran arenavirus koji eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili ovde opisanog alergena ili njegove kompozicije se daje subjektu koji ima neaktivnu infekciju, neaktivni kancer, ili neaktivnu alergiju koja može da se reaktivira nakon narušavanja imunskog sistema. Prema tome, ovde je obezbeđen postupak za prevenciju reaktivacije infekcije, kancera, ili alergije.
[0250] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je dobijen iz infektivnog organizma, kancer, ili alergen kao što se ovde opisuje ili njegova kompozicija se daje subjektu sa rekurentnom infekcijom, kancerom, ili alergijom.
[0251] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je dobijen iz infektivnog organizma, kancera, ili alergen kao što se ovde opisuje ili njegova kompozicija se daju subjektu sa genetičkom predispozicijom za infekciju, kancer, ili alergiju. U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je dobijen iz infektivnog organizma, kancera, ili alergen kao što se ovde opisuje ili njegova kompozicija se daje subjektu. U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koje eksprimiraju antigen koji je dobijen iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena se daje subjektu sa faktorima rizika. Primeri faktora rizika uključuju, starenje, konzumiranje duvana, izlaganje suncu, izlaganje zračenju, hemijsko izlaganje, porodičnu istoriju, alkohol, slabu ishranu, nedostatak fizičke aktivnosti, ili prekomernu težinu.
[0252] U drugom izvođenju, davanje arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen koji je dobijen iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena smanjuje simptomatsku infekciju, kancer, ili alegiju. U drugom izvođenju, davanje arenavirusne partikule ili trisegmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen koji je dobijen iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena smanjuje asimptomatsku infekciju, kancer, ili alergiju.
[0253] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz ovde opisanog infektivnog organizma ili njegova kompozicija se daju subjektima ili životinjama inficiranim sa jednim ili više sojeva virusa influence, virusa infektivne burzalne bolesti, rotavirusa, infektivnog virusa bronhitisa, infektivnog virusa laringotraheitisa, virusa anemije kokoši, virusa Marekove bolesti, ptičjeg virusa leukoze, ptičjeg adenovirusa, ili ptičjeg pneumovirusa, virusa uzročnika SARS-a, humani respiratorni sincicijalni virus, virus humane imunodeficijencije, virus hepatitisa A, virus hepatitisa B, virus hepatitisa C, poliovirus, virus besnila, Hendra virus, Nipah virus, virus humane parainfluence 3, virus boginja, virus zaušaka, Ebola virus, Marburg virus, virus bolesti zapadnog Nila, virus japanskog encefalitisa, Denga virus, Hantavirus, Rift Valley groznice virus, Lassa groznice virus, virus herpes simpleksa i virusa žute groznice.
[0254] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz ovde opisanog kancera cancer ili njegova kompozicija se daje subjektima koji pate od jednog ili više tipova kancera. U drugim izvođenjima, bilo koji tip kancera koj je podložan lečenju sa ovde opisanim vakcinama može da bude ciljana meta. U specifičnijem izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz ovde opisanog kancera cancer ili njegova kompozicija se daju subjektima koji pate od, na primer, melanoma, karcinoma prostate, karcinoma grudi, karcinoma pluća, neuroblastoma, hepatocelularnog karcinoma, cervikalnog karcinoma, i karcinoma stomaka, burkitovog limfoma; ne-Hodčkinovog limfoma; Hodčkinovog limfoma; nazofaringealnog karcinoma (kancera gornjeg dela grla iza nosa), leukemije, limfoma limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom.
[0255] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je dobijen od ovde opisanog alergena ili njegova kompozicija se daju subjektima koji pate od jedne ili više alergija. U specifičnijem izvođenju, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz ovde opisanog alergena ili njegova kompozicija se daje subjektima koji pate od, na primer, sezonske alergije, višegodišnje alergije, rinokonjunktivitisa, astme, ekcema, alegije na hranu.
[0256] U drugom izvođenju, davanje arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena kao što je ovde opisano ili njihove kompozicije subjektima dodeljuje imunost posredovanu ćelijama (CMI) protiv infekcije, kancera, ili alergena. Bez vezivanja za teoriju, u drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, alergena kao što je ovde opisano ili njihova kompozicija inficira i eksprimira antigene od interesa u antigen prezentujućim ćelijama (APC) domaćina (npr., makrofagima, dendritičnim ćelijama, ili B ćelijama) za direktno prezentovanje antigena na glavnom kompleksu tkivne podudarnosti (MHC) klase I i II. U drugom izvođenju, davanje arenavirusne partikule ili trisegmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, alergena kao što je ovde opisano ili njihove kompozicije subjektima koji indukuju plurifunkcionalni citolitik kao i IFN-γ i TNF-α koje istovremeno proizvode CMV-specifične CD4<+>i CD8<+>T ćelijske odgovore visoke magnitude za lečenje ili prevenciju infekcije, kancera, ili alergije.
[0257] U drugom izvođenju, davanje arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena ili njihova kompozicija smanjuje rizik da će individua razviti infekciju, kancer, alergiju za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa rizikom od razvijanja infekcije, kancera, ili alergije u odsustvu takvog tretmana.
[0258] U drugom izvođenju, davanje arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen koji je dobijen iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena ili njihove
4
kompozicije smanjuje simptome infekcije, kancera, ili alergije za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma infekcije, kancera, alergije u odsustvu takvog tretmana.
[0259] U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena se poželjno daje u višestrukim injekcijama (npr., najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 45, ili 50 injekcija) ili kontinualnom infuzijom (npr., upotrebom pumpe) na višestrukim mestima (npr., najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, ili 14 mesta). U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena se daje u dve ili više odvojenih injekcija tokom 6-mesečnog perioda, 12-mesečnog perioda, 24-mesečnog perioda, ili 48-mesečnog perioda. U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena se daje sa prvom dozom u izabranom datumu, drugoj dozi najmanje 2 meseca nakon prve doze, i trećoj dozi 6 meseci nakon prve doze.
[0260] U jednom primeru, kožne injekcije su izvedene na različitim mestima u telu kako bi se smanjio opseg lokalnih reakcija kože. U datom danu kada se izvodi vakcinacija, pacijent prima dodeljenu ukupnu dozu ćelija koje se daju iz jednog šprica u 3 do 5 odvojenih intradermalnih injekcija doze (npr., najmanje 0.4 ml, 0.2 ml, ili 0.1 ml) svaka u ekstremitetu koji je udaljen najmanje oko 5 cm (npr., najmanje 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, ili cm) na ulazu igle od najbliže susedne injekcije. U danima vakcinacije koji slede, mesta injekcije su rotirana sa različitim ekstremitetima na način u smeru kazaljke na satu ili suprotno od smera kazaljke na satu.
[0261] U drugom izvođenju, davanje infektivnog, deficijentnog za replikaciju arenavirusa koji eksprimira CMV antigen ili njegovu kompoziciju subjektima sa neonatalnim i prema tome imunskim sistemom indukuje ćelijski posredovan imunski (CMI) odgovor protiv infekcije, kancera, ili alergije, koji prelazi za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, CMI odgovora protiv infekcije, kancera, ili alergije u odsustvu takvog tretmana.
[0262] U određenim izvođenjima, davanje subjektu arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena, kao što je ovde opisano indukuje titar antitela koji se može detektovati za najmanje bar četiri nedelje. U drugom izvođenju, davanje subjektu arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergen, kao što je ovde opisano povećava titar antitela za najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000%.
[0263] U određenim izvođenjim, izlaganje primarnom antigenu pokreće funkcionalni, (neutralizujući) i minimalni titar antitela od najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednosti kontrolnih seruma iz humanih subjekata imunih na infekciju. U specifičnijim izvođenjima, geometrijska srednja vrednost titra primarnog neutralizujućeg antitela se povećava do maksimuma vrednosti od najmanje 1:50, najmanje 1:100, najmanje 1:200, najmanje 1:1000 tokom najmanje 4 nedelje posle-imunizacije. U drugom izvođenju, imunizacija sa arenavirusnom partikulom ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koji eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergije, kao što se ovde opisuje proizvodi visoke titre antitela koje traju najmanje 4 nedelje, najmanje 8 nedelja, najmanje 12 nedelja, najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine, najmanje 4 godine, ili najmanje 5 godina posle-imunizacije nakon jednog davanja vakcine, ili nakon dve ili više uzastopnih imunizacija.
[0264] U još drugom izvođenju, izlaganje sekundarnom antigenu povećava titar antitela za najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000%. U drugom izvođenju, izlaganje sekundarnom antigenu pokreće funkcionalni, (neutralizujući) i minimalni titar antitela od najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednost kontrolnih seruma iz humanih subjekata koji su imuni na infekciju. U specifičnijim izvođenjima, geometrijska srednja vrednost sekundarnog neutralizujućeg titra antitela se povećava do maksimuma vrednosti od najmanje 1:50, najmanje 1:100, najmanje 1:200, ili najmanaje 1:1000 tokom najmanje 4 nedelje posle-imunizacije. U drugom izvođenju, druga imunizacija sa arenavirusnom partikulom ili tri-segmentiranom arenavirusnom partikulom koja eksprimira antigen poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergije, kao što se ovde opisuje proizvodi visoke titre antitela koji traju najmanje 4 nedelje, najmanje 8 nedelja, najmanje 12 nedelja, najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine, najmanje 4 godina, ili najmanje 5 godina posle-imunizacije.
[0265] U još drugom izvođenju, treća imunizacija za pojačanje povećava titar antitela za najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000%. U drugom izvođenju, treća imunizacija za pojačanje pokreće funkcionalni, (neutralizujući) i minimalni titar antitela od najmanje 50 %, najmanje 100 %, najmanje 200 %, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednosti kontrolnog seruma iz huamnih subjekata koji su imuni na infekciju. U specifičnijim izvođenjima, treća imunizacija za pojačanje pokreće funkcionalni, (neutralizujući), i minimalni titar antitela od najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednosti kontrolnog seruma iz humanih subjekata koji su imuni na infekciju. U drugom izvođenju, treća imunizacija za pojačanje produžava titar antitela za najmanje 4 nedelje, najmanje 8 nedelja, najmanje 12 nedelja, najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine, najmanje 4 godine, ili najmanje 5 godina posle-imunizacije
[0266] U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancer, ili alergija, pokreće T ćelijski nezavisan ili T ćelijski zavisan odgovor. U drugim izvođenjima, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergije, pokreće T ćelijski odgovor. U drugim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom infektivnog organizma, kancera, ili alergije, kao što se ovde opisuje pokreće T pomoćnički odgovor. U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergije, kao što je ovde opisano pokreće Th1-usmeren odgovor ili Th2-usmeren odgovor.
[0267] U specifičnijim izvođenjima, Th1-orijentisan odgovor koji je naznačen sa prevladavanjem IgG1 antitela u odnosu na IgG2. U drugim izvođenjima odnos IgG1:IgG2 je veći od 1:1, veći od 2:1, veći od 3:1, ili je veći od 4:1. U drugom izvođenju infektivna, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergije, kao što je ovde opisano je naznačeno sa prevladavanjem IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD ili IgE antitela.
[0268] U nekim izvođenjima, infektivan, deficijentan za replikaciju arenavirus koji eksprimira CMV antigen ili njegov fragment koji pokreće CD8+ T ćelijski odgovor. U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergije pokreće oba CD4+ i CD8+ T ćelijske odogovore, u kombinaciji ili ne sa antitelima.
[0269] U određenim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektvnog organizma, kancera, ili alergije, kao što se ovde opisuje pokreće visoke titre neutralizujućih antitela. U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergije, kao što se ovde opisuje pokreće visoke titre neutralizujućih antitela ekspresija individualnih komponenata proteinskih kompleksa.
[0270] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira jedan, dva, tri, četiri, pet, ili više antigena poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena pokreće veće titre neutralizujućih antitela u odnosu na arenavirusnu partikulu ili trisegmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira jedan eksprimira jedan antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena.
[0271] U određenim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju istovremeno davanje arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule i najmanje jednu dodatnu terapiju. U određenim izvođenjima, primena je istovremena. U dodatnom izvođenju, arenavirusna partikula ili trisegmentirana arenavirusna partikula se daje pre davanja dodatne terapije. U drugim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula se daje posle davanja dodatne terapije. U određenim izvođenjima, davanje arenavirusne partikule ili tri-segmentirana arenavirusna partikula i dodatna terapija je oko 1 h, oko 2 h, oko 3 h, oko 4 h, oko 5 h, oko 6 h, oko 7 h, oko 8 h, oko 9 h, oko 10 h, oko 11 h, ili oko 12 h. U određenim izvođenjima, interval između primene arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule i pomenute dodatne terapije je oko 1 dana, 1 nedelje, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 5 nedelja, oko 6 nedelja, oko 7 nedelja, oko 8 nedelja, oko 9 nedelja, oko 10 nedelja, oko 11 nedelja, oko 12 nedelja. U određenim izvošenjima, interval između davanja arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule i dodatne terapije je oko 1 meseca, oko 2 meseca, oko 3 meseca, oko 4 meseci, oko 5 meseci, ili oko 6 meseci.
[0272] U određenim izvođenjima, davanje arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena ili njegova kompozicija redukuje broj detektovanih antitela u uzorku krvi pacijenta, ili uzorku seruma. U određenim izvođenjima, davanje arenavirusne partikule koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili njegove kompozicije alergena redukuje količinu infektivnog organizma, kancera, ili alergije koja se detektuje u urinu, pljuvački, krvi, suzama, semenoj tečnosti, uzorak ljuštenih ćelija, ili mleka dojke.
[0273] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena kao što je ovde opisano ili kompozicija mogu dalje da sadrže reporterski protein. U specifičnom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena i reporterski protein kao što se ovde opisuju ili kompozicija se daju subjektima za lečenje i/ili prevencije infekcije, kancera, ili alergije. U još drugom specifičnom izvođenju, reporterski protein može da se koristi za praćenje genske ekspresije, lokalizacije proteina, i isporuke vakcine, in vivo, in situ i u realnom vremenu.
[0274] U drugom izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergena kao što je ovde opisano ili kompozicija mogu dalje da sadrže fluorescentni protein. U specifičnijem izvođenju, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergen i reporterski protein kao što se ovde opisuje ili kompozicija se daje subjektima za lečenje i/ili prevenciju infekcije, kancera, ili alergije. U jođ drugom specifičnom izvođenju, fluorescentni protein može da bude reporterski protein koji može da se koristi za praćenje genske ekspresije, lokalizacije proteina, i isporuke vakcina, in vivo, in situ i u realnom vremenu.
[0275] Promene u funkcije CMI odgovora protiv infekcije, kancera, ili alergija indukovana davanjem arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, alergena ili njegove kompozicije kod subjekata može da se meri bilo kojim testom koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike uključujući, ali bez ograničenja na protočnu citometrijum (videti, npr., Perfetto S.P. et al., 2004, Nat Rev Immun., 4(8):648-55), testove za merenje proliferacije limfocita (videti, npr., Bonilla F.A. et al., 2008, Ann Allergy Asthma Immunol, 101:101-4; i Hicks M.J. et al., 1983, Am J Clin Pathol., 80:159-63), testovi kojima se meri aktivacija limfocita uključujući određivanje promena u ekspresiji površinskih markera nakon aktiviranja merenja citokina T limfocita (videti, npr., Caruso A. et al., Cytometry. 1997;27:71-6), ELISPOT testova (videti, npr., Czerkinsky C.C. et al., 1983, J Immunol Methods, 65:109-121; and Hutchings P.R. et al., 1989, J Immunol Methods, 120:1-8), ili testovi citotoksičnosti prirodnih ćelija ubica (videti, npr., Bonilla F.A. et al., 2006, Ann Allergy Asthma Immunol., 94(5 Suppl 1):S1-63).
[0276] Uspešan tretman pacijenta koji ima kancer može da bude procenjen produžavanje očekivanog preživljavanja, indukcija anti-tumorskog imunog odgovora, ili unapređenje određene karakteristike kancera. Pimeri karakteristika kancera koji može da bude unapređen uključuje veličinu tumora (npr., T0, T je, ili T1-4), stanje metastaza (npr., M0, M1), broj uočljivih tumora, zahvaćenost čvorova (npr., N0, N1-4, Nx), gradus (tj., gradusi 1, 2, 3, ili 4), stepen (npr., 0, I, II, III, ili IV), prisustvo ili koncentracija određenih markera na ćelijama ili telesnim tečnostima (npr., AFP, B2M, beta-HCG, BTA, CA 15-3, CA 27.29, CA 125, CA 72.4, CA 19-9, kalcitonin, CEA, hromgrainin A, EGFR, receptori za hormone, HER2, HCG, imunoglobulini, NSE, NMP22, PSA, PAP, PSMA, S-100, TA-90, i tiroglobulin), i/ili pridružene patologije (npr., asciti ili edem) ili simptomi (npr., kaheksija, groznica, anoreksija, ili bol). Unapređenje, ukoliko može da se izbori procentom, može da bude najmanje 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ili 90% (npr., procenat, ili zapremina ili linearne dimenzije tumora).
[0277] U drugom izvođenju, koje se ovde opisuje, je postupak za upotrebu sa arenavirusnom partikulom (npr., LCMV) koja eksprimira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, ili alergen kao što je ovde opisano u kome najmanje jedan od ORF koji kodira GP, NP, Z protein, i L protein je zamenjen sa nukleotidnom sekvencom koja kodira infektivnu nukleotidnu sekvencu koja kodira antigen koji je poreklom iz infektivnog organizma, kancera, alergena, ili njegov antigenski segment.
4.7 Kompozicije, davanje, i doza
[0278] Predmetna prijava se dalje odnosi na vakcine, imunogene kompozije (npr., formulacije vakcina), i farmaceutske kompzicije koje se sastoje iz arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule kao što je ovde opisano. Takve vakcine, imunogene kompozicije i farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane u skladu sa standardnim postupcima iz oblasti tehnike.
[0279] Stručnjaku iz relevantne oblasti tehnike će biti jasno da bilo koje modifikacije i adaptacije postupaka i ovde opisanih primena mogu da budu očigledni i može se napraviti bez odstupanja od obima od obima bilo kog njegovog izvođenja.
[0280] U drugom izvođenju, ovde su obezbeđene kompozicije koje se sastoje iz arenavirusne partikule ili ovde opisane tri-segmentirane arenavirusne partikule. Takve kompozicije mogu da se koriste u postupcima za lečenje i prevenciju bolesti. U specifičnom izvođenju, ovde opisane kompozicije su korišćene u lečenju subjekata koji su inficirani sa, ili su podložni da razviju, infekciju. U drugim izvođenjima, ovde opisane kompozicije su korišćene u lečenju subjekata koji su podložni za ili ispoljavaju simptome koji su karakteristični za kancer ili tumorigenezu ili kojima je određena dijagnoza kancera. U drugom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđene imunogene kompozicije mogu da se koriste za indukovanje imunog odgovora kod domaćina kome se kompozicija daje. Ovde opisane imunogene kompozicije mogu da se koriste kao vakcine i mogu, prema tome da budu formulisane kao farmaceutske kompozicije. U specifičnom izvođenju, ovde opisane imunogene kompozicije su korićene u prevenciji infekcije ili kancera subjekata (npr., humanih subjekata). U drugim izvođenjima, vakcina, imunogena kompozicija ili farmaceutska kompozicija su pogodne za veterinarsku i/ili humanu primenu.
[0281] U određenim izvođenjima, ovde su obezbeđene imunogene kompozicije koje se sastoje iz arenavirusnog vektora kao što je ovde opisano. U određenim izvođenjima, takva imunogena kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvaljiv ekscipijens. U određenim izvođenjima, takva imunogena kompozicija dalje sadrži adjuvans. Adjuvans za davanje u kombinaciji sa ovde opisanom kompozicijom može da se da pre, istovremeno sa, ili posle davanja pomenute kompozicije. U nekim izvođenjima, termin "adjuvans" se odnosi na jedinjenje koje kada se daje zajedno sa ili kao deo ovde opisane kompozicije povećava, unapređuje i/ili pojačava imunski odgovor prema arenavirusnoj partikuli ili tri-segmentiranoj arenavirusnoj partikuli i, najvažnije, genski proizvodi koji su u vektorima, ali kada se jedinjenje daje zasebno ne stvaraju imunski odgovor prema arenavirusnoj partikuli ili trisegmentiranoj arenavirusnoj partikuli i genski proizvodi koje potonji vektorizuju. U nekim izvođenjima, adjuvans stvara imunski odgovor prema arenavirusnoj partikuli ili tri-segmentiranoj arenavirusnoj partikuli i genski proizvodi koji potonji vektorizuju i ne proizvode alergiju ili drugu neželjenu reakciju. Adjuvansi mogu da unaprede imunski odgovor pomoću nekoliko mehanizama uključujući, npr., regrutovanje limfocita, stimulaciju B i/ili T ćelija, i stimulaciju makrofaga ili dendritičnih ćelija. Kada vakcina ili imunogena kompozicija iz pronalaska sadrži adjuvanse ili se daje sa jednim ili više adjuvanasa, adjuvansi koji mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničeni na, adjuvanse mineralnih soli ili gel adjuvanse mineralnih soli, partikulatne adjuvanse, mikropartikulatne adjuvanse, sluzne adjuvanse, i imunostimulatorne adjuvanse. Primeri adjuvanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, soli aluminijuma (alum) (kao što je aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, i aluminijum sulfat), 3 De-O-acilovani monofosforil lipid A (MPL) (videti GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbat 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), imidazopiridinska jedinjenja (videti Međunarodnu prijavu br. PCT/US2007/064857, objavljenu kao Međunarodna objava br. WO2007/109812), imidazohinoksalinska jedinjenja (videti Međunarodnu prijavu br. PCT/US2007/064858, objavljenu kao Međunarodna objava br. WO2007/109813) i saponini, kao što su QS21 (videti Kensil et al., 1995, u Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY); U.S. Pat. No.5,057,540). U nekim izvođenjima, adjuvans je Frojndov adjuvans (kompletni ili nekompletni). Drugi adjuvansi su emulzije ulja u vodi (kao što je skvalen ili ulje kikirikija), po potrebi u kombinaciji sa imunskim stimulansima, kao što je monofosforil lipid A (videti Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med.336, 86-91).
[0282] Kompozicije sadrže partikule arenavirusa ili tri-segmentiranu partikulu arenavirusa koja je ovde opisana zasebno ili zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Suspenzije ili dispenzije partikule arenavirusa ili tri-segmentirane partikule arenavirusa, posebno izotonočne vodene suspenzije ili disperzije, mogu da se koriste. Farmaceutske kompozicije mogu da budu sterilizovane i/ili mogu da sadrže ekscipijense, npr., konzervanse, stabilizatore, sredstva za vlaženje i/ili emulgatore, solubilizatore, soli za regulisanje osmotskog pritiska i/ili bufere i dobijeni su na način koji je poznat po sebi, na primer korišćenjem konvencionalnih postupaka raspršivanja i postupaka za suspanziju. U određenim izvođenjima, takve disperzije ili suspenzije mogu da sadrže sredstva za regulisanje viskoziteta. Suspenzije ili disperzije su držane na temperurama oko 2 °C do 8 °C, ili preferencijalno za duže skladištenje mogu da budu zamrznuti i zatim otopljeni neposredno pre upotrebe, ili alternativno mogu da budu liofizirani za skladištenje. Za injekciju, vakcina ili imunogeni preparati mogu da budu formulisani u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što je Hankov rastvor, Ringerov rastvor, ili fiziološki slani rastvor. Rastvor može da sadrži agense za formulaciju kao što su agensi za suspenziju, stabilizaciju i/ili disperziju.
[0283] U određenim izvođenjima, ovde opisane kompozicije dodatno sadrže konzervans, npr., derivat žive tiomersal. U specifičnom izvođenju, ovde opisane farmaceutske kompozicije sadrže 0.001% do 0.01% tiomersala. U drugim izvođenjima, ovde opisane farmaceutske kompozicije ne sadrže konzervans.
[0284] Farmaceutske kompozicije sadrže od oko 10<3>do oko 10<11>fokus formirajućih jedinica partikula arenavirusa ili tri-segmentiranu partikulu arenavirusa.
[0285] U jednom izvođenju, davanje farmaceutske kompozicije je parenteralno davanje. Parenteralno davanje može da bude intravenozno ili subkutanozno davanje. Prema tome, jedinični dozni oblici za<3>10 parenteralno davanje su, na primer, ampule ili bočice, npr., bočice koje sadrže od oko 10 do 10 fokusnih formirajućih jedinica ili 10<5>do 10<15>fizičkih partikula arenavirusne partikule ili trisegmentirane arenavirusne partikule.
[0286] U drugom izvođenju, vakcina ili ovde obezbeđena imunogena kompozicija se daje subjektu pomoću, uključujući ali bez ograničenja na, oralne, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, topiklane, subkutanozne, perkutanozne, intranazalne i načine davanja inhaliranjem, i preko skarifikacije (grebanje preko površinskih slojeva kože, npr., korišćenjem račvaste igle). Specifično, mogu da se koriste subkutanozni ili intravenozni načini.
[0287] Za davanje intranazalno ili inhalacijom, preparat za upotrebu prema predmentnom pronalasku može konvencionalno da bude isporučen u obliku aerosolnog spreja koji je predstavljen iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora sa korišćenjem odgovarajućeg propelanta, npr., dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen dioksida ili drugog pogodnog gasa. U slučaju aerosola pod pritiskom dozna jedinica može da bude određena obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i ketridži od, npr., želatina za upotrebu u inhalatoru ili insuflatorima mogu da budu formulisani sa sadrže smešu praha jedinjenja i kao odgovarajuća osnova praha kao što je lakotoza ili skrob.
[0288] Doza aktivnog sastojka zavisi od tipa vakcinacije i od subjekta, i njegove starosti, težine, individualnog stanja, individualnih farmakokinetičkih podataka, i načina davanja. U određenim izvođenjima, in vitro assay se koristi da se pomogne identifikovanje optimalnih doznih opsega. Efikanse doze mogu da se ekstrapoliraju sa kriva za procenu odgovora u odnosu na dozu koje se dobijaju in vitro ili sistemima za ispitivanje kod životinjskih modela.
[0289] U određenim izvođenjima, vakcina, imunogena kompozicija, ili farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz partikule arenavirusa ili tri-segmentirane partikule arenavirusa može da se koristi za živo vakcinisanje. Primeri doza za živu partikulu arenavirusa mogu da se razlikuju od 10-100, ili više, PFU žiivog virusa po dozi. U nekim izvođenjima, pogodne doze čestice arenavirusa ili tri-segmentirane 2 2 3 3<4>4 5
čestice arenavirusa su 10 , 5X10 , 10 , 5X10 , 10 5X10 , 10 , 5X105 , 106 , 5X106 , 10<7>5X107 , 108 , 5X108 , 1X10<9>, 5X109 , 1X1010 , 5X1010 , 1X1011 , 5X10<11>ili 10<12>pfu, i mogu da se daju subjektu jednom, dva puta, tri ili više puta sa intervalima onoliko često koliko je potrebno. U drugom izvođenju, živ arenavirus je formulisan tako da 0.2-mL doze sadrži 106.5-10<7.5>fluorescentnih fokalnih jedinica žive partikule arenavirusa. U drugom izvođenju, inaktivisana vakcina je formulisana tako da sadrži oko 15 µg do oko 100 µg, oko 15 µg do oko 75 µmg, oko 15 µg do oko 50 µg, ili oko 15 µg do oko 30 µg arenavirusa
[0290] U određenim izvođenjima, za davanje deci, dve doze partikule arenavirusa ili tri-segmentirane partikule arenavirusa koja se ovde opisuje ili njena kompozicija, koje su davane sa razmakom od najmanje mesec dana, se daju detetu. U specifičnim izvođenjima za davanje adultima, daje se jedna doza partikule arenavirusa ili tri-segmentirane partikule arenavirusa koja se ovde opisuje ili njegova kompozicija. U drugom izvođenju, dve doze arenavirusne partikule ili ovde opisane tri-segmentirane arenavirusne partikule ili njene kompozicije, koje su davane sa razmakom od najmanje mesec dana, se daju adultu. U drugom izvođenju, mlado dete (starosti šest meseci do devet godina) može da dobije arenavirusnu partikulu ili ovde opisanu tri-segmentiranu arenavirusnu partikulu ili njenu kompoziciju za prvi put u dve doze koje se daju sa razmakom od jednog meseca. U određenom izvođenju, dete koje je primilo samo jednu dozu u njihovoj prvoj godini vakcinacije treba da primi dve doze u sledećoj godini. U nekim izvođenjima, dve doze koje se daju u razmaku od 4 nedelje su poželjne za decu od 2-8 godina starosti kojima se daje ovde opisana imunogena kompozicija, za prvi put. U određenim izvođenjima, za decu starosti 6-35 meseci, polovina doze (0.25 ml) može da bude poželjno, nasuprot 0.5 ml koje može da bude poželjno za subjekte koji su stariji od tri godine..
[0291] U određenim izvođenjima, kompozicije mogu da se daju pacijentu u jednoj dozi koji obuhvata terapeutski efikasnu količinu arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule. U nekim izvođenjima, arenavirusna partikula ili tri-segmentirana arenavirusna partikula može da se daje pacijentu u jednoj dozi koja se sastoji iz terapeutski efikasne količine arenavirusne partikule ili trisegmentirane arenavirusne partikule i, jedne ili više farmaceutske kompozicije, svaka u terapeutski efikasnoj količini.
[0292] U određenim izvođenjima, kompozicija se daje pacijentu kao jedna doza koju prati druga doza tri do šest nedelja kasnije. U skladu sa ovim izvođenjima, inokulacije za pojačanje mogu da se daju subjektima u intervalima šest do dvanaest meseci nakon druge inokulacije. U određenim izvođenjima, inokulacije za pojačanje mogu da koriste različite arenaviruse ili njihove kompozicije. U nekim izvođenjima, davanje iste kompozicije kao što se ovde opisuje mogu da budu ponovljeni i odvojeni za najmanje 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 10 dana, 15 dana, 30 dana, 45 dana, 2 meseca, 75 dana, 3 meseca, ili najmanje 6 meseci.
[0293] Ovde su takođe obezbeđeni, postupci i upotreba arenavirusne partikule ili tri-segmentirane arenavirusne partikule za dobijanje vakcina u obliku farmaceutskih preparata, koji sadrže partikulu arenavirusa ili tri-segmentirana partikula arenavirusa kao aktivni sastojak. Farmaceutske kompozicije iz predmetne prijave se pripremaju na način koji je poznat po sebi, na primer pomoću konvencionalnih postupaka mešanja i/ili postupaka dispergovanja.
4.8 Testovi
4.8.1 Testovi za detekciju arenavirusa
[0294] Stručnjak iz oblasti tehnike može da detektuje arenavirusni genomski segment ili trisegmentiranu arenavirusnu partikulu, kao što je ovde opisano korišćenjem postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike. Na primer, RT-PCR može da se koristi sa prajmerima koji su specifični za arenavirus da bi se detektovao i kvantifikovao arenavirusni genomski segment koji je modifikovan da nosi ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu ili tri-segmentirana arenavirusna partikula. „Western blot“, ELISA, radioimunotest, imunoprecipitacija imunocitohemija, ili imunocitohemija koja je povezana sa FACS može da se koristi da se kvantifikuju genski proizvodi arenavirusnog genomskog segmenta ili tri-segmentirane arenavirusne partikule.
1
4.8.2 Test za merenje infektivnosti
[0295] Bilo koji test koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike može da se koristi za merenje infektivnosti preparata arenavirusnog vektora. Na primer, određivanje titra virusa/vektora može da se odredi pomoću "testa jedinica koje obrazuju fokus" (FFU test). Ukratko, komlementarne ćelije, npr., MC57 ćelije su zasejane i inokulirane sa različitim razblaženjima virusnog/vektorskog uzorka. Posle perioda inkubacije, da bi se ćelijama omogućilo da obrazuju monosloj i da se virus veže za ćelije, monosloj je pokriven sa metilcelulozom. Kada su ploče dalje inkubirane, originalne inficirane ćelije su oslobodile virusno potomstvo. Zbog pokrivanja sa metilcelulozom širenje novih virusa je ograničeno na susedne ćelije. Prema tome, svaka infektivna partikula proizvodi cirkularnu zonu inficiranih ćelija koja se zove fokus. Takvi fokusi mogu da postanu vidljivi i prema tome mogu da se broje korišćenjeim antitela protiv LCMV-NP ili drugog proteina koji je eksprimiran sa arenavirusne partikule ili trisegmentirane arenavirusne partikule i HRP-zasnovane bojene reakcije. Titar virusa / vektora može da bude izračunat u jedinicama koje obrazuju fokus po mililitru (FFU/mL).
4.8.3 Rast arenavirusne partikule
[0296] Rast ovde opisane arenavirusne partikule može da se ispita bilo kojim postupkom koji je poznat iz oblasti tehnike ili je ovde opisan (npr., ćelijska kultura). Virusni rast može da se odredi inokulacijom serijskih razblaženja ovde opisane arenavirusne partikule u ćeliji (npr., Vero ćelije ili BHK-21 ćelije). Posle inkubacije virusa za određeno vreme, virus je izolovan korišćenjem standardnih postupaka.
4.8.4 Serumska ELISA
[0297] Određivanje humoralnog imunskog odgovora nakon vakcinacije životinja (npr., miševa, zamoraca) može da se izvede pomoću antigen-specifičnog seruma ELISA (enzimskih imunoadsorpcionih testova). Ukratko, ploče su obložene sa antigenom (npr., rekombinantni protein), blokirane su da bi se izbeglo nespecifično vezivanje antitela i inkubirane su sa serijskim razblaženjima seruma. Posle inkubacije, vezana antitela iz seruma mogu da se detektuju, npr., korišćenjem enzimskih kuplovanih anti-vrsta (npr., mišjih, zamorca)-specifičnog antitela (određivanje ukupnih IgG ili IgG podklasa) i naknadne bojene reakcije. Titri antitela mogu da budu određeni kao, npr., krajnja tačka geometrijske srednje vrednosti titra.
4.8.5 Test za ispitivanje neutralizujće aktivnosti indukovanih antitela
[0298] Određivanje neutralizujućih antitela u serumima je izvedeno sa sledećim ćelijskim testom korišćenjem ARPE-19 ćelija iz ATCC i GFP-obeleženog virusa. Dodatno je korišćen dopunski serum zamorčića kao izvor egzogenog komlementa. Test je iniciran zasejavanjem 6.5x10<3>ćelija/bunariću (50µl/bunariću) u ploči sa 384 bunarića jedan ili dva dana pre korišćenja za neutralizaciju. Neutralizacija je sprovedena u sterilnim pločama za kulture tkiva sa 96-bunarića bez ćelija tokom 1 h na 37 °C. Posle neutralizacije korakom inkubacije smeša je dodata u bunariće i inkubirana je dodatnih 4 dana za GFP-detekciju sa čitaćem za ploče. Pozitivni neutralizujući humani serum je korišćen kao pozitivna kontrola testa na svakoj ploči da bi se proverila pouzdanost svih rezultata. Titri (EC50) su određeni korišćenjem uklapanja logističke krive sa 4 parametra. Kao dodatno ispitivanje bunarići su provereni sa fluorescentnim mikroskopom.
4.8.6 Testovi redukcije plaka
[0299] Ukratko, testovi redukcije plaka (neutralizacije) za LCMV mogu da se izvedu upotrebom kompetentnog za replikaciju ili deficijentnog LCMV koji je obeležen sa zelenim fluorescentnim
2
proteinom, 5% zečji serum može da se koristi kao izvor egzogenog komplementa, i plakovi se mogu izbrojati fluorescentnom mikroskopijom. Titri za neutralizaciju mogu da se definišu kao najveće razblažanje seruma koje rezultuje u 50%, 75%, 90% ili 95% smanjenjem u plakovima, u poređenju sa onim u kontroli (pre-imunim) uzorcima seruma.
[0300] qPCR LCMV RNK genomi su izolovani upotrebom QIAamp RNK virusnog mini Kita (QIAGEN), prema protokolu koji je obezbedio proizvođač. Ekvivalenti LCMV RNK genoma su detektovani kvantitativnim PCR-om koji je izveden na StepOnePlus sitemu PCR-a u realnom vremenu (Applied Biosystems) sa SuperScript® III Platinum® qRT-PCR kompletom iz jednog-koraka (Invitrogen) i prajmerima i probama (FAM reporterom i NFQ-MGB prigušivačem) koji su specifični za deo kodirajućeg regiona LCMV NP ili drugog genomskog protezanja partikule arenavirusa ili trisegmentirane arenavirusne partikule. Temperaturni profil reakcije može da bude : 30 min na 60 °C, 2 min na 95 °C, koji prati 45 ciklusa 15 s na 95 °C, 30 s na 56 °C. RNK može da bude kvantifikovana upoređivanjem rezultata uzoraka sa standardnom krivom koja je dobijena log10 serijama razblaženja spektrofotometrijski kvantifikovanog, in vitro-prepisanog fragmenta RNK, koji odgovara fragmentu kodirajuće sekvence LCMV NP ili drugom genomskom protezanju arenavirusne partikule ili trisegmentirane arenavirusne partikule koja sadrži prajmer i mesta vezivanja proba.
4.8.7 „Western“ blotovanje
[0301] Inficirane ćelije koje su gajene u balonima za kulture tkiva ili u suspenziji su lizirane nakon infekcije korišćenjem RIPA pufera (Thermo Scientific) ili su korišćene direktno bez liziranja ćelije. Uzorci su zagrevani do 99 °C tokom 10 minuta sa redukcionim agensom i NuPage LDS Sample puferom (NOVEX) i ohlađeni su do sobne temperature pre nalivanja na 4-12% SDS-gelove za elektroforezu. Proteini su blotovani na membrane upotrebom Invitrogens iBlot sprave za transfer gela i vizuelizovani su bojenjem po Ponceau. Konačno, preparati su analizirani sa primarnim antitelima koja su usmerena prema proteinima od interesa i sekundarnim antitelima koja su konjugovana sa alkalnom fosfatazom nakon čega sledi bojenje rastvorom 1-Step NBT/BCIP (INVITROGEN).
4.8.8 Test bojenja MHC-peptidnog multimera za detekciju proliferacije antigen-specifičnih CD8+T-ćelija
[0302] Bilo koji test koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike može da se koristi za ispitivanje antigenspecifičnih CD8+ T-ćelijskih odgovora. Na primer, može da se koristi test za bojenje MHC-peptidnog tetramera (videti, npr., Altman J.D. et al., Science.1996; 274:94-96; i Murali-Krishna K. et al., Immunity.
1998; 8:177-187). Ukratko, test obuhvata sledeće korake, test tetramera je korišćen za detekciju prisutnosti antigen specifičnih T-ćelija. Da bi T-ćelija detektovala peptid za koji je specifična, mora i da prepozna peptid i tetramer MHC molekula koji su napravljeni po meri za određenu specifičnost antigena i MHC haplotip T-ćelija (koji je obično fluorescentno obeležen). Tetramer se nakon toga detektuje protočnom citometrijom preko fluorescentnog obeleživača.
4.8.9 ELISPOT Test za detekciju proliferacije antigen-specifičnih CD4+ T-ćelija.
[0303] Bilo koji test koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike može da se koristi za ispitivanje antigenspecifičnih CD4+ T-ćelijskih odgovora. Na primer, može da se koristi ELISPOT test (videti, npr., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65:109-121; i Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120:1-8). Ukratko, test se sastoji iz sledećih koraka: Ploča za imunospot je obložena sa anti-citokinskim antitelom. Ćelije su inkubirane u ploči za imunospot. Ćelije sekretuju citokine i nakon toga se ispiraju. Ploče se zatim oblažu sa drugim biotinilovanim-anticitokinskim antitelom i vizuelizuju se sa avidin-HRP sistemom.
4.8.10 Unutarćelijski citokinski test za detekciju funkcionalnosti CD8+ i CD4+ T-ćelijskih odgovora.
[0304] Bilo koji test koji je poznat stručnjacima iz oblasti tehnike može da se koristi za ispitivanje funkcionalnosti CD8+ i CD4+ T ćelijskih odgovora. Na primer, može da se koristi unutarćelijski citokinski test kombinovan sa protočnom citometrijom (videti, npr., Suni M.A. et al., J Immunol Methods.1998; 212:89-98; Nomura L.E. et al., Cytometry.2000; 40:60-68; i Ghanekar S.A. et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.2001; 8:628-63). Ukratko, test se sastoji iz sledećih koraka: aktivacija ćelija pomoću specifičnih peptida ili proteina, inhibicija proteinskog transporta (npr., brefeldin A) se dodaje da bi se citokini zadržali unutar ćelije. Posle definisanog perioda inkubacije, obično 5 h, sledi korak ispiranja, i antitela koja su specifična za druge ćelijske markere mogu da se dodaju ćelijama. Ćelije su nakon toga fiksirane i permeabilizovane. Flurohromom-konjugovana anti-citokinska antitela se dodaju i ćelije mogu da se analiziraju sa protočnim citometrom.
4.8.11 Test za potvrđivanje deficijencije za replikaciju virusnih vektora
[0305] Bilo koji test koji je poznat stručnjacima iz oblasti tehnike koji određuje koncentraciju infektivne i kompetentne za replikaciju virusne partikule može takođe da se koristi da bi se u uzorku izmerile virusne partikule koje su deficijentne za replikaciju. Na primer, FFU testovi sa ne-komplementarnim ćelijama mogu da se koriste za ovu svrhu.
[0306] Dalje, testovi koji su zasnovani na plaku su standardni postupak koji se koristi za određivanje koncentracije virusa u pogledu jedinica za obrazovanje plaka (PFU) u virusnom uzorku. Specifično, konfluentni monosloj ne-komplementarnih ćelija domaćina je inficiran sa virusom u različitim razblaženjima i pokriven je sa polu-čvrstim medijumom, kao što je agar da bi se sprečilo da se infekcija virusom širi neselektivno. Virusni plak je obrazovan kada virus uspešno inficira i umnoži se u ćeliji u okviru fiksiranog monosloja ćelija, i širi se prema ćelijama iz okruženja (videti, npr., Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol.32:Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0-12-521532-0). Obrazovanje plaka može da traje 2 - 14 dana, u zavisnosti od virusa koji se analizira. Plakovi se generalno manuelno broje i rezultat, u kombinaciji sa faktorom razblaženja koji je korišćen za dobijanje ploče, su korišćeni za izračunavanje broja jedinica koje obrazuju plak po zapremini jedinice uzorka (PFU/mL). PFU/mL rezultat predstavlja broj infektivnih kompetentnih za replikaciju partikula u uzorku. Kada su korišćene C-ćelije, isti test može da se koristi za titraciju arenavirusnih partikula koje su deficijentne za replikaciju ili tri-segmentiranih arenavirusnih partikula.
4.8.12 Test za ekspresiju virusnog antigena
[0307] Bilo koji test koji je poznat stručnjacima iz oblasti tehnike može da se koristi za merenje expresije virusnih antigena. Na primer, mogu da se izvedu FFU testovi. Za detekciju, korišćeni su preparati mono- ili poliklonskih antitela protiv određenih virusnih antigena (transgen-specifični FFU).
4.8.13 Životinjski modeli
[0308] Da bi se ispitala rekombinacija i infektivnost arenavirusne partikule koja se ovde opisuje mogu da se koriste in vivo životinjski modeli. U određenim izvođenjima, životinjski modeli koji mogu da se koriste za ispitivanje rekombinacije i infektivnosti tri-segmentirane arenavirusne partikule uključuju miša, zamorčića, zeca, i majmune. U poželjnom izvođenju, životinjski modeli koji mogu da se koriste za ispitivanje rekombinacije i infektivnosti arenavirusa uključuju miša. U specifičnijem izvođenju, miševi koji mogu da se koriste za ispitivanje rekombinacije i infektivnosti arenavirusne partikule su trostruko-deficijentni za receptor tipa I interferona, receptor tipa II interferona i rekombinacijski aktivirajući gen 1 (RAG1).
4
[0309] U određenim izvođenjima, životinjski modeli mogu da se koriste za determine arenavirusne infektivnosti i stabilnosti transgena. U nekim izvođenjima, virusna RNK može da bude izolovana iz seruma životinjskog modela. Postupci su već poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Virusna RNK može da bude reverzno prepisana i cDNK koja nosi arenavirusne ORF-e može da bude umnožena sa PCR-sa prajmerima koji su specifični za gen. Protočna citomentrija takođe može da se koristi za ispitivanje arenavirusne infektivnosti i stabilnosti transgena.
5. PRIMERI
[0310] Ovi primeri pokazuju da tehnologija vektora koja je zasnovana na LCMV virusu može da se koristi za uspešno razvijanje (1) arenavirusnog genomskog segmenta sa virusnim ORF u položaju koji nije položaj ORF u divljem tipu, i (2) tri-segmentirana arenavirusna partikula koja ne dovodi do kompetentne za replikaciju bi-segmentirane virusne partikule.
5.1 Materijali i postupci
5.1.1 Ćelije
[0311] BHK-21 ćelije su kultivisane u Dulbecco Eagle-ovom medijumu sa visokim sadržajem glukoze (DMEM; Sigma) koji je dopunjen sa 10 % toplotom-inaktivisanim serumom fetusa govečeta (FCS; Biochrom), 10 mM HEPES (Gibco), 1 mM natrijum piruvatom (Gibco) i 1x triptoza fosfatnim bujonom. MC57 ćelije su održavane u minimalnom esencijalnom medijumu (MEM; Sigma) koji je dopunjen sa 5 % toplotom-inaktivisanim FCS, 2 mM L-glutaminom (Gibco) i penicilin-streptomicin (100’000 U/ml penicilin i 50 mg/l streptomicinom; Gibco). Obe ćelijske linije su kultivisane u inkubatoru na 37 °C u vlažnoj atmosferi sa 5 % CO2.
[0312] BHK-21 ćelije koje eksprimiraju NP su dobijene transfekcijom BHK-21 ćelija sa plazmidom koji eksprimira NP pod kontrolom eukariotskog EF1-alfa promotora i koji kodira gen za rezistenciju na puromicin prema protokolu proizvođača. 48 h posle infekcije, 4 µg/ml puromicina je dodato u medijum. Drugih 48 h kasnije, ćelije su pasažirane u T150 flaskove. Jednom kada su odvojeni klonovi postali vidljivi, ćelije su sakupljene and serijski razblažene u ploču sa 96 bunarića da se dobiju pojedinačni klonovi. Bunarići su optički provereni za rast ćelijskih populacija iz jednog klona i odgovarajuće ćelije su pasažirane u ploče sa 6-bunarića kada su obrazovale konfluentni monosloj. BHK-21 ćelije koje eksprimiraju NP su kultivisane u BHK-21 medijumu u prisustvu 4 µg/ml puromicina.
[0313] BHK-21 ćelije koje eksprimiraju GP su prethodno bile opisane. Ukratko, BHK-21 ćelije su stabilno transfektovane sa plazmidom koji eksprimira kodon-optimizovanu LCMV-GP cDNK i kasetu za rezistenciju na puromicin. GP-eksprimirajući klonovi su selektovani dodavanjem 4 µg/ml puromicina u medijum i pojedinačni klonovi su dobijeni serijskim razblaženjima kao što je opisano za BHK-21 ćelije koje eksprimiraju NP.
5.1.2 Plazmidi
[0314] Plazmidi pol-I L, pC-NP i pC-L su prethodno bili opisani. Za dobijanje pol-I S plazmida koji kodiraju za GFP ili RFP kao reporterske gene i ili NP ili GP, koristili smo pol-I Bbs/Bsm plazmid za kloniranje kao osnovu (pol-I 5’-BsmBI_IGR_BbsI_3’). Ovaj plazmid kodira 5’ netranslatirajući region (5’ UTR) virusnog S segmenta koga prate BsmBI restrikciona mesta, intergenski region (IGR), NP ostatak i CAT otvoreni okvir čitanja (ORF) koji se ograničena sa BbsI restrikcionim mestima i 3’ UTR S segmenta. Pol-I S plazmidi koji kodiraju za GP u njegovom prirodnom 5’ i GFP u antisens orijentaciji na 3’ položaju (pol-I 5’-GP_IGR_GfP-3’) su klonirani insertovanjem GP pomoću BsmBI mesto specifične restrikcije i spajanja u pol-I Bbs/Bsm plazmid. U drugom koraku GFP je insertovan sa digestijom BbsI i spajanjem. Da bi se dobili pol-I S plazmidi koji kodiraju za GP u veštačkoj 3’ orijentaciji (pol-I 5’-GFP_IGR_GP-3’), GP je insertovan sa BbsI digestijom na 3’ položaju u pol-I Bbs/Bsm plazmidu i GFP sa BsmBI restrikcijom/povezivanjem na 5’ položaju. pol-I S koja kodira za GFP ili RFP i NP (pol- GFP_IGR_NP-3’ ili pol-I 5’RFP_IGR_NP-3’) su klonirani insertovanjem NP sa BbsI digestijom i spajanjem u pol-I Bbs/Bsm plazmid za kloniranje i GFP ili RFP sa kloniranjem BsmBI. Pol-I plazmid sa GP LCMV soja WE i NP LCMV soja Klona 13 (Cl13) su klonirani insertovanjem odgovarajućih gena sa Bbs i Bsm mestospecifičnom restrikcijom/spajanjem na odgovarajućim mestima u pol-I Bbs/Bsm plazmidu za kloniranje.
[0315] S segment koji kodira za WE/WET spojeni GP je dobiven zamenom najmanje 255 baznih parova WE ORF sa kodon-optimizovanom sekvencom koja je poznata pod imenom "WET". Ovo je postignuto PCR umnožavanjem u prvom koraku fragmenta WE GP sa jednim WE specifičnim prajmerom (SEQ ID NO: 11) i WE specifičnim spojenim-prajmerom koji nosi prepust koji je komplementaran sa WET sekvencom (SEQ ID NO: 12). Paralelno WET sekvenca je umnožena sa PCR upotrebom WET-specifičnog prajmera (SEQ ID NO: 13) i WET-specifičnog spojenog-prajmera komplementarnog sa WE sekvencom (SEQ ID NO: 14). U trećoj PCR reakciji dva PCR proizvoda su spojeni sa PCR spajanjem korišćenjem dva pomenuta spojena-prajmera. Dobijeni WE/WET spojeni fragment je digestiran sa BsmBI i spojen je u pol-I BsmBI_IGR_GFP-3’ plazmid koji je digestiran sa istim restrikcionim enzimom.
[0316] Pol-I plazmid koji kodira za rekombinantni S segment za in vivo rekombinantni virus r3LCMV-GFP<nat>#3 je kloniran insercijom sintetisanog DNK fragmenta (genska sinteza pomoću GenScript) sa mesto specifičnom restrikcijom/spajanjem sa SacI i XmaI u plazmid koji kodira S-segment divljeg tipa pod kontrolom promotora pol-I (pol-I GP_IGR_NP) pri čemu se dobija pol-I GP_IGR_GFPrest_IGR_NP.
5.1.3 DNK transfekcija ćelija i dobijanje rekombinantnih virusa
[0317] BHK-21 ćelije su zasejane u pločama sa 6-bunarića u gustini 4x10<5>ćelija/bunariću i transfektovane su 24 h kasnije sa različitim količinama DNK korišćenjem lipofektamina (3 µl/mg DNK; Invitrogen) ili jetPRIME (2 µl/mg DNK; Polyplus) prema instrukcijama proizvođača. Za dobijanje rekombinantnih bi-segmentiranih virusa u potpunosti iz DNK plazmida, dva minimalna virusna faktora sa trans delovanjem NP i L su isporučeni sa plazmida koji su vođeni pol-II (0.8 µg pC-NP, 1 µg pC-L) i zajedno su transfektovan i sa 1.4 µg pol-I L i 0.8 µg pol-I S. U slučaju dobijanja tri-segmentiranog r3LCMV koji se sastoji iz jednog L i dva S segmenata, 0.8 µg oba pol-I vođena S segmenta su uključeni u transfekcionoj smeši.72 h posle infekcije supernatant je sakupljen i pasažiran je na BHK-21 ćelije za dalje umnožavanje virusa. Virusni titri u supernatantu su određeni pomoću testa za obrazovanje fokusa.
5.1.4 Virusi i kinetike rasta virusa
[0318] Divlji tip Cl13 LCMV, originalno dobijen iz divljeg tipa LCMV Armstrong, je prethodno bio opisan. Štokovi divljeg tipa i rekombinantih virusa su proizvedei inficiranjem BHK-21 ćelija na multiplicitetu infekcije (moi) od 0.01 i supernatant je sakupljen 48 h nakon rasta. Virusne krive rasta su urađene in vitro u formatu 6-bunarića. BHK-21 ćelije su zasejane na gustini od 6X105 ćelija/bunariću i inficirane 24 h kasnije inkubacijom ćelija zajedno sa 500 µl virusnog inokuluma na moi od 0.01 u trajanju od 90 minuta na ploči koja se pomera na 37°C i 5% CO2. Svež medijum je dodat i ćelije su inkubirane na 37°C / 5% CO2 u trajanju od 72 do 96 h. Supernatant je uziman u datim vremenskim tačkama (normalno 18, 24, 48, 72 h) i virusni titri su analizirani testom za obrazovanje fokusa
5.1.5 Test za obrazovanje fokusa
[0319] Sledeće, titri LCMV su određeni pomoću testa kojim se meri obrazovanje fokusa. LCMV je necitolitički virus koji ne lizira svoje ćelije domaćina i kao takav ne dovodi do obrazovanja plaka. Osim toga, jedinice u ovom radu će biti eksprimirane u izrazu koji se koristi češće jedinice za obrazovanje plaka (PFU) umesto ispravnog izraza jedinice za obrazovanje fokusa (FFU). MC57 ćelije su korišćene za test za obrazovanje fokusa ukoliko nije drugačije naznačeno. Ćelije su zasejane u gustini od 1.6x105 ćelija po bunariću u ploči sa 24 bunarića i pomešane su sa 200 µl 10-strukih serijskih razblaženja virusa koji je dobijen u MEM/ 2 % FCS. Posle 2-4 h inkubacije na 37 °C, 200 µl viskoznog medijuma (2 % Metilceluloza u 2x dopunjenom DMEM) je dodato po bunariću da bi se osiguralo širenje virusnih partikula samo na susedne ćelije. Posle 48 h na 37 °C the supernatant je odbačen i ćelije su fiksirane dodavanjem 200 µl 4 % paraformaldehida (PFA) u PBS u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi (svi koraci koji slede su izvedeni na sobnoj temperaturi). Ćelije su permeabilizovane sa 200 µl po bunariću BSS/ 1 % Triton X-100 (Merck Millipore) u trajanju od 20 minuta i nakon toga su blokirane 60 minuta sa PBS/ 5 % FCS. Za anti-NP bojenje pacovsko anti-LCMV-NP monoklonalno antitelo je korišćeno kao primarno antitelo za bojenje u razblaženju od 1:30 u PBS/ 2.5 % FCS tokom 60 minuta. Za anti-GFP bojenje prečišćno pacovsko-anti-GFP antitelo (Biolegend 338002) je korišćeno u razblaženju od 1:2000 u PBS/ 2.5 % FCS. Ploče su isprane tri puta sa vodom iz česme i sekundarno HRP-kozje-anti-pacovsko-IgG je dodato u razblaženju od 1:100 u PBS/ 2.5 % FCS i inkubirano je u trajanju od 1 h. Ploča je ponovo isprana tri puta sa vodom iz česme. Bojena reakcija (0.5 g/l DAB (Sigma D-5637), 0.5 g/l amonijum nikl sulfat u PBS/ 0.015 % H2O2) je dodat i reakcija je zaustavljena posle 10 minuta sa vodom iz česme. Bojeni fokusi su manuelno bojeni i konačni titar je izračunat prema razblaženju.
[0320] Za anti-GP bojenje ćelija, ploče su fiksirane sa 50 % MeOH/ 50 % acetonom tokom 5 minuta i isprane su sa PBS. Blokiranje je sprovedeno kao što je opisano. Kao primarno antitelo anti-GP GP83.4 (proizvedeno iz hibridoma) je razblaženo 1:10 u PBS/ 2.5 % FCS i inkubirano je u trajanju 60 minuta. Posle tri ispiranja sa vodom iz česme, sekudarno HRP-zečje-antimišjIgG antitelo je dodato u razblaženju od 1:50 u PBS/ 2.5 % FCS i inkubirano je u trajanju od 60 minuta. Posle druga tri ispiranja sa vodom iz česme bojena reakcija je dodata kao što je opisano gore u tekstu.
[0321] Da bi se odredila viremija u krvi miševa, jedna kap krvi (odgovara zapremini 50 µl ) je sakupljena u 950 µl BSS-heparinu (Na-heparin, Braun, 1 IE/ml finalno), pomešana inverzijom i skladištena na -80 °C do dalje upotrebe.
5.1.6 Miševi
[0322] AGRAG miševi (IFNα/βR-/-, IFNγP-/-, RAG-/-) u prethodno bili opisano i gajeni su i održavani u specifičnim uslovima koji su oslobođeni prisustva patogena (SPF). Gajeni su na Institut für Labortierkunde Univerziteta u Cirihu, Švajcarska. Svi eksperimenti na životinjama su izvedeni na Univerzitetima Ženeva i Bazela u skladu sa švajcarskim zakonom za zaštitu životinja i dozvolom nadležni kantonalnih vlasti Ženeve i Bazela. Infekcija miševa je izvedena intravenozno na dozi od 1X104 PFU po mišu.
5.1.7 Dobijanje virusne RNK i sekvenciranje
[0323] Virusna RNK je ekstrahovana iz supernatanta ćelijske kulture ili iz „scrum“ inficiranih miševa QIAamp Virusnog RNK Mini kompleta (QIAGEN) prema uputstvima proizvođača. Reakcija reverznog prepisivanja ThermoScript RT-PCR Sistema (Invitrogen) i prajmer koji je specifičan za LCMV NP (SEQ ID NO: 15) u skladu sa uputstvima proizvođača. Umnožavanje sa PCR je izvedno upotrebom 2 µl cDNK iz RT koraka i NP- i GP- specifičnih prajmera (SEQ ID NO: 16). PCR reakcija je izvedena upotrebom Phusion High-Fidelity DNK Polimeraze (NEB). Umnoženi proizvodi su analizirani na i isečeni su sa 2 % agaroznog gela, prečišćeni u korišćenjem QIAquick Gel komleta za ekstrakciju (QIAGEN) i poslati su za DNk Sanger Sekvenciranje (Microsynth) korišćenjem NP-i GP-specifičnih prajmera.
5.1.8 Protočna citometrija
[0324] Krv je bojena sa antitelima koja su specifična za CD11c (N418), CD11b (M1/70), CD19 (6D5), NK1.1 (PK136), CD90.2 (30-H12) i GR-1 (RB6-8C5). Ekspresija površinskih molekula koji su bojeni sa specifičim antitelima kao i ekspresija GFP i RFP je analizirana na BD LSR Fortessa protočnom citometru korišćenjem FlowJo softvera (Tree Star, Ashland, OR).
5.1.9 Statistička analiza
[0325] Statistički značaj je određen sa dvosmernim nesparenim t testom ili 1-smernom ANOVA koje prati Dunnet-ov ili Bonferroni-jev post-test za višestruka poređenja korišćenjem Graphpad Prism softvera (verzija 6.0d). p vrednosi od p > 0.5 nisu smatrane značajnim (ns), dok p vrednosti od p < 0.5 su smatrane značajnim (*) sa gradacijama od p < 0.01 (**) i p < 0.001 (***) kao visoko značajnim.
5.2 Rezultati
5.2.1 Recombinantni tri-segmentirani virusi rastu do nižih titra u odnosu na divlji tip LCMV [0326] Genom divljeg tipa LCMV se sastoji i dva jedno-lančana segmenta RNK egarivnog polariteta (jedan L, jedan S segment) (Sl 1A). Poslednjih godina se pokazalo da je moguće uvesi dodatne strane gene u normalno bi-segmentiran genom koji je pronađen kod LCMV partikula. NP i GP geni su odvojeni na dva analoga S segmenta, i geni od interesa su insertovani u svaki pri čemu se dobija S segment LCMV što dovodi do kompetentnih za replikaciju virusnih partikula sa RNK segmenta (dva S jedan L). Jedina trenutno objavljena strategija drži oba NP i GP u njihovom prirodnom položaju u S segmentu, prema tome postavljanje GFP ili drugih transgena u odgovarajuća slobodna mesta (r3LCMV- GFPnat) (Sl 1B). Ovo je bio intuitivan pristup sa ciljem minimalizovanja mogućeg rizika da genetičko premeštanje S segment ukine nastalu varijabilnost genoma. Međutim, ovo ispitivanje je pretpostavilo da takođe treba da bude moguće da se GP suprotstavi 3’UTR, eksprimiranjem sa promotorskog elementa koji normalno pokreće NP (r3LCMV-GFPart; Sl. 1C). Odgovarajući ekspresioni plazmidi u dobijeni rekombinantnim kloniranjem cDNK i tri virusna konstrukta su u potpunosi dobijena iz plazmidne DNK. Uporedive krive rasta su izvedene za tri virusa (Sl. ID). Sva tri virusa su pokazala najveće titre 48 h posle infekcije, sa maksimalnim titrima tri-segmentiranih virusa 10-100 puta nižim od virusa divljeg tipa. Divlji tip LCMV je dostigao 3.4X10<6>PFU/ml, r3LCMV-GFP<nat>sa maksimalnom vrednosti na 2.7X10<4>PFU/ml i r3LCMV-GFP<art>na 2.2X10<5>PFU/ml. Bez obzira na njegove slično smanjene maksimalne vrednoti titra, r3LCMV-GFP<nat>je pokazao nešto veću infektivnost bez ćelija tokom ranih vremenskih tačaka u odnosu na r3LCMV-GFPart .
5.2.2 Pakovanje tri-segmentiranih virusnih partikula je manje efikasno u odnosu za bi-segmentiran virus
[0327] Ova zapažanja sugerišu da je dodavanje S segmenta narušilo i usporilo virusni rast. Pretpostavljeno je da ovo smanjenje u virusnom fitnesu može da bude zbog neefikasnog pakovanja sva tri RNK segmenta u virusne partikule, i da je formiran višak bi-segmentiranih partikula, koji nije uspeo da se produktivno umnoži prilikom inficiranja sveži ćelija. Za ove eksperimente r3LCMVs a dva različita reporterska gena tj., GFP zajedno sa GP na jednom S segmentu, i NP pored RFP na drugom S segmentu su korišćeni. Ovo je rezultiralo u dva virusa pod imenom r3LCMV-GFP/RFP<nat>i r3LCMV-art
GFP/RFP , koji su se razlikovali samo u aranžmanu GFP i GP na odgovarajućem S segmentu. BHK-21 ćelije su inficirane sa r3LCMV-GFP-RFP<nat>ili bi-segmentiranom r2LCMV i testovi za obrazovanje fokusa su izvedeni na normalnim BHK-21 ćelijama ili, paralelno, sa stabilno transfektovanim BHK-21 ćelijama koje eksprimiraju ili GP (BHK-GP) ili NP (BHK-NP) kao ćelijski supstrat za trans-komplementarne virusne genome kojima nedostaju određeni geni. Divlji tip i GP-komplementarne ćelije su bojene za virusne fokuse koji eksprimiraju nukleoprotein, pri čemu su NP-komplementarne ćelije bojene za GP-pozitivne fokuse. Prema tome, obrazovanje imunofokusa na divljem tipu BHK-21 ćelija je detektovalo samo trisegmentirane virione. Bez ograničavanja teorijom, BHK-GP ćelije trebaju da umnože tri-segmentirane virione kao i bi-segmentirane koji sadrže L segment u kombinaciji sa S segmentom koji eksprimira NP (ali je lišen od GP-eksprimirajućeg S). Suprotno tome, BHK-NP ćelije trebaju da umnože trisegmentiran LCMV i dodatno NP-deficijentne virione koji se satoje iz L i S segmenta koji eksprimira GP (ali je lišen od NP-eksprimirajućeg S segmenta). Infektivni titri oba r3LCMV- GFP/RFP<nat>i r3LCMV-art
GFP/RFP , su bili konstantno veći kada se procenjuje na BHK-GP ili BHK-NP ćelijama u odnosu na to kada je infektivnost ispitana na wt BHK-21 ćelijama. Suprotno tome, titri r2LCMV su bili slični, bez obira na ćelijski supstrat koji je korišćen za ispitivanje njegove infektivnosti. Da bi se ispravile potencijalne unutrašnje razlike u permisivnosti svake ćelijske linije za LCMV, svaki virusni titar na BHK-21 ćelijama je normalnizovan na jedan, za prikaz i BHK-GP kao i titri za BHK-NP su eksprimirani kao njegov umnožak. Na taj način se održavaju razlike u titru povezane sa ćelijskim klonom u odnosu na potencijalne unutrašnje razlike klona u virusnoj permisivnosti (Sl. 2A). U bilo kojoj od komplementarnih ćelija, uočena je približno pet do deset puta razlika u titru za r3LCMV-GFP/RFP<nat>i art
r3LCMV-GFP/RFP , što je bilo značajno veće u odnosu na r2LCMV. Ovo je ukazalo da je većina virusnih partikula, koje su obrazovane sa dva tri-segmentirana virusa, sadržala samo jedan od dva S-segmenta, koji kodiraju ili samo NP-(samo NP partikule) ili S segment koji kodira GP (samo GP partikule), redom . Razlika u titru od 5-puta ili veća je ukazala da su obe, samo NP i takođe samo GP partikule brojnije od tri-segmentiranih partikula približno pet puta svaka, i da tri-segmentirane partikule čine manje od 10 procenata samo viriona, što je uporedivo sa odloženim rastom i smanjenjem u maksimalnim vrednostima virusnih titara kada se gaje na ne-komplementarnim ćelijama (Sl.1D). Ovi nalazi su dalje potvrđeni protočnom citometrijom. Ne-komplementarne BHK-21 ćelije ili BHK-NP ćelije su inficirane sa r3LCMV-GFP/RFP<art>ili r2LCMV kao kotrolom gejtinga i intenziteti fluorescencije GFP i RFP su ispitani sa protočnim citometrom (Sl. 2B). S obzirom na to da minimalni faktori sa trans delovanjem niu obezbeđeni od strane divljeg tipa BHK-21 ćelija, samo virioni koji sadrže najmanje L segment zajedno sa S segmentom koji eksprimira NP može da inicira infektivni ciklus nakon ulaska u ćeliju, pri čemu se dobija fluorescentni signal (RFP). Prema tome, populacija RFP+GFP- ćelija je primećena nakon infekcije BHK-21 ćelija, što odražava čestice samo sa NP. RFP+GFP+ dvostruko-pozitivne ćelije su bile verodostojni dokaz tri-segmentiranih partikula. Prema gejtovanju takođe su uočene RFP-GFP+ ćelije, koj su imale veći RFP MFI u odnosu na RFP-GFP-ćelije, što sugeriše da predstavljaju rane stadijume infekcije sa trisegmentiranim partikulama, interpretacija koja je takođe podržana sa kontinuitetom ove populacije i RFP+GFP+ dvostruko pozitivne. Međutim, kada se tri-segmentiran r3LCMV-GFP/RFPart gaji na BHK-NP ćelijama, čime se zamenjuje ovaj minimalni faktor transdelovanja, uočeno je više od 10-puta veći broj RFP-GFP+ ćelija u poređenju sa infekcijom ne-komplementarnih BHK-21 ćelija. Suprotno tome, RFP+GFP-(dokaz partikula sa samo NP) i GFP+RFP+ dvostruko pozitivne ćelije (trisegmentirane partikule) su detektovane u uporedivoj količini (Sl.2C). Ovi rezultati su potvrdili na nivou jedne ćelije otkrića koja su dobijena testo za obrazovanje fokusa, prema tome potvrđujući da preparati tri-segmentiranog virusa sadrže većinu bi-segmentiranih partikula koje su deficijentne za replikaciju. Ovi nalazi su potvrdili verovatno objašnjenje za oslabljeni rast r3LCMV-GFP/RFP<nat>i r3LCMV-GFP/RFPart čime se obzbeđuje uvid u očigledno prilično neefikasno nasumično pakovanje tri-segmentiranih virusa.
5.2.3 Kloniranje i dobijanje rekombinantnih virusa za praćenje rekombinacije in vivo
[0328] S obzirom na to da tri-segmentirani virusi pokazuju narušene kinetike rasta kao što je uočeno na Sl 1, predloženo je da treba da postoji visoki selekcioni pritisak na viruse da rekombinuju njihovu genetičku informaciju za NP i GP na samo jednom S segmentu. Pretpostavlja se da je intersegmentalna rekombinacija arenavirusa dovela do filogenetske evolucije severno američke klade, i prema tome se čini kao potencijalni mehanizam gde bi tri-segmentirani virusi mogli da uspostave funkcionalni bi-segmentiran genom. Bez ograničavanja teorijom, gledajući organizaciu genoma dva trisegmentirana virusa predloženo je da bi selekcioni pritisak na r3LCMV-GFP<nat>mogao da favorizuje događaje rekombinacije u oblasti IGR, da dovede GP i NP zajedno na isti segment, dok bi se rešio GFP. U populaciji r3LCMV-GFP<art>selekcioni pritisak treba da bude jednako visok, međutim, premeštanje GP i njegovo pozicioniranje blizu 3’UTR bi trebalo da čini veoma teškim ukoliko nemogućim da ovaj virus kombinuje njegove S segmente u jedan funkcionalni segment (videti Sl. 7 ispod). Na osnovu upozorenja za identifikaciju RNK rekombinacije i da se jasno naprai razlika od potencijalne kontaminacije cDNK, kloniran je S segment koji nosi GFP zajedno sa rekombinantnim GP ORF u kome su terminalni 255 nukleotidi optimizovani kodonom. Dobijeni GP je imao različitu nukleotidnu sekvencu ali identičan proizvod translacije kao divlji tip WE soja GP (WE/WET-GP, Sl. 3A). Ovaj rekombinantni WE/WET GP ORF nije, međutim, postojao kao infektivni bi-segmentirani virus niti je laboratorijki sadržao konstrukt cDNK u kome je bio povezan sa NP. Bilo koji potencijalni bisegmentirani virus koji sadrži WE/WET na istom segmentu kao NP se prema tome posmatrao kao jasan dokaz intersegmentalne rekombinacije, pri čemu se takvi virusi razlikuju od potencijalno kontaminiranih cDNK ili RNK u odgovarajućim testovima. Da bi se ispitalo da li himerni GP ima efekat na virusni fitnes, krive rasta ćelijske kulture rekombinantnog tri-segmentiranog virusa koji nosi WE/WET spojeni GP (r3LCMV-WEWET/GFPnat) su izvedene u poređenju sa tri-segmentiranim virusom koji nosi divlji tip WE GP (r3LCMV-WE/GFPnat) (Sl.3B). Kinetike rasta i maksimalne vrednosti titara dva virusa su uporedive (r3LCMV-WE/GFPnat<6>nat
: 1.7x10 PFU/ml, r3LCMV-WEWET/GF-P : 2.3x10<6>PFU/ml). Prema tome himerni WEWET glikoprotein nije primetno uticao na rast virusa.
[0329] Da bi se ispitalo da li potencijalni događaji rekombinacije mogu da se dese između NP i GP gena S segmenta koji bi mogao da uključi IGR. Prema ome, uklanjanje jednog nuklotida je uvedeno u intrgenskom regionu NP-kodirajućeg S segmenta, koji služi kao genetički obeleživač. Izbor obog nukleotidnog uklanjanja je napravljen zbog toga što se nalazi na potezu koji za razliku od većine S segmenta IGR nije konzervisan između sojeva, ni u sekvenci ni u dužini. U slučaju događaja rekombinacije "obeležen" (označen sa * kroz, i na slikama i u tekstu) intergenski region treba da omogući idenifikaiju genskog početka IGR sekvenci S segmenta. Položaj uklonjenog citozina (označn sa strelicom) i šematski prikaz S segmenta koji nosi NP je predstavljen na Slici 3C. Kako bi se ispitalo da li uvedeno uklanjanje u IGR je imalo uticaja na virusni rast, dobijen je rekombinantni r3LCMV-GFPnat sa ili bez uklanjanja jednog nukleotida. Eksperimenti za dobijanje kriva rasta su izvedeni na BHK-21 ćelijama (moi= 0.01). Tri-segmentiran virus sa divljim tipom IGR (r3LCMV-GFPnat) i njegov komparator sa mutiranim IGR (r3LCMV-GFP<nat>IGR*) su rasli sličnom brzinom i dostigli su maksimalne vrednosti titrara koje se ne razlikuju (Slika 3D). Shodno tome obeleživač na IGR na S segmentu koji nosi NP nije imao primetan uticaj na virusni fitnes, čime se potvrđuje njegova upotreba za naknadno eksperimentisanje in vivo.
5.2.4 r3LCMV-GFP<nat>ali ne r3LCMV-GFP<art>trajna infekcija kod miševa dostiže nivoe viremije koji su ekvivalentni sa bi-segmentiranim wt virusom i rezultuje u gubitku ekspresije GFP
[0330] Nakon dobijanja reokmbinantnog r3LCMV-GFP<nat>cilj je bio da se ispita da li se tri-segmentirani virusi rekombinuju in vivo. Za ovu svrhu AGRAG miševi su inficirani sa r3LCMV-GFPnat , r3LCMV-GFPart ili bi-segmentiranim r2LCMV kao kontrolom. AGRAG miševi nose ciljana uklanjanja u genima koji kodiraju za receptor interferona-α/β, receptor interferona-y i RAG1, što dovodi do imunodeficijentnog fenotipa i uspostavljanja hronične viremije posle infekcije sa tri-segmentiranim LCMV. Uzorci krvi su uzimani tokom vremena i virusni titri su ispitani sa testom za obrazovanje fokusa (Sl.
<5>4A). Nosači bi-segmentiranog LCMV su pokazali visok titar viremije u opsegu od 5X10 PFU/ml krvi 4
tokom 5 dana posle infekcije, na naknadno stabilnom viremijom 10 - 10<5>PFU/ml opsega do najmanje dana 50 posle infekcije. Miševi koji su inficirani sa tri-segmentiranim LCMV pokazuju virusna opterećnja od oko 5X10<3>PFU/ml krvi do dana 20, u skladu sa oslabljenim rastom u ćelijskoj kulturi (u poređenju sa Sl. ID). Od dana 30 nadalje, nosači r3LCMV-GFP<nat>su ispoljili porast u virusnom opterećenju, koji nije uočen kod životinja inficiranih sa r3LCMV-GFPart , pri čemu se dobija razlika u viremiji koja je veća od 10-puta u danu 50. Da bi se odredilo da li dominantna populacija virusa još uvek nosi GFP reporterski gen, prema tome dolazi do GFP ekspresije u inficiranim ćelijama, testovi za obrazovanje fokusa virusa sa uzorcima krvi r3LCMV-GFP<nat>i r3LCMV-GFP<art>nosačima koji su uzeti u danu 127 posle infekcije su izvedeni i obojeni za nukleoprotein ili reporterskim genom GFP (Sl. 4B). Dok je bojenje krvi izolovane iz r3LCMV-GFP<art>nosača za rezultat imalo jednake količine fokusa sa detekcijom anti-NP i anti-GFP antitela (oba ispitivanja nezavisno ukazuju na virusne titre u opsegu 103 PFU/ml) najmanje 100-puta veći brojevi ukupnih (NP+) r3LCMV-GFP<nat>fokusa su uočljiviji od fokusa koji eksprimiraju GFP. Virusni titri od najmanje 10<4>PFU/ml su izmereni na osnovu detekcije anti-NP, dok dva od tri miša nije uspeo da pokaže bilo koju detektabilnu GFP-pozitivnu infektivnost i jedan miš je imao preostali deo GFP-poziivnih fokusa u opsegu 100 PFU/ml, šo odgovara nižoj granici detekcije u našim testovima. Ekspresija GFP od strane inficiranih ćelija je takođe ispitana fluorescentom mikroskopijom (podaci nisu prikazani). GFP-fluorescentni fokusi su bili praktično neotkriveni kada je ispitana krv iz r3LCMV-GFP<nat>nosača dok manuelna brojanja GFP-pozitivnih fokusa od r3LCMV-GFPart nosača krvi se poklapalo sa rezultatima titra koji su dobijeni sa anti-NP testom za obrazovanje fokusa. Ekspresija reporterskog gena je dalje potvrđena protočno citometrijskom analizom PBMC-a inficiranih miševa u danu 120 posle infekcije. Pronađeno je da je više od 10 % CD11b+GR1-monocita/makrofaga bilo pozitivno za GFP u r3LCMV-GFP<art>inficiranim životinjama dok je krv iz r3LCMV-GFP<nat>pokazala samo pozadinske nivoe GFP, koji je bio uporediv sa životinjama koje su inficirane sa ne-fluorescentnim r2LCMV (Sl.4C-E). Ovo okriće je dodatno podržalo hipotezu da tri-segmentirani virusi sa GP u njihovom prirodnom položaju gube ekspresiju reporterskog gena tokom vremena dok transpozicija GP u veštačkoj 3’UTR jukstapoziciji sprečilo gubitak transgena.
5.2.5 Tri-segmentirani virusi sa GP u prirodnom položaju mogu da rekombinuju njihova dva S segmenta pri čemu se dobija jedan S segment sa parcijalnim ili potpunim IGR duplikacijma koje okružuju rudiment sekvence transena
[0331] Slika 4 pokazuje povećanu viremiju i gubitak ekspresije reporterskog gena kod miševa koji su inficirani sa r3LCMV-GFPnat . Prema tome, pretpostavljeno je da bi događaj rekombinacije mogao da objasni ovaj eksperimentalni ishod. Intersegmentalna rekombinacija bi mogla da kombinuje GP i NP na istom S segmentu, otklanjajući potrebu za drugim S segmentom u ciklusu virusne replikacije. Akav događaj bi naon toga mogao da objasni viremiju na nivou virusa divljeg tipa, u kombinaciji sa gubitkom ekspresije reporterskog gena. Da bi se ova mogućnost ispitala virusna RNK iz seruma inficiranih miševa je izolovana i par prajmera koji se vezuju za NP i GP sekvence, redom, su korišćeni za selektivno umnožavanje sa RT-PCR samo navodno rekombinovanih RNK molekula, koji nose oba NP i GP ORF u ambisens orijentaciji na jedom RNK segmentu. Dobijeni PCR fragmenti su analizirani elektroforezom na gelu (Sl. 5A). Serum svih r3LCMV-GFP<nat>nosača je proizveo RT-zavisne PCR proizvode, pri čemu r3LCMV-GFP<art>nosači i naivne kontrole nisu pokazali specifične trake. Kontrolne PCR reakcije su izvedene na lažnim-RT-tretiranim RNK uzorcima da bi se isključile kontaminacije sa cDNK kao izvorom PCR proizvoda. Rezultati sekvenciranja tri individualna r3LCMV-GFP<nat>nosača su šematski prikazani na
1
Sl. 5C. Tri miša su sadržala virusne RNK segmente različitih sekvenci ali istog obrasca: C-terminalni delovi GP i NP su pronađeni u ambisens orijentaciji na jednom RNK segmentu. Između njih, oba intergenska regiona, tj., jedan koji eksprimira NP i jedan originalnog segmenta koji eksprimira GP su bar delom zadržani, razdvojeni sa fragmentom i bilo kog jednog ili oba GFP reporterska gena u parentalnim S segmentima trisegmentiranog virusa. Smer i dužina GFP fragmenta se razlikovala između tri vrste RNK koje su dobijene iz individalnih miševa, što je ukazivalo na nezavisne događaje rekombinacije. U daljoj podrši ovom utisku, tačno ista rekombinovana RNK sekvenca je dobijena iz dva uzastopna uzorka koja su uzea iz istog miša sa više od tri nedelje intervala između uzorkovanja. Na osnovu dobijenih sekvenci rekombinovanog S segmenta, predložen je molekularni mehnizam, kao što je šematski naznačeno na Sl.7 i opisano u legendi slike, pri čemu r3LCMV- GFP<nat>rekombinuje svoja dva S segmenta, što dovodi do gubitka transgena i reverzije fenotipa do virusa divljeg tipa. Šematski prikazi na Sl.7 takođe objašnjavaju zašto, prema predloženom mehanizmu rekombinacije S segmenta, r3LCMV-GFPartne može da se rekombinje i dovede zajedno svoje NP i GP ORF na jedan funkcionalni S segment.
5.2.6 Recombinantni r2LCMV sa dva IGR na S segmentu je vijabilan i raste do sličnih vrednosti titara kao bi-segmentiran LCMV sa samo jednim IGR u S segmentu.
[0332] Gore navedni podaci sekvenciranja u otkrili dosleda obrazac virunih genetičkih elemenata u rekombinantnim S segmentima među kojima i (bar delom) duplikacija IGR je posebno bila vredna pažnje i karakteristična. Međutim, arenavirusi sa ponovcima intergenkih regiona na jednom S segmentu nisu poznati. Dvostruka petlja drška e, međutim, prirodno nalazi u arenavirusu Mopeia starog sveta. Prema tome, kloniran je rearanžiran S segment r3LCMV-GFP<nat>nosača #3 sa dva IGRa i ostatak od GFP u S segment ekspresionog plazmida koji je vođen sa pol I i dobijen je određeni virus. Kinetike rasta ovog virusa (r2LCMV_2IGRs) na BHK-21 ćelijama su upoređene sa tri-segmentiranim r3LCMV-GFP<nat>i bi-segmentiranim r2LCMV (Sl.6). Infektivni titri bez ćelija r2LCMV_2IGRs su premašili one od r3LCMV-GFPnatveć u ranim vremenskim tačkama i dostigli su identične maksimalne vrednsoti titra kao za r2LCMV (1.7X10<7>PFU/ml u odnosu na 1.6X10<7>PFU/ml, redom). Važno, r2LCMV_2IGRs je rastao do značajno vćih maksimalnih vrednosti titara u odnosu na njegov parentalni tri-segmentirani r3LCMV-GFP<nat>što svedoči o selektivnoj prednosti intersegmentalne rekombinacije despite pored dupliciranja IGR tokom ovog postupka.
5.2.7 Recombinantni r3LCMV koji eksprimira ovalbumin (OVA) indukuje brz, jak i polifunkcionalan OVA-specifičan CD8+ T ćelijski odgovor.
[0333] Da bi se ispitala korisnost tehnologije za isporuku r3LCMV<art>vektora za svr vakcinacije dobijen je r3LCMV- OVA<art>vektor vakcine za genomsku organizaciju koji je analogan sa r3LCMV-GFP<art>(Sl.1C) ali sa dva gena za ovalbumin (OVA) umesto odgovarajućih GFP gena u potonjem virusu. C57BL/6 miševi u imunizovani intramuskularno (i.m.) sa 10<4>PFU r3LCMV-OVA<art>i osam dana kasnije je analiziran odgovor T ćelija u slezini. Za poređenje sa široko korišćenom vektorskom platformom imunizovana je druga grupa C57BL/6 miševa sa 10<8>partikulama deficijentnog za replikaciju E1-uklonjenog vektora koji je zasnovan na adenovirusu koji takođe eksprimira OVA (rAd5-OVA). Učestalost OVA-specifičnih CD8+ T ćelija koji prepoznaju imunodominantni OVA-izvedeni SIINFEKL epitop je bila u 10% opsegu CD8+ T ćelija u r3LCMV- OVA<art>grupi vakcine, koja je bila značajno veća nego u rAd5-OVA grupi (Sl. 8A). r3LCMV-OVA<art>indukovani CD8+ T ćelijski odgovori nisu bili samo velike magnitude ve takođe vioko funkcionalni kao što je određeno sa testovima za ispitivanje unutarćelijskih citokina, otkrivajući da veliki deo SIINFEKL-reactivnog r3LCMV-OVA<art>indukuje CD8+ T ćelije koje proizvode IFN-γ u odgovoru na stimulaciju peptidom, i da je dobar deo istovremeno proizveo TNF-α i/ili IL-2. Ovo je pokazalo korisnost tehnologije r3LCMV- OVA<art>vektora za isporuku vakcine.
2
5.2.8 Trisegmentiran LCMV indukuje polifunkcionalne memorijske CD8+ T ćelije.
[0334] Da bi se rešilo pitanje da li r3LCMV vektori indukuju funkcionalnu CD8+ T ćelijsku memoriju C57BL/6 miševi su imunizovani sa 10e5 PFU r3LCMV-OVA<art>i.v. i analizirani su OVA-specifični (SIINFEKL-specifični) CD8+ T ćelijski odgovori u slezini u danu 25. Referentna kontrolna grupa miševa je vakcinisana sa 10e8 virusnim partikulama (vp) rekombinantnog E1-uklonjenog adenoviralnog vektora (rAd) koji eksprimira OVA sa istim načinom davanja. OVA-specifične CD8+ T ćelije koje proizvode IFN-γ, TNF-α i/ili IL-2 posle stimulacije peptidom su ispitani u standardnim testovima unutarćelijskog citokina nakon stimulacije SIINFEKL peptidom. Određena je učestalost (Slika 9A) i apsolutni broj (Slika 9B) ćelija koje proizvode citokine kao što je naznačeno u tabeli. r3LCMV-OVAartimuni miševi ispoljavaju značajno veće učestalosti i brojeve polifunkcionalnih I OVA-specifičnih CD8+ T ćelija koje zajedno proizvode FN-γ / TNF-α i IFN-γ / TNF-α / IL-2 u odnosu na rAd-OVA-imune miševe.
5.2.9 LCMV koji kodira antigen indukuje specifične T ćelijske odgovore prema stranim i sopstvenim antigenima.
[0335] Da bi se ispitalo da li r3LCMV<art>vektori mogu da se koriste za indukovanje CD8+ T ćelijskih odgovora protiv sopstvenih antigena koji su eksprimirani na tumorima, BALB/c miševi su imunizovani sa r3LCMV<art>vektorima koji eksprimiraju ili pacovske (TYVPANASL), humane (TYLPTNASL) ili mišje (TYLPANASL) Her2-izvedene CD8+ T ćelijske epitope (Slika 10). Devet dana kasnije su merene CD8+ T ćelije koje proizvode IFN-γ, TNF-α i/ili IL-2 nakon stimulacije sa odgovarajućim peptidima u testovima za merenje unutarćelijskog citokina. Slika 10 prikazuje učestalnosti epitop-specifičnih CD8+ T ćelija kao procenat CD8+ T ćelija koje proizvode naznačenu kombinaciju citokina nakon stimulacije sa srodnim peptidom. Učestalosti CD8+ T ćelija koje proizvode citokine nakon restimulacije samo sa medijumom su bile beznačajne. Rezultati pokazuju da r3LCMV<art>vekori imaju kapacitet da indukuju značajne učestalosti odgovora reaktivnih CD8+ T ćelija prema tumorskih sopstvenih (auto) antigena.
5.2.10 Interferon-α se indukuje nakon r3LCMV<art>infekcije ali ne nakon infekcije sa rekombinantnim Adeno-ili Vaccinia virusnim vektorima.
[0336] Interferoni tipa I mogu da imaju brojne imunostimulatorne i anti-tumorske efekte. Prema tome, uvođenje interferona tipa I može da predstavlja povoljnu karaktristiku virusno vektorske vakcine. Sprovedena su ELISA merenja da bi se odredile koncenracije interferona-alfa u serumu miševa koji su imunizovani sa r3LCMV-OVAart , rAd-OVA ili rekombinantnim vaccinia virusom koji eksprimira OVA (rVacc) 24, 48 ili 72 h ranije (Slika 11). r3LCMV<art>ali ni rAd niti rVacc indukuju detektabilni i neprekidni (najmanje 48 h) sistemski odgovor interferona-alfa. Ovo svedoči o kapacitetu r3LCMVart vektora da indukuju jake odgovore urođenog imuniteta.
5.2.11 Rast ćelijske kulture r3JUNV-GFPart u poređenju sa r3JUNV-GFP<nat>i parentalnim Junin sojem Candid#1.
[0337] Po analogiji sa r3LCMV-GFP<nat>i r3LCMV-GFP<art>vektorima, koji nose genom koji je naznačen na<nat>art
Sl 1B izvršena je modifikacija r3JUNV-GFP i r3JUNV-GFP , koji se sastoji iz vektora zanovanih na trisegmentiranom Junin vakcina soju Candid#1 koji nose GFP gene u svakom od njihova dva odgovarajuća S segmenta (r3JUNV-GFP<nat>i r3JUNV-GFPart). Mi smo ispitali njihova svojstva rasta u 293T ćelijama, koje su inficirane na multiplicitetu infekcije 0.01 i supernatant je sakupljen tokom vremena (Sl.12). Pronađeno je da je r3JUNV-GFP<art>rastao sporije u odnosu na njegov parentalni bisegmentiran nat
Junin vakcina soj Candid#1 (Sl.12). Međutim, brže je rastao u odnosu na r3JUNV-GFP ,(Sl.12). Ovo diferencijalno ponašanje u rastu vektora koji u zasnovani na trisegmentiranom Junin virusu bilo je paralelno sa brzinama rasta r3LCMV-GFP<nat>i r3LCMV-GFP<art>vektora (Sl. ID).
5.2.12 Trisegmentirani JUNV su dramatično oslabljeni in vivo, i r3JUNV-GFP<nat>ali ne r3JUNV-GFPart gubi ekspresiju GFP nakon produžene in vivo replikacije.
<nat>art
[0338] Da bi se ispitala genetička stabilnost r3JLJNV-GFP i r3JUNV-GFP AGRAG miševi su inficirani (IF- Nα/βR-/-, IFNγR-/-, RAG-/-) sa 7x10<e4>PFU sa bilo kojim od ovih vektora koji eksprimiraju GFP. Za vrhu poređenja, treća grupa je inficirana sa divljim tipom bisegmentiranim Candid#1 virusom. Potonji virus je brzo detektovana u krvi svih inficiranih miševa do dana 20 posle infekcije (Slika 13A), pri čemu su trisegmentirani virusi ostali nedetektabilni najmanje 40 dana. Ovo otkriće je dokumantovalo oslabljen in vivo rast kao rezultat reorganizacije genoma, proširujući naša otkrića sa r3LCMV-GFP vektorima u Sl. 4A sa Junin-zasnovanim vektorima. Posle dana 40, takođe r3JUNV-GFP<nat>i r3JUNV-GFP<art>su postali detektabilni kod nekoliko životinja u svakoj grupi (Slika 13A). Važno je, međutim, da nat
su neki od r3JUNV- GFP -inficiranih miševa dostigli virusna opterećenja u opsegu divljeg tipa Candid#1-inficiranih miševa pri čemu su viremični r3JUNV-GFPart-inficirani miševi zadržali niže virusn opterećenje u odnosu na Candid#1-inficirane kontrole.
[0339] Da bi se odredilo da li dominantna populacija virusa u ovim viremičnim životinjama još uvek nosi GFP reporterski gen, prema tome dolazi do ekspresije GFP u inficiranim ćelijama, izvedeni su<nat>art
testovi za obrazovanje virusnog fokusa sa uzorcima krvi r3JUNV-GFP i r3JUNV-GFP nosačima koji su uzeti u danu 120 posle infekcije. Upoređeni su infektivni titri virusa koji zadržavaju ekspresiju GFP (anti-GFP, Sl. 13B) i ukupna infektivnost Junin virusa (anti-NP, Sl. 13B). r3JUNV-GFP<art>titri su bili u sličnim opsezima kada su određeni ili sa anti-GFP ili anti-NP imunofokusnim testom dokumentujući da većina virusne populacije zadržava ekspresiju GFP. Suprotno tome, krv od četiri r3JUNV-GFPnat inficirane životinje sa najvećom viremijom (koja može da se uporedi sa divljim tipom Candid#1) anti-GFP infektivni titar je bio najmanje 10 puta niži u odnosu na titar ukupnih infekcija kao što je određeno sa NP bojenjem. Ovo je dokumentovalo da je r3JUNV-GFP<art>ali ne r3JUNV-GFP<nat>stabilno zadržao GFP transgen in vivo.
5.2.13 Homologne i heterologne kombinacije primarnog pojačanja trisegmentiranih LCMV- i vekora vakcina zasnovanih na JUNV indukiju jake P1A autoantigen-specifične CD8+ T ćelijske odgovore.
[0340] Sledeće je ispitano da li r3LCMVart- i r3JUNVart-zasnovani vektori mogu da se koriste u homolognim i eterolognim kombinacijama primarnog pojačanja za indukovanje tumorskih autoantigen-specifičnih CD8+ T će ovora Konstru MV<art>art lijskih odg isani su r3LC i r3JUNV - zasnovani vektori koji eksprimiraju P815 mišji mastocitom-izvedeni auto antigen P1A (SEQ ID NO: 24) (r3LCMV-P1A<art>(SEQ ID NOs: 18, 19, 20) i r3JUNV-P1A<art>(SEQ ID NOs: 21, 22, 23)). Ovi konstrukti vakcine su korišćeni za imunizovanje BALB/c miševa i.v. u homolognim i heterolognim kombinacijama primarnog pojačanja kao što je naznačeno na Slici 14. Oba, r3LCMV-P1A<art>i r3JUNV-P1A<art>indukuju P1A epitopspecifične CD8+ T ćelije kada se daju u homolognoj vakcinaciji primarnog pojačanja, kao što je d
određeno u krvi korišćenjem H-2L -tetramera napunjenih sa LPYLGWLVF peptidom (P1A epitop 35-43). Srednje vrednosti učestalosti epitop-specifičnih CD8+ T ćelija u danu 63 eksperimenta su bile redom 1.2% (r3JUNV-P1Aart) i 3.9% (r3LCMV-P1Aart). Dodatno, životinje koje su prajmovane sa r3JUNV-P1A<art>i pojačane sa r3LCMV-P1A<art>na heterologni način razvile su još veće odgovore sa srednjim učestalostima epitop-specifičnih CD8+ T ćelija od 19.5% u danu 63. Učestalosti r3LCMV-P1Aartprajmovanih i r3JUNV-P1Aart-pojačanih životinja (3.1%) bile su uporedive sa onima koji su prošli r3LCMV-P1A<art>homolognu „prime-boost“ vakcinaciju.
4
7. LISTA SEKVENCI
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1 (nastavak)
2 (nastavak)
(nastavak)
4 (nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1 (nastavak)
2 (nastavak)
(nastavak)
4 (nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1 (nastavak)
11 (nastavak)
12 (nastavak)
1 (nastavak)
14 (nastavak)
1 (nastavak)
1 (nastavak)
1 (nastavak)
1 (nastavak)
1 (nastavak)
11 (nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
11 (nastavak)
(nastavak)
11 (nastavak)
11 (nastavak)
11 (nastavak)
11 (nastavak)
11 (nastavak)
12 (nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
12 (nastavak)
12
��
��
12
��
�
11
��
�
��
�
1
�
�
�
��
��
��
��
14
��
��
1
11
��
�
��
�
�
�
�
�
�
11
��
�
��
1
1
1
�
1
1
11
��
�
��
1
�
�
1
�
1
11
��
�
��
1
�

Claims (24)

Patentni zahtevi
1. Tri-segmentirana infektivna i kompetentna za replikaciju arenavirusna partikula koja se sastoji iz jednog L segmenta i dva S segmenta, pri čemu jedan od dva S segmenta je izabran iz grupe koja se sastoji iz:
(i) S segmenta, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom 5’ UTR arenavirusa;
(ii) S segmenta, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom 5’ UTR arenavirusa; (iii) S segment, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom 5’ UTR arenavirusa; (iv) S segment, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom 3’ UTR arenavirusa;
(v) S segment, pri čemu ORF koji kodira L je pod kontrolom 3’ UTR arenavirusa; i
(vi) S segment, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom 3’ UTR arenavirusa, pri čemu tri-segmentirana virusna partikula sadrži dva heterologna ORF-a.
2. Tri-segmentirana infektivna i kompetentna za replikaciju arenavirusna partikula koja se sastoji iz dva L segmenta i jednog S segmenta, pri čemu jedan od dva L segmenta je izabran iz grupe koja se sastoji iz:
(i) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom 5’ UTR arenavirusa;
(ii) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom 5’ UTR arenavirusa;
(iii) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira L protein je pod kontrolom 5’ UTR arenavirusa; (iv) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira GP je pod kontrolom 3’ UTR arenavirusa;
(v) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira NP je pod kontrolom 3’ UTR arenavirusa; i (vi) L segmenta, pri čemu ORF koji kodira Z protein je pod kontrolom 3’ UTR arenavirusa, pri čemu tri-segmentirana virusna partikula sadrži dva heterologna ORF-a.
3. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 1, pri čemu inter-segmentalna rekombinacija dva S segmenta, ujedinjuje dva ORF-a arenavirusa u samo jedan umesto na dva odvojena segmenta, ukida aktivnost virusnog promotora.
4. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 2, pri čemu inter-segmentalna rekombinacija dva L segmenta, ujedinjuje dva ORF-a arenavirusa u samo jedan umesto na dva odvojena segmenta, ukida aktivnost virusnog promotora.
5. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu propagacija tri-segmentirane arenavirusne partikule ne dovodi do kompetentne za replikaciju bisegmentirane virusne partikule posle 70 dana uporne infekcije kod miševa kojima nedostaje receptor za tip I interferona, receptor za tip II interferona i gen za akivaciju rekombinacije 1 (RAG1) i koji su inficirani sa 10<4>PFU tri-segmentirane arenavirusne partikule.
6. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu arenaviruisni 3’ UTR je 3’ UTR arenavirusnog S segmenta ili arenavirusnog L segmenta, i pri čemu arenavirusni 5’ UTR je 5’ UTR arenavirusnog S segmenta ili arenavirusnog L segmenta.
7. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema bilo kom od zahteva 1, 3, 5 i 6, pri čemu dva S segmenta sadrže dva heterologna ORFa.
8. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema bilo kom od zahteva 2, 4, 5 i 6, pri čemu dva L segmenta sadrže dva heterologna ORFa.
9. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 7 ili 8, pri čemu najmanje jedan heterologni ORF kodira antigen (i) koji je dobijen iz infektivnog organizma, tumora, ili alergena; ili (ii) je izabran iz antigena virusa humane imunodeficijencije, antigena virusa hepatitisa C, antigena varičela zoster virusa, antigena citomegalovirusa, antigena mycobacterium tuberculosis, i antigena koji su povezani sa tumorom.
10. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu najmanje jedan heterologni ORF kodira fluorescentni protein.
11. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 10, pri čemu je fluorescentni protein zeleni fluorescentni protein (GFP) ili crveni fluorescentni protein (RFP).
12. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 11, pri čemu dva heterologna ORF svaki kodiraju GFP.
13. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 11, pri čemu jedan heterologni ORF kodira GFP i jedan heterologni ORF kodira RFP.
14. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 1, pri čemu prvi S segment je modifikovan da nosi ORF koji kodira GP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR i heterologni ORF koji kodira prvi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR i drugi S segment S segment je modifikovan da nosi ORF koji kodira NP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR i heterologni ORF koji kodira drugi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR.
15. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 1, pri čemu prvi S segment je modifikovan da nosi ORF koji kodira GP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR i heterologni ORF koji kodira prvi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR i drugi S segment je modifikovan da nosi ORF koji kodira NP u položaju pod kontrolom arenavirusnog 5’ UTR i heterologni ORF koji kodira drugi gen od interesa u položaju pod kontrolom arenavirusnog 3’ UTR.
16. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema zahtevu 14 ili 15, pri čemu gen od interesa kodira antigen (i) koji je dobijen iz infektivnog organizma, tumora, ili alergena; ili (ii) je izabran iz antigena virusa humane imunodeficijencije, antigena virusa hepatitisa C, antigena varičela zoster virusa, antigena citomegalovirusa, antigena mycobacterium tuberculosis, i antigena koji su povezani sa tumorom.
17. Tri-segmentirana arenavirusna partikula prema bilo kom od zahteva 1 do 16, pri čemu je trisegmentirana arenavirusna partikula dobijena iz LCMV.
18. cDNK genoma tri-segmentirane arenavirusne partikule prema bilo kom od zahteva 1 do 17.
19. DNK ekspresioni vektor koji se sastoji iz cDNK prema zahtevu 18.
1
20. Ćelija domaćina koja se sastoji iz tri-segmentirane arenavirusne partikule prema bilo kom od zahteva 1 do 17, cDNK prema zahtevu 18, ili vektor prema zahtevu 19.
21. Postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule prema bilo kom od zahteva 1, 3, i 5, pri čemu postupak obuhvata:
(i) transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više cDNA iz jednog L segmenta i dva S segmenta; (ii) održavanje ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i (iii) sakupljanje arenavirusne partikule.
22. Postupak za dobijanje tri-segmentirane arenavirusne partikule prema bilo kom od zahteva 2, 4, i 5, pri čemu postupak obuhvata:
(i) transfekciju u ćeliju domaćina jedne ili više cDNK iz dva L segmenta i jednog S segmenta; (ii) održavanje ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i (iii) sakupljanje arenavirusne partikule.
23. Vakcina koja se sastoji iz tri-segmentirane arenavirusne partikule prema bilo kom od zahteva 1 do 17 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
24. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz tri-segmentirane arenavirusne partikule prema bilo kom od zahteva 1 do 17 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
1
RS20201251A 2014-11-13 2015-11-12 Tri-segmentirani arenavirusi kao vektori za vakcinu RS60937B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462079493P 2014-11-13 2014-11-13
EP15794900.9A EP3218504B1 (en) 2014-11-13 2015-11-12 Tri-segmented arenaviruses as vaccine vectors
PCT/EP2015/076458 WO2016075250A1 (en) 2014-11-13 2015-11-12 Tri-segmented arenaviruses as vaccine vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60937B1 true RS60937B1 (sr) 2020-11-30

Family

ID=54545130

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201251A RS60937B1 (sr) 2014-11-13 2015-11-12 Tri-segmentirani arenavirusi kao vektori za vakcinu

Country Status (18)

Country Link
US (3) US10722564B2 (sr)
EP (2) EP3218504B1 (sr)
JP (4) JP6805139B2 (sr)
CN (1) CN107223130A (sr)
AU (3) AU2015345080B2 (sr)
CA (1) CA2967720C (sr)
CY (1) CY1123339T1 (sr)
DK (2) DK3778903T3 (sr)
ES (1) ES2811093T3 (sr)
FI (1) FI3778903T3 (sr)
HR (1) HRP20201684T1 (sr)
HU (1) HUE051390T2 (sr)
LT (2) LT3778903T (sr)
PL (1) PL3218504T3 (sr)
PT (1) PT3218504T (sr)
RS (1) RS60937B1 (sr)
SI (1) SI3218504T1 (sr)
WO (1) WO2016075250A1 (sr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2604695T3 (pl) 2007-12-27 2023-04-11 Universität Zürich Cząstka arenawirusa z defektem replikacji
DK3077519T3 (en) * 2013-12-03 2021-06-14 Hookipa Biotech Gmbh Cmv-vacciner
HUE051390T2 (hu) 2014-11-13 2021-03-01 Univ Geneve Háromszegmensû arenavírusok mint vakcinavektorok
HK1246183A1 (zh) * 2015-06-10 2018-09-07 Hookipa Biotech Gmbh Hpv疫苗
WO2018045029A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army Pan south american arenavirus live attenuated vaccine
CN115948467A (zh) * 2015-11-04 2023-04-11 霍欧奇帕生物科技有限公司 针对乙型肝炎病毒的疫苗
CA3003548A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-18 Hookipa Biotech Ag Arenavirus particles as cancer vaccines
JP2019533690A (ja) * 2016-11-04 2019-11-21 ホオキパ バイオテック ジーエムビーエイチ 癌ワクチンとしての複製欠損性アレナウイルス粒子及び３セグメント型アレナウイルス粒子
AU2018247958A1 (en) * 2017-04-07 2019-10-10 Hookipa Biotech Gmbh Arenavirus particles to treat solid tumors
US11021692B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
CN108611310A (zh) * 2018-04-28 2018-10-02 中国药科大学 一种重组Hsp65与STEAP1186-193融合蛋白的基因工程菌的构建
CN108977434A (zh) * 2018-07-03 2018-12-11 张罗 鼻腔脱落细胞rna的提取方法
AU2020297011A1 (en) * 2019-06-18 2022-02-10 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Arenavirus vectors for hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
CA3145791A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Gilead Sciences, Inc. Hiv vaccines and methods of making and using
KR20220074917A (ko) 2019-09-30 2022-06-03 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Hbv 백신 및 hbv를 치료하는 방법
US20220380805A1 (en) 2019-11-07 2022-12-01 Universität Basel Arenaviruses as vectors
BR112022024404A2 (pt) 2020-05-29 2023-02-07 Hookipa Biotech Gmbh Método para tratar câncer, sequência de nucleotídeos, célula hospedeira, partícula de lcmv, partícula de picv, composição farmacêutica, partícula de arenavírus
KR20230131481A (ko) 2021-01-14 2023-09-13 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Hiv 백신 및 이의 사용 방법
WO2022159664A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-28 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Engineered multi-segmented rna viruses for large-scale combinatorial genetic screening
BR112023019365A2 (pt) 2021-03-23 2023-12-26 Hookipa Biotech Gmbh Segmento s de arenavírus, cdna, vetor de expressão de dna, célula hospedeira, partícula de arenavírus trissegmentada, método para gerar uma partícula de arenavírus trissegmentada, composição farmacêutica, método para tratar câncer de próstata e kit
US20240229073A1 (en) 2021-05-13 2024-07-11 Hookipa Biotech Gmbh Arenaviruses as vectors
JP2024540385A (ja) 2021-11-08 2024-10-31 ホオキパ バイオテック ジーエムビーエイチ 変異型ｋｒａｓ、変異したがんドライバー遺伝子、または腫瘍関連抗原を発現する、がん免疫療法としての改変アレナウイルス粒子
CN114231562A (zh) * 2021-12-15 2022-03-25 中国科学院武汉病毒研究所 一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用
EP4475879A1 (en) 2022-02-08 2024-12-18 Hookipa Biotech GmbH Combination therapy with arenavirus particles and immune checkpoint modulators or cytokines
JP2025523043A (ja) 2022-07-12 2025-07-17 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｉｖ免疫原性ポリペプチド及びワクチン、並びにその使用
AU2024343172A1 (en) 2023-09-15 2026-03-05 Gilead Sciences, Inc. Arenavirus formulations, methods and uses thereof
WO2025191169A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Hookipa Biotech Gmbh Modified arenavirus particles expressing cancer testis antigens as cancer immunotherapies

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US8158413B2 (en) * 2005-10-17 2012-04-17 Institut Pasteur Lentiviral vector-based vaccine
WO2007109813A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
US8063063B2 (en) 2006-03-23 2011-11-22 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
PL2604695T3 (pl) * 2007-12-27 2023-04-11 Universität Zürich Cząstka arenawirusa z defektem replikacji
GB201001726D0 (en) * 2010-02-03 2010-03-24 Univ St Andrews Bunyavirus vaccine
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
CN110042110A (zh) 2012-01-24 2019-07-23 桑福德健康公司 用于治疗致癌病毒多肽阳性肿瘤的多核苷酸
ES2751423T3 (es) 2013-03-15 2020-03-31 Univ Geneve Vacunas antimicobacterianas
GB201305361D0 (en) 2013-03-25 2013-05-08 Univ Edinburgh Enhanced expression
DK3077519T3 (en) 2013-12-03 2021-06-14 Hookipa Biotech Gmbh Cmv-vacciner
WO2015183895A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 University Of Rochester Novel arenavirus vaccine
US9943585B2 (en) 2014-07-30 2018-04-17 University Of Rochester Methods and compositions related to reorganization of arenavirus genome for development of novel arenavirus live-attenuated vaccines (LAV)
BR112017005744B1 (pt) * 2014-09-22 2023-11-28 Regents Of The University Of Minnesota "vírus pichinde geneticamente manipulado, método de fabricação e uso do mesmo, partícula viral infecciosa, composição, coleção de vetores, sistema de genética reversa e método de uso do mesmo"
GB201419572D0 (en) 2014-11-03 2014-12-17 Pirbright Inst The Virus
HUE051390T2 (hu) 2014-11-13 2021-03-01 Univ Geneve Háromszegmensû arenavírusok mint vakcinavektorok
DE102015207036A1 (de) 2015-04-17 2016-10-20 Karl Sebastian Lang Arenaviren zur Anwendung bei der Behandlung und/oder Vorbeugung von Tumoren sowie Verfahren zur Herstellung von Arenaviren mit (verbesserten) tumorregressiven Eigenschaften
HK1246183A1 (zh) 2015-06-10 2018-09-07 Hookipa Biotech Gmbh Hpv疫苗
EP3365005B1 (en) 2015-10-23 2025-04-09 Institut Pasteur Recombinant mopeia virus and vaccine platform
CN115948467A (zh) 2015-11-04 2023-04-11 霍欧奇帕生物科技有限公司 针对乙型肝炎病毒的疫苗
CA3003548A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Hookipa Biotech Ag Arenavirus particles as cancer vaccines
IL314272A (en) 2016-05-18 2024-09-01 Hookipa Biotech Gmbh Three-segmented PICHINDE viruses as vaccine vectors
JP2019533690A (ja) 2016-11-04 2019-11-21 ホオキパ バイオテック ジーエムビーエイチ 癌ワクチンとしての複製欠損性アレナウイルス粒子及び３セグメント型アレナウイルス粒子
AU2018247958A1 (en) 2017-04-07 2019-10-10 Hookipa Biotech Gmbh Arenavirus particles to treat solid tumors

Also Published As

Publication number Publication date
ES2811093T3 (es) 2021-03-10
JP2017535267A (ja) 2017-11-30
AU2015345080A1 (en) 2017-06-01
PT3218504T (pt) 2020-09-24
US20210145950A1 (en) 2021-05-20
US10722564B2 (en) 2020-07-28
CA2967720C (en) 2024-01-02
AU2015345080B2 (en) 2022-01-27
HUE051390T2 (hu) 2021-03-01
EP3218504B1 (en) 2020-07-22
EP3778903B1 (en) 2026-01-14
FI3778903T3 (fi) 2026-02-24
CN107223130A (zh) 2017-09-29
DK3218504T3 (da) 2020-10-19
PL3218504T3 (pl) 2021-02-08
JP2021045154A (ja) 2021-03-25
EP3218504A1 (en) 2017-09-20
US20170319673A1 (en) 2017-11-09
HRP20201684T1 (hr) 2020-12-25
AU2022200061A1 (en) 2022-02-03
JP2023036933A (ja) 2023-03-14
JP6805139B2 (ja) 2020-12-23
SI3218504T1 (sl) 2020-11-30
LT3778903T (lt) 2026-02-10
JP2025170342A (ja) 2025-11-18
HK1244034A1 (en) 2018-07-27
JP7796680B2 (ja) 2026-01-09
DK3778903T3 (da) 2026-02-09
EP3778903A1 (en) 2021-02-17
US20240082376A1 (en) 2024-03-14
LT3218504T (lt) 2020-09-10
WO2016075250A1 (en) 2016-05-19
CY1123339T1 (el) 2021-12-31
CA2967720A1 (en) 2016-05-19
AU2024259760A1 (en) 2024-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7796680B2 (ja) ワクチンベクターとしての３分節型アレナウイルス
US20220289797A1 (en) Tri-segmented pichinde viruses as vaccine vectors
HK40036451A (en) Tri-segmented arenaviruses as vaccine vectors
HK40106995A (zh) 作为疫苗载体的三区段pichinde病毒
HK1244034B (en) Tri-segmented arenaviruses as vaccine vectors
HK40004707B (zh) 作为疫苗载体的三区段pichinde病毒
EA046869B1 (ru) Вирусы пичинде с трехсегментным геномом в качестве векторных вакцин