JP2017535267A - ワクチンベクターとしての３分節型アレナウイルス - Google Patents

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Abstract

本出願は、ゲノム中のオープンリーディングフレーム(「ORF」)の再構成を有するアレナウイルスに関する。特に、ウイルスのORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている、改変アレナウイルスゲノムセグメントが本明細書に記載される。1つのLセグメント及び2つのSセグメント、又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子もまた、本明細書に記載される。本明細書に記載されるアレナウイルスは、ワクチン及び/又は疾患の治療にかつ/又は免疫療法における使用に適する可能性がある。【選択図】図１

Description

本出願は、2014年11月13日に出願された米国仮特許出願第62/079,493号の優先権の利益を主張し、その全体は参照によって本明細書に組み込まれている。
(1. 序)
本出願は、ゲノム中のオープンリーディングフレーム(「ORF」)の再構成を有するアレナウイルスに関する。特に、ウイルスのORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている、改変アレナウイルスゲノムセグメントが本明細書に記載される。1つのLセグメント及び2つのSセグメント、又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子もまた、本明細書に記載される。本明細書に記載されるアレナウイルスは、ワクチン及び/又は疾患の治療にかつ/又は免疫療法における使用に適する可能性がある。
(2. 背景)
(2.1 リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス研究及びヒト疾患)
アレナウイルス科の一員であるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)は、ウイルス感染症の研究におけるプロトタイプのマウスモデルウイルスである。1930年代にそれが単離されて以来(Rivers及びMcNair Scottの文献、1935、Science、81(2105): 439-440)、このウイルスを用いる研究は、ウイルスの免疫学及び病原性における多くの鍵となる概念を明らかにしてきた(Zinkernagelの文献、2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:1-5; Oldstoneの文献、2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:83-117に概説されている)。LCMVは、特に、持続感染との関連でのウイルスの分子生物学及び免疫応答を調査するために広く用いられてきた。LCMVの自然宿主は、マウスである。しかしながら、いくつかの報告により、LCMVが、顧みられないヒト病原体でもある可能性があることが明らかにされた(Bartonの文献、1996, Clin. Infect. Dis, 22(1):197; Wrightらの文献、1997, Pediatrics 100(1): E9)。さらに、多くの他のアレナウイルス科に属するものが、世界中のげっ歯類の集団で見出されている。アフリカでみられる旧世界アレナウイルスであるラッサウイルス(LASV)に加え、フニン(JUNV)、グアナリト、又はマチュポのようないくつかの新世界アレナウイルスが、南アメリカの多様なげっ歯類の集団において蔓延している(Johnsonらの文献、1966、Am J Trop Med Hyg、15(1): 103-106;Teshらの文献、1993、Am J Trop Med Hyg 49(2):227-235;Millsらの文献、1994、Trop Med Hyg 51(5): 554-562)。これらのウイルスの多くは、ヒトに伝染すると、高い死亡率を伴うウイルス性の出血熱を引き起こす可能性がある(Geisbert及びJahrlingの文献、2004、Nat Med 10(12 Suppl): S110-121)。
(2.2 リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスのゲノム構成)
アレナウイルスは、エンベロープウイルスである。そのゲノムは、マイナスセンスの一本鎖RNAの2つのセグメント (L:7.2kb、S:3.4kb)からなる。各セグメントは、反対の配向性で、2つのウイルス遺伝子をコードする。短い方のセグメント(Sセグメント)は、ウイルスの糖タンパク質(GP)前駆体(GP-C;75kDa)及びヌクレオプロテイン(NP;63kDa)をコードする(Salvatoらの文献、1988、Virology 164(2): 517-522)。長い方のセグメント(Lセグメント)は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp;Lタンパク質;約200kDa)及びマトリックスタンパク質Z(タンパク質Z)、RINGフィンガータンパク質(11kDa)を発現する(図1A)(Salvatoらの文献、1988、Virology 164(2): 517-522)。GP前駆体GP-Cは、翻訳後にGP-1及びGP-2へと切断されるが、これらは非共有結合的に会合し続ける(Buchmeier及びOldstoneの文献、1979、Virology 99(1): 111-120)。GP-1及びGP-2の三量体は、ビリオンの表面にスパイクとして組み立てられ、細胞表面受容体との相互作用による宿主細胞内への侵入を媒介するのに必須なものである。ウイルスの宿主細胞内への結合及び侵入は、LCMV GPの、LCMVの唯一の細胞受容体としての、細胞受容体α-ジストログリカンとの相互作用により媒介されると、長く主張されていた(Caoらの文献、1998、Science、282(5396):2079-2081)。極最近に、3つのさらなるヒト分子(TAMファミリーのAxl及びTyro3、並びに樹状細胞特異的細胞内接着分子3結合ノンインテグリン)が、LCMV及びLCMVの近縁種であるLASVのさらなる受容体として仮定され、これらはα-ジストログリカンとは独立して、LCMVの細胞内への侵入を可能とする(Shimojima及びKawaokaの文献、2012、J Vet Med、74(10):1363-1366;Shimojimaらの文献、2012、J Virol 86(4):2067-2078)。NPは、ウイルスRNAに結合してヌクレオカプシドを形成し、これは、ウイルスのLタンパク質のテンプレートとして働く。ウイルスのLタンパク質と会合したヌクレオカプシドは、いわゆるリボヌクレオタンパク質複合体を形成し、これは、複製及び転写の双方で活性であり、ウイルスの感染力の最小単位となる。NP及びLタンパク質が、ウイルスRNAの転写及び複製に必要な最低限のトランス作用因子であることが示されている(Leeらの文献、2000、J Virol 74(8): 3470-3477)。各セグメント上の2つの遺伝子は、ノンコーディング遺伝子間領域(IGR)により分離されており、5’及び3’非翻訳領域(UTR)の側方に位置している。IGRは、安定なヘアピン構造を形成しており、ウイルスのmRNA転写の構造依存的な終結に関与していることが示されている(Pinschewerらの文献、2005、J Virol 79(7): 4519-4526)。UTRの末端ヌクレオチドは、高度な相補性を示し、二次構造の形成をもたらす。これらのパンハンドル構造は、転写及び複製のためのウイルスプロモーターとして働くことが知られており、部位特異的な突然変異誘発によるこれらの分析により、僅かな配列変化でさえも許容されない配列及び構造依存性が明らかにされている(Perez及びde la Torreの文献、2003, Virol 77(2): 1184-1194)。
(2.3 逆遺伝学的なシステム)
LCMVのようなマイナス鎖ウイルスの単離及び精製されたRNAは、直接的にmRNAとして働くことはできない。すなわち、細胞に導入された場合に、翻訳されることができない。その結果、ウイルスRNAによる細胞のトランスフェクションは、感染性のウイルス粒子の産生には繋がらない。培養された許容細胞中のcDNAからマイナス鎖のRNAウイルスの感染性のウイルス粒子を産生させるためには、ウイルスRNAセグメント(複数可)は、転写及び複製に必要とされる最低限の因子がトランス補足(trans-complemented)されなければならない。数年前に公表されたミニゲノムシステムの助けを借りて、ウイルス粒子の転写、複製、及び形成に関与するウイルスのシス作用エレメント及びトランス作用因子が、ついに分析可能となった(Leeらの文献、2000、J Virol 74(8): 3470-3477;Leeらの文献、2002、J Virol 76(12): 6393-6397;Perez及びde la Torreの文献、2003, J Virol 77(2): 1184-1194;Pinschewerらの文献、2003、J Virol 77(6): 3882-3887;Pinschewerらの文献、2005、J Virol 79(7): 4519-4526)。また、LASV及びタカリベウイルスのような別のアレナウイルスに対しても、逆遺伝学的システムが確立された(Lopezらの文献、2001、J Virol 75(24): 12241-12251;Hassらの文献、2004、J Virol 78(24): 13793-13803)。2つの刊行物は、それぞれ、pol-I/-II又はT7/pol-II駆動型プラスミドを用いた完全にcDNA由来の感染性LCMVの回収を示した(「ウイルスの救出」と呼ばれている)(Flatzらの文献、2006、Proc Natl Acad Sci U S A 103(12): 4663-4668;Sanchez及びde la Torreの文献、2006、Virology 350(2): 370-380)。
(2.4 目的遺伝子を発現する組換えLCMV)
外来性の目的遺伝子を発現する組換えマイナス鎖RNAウイルスの生成が、長期間推し進められてきた。異なる戦略が、別のウイルスに対し公表されている(Garcia-Sastreらの文献、1994、J Virol 68(10): 6254-6261;Percyらの文献、1994、J Virol 68(7): 4486-4492;Flick 及びHobomの文献、1999、Virology 262(1): 93-103;Machadoらの文献、2003、Virology 313(1): 235-249)。これまでに、追加の外来遺伝子を、2分節型LCMV粒子のゲノム内に導入することが可能であることが示されている(Emonetらの文献、2009、PNAS、106(9):3473-3478)。2つの外来性の目的遺伝子が、LCMVの2分節型ゲノム内に挿入されて、2つのSセグメント及び1つのLセグメントを有する3分節型LCMV粒子(r3LCMV)がもたらされた。Emonetらの文献(2009)により公表されたこの3分節型ウイルスにおいては、NP及びGPの双方が、Sセグメントにおけるそれぞれの天然位置に保たれており、従って、隣接するUTRにおけるそれらの天然のプロモーターの下で発現される(図1B)。しかしながら、本出願は、Emonetらの文献により開示された3分節型LCMV粒子は、主に2分節型粒子を集めたものであり(すなわち、該アレナウイルスは、2つのSセグメントではなく1つのSセグメントを包んでいるだけであり)、結果として、減弱された増殖及び2つのSセグメントを組み換える強い選択圧をもたらすことを明らかとする。本出願においてさらに示されるように、このような組換えは、再現性よく見られ、結果として野生型ウイルスへの表現型の復帰及び導入遺伝子の喪失をもたらす。
(2.5 複製欠損性アレナウイルス)
近年、感染性のアレナウイルス粒子を、感染細胞においてその遺伝子材料を増幅し発現する能力を有するが、正常で遺伝的に操作されていない細胞では子孫をさらに生じさせることはできないゲノムを含有するよう操作し得ることが示されている(すなわち、感染性の複製欠損性アレナウイルス粒子)(国際公報第WO2009/083210 A1号及び国際公報第WO2014/140301 A1号)。
(3. 発明の概要)
本出願は、ゲノム中のORFの再構成を有するアレナウイルスに関する。特に、本出願は、アレナウイルスORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているアレナウイルスゲノムセグメントに関する。本出願はまた、複製可能な2分節型アレナウイルス粒子には組み換わらない、1つのLセグメント及び2つのSセグメント、又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子を提供する。本出願は、該3分節型アレナウイルス粒子を遺伝的安定性を向上し、かつ持続する導入遺伝子発現を確実とするよう操作することができることを実証する。
ある実施態様において、本明細書において提供されるウイルスベクターは、感染性である、すなわち、宿主細胞内に侵入することができるか、又はその遺伝子材料を宿主細胞内に注入することができる。より具体的なある実施態様において、本明細書において提供されるウイルスベクターは、感染性である、すなわち、宿主細胞内に侵入することができるか、又はその遺伝子材料を宿主細胞内に注入することができ、それに続き、宿主細胞の内部でその遺伝情報の増幅及び発現が可能である。ある実施態様において、ウイルスベクターは、感染細胞においてその遺伝情報を増幅しかつ発現する能力を有するが、正常で遺伝的に操作されていない細胞においては、感染性の子孫粒子をさらに生じさせることはできないゲノムを含有するよう操作された感染性の複製欠損性アレナウイルスのウイルスベクターである。ある実施態様において、感染性のアレナウイルスのウイルスベクターは、複製可能であり、かつ正常で遺伝的に操作されていない細胞において、感染性の子孫粒子をさらに生じさせることができる。より具体的なある実施態様において、このような複製可能なウイルスベクターは、該複製可能なウイルスベクターの誘導元である野生型ウイルスと比較して弱毒化されている。
(3.1 非天然のオープンリーディングフレーム)
従って、一態様において、アレナウイルスゲノムセグメントが、本明細書において提供される。ある実施態様において、前記ゲノムセグメントは、ウイルスのORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。いくつかの実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントは:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
(vii)GPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(viii)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(x)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;
(xi)NPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント、
からなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、アレナウイルス3’UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3’UTRである。ある実施態様において、アレナウイルス5’UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5’UTRである。
また、本明細書において提供されるアレナウイルスゲノムセグメントの単離されたcDNAも本明細書において提供される。また、前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを含むDNA発現ベクターも本明細書において提供される。
また、前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNA、又は前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを含むベクター、を含む宿主細胞も本明細書において提供される。
また、Sセグメント及びLセグメントを含むように、前記アレナウイルスゲノムセグメント及び第二のアレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子も本明細書において提供される。
ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、感染性かつ複製可能である。いくつかの実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、弱毒化されている。他の実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、感染性ではあるが、非補完細胞(non-complementing細胞)において感染性の子孫をさらに生じさせることはできない。
ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つは、除去されているか、又は機能的に不活性化されている。
ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つは除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。他の実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの１つのみが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。より具体的な実施態様において、GPをコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。他の実施態様において、NPをコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。いくつかの実施態様において、Zタンパク質をコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。他の実施態様において、Lタンパク質をコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。
ある実施態様において、前記異種ORFは、レポータータンパク質をコードする。いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原をコードする。他の実施態様において、抗原をコードする前記異種ORFは、ヒト免疫不全ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面抗原、水痘帯状疱疹(varizella zoster)ウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、結核菌抗原、及び腫瘍関連抗原から選択される。
ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子の増殖又は感染力は、前記アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFにより影響されない。
また、前記アレナウイルスゲノムセグメントを生成させる方法も本明細書において提供される。ある実施態様において、該方法は、前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを転写することを含む。
また、前記アレナウイルス粒子を産生させる方法も本明細書において提供される。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子を産生させる方法は:
(i)前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;
(ii)前記第二のアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを含むプラスミドを、宿主細胞にトランスフェクトすること;
(iii)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び
(iv)該アレナウイルス粒子を回収すること、
を含む。
ある実施態様において、前記Lセグメント及び前記Sセグメントの転写は、双方向性プロモーターを用いて行われる。
ある実施態様において、前記方法は、アレナウイルスポリメラーゼをコードする1以上の核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む。さらにより具体的な実施態様において、前記ポリメラーゼは、Lタンパク質である。他の実施態様において、前記方法は、NPをコードする1以上の核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む。
ある実施態様において、前記Lセグメント及び前記Sセグメントの転写は、それぞれ:
(i)RNAポリメラーゼIプロモーター;
(ii)RNAポリメラーゼIIプロモーター;及び
(iii)T7プロモーター
からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。
別の実施態様において、アレナウイルス粒子を含むワクチンであって、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つが、除去されているか、又は機能的に不活性化されているか;又はGP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の別の生物由来の異種ORFと置き換えられているか;又はGP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの１つのみが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、前記ワクチンが、本明細書において提供される。より具体的な実施態様において、前記ワクチンは、医薬として許容し得る担体をさらに含む。
別の実施態様において、アレナウイルス粒子を含む医薬組成物であって、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つが、除去されているか、又は機能的に不活性化されているか;又はGP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする少なくとも1つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の別の生物由来の異種ORFと置き換えられているか;又はGP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの１つのみが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、前記医薬組成物が、本明細書において提供される。より具体的な実施態様において、前記医薬として許容し得る担体は、医薬として許容し得る担体をさらに含む。
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント又は前記アレナウイルス粒子は、LCMV由来である。いくつかの実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント又はアレナウイルス粒子は、LCMV MP株、Armstrong株、又はArmstrongクローン13株由来である。他の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント又は前記アレナウイルス粒子は、フニンウイルスワクチンCandid #1、又はフニンウイルスワクチンXJクローン3株由来である。
(3.2 3分節型アレナウイルス)
一態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。いくつかの実施態様において、該3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体、及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、104PFUの該3分節型アレナウイルス粒子に感染しているマウスにおける70日間の持続感染後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。ある実施態様において、2つのアレナウイルスORFを、2つの別のセグメント上にではなく単一のセグメント上に一体化する、前記2つのSセグメントのセグメント間組換えは、ウイルスのプロモーター活性を抑制する。
別の態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。ある実施態様において、該3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体、及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、104PFUの該3分節型アレナウイルス粒子に感染しているマウスにおける70日間の持続感染後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。ある実施態様において、2つのアレナウイルスORFを、2つの別のセグメント上にではなく単一のセグメント上に一体化する、前記2つのLセグメントのセグメント間組換えは、ウイルスのプロモーター活性を抑制する。
ある実施態様において、前記2つのSセグメントのうちの1つは:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント、
からなる群から選択される。
ある実施態様において、2つのLセグメントのうちの1つは:
(i)GPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(ii)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;
(v)NPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント、
からなる群から選択される。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子3’UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3’UTRである。他の実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子5’UTRは、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5’UTRである。
ある実施態様において、前記2つのSセグメントは、(i)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ若しくは2つ;又は(ii)複製されたアレナウイルスORFを1つ若しくは2つ;又は(iii)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ及び複製されたアレナウイルスORFを1つ含む。
ある実施態様において、前記2つのLセグメントは、(i)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ若しくは2つ;又は(ii)複製されたアレナウイルスORFを1つ若しくは2つ;又は(iii)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ及び複製されたアレナウイルスORFを1つ含む。
ある実施態様において、前記異種ORFは、感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原をコードする。他の実施態様において、抗原をコードする前記異種ORFは、ヒト免疫不全ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、結核菌抗原、及び腫瘍関連抗原から選択される。
ある実施態様において、少なくとも1つの異種ORFは、蛍光タンパク質をコードする。他の実施態様において、前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)又は赤色蛍光タンパク質(RFP)である。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFの全てを含む。いくつかの実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、感染性かつ複製可能である。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFのうちの1つ以上を欠く。他の実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、感染性ではあるが、非補完細胞において感染性の子孫をさらに生じさせることはできない。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFのうちの1つを欠き、ここで該3分節型アレナウイルス粒子は、感染性ではあるが、非補完細胞において感染性の子孫をさらに生じさせることはできない。
いくつかの実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、GP ORFを欠く。
さらなる態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。ある実施態様において、アレナウイルス3’UTRの制御下にある位置にGPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス5’UTRの制御下にある位置に第一の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう、第一のSセグメントが操作されている。いくつかの実施態様において、アレナウイルス3’UTRの制御下にある位置にNPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス5’UTRの制御下にある位置に第二の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう、第二のSセグメントが操作されている。
さらに別の態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。ある実施態様において、アレナウイルス5’UTRの制御下にある位置にGPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス3’UTRの制御下にある位置に第一の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう、第一のSセグメントが操作されている。いくつかの実施態様において、アレナウイルス5’UTRの制御下にある位置にNPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス3’UTRの制御下にある位置に第二の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう、第二のSセグメントが操作されている。
ある実施態様において、前記目的遺伝子は、感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原をコードする。他の実施態様において、前記目的遺伝子は、ヒト免疫不全ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、結核菌抗原、及び腫瘍関連抗原から選択される抗原をコードする。さらに別の実施態様において、少なくとも1つの目的遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。具体的な実施態様において、前記蛍光タンパク質は、GFP又はRFPである。
また、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノムの単離されたcDNAも本明細書において提供される。また、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノムのcDNAを含むDNA発現ベクターも本明細書において提供される。また、個々にか又はそれら全体としてのいずれかで前記3分節型アレナウイルスのcDNAを含む1つ以上のDNA発現ベクターも本明細書において提供される。
また、前記3分節型アレナウイルス粒子、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノムのcDNA、又は前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノムのcDNAを含むベクターを含む宿主細胞も本明細書において提供される。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、弱毒化されている。
また、前記3分節型アレナウイルス粒子を産生させる方法も本明細書において提供される。ある実施態様において、該アレナウイルス粒子を産生させる方法は:
(i)1つのLセグメント及び2つのSセグメントの1つ以上のcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;
(ii)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び
(iii)該アレナウイルス粒子を回収すること
を含む。
また、前記3分節型アレナウイルス粒子を産生させる方法も本明細書において提供される。ある実施態様において、該3分節型アレナウイルス粒子を含むベクターを産生させる方法は:
(i)2つのLセグメント及び1つのSセグメントの1つ以上のcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;
(ii)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び
(iii)該アレナウイルス粒子を回収すること
を含む。
ある実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントの転写は、双方向性プロモーターを用いて行われる。いくつかの実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントの転写は、双方向性プロモーターを用いて行われる。
ある実施態様において、前記方法は、アレナウイルスポリメラーゼをコードする1以上の核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む。さらにより具体的な実施態様において、前記ポリメラーゼは、Lタンパク質である。他の実施態様において、前記方法は、NPタンパク質をコードする1以上の核酸を、前記宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む。
ある実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントの転写は、それぞれ:
(i)RNAポリメラーゼIプロモーター;
(ii)RNAポリメラーゼIIプロモーター;及び
(iii)T7プロモーター
からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。
ある実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントの転写は、それぞれ:
(i)RNAポリメラーゼIプロモーター;
(ii)RNAポリメラーゼIIプロモーター;及び
(iii)T7プロモーター
からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、2分節型アレナウイルス粒子と同じトロピズムを有する。他の実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、複製欠損性のものである。
別の実施態様において、3分節型アレナウイルス粒子及び医薬として許容し得る担体を含むワクチンが、本明細書において提供される。
別の実施態様において、3分節型アレナウイルス粒子及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、LCMV由来である。いくつかの実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、LCMV MP株、Armstrong株、又はArmstrongクローン13株由来である。他の実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、フニンウイルスワクチンCandid #1、又はフニンウイルスワクチンXJクローン3株由来である。
(3.3 規約及び略語)
Figure 2017535267
(4. 図面の簡単な説明)
組換え3分節型ウイルスは、ゲノムにおけるGP ORFの位置とは無関係に、野生型LCMVと比べて損なわれた増殖を示す。(A〜C)2分節型及び3分節型LCMVのゲノム構成の略図。野生型LCMVの2分節型のゲノムは、GP及びNPをコードする1つのSセグメント、並びにZタンパク質及びLタンパク質をコードする1つのLセグメントからなる(A)。両セグメントは、それぞれの5’及び3’UTRの側方に位置する。組換え3分節型LCMV(r3LCMV)のゲノムは、1つのLセグメント、及び2つのSセグメントからなり、該Sセグメントのそれぞれ1つずつに目的遺伝子(ここでは、GFP)が挿入される位置が1つ存在する。(B)r3LCMV-GFPnatural(nat)は、全てのウイルス遺伝子を、それらの天然位置に有する。一方で、r3LCMV-GFPartificial(art)のGP ORFは、人工的に3’UTRに並置されており、該3’UTRの制御下で発現される(C)。(D)0.01の感染多重度(moi)で感染したBHK-21細胞における、示されたウイルスの増殖キネティクス(野生型LCMV:灰色の三角;r3LCMV-GFPnat:黒色の丸;r3LCMV-GFPart:白色の四角)。上清を感染後の示された時点で採取し、ウイルス力価をフォーカス形成アッセイにより決定した。シンボル及びバーは、１群あたり3連の平均値±SEMを表す。エラーバーは、シンボルの大きさ内に隠れている。
3分節型ウイルス調製物は、大多数の2分節型複製欠損性粒子を含有する(r2LCMV)。(A)r2LCMV(白色のバー)、r3LCMV-GFP/RFPart(黒色のバー、GFP-GP、RFP-NP)、及びr3LCMV-GFP/RFPnat(灰色のバー、GP-GFP、RFP-NP)を野生型のBHK-21細胞で増殖させ、上清の感染力を野生型の非補完BHK-21細胞(BHK21)、GP発現(BHK-GP)又はNP発現(BHK-NP)BHK-21細胞で決定した。BHK-21及びBHK-GP細胞での力価を、NP陽性ウイルスのフォーカスを染色することにより決定した。NP補完BHK-21細胞での力価を、GP陽性フォーカスを計数することにより決定した。力価は、BHK-21細胞で評価したときに得られた平均力価に対して規格化したため、その倍数として表されている。バーは、１群あたり６連の平均値±SEMを表す。ns.:統計的に有意でない(p≧0.05);**:p＜0.01(参照としてr2LCMVを用いた一元配置分散分析と、それに続くダネットの事後検定による)。(B)r2LCMV(左のプロット)又はr3LCMV-GFP/RFPart(中央及び右のプロット)を、野生型のBHK-21細胞(BHK21;左及び中央のプロット)又はNP発現BHK-21細胞(BHK-NP、右のプロット)で増殖させて、感染12時間後に、蛍光をフローサイトメトリーにより評価した。r2LCMV感染細胞を、ゲーティングコントロールとして用いた。各条件あたり代表的プロットを一つ示す。(C)BHK-21又はBHK-NP細胞に対するr3LCMV-GFP/RFPartでの感染12時間後の、GFP+、RFP+、又はGFP+RFP+二重陽性細胞の定量。バーは、１群あたり3連の平均値±SEMを表す。ns.:統計的に有意でない(p≧0.05);***:p＜0.001(独立両側スチューデントのt検定による)。
部分的にコドン最適化されたGP ORF又は遺伝子タグを、SセグメントのIGRに保持する組換え3分節型ウイルスの設計及び増殖キネティクス。(A)GPの255個のC-末端塩基対がコドン最適化され、かつNPが、GFPを置き換えている遺伝子操作されたSセグメントの模式図(「WE/WET」と称するGP ORF)。(A)に示すようなGP含有Sセグメントの改変を伴う、図1Bに詳細を示したような2つのSセグメント及び1つのLセグメントからなる3分節型r3LCMV-WEWET/GFPnatの増殖キネティクスを、BHK-21細胞で行った。moi＝0.01で感染後、示された時点で上清を採取し、ウイルス力価をフォーカス形成アッセイにより決定した(B)。シンボル及びバーは、１群あたり3連の平均値±SEMを表す。エラーバーは、シンボルの大きさ内に隠れている。(C)ノンコーディングRNAエレメントを遺伝的に「タグ」付けするためにIGRの1塩基対が欠失している、NPをコードするSセグメントの模式図。欠失したG残基(矢印により示されるもの)は、IGRの重大な意味を持つステムループ構造の外部に存在する。NPをコードするSセグメントのIGRに、遺伝子タグを有するか又は有しない3分節型ウイルスの比較増殖キネティクス(r3LCMV-GFPnat:黒色の丸;r3LCMV-GFPnat IGR*:白色の丸)を、0.01のmoiでBHK-21細胞で行った。感染後の示された時点で上清を採取し、ウイルス力価をフォーカス形成アッセイにより決定した。シンボル及びバーは、１群あたり3連の平均値±SEMを表す。2つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータが示されている。
免疫不全のマウスにおけるr3LCMV-GFPnatの持続感染は、2分節型野生型ウイルスと同等のウイルス血症レベルに達し、かつGFP発現の喪失をもたらすが、r3LCMV-GFPartはそうではない。(A)AGRAGマウスを、1×104PFUのr3LCMV-GFPnat(黒色の丸)、r3LCMV-GFPart(白色の四角)、又は対照の2分節型r2LCMV(灰色の三角)で静脈内感染させ、ウイルス血症を経時的にモニターした。シンボルは、１群あたり3〜7頭のマウスの平均値±SEMを表す。(B)AGRAGマウスを1×104PFUのr3LCMV-GFPnat又はr3LCMV-GFPartで静脈内感染させた後127日目のLCMVウイルス血症を示す。イムノフォーカスアッセイを行って、ヌクレオプロテインNP(灰色の丸)又はGFP(白色の丸)のいずれかを検出した。シンボルは、個々のマウスを示す。ns.:統計的に有意でない(p≧0.05);***:p＜0.001(独立両側スチューデントのt検定)。(C〜E)r3LCMV-GFPnat、r3LCMV-GFPart、又はr2LCMVに感染したAGRAGマウス由来の血液を、感染後120日目に、フローサイトメトリーにより、GFP+細胞の存在について分析した。単球及びマクロファージを(C)に概略が示されているゲーティング戦略を用いて特定した。各群について代表的なFACSプロットを1つ、及びGFP発現の代表的なヒストグラムオーバーレイを1つ(D)に示す。(E)CD11b+GR1-単球/マクロファージ集団内のGFP+集団の定量。シンボルは、個々のマウスを示す。
マウスのr3LCMV-GFPnat持続感染は、Sセグメント組換え及び機能的全長導入遺伝子の喪失をもたらす。ウイルスRNAを、1×104PFUのr3LCMV-GFPnat又はr3LCMV-GFPartでの静脈内感染の後127日目にAGRAGマウスの血清から単離した。ウイルスRNAを逆転写して、NP及びGP配列の双方を保持するcDNAを適切な遺伝子特異的プライマーを用いてPCR増幅した。(A)前もって行うRNAテンプレートの逆転写の後に(+RT、レーン1〜8)又はそれを行わずに(-RT、陰性対照、レーン9〜12)得られたPCR産物のDNA電気泳動。未処理の動物の血清を、別の陰性対照として用い(n、レーン8)、野生型LCMVのSセグメントをコードするプラスミドDNAを陽性対照として用いた(p、レーン17)。レーン1〜3の増幅産物を、サンガー配列決定法に処した。(B)NP及びGP配列、2つのIGR(太字)、並びにC末端のGFP部分(灰色のハイライト)を組み合わせた組換えSセグメント(配列番号:17)を明らかとする動物#3から得られる代表的なcDNA配列(r3LCMV-GFPnat #3)。(C)感染後127日目に単離された3つの組換えウイルスのSセグメント配列の模式図(これらはそれぞれ代表的な1頭のAGRAGマウスにおけるウイルスの集団で支配的である)。NPを保持するSセグメント由来のタグ付けされたIGRを星(*)でマークする。配列決定された区間を二重矢印
Figure 2017535267
 で示す。塩基対(bp)長表示は、上記GFPレムナント及び切断型の(短縮された)IGRエレメントを示す。
2つのIGRをSセグメント上に有する組換えウイルスの増殖キネティクスは2分節型ウイルスに類似する。BHK-21細胞を、0.01のmoiで、野生型Sセグメントを保持する2分節型LCMV(灰色の三角)でか、3分節型r3LCMV-GFPnat(黒色の丸)でか、又は感染したAGRAGマウスから回収された組換え産物に対応する1つのSセグメントを保持するr2LCMV_2IGRs(白色のひし形)でのいずれかで感染させた(比較:図5)。上清を示された時点で採取し、ウイルス力価をフォーカス形成アッセイにより決定した。シンボル及びバーは、１群あたり3連の平均値±SEMを表す。エラーバーは、シンボルの大きさ内に隠れている。ns.:統計的に有意でない(p≧0.05);***:p＜0.001(一元配置分散分析及びそれに続く多重比較のためのボンフェローニの事後検定)。
r3LCMV-GPnat導入遺伝子の喪失を説明できる組換え事象のモデル及びr3LCMV-GPart遺伝的安定性の仮定された機構。このモデル自体は、IGRの転写終結シグナルとしての逆遺伝学的な証拠(Pinschewerらの文献、2005、J Virol、79(7):4519-4526)と組み合わせた、LCMV転写終結の配列データ (Meyer及びSouthernの文献、1993、J Virol、67(5):2621-2627)に基づいている。まとめると、これらの知見は、IGRのヘアピン構造が完成した時の構造依存的なポリメラーゼ休止を示唆した。組換えSセグメントにおける2つのIGR間のGFPレムナントは、Sセグメントのいずれか一方又は双方に由来することが分かり、このことはゲノム又はアンチゲノムいずれかの合成中にポリメラーゼが休止した時に、ポリメラーゼテンプレートスイッチ(コピー選択とも称される)が起こったというモデル作成の助けとなる(それぞれ以下のシナリオA及びB)。(A)アンチゲノム合成の間に、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)は、ゲノムのSセグメントテンプレートの3’UTRで開始し、その後NP ORF及びIGRを読み通す。IGRの最後では、二次構造のためにポリメラーゼは休止する(「構造依存的なポリメラーゼ休止」)。ポリメラーゼの停止は、コピー選択及び代わりのテンプレート(ここでは、GPをコードするSセグメントゲノム)上でのRNA複製の継続を容易にする。テンプレートスイッチは、GP終止コドンの上流で起こらなければならず、見たところIGRヘアピンに近いか又はその基部の配列を標的としている可能性が最も高い。第二のテンプレートのGFPのC終端を読み続けて、ポリメラーゼはその後第二のIGR、GP ORF、及び5’UTRを合成する。(B)ゲノム合成の間に、RdRpはGPを含むアンチゲノムのSセグメントテンプレートの3’末端でRNA合成を開始させ、5’UTR、GP、及びIGRの大部分又は全てを合成し、それに構造依存的なポリメラーゼ休止が続く。コピー選択が起こり、NP含有SセグメントのIGR近くのGFP ORFのC末端部分へ切り替わる。このように、複製はGFPの断片を追加し、全長のIGR、NP、及び3’UTRがそれに続く。(C〜D)シナリオ(A)及び(B)に類似して、テンプレートスイッチもr3LCMV-GFPartのゲノム又はアンチゲノム合成の間に起こり得る。このプロセスもまた、NP ORF及びGP ORFを1つのRNAセグメント上に組み合わせ得る。しかしながら、後者は、3’UTR及び5’UTRではなく2つの3’UTRで形成されており、これらのみが一緒になって機能的ウイルスプロモーターを形成する。従って、このような分子は、RdRpにより増幅することができず、よって、組み換えられた複製可能なウイルスを形成しない。
r3LCMV-GFPartに類似のゲノム構成(図1Cを参照されたい)を有するが、該ウイルスにおけるそれぞれのGFP遺伝子の代わりに2つの卵白アルブミン(OVA)遺伝子を有するr3LCMV-OVAartワクチンベクターを作製した。C57BL/6マウスを、筋肉内(i.m.)への104PFUのr3LCMV-OVAart又はOVAを発現する108粒の複製欠損性E1欠損アデノウイルス5ベースのベクターのいずれかで免疫化した。8日後、該動物を安楽死させ、ワクチン接種に応答して誘発されたT細胞応答を分析した。A:脾臓におけるOVA特異的CD8+T細胞の頻度を、
Figure 2017535267
 ペプチドをロードしたMHCクラスIテトラマーを用いて決定した。B220陰性CD8+リンパ球のうちのエピトープ特異的細胞頻度を決定した。B:OVA特異的CD8+T細胞の機能性を、再刺激のための
Figure 2017535267
 ペプチドを用いる細胞内サイトカインアッセイにより分析した。バーは、１群あたり5頭のマウスの平均値+/-SEMを表す。*:p<0.05;**:p>0.01(独立両側スチューデントのt検定による)。
3分節型LCMVは、多機能的メモリーCD8+T細胞を誘導する。C57BL/6マウスを1×105PFUのr3LCMV-OVA又は1×108PFUのrAd-OVAでi.v.により感染させた。脾臓を感染25日後に採取し、OVA特異的CD8+T細胞の機能性を細胞内サイトカイン染色により分析した。r3LCMV-OVA(黒色のバー)又はrAd-OVA(白色のバー)により誘導されたOVA特異的T細胞のサイトカインプロファイル(IFN-γ、TNF-α、及びIL-2)を、CD8+T細胞のパーセント(A)又は1脾臓あたりの絶対数(B)として示す。シンボル及びバーは、１群あたり5頭のマウスの平均値±SEMを表す。独立両側スチューデントのt検定を統計解析に用いて、結果として得られたP値を、比較の数(n=7)との掛け算により多重比較のために補正した。2つの類似の実験のうちの代表的な1つを示した。
抗原をコードするLCMVは、外来抗原及び自己抗原に対する特異的T細胞応答を誘導する。C57BL/6マウスを、ラット、ヒト、又はマウスHer2ペプチド(それぞれA、B、及びC)をコードする1×105PFUのr3LCMVでi.v.により感染させた。感染9日後、脾臓を採取し、機能的抗原特異的CD8+T細胞の誘導を、細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリーにより分析した。r3LCMVにより誘導されたHer2特異的CD8+T細胞のサイトカインプロファイル(IFN-γ、TNF-α、及びIL-2)を、CD8+T細胞の％で示す。シンボル及びバーは、１群あたり3頭のマウスの平均値±SEMを表す。
r3LCMVの感染に際しインターフェロン-αが誘導されるが、組換えアデノウイルス又はワクシニアウイルスの感染ではされない。C57BL/6マウスを、1×105PFUのr3LCMV-OVA、1×108PFUのrAd-OVA、又は1×106PFUのrVacc-OVAでi.v.により感染させた。血液を感染後の示された時点で採取し、血清中のインターフェロン-αのレベルを、ELISAにより決定した。シンボル及びバーは、１群あたり4頭のマウスの平均値±SEMを表す。***:p＜0.001(2元配置分散分析及びそれに続く多重比較のためのボンフェローニの事後検定)。2つの独立した実験のうちの1つからの代表的なデータを示す。
r3JUNV-GFPnat及びr2JUNV-wtと比較したr3JUNV-GFPartの細胞培養増殖。r3JUNV-GFPart及びr3JUNV-GFPnatを、図1に模式的に概略が示されているそれぞれのr3LCMVベクターと同様に構築した。それらの細胞培養増殖性を比較するために、293T細胞を、r2LCMV-wt、r3JUNV-GFPart、及びr3JUNV-GFPnatに、0.01の感染多重度(MOI)で感染させ、上清を示された時点で回収した。上清中の感染単位(FFU)をイムノフォーカスアッセイにより決定した。シンボル及びバーは、１群あたり3連の平均値±SEMを表し、シンボルの大きさ内に隠れている。
3分節型JUNVは、インビボで劇的に弱毒化されており、GFPの喪失に際して検出可能なウイルス血症に繋がるのみである。(A)AGRAGマウスを、7×104PFUのr3JUNV-GFPnat(灰色の四角)、r3JUNV-GFPart(白色の三角)、又は対照の2分節型r2JUNV株Candid#1(黒色の丸)でi.v.により感染させ、ウイルス血症を経時的にモニターした。シンボルは、個々のマウスを示す(１群あたりn=3〜7)。(B)JUNVウイルス血症を、AGRAGマウスの、7×104PFUのr3JUNV-GFPnat又はr3JUNV-GFPartでの静脈内感染の120日目に決定した。イムノフォーカスアッセイを行って、ヌクレオプロテインNP(灰色の丸)又はGFP(白色の丸)のいずれかを検出した。マウスに接種するために使用されたウイルスのストックを、本アッセイでの染色対照として使用した。シンボルは、個々のマウス及び接種材料をそれぞれ示す。
3分節型LCMV及びJUNVベースのワクチンベクターの相同かつ異種のプライムブースト組合せは、強力なP1A自己抗原特異的CD8+T細胞応答を誘導する。(A)実験の0日目及び35日目に、チャートに示された相同又は異種の組合せで、BALB/cマウスを静脈内への8.5×104PFUのr3JUNV-P1Aart(r3JUNV-P1A)及びr3LCMV-P1Aart(r3LCMV-P1A)で免疫化した。エピトープ特異的CD8+T細胞を、抗CD8a抗体と組み合わせたP1Aエピトープをロードした MHCクラスIテトラマーを用いて染色した。末梢血中のCD8+T細胞コンパートメントのうちのP1A-テトラマー結合性細胞の頻度(A)及び末梢血1マイクロリットルあたりのP1Aテトラマー結合性CD8+T細胞の絶対数(B)を計算した。シンボルは、１群及び1時点あたり3〜5頭のマウスの平均値+/-SEMを表す。
(発明の詳細な説明)
(4.1 非天然位置にオープンリーディングフレームを有するアレナウイルス)
本明細書においては、ORFの再構成を有するアレナウイルスが提供される。ある実施態様において、このようなアレナウイルスは、複製可能かつ感染性である。このようなアレナウイルスのゲノム配列が、本明細書において提供される。一態様において、アレナウイルスORFを、該ORFのそれぞれの遺伝子がLCMV-MP(配列番号:4及び5を参照されたい)などの野生から単離されたウイルスにおいてみられる(本明細書では「野生型の位置」と称する)位置とは別の位置 (すなわち、非天然位置)に保持するよう操作されているアレナウイルスゲノムセグメントが、本明細書において提供される。一実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、LCMVである。
野生型のアレナウイルスゲノムセグメント及びORFは、当技術分野において公知である。特に、アレナウイルスゲノムは、Sセグメント及びLセグメントからなる。Sセグメントは、GP及びNPをコードするORFを保持する。Lセグメントは、Lタンパク質及びZタンパク質をコードする。両セグメントは、それぞれの5’及び3’UTRの側方に位置する(図1Aを参照されたい)。例示的な野生型のアレナウイルスゲノムセグメントは、配列番号:1〜10に提供されている。
ある実施態様において、アレナウイルスゲノムセグメントを、野生型の位置とは別の位置に、2つ以上のアレナウイルスORFを保持するよう操作することができる。他の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントは、野生型の位置とは別の位置に、2つのアレナウイルスORF、又は3つのアレナウイルスORF、又は4つのアレナウイルスORFを保持するよう操作することができる。
ある実施態様において、本明細書において提供されるアレナウイルスゲノムセグメントは:
(i)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(vii)GPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(viii)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(x)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;
(xi)NPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメント;及び
(xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスLセグメントとすることができる。
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、アレナウイルス3’UTR又はアレナウイルス5’UTRの制御下とすることができる。より具体的な実施態様において、前記アレナウイルス3’UTRは、アレナウイルスSセグメントの3’UTRである。別の具体的な実施態様において、前記アレナウイルス3’UTRは、アレナウイルスLセグメントの3’UTRである。より具体的な実施態様において、前記アレナウイルス5’UTRは、アレナウイルスSセグメントの5’UTRである。他の具体的な実施態様において、前記5’UTRは、Lセグメントの5’UTRである。
他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、アレナウイルスの保存末端配列エレメント(5’-及び3'-末端の19〜20nt領域)の制御下にあり得る(例えば、Perez及びde la Torreの文献、2003、J Virol. 77(2): 1184-1194を参照されたい)。
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、5’UTRのプロモーターエレメントの制御下にあり得る(例えば、Albarinoらの文献、2011、J Virol.、85(8):4020-4を参照されたい)。別の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、3’UTRのプロモーターエレメントの制御下にあり得る(例えば、Albarinoらの文献、2011、J Virol.、85(8):4020-4を参照されたい)。より具体的な実施態様において、前記5’UTRのプロモーターエレメントは、Sセグメント又はLセグメントの5’UTRプロモーターエレメントである。別の具体的な実施態様において、前記3’UTRのプロモーターエレメントは、Sセグメント又はLセグメントの3’UTRプロモーターエレメントである。
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントの非天然位置にあるORFは、切断型のアレナウイルス3’UTR又は切断型のアレナウイルス5’UTRの制御下にあり得る(例えば、Perez及びde la Torreの文献、2003、J Virol. 77(2): 1184-1194;Albarinoらの文献、2011、J Virol.、85(8):4020-4を参照されたい)。より具体的な実施態様において、前記切断型の3’UTRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントの3’UTRである。より具体的な実施態様において、前記切断型の5’UTRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントの5’UTRである。
また、Sセグメント及びLセグメントを含むように、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている第一のゲノムセグメント、及び第二のアレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子も本明細書において提供される。具体的な実施態様において、前記ORFの野生型の位置とは別の位置のORFは、アレナウイルスORFのうちの1つである。
具体的なある実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFの全てを完全に(a full complement of all four arenavirus ORFs)含み得る。具体的な実施態様において、前記第二のアレナウイルスゲノムセグメントは、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。別の具体的な実施態様において、前記第二のアレナウイルスゲノムセグメントは、野生型のゲノムセグメントとすることができる(すなわち、野生型の位置のセグメント上にORFを含む)。
ある実施態様において、前記第一のアレナウイルスゲノムセグメントは、Lセグメントであり、かつ前記第二のアレナウイルスゲノムセグメントは、Sセグメントである。他の実施態様において、前記第一のアレナウイルスゲノムセグメントは、Sセグメントであり、かつ前記第二のアレナウイルスゲノムセグメントは、Lセグメントである。
ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に有するゲノムセグメント及び第二のゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子の非限定的な例が、表1に例示される。
(表1)
アレナウイルス粒子
*位置1は、アレナウイルスSセグメント5’UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスSセグメント3’UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスLセグメント5’UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスLセグメント3’UTRの制御下にある。
Figure 2017535267
また、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作された前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAも本明細書において提供される。より具体的な実施態様において、表1に記載されるアレナウイルスゲノムのcDNA又はcDNAのセットが、本明細書において提供される。
ある実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作された前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAは、DNA発現ベクターの一部であるか、又はDNA発現ベクターに組み込まれている。具体的な実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作された前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAは、本明細書に記載されるようなアレナウイルスゲノムセグメントの生成を容易にするDNA発現ベクターの一部であるか、又はそのようなDNA発現ベクターに組み込まれている。別の実施態様において、本明細書に記載のcDNAは、プラスミドに組み込むことができる。前記cDNA又は核酸及び発現系のより詳細な説明は、セクション4.5.1で提供される。前記cDNAの生成のための技術は、ルーチンのものであり、分子生物学並びにDNAの取扱い及び生成の従来技術である。当業者に公知の任意のクローニング技術を使用し得る。そのような技術は周知であり、Sambrook及びRussellの文献、「分子クローニング：ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A laboratory Manual)」、第三版、Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)のような実験マニュアルにおいて当業者に利用可能となっている。
ある実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作された前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAは、宿主細胞に導入される(例えば、トランスフェクトされる)。従って、いくつかの実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作された前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNA(すなわち、前記ゲノムセグメントのcDNA)を含む宿主細胞が、本明細書において提供される。他の実施態様において、本明細書に記載のcDNAは、DNA発現ベクターの一部であるか、又はDNA発現ベクターに組み込まれて宿主細胞に導入され得る。従って、いくつかの実施態様において、ベクターに組み込まれた本明細書に記載のcDNAを含む宿主細胞が、本明細書において提供される。他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントは、宿主細胞に導入されている。
ある実施態様において、アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを転写することを含むアレナウイルスゲノムセグメントを生成させる方法が本明細書に記載される。ある実施態様において、ウイルスのポリメラーゼタンパク質は、インビトロ又はインビボでの前記アレナウイルスゲノムセグメントの転写の間に存在し得る。
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、双方向性プロモーターを用いて行われる。他の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、双方向性発現カセットを用いて行われる(例えば、Ortiz-Rianoらの文献、2013、J Gen Virol.、94(Pt 6): 1175-1188を参照されたい)。より具体的な実施態様において、該双方向性発現カセットは、前記挿入されたアレナウイルスゲノムセグメントの2つの終端の内部に、それぞれ反対側から読むポリメラーゼI及びポリメラーゼIIプロモーターの双方を含む。さらにより具体的な実施態様においては、前記pol-I及びpol-IIプロモーターを有する双方向性発現カセットは、Lセグメント及びSセグメント内部へ反対側から読む。
他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAの転写は、プロモーターを含む。プロモーターの具体例としては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、又はT3プロモーターが挙げられる。
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントを生成させる方法は、宿主細胞内に、前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを導入することをさらに含み得る。ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントを生成させる方法は、前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを、該アレナウイルスゲノムセグメントの生成のためのすべての他の成分を発現する宿主細胞に導入すること;及び該アレナウイルスゲノムセグメントを、該宿主細胞の上清から精製することをさらに含み得る。そのような方法は、当業者に周知である。
本明細書においては、本明細書において提供される核酸、ベクター、及び組成物に感染した細胞株、培養物、及びそのような細胞を培養する方法が提供される。本明細書に記載される核酸、ベクター系、及び細胞株のより詳細な説明は、セクション4.5で提供される。
ある実施態様において、本明細書に記載されるようなアレナウイルス粒子は、結果として、感染性かつ複製可能なアレナウイルス粒子となる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子は、弱毒化されている。特定の実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、該ウイルスが、少なくとも部分的に広がることができるままであり、かつインビボで複製可能であるが、低いウイルス負荷を生じさせ得るのみであり、結果として、病原性ではない不顕性なレベルの感染をもたらすように弱毒化されている。このような弱毒化ウイルスは、免疫原性組成物として用い得る。セクション4.7に記載されるように、ORFを非天然位置に有するアレナウイルスを含む免疫原性組成物が、本明細書において提供される。
(4.1.1 非天然位置にオープンリーディングフレームを有する複製欠損性アレナウイルス粒子)
ある実施態様において、アレナウイルス粒子であって、(i)ORFが、該ORFの野生型の位置とは別の位置にあり;かつ(ii)GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードするORFが、除去又は機能的に不活性化されており、結果として生じるウイルスが、感染性の子孫ウイルス粒子をさらに生じさせることができなくなっている、前記アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。1つ以上のORFが欠失しているか又は機能的に不活性化されている遺伝子改変ゲノムを含むアレナウイルス粒子は、補完細胞(complementing cells)(すなわち、該欠失しているか又は機能的に不活性化されているアレナウイルスORFを発現する細胞)において生成させ得る。結果として生じるアレナウイルス粒子の遺伝子材料は、宿主細胞の感染時に、該宿主細胞内に移行させることができ、ここで、該遺伝子材料は、発現及び増幅され得る。加えて、本明細書に記載される前記遺伝子改変アレナウイルス粒子のゲノムは、アレナウイルス粒子以外の生物由来の異種ORFをコードし得る。
ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。別の実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする少なくとも1つのORF、少なくとも2つのORF、少なくとも3つのORF、又は少なくとも4つのORFが、除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられ得る。具体的な実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの１つのみが除去されて、アレナウイルス粒子以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。より具体的な実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントのGPをコードするORFが除去されている。別の具体的な実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントのNPをコードするORFが除去されている。より具体的な実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントのZタンパク質をコードするORFが除去されている。さらに別の具体的な実施態様において、Lタンパク質をコードするORFが除去されている。
従って、ある実施態様において、本明細書において提供されるアレナウイルス粒子は、(i)ORFを非天然位置に保持するよう操作され;(ii)GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが除去され;(iii)除去されたORFが、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられているゲノムセグメントを含む。
ある実施態様において、前記異種ORFは、8〜100ヌクレオチドの長さ、15〜100ヌクレオチドの長さ、25〜100ヌクレオチドの長さ、50から200ヌクレオチドの長さ、50から400ヌクレオチドの長さ、200から500ヌクレオチドの長さであるか、又は400〜600ヌクレオチドの長さ、500から800ヌクレオチドの長さである。他の実施態様において、前記異種ORFは、750〜900ヌクレオチドの長さ、800〜100ヌクレオチドの長さ、850〜1000ヌクレオチドの長さ、900〜1200ヌクレオチドの長さ、1000〜1200ヌクレオチドの長さ、1000〜1500ヌクレオチドもしくは10〜1500ヌクレオチドの長さ、1500〜2000ヌクレオチドの長さ、1700〜2000ヌクレオチドの長さ、2000〜2300ヌクレオチドの長さ、2200〜2500ヌクレオチドの長さ、2500〜3000ヌクレオチドの長さ、3000〜3200ヌクレオチドの長さ、3000〜3500ヌクレオチドの長さ、3200〜3600ヌクレオチドの長さ、3300〜3800ヌクレオチドの長さ、4000ヌクレオチド〜4400ヌクレオチドの長さ、4200〜4700ヌクレオチドの長さ、4800〜5000ヌクレオチドの長さ、5000〜5200ヌクレオチドの長さ、5200〜5500ヌクレオチドの長さ、5500〜5800ヌクレオチドの長さ、5800〜6000ヌクレオチドの長さ、6000〜6400ヌクレオチドの長さ、6200〜6800ヌクレオチドの長さ、6600〜7000ヌクレオチドの長さ、7000〜7200ヌクレオチドの長さ、7200〜7500ヌクレオチドの長さ、又は7500ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、5〜10アミノ酸長、10〜25アミノ酸長、25〜50アミノ酸長、50〜100アミノ酸長、100〜150アミノ酸長、150〜200アミノ酸長、200〜250アミノ酸長、250〜300アミノ酸長、300〜400アミノ酸長、400〜500アミノ酸長、500〜750アミノ酸長、750〜1000アミノ酸長、1000〜1250アミノ酸長、1250〜1500アミノ酸長、1500〜1750アミノ酸長、1750〜2000アミノ酸長、2000〜2500アミノ酸長、又は2500を超えるもしくはそれ以上のアミノ酸長のペプチド又はポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、2500アミノ酸長を超えないポリペプチドをコードする。具体的な実施態様において、前記異種ORFは、終止コドンを含まない。ある実施態様において、前記異種ORFは、コドン最適化されている。ある実施態様において、前記ヌクレオチド組成物、ヌクレオチド対組成物、又は双方を、最適化することができる。そのような最適化のための技術は、当技術分野において公知であり、異種ORFの最適化に適用し得る。
任意のアレナウイルス以外の生物由来の異種ORFが、アレナウイルスゲノムセグメントに含まれ得る。一実施態様において、前記異種ORFは、レポータータンパク質をコードする。レポータータンパク質のより詳細な説明は、セクション4.3に記載されている。別の実施態様において、前記異種ORFは、免疫応答を誘発することが可能な、感染性の病原体の抗原又は任意の疾患に関連する抗原をコードする。具体的な実施態様において、前記抗原は、感染性の生物、腫瘍(すなわち、がん)、又はアレルゲン由来である。異種ORFに関するより詳細な説明は、セクション4.3に記載されている。
ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子の増殖及び感染力は、前記アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFにより影響されない。
当業者に公知の技術を用いて、アレナウイルスORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されたアレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子を生成させてもよい。例えば、逆遺伝学的な技術を用いて、このようなアレナウイルス粒子を産生させてもよい。他の実施態様において、前記複製欠損性アレナウイルス粒子(すなわち、アレナウイルスORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されたアレナウイルスゲノムセグメントであって、GP、NP、Zタンパク質、Lタンパク質をコードするORFが欠失している、前記アレナウイルスゲノムセグメント)は、補完細胞において生成させ得る。
ある実施態様において、本出願に従い用いるアレナウイルスゲノムセグメント又はアレナウイルス粒子は、旧世界ウイルス、例えば、LCMVとすることができる。
ある実施態様において、本出願は、ワクチンとしての使用に適した本明細書に記載されるアレナウイルス粒子、並びにワクチン接種、並びに、例えば、感染症又はがんの治療又は予防においてこのようなアレナウイルス粒子を使用する方法に関する。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、セクション4.6に提供されている。
ある実施態様において、1つ以上の容器に、1つ以上の本明細書に記載のcDNAを含むキットが、本明細書において提供される。具体的な実施態様において、キットは、1つ又は2つ以上の容器に、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメント又はアレナウイルス粒子を含む。該キットは、以下のもの:前記アレナウイルスゲノムセグメント又は前記アレナウイルス粒子の救出に適した宿主細胞、プラスミドcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトするのに適した試薬、ヘルパーウイルス、ウイルスタンパク質をコードするプラスミド、及び/又は改変されたアレナウイルスゲノムセグメントもしくはアレナウイルス粒子、又はそれらのcDNAに対して特異的な1つ以上のプライマー、のうちの1つ以上をさらに含んでいてもよい。
ある実施態様において、本出願は、医薬組成物としての使用に適した本明細書に記載されるアレナウイルス粒子、及びワクチン接種、並びに、例えば、感染症及びがんの治療又は予防において、このようなアレナウイルス粒子を使用する方法に関する。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、セクション4.7に提供されている。
(4.2 3分節型アレナウイルス粒子)
本明細書においては、ORFの再構成を有する3分節型アレナウイルス粒子が提供される。一態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメント、又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、複製可能な2分節型アレナウイルス粒子へとは組み換わらない。より詳細には、ある実施態様において、前記ゲノムセグメントのうちの2つ(例えば、それぞれ、前記2つのSセグメント又は前記2つのLセグメント)は、該2つの親セグメントを置き換え得る単一のウイルスのセグメントを生じるように組み換わることはできない。具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に含む。さらに別の具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFの全てを含む。従って、ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、複製可能かつ感染性である。他の実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFのうちの1つを欠く。従って、ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、感染性ではあるが、非補完細胞において感染性の子孫をさらに生じさせることはできない。
ある実施態様において、本明細書に記載される3分節型アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFは、アレナウイルス3’UTR又はアレナウイルス5’UTRの制御下とすることができる。より具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス3’UTRは、アレナウイルスSセグメント(複数可)の3’UTRである。別の具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス3’UTRは、3分節型アレナウイルスLセグメント(複数可)の3’UTRである。より具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス5’UTRは、アレナウイルスSセグメント(複数可)の5’UTRである。他の具体的な実施態様において、前記5’UTRは、Lセグメント(複数可)の5’UTRである。
他の実施態様において、本明細書に記載される3分節型アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFは、アレナウイルス保存末端配列エレメント(5’-及び3'-末端の19〜20nt領域)の制御下にあり得る(例えば、Perez及びde la Torreの文献、2003、J Virol. 77(2): 1184-1194を参照されたい)。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFは、5’UTRのプロモーターエレメントの制御下にあり得る(例えば、Albarinoらの文献、2011、J Virol.、85(8):4020-4を参照されたい)。別の実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、Lタンパク質をコードするORFは、3’UTRのプロモーターエレメントの制御下にあり得る(例えば、Albarinoらの文献、2011、J Virol.、85(8):4020-4を参照されたい)。より具体的な実施態様において、前記5’UTRのプロモーターエレメントは、Sセグメント(複数可)又はLセグメント(複数可)の5’UTRプロモーターエレメントである。別の具体的な実施態様において、前記3’UTRのプロモーターエレメントは、Sセグメント(複数可)又はLセグメント(複数可)の3’UTRプロモーターエレメントである。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子のGP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFは、切断型のアレナウイルス3’UTR又は切断型のアレナウイルス5’UTRの制御下にあり得る(例えば、Perez及びde la Torreの文献、2003、J Virol. 77(2): 1184-1194;Albarinoらの文献、2011、J Virol.、85(8):4020-4を参照されたい)。より具体的な実施態様において、前記切断型の3’UTRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントの3’UTRである。より具体的な実施態様において、前記切断型の5’UTRは、アレナウイルスSセグメント(複数可)又はLセグメント(複数可)の5’UTRである。
また、前記3分節型アレナウイルス粒子のcDNAも本明細書において提供される。より具体的な実施態様において、表2又は表3に記載される3分節型アレナウイルス粒子をコードするDNAヌクレオチド配列又はDNAヌクレオチド配列のセットが、本明細書において提供される。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルスゲノムをコードする核酸は、1つ以上のDNA発現ベクターの一部であるか、又は1つ以上のDNA発現ベクターに組み込まれている。具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノムをコードする核酸は、本明細書に記載される3分節型アレナウイルス粒子の生成を容易にする1つ以上のDNA発現ベクターの一部であるか、又はそのような1つ以上のDNA発現ベクターに組み込まれている。別の実施態様において、本明細書に記載のcDNAは、プラスミドに組み込むことができる。前記cDNAs及び発現系のより詳細な説明は、セクション4.5.1において提供される。前記cDNAの生成のための技術は、ルーチンのものであり、分子生物学並びにDNAの取扱い及び生成の従来技術である。当業者に公知の任意のクローニング技術を使用し得る。そのような技術は、周知であり、Sambrook及びRussellの文献、「分子クローニング：ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A laboratory Manual)」、第三版、Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)などの実験マニュアルにおいて当業者に利用可能である。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルスのcDNAは、宿主細胞に導入される(例えば、トランスフェクトされる)。従って、いくつかの実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子のcDNA(すなわち、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノムセグメントのcDNA)を含む宿主細胞が、本明細書において提供される。他の実施態様において、
本明細書に記載のcDNAは、DNA発現ベクターの一部であるか、DNA発現ベクターに組み込まれることができ、宿主細胞に導入され得る。従って、いくつかの実施態様において、ベクターに組み込まれた本明細書に記載のcDNAを含む宿主細胞が、本明細書において提供される。他の実施態様において、本明細書に記載される前記3分節型アレナウイルスゲノムセグメント(すなわち、Lセグメント及び/又はSセグメント(単数)又はセグメント(複数))は、宿主細胞に導入されている。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子を生成させる方法であって、該3分節型アレナウイルス粒子のcDNAを転写することを含む、前記方法が本明細書に記載される。ある実施態様において、ウイルスのポリメラーゼタンパク質は、インビトロ又はインビボでの前記3分節型アレナウイルス粒子の転写の間存在し得る。ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、双方向性プロモーターを用いて行われる。
他の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントの転写は、双方向性発現カセットを用いて行われる(例えば、Ortiz-Rianoらの文献、2013、J Gen Virol.、94(Pt 6): 1175-1188を参照されたい)。より具体的な実施態様において、前記双方向性発現カセットは、前記挿入されたアレナウイルスゲノムセグメントの2つの終端の内部に、それぞれ反対側から読むポリメラーゼI及びポリメラーゼIIプロモーターの双方を含む。
他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAの転写は、プロモーターを含む。プロモーターの具体例としては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、又はT3プロモーターが挙げられる。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子を生成させる方法は、前記3分節型アレナウイルス粒子のcDNAを、宿主細胞に導入することをさらに含み得る。ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子を生成させる方法は、前記3分節型アレナウイルス粒子のcDNAを、該3分節型アレナウイルス粒子の生成のためのすべての他の成分を発現する宿主細胞に導入すること;及び該3分節型アレナウイルス粒子を、該宿主細胞の上清から精製することをさらに含み得る。そのような方法は、当業者に周知である。
本明細書においては、本明細書において提供される核酸、ベクター、及び組成物に感染した細胞株、培養物、及びそのような細胞を培養する方法が提供される。本明細書に記載される核酸、ベクター系、及び細胞株のより詳細な説明は、セクション4.5に提供されている。
ある実施態様において、本明細書に記載される前記3分節型アレナウイルス粒子は、結果として、感染性かつ複製可能なアレナウイルス粒子を生ずる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子は、弱毒化されている。特定の実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、該ウイルスが、少なくとも部分的に複製可能なままであり、かつインビボで複製可能であるが、低いウイルス負荷を生じさせ得るのみであり、結果として病原性ではない不顕性なレベルの感染症をもたらすように弱毒化されている。このような弱毒化ウイルスは、免疫原性組成物として用い得る。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、2分節型アレナウイルス粒子と同じトロピズムを有する。
また、1つ以上の容器に、1つ以上の本明細書に記載のcDNAを含むキットも本明細書において提供される。具体的な実施態様において、キットは、1つ又は2つ以上の容器に、本明細書に記載される3分節型アレナウイルス粒子を含む。該キットは、以下のもの:前記3分節型アレナウイルス粒子の救出に適した宿主細胞、プラスミドcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトするのに適した試薬、ヘルパーウイルス、ウイルスタンパク質をコードするプラスミド、及び/又は改変されたアレナウイルスゲノムセグメントもしくはアレナウイルス粒子、又はそれらをコードする核酸に対して特異的な1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、のうちの1つ以上をさらに含んでいてもよい。
また、セクション4.6及び4.7に記載されるような3分節型アレナウイルス粒子を含む免疫原性組成物も本明細書において提供される。
(4.2.1 1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子)
一態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。ある実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。具体的な実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体、及び組換え活性化遺伝子(RAG1)を欠き、104PFUの該3分節型アレナウイルス粒子に感染しているマウスにおいて、少なくとも10日間、少なくとも20日間、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、少なくとも90日間、又は少なくとも100日間の持続感染後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない(セクション4.8.13を参照されたい)。他の実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、少なくとも10回の継代、少なくとも20回の継代、少なくとも30回の継代、少なくとも40回の継代、又は少なくとも50回の継代後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。
全てのウイルス遺伝子がそれらのそれぞれの野生型の位置にある3分節型アレナウイルス粒子は、当技術分野において公知である(例えば、Emonetらの文献、2011 J. Virol.、85(4):1473;Popkinらの文献、2011、J. Virol、85(15):7928)。特に、前記3分節型アレナウイルスゲノムは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントからなり、ここで異種ORF(例えば、GFP)が、各Sセグメント上の1つの位置に挿入されている。より詳細には、一方のSセグメントが、GP及びGFPをそれぞれコードする。他方のSセグメントは、GFP及びNPをそれぞれコードする。Lセグメントは、Lタンパク質及びZタンパク質をコードする。すべてのセグメントは、それぞれの5’及び3’UTRの側方に位置する。
ある実施態様において、本明細書において提供される3分節型アレナウイルス粒子の2つのSセグメントの、該2つのアレナウイルスのORFを2つの別のセグメントではなく1つのセグメント上に一体化させるセグメント間組換えは、結果として、ゲノムの一端を形成している各UTRが、同じゲノムの他端の反転繰り返し配列である非機能性プロモーター(すなわち、
Figure 2017535267
 の構造のゲノムセグメント)をもたらす。
ある実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、アレナウイルスORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。他の実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、2つのアレナウイルスORF、又は3つのアレナウイルスORF、又は4つのアレナウイルスORF、又は5つのアレナウイルスORF、又は6つのアレナウイルスORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。特定の実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFの全てを完全に含む。従って、いくつかの実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、感染性かつ複製可能な3分節型アレナウイルス粒子である。具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子の2つのSセグメントは、それらのORFのうちの1つを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。より具体的な実施態様において、前記2つのSセグメントは、SセグメントORFを完全に含む。具体的なある実施態様において、前記Lセグメントは、ORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているか、又は前記Lセグメントは、野生型のゲノムセグメントとすることができる。
ある実施態様において、前記2つのSセグメントのうちの1つは:
(i)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(ii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iii)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;
(v)LをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるアレナウイルスSセグメント
とすることができる。
ある実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、重複するORF(すなわち、2つの野生型のSセグメントORF、例えば、GP又はNP)を含み得る。具体的な実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、１種の重複するORF(例えば、(GP、GP))又は2種の重複するORF(例えば、(GP、GP)及び(NP、NP))を含み得る。
以下の表2Aは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、該3分節型アレナウイルスゲノムにおける2つのSセグメントのセグメント間組換えが、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさず、かつアレナウイルスのプロモーター活性を抑制する(すなわち、結果として生じる組換えSセグメントが、3’UTR及び5’UTRではなく2つの3’UTRで形成される)、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノム構成の実例である。
(表2A)
1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子
位置1は、アレナウイルスSセグメント5’UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスSセグメント3’UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスSセグメント5’UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスSセグメント3’UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスLセグメント5’UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスLセグメント3’UTRの制御下にある。
*ORFは、異種ORFが挿入されていることを表す。
Figure 2017535267
ある実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができる。具体的な実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスSセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスSセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができる。ある実施態様において、他の組合せもまた考えられる。例えば、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、3分節型アレナウイルスゲノムにおける2つのSセグメントのセグメント間組換えが、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさず、かつアレナウイルスのプロモーター活性を抑制する(すなわち、結果として生じる組換えSセグメントが、3’UTR及び5’UTRではなく2つの5’UTRで形成されている)、前記3分節型アレナウイルス粒子である。
ある実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子におけるSセグメント及びLセグメントのセグメント間組換えは、2つのウイルス遺伝子が2つの別のセグメント上ではなく1つのセグメントのみの上に存在する機能的セグメントを回復させる。他の実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子におけるSセグメント及びLセグメントのセグメント間組換えは、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。
以下の表2Bは、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、3分節型アレナウイルスゲノムにおけるSセグメント及びLセグメントのセグメント間組換えが、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさず、かつアレナウイルスのプロモーター活性を抑制する(すなわち、結果として生じる組換えSセグメントが、3’UTR及び5’UTRではなく2つの3’UTRで形成されている)、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノム構成の実例である。
(表2B)
1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子
位置1は、アレナウイルスSセグメント5’UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスSセグメント3’UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスSセグメント5’UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスSセグメント3’UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスLセグメント5’UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスLセグメント3’UTRの制御下にある。
*ORFは、異種ORFが挿入されていることを表す。
Figure 2017535267
ある実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができる。具体的な実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスSセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスSセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができる。ある実施態様において、他の組合せもまた考えられる。例えば、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、該3分節型アレナウイルスゲノムにおける2つのSセグメントのセグメント間組換えが、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさず、かつアレナウイルスのプロモーター活性を抑制する(すなわち、結果として生じる組換えSセグメントが、3’UTR及び5’UTRではなく2つの5’UTRで形成されている)、前記3分節型アレナウイルス粒子である。
ある実施態様において、当業者であれば、表2A又は2Bに例示され、かつ本明細書で説明されるような構成のアレナウイルスゲノムを構築し、その後、セクション4.8に記載されるようなアッセイを用いて、該3分節型アレナウイルス粒子が、遺伝的に安定であるかどうか、すなわち、本明細書で論じられているように、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさないかどうかを決定し得る。
(4.2.2 2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子)
一態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。ある実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。具体的な実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体、及び組換え活性化遺伝子(RAG1)を欠き、かつ104PFUの該3分節型アレナウイルス粒子に感染しているマウスにおいて、少なくとも10日間、少なくとも20日間、少なくとも30日間、少なくとも40日間、又は少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、少なくとも90日間、少なくとも100日間の持続性の後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない(セクション4.8.13を参照されたい)。他の実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子の増殖は、少なくとも10回の継代、20回の継代、30回の継代、40回の継代、又は50回の継代後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。
ある実施態様において、本明細書において提供される3分節型アレナウイルス粒子の前記2つのLセグメントの、該2つのアレナウイルスのORFを、2つの別のセグメントではなく1つのセグメント上に一体化させるセグメント間組換えは、結果として、ゲノムの一端を形成している各UTRが、同じゲノムの他端の反転繰り返し配列である、非機能性プロモーター(すなわち、
Figure 2017535267
 構造のゲノムセグメント)をもたらす。
ある実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、アレナウイルスORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。他の実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、2つのアレナウイルスORF、又は3つのアレナウイルスORF、又は4つのアレナウイルスORF、又は5つのアレナウイルスORF、又は6つのアレナウイルスORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。具体的な実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、4つのアレナウイルスORFの全てを完全に含む。従って、いくつかの実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、感染性かつ複製可能な3分節型アレナウイルス粒子である。具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子の2つのLセグメントは、それらのORFのうちの1つを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている。より具体的な実施態様において、前記2つのLセグメントは、LセグメントORFを完全に含む。具体的なある実施態様において、前記Sセグメントは、それらのORFのうちの1つを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているか、又は前記Sセグメントは、野生型のゲノムセグメントとすることができる。
ある実施態様において、2つのLセグメントのうちの1つは:
(i)GPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(ii)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
(iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;
(v)NPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;及び
(vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント
とすることができる。
ある実施態様において、前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、重複するORF(すなわち、2つの野生型のLセグメントORF、例えば、Zタンパク質又はLタンパク質)を含み得る。具体的な実施態様において、前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子は、1種の重複するORF(例えば、(Zタンパク質、Zタンパク質))又は2種の重複するORF(例えば、(Zタンパク質、Zタンパク質)及び(Lタンパク質、Lタンパク質))を含み得る。
以下の表3は、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、3分節型アレナウイルスゲノム中の2つのLセグメントのセグメント間組換えが、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさず、かつアレナウイルスのプロモーター活性を抑制する(すなわち、推定上結果として生じている組換えLセグメントは、3’UTR及び5’UTRではなく2つの3’UTR又は2つの5’UTRで形成されているであろう)、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノム構成の実例である。表3に基づいて、類似の組合せを、3’UTR及び5’UTRではなく2つの5’UTRで形成されているアレナウイルス粒子を産生させるために予測可能であろう。
(表3)
2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子
*位置1は、アレナウイルスLセグメント5’UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスLセグメント3’UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスLセグメント5’UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスLセグメント3’UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスSセグメント5’UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスSセグメント3’UTRの制御下にある。
*ORFは、異種ORFが挿入されていることを表す。
Figure 2017535267
ある実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができる。具体的な実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスSセグメントIGRとすることができる。ある実施態様において、他の組合せもまた考えられる。
ある実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子由来のLセグメント及びSセグメントのセグメント間組換えは、2つのウイルス遺伝子が、2つの別のセグメント上ではなく1つのセグメント上のみにある機能的セグメントを回復させる。他の実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子におけるLセグメント及びSセグメントのセグメント間組換えは、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない。
以下の表3Bは、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、3分節型アレナウイルスゲノムにおけるLセグメント及びSセグメントのセグメント間組換えが、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさず、かつアレナウイルスのプロモーター活性を抑制する(すなわち、結果として生じる組換えSセグメントが、3’UTR及び5’UTRではなく2つの3’UTRで形成されている)、前記3分節型アレナウイルス粒子のゲノム構成の実例である。
(表3B)
2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子
*位置1は、アレナウイルスLセグメント5’UTRの制御下にある;位置2は、アレナウイルスLセグメント3’UTRの制御下にある;位置3は、アレナウイルスLセグメント5’UTRの制御下にある;位置4は、アレナウイルスLセグメント3’UTRの制御下にある;位置5は、アレナウイルスSセグメント5’UTRの制御下にある;位置6は、アレナウイルスSセグメント3’UTRの制御下にある。
*ORFは、異種ORFが挿入されていることを表す。
Figure 2017535267
ある実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスSセグメント又はLセグメントIGRとすることができる。具体的な実施態様において、位置1と位置2との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができ;位置2と3との間のIGRは、アレナウイルスLセグメントIGRとすることができ;かつ位置5と6との間のIGRは、アレナウイルスSセグメントIGRとすることができる。ある実施態様において、他の組合せもまた考えられる。
ある実施態様において、当業者であれば、表3A又は3Bに例示され、かつ本明細書で説明されるような構成のアレナウイルスゲノムを構築し、その後、セクション4.8に記載されるようなアッセイを用いて、該3分節型アレナウイルス粒子が、遺伝的に安定であるかどうか、すなわち、本明細書で論じられているように、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさないかどうかを決定し得る。
(4.2.3 複製欠損性3分節型アレナウイルス粒子)
ある実施態様において、3分節型アレナウイルス粒子であって、(i)ORFが、該ORFの野生型の位置とは別の位置にあり;かつ(ii)GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが、除去又は機能的に不活性化されており、結果として生じるウイルスが、感染性の子孫ウイルス粒子をさらに生じさせることができなくなっている(すなわち、複製欠損性である)、前記3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。ある実施態様において、第三のアレナウイルスセグメントは、Sセグメントとすることができる。他の実施態様において、第三のアレナウイルスセグメントは、Lセグメントとすることができる。より具体的な実施態様において、第三のアレナウイルスセグメントは、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作することができるか、又は第三のアレナウイルスセグメントは、野生型のアレナウイルスゲノムセグメントとすることができる。さらにより具体的な実施態様において、第三のアレナウイルスセグメントは、GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするアレナウイルスORFを欠く。
ある実施態様において、3分節型ゲノムセグメントは、S又はLセグメントハイブリッド(すなわち、Sセグメント及びLセグメントの組合せとすることができるゲノムセグメント)とすることもできる。他の実施態様において、前記ハイブリッドセグメントは、LセグメントIGRを含むSセグメントである。別の実施態様において、前記ハイブリッドセグメントは、SセグメントIGRを含むLセグメントである。他の実施態様において、前記ハイブリッドセグメントは、LセグメントIGRを伴うSセグメントUTRである。別の実施態様において、前記ハイブリッドセグメントは、SセグメントIGRを伴うLセグメントUTRである。具体的な実施態様において、前記ハイブリッドセグメントは、LセグメントIGRを伴うSセグメント5’UTRであるか、又はLセグメントIGRを伴うSセグメント3’UTRである。他の具体的な実施態様において、前記ハイブリッドセグメントは、SセグメントIGRを伴うLセグメント5’UTRであるか、又はSセグメントIGRを伴うLセグメント3’UTRである。
1つ以上のORFが欠失しているか又は機能的に不活性化されている遺伝子改変ゲノムを含む3分節型アレナウイルス粒子は、補完細胞(すなわち、該欠失しているか又は機能的に不活性化されているアレナウイルスORFを発現する細胞)において生成させ得る。結果として生じるアレナウイルス粒子の遺伝子材料は、宿主細胞の感染時に、該宿主細胞内に移行させることができ、ここで、該遺伝子材料は、発現及び増幅され得る。加えて、本明細書に記載される遺伝子改変アレナウイルス粒子のゲノムは、アレナウイルス粒子以外の生物由来の異種ORFをコードし得る。
ある実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。別の実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする少なくとも1つのORF、少なくとも2つのORF、少なくとも3つのORF、又は少なくとも4つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられ得る。具体的な実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの１つのみが除去されて、アレナウイルス粒子以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。より具体的な実施態様において、アレナウイルスゲノムセグメントのGPをコードするORFが除去されている。別の具体的な実施態様において、アレナウイルスゲノムセグメントのNPをコードするORFが除去されている。より具体的な実施態様において、アレナウイルスゲノムセグメントのZタンパク質をコードするORFが除去されている。さらに別の具体的な実施態様において、Lタンパク質をコードするORFが除去されている。
ある実施態様において、1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、(i)ORFが、該ORFの野生型の位置とは別の位置にあり;かつ(ii)GP又はNPをコードするORFが、除去又は機能的に不活性化されており、結果として生じるウイルスが、複製欠損性かつ非感染性となっている、前記3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。具体的な実施態様において、1つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。別の具体的な実施態様において、２つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。他の具体的な実施態様において、３つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。具体的な実施態様において、GPをコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。他の具体的な実施態様において、NPをコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。さらにより具体的な実施態様において、NPをコードするORF及びGPをコードするORFが除去されて、アレナウイルス粒子以外の生物由来の1つ又は2つの異種ORFと置き換えられている。従って、ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、(i)1つのLセグメント及び2つのSセグメント;(ii)ORFであって、該ORFの野生型の位置とは別の位置にある前記ORF;(iii)アレナウイルス以外の生物由来の1つ以上の異種ORF、を含む。
ある実施態様において、2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、(i)ORFが、該ORFの野生型の位置とは別の位置にあり;かつ(ii)Zタンパク質及び/又はLタンパク質をコードするORFが、除去又は機能的に不活性化されており、結果として生じるウイルスが、複製欠損性かつ非感染性となっている、前記3分節型アレナウイルス粒子が、本明細書において提供される。具体的な実施態様において、1つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。別の具体的な実施態様において、２つのORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。具体的な実施態様において、Zタンパク質をコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。他の具体的な実施態様において、Lタンパク質をコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。さらにより具体的な実施態様において、Zタンパク質をコードするORF及びLタンパク質をコードするORFが除去されて、アレナウイルス粒子以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。従って、ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、(i)2つのLセグメント及び1つのSセグメント;(ii)ORFであって、該ORFの野生型の位置とは別の位置にある前記ORF;(iii)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORF、を含む。
従って、ある実施態様において、本明細書において提供される3分節型アレナウイルス粒子は、i)ORFを非天然位置に保持するよう操作され;ii)GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが除去され;iii)該除去されたORFが、アレナウイルス以外の生物由来の1つ以上の異種ORFと置き換えられている、3分節型アレナウイルス粒子(すなわち、1つのLセグメント及び2つのSセグメント、又は2つのLセグメント及び1つのSセグメント)を含む。
ある実施態様において、前記異種ORFは、8〜100ヌクレオチドの長さ、15〜100ヌクレオチドの長さ、25〜100ヌクレオチドの長さ、50から200ヌクレオチドの長さ、50から400ヌクレオチドの長さ、200から500ヌクレオチドの長さ、又は400〜600ヌクレオチドの長さ、500から800ヌクレオチドの長さである。他の実施態様において、前記異種ORFは、750〜900ヌクレオチドの長さ、800〜100ヌクレオチドの長さ、850〜1000ヌクレオチドの長さ、900〜1200ヌクレオチドの長さ、1000〜1200ヌクレオチドの長さ、1000〜1500ヌクレオチドもしくは10〜1500ヌクレオチドの長さ、1500〜2000ヌクレオチドの長さ、1700〜2000ヌクレオチドの長さ、2000〜2300ヌクレオチドの長さ、2200〜2500ヌクレオチドの長さ、2500〜3000ヌクレオチドの長さ、3000〜3200ヌクレオチドの長さ、3000〜3500ヌクレオチドの長さ、3200〜3600ヌクレオチドの長さ、3300〜3800ヌクレオチドの長さ、4000ヌクレオチド〜4400ヌクレオチドの長さ、4200〜4700ヌクレオチドの長さ、4800〜5000ヌクレオチドの長さ、5000〜5200ヌクレオチドの長さ、5200〜5500ヌクレオチドの長さ、5500〜5800ヌクレオチドの長さ、5800〜6000ヌクレオチドの長さ、6000〜6400ヌクレオチドの長さ、6200〜6800ヌクレオチドの長さ、6600〜7000ヌクレオチドの長さ、7000〜7200ヌクレオチドの長さ、7200〜7500ヌクレオチドの長さ、又は7500ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、5〜10アミノ酸長、10〜25アミノ酸長、25〜50アミノ酸長、50〜100アミノ酸長、100〜150アミノ酸長、150〜200アミノ酸長、200〜250アミノ酸長、250〜300アミノ酸長、300〜400アミノ酸長、400〜500アミノ酸長、500〜750アミノ酸長、750〜1000アミノ酸長、1000〜1250アミノ酸長、1250〜1500アミノ酸長、1500〜1750アミノ酸長、1750〜2000アミノ酸長、2000〜2500アミノ酸長、又は2500を超えるもしくはそれ以上のアミノ酸長のペプチド又はポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、2500アミノ酸長を超えないポリペプチドをコードする。具体的な実施態様において、前記異種ORFは、終止コドンを含まない。ある実施態様において、前記異種ORFは、コドン最適化されている。ある実施態様において、ヌクレオチド組成物、ヌクレオチド対組成物、又は双方を、最適化することができる。そのような最適化のための技術は、当技術分野において公知であり、異種ORFの最適化に適用し得る。
任意のアレナウイルス以外の生物由来の異種ORFが、前記3分節型アレナウイルス粒子に含まれ得る。一実施態様において、前記異種ORFは、レポータータンパク質をコードする。レポータータンパク質のより詳細な説明は、セクション4.3に記載されている。別の実施態様において、前記異種ORFは、感染性の病原体の抗原又は任意の疾患に関連する抗原をコードしており、ここで、該抗原は、免疫応答を誘発することが可能である。具体的な実施態様において、前記抗原は、感染性の生物、腫瘍(すなわち、がん)、又はアレルゲン由来である。異種ORFに関するより詳細な説明は、セクション4.3に記載されている。
ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子の増殖及び感染力は、前記アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFにより影響されない。
当業者に公知の技術を用いて、アレナウイルスORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されたアレナウイルスゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子を生成させ得る。例えば、逆遺伝学的な技術を用いて、このようなアレナウイルス粒子を生じさせてもよい。他の実施態様において、前記複製欠損性アレナウイルス粒子(すなわち、アレナウイルスORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されたアレナウイルスゲノムセグメントであって、GP、NP、Zタンパク質、Lタンパク質をコードするORFが欠失している、前記アレナウイルスゲノムセグメント)は、補完細胞において生成させ得る。
ある実施態様において、本出願に従い用いる3分節型アレナウイルス粒子は、旧世界ウイルス、例えば、LCMVとすることができる。
ある実施態様において、本出願は、ワクチンとしての使用に適した本明細書に記載されるアレナウイルス粒子、並びにワクチン接種、並びに、例えば、感染症及びがんの治療又は予防においてこのようなアレナウイルス粒子を使用する方法に関する。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、セクション4.6に提供されている。
ある実施態様において、本出願は、医薬組成物としての使用に適した本明細書に記載されるアレナウイルス粒子、及びワクチン接種、並びに、例えば、感染症又はがんの治療又は予防において、このようなアレナウイルス粒子を使用する方法に関する。本明細書に記載されるアレナウイルス粒子を使用する方法のより詳細な説明は、セクション4.6に提供されている。
(4.3 異種ORFを発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子)
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント、及びそれぞれのアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、異種ORFを含み得る。他の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント及びそれぞれのアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、目的遺伝子を含み得る。より具体的な実施態様において、前記異種ORF又は前記目的遺伝子は、抗原をコードする。より具体的な実施態様において、前記異種ORF、又は前記目的遺伝子は、レポータータンパク質又は蛍光タンパク質をコードする。
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、1つ以上の異種ORF又は1つ以上の目的遺伝子を含み得る。他の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、少なくとも1つの異種ORF、少なくとも2つの異種ORF、少なくとも３つの異種ORF、又はそれを超える異種ORFを含み得る。他の実施態様において、前記アレナウイルス粒子又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、少なくとも1つの目的遺伝子、少なくとも2つの目的遺伝子、少なくとも３つの目的遺伝子、又はそれを超える目的遺伝子を含む。
本出願のアレナウイルスゲノムセグメント、アレナウイルス粒子、又は3分節型アレナウイルス粒子により、多様な抗原を発現させ得る。一実施態様において、前記異種ORFは、免疫応答を誘発することが可能な、感染性の病原体の抗原又は任意の疾患に関連する抗原をコードする。ある実施態様において、前記異種ORFは、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物由来の抗原をコードし得るか、又は腫瘍もしくは腫瘍関連疾患(すなわち、がん)、自己免疫疾患、変性疾患、遺伝性疾患、物質依存症、肥満症、又はアレルギー性疾患において発現され得る。
いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、ウイルス抗原をコードする。ウイルス抗原の非限定的な例としては、アデノウイルス科(adenoviridae)(例えば、マストアデノウイルス及びアビアデノウイルス)、ヘルペスウイルス科(herpesviridae)(例えば、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、単純ヘルペスウイルス5、単純ヘルペスウイルス6、エプスタイン・バーウイルス、HHV6-HHV8、及びサイトメガロウイルス)、レビウイルス科(leviviridae)(例えば、レビウイルス、腸内細菌フェーズMS2、アロレビウイルス)、ポックスウイルス科(poxyiridae)(例えば、脊椎動物ポックスウイルス亜科(chordopoxyirinae)、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、及び昆虫ポックスウイルス亜科(entomopoxyirinae))、パポバウイルス科(例えば、ポリオーマウイルス及びパピローマウイルス)、パラミクソウイルス科(paramyxoviridae)(例えば、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス1、モビリウイルス(mobillivirus)(例えば、麻疹ウイルス)、ルブラウイルス(例えば、ムンプスウイルス)、ニューモノウイルス亜科(pneumonovirinae)(例えば、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス)、ヒト呼吸器合胞体ウイルス及びメタニューモウイルス(例えば、トリニューモウイルス及びヒトメタニューモウイルス)、ピコルナウイルス科(pneumonovirinae)(例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス(例えば、ヒトA型肝炎ウイルス)、カルジオウイルス、及びアプトウイルス(apthovirus))、レオウイルス科(reoviridae)(例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、フィトレオウイルス、及びオリザウイルス)、レトロウイルス科(retroviridae)(例えば、哺乳類B型レトロウイルス、哺乳類C型レトロウイルス、鳥類C型レトロウイルス、D型レトロウイルス群、BLV-HTLVレトロウイルス、レンチウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1及びHIV-2(例えば、HIV gp160)、スプーマウイルス)、フラビウイルス科(flaviviridae)(例えば、C型肝炎ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス)、ヘパドナウイルス科(hepadnaviridae)(例えば、B型肝炎ウイルス)、トガウイルス科(togaviridae)(例えば、アルファウイルス(例えば、シンドビスウイルス)及びルビウイルス(例えば、風疹ウイルス))、ラブドウイルス科(rhabdoviridae)(例えば、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス、及びネクレオラブドウイルス(necleorhabdovirus))、アレナウイルス科(例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピーウイルス(Ippy virus)、及びラッサウイルス)、並びにコロナウイルス科(例えば、コロナウイルス及びトロウイルス)由来の抗原が挙げられる。具体的な実施態様において、前記ウイルス抗原は、HIV gp120、gp41、HIV Nef、RSV F糖タンパク質、RSV G糖タンパク質、HTLV tax、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(例えば、gB、gC、gD、及びgE)、又はB型肝炎表面抗原、C型肝炎ウイルスEタンパク質、又はコロナウイルススパイクタンパク質である。一実施態様において、前記ウイルス抗原は、HIV抗原ではない。
他の実施態様において、前記異種ORFは、細菌抗原(例えば、細菌のコートタンパク質)をコードする。他の実施態様において、前記異種ORFは、寄生生物の抗原(例えば、原虫の抗原)をコードする。さらに他の実施態様において、異種のヌクレオチド配列は、真菌抗原をコードする。
細菌抗原の非限定的な例としては、アクアスピリルム科(Aquaspirillum family)、アゾスピリルム科(Azospirillum family)、アゾトバクター科(Azotobacteraceae family)、バクテロイデス科(Bacteroidaceae family)、バルトネラ種(Bartonella species)、ブデロビブリオ科(Bdellovibrio family)、カンピロバクター属(Campylobacter species)、クラミジア属(Chlamydia species)(例えば、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae))、クロストリジウム(clostridium)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae family)(例えば、シトロバクター種(Citrobacter species)、エドワージエラ(Edwardsiella)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンヴィニア種(Envinia species)、大腸菌(Escherichia coli)、ハフニア種(Hafnia species)、クレブシエラ種(Klebsiella species)、モルガネラ種(Morganella species)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、プロビデンシア (Providencia)、サルモネラ種(Salmonella species)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、及びシゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri))、ガルジネラ科(Gardinella family)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ハロバクテリウム科(Halobacteriaceae family)、ヘリコバクター科(Helicobacter family)、レジオナラセア科(Legionallaceae family)、リステリア種(Listeria species)、メチロコッカス科(Methylococcaceae family)、マイコバクテリア(mycobacteria)(例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis))、ナイセリア科(Neisseriaceae family)、オケアノスピリルム科(Oceanospirillum family)、パスツレラ科(Pasteurellaceae family)、肺炎レンサ球菌種(Pneumococcus species)、シュードモナス種(Pseudomonas species)、リゾビウム科(Rhizobiaceae family)、スピリルム科(Spirillum family)、スピロソマセア科(Spirosomaceae family)、ブドウ球菌(Staphylococcus)(例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus)及び化膿レンサ球菌(Streptococcus pyrogenes)、レンサ球菌(Streptococcus)(例えば、レンサ球菌エンテリティディス(Streptococcus enteritidis)、レンサ球菌フェーシエ(Streptococcus fasciae)、及び肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae))、バンピロビブルヘリコバクター科(Vampirovibr Helicobacter family)、エルシニア科、炭疽菌(Bacillus antracis)及びバンピロビブリオ科の細菌由来の抗原が挙げられる。
寄生生物抗原の非限定的な例としては、アメーバ、マラリア寄生虫、プラスモディウム(Plasmodium)、クルーズ・トリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)などの寄生生物由来の抗原が挙げられる。真菌抗原の非限定的な例としては、アブシディア種(Absidia species)(例えば、アブシディア・コリムビフェラ(Absidia corymbifera)及びアブシディア・ラモサ(Absidia ramosa))、アスペルギルス種(Aspergillus species)、(例えば、アスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、及びアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus))、バシジオボラス・ラナルム(Basidiobolus ranarum)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、カンジダ種(Candida species)(例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・ケルン(Candida kern)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・パラプローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダ・キリエルモンディ(Candida quillermondii)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、カンジダ・ステラトイデア(Candida stellatoidea)、及びカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis))、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、コニディオボルス種(Conidiobolus species)、クリプトコッカス・ネオフォルムス(Cryptococcus neoforms)、クンニングアメラ種(Cunninghamella species)、皮膚糸状菌、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、ミクロスポルム・ギプセウム(Microsporum gypseum)、ムコール・プシルス(Mucor pusillus)、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、シュードアレシェリア・ボイジイ(Pseudallescheria boydii)、リノスポリジウム・セーベリ(Rhinosporidium seeberi)、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、リゾプス種(Rhizopus species)(例えば、リゾプス・アリズス(Rhizopus arrhizus)、リゾプス・オリザエ(Rhizopus oryzae)及びリゾプス・ミクロスポラス(Rhizopus microsporus))、サッカロマイセス種(Saccharomyces species)、スポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix schenckii)、接合菌類、並びに接合菌、子嚢菌、担子菌、不完全菌、及び卵菌などの綱などの真菌由来の抗原が挙げられる。
いくつかの実施態様において、異種ORFは、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原をコードする。いくつかの実施態様において、前記腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、小児副腎皮質癌、AIDS関連がん、カポジ肉腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、異型テラトイド／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、肝臓外の(胆管細胞癌を参照されたい)、膀胱がん、骨の骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳がん、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫/悪性神経膠腫脳腫瘍、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、カルチノイド胃腸腫瘍、原発不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、原発性、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫/悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児がん、慢性気管支炎、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性の障害、結腸がん、皮膚のT細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、肺気腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍のユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝外胆管癌、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃(gastric)(胃(stomach))がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸ストローマ腫瘍、胚細胞性腫瘍:頭蓋外の、性腺外の、又は卵巣の妊娠性絨毛性腫瘍、脳幹の神経膠腫、神経膠腫、小児大脳星細胞腫、小児視覚路及び視床下部の、胃カルチノイド、ヘアリー細胞白血病、頭部及び頚部がん、心臓がん、肝細胞がん(肝臓がん)、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部及び視覚路神経膠腫、眼球内黒色腫、島細胞癌(膵内分泌部)、カポジ肉腫、腎臓がん(腎細胞がん)、喉頭がん、急性リンパ芽球性リンパ腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、口唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん(原発性)、肺がん、非小細胞、小細胞性、AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、原発性中枢神経系、マクログロブリン血症、ワルデンストレーム、男性乳がん、骨/骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、メラノーマ、眼球内(眼)、メルケル細胞がん、中皮腫、成人悪性、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性、骨髄性白血病、成人急性、骨髄性白血病、小児急性、骨髄腫、多発性(骨髄のがん)、骨髄増殖性の障害、慢性、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭癌、神経芽腫、非小細胞肺がん、乏突起神経膠腫、口腔がん、中咽頭がん、骨の骨肉腫/悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん(表面上皮ストローマ腫瘍)、卵巣の胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、島細胞、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞新形成/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌(腎臓がん)、腎盂及び尿管、移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児、唾液腺がん、肉腫、ユーイングファミリーの腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん(非黒色腫性)、皮膚がん(黒色腫性)、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌−皮膚がん(非黒色腫性)を参照、原発不明の扁平上皮頚部がん、転移性、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、T細胞リンパ腫、皮膚−菌状息肉症及びセザリー症候群を参照、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺がん、腎盂及び尿管の小児移行上皮がん、妊娠性絨毛性腫瘍、原発部位不明、成人の癌腫、原発部位不明、小児のがん、尿管及び腎盂、移行上皮がん、尿道がん(rethral cancer)、子宮がん、子宮内膜の子宮肉腫、気管支腫瘍、中枢神経系胚芽腫;小児脊索腫、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、ランゲルハンス細胞組織球症、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病(成人/小児)、小細胞肺がん、髄様上皮腫、口腔がん、乳頭腫、中分化型の松果体実質腫瘍、下垂体腫瘍、染色体15上のNUT遺伝子が関与する気道癌、脊髄腫瘍、胸腺腫、甲状腺がん、膣がん;外陰がん、及びウィルムス腫瘍
を含む腫瘍関連疾患由来の抗原を含む。
腫瘍又は腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1A1、BCLX (L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レンシン（Lengsin)、M-CSF、MCSP、mdm-2、メロエ(Meloe)、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン(secernin)1、SOX10、STEAP1、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、又はWT1、EGF-R、CEA、CD52、gp 100タンパク質、MELANA/MART1、NY-ESO-1、p53 MAGE1、MAGE3、及びCDK4、アルファ-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARalpha融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1又は-SSX2融合タンパク質、TGF-ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、レンシン（Lengsin)、M-CSF、MCSP、又はmdm-2が挙げられる。
いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、呼吸器の病原体抗原をコードする。具体的な実施態様において、前記呼吸器の病原体は、RSV、コロナウイルス、ヒトメタニューモウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、又はPRRSVなどのウイルスである。呼吸器のウイルス抗原の非限定的な例としては、呼吸器合胞体ウイルスF、G、及びM2タンパク質、コロナウイルス(SARS、HuCoV)スパイクタンパク質(S)、ヒトメタニューモウイルス融合タンパク質、パラインフルエンザウイルス融合及びヘマグルチニンタンパク質(F、HN)、ヘンドラウイルス(HeV)及びニパウイルス(NiV)付着糖タンパク質(G及びF)、アデノウイルスカプシドタンパク質、ライノウイルスタンパク質、及びPRRSV野生型又は改変型GP5及びMタンパク質が挙げられる。
具体的な実施態様において、前記呼吸器の病原体は、炭疽菌、結核菌、百日咳菌(Bordetella pertussis)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、ペスト菌(Yersinia pestis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、野兎病菌(Francisella tularensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、及びインフルエンザ菌などの細菌である。呼吸器の細菌抗原の非限定的な例としては、炭疽菌感染防御抗原PA、結核菌マイコバクテリア抗原85A及び熱ショックタンパク質(Hsp65)、百日咳菌百日咳トキソイド(PT)及び繊維状ヘマグルチニン(FHA)、肺炎レンサ球菌ソルターゼ(sortase)A及び表面アドヘシンA(PsaA)、ペスト菌F1及びVサブユニット、並びに黄色ブドウ球菌、野兎病菌、レジオネラ・ニューモフィラ、肺炎クラミジア、緑膿菌、髄膜炎菌、及びインフルエンザ菌由来のタンパク質が挙げられる。
いくつかの実施態様において、前記異種ORFは、T細胞エピトープをコードする。他の実施態様において、前記異種ORFは、サイトカイン又は増殖因子をコードする。
他の実施態様において、前記異種ORFは、自己免疫疾患において発現される抗原をコードする。より具体的な実施態様において、前記自己免疫疾患は、I型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、紅斑性狼瘡(lupus erythmatosus)、及び乾癬であり得る。自己免疫疾患抗原の非限定的な例としては、Ro60、dsDNA、又はRNPが挙げられる。
他の実施態様において、ORFは、アレルギー性疾患において発現される抗原をコードする。より具体的な実施態様において、前記アレルギー性疾患は、季節性及び通年性の鼻炎結膜炎、喘息、及び湿疹を含み得るが、これらに限定されない。アレルギー抗原の非限定的な例としては、Bet v 1及びFel d 1が挙げられる。
他の実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、レポータータンパク質をさらに含む。該レポータータンパク質は、本明細書に記載される抗原と同時に発現し得る。理想的には、発現は、通常光又は他の波長の光で可視のものである。ある実施態様において、レポータータンパク質により引き起こされる作用の強度を使用して、前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を直接的に測定及びモニターし得る。
レポーター遺伝子は、当業者に容易に認識されるであろう。ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、蛍光タンパク質である。他の実施態様において、前記レポーター遺伝子は、GFPである。GFPは、UV又は青色光に曝されると、明るい緑色光を発する。
レポータータンパク質の非限定的な例としては、これらに限定されないが、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、又はRFPなどの種々の酵素が挙げられる。
ある実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、ワクチン接種用ベクターとしての使用に望ましい性質を有している(例えば、セクション4.6を参照されたい)。別の実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、宿主(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒト)において、免疫応答を誘導可能である。他の実施態様において、本明細書に記載される異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、自然免疫応答を誘導する。他の実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、適応免疫応答を誘導する。より具体的な実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、自然免疫応答及び適応免疫応答の双方を誘導する。
別の実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、T細胞応答を誘導する。さらにより具体的な実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は3分節型アレナウイルス粒子は、CD8+T細胞応答を誘導する。他の実施態様において、外来性の目的遺伝子を保持している前記アレナウイルス粒子は、高い頻度と機能性の強力なCD8+T細胞応答を誘導する。他の実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、対応する外来性の目的遺伝子の1又は複数のエピトープに特異的なCD8+T細胞を誘導する。
ある実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、Tヘルパー1分化、CD4+T細胞の記憶形成を誘導することができ、かつ/又は長続きする抗体応答を誘発する。これらの抗体は、腫瘍細胞に対し中和性、オプソニン化性、有毒であり得るか、又は他の好ましい生物学的特徴を有する。他の実施態様において、異種ORFを発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は3分節型アレナウイルス粒子は、樹状細胞に対する強いトロピズムを有し、感染するとそれらを活性化する。このことは、抗原提示細胞による該抗原の提示を増強する。
ある実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現する前記アレナウイルスゲノムセグメント、前記アレナウイルス粒子、又は前記3分節型アレナウイルス粒子は、LCMVに対する低い又は検出不能な中和抗体力価、及びそれぞれの外来性導入遺伝子に対する高度な保護的な中和抗体応答を誘導する。いくつかの実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現する前記粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を形成しているアレナウイルス骨格は、アレナウイルスの骨格成分に対する免疫を誘導する低い能力を有している。
(4.4 アレナウイルス粒子及び3分節型アレナウイルス粒子の産生)
一般に、アレナウイルス粒子は、LCMVに対して説明されているような標準的な逆遺伝学的な技術により組換えで生成させることができる(引用により本明細書に組み込まれているFlatzらの文献、2006、Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668;Sanchezらの文献、2006、Virology 350:370;Ortiz-Rianoらの文献、2013、J Gen Virol. 94:1175-88を参照されたい)。本明細書において提供されるアレナウイルス粒子を産生させるために、これらの技術を以下に示されるように適用し得る。ウイルスのゲノムは、セクション4.1及びセクション4.2にそれぞれ記載されるように改変し得る。
(4.4.1 非天然位置オープンリーディングフレーム)
ウイルスのORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているゲノムセグメントを含むアレナウイルス粒子の産生は、当業者に公知の任意の逆遺伝学的な技術により組換えで生成させ得る。
((i)感染性かつ複製可能なアレナウイルス粒子))
ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子を産生させる方法は、(i)前記第一のアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;(ii)前記第二のアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;(iii)アレナウイルスの最低限のトランス作用因子NP及びLを発現するプラスミドを、宿主細胞にトランスフェクトすること;(iv)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び(v)該アレナウイルス粒子を回収すること、を含む。より具体的なある実施態様において、前記cDNAは、プラスミドに含まれている。
ひとたびcDNAから産生されれば、アレナウイルス粒子(すなわち、感染性かつ複製可能なもの)は、増殖可能である。ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、本明細書に記載されるような該ウイルスの使用が可能となる力価まで、該ウイルスが増殖することを可能とする任意の宿主細胞において増殖可能である。一実施態様において、前記宿主細胞は、前記アレナウイルス粒子が、対応する野生型に対して決定された力価と同程度の力価まで増殖することを可能とする。
ある実施態様において、前記アレナウイルス粒子を、宿主細胞において増殖させてもよい。使用し得る宿主細胞の具体例としては、BHK-21、HEK 293、VERO等が挙げられる。具体的な実施態様において、前記アレナウイルス粒子は、細胞株において増殖させてもよい。
ある実施態様において、前記宿主細胞は、培養物中に維持されて、1つ以上のプラスミドでトランスフェクトされる。該プラスミド(複数可)は、例えば、ポリメラーゼIプロモーター及びターミネーターからなる、哺乳動物細胞における発現に適した1つ以上の発現カセットの制御下で産生されることとなる前記アレナウイルスゲノムセグメント(複数可)を発現する。
前記アレナウイルス粒子の産生に使用し得るプラスミドは:i)Sゲノムセグメントをコードするプラスミド、例えば、pol-I S、ii)Lゲノムセグメントをコードするプラスミド、例えば、pol-I Lを含み得る。ある実施態様において、ウイルスのL及びSセグメントの細胞内合成を方向づけるアレナウイルスポリメラーゼをコードするプラスミドを、トランスフェクション混合物に組み込み得る。例えば、Lタンパク質をコードするプラスミド及び/又はNPをコードするプラスミド(それぞれ、pC-L及びpC-NP)が存在し得る。Lタンパク質及びNPは、ウイルスRNAの転写及び複製に必要な最低限のトランス作用因子である。あるいは、それぞれ、反対側からL及びSセグメント内へと2つの別々のプラスミドのcDNAを読み取るpol-I及びpol-IIプロモーターを有する発現カセットを用いて、NP及びLタンパク質と一緒に、ウイルスのL及びSセグメントの細胞内合成を行い得る。
ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントは、プロモーターの制御下にある。典型的には、RNAポリメラーゼI駆動型発現カセット、RNAポリメラーゼII駆動型カセット、又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ駆動型カセットを使用し得る。ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントをコードするプラスミド(複数可)は、同一のものとすることができ、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、1つのプラスミド由来のプロモーターにより転写され得る。プロモーターの具体例としては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、又はT3プロモーターが挙げられる。
加えて、前記プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における遺伝子発現に適した発現カセット、例えば、上述のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下の、哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とし得るか、又はウイルスの遺伝子転写産物(複数可)に、脳心筋炎ウイルスのものなどの配列内リボソーム進入部位が続き、それに、哺乳動物の耐性マーカーが続く。大腸菌における生成のためには、前記プラスミドは、加えて、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
プラスミド(複数可)での宿主細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール又は電気穿孔法などのよく使用される戦略のうちの任意のものを用いて行い得る。数日後に、適当な選択試薬、例えば、ピューロマイシンを、用量設定濃度で加える。標準的な手順に従い生存クローンを単離し、サブクローニングして、高発現クローンを、目的とするウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体を用いたウエスタンブロット又はフローサイトメトリー手順を用いて特定する。
本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の回収には、以下の手順が想定される。初日:細胞、典型的にはM6ウェルプレート中80％コンフルエントのものを上記したようにプラスミドの混合物でトランスフェクトする。これには、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール、又は電気穿孔法などの任意のよく使用される戦略を活用し得る。
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を回収し、分割し、使用前に該アレナウイルスベクターをどのくらいの期間保管すべきかに応じて4℃、-20℃、又は-80℃で保管する。アレナウイルスベクター調製物の感染力価は、イムノフォーカスアッセイにより評価される。あるいは、トランスフェクション後3〜5日目に、前記トランスフェクトされた細胞及び上清を、より大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)へ継代培養してもよく、培養上清を、継代後5日目まで回収する。
本出願は、更に、異種ORFの発現に関し、ここで、ゲノムセグメントをコードするプラスミドが、異種ORFを組み込むように改変されている。該異種ORFは、制限酵素を用いて該プラスミドに組み込むことができる。
((ii)感染性複製欠損性アレナウイルス粒子)
感染性複製欠損性アレナウイルス粒子は、上記したように救出し得る。しかしながら、ひとたびcDNAから産生されれば、本明細書において提供される感染性の複製欠損性アレナウイルスは、補完細胞において増殖可能である。補完細胞は、そのゲノムの改変により該複製欠損性アレナウイルスから除去されている機能性を提供する細胞である(例えば、GPタンパク質をコードするORFが、欠失しているか又は機能的に不活性化されている場合、補完細胞は、まさにそのGPタンパク質を提供する)。
アレナウイルスベクターにおけるORFのうちの1つ以上の除去又は機能的不活性化のために(ここでは、糖タンパク質GPの欠失を一例として挙げる)、アレナウイルスベクターを、欠失したウイルス遺伝子(複数可)、例えば、本例におけるGPをイントランス(in trans)で提供する細胞において、産生させて増殖させ得る。このような補完細胞株(以下C-細胞と称する)は、BHK-21、HEK 293、VEROなどの細胞株を、目的ウイルス遺伝子(複数可)の発現のための1つ以上のプラスミド(相補性プラスミド、C-プラスミドと称する)でトランスフェクトすることにより作製される。該C-プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における発現に適した1つ以上の発現カセット、例えば、ポリアデニル化シグナルを伴うEF1アルファプロモーターなどの哺乳動物のポリメラーゼIIプロモーターの制御下で作製されることとなる、アレナウイルスベクターにおいて欠失しているウイルス遺伝子(複数可)を発現する。加えて、相補性プラスミドは、哺乳動物細胞における遺伝子発現に適した発現カセット、例えば、上述のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下の哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とするか、又はウイルスの遺伝子転写産物(複数可)に、脳心筋炎ウイルスのものなどの配列内リボソーム進入部位が続き、哺乳動物の耐性マーカーがそれに続く。大腸菌における生成のためには、前記プラスミドは、加えて、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
使用し得る細胞、例えば、BHK-21、HEK 293、MC57Gなどは、培養液中に維持されて、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール、又は電気穿孔法などのよく使用される戦略のうちの任意のものを用いて、相補性プラスミド(複数可)でトランスフェクトされる。数日後に、適当な選択試薬、例えば、ピューロマイシンを、用量設定濃度で加える。生存クローンを単離して、標準的な手順に従いサブクローニングし、高発現のC-細胞クローンを、目的のウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体を用いたウエスタンブロット又はフローサイトメトリー手順を用いて特定する。安定にトランスフェクトされるC-細胞の使用の代わりに、正常細胞の一過性トランスフェクションが、以下ではC-細胞が使用されることとなる各ステップにおいて欠損しているウイルス遺伝子(複数可)を補完することができる。加えて、ヘルパーウイルスを使用して、欠損している機能性をイントランスで提供し得る。
プラスミドは、以下の2つの種類のものとすることができる:i)C-細胞内で、アレナウイルスの最低限のトランス作用因子を細胞内発現するためのTF-プラスミドと称する2つのプラスミドであって、例えば、本例におけるLCMVのNP及びLタンパク質由来であるプラスミド;及びii)C-細胞内で、アレナウイルスベクターゲノムセグメント、例えば、設計された改変を有するセグメントを細胞内発現するためのGS-プラスミドと称するプラスミド。TF-プラスミドは、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現に適した発現カセット、典型的には、例えば、優先的には、どちらもポリアデニル化シグナルと組み合わせたCMV又はEF1アルファプロモーターなどの哺乳動物のポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、それぞれのアレナウイルスベクターのNP及びLタンパク質を発現する。GS-プラスミドは、ベクターの小さい(S)及び大きい(L)ゲノムセグメントを発現する。典型的には、ポリメラーゼI駆動型発現カセット又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ(T7-)駆動型発現カセットを使用することができ、後者は、優先的には、一次転写産物をプロセッシングして、正常な末端(correct end)をもたらすための3’-末端リボザイムを有する。T7-ベースの系を使用する場合には、C-細胞内でのT7の発現は、回収プロセスに、TF-プラスミドに類似して構築されたT7を提供する追加の発現プラスミドを含めることのいずれかにより提供されなければならないか、又はC-細胞が、T7を安定に追加発現するように構築される。ある実施態様において、TF及びGSプラスミドは、同一のものとすることができ、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子は、1つのプラスミドからT7、polI、及びpolIIプロモーターにより転写され得る。
アレナウイルスベクターの回収のためには、以下の手順を使用し得る。初日:C-細胞、典型的には、M6ウェルプレート中80％コンフルエントのものを、前記２つのTF-プラスミドと前記2つのGS-プラスミドとの混合物でトランスフェクトする。ある実施態様において、前記TF及びGSプラスミドは、同一のものとすることができ、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子が、1つのプラスミドからT7、polI、及びpolIIプロモーターにより転写され得る。これには、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール、又は電気穿孔法などのよく使用される戦略のうちの任意のものを活用し得る。
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を回収し、分割し、該アレナウイルスベクターを使用前にどのくらいの期間保管すべきかに応じて4℃、-20℃、又は-80℃で保管する。その後、該アレナウイルスベクター調製物の感染力価を、C-細胞においてイムノフォーカスアッセイにより評価する。あるいは、前記トランスフェクトされた細胞及び上清を、トランスフェクション後3〜5日目により大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)に継代培養してもよく、培養上清を、継代後5日目まで回収する。
本発明は更に、抗原を発現する感染性の複製欠損性アレナウイルスに感染している細胞培養物における抗原の発現に関する。培養された細胞における抗原の発現に用いられる場合、以下の2つの手順を使用し得る:
i)目的とする細胞型を、感染の直ぐ後にすでに全ての細胞において抗原の生成をもたらすこととなる1以上の、例えば、2、3、または4の感染多重度(MOI)で、本明細書に記載されるアレナウイルスベクター調製物に感染させる。
ii)あるいは、より低いMOIを使用することができ、個々の細胞クローンを、ウイルス駆動型抗原発現のそれらのレベルについて選択し得る。アレナウイルスベクターの非細胞溶解性の性質のために、個々のクローンはその後無限に増殖し得る。アプローチにかかわらず、それに続き、生成される抗原の性質に応じて培養上清又は細胞自体のいずれかから、該抗原を回収(及び精製)し得る。しかしながら、本発明は、これら2つの戦略に限定されず、感染性の複製欠損性アレナウイルスをベクターとして用いる抗原の発現を駆動する他の方法を考慮に入れてもよい。
(4.4.2 3分節型アレナウイルス粒子の産生)
3分節型アレナウイルス粒子を、例えば、引用により本明細書に組み込まれているEmonetらの文献、2008、PNAS、106(9):3473-3478;Popkinらの文献、2011、J. Virol.、85 (15):7928-7932により記載されるような当技術分野において公知の逆遺伝学的な技術により組換えで生成させ得る。本明細書において提供される3分節型アレナウイルス粒子の産生は、セクション4.2に記載されるように改変し得る。
((i)感染性かつ複製可能な3分節型アレナウイルス粒子)
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子を含むベクターを産生させる方法は、(i)1つのLセグメント及び2つのSセグメント、又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントのcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;(ii)アレナウイルスの最低限のトランス作用因子NP及びLを発現するプラスミドを、宿主細胞にトランスフェクトすること;(iii)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び(iv)該アレナウイルス粒子を回収することを含む。
ひとたびcDNAから産生されれば、前記3分節型アレナウイルス粒子(すなわち、感染性かつ複製可能なもの)は、増殖可能である。ある実施態様において、3分節型アレナウイルス粒子は、本明細書に記載されるような該ウイルスの使用が可能となる力価まで、該ウイルスが増殖することを可能とする任意の宿主細胞において増殖可能である。一実施態様において、前記宿主細胞は、前記3分節型アレナウイルス粒子が、対応する野生型に対して決定された力価と同程度の力価まで増殖することを可能とする。
ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、宿主細胞において増殖させてもよい。使用し得る宿主細胞の具体例としては、BHK-21、HEK 293、VEROなどが挙げられる。具体的な実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子は、細胞株において増殖させてもよい。
ある実施態様において、前記宿主細胞は、培養物中に維持されて、1つ以上のプラスミドでトランスフェクトされる。該プラスミド(複数可)は、例えば、ポリメラーゼIプロモーター及びターミネーターからなる、哺乳動物細胞における発現に適した1つ以上の発現カセットの制御下で産生されることとなるアレナウイルスゲノムセグメント(複数可)を発現する。
具体的な実施態様において、前記宿主細胞は、培養物中に維持されて、1つ以上のプラスミドでトランスフェクトされる。該プラスミド(複数可)は、例えば、ポリメラーゼIプロモーター及びターミネーターからなる、哺乳動物細胞における発現に適した1つ以上の発現カセットの制御下で産生されることとなるウイルス遺伝子(複数可)を発現する。
前記1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルスを産生させるために使用し得るプラスミドとしては:i)それぞれがSゲノムセグメントをコードする2つのプラスミド、例えば、pol-I S、ii)Lゲノムセグメントをコードするプラスミド、例えば、pol-I Lを挙げることができる。前記2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルスに必要とされるプラスミドは、i)それぞれがLゲノムセグメントをコードする2つのプラスミド、例えば、pol-L、ii)Sゲノムセグメント、をコードするプラスミド、例えば、pol-I Sである。
ある実施態様において、ウイルスのL及びSセグメントの細胞内合成を方向づけるアレナウイルスポリメラーゼをコードするプラスミドを、トランスフェクション混合物に組み込み得る。例えば、Lタンパク質をコードするプラスミド及びNPをコードするプラスミド(それぞれ、pC-L及びpC-NP)である。Lタンパク質及びNPは、ウイルスRNAの転写及び複製に必要な最低限のトランス作用因子である。あるいは、それぞれ、反対側からL及びSセグメント内へと2つの別々のプラスミドのcDNAを読み取るpol-I及びpol-IIプロモーターを有する発現カセットを用いて、NP及びLタンパク質と一緒に、ウイルスのL及びSセグメントの細胞内合成を行い得る。
加えて、前記プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における遺伝子発現に適した発現カセット、例えば、上述のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下の哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とするか、又はウイルスの遺伝子転写産物(複数可)に脳心筋炎ウイルスのものなどの配列内リボソーム進入部位が続き、前記哺乳動物の耐性マーカーがそれに続く。大腸菌における生成のためには、前記プラスミドは、加えて、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
BHK-21細胞のプラスミド(複数可)でのトランスフェクションは、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール、又は電気穿孔法などのよく使用される戦略のうちの任意のものを用いて行い得る。数日後に、適当な選択試薬、例えば、ピューロマイシンを用量設定濃度で加える。生存クローンを単離して、標準的な手順に従いサブクローニングし、高発現クローンを、目的とするウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体を用いたウエスタンブロット又はフローサイトメトリー手順を用いて特定する。
典型的には、RNAポリメラーゼI駆動型発現カセット、RNAポリメラーゼII駆動型カセット、又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ駆動型カセットを使用し得る。後者は、優先的には、一次転写産物をプロセッシングして、正常な末端を生じさせるための3’-末端リボザイムを有する。ある実施態様において、前記アレナウイルスゲノムセグメントをコードする複数のプラスミドは、同一のものとすることができ、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子が、1つのプラスミドからT7、polI、及びpolIIプロモーターにより転写され得る。
前記アレナウイルス、前記3分節型アレナウイルスベクターを回収するために、以下の手順が想定される。初日:細胞、典型的には、M6ウェルプレート中80％コンフルエントのものを、上記したようにプラスミドの混合物でトランスフェクトする。これには、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール、又は電気穿孔法などの任意のよく使用される戦略を活用し得る。
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を回収し、分割し、使用前に該アレナウイルスベクターをどのくらいの期間保管すべきかに応じて、4℃、-20℃、又は-80℃で保管する。アレナウイルスベクター調製物の感染力価は、イムノフォーカス(immunofocus)アッセイにより評価される。あるいは、前記トランスフェクトされた細胞及び上清を、トランスフェクション後3〜5日目により大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)に継代培養してもよく、培養上清を、継代後5日目まで回収する。
本出願は更に、異種ORF及び/又は目的遺伝子の発現に関し、ここで、ゲノムセグメントをコードするプラスミドが、異種ORF及び/又は目的遺伝子を組み込むよう改変されている。該異種ORF及び/又は目的遺伝子は、制限酵素を用いて該プラスミドに組み込むことができる。
((ii)感染性複製欠損性3分節型アレナウイルス粒子)
感染性複製欠損性3分節型アレナウイルス粒子は、上記したように救出し得る。しかしながら、ひとたびcDNAから産生されれば、本明細書において提供される感染性の複製欠損性アレナウイルスは、補完細胞において増殖可能である。補完細胞は、そのゲノムの改変により該複製欠損性アレナウイルスから除去されている機能性を提供する細胞である(例えば、GPタンパク質をコードするORFが欠失しているか又は機能的に不活性化されている場合には、補完細胞は、まさにそのGPタンパク質を提供する)。
アレナウイルスベクターにおけるORFのうちの1つ以上の除去又は機能的不活性化のために(ここで、糖タンパク質GPの欠失を一例として挙げる)、アレナウイルスベクターを、該欠失したウイルス遺伝子(複数可)、例えば、本例におけるGPをイントランスで提供する細胞において産生させて増殖させ得る。このような補完細胞株は、以下C-細胞と称され、BHK-21、HEK 293、VERO(ここで、BHK-21を一例として挙げる)などの哺乳動物細胞株を、目的ウイルス遺伝子(複数可)の発現のための1つ以上のプラスミド(相補性プラスミド、C-プラスミドと称する)でトランスフェクトすることにより産生される。該C-プラスミド(複数可)は、哺乳動物細胞における発現に適した1つ以上の発現カセット、例えば、ポリアデニル化シグナルを伴うCMV又はEF1アルファプロモーターなどの哺乳動物のポリメラーゼIIプロモーターの制御下で作製されることとなる、アレナウイルスベクターにおいて欠失しているウイルス遺伝子(複数可)を発現する。加えて、前記相補性プラスミドは、哺乳動物細胞における遺伝子発現に適した発現カセット、例えば、上述のようなポリメラーゼII発現カセットの制御下の哺乳動物選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性を特徴とするか、又は前記ウイルスの遺伝子転写産物(複数可)に、脳心筋炎ウイルスのものなどの配列内リボソーム進入部位が続き、前記哺乳動物の耐性マーカーがそれに続く。大腸菌における生成のためには、前記プラスミドは、加えて、アンピシリン耐性カセットなどの細菌選択マーカーを特徴とする。
使用し得る細胞、例えば、BHK-21、HEK 293、MC57Gなどは、培養液中に維持されて、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール、又は電気穿孔法などのよく使用される戦略のうちの任意のものを用いて相補性プラスミド(複数可)でトランスフェクトされる。数日後に、適当な選択試薬、例えば、ピューロマイシンを用量設定濃度で加える。生存クローンを単離して、標準的な手順に従いサブクローニングし、高発現のC-細胞クローンを、目的とするウイルスタンパク質(複数可)に対する抗体を用いたウエスタンブロット又はフローサイトメトリー手順を用いて特定する。安定にトランスフェクトされるC-細胞の使用の代わりに、正常細胞の一過性トランスフェクションが、以下ではC-細胞が使用されることとなる各ステップにおいて欠損しているウイルス遺伝子(複数可)を補完することができる。加えて、ヘルパーウイルスを使用して、欠損している機能性をイントランスで提供し得る。
2つの種類のプラスミド:i)C-細胞内で、アレナウイルスの最低限のトランス作用因子を細胞内発現するためのTF-プラスミドと称する2つのプラスミドであって、例えば、本例におけるLCMVのNP及びLタンパク質由来であるプラスミド;及びii)C-細胞内で、前記アレナウイルスベクターゲノムセグメント、例えば、設計された改変を有するセグメントを細胞内発現するためのGS-プラスミドと称するプラスミドを使用し得る。TF-プラスミドは、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現に適した発現カセット、典型的には、例えば、優先的には、どちらもポリアデニル化シグナルと組み合わせたCMV又はEF1アルファプロモーターなどの哺乳動物のポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、それぞれのアレナウイルスベクターのNP及びLタンパク質を発現する。GS-プラスミドは、ベクターの小さい(S)ゲノムセグメント及び大きい(L)ゲノムセグメントを発現する。典型的には、ポリメラーゼI駆動型発現カセット又はT7バクテリオファージRNAポリメラーゼ(T7-)駆動型発現カセットを使用し得る。後者は、優先的には、一次転写産物をプロセッシングして、正常な末端を生じさせるための3’-末端リボザイムを有する。T7-ベースの系を用いる場合には、C-細胞内でのT7の発現は、回収プロセスにおいて、TF-プラスミドに類似して構築されたT7を提供する追加の発現プラスミドを含めることのいずれかにより提供されなければならないか、又はC-細胞が、安定にT7を更に発現するように構築される。ある実施態様において、TF及びGSプラスミドは、同一のものとすることができ、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子が、1つのプラスミドからT7、polI、及びpolIIプロモーターにより転写され得る。
アレナウイルスベクターの回収のためには、以下の手順を使用し得る。初日:C-細胞、典型的には、M6ウェルプレート中80％コンフルエントのものを、前記２つのTF-プラスミドと前記2つのGS-プラスミドとの混合物でトランスフェクトする。ある実施態様において、前記TF及びGSプラスミドは、同一のものとすることができ、すなわち、ゲノム配列及びトランス作用因子が、1つのプラスミドからT7、polI、及びpolIIプロモーターにより転写され得る。これには、リン酸カルシウム、リポソームベースのプロトコール、又は電気穿孔法などのよく使用される戦略のうちの任意のものを活用し得る。
3〜5日後:培養上清(アレナウイルスベクター調製物)を回収し、分割し、該アレナウイルスベクターを使用前にどのくらいの期間保管すべきかに応じて4℃、-20℃、又は-80℃で保管する。その後、該アレナウイルスベクター調製物の感染力価を、C-細胞でのイムノフォーカスアッセイにより評価する。あるいは、前記トランスフェクトされた細胞及び上清を、トランスフェクション後3〜5日目により大きな容器(例えば、T75組織培養フラスコ)に継代培養してもよく、培養上清を、継代後5日目まで回収する。
本発明は更に、抗原を発現する感染性の複製欠損性3分節型アレナウイルスに感染している細胞培養物における抗原の発現に関する。培養された細胞におけるCMV抗原の発現に用いられる場合、以下の2つの手順を使用し得る:
i)目的とする細胞型を、感染の直ぐ後にすでに全ての細胞における抗原の生成をもたらす1以上の、例えば、2、3、または4の感染多重度(MOI)で、本明細書に記載されるアレナウイルスベクター調製物に感染させる。
ii)あるいは、より低いMOIを使用することができ、個々の細胞クローンを、それらのウイルス駆動型抗原発現のレベルについて選択し得る。アレナウイルスベクターの非細胞溶解性の性質のために、個々のクローンはその後無限に増殖し得る。アプローチにかかわらず、それに続き、生成される抗原の性質に応じて培養上清又は細胞自体のいずれかから、該抗原を回収(及び精製)し得る。しかしながら、本発明は、これら2つの戦略に限定されず、感染性の複製欠損性アレナウイルスをベクターとして用いるCMV抗原の発現を駆動する他の方法を考慮に入れてもよい。
(4.5 核酸、ベクター系、及び細胞株)
ある実施態様において、セクション4.1及びセクション4.2にそれぞれ記載されるようなアレナウイルスゲノムセグメント又は3分節型アレナウイルス粒子を含むか、又はこれからなるcDNAが、本明細書において提供される。
(4.5.1 非天然位置オープンリーディングフレーム)
一実施態様において、セクション4.1に記載されるようなアレナウイルスゲノムセグメントをコードする核酸が、本明細書において提供される。より具体的な実施態様において、表1に記載されるDNAヌクレオチド配列又はDNAヌクレオチド配列のセットが、本明細書において提供される。このような核酸を含む宿主細胞もまた、セクション4.1で提供される。
具体的な実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されたアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAであって、該アレナウイルスゲノムセグメントが、セクション4.1に記載されるような異種ORFをコードする前記cDNAが、本明細書において提供される。
一実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されたアレナウイルスゲノムセグメントをコードするDNA発現ベクター系が本明細書において提供される。具体的には、1つ以上のベクターが、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の2つのアレナウイルスゲノムセグメント、すなわち、Lセグメント及びSセグメントをコードするDNA発現ベクター系が、本明細書において提供される。このようなベクター系は、(1つ以上の別個のDNA分子)をコードし得る。
別の実施態様において、ORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているアレナウイルスSセグメントのcDNAが、本明細書において提供され、これは、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれている。他の実施態様において、ORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているアレナウイルスLセグメントのcDNAは、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれている。ある実施態様において、(i)ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている前記アレナウイルスゲノムセグメントのcDNAであり;かつ(ii)GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが、除去されてアレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。
ある実施態様において、本明細書において提供されるcDNAは、特定のLCMVの株由来のものとすることができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、アーム(Arm)CA 1371、アームE-250、WE、UBC、トラウブ(Traub)、パスツール(Pasteur)、810885、CH-5692、マルセイユ(Marseille)#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、ダグラス(Douglas)、GR01、SN05、CABN、及びそれらの派生株が挙げられる。具体的な実施態様において、前記cDNAは、LCMVクローン13由来である。他の具体的な実施態様において、前記cDNAは、LCMV MP株由来である。
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子をコードするよう作製されるベクターは、LCMVの特定の株ベースであってもよい。LCMVの株としては、クローン13、MP株、アームCA 1371、アームE-250、WE、UBC、トラウブ、パスツール、810885、CH-5692、マルセイユ#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、ダグラス、GR01、SN05、CABN、及びそれらの派生株が挙げられる。ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、LCMVクローン13ベースであってもよい。他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子をコードするよう作製されるベクターは、LCMV MP株である。LCMVクローン13のSセグメントの配列は、配列番号:2として記載されている。ある実施態様において、LCMVクローン13のSセグメントの配列は、配列番号:1に記載されている配列である。LCMVクローン13のLセグメントの配列は、配列番号:5として記載されている。LCMV株MPのSセグメントの配列は、配列番号:53として記載されている。LCMV株MPのLセグメントの配列は、配列番号:4として記載されている。
別の実施態様において、本セクションにおいて上述のcDNA又はベクター系を含む細胞が、本明細書において提供される。感染したこのような細胞由来の細胞株、このような細胞を含む培養物、このような細胞を培養する方法もまた本明細書において提供される。ある実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを含む細胞が、本明細書において提供される。いくつかの実施態様において、前記細胞は、Sセグメント及び/又はLセグメントを含む。
(4.5.2 3分節型アレナウイルス粒子)
一実施態様において、セクション4.2に記載されるような3分節型アレナウイルス粒子をコードする核酸が、本明細書において提供される。より具体的な実施態様において、例えば、表2又は表3に記載したようなDNAヌクレオチド配列又はDNAヌクレオチド配列のセットが、本明細書において提供される。このような核酸を含む宿主細胞もまた、セクション4.2に提供される。
具体的な実施態様において、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている前記3分節型アレナウイルス粒子のcDNAからなるcDNAが、本明細書において提供される。他の実施態様において、(i)アレナウイルスORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されている3分節型アレナウイルス粒子のcDNAであり;(ii)該3分節型アレナウイルス粒子は、セクション4.2に記載されるような異種ORFをコードする。
一実施態様において、全体として、本明細書に記載される3分節型アレナウイルス粒子をコードするDNA発現ベクター系が、本明細書において提供される。具体的には、DNA発現ベクター系であって、本明細書に記載される3分節型アレナウイルス粒子の、1つ以上のベクターが、3つのアレナウイルスゲノムセグメント、すなわち、1つのLセグメント及び2つのSセグメント、又は2つのLセグメント及び1つのSセグメントをコードする、前記DNA発現ベクター系が、本明細書において提供される。このようなベクター系は、(1つ以上の別個のDNA分子)をコードし得る。
別の実施態様において、ORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されており、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれているアレナウイルスSセグメント(複数可)のcDNAが、本明細書において提供される。他の実施態様において、ORFを、野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているアレナウイルスLセグメントのcDNA(複数可)は、DNA発現系の一部であるか、又はDNA発現系に組み込まれている。ある実施態様において、(i)ORFであって、該ORFの野生型の位置とは別の位置にある前記ORFを保持するよう操作されている前記3分節型アレナウイルス粒子のcDNAであり;かつ(ii)GP、NP、Zタンパク質、又はLタンパク質をコードするORFが、除去されてアレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている。
ある実施態様において、本明細書において提供されるcDNAは、特定のLCMVの株由来のものとすることができる。LCMVの株としては、クローン13、MP株、アームCA 1371、アームE-250、WE、UBC、トラウブ、パスツール、810885、CH-5692、マルセイユ#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、ダグラス、GR01、SN05、CABN、及びそれらの派生株が挙げられる。具体的な実施態様において、前記cDNAは、LCMVクローン13由来である。他の具体的な実施態様において、前記cDNAは、LCMV MP株由来である。
ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子をコードするよう作製されるベクターは、LCMVの特定の株ベースであってもよい。LCMVの株としては、クローン13、MP株、アームCA 1371、アームE-250、WE、UBC、トラウブ、パスツール、810885、CH-5692、マルセイユ#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、ダグラス、GR01、SN05、CABN、及びそれらの派生株が挙げられる。ある実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、LCMVクローン13ベースであってもよい。他の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子をコードするよう作製されるベクターは、LCMV MP株である。LCMVクローン13のSセグメントの配列は、配列番号:2として記載されている。ある実施態様において、LCMVクローン13のSセグメントの配列は、配列番号:1に記載されている配列である。LCMVクローン13のLセグメントの配列は、配列番号:5として記載されている。LCMV株MPのSセグメントの配列は、配列番号:53として記載されている。LCMV株MPのLセグメントの配列は、配列番号:4として記載されている。
別の実施態様において、本セクションにおいて上述のcDNA又はベクター系を含む細胞が、本明細書において提供される。感染したこのような細胞由来の細胞株、このような細胞を含む培養物、このような細胞を培養する方法もまた、本明細書において提供される。ある実施態様において、前記3分節型アレナウイルス粒子のcDNAを含む細胞が、本明細書において提供される。いくつかの実施態様において、前記細胞は、Sセグメント及び/又はLセグメントを含む。
(4.6 使用の方法)
ワクチンは、ポリオウイルス及び麻疹に対するものなど、感染性疾患の予防及び/又は治療に成功している。しかしながら、慢性感染症及びがんの双方を含む確立された慢性疾患の状況における治療的免疫化は、それほど成功していない。アレナウイルス粒子及び/又は3分節型アレナウイルス粒子を産生させる能力は、これまでに存在しなかった新規のワクチン戦略を意味する。
一実施態様において、本明細書に記載されるようなアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子の1種以上、又はその組成物を対象に投与することを含む、対象における感染症及び/又はがんを治療する方法が、本明細書において提供される。具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染症及び/又はがんを治療する方法は、有効量の本明細書に記載されるアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子の1つ以上の又はその組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。対象は、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、これらに限定されないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、ロバなどの家畜などの哺乳動物とすることができる。具体的な実施態様において、前記対象はヒトである。該ヒト対象は、男性、女性、成人、小児、高齢者(65歳以上)、及び複数の疾患を有する者(すなわち、多病(polymorbid)対象)であり得る。ある実施態様において、対象は、化学療法、放射線療法、外科手術、及び/又は生物学的製剤による治療の後に疾患が進行した者である。
別の実施態様において、感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物を対象に投与することを含む、対象における感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原に対する免疫応答を誘導する方法が、本明細書において提供される。
別の実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が投与される対象は、感染症、がんの進展、もしくはアレルギーを有するか、それになりやすいか、もしくはそのリスクがあるか、又は前がん性の組織病変を示す。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が投与される対象は、感染症、がん、前がん性の組織病変、又はアレルギーに感染しているか、それになりやすいか、そのリスクがあるか、又は感染症、がん、前がん性の組織病変、又はアレルギーと診断されている。
別の実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が投与される対象は、特に、肺系、中枢神経系、リンパ系、胃腸管系、又は循環器系において感染症、がん、前がん性の病変、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、そのリスクがある対象である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が投与される対象は、脳、肝臓、肺、眼、耳、腸、食道、子宮、鼻咽頭、又は唾液腺が挙げられるがこれらに限定されない身体の1つ以上の器官において感染症、がん、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、そのリスクがある対象である。
別の実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が投与される対象としては、発熱、寝汗、疲労、倦怠感、不安、咽喉痛、腺腫脹、関節痛、筋痛、食欲喪失、体重減少、下痢、胃腸潰瘍、消化管出血、息切れ、肺炎、口腔内潰瘍、視力障害、肝炎、黄疸、脳炎、発作、昏睡、そう痒症、紅斑、色素沈着過剰、リンパ節の変化、又は聴覚消失が挙げられるがこれらに限定されない症状を患う対象が挙げられる。
別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルスもしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、感染症、がん、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、そのリスクがある任意の年齢群の対象に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、免疫系が損なわれている対象、妊娠中の対象、臓器移植又は骨髄移植を受けている対象、免疫抑制薬を摂取している対象、血液透析を受けている対象、がんを有する対象、又は感染症、がん、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、もしくはそのリスクがある対象に投与される。より具体的な実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、感染症、がん、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、そのリスクがある0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、又は17歳の年齢の小児である対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、感染症、がん、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、又はそのリスクがある乳幼児である対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、感染症、がん、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、又はそのリスクがある0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12か月の月齢の乳幼児である対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、感染症、がん、又はアレルギーを患っているか、それになりやすいか、又はそのリスクがある高齢の対象に投与される。より具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、又は90歳の年齢の年輩の対象である対象に投与される。
別の実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、播種性の感染症、がん、又はアレルギーの増加したリスクを有する対象に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、新生児期において、新生児期の従って未熟な免疫系を有する対象に投与される。
別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、休止状態の感染症、がん、又はアレルギーを有する対象に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス、又はその組成物は、免疫系が損なわれると再活性化し得る休止状態の感染症、休止状態のがん、又は休止状態のアレルギーを有する対象に投与される。従って、感染症、がん、又はアレルギーの再活性化を予防するための方法が、本明細書において提供される。
別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、再発性の感染症、がん、又はアレルギーを有する対象に投与される。
別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、感染症、がん、又はアレルギーの遺伝的素因を有する対象に投与される。別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、対象に投与される。別の実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、リスク因子を有する対象に投与される。例示的なリスク因子としては、加齢、タバコ、太陽光曝露、放射線曝露、化学薬品への曝露、家族歴、アルコール、粗末な食事、身体活動の不足、又は過体重であることが挙げられる。
別の実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を投与することは、症候性の感染症、がん、又はアレルギーを減少させる。別の実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を投与することは、無症候性の感染症、がん、又はアレルギーを減少させる。
別の実施態様において、本明細書に記載される感染性の生物由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、インフルエンザウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ロタウイルス、感染性の気管支炎ウイルス、感染性の喉頭気管炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、マレック病ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリアデノウイルス、又はトリニューモウイルス、SARSの原因となるウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、ヒトパラインフルエンザ3型ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ウエストナイル病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、単純ヘルペスウイルス、及び黄熱ウイルスのうちの1つ以上の株に感染した対象又は動物に投与される。
別の実施態様において、本明細書に記載されるがん由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、1種以上のがんを患う対象に投与される。他の実施態様において、本明細書に記載されるワクチンによる処置に感受性がある任意の種類のがんを標的とし得る。より具体的な実施態様において、本明細書に記載されるがん由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、例えば、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、肺癌、神経芽腫、肝細胞癌、子宮頚癌、及び胃癌、バーキットリンパ腫;非ホジキンリンパ腫;ホジキンリンパ腫;上咽頭癌(鼻の後ろの喉の上部のがん)、白血病、粘膜関連リンパ組織リンパ腫などを患う対象に投与される。
別の実施態様において、本明細書に記載されるアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、1種以上のアレルギーを患う対象に投与される。より具体的な実施態様において、本明細書に記載されるアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、例えば、季節性アレルギー、通年性アレルギー、鼻炎結膜炎、喘息、湿疹、食物アレルギーを患う対象に投与される。
別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物を対象に投与することは、感染症、がん、又はアレルゲンに対する細胞性免疫(CMI)を付与する。理論に束縛されるものではないが、別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、アレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物は、主要組織適合複合体(MHC)クラスI及びII上に抗原を直接提示するための宿主(例えば、マクロファージ、樹状細胞、又はB細胞)の抗原提示細胞(APC)において、感染しかつ目的の抗原を発現する。別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、アレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物を対象に投与することは、高い重要性の、多機能性の細胞溶解性かつIFN-γ及びTNF-α共産生性のCMV-特異的CD4+かつCD8+T細胞応答を誘導して、感染症、がん、又はアレルギーを治療又は予防する。
別の実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物を投与することは、個体が感染症、がん、アレルギーを発症するリスクを、そのような治療の非存在下における感染症、がん、又はアレルギーを発症するリスクと比較して少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、又はそれを超えて減少させる。
別の実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物を投与することは、感染症、がん、又はアレルギーの症状を、そのような治療の非存在下における感染症、がん、アレルギーの症状の顕在化と比べて、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、又はそれを超えて減少させる。
ある実施態様において、前記感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、好ましくは、複数回の注射(例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、40、45、又は50回の注射)で、又は連続的な注入(例えば、ポンプを用いて)で、複数部位(例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、又は14部位)に投与される。ある実施態様において、前記感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、2回以上の別々の注射で、6ヶ月間、12ヶ月間、24ヶ月間、又は48ヶ月間にわたり投与される。ある実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現する前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、初回投与が選ばれた日、2回目の投与が初回投与の少なくとも2ヶ月後、及び3回目の投与が初回投与の6ヶ月後で投与される。
ある例において、身体の複数部位に皮膚注射が行われて、局所的皮膚反応の程度が減少される。所与のワクチン接種日に、患者は、それぞれが、用量(例えば、少なくとも0.4ml、0.2ml、又は0.1ml)の、針刺し時に最近接の注射から少なくとも約5cm(例えば、少なくとも4.5、5、6、7、8、9、又はcm)離して行われ、1本のシリンジから、3〜5回の別個の皮内注射で投与される割り当てられた総用量の細胞を受ける。次のワクチン接種日に、注射部位を、時計回り又は反時計回りに、異なる手か足へと交代する。
別の実施態様において、新生児期の従って免疫系を有する対象において、CMV抗原を発現する感染性の複製欠損性アレナウイルス又はその組成物を投与することは、このような処置の非存在での感染症、がん、又はアレルギーに対する細胞性免疫(CMI)応答を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、又はそれを上回って感染症、がん、又はアレルギーに対するCMI応答を誘発する。
ある実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を対象に投与することは、最低で少なくとも4週間検出可能な抗体価を誘導する。別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を対象に投与することは、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は少なくとも1000％抗体価を増加させる。
ある実施態様において、一次抗原への曝露は、感染症-免疫のヒト対象由来の平均対照血清の少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は少なくとも1000％の機能的(中和性)最小抗体価を誘発する。より具体的な実施態様において、一次中和性幾何平均抗体価は、免疫化の後少なくとも4週間以内で少なくとも1:50、少なくとも1:100、少なくとも1:200、又は少なくとも1:1000のピーク値まで増加する。別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子による免疫化は、ワクチンの単回投与の後の、又は2回以上の連続的な免疫化の後の免疫化後少なくとも4週間、少なくとも8週間、少なくとも12週間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも12ヶ月間、少なくとも2年間、少なくとも3年間、少なくとも4年間、又は少なくとも5年間持続する、高い抗体の力価を生じさせる。
さらに別の実施態様において、2次抗原への曝露は、抗体価を少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は少なくとも1000％増加させる。別の実施態様において、2次抗原への曝露は、感染症に免疫のあるヒト対象由来の平均対照血清の少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は少なくとも1000％の機能的(中和性)最小抗体価を誘発する。より具体的な実施態様において、2次中和性幾何平均抗体価は、免疫化後少なくとも4週間以内で少なくとも1:50、少なくとも1:100、少なくとも1:200、又は少なくとも1:1000のピーク値まで増加する。別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子による第二の免疫化は、免疫化後少なくとも4週間、少なくとも8週間、少なくとも12週間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも12ヶ月間、少なくとも2年間、少なくとも3年間、少なくとも4年間、又は少なくとも5年間持続する、高い抗体の力価を生じさせる。
さらに別の実施態様において、第三のブースト免疫化(boosting immunization)は、抗体価を少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は少なくとも1000％増加させる。別の実施態様において、該ブースト免疫化は、感染症に免疫のあるヒト対象由来の平均対照血清の少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は少なくとも1000％の機能的(中和性)最小抗体価を誘発する。より具体的な実施態様において、前記第三のブースト免疫化は、感染症に免疫のあるヒト対象由来の平均対照血清の少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は少なくとも1000％の機能的、(中和性)、かつ最小の抗体価を誘発する。別の実施態様において、第三のブースト免疫化は、抗体価を、免疫化後少なくとも4週間、少なくとも8週間、少なくとも12週間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも12ヶ月間、少なくとも2年間、少なくとも3年間、少なくとも4年間、又は少なくとも5年間延長する。
ある実施態様において、前記感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、T細胞非依存性又はT細胞依存性の応答を誘発する。他の実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、T細胞応答を誘発する。他の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、Tヘルパー応答を誘発する。別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、Th1適応(Th1-orientated)応答又はTh2適応(Th2-orientated)応答を誘発する。
より具体的な実施態様において、前記Th1適応応答は、IgG2に対して優勢なIgG1抗体により示される。他の実施態様において、IgG1:IgG2の比は、1:1超、2:1超、3:1超、又は4:1超である。別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現する感染性のアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、優勢なIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、又はIgE抗体により示される。
いくつかの実施態様において、CMV抗原又はその断片を発現する感染性の複製欠損性アレナウイルスは、CD8+T細胞応答を誘発する。別の実施態様において、前記感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、CD4+及びCD8+T細胞応答の双方を、抗体との組み合わせでか、又は組み合わせずに誘発する。
ある実施態様において、前記本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、高い力価の中和抗体を誘発する。別の実施態様において、前記本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、タンパク質複合体成分個々の発現よりも高い力価の中和抗体を誘発する。
別の実施態様において、1、2、3、4、5、又はそれを超える感染性の生物、がん、又はアレルギー由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、 感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を1つ発現するアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子よりも高い力価の中和抗体を誘発する。
ある実施態様において、前記方法は、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子及び少なくとも1つの追加療法の共投与をさらに含む。ある実施態様において、該共投与は、同時である。別の実施態様において、前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、追加療法の投与の前に投与される。他の実施態様において、前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、追加療法の投与後に投与される。ある実施態様において、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子及び追加療法の投与は、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、又は約12時間である。ある実施態様において、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子及び前記追加療法の投与間隔は、約1日、1週間、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、約6週間、約7週間、約8週間、約9週間、約10週間、約11週間、約12週間である。ある実施態様において、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子及び追加療法の投与の間隔は、約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、又は約6ヶ月である。
ある実施態様において、感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子又はその組成物を投与することは、患者の血液サンプル、又は血清サンプルにおいて検出される抗体の数を減少させる。ある実施態様において、感染性の生物、がん、又はそのアレルゲン組成物由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子を投与することは、尿、唾液、血液、涙、精液、剥離細胞サンプル、又は母乳において検出される該感染性の生物、がん、又はアレルギーの量を減少させる。
別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又は組成物は、レポータータンパク質をさらに含んでいてもよい。より具体的な実施態様において、本明細書に記載されるような感染生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原及びレポータータンパク質を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又は組成物は、感染症、がん、又はアレルギーを治療する及び/又は予防するために対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、前記レポータータンパク質は、遺伝子発現、タンパク質局在化、及びワクチン送達を、インビボで、インサイチュで、かつリアルタイムにモニターするのに使用し得る。
別の実施態様において、本明細書に記載されるような感染生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又は組成物は、蛍光タンパク質をさらに含んでいてもよい。より具体的な実施態様において、本明細書に記載されるような感染生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原及びレポータータンパク質を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又は組成物は、感染症、がん、又はアレルギーを治療する及び/又は予防するために対象に投与される。さらに別の具体的な実施態様において、前記蛍光タンパク質はレポータータンパク質であってよく、遺伝子発現、タンパク質局在化、及びワクチン送達を、インビボで、インサイチュで、かつリアルタイムにモニターするのに使用し得る。
対象における、感染性の生物、がん、アレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物を投与することにより誘発される感染症、がん、又はアレルギーに対するCMI応答機能における変化は、フローサイトメトリー(例えば、Perfetto S.P.らの文献、2004、Nat Rev Immun.、4(8):648-55を参照されたい)、リンパ球増殖アッセイ(例えば、Bonilla F.A.らの文献、2008、Ann Allergy Asthma Immunol、101:101-4;及びHicks M.J.らの文献、1983、Am J Clin Pathol.、80:159-63を参照されたい)、Tリンパ球のサイトカインの測定の活性化後の表面マーカー発現の変化を決定することを含むリンパ球活性化を測定するアッセイ(例えば、Caruso A.らの文献、Cytometry. 1997;27:71-6を参照されたい)、ELISPOTアッセイ(例えば、Czerkinsky C.C.らの文献、1983、J Immunol Methods、65:109-121;及び Hutchings P.R.らの文献、1989、J Immunol Methods、120:1-8を参照されたい)、又はナチュラルキラー細胞の細胞傷害性アッセイ(例えば、Bonilla F.A.らの文献、2006、Ann Allergy Asthma Immunol.、94(5 Suppl 1):S1-63を参照されたい)が挙げられるがこれらに限定されない当業者に公知の任意のアッセイにより測定可能である。
がん患者の治療の成功は、予想される生存時間の延長、抗腫瘍免疫応答の誘導、又はがんの特定の特徴の向上として評価し得る。向上させ得るがんの特徴の例としては、腫瘍サイズ(例えば、T0、Tは、又はT1〜T4)、転移の状況(例えば、M0、M1)、観察可能腫瘍の数、節の関与(例えば、N0、N1〜4、Nx)、グレード(すなわち、グレード1、2、3、又は4)、ステージ(例えば、0、I、II、III、又はIV)、細胞上又は体液中のある種のマーカーの存在又は濃度(例えば、AFP、B2M、ベータ-HCG、BTA、CA 15-3、CA 27.29、CA 125、CA 72.4、CA 19-9、カルシトニン、CEA、クロムグラニンA(chromgrainin A)、EGFR、ホルモン受容体、HER2、HCG、免疫グロブリン、NSE、NMP22、PSA、PAP、PSMA、S-100、TA-90、及びサイログロブリン)、並びに/又は関連する病態(例えば、腹水症又は浮腫)もしくは症状(例えば、悪液質、発熱、食欲不振、又は疼痛)が挙げられる。パーセントで測定可能な場合には、向上は、少なくとも5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、又は90％とすることができる(例えば、生存時間、又は腫瘍の体積もしくは線寸法)。
別の実施態様において、GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードするORFのうちの少なくとも1つが、感染性の生物、がん、アレルゲン由来の抗原、又はその抗原断片をコードする感染性のヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列で置換されている、本明細書に記載されるような感染性の生物、がん、又はアレルゲン由来の抗原を発現するアレナウイルス粒子(例えば、LCMV)を用いる使用の方法が本明細書に記載される。
(4.7 組成物、投与、及び投薬量)
本出願は更に、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を含むワクチン、免疫原性組成物(例えば、ワクチン製剤)、及び医薬組成物に関する。そのようなワクチン、免疫原性組成物、及び医薬組成物は、当該技術分野において標準的な手順に従い製剤化し得る。
本明細書に記載される方法及び応用に対する適当な変更及び適応が明白であり得、かつその範囲又はその任意の実施態様から逸脱することなく成しうることは当業者に容易に明らかとなるであろう。
別の実施態様において、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を含む組成物が、本明細書において提供される。そのような組成物は、疾患の治療及び予防の方法に使用し得る。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組成物は、感染症に感染した、又はそれに感受性がある対象の治療において用いられる。他の実施態様において、本明細書に記載される組成物は、がんもしくは腫瘍形成に対して感受性があるか、又はがんもしくは腫瘍形成に特徴的な症状を示すか、又はがんと診断されている対象の治療において用いられる。別の具体的な実施態様において、本明細書において提供される免疫原性組成物を使用して、該組成物が投与された宿主において免疫応答を誘発し得る。本明細書に記載される免疫原性組成物は、ワクチンとして用いることができ、それに合わせて医薬組成物として製剤化し得る。具体的な実施態様において、本明細書に記載される免疫原性組成物は、対象(例えば、ヒト対象)の感染症又はがんの予防において用いられる。他の実施態様において、前記ワクチン、免疫原性組成物、又は医薬組成物は、獣医学の投与及び/又はヒトへの投与に適している。
ある実施態様において、本明細書に記載されるようなアレナウイルスベクターを含む免疫原性組成物が、本明細書において提供される。ある実施態様において、このような免疫原性組成物は、医薬として許容し得る賦形剤をさらに含む。ある実施態様において、このような免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。本明細書に記載される組成物との組合せでの投与のためのアジュバントは、該組成物の投与の前に、それと同時に、又はその後に投与され得る。いくつかの実施態様において、用語「アジュバント」は、本明細書に記載される組成物と併用して又はその一部として投与される場合に、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子に対する免疫応答を増強、強化、及び/又はブーストする化合物を指し、かつ最も重要なことに、それがベクター化する遺伝子産物は、該化合物が単独で投与される場合、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子、及び後者によりベクター化された遺伝子産物に対する免疫応答を生じさせない。いくつかの実施態様において、前記アジュバントは、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子、及び後者によりベクター化された遺伝子産物に対する免疫応答を生じさせ、かつアレルギーや他の有害な反応を生じさせない。アジュバントは、例えば、リンパ球の動員、B細胞及び/又はT細胞の刺激、及びマクロファージ又は樹状細胞の刺激などのいくつかの機構により免疫応答を強化し得る。本発明のワクチン又は免疫原性組成物がアジュバントを含む場合、又は1種以上のアジュバントと一緒に投与される場合、使用し得るアジュバントとしては、鉱物塩アジュバントもしくは鉱物塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、マイクロ粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、及び免疫賦活性アジュバントが挙げられるがこれらに限定されない。アジュバントの例としては、アルミニウム塩(ミョウバン)(水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウムなど)、3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA(MPL)(GB 2220211を参照されたい)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(Tween 80;ICL Americas、Inc.)、イミダゾピリジン化合物(国際公報第WO2007/109812号として公表されている国際出願第PCT/US2007/064857号を参照されたい)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公報第WO2007/109813号として公表されている国際出願番号第PCT/US2007/064858号を参照されたい)、及びQS21などのサポニン(「ワクチン設計(Vaccine Design)」中のKensilらの文献、1995:「サブユニット及びアジュバントアプローチ(The Subunit and Adjuvant Approach)」(Powell & Newman編, Plenum Press, NY);米国特許第5,057,540号を参照されたい)が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様において、前記アジュバントは、フロイントアジュバント(完全型又は不完全型)である。他のアジュバントは、任意にモノホスホリルリピドAなどの免疫刺激剤と組み合わせた、水中油型乳濁液(スクアレン又はピーナッツ油など)である(Stouteらの文献、1997、N. Engl. J. Med. 336、86-91を参照されたい)。
前記組成物は、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を単独で、又は医薬として許容し得る担体と一緒に含む。アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子の懸濁液又は分散液、特に等張の水性懸濁液又は分散液を使用し得る。前記医薬組成物は、滅菌されていてもよく、かつ/又は賦形剤、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、及び/又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩、及び/又は緩衝剤を含んでもよく、それ自体公知の様式で、例えば従来の分散化プロセス及び懸濁化プロセスにより調製される。ある実施態様において、このような分散液又は懸濁液は、粘度調整剤を含んでいてもよい。前記懸濁液又は分散液は、2℃〜8℃前後の温度に保たれるか、又は優先的には、より長い保管のためには、凍結して、その後、使用の直前に解凍してもよいか、或いは保管のために凍結乾燥してもよい。注射のためには、前記ワクチン又は免疫原性の調製物は、水溶液中に、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液中に製剤化し得る。該溶液は、懸濁化剤、安定化剤、及び/又は分散化剤などの製剤用剤(formulatory agent)を含有していてもよい。
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、防腐剤、例えば、水銀誘導体チメロサールを追加で含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、0.001％〜0.01％のチメロサールを含む。他の実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、防腐剤を含まない。
前記医薬組成物は、約103〜約1011のフォーカス形成単位のアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を含む。
一実施態様において、前記医薬組成物の投与は、非経口投与である。非経口投与は、静脈内又は皮下投与とすることができる。従って、非経口投与のための単位用量形態は、例えば、アンプル又はバイアル、例えば、約103〜1010のフォーカス形成単位又は105〜1015個の物理的粒子の前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を含有するバイアルである。
別の実施態様において、本明細書において提供されるワクチン又は免疫原性組成物は、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、外用、皮下、経皮、鼻腔内、及び吸入が挙げられるがこれらに限定されない経路、並びに乱切法(例えば、二股針を用いて皮膚の上層をひっかくこと)により対象に投与される。具体的には、皮下又は静脈内経路を使用し得る。
鼻腔内投与又は吸入による投与のためには、本発明による使用のための調製物は、好都合なことには、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適当なガスの使用を伴う、加圧パック又はネブライザーからの、エアロゾルスプレーの体裁(presentation)の形態で送達し得る。加圧エアロゾル剤の場合には、投薬単位を、計量された量を送達するバルブを提供することにより決定してもよい。吸入器(inhaler)又は吸入器(insufflator)における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセル剤及びカートリッジは、前記化合物及びラクトース又はデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含有させて製剤化されてもよい。
活性成分の投薬量は、ワクチン接種の種類、並びに対象及びその年齢、体重、個々の状態、個々の薬物動態学的データ、及び投与様式次第である。ある実施態様において、インビトロアッセイを採用して、最適な投薬量範囲を特定するのに役立てる。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれた用量反応曲線から推定してもよい。
ある実施態様において、アレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子を含むワクチン、免疫原性組成物、又は医薬組成物は、生ワクチン接種として用い得る。例示的な生アレナウイルス粒子の用量は、一回用量あたり生ウイルスが10〜100、又はそれ以上のPFUで変化し得る。いくつかの実施態様において、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子の適当な投薬量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、又は1012pfuであり、必要に応じた頻度で間隔をおいて１回、2回、3回又はそれ以上対象に投与し得る。別の実施態様において、生アレナウイルスは、0.2mL用量が、106.5〜107.5の蛍光フォーカス単位の生アレナウイルス粒子を含有するように製剤化される。別の実施態様において、不活性化ワクチンは、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約15μg〜約50μg、又は約15μg〜約30μgのアレナウイルスを含有するように製剤化される
ある実施態様において、小児への投与のためには、少なくとも1か月離して与えられる2回用量の本明細書に記載されるアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が、小児に投与される。具体的な実施態様において、成人への投与のためには、1回用量の本明細書に記載されるアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が与えられる。別の実施態様において、少なくとも1か月離して与えられる2回用量の本明細書に記載されるアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物が、成人に投与される。別の実施態様において、年少の小児(6ヶ月から9歳)は、第一回目に、1か月離して与えられる2回用量で本明細書に記載されるアレナウイルス粒子もしくは3分節型アレナウイルス粒子、又はその組成物を投与され得る。特定の実施態様において、ワクチン接種の最初の１年で、1回用量のみしか受けていない小児は、次の年に2回用量を受けるべきである。いくつかの実施態様において、4週間離して投与される2回用量が、本明細書に記載される免疫原性組成物を初めて投与される2〜8歳の小児に好ましい。ある実施態様において、３歳を超える対象に好ましい可能性がある0.5mlとは異なり、6〜35月齢の小児に対しては、半分用量(0.25 ml)が好ましい可能性がある。
ある実施態様において、前記組成物は、治療的有効量のアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を含む単一の投薬量で患者に投与され得る。いくつかの実施態様において、前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子は、治療的有効量のアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子及びそれぞれが治療的有効量である1つ以上の医薬組成物を含む単一の用量で患者に投与され得る。
ある実施態様において、前記組成物は、単一用量及びその3〜6週間後に続く2回目の投与として、患者に投与される。これらの実施態様により、2回目の接種後6〜12か月の間隔で、ブースター接種が対象に実施され得る。ある実施態様において、前記ブースター接種には、異なるアレナウイルス又はその組成物を利用してもよい。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのと同じ組成物の投与を繰り返してもよく、少なくとも1日、2日間、3日間、4日間、5日間、10日間、15日間、30日間、45日間、2ヶ月間、75日間、3ヶ月間、又は少なくとも6ヶ月間離してもよい。
また、前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を活性成分として含む医薬調製物の形態のワクチンの製造のためのプロセス及び、アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子の使用も本明細書において提供される。本出願の医薬組成物は、それ自体公知の様式で、例えば、従来の混合及び/又は分散プロセスにより調製される。
(4.8 アッセイ)
(4.8.1 アレナウイルス検出アッセイ)
当業者であれば、当技術分野において公知の技術を用いて、本明細書に記載されるようなアレナウイルスゲノムセグメント又は3分節型アレナウイルス粒子を検出し得るであろう。例えば、RT-PCRをアレナウイルスに特異的なプライマーと共に使用して、ORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されているアレナウイルスゲノムセグメント、又は3分節型アレナウイルス粒子を検出及び定量し得る。ウエスタンブロット、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降(immuneprecipitation)、免疫細胞化学(immunecytochemistry)、又はFACSと組み合わせた免疫細胞化学(immunocytochemistry)を使用して、アレナウイルスゲノムセグメント又は3分節型アレナウイルス粒子の遺伝子産物を定量し得る。
(4.8.2感染力を測定するためのアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを、アレナウイルスベクター調製物の感染力を測定するために使用し得る。例えば、ウイルス/ベクター力価の決定は、「フォーカス形成単位アッセイ」(FFUアッセイ)により行い得る。手短にいうと、補完細胞、例えば、MC57細胞をプレーティングし、それに異なる希釈度のウイルス/ベクターサンプルを接種する。インキュベーション期間の後に、細胞に単層を形成させ、ウイルスを細胞に付着させるために、該単層を、メチルセルロースで覆う。プレートを更にインキュベートすると、元の感染細胞は、ウイルスの子孫を放出する。メチルセルロースオーバレイのために、新しいウイルスの伝播は、隣接している細胞に制限されている。その結果、各感染性の粒子は、フォーカスと呼ばれる感染細胞の環状領域を生じさせる。このようなフォーカスは、LCMV-NP又はアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子により発現される別のタンパク質に対する抗体、及びHRPベースの呈色反応を用いて可視化することができ、それにより、計数可能とすることができる。ウイルス/ベクターの力価は、ミリリットルあたりのフォーカス形成単位(FFU/mL)で計算し得る。
(4.8.3 アレナウイルス粒子の増殖)
本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の増殖は、当技術分野において公知の、又は本明細書に記載されている任意の方法(例えば、細胞培養)により評価し得る。ウイルスの増殖は、細胞(例えば、Vero細胞又はBHK-21細胞)培養液中に、本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の段階希釈物を接種することにより決定してもよい。特定の期間ウイルスをインキュベーションした後、該ウイルスは、標準的な方法を用いて単離される。
(4.8.4 血清ELISA)
動物(例えば、マウス、モルモット)のワクチン接種時の液性免疫応答の決定は、抗原特異的血清ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)により行い得る。手短にいうと、プレートを抗原(例えば、組換えタンパク質)で覆い、抗体の非特異的な結合を避けるためにブロッキングを行い、血清の段階希釈物とインキュベートする。インキュベーション後、結合した血清-抗体を、例えば、酵素結合抗種(例えば、マウス、モルモット)特異的抗体(enzyme-coupled anti-species-specific antibody)(総IgG又はIgGサブクラスを検出)、及びそれに続く呈色反応を用いて検出することができる。抗体価は、例えば、エンドポイント幾何平均力価として決定し得る。
(4.8.5 誘導された抗体の中和活性を測定するためのアッセイ)
血清中の中和抗体の決定は、ATCC由来のARPE-19細胞及びGFPタグを付けたウイルスを用いる以下の細胞アッセイで行われる。それに加え、外来性の補体源としての追加のモルモット血清を用いる。このアッセイは、中和に用いる1日又は2日前に、384ウェルプレートに6.5×103細胞/ウェル(50μl/ウェル)で播種することから開始する。中和は、96ウェルの無菌の組織培養プレート中、細胞無しで、37℃で1時間行われる。中和インキュベーション工程後、混合物を細胞に加え、プレートリーダーでのGFP検出のためにさらに4日間インキュベートする。各プレート上で、陽性中和性ヒト血清(positive neutralizing human sera)をアッセイの陽性対照として用いて、全ての結果の信頼性をチェックする。力価(EC50)を、4パラメーターロジスティック曲線あてはめを用いて決定する。追加の試験として、ウェルを、蛍光顕微鏡でチェックする。
(4.8.6 プラーク減少アッセイ)
手短にいうと、LCMVのプラーク減少(中和)アッセイは、緑色蛍光タンパク質でタグ付けされた複製可能LCMV又は複製欠損LCMVを用いて行うことができ、5％ウサギ血清を外来性の補体源として用いてもよく、プラークは、蛍光顕微鏡法により数え上げることができる。中和価は、コントロール(免疫前)血清サンプル中のものと比較して、プラークの50％、75％、90％、又は95％の減少をもたらす血清の最高希釈度として定義してもよい。
QIAampウイルスRNAミニキット(QIAGEN)を製造業者により提供されるプロトコールに従い用いて、qPCR LCMV RNAゲノムを単離する。LCMV RNAゲノムに相当するものは、SuperScript (登録商標)III Platinum(登録商標)ワンステップqRT-PCRキット(Invitrogen)、及びプライマー、及びLCMV NPコード領域の一部又は前記アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子の別のゲノムの区間に対して特異的なプローブ(FAMレポーター及びNFQ-MGBクエンチャー)を用いるStepOnePlusリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)上で実施される定量的PCRにより検出される。反応の温度プロファイルは:60℃で30分間、95℃で2分間、それに続く95℃で15秒を45サイクル、56℃で30秒としてもよい。RNAは、サンプルの結果を、LCMV NPコード配列の断片又はプライマー及びプローブ結合部位を含むアレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子の別のゲノム区間に対応する、分光光度法で定量したインビトロ転写RNA断片のlog10希釈系列から作成された標準的な曲線と比較することにより定量化できる。
(4.8.7 ウエスタンブロット法)
組織培養フラスコ中又は懸濁液中で増殖させた感染細胞を、感染後の示された時点で、RIPAバッファー(Thermo Scientific)を用いて溶解させるか、又は細胞溶解無しで直接用いる。サンプルを、還元剤及びNuPage LDS サンプルバッファー (NOVEX)と共に99℃に10分間加熱し、室温まで冷却してから、電気泳動用の4〜12％のSDS-ゲルに載せた。タンパク質を、Invitrogens iBlotゲルトランスファーデバイスを用いて膜上にブロットして、ポンソー染色により可視化する。最後に、調製物を目的タンパク質に対する一次抗体及びアルカリホスファターゼ複合二次抗体、並びにそれに続く1ステップNBT/BCIP溶液(INVITROGEN)での染色を用いて探索する。
(4.8.8 抗原特異的CD8+T細胞増殖の検出のためのMHC-ペプチド多量体染色アッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを使用して、抗原特異的CD8+T細胞応答を試験し得る。例えば、MHC-ペプチド四量体染色アッセイを使用し得る(例えば、Altman J.D.らの文献、Science. 1996;274:94-96;及びMurali-Krishna K.らの文献、Immunity. 1998;8:177-187を参照されたい)。簡単に言えば、このアッセイは、以下の工程を含み、四量体アッセイを用いて、抗原特異的T-細胞の存在を検出する。T細胞が、それが特異的なペプチドを検出するためには、T細胞は、該ペプチド、及びT-細胞(典型的には、蛍光標識されているもの)の規定された抗原特異性及びMHCハプロタイプに対してカスタムメイドされたMHC分子の四量体の双方を認識しなければならない。その後、この四量体は前記蛍光標識を介してフローサイトメトリーにより検出される。
(4.8.9 抗原特異的CD4+T細胞増殖の検出のためのELISPOTアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを使用して、抗原特異的CD4+T細胞応答を試験し得る。例えば、ELISPOTアッセイを使用し得る(例えば、Czerkinsky C.C.らの文献、J Immunol Methods. 1983;65:109-121;及び Hutchings P.R.らの文献、J Immunol Methods. 1989;120:1-8を参照されたい)。簡単に説明すると、このアッセイは、以下の工程を含む:イムノスポットプレートを抗サイトカイン抗体で覆う。細胞をイムノスポットプレート内でインキュベートする。細胞がサイトカインを分泌し、その後洗い落とされる。その後、プレートを、第二のビオチン化(biotyinlated)抗サイトカイン抗体で覆い、アビジン-HRP系で可視化させる。
(4.8.10 CD8+及びCD4+T細胞応答の機能性の検出のための細胞内サイトカインアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを使用して、CD8+及びCD4+ T細胞応答の機能性を試験し得る。例えば、フローサイトメトリーと組み合わせた細胞内サイトカインアッセイを使用し得る(例えば、Suni M.A.らの文献、J Immunol Methods. 1998;212:89-98;Nomura L.E.らの文献、Cytometry. 2000;40:60-68;及び Ghanekar S.A.らの文献、Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001;8:628-63を参照されたい)。簡単に説明すると、本アッセイは、以下の工程を含む:特異的ペプチド又はタンパク質を介する細胞の活性化、タンパク質輸送の阻害(例えば、ブレフェルジンA)を加えて、細胞内のサイトカインを保持する。規定の期間、典型的には5時間のインキュベーション後、洗浄工程が続き、他の細胞マーカー(cellular marker)に対する抗体を、細胞に追加し得る。その後、細胞は固定され、透過処理される。フルロコーム(flurochrome)複合抗サイトカイン抗体を加え、細胞をフローサイトメトリーにより分析することができる。
(4.8.11 ウイルスベクターの複製欠損を確認するためのアッセイ)
感染性かつ複製可能なウイルス粒子の濃度を決定する当業者に公知の任意のアッセイも、サンプル中の複製欠損性ウイルス粒子の測定に使用し得る。例えば、非補完細胞を用いるFFUアッセイを、この目的のために使用し得る。
更に、プラークベースのアッセイは、ウイルスサンプル中のプラーク形成単位(PFU)でのウイルス濃度を決定するのに用いられる標準的な方法である。具体的には、非補完宿主細胞のコンフルエントな単層に、様々な希釈度でウイルスを感染させ、ウイルス感染が無差別に広がるのを防ぐために寒天などの半固体培地で覆われる。ウイルスプラークは、ウイルスが感染に成功し、固定された細胞単層内の細胞中で自身を複製し、周囲の細胞に広がる場合に形成される(例えば、Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D.の文献(2002)「微生物学における方法（Methods in Microbiology)」、第32巻:「感染の免疫学（Immunology of Infection): Academic Press. ISBN 0-12-521532-0を参照されたい)。プラーク形成は、分析されるウイルスに応じて2〜14日間かかることもある。プラークは、一般的に、人力で計数されて、この結果を、プレートを調製するのに用いた希釈係数と組み合わせて用いて、サンプルの単位体積あたりのプラーク形成単位の数(PFU/mL)を計算する。PFU/mLの結果は、サンプル内の感染性の複製可能な粒子の数を示す。C-細胞を用いる場合、同じアッセイを使用して、複製欠損性アレナウイルス粒子又は3分節型アレナウイルス粒子を滴定し得る。
(4.8.12 ウイルス抗原の発現についてのアッセイ)
当業者に公知の任意のアッセイを、ウイルス抗原の発現を測定するために使用し得る。例えば、FFUアッセイを行うことができる。検出のためには、それぞれのウイルス抗原に対するモノ又はポリクローナル抗体調製物(複数可)を使用する(導入遺伝子特異的FFU)。
(4.8.13 動物モデル)
本明細書に記載されるアレナウイルス粒子の組換え及び感染力を調査するために、インビボ動物モデルを使用し得る。ある実施態様において、3分節型アレナウイルス粒子の組換え及び感染力を調査するために使用し得る動物モデルとしては、マウス、モルモット、ウサギ、及びサルが挙げられる。好ましい実施態様において、アレナウイルスの組換え及び感染力を調査するために使用し得る動物モデルとしては、マウスが挙げられる。より具体的な実施態様において、アレナウイルス粒子の組換え及び感染力調査するために使用し得るマウスは、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体、及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)の三重欠損型である。
ある実施態様において、前記動物モデルを使用して、アレナウイルスの感染力及び導入遺伝子の安定性を決定し得る。いくつかの実施態様において、ウイルスRNAは、動物モデルの血清から単離し得る。技術は、当業者によく知られている。ウイルスRNAは、逆転写することができ、かつアレナウイルスORFを保持するcDNAは、遺伝子特異的なプライマーを用いてPCR増幅することができる。フローサイトメトリーを使用して、アレナウイルスの感染力及び導入遺伝子の安定性を調査することもできる。
(5. 実施例)
これらの実施例は、LCMVウイルスベースのベクター技術を使用して、(1)ウイルスのORFを、該ORFの野生型の位置とは別の位置に有するアレナウイルスゲノムセグメント、及び(2)複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない3分節型アレナウイルス粒子の開発に成功し得ることを実証する。
(5.1 材料及び方法)
(5.1.1 細胞)
BHK-21細胞を、10％の熱失活させたウシ胎仔血清(FCS; Biochrom)、10mMのHEPES(Gibco)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco)、及び1×トリプトースホスフェートブロスを補完した高グルコースダルベッコイーグル培地(DMEM;Sigma)中で培養した。MC57細胞を、5％の熱失活させたFCS、2mMのL-グルタミン(Gibco)、及びペニシリン-ストレプトマイシン(100’000U/mlのペニシリン及び50mg/lのストレプトマイシン;Gibco)を補足した最小必須培地(MEM;Sigma)中で維持した。双方の細胞株を、37℃で、加湿された5％CO2インキュベーター中で培養した。
NP発現BHK-21細胞は、製造業者のプロトコールに従い、真核生物のEF1-アルファプロモーターの制御下でNPを発現し、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドで、BHK-21細胞をトランスフェクトすることにより作製した。トランスフェクションの48時間後、4μg/mlのピューロマイシンを、培地に加えた。更に48時間後、細胞をT150フラスコに継代培養した。個々のクローンが見えるようになったら、細胞を回収し、96ウェルプレートに段階希釈して単クローンを得た。ウェルを、単クローン由来の細胞集団の増殖について光学的にチェックし、コンフルエントな単層が形成されたら、それぞれの細胞を6ウェルプレートに継代培養した。NP発現BHK-21細胞を、BHK-21培地中、4μg/mlのピューロマイシンの存在下培養した。
GP発現BHK-21細胞はすでに説明されている。簡単に説明すると、BHK-21細胞は、コドン最適化されたLCMV-GP cDNA及びピューロマイシン耐性カセットを発現するプラスミドで安定にトランスフェクトされた。GP発現クローンを、4μg/mlのピューロマイシンを培地に添加することにより選択し、単クローンを、NP発現BHK-21細胞に対して説明されているような段階希釈により得た。
(5.1.2 プラスミド)
pol-I L、pC-NP、及びpC-Lプラスミドはすでに説明されている。レポーター遺伝子としてのGFP又はRFP、及びNP又はGPのいずれかをコードするpol-I Sプラスミドの生成のために、本発明者らは、pol-I Bbs/Bsmクローニングプラスミドを基礎として用いた(pol-I 5’-BsmBI_IGR_BbsI_3’)。このプラスミドは、2つのBsmBI制限部位がそれに続くウイルスのSセグメントの5’非翻訳領域(5’UTR)、BbsI制限部位の側方に位置する遺伝子間領域(IGR)、NPレスト、及びCATオープンリーディングフレーム(ORF)、並びにSセグメントの3’UTRをコードする。GPをその天然の5’に、かつGFPをアンチセンスの向きで3’位置にコードするpol-I Sプラスミド(pol-I 5’-GP_IGR_GfP-3’)を、GPをBsmBI部位特異的な制限及びライゲーションによりpol-I Bbs/Bsmプラスミドへ挿入することによりクローニングした。第二の工程では、GFPをBbsI消化及びライゲーションにより挿入した。人工の3’配向性でGPをコードするpol-I Sプラスミド(pol-I 5’-GFP_IGR_GP-3’)を得るために、GPを3’位置でBbsI 消化によりpol-I Bbs/Bsmプラスミド中に挿入し、GFPを5’位置でのBsmBI制限/ライゲーションで挿入した。GFP又はRFP、及びNPをコードするpol-I S(pol-I 5’-GFP_IGR_NP-3’又はpol-I 5’RFP_IGR_NP-3’)は、NPをBbsI消化及びライゲーションによりpol-I Bbs/Bsmクローニングプラスミドに挿入し、かつGFP又はRFPをBsmBIクローニングによりpol-I Bbs/Bsmクローニングプラスミドに挿入することによりクローニングした。LCMV株クローン13(Cl13)のLCMV株WE及びNPのGPを有するpol-Iプラスミドは、それぞれの遺伝子を、Bbs及びBsm部位特異的な制限/ライゲーションで、pol-I Bbs/Bsmクローニングプラスミドのそれぞれの部位に挿入することによりクローニングした。
WE/WET融合GPをコードするSセグメントは、WE ORFの最後の255塩基対を、「WET」と名付けられたコドン最適化された配列で置き換えることにより得た。このことは、第一の工程で、1つのWE特異的プライマー(配列番号:11)、及びWET配列に相補的なオーバーハングを保持する1つのWE特異的融合プライマー(配列番号:12)を有するWE GPの断片をPCR増幅することにより達成された。並行して、WET配列を、WET特異的プライマー(配列番号:13)及びWE配列に相補的なWET特異的融合プライマー(配列番号:14)を用いるPCRにより増幅した。第三のPCR反応において、2つのPCR産物を、前述の2つの融合プライマーを用いるPCR融合により融合した。結果として得られたWE/WET融合断片を、BsmBIで消化し、同じ制限酵素で消化しておいたpol-I BsmBI_IGR_GFP-3’プラスミド中にライゲーションした。
インビボ組換えウイルスr3LCMV-GFPnat #3の組換えSセグメントをコードするpol-Iプラスミドを、合成されたDNA断片(GenScriptによる遺伝子合成)を、SacI及びXmaIを用いる部位特異的な制限/ライゲーションにより、pol-Iプロモーターの制御下にある野生型のSセグメントをコードするプラスミド(pol-I GP_IGR_NP)へと挿入することによりクローニングし、pol-I GP_IGR_GFPrest_IGR_NPを生じさせた。
(5.1.3 細胞のDNAトランスフェクション及び組換えウイルスの救出
BHK-21細胞を、4×105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種し、24時間後に、製造業者の説明書に従いリポフェクタミン(3μl/μgのDNA;Invitrogen)、又はjetPRIME(2μl/μgのDNA;Polyplus)のいずれかを用いて様々な量のDNAでトランスフェクトした。全体がプラスミドDNA由来の組換え2分節型ウイルスの救出のために、2つの最低限のウイルスのトランス作用因子NP及びLを、pol-II駆動型プラスミド(0.8μgのpC-NP、1μgのpC-L)から送達し、1.4μgのpol-I L及び0.8μgのpol-I Sで共トランスフェクトした。1つのL及び2つのSセグメントからなる3分節型r3LCMVの救出の場合には、両pol-I 駆動型Sセグメント0.8μgを、トランスフェクション混合物中に含めた。トランスフェクションの72時間後、上清を回収して、該ウイルスのさらなる増幅のために、BHK-21細胞で継代培養した。上清中のウイルス力価は、フォーカス形成アッセイにより決定した。
(5.1.4 ウイルス及びウイルスの増殖キネティクス)
元々は野生型LCMV Armstrong由来の野生型Cl13 LCMVがこれまでに記載されている。野生型ウイルス及び組換えウイルスのストックは、BHK-21細胞を、0.01の感染多重度(moi)で感染させることにより製造し、上清を感染後48時間で回収した。ウイルスの増殖曲線は、インビトロで6ウェル形式で行った。BHK-21細胞を、6×105細胞/ウェルの密度で播種し、24時間後に細胞を、ロッカープレート上、37°C及び5％ CO2で、500μlのウイルス接種材料と一緒に0.01のmoiで90 分間インキュベートすることで感染させた。新鮮な培地を加え、37°C/5％ CO2で、72〜96時間細胞をインキュベートした。上清を所与の時点(通常、18、24、48、72時間)で採取し、ウイルス力価をフォーカス形成アッセイで分析した。
(5.1.5 フォーカス形成アッセイ)
次に、LCMVの力価を、フォーカス形成アッセイにより決定した。LCMVは、その宿主細胞を溶解せず、従って、プラークを形成しない非細胞溶解性ウイルスである。しかしながら、本研究における単位は、正しい用語であるフォーカス形成単位(FFU)ではなく、よりよく使用される用語であるプラーク形成単位(PFU)で表わすこととする。別途記載しない限り、MC57細胞をフォーカス形成アッセイに用いた。細胞を、24ウェルプレート中の1ウェルあたり1.6×105細胞の密度で播種し、MEM/2％ FCS中に調製されたウイルスの10倍段階希釈物200μlと混合した。37℃で2〜4時間のインキュベーション後、1ウェルあたり200μlの粘稠な培地(2×補完DMEM中2％メチルセルロース)を添加し、ウイルス粒子が隣接している細胞のみに広がることを確実なものとした。37℃で48時間後、上清をはじきとばし、200μlのPBS中の4％パラホルムアルデヒド(PFA)を加えることにより、室温で30分間細胞を固定した(以下の工程は全て、室温で行う)。細胞を、1ウェルあたり200μlのBSS/1％ Triton X-100(Merck Millipore)で、20分間透過処理し、それに続きPBS/5％ FCSで60分間ブロッキングした。抗NP染色のために、ラット抗LCMV-NPモノクローナル抗体を、PBS/2.5％FCS中1:30の希釈度で一次染色抗体として60分間用いた。抗GFP染色のために、精製ラット抗GFP抗体(Biolegend 338002)を、PBS/2.5％ FCS中1:2000の希釈度で用いた。プレートを水道水で3回洗浄し、二次HRP-ヤギ抗ラット-IgGを、PBS/2.5％ FCS中1:100 PBS/2.5％の希釈度で加え、1時間インキュベートした。再度、プレートを水道水で3回洗浄した。呈色反応(PBS/0.015％ H2O2中0.5g/lのDAB(Sigma D-5637)、0.5g/lの硫酸ニッケルアンモニウム)を加え、該反応を10分後に水道水で停止させた。染色されたフォーカスを人力で計数し、最終力価を希釈度に基づいて計算した。
細胞の抗GP染色のために、プレートを50％MeOH/50％アセトンで5分間固定化し、PBSで洗浄した。ブロッキングは、上述のように行った。一次抗体として、抗GP GP83.4(ハイブリドーマより製造)をPBS/2.5％ FCS中1:10で希釈し、60分間インキュベートした。水道水で3回洗浄した後に、二次HRP-ウサギ抗マウスIgG抗体を、PBS/2.5％ FCS中1:50の希釈度で加え、60分間インキュベートした。さらに3回水道水で洗浄した後に、呈色反応を上記したように加えた。
血液中のマウスのウイルス血症を決定するために、1滴の血液(50μl体積に対応)を950μlのBSS-ヘパリン(Na-ヘパリン、Braun、最終1 IE/ml)中に採取し、ひっくり返すことにより混合し、更なる使用まで-80℃で保管した。
(5.1.6 マウス)
AGRAGマウス(IFNα/βR-/-、IFNγR-/-、RAG-/-)はすでに説明されており、特定病原体除去(SPF)条件下で飼育され収容されている。AGRAGマウスは、スイスのチューリッヒ大学のInstitut fur Labortierkundeで飼育された。動物実験は全て、スイス国の動物保護法及びジュネーブ及びバーゼルそれぞれの責任ある州当局の許可に従い、ジュネーブ大学及びバーゼル大学で行った。マウスの感染は、マウス1頭あたり1×104PFUの用量で、静脈内で行った。
(5.1.7 ウイルスRNAの調製及び配列決定)
QIAampウイルスRNAミニキット(QIAGEN)を製造業者の説明書に従い用いて、細胞培養上清からか、又は感染マウスの血清から、ウイルスRNAを抽出した。逆転写反応は、ThermoScript RT-PCRシステム(Invitrogen)及びLCMV NP(配列番号:15) に対して特異的なプライマーを、製造業者のプロトコールに従い用いて行った。PCRによる増幅を、RT工程からのcDNAを2μl及びNP及びGP特異的プライマー(配列番号:16)を用いて行った。PCR反応は、Phusion高フィデリティDNAポリメラーゼ(NEB)を用いて行った。増幅産物を2％アガロースゲル上で分析し、それから切り出し、QIAquickゲル抽出キット(QIAGEN)を用いて精製し、NP及びGP特異的プライマーを用いるDNA Sanger配列決定(Microsynth)に送った。
(5.1.8 フローサイトメトリー)
血液をCD11c(N418)、CD11b(M1/70)、CD19(6D5)、NK1.1(PK136)、CD90.2(30-H12)、及びGR-1(RB6-8C5)に対する抗体で染色した。特異的抗体で染色された表面分子の発現、並びにGFP及びRFPの発現をFlowJoソフトウェア(Tree Star、Ashland、OR)を用いて、BD LSR Fortessaフローサイトメーターで分析した。
(5.1.9 統計解析)
統計学的有意性は、Graphpad Prismソフトウェア(第6.0d版)を用いた、両側独立t検定又は一元配置分散分析、及びそれに続く多重比較のためのダネット又はボンフェローニの事後検定(post-test)により決定した。p＞0.5のP値は、有意ではない(ns)とみなす一方で、p＜0.5のP値は、有意である(*)とみなし、ここで、p＜0.01(**)及びp＜0.001(***)の段階は、高度に有意である。
(5.2 結果)
(5.2.1 組換え3分節型ウイルスは増殖して野生型LCMVよりも低い力価に達する)
野生型LCMVのゲノムは、負極性の2本の一本鎖RNAセグメント(Lセグメント1つ、Sセグメント1つ)からなる(図1A)。近年、追加の外来遺伝子を、LCMV粒子にみられる通常は2分節型であるゲノムに導入することが可能であることが示されている。NP及びGP遺伝子は、2つのSセグメント類似物上に分離し、目的遺伝子が、結果として生じるLCMVの各Sセグメント内に挿入され、3つのRNAセグメント(2つのS及び1つのL)を有する複製可能なウイルス粒子をもたらす。つい最近に公表された戦略は、NP及びGPの双方を、Sセグメントにおけるそれらの天然位置に保っており、従って、GFP又は他の導入遺伝子を、それぞれの空いた部位に配置している(r3LCMV-GFPnat)(図1B)。このことは、Sセグメントの遺伝的な再入れ替えにより、結果として生じるゲノムの生存能が無くなるという考えられるリスクを最小化することを目指す直観的なアプローチであった。しかしながら、本研究では、GPを3’UTRに並置して、それを通常はNPを駆動するプロモーターエレメントから発現することも可能であろうと仮定した(r3LCMV-GFPart;図1C)。それぞれの発現プラスミドは、組換えcDNAクローニングにより作製し、3つ全てのウイルス構築体を、完全にプラスミドDNAから救出した。比較増殖曲線は、3つのウイルスで行った(図1D)。3つのウイルスは全て、感染後48時間で最高力価を示し、3分節型ウイルスのピーク力価は、野生型ウイルスよりも10〜100倍低かった。野生型LCMVは、3.4×106PFU/mlに達し、r3LCMV-GFPnatは、2.7×104PFU/mlでピークとなり、r3LCMV-GFPartは、2.2×105PFU/mlでピークとなった。その同様に減少したピーク力価とは関係なく、r3LCMV-GFPnatは、初期の時点で、r3LCMV-GFPartよりも幾分高い無細胞感染力(cell-free infectivity)を示した。
(5.2.2 3分節型ウイルス粒子のパッケージングは、2分節型ウイルスのそれよりも効率的ではない)
これらの観察は、第二のSセグメントの追加が、ウイルスの増殖を損ない遅延させることを示唆した。このウイルスの適応度の減少が、3つのRNAセグメント全てのウイルス粒子への非効率的なパッケージングを原因とするものである可能性があり、過剰の2分節型粒子が形成され、これが新たな細胞に感染したときに、増殖性の複製に失敗したという仮定を立てた。これらの実験のために、2つの異なるレポーター遺伝子、すなわち、1つのSセグメント上にGPと一緒のGFP、及び第二のSセグメント上のRFPの隣にNPを有するr3LCMVを用いた。これは、それぞれのSセグメント上のGFP及びGPの配置のみが異なるr3LCMV-GFP/RFPnat及びr3LCMV-GFP/RFPartと名付けられた2つのウイルスをもたらした。BHK-21細胞を、r3LCMV-GFP-RFPnat又は2分節型r2LCMVに感染させ、フォーカス形成アッセイを、正常BHK-21細胞で、又は、並行して、GP(BHK-GP)又はNP(BHK-NP)のいずれかを発現する安定にトランスフェクトされたBHK-21細胞を、それぞれの遺伝子を欠くトランス補完(trans-complement)ウイルスゲノムに対する細胞基質として用いて行った。野生型及びGP補完細胞を、ヌクレオプロテイン発現ウイルスのフォーカスについて染色する一方で、NP補完細胞は、GP陽性フォーカスについて染色した。これにより、野生型のBHK-21細胞上のイムノフォーカス形成は、3分節型ビリオンのみを検出した。理論によって制限されないが、BHK-GP細胞は、3分節型ビリオンに加え、NP発現Sセグメントと組み合わせた(しかし、GP発現Sを欠く)Lセグメントを含有する2分節型のものを複製するはずである。逆に、BHK-NP細胞は、3分節型LCMV及びそれに加えて、L及びGP発現Sセグメントからなる(しかしNP発現Sセグメントを欠く)NP欠損ビリオンを複製するはずである。r3LCMV-GFP/RFPnat及びr3LCMV-GFP/RFPartの双方の感染力価は、感染力を野生型BHK-21細胞で試験した場合よりも、BHK-GP又はBHK-NP細胞で評価した場合のほうが一貫して高かった。逆に、r2LCMVの力価は、その感染力の評価に使用した細胞基質に関係なく同様であった。LCMVに対する各細胞株の寛容性における存在し得る固有の相違を補正するために、BHK-21細胞での各ウイルス力価を表示のために1つに対し規格化し、かつBHK-GP及びBHK-NP力価を、その倍数として表した。従って、存在し得るウイルスの寛容性のクローン固有の違いに関連する細胞クローンに関係する力価の相違を反映する(図2A)。r3LCMV-GFP/RFPnat及びr3LCMV-GFP/RFPartについて、補完細胞のうちのいずれか1つにおいて、約5〜10倍の力価の違いが観察され、これは、r2LCMVについてのものよりも有意に高かった。このことは、2つの3分節型ウイルスにより形成されていたウイルス粒子の大多数が、それぞれNP発現Sセグメント(NPのみの粒子)又はGP発現Sセグメント(GPのみの粒子)いずれかのみをコードする2つのSセグメントのうちの１つのみを含有していたことを示唆する。この5倍以上の力価の違いは、NPのみの粒子とGPのみの粒子の双方がそれぞれ、3分節型粒子を約5倍、数で上回り、3分節型粒子がビリオンの僅か10パーセント未満のみを占めていたことを示唆し、これは非補完細胞上で増殖された場合の遅延した増殖及びウイルスのピーク力価の減少と矛盾しない(図1D)。これらの知見は、フローサイトメトリーによりさらに検証された。非補完BHK-21細胞又はBHK-NP細胞を、r3LCMV-GFP/RFPart又はゲーティングコントロールとしてのr2LCMVに感染させ、GFP及びRFPの蛍光強度をフローサイトメーターで評価した(図2B)。野生型のBHK-21細胞では最低限のトランス作用因子が提供されないため、NP発現Sセグメントと共にLセグメントを少なくとも含有するビリオンのみが、細胞侵入後に感染サイクルを開始させることができ、蛍光シグナル(RFP)をもたらす。従って、BHK-21細胞を感染させると、NPのみの粒子を反映するRFP+GFP-細胞の集団が観察された。RFP+GFP+二重陽性の細胞は、真正の3分節型粒子の証拠であった。このゲーティングにより、RFP-GFP+細胞もまた観察され、その上RFP-GFP-細胞よりも高いRFP MFIを有していた。このことは、RFP-GFP+細胞が、3分節型粒子による感染症の初期段階を表していたことを示唆する。この解釈は、この集団とRFP+GFP+二重陽性のものとの連続性によっても支持される。しかしながら、3分節型r3LCMV-GFP/RFPartをBHK-NP細胞で増殖させ、それによってこの最低限のトランス作用因子の代わりに用いた場合、本発明者らは、非補完BHK-21細胞の感染と比較して、10倍超多い数のRFP-GFP+細胞を観察した。逆に、RFP+GFP-(NPのみの粒子の証拠)及びGFP+RFP+二重陽性の細胞(3分節型粒子)は、同程度の存在量で検出された(図2C)。これらの結果から、単一の細胞レベルで、フォーカス形成アッセイにより得られた知見が確認され、従って、3分節型ウイルス調製物が、大多数の2分節型複製欠損性粒子を含有することの確証となった。これらの知見は、r3LCMV-GFP/RFPnat及びr3LCMV-GFP/RFPartの減弱された増殖に対するもっともらしい説明を提供し、見たところ非常に非効率的な、3分節型ウイルスのランダムなパッケージングに対する洞察を提供した。
(5.2.3 インビボでの組換えを追跡するための組換えウイルスのクローニング及び救出)
3分節型ウイルスは、図1にみられるような損なわれた増殖キネティクスを示すため、NP及びGPのその遺伝情報を1つのSセグメント上のみに組み換えるというウイルスに対する高い選択圧が存在するはずであると仮定した。アレナウイルスのセグメント間の組換えが、北アメリカのクレードの系統発生学的な進化に繋がったと仮定されており、従って、3分節型ウイルスが機能的な2分節型ゲノムを再建可能となり得る機構であったようである。理論により限定されないが、2つの3分節型ウイルスのゲノム構成を見て、r3LCMV-GFPnatに対する選択圧は、IGRのエリアでの組換え事象に有利に働いたかもしれず、それによりGP及びNPを共に同じセグメント上とする一方で、GFPを除去すると仮定した。r3LCMV-GFPartの集団において、選択圧は等しく高いはずであるが、GPのリシャッフリング及び3’UTRの隣というその位置が、このウイルスが、その2つのSセグメントを1つの機能的セグメントへと結合させることを、不可能ではないにしても非常に困難なものとするはずである(以下の図7を参照されたい)。RNA組換えの特定の注意を考慮に入れ、かつそれを起こり得るcDNA汚染からしっかりと区別するために、本発明者らは、GFPと共に、末端の255ヌクレオチドがコドン最適化されている組換えGP ORFを保持するSセグメントをクローニングした。結果として得られたGPは、異なるヌクレオチド配列を有していたが、野生型のWE株GPと同一の翻訳産物を有していた(WE/WET-GP、図3A)。しかしながら、この組換えWE/WET GP ORFは、感染性の2分節型ウイルスとしては存在せず、本研究室もNPと関連するcDNA構築体を所持していなかった。従って、WE/WETをNPと同じセグメント上に含有する存在し得る2分節型ウイルスはいかなるものであっても、セグメント間組換えの明確な証拠と見なし、このようなウイルスは、それぞれのアッセイにおいて汚染する可能性のあるcDNA又はRNAから区別された。キメラGPが、ウイルスの適応度に対する作用を有していたかを試験するために、WE/WET融合GPを保持する組換え3分節型ウイルス(r3LCMV-WEWET/GFPnat)の細胞培養増殖曲線を、野生型のWE GPを保持する3分節型ウイルス(r3LCMV-WE/GFPnat)と比較して行った(図3B)。2つのウイルスの増殖キネティクス及びピーク力価は、同程度であった(r3LCMV-WE/GFPnat:1.7x106PFU/ml、r3LCMV-WEWET/GFPnat:2.3x106PFU/ml)。従って、キメラのWEWET糖タンパク質は、ウイルスの増殖に検出できるほどの影響を与えなかった。
可能性のある組換え事象が、IGRを伴い得るSセグメントのNP及びGP遺伝子の間で起こり得るかどうか試験するために、遺伝子タグとして働く単一のヌクレオチド欠失を、NPをコードするSセグメントの遺伝子間領域に導入した。このヌクレオチド欠失を選択した理由は、これが、大部分のSセグメントIGRとは異なり、株間で配列も長さも保存されていない区間に位置しているためである。組換え事象の場合には、この「タグ付けされた」(図面及び文章の双方の全体にわたり*としてマークする)遺伝子間領域は、SセグメントIGR配列の遺伝的起源の特定を可能とするはずである。欠失したシトシン(矢印でマークする)の位置及び結果として生じるNPを保持するSセグメントの概略図を、図3Cに示す。IGRに導入された欠失が、ウイルスの増殖に対する影響を有するかどうか試験するために、該単一のヌクレオチド欠失を有するか又は有しない組換えr3LCMV-GFPnatを救出した。増殖曲線実験を、BHK-21細胞(moi=0.01)で対して行った。野生型のIGRを有する3分節型ウイルス(r3LCMV-GFPnat)及び変異型であるIGRを有するその比較物(r3LCMV-GFPnat IGR*)は、類似の速度で増殖し、区別がつかないピーク力価に達した(図3D)。その結果、NPを保持するSセグメント上のIGRのタグは、ウイルスの適応度に対し検出可能な影響を有しなかった。従って、インビボでの後続の実験におけるその使用の妥当性が確認された。
(5.2.4 マウスにおけるr3LCMV-GFPnatの持続感染は、2分節型wtウイルスと同等のウイルス血症レベルに達し、GFP発現の喪失をもたらすが、r3LCMV-GFPartはそうではない)
組換えr3LCMV-GFPnatの救出の際の目的は、3分節型ウイルスがインビボで組み換えられたかどうかを調査することであった。この目的のために、AGRAGマウスを、r3LCMV-GFPnat、r3LCMV-GFPart、又は対照としての2分節型r2LCMVに感染させた。AGRAGマウスは、標的とする欠失を、インターフェロン-α/β受容体、インターフェロン-γ受容体、及びRAG1をコードする遺伝子に保持しており、これは、免疫不全の表現型及び3分節型LCMVに感染後の慢性ウイルス血症の樹立に繋がる。血液サンプルを経時的に採取し、ウイルス力価をフォーカス形成アッセイにより評価した(図4A)。2分節型LCMVのキャリアは、感染後5日以内で5×105PFU/ml血液の範囲の高力価のウイルス血症を示し、それに続き、感染後少なくとも50日目まで104〜105PFU/mlの範囲の安定なウイルス血症を示した。3分節型LCMVに感染したマウスは、細胞培養物における減弱された増殖と一致して、20日目まで、約5×103PFU/ml血液のウイルス負荷を示した(図1Dと比較)。30日目以降は、r3LCMV-GFPnatのキャリアは、ウイルス負荷の上昇を示し、これは、r3LCMV-GFPartに感染した動物には観察されず、50日目にはウイルス血症の10倍を超える違いをもたらした。支配的なウイルス集団がまだGFPレポーター遺伝子を保持しており、従って、感染細胞においてGFP発現をもたらすかどうかを決定するために、感染後127日目に採取した3LCMV-GFPnat及びr3LCMV-GFPartキャリアの血液サンプルを用いたウイルスのフォーカス形成アッセイを行い、ヌクレオプロテイン又はレポーター遺伝子GFPについて染色した(図4B)。r3LCMV-GFPartキャリアから単離された血液の染色は、抗NP及び抗GFP抗体検出で等しい量のフォーカスをもたらした一方で(双方の評価は、独立して、103PFU/mlの範囲のウイルス力価を含んだ)、GFPを発現するフォーカスよりも少なくとも100倍大きい数の総(NP+)r3LCMV-GFPnatフォーカスが明らかであった。少なくとも104PFU/mlのウイルスの力価が、抗NP検出に基づいて測定された一方で、3頭のマウスのうちの2頭は、検出可能なGFP陽性の感染を全く示さず、1頭のマウスは、本発明者らのアッセイの検出の下限に対応する、100PFU/mlの範囲のGFP陽性フォーカスの残りの画分を有していた。感染細胞のGFP発現もまた、蛍光顕微鏡法により評価した(データは示さず)。r3LCMV-GFPnatキャリア由来の血液をアッセイした場合、GFP蛍光フォーカスは、実質的に検出不能であった。一方、r3LCMV-GFPartキャリア血液由来のGFP陽性フォーカスのマニュアル計数は、抗NPフォーカス形成アッセイで得られた力価の結果と釣り合うものであった。レポーター遺伝子発現をさらに、感染後120日目に感染マウスのPBMCのフローサイトメトリー分析で確認した。本発明者らは、r3LCMV-GFPart感染動物において、10％超のCD11b+GR1-単球/マクロファージがGFP陽性である一方で、r3LCMV-GFPnat由来の血液は、非蛍光r2LCMVに感染した動物と同程度である僅かにバックグラウンドレベルのGFPの証拠を示した(図4C〜E)。この知見はさらに、それらの天然位置にGPを有する3分節型ウイルスが、経時的にレポーター遺伝子発現を失う一方で、人工の3’UTR並置におけるGPの転位は導入遺伝子の喪失を予防するという仮説を支持した。
(5.2.5 天然位置にGPを有する3分節型ウイルスは、それらの2つのSセグメントを組み換えて、導入遺伝子配列の痕跡に隣接する部分的な又は完全なIGR重複を有する単一のSセグメントをもたらすことができる)
図4は、r3LCMV-GFPnatに感染したマウスにおいて上昇したウイルス血症及びレポーター遺伝子発現の喪失を示した。従って、組換え事象が、この実験的な結果を説明し得ると仮定した。セグメント間組換えは、GP及びNPを、同じSセグメント上に組み合わせて、ウイルス複製サイクルにおいて第二のSセグメントを不必要にするはずである。レポーター遺伝子発現の喪失と組み合わせて、このような事象は、さらに、野生型ウイルスのレベルのウイルス血症を説明できたであろう。この可能性を試験するために、感染マウスの血清由来のウイルスRNAを単離して、NP及びGP配列にそれぞれ結合する1組のプライマーを用いて、1つのRNAセグメント上にアンビセンス配向性でNP ORF及びGP ORFの双方を保持している組み換えられたと推定されるRNA分子のみを、RT-PCRにより選択的に増幅させた。結果として得られたPCR断片を、ゲル電気泳動により分析した(図5A)。全てのr3LCMV-GFPnatキャリアの血清は、RT依存性のPCR産物を生じさせた一方で、r3LCMV-GFPartキャリア及び未処理の対照は、特定のバンドを示さなかった。対照PCR反応を、PCR産物の発生源としてのcDNA汚染を排除するために、模擬的にRT処理したRNAサンプルに対して行った。3頭のr3LCMV-GFPnatキャリアそれぞれの配列決定結果を、図5Cに模式的に示した。この3頭のマウスは、類似のパターンを有するものの、別個の配列のウイルスRNAセグメントを含有していた:GP及びNPのC-末端部分は、1つのRNAセグメント上にアンビセンス配向性で見出された。これらの間で、双方の遺伝子間領域、すなわち、NP発現セグメントのもの及び元のGP発現セグメントのものは、少なくとも部分的に保持されており、3分節型ウイルスの親のSセグメントにおけるGFPレポーター遺伝子のいずれか一方又は双方由来の断片により分離されていた。GFP断片の方向及び長さは、個々のマウスから回収された3つのRNA種間で変化し、このことは、独立した組換え事象を示していた。この考えをさらに支持して、正確に同じ組み換えRNA配列が、3週間を超えるサンプリング間隔で同じマウスから採取された2つの連続したサンプルから回収された。得られた組換えSセグメント配列に基づいて、本発明者らは、図7に模式的に概略が示され図面の説明文に記載されているような、r3LCMV-GFPnatが、その2つのSセグメントを組み変えて、導入遺伝子の喪失及び野生型ウイルスへの表現型の復帰をもたらす分子機構を提案した。また、図7の模式図は、何故、提案されたSセグメント組換えの機構により、r3LCMV-GFPartがそのNP ORF及びGP ORFを組み換えて、1つの機能的Sセグメントに一緒にすることができないのかを説明する。
(5.2.6 Sセグメント上に2つのIGRを有する組換えr2LCMVは生存可能であり、Sセグメントに1つのIGRのみを有する2分節型LCMVと類似の力価まで増殖する)
上記の配列決定データは、IGRの(少なくとも部分的な)重複が、その間で特に注目すべきでありかつ特徴的であった組換えSセグメントにおけるウイルスの遺伝学的なエレメントの矛盾のないパターンを明らかとした。しかしながら、1つのSセグメント上に遺伝子間領域の反復を有するアレナウイルスは、公知ではなかった。しかしながら、デュアルステムループが、旧世界アレナウイルスであるモペイア(Mopeia)に天然に発見されている。従って、本発明者らは、r3LCMV-GFPnatキャリア#3の再編成されたSセグメントを、2つのIGR及びGFPのレムナントとともに、pol-I駆動型Sセグメント発現プラスミド中にクローニングし、それぞれのウイルスを救出した。BHK-21細胞でのこのウイルス(r2LCMV_2IGRs)の増殖キネティクスを、3分節型r3LCMV-GFPnat及び2分節型r2LCMVと比較した(図6)。r2LCMV_2IGRの感染無細胞力価は、初期の時点ですでに、r3LCMV-GFPnatのそれを超えており、r2LCMVと同一のピーク力価に達した(それぞれ1.7×107PFU/ml対1.6×107PFU/ml)。重要なことに、r2LCMV_2IGRは、その親の3分節型r3LCMV-GFPnatよりもかなり高いピーク力価まで増殖し、本プロセスの間のIGRの重複にもかかわらずセグメント間組換えの選択有利性を証明した。
(5.2.7 卵白アルブミン(OVA)を発現する組換えr3LCMVは、迅速、強力、かつ多機能的なOVA特異的CD8+T細胞応答を誘導する）
ワクチン接種目的でのr3LCMVartベクター送達技術の有用性を試験するために、本発明者らは、r3LCMV-GFPart(図1C)に類似であるが、そのウイルスにおけるそれぞれのGFP遺伝子の代わりに、2つの卵白アルブミン(OVA)遺伝子を有するゲノム構成を有するr3LCMV-OVAartワクチンベクターを作製した。本発明者らは、筋肉内(i.m.)の104PFUのr3LCMV-OVAartで、C57BL/6マウスを免疫化し、8日後、本発明者らは、脾臓でのT細胞応答を分析した。広く用いられているベクタープラットフォームとの比較のために、本発明者らは、C57BL/6マウスの第二の群を、108粒子の、同じくOVAを発現する複製欠損性E1欠損アデノウイルス5-ベースのベクター(rAd5-OVA)で免疫化した。免疫優性のOVA誘導
Figure 2017535267
 エピトープを認識するOVA特異的CD8+T細胞の頻度は、r3LCMV-OVAartワクチン群におけるCD8+T細胞の10％の範囲であり、これは、rAd5-OVA群よりも有意に高かった(図8A)。r3LCMV-OVAart誘導性CD8+T細胞応答は、細胞内サイトカインアッセイにより決定されるように、高い重要性のものであるだけでなく高度に機能的なものでもあり、大部分の
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 反応性r3LCMV-OVAart誘導性CD8+T細胞が、ペプチド刺激に応答してIFN-γを産生したこと、及びかなりの比率が、TNF-α及び/又はIL-2を共産生したことが明らかにされた。このことは、ワクチン送達に対するr3LCMV-OVAartベクター技術の有用性を実証した。
(5.2.8 3分節型LCMVは、多機能的なメモリーCD8+T細胞を誘導する)
r3LCMVベクターが、機能的CD8+T細胞メモリーを誘導するかどうかという問題に対処するために、本発明者らは、C57BL/6マウスを、10e5PFUのr3LCMV-OVAartでi.v.免疫化し、25日目に、脾臓でのOVA特異的(
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 特異的)CD8+T細胞応答を分析した。マウスの参照対照群を、OVAを発現する組換えE1欠損アデノウイルスのベクター(rAd)の10e8個のウイルス粒子(vp)で、同じ経路でワクチン接種した。ペプチド刺激に際しIFN-γ、TNF-α、及び/又はIL-2を産生するOVA特異的CD8+T細胞を、
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 ペプチド刺激に際し標準的な細胞内サイトカインアッセイで評価した。チャートに示したようなサイトカイン産生細胞の頻度(図9A)及び絶対数(図9B)を決定した。r3LCMV-OVAart免疫マウスは、rAd-OVA免疫マウスよりも、有意に高い頻度及び数の多機能的なIFN-γ/TNF-α及びIFN-γ/TNF-α/IL-2共産生性のOVA特異的CD8+T細胞を示した。
(5.2.9 抗原をコードするLCMVは、外来抗原及び自己抗原に対する特異的T細胞応答を誘導する)
r3LCMVartベクターを活用して、腫瘍発現自己抗原に対するCD8+T細胞応答を誘導し得るかどうか調査するために、本発明者らは、BALB/cマウスを、ラット
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 ヒト
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 又はマウス
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 Her2誘導CD8+T細胞エピトープのいずれかを発現するr3LCMVartベクターで免疫化した(図10)。9日後、本発明者らは、細胞内サイトカインアッセイにおいて、それぞれのペプチドでの刺激に際しIFN-γ、TNF-α、及び/又はIL-2を産生する特異的CD8+T細胞を測定した。図10は、エピトープ特異的CD8+T細胞の頻度を、同族ペプチドでの刺激に際し、示されたサイトカインの組合せを産生するCD8+T細胞の百分率として示す。培地のみでの再刺激の際のサイトカイン産生CD8+T細胞の頻度は、僅かであった。結果は、r3LCMVartベクターが、かなりの頻度の腫瘍自己抗原反応性CD8+T細胞応答を誘導する能力を有することを実証する。
(5.2.10 r3LCMVart感染に際しインターフェロン-αが誘導されるが、組換えのアデノウイルスベクター又はワクシニアウイルスベクターの感染では誘導されない)
I型インターフェロンは、複数の免疫賦活性及び抗腫瘍性作用を有する可能性がある。従って、I型インターフェロンの誘導は、ウイルスにより媒介されるワクチンの好ましい特徴を意味する可能性がある。本発明者らは、ELISA測定を行い、r3LCMV-OVAart、rAd-OVA、又はOVAを発現する組換えワクシニアウイルス(rVacc)で前もって24、48、又は72時間免疫化したマウスの血清中のインターフェロン-アルファ濃度を決定した(図11)。r3LCMVartは、検出可能かつ持続性の(少なくとも48時間)全身的インターフェロン-アルファ反応を誘導したが、rAdもrVaccも誘導しなかった。このことは、r3LCMVartベクターの、強力な自然免疫応答を誘導する能力の証拠となる。
(5.2.11 r3JUNV-GFPnat及び親のフニン株Candid#1と比較したr3JUNV-GFPartの細胞培養増殖)
図1Bに概略が示されているゲノムを保持しているr3LCMV-GFPnat及びr3LCMV-GFPartベクターとの類似で、本発明者らは、それぞれの2つのSセグメントのうちの1つずつにGFP遺伝子を保持する3分節型フニンワクチン株Candid#1-ベースのベクターからなるr3JUNV-GFPnat及びr3JUNV-GFPartを設計した(r3JUNV-GFPnat及びr3JUNV-GFPart)。本発明者らが0.01の感染多重度で感染させた293T細胞でのそれらの増殖性を本発明者らは試験し、上清を経時的に採取した(図12)。本発明者らは、r3JUNV-GFPartが、その親の２分節型フニンワクチン株Candid#1よりもゆっくりと増殖したことを見出した(図12)。しかしながら、それは、r3JUNV-GFPnatよりも速く増殖した(図12)。この3分節型フニンウイルスベースのベクターの異なる増殖挙動は、r3LCMV-GFPnat及びr3LCMV-GFPartベクターの増殖速度と類似していた(図1D)。
(5.2.12 3分節型JUNVはインビボで劇的に弱毒化されており、長期のインビボでの複製に際し、r3JUNV-GFPnatはGFP発現を失うが、r3JUNV-GFPartは失わない)
r3JUNV-GFPnat及びr3JUNV-GFPartの遺伝的安定性を調査するために、本発明者らは、AGRAGマウス(IFNα/βR-/-、IFNγR-/-、RAG-/-)を、7×10e4PFUのこれらのGFP発現ベクターのうちのいずれかに感染させた。比較の目的のために、第三の群を野生型２分節型Candid#1ウイルスに感染させた。後者のウイルスは、感染後20日目までに全ての感染マウスの血液中に容易に検出された(図13A)。一方で、3分節型ウイルスは、少なくとも40日間検出不能なままであった。この知見は、ゲノム再構成の結果として弱毒化されているインビボでの増殖を証明し、r3LCMV-GFPベクターを用いた図4Aの本研究者らの知見をフニンベースのベクターまで拡張した。40日後、r3JUNV-GFPnat及びr3JUNV-GFPartも各群の数頭の動物で検出可能となった(図13A)。しかしながら、重要なことに、r3JUNV-GFPnat感染マウスの一部が野生型Candid#1感染マウスの範囲のウイルス負荷に達した一方で、ウイルス血症のr3JUNV-GFPart感染マウスは、Candid#1感染対照よりも低いウイルス負荷を保持した。
これらのウイルス血症の動物における支配的なウイルス集団が、GFPレポーター遺伝子をいまだ保持しており、従って、感染細胞においてGFP発現をもたらすかどうかを決定するために、本発明者らは、感染後120日目に採取したr3JUNV-GFPnat及びr3JUNV-GFPartキャリアの血液サンプルを用いたウイルスのフォーカス形成アッセイを行った。本発明者らは、GFP発現を保持しているウイルスの感染力価(抗GFP、図13B)及び総フニンウイルス感染力(抗NP、図13B)を比較した。r3JUNV-GFPart力価は、抗GFP又は抗NPイムノフォーカスアッセイのいずれかにより決定した場合類似の範囲にあり、ウイルス集団の大部分がGFP発現を維持していたことを実証した。逆に、最も高いウイルス血症(野生型Candid#1と同程度)を有する4頭のr3JUNV-GFPnat感染動物の血液中では、抗GFP感染力価は、NP染色により決定した総感染力価よりも少なくとも10倍低かった。このことは、r3JUNV-GFPartはインビボでGFP導入遺伝子を安定に維持したが、r3JUNV-GFPnatはしなかったことを実証した。
(5.2.13 3分節型LCMV及びJUNVベースのワクチンベクターの相同かつ異種のプライムブースト組合せは、強力なP1A自己抗原特異的CD8+T細胞応答を誘導する)
次に、本発明者らは、r3LCMVart及びr3JUNVartベースのベクターを、腫瘍自己抗原特異的CD8+T細胞応答を誘導するための相同かつ異種のプライムブースト組合せに使用し得るかどうかを調査した。本発明者らは、P815マウスマスト細胞腫由来の自己抗原P1A(配列番号:24)(r3LCMV-P1Aart(配列番号:18、19、20)及びr3JUNV-P1Aart(配列番号:21、22、23))を発現するr3LCMVart及びr3JUNVartベースのベクターを構築した。これらのワクチン構築体を用いて、図14に概略が示されている相同かつ異種のプライムブースト組合せでBALB/cマウスをi.v.で免疫化した。r3LCMV-P1Aart及びr3JUNV-P1Aartの双方は、相同プライムブーストワクチン接種において投与された場合に、
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 ペプチド(P1Aエピトープ35〜43)を負荷したH-2Ld-テトラマーを用いて血液から決定されるP1Aエピトープ特異的CD8+T細胞を誘導した。実験63日目でのエピトープ特異的CD8+T細胞の平均頻度は、それぞれ1.2％(r3JUNV-P1Aart)及び3.9％(r3LCMV-P1Aart)であった。更に、異種の様式でr3JUNV-P1Aartでプライミングされ、r3LCMV-P1Aartでブーストされた動物は、63日目に平均エピトープ特異的CD8+T細胞頻度が19.5％であるさらに高い応答を開始した。r3LCMV-P1Aartによりプライミングされ及びr3JUNV-P1Aartによりブーストされた動物の頻度(3.1％)は、r3LCMV-P1Aart相同プライムブーストワクチン接種を受けたものと同程度であった。
(6. 均等物)
本明細書において開示されるウイルス、核酸、方法、宿主細胞、及び組成物は、本明細書に記載される具体的な実施態様による範囲に限定されるべきではない。実際に、記載されたものに加えて、ウイルス、核酸、方法、宿主細胞、及び組成物の種々の変更形態が、前述の説明及び添付の図面より当業者には明らかとなろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
種々の刊行物、特許、及び特許出願が本明細書中に引用されており、その開示は、その全体が引用により組み込まれている。
種々の刊行物、特許、及び特許出願が本明細書中に引用されており、その開示は、その全体が引用により組み込まれている。
(7. 配列表)
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Claims (75)

  1. ウイルスのオープンリーディングフレーム(「ORF」)を、該ORFの野生型の位置とは別の位置に保持するよう操作されたアレナウイルスゲノムセグメントであって:
    (i)ヌクレオプロテイン(「NP」)をコードするORFが、アレナウイルス5’非翻訳領域(「UTR」)の制御下にあるSセグメント;
    (ii)マトリックスタンパク質Z(「Zタンパク質」)をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (iii)RNA依存性RNAポリメラーゼL(「Lタンパク質」)をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (iv)ウイルスの糖タンパク質(「GP」)をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (v)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (vii)GPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (viii)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (ix)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (x)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (xi)NPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;及び
    (xii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメントからなる群から選択される、前記アレナウイルスゲノムセグメント。
  2. 前記アレナウイルス3’UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3’UTRであり、かつ前記アレナウイルス5’UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5’UTRである、請求項1記載のアレナウイルスゲノムセグメント。
  3. 請求項1記載のアレナウイルスゲノムセグメントのcDNA。
  4. 請求項3記載のcDNAを含むDNA発現ベクター。
  5. 請求項1記載のアレナウイルスゲノムセグメント、請求項3記載のcDNA、又は請求項4記載のベクターを含む宿主細胞。
  6. Sセグメント及びLセグメントを含むように、請求項1記載のアレナウイルスゲノムセグメント、及び第二のアレナウイルスゲノムセグメントを含む、アレナウイルス粒子。
  7. 感染性かつ複製可能である、請求項6記載のアレナウイルス粒子。
  8. 弱毒化されている、請求項6記載のアレナウイルス粒子。
  9. 感染性ではあるが、非補完細胞において感染性の子孫をさらに生じさせることはできない、請求項6記載のアレナウイルス粒子。
  10. GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つが、除去されているか、又は機能的に不活性化されている、請求項9記載のアレナウイルス粒子。
  11. GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの少なくとも1つが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、請求項9記載のアレナウイルス粒子。
  12. GP、NP、Zタンパク質、及びLタンパク質をコードする4つのORFのうちの１つのみが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、請求項9記載のアレナウイルス粒子。
  13. GPをコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、請求項9記載のアレナウイルス粒子。
  14. NPをコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、請求項9記載のアレナウイルス粒子。
  15. Zタンパク質をコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、請求項9記載のアレナウイルス粒子。
  16. Lタンパク質をコードするORFが除去されて、アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFと置き換えられている、請求項9記載のアレナウイルス粒子。
  17. 前記異種ORFが、レポータータンパク質をコードする、請求項11〜16のいずれか１項記載のアレナウイルス粒子。
  18. 前記異種ORFが、感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原をコードする、請求項11〜17のいずれか１項記載のアレナウイルス粒子。
  19. 抗原をコードする前記異種ORFが、ヒト免疫不全ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、結核菌抗原、及び腫瘍関連抗原から選択される、請求項18記載のアレナウイルス粒子。
  20. 前記アレナウイルス粒子の増殖又は感染力が、前記アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFにより影響されない、請求項11〜18のいずれか１項記載のアレナウイルス粒子。
  21. 請求項3記載のcDNAを転写することを含む、請求項1記載のアレナウイルスゲノムセグメントを生成させる方法。
  22. 請求項6記載のアレナウイルス粒子を産生させる方法であって、
    (i)請求項3記載のcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;
    (ii)前記第二のアレナウイルスゲノムセグメントのcDNAを含むプラスミドを、該宿主細胞にトランスフェクトすること;
    (iii)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び
    (iv)該アレナウイルス粒子を回収すること、
    を含む、前記方法。
  23. 前記Lセグメント及び前記Sセグメントの転写が、双方向性プロモーターを用いて行われる、請求項22記載の方法。
  24. アレナウイルスポリメラーゼをコードする1以上の核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む、請求項22記載の方法。
  25. 前記アレナウイルスポリメラーゼが、Lタンパク質である、請求項22記載の方法。
  26. NPタンパク質をコードする1以上の核酸を、前記宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む、請求項22又は24記載の方法。
  27. 前記Lセグメント及び前記Sセグメントの転写が、それぞれ:
    (i)RNAポリメラーゼIプロモーター;
    (ii)RNAポリメラーゼIIプロモーター;及び
    (iii)T7プロモーター
    からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項22記載の方法。
  28. 請求項10又は11〜16記載のアレナウイルス粒子、及び医薬として許容し得る担体を含むワクチン。
  29. 請求項10又は11〜16記載のアレナウイルス粒子、及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物。
  30. リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(「LCMV」)由来である、請求項1記載のアレナウイルスゲノムセグメント、又は請求項6記載のアレナウイルス粒子。
  31. 前記LCMVが、MPステイン、Armstrong株、又はArmstrongクローン13株である、請求項30記載のアレナウイルスゲノムセグメント又はアレナウイルス粒子。
  32. フニンウイルスワクチンCandid #1、又はフニンウイルスワクチンXJクローン3株由来である、請求項1記載のアレナウイルスゲノムセグメント、又は請求項6記載のアレナウイルス粒子。
  33. 1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、該3分節型アレナウイルス粒子の増殖が、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体、及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、かつ104PFUの該3分節型アレナウイルス粒子に感染しているマウスにおける70日間の持続感染後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない、前記3分節型アレナウイルス粒子。
  34. 2つのアレナウイルスORFを、2つの別のセグメント上にではなく単一のセグメント上に一体化する、前記2つのSセグメントのセグメント間組換えが、ウイルスのプロモーター活性を抑制する、請求項33記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  35. 2つのLセグメント及び1つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、該3分節型アレナウイルス粒子の増殖が、I型インターフェロン受容体、II型インターフェロン受容体、及び組換え活性化遺伝子1(RAG1)を欠き、かつ104PFUの該3分節型アレナウイルス粒子に感染しているマウスにおける70日間の持続感染後に、複製可能な2分節型ウイルス粒子をもたらさない、前記3分節型アレナウイルス粒子。
  36. 2つのアレナウイルスORFを、2つの別のセグメント上にではなく単一のセグメント上に一体化する、前記2つのLセグメントのセグメント間組換えが、ウイルスのプロモーター活性を抑制する、請求項35記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  37. 前記2つのSセグメントのうちの1つが:
    (i)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (ii)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;
    (v)LをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント;及び
    (vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるSセグメント、
    からなる群から選択される、請求項33記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  38. 前記2つのLセグメントのうちの1つが:
    (i)GPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (ii)NPをコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (iii)Lタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス5’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (iv)GPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;
    (v)NPをコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント;及び
    (vi)Zタンパク質をコードするORFが、アレナウイルス3’UTRの制御下にあるLセグメント、
    からなる群から選択される、請求項35記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  39. 前記アレナウイルス3’UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの3’UTRであり、かつ前記アレナウイルス5’UTRが、アレナウイルスSセグメント又はアレナウイルスLセグメントの5’UTRである、請求項37又は38記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  40. 前記2つのSセグメントが、(i)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ又は2つ;又は(ii)複製されたアレナウイルスORFを1つ又は2つ;又は (iii)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ及び複製されたアレナウイルスORFを1つ含む、請求項33記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  41. 前記2つのLセグメントが、(i)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ又は2つ;又は(ii)複製されたアレナウイルスORFを2つ;又は(iii)アレナウイルス以外の生物由来の異種ORFを1つ及び複製されたアレナウイルスORFを1つを含む、請求項35記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  42. 前記異種ORFが、感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原をコードする、請求項40又は41記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  43. 抗原をコードする前記異種ORFが、ヒト免疫不全ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、結核菌抗原、及び腫瘍関連抗原から選択される、請求項42記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  44. 少なくとも1つの異種ORFが、蛍光タンパク質をコードする、請求項40又は41記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  45. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質である、請求項44記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  46. 4つのアレナウイルスORFの全てを含み、かつ、感染性かつ複製可能である、請求項33〜43のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  47. 4つのアレナウイルスORFのうちの1つ以上を欠き、感染性ではあるが、非補完細胞において感染性の子孫をさらに生じさせることはできない、請求項33〜45のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  48. 4つのアレナウイルスORFのうちの1つを欠き、感染性ではあるが、非補完細胞において感染性の子孫をさらに生じさせることはできない、請求項33〜45のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  49. 前記アレナウイルスが、GP ORFを欠く、請求項46又は47記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  50. 1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、第一のSセグメントが、アレナウイルス3’UTRの制御下にある位置にGPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス5’UTRの制御下にある位置に第一の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう操作されており、かつ第二のSセグメントが、アレナウイルス3’UTRの制御下にある位置にNPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス5’UTRの制御下にある位置に第二の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう操作されている、前記3分節型アレナウイルス粒子。
  51. 1つのLセグメント及び2つのSセグメントを含む3分節型アレナウイルス粒子であって、第一のSセグメントが、アレナウイルス5’UTRの制御下にある位置にGPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス3’UTRの制御下にある位置に第一の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう操作されており、第二のSセグメントが、アレナウイルス5’UTRの制御下にある位置にNPをコードするORFを保持し、かつアレナウイルス3’UTRの制御下にある位置に第二の目的遺伝子をコードするORFを保持するよう操作されている、前記3分節型アレナウイルス粒子。
  52. 前記目的遺伝子が、感染性の生物、腫瘍、又はアレルゲン由来の抗原をコードする、請求項50又は51記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  53. 前記目的遺伝子が、ヒト免疫不全ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、結核菌抗原、及び腫瘍関連抗原から選択される抗原をコードする、請求項52記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  54. 少なくとも1つの目的遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項50又は51記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  55. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質である、請求項54記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  56. 請求項33、35、37、38、50、又は51のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子ゲノムのcDNA。
  57. 請求項56記載のcDNAを含む、DNA発現ベクター。
  58. 請求項33又は35記載の3分節型アレナウイルス粒子、請求項56記載のcDNA、又は請求項57記載のベクターを含む、宿主細胞。
  59. 弱毒化されている、請求項33〜51のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  60. 請求項33記載の3分節型アレナウイルス粒子を産生させる方法であって:
    (i)前記Lセグメント及び2つのSセグメントの1つ以上のcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;
    (ii)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び
    (iii)該アレナウイルス粒子を回収すること、
    を含む、前記方法。
  61. 請求項35記載の3分節型アレナウイルス粒子を産生させる方法であって:
    (i)2つのLセグメント及び1つのSセグメントの1つ以上のcDNAを、宿主細胞にトランスフェクトすること;
    (ii)該宿主細胞を、ウイルス形成に適した条件下で維持すること;及び
    (iii)該アレナウイルス粒子を回収すること、
    を含む、前記方法。
  62. 1つのLセグメント及び2つのSセグメントの転写が、双方向性プロモーターを用いて行われる、請求項60記載の方法。
  63. 2つのLセグメント及び1つのSセグメントの転写が、双方向性プロモーターを用いて行われる、請求項61記載の方法。
  64. アレナウイルスポリメラーゼをコードする1以上の核酸を、前記宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む、請求項60又は61記載の方法。
  65. 前記アレナウイルスポリメラーゼが、Lタンパク質である、請求項62記載の方法。
  66. NPタンパク質をコードする1以上の核酸を、宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに含む、請求項60、61、62、又は63記載の方法。
  67. 前記Lセグメント、及び前記2つのSセグメントの転写が、それぞれ:
    (i)RNAポリメラーゼIプロモーター;
    (ii)RNAポリメラーゼIIプロモーター;及び
    (iii)T7プロモーター、
    からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項60記載の方法。
  68. 2つのLセグメント、及び前記Sセグメントの転写が、それぞれ:
    (i)RNAポリメラーゼIプロモーター;
    (ii)RNAポリメラーゼIIプロモーター;及び
    (iii)T7プロモーター、
    からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項61記載の方法。
  69. 2分節型アレナウイルス粒子と同じトロピズムを有する、請求項33〜51のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  70. 複製欠損性のものである、請求項33〜51のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  71. 請求項33〜51、69、又は70のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子、及び医薬として許容し得る担体、を含むワクチン。
  72. 請求項33〜51、69、又は70のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子、及び医薬として許容し得る担体、を含む医薬組成物。
  73. LCMV由来である、請求項33〜51、69、又は70のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  74. 前記LCMVが、MPステイン、Armstrong株、又はArmstrongクローン13株である、請求項73記載の3分節型アレナウイルス粒子。
  75. フニンウイルスワクチンCandid #1、又はフニンウイルスワクチンXJクローン3株由来である、請求項33〜51、69、又は70のいずれか1項記載の3分節型アレナウイルス粒子。
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