ES2868427T3 - Vacunas contra el CMV - Google Patents

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ES2868427T3 ES14820762T ES14820762T ES2868427T3 ES 2868427 T3 ES2868427 T3 ES 2868427T3 ES 14820762 T ES14820762 T ES 14820762T ES 14820762 T ES14820762 T ES 14820762T ES 2868427 T3 ES2868427 T3 ES 2868427T3
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Thomas Monath
Farshad Guirakhoo
Gerhard Fuhrmann
Katherine Cohen
Vera Baumgartl-Strasser
Andreas Aspöck
Manuela Kainer
Bernhard Brim
Bettina Kiefmann
Elizabeth Watson
Mario Aistleithner
Katharina Bayer
Elsa Mühlbacher
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Abstract

Un vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente diseñado por ingeniería para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas, en donde el vector viral es capaz de producir virus de progenie infecciosos en células complementarias, pero no es capaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células no complementarias, en donde el marco de lectura abierto de arenavirus que codifica la proteína GP dentro del segmento S se elimina y se reemplaza por: a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana; o b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas contra el CMV
Referencia cruzada a aplicación relacionada
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 61/911.135 presentada el 3 de diciembre, 2013 y la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 62/055.699 presentada el 26 de septiembre, 2014.
1. Introducción
La invención se refiere a arenavirus modificados genéticamente adecuados como vacunas para la prevención y el tratamiento de las infecciones por citomegalovirus y su reactivación. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y a su uso en métodos para el tratamiento de infecciones por citomegalovirus y su reactivación. Específicamente, en la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas, vacunas como tales y para su uso en métodos de tratamiento de infecciones por citomegalovirus y su reactivación.
2. Antecedentes
2.1 Necesidad médica
El citomegalovirus humano (HCMV) es un virus beta-herpes ubicuo que típicamente causa una infección asintomática latente crónica en individuos sanos, con una seroprevalencia general de CMV ajustada por edad en el mundo desarrollado de más del 50% (Bate et al., Clin. Infect. Dis., 2010, 50 (11):1439; La Rosa y Diamond, Future Virol., 2012, 7 (3):279). Sin embargo, en los pacientes inmunocomprometidos, especialmente los receptores de trasplantes, las personas infectadas por el VIH y los recién nacidos con infección congénita, el CMV causa una morbilidad y una mortalidad significativas y, por lo tanto, plantea un importante problema de salud pública.
La infección por HCMV es la causa más común de infección viral congénita en el mundo desarrollado. En los Estados Unidos nacen aproximadamente 40.000 bebés con infección congénita por año. La infección congénita por CMV puede dar lugar a una amplia gama de discapacidades del desarrollo neurológico y representa la causa infecciosa más común de pérdida auditiva en los niños. El gran impacto en la salud pública del HCMV se demuestra por el hecho de que más niños sufren de secuelas a largo plazo como resultado de una infección congénita por CMV que el síndrome de Down o el síndrome de alcoholismo fetal (Cannon et al., BMC Public Health, 2005, 5:70).
Además de su impacto como infección perinatal, el HCMV también es una causa importante de complicaciones infecciosas en pacientes trasplantados, provocando neumonitis, hepatitis, ulceración gastrointestinal, retinitis y muerte. Aunque hoy en día estas formas graves de enfermedad de órganos terminales se pueden prevenir en la mayoría de los casos mediante el uso rutinario y costoso de la terapia preventiva con fármacos antivirales, la reactivación tardía de la infección por CMV sigue siendo un problema. Además, el CMV desencadena efectos indirectos tales como el rechazo del injerto, la aterosclerosis acelerada tras el trasplante de corazón o pulmón o la inmunosupresión.
Además, la infección y/o reactivación por CMV también se asocian significativamente con la mortalidad en pacientes con VIH, así como en pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos.
2.2 Inmunidad contra el HCMV y desarrollo de vacunas
El importante impacto en la salud pública del CMV congénito ha llevado al Instituto de Medicina de EE. UU. a clasificar el desarrollo de una vacuna contra el CMV como una de las principales prioridades en su informe reciente "Vaccines for the 21 st Century ". Aunque los esfuerzos para el desarrollo de vacunas se han realizado durante varias décadas; hasta el momento no se dispone de ninguna vacuna contra el CMV autorizada. Se ha demostrado que el desarrollo de una vacuna eficaz es difícil ya que todavía existen brechas críticas en la comprensión de la epidemiología y la transmisión del CMV.
El CMV rara vez provoca la enfermedad en huéspedes inmunocompetentes sanos, donde la inmunidad contra el CMV proporciona cierto nivel de protección y desempeña un papel esencial en el mantenimiento de la infección asintomática. Sin embargo, el sistema inmune humano no puede eliminar la infección y el CMV generalmente establece infecciones crónicas que pueden persistir durante toda la vida a pesar de la inmunidad del huésped. Por el contrario, la viremia incontrolada por CMV y los síntomas que ponen en peligro la vida ocurren fácilmente después de la inmunosupresión y en el huésped inmaduro.
Ya se han estudiado en ensayos clínicos varias vacunas candidatas basadas en diferentes tecnologías. Se ha demostrado una protección parcial mediante vacunación con candidatos a vacuna vivos atenuados y con glicoproteínas que inducen respuestas de anticuerpos específicos contra CMV. También se ha mostrado que la inmunización pasiva con anticuerpos proporciona cierta protección. Sin embargo, una vez que se ha establecido la infección latente, parece ser necesaria una fuerte inducción de células T específicas de CMV para controlar la reactivación y la enfermedad.
2.3 Antígenos de la vacuna contra el HCMV
Varios datos indican que los anticuerpos neutralizantes que inhiben la entrada de CMV en las células huésped desempeñan un papel importante para la prevención de la transmisión del virus horizontal y vertical. Los estudios basados en la neutralización de la infección de fibroblastos han definido la principal glicoproteína B de la envoltura (gB) como uno de las dianas dominantes de los anticuerpos neutralizantes. La inclusión de gB en un candidato a vacuna contra el CMV humano está respaldada además por datos clínicos de fase II que muestran que una vacuna de subunidad basada en gB en combinación con el adyuvante MF59 puede conferir protección parcial en mujeres seronegativas (Pass, J. Clin. Virol., 2009, 46 (Supl 4): S73; Pass et al., N. Eng. J. Med., 2009, 360 (12):1191).
Aunque los candidatos a vacunas basados en gB recombinante incitan titulaciones altas de anticuerpos neutralizantes que previenen la infección por HCMV, otros antígenos del HCMV pueden incitar titulaciones más altas de anticuerpos que inhiben la infección por HCMV de tipos de células particulares, tales como las células epiteliales y endoteliales. Una estrategia de vacuna para la prevención eficaz de la infección por HCMV probablemente dependerá de la capacidad para inducir potentes anticuerpos neutralizantes que inhiban la entrada del virus en diversos tipos de células. Los estudios recientes han mostrado que se requiere un complejo pentamérico formado por las glicoproteínas gH/gL (UL75/UL115), UL128, UL130 y UL131A para la entrada del h Cm V en las células epiteliales y endoteliales y es la diana de potentes anticuerpos neutralizantes en individuos seropositivos para HCMV. (Ryckman et al., J. Virol., 2008, 82 (1):60; Wang y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102:18153; Wussow et al., J. Virol., 2013, 87 (3):1322).
Un antígeno de vacuna potencial para la inducción de la protección contra la enfermedad por CMV mediada por células T citotóxicas es la proteína del tegumento pp65, que es un antígeno inmunodominante de las células T CD8+ (Wills et al., J. Virol., 1996, 70 (11):7569). Las frecuencias de células T CD8+ específicas de pp65 se han asociado con el control inmune del c Mv en pacientes trasplantados (Pipeling et al., J. Infect. Dis., 2011, 204 (11):1663) y la transferencia adaptativa de células T específicas de pp65 parece tener utilidad terapéutica en receptores de trasplantes de células madre hematopoyéticas (Peggs et al., Clin Infect Dis 2011,52 (1):49; Einsele et al., Blood, 2002, 99 (11 ):3916; Micklethwaite et al., Blood, 2008, 112 (10):3974). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que una vacuna contra el CMV diseñada para prevenir la enfermedad por CMV en pacientes trasplantados requiere la inclusión de pp65.
3. Resumen de la invención
La presente invención proporciona un vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente diseñado por ingeniería para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas, en donde el vector viral es capaz de producir virus de progenie infecciosos en células complementarias pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células no complementarias, en donde el marco de lectura abierto del arenavirus que codifica la proteína GP dentro del segmento S se elimina y se reemplaza por:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana; o
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización, el vector viral comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 771 de la SEQ ID NO: 3, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 772 a 906 de la SEQ ID NO: 3.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 772 de la SEQ ID NO: 60, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 773 a 907 de la SEQ ID NO: 60.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID. NO: 15, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 63.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la s Eq ID NO: 18.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
En una realización, la glicoproteína gB consiste en una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica una glicoproteína gB en donde: (i) se deleciona el dominio citoplásmico de la glicoproteína gB; (ii) se deleciona el dominio transmembrana de la glicoproteína gB; o (iii) se delecionan el dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de la glicoproteína gB.
En una realización, en la presente memoria se proporciona dicho vector viral, en donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento consiste en una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización es el vector viral de la invención en donde:
(i) el arenavirus es el virus de la coriomeningitis linfocítica;
(ii) la información genómica que codifica el vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente se deriva de la cepa Clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica;
(iii) el vector viral induce una respuesta inmune de larga duración contra una glicoproteína gB del citomegalovirus (CMV) o antígeno pp65 de la proteína del tegumento codificada por la secuencia de nucleótidos; o
(iv) el vector viral es adecuado para proteger contra una infección congénita por CMV.
La invención proporciona una composición que comprende un primer vector viral y un segundo vector viral, en donde dicho primer vector viral y dicho segundo vector viral es un vector viral según la invención, y en donde dichos primer y segundo vectores virales son diferentes.
En una realización, dicho primer vector viral comprende el vector viral de la invención, y en donde dicho segundo vector viral comprende el vector viral de la invención.
La invención proporciona una composición farmacéutica o inmunogénica o vacuna que comprende un vector viral de la invención, o la composición de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la vacuna comprende proteína gB de citomegalovirus humano (HCMV), en donde se deleciona el dominio citoplásmico de gB de HCMV, y en donde la proteína gB de HCMV:
(i) comprende los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60) pero no comprende los aminoácidos C-terminales restantes de la gB de la cepa Merlin de CMV;
(ii) consiste esencialmente en los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60); (iii) consiste esencialmente en los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60) seguidos por un residuo de Arginina en la posición 773; o
(iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, al menos un 99,5% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En una realización, dicho vector viral, dicha composición, dicha composición farmacéutica o inmunogénica o dicha vacuna es adecuada para inyección intramuscular.
La invención proporciona un vector viral, o la composición, o una composición farmacéutica o inmunogénica de la invención, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por citomegalovirus en un paciente. La invención proporciona un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico codifica un segmento S genómico de arenavirus en donde el marco de lectura abierto que codifica la proteína GP dentro del segmento S genómico de arenavirus se elimina y se reemplaza por:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana; o
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
La invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de la invención.
La invención proporciona una célula que comprende el ácido nucleico aislado o el vector de expresión de la invención.
La invención proporciona un método para generar un vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que comprende:
a. transfectar en una célula huésped el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención;
b. mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y
c. recoger el vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente;
en donde la célula huésped expresa un marco de lectura abierto que codifica una proteína GP.
Según la invención, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de entrar en o inyectar su material genético en una célula huésped. En determinadas realizaciones más específicas, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de entrar en o inyectar su material genético en una célula huésped seguido de amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula huésped.
En determinadas realizaciones, la glicoproteína gB de CMV se selecciona de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 63. Un fragmento antigénico de la misma puede tener una longitud de al menos 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, o al menos 900 aminoácidos. El fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) incitar una respuesta inmune de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a la glicoproteína gB del CMV humano; y/o (ii) incitar una respuesta inmune de células T específica.
En determinadas realizaciones, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 771 de la SEQ ID NO: 3, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 772 a 906 de la SEQ ID NO: 3.
En determinadas realizaciones, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 772 de la SEQ ID NO: 60, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 773 a 907 de la SEQ ID NO: 60.
En determinadas realizaciones, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID. NO: 15, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 63.
En determinadas realizaciones, el antígeno pp65 comprende una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica al antígeno pp65 o al fragmento antigénico de la SEQ ID NO: 36. En determinadas realizaciones, el fragmento antigénico tiene una longitud de al menos 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o al menos 500 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) incitar una respuesta inmune de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a pp65 de CMV humano; y/o (ii) incitar una respuesta inmune de células T específica.
La glicoproteína gH puede comprender una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la glicoproteína gH o al fragmento antigénico seleccionado de la SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 52. El fragmento antigénico puede tener una longitud de menos 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700 o al menos 750 aminoácidos. El fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) incitar una respuesta inmune de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a la glicoproteína gH del CMV humano; y/o (ii) incitar una respuesta inmune de células T específica.
La glicoproteína gL puede comprender una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la glicoproteína gL o fragmento antigénico de la SEQ ID NO: 41. El fragmento antigénico puede tener una longitud de al menos 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 o al menos 300 aminoácidos. El fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) incitar una respuesta inmune de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a la glicoproteína gL del CMV humano; y/o (ii) incitar una respuesta inmune de células T específica.
La UL128 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la UL128 o al fragmento antigénico de la SEQ ID NO: 43. El fragmento antigénico puede tener una longitud de al menos 10, 25, 50, 75, 100, al menos 150 aminoácidos. El fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) incitar una respuesta inmune de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a UL128 de CMV humano; y/o (ii) incitar una respuesta inmune de células T específica.
La UL130 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la UL130 o al fragmento antigénico de la SEQ ID NO: 46. El fragmento antigénico puede tener una longitud de al menos 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, al menos 250 aminoácidos. El fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) incitar una respuesta inmune de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a la UL130 de CMV humano; y/o (ii) incitar una respuesta inmune de células T específica.
La UL131A puede comprender una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la UL131A o al fragmento antigénico de la SEQ ID NO: 48. El fragmento antigénico puede tener una longitud de al menos 10, 25, 50, 75, al menos 100 aminoácidos. El fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) incitar una respuesta inmune de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a la UL131A de CMV humano; y/o (ii) incitar una respuesta inmune de células T específica.
El vector viral puede comprender al menos dos de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gH de CMV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gL de CMV o un fragmento antigénico de la misma; c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL128 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; d. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL130 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; y e. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL131A de CMV o un fragmento antigénico de la misma, en donde las dos secuencias de nucleótidos seleccionadas de a. a e. anteriores están separadas por una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido autoescindible o una secuencia de aminoácidos que conduce a la liberación de la secuencia de aminoácidos aguas arriba por "salto del ribosoma'' o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y la traducción de la secuencia aguas abajo tales como "sitios internos de entrada de ribosomas''. El vector viral puede comprender al menos tres de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gH de CMV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gL de CMV o un fragmento antigénico de la misma; c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL128 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; d. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL130 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; y e. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL131A de CMV o un fragmento antigénico de la misma, en donde las tres secuencias de nucleótidos seleccionadas de a. a e. anteriores están separadas por una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido autoescindible o una secuencia de aminoácidos que conduce a la liberación de la secuencia de aminoácidos aguas arriba por "salto del ribosoma" o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y la traducción de la secuencia aguas abajo tales como "sitios internos de entrada de ribosomas". El vector viral puede comprender al menos cuatro de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gH de CMV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gL de CMV o un fragmento antigénico de la misma; c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL128 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; d. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL130 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; y e. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL131A de CMV o un fragmento antigénico de la misma, en donde las cuatro secuencias de nucleótidos seleccionadas de a. a e. anteriores están separadas por una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido autoescindible o una secuencia de aminoácidos que conduce a la liberación de la secuencia de aminoácidos aguas arriba por "salto del ribosoma'' o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y la traducción de la secuencia aguas abajo tales como "sitios internos de entrada de ribosomas''.
El vector viral puede comprender:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gH de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gL de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL128 de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
d. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL130 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; y
e. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL131A de CMV o un fragmento antigénico de la misma,
en donde las cinco secuencias de nucleótidos a. a e. anteriores están separadas por una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido autoescindible o una secuencia de aminoácidos que conduce a la liberación de la secuencia de aminoácidos aguas arriba por "salto del ribosoma" o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y la traducción de la secuencia aguas abajo tales como "sitios internos de entrada de ribosomas".
El péptido autoescindible (o la secuencia de salto del ribosoma) se puede obtener a partir de una proteína 2A de un miembro de la familia de virus Picornaviridae. El péptido autoescindible (o la secuencia de salto del ribosoma) puede obtenerse de (o derivarse de) 2A de teschovirus-1 porcino, 2A del virus Thosea asigna o del péptido 2A del virus de la enfermedad de la fiebre aftosa.
En determinadas realizaciones, se deleciona un marco de lectura abierto (ORF) del arenavirus. En una realización específica, se deleciona el ORF que codifica la glicoproteína GP del arenavirus.
En determinadas realizaciones, el vector viral puede amplificar y expresar su información genética en una célula que ha sido infectada por el vector viral, pero el vector viral es incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en una célula no complementaria. En determinadas realizaciones, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de entrar en o inyectar su material genético en una célula huésped. En determinadas realizaciones más específicas, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de entrar en o inyectar su material genético en una célula huésped seguido de la amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula huésped.
En determinadas realizaciones, la información genómica que codifica la partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente se deriva de la cepa del Clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). La secuencia de nucleótidos del segmento S y del segmento L del Clon 13 se muestran en las SEQ ID NO: 32 y 33, respectivamente.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un vector viral cuyo genoma es o ha sido derivado del genoma del Clon 13 (SEQ ID NO: 32 y 33) mediante la deleción de un ORF del genoma del Clon 13 (p. ej., el ORF de la proteína GP ) y su reemplazo con un ORF heterólogo que codifica un antígeno (p. ej., un antígeno de CMV) de modo que el genoma de LCMV restante es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99% o 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos del Clon 13 (SEQ ID NO: 32 y 33).
En la presente memoria se describe un vector viral cuyo genoma puede derivarse del genoma de la cepa MP de LCMV (SEQ ID NO: 49 y 53) mediante la deleción de un ORF del genoma de la cepa MP de LCMV (p. ej., el ORF de la proteína GP) y su reemplazo con un ORF heterólogo que codifica un antígeno (p. ej., un antígeno de CMV) de modo que el genoma de LCMV restante es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, al menos un 99,9% o 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos de la cepa MP de Lc Mv (SEQ ID NO: 49 y 53).
En una realización más específica, el vector viral comprende un segmento genómico, en donde el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos 1639 a 3315 de la SEQ ID NO: 31 o 1640 a 3316 de la SEQ ID NO: 32. En determinadas realizaciones, el vector viral comprende un segmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de expresión cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99%, o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por 1639 a 3315 de la SEQ ID NO: 31 o 1640 a 3316 de la SEQ ID NO: 32.
La invención se refiere a una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de CMV en donde se ha delecionado el dominio citoplásmico de la glicoproteína gB. En realizaciones específicas, se ha delecionado el dominio citoplásmico de gB. El dominio citoplásmico de gB puede sustituirse por el dominio citoplásmico de una proteína heteróloga. El dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de gB pueden sustituirse por el dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de una proteína heteróloga. La proteína heteróloga puede ser la proteína G del virus de la estomatititis vesicular (VSV) o la proteína hemaglutinina del virus de la influenza. El crecimiento o infectividad del arenavirus no se ve afectado por los aminoácidos heterólogos. En realizaciones específicas, se deleciona el dominio transmembrana de la proteína gB.
En la presente memoria se describen ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión que comprende una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma y un polipéptido heterólogo. El dominio citoplásmico de la glicoproteína gB puede sustituirse por el dominio citoplásmico de una proteína heteróloga. El dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de gB pueden sustituirse por el dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de una proteína heteróloga. La proteína heteróloga puede ser la proteína G del VSV o la proteína hemaglutinina del virus de la influenza.
En la presente memoria se describen proteínas de fusión que comprenden una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma y un polipéptido heterólogo. El dominio citoplásmico de la glicoproteína gB puede sustituirse por el dominio citoplásmico de la proteína heteróloga. El dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de gB pueden sustituirse por el dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de una proteína heteróloga. La proteína heteróloga puede ser la proteína G del VSV o la proteína hemaglutinina del virus de la influenza. El dominio transmembrana de la proteína gB puede delecionarse.
En la presente memoria se proporcionan ácidos nucleicos aislados, en donde el ácido nucleico codifica un segmento genómico de arenavirus en donde se deleciona un ORF del segmento genómico y en donde el segmento genómico comprende uno de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de CMV o
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
En determinadas realizaciones, el segmento genómico codificado por el ácido nucleico aislado es el segmento corto, en donde se deleciona el ORF que codifica la GP. En determinadas realizaciones, el segmento genómico comprende una glicoproteína gB de CMV. En determinadas realizaciones, se ha delecionado el dominio citoplásmico de la glicoproteína gB.
En un aspecto, en la presente memoria se proporcionan métodos para generar una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente que comprenden:
a. transfectar en una célula huésped un ácido nucleico descrito en la presente memoria;
b. mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y
c. recoger la partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente;
en donde la célula huésped expresa el ORF que se deleciona en el segmento genómico. En determinadas realizaciones, cualquier ácido nucleico adicional requerido para el resultado de una partícula viral también se transfecta en la célula huésped en la etapa a. Dichos ácidos nucleicos adicionales pueden ser: el ADNc del segundo segmento genómico de arenavirus, un ácido nucleico que codifica el ORF L y/o un ácido nucleico que codifica el ORF NP.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan composiciones, p. ej., composiciones farmacéuticas, inmunogénicas o de vacuna, que comprenden un vector viral descrito en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la presente memoria también se proporcionan composiciones (p. ej., composiciones de vacuna) que comprenden dos o más vectores virales diferentes descritos en la presente memoria (es decir, en donde los vectores virales codifican diferentes antígenos de CMV). En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico descrito en la presente memoria.
En un aspecto adicional, en la presente memoria se proporciona un vector viral, una composición farmacéutica, una composición inmunogénica o una vacuna proporcionada en la presente memoria para su uso en métodos de tratamiento o prevención de la infección o reactivación por CMV en un paciente. En otro aspecto más, en la presente memoria se proporciona el uso de un vector viral, una composición farmacéutica, una composición inmunogénica o una vacuna proporcionada en la presente memoria para el tratamiento o la prevención de la infección por CMV o la reactivación en un paciente. En determinadas realizaciones, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo es capaz de prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto. En determinadas realizaciones, uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV o un fragmento del mismo son capaces de prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto.
En determinadas realizaciones, la administración a un paciente de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo induce una respuesta inmunitaria de larga duración.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo para su uso en métodos de tratamiento o prevención de la infección o reactivación por CMV en un paciente, que comprenden administrar al paciente dos o más arenavirus de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV o fragmento del mismo. En una realización más específica, cada arenavirus de replicación deficiente expresa un antígeno de CMV diferente o un fragmento del mismo. En otras realizaciones, cada arenavirus de replicación deficiente expresa un antígeno de CMV o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el derivado del mismo es un fragmento de antígeno de CMV. En otra realización más, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden dos o más arenavirus de replicación deficiente, cada uno de los cuales expresa un antígeno de CMV diferente o un fragmento del mismo.
3.1 Convenciones y abreviaturas
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4. Descripción del listado de secuencias
Las siguientes secuencias son secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos ilustrativas que pueden usarse con los métodos y composiciones descritos en la presente memoria. En algunos casos, se usa una secuencia de ADN para describir la secuencia de ARN de un segmento genómico viral. La secuencia de ARN se puede deducir fácilmente de la secuencia de ADN.
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(FL). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 1 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 1 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(FL).
La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de HgB(FL).
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(dTM). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 4 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 4 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(dTM).
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de HgB(dTM).
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1 -HgB(1 -706). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 7 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 7 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(1 -706).
La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de HgB(1 -706).
La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(1-691). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 10 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 10 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(1 -691).
La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de HgB(1-691).
La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(1-447). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 13 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 13 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(1-447).
La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de HgB(1-447).
La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(dCt). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 16 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 16 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(dCt).
La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de HgB(dCt).
La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(VSV-G-1). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 19 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 19 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(VSV-G-1).
La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de HgB(VSV-G-1).
La SEQ ID NO: 22 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(VSV-G-2). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 22 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 22 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(VSV-G-2).
La SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de HgB(VSV-G-2).
La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(H3-1). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 25 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 25 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 26 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(H3-1).
La SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoácidos de HgB(H3-1).
La SEQ ID NO: 28 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HgB(H3-2). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 28 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 28 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 29 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgB(H3-2).
La SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de HgB(H3-2).
La SEQ ID NO: 31 es la secuencia completa del segmento S del virus de la coriomeningitis linfocítica. El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 31 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 31 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 32 es la secuencia completa del segmento S del clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica (GenBank: DQ361065.2). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 32 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 32 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 33 es la secuencia completa del segmento L del clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica (GenBank: DQ361066.1). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 33 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 33 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 34 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-Hpp65. El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 34 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 34 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 35 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de Hpp65.
La SEQ ID NO: 36 es la secuencia de aminoácidos de Hpp65.
La SEQ ID NO: 37 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1 -HgH. El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 37 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 37 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 38 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgH.
La SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos de HgH.
La SEQ ID NO: 40 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgL.
La SEQ ID NO: 41 es la secuencia de aminoácidos de HgL.
La SEQ ID NO: 42 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HUL128.
La SEQ ID NO: 43 es la secuencia de aminoácidos de HUL128.
La SEQ ID NO: 44 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1-HUL130. El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 44 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 44 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 45 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HUL130.
La SEQ ID NO: 46 es la secuencia de aminoácidos de HUL130.
La SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HUL131A.
La SEQ ID NO: 48 es la secuencia de aminoácidos de HUL131A.
La SEQ ID NO: 49 es la secuencia completa del segmento L de la cepa MP de coriomeningitis linfocítica. El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 49 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 49 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 50 es la secuencia de nucleótidos del segmento genómico HK1 -HgH(dTM). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 50 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 50 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 51 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HgH(dTM).
La SEQ ID NO: 52 es la secuencia de aminoácidos de HgH(dTM).
La SEQ ID NO: 53 es la secuencia completa del segmento S de la cepa MP de coriomeningitis linfocítica. El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 53 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 53 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 54 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NP de la cepa MP de LCMV.
La SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos de la proteína GP de la cepa MP de LCMV.
La SEQ ID NO: 56 es la secuencia de aminoácidos de la proteína L de la cepa MP de LCMV.
La SEQ ID NO: 57 es la secuencia de aminoácidos de la proteína Z de la cepa MP de LCMV.
La SEQ ID NO: 58 es la secuencia del segmento S del clon 13 de LCMV que codifica la gB de la cepa Merlin de HCMV; de tipo salvaje de longitud completa. El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 58 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 58 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 59 es la secuencia de ADNc del ORF de gB(FL) de la cepa Merlin de HCMV.
La SEQ ID NO: 60 es la secuencia de aminoácidos de gB(FL) de la cepa Merlin de HCMV.
La SEQ ID NO: 61 es la secuencia del segmento S del clon 13 de LCMV que codifica la secuencia de gB de la cepa Merlin de HCMV; deleción de la región transmembrana (dTM). El segmento genómico es ARN, la secuencia en la SEQ ID NO: 61 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en la SEQ ID NO: 61 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
La SEQ ID NO: 62 es la secuencia de ADNc del ORF de gB(dTM) de la cepa Merlin de HCMV.
La SEQ ID NO: 63 es la secuencia de aminoácidos de gB(dTM) de la cepa Merlin de HCMV.
5. Breve descripción de las figuras
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Fig. 1: el genoma de los arenavirus de tipo salvaje consiste en un segmento de ARN corto (1; ~ 3,4 kb) y uno grande (2; ~ 7,2 kb). El segmento corto porta ORF que codifican la nucleoproteína (3) y la glicoproteína (4). El segmento grande codifica la ARN polimerasa L dependiente de ARN (5) y la proteína de la matriz Z (6). Los arenavirus de tipo salvaje pueden convertirse en vectores vacunales de replicación deficiente delecionando el gen de la glicoproteína e insertando, en lugar del gen de la glicoproteína, antígenos de elección (7) contra los cuales se quieren inducir las respuestas inmunes.
Fig. 2: (Adaptado de Potzsch, et al., 2011) sitios antigénicos de la proteína gB expresados en varios vectores rLCMV-gB diferentes; AS-1/5 se refiere a los sitios antigénicos 1-5 de la glicoproteína B. TM indica el dominio transmembrana de gB. Las tijeras tachadas indican una mutación en el sitio de escisión de furina ubicado dentro del ectodominio de gB. "H" en los nombres de los vectores (p. ej., HK1-HgB(FL)) indica secuencias de gB de CMV humano; "GP" en los nombres de los vectores (p. ej., HK1 -GPgB(FL)) indica secuencias de gB de CMV de cobaya.
Fig. 3A: se generan diferentes vectores rLCMV-PC para la expresión de formas ancladas a la membrana (tipo salvaje) o no ancladas (dominio transmembrana delecionado) del complejo pentamérico completo o solo de partes del mismo. Las flechas en colores individuales indican secuencias autoescindibles 2A. La secuencia de nucleótidos 2A se balanceó para evitar la recombinación homóloga durante la clonación del plásmido o en el contexto del esqueleto del vector.
Fig. 3B: se generan diferentes vectores rLCMV-PC para la expresión de formas ancladas a la membrana (tipo salvaje) o no ancladas (dominio transmembrana delecionado) del complejo pentamérico completo o solo de partes del mismo. Las secuencias autoescindibles 2A que separan los componentes de PC individuales se balancearon por las razones descritas anteriormente. Alternativamente, se colocó una secuencia IRES entre dos marcos de lectura abiertos (ORF) dando lugar a la traducción del ORF aguas abajo. Además, se fusionó una etiqueta de proteína (V5) a proteínas del complejo pentamérico individuales para facilitar la detección en la transferencia Western. 2A*: péptido 2A derivado de una proteína 2A de un miembro de la familia de virus Picornaviridae (p. ej., 2A de teschovirus-1 porcino, 2A de virus Thosea asigna).
Fig. 4: se infectaron cultivos en suspensión de HEK 293 que expresaban GP de LCMV con vectores rLCMV HK1-HgB(FL), HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(706), HK1-HgB(691), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(H3-1) y HK1-HgB(H3-2) (MOI de 0,001). Se ha usado como control un vector rLCMV correspondiente que expresa la proteína verde fluorescente (HK1-GFP). (A) La infección viral se monitorizó en el ensayo de unidades formadoras de focos (FFU) contando los focos teñidos después de 72 h o 96 h de incubación. Los resultados se usaron para determinar la titulación viral calculando el número de unidades formadoras de focos por mililitro (FFU/ml). (B) Para evaluar la infectividad de las partículas del vector, se aisló el ARN del vector a partir de las preparaciones madre y se determinó la cantidad de equivalentes del genoma usando PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Los resultados respectivos se pusieron en correlación con las titulaciones de FFU establecidas en (A) para calcular la infectividad específica de las construcciones de vector.
Fig. 5: con el fin de analizar la replicación del vector, se realizaron curvas de crecimiento usando células HEK 293 en suspensión que expresaban GP de LCMV. Las células respectivas se sembraron con una densidad celular de 3x105 células/ml y se infectaron con vectores individuales (HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(H3-2) y HK1 -HgB(691)) a una MOI de 0,001. Se extrajeron muestras cada 24 horas y se analizaron mediante el ensayo FFU. Todos los vectores ensayados exhibieron cinéticas de crecimiento y titulaciones máximas similares en comparación con HK1-GFP, lo que indica que los transgenes de gB individuales no interfirieron con la replicación del vector en mayor medida que el pequeño gen informador GFP.
Fig. 6: las células HEK 293 que expresaban GP de LCMV se infectaron con construcciones individuales de rLCMV-gB (HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(FL), HK1-HgB(dTM)) con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001. Las células se analizaron 96 h después de la infección. Las proteínas se separaron en geles de SDS, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se detectó la expresión de la proteína gB con anticuerpo primario específico del transgén (anticuerpo monoclonal de ratón contra gB de CMV humano) y el anticuerpo secundario apropiado. Se espera que los precursores no escindidos de gB de longitud completa se agrupen aparezcan como bandas a ~ 160 kDa, mientras que la gB escindida contiene un componente de superficie con una masa molecular estimada de 116 kDa que está unido por enlaces disulfuro a un componente transmembrana con una masa molecular estimada de 55 kDa. Sin embargo, debido al uso de un anticuerpo primario monoclonal, se espera que sólo dos bandas que representan la proteína gB no escindida y el producto de escisión más pequeño de gB sean visibles en la transferencia. Como era de esperar, gB de longitud completa (carril 7) apareció como una banda a ~ 160 kDa, mientras que todas las construcciones restantes mostraron bandas de menor tamaño que pueden explicarse por la deleción o intercambio de al menos partes del dominio citoplásmico de gB. De manera análoga, la parte transmembrana de gB de longitud completa (carril 7) aparece como una banda a ~60 kDa (ligeramente superior a lo esperado) y todos los derivados de gB exhiben productos de escisión de menor tamaño. En general, HK1-gB(FL) y HK1-gB(dTM) exhibieron bandas de gB más débiles en comparación con todos los demás vectores.
Fig. 7: se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía subcutánea 3 veces los días 0, 21 y 42 del experimento con 6,7x104 FFU/dosis de cada uno de HK1-GPgB-dTM, HK1-GPgB-dTMuc, HK1-GPgB-FL y con 9,2x105 FFU/dosis de HK1-GFP. Se recogieron sueros de los ratones inmunizados los días 21,42 y 63 del experimento y se determinaron las titulaciones de los anticuerpos IgG anti-GPgB mediante ELISA. Se muestran las GMT de los puntos finales.
Fig. 8A y B: se inmunizaron ratones C57BL/63 veces los días 0, 21 y 42 del experimento, ya sea por vía intramuscular (Fig. 8A) o mediante inyecciones subcutáneas (Fig. 8B) con diferentes concentraciones (7,4x101, 2,2x103, 6,7x104 y 2x106 FFU/dosis) de HK1-GPgB-dTM. Se recogieron sueros de los ratones inmunizados los días 21, 42 y 63 del experimento y se determinaron las titulaciones de los anticuerpos IgG anti-GPgB mediante ELISA. Se muestran las GMT de los puntos finales.
Fig. 8C: se inmunizaron ratones C57BL/6 con 5,6x105 (grupos 1 y 3) o 3,2x103 (grupos 2 y 4) FFU/dosis de HK1-HgB(dCt) los días 0 y 28 por vía intramuscular (Grupos 1 y 2) o intradérmica (Grupos 3 y 4). Se recogieron sueros de los ratones inmunizados los días 28, 56 y 70 y se midieron las titulaciones de los anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA. Se muestran las concentraciones equivalentes de anticuerpos monoclonales (pg/ml); se ha usado un anticuerpo monoclonal anti-gB (mIgG1) para la generación de curvas estándar.
Fig. 8D: se inmunizaron ratones C57BL/6 con 6,7x105 (Grupos 1 y 3) o 3,5x103 (Grupos 2 y 4) FFU/dosis de HK1-Hpp65 los días 0 y 28 por vía intramuscular (Grupos 1 y 2) o intradérmica (Grupos 3 y 4). Las respuestas de las células T CD8+ se analizaron mediante citometría de flujo reestimulando las células del bazo con un conjunto de péptidos generados en base a Shedlock D. et al (Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012; 8:11, 1-14) el día 38. Las células de control se estimularon solo con medio. Después de la incubación con medio (carriles 1 - 4) o con péptidos específicos (carriles 5 - 8), las células se tiñeron para el análisis por citometría de flujo de células T CD8+. Se analizó la expresión de IL-2, IFN-g y TNF.
Fig. 9: se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 1x105 FFU/dosis de HK1-HgB(691), HK1-HgB(706), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(dTM) y gB recombinante/adyuvante los días 0 y 21. Se recogieron sueros de los ratones inmunizados los días 0, 21,42, 63, 84 y 105 del experimento y se midieron las titulaciones de los anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA. Se muestran las GMT de los puntos finales.
Fig. 10: se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 1x105 FFU/dosis de HK1-HgB(691), HK1-HgB(706), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(dTM) y gB recombinante/adyuvante los días 0 y 21. Los sueros recogidos el día 42 se mezclaron con medios que contenían complemento de cobaya (concentración final: 5%) y cepa TS15-rN de HCMV etiquetada con GFP. Las mezclas de suero/medio se incubaron durante 60 min a 37 °C y luego se transfirieron a pocillos de una placa de 384 pocillos que contenía células ARPE-19. Se tomaron micrografías representativas el día 4 y se cuantificó la GFP el día 7 después de la infección. Los valores de GFP se representaron frente a la concentración sérica y se analizaron usando un ajuste de curva de cuatro parámetros para determinar diluciones aproximadas que dan como resultado una inhibición del 50%. Se presentan las titulaciones de neutralización recíproca logarítmica (CI50).
Fig. 11: se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 1x105 FFU/dosis de HK1-HgB(691), HK1-HgB(706), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(dTM) y gB recombinante/adyuvante los días 0 y 21. Los sueros recogidos el día 42 se analizaron mediante ELISA de subclase de IgG específica de HCMVgB. El porcentaje de subclases de IgG específicas de HCMVgB se calculó como la relación de la subclase individual de la GMT de la titulación de punto final dividido por la GMT de la titulación de punto final total de todas las subclases.
Fig. 12: se inmunizaron cobayas Hartley (4 animales/grupo) por vía intramuscular con diferentes concentraciones (1,54x107, 1,54x106, 1,54x105 y 1,54x104 FFU/dosis) de HK1-GPgB-dTM los días 0, 21 y 42. Los sueros de los animales inmunizados se recogieron los días 0, 21,42 y 63 del experimento y las titulaciones de anticuerpos anti-gB se analizaron mediante ELISA de IgG específica de GPgB. Se muestran las GMT de los puntos finales. El círculo relleno solitario indica suero de control positivo para GPCMV.
Fig. 13: se inmunizaron cobayas Hartley (4 animales/grupo) por vía intramuscular con diferentes concentraciones (1,54x107, 1,54x106, 1,54x105 y 1,54x104 FFu/dosis) de HK1-GPgB-dTM los días 0, 21 y 42. La actividad neutralizante de los anticuerpos anti-GPgB en los sueros de los animales inmunizados recogidos el día 63 del experimento se analizó mediante un ensayo de reducción de placa.
Fig. 14: se infectaron células en suspensión HEK 293 que expresaban GP de LCMV con el vector rLCMV HK1-Hpp65 (MOI = 0,001). Se usó como control un vector rLCMV que expresaba GFP (HK1-GFP). Las muestras se extrajeron en los puntos de tiempo indicados y se analizaron mediante el ensayo FFU (A) para calcular el número de unidades formadoras de foco (FFU) por unidad de volumen de muestra (FFU/ml) y mediante qPCR para calcular la infectividad específica de las construcciones del vector (B).
Fig. 15: se infectaron células en suspensión HEK 293 que expresaban GP de LCMV con HK1-Hpp65 o un vector de control negativo HK1-GFP, se recogieron y se lisaron 96 h después de la infección, se separaron en geles de SDS, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se ensayaron con anti-pp65 primario. y anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina apropiado. Se espera que la proteína pp65 del CMV humano aparezca como una banda en el rango de 65 kDa, correspondiente a la banda principal de HK1 -Hpp65 en la transferencia Western.
Fig. 16: (A) y (B) se vacunaron grupos de 15 ratones C57BL/6 por vía intramuscular (100 pL/ratón en total; 50 pL/muslo) con una dosis diana de 1x104 de HK1-Hpp65 (Grupo 1) o HK3-Hpp65 (Grupo 2). Se usaron ratones no vacunados (Grupo 7) como control. Para la determinación de las respuestas de las células T, las citoquinas se analizaron mediante citometría de flujo. El día 10 después de la inmunización, se sacrificaron 5 ratones/grupo y se reestimuló la suspensión de células individuales de células del bazo con un conjunto de péptidos generados en base a Shedlock D. et al (Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012; 8:11, 1-14). Después de 5 horas de tiempo de estimulación, las células se tiñeron para el análisis por citometría de flujo de células T CD4+ y CD8+. Las células se tiñeron para el marcador de superficie CD3, CD4 y CD8. Después de 30 min de tinción de la superficie, las células se permeabilizaron con PFA al 2% (15 min) y se trataron con saponina para asegurar que la superficie celular permaneciera permeable. Después de 30 min de tinción intracelular (IL-2, IFN-g y TNF-a), las muestras se lavaron y se midieron con FACS Gallios. Se reporta la frecuencia de células T CD4+ (A) o CD8+ (B) que expresan citoquinas. (C) Se vacunaron grupos de 10 ratones C57BL/6 dos veces por vía intramuscular con una dosis diana de 1x104 de HK1-HgB(dTM) los días 0 y 28 del experimento. El día 56 del experimento, los ratones se vacunaron por vía intramuscular con una dosis diana de 1x104 de HK1 -Hpp65 (Grupo 3) o HK3-Hpp65 (Grupo 4). Se usaron ratones no vacunados (Grupo 7) como control. El día 66 del experimento, se analizaron las respuestas de las células T midiendo las citoquinas mediante citometría de flujo. Se reestimuló la suspensión de células individuales de células del bazo de ratones sacrificados (5/grupo) con el mismo conjunto de péptidos. Después de 5 horas de tiempo de estimulación, las células se tiñeron para el análisis por citometría de flujo de las células T CD8+. Las células se tiñeron para el marcador de superficie CD3, CD4 y CD8. Después de 30 min de tinción de la superficie, las células se permeabilizaron con PFA al 2% (15 min) y se trataron con saponina para asegurar que la superficie celular permaneciera permeable. Después de 30 min de tinción intracelular (IL-2, IFN-g y TNF-a), las muestras se lavaron y se midieron con FACS Gallios. Se reporta la frecuencia de células T CD8+ que expresan citoquinas.
Fig. 17: se vacunaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular (100 pL/ratón en total; 50 pL/muslo) los días 0 y 28 del experimento con una dosis diana de 1x104 de HK1-GPgB(dTM) y HK3-GPgB(dTM). Se generaron sueros de animales individuales antes de cada dosis de vacuna (días 0, 28), así como cuatro semanas (día 56) después de la última (segunda) inyección. Todos los sueros se ensayaron para determinar el nivel de anticuerpos IgG específicos de GPgB mediante ELISA; los datos de ELISA se expresan como media geométrica de la titulación de punto final de IgG específica de GPgB.
Fig. 18: se vacunaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular (100 pL/ratón en total; 50 pL/muslo) los días 0 y 28 del experimento con una dosis diana de 1x104 de HK1-HgB(dTM) y HK3-HgB(dTM). Se generaron sueros de animales individuales antes de cada dosis de vacuna (días 0, 28), así como cuatro semanas (día 56) después de la última (segunda) inyección. Todos los sueros se ensayaron para determinar el nivel de anticuerpos IgG específicos de HgB mediante ELISA; los datos de ELISA se expresan como media geométrica de la titulación de punto final de IgG específica de HgB.
Fig. 19: se sembraron células HEK 293T en pocillos de cultivo de pocillos M6 a una densidad de 500.000 células por pocillo. Al día siguiente, las células se infectaron con diferentes cepas de LCMV a una multiplicidad de infección de 0,05. El sobrenadante se recogió en los puntos de tiempo indicados y las titulaciones virales se determinaron mediante un ensayo de inmunofoco. Los símbolos representan la media de dos pocillos.
Fig. 20: se inmunizaron grupos de 5 conejos blancos de Nueva Zelanda por vía intramuscular con diferentes dosis (2,0x102, 4,4x104 y 4,5x106 FFU/dosis) de HK1 -HgB(dCt) los días 0 y 28. Se recogieron los sueros los días 0, 28 y 42 y se midieron las titulaciones de anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA. Se muestran las GMT de los puntos finales.
Fig. 21A: se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 1x105 FFU/dosis de HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1) y gB recombinante/adyuvante los días 0, 21 y 42. Se recogieron sueros de los ratones inmunizados los días 21,42, 63, 91, 119, 147 y 175 y se midieron las titulaciones de anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA. Se muestran las GMT de los puntos finales.
Fig. 21B: se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 1x105 FFU/dosis de HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(dCt) y gB recombinante/adyuvante los días 0, 21 y 105. Sueros de los ratones inmunizados se recogieron los días 21,42, 63, 84, 105 y 126 y se midieron las titulaciones de anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA. Se muestran las GMT de los puntos finales.
Fig. 22: se inmunizaron grupos de 10 ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 9x104 FFU/dosis de HK1-HgB(dCt) solo o 9x104 FFU/dosis de HK1 -Hpp65 solo o con 9x104 FFU/dosis de cada uno de HK1 -HgB(dCt) y HK1 -Hpp65 juntos los días 0 y 28. (A) Se recogieron los sueros de los ratones inmunizados el día 49 y se midieron las titulaciones de anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA. (B) Para la determinación de las respuestas de las células T, las citoquinas se analizaron mediante citometría de flujo. El día 49 después de la inmunización, se sacrificaron los ratones y se reestimuló la suspensión de células individuales de células del bazo con un conjunto de péptidos generados en base a Shedlock D. et al (Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012; 8:11, 1-14). Las células de control se estimularon solo con medio. Después de la incubación con medio (carriles 1 y 2) o con péptidos específicos (carriles 3 y 4), las células se tiñeron para el análisis por citometría de flujo de células T CD8+. Se analizó la expresión de IL-2, IFN-g y TNF.
Fig. 23: se inmunizaron cobayas Hartley (11 animales/grupo) por vía intramuscular tres veces (los días 0, 21 y 42) con 1,54 x 106 FFU/dosis de HK1 -GPgB-dTM o HK1 -GPpp65 antes de la reproducción. Los animales de control (10/grupo) recibieron tampón en lugar de construcciones de vector rLCMV. Los animales se reprodujeron el día 63+ del experimento. ~ 45 días después de la gestación, las cobayas se pulsaron por vía subcutánea con 1x105 pfu de CMV de cobaya. La mortalidad de las crías se midió durante el parto y las tasas de protección se determinaron mediante la comparación de los grupos de tratamiento para la viremia y las tasas de muerte de las crías, * indica una reducción significativa (p <0,05).
Fig. 24: se inocularon ratones AG129 deficientes en receptores de IFN a/p y y (A), así como ratones RAG -/- deficientes en células T y B por vía intracerebral con 7,65x105 así como 7,65x103 FFU/dosis de HK3-Hpp65 o del análogo de ratón HK3-Mpp65 el día 0. Los grupos de control de ratones recibieron 100 FFU/dosis de LCMV de tipo salvaje o diluyente solamente. Posteriormente, los ratones se monitorizaron para detectar signos de enfermedad y se recogió tejido cerebral en los días indicados y se analizó para determinar la presencia de virus infecciosos.
Fig. 25: se inmunizaron cobayas Hartley (18 animales/grupo) por vía intramuscular con 8x105 FFU/dosis de HK1-GPgB(dCt) (grupo 1), 8x105 FFU/dosis de Hk 1 -GPpp65 (grupo 2), o 8x105 FFU/dosis de cada uno de HK1 -GPgB(dCt) y HK1-GPpp65 (grupo 3) los días 0, 31 y 72 (grupo 1)/días 0, 31 y 70 (grupo 2)/días 0, 34 y 70 (grupo 3) del experimento. Además, se inmunizaron cobayas Hartley (18 animales/grupo) por vía subcutánea con 50 pg de proteína de la subunidad gB, formulada en adyuvante completo de Freund (grupo 4) los días 0, 46 y 76. Se recogieron los sueros de los animales inmunizados los días 0, 28, 52, 103 y 155 del experimento y se analizaron las titulaciones de anticuerpos anti-gB mediante ELISA de IgG específica de GPgB usando un conjunto de sueros con titulación de anticuerpo anti-gB asignada como estándar de referencia.
Fig. 26: se inmunizaron cobayas Hartley (18 animales/grupo) por vía intramuscular con 8x105 FFU/dosis de HK1-GPgB(dCt) (grupo 1), 8x105 FFU/dosis de HK1-GPpp65 (grupo 2), o 8x105 FFU/dosis de cada uno HK1-GPgB(dCt) y HK1-GPpp65 (grupo 3) los días 0, 31 y 72 (grupo 1)/días 0, 31 y 70 (grupo 2)/días 0, 34 y 70 (grupo 3). Además, se inmunizaron cobayas Hartley (18 animales/grupo) por vía subcutánea con 50 pg de proteína de subunidad gB, formulada en adyuvante completo de Freund (grupo 4) los días 0, 46 y 76. Se recogieron los sueros de los animales inmunizados el día 103 y se analizó la actividad neutralizante de los sueros del experimento. La línea de puntos indica el límite de detección. A las muestras de suero que no alcanzaron el límite de detección en el ensayo se les asignó arbitrariamente un valor de 20 para la representación gráfica y los cálculos estadísticos.
Fig. 27: se aislaron esplenocitos de cobayas Hartley inmunizados por vía intramuscular con 8x105 FFU/dosis de HK1-GFP (grupo 1), 8x105 FFU/dosis de HK1 -GPpp65 (grupo 2) o 8x105 FFU/dosis de cada uno de HK1 -GPgB(dCt) y HK1 -GPpp65 (grupo 3) y se analizaron mediante el ensayo ELISPOT. Se sacrificaron tres animales de cada grupo de vacuna después de 2 dosis de vacuna y se sacrificaron tres animales adicionales de cada grupo de vacuna después de 3 dosis de vacuna. La magnitud de la respuesta de esplenocitos específica de pp65 para cada animal se calculó usando Prism6 como el "área bajo la curva" por encima del control de DMSO de la respuesta de cada animal a todos los conjuntos de péptidos pp65. (A) El número promedio de manchas por animal se representa mediante puntos de datos para 2 dosis (círculos) o 3 dosis (recuadros) de vacuna (las barras representan la media del grupo y ± SEM). (B) El número promedio de manchas por animal se representa mediante puntos de datos para animales vacunados con HK1 -GFP (círculos), HK1 -GPpp65 (cuadrados) o HK1 -GPgB(dCt)/HK1 -GPpp65 (triángulos) (las barras representan la media del grupo y ± SEM). Los valores p que se muestran en la figura se calcularon usando un ensayo U de Mann-Whitney (Wilcoxon, Biometrics Bulletin, 1945, 1: 80-83; Mann y Whitney, Annals of mathematical Statistics, 1947, 18: 50-60).
Fig. 28: se inmunizaron cobayas Hartley por vía intramuscular tres veces con 8x105 FFU/dosis de HK1-GFP (grupo 1), HK1 -GPgB(dCt) (grupo 2), HK1 -GPpp65 (grupo 3) o 8x105 FFU/dosis de cada uno HK1 -GPgB(dCt) y HK1 -GPpp65 en combinación (grupo 4) antes de la reproducción. Aproximadamente un mes después de la última dosis de vacuna, se permitió que los animales se reprodujeran. Los embarazos en cobayas hembras se confirmaron y se monitorizaron mediante palpación. Las hembras preñadas se pulsaron en el tercer trimestre de gestación con 105 unidades formadoras de placa de CMV de cobaya pasado por glándulas salivales y posteriormente se monitorizaron hasta el parto. La mortalidad de las crías se midió durante el parto y las tasas de protección se determinaron mediante la comparación de los grupos de tratamiento para las tasas de mortalidad de las crías.
6. Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente diseñado por ingeniería para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas, en donde el vector viral es capaz de producir virus de progenie infecciosos en células complementarias pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células no complementarias, en donde el marco de lectura abierto del arenavirus que codifica la proteína GP dentro del segmento S se elimina y se reemplaza por:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana; o
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización, el vector viral comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 771 de la SEQ ID NO: 3, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 772 a 906 de la SEQ ID NO: 3.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 772 de la SEQ ID NO: 60, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 773 a 907 de la SEQ ID NO: 60.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID. NO: 15, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 63.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la s Eq ID NO: 18.
En una realización, la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
En una realización, la glicoproteína gB consiste en una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica una glicoproteína gB en donde: (i) se deleciona el dominio citoplásmico de la glicoproteína gB; (ii) se deleciona el dominio transmembrana de la glicoproteína gB; o (iii) se delecionan el dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de la glicoproteína gB.
En una realización proporcionada en la presente memoria se proporciona dicho vector viral, en donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización, la proteína pp65 del tegumento consiste en una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
En una realización es el vector viral de la invención en donde:
(i) el arenavirus es el virus de la coriomeningitis linfocítica;
(ii) la información genómica que codifica el vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente se deriva de la cepa Clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica;
(iii) el vector viral induce una respuesta inmune de larga duración contra una glicoproteína gB del citomegalovirus (CMV) o antígeno pp65 de la proteína tegumento codificada por la secuencia de nucleótidos; o
(iv) el vector viral es adecuado para proteger contra una infección congénita por CMV.
La invención proporciona una composición que comprende un primer vector viral y un segundo vector viral, en donde dicho primer vector viral y dicho segundo vector viral es un vector viral según la invención, y en donde dichos primer y segundo vectores virales son diferentes.
En una realización, dicho primer vector viral comprende el vector viral de la invención, y en donde dicho segundo vector viral comprende el vector viral de la invención.
La invención proporciona una composición farmacéutica o inmunogénica o vacuna que comprende un vector viral de la invención, o la composición de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la vacuna comprende proteína gB de citomegalovirus humano (HCMV), en donde se deleciona el dominio citoplásmico de gB de HCMV, y en donde la proteína gB de HCMV:
(i) comprende los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60) pero no comprende los aminoácidos C-terminales restantes de la gB de la cepa Merlin de CMV;
(ii) consiste esencialmente en los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60); (iii) consiste esencialmente en los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60) seguido por un residuo de arginina en la posición 773; o
(iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, al menos un 99,5% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En una realización, dicho vector viral, dicha composición, dicha composición farmacéutica o inmunogénica o dicha vacuna es adecuada para inyección intramuscular.
La invención proporciona un vector viral, o la composición, o una composición farmacéutica o inmunogénica de la invención, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por citomegalovirus en un paciente. La invención proporciona un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico codifica un segmento S genómico de arenavirus en donde el marco de lectura abierto que codifica la proteína GP dentro del segmento S genómico de arenavirus se elimina y se reemplaza por:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana; o
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
La invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de la invención.
La invención proporciona una célula que comprende el ácido nucleico aislado o el vector de expresión de la invención.
La invención proporciona un método para generar un vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que comprende:
a. transfectar en una célula huésped el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención;
b. mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y
c. recoger el vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente;
en donde la célula huésped expresa un marco de lectura abierto que codifica una proteína GP.
En la presente memoria se proporcionan composiciones para su uso en el tratamiento o prevención de la infección de un sujeto con CMV, o de la reactivación de CMV en un sujeto. Más específicamente, en la presente memoria se proporcionan arenavirus infecciosos de replicación deficiente que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV. Estos virus pueden administrarse a un sujeto para el tratamiento o la prevención de la infección por CMV o su reactivación. La generación de vectores de arenavirus infecciosos de replicación deficiente para su uso con la presente invención se describe con más detalle en la Sección 6.3.
En la presente memoria se proporciona un arenavirus genéticamente modificado, donde el arenavirus:
• es infeccioso;
• no puede formar virus de progenie infecciosos en una célula no complementaria (es decir, una célula que no expresa la funcionalidad que falta en el arenavirus de replicación deficiente y hace que sea de replicación deficiente);
• es capaz de replicar su genoma y expresar su información genética; y
• codifica un antígeno de CMV o un fragmento del mismo.
Un arenavirus modificado genéticamente descrito en la presente memoria es infeccioso, es decir, puede unirse a una célula huésped y liberar su material genético en la célula huésped. Un arenavirus modificado genéticamente descrito en la presente memoria es de replicación deficiente, es decir, el arenavirus es incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en una célula no complementaria. En particular, el genoma del arenavirus se modifica (p. ej., mediante deleción o inactivación funcional de un ORF) de modo que un virus que porta el genoma modificado ya no puede producir virus de progenie infecciosos. Una célula no complementaria es una célula que no proporciona la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente mediante la modificación del genoma del virus (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se deleciona o se inactiva funcionalmente, una célula no complementaria no proporciona la proteína GP). Sin embargo, un arenavirus modificado genéticamente proporcionado en la presente memoria es capaz de producir virus de progenie infecciosos en células complementarias. Las células complementarias son células que proporcionan (en trans) la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente mediante la modificación del genoma del virus (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se deleciona o se inactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP). La expresión de la funcionalidad complementaria (p. ej., la proteína GP) puede lograrse mediante cualquier método conocido por el experto en la técnica (p. ej., expresión transitoria o estable). Un arenavirus modificado genéticamente descrito en la presente memoria puede amplificar y expresar su información genética en una célula que ha sido infectada por el virus. Un arenavirus modificado genéticamente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV tales como, pero no limitados a, los antígenos de CMV descritos en la Sección 6.2.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un arenavirus modificado genéticamente en el que se deleciona un ORF (ORF) del genoma del arenavirus de modo que el virus resultante no puede producir más partículas de virus de progenie infecciosas en células no complementarias. Una partícula de arenavirus que comprende un genoma modificado genéticamente en el que se deleciona un ORF se puede producir en células complementarias (es decir, en células que expresan el ORF de arenavirus que se ha delecionado o inactivado funcionalmente) (véase la Sección 6.3). El material genético de las partículas de arenavirus resultantes se puede transferir tras la infección de una célula huésped al interior de la célula huésped, en donde el material genético se puede expresar y amplificar. Además, el genoma de las partículas de arenavirus modificadas genéticamente proporcionadas en la presente memoria codifica un antígeno de CMV que puede expresarse en la célula huésped.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica el gen de la glicoproteína (GP) del arenavirus se deleciona para generar un arenavirus de replicación deficiente de la presente invención. En una realización específica, el arenavirus de replicación deficiente comprende un segmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV. Por tanto, en determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus modificada genéticamente proporcionada en la presente memoria comprende un segmento genómico que a) tiene una deleción de un ORF que está presente en la forma de tipo salvaje del segmento genómico; y b) codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de CMV (véase la Sección 6.3).
En determinadas realizaciones, el antígeno codificado por el ácido nucleico que se inserta en el genoma del arenavirus de replicación deficiente:
a. una glicoproteína gB de CMV o
b. una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
En la Sección 6.2 se proporciona una descripción detallada de los antígenos descritos en la presente memoria.
En determinadas realizaciones, los arenavirus usados de acuerdo con la invención descrita en la presente memoria pueden ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). En la Sección 6.1 se proporciona una descripción más detallada de los arenavirus descritos en la presente memoria.
En la presente memoria se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el genoma de dichos arenavirus de replicación deficiente. Una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente puede comprender un segmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SeQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 49, o SEQ ID NO: 50.
En la presente memoria se describe un plásmido de expresión que codifica uno o más componentes requeridos para la generación de un vector viral. En la presente memoria se proporciona un vector de expresión que codifica un segmento S de LCMV en donde el ORF de la proteína GP se ha delecionado del segmento S y se ha reemplazado por el ORF de la glicoproteína gB del CMV humano con un truncamiento del extremo carboxi (p. ej., que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18).
En la presente memoria se describen kits que comprenden uno o dos de los plásmidos de vector descritos en la presente memoria. Un kit comprende a) un plásmido de expresión que codifica el segmento S de un vector de LCMV; b) un plásmido de expresión que codifica el segmento L de un vector de LCMV; y c) un plásmido de expresión que codifica la funcionalidad complementaria. Un kit puede comprender a) un vector de expresión que codifica un segmento S de LCMV en donde el ORF de la proteína GP se ha delecionado del segmento S y se ha reemplazado por el ORF de la glicoproteína gB del CMV humano con un truncamiento del extremo carboxi (p. ej., que tiene que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18); b) un plásmido de expresión que codifica el segmento L de un vector de LCMV; y c) un plásmido de expresión que codifica la proteína GP de LCMV (o una línea celular que expresa la proteína GP de LCMV).
En la presente memoria también se describen líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones proporcionadas en la presente memoria. En la Sección 6.4 se proporciona una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, los sistemas de vectores y las líneas celulares descritos en la presente memoria.
La invención se refiere a arenavirus de replicación deficiente modificados genéticamente adecuados como vacunas y a dichos arenavirus para su uso en la vacunación y tratamiento o prevención de infecciones por CMV o reactivación de CMV. En la Sección 6.5 se proporciona una descripción más detallada de dichos arenavirus para su uso descritos en la presente memoria.
En determinadas realizaciones, la inmunización con un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, proporciona una respuesta inmune de larga duración. En determinadas realizaciones, se pueden alcanzar niveles máximos de anticuerpos después de dos inmunizaciones. En otra realización, se puede administrar una tercera inmunización para un efecto de refuerzo. En la presente memoria se describen programas de administración que usan el arenavirus infeccioso de replicación deficiente en una vacunación para el tratamiento y/o la prevención de infecciones por CMV o la reactivación de CMV. En la Sección 6.5 se proporciona una descripción más detallada de los programas de administración que usan un arenavirus infeccioso de replicación deficiente, como se describe en la presente memoria.
En determinadas realizaciones, la administración a un sujeto seronegativo de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, induce una titulación de anticuerpos detectable durante un mínimo de al menos 4 semanas. En otra realización, la administración a un sujeto infectado con una infección por CMV de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, incrementa la titulación de anticuerpos en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1.000%. En determinadas realizaciones, la exposición primaria al antígeno incita una titulación de anticuerpo funcional, (neutralizante) y mínima de al menos un 50%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1.000% de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, la media geométrica de la titulación de anticuerpo neutralizante primario se incrementa hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200, o al menos 1:1.000 dentro de al menos 4 semanas después de la inmunización. En otra realización, la inmunización con un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, produce titulaciones altas de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización después de una sola administración de la vacuna.
En otra realización más, la exposición secundaria al antígeno incrementa la titulación de anticuerpos en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1.000%. En otra realización, la exposición secundaria al antígeno incita una titulación de anticuerpo funcional, (neutralizante) y mínima de al menos un 50%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1.000% de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, la media geométrica de la titulación de anticuerpo neutralizante secundario se incrementa hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200, o al menos 1:1.000 dentro de al menos 4 semanas después de la inmunización. En otra realización, una segunda inmunización con un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, produce titulaciones altas de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización.
En otra realización más, una tercera inmunización de refuerzo incrementa la titulación de anticuerpos en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1.000%. En otra realización, la inmunización de refuerzo indita una titulación de anticuerpo funcional, (neutralizante) y mínima de al menos un 50%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1.000% de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, la tercera inmunización de refuerzo incita una titulación de anticuerpo funcional, (neutralizante) y mínima de al menos un 50%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500%, o al menos un 1.000% del suero control medio de sujetos humanos inmunes a la infección. En otra realización, una tercera inmunización de refuerzo prolonga la titulación de anticuerpos en al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años, o al menos 5 años después de la inmunización.
En determinadas realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, incita una respuesta independiente de células T o dependiente de células T. En otras realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, incita una respuesta de células T. En otras realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, incita una respuesta de T auxiliares. En otra realización, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, incita una respuesta orientada a Th1 o una respuesta orientada a Th2.
En realizaciones más específicas, la respuesta orientada a Th1 se indica por un predominio de anticuerpos IgG1 frente a IgG2. En otras realizaciones, la relación de IgG1 :IgG2 es mayor de 1:1, mayor de 2:1, mayor de 3:1 o mayor de 4:1. En otra realización, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, se indica por un predominio de anticuerpos IgG3.
En algunas realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo incita una respuesta de células T CD8+. En otras realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo incita una respuesta de células T reguladoras. En realizaciones más específicas, la respuesta de las células T reguladoras mantiene la tolerancia inmune. En otra realización, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo incita respuestas de células T tanto CD4+ como CD8+.
En determinadas realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, incita titulaciones altas de anticuerpos neutralizantes.
Dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV incitan titulaciones altas de anticuerpos neutralizantes. Dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV incitan titulaciones más altas de anticuerpos neutralizantes que un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo.
El arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos de CMV incita titulaciones más altas de anticuerpos neutralizantes que un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o fragmento del mismo.
6.1 Vectores de arenavirus infecciosos con replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV
Los arenavirus para su uso en los métodos y composiciones según la invención pueden ser de virus del Viejo Mundo, por ejemplo, virus de Lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus de Mobala, virus de Mopeia o virus de Ippy, o virus del Nuevo Mundo, por ejemplo, virus de Amapari, virus Flexal, virus Guanarito, virus Junin, virus Latino, virus Machupo, virus Oliveros, virus Paraná, virus Pichinde, virus Pirital, virus Sabia, virus Tacaribe, virus Tamiami, virus Bear Canyon o virus Whitewater Arroyo. El arenavirus modificado genéticamente se puede generar como se describe en la Sección 6.3.
El genoma del arenavirus de tipo salvaje consiste en un segmento de ARN corto (~3,4 kb) y uno grande (~7,2 kb). El segmento corto porta los ORF que codifican los genes de la nucleoproteína NP y la glicoproteína GP. El segmento grande codifica la ARN polimerasa L dependiente de ARN y los genes Z de la proteína de la matriz. Los arenavirus de tipo salvaje pueden volverse deficientes en replicación para generar vectores de vacuna sustituyendo el gen de la glicoproteína por uno o más antígenos de CMV, contra los cuales quieren inducirse las respuestas inmunes.
Los vectores de arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV, o una combinación de antígenos de CMV como se describe en la presente memoria, pueden usarse para inmunizar (de manera preventiva) o tratar (de manera inmunoterapéutica) sujetos contra la infección por CMV o su reactivación. En una realización específica, se usa una combinación de gB y pp65.
Se sabe que la enfermedad por arenavirus y la inmunosupresión en la infección por arenavirus de tipo salvaje son el resultado de la replicación viral no controlada. Al abolir la replicación, es decir, la capacidad de producir partículas de virus de progenie infecciosas, de vectores de arenavirus mediante la deleción de su genoma, p. ej., el gen Z que se requiere para la liberación de partículas, o el gen GP que se requiere para la infección de las células diana, el número total de células infectadas puede estar limitado por el inóculo administrado, p. ej., a un receptor de vacuna, o transmitido accidentalmente al personal implicado en aplicaciones médicas o biotecnológicas, o a animales. Por lo tanto, la abolición de la replicación de los vectores de arenavirus previene la patogénesis como resultado de la transmisión intencional o accidental de partículas de vector. En esta invención, un aspecto importante consiste en aprovechar la necesidad anterior de abolición de la replicación de una manera beneficiosa con el fin de expresar un antígeno de CMV. En determinadas realizaciones, una partícula de arenavirus se vuelve deficiente en replicación por la modificación genética de su genoma. Dichas modificaciones del genoma pueden incluir:
• deleción de un ORF (p. ej., el ORF que codifica la proteína GP, NP, L o Z);
• inactivación funcional de un ORF (p. ej., el ORF que codifica la proteína GP, NP, L o Z). Por ejemplo, esto se puede lograr introduciendo una mutación con cambio de sentido o sin sentido.
• cambio de la secuencia del ORF (p. ej., el intercambio de un sitio de escisión de SIP con el sitio de escisión de otra proteasa);
• mutagénesis de uno de los extremos 5' o 3' de uno de los segmentos genómicos;
• mutagénesis de una región intergénica (es decir, del segmento genómico L o S).
En determinadas realizaciones, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria es un virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV) en donde el segmento S del virus se modifica sustituyendo el ORF que codifica la proteína GP por un ORF que codifica un antígeno de CMV.
En determinadas realizaciones, se puede diseñar el genoma de un vector de arenavirus de tipo salvaje (FIG. 1) para que retenga al menos los elementos reguladores esenciales en las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' de ambos segmentos, y/o también las regiones intergénicas (IGR). Sin estar ligado a la teoría, los factores de que actúan en trans mínimos para la expresión génica en las células infectadas permanecen en el genoma del vector como ORF que se pueden expresar, sin embargo, se pueden colocar de manera diferente en el genoma y se pueden colocar bajo el control de un promotor diferente al de forma natural, o se pueden expresar a partir de sitios de entrada de ribosomas internos. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un antígeno de CMV se transcribe a partir de uno de los promotores de arenavirus endógenos (es decir, 5' UTR, 3' UTR del segmento S, 5' UTR, 3' UTR del segmento L). En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica un antígeno de CMV se expresa a partir de secuencias promotoras introducidas heterólogas que pueden ser leídas por la ARN polimerasa dependiente de ARN viral, por la ARN polimerasa I celular, ARN polimerasa II o ARN polimerasa III, tales como duplicaciones de secuencias promotoras virales que se encuentran naturalmente en las UTR virales, el promotor de ARN ribosómico 28S, el promotor de beta-actina o el promotor de ARN ribosómico 5S, respectivamente. En determinadas realizaciones, los ácidos ribonucleicos que codifican antígenos de CMV se transcriben y traducen por sí mismos o como lectura completa mediante fusión con ORF de proteínas de arenavirus, y la expresión de proteínas en la célula huésped puede aumentarse introduciendo en la secuencia del transcrito viral en el o los sitios apropiados uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, sitios de entrada al ribosoma internos.
En determinadas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En determinadas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV puede basarse en el Clon 13 de LCMV. El vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV puede basarse en la cepa MP de LCMV. La secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 32. En determinadas realizaciones, la secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV es la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 31. La secuencia del segmento L del Clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 33. La secuencia del segmento S de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 53. La secuencia del segmento L de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 49.
En la presente memoria se describe una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente que comprende una secuencia de nucleótidos o un fragmento de la misma seleccionada de la SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, o una combinación de las mismas.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se describe una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente que comprende una secuencia de nucleótidos, o una combinación de secuencias de nucleótidos, seleccionada del grupo que consiste en:
• una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB o de citomegalovirus o;
• una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
6.2 Antígenos CMV
En la presente memoria se proporcionan antígenos de CMV para su uso en los métodos según la invención y para su uso en las composiciones descritas en la presente memoria.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV descritos pueden transcribirse como un único transcrito. Los ORF que codifican los antígenos de CMV en ese transcrito pueden estar separados por un ácido nucleico que codifica un péptido autoescindible o una secuencia de salto de ribosomas. El péptido autoescindible (o la secuencia de salto de ribosomas) se puede obtener a partir de una proteína 2A de un miembro de la familia de virus Picornaviridae. El péptido autoescindible se puede obtener de (o derivarse de) 2A de teschovirus-1 porcino, 2A de virus Thosea asigna, péptido 2A del virus de la fiebre aftosa o péptido 2A del virus A de la rinitis equina. El péptido 2A obtenido de (o derivado de) 2A de teschovirus-1 porcino tiene la mayor eficiencia de escisión. El péptido 2A tiene una alta eficiencia de escisión en combinación con los antígenos de CMV descritos en la presente memoria en 5' o en 3' del péptido 2A.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV pueden estar separados por una secuencia de salto de ribosomas. La secuencia de salto de ribosomas es una secuencia de elementos de hidrolasa que actúan en cis.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV pueden estar separados por una proteasa autoescindible obtenida de (o derivada de) los virus de grabado del tabaco (TEV) de la familia Potyviridae.
Puede insertarse un conector Gly-Ser-Gly en el extremo N y el extremo C del péptido 2A. El conector Gly-Ser-Gly puede insertarse en el extremo N del péptido 2A. El conector Gly-Ser-Gly puede insertarse en el extremo C del péptido 2A. El conector Gly-Ser-Gly puede mejorar la eficiencia de la escisión por el péptido 2A.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV pueden estar separados por un sitio de entrada de ribosoma interno. El sitio de entrada de ribosoma interno funciona bajo el control de un promotor en 5'. El sitio de entrada de ribosoma interno puede obtenerse de (o derivarse de) el virus de la encefalomiocarditis.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV pueden estar separados por un péptido 2A y un sitio de escisión de furina. El péptido 2A puede estar flanqueado por un sitio de escisión de furina. El sitio de escisión de furina puede estar ubicado entre un ORF que codifica un antígeno de CMV y el péptido 2A. El sitio de escisión de furina puede añadirse en 5' del péptido 2A. El sitio de escisión de furina puede añadirse en 3' del péptido 2A. El sitio de escisión de furina puede estar ubicado en el vector con los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco, o más antígenos de CMV, un péptido autoescindible y combinaciones de los mismos. La secuencia consenso del sitio de escisión de furina puede ser R-X-K-/R-R. El sitio de escisión de furina es escindido por la proteína furina en la red trans golgi. El sitio de escisión de furina puede eliminar la secuencia del péptido 2A. El sitio de escisión de furina puede eliminar la secuencia del péptido autoescindible en el extremo C. Por ejemplo, véase, Fang et al., Molecular Therapy.
2007; 15 (6): 1153-1159.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV pueden estar separados por el péptido 2A y una etiqueta. La etiqueta puede estar unida al péptido 2A. La etiqueta puede estar ubicada entre el péptido 2A y el sitio de escisión de furina. La etiqueta puede estar ubicada en el extremo C o el extremo N del ORF en 3' que codifica el antígeno de CMV. La etiqueta puede estar ubicada en el extremo C o el extremo N del ORF en 5' que codifica el antígeno de CMV. La etiqueta puede estar ubicada en el vector con los ORF que codifican dos, tres, cuatro o más antígenos de CMV, un péptido 2A, un sitio de escisión de furina o una combinación de los mismos. La etiqueta puede ser una etiqueta de péptido. La etiqueta puede ser una etiqueta de aminoácidos V5.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV pueden estar separados por el péptido 2A y una secuencia espaciadora. La secuencia espaciadora puede estar ubicada en 5' del péptido 2A. La secuencia espaciadora puede estar ubicada entre los ORF que codifican los antígenos de CMV. La secuencia espaciadora puede estar ubicada en 5' del péptido 2A y la etiqueta. La secuencia espaciadora puede estar ubicada entre el péptido 2A en 5' y el sitio de escisión de furina en 3'. La secuencia espaciadora puede estar ubicada en el vector con los ORF que codifican los antígenos de CMV, un péptido autoescindible, un sitio de escisión de furina, una etiqueta o una combinación de los mismos. La secuencia espaciadora incrementa la eficiencia de la escisión.
Los ORF que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV pueden estar separados por una secuencia de nucleótidos que codifica: un péptido autoescindible, una secuencia de aminoácidos que conduce a la liberación de la secuencia de aminoácidos en 5' mediante "salto de ribosoma" o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3' como "sitios de entrada al ribosoma internos"(IRES).
Se puede usar cualquier cepa de CMV humano o cualquier aislado clínico de CMV humano con la presente invención para obtener los antígenos para la generación de los vectores arenavirales descritos en la presente memoria. Dichas cepas de CMV incluyen AD-169, Merlin, C327A (GenBank M60929), C076A (GenBank M85228) y C194A (GenBank 60926). Otras cepas de CMV humano y secuencias antigénicas de CMV humano que se pueden usar con las composiciones descritas actualmente se enumeran en Meyer-Koenig et al. 1998, J Infect Dis 177: 1162-1169; Shedlock et al. 2012, Human Vaccines & Immunotherapeutics 8: 1-14; y Chou y Dennison 1991, J Infect Dis 163: 1229­ 34. Las secuencias y las cepas se enumeran en Meyer-Koenig et al. 1998, J Infect Dis 177: 1162-1169; Shedlock et al. 2012, Human Vaccines & Immunotherapeutics 8: 1-14; y Chou y Dennison 1991, J Infect Dis 163: 1229-34.
El antígeno de CMV puede ser un ortólogo de antígeno de CMV, p. ej., un antígeno de CMV de mamífero (es decir, de primate no humano, cerdo, perro, gato o caballo).
(a) antígenos gB
En determinadas realizaciones, el antígeno es la glicoproteína gB de la envoltura principal del CMV. El antígeno puede ser un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 o más aminoácidos de la glicoproteína gB de la envoltura principal del CMV. En determinadas realizaciones, se deleciona el dominio transmembrana de gB. En algunas realizaciones, se deleciona el dominio citoplásmico de gB. En determinadas realizaciones, se delecionan los dominios citoplásmico y transmembrana de la glicoproteína gB.
En realizaciones específicas, el antígeno comprende los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5 y AS-4. (Véase la FIG.
2). En determinadas realizaciones, el antígeno gB comprende los sitios antigénicos AS-2, AS-5, AS-4 y AS-1. En determinadas realizaciones, el antígeno comprende el dominio transmembrana de gB. En determinadas realizaciones, el antígeno comprende los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4 y AS-1, así como el dominio transmembrana gB. En determinadas realizaciones, el antígeno comprende el ectodominio de gB.
El antígeno puede ser una proteína de fusión entre la glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma y un polipéptido heterólogo. El antígeno puede tener una longitud de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 o al menos 900 aminoácidos. Uno o más dominios de gB pueden estar sustituidos por uno o más dominios de una proteína heteróloga. El dominio citoplásmico de gB puede estar sustituido por el dominio citoplásmico de una proteína heteróloga. El dominio citoplásmico y los dominios transmembrana de gB pueden estar sustituidos por el dominio citoplásmico de una proteína heteróloga. Los dominios citoplásmico y transmembrana de gB pueden estar sustituidos por los dominios citoplásmico y transmembrana de una proteína heteróloga. El dominio citoplásmico de gB puede estar sustituido por los dominios citoplásmico y transmembrana de una proteína heteróloga. La proteína heteróloga puede ser una glicoproteína de un virus de ARN. La proteína heteróloga puede ser una glicoproteína de VSV. La proteína heteróloga puede ser VSV-G. La proteína heteróloga puede ser la proteína VSV-G del VSV de tipo salvaje. La proteína heteróloga puede ser la proteína VSV-G de la cepa AV1 o AV2 de VSV. La proteína heteróloga puede ser la proteína VSV-G del Serotipo Indiana de VSV. La proteína heteróloga puede ser la proteína VSV-G de la cepa de VSV MARM U, MARM M, MRr o MRb. El antígeno puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 23. El antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 24.
El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5 y AS-4 y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4 y AS-1 y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4, AS-1 y AS-3 y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G. El antígeno puede comprender el dominio transmembrana de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G. El antígeno puede comprender el dominio citoplásmico de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4 y AS-1, así como el dominio transmembrana de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4, AS-1 y AS-3, así como el dominio transmembrana de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G. El antígeno puede comprender el ectodominio de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de VSV-G.
El antígeno puede ser una proteína de fusión entre la glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma y un polipéptido heterólogo. El antígeno puede tener una longitud de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 o al menos 900 aminoácidos. Uno o más dominios de gB pueden estar sustituidos por uno o más dominios de una proteína heteróloga. La proteína heteróloga puede ser una glicoproteína del virus de la influenza. La proteína heteróloga puede ser la proteína hemaglutinina del virus de la influenza (Flu-HA). La proteína heteróloga puede ser la proteína hemaglutinina del virus de la influenza A. La proteína heteróloga puede ser la proteína hemaglutinina del virus de la influenza B. La proteína heteróloga puede ser la proteína hemaglutinina del virus de la influenza C. El antígeno puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 29. El antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que puede ser un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 30.
El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5 y AS-4 y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4 y AS-1 y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4, AS-1 y AS-3 y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA. El antígeno puede comprender el dominio transmembrana de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA. El antígeno puede comprender el dominio citoplásmico de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4 y AS-1, así como el dominio transmembrana de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA. El antígeno puede comprender los sitios antigénicos de gB AS-2, AS-5, AS-4, AS-1 y AS-3, así como el dominio transmembrana de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA. El antígeno puede comprender el ectodominio de gB y una región transmembrana y citoplásmica heteróloga derivada de Flu-HA.
La proteína gB es de la cepa Merlin de CMV. Las secuencias ilustrativas que se pueden usar con las composiciones de vectores virales y los usos de las mismas como se describen en la presente memoria se muestran en la SEQ ID NO: 58 a 63. En determinadas realizaciones, el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 63.
(b) Antígenos de gB truncada
En determinadas realizaciones, el extremo carboxi de la proteína gB está truncado. En determinadas realizaciones, el truncamiento del extremo carboxi de la proteína gB puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,132, 133 o 134 aminoácidos. En otra realización, el truncamiento del extremo carboxi de la proteína gB puede tener una longitud de 1-10, 10-20, 25-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110­ 120, 120-130 o 120-134 aminoácidos. En otras realizaciones, el truncamiento del extremo carboxi de la proteína gB puede tener una longitud de 10-134, 20-134, 30-134, 40-134, 50-134, 60-134, 70-134, 80-134, 90- 134, 100-134, 110­ 134 o 120-134 aminoácidos.
En determinadas realizaciones, la proteína gB con un truncamiento del extremo carboxi comprende una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SeQ ID n O: 3 sobre toda la longitud de la proteína gB truncada. En realizaciones más específicas, la proteína gB tiene un truncamiento entre los aminoácidos 772 a 906 y comprende una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 3 sobre toda la longitud de la proteína gB truncada. En otras realizaciones, la proteína gB con un truncamiento del extremo carboxi comprende una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
En determinadas realizaciones, la proteína gB tiene una deleción en el extremo carboxi. En determinadas realizaciones, la deleción en el extremo carboxi puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 o 133 aminoácidos. En otra realización, la deleción en el extremo carboxi de la proteína gB puede tener una longitud de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120­ 130 o 130-133 aminoácidos. En otras realizaciones, la deleción en el extremo carboxi de la proteína gB puede tener una longitud de 10-133, 20-133, 30-133, 40-133, 50-133, 60-133, 70-133, 80-133, 90- 133, 100-133, 110-133 o 120­ 133 aminoácidos.
En otras realizaciones, la proteína gB con un truncamiento del extremo carboxi todavía está anclada en la membrana del virión de CMV.
(c) Antígenos de pp65
En determinadas realizaciones, el antígeno es la proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 o más aminoácidos de la proteína pp65 del tegumento del CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de pp65. En determinadas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 35. En determinadas realizaciones, el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
(d) Antígenos del complejo pentamérico
Las realizaciones enumeradas en esta sección (d) no forman parte de la invención.
En determinadas realizaciones, el antígeno es la glicoproteína gH de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 o más aminoácidos de la glicoproteína gH de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, gH carece de un dominio transmembrana. En determinadas realizaciones, el antígeno contiene solo el ectodominio de gH. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de gH. En determinadas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 38. En determinadas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 51.
En determinadas realizaciones, el antígeno es un derivado del fragmento de glicoproteína gH. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de gH con la secuencia de anclaje a la membrana C-terminal delecionada, gH(dTM).
En determinadas realizaciones, el antígeno es la glicoproteína gL de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de la glicoproteína gL de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de gL. En determinadas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 40.
En determinadas realizaciones, el antígeno es una proteína del complejo pentamérico o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de una proteína del complejo pentamérico de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones más específicas, la proteína del complejo pentamérico es UL128 de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de UL128. En determinadas realizaciones más específicas, la proteína del complejo pentamérico es UL130 de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de UL130. En determinadas realizaciones más específicas, la proteína del complejo pentamérico es UL131A de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de UL131A. En determinadas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 42. En determinadas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 45. En determinadas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 47.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno de CMV pueden introducirse en el genoma de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente mediante la sustitución de la secuencia de ácido nucleico del ORF (ORF) de la glicoproteína GP, la proteína Z de la matriz, la nucleoproteína NP o la proteína polimerasa L. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno de CMV se fusiona con el ORF (ORF) de la glicoproteína GP, la proteína Z de la matriz, la nucleoproteína NP o la proteína polimerasa L. La secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de CMV, una vez insertada en el genoma de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente, se puede transcribir y/o expresar bajo el control de los cuatro promotores de arenavirus (5' UTR y 3' UTR del segmento S, y 5' UTR y 3' u T r del segmento L), así como ácidos ribonucleicos que pueden insertarse con elementos reguladores que pueden ser leídos por la ARN polimerasa dependiente de ARN viral, la ARN polimerasa I celular, la ARN polimerasa II o la ARN polimerasa III, tales como duplicaciones de secuencias promotoras virales que se encuentran naturalmente en las UTR virales, el promotor de ARN ribosómico 28S, el promotor de beta-actina o el promotor de ARN ribosómico 5S, respectivamente. Los ácidos nucleicos que codifican el antígeno de CMV pueden transcribirse y/o expresarse por sí mismos o como lectura completa por fusión con ORF y genes de arenavirus, respectivamente, y/o en combinación con uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, sitios de entrada de ribosomas internos.
En una realización, el antígeno es uno que es útil para la prevención de enfermedades infecciosas. En una realización específica, el antígeno se deriva de CMV. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica gH o gL. En realizaciones más específicas, la secuencia de ácido nucleico que codifica gH y gL está separada por una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido 2A. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica gH y gL está separada por una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido 2A y un espaciador. En realizaciones más específicas, las secuencias de ácido nucleico que codifican gH y gL están separadas por una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido 2A y un sitio de escisión de furina. En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica gH y gL está separada por un péptido 2A fusionado a una etiqueta, tal como una etiqueta de aminoácido V5 y una escisión de furina ubicada en 5' del péptido 2A. En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica gH y gL está separada por un péptido 2A, un sitio de escisión de furina fusionado a una etiqueta, tal como una etiqueta de aminoácidos V5, y un espaciador. En realizaciones específicas, el espaciador está en 5' del péptido 2A. En realizaciones aún más específicas, el espaciador está en 5' del péptido 2A entre el péptido 2A y la etiqueta.
En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican la glicoproteína gH (dTM) y la glicoproteína gL están separadas por una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido autoescindible. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican la glicoproteína gH (dTM) y la glicoproteína gL están separadas por un péptido 2A. En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la glicoproteína gH (dTM) y la glicoproteína gL están conectadas por un péptido 2A que se fusiona con una etiqueta, tal como V5.
En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más proteínas del complejo pentamérico de CMV están separadas por un péptido autoescindible. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas del complejo pentamérico de CMV están conectadas por un péptido 2A. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas del complejo pentamérico de CMV están conectadas por un péptido 2A fusionado a una etiqueta. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas del complejo pentamérico de CMV están conectadas por un péptido 2A fusionado a una etiqueta de aminoácidos V5.
En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más proteínas del complejo pentamérico de CMV están separadas por un péptido autoescindible, una secuencia de aminoácidos que conduce a la liberación de la secuencia de aminoácidos en 5' mediante "salto de ribosomas", o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3', tales como los "sitios de entrada del ribosoma internos" (IRES). En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más proteínas del complejo pentamérico de CMV están separadas por un péptido autoescindible, una secuencia de aminoácidos que conduce a la liberación de la secuencia de aminoácidos en 5' mediante "salto de ribosomas", o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3', tales como los "sitios de entrada del ribosoma internos" (IRES).
En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más proteínas del complejo pentamérico de CMV están separadas por un péptido autoescindible y un sitio de escisión de furina. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican dos, tres, cuatro o cinco o más proteínas del complejo pentamérico de CMV están separadas por un péptido autoescindible fusionado a una etiqueta, tal como una etiqueta de aminoácidos V5 y un sitio de escisión de furina. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas del complejo pentamérico de CMV están separadas por un péptido autoescindible fusionado a una etiqueta, tal como una etiqueta de aminoácidos V5, un sitio de escisión de furina y un espaciador. En realizaciones específicas, el espaciador está en 5' del péptido autoescindible.
(e) Sustitución del ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus
Las realizaciones enumeradas en esta sección (e) no forman parte de la invención.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica uno, dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV descritos en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica dos, tres, cuatro o cinco o más antígenos de CMV descritos en la presente memoria, separados por péptidos autoescindibles o secuencias de salto de ribosoma. En determinadas realizaciones, el péptido autoescindible (o la secuencia de salto de ribosoma) se puede obtener a partir de una proteína 2A de un miembro de la familia de virus Picornaviridae. En determinadas realizaciones específicas, el péptido autoescindible (o la secuencia de salto de ribosoma) se obtiene de (o se deriva de) 2A de teschovirus-1 porcino, 2A del virus Those asigna o 2A del péptido 2A del virus de la fiebre aftosa.
En una realización, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno de CMV. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la glicoproteína gB de la envoltura principal del CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de gB. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, la glicoproteína gB de la envoltura principal o un fragmento de gB.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es una proteína de fusión entre gB y VSV-G. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que tiene una longitud de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600 o al menos 700 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 23. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 21 o 24.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es una proteína de fusión entre gB y hemaglutinina del virus de la influenza. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que tiene una longitud de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600 o al menos 700 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 26 o 29. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido que es un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 27 o 30.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la proteína pp65 del tegumento del CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de pp65. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, pp65 o un fragmento de pp65.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la glicoproteína gH del CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de gH. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, gH o un fragmento de gH.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la glicoproteína gL de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de gL. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, gL o un fragmento de gL.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la proteína del complejo pentamérico UL128 de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de UL128. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, UL128 o un fragmento de UL128.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la proteína del complejo pentamérico UL130 de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de UL130. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, UL130 o un fragmento de UL130.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la proteína del complejo pentamérico UL131A de CMV o un fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de UL131A. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, UL131A o un fragmento de UL131A.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica dos, tres, cuatro o cinco proteínas del complejo pentamérico o fragmentos de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 o más aminoácidos de las mismas, separados por péptidos autoescindibles o secuencias de salto de ribosomas o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3' tal como IRES. En realizaciones específicas, los péptidos autoescindibles o las secuencias de salto de ribosomas son péptidos 2A de Teschovirus (T2A).
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica gH, gL, UL128, UL130 y UL131A. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica gH y gL. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica gH, gL, UL128, UL130 y UL131A, separada por un péptido autoescindible o una secuencia de salto de ribosoma o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3' tal como IRES. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica gH, gL, UL128, UL130 y UL131A, separados por T2A. En determinadas realizaciones, el marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica gH y gL por T2A.
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica el ectodominio de gH, gL, UL128, UL130 y UL131A. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica el ectodominio de gH y gL. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica el ectodominio de gH, gL, UL128, UL130 y UL131A, separada por un péptido autoescindible o una secuencia de salto de ribosoma o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3' tal como IRES. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica gH y gL, separadas por T2A. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica el ectodominio de gH y gL, separada por un T2A.
En determinadas otras realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete antígenos de CMV, proteínas de fusión de antígenos de CMV con secuencias heterólogas o fragmentos de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 o más aminoácidos de los mismos, separados por péptidos autoescindibles o secuencias de salto de ribosoma o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3' tal como IRES. En realizaciones específicas, los péptidos autoescindibles son péptidos 2A de Teschovirus (T2A).
En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más de gB o un fragmento antigénico de la misma, pp65 o un fragmento antigénico de la misma, gH o un fragmento antigénico de la misma, gL o un fragmento antigénico de la misma, UL128 o un fragmento antigénico de la misma, UL130 o un fragmento antigénico de la misma, y UL131A o un fragmento antigénico de la misma. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más de gB o un fragmento antigénico de la misma, pp65 o un fragmento antigénico de la misma, gH o un fragmento antigénico de la misma, gL o un fragmento antigénico de la misma, UL128 o un fragmento antigénico de la misma, UL130 o un fragmento antigénico de la misma, y UL131A o un fragmento antigénico de la misma, separados por un péptido autoescindible o una secuencia de salto de ribosoma o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3' tal como IRES. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más de gB o un fragmento antigénico de la misma, pp65 o un fragmento antigénico de la misma, gH o un fragmento antigénico de la misma, gL o un fragmento antigénico de la misma, UL128 o un fragmento antigénico de la misma, UL130 o un fragmento antigénico de la misma, y UL131A o un fragmento antigénico de la misma, separados por T2A. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica más de una copia de los antígenos de CMV de la presente memoria. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica más de una copia de los antígenos de CMV de la presente memoria, separada por un péptido autoescindible o una secuencia de salto de ribosoma o un elemento de secuencia que conduce a la unión del ribosoma y a la traducción de la secuencia en 3' tal como IRES. En determinadas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica más de una copia de los antígenos de CMV de la presente memoria, separados por T2A.
6.3 Generación de arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV
Generalmente, las partículas de arenavirus se pueden producir de forma recombinante mediante técnicas de genética inversa estándar como se describe para LCMV (L. Flatz, A. Bergthaler, J. C. de la Torre y D. D. Pinschewer, Proc Natl Acad Sci USA 103: 4663-4668, 2006; A. B. Sánchez y J. C. de la Torre, Virology 350: 370, 2006; E. Ortiz-Riano, B.Y. Cheng, J. C. de la Torre, L. Martínez-Sobrido. J Gen Virol. 94: 1175-88, 2013). Para generar arenavirus infecciosos de replicación deficiente para su uso con la presente invención se pueden usar estas técnicas, sin embargo, el genoma del virus rescatado se modifica como se describe en la Sección 6.1. Estas modificaciones pueden ser: i) uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, de los cuatro ORF de arenavirus (glicoproteína (GP); nucleoproteína (NP); la proteína Z de la matriz; la ARN polimerasa L dependiente de ARN) se eliminan o se inactivan funcionalmente para prevenir la formación de partículas infecciosas en células normales, aunque todavía se permite la expresión génica en células huésped infectadas con el vector de arenavirus; y ii) se pueden introducir ácidos nucleicos que codifican antígenos de CMV. Los virus infecciosos de replicación deficiente, como se describe en la presente memoria, se pueden producir como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2009/083210 (número de solicitud PCT/EP2008/010994).
Una vez generados a partir de ADNc, los arenavirus infecciosos de replicación deficiente proporcionados en la presente memoria pueden propagarse en células complementarias. Las células complementarias son células que proporcionan la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente mediante la modificación de su genoma (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se deleciona o se inactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP).
Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los genes virales en los vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la deleción de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus se pueden generar y expandir en las células que proporcionan en trans el o los genes del virus delecionados, p. ej., la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular complementaria, en lo sucesivo denominada células C, se genera transfectando una línea celular de mamífero tal como BHK-21, HEK 293, VERO u otra (aquí se tomará como ejemplo BHK-21) con uno o más plásmidos para la expresión del gen o genes virales de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El o los plásmidos C expresan el o los genes virales delecionados en el vector de arenavirus que se generará bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos, p. ej., un promotor de la polimerasa II de mamíferos tal como el promotor de CMV o EF1 alfa con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamíferos, p. ej., resistencia a puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos, p. ej., casete de expresión de polimerasa II como anteriormente, o el o los transcritos de genes virales están seguidos de un sitio de entrada de ribosoma interno, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamíferos. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriano, tal como un casete de resistencia a ampicilina.
Las células que se pueden usar, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con el o los plásmidos de complementación usando cualquiera de las estrategias comúnmente usadas, tales como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación. Unos días más tarde, se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C de alta expresión se identifican usando procedimientos de citometría de flujo o transferencia Western con anticuerpos dirigidos contra la proteína o proteínas virales de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de forma estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el gen o los genes virales ausentes en cada una de las etapas en las que se usarán las células C a continuación. Además, se puede usar un virus auxiliar para proporcionar la funcionalidad ausente en trans.
Los plásmidos que se pueden usar pueden ser de dos tipos: i) Dos plásmidos, denominados plásmidos TF para expresar intracelularmente en las células C los factores que actúan en trans mínimos del arenavirus, se derivan de, p. ej., proteínas NP y L de LCMV en el presente ejemplo; y ii) Plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en las células C los segmentos del genoma del vector de arenavirus, p. ej., los segmentos con modificaciones diseñadas. Los plásmidos TF expresan las proteínas NP y L del vector de arenavirus respectivo bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamíferos, típicamente, p. ej., un promotor de polimerasa II de mamífero tal como el promotor de CMV o EF1alfa, cualquiera de ellos preferentemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos del genoma pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por polimerasa I o casetes de expresión dirigidos por ARN polimerasa del bacteriófago T7 (T7), esto últimos preferentemente con una ribozima terminal 3' para procesar el transcrito primario para producir el extremo correcto. En el caso de usar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en las células C debe proporcionarse incluyendo en el proceso de recuperación un plásmido de expresión adicional, construido de manera análoga a los plásmidos TF, siempre que T7 o las células C estén construidas para expresan adicionalmente T7 de manera estable. En determinadas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia del genoma y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, poll y polII de un plásmido.
Para recuperar el vector de arenavirus, se pueden usar los siguientes procedimientos. Primer día: las células C, típicamente confluentes al 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En determinadas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia del genoma y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, poll y polII de un plásmido. Para ello se puede aprovechar cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como el fosfato cálcico, los protocolos basados en liposomas o la electroporación.
3-5 días después: el sobrenadante del cultivo (preparación del vector de arenavirus) se recoge, se divide en partes alícuotas y se almacena a 4 °C, -20 °C o -80 °C, dependiendo de cuánto tiempo se deba almacenar el vector de arenavirus antes de su uso. A continuación, se evalúa la titulación infecciosa de la preparación del vector de arenavirus mediante un ensayo de inmunofoco en células C.
Un cultivo celular puede infectarse con un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV. Cuando se usa para la expresión de un antígeno de CMV en células cultivadas, se pueden usar los siguientes dos procedimientos:
i) El tipo de célula de interés se infecta con la preparación de vector de arenavirus descrita en la presente memoria con una multiplicidad de infección (MOI) de uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, lo que da como resultado la producción del antígeno de CMV en todas las células ya poco después infección.
ii) Alternativamente, se puede usar una MOI más baja y se pueden seleccionar clones de células individuales por su nivel de expresión de antígeno de CMV dirigido por virus. Posteriormente, los clones individuales se pueden expandir infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente del enfoque, el antígeno de CMV puede recogerse (y purificarse) posteriormente del sobrenadante del cultivo o de las propias células, dependiendo de las propiedades del antígeno de CMV producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y se pueden considerar otras formas de dirigir la expresión del antígeno de CMV usando arenavirus infecciosos de replicación deficiente como vectores.
6.4 Ácidos nucleicos, sistemas de vectores y líneas celulares
En la presente memoria se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico grande (segmento L) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona o se inactiva funcionalmente, y el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV.
En una realización, en la presente memoria se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV. En otra realización, en la presente memoria se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que el ORF del gen de la glicoproteína se deleciona y en donde el segmento genómico corto comprende secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV. En determinadas realizaciones más específicas, el antígeno de CMV es un antígeno descrito en la Sección 6.2.
En determinadas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden derivarse de una cepa particular de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el ácido nucleico se deriva del Clon 13 de LCMV. En otras realizaciones específicas, el ácido nucleico se deriva de la cepa MP de LCMV.
Un ácido nucleico que codifica un segmento genómico de arenavirus puede comprender una secuencia que es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, O SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 50. En otra realización, se proporciona aquí una ácido nucleico que codifica un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos 99%, o 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos 1639 a 3315 de SEQ ID NO: 31; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ácido nucleico que codifica un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de expresión cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por 1639 a 3315 de la SEQ ID NO: 31; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ácido nucleico que codifica un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos 1640 a 3316 de la SEQ ID NO: 32; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ácido nucleico que codifica un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de expresión cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por 1640 a 3316 de la SEQ ID NO: 32; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV
Los ácidos nucleicos pueden codificar un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido autoescindible (o secuencia de salto de ribosoma); y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos de CMV. La secuencia de nucleótidos que codifica un péptido autoescindible puede codificar 2A de Teschovirus. Los ácidos nucleicos pueden codificar dos, tres, cuatro o cinco proteínas del complejo pentamérico separadas por una o más secuencias de nucleótidos que codifican péptidos autoescindibles (o secuencias de salto de ribosoma) (p. ej., T2A). Los ácidos nucleicos pueden codificar una o más proteínas gB o fragmentos de las mismas y uno o más de otros antígenos de CMV, separados por una o más secuencias de nucleótidos que codifican péptidos autoescindibles (o secuencias de salto de ribosoma). Los ácidos nucleicos pueden codificar una o más proteínas pp65 o fragmentos de las mismas y uno o más de otros antígenos de CMV, separados por una o más secuencias de nucleótidos que codifican péptidos autoescindibles (o secuencias de salto de ribosoma). Los ácidos nucleicos pueden codificar una o más proteínas pentaméricas o fragmentos de las mismas y uno o más de otros antígenos de CMV, separados por una o más secuencias de nucleótidos que codifican péptidos autoescindibles (o secuencias de salto de ribosoma).
En la presente memoria se describe un sistema de vector que comprende uno o más vectores que juntos codifican el genoma de una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente descrita en la presente memoria. Específicamente, en la presente memoria se describe un sistema de vector en donde uno o más vectores codifican dos segmentos genómicos de arenavirus, a saber, un segmento L y un segmento S, de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria. Dicho sistema de vector puede codificar (en una o más moléculas de ADN separadas):
Un segmento genómico S de arenavirus que se modifica de manera que una partícula de arenavirus que porta este segmento genómico S modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y un segmento genómico L de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de CMV;
Un segmento genómico L de arenavirus que se modifica de manera que una partícula de arenavirus que porta este segmento genómico L modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y un segmento genómico S de arenavirus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de CMV;
Un segmento genómico S de arenavirus que se modifica de manera que una partícula de arenavirus que porta este segmento genómico S modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y en donde el segmento genómico S de arenavirus comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de CMV y un segmento genómico L de arenavirus de tipo salvaje; o
Un segmento genómico L de arenavirus que se modifica de modo que una partícula de arenavirus que porta este segmento genómico L modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y en donde el segmento genómico L de arenavirus comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de CMV y un segmento genómico S de arenavirus de tipo salvaje.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico codifica un segmento genómico de arenavirus (p. ej., LCMV) en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S está sustituido con una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB del citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma;
• una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento del citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma;
En la presente memoria se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento genómico de arenavirus (p. ej., LCMV) en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S está sustituido con una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de antígenos de CMV (p. ej., una o más de las enumeradas en el párrafo anterior), separadas por secuencias de nucleótidos que codifican un péptido autoescindible (o secuencias de salto de ribosoma). Las secuencias de nucleótidos que codifican un péptido autoescindible pueden codificar 2A de Teschovirus.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona una célula en donde la célula comprende un ácido nucleico o un sistema de vector descrito anteriormente en esta sección. En la presente memoria también se proporcionan líneas celulares derivadas de dichas células, cultivos que comprenden dichas células y métodos para cultivar dichas células infectadas. Una célula puede comprender un ácido nucleico que codifica el segmento genómico grande (segmento L) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona o se inactiva funcionalmente, y el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de CMV.
En otras realizaciones, en la presente memoria se proporciona una célula en donde la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno gB de CMV o un fragmento antigénico del mismo.
En la presente memoria se describe una célula en donde la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona o se inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende al menos un dominio del antígeno gB de CMV y un dominio heterólogo del VSV-G.
En la presente memoria se describe una célula en donde la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona o se inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende al menos un dominio del antígeno gB de CMV y un dominio heterólogo de Flu-HA.
En otras realizaciones, en la presente memoria se proporciona una célula en donde la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno pp65 de CMV o un fragmento antigénico del mismo.
En la presente memoria se describe una célula en donde la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona o se inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de los antígenos de CMV gH, gL, UL128, UL130, UL131A, o fragmentos antigénicos de los mismos. El segmento genómico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más del grupo de antígenos de CMV que comprende gH, gL, UL128, UL130, UL131A o fragmentos antigénicos de los mismos, separados por uno o más péptidos autoescindibles (o secuencias de salto de ribosoma). El uno o más péptidos autoescindibles pueden ser péptidos T2A.
En la presente memoria se describe una célula en donde la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente descrito en la presente memoria, en el que un ORF del segmento genómico se deleciona o se inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de los antígenos de CMV separados por uno o más péptidos autoescindibles (o secuencias de salto de ribosoma). El uno o más péptidos autoescindibles pueden ser péptidos T2A.
En otra realización, es una célula en donde la célula comprende dos ácidos nucleicos o un sistema de vector descrito en la presente memoria. En la presente memoria también se describen líneas celulares derivadas de dichas células, cultivos que comprenden dichas células y métodos para cultivar dichas células infectadas.
En la presente memoria se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 53. En la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 53. En la presente memoria se describe una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 53.
En la presente memoria se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID n O: 54, 55, 56 o 57. En la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 54, 55, 56 o 57. En la presente memoria se describe una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SeQ ID NO: 54, 55, 56 o 57.
En la presente memoria se describe una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 54, 55, 56 o 57. En la presente memoria se describe una célula huésped que expresa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 54, 55, 56 o 57. La célula huésped puede cultivarse en medio de cultivo celular.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SeQ ID NO: 32 o SeQ ID NO: 33. En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 33.
6.5 Uso en métodos
En una realización, en la presente memoria se proporcionan uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se proporciona en la presente memoria o una composición de los mismos para su uso en métodos de tratamiento de una infección en un sujeto que comprenden administrar al sujeto uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición de los mismos. En una realización específica, dicho método para tratar una infección descrito en la presente memoria comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición de los mismos. El sujeto puede ser un mamífero, tal como, pero no limitado a, un ser humano, un ratón, una rata, una cobaya, un animal domesticado, tal como, pero no limitado a, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un gato, un perro, un hámster, un burro. En una realización específica, el sujeto es un ser humano.
En otra realización, dichos métodos son para inducir una respuesta inmune contra CMV en un sujeto que comprenden administrar al sujeto un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo.
En otra realización, los sujetos a los que se les administra un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo tienen, son susceptibles o están en riesgo de una infección por CMV o su reactivación. En otra realización específica, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo están infectados con, son susceptibles o están en riesgo de, una infección con CMV o una reactivación con CMV.
En otra realización, los sujetos a los que se les administra un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo padecen, son susceptibles o están en riesgo de, una infección con CMV en el sistema pulmonar, sistema nervioso central, sistema linfático, sistema gastrointestinal o sistema circulatorio entre otros. En una realización específica, los sujetos a los que se les administra un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo padecen de, son susceptibles o están en riesgo de, una infección con CMV en uno o más órganos del cuerpo, incluyendo, pero no limitados a, el cerebro, el hígado, los pulmones, los ojos, los oídos, los intestinos, el esófago o las glándulas salivales.
En otra realización, los sujetos a los que se les administra un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo padecen de síntomas que incluyen, pero no están limitados a, fiebre, sudores nocturnos, cansancio, malestar, desasosiego, dolor de garganta, glándulas inflamadas, dolor en las articulaciones, dolor muscular, pérdida de apetito, pérdida de peso, diarrea, úlceras gastrointestinales, hemorragia gastrointestinal, dificultad para respirar, neumonía, úlceras en la boca, problemas de visión, hepatitis, ictericia, encefalitis, convulsiones, coma o pérdida de audición.
En otra realización, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto de cualquier grupo de edad que padece de, es susceptible a, o está en riesgo de, una infección con CMV. En una realización específica, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto con un sistema inmunológico comprometido, un sujeto embarazada, un sujeto sometido a un trasplante de órgano o de médula ósea, un sujeto que toma fármacos inmunosupresores, un sujeto sometido a hemodiálisis, un sujeto que tiene cáncer, o un sujeto que padece de, es susceptible a, o está en riesgo de, una infección con CMV o reactivación de CMV. En una realización más específica, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto con un sistema inmunológico comprometido debido a la infección por VIH, que padece de, es susceptible a, o está en riesgo de, una infección con CMV o reactivación de CMV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que es un niño de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padece de, es susceptible a, o está en riesgo de, una infección con CMV o reactivación de CMV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que es un bebé que padece de, es susceptible a, o está en riesgo de, una infección con CMV o reactivación de CMV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que es un bebé de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de edad que padece de, es susceptible a, o está en riesgo de, una infección con CMV o reactivación de CMV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto anciano que padece de, es susceptible a, o está en riesgo de, una infección con CMV o reactivación. de CMV.
En otra realización, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a sujetos con un riesgo elevado de infección por CMV diseminada. En una realización específica, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a sujetos en período neonatal con un sistema inmune neonatal inmaduro.
En otra realización, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que tiene una infección latente con CMV. En una realización específica, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que tiene una infección latente con CMV, que puede reactivarse tras el compromiso del sistema inmune. En una realización, dicho método es para prevenir la reactivación de CMV.
En otra realización, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a sujetos infectados con una o más cepas de CMV. En determinadas realizaciones, una o más de esas cepas incluyen AD169, Towne, Merlin, Toledo, FIX, PH, TR, Davis, TB40/E, 3157, 6397, 711,5234 u otras cepas.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo a sujetos confiere inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección por CMV o reactivación de CMV. Sin estar ligado a la teoría, en otra realización, un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo infecta y expresa antígenos de interés en células presentadoras de antígeno (APC) del huésped (p. ej., macrófagos) para la presentación directa de antígenos en el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (Mh c ) de clase I y II. En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo a sujetos induce respuestas plurifuncionales de células T CD4+ y CD8+ específicas de CMV coproductoras de IFN-y y TNF-a (IFN-y es producido por las células T CD4+ y CD8+ y TNF-a es producido por las células T CD4+) de alta magnitud para tratar o prevenir una infección por CMV o reactivación de CMV.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección con CMV o reactivación de CMV en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por CMV o reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce los síntomas de una infección por CMV o la reactivación de CMV en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%., al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección por CMV o la reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo en sujetos con un sistema inmune neonatal inmaduro induce una respuesta de inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección por CMV o la reactivación de CMV en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o más, en comparación con la respuesta de inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección por CMV o la reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En determinadas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce el número de cuerpos de inclusión detectados en las glándulas salivales u otra muestra histológica. En determinadas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce el número de anticuerpos anti-CMV detectados en una muestra de sangre del paciente. En determinadas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce la cantidad de pp65 de CMV detectada en los leucocitos de sangre periférica mediante un ensayo de antigenemia de pp65 de CMV. En determinadas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce la cantidad de CMV detectada en orina, saliva, sangre, lágrimas, semen o leche materna. En determinadas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce el nivel de virus cultivado de una muestra de orina, frotis de garganta, lavado bronquial o tejido. En determinadas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo reduce el nivel de virus detectado a través de ensayos de PCR cuantitativa o cualitativa.
Los cambios en la función de la respuesta de la inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección por CMV o la reactivación de CMV inducida por la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o una composición del mismo en sujetos pueden medirse mediante cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica incluyendo, pero no limitado a, citometría de flujo (véase, p. ej., Perfetto S.P. et al., Nat Rev Immun. 2004; 4 (8): 648-55), ensayos de proliferación de linfocitos (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 2008; 101: 101-4; y Hicks M.J. et al., Am J Clin Pathol. 1983; 80: 159-63), ensayos para medir la activación de linfocitos, incluyendo la determinación de cambios en la expresión de marcadores de superficie después de la activación de la medición de citoquinas de linfocitos T (véase, p. ej., Caruso A. et al., Citometry. 1997; 27: 71-6), ensayos ELISPOT (véase, p. ej., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65: 109-121; y Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120: 1-8), o ensayos de citotoxicidad de células asesinas naturales (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol. Mayo de 2005; 94 (5 Supl 1): S1-63).
En la presente memoria se describe un método de uso con un arenavirus infeccioso de replicación deficiente (p. ej., LCMV) que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gH de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
d. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gL de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
e. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL128 de CMV o un fragmento antigénico de la misma;
f. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL130 de CMV o un fragmento antigénico de la misma; o
g. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína UL131A de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
En otra realización, los métodos son para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto que comprenden administrar a un sujeto en edad fértil un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. Véase la sección 6.2. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto seronegativo en edad fértil un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización más, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden la administración a un sujeto en edad fértil con la intención de procrear de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria.
En otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto en edad fértil uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. Véase la sección 6.2. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto seronegativo en edad fértil uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización más, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden la administración a un sujeto en edad fértil con la intención de procrear de uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria.
En otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto embarazada un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden administrar a una mujer embarazada una cantidad eficaz de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria.
En otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto embarazada uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de CMV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto embarazada una cantidad efectiva de uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV reduce la infección congénita sintomática por CMV. En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV reduce la infección congénita asintomática por CMV.
En otra realización, la administración de uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV reduce la infección congénita sintomática por CMV. En otra realización, la administración de uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV reduce la infección congénita asintomática por CMV.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV reduce las manifestaciones de infección congénita por CMV en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o más. En otra realización específica, la administración de un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV reduce la mortalidad de los recién nacidos con infección congénita por CMV.
En otra realización, la administración de uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV reduce las manifestaciones de infección congénita por CMV en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o más. En otra realización específica, la administración de uno o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV reduce la mortalidad de los recién nacidos con infección congénita por CMV.
Dichas manifestaciones de CMV congénitas incluyen, pero no se limitan a, retraso mental, ceguera y sordera neurosensorial, microcefalia, coriorretinitis, calcificaciones intracraneales, hepatoesplenomegalia, hepatitis, ictericia, hiperbilirrubinemia directa, trombocitopenia, petequias, oligohidramnios, polihidramnios, prematuridad, retraso del crecimiento intrauterino. hidropesía no inmune, ascitis fetal, hipotonía y anemia.
6.6 Composiciones, administración y dosificación
La invención se refiere además a vacunas, composiciones inmunogénicas y composiciones farmacéuticas que comprenden un arenavirus modificado por ingeniería genética como se proporciona en la presente memoria. Estas vacunas y composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica.
En otra realización, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden un arenavirus infeccioso de replicación deficiente proporcionado en la presente memoria. Dichas composiciones se pueden usar en métodos de tratamiento y prevención de enfermedades. En una realización específica, las composiciones proporcionadas en la presente memoria se usan en el tratamiento de sujetos infectados con, o susceptibles de, una infección por CMV o reactivación de CMV. En otra realización específica, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria se pueden usar para inducir una respuesta inmune en un huésped al que se administra la composición. Las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria se pueden usar como vacunas y, en consecuencia, se pueden formular como composiciones farmacéuticas. En una realización específica, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria se usan en la prevención de la infección de sujetos (p. ej., sujetos humanos) por CMV o la reactivación de CMV en sujetos (p. ej., sujetos humanos).
En determinadas realizaciones, las composiciones inmunogénicas comprenden un vector de arenavirus (o una combinación de diferentes vectores de arenavirus) como se proporciona en la presente memoria. En determinadas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un adyuvante. El adyuvante para la administración en combinación con una composición proporcionada en la presente memoria puede administrarse antes, concomitantemente o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en la presente memoria aumenta, mejora y/o refuerza la respuesta inmune a una partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmune a la partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmune a la partícula de arenavirus infecciosa de replicación deficiente y no produce una alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden potenciar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen, p. ej., el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de las células B y/o T y la estimulación de los macrófagos. Cuando una vacuna o composición inmunogénica de la invención comprende adyuvantes o se administra junto con uno o más adyuvantes, los adyuvantes que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a, adyuvantes de sales minerales o adyuvantes de gel de sales minerales, adyuvantes en partículas, adyuvantes en micropartículas, adyuvantes mucosos y adyuvantes inmunoestimuladores. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (Mp L) (véase, GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la Solicitud Internacional No. PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional No. WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la Solicitud Internacional No. PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional No. WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véase, Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman, Plenum Press, NY, 1995); Pat. de EE. UU. No. 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunes, tales como monofosforil lípido A (véase, Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)).
Las composiciones comprenden los arenavirus infecciosos de replicación deficiente proporcionados en la presente memoria solos o junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden usarse suspensiones o dispersiones de arenavirus modificados por ingeniería genética, especialmente suspensiones o dispersiones acuosas isotónicas. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, p. ej., conservantes, estabilizadores, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o tampones y se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, por medios de procesos convencionales de dispersión y suspensión. En determinadas realizaciones, dichas dispersiones o suspensiones pueden comprender agentes reguladores de la viscosidad. Las suspensiones o dispersiones se mantienen a temperaturas de alrededor de 2-8 °C, o preferentemente para un almacenamiento más prolongado se pueden congelar y luego descongelar poco antes de su uso. Para inyección, la vacuna o las preparaciones inmunogénicas se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer o tampón salino fisiológico. La disolución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
En determinadas realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente memoria comprenden adicionalmente un conservante, p. ej., el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria comprenden timerosal del 0,001% al 0,01%. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria no comprenden un conservante.
Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 103 a aproximadamente 1011 unidades formadoras de foco de los arenavirus modificados por ingeniería genética. Las formas de dosis unitarias para la administración parenteral son, por ejemplo, ampollas o viales, p. ej., viales que contienen aproximadamente 103 a 1010 unidades de formación de foco o 105 a 1015 partículas físicas de arenavirus modificados por ingeniería genética.
En otra realización, una vacuna o composición inmunogénica proporcionada en la presente memoria se administra a un sujeto por, incluyendo, pero no limitado a, las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, tópica, subcutánea, percutánea, intranasal y de inhalación, y por escarificación (rascado a través de las capas superiores de la piel, p. ej., usando una aguja bifurcada). Específicamente, se pueden usar las vías subcutánea o intravenosa.
Para la administración intranasal o por inhalación, la preparación para su uso según la presente invención se puede administrar convenientemente en forma de una pulverización en aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para su uso en un inhalador o insufladores que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
La dosificación del ingrediente activo depende del tipo de vacunación y del sujeto, y su edad, peso, estado individual, datos farmacocinéticos individuales y modo de administración.
En la presente memoria se describen procesos y el uso de arenavirus modificados por ingeniería genética para la fabricación de vacunas en forma de preparaciones farmacéuticas, que comprenden arenavirus modificados por ingeniería genética como ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezclado y/o dispersión.
6.7 Generación optimizada de vectores de LCMV
Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los genes virales en los vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la deleción de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus se pueden generar y expandir en células que proporcionan el o los genes virales delecionados o inactivados funcionalmente (p. ej., la GP) "en trans". El virus resultante en sí mismo es infeccioso. pero no puede producir más partículas de progenie infecciosas en células no complementarias debido a la falta del gen o genes virales eliminados o inactivados funcionalmente (p. ej., la GP). La célula complementaria puede proporcionar la funcionalidad ausente por transfección estable, transfección transitoria o por infección con un virus auxiliar que expresa la funcionalidad ausente.
En determinadas realizaciones, la célula complementaria proporciona el gen viral que se ha delecionado o inactivado funcionalmente del genoma del vector de arenavirus. En una realización específica, la célula complementaria proporciona el gen viral a partir de una cepa viral que es la misma que la cepa viral que se usó para generar el genoma del vector de arenavirus. En otra realización, la célula complementaria proporciona el gen viral a partir de una cepa viral que es diferente de la cepa viral que se usó para generar el genoma del vector de arenavirus. El gen viral proporcionado en la célula complementaria puede obtenerse a partir de la cepa MP de LCMV y codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, 55, 56 o 57.
La célula complementaria puede proporcionar la GP de la cepa MP de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno de CMV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. La célula complementaria puede proporcionar la GP de la cepa MP de LCMV y el vector arenavirus se obtiene del Clon 13 de LCMV y comprende un ORF de un antígeno de CMV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. La proteína GP puede ser al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55.
6.8 Terapia de combinación
6.8 (a) Métodos
En una realización, en la presente memoria se proporcionan dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente para su uso en métodos de tratamiento y/o prevención de una infección por CMV en un sujeto que comprenden administrar al sujeto dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. Véase, p. ej., la Sección 6.2. En realizaciones específicas, un método para tratar y/o prevenir una infección por CMV comprende administrar un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria, p. ej., en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de CMV, en donde el antígeno de CMV puede ser, pero no está limitado a:
a) una glicoproteína gB de CMV o un fragmento antigénico de la misma; o
b) una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria, p. ej., en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de CMV, en donde el antígeno de CMV puede ser, pero no está limitado a:
a) una glicoproteína gB de CMV o un fragmento antigénico de la misma o
b) una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
En determinadas realizaciones, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar dos construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En una realización específica, las dos construcciones de vector de arenavirus expresan un antígeno de CMV diferente.
En determinadas realizaciones, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar dos o más construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar tres o más construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización, los métodos para tratar/o prevenir una infección comprenden administrar cuatro o más construcciones de vector de arenavirus, cinco o más construcciones de vector de arenavirus, seis o más construcciones de vector de arenavirus o 7 construcciones de vector de arenavirus, cada una de las cuales expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En determinadas realizaciones, la construcción de vector de arenavirus puede ser LCMV.
En determinadas realizaciones, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar dos construcciones de vector de arenavirus, cada una de las cuales expresa un antígeno de CMV diferente como se describe en la presente memoria. Los métodos para tratar y/o prevenir una infección pueden comprender administrar tres o más construcciones de vector de arenavirus, cada una de las cuales expresa un antígeno de CMV diferente como se describe en la presente memoria. Los métodos para tratar/o prevenir una infección pueden comprender administrar cuatro o más construcciones de vector de arenavirus, cinco o más construcciones de vector de arenavirus, seis o más construcciones de vector de arenavirus o 7 construcciones de vector de arenavirus, cada una de las cuales expresa un antígeno de CMV diferente como se describe en la presente memoria. La construcción del vector de arenavirus puede ser LCMV.
El antígeno puede ser la glicoproteína gB de la envoltura del CMV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2 (a)). En realizaciones específicas, el antígeno es la glicoproteína gB de la envoltura del CMV con un truncamiento del extremo carboxi. (Véase, p. ej., la Sección 6.2 (b)).
En determinadas realizaciones, el antígeno es la proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2 (c)).
El antígeno puede ser una proteína del complejo pentamérico de CMV. El antígeno del complejo pentamérico de CMV puede ser gH, gH (dTM), gL, UL128, UL131A o UL130 o combinaciones de los mismos. (Véase, p. ej., la Sección 6.2 (d)).
Los antígenos de CMV pueden estar separados por varios conectores, espaciadores y sitios de escisión como se describe en la presente memoria.
En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV como se describe en la presente memoria del primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente se basa en el Clon 13 de LCMV (Véase, p. ej., la Sección 7.1).
En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV como se describe en la presente memoria del segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente se basa en el Clon 13 de LCMV (Véase, p. ej., la Sección 7.1).
Los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto pueden comprender administrar al sujeto un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
Los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto pueden comprender administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
Los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto pueden comprender administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
El arenavirus de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma puede ser un antígeno de vacuna primario y el segundo arenavirus de replicación deficiente infeccioso que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento antigénico de la misma puede ser un antígeno de vacuna secundario.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección por CMV en un sujeto comprenden administrar al sujeto un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi. (Véase, p. ej., la Sección 6.2 (b) para proteínas gB truncadas).
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección por CMV en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(b) para proteínas gB truncadas).
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección por CMV en un sujeto comprenden administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(b) para proteínas gB truncadas).
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma es un antígeno de vacuna primario y el segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi es un antígeno de vacuna secundario.
La administración de un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma o una proteína pp65 del tegumento de CMV y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma o una proteína pp65 del tegumento de CMV proporciona mejor efecto protector contra CMV después de la vacunación que administrar un único arenavirus infeccioso de replicación deficiente que exprese un antígeno de CMV, p. ej., que expresa solo la glicoproteína gB (o un fragmento de la misma) o solo la proteína pp65 del tegumento. En otras realizaciones, la administración de un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma o una proteína pp65 del tegumento de CMV y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma o una proteína pp65 del tegumento de CMV incita una respuesta inmune mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV, p. ej., que expresa solo la glicoproteína gB (o un fragmento de la misma) o solo la proteína pp65 del tegumento. En otra realización, la administración de un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma o una proteína pp65 del tegumento de CMV y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma, o una proteína pp65 del tegumento de CMV incita una respuesta mayor de células T CD8+ que la administración de un solo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV, p. ej., que expresa solo la glicoproteína gB (o un fragmento de la misma) o solo la proteína pp65 del tegumento. En otras realizaciones, la administración de un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma o una proteína pp65 del tegumento de CMV y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV o un fragmento de la misma o una proteína pp65 del tegumento de CMV incita titulaciones más altas de anticuerpos neutralizantes que la administración de un solo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV, p. ej., que expresa solo la glicoproteína gB (o un fragmento de la misma) o solo la proteína pp65 del tegumento.
En determinadas realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi (véase la Sección 6.2(b)) proporciona un mejor efecto protector contra CMV después de la vacunación que un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un glicoproteína gB de CMV, en donde se ha delecionado el dominio transmembrana de gB, según se ensayó mediante ELISA, ensayo de anticuerpos neutralizantes y modelos animales. Véase la Sección 6.9. En otras realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi incita una mayor respuesta inmune que un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV, en donde se ha delecionado el dominio transmembrana de gB. En determinadas realizaciones, el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi incita una mayor respuesta de linfocitos T CD8+ que el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV, en donde se ha delecionado el dominio transmembrana de gB. En otras realizaciones, el arenavirus de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi incita titulaciones más altas de anticuerpos neutralizantes que el arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV, en donde se ha delecionado el dominio transmembrana de gB. (Véanse, p. ej., las Fig. 12, 13 y 25, 26).
En otra realización más, existe el uso combinado del arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria y uno o más vectores de virus de replicación defectuosa. En una realización más específica, el vector de virus de replicación defectuosa se selecciona del grupo que comprende poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociado y virus sendai y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna modificada Ankara.
En otra realización más, existe el uso combinado del arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria y uno o más vectores de virus de replicación defectuosa que expresan un antígeno de CMV. En una realización más específica, el vector de virus de replicación defectuosa se selecciona del grupo que comprende poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociado y virus sendai y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna modificada Ankara.
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria se administra antes o después del segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, el primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV se administra aproximadamente 30­ 60 minutos antes o después de la primera administración del segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente.
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV se administra antes del segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de vacuna. En determinadas realizaciones hay un período de aproximadamente 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año entre la administración del primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente y el segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente.
En otra realización, se administran dos arenavirus infecciosos de replicación deficiente en un régimen de tratamiento en relaciones molares que varían de aproximadamente 1:1 a 1:1.000, en particular incluyendo: relación 1:1, relación 1:2, relación 1:5, relación 1:10, relación 1:20, relación 1:50, relación 1:100, relación 1:200, relación 1:300, relación 1:400, relación 1:500, relación 1:600, relación 1:700, relación 1:800, relación 1:900, relación 1:1.000.
En otra realización, los sujetos a los que se administran dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria tienen, son susceptibles o están en riesgo de una infección por CMV o su reactivación. En otra realización, los sujetos a los que se administran dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria están infectados con, son susceptibles o están en riesgo de, una infección por CMV o una reactivación con CMV.
En otra realización, los sujetos a los que se administran simultáneamente dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria tienen, son susceptibles o están en riesgo de, una infección por CMV o su reactivación. En otra realización, los sujetos a los que se administran simultáneamente dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria, están infectados con, son susceptibles o están en riesgo de, una infección por CMV o una reactivación con CMV.
En otra realización, los sujetos a los que se administran secuencialmente dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria tienen, son susceptibles o están en riesgo de, una infección por CMV o su reactivación. En otra realización, los sujetos a los que se administran secuencialmente dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria están infectados con, son susceptibles o están en riesgo de, una infección por CMV o una reactivación con CMV.
En otra realización, dichos dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria se administran además en combinación con al menos otro medicamento para tratar y/o prevenir el CMV. Los medicamentos terapéuticos para tratar y/o prevenir el CMV incluyen, pero no se limitan a, Valganciclovir, Ganciclovir, Foscarnet, Cidofovir o Maribavir.
En otra realización, dichos dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria se administran además en combinación con al menos otro inmunomodulador. En una realización más específica, dichos dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria se administran además en combinación con al menos un adyuvante específico de Th1. En una realización más específica, el adyuvante específico de Th-1 es Bacillus Calmette-Guerin (BCG).
En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto sintomático de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización más, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto con un sistema inmunológico comprometido, especialmente receptores de trasplantes, personas infectadas por VIH, un sujeto embarazado, un sujeto que tiene cáncer, de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización, dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria se administran a un sujeto que es un niño de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padece o es susceptible o están en riesgo de una infección por CMV o reactivación de CMV.
En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto que es un niño, de un primer arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV, y la administración al mismo sujeto que es un adolescente de un segundo arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV. En una realización específica, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto que tiene 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o 17 años de edad, de un primer arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria, y al mismo sujeto que tiene 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 años de edad un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV.
En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto prepúber de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un varón adolescente, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a una mujer, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV.
En otra realización, la administración de dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por CMV o reactivación de CMV en al menos un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección por CMV o reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En otra realización, la administración de dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV, administrados por separado, reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por CMV o reactivación de CMV en al menos un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección por CMV o reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En otra realización, la administración de dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV, administrados secuencialmente, reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por CMV o reactivación de CMV en al menos un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección por CMV o reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
6.8 (b) Composiciones
La invención se refiere además a vacunas, composiciones inmunogénicas y composiciones farmacéuticas que comprenden un arenavirus modificado por ingeniería genética como se describe en la presente memoria. Estas vacunas y composiciones farmacéuticas se pueden formular según procedimientos estándar en la técnica.
En una realización, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. Véase, p. ej., la Sección 6.2. En realizaciones específicas, las composiciones descritas en la presente memoria comprenden la administración a un sujeto de un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria, p. ej., en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos. que codifica el antígeno CMV. El antígeno de CMV puede ser:
a) una glicoproteína gB de CMV o
b) una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma
y una segunda composición de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria, p. ej., en la que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de CMV. El antígeno de CMV puede ser:
a) una glicoproteína gB de CMV o
b) una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan composiciones adecuadas para un método de tratamiento y/o prevención de una infección por CMV que comprende administrar dos construcciones de arenavirus que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En una realización específica, las dos construcciones de vector de arenavirus expresan un antígeno de CMV.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden dos o más construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden tres o más construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden cuatro o más construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV, cinco o más construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV, seis o más construcciones de vector de arenavirus que expresan un antígeno de CMV o 7 construcciones de vector de arenavirus que expresan cada una un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o una combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, el arenavirus puede ser LCMV.
En realizaciones específicas, el antígeno es la glicoproteína gB de la envoltura principal del CMV con un truncamiento del extremo carboxi. (Véase, p. ej., la Sección 6.2 (b) para proteínas gB truncadas).
En determinadas realizaciones, el antígeno es la proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2 (c)).
El antígeno puede ser una proteína del complejo pentamérico de CMV. El antígeno del complejo pentamérico de CMV puede ser gH, gH (dTM), gL, UL128, UL131A o UL130 o combinaciones de los mismos. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(d)).
El vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV como se describe en la presente memoria puede comprender uno o más ácidos nucleicos que codifican un antígeno de CMV y combinaciones de los mismos como se describe. Los antígenos de CMV pueden estar separados mediante varios conectores, espaciadores y sitios de escisión como se describe en la presente memoria.
El vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV como se describe en la presente memoria del primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente se basa en el Clon 13 de LCMV (Véase, p. ej., la Sección 7.1).
El vector generado para codificar uno o más antígenos de CMV como se describe en la presente memoria del segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente se basa en el Clon 13 de LCMV (Véase, p. ej., la Sección 7.1).
En una realización específica, en la presente memoria se proporciona una composición que comprende una primera composición de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una proteína pp65 del tegumento de CMV o un fragmento antigénico de la misma y una segunda composición de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína de CMV con un truncamiento del extremo carboxi. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(b) para proteínas gB truncadas).
En otra realización más, existe el uso combinado de las composiciones de arenavirus de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria y una o más composiciones de vector de virus de replicación defectuosa. En una realización más específica, la composición de vector de virus de replicación defectuosa puede ser, pero no se limita a: poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociado y virus Sendai, y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna modificada de Ankara.
En otra realización, dos composiciones de arenavirus infeccioso de replicación deficiente tienen relaciones molares que varían de aproximadamente 1:1 a 1:1.000, en particular que incluyen: relación 1:1, relación 1:2, relación 1:5, relación 1:10, relación 1:20, relación 1:50, relación 1:100, relación 1:200, relación 1:300, relación 1:400, relación 1:500, relación 1:600, relación 1:700, relación 1:800, relación 1:900, relación 1:1.000.
En otra realización, las composiciones son adecuadas para la administración a sujetos que tienen, son susceptibles o están en riesgo de, una infección por CMV o su reactivación. En otra realización, los sujetos a los que se administran dos o más composiciones de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo, están infectados con, son susceptibles o están en riesgo de, una infección por CMV o una reactivación con CMV.
En otra realización, dichas dos o más composiciones de arenavirus infeccioso de replicación deficiente comprenden además al menos otro medicamento para tratar y/o prevenir la infección por CMV o la reactivación de CMV. Los medicamentos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, Valganciclovir, Ganciclovir, Foscarnet, Cidofovir o Maribavir.
En otra realización, las composiciones son adecuadas para la administración a un sujeto sintomático de una segunda composición de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV o un fragmento del mismo como se describe en la presente memoria. En otra realización más, las composiciones son adecuadas para la administración a un sujeto con un sistema inmune comprometido, especialmente receptores de trasplantes, personas infectadas por VIH, un sujeto embarazado o un sujeto que tiene cáncer, de una segunda composición de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo. En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria o un fragmento del mismo son adecuadas para la administración a un sujeto que es un niño de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padece o es susceptible o está en riesgo de una infección por CMV o reactivación de CMV.
En otra realización, las composiciones son adecuadas para la administración a un sujeto que es un niño, de un primer arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV, y para la administración al mismo sujeto que es un adolescente de un segundo arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV. En una realización específica, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto que tiene 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o 17 años de edad, de un primer arenavirus de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria, y al mismo sujeto que tiene 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 años de edad de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV.
En otra realización, las composiciones son adecuadas para la administración a un sujeto prepúber de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un varón adolescente, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV como se describe en la presente memoria. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a una mujer, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV.
En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, reducen el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por CMV o la reactivación de CMV en al menos un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección por CMV o reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, administradas por separado, reducen el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por CMV o la reactivación de CMV en al menos un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección por CMV o reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, administradas secuencialmente, reducen el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por CMV o reactivación de CMV en al menos un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección por CMV o reactivación de CMV en ausencia de dicho tratamiento.
En otra realización, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende una combinación sinérgica de dos o más arenavirus infecciosos de replicación deficiente que expresan un antígeno de CMV.
En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(b) para proteínas gB truncadas). En otra realización, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi o una proteína pp65 del tegumento de CMV y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi o una proteína pp65 del tegumento de CMV.
En otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi que puede ser un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 771 de la SEQ ID NO: 3. En una realización específica, la proteína gB truncada consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En determinadas realizaciones, el truncamiento de la glicoproteína gB puede tener una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29,
40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,
102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,
125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 aminoácidos. Véase la Sección 6.2(b) para proteínas gB truncadas.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una composición inmunogénica que comprende un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi (Véase, p. ej., la Sección 6.2(b) para proteínas gB truncadas). En otra realización, en la presente memoria se proporciona una composición inmunogénica que comprende un primer arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi
0 una proteína pp65 del tegumento de CMV y un segundo arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa una glicoproteína gB de CMV con un truncamiento del extremo carboxi o una proteína pp65 del tegumento de CMV.
En otras realizaciones, la composición inmunogénica comprende un polipéptido que puede ser un 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a los aminoácidos 1 a 771 de la SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones específicas más, el truncamiento o deleción de la glicoproteína gB puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 54, 55, 56,
Figure imgf000045_0002
57, 58, 59, 60, 61,62,
Figure imgf000045_0001
63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
Figure imgf000045_0003
97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 aminoácidos. En determinadas realizaciones, la composición inmunogénica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6.9 Ensayos
Ensayo para medir la infectividad del vector de arenavirus Se puede usar cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para medir la infectividad de una preparación de vector de arenavirus. Por ejemplo, la determinación de la titulación del virus/vector puede realizarse mediante un "ensayo de unidad formadora de foco" (ensayo FFU).
Brevemente, células complementarias, p. ej., células HEK 293 que expresan la proteína GP de LCMV se siembran en placas y se inoculan con diferentes diluciones de una muestra de virus/vector. Después de un período de incubación, para permitir que las células formen una monocapa y que el virus se una a las células, la monocapa se cubre con metilcelulosa. Cuando las placas se incuban más, las células infectadas originales liberan progenie viral. Debido a la superposición de metilcelulosa, la propagación de los nuevos virus está restringida a las células vecinas. En consecuencia, cada partícula infecciosa produce una zona circular de células infectadas llamada Foco. Dichos Focos pueden hacerse visibles y contables usando anticuerpos contra LCMV-NP y una reacción de color basada en HRP.
La titulación de un virus/vector se puede calcular en unidades formadoras de foco por mililitro (FFU/mL).
Para determinar la titulación infecciosa (FFU/mL) de los vectores portadores de transgenes, este ensayo se modifica mediante el uso del anticuerpo específico del transgén respectivo en lugar del anticuerpo anti-LCMV-NP.
ELISA en suero La determinación de la respuesta inmune humoral tras la vacunación de animales (p. ej., ratones, cobayas) puede realizarse mediante ELISA de suero específico de antígeno (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas). Brevemente, las placas se recubren con antígeno (p. ej., proteína recombinante), se bloquean para evitar la unión inespecífica de anticuerpos y se incuban con diluciones seriadas de sueros. Después de la incubación, los anticuerpos de suero unidos pueden detectarse, p. ej., usando un anticuerpo específico de anti-especie acoplado a enzima (p. ej., ratón, cobaya) (que detecta IgG total o subclases de IgG) y la posterior reacción de color. Las titulaciones de anticuerpos se pueden determinar, p. ej., como media geométrica de la titulación de punto final.
Ensayo de neutralización en células ARPE-19 La determinación de la actividad neutralizante de anticuerpos inducidos en sueros se realiza con el siguiente ensayo celular usando células ARPE-19 de la ATCC y un virus etiquetado con
GFP. Además, se usa suero de cobaya suplementario como fuente de complemento exógeno. El ensayo se inicia con una siembra de 6,5x103 células/pocillo (50 pl/pocillo) en una placa de 384 pocillos uno o dos días antes de usarla para la neutralización. La neutralización se realiza en placas de cultivo de tejidos estériles de 96 pocillos sin células durante
1 h a 37 °C. Después de la etapa de incubación de la neutralización, la mezcla se añade a las células y se incuba durante 4 días adicionales para la detección de GFP con un lector de placas. Se usa un suero humano neutralizante positivo como control positivo del ensayo en cada placa para comprobar la fiabilidad de todos los resultados. Las titulaciones (CE50) se determinan usando un ajuste de curva logístico de 4 parámetros. Como ensayo adicional, los pocillos se controlan con un microscopio de fluorescencia.
Ensayo de reducción en placa Brevemente, los ensayos de reducción en placa (neutralización) para el citomegalovirus de cobaya se realizan mediante el uso de un aislado de GPCMV etiquetado con proteína verde fluorescente, se usó
suero de conejo al 5% como fuente de complemento exógeno y las placas se enumeraron por microscopía de fluorescencia. Las titulaciones de neutralización se definieron como la dilución más alta de suero que dio lugar a una reducción del 50% en las placas, en comparación con las muestras de suero de control (preinmunes).
Ensayo de neutralización en células de fibroblastos de pulmón de cobaya (GPL) Brevemente, se prepararon diluciones seriadas de sueros de ensayo y control (prevacunación) en medio completo GPL con suero de conejo suplementario (1%) como fuente de complemento exógeno. La serie de diluciones abarcó de 1:40 a 1:5.120. Las diluciones de suero se incubaron con virus etiquetado con eGFP (100-200 pfu por pocillo) durante 30 min a 37 °C y luego se transfirieron a placas de 12 pocillos que contenían células GPL confluentes. Las muestras se procesaron por triplicado. Después de 2 horas de incubación a 37 °C, las células se lavaron con PBS, se volvieron a alimentar con medio GPL completo y se incubaron a 37 °C/5% de CO2 durante 5 días. Las placas se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia, se contaron y se compararon con los pocillos de control. La dilución de suero que da como resultado una reducción del 50% en el número de placas en comparación con los controles se designó como la titulación neutralizante.
qPCR Los genomas de ARN de LCMV se aíslan usando el mini kit de ARN viral QlAamp (QIAGEN), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los equivalentes del genoma de ARN de LCMV se detectan mediante PCR cuantitativa realizada en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) con el kit de qRT-PCR SuperScript® III Platinum® One-Step (Invitrogen) y cebadores y sondas (informador FAM y extintor NFQ-MGB) específicos para parte de la región codificadora de NP de LCMV. El perfil de temperatura de la reacción es: 30 min a 60 °C, 2 min a 95 °C, seguido de 45 ciclos de 15 s a 95 °C, 30 s a 56 °C. El ARN se cuantifica mediante la comparación de los resultados de la muestra con una curva estándar preparada a partir de una serie de diluciones log10 de un fragmento de ARN transcrito in vitro cuantificado espectrofotométricamente, correspondiente a un fragmento de la secuencia codificadora de NP de LCMV que contiene los sitios de unión del cebador y de la sonda.
Transferencia de Western Las células infectadas que crecen en matraces de cultivo de tejidos o en suspensión se lisan en los puntos de tiempo indicados después de la infección usando tampón RIPA (Thermo Scientific) o se usan directamente sin lisis celular. Las muestras se calientan hasta 99 °C durante 10 minutos con agente reductor y tampón de muestra NuPage LDS (NOVEX) y se enfrían hasta temperatura ambiente antes de cargarlas en geles de SDS al 4-12% para electroforesis. Las proteínas se transfieren a las membranas usando el dispositivo de transferencia de gel Invitrogens iBlot y se visualizan mediante tinción de Ponceau. Finalmente, las preparaciones se sondaron con anticuerpos primarios dirigidos contra proteínas de interés y anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina, seguido de tinción con disolución NBT/BCIP de 1 etapa (INVITROGEN).
Ensayo de tinción de multímero de péptidos MHC para la detección de la proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno Se puede usar cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para ensayar las respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de tinción de tetrámero de péptido MHC (véase, p. ej., Altman J.D. et al., Science. 1996; 274: 94-96; y Murali-Krishna K. et al., Immunity. 1998; 8: 177­ 187). Brevemente, el ensayo comprende las siguientes etapas, se usa un ensayo de tetrámero para detectar la presencia de células T específicas de antígeno. Con el fin de que una célula T detecte el péptido para el que es específica, debe reconocer tanto el péptido como el tetrámero de moléculas de MHC personalizadas para una célula T específica de antígeno (típicamente marcadas con fluorescencia). A continuación, el tetrámero se detecta mediante citometría de flujo a través del marcador fluorescente.
Ensayo ELISPOT para la detección de la proliferación de células T CD4+ específicas de antígeno Se puede usar cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para ensayar las respuestas de células T CD4+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede usar el ensayo ELISPOT (véase, p. ej., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods.
1983; 65: 109-121; y Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120: 1-8). Brevemente, el ensayo comprende las siguientes etapas: se recubre una placa de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-citoquina. Las células se incuban en la placa de inmunotransferencia. Las células secretan citoquinas y después se retiran por lavado. A continuación, las placas se recubren con un segundo anticuerpo anticitoquina biotinilado y se visualizan con un sistema avidina-HRP.
Ensayo de citoquinas intracelulares para la detección de la funcionalidad de las respuestas de las células T CD8+ y CD4+ Se puede usar cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para ensayar la funcionalidad de las respuestas de las células T CD8+ y CD4+. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de citoquinas intracelulares combinado con citometría de flujo (véase, p. ej., Suni M.A. et al., J Immunol Methods. 1998; 212: 89-98; Nomura L.E. et al., Citometry. 2000; 40: 60-68; y Ghanekar S.A. et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8: 628-63). Brevemente, el ensayo comprende las siguientes etapas: activación de células a través de péptidos o proteínas específicos, se añade una inhibición del transporte de proteínas (p. ej., brefeldina A) para retener las citoquinas dentro de la célula. Después del lavado, se pueden añadir a las células anticuerpos contra otros marcadores celulares. A continuación, las células se fijan y se permeabilizan. Se añade el anticuerpo anti-citoquina y las células se pueden analizar mediante citometría de flujo.
Ensayo para confirmar la deficiencia en la replicación de vectores virales También se puede usar cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica que determina la concentración de partículas de virus infecciosas y competentes para la replicación como método para medir partículas virales de replicación deficiente en una muestra. Por ejemplo, los ensayos de FFU (como se describe en [00225]) con células no complementarias pueden usarse para este propósito.
Además, los ensayos basados en placas son el método estándar usado para determinar la concentración de virus en términos de unidades formadoras de placa (UFP) en una muestra de virus. Específicamente, una monocapa confluente de células huésped no complementarias se infecta con el virus en diferentes diluciones y se cubre con un medio semisólido, tal como agar, para evitar que la infección por el virus se propague indiscriminadamente. Una placa viral se forma cuando un virus infecta y se replica con éxito en una célula dentro de la monocapa de células fijadas (véase, p. ej., Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol. 32: Inmunology of Infection. Academic Press. ISBN 0-12-521532-0). La formación de placas puede tardar 3-14 días, dependiendo del virus que se esté analizando. Las placas generalmente se cuentan manualmente y los resultados, en combinación con el factor de dilución usado para preparar la placa, se usan para calcular el número de unidades formadoras de placa por unidad de volumen de muestra (PFU/mL). El resultado de PFU/mL representa el número de partículas infecciosas competentes para la replicación dentro de la muestra.
Ensayo para la expresión de antígeno viral Se puede usar cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para medir la expresión de antígenos virales. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de FFU (como se describe en [00225]). Para la detección, se usan preparaciones de anticuerpos mono o policlonales contra los respectivos antígenos virales (FFU específico de transgén).
Además, se puede realizar una transferencia Western (como se describe en [00231]).
Modelos animales La seguridad, tolerancia y eficacia inmunogénica de las vacunas que comprenden un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno de CMV descrito en la presente memoria o una composición del mismo pueden ensayarse en modelos animales. En determinadas realizaciones, los modelos animales que se pueden usar para ensayar la seguridad, tolerancia y eficacia inmunogénica de las vacunas y las composiciones de las mismas usadas en la presente memoria incluyen ratón, cobaya, rata y mono. En una realización preferida, los modelos animales que se pueden usar para ensayar la seguridad, tolerancia y eficacia inmunogénica de las vacunas y las composiciones de las mismas usadas en la presente memoria incluyen el ratón.
Modelo de cobaya La evaluación preclínica de la inmunogenicidad y eficacia de las vacunas contra e1HCMV se ve dificultada por la especificidad de especie del CMV. Sin embargo, en las cobayas, el CMV de cobaya (GPCMV) atraviesa la placenta para causar una infección congénita similar a la infección humana (Bourne N et al, JID 1996; Schleiss M et al, JID 2003). Además, la estructura de la placenta, así como el período de embarazo similar a un trimestre de las cobayas, es similar a la de los humanos. Además, como en los seres humanos, se produce el paso transplacentario de anticuerpos maternos. Sobre la base de estas características, el modelo de cobaya se usa comúnmente para la evaluación de estrategias de vacuna.
Para investigar la eficacia protectora contra la infección congénita por CMV, se pueden inmunizar cobayas Hartley con candidatos a vacunas de ensayo y posteriormente se puede permitir que los cobayas inmunizados se reproduzcan. Los embarazos en hembras de cobayas pueden confirmarse y monitorizarse mediante palpación. Las hembras preñadas se pueden pulsar con GPCMV y se puede medir la mortalidad de las crías y determinar las tasas de protección en el parto.
La inclusión de dominios heterólogos de otros virus en el antígeno de CMV humano puede dar lugar a la inducción de niveles más altos de anticuerpos. Para ensayar la generación de anticuerpos neutralizantes, se puede realizar un ensayo como sigue: se inmunizan cobayas hembras tres veces los días 0, 21 y 42. Dos semanas después de la última dosis de vacuna, se deja que las cobayas inmunizadas se reproduzcan. Las cobayas preñadas se pulsan a los 40-50 días de gestación con GpCm V. Los sueros de los animales vacunados se analizarán mediante ELISA y se obtendrán ensayos de neutralización y muestras de sangre después del pulso para la detección de viremia mediante PCR en tiempo real. Las hembras serán monitorizadas hasta el parto, y se analizará con detalle la supervivencia y el estado de las crías.
La inclusión de dominios heterólogos de otros virus en el antígeno de CMV humano puede dar lugar a la inducción de niveles más altos de anticuerpos.
7. Ejemplos
7.1 Diseño del genoma del vector de arenavirus/construcción del vector
Siguiendo los enfoques establecidos (Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US 2010/0297172 A1; y Flatz L. et al., Nat Med. Marzo de 2010; 16 (3): 339-345), se diseñaron vectores de vacuna de rLCMV que expresan los respectivos antígenos de CMV o ciertos dominios de los mismos (FIG. 1).
Diseño de vectores de rLCMV que expresan gB de CMV Para la generación de vectores de vacuna de rLCMV que expresan el antígeno gB de CMV, se diseñaron diversas construcciones de vectores de rLCMV-gB (FIG. 2) que codificaban partes seleccionadas de la proteína gB. Las respectivas construcciones incluyeron vectores de rLCMV que codificaban:
• gB de tipo salvaje de longitud completa (HK1 -HgB(FL), SEQ ID NO: 1),
• gB con región transmembrana delecionada (dTM) en la que los aminoácidos 1-698 se fusionaron con los aminoácidos 775-906 (HK1-HgB(dTM), SEQ ID NO: 4),
• una gB truncado en el extremo C que consiste en los 706 aminoácidos N-terminales de gB (HK1 -HgB(1 -706), SEQ ID NO: 7),
• una gB truncada en el extremo C que consiste en los 691 aminoácidos N-terminales de gB (HK1 -HgB(1 -691), SEQ ID NO: 10)
• una gB truncada en el extremo C que consiste en los 447 aminoácidos N-terminales de gB (HK1 -HgB(1 -447), SEQ ID NO: 13),
• una gB truncada en el extremo C que consiste en los 772 aminoácidos N-terminales de gB, que codifican el ectodominio y la región transmembrana de gB, seguido de un residuo de arginina artificial en la posición 773 (HK1 -HgB(dCt), SEQ ID NO: 16),
• una construcción de gB que consiste en los 751 aminoácidos N-terminales de gB seguidos por los 49 aminoácidos C-terminales de la proteína G del virus de la estromatitis vesicular (HK1 -HgB(VSVG-1), SEQ ID NO: 19),
• una construcción de gB que consiste en los 706 aminoácidos N-terminales de gB seguidos por los 49 aminoácidos C-terminales de la proteína G del virus de la estromatitis vesicular (HK1 -HgB(VSVG-2), SEQ ID NO: 22),
• una gB truncado en el extremo C que consiste en los 751 aminoácidos N-terminales de gB seguidos por los 37 aminoácidos C-terminales de la hemaglutinina H3 de influenza (HK1-HgB(H3-1), SEQ ID NO: 25),
• una gB truncada en el extremo C que consiste en los 706 aminoácidos N-terminales de gB seguidos por los 37 aminoácidos C-terminales de la hemaglutinina H3 de influenza (HK1-HgB(H3-2), SEQ ID NO: 28).
Dado que la especificidad de especie del CMV impide los estudios de eficacia en animales de vacunas que expresan antígenos de CMV humano, no solo se han generado vectores de rLCMV que codifican la secuencia de gB del CMV humano (HCMV), sino también se han diseñado los vectores correspondientes que expresan secuencias análogas del CMV de cobaya (GPCMV) para algunas construcciones, p. ej., HK1-GPgB(FL), HK1-GPgB(FLuc), HK1-GPgB(dTM), HK1-GPgB(dTMuc), HK1-GPgB(1-706), HK1-GPgB(1-691), HK1-GPgB(1-447), HK1-GPgB (dCt). HK1-GPgB(FLuc) de forma análoga a HK1 -GPgB(FL) excepto que el sitio de escisión de furina ubicado en el ectodominio de gB ha sido inactivado por mutación. HK1 -GPgB(dTMuc) se ha diseñado de forma análoga a HK1 -GPgB(dTM) excepto que el sitio de escisión de furina ubicado en el ectodominio de gB ha sido inactivado por mutación. Las construcciones de vectores que codifican antígenos de GPCMV permiten estudios preclínicos de inmunogenicidad y eficacia en el modelo de cobaya que presenta el estándar de oro para el desarrollo de vacunas contra el CMV. De manera similar, se generaron construcciones que expresan las secuencias análogas de gB de CMV de ratón, lo que permite un precribado rápido y rentable del diseño del vector individual.
De forma análoga, se ha construido un vector de rLCMV que expresa el antígeno pp65 de células T de longitud completa del CMV humano (HK1-Hpp65, SEQ ID NO: 34). Además, se ha generado un vector correspondiente que expresa las secuencias análogas del CMV de cobaya (GPCMV) (HK1-GPpp65).
Además, se han diseñado vectores de rLCMV para la expresión de diferentes partes del complejo pentamérico (PC) del CMV, formado por las glicoproteínas gH/gL, UL128, UL130 y UL131A. Con el fin de generar un vector de rLCMV que exprese el complejo completo, se ha diseñado un vector poliproteína que codifica las cinco proteínas separadas por secuencias del péptido 2A de Teschovirus (T2A) (FIG. 3) (Donnelly Ml L et al 2001, Gao SY et al 2012, Kim JH et al 2011). Se han elegido péptidos 2A autoescindibles porque tienen un tamaño relativamente pequeño y muestran una alta eficiencia de escisión entre genes en 5' y 3' del péptido 2A (Donnelly MLL et al 2001, Gao SY et al 2012, Kim JH et al 2011).
Las construcciones respectivas comprendían
• un vector que codifica solo la glicoproteína gH (HK1-HgH, SEQ ID NO: 37)
• un vector que codifica una versión delecionada del dominio transmembrana de la glicoproteína gH (HK1-HgH(dTM), SEQ ID NO: 50).
Derivación de construcciones de vector de rLCMV Los vectores de rLCMV pueden diferir en la cepa de LCMV de la que se derivan las secuencias de ADNc y el sistema plasmídico usado para su rescate. El Clon 13 o la cepa MP de LCMV son dos posibles cepas usadas para la derivación de los vectores. Los estudios que comparan el efecto de la estructura del vector de rLCMV, Clon 13 y MP, sobre la inducción de respuestas inmunes se han evaluado usando Hpp65, HgBdTM y GPgBdTM como transgenes, como se muestra en la figura 16-18. Se pueden usar cuatro enfoques/sistemas de plásmidos diferentes para el rescate de vectores. En un enfoque, la transcripción de los segmentos genómicos corto (S) y largo (L) del vector viral se controla mediante un promotor y un terminador de ARN polimerasa I específico de murino. Las proteínas polimerasa y NP se expresan a partir de construcciones individuales bajo el control de un promotor de polimerasa II. La sustitución de GP por un antígeno de CMV en el sistema de ADNc seguida de la transfección de los cuatro plásmidos en células murinas que proporcionan la proteína GP de LCMV en trans conduce a la formación de partículas de vector que pueden recogerse del sobrenadante de las células transfectadas. Este enfoque se usa en Flatz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103:4663.
En el segundo sistema, la transcripción del segmento S (incluyendo el antígeno de CMV) y L está bajo el control de un promotor T7, que requiere la introducción de un quinto plásmido que codifica la polimerasa T7 para dirigir la expresión de los promotores T7. Los factores virales que actúan en trans (NP y L) se coexpresan nuevamente a partir de diferentes plásmidos usando un promotor de ARN polimerasa II. Este sistema está adaptado de Sanchez y de la Torre, Virology julio de 2006, 350 (2):370.
En el tercer sistema, la transcripción de los segmentos genómicos corto (S) y largo (L) del vector viral está controlada por un promotor de la ARN polimerasa I humana y un terminador apropiado. Los factores virales que actúan en trans (NP y L) se coexpresan nuevamente a partir de diferentes plásmidos usando un promotor de ARN polimerasa II.
En el cuarto sistema, la transcripción de los segmentos genómicos corto (S) y largo (L) del vector viral está controlada por un promotor de la ARN polimerasa I humana y un terminador apropiado. En el mismo plásmido, la transcripción de los factores virales que actúan en trans está dirigida por un promotor de la polimerasa II que está diseñado para dirigirse en la dirección opuesta para dirigir la transcripción de ARN de cadena positiva de los ORF de NP y L del mismo molde. Este enfoque se usó antes para generar virus de influenza recombinantes y se describe en Hoffmann E et al 2000. Todos los vectores de rLCMV descritos anteriormente pueden producirse de acuerdo con la metodología establecida (Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US 2010/0297172 A1; y Flatz L. et al., Nat Med. Marzo de 2010; 16 (3): 339-345). También se pueden usar otros métodos; p. ej., se pueden usar diferentes sistemas de plásmidos, diferentes células y diferentes métodos de transfección para generar los vectores de arenavirus proporcionados en la presente memoria.
7.2 Caracterización de los vectores
Caracterización de los vectores de rLCMV que expresan gB de CMV La caracterización de las construcciones de vector generadas incluyó el análisis de la replicación viral y la infectividad específica de las células huésped (FIG. 4).
La Figura 4 muestra las titulaciones virales y la infectividad de las construcciones de vectores HK1-HgB(FL), HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(706), HK1-HgB(691), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(H3-1) y HK1-HgB(H3-2). Las respectivas construcciones de vectores mostraron titulaciones máximas similares y una infectividad comparable a un vector de LCMV de control que expresa la proteína verde fluorescente (HK1-GFP), lo que indica que no hubo un impacto negativo en la producción de los vectores debido al tamaño y la naturaleza de los transgenes.
Con el fin de analizar la replicación de los vectores, se realizaron curvas de crecimiento usando células HEK 293 en suspensión que expresaban GP de LCMV. Las células respectivas se sembraron con una densidad celular de 3x105 células/ml y se infectaron con vectores individuales (HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(H3-2) y HK1 -HgB(691)) a una MOI de 0,001. Se extrajeron muestras cada 24 horas y se analizaron mediante el ensayo FFU (FIG. 5). Todos los vectores ensayados exhibieron cinéticas de crecimiento y titulaciones máximas similares en comparación con HK1-GFP, lo que indica que los transgenes de gB individuales no interfirieron con la replicación de los vectores en mayor medida que el pequeño gen informador GFP.
Se usaron experimentos de transferencia Western para confirmar la presencia del antígeno gB para todas las construcciones ensayadas; en la Figura 6 se muestran datos ejemplares. Se espera que los precursores no escindidos de gB de longitud completa aparezcan como una banda a ~ 160 kDa mientras que gB escindida consiste en un componente de superficie con una masa molecular estimada de 116 kDa que está unida por enlaces disulfuro a un componente transmembrana con una masa molecular estimada de 55 kDa. Sin embargo, debido al uso de un anticuerpo primario monoclonal, se espera que solo dos bandas que representan la proteína gB no escindida y el producto de escisión más pequeño de gB sean visibles en la transferencia. gB de longitud completa (carril 7) apareció como una banda en el rango esperado de ~ 160 kDa, mientras que todas las construcciones restantes mostraron bandas de menor tamaño que pueden explicarse por la deleción o intercambio de al menos parte del dominio citoplásmico de gB. De manera análoga, la parte transmembrana de gB de longitud completa (carril 7) apareció como una banda a ~ 60 kDa (ligeramente superior a lo esperado) y todos los derivados de gB exhiben productos de escisión de menor tamaño. En general, HK1 -gB(FL) y HK1 -gB(dTM) exhibieron bandas de gB más débiles en comparación con todos los demás vectores.
Comparación de inmunogenicidad de HK1-GPgB(FL), HK1-GPgB(dTM) y HK1-GPgB(dTMuc) A continuación, se analizó la inmunogenicidad de HK1 -GPgB(FL), HK1 -GPgB(dTM) y HK1 -GPgB(dTMuc) y se comparó en ratones (FiG.
7). Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 6,7x104 FFU/dosis de los respectivos vectores los días 0, 21 y 42 del experimento. Se recogieron sueros de ratones inmunizados los días 21,42 y 63 del experimento y se midieron las titulaciones de los anticuerpos anti-gB mediante ELISA. Se usó como control un vector de rLCMV análogo que expresaba la proteína verde fluorescente (HK1 -GFP). El vector de control se usó a una concentración de 9,2x105 FFU por inyección.
HK1-GPgB(dTM) y HK1-GPgB(dTMuc) indujeron titulaciones de anticuerpos significativamente más altas que HK1-GPgB(FL) después de la inyección subcutánea en ratones.
Comparación de la inmunogenicidad del vector de vacuna HK1-GPgB(dTM) administrado por vía intramuscular o subcutánea a diferentes concentraciones A continuación, se analizó sistemáticamente la inmunogenicidad de HK1-GPgB-dTM, cuando se administró en diferentes dosis y diferentes vías de inyección (FIG. 8A y B).
Estos análisis demostraron que HK1-GPgB-dTM inducía respuestas de anticuerpos más altas después de la inyección intramuscular (FIG. 8A) en comparación con la administración subcutánea. Entre las dosis de inmunización ensayadas, las dosis de vacuna de 2x106 y 6,7x104 FFU/dosis dieron lugar a titulaciones de anticuerpos comparativamente altas.
Comparación de la vía de inmunización intramuscular e intradérmica. La inducción de respuestas humorales, así como de células T CD8+ se analizó después de la inmunización con diferentes concentraciones de HK1 -HgB(dCt) (FIG. 8C) o HK1-Hpp65 (FIG. 8D) usando la vía intramuscular e intradérmica. Los resultados respectivos demuestran que se incitaron titulaciones significativamente más altas de anticuerpos específicos de antígeno por vía intramuscular en comparación con la vía intradérmica a una dosis de 5,6x105 FFU (FIG. 8C, grupos 1 y 3) lo que indica que no se pudo lograr ningún efecto de ahorro de dosis cuando la vacuna se administró por vía intradérmica. De manera similar, se observaron respuestas de células T CD8+ más altas después de la inyección intramuscular en comparación con la inmunización intradérmica a una dosis de 6,7x105 FFU (FIG. 8D grupos 1 y 3).
Comparación de la inmunogenicidad de HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(1-706), HK1-HgB(1-691), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2) y una proteína gB recombinante mezclada con adyuvante Se analizó en ratones la inmunogenicidad de HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(1-706), HK1-HgB(1-691), HK1-HgB(dCt), HK1 -HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2) y una proteína gB recombinante mezclada con adyuvante. Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 1x105 FFU/dosis de los vectores respectivos o 5 gg de una proteína gB recombinante mezclada 1:1 con adyuvante los días 0 y 21 del experimento. Se recogieron sueros de ratones inmunizados antes de cada dosis de vacuna los días 0, 21 así como en intervalos de tres semanas los días 42, 63, 84 y 105 del experimento. Los sueros generados se ensayaron para determinar el nivel de anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA y la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante el ensayo de neutralización en células ARPE-19.
El análisis estadístico de los datos de ELISA respectivos (FIG. 9) reveló una inducción de anticuerpos comparable de la proteína gB recombinante (mezclada con adyuvante) y todas las construcciones de rLCMV-gB ensayadas. Además, los resultados generados indican que ya se pueden lograr respuestas inmunes muy duraderas después de dos inmunizaciones, ya que los niveles de anticuerpos alcanzan una meseta después de la segunda inmunización.
Funcionalidad de los anticuerpos inducidos Con el fin de ensayar la funcionalidad de los anticuerpos inducidos, los sueros de los animales vacunados se analizaron adicionalmente mediante un ensayo de neutralización en células ARPE-19. La actividad neutralizante de los anticuerpos inducidos, presentes en los sueros de ratones inmunizados, recogidos el día 42, se midió en células epiteliales ARPE-19 (FIG. 10). Los resultados respectivos indican que todas las construcciones de rLCMV-gB ensayadas indujeron niveles más altos de anticuerpos neutralizantes de HCMV que la proteína de la subunidad de gB recombinante mezclada con adyuvante. Sin embargo, HgB(dTM) indujo niveles significativamente más bajos de anticuerpos neutralizantes de HCMv que todos los demás vectores de rLCMV-gB ensayados.
Análisis de subclases individuales de IgG Los sueros de grupos experimentales seleccionados (vacunados con HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(1-706), HK1-HgB(1-691), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1) y la proteína gB recombinante mezclada con adyuvante), recogidos el día 42, se analizaron mediante ELISA de subclase de IgG específica de HCMVgB (FIG. 11). El análisis respectivo reveló la inducción predominante de IgG2c por construcciones de rLCMV-gB mientras que la proteína gB recombinante mezclada con adyuvante indujo principalmente IgG1. Estos datos apuntan a una inducción de respuesta inmune sesgada de tipo 1 por los vectores de rLCMV-gB que parece ser significativamente diferente de la respuesta sesgada de tipo 2 inducida por la proteína de la subunidad gB.
Inmunogenicidad de HK1-GPgB(dTM) en cobayas Se inmunizaron cobayas Hartley mediante inyección intramuscular con diferentes concentraciones (1,54x107, 1,54x106, 1,54x105 y 1,54x104 FFU/dosis) de HK1-GPgB-dTM los días 0, 21 y 42 del experimento. Para fines de control, un animal no recibió vacuna ni tampón. Se recogieron sueros de animales inmunizados los días 0, 21,42 y 63 del experimento y se analizaron las titulaciones de los anticuerpos anti-GPgB mediante ELISA de IgG específico de GPgB. Se usó como control un suero positivo para GPCMV.
Los datos de ELISA muestran que ya después de una única inmunización intramuscular (cebado), HK1-GPgB(dTM) inducía respuestas de anticuerpos anti-GPgB de magnitud considerable de una manera dependiente de la dosis (FIG.
12). Estas respuestas pudieron aumentarse de manera eficiente cuando el mismo vector se volvió a administrar tres semanas después del cebado y alcanzó una meseta de respuesta de IgG después de dos inyecciones para las tres dosis más altas (1,54x107, 1,54x106, 1,54x105) de HK1 -GPgB(dTM). Los valores alcanzados son similares a un suero control usado (generado 30 dpi con 1x105 pfu de GPCMV). Una respuesta significativamente menor fue inducida por el grupo de la dosis más baja (1,54x104).
Los sueros respectivos se analizaron adicionalmente para determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes de virus mediante un ensayo de reducción en placa (FIG. 13). Los resultados mostraron la inducción de anticuerpos neutralizantes en cobayas tras la inmunización con HK1-GPgB(dTM). Los datos respectivos apuntan a una dosis mínima en el rango de >1,54x105 de HK1-GpgB(dTM) requerida para incitar anticuerpos neutralizantes robustos. Según los datos disponibles, se ha seleccionado una dosis de 1,54x106 FFU para estudiar el efecto protector de HK1 -GpgB(dTM) en el modelo congénito de infección por GPCMV (compárese con la FIG. 23).
Caracterización de vectores de rLCMV que expresan pp65 de CMV Con el fin de caracterizar las cinéticas de crecimiento y la infectividad del vector HK1-Hpp65 generado, se infectaron células en suspensión HEK 293 que expresaban GP de LCMV con HK1 -Hpp65 a una MOI = 0,001. En puntos de tiempo definidos (2 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h) después de la infección, se extrajeron y analizaron muestras de sobrenadante celular mediante ensayo FFU y qPCR (FIG. 14).
Los datos de la Figura 14 muestran cinéticas de replicación, titulaciones máximas e infectividad comparables de la construcción de vector HK1-Hpp65 y el vector de control HK1-GFP, lo que indica que el antígeno pp65 no influye negativamente en el crecimiento o la infectividad del vector. Se observaron relaciones de infectividad de partículas más bajas en puntos de tiempo posteriores.
Para confirmar la expresión del antígeno pp65, se infectaron células en suspensión HEK 293 que expresaban GP de LCMV con HK1-Hpp65 o un vector de control negativo HK1-GFP y se recogieron y lisaron 96 h después de la infección y posteriormente se analizaron mediante transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal primario anti-pp65 de HCMV y un anticuerpo secundario apropiado conjugado con fosfatasa alcalina (FIG. 15).
A continuación, se analizó la inmunogenicidad de HK1-Hpp65 y HK3-Hpp65 en ratones C57BL/6 para examinar el efecto de diferentes estructuras del vector de LCMV (HK1 (clon13), HK3 (MP)). Se vacunaron ratones C57BL/6 i.m. (50 pL/muslo; total 100 pL/ratón) con una dosis diana de 1x104 FFU de HK1-Hpp65 (Grupo 1) o HK3-Hpp65 (Grupo 2). Se usaron ratones no vacunados como control (Grupo 7). La inducción de respuestas inmunes celulares se determinó mediante citometría de flujo el día 10 después de la inyección, analizando la producción de citoquinas (IL-2, IFN-g, TNF-a) de células T CD4+ y CD8+. Un grupo de péptidos Hpp65 (basado en Shedlock D.J. et al; Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012) se usó para la reestimulación de esplenocitos.
Después de una única inyección intramuscular, HK1-Hpp65 y HK3-Hpp65 indujeron respuestas de células T CD8+ (y CD4+) específicas de HCMV de magnitud considerable. La frecuencia de las respuestas de las células T CD8+, analizada 10 días después de la inyección única, fue mayor que la observada para las respuestas de las células T CD4+ (FIG. 16 A y B, respectivamente). Sobre la base de la estructura del vector (HK1 o HK3), no se observaron diferencias en la inducción de células T CD4+. Por el contrario, HK1-pp65 indujo mayores respuestas de células T CD8+ en comparación con HK3-Hpp65. (C) Se observaron respuestas de células T CD8+ específicas de HCMV de magnitud similar 10 días (día 66 del experimento) después de una única inyección intramuscular (día 56 del experimento) con HK1 -Hpp65 (Grupo 3) y HK3-Hpp65 (Grupo 4) en ratones que habían sido previamente inmunizados dos veces (8 y 4 semanas antes; es decir, los días 0 y 28 del experimento) con HK1-HgB(dTM). Los resultados respectivos indican que la inducción de respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno no se había visto afectada por la inmunidad del vector debido a la inmunización previa con la misma estructura del vector.
También se evaluó el efecto de la estructura del vector de rLCMV, HK1 (Clon 13) o HK3 (MP), sobre la inducción de una respuesta inmune usando GPgBdTM (FIG. 17) y HgBdTM (FIG. 18) como transgenes.
Para examinar el efecto de diferentes estructuras de vectores sobre la inmunogenicidad de la construcción GPgB­ dTM, se vacunaron ratones C57BL/6 i.m. los días 0 y 28 con una dosis diana de 1x104 FFU de los respectivos vectores. Se generaron sueros de animales individuales antes de cada dosis de vacuna (días 0, 28) así como cuatro semanas (día 56) después de la última (segunda) inyección. Todos los sueros se ensayaron para determinar el nivel de anticuerpos IgG específicos de GPgB mediante ELISA; los datos de ELISA se expresan como media geométrica de la titulación de punto final de IgG específica de GPgB. El análisis estadístico de los datos presentados en la Figura 17 indica que la respuesta inducida por HK1 -GPgB(dTM) es superior a HK3-GPgB(dTM).
Para examinar el efecto de diferentes estructuras de vectores sobre la inmunogenicidad de la construcción HgB-dTM, se vacunaron ratones C57BL/6 i.m. los días 0 y 28 con una dosis diana de 1x104 FFU de los respectivos vectores. Se generaron sueros de animales individuales antes de cada dosis de vacuna (días 0, 28) así como cuatro semanas (día 56) después de la última (segunda) inyección. Todos los sueros se ensayaron para determinar el nivel de anticuerpos IgG específicos de HgB mediante ELISA; los datos de ELISA se expresan como media geométrica de la titulación de punto final de IgG específica de HgB. El análisis estadístico de los datos presentados en la Figura 18 indica que la respuesta inducida por HK1-HgB(dTM) y HK3-HgB(dTM) no son significativamente diferentes.
Para determinar la cepa óptima de LCMV para usar con células T HEK 293, como se muestra en la Figura 19, se sembraron células HEK 293T en pocillos de cultivo de pocillos M6 a una densidad de 500.000 células por pocillo. Al día siguiente, se infectaron con una multiplicidad de infección de 0,05 por las cepas MP, Pasteur, Clon 13 y WE54. El sobrenadante se recogió en los puntos de tiempo indicados y las titulaciones virales se determinaron mediante un ensayo de inmunofoco. Los símbolos representan la media de dos pocillos.
Inmunogenicidad de HK1 -HgB(dCt) en conejos Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda mediante inyección intramuscular con diferentes concentraciones (2,0x102, 4,4x104 y 4,5x106 FFU/dosis) de HK1-HgB(dCt) los días 0 y 28 del experimento. Se recogieron sueros de animales inmunizados los días 0, 28 y 42 del experimento y se analizaron las titulaciones de anticuerpos anti-HgB mediante ELISA de IgG específica de HgB.
Los datos de ELISA muestran que ya después de la única inmunización intramuscular (cebado), las dosis más altas (4,4x104 y 4,5x106 FFU/dosis) de HK1-HgB(dCt) inducían respuestas de anticuerpos anti-HgB de magnitud considerable de una manera dependiente de la dosis (FIG. 20). Estas respuestas pudieron aumentarse de manera eficaz cuando se volvió a administrar el mismo vector cuatro semanas después del cebado. La inyección de 4,5x106 FFU/dosis de HK1-HgB(dCt) indujo respuestas de anticuerpos más altas estadísticamente significativas que un 4,4x104 FFU/dosis los días 28 y 42.
Duración de las respuestas de anticuerpos y comparación de diferentes programas de inmunización Se compararon diferentes programas de inyección con respecto al nivel, así como la duración de las respuestas de anticuerpos, inducidas tras la inmunización con HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1) y una proteína gB recombinante mezclada con adyuvante (Fig. 21A) o HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HgB(dTM), HK1-HgB(dCt) y una proteína gB recombinante mezclada con adyuvante (Fig. 21B). Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 1x105 FFU/dosis de los vectores respectivos o 5 gg de una proteína gB recombinante mezclada 1:1 con adyuvante los días 0, 21 y 42 (FIG. 21A) o los días 0, 21 y 105 (FIG. 21B) del experimento. Se recogieron sueros de ratones inmunizados los días 21,42, 63, 91, 119, 147 y 175 (FIG. 21A) o los días 21,42, 63, 84, 105 y 126 (FIG. 21B) del experimento. Los sueros generados se ensayaron para determinar el nivel de anticuerpos IgG anti-HCMVgB mediante ELISA. Los datos de ELISA respectivos indican que se pueden alcanzar niveles máximos de anticuerpos mediante dos inmunizaciones y que las respuestas humorales inducidas son muy duraderas.
Ausencia de interferencia negativa por inyección simultánea de dos vectores Con el fin de investigar una interferencia potencial de diferentes construcciones de vector de LCMV, se analizó la inducción de respuestas de células B y T CD8+ después de la inmunización con HK1 -HgB(dCt) solo, HK1 -Hpp65 solo o inyección simultánea de HK1 -HgB(dCt) y HK1-Hpp65. Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intramuscular con 9x104 FFU/dosis de HK1-HgB(dCt) solo, 9x104 FFU/dosis de HK1-Hpp65 solo o 9x104 FFU/dosis de cada uno de HK1-HgB(dCt) y HK1-Hpp65 juntos en los días 0 y 28. Se monitorizó la inducción de anticuerpos anti-HCMVgB (FIG. 22A) o respuestas de células T CD8+ específicas de pp65 (FIG. 22B) 49 días después de la primera inyección. No se pudo observar ninguna diferencia significativa en los niveles de anticuerpos anti-HCMVgB (FIG. 22A) o en las respuestas de células T CD8+ específicas de pp65 (FIG. 22B) entre la vacuna el monovalente (HK1-HgB(dCt) o HK1-Hpp65 solamente) y bivalente (HK1-HgB(dCt) y HK1-Hpp65) que indica una falta de interferencia negativa cuando se mezclan y coinyectan dos vectores de rLCMV.
Los vectores de LCMV protegen a las crías contra la infección congénita por CMV en el modelo de cobaya La evaluación preclínica de la eficacia protectora contra la infección congénita por CMV de las vacunas contra HCMv se ve dificultada por la especificidad de especie del CMV. Sin embargo, el CMV de cobaya (GPCMV) atraviesa la placenta para causar una infección congénita similar a la infección humana (Bourne N et al, JID 1996; Schleiss M et al, JID 2003). Además, la estructura de la placenta, así como el período de embarazo similar a un trimestre y el paso transplacentario de anticuerpos maternos son similares en cobayas y seres humanos. Sobre la base de estas características, el modelo de cobaya es el mejor modelo animal disponible para la evaluación de la eficacia de la vacuna contra el CMV contra la infección congénita.
Se inmunizaron cobayas Hartley por vía intramuscular tres veces los días 0, 21 y 42 con HK1-GPgB(dTM), HK1-GPpp65 o tampón (grupo de control). Aproximadamente dos semanas después de la última dosis de vacuna, se permitió que los cobayas inmunizados se reprodujeran. Las cobayas preñadas se pulsaron a los ~ 45 días de gestación con GPCMV y posteriormente se monitorizaron hasta el parto. El análisis de la supervivencia de la descendencia reveló una reducción significativa en la mortalidad de las crías en las hembras inmunizadas con HK1-GPgB(dTM) (p = 0,026) o HK1-GPpp65 (p = 0,032) solo antes de la reproducción (FIG. 23). Se pueden anticipar tasas más altas de protección después de la vacunación con una combinación de construcciones de vector de rLCMV que expresan gB y pp65. Véase, p. ej., la Fig. 28.
Para determinar la seguridad (virulencia y replicación del virus) de los vectores de rLCMV, se han inoculado intracerebralmente ratones específicos, altamente susceptibles a la infección por LCMV, el día 0 con HK3-Hpp65 o HK3-Mpp65, un vector de LCMV de replicación deficiente derivado de la cepa MP. de LCMV que expresa el antígeno pp65 de CMV de ratón. Posteriormente, los ratones han sido monitorizados para detectar signos de enfermedad. Se ha analizado la presencia de virus replicantes en tejidos cerebrales recogidos el día 28 o antes en caso de enfermedad.
No se pudieron observar signos de enfermedad ni replicación del virus en ratones AG129, que son deficientes en los receptores de IFN a/p e y y, por lo tanto, son altamente susceptibles a la infección por LCMV, 28 días después de la inoculación intracerebral de diferentes dosis de HK3-Hpp65 o HK3-Mpp65 (FIG. 24A). Por el contrario, los ratones AG129 inoculados con LCMV de tipo salvaje mostraron signos de enfermedad y, por lo tanto, tuvieron que ser sacrificados por eutanasia el día 7.
De manera similar, no se pudo observar replicación del virus en ratones RAG-/- deficientes en células T y B, que también son altamente susceptibles a la infección por LCMV, 28 días después de la inoculación intracerebral de diferentes dosis de HK3-Hpp65 o HK3-Mpp65 (FIG. 24B). Se pudieron observar altas dosis de virus replicante en ratones RAG-/- inoculados con LCMV de tipo salvaje.
Inmunogenicidad de HK1-GPgB(dCt) y HK1-GPpp65 en cobayas
Se inmunizaron cobayas Hartley (18 animales/grupo) mediante inyección intramuscular con 8x105 FFU/dosis de HK1-GPgB(dCt) (grupo 1), 8x105 FFU/dosis de HK1 -GPpp65 (grupo 2), o 8x105 FFU/dosis de cada uno de HK1 -GPgB(dCt) y HK1-GPpp65 (grupo 3) en los días 0, 31 y 72 (grupo 1)/días 0, 31 y 70 (grupo 2)/días 0, 34 y 70 (grupo 3) del experimento. Además, se inmunizaron cobayas Hartley (18 animales/grupo) mediante inyección subcutánea con 50 gg de proteína de subunidad gB, formulada en adyuvante completo de Freund (grupo 4) los días 0, 46 y 76. Se recogieron sueros de animales inmunizados los días 0, 28, 52, 103 y 155 del experimento y las titulaciones de anticuerpos anti-GPgB se analizaron mediante ELISA de IgG específica de GPgB usando un grupo de sueros con titulación de anticuerpo anti-gB asignada como estándar de referencia.
Los datos de ELISA muestran que ya después de una única inmunización, HK1-GPgB(dCt) inducía respuestas de anticuerpos anti-GPgB de considerable magnitud (FIG. 25). Estas respuestas pudieron aumentarse de manera eficaz cuando se volvió a administrar el mismo vector un mes después de la primera vacunación. Las respuestas de anticuerpos anti-GPgB inducidas por la inmunización con HK1-GPgB(dCt) solo estaban en un rango similar a las inducidas después de la vacunación con HK1-GPgB(dCt) en combinación con HK1-GPpp65. Es importante destacar que se estimularon niveles significativamente más altos de anticuerpos anti-GPgB después de la inmunización con HK1 -GPgB(dCt) que después de la vacunación con una proteína de subunidad gB formulada en adyuvante completo de Freund.
Datos de neutralización
Los sueros respectivos se analizaron adicionalmente para determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes de virus mediante el ensayo de neutralización en células GPL (FIG. 26). Los resultados mostraron la inducción de anticuerpos neutralizantes en cobayas tras la inmunización con HK1-GPgB(dCt) solo (grupo 1) o HK1-GPgB(dCt) en combinación con HK1-GPpp65 (grupo 3). De acuerdo con los datos de ELISA (FIG. 25), HK1-GPgB(dCt) indujo niveles significativamente (P <0,0001, ensayo de la t no apareada) más altos de anticuerpos neutralizantes que una proteína de subunidad gB formulada en adyuvante completo de Freund. Inesperadamente, la combinación de HK1 -GPgB(dCt) con HK1-GPpp65 (Grupo 3) incitó sueros neutralizantes más potentes significativamente (P = 0,0003, ensayo de la t no apareada) que HK1-GPgB(dCt) solo (Grupo 1).
Datos de células T
Con el fin de analizar la inducción de respuestas de células T específicas de pp65 en animales vacunados, se aislaron esplenocitos de cobayas Hartley inmunizados por vía intramuscular con 8x105 FFU/dosis de HK1-GFP (grupo 1), 8x105 FFU/dosis de HK1-GPpp65 (grupo 2) o 8x105 FFU/dosis de cada uno de HK1-GPgB(dCt) y HK1-GPpp65 (grupo 3). Se sacrificaron tres animales de cada grupo de vacuna (grupo 1, grupo 2 y grupo 3) después de 2 dosis de vacuna (los animales se sacrificaron 43, 40 y 37 días después de la segunda dosis de vacuna, respectivamente). Se sacrificaron tres animales adicionales de cada grupo de vacuna 7 días después de la dosis 3 con el fin de analizar si una tercera dosis de vacuna aumenta aún más la respuesta de células T específicas de pp65, en comparación con dos dosis de vacuna.
Los esplenocitos aislados se analizaron mediante el ensayo ELISPOT usando grupos de péptidos pp65 para la reestimulación. Los péptidos respectivos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se diseñaron para abarcar pp65 en fragmentos de 9 aminoácidos de longitud con superposiciones de 5 aminoácidos (140 péptidos en total). Los péptidos se distribuyeron en grupos que contenían 11 o 12 péptidos. La magnitud de la respuesta de cada animal es la diferencia acumulativa ("área bajo la curva") entre los esplenocitos reestimulados con péptido y los esplenocitos reestimulados con el control DMSO (vehículo), para cada grupo de péptidos.
Como se muestra en la Fig. 27 A, se indujeron esplenocitos productores de IFN-y específicos de pp65 en animales vacunados con HK1-GPpp65 solo (grupo 2) así como en animales vacunados con HK1-GPpp65 en combinación con HK1 -GPgB(dCt) (grupo 3). En ambos grupos de vacunas, se observaron números promedio más altos de esplenocitos productores de IFN-y específicos de pp65 después de tres dosis de vacuna en comparación con dos dosis.
51 bien los tamaños pequeños de los grupos (n = 3) impiden la comparación estadística directa entre los grupos de vacuna después de 2 o 3 dosis de vacuna, se pueden hacer comparaciones estadísticas entre los grupos de vacunación combinados, es decir, combinando los datos del grupo de 2 dosis y el grupo de 3 dosis juntos para cada vacuna (grupo 1, grupo 2 y grupo 3) (FIG. 27 B). El análisis respectivo reveló que los animales vacunados con HK1-GPpp65 (grupo 2) tenían un número significativamente mayor de esplenocitos específicos de pp65 por animal en comparación con los controles HK1-GFP (grupo 1). De manera similar, el grupo de vacuna HK1-GPgB(dCt)/HK1

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente diseñado por ingeniería para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas, en donde el vector viral es capaz de producir virus de progenie infecciosos en células complementarias, pero no es capaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células no complementarias, en donde el marco de lectura abierto de arenavirus que codifica la proteína GP dentro del segmento S se elimina y se reemplaza por:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana; o
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
2. El vector viral de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana.
3. El vector viral de la reivindicación 2, en donde la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 771 de la SEQ ID NO: 3, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 772 a 906 de la SEQ ID NO: 3.
4. El vector viral de la reivindicación 2, en donde la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 772 de la SEQ ID NO: 60, y comprende la deleción del dominio citoplásmico entre los aminoácidos 773 a 907 de la SEQ ID NO: 60.
5. El vector viral de la reivindicación 2, en donde la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 63.
6. El vector viral de la reivindicación 2, en donde la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
7. El vector viral de la reivindicación 2, en donde la glicoproteína gB comprende una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
8. El vector viral de la reivindicación 2, en donde la glicoproteína gB consiste en una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 18.
9. El vector viral de la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una glicoproteína gB en donde: (i) se deleciona el dominio citoplásmico de la glicoproteína gB; (ii) se deleciona el dominio transmembrana de la glicoproteína gB; o (iii) se delecionan el dominio citoplásmico y el dominio transmembrana de la glicoproteína gB.
10. El vector viral de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
11. El vector viral de la reivindicación 10, en donde la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
12. El vector viral de la reivindicación 10, en donde la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
13. El vector viral de la reivindicación 10, en donde la proteína pp65 del tegumento o fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
14. El vector viral de la reivindicación 10, en donde la proteína pp65 del tegumento consiste en una secuencia de aminoácidos que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 36.
15. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde:
(i) el arenavirus es el virus de la coriomeningitis linfocítica;
(ii) la información genómica que codifica el vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente se deriva de la cepa Clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica;
(iii) el vector viral induce una respuesta inmune de larga duración contra una glicoproteína gB del citomegalovirus (CMV) o antígeno pp65 de la proteína tegumento codificada por la secuencia de nucleótidos; o
(iv) el vector viral es adecuado para proteger contra una infección congénita por CMV.
16. Una composición que comprende un primer vector viral y un segundo vector viral, en donde dicho primer vector viral y dicho segundo vector viral es un vector viral según la reivindicación 1, y en donde dichos primer y segundo vectores virales son diferentes.
17. La composición de la reivindicación 16, en donde dicho primer vector viral comprende el vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, y en donde dicho segundo vector viral comprende el vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14.
18. Una composición farmacéutica o inmunogénica o vacuna que comprende un vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o la composición de la reivindicación 16 o 17, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. La vacuna de la reivindicación 18, que comprende la proteína gB del citomegalovirus humano (HCMV), en donde se deleciona el dominio citoplásmico de gB del HCMV, y en donde la proteína gB de1HCMV:
(i) comprende los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60) pero no comprende los aminoácidos C-terminales restantes de la gB de la cepa Merlin de CMV;
(ii) consiste esencialmente en los 772 aminoácidos N-terminales de la gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60); (iii) consiste esencialmente en los 772 aminoácidos N-terminales del gB de la cepa Merlin de CMV (SEQ ID NO: 60) seguidos por un residuo de arginina en la posición 773; o
(iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, al menos un 99,5% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
20. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o la composición de la reivindicación 16 o 17, o la composición farmacéutica o inmunogénica o vacuna de la reivindicación 18 o 19, en donde dicho vector viral, dicha composición, dicha composición farmacéutica o inmunogénica, o dicha vacuna es adecuada para inyección intramuscular.
21. Un vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y 20, o la composición de las reivindicaciones 16, 17 y 20, o una composición farmacéutica o inmunogénica o vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por citomegalovirus en un paciente.
22. Un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico codifica un segmento genómico S de arenavirus en donde el marco de lectura abierto que codifica la proteína GP dentro del segmento genómico S de arenavirus se elimina y se reemplaza por:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una glicoproteína gB de citomegalovirus, en donde la glicoproteína gB tiene una deleción del dominio citoplásmico y/o dominio transmembrana; o
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pp65 del tegumento de citomegalovirus o un fragmento antigénico de la misma.
23. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 22.
24. Una célula que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 22 o el vector de expresión de la reivindicación 23.
25. Un método para generar un vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente que comprende: a. transfectar en una célula huésped el ácido nucleico de la reivindicación 22 o el vector de expresión de la reivindicación 23;
b. mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y
c. recoger el vector viral de arenavirus infeccioso de replicación deficiente;
en donde la célula huésped expresa un marco de lectura abierto que codifica una proteína GP.
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