ES2934698T3 - Vacunas contra el virus de la hepatitis B - Google Patents

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Abstract

La presente solicitud proporciona inmunoterapias para infecciones por el virus de la Hepatitis B. En el presente documento se proporcionan vectores arenavirales modificados genéticamente adecuados como vacunas para la prevención y el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis B. También se proporcionan en este documento composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis B. Específicamente, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas, vacunas y métodos para tratar la infección por el virus de la hepatitis B. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas contra el virus de la hepatitis B
1. INTRODUCCIÓN
En la presente memoria se proporcionan arenavirus modificados genéticamente adecuados como vacunas para la prevención y el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis B. También se proporcionan en la presente memoria composiciones farmacéuticas y composiciones farmacéuticas para uso en métodos para el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis B. Específicamente, en la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas, vacunas y composiciones farmacéuticas y vacunas para uso en métodos de tratamiento o prevención de infecciones por el virus de la hepatitis B. Como tal, la presente solicitud proporciona inmunoterapias para infecciones por el virus de la Hepatitis B.
2. ANTECEDENTES
2.1 El patógeno y la enfermedad.
El virus de la hepatitis B (HBV) es un virus con envoltura de doble cadena de la familia Hepadnaviridae. La partícula del virus consiste en una envoltura lipídica externa y un núcleo de nucleocápside icosaédrico compuesto de proteína. La nucleocápside encierra el ADN viral y una ADN polimerasa que tiene actividad de transcriptasa inversa. La envoltura exterior contiene proteínas incrustadas que están involucradas en la unión viral y la entrada en células susceptibles. El HBV se replica en los hepatocitos de humanos y otros primates superiores, pero no crece en cultivos de células artificiales.
Los resultados de la infección por HBV dependen de la edad e incluyen infección asintomática, hepatitis B aguda, infección crónica por HBV, cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC). La hepatitis B aguda ocurre en aproximadamente el 1 % de las infecciones perinatales, el 10 % de las infecciones en la primera infancia (niños de 1 a 5 años) y el 30 % de las infecciones tardías (personas mayores de 5 años). La hepatitis fulminante se desarrolla en el 0,1-0,6% de los casos de hepatitis aguda; la mortalidad por hepatitis B fulminante es de aproximadamente 70%. El desarrollo de la infección crónica por HBV está inversamente relacionado con la edad de adquisición, ocurriendo en aproximadamente el 80-90% de las personas infectadas perinatalmente, aproximadamente 30% de los niños infectados antes de los 6 años y en <5% de las infecciones que ocurren en otros adultos sanos (Hyams et al., 1995, Clinical Infections Diseases 20:992-1000). Las comorbilidades, incluida la infección por VIH concurrente y la ingestión de alcohol o aflotoxinas, o ambas, pueden tener un papel importante en el desarrollo de la morbilidad relacionada con la hepatitis B. Se estima que el 10 % de los 40 millones de personas infectadas por el VIH en todo el mundo están coinfectadas por el HBV.
Las personas con infección crónica por HBV tienen un riesgo del 15-25 % de morir prematuramente por cirrosis y HCC relacionados con el HBV (Beasley and Hwang, 1991, Proceedings of the 1990 International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease: Contemporary Issues and Future Prospects 532-535). La infección aguda por HBV se caracteriza por la presencia de HBsAg, el antígeno de superficie del HBV, y anticuerpos de inmunoglobulina M (IgM) contra el antígeno central, HBcAg. Durante la fase inicial altamente replicativa de la infección, los pacientes también son seropositivos para HBeAg, la forma extracelular y secretada de HBcAg que se puede encontrar en el suero de los pacientes donde sirve como marcador de replicación activa en la hepatitis crónica. El anticuerpo contra HBsAg (anti-HBs) es discernible después de algunas semanas y es seguido por la eliminación del HBsAg. La infección crónica se caracteriza por la persistencia (>6 meses) de HBsAg (con o sin HBeAg concurrente). La persistencia de HBsAg es el principal marcador de riesgo de desarrollar enfermedad hepática crónica y HCC más adelante en la vida. La presencia de HBeAg indica que la sangre y los fluidos corporales del individuo infectado son altamente contagiosos.
2.2 Epidemiología y salud pública
Las enfermedades causadas por el virus de la hepatitis B tienen una distribución mundial. Se estima que dos mil millones de personas se han infectado en algún momento con el HBV. De estos, aproximadamente 360 millones de personas tienen infección crónica y riesgo de enfermedad grave y muerte, principalmente por cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (HCC). El modelo matemático para el año 2000 estimó el número de muertes por enfermedades relacionadas con el HBV en alrededor de 600000 cada año en todo el mundo (Goldstein et al., 2005, International J. Epidemiology 34:1329-1339). Los seres humanos son el único reservorio del HBV. El virus se transmite por exposición percutánea y permucosa a sangre y otros fluidos corporales infectados, principalmente semen y fluido vaginal. El período de incubación es de 75 días en promedio, pero puede variar de unos 30 días a 180 días. El antígeno de superficie del HBV (HBsAg) puede detectarse en el suero 30 a 60 días después de la infección y puede persistir durante períodos de tiempo muy variables. La endemicidad de la hepatitis B se describe por la prevalencia de HBsAg en la población general de un área geográfica definida, y varía considerablemente a nivel mundial: prevalencias de HBsAg >8% son típicas de áreas altamente endémicas, prevalencias de 2-7% se encuentran en áreas de endemicidad intermedia, mientras que en áreas con baja endemicidad <2% de la población es HBsAg-positiva.
En áreas altamente endémicas, el HBV se transmite más comúnmente de madre a hijo al nacer, o de persona a persona en la primera infancia (Goldstein et al., 2005, International J. Epidemiology 34:1329-1339; Wong et al., 1984, Lancet 1:921-926; de la Hoz et al., 2008 International J. Infectious Diseases 12:183-189). La transmisión perinatal o en la primera infancia también puede representar más de un tercio de las infecciones crónicas en áreas de baja endemicidad (Margolis et al., 1995, JAMA 274:1201 -1208) aunque en esos entornos, la transmisión sexual y el uso de agujas contaminadas, especialmente entre los usuarios de drogas inyectables, son las principales vías de infección (Goldstein et al., 2002, J. Infectious Diseases 185:713-719).
2.3 Tratamiento actual
Se ha demostrado que la vacunación universal contra la hepatitis B reduce significativamente las tasas de infección por HBV y HCC. Sin embargo, una vez que se establece la infección crónica por HBV, el tratamiento aún representa un gran desafío, ya que las terapias tradicionales generalmente no logran proporcionar un control sostenido de la replicación viral y el daño hepático en la mayoría de los pacientes.
Los tratamientos antivirales actualmente aprobados para la hepatitis B crónica incluyen el interferón-a recombinante pegilado (PEG) y los inhibidores de la ADN polimerasa viral. Estos agentes disminuyen la replicación viral y se ha demostrado que retrasan la progresión de la cirrosis, reducen la incidencia de HCC y mejoran la supervivencia a largo plazo. Sin embargo, el tratamiento se complica por la toxicidad de los agentes y solo puede curar a un pequeño subconjunto de personas con infección crónica. Aunque los niveles virales en la sangre caen en picado a niveles casi indetectables en individuos que reciben terapias estándar, las reducciones del ADN viral intrahepático son solo modestas. Como consecuencia, el rebote de la viremia ocurre con frecuencia después de la interrupción del tratamiento y las personas con infecciones crónicas por HBV deben continuar con el tratamiento de por vida. Sin embargo, incluso después de diez años de terapia antiviral, los medicamentos reducen la insuficiencia hepática en solo un 40-70%, y la mortalidad por cirrosis y cáncer de hígado sigue siendo alta.
2.4 La hepatitis B y el sistema inmunitario
La infección crónica por hepatitis B se caracteriza por una inmunidad antiviral innata y adaptativa disfuncional (Bertoletti & Ferrari, 2012, Gut 61:1754-1764). Por el contrario, la inmunidad específica contra el HBV en pacientes con infección por HBV resuelta es robusta y multifuncional. Varios mecanismos podrían contribuir a la disfunción de la inmunidad de las células T específicas del HBV en pacientes con hepatitis B crónica, incluidos los altos niveles de antigenemia viral y el microambiente tolerante del hígado (Jenne & Kubes, 2013, Nat. Immunol. 14:996-1006). Estudios previos han demostrado que la supresión de la replicación viral puede restaurar transitoriamente y parcialmente la inmunidad de las células T antivirales, lo que respalda la hipótesis de que la exposición a largo plazo a altos niveles de antigenemia podría causar disfunción de las células T antivirales (Boni et al., 2003, J. Hepatol. 39:595-605).
Las vacunas terapéuticas que podrían revertir el estado inmunológico disfuncional de los pacientes con hepatitis B crónica y restaurar la inmunidad antiviral, teóricamente tendrían el potencial de eliminar la viremia y reducir los niveles intrahepáticos de ADN del HBV a cero, por lo que serían muy prometedores para la cura del HBV.
Recientemente, las vacunas contra el HBV han sido identificadas como una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento y control de la infección por HBV en portadores de HBV y pacientes persistentemente infectados (Michel & Tiollais, 2010, Pathol. Biol. (Paris) 58:288-295; Liu et al., 2014, Virol. Sin. 29:10-16). En aproximadamente el 50 % de los pacientes con HBV crónicamente activos, la terapia específica mediante la vacunación anti-HBV convencional redujo de forma eficaz la replicación del HBV e inhibió la tolerancia inmunitaria a la proteína HbsAg (Couillin et al., 1999, J. Infect. Dis. 180:15-26). Sin embargo, hasta ahora la monoterapia con vacunas basadas en HBsAg no condujo a un control sostenido de la replicación del HBV y/o al daño hepático (Akbar et al., 2013, Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 12:363-369) y se necesitan nuevas estrategias de terapia para proporcionar respuestas inmunitarias antivirales potentes y duraderas y un control a largo plazo de la replicación del HBV.
El fracaso de los enfoques de vacunas terapéuticas anteriores destaca los desafíos y las limitaciones del conocimiento actual sobre las respuestas inmunitarias en la infección crónica por HBV (Michel et al., 2011, J. Hepatol. 54:1286-1296). La combinación de una condición de alta carga viral como la hepatitis B crónica con el microambiente hepático tolerante podría dificultar la recuperación total de la inmunidad de células T antivirales.
La investigación intensiva se concentra actualmente en una mejor comprensión de las respuestas inmunes en los hepatocitos, en los mecanismos por los cuales el HBV evade la inmunidad innata y en la selección adecuada de pacientes susceptibles de beneficiarse de la terapia inmune, lo que podría aumentar la eficacia de la vacunación terapéutica (Michel et al., 2015, Med. Microbiol. Immunol. 204:121 -129).
En el primer aspecto, la invención proporciona un vector viral de arenavirus infeccioso, en donde se elimina un marco de lectura abierto de arenavirus y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; en donde el vector viral es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En el segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica, una composición inmunogénica o una vacuna que comprende el vector viral de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En el tercer aspecto, la invención proporciona un vector viral, una composición farmacéutica, una composición inmunogénica o una vacuna de la invención, para uso en un método para tratar o prevenir una infección por el virus de la Hepatitis B en un paciente.
En el cuarto aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico comprende un segmento genómico de arenavirus en donde se elimina o inactiva funcionalmente un marco de lectura abierto del segmento genómico y en donde el segmento genómico comprende uno o más de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; o
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; en donde un vector viral que comprende el segmento genómico de arenavirus es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; opcionalmente, en donde el segmento genómico es el segmento corto, en donde se elimina el marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína (GP).
En el quinto aspecto, la invención proporciona un ADNc del segmento genómico de arenavirus como se define en el cuarto aspecto.
En el sexto aspecto, la invención proporciona un in vitro método para generar un vector viral de arenavirus infeccioso, deficiente en replicación que comprende:
a. transfectar en una célula huésped el ADNc de la invención;
b. mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y
c. recolectar el vector viral arenavirus infeccioso, deficiente en replicación;
en donde la célula huésped expresa el marco de lectura abierto del segmento genómico que se elimina o inactiva funcionalmente;
opcionalmente en donde el método comprende además en el paso a. transfectar en la célula huésped: un ADNc de un segundo segmento genómico de arenavirus, un ácido nucleico que comprende el ORF de proteína L y/o un ácido nucleico que comprende el ORF de NP.
En el séptimo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer vector viral de arenavirus infeccioso y deficiente en replicación modificado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir partículas de progenie infecciosas adicionales en condiciones normales. , no células modificadas genéticamente, en donde se elimina un marco de lectura abierto de arenavirus y se reemplaza por una primera secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y un segundo vector viral de arenavirus infeccioso, deficiente en replicación, modificado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir partículas de progenie infecciosas adicionales en células normales, no modificadas genéticamente, en donde una lectura abierta de arenavirus el marco se elimina y se reemplaza por una segunda secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
en donde la primera y la segunda secuencia de nucleótidos son diferentes; donde el primer vector viral y el segundo vector viral son capaces de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En adelante, la referencia al arenavirus en el contexto de la invención, o el arenavirus comprendido en la composición farmacéutica de la invención, significa el vector viral arenavirus.
3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente solicitud proporciona inmunoterapias para infecciones por el virus de la Hepatitis B. En la presente memoria se proporciona un vector viral de arenavirus infeccioso, en donde se elimina un marco de lectura abierto de arenavirus y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
en donde el vector viral es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso y deficiente en replicación está bisegmentado. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso y deficiente en replicación está trisegmentado. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso y competente para la replicación está trisegmentado.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un vector viral de arenavirus, en donde se elimina un marco de lectura abierto de arenavirus y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y en donde el vector viral es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus es deficiente en replicación. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus es competente para la replicación.
En ciertas realizaciones, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de ingresar o inyectar su material genético en una célula huésped. En ciertas realizaciones más específicas, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de ingresar o inyectar su material genético en una célula huésped seguido de amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula huésped. En ciertas realizaciones, el vector viral es un vector viral de arenavirus infeccioso, deficiente en replicación modificado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir partículas de progenie infecciosas adicionales en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una línea celular que soporta el crecimiento viral de un virus de tipo salvaje pero que no expresa la proteína viral complementaria, por lo que es incapaz de producir partículas de progenie infecciosas virales adicionales. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación y capaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente.
En ciertas realizaciones, la proteína pre-S2/S o el fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, el fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente al HBV humano pre -proteína S2/S; y/o (ii) provocar una respuesta inmunitaria de células T específica.
En ciertas realizaciones, la proteína HBc o el fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a la proteína HBc del HBV humano; y/o (ii) provocar una respuesta inmunitaria de células T específica.
En ciertas realizaciones, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el fragmento es antigénico cuando es capaz de (i) provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a los HBs del HBV humano. , HBc o tanto HBs como HBc; y/o (ii) provocar una respuesta inmunitaria de células T específica.
La proteína HBe o el fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 26. El fragmento puede ser antigénico cuando es capaz de (i) provocar una respuesta inmunitaria de anticuerpos en un huésped (p. ej., ratón, conejo, cabra o burro) en donde los anticuerpos resultantes se unen específicamente a la proteína HBe del HBV humano; y/o (ii) provocar una respuesta inmunitaria de células T específica.
En ciertas realizaciones, el vector viral comprende al menos dos de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
en donde el vector viral es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En ciertas realizaciones, el vector viral comprende al menos tres de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
en donde el vector viral es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En ciertas realizaciones, un marco de lectura abierto (ORF) del arenavirus se elimina o inactiva funcionalmente y se reemplaza con un ácido nucleico que codifica un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En una realización específica, el ORF que codifica la glicoproteína GP del arenavirus se elimina o inactiva funcionalmente. En ciertas realizaciones, la inactivación funcional de un gen elimina cualquier producto de traducción. En ciertas realizaciones, la inactivación funcional se refiere a una alteración genética que permite alguna traducción, sin embargo, el producto de la traducción ya no es funcional y no puede reemplazar la proteína de tipo salvaje.
En ciertas realizaciones, el vector viral puede amplificar y expresar su información genética en una célula que ha sido infectada por el vector viral, pero el vector viral no puede producir más partículas de progenie infecciosas en una célula que no se complementa. En ciertas realizaciones, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de ingresar o inyectar su material genético en una célula huésped. En ciertas realizaciones más específicas, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de ingresar o inyectar su material genético en una célula huésped seguido de amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula huésped.
En ciertas realizaciones, la información genómica que codifica la partícula de arenavirus infeccioso se deriva de la cepa Clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) o la cepa MP de LCMV. La secuencia de nucleótidos del segmento S y del segmento L del Clon 13 se exponen en SEQ ID NO: 12 y 7, respectivamente.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un vector viral cuyo genoma es o ha sido derivado del genoma del Clon 13 (SEQ ID NO: 12 y 7) mediante la eliminación de un ORF del genoma del Clon 13 (p. ej., el ORF de la proteína GP) y reemplazándolo con un ORF heterólogo que codifica un antígeno (p. ej., un antígeno del HBV) de modo que el genoma restante del LCMV sea al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntico a la secuencia de nucleótidos del Clon 13 (SEQ ID NO: 12 y 7).
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un vector viral cuyo genoma se ha derivado del genoma de la cepa MP de LCMV (SEQ ID NO: 13 y 14) mediante la eliminación de un ORF del genoma MP de la cepa de LCMV (p. ej., el ORF de la proteína GP) y reemplazándolo con un ORF heterólogo que codifica un antígeno (p. ej., un antígeno del HBV) de modo que el genoma restante del LCMV es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, al menos 99,9 % o 100 % idénticos a la secuencia de nucleótidos de la cepa MP de LCMV (SEQ ID NO: 13 y 14).
En una realización más específica, el vector viral comprende un segmento genómico, en donde el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, al menos 99% o 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos 1639 a 3315 de SEQ iD NO: 11 o 1640 a 3316 de SEQ ID NO: 12. En ciertas realizaciones, el vector viral comprende un segmento genómico que comprende un secuencia de nucleótidos que codifica un producto de expresión cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por 1639 a 3315 de SEQ ID NO: 11 o 1640 a 3316 de SEQ ID NO: 12.
También se proporcionan en la presente memoria ácidos nucleicos aislados, en donde el ácido nucleico es un ADNc de un segmento genómico de arenavirus en donde se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico y en donde el segmento genómico comprende uno o cualquier combinación de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
en donde un vector viral que comprende el segmento genómico de arenavirus es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína pre-S2/S del HBV, la proteína HBc del HBV o la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, o un fragmento antigénico de las mismas.
En ciertas realizaciones, el segmento genómico es el segmento corto, en donde se elimina el ORF que codifica la GP.
En un aspecto, en la presente memoria se proporcionan métodos para generar una partícula de arenavirus infecciosa deficiente en replicación que comprende:
a. transfectar en una célula huésped un ácido nucleico descrito en la presente memoria;
b. mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y
c. recolectar la partícula de arenavirus infecciosa, deficiente en replicación;
en donde la célula huésped expresa el ORF que se elimina o inactiva funcionalmente en el segmento genómico. En ciertas realizaciones, cualquier ácido nucleico adicional requerido para el rescate de una partícula viral también se transfecta en la célula huésped en el paso a. Dichos ácidos nucleicos adicionales pueden ser: el ADNc del segundo segmento genómico de arenavirus, un ácido nucleico que comprende el ORF de proteína L y/o un ácido nucleico que comprende el ORF de NP.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan composiciones, p. ej., composiciones farmacéuticas, inmunogénicas o vacunas, que comprenden un vector viral descrito en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporcionan en la presente memoria composiciones (p. ej., composiciones de vacunas) que comprenden dos o más vectores virales diferentes descritos en la presente memoria (es decir, en donde los vectores virales codifican diferentes antígenos del HBV). En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico o una proteína de fusión descrita en la presente memoria.
En otro aspecto, los métodos para tratar o prevenir la infección por HBV en un paciente comprenden administrar al paciente un vector viral, una composición farmacéutica, una composición inmunogénica o una vacuna descrita en la presente memoria. En otro aspecto más, en la presente memoria se proporciona el uso de un vector viral, una composición farmacéutica, una composición inmunogénica o una vacuna descrita en la presente memoria en métodos de tratamiento o prevención del HBV. En ciertas realizaciones, un vector viral de arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV o un fragmento del mismo es capaz de prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto. En ciertas realizaciones, uno o más vectores virales de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV o un fragmento del mismo son capaces de prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En ciertas realizaciones, la administración a un paciente de un vector vírico del virus de la arena infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo induce una respuesta inmunitaria de larga duración. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En ciertas realizaciones, los métodos para tratar y o prevenir la infección por HBV en un paciente comprenden administrar al paciente dos o más vectores virales de arenavirus que expresan un antígeno de HBV o un fragmento del mismo. En una realización más específica, cada vector viral de arenavirus expresa un antígeno de HBV diferente o un fragmento del mismo. En otras realizaciones, cada vector viral de arenavirus expresa un antígeno del HBV o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el derivado del mismo es un fragmento de antígeno de HBV. En aún otra realización proporcionada en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden dos o más vectores virales de arenavirus, cada uno de los cuales expresa un antígeno de HBV diferente o un fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En ciertas realizaciones, el arenavirus es el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) o el virus Junín (JUNV).
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un vector viral de arenavirus infeccioso, en donde se elimina un marco de lectura abierto de arenavirus y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas. En realizaciones específicas, el arenavirus es el virus de la coriomeningitis linfocítica. En realizaciones específicas, el marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína del arenavirus se elimina o se inactiva funcionalmente. En realizaciones específicas, el vector viral es deficiente en replicación. En realizaciones específicas, el vector viral es competente para la replicación. En realizaciones específicas, el vector viral está trisegmentado. En ciertas realizaciones, un método para tratar o prevenir una infección por el virus de la hepatitis B en un paciente comprende administrar al paciente el vector viral del que se elimina un marco de lectura abierto de arenavirus y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
3.1 Convenciones y abreviaturas
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4. DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
Las siguientes secuencias son secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos ilustrativas que pueden usarse con los métodos y composiciones descritos en la presente memoria. En algunos casos, se usa una secuencia de ADN para describir la secuencia de ARN de un segmento genómico viral. La secuencia de ARN se puede deducir fácilmente a partir de la secuencia de ADN. Las secuencias mismas también se pueden encontrar en la Tabla 3 de la Sección 6.10.
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del ORF pre-S2/S del HBV.
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos del ORF de HBc del HBV.
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del ORF de la proteína de fusión HBs-HBc del HBV.
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos del segmento S de LCMV que expresa la proteína de fusión HBs-HBc del HBV en forma de ADNc. El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO:4 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO: 4 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del segmento S de LCMV que expresa el ORF de HBc, en forma de ADNc. El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO:5 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO: 5 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos del segmento S de LCMV que expresa el ORF pre-S2/S, en forma de ADNc. El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO:6 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO:6 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
SEQ ID NO: 7 es el clon 13 del segmento L del virus de la coriomeningitis linfocítica, secuencia completa (GenBank:
DQ361066.1). El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO: 7 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO: 7 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de un epítopo derivado de la proteína HBs del HBV.
SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de un epítopo derivado de la proteína HBs del HBV.
SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de un epítopo derivado de proteína HBc del HBV.
SEQ ID NO: 11 es el segmento S del virus de la coriomeningitis linfocítica, secuencia completa. El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO: 11 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO: 11 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
SEQ ID NO: 12 es el clon 13 del segmento S del virus de la coriomeningitis linfocítica, secuencia completa (GenBank: DQ361065.2). El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO: 12 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO: 12 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN. SEQ ID NO: 13 es la cepa de coriomeningitis linfocítica MP segmento L, secuencia completa. El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO:13 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO: 13 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
SEQ ID NO: 14 es la cepa de coriomeningitis linfocítica MP segmento S, secuencia completa. El segmento genómico es ARN, la secuencia en SEQ ID NO:14 se muestra para ADN; sin embargo, el intercambio de todas las timidinas ("T") en SEQ ID NO: 14 por uridinas ("U") proporciona la secuencia de ARN.
SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NP de la cepa MP de LCMV.
SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de la proteína GP de la cepa MP de LCMV.
SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos de la proteína L de la cepa MP de LCMV.
SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de la proteína Z de la cepa MP de LCMV.
SEQ ID NO: 19 es el segmento L de la cepa Candid #1 del virus Junín, secuencia completa.
SEQ ID NO: 20 es el segmento S de la cepa Candid #1 del virus Junín, secuencia completa.
SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NP de la cepa Clon 13 de LCMV.
SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos de la proteína GP de la cepa Clon 13 de LCMV.
SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de la proteína L de la cepa Clon 13 de LCMV.
SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de la proteína Z de la cepa Clon 13 de LCMV
SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de la proteína GP de la cepa WE de LCMV.
SEQ ID NO: 26 es la secuencia de nucleótidos del antígeno Hbe de HBV.
5. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: El genoma de los arenavirus de tipo salvaje consiste en un segmento de ARN corto (1; ~3,4 kb) y uno grande (2; ~7,2 kb). El segmento corto lleva ORF que codifican la nucleoproteína (3) y la glicoproteína (4). El segmento grande codifica la ARN polimerasa L dependiente de ARN (5) y la proteína de matriz Z (6). Los arenavirus de tipo salvaje pueden convertirse en vectores de vacunas deficientes en replicación eliminando el gen de la glicoproteína e insertando, en lugar del gen de la glicoproteína, antígenos de elección (7) contra los que se inducirán las respuestas inmunitarias.
Figuras 2A-C: Representación esquemática de la organización genómica de LCMV bisegmentado y trisegmentado. El genoma bisegmentado del LCMV de tipo salvaje consiste en un segmento S que codifica la GP y la NP y un segmento L que codifica la proteína Z y la proteína L (A). Ambos segmentos están flanqueados por las respectivas UTR 5' y 3'. El genoma de los LCMV trisegmentados recombinantes (r3LCMV) consiste en un segmento L y dos S con una posición donde insertar un gen de interés (aquí GFP) en cada uno de los segmentos S. r3LCMV-GFPnatural (nat) tiene todos los genes virales en su posición natural (B), mientras que el ORF de GP en r3LCMV-GFPartificial (art) se yuxtapone artificialmente y se expresa bajo el control de la UTR 3’ (C).
Figura 3: Células T CD8+ específicas del virus de la hepatitis B, expresadas como porcentaje del grupo total de células T CD8+B220- en sangre periférica de ratones C57BL/6 (5 ratones por grupo) diez días después de la inmunización intravenosa con 105 FFU de rLCMV/HBs-HBc (grupo 1), rLCMV/HBc (grupo 3), rLCMV/Pre-S2 (grupo 4), o con 104 FFU de rLCMV/HBs-HBc (grupo 2). Los ratones de control se dejaron sin tratar.
Figura 4A-B: Células T CD8+ específicas del virus de la hepatitis B, expresadas como (A) un porcentaje del grupo total de células T CD8+B220- en sangre periférica o, (B) como un porcentaje de los linfocitos circulantes en la sangre, de ratones C57BL/6 (5 ratones por grupo) ocho días después de la inmunización intravenosa con 105 FFU de r3LCMV/HBs-HBc (grupo 1), r3LCMV/HBc (grupo 2), r3LCMV/Pre-S2 (grupo 3), o con 105 FFU de rLCMV/HBs-HBc (grupo 4). Los ratones de control se dejaron sin tratar.
6. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente solicitud proporciona inmunoterapias para infecciones por el virus de la Hepatitis B. En la presente memoria se proporcionan composiciones y composiciones para uso en el tratamiento o prevención de la infección de un sujeto con HBV. Más específicamente, en la presente memoria se proporcionan arenavirus infecciosos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno del HBV. En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso es deficiente en replicación. En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso es competente para la replicación. Estos virus se pueden administrar a un sujeto para el tratamiento o prevención de la infección por HBV. La generación de vectores de arenavirus infecciosos para uso con la presente invención se describe con más detalle en la Sección 6.3.
En la presente memoria se proporciona un arenavirus modificado genéticamente, en donde el arenavirus: es infeccioso;
no puede formar un virus de progenie infeccioso en una célula no complementaria (es decir, una célula que no expresa la funcionalidad que falta en el arenavirus deficiente en replicación y hace que sea deficiente en replicación);
es capaz de replicar su genoma y expresar su información genética; y
codifica un antígeno del HBV o un fragmento del mismo.
Un arenavirus modificado genéticamente descrito en la presente memoria es infeccioso, es decir, puede unirse a una célula huésped y liberar su material genético en la célula huésped. Un arenavirus modificado genéticamente descrito en la presente memoria puede ser deficiente en replicación, es decir, el arenavirus es incapaz de producir partículas de progenie infecciosas adicionales en una célula que no se complementa. En particular, para crear un arenavirus deficiente en replicación, el genoma del arenavirus se modifica (p. ej., por eliminación o inactivación funcional de un ORF) de modo que un virus que lleva el genoma modificado ya no puede producir virus de progenie infecciosos. Una célula que no se complementa es una célula que no proporciona la funcionalidad que se eliminó del arenavirus deficiente en replicación mediante la modificación del genoma del virus (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, la célula no proporciona la proteína GP). Sin embargo, un arenavirus deficiente en replicación modificado genéticamente proporcionado en la presente memoria es capaz de producir virus de progenie infecciosos en células complementarias. Las células complementarias son células que proporcionan (en trans) la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus deficiente en replicación mediante la modificación del genoma del virus (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se desactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP). La expresión de la funcionalidad complementaria (p. ej., la proteína GP) puede lograrse mediante cualquier método conocido por el experto en la técnica (p. ej., expresión transitoria o estable). Un arenavirus genéticamente modificado descrito en la presente memoria puede amplificar y expresar su información genética en una célula que ha sido infectada por el virus. Un arenavirus modificado genéticamente que se proporciona en la presente memoria comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno del HBV tal como, pero no limitado a, los antígenos del HBV descritos en la Sección 6.2.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un arenavirus genéticamente modificado en donde se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del genoma del arenavirus de manera que el virus resultante no puede producir más partículas de virus de progenie infecciosas en células que no se complementan. Una partícula de arenavirus que comprende un genoma modificado genéticamente en donde se elimina o inactiva funcionalmente un ORF se puede producir en células complementarias (es decir, en células que expresan el ORF de arenavirus que se ha eliminado o inactivado funcionalmente) (Véase la Sección 6.3). El material genético de las partículas de arenavirus resultantes puede transferirse tras la infección de una célula huésped a la célula huésped, en donde el material genético puede expresarse y amplificarse. Además, el genoma de las partículas de arenavirus modificadas genéticamente proporcionadas en la presente memoria codifica un antígeno del HBV que puede expresarse en la célula huésped.
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína (GP) del arenavirus se elimina para generar un arenavirus deficiente en replicación para uso con la presente invención. En una realización específica, el arenavirus deficiente en replicación comprende un segmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno del HBV. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus modificada genéticamente proporcionada en la presente memoria comprende un segmento genómico que a) tiene una deleción o inactivación funcional de un ORF que está presente en la forma de tipo salvaje del segmento genómico; yb) codifica (ya sea en sentido o antisentido) un antígeno de HBV (Véase la Sección 6.3).
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que se inserta en el genoma del arenavirus que codifica un antígeno del HBV o combinaciones de antígenos del HBV se selecciona entre:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas;
y en donde un vector viral que comprende la secuencia de nucleótidos es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína pre-S2/S del HBV, la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, o un fragmento antigénico de las mismas.
En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b))
En la Sección 6.2 se proporciona una descripción detallada de los antígenos descritos en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, los arenavirus usados de acuerdo con la invención descrita en la presente memoria pueden ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). En la Sección 6.1 se proporciona una descripción más detallada de los arenavirus descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, los arenavirus usados de acuerdo con la invención descrita en la presente memoria pueden ser virus del Nuevo Mundo.
En la presente memoria se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden el genoma de dichos arenavirus deficientes en replicación. En ciertos aspectos, una partícula de arenavirus infecciosa deficiente en replicación comprende un segmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
En la presente memoria se proporciona un plásmido de expresión que codifica uno o más componentes necesarios para la generación de un vector viral descrito en la presente memoria. Específicamente, en la presente memoria se proporciona un vector de expresión que codifica un segmento S de LCMV en donde el ORF para la proteína GP se ha eliminado del segmento S y se ha reemplazado con el ORF de la proteína pre-S2/S del HBV humano (p. ej., que tiene un amino secuencia de ácido codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SeQ ID NO: 1).
En la presente memoria se proporciona un plásmido de expresión que codifica uno o más componentes necesarios para la generación de un vector viral descrito en la presente memoria. Específicamente, en la presente memoria se proporciona un vector de expresión que codifica un segmento S de LCMV en donde el ORF para la proteína GP se ha eliminado del segmento S y se ha reemplazado con el ORF de la proteína HBc del HBV humano (p. ej., que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SeQ ID NO: 2).
En la presente memoria se proporciona un plásmido de expresión que codifica uno o más componentes necesarios para la generación de un vector viral descrito en la presente memoria. Específicamente, en la presente memoria se proporciona un vector de expresión que codifica un segmento S de LCMV en donde el ORF para la proteína GP se ha eliminado del segmento S y se ha reemplazado con el ORF de HBs del HBV humano y el ORF de HBc del HBV humano (p. ej., que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO : 3).
En la presente memoria se proporcionan kits que comprenden uno o dos de los plásmidos de vector descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un kit que comprende a) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento S de un vector LCMV; b) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento L de un vector LCMV; yc) un plásmido de expresión que codifica la funcionalidad complementaria. En una realización específica, en la presente memoria se proporciona un kit que comprende a) un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un segmento S de LCMV en donde el ORF para la proteína GP se ha eliminado del segmento S y se ha reemplazado con el ORF del HBV humano proteína pre-S2/S (p. ej., que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un aminoácido secuencia codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1); b) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento L de un vector LCMV; yc) un plásmido de expresión que codifica la proteína GP de LCMV (o una línea celular que expresa la proteína GP de LCMV).
En la presente memoria se proporcionan kits que comprenden uno o dos de los plásmidos de vector descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un kit que comprende a) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento S de un vector LCMV; b) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento L de un vector LCMV; yc) un plásmido de expresión que codifica la funcionalidad complementaria. En una realización específica, en la presente memoria se proporciona un kit que comprende a) un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un segmento S de LCMV en donde el ORF para la proteína GP se ha eliminado del segmento S y se ha reemplazado con el ORF del HBV humano Proteína HBc (p. ej., que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por el secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2); b) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento L de un vector LCMV; yc) un plásmido de expresión que codifica la proteína GP de LCMV (o una línea celular que expresa la proteína GP de LCMV).
En la presente memoria se proporcionan kits que comprenden uno o dos de los plásmidos de vector descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un kit que comprende a) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento S de un vector LCMV; b) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento L de un vector LCMV; yc) un plásmido de expresión que codifica la funcionalidad complementaria. En una realización específica, en la presente memoria se proporciona un kit que comprende a) un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un segmento S de LCMV en donde el ORF para la proteína GP se ha eliminado del segmento S y se ha reemplazado con el ORF del HBV humano HBs y el ORF del HBV humano HBc (p. ej., que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3); b) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del segmento L de un vector LCMV; yc) un plásmido de expresión que codifica la proteína GP de LCMV (o una línea celular que expresa la proteína GP de LCMV).
También se proporcionan en la presente memoria líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones proporcionadas aquí. En la Sección 6.4 se proporciona una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, los sistemas de vectores y las líneas celulares descritos en la presente memoria.
En un aspecto, en la presente memoria se proporcionan tales arenavirus genéticamente modificados deficientes en replicación adecuados como vacunas y dichos arenavirus para uso en vacunación y tratamiento o prevención de infecciones por HBV. En la Sección 6.5 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de dichos arenavirus descritos en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, la inmunización con un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, proporciona una respuesta inmunitaria de larga duración. En ciertas realizaciones, los niveles máximos de anticuerpos se pueden lograr después de dos inmunizaciones. En otra realización, se puede administrar una tercera inmunización para un efecto de refuerzo. En realizaciones más específicas, en la presente memoria se proporcionan programas de administración que utilizan el arenavirus infeccioso en una vacunación para el tratamiento y/o prevención de infecciones por HBV. En la Sección 6.6 se proporciona una descripción más detallada de los programas de administración utilizando un arenavirus infeccioso como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En ciertas realizaciones, la administración a un sujeto seronegativo de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, induce un título de anticuerpos detectables durante un mínimo de al menos 4 semanas. En otra realización, la administración a un sujeto infectado con una infección por HBV de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, aumenta el título de anticuerpos en al menos aproximadamente 100 %, al menos aproximadamente 200 %, al menos aproximadamente 300 %, al menos 400%, al menos 500% o al menos 1000%. En ciertas realizaciones, la exposición al antígeno primario, mediante la primera inmunización con un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, provoca un título de anticuerpos funcional, (neutralizante) y mínimo de al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 300 %, al menos el 400%, al menos el 500% o al menos el 1000% de la media de sueros de control de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, el título de anticuerpos de la media geométrica neutralizante primaria aumenta hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200 o al menos 1:1000 dentro de al menos 4 semanas después de la inmunización. En otra realización, la inmunización con un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, produce títulos elevados de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización después de una sola administración de la vacuna. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En aún otra realización, la exposición al antígeno secundario mediante una segunda inmunización con un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo aumenta el título de anticuerpos en al menos aproximadamente 100 %, al menos aproximadamente 200 %, al menos aproximadamente 300 %, al menos aproximadamente 400 %, al menos 500%, o al menos 1000%. En otra realización, la exposición al antígeno secundario provoca un título de anticuerpos funcional, (neutralizante) y mínimo de al menos el 50 %, al menos el 100 %, al menos el 200 %, al menos el 300 %, al menos el 400 %, al menos el 500 %, o al menos el 1000 % de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, el título de anticuerpos neutralizantes medios geométricos secundarios aumenta hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200 o al menos 1:1000 dentro de al menos 4 semanas después de la inmunización. En otra realización, una segunda inmunización con un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, produce altos títulos de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses. , al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En aún otra realización, una tercera inmunización de refuerzo aumenta el título de anticuerpos en al menos aproximadamente 100 %, al menos aproximadamente 200 %, al menos aproximadamente 300 %, al menos aproximadamente 400 %, al menos aproximadamente 500 % o al menos aproximadamente 1000 %. En otra realización, la inmunización de refuerzo provoca un título de anticuerpos funcional, (neutralizante) y mínimo de al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 300 %, al menos 400 %, al menos 500 %, o al menos el 1000 % de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, el título de anticuerpos de la media geométrica neutralizante después de la tercera inmunización de refuerzo aumenta hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200 o al menos 1:1000 dentro de al menos 4 semanas después de la vacunación. En otra realización, una tercera inmunización de refuerzo prolonga el título de anticuerpos en al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años, o al menos 5 años después de la inmunización.
En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo provoca una respuesta independiente de células T o dependiente de células T. En otras realizaciones, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo provoca una respuesta de células T. En otras realizaciones, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, provoca una respuesta auxiliar T. En otra realización, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, provoca una respuesta orientada a Th1 o una respuesta orientada a Th2. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En realizaciones más específicas, la respuesta orientada a Th1 se indica mediante un predominio de anticuerpos IgG1 frente a IgG2. En otras realizaciones, la relación de IgG1:IgG2 es superior a 1:1, superior a 2:1, superior a 3:1 o superior a 4:1. En otra realización, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, se indica mediante un predominio de anticuerpos IgG3. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En algunas realizaciones, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo provoca una respuesta de células T CD8+. En otras realizaciones, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo provoca una respuesta de células T reguladoras. En realizaciones más específicas, la respuesta de las células T reguladoras mantiene la tolerancia inmunitaria. En otra realización, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo provoca respuestas de células T CD4+ y CD8+. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso que expresa uno o más antígenos del HBV o fragmentos de los mismos, como se describe en la presente memoria, provoca títulos elevados de anticuerpos neutralizantes. En otra realización, el arenavirus infeccioso que expresa dos o más antígenos del HBV o fragmentos de los mismos, como se describe en la presente memoria, provoca títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que la expresión de los componentes del complejo proteico individualmente. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En otras realizaciones, dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV provocan títulos elevados de anticuerpos neutralizantes. En una realización más específica, dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV provocan títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En otra realización, el arenavirus infeccioso que expresa dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos de HBV provoca títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV o un fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
6.1 Vectores de arenavirus que expresan un antígeno del HBV
Los arenavirus para uso con los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria pueden ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, virus Lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus Mobala, virus Mopeia o virus Ippy, o virus del Nuevo Mundo, por ejemplo, virus Amapari, virus Flexal, virus Guanarito, virus Junín, virus Latino, virus Machupo, virus Oliveros, virus Paraná, virus Pichinde, virus Pirital, virus Sabia, virus Tacaribe, virus Tamiami, virus Bear Canyon o virus Whitewater Arroyo. El arenavirus genéticamente modificado se puede generar como se describe en la Sección 6.3.
El genoma del arenavirus de tipo salvaje consiste en un segmento de ARN corto (~3,4 kb) y uno grande (~7,2 kb). El segmento corto lleva los ORF que codifican los genes de la nucleoproteína NP y la glicoproteína GP. El segmento grande comprende los genes de la ARN polimerasa L dependiente de ARN y de la proteína de matriz Z.
(a) Vectores de arenavirus deficiente en replicación
En ciertas realizaciones, el vector de arenavirus es un vector de arenavirus bisegmentado, deficiente en replicación. En ciertas realizaciones, el vector de arenavirus es un vector de arenavirus trisegmentado deficiente en replicación. Los arenavirus de tipo salvaje pueden volverse deficientes en la replicación para generar vectores de vacuna sustituyendo el gen de la glicoproteína por uno o más antígenos del HBV, contra los cuales se van a inducir las respuestas inmunitarias.
Los vectores de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV, o una combinación de antígenos de HBV como se describe en la presente memoria, se pueden usar para inmunizar (de manera preventiva) o tratar (de manera inmunoterapéutica) a sujetos contra la infección por HBV. En una realización específica, se usa una combinación de HBs y HBc.
Se sabe que la enfermedad por arenavirus y la inmunosupresión en la infección por arenavirus de tipo salvaje son el resultado de una replicación viral no controlada. Al abolir la replicación, es decir, la capacidad de producir partículas de virus de progenie infecciosas, de los vectores de arenavirus eliminando de su genoma, por ejemplo, el gen Z que se requiere para la liberación de partículas, o el gen GP que se requiere para la infección de células diana, el número total de células infectadas puede estar limitado por el inóculo administrado, por ejemplo, a un receptor de la vacuna, o puede transmitirse accidentalmente al personal involucrado en aplicaciones médicas o biotecnológicas, o a los animales. Por lo tanto, la supresión de la replicación de los vectores de arenavirus evita la patogenia como resultado de la transmisión intencionada o accidental de partículas de vectores. Provisto aquí, un aspecto importante consiste en explotar la necesidad anterior de abolición de la replicación de una manera beneficiosa con el propósito de expresar un antígeno del HBV. En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus se vuelve deficiente en replicación mediante la modificación genética de su genoma. Tales modificaciones al genoma pueden incluir:
eliminación de un ORF (p. ej., el ORF que codifica la proteína GP, NP, L o Z);
inactivación funcional de un ORF (p. ej., el ORF que codifica la proteína GP, NP, L o Z).
Por ejemplo, esto se puede lograr introduciendo una mutación de sentido contrario o sin sentido;
cambio de la secuencia del ORF (p. ej., el intercambio de un sitio de corte SIP con el sitio de corte de otra proteasa);
mutagénesis de uno de los terminales 5' o 3' de uno de los segmentos genómicos;
mutagénesis de una región intergénica (es decir, del segmento genómico L o S).
En ciertas realizaciones, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria es un virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) en donde el segmento S del virus se modifica sustituyendo el ORF que codifica la proteína GP con un ORF que codifica un antígeno del HBV.
En ciertas realizaciones, se puede modificar un genoma de vector de arenavirus de tipo salvaje (FIG. 1) para retener al menos los elementos reguladores esenciales en las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' de ambos segmentos y/o también las regiones intergénicas (IGR). Sin estar ligado a la teoría, los factores de transacción mínimos para la expresión génica en las células infectadas permanecen en el genoma del vector como ORF que se pueden expresar, pero se pueden colocar de manera diferente en el genoma y se pueden colocar bajo el control de un promotor diferente al natural, o puede expresarse a partir de sitios de entrada de ribosomas internos. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un antígeno del HBV se transcribe a partir de uno de los promotores de arenavirus endógenos (es decir, UTR 5’, UTR 3’ del segmento S, UTR 5’, UTR 3’ del segmento L). En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica un antígeno del HBV se expresa a partir de secuencias promotoras heterólogas introducidas que pueden ser leídas por la ARN polimerasa dependiente de ARN viral, por la ARN polimerasa I celular, la ARN polimerasa II o la ARN polimerasa III, como duplicaciones de secuencias de promotores virales que se encuentran naturalmente en las UTR virales, el promotor de ARN ribosomal 28S, el promotor de beta-actina o el promotor de ARN ribosomal 5S, respectivamente. En ciertas realizaciones, los ácidos ribonucleicos que codifican antígenos del HBV se transcriben y traducen por sí mismos o como lectura mediante fusión a ORF de proteína de arenavirus, y la expresión de proteínas en la célula huésped puede mejorarse introduciendo en la secuencia de transcripción viral en los uno o más lugares apropiados, p. ej., dos, tres o cuatro sitios internos de entrada al ribosoma.
En ciertas realizaciones, para uso con las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria, hay una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S en donde (i) un ORF está en una posición diferente a la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) se ha eliminado o inactivado funcionalmente un ORF que codifica GP o NP, de manera que el virus resultante no puede producir más partículas de virus de progenie infecciosas. En una realización específica, se elimina un ORF y se reemplaza con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En otra realización específica, se eliminan dos ORF y se reemplazan con un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otras realizaciones específicas, se eliminan tres ORF y se reemplazan con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En realizaciones específicas, el ORF que codifica GP se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En otras realizaciones específicas, el Or F que codifica NP se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En realizaciones aún más específicas, el ORF que codifica el NP y el ORF que codifica la GP se eliminan y reemplazan con uno o dos ORF heterólogos (p. ej., que codifica uno o dos antígenos del HBV) de un organismo que no sea una partícula de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) un segmento L y dos segmentos S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; (iii) uno o más ORF heterólogos (p. ej., que codifican uno o más antígenos del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus.
En ciertas realizaciones, para uso con las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria, hay una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S en la que (i) un ORF está en una posición diferente a la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) un o Rf que codifica la proteína Z, y/o la proteína L se ha eliminado o inactivado funcionalmente, de modo que el virus resultante no puede producir más partículas virales descendientes infecciosas. En una realización específica, se elimina un ORF y se reemplaza con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En otra realización específica, se eliminan dos ORF y se reemplazan con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En realizaciones específicas, el ORF que codifica la proteína Z se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En otras realizaciones específicas, el ORF que codifica la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus. En realizaciones aún más específicas, el ORF que codifica la proteína Z y el ORF que codifica la proteína L se eliminan y reemplazan con un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de una partícula de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) dos segmentos L y un segmento S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; (iii) un ORF heterólogo (p. ej., que codifica un antígeno del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada para uso con las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria comprende una partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S) que i) está modificado para transportar un ORF en una posición no natural; ii) se elimina un ORF que codifica GP, NP, proteína Z o proteína L; iii) el ORF que se extrae se reemplaza con uno o más ORF heterólogos (p. ej., que codifican uno o más antígenos del HBV) de un organismo distinto de un arenavirus.
En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV puede basarse en el Clon 13 de LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV puede basarse en la cepa MP de LCMV. La secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 12. En ciertas realizaciones, la secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV es la secuencia establecida en SEQ ID NO: 11. La secuencia del L El segmento del clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 7. La secuencia del segmento S de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 14. La secuencia del segmento L de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 13
En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos del HBV puede basarse en una cepa específica del virus Junín. Las cepas del virus Junín incluyen las cepas vacunales XJ13, XJ#44 y Candid#1, así como IV4454, un aislado humano. En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos del HBV se basa en la cepa Candid #1 del virus Junín.
En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus infecciosa deficiente en replicación en el contexto de la invención comprende una secuencia de nucleótidos o un fragmento de la misma seleccionado de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, o una combinación de los mismos.
En ciertas realizaciones, se describe en la presente memoria una partícula de arenavirus infecciosa con deficiencia de replicación que comprende una secuencia de nucleótidos, o una combinación de secuencias de nucleótidos, seleccionada del grupo que consiste en:
• una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del virus de la Hepatitis B o un fragmento antigénico de la misma;
• una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del virus de la hepatitis B o un fragmento antigénico de la misma; y
• una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del virus de la hepatitis B o fragmentos antigénicos de las mismas;
y donde la partícula de arenavirus es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína pre-S2/S del HBV, la proteína HBc, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, o un fragmento antigénico de las mismas.
En ciertas realizaciones, el vector de arenavirus infeccioso deficiente en replicación está trisegmentado.
(b) Vectores de arenavirus trisegmentados competentes para la replicación
En ciertas realizaciones, para uso con las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria es un vector de arenavirus trisegmentado, competente para la replicación. En ciertas realizaciones, el vector de arenavirus es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S que no se recombina en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación.
En ciertas realizaciones, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV para su uso con las composiciones y los métodos descritos en la presente memoria se modifica para llevar un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En algunas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus se selecciona del grupo que consiste en: (i) un segmento S, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (ii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iv) un segmento S, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (vii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (viii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (ix) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (x) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (xi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y (xii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus.
En algunas realizaciones, la UTR 3’ de arenavirus es la UTR 3’ del segmento S de arenavirus o del segmento L de arenavirus. En ciertas realizaciones, la UTR 5' de arenavirus es la UTR 5' del segmento S de arenavirus o el segmento L de arenavirus.
Para su uso con las composiciones y métodos, en la presente memoria se proporcionan partículas de arenavirus trisegmentadas con reordenamientos de sus ORF. En un aspecto, para su uso con las composiciones y métodos, se proporciona en la presente memoria una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada no se recombina en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En otra realización específica más, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende los cuatro o Rf de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es competente para la replicación e infecciosa. La Figura 2 muestra representaciones esquemáticas de ejemplo de la organización genómica de un vector LCMV trisegmentado competente para la replicación (Figs. 2B-C). La Figura 2C muestra una representación esquemática de ejemplo de la organización genómica del vector LCMV trisegmentado competente para la replicación que no puede recombinarse en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. En comparación, la Figura 2A muestra el vector LCMV bisegmentado de tipo salvaje.
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria puede estar bajo el control de una UTR 3’ de arenavirus o una UTR 5’ de arenavirus. En realizaciones más específicas, la UTR 3' trisegmentada de arenavirus es la UTR 3' de uno o más segmentos S de arenavirus. En otra realización específica, la UTR 3' trisegmentada de arenavirus es la UTR 3' de uno o más segmentos L de arenavirus. En realizaciones más específicas, la UTR 5' trisegmentada de arenavirus es la UTR 5' de uno o más segmentos S de arenavirus. En otras realizaciones específicas, la UTR 5' es la UTR 5' de uno o más segmentos L de arenavirus.
En otras realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria puede estar bajo el control del elemento de secuencia terminal conservado de arenavirus (las regiones de 19-20 nt de los terminales 5' y 3') (véase p. ej., Pérez & de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194).
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la UTR 5' (véase p. ej., Albariño et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En otra realización, el ORF que codifica GP, NP, proteína Z, proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la UTR 3' (véase p. ej., Albariño et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, el elemento promotor de la UTR 5' es el elemento promotor de la UTR 5' del segmento o segmentos S o L. En otra realización específica, el elemento promotor de la UTR 3' es el elemento promotor de la la UTR 3' del segmento o segmentos S o del segmento o segmentos L.
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control de una UTR 3' de arenavirus truncada o una UTR 5' de arenavirus truncada (véase p. ej., Pérez & de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194; Albariño et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, la UTR 3' truncada es la UTR 3' del segmento S o L del arenavirus. En realizaciones más específicas, la UTR 5’ truncada es la UTR 5’ del segmento(s) S o segmento(s) L de arenavirus.
En un aspecto, para su uso con las composiciones y métodos, se proporciona en la presente memoria una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días o al menos 100 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de la recombinación (RAG1), y haber sido infectado con 104 UFP de la partícula de arenavirus trisegmentada. En otras realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 pases, al menos 20 pases, al menos 30 pases, en al menos 40 pases, o al menos 50 pases.
La partícula de arenavirus trisegmentada con todos los genes virales en su respectiva posición de tipo salvaje es conocida en la técnica. (p. ej., Emonet et al., 2011 J. Virol., 85(4):1473; Popkin et al., 2011, J. Virol, 85(15):7928). En particular, el genoma de arenavirus trisegmentado consiste en un segmento L y dos segmentos S, en el que un ORF heterólogo (p. ej., a GFP) se inserta en una posición en cada segmento S. Más específicamente, un segmento S codifica GP y g Fp , respectivamente. El otro segmento S codifica GFP y NP, respectivamente. El segmento L codifica la proteína L y la proteína Z. Todos los segmentos están flanqueados por las respectivas UTR 5' y 3'.
En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada para uso con las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria, que une los dos ORF de arenavirus en uno en lugar de dos segmentos separados, da como resultado un promotor no funcional. (es decir, un segmento genómico de la estructura: UTR 5’.............. UTR 5’ o una UTR 3’........................UTR 3’), en donde cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia repetida invertida del otro extremo del mismo genoma.
En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S se ha modificado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S se ha modificado para transportar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición diferente que la posición de tipo salvaje. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S comprende un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada se han modificado para llevar uno de sus ORF en una posición distinta a la posición de tipo salvaje. En realizaciones más específicas, los dos segmentos S comprenden un complemento completo de los ORF del segmento S. En ciertas realizaciones específicas, el segmento L se ha modificado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje o el segmento L puede ser el segmento genómico de tipo salvaje.
En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos S puede ser:
(i) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
(ii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
(iii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
(iv) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
(v) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la L está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y
(vi) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus.
En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (es decir, dos ORF de segmento S de tipo salvaje p. ej., GP o NP). En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un Or F duplicado (p. ej., (GP, GP)) o dos ORF duplicados (p. ej., (GP, GP) y (NP, NP)).
La Tabla 1A, a continuación, es una ilustración de ejemplo de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, donde la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una replicación. -partícula viral bisegmentada competente y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante se compone de dos UTR 3’ en lugar de una UTR 3’ y una UTR 5’).
Tabla 1A
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En ciertas realizaciones, el IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser un IGR del segmento S o del segmento L de arenavirus; el IGR entre la posición tres y cuatro puede ser un segmento S de arenavirus o un IGR de segmento L; y el IGR entre la posición cinco y seis puede ser un IGR del segmento L de arenavirus. En una realización específica, el IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser un IGR del segmento S de arenavirus; el IGR entre la posición tres y cuatro puede ser un IGR del segmento S de arenavirus; y el IGR entre la posición cinco y seis puede ser un IGR del segmento L de arenavirus. En ciertas realizaciones, también son posibles otras combinaciones. Por ejemplo, una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada con capacidad de replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante se compone de dos UTR 5’ en lugar de una UTR 3’ y una UTR 5’).
En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S restaura un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otras realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.
En un aspecto, para su uso con las composiciones y métodos, se proporciona en la presente memoria una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, o al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días, al menos 100 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de la recombinación (RAG1), y haber sido infectado con 104 PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada. En otras realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 pases, 20 pases, 30 pases, 40 pases o 50 pases.
En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada para uso con las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria, que une los dos ORF de arenavirus en uno en lugar de dos segmentos separados da como resultado un promotor no funcional (es decir, un segmento genómico de la estructura: UTR 5’............. UTR 5’ o una UTR 3’...............UTR 3’), donde cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia repetida invertida del otro extremo del mismo genoma.
En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S se ha modificado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S se ha modificado para llevar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición diferente que la posición de tipo salvaje. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S comprende un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada se han modificado para llevar uno de sus ORF en una posición distinta a la posición de tipo salvaje. En realizaciones más específicas, los dos segmentos L comprenden un complemento completo de los ORF del segmento L. En ciertas realizaciones específicas, el segmento S se ha modificado para llevar uno de sus ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje o el segmento S puede ser el segmento genómico de tipo salvaje.
En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos L puede ser:
(i) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
(ii) un segmento L, en donde el ORF que codifica NP está bajo el control de una UTR 5’ de arenavirus;
(iii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iv) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
(v) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y (vi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y segmentos S puede comprender un ORF duplicado (es decir, dos ORF de segmento L de tipo salvaje p. ej., proteína Z o proteína L). En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S puede comprender un ORF duplicado (p. ej., (proteína Z, proteína Z)) o dos ORF duplicados (p. ej., (proteína Z, proteína Z) y (proteína L, proteína L)).
La Tabla 2A, a continuación, es una ilustración de ejemplo de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S, donde la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos L en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento L resultante se compone de dos UTR 3’ en lugar de una UTR 3’ y una UTR 5’). Basándose en la Tabla 3, se podrían predecir combinaciones similares para generar una partícula de arenavirus formada por dos UTR 5’ en lugar de una UTR 3’ y una UTR 5’.
Tabla 2A
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En ciertas realizaciones, el IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser un IGR del segmento S o del segmento L de arenavirus; el IGR entre la posición tres y cuatro puede ser un segmento S de arenavirus o un IGR de segmento L; y el IGR entre la posición cinco y seis puede ser un IGR del segmento S de arenavirus. En una realización específica, el IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser un IGR del segmento L de arenavirus; el IGR entre la posición tres y cuatro puede ser un IGR del segmento L de arenavirus; y el IGR entre la posición cinco y seis puede ser un IGR del segmento S de arenavirus. En ciertas realizaciones, también son posibles otras combinaciones.
En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento L y un segmento S de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S restaura un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otras realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento L y un segmento S en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.
En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria es una partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria está atenuada. En una realización particular, la partícula de arenavirus trisegmentada se atenúa de manera que el virus permanece, al menos parcialmente, competente para la replicación y puede replicarse. en vivo, pero solo puede generar cargas virales bajas que dan como resultado niveles subclínicos de infección que no son patogénicos. Dichos virus atenuados pueden usarse como una composición inmunogénica. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus es infecciosa pero incapaz de producir descendencia infecciosa adicional en células que no se complementan.
En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus y la partícula de arenavirus respectiva o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender un ORF heterólogo. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus y la partícula de arenavirus respectiva o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender un gen de interés. En realizaciones más específicas, el ORF heterólogo o el gen de interés codifica un antígeno. En realizaciones más específicas, el ORF heterólogo o el gen de interés codifica un antígeno del HBV o un fragmento antigénico del mismo (véase Sección 6.2).
En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender uno o más ORF heterólogos o uno o más genes de interés. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender al menos aproximadamente ORF heterólogo, al menos dos ORF heterólogos, al menos tres ORF heterólogos o más ORF heterólogos. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada comprende al menos aproximadamente gen de interés, al menos dos genes de interés, al menos tres genes de interés o más genes de interés. En realizaciones más específicas, el uno o más ORF heterólogos o los genes de interés codifican uno o más antígenos del HBV o fragmentos antigénicos de los mismos (véase Sección 6.2).
En ciertas realizaciones, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria es una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S.
6.2 Antígenos del HBV
En ciertas realizaciones, los antígenos para uso con los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son antígenos del HBV.
En ciertas realizaciones, los ORF de dos o más antígenos del HBV descritos se transcriben como un solo transcrito.
En ciertas realizaciones, cualquier genotipo o subgenotipo de HBV humano o cualquier aislado clínico de HBV humano puede usarse con la presente invención para obtener los antígenos para la generación de los vectores arenavirales descritos en la presente memoria. Dichos genotipos y subgenotipos del HBV incluyen los genotipos A-J y los subgenotipos A1-A6, B1-B4, C1-C6, D1-D7 y F1-F4.
En ciertas realizaciones, el antígeno de HBV puede ser un ortólogo de antígeno de HBV, por ejemplo, un antígeno de HBV de mamífero (es decir, primate no humano, cerdo, perro, gato o caballo).
(a) antígenos de la proteína pre-S2/S
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma. En ciertas realizaciones, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más aminoácidos de HBV pre-S2 proteína /S. En ciertas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de la proteína pre-S2/S del HBV. En ciertas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
(b) antígenos de la proteína HBc
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína HBc del HBV o un fragmento de la misma. En ciertas realizaciones, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150 o más aminoácidos de la proteína HBc del HBV. En ciertas realizaciones, el antígeno es un fragmento antigénico de HBc. En ciertas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
(c) antígenos de la proteína HBs
En ciertos ejemplos, fuera del contexto de la invención, el antígeno es la proteína HBs del HBV o un fragmento de la misma. En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos de la proteína HBs del HBV. En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento antigénico de HBs.
En ciertos ejemplos, el antígeno es el polipéptido pequeño HBs del HBV (p .ej., "S") o un fragmento del mismo. En ciertos ejemplos, el antígeno es el polipéptido medio HBs del HBV (p. ej., "pre-S2/S") o un fragmento del mismo. En ciertos ejemplos, el antígeno es el polipéptido grande HBs del HBV (p. ej., "pre-S1/pre-S2/S") o un fragmento del mismo. En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más aminoácidos del polipéptido pequeño HBs del HBV. En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más aminoácidos del medio polipéptido HBs del HBV. En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o más aminoácidos del polipéptido grande HBs del HBV.
(d) Proteínas de fusión HBs y HBc
En ciertas realizaciones, el antígeno es una proteína de fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas. En ciertas realizaciones, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o más aminoácidos de una proteína de fusión de HBs y HBc. En ciertas realizaciones, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
(e) antígenos de la proteína HBe
En ciertos ejemplos, fuera del contexto de la invención, el antígeno es la proteína HBe del HBV o un fragmento de la misma. En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más aminoácidos de la proteína HBe del HBV . En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento antigénico de HBe. En ciertos ejemplos, el antígeno está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 26. En ciertos ejemplos, el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 26.
(f) Antígenos de la proteína polimerasa
En ciertos ejemplos, fuera del contexto de la invención, el antígeno es una proteína polimerasa del HBV o un fragmento antigénico de la misma. En ciertos ejemplos, el antígeno es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700 o más amino ácidos de una proteína polimerasa del HBV.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno del HBV pueden introducirse en el genoma de un arenavirus infeccioso mediante la sustitución de la secuencia de ácido nucleico del ORF de la glicoproteína GP, la proteína de matriz Z, la nucleoproteína NP o la proteína polimerasa L. En otros ejemplos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno del HBV se fusiona con el ORF de la glicoproteína GP, la proteína de matriz Z, la nucleoproteína NP o la proteína polimerasa L. La secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno del HBV, una vez insertada en el genoma de un arenavirus infeccioso, pueden transcribirse y/o expresarse bajo el control de uno de los cuatro promotores de arenavirus (UTR 5’ y UTR 3’ del segmento S, y u Tr 5’ y UTR 3’ del segmento L), así como ácidos ribonucleicos que pueden ser insertados con elementos reguladores que pueden ser leídos por la ARN polimerasa dependiente de ARN viral, la ARN polimerasa I celular, la ARN polimerasa II o la ARN polimerasa III, como duplicaciones de secuencias de promotores virales que se encuentran naturalmente en las UTR virales, el promotor de ARN ribosomal 28S, el promotor de beta-actina o el promotor de ARN ribosomal 5S, respectivamente. Los ácidos nucleicos que codifican el antígeno del HBV se pueden transcribir y/o expresar por sí mismos o mediante lectura mediante fusión con ORF y genes de arenavirus, respectivamente, y/o en combinación con uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, sitios internos de entrada a los ribosomas.
En una realización, el antígeno es útil para la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas. En una realización específica, el antígeno se deriva de HBV. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína pre-S2/S del HBV. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HBc del HBV.
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
(g) Sustitución del ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica uno, dos o más antígenos del HBV descritos en la presente memoria.
En una realización, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno del HBV. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de pre-S2/S. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, pre-S2/S o un fragmento de pre-S2/S.
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150 o más aminoácidos. de un gen producto de un gen de la proteína HBc del HBV o un fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de HBc. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a, HBc o un fragmento de HBc.
En ciertos ejemplos, fuera del contexto de la invención, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un antígeno que es un fragmento de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos de un producto génico de un gen de la proteína HBs del HBV o un fragmento del mismo. En ciertos ejemplos, fuera del contexto de la invención, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican un fragmento antigénico de HBs. En ciertos ejemplos, fuera del contexto de la invención, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos que incluyen, pero no se limitan a HBs o un fragmento de HBs.
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica dos o más proteínas del HBV o fragmentos de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o más aminoácidos de los mismos. En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica HBs y HBc.
En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la glicoproteína del arenavirus se sustituye por una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más de la proteína pre-S2/S o un fragmento antigénico de la misma, la proteína HBc o un fragmento antigénico de la misma,
6.3 Generación de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV
En general, las partículas de arenavirus se pueden producir de forma recombinante mediante técnicas genéticas inversas estándar como se describe para LCMV (L. Flatz, A. Bergthaler, J. C. de la Torre y D. D. Pinschewer, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668, 2006; A. B. Sánchez y J. C. de la Torre, Virology 350:370, 2006; E. Ortiz-Riano, B.Y. Cheng, J. C. de la Torre, L. Martínez-Sobrido. J Gen Virol. 94:1175-88, 2013).
(a) Arenavirus deficiente en replicación
Para generar arenavirus infecciosos deficientes en replicación para su uso con la presente invención, se pueden usar estas técnicas, sin embargo, el genoma del virus rescatado se modifica como se describe en la Sección 6.1. Estas modificaciones pueden ser: i) uno o más, por ejemplo, dos, tres o cuatro, de los cuatro ORF de arenavirus (glicoproteína (GP); nucleoproteína (NP); la proteína de matriz Z; la ARN polimerasa L dependiente de ARN) se eliminan o inactivado funcionalmente para evitar la formación de partículas infecciosas en células normales, aunque todavía permite la expresión génica en células huésped infectadas con vector de arenavirus; y ii) pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican antígenos de HBV. Los virus infecciosos, deficientes en replicación, como se describe en la presente memoria, se pueden producir como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2009/083210 (Numero de solicitud PCT/EP2008/010994) y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2014/140301 (Numero de solicitud PCT/EP2014/055144),
Una vez generados a partir del ADNc, los arenavirus infecciosos deficientes en replicación proporcionados en la presente memoria pueden propagarse en células complementarias. Las células complementarias son células que brindan la funcionalidad que se eliminó del arenavirus deficiente en replicación mediante la modificación de su genoma (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP).
Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los genes virales en los vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la eliminación de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en las células proporcionando en trans los genes virales eliminados, por ejemplo, la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular complementaria, denominada en lo sucesivo células C, se genera mediante la transfección de una línea celular de mamífero tal como BHK-21, HEK 293, VERO u otra (aquí se tomará BHK-21 como ejemplo) con uno o más plásmido(s) para la expresión de los genes virales de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El (los) plásmido (s) C expresa(n) el (los) gen (es) viral (es) eliminado (s) en el vector de arenavirus que se generará bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, por ejemplo, un promotor de polimerasa II de mamífero como el CMV o EF1alfa promotor con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamíferos, por ejemplo, resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, por ejemplo, casete de expresión de polimerasa II como se indicó anteriormente, o se siguen los transcritos de genes virales. por un sitio de entrada al ribosoma interno, como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de los mamíferos. Para la producción en E. coli, el plásmido cuenta además con un marcador de selección bacteriana, como un casete de resistencia a la ampicilina.
Las células que se pueden usar, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con los plásmidos de complementación usando cualquiera de las estrategias comúnmente usadas, como protocolos basados en liposomas con fosfato de calcio o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C de alta expresión se identifican mediante procedimientos de transferencia Western o citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) viral(es) de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de forma estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar los genes virales que faltan en cada uno de los pasos en donde se utilizarán células C a continuación. Además, se puede utilizar un virus auxiliar para proporcionar la funcionalidad que falta en trans.
Los plásmidos que se pueden usar pueden ser de dos tipos: i) Dos plásmidos, denominados plásmidos TF para expresar intracelularmente en células C los factores de transacción mínimos del arenavirus, de los cuales se deriva el vector de arenavirus deficiente en replicación, p. ej., proteínas NP y L de LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos del genoma del vector de arenavirus, p. ej., los segmentos con modificaciones diseñadas. Los plásmidos TF expresan las proteínas NP y L del respectivo vector de arenavirus bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamíferos, normalmente, p. ej., un promotor de la polimerasa II de mamíferos como el CMV o el promotor alfa EF1, cualquiera de ellos preferentemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos del genoma pequeño (S) y grande (L) del vector. Por lo general, se pueden usar casetes de expresión impulsados por polimerasa I o casetes de expresión impulsados por ARN polimerasa (T7-) del bacteriófago T7, este último preferentemente con una ribozima 3'-terminal para el procesamiento de la transcripción primaria para producir el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en células C debe proporcionarse mediante la inclusión en el proceso de recuperación de un plásmido de expresión adicional, construido de manera análoga a los plásmidos TF, siempre que T7, o las células C se construyan para adicionalmente expresar T7 de manera estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia del genoma y los factores de transacción pueden transcribirse mediante los promotores T7, poll y polII de un plásmido.
Para la recuperación del vector de arenavirus, se pueden usar los siguientes procedimientos. Primer día: las células C, normalmente con una confluencia del 80 % en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia del genoma y los factores de transacción pueden transcribirse mediante los promotores T7, poll y polII de un plásmido. Para esto, se puede explotar cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación.
3-5 días después: el sobrenadante del cultivo (preparación del vector de arenavirus) se recolecta, se divide en alícuotas y se almacena a 4 °C, -20 °C o -80 °C, dependiendo de cuánto tiempo deba almacenarse el vector de arenavirus antes de su uso. Luego, el título infeccioso de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunoenfoque en células C.
La invención además se refiere a la expresión de un antígeno del HBV en un cultivo celular en donde el cultivo celular está infectado con un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV. Cuando se usa para la expresión de un antígeno del HBV en células cultivadas, se pueden usar los dos procedimientos siguientes:
i) El tipo de célula de interés se infecta con la preparación de vector de arenavirus descrita en la presente memoria a una multiplicidad de infección (MOI) de uno o más, por ejemplo, dos, tres o cuatro, lo que da como resultado la producción del antígeno del HBV en todas las células poco después. infección.
ii) Alternativamente, se puede usar una MOI más baja y se pueden seleccionar clones de células individuales por su nivel de expresión del antígeno del HBV impulsado por el virus. Posteriormente, los clones individuales se pueden expandir infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente del enfoque, el antígeno del HBV se puede recolectar (y purificar) posteriormente del sobrenadante del cultivo o de las propias células, según las propiedades del antígeno del HBV producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y se pueden considerar otras formas de impulsar la expresión del antígeno del HBV usando arenavirus infecciosos deficientes en replicación como vectores.
Alternativamente, se puede usar un sistema de rescate que consiste en tres plásmidos: (1) el primer plásmido expresa la proteína NP por transcripción a través de la polimerasa II y posterior traducción en células transfectadas; (2) el segundo plásmido da lugar al segmento L (de cadena negativa) del genoma de LCMV por transcripción a través de la polimerasa I, así como a la proteína L por transcripción a través de la polimerasa II del mismo molde en la dirección opuesta al promotor de la polimerasa I; (3) el tercer plásmido da lugar al segmento S del genoma del LCMV (que codifica la secuencia codificante del antígeno en lugar de la glicoproteína del LCMV) a través de la transcripción por la polimerasa I. Se utilizan 3 gg de cada plásmido para la electroporación de las células C, seguido de siembra de células en placas de 6 pozos e incubación a 37°C. Después de la incubación, las células y el sobrenadante de las transfecciones se combinan con células C recién sembradas, y los vectores se recolectan y eliminan de las células y los desechos en un punto de tiempo definido después de la infección. Una vez que se ha generado el vector, se puede insertar un ácido nucleico que codifica un antígeno de un virus oncogénico y/o un péptido, polipéptido o proteína inmunomodulador (Véase la Sección 6.2) en un plásmido del que se extrae un segmento genómico de un vector infeccioso deficiente en replicación se transcribe mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica.
Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los genes virales en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la eliminación de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionan los genes virales eliminados o funcionalmente inactivados (p. ej., la GP) en trans. El virus resultante en sí mismo es infeccioso pero no puede producir más partículas de progenie infecciosas en células que no se complementan debido a la falta de genes virales eliminados o inactivados funcionalmente (p. ej., la GP). La célula complementaria puede proporcionar la funcionalidad faltante ya sea por transfección estable, transfección transitoria o por infección con un virus auxiliar que exprese la funcionalidad faltante.
En ciertas realizaciones, la célula complementaria proporciona el gen viral que se ha eliminado o inactivado funcionalmente del genoma del vector de arenavirus. En una realización específica, la célula complementaria proporciona el gen viral de una cepa viral que es la misma que la cepa viral que se usó para generar el genoma del vector de arenavirus. En otra realización, la célula complementaria proporciona el gen viral de una cepa viral que es diferente de la cepa viral que se usó para generar el genoma del vector de arenavirus. Por ejemplo, el gen viral proporcionado en la célula complementaria se obtiene de la cepa MP de LCMV y codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, 16, 17 o 18. En otro ejemplo, el gen viral proporcionado en la célula complementaria se obtiene de la cepa Clon 13 de LCMV y codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21,22, 23 o 24. En otro ejemplo, se obtiene el gen viral proporcionado en la célula complementaria de la cepa WE de LCMV y codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa MP de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa MP de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene del Clon 13 de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa Clon 13 de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa Clon 13 de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene de la cepa MP de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O: 22.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene del Clon 13 de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene de la cepa MP de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso deficiente en replicación está trisegmentado.
(b) Arenavirus trisegmentados, competentes para la replicación
En la presente memoria se proporcionan métodos in vitro de generación de vectores de arenavirus competentes para la replicación. Los virus trisegmentados infecciosos, competentes para la replicación, como se describe en la presente memoria, se pueden producir como se describe en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No.
62/079,493.
En ciertas realizaciones, el método para generar una partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) transfectar en una célula huésped los ADNc de un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S; (ii) transfectar en una célula huésped plásmidos que expresan los factores mínimos NP y L que actúan en trans del arenavirus; (iii) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y (iv) recolectar la partícula de arenavirus.
Una vez generada a partir del ADNc, la partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, infecciosa y competente para la replicación) puede propagarse. En ciertas realizaciones, las partículas de arenavirus trisegmentadas se pueden propagar en cualquier célula huésped que permita que el virus crezca hasta títulos que permitan los usos del virus como se describe en la presente memoria. En una realización, la célula huésped permite que la partícula de arenavirus trisegmentada crezca hasta títulos comparables a los determinados para el tipo salvaje correspondiente.
En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en células huésped. Los ejemplos específicos de células huésped que se pueden usar incluyen BHK-21, HEK 293, VERO u otras. En una realización específica, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en una línea celular.
En ciertas realizaciones, las células huésped se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmidos. Los plásmidos expresan los segmentos genómicos de arenavirus que se van a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, p. ej., que consisten en un promotor y un terminador de la polimerasa I.
En realizaciones específicas, las células huésped se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmidos. Los plásmidos expresan los genes virales que se van a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, p. ej., que consisten en un promotor y un terminador de la polimerasa I.
Los plásmidos que se pueden usar para generar un arenavirus trisegmentado que comprende un segmento L y dos segmentos S pueden incluir: i) dos plásmidos, cada uno de los cuales codifica el segmento del genoma S, p. ej., plásmidos de expresión del segmento S impulsados por pol-I, ii) un plásmido que codifica el Segmento del genoma L, p. ej., un plásmido de expresión del segmento L impulsado por pol-I. Los plásmidos necesarios para el arenavirus trisegmentado que comprende dos segmentos L y un segmento S son: i) dos plásmidos, cada uno de los cuales codifica el segmento del genoma L, p. ej., pol-L, ii) un plásmido que codifica el segmento del genoma S, p. ej., pol-I S.
En ciertas realizaciones, los plásmidos que codifican una polimerasa de arenavirus que dirige la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales pueden incorporarse a la mezcla de transfección. Por ejemplo, un plásmido que codifica la proteína L y un plásmido que codifica NP (pC-L y pC-NP, respectivamente). La proteína L y NP son los factores mínimos que actúan en trans necesarios para la transcripción y replicación del ARN viral. Alternativamente, la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales, junto con la proteína NP y L se puede realizar usando un casete de expresión con promotores pol-I y pol-II leyendo desde lados opuestos en los ADNc de los segmentos L y S de dos plásmidos separados, respectivamente.
Además, los plásmidos presentan un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, p. ej., el casete de expresión de la polimerasa II como se indicó anteriormente, o los transcritos de genes virales. van seguidos de un sitio de entrada al ribosoma interno, como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido del marcador de resistencia de los mamíferos. Para la producción en E.coli, el plásmido cuenta además con un marcador de selección bacteriana, como un casete de resistencia a la ampicilina.
La transfección de células BHK-21 con plásmidoss se puede realizar utilizando cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de alta expresión se identifican utilizando procedimientos de transferencia Western o citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) viral(es) de interés.
Por lo general, se pueden usar casetes de expresión impulsados por ARN polimerasa I, casetes impulsados por ARN polimerasa II o casetes impulsados por ARN polimerasa de bacteriófago T7, este último preferiblemente con una ribozima 3'-terminal para el procesamiento de la transcripción primaria para producir el extremo correcto. En ciertas realizaciones, los plásmidos que codifican los segmentos genómicos de arenavirus pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores de transacción pueden transcribirse mediante los promotores T7, poll y polII de un plásmido.
Para recuperar el vector arenavirus trisegmentado, se prevén los siguientes procedimientos. Primer día: las células, normalmente con una confluencia del 80 % en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de plásmidos, como se ha descrito anteriormente. Para ello, se pueden aprovechar las estrategias de uso común, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación.
3-5 días después: el sobrenadante cultivado (preparación del vector de arenavirus) se recolecta, se divide en alícuotas y se almacena a 4 °C, -20 °C o -80 °C, dependiendo de cuánto tiempo deba almacenarse el vector de arenavirus antes de su uso. El título infeccioso de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunoenfoque. Como alternativa, las células transfectadas y el sobrenadante se pueden pasar a un recipiente más grande (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T75) el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del paso.
La presente solicitud se refiere además a la expresión de un ORF heterólogo (p. ej., un antígeno del HBV), en donde un plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar un ORF heterólogo. El ORF heterólogo se puede incorporar al plásmido utilizando enzimas de restricción. En ciertas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno de HBV. En ciertas realizaciones, el plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar uno o más ORF heterólogos. En ciertas realizaciones, los ORF heterólogos codifican uno o más antígenos de HBV.
6.4 Ácidos nucleicos, sistemas vectoriales y líneas celulares
En una realización, se describe en la presente memoria una secuencia de ácido nucleico que es el ADNc del segmento genómico grande (segmento L) de un arenavirus infeccioso descrito en la presente memoria, en la que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico, y el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno del HBV. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En una realización, se describe en la presente memoria una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso descrito en la presente memoria, en la que un ORF del segmento genómico se elimina o inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende un nucleótido secuencia que codifica un antígeno del HBV. En otra realización, en la presente memoria se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso descrito en la presente memoria, en la que el ORF del gen de la glicoproteína se elimina o inactiva funcionalmente y en donde el segmento genómico corto comprende un nucleótido secuencia que codifica un antígeno del HBV. En ciertas realizaciones más específicas, el antígeno de HBV es un antígeno descrito en la Sección 6.2.
En ciertas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden derivar de una cepa particular de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el ácido nucleico se deriva del Clon 13 de LCMV. En otras realizaciones específicas, el ácido nucleico se deriva de la cepa MP de LCMV.
En una realización más específica, en la presente memoria se proporciona un ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus que comprende una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % , al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID n O: 2 o SeQ ID NO: 3. En otra realización, se proporciona en el presente un ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de nucleótido 1639 a 3315 de SEQ ID NO: 11; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de HBV.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de expresión cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97%, 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por 1639 a 3315 de SEQ ID NO: 11; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de HBV.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos 1640 a 3316 de SEQ ID NO: 12; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de HBV.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de expresión cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos codificada por 1640 a 3316 de SEQ ID NO: 12; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno del HBV
En una realización, en la presente memoria se describe un sistema de vector que comprende uno o más vectores que juntos comprenden el genoma de una partícula de arenavirus infecciosa descrita en la presente memoria. Específicamente, en la presente memoria se proporciona un sistema de vector en donde uno o más vectores comprenden dos segmentos genómicos de arenavirus, a saber, un segmento L y un segmento S, de un arenavirus infeccioso descrito en la presente memoria. Tal sistema de vector puede comprender (en una o más moléculas de ADN separadas):
Un segmento genómico de arenavirus S que está modificado de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico S modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y un segmento genómico de arenavirus L que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de HBV;
Un segmento genómico de arenavirus L que se modifica de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico L modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y un segmento genómico de arenavirus S que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica en (sentido o antisentido) un antígeno del HBV;
Un segmento genómico S de arenavirus que está modificado de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico S modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y en donde el segmento genómico S de arenavirus comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de HBV y que comprende un segmento genómico de arenavirus L de tipo salvaje; o
Un segmento genómico de arenavirus L que está modificado de tal manera que una partícula de arenavirus que lleva este segmento genómico L modificado no puede producir partículas de virus de progenie infecciosas y en donde el segmento genómico de arenavirus L comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (en sentido o antisentido) un antígeno de HBV y que comprende un segmento genómico de arenavirus S de tipo salvaje.
En el contexto de la invención, en la presente memoria se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus (p. ej., LCMV) en donde el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que comprende:
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S de hepatitis B o un fragmento antigénico de la misma;
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del virus de la hepatitis B o un fragmento antigénico de la misma; o
una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del virus de la hepatitis B o fragmentos antigénicos de las mismas;
y en donde un vector viral que comprende el segmento genómico de arenavirus es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína pre-S2/S del HBV, la proteína HBc, la fusión de proteínas HBs y HBc, o un fragmento antigénico de las mismas.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento genómico de arenavirus (p. ej., LCMV) en la que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más antígenos del HBV (p. ej., uno o más de los enumerados en el párrafo anterior).
En otra realización, una célula puede comprender un ácido nucleico o un sistema de vector descrito anteriormente en esta sección. También se describen líneas celulares derivadas de tales células, cultivos que comprenden tales células y métodos para cultivar tales células infectadas con ácidos nucleicos o sistemas de vectores. En ciertas realizaciones, la célula puede comprender un ácido nucleico que comprende el segmento genómico grande (segmento L) de un arenavirus infeccioso descrito en la presente memoria, en el que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico, y el segmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno del HBV.
En otras realizaciones, la célula puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comprende el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso proporcionado en la presente memoria, en la que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En otras realizaciones, una célula puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comprende el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso proporcionado en la presente memoria, en la que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En ejemplos, fuera del contexto de la invención, una célula puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comprende el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso, en la que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En otras realizaciones, una célula puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comprende el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso proporcionado en la presente memoria, en la que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende al menos aproximadamente dominio de la proteína HBs del HBV y la proteína HBc del HBV.
En otras realizaciones, una célula puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comprende el segmento genómico corto (segmento S) de un arenavirus infeccioso proporcionado en la presente memoria, en la que se elimina o inactiva funcionalmente un ORF del segmento genómico y en donde el segmento genómico corto comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de los antígenos del HBV.
En otra realización, una célula puede comprender dos ácidos nucleicos o sistemas de vectores descritos en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, un ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En ciertas realizaciones, un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En ciertas realizaciones, una célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.
En ciertas realizaciones, un ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos en al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % , 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SeQ iD NO: 15, 16, 17 o 18. En ciertas realizaciones, un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 15, 16, 17 o 18. En ciertas realizaciones, una célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 15, 16, 17 o 18.
En ciertas realizaciones, una proteína aislada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 15, 16, 17 o 18. En ciertas realizaciones, una célula huésped expresa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 15, 16, 17 o 18. En ciertas realizaciones, la célula huésped se cultiva en medio de cultivo celular.
En ciertas realizaciones, un ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 7. En ciertas realizaciones, un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 7. En ciertas realizaciones, una célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 7.
En ciertas realizaciones, un ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos en al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % , 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SeQ iD NO: 21, 22, 23 o 24. En ciertas realizaciones, un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 21, 22, 23 o 24. En ciertas realizaciones, una célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 21,22, 23 o 24.
En ciertas realizaciones, una proteína aislada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 21,22, 23 o 24. En ciertas realizaciones, una célula huésped expresa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 21,22, 23 o 24. En ciertas realizaciones, la célula huésped se cultiva en medio de cultivo celular.
6.5 Métodos de uso
En la presente memoria se proporcionan vectores virales de arenavirus según la invención, para uso en inmunoterapias para infecciones por el virus de la hepatitis B. En una realización, en la presente memoria se proporcionan uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se proporciona en la presente memoria o una composición de los mismos para uso en métodos de tratamiento de una infección en un sujeto que comprende administrar al sujeto uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se proporciona presente o una composición del mismo. En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos son deficientes en replicación. En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos son competentes para la replicación. En una realización específica, un método para tratar una infección comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV proporcionado en la presente memoria o una composición del mismo. El sujeto puede ser un mamífero, como, entre otros, un ser humano, un ratón, una rata, un conejillo de indias, un animal doméstico, como, entre otros, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo. , una cabra, un gato, un perro, un hámster, un burro. En una realización específica, el sujeto es un ser humano.
En otra realización, los métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra el HBV en un sujeto comprenden administrar al sujeto un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo.
En otra realización, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo tienen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV. En otra realización específica, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo están infectados, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV.
En otra realización, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo padecen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV, p. ej., en el hígado En una realización específica, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo padecen, son susceptibles o corren el riesgo de sufrir una infección por el HBV en uno o más órganos del cuerpo, p. ej., el hígado.
En otra realización, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo tienen resultados de prueba (p. ej., resultados de análisis de sangre) que indican daño hepático. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en la sangre que indican daño hepático. En cierta realización, los sujetos tienen niveles de aspartato aminotransferasa (AST) en la sangre que indican daño hepático. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles de fosfatasa alcalina en la sangre que indican daño hepático. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) en la sangre que indican daño hepático. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen uno o más niveles de ALT, AST, fosfatasa alcalina y LDH en la sangre que indican daño hepático.
En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles de alfa-fetoproteína (AFP) en la sangre que indican cáncer de hígado o susceptibilidad al mismo. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles de bilirrubina (p. ej., bilirrubina conjugada) en la sangre que indican daño hepático. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles de albúmina en la sangre que indican daño hepático.
En ciertas realizaciones, los sujetos tienen resultados de ultrasonido abdominal que indican daño hepático. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen resultados de TAC que indican daño hepático. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen resultados de resonancia magnética que indican daño hepático.
En otra realización, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo tienen niveles detectables de antígeno HBs (HBsAg) en la sangre. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles detectables de anticuerpos IgM contra el antígeno HBc (HBcAg) en la sangre. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles detectables de antígeno HBe (HBeAg, la versión extracelular/secretada de la proteína HBc) en la sangre. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles detectables de anticuerpos contra HBsAg en la sangre.
En otra realización, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo tienen niveles persistentes de HBsAg, indicativos de hepatitis crónica. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles persistentes de HBeAg, indicativos de hepatitis crónica. En ciertas realizaciones, los sujetos tienen niveles persistentes de HBsAg y HBeAg, indicativos de hepatitis crónica.
En otra realización, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo sufren síntomas de infección por HBV, que incluyen, pero no se limitan a, pérdida de apetito, fatiga, náuseas, vómitos, picazón, dolor abdominal, hinchazón abdominal o ictericia.
En otra realización, los sujetos a los que se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo sufren manifestaciones del HBV, que incluyen, pero no se limitan a, hepatitis B aguda, infección crónica por el HBV, cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC). En otra realización, el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto con HBV asintomático.
En otra realización, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto de cualquier grupo de edad que padece, es susceptible o corre el riesgo de contraer una infección por el HBV. En una realización específica, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto con un sistema inmunitario comprometido, un sujeto femenino en embarazo, un sujeto que se somete a un trasplante de órgano o de médula ósea, un sujeto que toma medicamentos inmunosupresores, un sujeto sometido a hemodiálisis, un sujeto que tiene cáncer, o un sujeto que padece, es susceptible o está en riesgo de sufrir una infección por HBV. En una realización más específica, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto con un sistema inmunitario comprometido debido a la infección por el VIH, que padece, es susceptible o está en riesgo de padecer una infección por HBV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que es un niño de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padecen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que es un bebé que padece, es susceptible o corre el riesgo de contraer una infección por el HBV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto que es un bebé de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 o 12 meses de edad que padecen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV. En otra realización específica más, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a un sujeto de edad avanzada que padece, es susceptible o está en riesgo de infección por HBV.
En otra realización, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a sujetos con un mayor riesgo de infección por el HBV diseminada. En una realización específica, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a sujetos en período neonatal con un sistema inmunitario neonatal inmaduro. En otra realización, se administra un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo a un sujeto que utiliza fármacos intravenosos con un mayor riesgo de infección por el HBV.
En otra realización, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo se administra a sujetos infectados con uno o más genotipos o subgenotipos del HBV. En ciertas realizaciones, el genotipo es uno o más de los genotipos A-J u otro genotipo. En ciertas realizaciones, el subgenotipo es uno o más subgenotipos A1-A6, B1-B4, C1-C6, D1-D7, F1-F4 u otro subgenotipo.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo a sujetos confiere inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección por el HBV. Sin estar ligado a la teoría, en otra realización, un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo infecta y expresa antígenos de interés en células presentadoras de antígenos (APC) del huésped (p. ej., macrófagos) para la presentación directa de antígenos sobre el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) clase I y II. En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o una composición del mismo a sujetos induce respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas del HBV coproductoras de IFN-y y TNF-a plurifuncionales (el IFN-y es producido por células T CD4+ y T CD8+ y TNF-a es producido por células T CD4+) de gran magnitud para tratar o prevenir una infección por HBV.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por HBV en ausencia de tal tratamiento.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los síntomas de una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o más, en comparación con la manifestación de la síntomas de una infección por el HBV en ausencia de tal tratamiento.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo a sujetos con un sistema inmunitario neonatal inmaduro induce una respuesta de inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o más, en comparación con la respuesta de inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección con HBV en ausencia de tal tratamiento.
En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de ALT en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de AST en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de fosfatasa alcalina en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de LDH en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce uno o más de los niveles de ALT, AST, fosfatasa alcalina y LDH en la sangre.
En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de AFP en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de bilirrubina (p. ej., bilirrubina conjugada) en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo aumenta los niveles de albúmina en la sangre.
En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de HBsAg en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de anticuerpos IgM contra el HBcAg en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de HBeAg en la sangre. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce los niveles de anticuerpos contra el HBsAg en la sangre.
En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce el número de cuerpos de inclusión detectados en las glándulas salivales u otra muestra histológica. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce el número de anticuerpos anti-HBV detectados en una muestra de sangre del paciente. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce la cantidad de HBV detectada en orina, saliva, sangre, lágrimas, semen o leche materna. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce el nivel de virus cultivado a partir de una muestra de orina, frotis faríngeo, lavado bronquial o tejido. En ciertas realizaciones, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo reduce el nivel de virus detectado a través de pruebas de PCR cuantitativas o cualitativas.
Los cambios en la función de respuesta de la inmunidad mediada por células (CMI) frente a una infección por el HBV inducida mediante la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o una composición del mismo en sujetos pueden medirse mediante cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica, incluido, pero no limitado a, citometría de flujo ((véase, p. ej., Perfetto S.P. et al., Nat Rev Immun. 2004; 4(8):648-55), ensayos de proliferación de linfocitos (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 2008; 101:101-4; y Hicks M.J. et al., Am J Clin Pathol. 1983; 80:159-63), ensayos para medir la activación de linfocitos, incluida la determinación de cambios en la expresión de marcadores de superficie después de la activación de la medición de citoquinas de linfocitos T ((véase, p. ej., Caruso A. et al., Cytometry. 1997;27:71-6), ensayos ELISPOT ((véase, p. ej., Czerkinsky CC et al., J Immunol Methods. 1983; 65:109-121; y Hutchings PR et al., J Immunol Methods. 1989; 120:1-8), o ensayos de citotoxicidad de células asesinas naturales (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 2005 mayo; 94(5 Suppl 1 ):S1 -63).
En otra realización, en la presente memoria se describe el uso de un arenavirus infeccioso (p. ej., LCMV) que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria, en donde el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que comprende:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; o
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas;
y en donde el arenavirus es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína pre-S2/S del HBV, la proteína HBc, la fusión de proteínas HBs y HBc, o un fragmento antigénico de las mismas.
En otra realización, en la presente memoria se proporciona un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se reivindica para su uso en métodos para prevenir la transmisión y/o infección del HBV de una madre a un feto, los métodos comprenden administrar a un sujeto en edad fértil el arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV. Véase la Sección 6.2. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto seronegativo en edad fértil un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. En aún otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto en edad fértil con la intención de procrear un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria.
En otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto en edad fértil uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. Véase la Sección 6.2. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto seronegativo en edad fértil uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. En aún otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto en edad fértil con la intención de procrear uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria.
En otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto femenino en embarazo un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto femenino en embarazo una cantidad efectiva de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV descrito en la presente memoria.
En otra realización, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto femenino en embarazo uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. En realizaciones específicas, los métodos para prevenir la transmisión y/o infección de HBV de una madre a un feto comprenden administrar a un sujeto femenino en embarazo una cantidad efectiva de uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV descrito en la presente memoria.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV reduce la infección por HBV congénita. En otra realización, la administración de uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV reduce la infección por HBV congénita.
En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV reduce las manifestaciones de la infección por HBV congénita en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o más. En otra realización específica, la administración de un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV reduce la mortalidad de recién nacidos con infección congénita de HBV.
En otra realización, la administración de uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV reduce las manifestaciones de la infección congénita por HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o más. En otra realización específica, la administración de uno o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV reduce la mortalidad de recién nacidos con infección congénita por HBV.
Tales manifestaciones de HBV congénito incluyen, pero no se limitan a, hepatitis B aguda, infección crónica por HBV, cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC).
6.6 Composiciones, Administración y Dosificación
La invención además se refiere a vacunas, composiciones inmunogénicas y composiciones farmacéuticas que comprenden un arenavirus modificado genéticamente como se describe en la presente memoria. Dichas vacunas y composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica.
En otra realización, en la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un arenavirus infeccioso descrito en la presente memoria. Tales composiciones se pueden usar en métodos de tratamiento y prevención de enfermedades. En una realización específica, las composiciones descritas en la presente memoria se utilizan en los métodos de tratamiento de sujetos infectados o susceptibles a una infección por HBV. En otra realización específica, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria se pueden usar para inducir una respuesta inmunitaria en un huésped al que se administra la composición. Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente memoria se pueden usar como vacunas y, en consecuencia, se pueden formular como composiciones farmacéuticas. En una realización específica, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria se utilizan en los métodos de prevención de la infección de sujetos (p. ej., sujetos humanos) por el HBV. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es deficiente en replicación (Véase la Sección 6.1 (a)). En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación (Véase la Sección 6.1 (b)).
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden un vector de arenavirus (o una combinación de diferentes vectores de arenavirus) como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un adyuvante. El adyuvante para la administración en combinación con una composición descrita en la presente memoria puede administrarse antes, junto con o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en la presente memoria, aumenta, mejora y/o potencia la respuesta inmunitaria a una partícula de arenavirus infecciosa, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmunitaria a la partícula arenavirus infecciosa. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria a la partícula de arenavirus infecciosa y no produce alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden potenciar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen, p. ej., el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de células B y/o T y la estimulación de macrófagos. Cuando una vacuna o composición inmunogénica de la invención comprende adyuvantes o se administra junto con uno o más adyuvantes, los adyuvantes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de sales minerales o adyuvantes de gel de sales minerales, adyuvantes en partículas, adyuvantes en micropartículas, adyuvantes mucosales y adyuvantes inmunoestimuladores. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado (Mp L) (véase GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase Solicitud Internacional No. PCT/US2007/064857, publicado como Publicación Internacional No. WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase Solicitud Internacional No. PCT/US2007/064858, publicado como Publicación Internacional No. WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véase Kensil et al., en Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); U.S. Pat. No. 5,057,540). En algunas realizaciones, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite en agua (como el escualeno o el aceite de maní), opcionalmente en combinación con inmunoestimulantes, tales como el monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)).
Las composiciones comprenden los arenavirus infecciosos descritos en la presente memoria solos o junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden usarse suspensiones o dispersiones de arenavirus modificados genéticamente, especialmente suspensiones o dispersiones acuosas isotónicas. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, p. ej., conservantes, estabilizantes, humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o reguladores, y se preparan de manera conocida, por ejemplo mediante medios de procesos convencionales de dispersión y suspensión. En ciertas realizaciones, dichas dispersiones o suspensiones pueden comprender agentes reguladores de la viscosidad. Las suspensiones o dispersiones se mantienen a temperaturas alrededor de 2-8°C, o preferiblemente para un almacenamiento más prolongado, se pueden congelar y luego descongelar poco antes de su uso. Para inyección, la vacuna o las preparaciones inmunogénicas pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en reguladores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o regulador salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en la presente memoria comprenden adicionalmente un conservante, p. ej., el timerosal derivado de mercurio. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria comprenden de 0,001 % a 0,01 % de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria no comprenden conservantes.
Las composiciones farmacéuticas comprenden aproximadamente 103 a aproximadamente 1011 unidades formadoras de focos de los arenavirus manipulados genéticamente. Las formas de dosis unitarias para administración parenteral son, por ejemplo, ampollas o viales, p. ej., viales que contienen aproximadamente 103 a 1010 unidades formadoras de foco o 105 a 1015 partículas físicas de arenavirus modificados genéticamente.
En otra realización, una vacuna o composición inmunogénica proporcionada en la presente memoria se administra a un sujeto por vía oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, tópica, subcutánea, percutánea, intranasal y por inhalación, y mediante escarificación (rascado a través de las capas superiores de la piel, por ejemplo, usando una aguja bifurcada). En concreto, se pueden utilizar las vías subcutánea, intramuscular o intravenosa.
Para la administración por vía intranasal o por inhalación, la preparación para uso de acuerdo con la presente invención se puede administrar convenientemente en forma de una presentación de aspersión en aerosol desde paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para uso en un inhalador o insufladores que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
La dosificación del ingrediente activo depende del tipo de vacunación y del sujeto, y su edad, peso, condición individual, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración.
Los procesos y usos de arenavirus modificados genéticamente para la fabricación de vacunas en forma de preparados farmacéuticos pueden comprender arenavirus modificados genéticamente como ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de manera en sí conocida, por ejemplo mediante procesos de mezcla y/o dispersión convencionales.
6.7 Generación optimizada de vectores de LCMV
Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los genes virales en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la eliminación de la glicoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionan los genes eliminados o funcionalmente inactivados (p. ej.,la GP) "en trans". El virus resultante en sí mismo es infeccioso pero no puede producir más partículas de progenie infecciosas en células que no se complementan debido a la falta de los genes virales eliminados o inactivados funcionalmente (p. ej., la GP). La célula complementaria puede proporcionar la funcionalidad faltante ya sea por transfección estable, transfección transitoria o por infección con un virus auxiliar que exprese la funcionalidad faltante.
En ciertas realizaciones, la célula complementaria proporciona el gen viral que se ha eliminado o inactivado funcionalmente del genoma del vector de arenavirus. En una realización específica, la célula complementaria proporciona el gen viral de una cepa viral que es la misma que la cepa viral que se usó para generar el genoma del vector de arenavirus. En otra realización, la célula complementaria proporciona el gen viral de una cepa viral que es diferente de la cepa viral que se usó para generar el genoma del vector de arenavirus. Por ejemplo, el gen viral proporcionado en la célula complementaria se obtiene de la cepa MP de LCMV y codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, 16, 17 o 18. En otro ejemplo, el gen viral proporcionado en la célula complementaria se obtiene de la cepa Clon 13 de LCMV y codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21,22, 23 o 24. En otro ejemplo, se obtiene el gen viral proporcionado en la célula complementaria de la cepa WE de LCMV y codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa MP de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa MP de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene del Clon 13 de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa Clon 13 de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa Clon 13 de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene de la cepa MP de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O: 22.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene del Clon 13 de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En una realización específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la célula complementaria proporciona la GP de la cepa WE de LCMV y el vector de arenavirus se obtiene de la cepa MP de LCMV y comprende un ORF de un antígeno del HBV humano como se describe en la presente memoria en lugar del ORF que codifica la proteína GP. En una realización aún más específica, la proteína GP es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
6.8 Terapia de combinación
6.8 (a) Métodos
En una realización, se proporcionan en la presente memoria dos o más arenavirus infecciosos según se reivindica, para uso en métodos de tratamiento y/o prevención de una infección por HBV en un sujeto que comprende administrar al sujeto dichos dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno de HBV. Véase, p. ej., la Sección 6.2. En realizaciones específicas, un método para tratar y/o prevenir una infección por HBV comprende administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria, por ejemplo, en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno del HBV, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c) una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y, en donde el primer arenavirus infeccioso es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína pre-S2/S del HBV, la proteína HBc, la fusión de proteínas HBs y HBc, o un fragmento antigénico de las mismas;
y un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria, p. ej., en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno del HBV, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c) una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y en donde el segundo arenavirus infeccioso es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína pre-S2/S del HBV, la proteína HBc, la fusión de proteínas HBs y HBc, o un fragmento antigénico de la misma.
En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos primero y segundo son deficientes en replicación. En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos primero y segundo son competentes para la replicación. En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso primero o segundo es deficiente en replicación. En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos primero y segundo están bisegmentados. En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos primero y segundo están trisegmentados. En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso primero o segundo está bisegmentado y el otro está trisegmentado.
En realizaciones específicas, los métodos para tratar y/o prevenir una infección por HBV comprenden administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa un primer antígeno de HBV, seleccionado entre: una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma, y un segundo arenavirus infeccioso que expresa un segundo antígeno del HBV, seleccionado entre: una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En ciertas realizaciones, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar dos constructos de vector de arenavirus que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. En una realización específica, los dos constructos de vector de arenavirus expresan un antígeno de HBV diferente.
En ciertas realizaciones, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar dos o más constructos de vector de arenavirus que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar tres o más constructos de vector de arenavirus que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el constructo de vector de arenavirus puede basarse en LCMV.
En ciertas realizaciones, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar dos o más constructos de vector de arenavirus, cada uno de los cuales expresa un antígeno de HBV diferente como se describe en la presente memoria. En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección comprenden administrar tres o más constructos de vector de arenavirus, cada uno de los cuales expresa un antígeno de HBV diferente como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el constructo de vector de arenavirus puede basarse en LCMV.
En realizaciones específicas, el antígeno es la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(a)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína HBc del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(b)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína HBs del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(c)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(d)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína HBe del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(e)).
En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV como se describe en la presente memoria comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican un antígeno de HBV y combinaciones de los mismos como se describe. En realizaciones específicas, los antígenos del HBV, como se describe en la presente memoria, están separados por diversos enlazadores, espaciadores y sitios de escisión como se describe en la presente memoria.
En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV como se describe en la presente memoria del primer arenavirus infeccioso puede basarse en el Clon 13 de LCMV o en la cepa MP de LCMV. (Véase, p. ej., la Sección 7.1).
En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV como se describe en la presente memoria del segundo arenavirus infeccioso puede basarse en el Clon 13 de LCMV o en la cepa MP de LCMV. (Véase, p. ej., la Sección 7.1). En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos del HBV como se describe en la presente memoria del primer arenavirus infeccioso puede estar basado en el virus Junín.
En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos del HBV como se describe en la presente memoria del segundo arenavirus infeccioso puede estar basado en el virus Junín.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, los métodos para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto comprenden administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV es un antígeno de vacuna primario y el segundo arenavirus infeccioso que expresa otro antígeno de HBV es un antígeno de vacuna secundario.
En ciertas realizaciones, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o una proteína HBc del HBV proporciona un mejor efecto de protección al HBV después de la vacunación que administrar un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBc. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBc del HBV provoca una respuesta inmunitaria mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, por ejemplo, expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBc. En otra realización, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma, o una proteína HBc del HBV provoca una respuesta de células T CD8+ mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBc. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBc del HBV provoca títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBc.
En ciertas realizaciones, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBs del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o una proteína HBs del HBV proporciona un mejor efecto de protección al HBV después de la vacunación que administrar un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBs. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBs del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBs del HBV provoca una respuesta inmunitaria mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBs. En otra realización, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBs del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma, o una proteína HBs del HBV provoca una respuesta de células T CD8+ mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBs. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBs del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBs del HBV provoca títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBs.
En ciertas realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV proporcionan un mejor efecto protector contra el HBV después de la vacunación que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV provoca una respuesta inmunitaria mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV . En otra realización, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma, o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV provoca una respuesta de células T CD8+ mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, por ejemplo, expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV provoca títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., que expresa solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV.
En ciertas realizaciones, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBe del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o una proteína HBe del HBV proporciona un mejor efecto de protección al HBV después de la vacunación que administrar un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, p. ej., expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBe. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBe del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBe del HBV provoca una respuesta inmunitaria mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, por ejemplo, expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBe. En otra realización, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBe del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma, o una proteína HBe del HBV provoca una respuesta de células T CD8+ mayor que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, por ejemplo, expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBe. En otras realizaciones, administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBe del HBV y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma o una proteína HBe del HBV provoca títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que la administración de un solo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV, por ejemplo, expresando solo la proteína pre-S2/S (o un fragmento de la misma) o solo la proteína HBe.
En aún otra realización, en la presente memoria se proporciona el uso combinado del arenavirus deficiente en replicación que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria y uno o más vectores de virus defectuosos en replicación. En una realización más específica, el vector de virus defectuoso en replicación se selecciona del grupo que comprende poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociados y virus sendai, y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna Ankara modificada.
En aún otra realización, en la presente memoria se proporciona el uso combinado del arenavirus deficiente en replicación que expresa un antígeno de HBV descrito en la presente memoria y uno o más vectores de virus defectuosos en replicación que expresan un antígeno de HBV. En una realización más específica, el vector de virus defectuoso en replicación se selecciona del grupo que comprende poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociados y virus sendai, y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna Ankara modificada.
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria se administra antes o después del segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, el primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV se administra alrededor de 30-60 minutos antes o después de la primera administración del segundo arenavirus infeccioso.
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de vacuna se administra antes que el segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de vacuna. En ciertas realizaciones hay un periodo de aproximadamente 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año entre la administración del primer arenavirus infeccioso y el segundo arenavirus infeccioso.
En otra realización, se administran dos arenavirus infecciosos en un régimen de tratamiento en relaciones molares que oscilan entre aproximadamente 1:1 y 1:1000, que incluyen en particular: relación 1:1, relación 1:2, relación 1:5, relación 1:10, relación 1:20, relación 1:50, relación 1:100, relación 1:200, relación 1:300, relación 1:400, relación 1:500, relación 1:600, relación 1:700, relación 1:800 , relación 1:900, relación 1:1000.
En otra realización, los sujetos a los que se les administran dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria tienen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por HBV. En otra realización, los sujetos a los que se administran dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria están infectados, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV.
En otra realización, los sujetos a los que se administran simultáneamente dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria tienen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por HBV. En otra realización, los sujetos a los que se administran simultáneamente dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria están infectados, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV.
En otra realización, los sujetos a los que se administran secuencialmente dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria tienen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por HBV. En otra realización, los sujetos a los que se administran secuencialmente dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria están infectados, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por HBV.
En otra realización, dichos dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria se administran además en combinación con al menos otro medicamento para tratar y/o prevenir el HBV. Los medicamentos terapéuticos para tratar y/o prevenir el HBV incluyen, pero no se limitan a, entecavir (BARACLUDE®; Bristol-Myers Squibb), lamivudina (EPIVIR HBV®; GlaxoSmithKline), adefovir dipivoxil (HEPSERA®; Gilead Sciences), interferón alfa 2b (INTRON A®; Schering), interferón pegilado (PEGASYS®; Roche), telbivudina (TYZEKA®, Novartis) y tenofovir (VIr Ea D®; Gilead Sciences).
En otra realización, dichos dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria se administran además en combinación con al menos otro inmunomodulador. En una realización más específica, dichos dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria se administran además en combinación con al menos aproximadamente adyuvante específico de Th1. En una realización más específica, el adyuvante específico de Th-1 es Bacillus Calmette-Guerin (BCG).
En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto sintomático de un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En aún otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto con un sistema inmunitario comprometido, especialmente receptores de trasplantes, personas infectadas por el VIH, un sujeto femenino en embarazo, un sujeto que tiene cáncer, un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En otra realización, se administran dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria a un sujeto que es un niño de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padecen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV.
En otra realización, el régimen de administración puede implicar administrar a un sujeto que es un niño un primer arenavirus que expresa un antígeno del HBV y administrar al mismo sujeto que es un adolescente un segundo arenavirus que expresa un antígeno del HBV. En una realización específica, el régimen de administración puede implicar administrar a un sujeto que tiene 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o 17 años de edad un primer arenavirus que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria, y al mismo sujeto que tiene 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 años de edad un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV.
En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un sujeto preadolescente de un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un varón adolescente, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a una mujer, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV.
En otra realización, la administración de dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %. al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por HBV en la ausencia de tal tratamiento.
En otra realización, la administración de dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV, administrados por separado, reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por el HBV en ausencia de tal tratamiento.
En otra realización, la administración de dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV, administrados secuencialmente, reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al me aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al
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menos aproximadamente 50 %, al me aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al me aproximadamente 90 %, o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por el HBV en ausencia de tal tratamiento.
Sin estar limitado por la teoría, la administración de un primer arenavirus infeccioso y posteriormente de un segundo vector de arenavirus infeccioso da como resultado un efecto de principal-refuerzo.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan métodos para tratar y/o prevenir una infección por
HBV que comprenden la administración de dos o más constructos de vectores de arenavirus, cada uno de los cuales expresa el mismo antígeno del HBV o uno diferente de forma secuencial. El intervalo de tiempo entre cada administración puede ser de aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses o aproximadamente 24 meses.
En ciertas realizaciones, el primer arenavirus infeccioso y el segundo arenavirus infeccioso son homólogos. En ciertas realizaciones, el primer arenavirus infeccioso y el segundo arenavirus infeccioso son heterólogos.
En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso es un arenavirus del Viejo Mundo, y el segundo arenavirus infeccioso es un arenavirus del Viejo Mundo. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso es un arenavirus del Viejo Mundo, y el segundo arenavirus infeccioso es un arenavirus del Nuevo Mundo.
En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso es un arenavirus del Nuevo Mundo, y el segundo arenavirus infeccioso es un arenavirus del Nuevo Mundo. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso es un arenavirus del Nuevo Mundo, y el segundo arenavirus infeccioso es un arenavirus del Viejo Mundo.
En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso se deriva de LCMV y el segundo arenavirus infeccioso se deriva de LCMV. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso se deriva del LCMV y el segundo arenavirus infeccioso se deriva del virus Junín. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso se deriva del virus Junín y el segundo arenavirus infeccioso se deriva del virus Junín. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso se deriva del virus Junín y el segundo arenavirus infeccioso se deriva del LCMV.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un método para tratar y/o prevenir una infección por
HBV en donde un primer arenavirus infeccioso se administra primero como "principal" y un segundo arenavirus infeccioso se administra como "refuerzo". Los vectores de arenavirus infecciosos primero y segundo pueden expresar los mismos o diferentes antígenos de HBV. En ciertas realizaciones específicas, la administración "principal" se realiza con un arenavirus infeccioso derivado del LCMV, y el "refuerzo" se realiza con un arenavirus infeccioso derivado del virus Junín. En ciertas realizaciones específicas, la administración "principal" se realiza con un arenavirus infeccioso derivado del virus Junín, y el "refuerzo" se realiza con un arenavirus infeccioso derivado del LCMV.
En ciertas realizaciones, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, seguido de la administración de un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del
HBV o un fragmento del mismo da como resultado una mayor respuesta de células T CD8+ específicas de antígeno que la administración de un único arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo.
En ciertas realizaciones, el recuento de células T CD8+ específicas de antígeno aumenta en un 50 %, 100 %, 150 %
o 200 % después de la segunda administración en comparación con la primera administración. En ciertas realizaciones, la administración de un tercer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV da como resultado una mayor respuesta de células T CD8+ específicas de antígeno que la administración de dos arenavirus infecciosos consecutivos que expresan un antígeno de HBV. En ciertas realizaciones, el recuento de células T CD8+ específicas de antígeno aumenta aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 100 %, aproximadamente un 150 %, aproximadamente un 200 % o aproximadamente un 250 % después de la tercera administración en comparación con la primera administración.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan métodos para tratar y/o prevenir una infección que comprenden la administración de dos o más constructos de vector de arenavirus, en donde los dos o más constructos de vector de arenavirus son homólogos, y en donde el intervalo de tiempo entre cada administración es de aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses , aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses o aproximadamente 24 meses.
En ciertas realizaciones, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo y un segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo provoca una mayor respuesta de células T CD8+ que la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo y un segundo arenavirus infeccioso homólogo que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo.
En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV es LCMV, y el segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína pre-S2/S del HBV es el virus Junín. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV es el virus Junín, y el segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína pre-S2/S del HBV es LCMV.
En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV es LCMV, y el segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína HBc del HBV es el virus Junín. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV es el virus Junín, y el segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína HBc del HBV es el LCMV.
En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV es LCMV, y el segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV es el virus Junín. En ciertas realizaciones específicas, el primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV es el virus Junín, y el segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV es el LCMV.
En ciertas realizaciones específicas, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV y un segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína pre-S2/S del HBV provoca una mayor respuesta de células T CD8+ que la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV y un segundo arenavirus infeccioso homólogo que expresa proteína pre-S2/S del HBV. En ciertas realizaciones específicas, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV y un segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína pre-S2/S del HBV provoca una respuesta de células T CD8+ que es aproximadamente 20%, aproximadamente 40%, aproximadamente 60 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 100 %, aproximadamente 120 %, aproximadamente 140 %, aproximadamente 160 %, aproximadamente 180 % o aproximadamente 200 % mayor que administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV y un segundo arenavirus infeccioso homólogo que expresa una proteína pre-S2/S del HBV.
En ciertas realizaciones específicas, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína HBc del HBV provoca una mayor respuesta de células T CD8+ que la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso homólogo que expresa una proteína HBc del HBV. En ciertas realizaciones específicas, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína HBc del HBV provoca una respuesta de células T CD8+ que es de aproximadamente 20 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 100 %, aproximadamente 120 %, aproximadamente 140 %, aproximadamente 160 %, aproximadamente 180 % o aproximadamente 200 % mayor que administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso homólogo que expresa una proteína HBV del HBV proteína.
En ciertas realizaciones específicas, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV provoca una mayor respuesta de células T CD8+ que la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso homólogo que expresa la proteína de fusión HBs y HBc del HBV. En ciertas realizaciones específicas, la administración de un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso heterólogo que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del h Bv provoca una respuesta de células T CD8+ que es aproximadamente 20 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 100 %, aproximadamente 120 %, aproximadamente 140 %, aproximadamente 160 %, aproximadamente 180 % o aproximadamente 200 % mayor que administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV y un segundo arenavirus infeccioso homólogo que expresa una proteína de fusión HBs y HBc del HBV.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan métodos para tratar y/o prevenir una infección que comprenden la administración de dos o más constructos de vector de arenavirus, en donde los dos o más constructos de vector de arenavirus son heterólogos, y en donde el intervalo de tiempo entre cada administración es de aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses o aproximadamente 24 meses.
En aún otra realización, en la presente memoria se proporciona el uso combinado del arenavirus deficiente en replicación que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria y uno o más vectores de virus defectuosos en replicación. En una realización más específica, el vector de virus defectuoso en replicación se selecciona del grupo que comprende poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociados y virus sendai, y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna Ankara modificada.
En aún otra realización, en la presente memoria se proporciona el uso combinado del arenavirus deficiente en replicación que expresa un antígeno de HBV descrito en la presente memoria y uno o más vectores de virus defectuosos en replicación que expresan un antígeno de HBV. En una realización más específica, el vector de virus defectuoso en replicación se selecciona del grupo que comprende poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociados y virus sendai, y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna Ankara modificada.
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria se administra antes o después del segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, el primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV se administra alrededor de 30-60 minutos antes o después de la primera administración del segundo arenavirus infeccioso.
En otra realización, el primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de vacuna se administra antes que el segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de vacuna. En ciertas realizaciones hay un periodo de aproximadamente 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año entre la administración del primer arenavirus infeccioso y el segundo arenavirus infeccioso.
En otra realización, se administran dos arenavirus infecciosos en un régimen de tratamiento en relaciones molares que oscilan entre aproximadamente 1:1 y 1:1000, que incluyen en particular: relación 1:1, relación 1:2, relación 1:5, relación 1:10, relación 1:20, relación 1:50, relación 1:100, relación 1:200, relación 1:300, relación 1:400, relación 1:500, relación 1:600, relación 1:700, relación 1:800 , relación 1:900, relación 1:1000.
En otra realización, los sujetos a los que se administran dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria tienen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por HBV. En otra realización, los sujetos a los que se administran dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria están infectados, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV.
Los sujetos que pueden ser tratados con los métodos proporcionados en la presente memoria son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por HBV.
En otra realización, dichos dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria expresan además al menos otro péptido, polipéptido o proteína inmunoestimuladora. En ciertas realizaciones, el péptido, polipéptido o proteína inmunoestimuladora es Calreticulina (CRT), o un fragmento de la misma; Ubiquitina o un fragmento de la misma; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o un fragmento del mismo; Cadena invariable (CD74) o un fragmento antigénico de la misma; Mycobacterium tuberculosis proteína de choque térmico 70 o un fragmento antigénico de la misma; proteína VP22 del virus del herpes simplex 1 o un fragmento antigénico de la misma; ligando de CD40 o un fragmento antigénico del mismo; o ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con Fms (Flt3) o un fragmento antigénico del mismo.
Métodos heterólogos de principal-refuerzo con vectores de arenavirus infecciosos defectuosos en replicación en donde los dos vectores de arenavirus infecciosos defectuosos en replicación se derivan de diferentes arenavirus (p. ej., LCMV y virus Junín). Estos vectores de arenavirus infecciosos defectuosos en replicación pueden expresar un antígeno, tal como un antígeno de HBV.
Métodos heterólogos de principal-refuerzo con vectores de arenavirus infecciosos competentes para la replicación en donde los dos vectores de arenavirus infecciosos competentes para la replicación se derivan de diferentes arenavirus (p. ej., También se proporcionan LCMV y virus Junín). Estos vectores de arenavirus infecciosos competentes para la replicación pueden expresar un antígeno, tal como un antígeno de HBV.
6.8 (b) Composiciones
La invención además se refiere a vacunas, composiciones inmunogénicas y composiciones farmacéuticas que comprenden un arenavirus modificado genéticamente como se describe en la presente memoria. Dichas vacunas y composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica.
En una realización, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden dos o más arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. Véase, p. ej., la Sección 6.2.
En realizaciones específicas, las composiciones descritas en la presente memoria son para uso en métodos discutidos previamente, en donde los métodos comprenden administrar a un sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria, p. ej., en el que el ORF que codifica la GP de la S genómica segmento se sustituye con una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno del HBV. El antígeno del HBV puede ser, pero no se limita a:
a) una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b) una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c) una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas
Los métodos comprenden además administrar una segunda composición de arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria, p. ej., en el que el ORF que codifica la GP del segmento genómico S se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno del HBV. El antígeno del HBV puede ser, pero no se limita a:
a) una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b) una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; y
c) una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas
En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos primero y segundo son deficientes en replicación. En ciertas realizaciones, los arenavirus infecciosos primero y segundo son competentes para la replicación. En ciertas realizaciones, el arenavirus infeccioso primero o segundo es deficiente en replicación.
En realizaciones específicas, los métodos para tratar y/o prevenir una infección por HBV comprenden administrar un primer arenavirus infeccioso que expresa un primer antígeno de HBV, seleccionado entre: una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas, como se describe en la presente memoria y un segundo arenavirus infeccioso que expresa un segundo antígeno del HBV, seleccionado entre: una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan composiciones adecuadas para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de una infección por HBV que comprende la administración de dos constructos de arenavirus que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En una realización específica, los dos constructos de vector de arenavirus expresan un antígeno de HBV.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden dos o más constructos de vectores de arenavirus que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden tres o más constructos de vectores de arenavirus que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el arenavirus puede ser LCMV.
En realizaciones específicas, el antígeno es la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(a)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína HBc del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(b)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína HBs del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(c)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas ((véase, p. ej., la Sección 6.2(d)).
En ciertas realizaciones, el antígeno es la proteína HBe del HBV o un fragmento de la misma. (Véase, p. ej., la Sección 6.2(e)).
En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV como se describe en la presente memoria comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican un antígeno de HBV y combinaciones de los mismos como se describe. En realizaciones específicas, los antígenos del HBV, como se describe en la presente memoria, están separados por diversos enlazadores, espaciadores y sitios de escisión como se describe en la presente memoria.
En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV como se describe en la presente memoria del primer arenavirus infeccioso puede basarse en el Clon 13 de LCMV o en la cepa MP de LCMV. (Véase, p. ej., la Sección 7.1).
En otra realización, el vector generado para codificar uno o más antígenos de HBV como se describe en la presente memoria del segundo arenavirus infeccioso puede basarse en el Clon 13 de LCMV o en la cepa MP de LCMV. (Véase, p. ej., la Sección 7.1).
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección por HBV en un sujeto que comprende administrar al sujeto una primera composición de arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma. y una segunda composición de arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones o uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar secuencialmente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para uso en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBs del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En una realización específica, en la presente memoria se proporcionan composiciones para cuatro usos en un método para tratar y/o prevenir una infección en un sujeto que comprende administrar simultáneamente al sujeto un primer arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBe del HBV o un fragmento antigénico de la misma y un segundo arenavirus infeccioso que expresa una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
En otra realización, la primera composición de arenavirus infeccioso que expresa un antígeno de HBV es un antígeno de vacuna primario y el segundo arenavirus infeccioso que expresa otro antígeno de HBV es un antígeno de vacuna secundario.
En aún otra realización, en la presente memoria se proporciona el uso combinado de las composiciones de arenavirus deficiente en replicación que expresan un antígeno de HBV como se describe en la presente memoria y una o más composiciones de vectores de virus defectuosas en replicación. En una realización más específica, la composición de vector de virus defectuosa en replicación puede ser pero no se limita a: poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del herpes simple, paramixovirus, rabdovirus, poliovirus, virus adenoasociados y virus Sendai, y mezclas de los mismos. En una realización específica, el poxvirus es una vacuna Ankara modificada.
En otra realización, dos composiciones de arenavirus infecciosos tienen relaciones molares que oscilan entre aproximadamente 1:1 y 1:1000, que incluyen en particular: relación 1:1, relación 1:2, relación 1:5, relación 1:10, relación 1:20, relación 1:50, relación 1:100, relación 1:200, relación 1:300, relación 1:400, relación 1:500, relación 1:600, relación 1:700, relación 1:800, relación 1:900, relación 1:1000.
En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria son adecuadas para la administración a sujetos que tienen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por HBV. En otra realización, los sujetos a los que se administran dos o más composiciones de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición de las mismas están infectados, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV.
En otra realización, dichas dos o más composiciones de arenavirus infecciosos comprenden además al menos otro medicamento para tratar y/o prevenir la infección por HBV. Los medicamentos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, entecavir (Ba RACLu De®; Bristol-Myers Squibb), lamivudina (EPIVIR HBV®; GlaxoSmithKline), adefovir dipivoxil (He PSERA®; Gilead Sciences), interferón alfa 2b (INTRON A®; Schering), interferón pegilado (p Eg ASYS®; Roche), telbivudina (TYZEKA®, Novartis) y tenofovir (VIReA d®; Gilead Sciences).
En otra realización, las composiciones son adecuadas para administrar a un sujeto sintomático una segunda composición de arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV o un fragmento del mismo como se describe en la presente memoria. En aún otra realización, las composiciones son adecuadas para la administración a un sujeto con un sistema inmunitario comprometido, especialmente receptores de trasplantes, personas infectadas por el VIH, un sujeto femenino en embarazo o un sujeto que tiene cáncer, se describe una segunda composición de arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo. En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria o un fragmento del mismo son adecuadas para administrar a un sujeto que es un niño de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ,9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padecen, son susceptibles o corren el riesgo de contraer una infección por el HBV.
En otra realización, las composiciones son adecuadas para administrar a un sujeto que es un niño, un primer arenavirus que expresa un antígeno del HBV y administrar al mismo sujeto que es un adolescente un segundo arenavirus que expresa un antígeno del HBV. En una realización específica, el régimen de administración puede implicar administrar a un sujeto que es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o 17 años de edad un primer arenavirus que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria, y al mismo sujeto que tiene 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 años de edad un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV.
En otra realización, las composiciones son adecuadas para administrar a un sujeto preadolescente un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a un varón adolescente, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV como se describe en la presente memoria. En otra realización, el régimen de administración puede implicar la administración a una mujer, de 12 a 18 años de edad, de un segundo arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV.
En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, reducen el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por el HBV en ausencia de tal tratamiento.
En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, administradas por separado, reducen el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o más , en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por HBV en ausencia de tal tratamiento.
En otra realización, dos o más composiciones de arenavirus infecciosos que expresan un antígeno del HBV o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, administradas secuencialmente, reducen el riesgo de que un individuo desarrolle una infección por el HBV en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o más , en comparación con el riesgo de desarrollar una infección por HBV en ausencia de tal tratamiento.
En otra realización, proporcionada en la presente memoria, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende una combinación sinérgica de dos o más arenavirus infecciosos deficientes en replicación que expresan un antígeno del HBV.
En otra realización, proporcionada en la presente memoria, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende una combinación sinérgica de dos o más arenavirus infecciosos competentes para la replicación que expresan un antígeno del HBV.
6.9 Ensayos
Ensayo para medir la infectividad del vector Arenavirus Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para medir la infectividad de una preparación de vector de arenavirus. Por ejemplo, la determinación del título de virus/vector se puede realizar mediante un "ensayo de unidades formadoras de focos" (ensayo FFU). En resumen, las células complementarias, p. ej. las células HEK 293 que expresan la proteína GP de LCMV se cultivan en placa y se inoculan con diferentes diluciones de una muestra de virus/vector. Después de un período de incubación, para permitir que las células formen una monocapa y que el virus se adhiera a las células, la monocapa se cubre con metilcelulosa. Cuando las placas se incuban adicionalmente, las células infectadas originales liberan progenie viral. Debido a la superposición de metilcelulosa, la propagación de los nuevos virus se restringe a las células vecinas. En consecuencia, cada partícula infecciosa produce una zona circular de células infectadas llamada Foco. Dichos focos se pueden hacer visibles y, por lo tanto, contables usando anticuerpos contra LCMV-NP y una reacción de color basada en HRP. El título de un virus/vector se puede calcular en unidades formadoras de focos por mililitro (FFU/mL).
Para determinar el título infeccioso (FFU/mL) de los vectores portadores de transgenes, este ensayo se modifica mediante el uso del anticuerpo específico del transgen respectivo en lugar del anticuerpo anti-LCMV-NP.
ELISA en suero La determinación de la respuesta inmunitaria humoral tras la vacunación de animales (p. ej., ratones, cobayas) se puede realizar mediante ELISA de suero específico de antígeno (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas). En resumen, las placas se recubren con antígeno (p. ej., proteína recombinante), se bloquean para evitar la unión inespecífica de anticuerpos y se incuban con diluciones en serie de sueros. Después de la incubación, los anticuerpos séricos unidos pueden detectarse, p.ej., usando un anticuerpo específico anti-especie (p. ej., ratón, cobaya) acoplado a enzima (detectando IgG total o subclases de IgG) y la subsiguiente reacción de color. Los títulos de anticuerpos se pueden determinar como, p. ej., el título medio geométrico de punto final.
También se puede realizar ELISA de inmunocaptura (IC-ELISA) (véase Shanmugham et al., 2010, Clin. Vaccine Immunol. 17(8):1252-1260), en donde los agentes de captura se entrecruzan con perlas.
Ensayo de neutralización en células ARPE-19 La determinación de la actividad de neutralización de los anticuerpos inducidos en sueros se realiza con el siguiente ensayo celular utilizando células ARPE-19 de la ATCC y un virus marcado con GFP. Además, se utiliza suero suplementario como fuente de complemento exógeno. El ensayo se inicia con la siembra de 6,5 x 103 células/pocillo (50 gl/pocillo) en una placa de 384 pocillos uno o dos días antes de usar para la neutralización. La neutralización se realiza en placas de cultivo de tejidos estériles de 96 pocillos sin células durante 1 h a 37°C. Después de la etapa de incubación de neutralización, la mezcla se agrega a las células y se incuba durante 4 días adicionales para la detección de GFP con un lector de placas. Se utiliza un suero humano neutralizante positivo como control positivo del ensayo en cada placa para comprobar la fiabilidad de todos los resultados. Los títulos (EC50) se determinan utilizando un ajuste de curva logística de 4 parámetros. Como prueba adicional, los pocillos se verifican con un microscopio de fluorescencia.
Ensayo de reducción de placa En resumen, los ensayos de reducción (neutralización) de placas para el virus de la hepatitis B se realizan mediante el uso de un aislado de HBV marcado con proteína fluorescente verde, se utilizó suero de conejo al 5 % como fuente de complemento exógeno y las placas se enumeran mediante microscopía de fluorescencia. Los títulos de neutralización se definen como la dilución más alta de suero que da como resultado una reducción del 50 % en las placas, en comparación con las muestras de suero de control (preinmunes).
Ensayo de neutralización en células de fibroblastos de pulmón de cobaya (GPL) En resumen, se prepararon diluciones en serie de sueros de prueba y de control (antes de la vacunación) en medio completo GPL con suero de conejo suplementario (1%) como fuente de complemento exógeno. La serie de dilución abarcó desde 1:40 hasta 1:5120. Las diluciones de suero se incubaron con virus marcado con eGFP (100-200 ufp por pocillo) durante 30 min a 37 °C y luego se transfirieron a placas de 12 pocillos que contenían células GPL confluentes. Las muestras se procesaron por triplicado. Después de 2 horas de incubación a 37 °C, las células se lavaron con PBS, se volvieron a alimentar con medio completo GPL y se incubaron a 37 °C/5 % CO2 durante 5 días. Las placas se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia, se contaron y compararon con pocillos de control. Aquella dilución de suero que dio como resultado una reducción del 50% en el número de placas en comparación con los controles se denominó título neutralizante.
qPCR Los genomas de ARN de LCMV se aíslan utilizando el kit QIAamp Viral RNA mini (QIAGEN), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los equivalentes del genoma del ARN del LCMV se detectan mediante PCR cuantitativa realizada en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) con SuperScript® III Platino® Kit qRT-PCR de una sola etapa (Invitrogen) y cebadores y sondas (FAM reporter y NFQ-MGB Quencher) específicos para parte de la región codificante de NP de LCMV. El perfil de temperatura de la reacción es: 30 min a 60°C, 2 min a 95°C, seguido de 45 ciclos de 15 s a 95°C, 30 s a 56°C. El ARN se cuantifica comparando los resultados de la muestra con una curva estándar preparada a partir de una serie de diluciones log 10 de un fragmento de ARN transcrito in vitro cuantificado espectrofotométricamente, correspondiente a un fragmento de la secuencia codificante de NP de LCMV que contiene los sitios de unión del cebador y la sonda.
Transferencia Western Las células infectadas cultivadas en frascos de cultivo de tejidos o en suspensión se lisan en los puntos de tiempo indicados después de la infección usando regulador RIPA (Thermo Scientific) o se usan directamente sin lisis celular. Las muestras se calientan hasta 99 °C durante 10 minutos con un agente reductor y el regulador de muestra NuPage LDS (NOVEX) y se enfrían a temperatura ambiente antes de cargarlas en geles SDS al 4-12 % para electroforesis. Las proteínas se transfieren a las membranas utilizando el dispositivo de transferencia de gel iBlot de Invitrogens y se visualizan mediante tinción de Ponceau. Finalmente, las preparaciones se prueban con anticuerpos primarios dirigidos contra las proteínas de interés y anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina, seguido de tinción con solución NBT/BCIP de 1 Etapa (INVITROGEN).
Ensayo de tinción de multímeros de péptidos MHC para la detección de la proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para ensayar respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de tinción de tetrámero de péptido MHC ((véase, p. ej., Altman J.D. et al., Science. 1996; 274:94-96; y Murali-Krishna K. et al., Immunity. 1998; 8:177-187). En resumen, el ensayo comprende las siguientes etapas, se usa un ensayo de tetrámero para detectar la presencia de células T específicas de antígeno. Para que una célula T detecte el péptido para el que es específica, debe reconocer tanto el péptido como el tetrámero de las moléculas MHC hechas a la medida para una célula T específica de antígeno (típicamente marcada con fluorescencia). A continuación, el tetrámero se detecta mediante citometría de flujo a través del marcador fluorescente.
Ensayo ELISPOT para la detección de proliferación de células T CD4+ específicas de antígeno Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para probar respuestas de células T CD4+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede utilizar el ensayo ELISPOT ((véase, p. ej., Czerkinsky CC et al., J Immunol Methods.
1983; 65:109-121; y Hutchings PR et al., J Immunol Methods. 1989; 120:1-8). En resumen, el ensayo consiste en las siguientes etapas: una placa de inmunospot se recubre con un anticuerpo anti-citoquina. Las células se incuban en la placa de inmunopunto. Las células secretan citoquinas y luego se lavan. A continuación, las placas se recubren con un segundo anticuerpo anticitoquina biotinilado y se visualizan con un sistema de avidina-HRP.
Ensayo de citoquinas intracelulares para la detección de la funcionalidad de las respuestas de células T CD8+ y CD4+ Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para probar la funcionalidad de las respuestas de células T CD8+ y CD4+. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de citoquinas intracelulares combinado con citometría de flujo ((véase, p. ej., Suni m A et al., J Immunol Methods. 1998; 212:89-98; Nomura LE et al., Cytometry. 2000; 40:60-68; y Ghanekar S.A. et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8:628-63). En resumen, el ensayo comprende las siguientes etapas: activación de células a través de péptidos o proteínas específicos, se agrega una inhibición del transporte de proteínas (p. ej., brefeldina A) para retener las citoquinas dentro de la célula. Después del lavado, se pueden añadir a las células anticuerpos contra otros marcadores celulares. A continuación, las células se fijan y permeabilizan. Se añade el anticuerpo anti-citoquina y las células pueden analizarse mediante citometría de flujo.
Ensayo para confirmar la deficiencia de replicación de vectores virales Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica que determine la concentración de partículas virales infecciosas y competentes para la replicación también se puede usar para medir partículas virales deficientes en replicación en una muestra. Por ejemplo, para este fin se pueden usar ensayos FFU (como se describe en [00408]) con células que no se complementan.
Además, los ensayos basados en placa son el método estándar utilizado para determinar la concentración de virus en términos de unidades formadoras de placas (PFU) en una muestra de virus. Específicamente, una monocapa confluente de células huésped que no se complementan se infecta con el virus en diluciones variables y se cubre con un medio semisólido, como agar, para evitar que la infección por el virus se propague indiscriminadamente. Una placa viral se forma cuando un virus infecta y se replica con éxito en una célula dentro de la monocapa celular fijada ((véase, p. ej., Kaufmann, SH; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol.32:Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0-12-521532-0). La formación de placa puede demorar de 3 a 14 días, según el virus que se esté analizando. Las placas generalmente se cuentan manualmente y los resultados, en combinación con el factor de dilución utilizado para preparar la placa, se utilizan para calcular el número de unidades formadoras de placa por unidad de volumen de muestra (PFU/mL). El resultado de PFU/mL representa el número de partículas infectivas competentes para la replicación dentro de la muestra.
Medición de la carga viral en la sangre o el hígado Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica que determine la carga viral puede usarse para detectar el número de partículas de HBV por volumen en la sangre o el hígado (véase, p. ej., Mendy et al., 2010, J. Viral Hepat. 17(2): 115-122). Los ejemplos no limitantes de dichos ensayos incluyen pruebas basadas en ácidos nucleicos tales como PCR, así como pruebas no basadas en ácidos nucleicos.
Biopsia hepatica Cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica que realice una biopsia de hígado se puede usar para determinar el grado de daño hepático, por ejemplo, para evaluar a un paciente en busca de infección crónica por HBV o cáncer de hígado. Los ejemplos no limitativos de tipos de biopsias hepáticas incluyen biopsias percutáneas con aguja, biopsias laparoscópicas y biopsias transvenosas. En ciertas realizaciones, se usa una biopsia de hígado para determinar la presencia de hepatocitos en vidrio esmerilado cuando las células se examinan bajo un microscopio óptico. La observación de hepatocitos en vidrio esmerilado es indicativa de la presencia de HBsAg en las células hepáticas.
Ensayo de expresión de antígeno viral Puede usarse cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica para medir la expresión de antígenos virales. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos FFU (como se describe en [00408]). Para la detección, se utilizan preparados de anticuerpos monoclonales o policlonales contra los respectivos antígenos virales (FFU específicos de transgén).
Además, se puede realizar la transferencia Western (como se describe en [00415]).
Inmunoensayo enzimático de micropartículas El AXSYM® HbsAg (Abbott) es un inmunoensayo enzimático de micropartículas (MEIA) para detectar HBsAg en suero o plasma adulto, pediátrico y neonatal, incluso en sujetos femeninos en embarazo. Este ensayo se puede utilizar como ayuda en el diagnóstico de HBV agudo o crónico. Este ensayo también se puede utilizar para confirmar la presencia de infección por HBV.
Para realizar el ensayo, se coloca una muestra de sangre del paciente en pocillos de reacción que contienen anticuerpos detectores y micropartículas recubiertas con anticuerpos contra el HBV (p. ej., a los antígenos del HBV). Si la muestra de sangre contiene proteínas del HBV (p. ej., HBsAg), se unirán a las micropartículas en los pocillos de reacción. Esta reacción es detectada por otra sustancia que produce luz, que luego se mide para determinar la presencia de HBV (p. ej., antígenos de HBV) en la sangre. Si la primera prueba es positiva, se vuelve a analizar la sangre del paciente para confirmar la presencia de HBV (p. ej., antígenos del HBV). Puede usarse cualquier inmunoensayo enzimático de micropartículas conocido por el experto en la técnica para medir la presencia de HBsAg u otros antígenos del HBV.
Otros ensayos de HBV Una muestra de la sangre del paciente se pone en contacto con anticuerpos contra el HBV o con antígenos del HBV. Los anticuerpos y/o antígenos incluyen HBsAg, anticuerpos contra HBeAg, anticuerpos contra HBsAg, HBeAg, anticuerpos IgM contra HBcAg y anticuerpos contra HBcAg. Si el paciente está infectado con el HBV, los antígenos y/o anticuerpos presentes en la sangre provocarán una reacción química cuando se realice la prueba. Este ensayo permite la detección del estadio del HBV, según qué antígenos y/o anticuerpos del HBV estén presentes en la sangre del paciente.
Puede usarse cualquier ensayo conocido por un experto en la técnica para evaluar los niveles de HBV, antígenos de HBV o anticuerpos de HBV. Para ejemplos no limitantes de tales ensayos, véase, p. ej., Mayer et al., 2012, BMC Clin. Pathol. 12:8, Van Helden et al., 2004, Clin. Lab. 50(1 -2):63-73, and Villar et al., 2011, J. Med. Virol. 83(9):1522-1529.,
Modelos animales La seguridad, tolerancia y eficacia inmunogénica de las vacunas que comprenden un arenavirus infeccioso que expresa un antígeno del HBV descrito en la presente memoria o una composición del mismo puede probarse en modelos animales. En ciertas realizaciones, los modelos animales que se pueden usar para probar la seguridad, la tolerancia y la eficacia inmunogénica de las vacunas y las composiciones de las mismas usadas en la presente memoria incluyen ratones, cobayas, ratas, monos y chimpancés. En una realización preferida, los modelos animales que se pueden usar para probar la seguridad, la tolerancia y la eficacia inmunogénica de las vacunas y las composiciones de las mismas usadas aquí incluyen ratones.
En un ejemplo específico, se puede utilizar un modelo de ratón transgénico para evaluar el potencial antiviral de agentes farmacológicos, tales como inmunoterapias o vacunas, y para evaluar procesos fisiológicos, incluida la respuesta inmunitaria (véase, p. ej., Guidotti et al., 1995, J. Virol. 69(10):6158-69). Tales modelos de ratones transgénicos pueden expresar moléculas humanas, tales como moléculas HLA de clase I y II humanas, y/o el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) ((véase, p. ej., Bourgine et al., 2012, Virology 430(1):10-9).
En otro ejemplo específico, la marmota (Marmota monax) se puede utilizar como modelo animal para desarrollar y probar enfoques de tratamiento y prevención de infecciones hepadnavirales crónicas, tales como la hepatitis B crónica (véase, p. ej., Kosinska et al., Hepat. Res. Treat. 2010:817580). El modelo de la marmota es aplicable para la evaluación de la inmunogenicidad y otras respuestas inmunitarias de posibles inmunoterapias tales como las vacunas (véase, p. ej., Vaccine 27(25-26):3271-3275).
6.10 Secuencias
Las secuencias de la Tabla 3 son secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos ilustrativas que se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en la presente memoria. En algunos casos, se usa una secuencia de ADN para describir la secuencia de ARN de un segmento genómico viral. La secuencia de ARN se puede deducir fácilmente a partir de la secuencia de ADN.
Tabla 3. Secuencias de aminoácidos ilustrativas.
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7. EJEMPLOS
7.1 Diseño del Genoma Vectorial de Arenavirus / Construcción de vectores
Basado en enfoques establecidos (Publicación de solicitud de patente U.S. No. US 2010/0297172 A1; y Flatz L. et al., Nat Med. 2010 marzo; 16(3): 339-345), se diseñan vectores vacunales basados en LCMV y Virus Junín (JUNV) que expresan los respectivos antígenos HBV o ciertos dominios de los mismos (FIG. 1).
7.2 Vacunas contra el virus de la hepatitis B
Las vacunas candidatas contra el virus de la hepatitis B (HBV) comprenden vectores basados en rLCMV y rJUNV (cepa de vacuna Junín Candid#1) que expresan pre-S2/S (rLCMV/pre-S2/S, rJUNV/Pre-S2/S), HBc (rLCMV/HBc, rJUNV/HBc), una proteína de fusión que consiste en los ORF de HBs y HBc de longitud completa (rLCMV/HBsHBc) y HBe (rLCMV/HBe, rJUNV/HBe). Los vectores serán deficiente en replicación (r2LCMV, también denominado rLCMV, r2JUNV, también denominado rJUNV) y constructos trisegmentados competentes para la replicación (r3LCMV, r3JUNV; véase, p. ej., Emonet et al., 2009, PNAS, 106(9):3473-3478), en donde los transgenes están dispuestos de la forma denominada "artificial" (r3LCMVart, r3JUNVart). Se inmunizan ratones (p. ej., ratones C57BL/6) con uno de estos constructos, o con combinaciones de los mismos en una vacunación de iniciador-potenciador homólogo o heterólogo. La administración se realiza por vía intraperitoneal, intramuscular o intravenosa. La dosis estará en el rango de 104 a 107 unidades formadoras de focos (FFU). En puntos de tiempo que oscilan entre 7 a 100 días después de la inmunización, se miden las células T CD8+ específicas del HBV en la sangre y/o el bazo. Las células T pueden medirse, por ejemplo, utilizando tetrámeros de MHC de clase I en combinación con anticuerpos anti-CD8 para identificar la magnitud de la respuesta de las células T CD8+ a los epítopos derivados del HBV.
En un enfoque complementario, se utilizan péptidos sintéticos para estimular selectivamente células T CD8+ derivadas de sangre y/o bazo directamente ex vivo por medio de ensayos de citoquinas intracelulares. Los ensayos de citoquinas intracelulares miden la frecuencia de interferón (IFN)-y, factor de necrosis tumoral (TNF)-a y/o células T CD8+ productoras de interleucina (IL)-2. La expresión superficial de CD107a sirve como marcador de desgranulación citolítica en citometría de flujo (FACS). Se analizan las especificidades de los péptidos, que incluyen: epítopo derivado de HBs VWLSVIWM (SEQ ID NO: 8), epítopo derivado de HBs IPQSLDSWWTSL (SEQ ID NO: 9) y epítopo derivado de HBc MGLKFRQL (SEQ ID NO: 10).
7.3 Inmunogenicidad de vectores basados en arenavirus deficientes en replicación que expresan antígenos del HBV
S Se inmunizaron ratones C57BL/6 (5 ratones por grupo) una vez con 105 FFU de r3LCMV/HBs-HBc (grupo 1), r3LCMV/HBc (grupo 2), r3LCMV/Pre-S2 (grupo 3), o con 105 FFU de rLCMV/HBs-HBc (grupo 4), por vía intravenosa. Los ratones de control se dejaron sin vacunación. 10 días después de la inmunización, se midieron las células T CD8+ en la sangre usando multímeros MHC de clase I. Se usaron dextrámeros H-2Kb en complejo con el epítopo VWLSVIWM derivado de HBs y dextrámeros H-2Kb en complejo con el epítopo MGLKFRQL derivado de HBc en combinación con anticuerpos anti-CD8a para identificar células T CD8+ específicas del virus de la hepatitis B. Las células enumeradas se expresaron de dos maneras diferentes, ya sea como un porcentaje del grupo total de células T CD8+B220- en sangre periférica (FIG. 4A) o como un porcentaje de linfocitos circulantes en sangre (FIG. 4B).
Los resultados, como se muestra en la Figura 3, indican que la vacunación con rLCMV/HBs-HBc, rLCMV/HBc y rLCMV/Pre-S2 induce respuestas sustanciales de células T CD8+ específicas de antígeno contra los antígenos expresados por los respectivos vectores. Las respuestas de células T CD8+ anti-HBs y anti-HBc inducidas por la vacunación con rLCMV/HBs-HBc mostraron una clara dependencia de la dosis. Las frecuencias superiores de células T CD8+ anti-HBc tras la inmunización con rLCMV/HBs-HBc en comparación con la inmunización con rLCMV/HBc indican que la fusión con HBs da como resultado una inmunogenicidad aumentada de HBc.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un vector viral de arenavirus infeccioso, en donde un marco de lectura abierto de arenavirus se elimina y se reemplaza por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; en donde el vector viral es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
2. El vector viral de la reivindicación 1, en donde
(i) la proteína HBc o el fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % , 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2;
(ii) la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o sus fragmentos antigénicos comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3; o
(iii) la proteína pre-S2/S o el fragmento antigénico de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO : 1.
3. El vector viral de la reivindicación 1, que comprende al menos dos o al menos tres de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; opcionalmente en donde la expresión de las secuencias de nucleótidos produce un complejo proteico antigénico que provoca títulos más elevados de anticuerpos neutralizantes que la expresión de los componentes del complejo proteico individualmente.
4. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el arenavirus es:
(i) virus de la coriomeningitis linfocítica;
(ii) deficiente en replicación y está modificado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir partículas adicionales de progenie infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente;
(iii) bisegmentado y deficiente en replicación; o
(iv) tri-segmentado y competente para la replicación.
5. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína (GP) del arenavirus se elimina o se inactiva funcionalmente.
6. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la información genómica que codifica el vector viral de arenavirus infeccioso se deriva del virus de la coriomeningitis linfocítica o del virus Pichinde.
en donde opcionalmente el virus de la coriomeningitis linfocítica es la cepa Clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica o la cepa MP del virus de la coriomeningitis linfocítica.
7. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el vector viral comprende un segmento genómico, en donde el segmento genómico comprende:
(i) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos 1639 a 3315 de s Eq ID NO: 11 o nucleótidos 1640 a 3316 de SEQ ID NO: 12; o
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de expresión cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1639 a 3315 de SEQ ID NO: 11 o los nucleótidos 1640 a 3316 de SEQ ID NO: 12.
8. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el crecimiento o la infectividad del arenavirus no se ven afectados por la secuencia de nucleótidos.
9. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el arenavirus es un vector viral de arenavirus infeccioso, deficiente en replicación modificado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas, pero incapaz de producir partículas de progenie infecciosas adicionales en células normales, no modificadas genéticamente y en donde la administración del vector viral de arenavirus a un sujeto induce una respuesta inmunitaria de larga duración contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV, o un fragmento antigénico de la misma, opcionalmente en donde (i) la respuesta inmunitaria de larga duración induce un título de anticuerpos detectables contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; o
(ii) la respuesta inmunitaria de larga duración induce un título de anticuerpos detectables contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma durante al menos un mínimo de 4 semanas;
opcionalmente en donde la respuesta inmunitaria de larga duración aumenta el título de anticuerpos contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400%, al menos 500% o al menos 1000%.
10. Una composición farmacéutica, composición inmunogénica o vacuna que comprende el vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Un vector viral como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una composición farmacéutica, una composición inmunogénica o una vacuna como se define en la reivindicación 10, para uso en un método para tratar o prevenir una infección por el virus de la hepatitis B en un paciente.
12. Un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico comprende un segmento genómico de arenavirus, en donde se elimina o inactiva funcionalmente un marco de lectura abierto del segmento genómico y en donde el segmento genómico comprende uno o más de:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; o
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; en donde un vector viral que comprende el segmento genómico de arenavirus es capaz de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma; opcionalmente, en donde el segmento genómico es el segmento corto, en donde se elimina el marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína (GP).
13. Un ADNc del segmento genómico de arenavirus como se define en la reivindicación 12.
14. Un método in vitro para generar un vector viral de arenavirus infeccioso, deficiente en replicación que comprende: a. transfectar en una célula huésped el ADNc de la reivindicación 13;
b. mantener la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la formación de virus; y
c. recolectar el vector viral arenavirus infeccioso, deficiente en replicación;
en donde la célula huésped expresa el marco de lectura abierto del segmento genómico que se elimina o inactiva funcionalmente;
opcionalmente en donde el método comprende además en la etapa a. transfectar en la célula huésped: un ADNc de un segundo segmento genómico de arenavirus, un ácido nucleico que comprende el ORF de proteína L y/o un ácido nucleico que comprende el ORF de NP.
15. Una composición farmacéutica que comprende un primer vector viral de arenavirus infeccioso, deficiente en replicación modificado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir partículas de progenie infecciosas adicionales en células normales, no modificadas genéticamente, en donde un marco de lectura abierto de arenavirus se elimina y se reemplaza por una primera secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
y un segundo vector viral de arenavirus infeccioso, deficiente en replicación, modificado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir partículas de progenie infecciosas adicionales en células normales, no modificadas genéticamente, en donde un marco de lectura abierta de arenavirus se elimina y se reemplaza por una segunda secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HBc del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de proteínas HBs y HBc del HBV o fragmentos antigénicos de las mismas; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma;
en donde la primera y la segunda secuencia de nucleótidos son diferentes; en donde el primer vector viral y el segundo vector viral son capaces de provocar una respuesta de células T contra la proteína HBc del HBV, la fusión de proteínas HBs y HBc del HBV, la proteína pre-S2/S del HBV o un fragmento antigénico de la misma.
16. El vector viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o la composición farmacéutica, composición inmunogénica o vacuna de la reivindicación 10, o la composición farmacéutica de la reivindicación 15, en donde el vector viral, composición farmacéutica, composición inmunogénica o vacuna son adecuados para administración intramuscular o administración intravenosa.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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HK1246183A1 (zh) 2015-06-10 2018-09-07 Hookipa Biotech Gmbh Hpv疫苗
CN115948467A (zh) * 2015-11-04 2023-04-11 霍欧奇帕生物科技有限公司 针对乙型肝炎病毒的疫苗
CA3003548A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Hookipa Biotech Ag Arenavirus particles as cancer vaccines
MA46535A (fr) 2016-10-14 2019-08-21 Prec Biosciences Inc Méganucléases modifiées spécifiques de séquences de reconnaissance dans le génome du virus de l'hépatite b
JP2022010187A (ja) * 2017-02-03 2022-01-14 株式会社三洋物産 遊技機
JP2022010188A (ja) * 2017-02-03 2022-01-14 株式会社三洋物産 遊技機
US11021692B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
EA202091517A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv)
US11020476B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV)
WO2019195181A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Gilead Sciences, Inc. Antibodies and fragments thereof that bind hepatitis b virus protein x
TW201945388A (zh) 2018-04-12 2019-12-01 美商精密生物科學公司 對b型肝炎病毒基因體中之識別序列具有特異性之最佳化之經工程化巨核酸酶
AU2020297011A1 (en) * 2019-06-18 2022-02-10 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Arenavirus vectors for hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
EP3986454A1 (en) * 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
MX2021015452A (es) 2019-06-25 2022-02-11 Gilead Sciences Inc Proteinas de fusion flt3l-fc y metodos de uso.
KR20220074917A (ko) 2019-09-30 2022-06-03 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Hbv 백신 및 hbv를 치료하는 방법
US20220380805A1 (en) * 2019-11-07 2022-12-01 Universität Basel Arenaviruses as vectors
DK4069729T3 (da) 2019-12-06 2025-04-07 Prec Biosciences Inc Optimerede, modificerede meganukleaser med specificitet for en genkendelsessekvens i hepatitis b-virusgenomet
JP7711068B2 (ja) 2019-12-24 2025-07-22 カルナバイオサイエンス株式会社 ジアシルグリセロールキナーゼ調節化合物
AR121620A1 (es) 2020-03-20 2022-06-22 Gilead Sciences Inc Profármacos de nucleósidos 4’-c-sustituidos-2-halo-2’-deoxiadenosina y métodos de preparación y uso de los mismos
KR102375703B1 (ko) 2020-07-28 2022-03-17 경북대학교 산학협력단 사물 인터넷 환경에서 CoAP 기반의 데이터 스트리밍 방법 및 통신 시스템
BR112023019365A2 (pt) 2021-03-23 2023-12-26 Hookipa Biotech Gmbh Segmento s de arenavírus, cdna, vetor de expressão de dna, célula hospedeira, partícula de arenavírus trissegmentada, método para gerar uma partícula de arenavírus trissegmentada, composição farmacêutica, método para tratar câncer de próstata e kit
US20250034213A1 (en) * 2021-04-21 2025-01-30 La Jolla Institute For Immunology Engineered arenavirus glycoprotein compositions, methods and use thereof
CN113201051B (zh) * 2021-04-27 2022-08-02 复旦大学 一种乙肝病毒表面蛋白突变体及其在抗乙肝病毒中的应用
EP4337223A1 (en) 2021-05-13 2024-03-20 Gilead Sciences, Inc. Combination of a tlr8 modulating compound and anti-hbv sirna therapeutics
AU2022298639C1 (en) 2021-06-23 2025-07-17 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
KR20240005901A (ko) 2021-06-23 2024-01-12 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
AU2022299051B2 (en) 2021-06-23 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
KR20240025616A (ko) 2021-06-23 2024-02-27 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 다이아실글리세롤 키나제 조절 화합물
AU2024343172A1 (en) 2023-09-15 2026-03-05 Gilead Sciences, Inc. Arenavirus formulations, methods and uses thereof
US20250345389A1 (en) 2024-05-13 2025-11-13 Gilead Sciences, Inc. Combination therapies
WO2025240242A1 (en) 2024-05-13 2025-11-20 Gilead Sciences, Inc. Combination therapies with ribavirin
WO2025240244A1 (en) 2024-05-13 2025-11-20 Gilead Sciences, Inc. Combination therapies comprising bulevirtide and lonafarnib for use in the treatment of hepatitis d virus infection
WO2025240246A1 (en) 2024-05-13 2025-11-20 Gilead Sciences, Inc. Combination therapies with ribavirin

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
JPH1084967A (ja) * 1996-09-19 1998-04-07 Fujirebio Inc Ｂ型肝炎のｅ抗原
AU770225B2 (en) * 1998-12-04 2004-02-19 Biogen Idec Ma Inc. HBV core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands
FR2803599B1 (fr) * 2000-01-06 2004-11-19 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau virus mute de l'hepatite b, ses constituants nucleiques et proteiques et leurs applications
US20100183652A1 (en) * 2002-02-21 2010-07-22 Mark Page STABILIZED HBc CHIMER PARTICLES AS THERAPEUTIC VACCINE FOR CHRONIC HEPATITIS
WO2006125983A1 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 Oxxon Therapeutics Ltd Compositions for inducing an immune response against hepatitis b
CN101037476A (zh) * 2006-03-15 2007-09-19 复旦大学 一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白及其载体
WO2007109813A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
US8063063B2 (en) 2006-03-23 2011-11-22 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
CA2673870A1 (en) * 2006-12-27 2008-07-10 Emory University Compositions and methods for the treatment of infections and tumors
PL2604695T3 (pl) * 2007-12-27 2023-04-11 Universität Zürich Cząstka arenawirusa z defektem replikacji
KR20120052352A (ko) 2009-08-07 2012-05-23 트랜스진 에스.에이. Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물
US10076570B2 (en) * 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
EP3266464A3 (en) * 2011-02-12 2018-03-14 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
CN110042110A (zh) 2012-01-24 2019-07-23 桑福德健康公司 用于治疗致癌病毒多肽阳性肿瘤的多核苷酸
ES2751423T3 (es) 2013-03-15 2020-03-31 Univ Geneve Vacunas antimicobacterianas
GB201305361D0 (en) 2013-03-25 2013-05-08 Univ Edinburgh Enhanced expression
DK3077519T3 (en) 2013-12-03 2021-06-14 Hookipa Biotech Gmbh Cmv-vacciner
WO2015183895A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 University Of Rochester Novel arenavirus vaccine
US9943585B2 (en) 2014-07-30 2018-04-17 University Of Rochester Methods and compositions related to reorganization of arenavirus genome for development of novel arenavirus live-attenuated vaccines (LAV)
BR112017005744B1 (pt) 2014-09-22 2023-11-28 Regents Of The University Of Minnesota "vírus pichinde geneticamente manipulado, método de fabricação e uso do mesmo, partícula viral infecciosa, composição, coleção de vetores, sistema de genética reversa e método de uso do mesmo"
GB201419572D0 (en) 2014-11-03 2014-12-17 Pirbright Inst The Virus
HUE051390T2 (hu) * 2014-11-13 2021-03-01 Univ Geneve Háromszegmensû arenavírusok mint vakcinavektorok
DE102015207036A1 (de) 2015-04-17 2016-10-20 Karl Sebastian Lang Arenaviren zur Anwendung bei der Behandlung und/oder Vorbeugung von Tumoren sowie Verfahren zur Herstellung von Arenaviren mit (verbesserten) tumorregressiven Eigenschaften
HK1246183A1 (zh) 2015-06-10 2018-09-07 Hookipa Biotech Gmbh Hpv疫苗
EP3365005B1 (en) 2015-10-23 2025-04-09 Institut Pasteur Recombinant mopeia virus and vaccine platform
CN115948467A (zh) 2015-11-04 2023-04-11 霍欧奇帕生物科技有限公司 针对乙型肝炎病毒的疫苗
CA3003548A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Hookipa Biotech Ag Arenavirus particles as cancer vaccines
US10980877B2 (en) 2016-04-28 2021-04-20 The University Of Chicago Method for treating melanoma using lymphangiogenesis inducers and a melanoma-specific antigen
IL314272A (en) 2016-05-18 2024-09-01 Hookipa Biotech Gmbh Three-segmented PICHINDE viruses as vaccine vectors
JP2019533690A (ja) 2016-11-04 2019-11-21 ホオキパ バイオテック ジーエムビーエイチ 癌ワクチンとしての複製欠損性アレナウイルス粒子及び３セグメント型アレナウイルス粒子
AU2018247958A1 (en) 2017-04-07 2019-10-10 Hookipa Biotech Gmbh Arenavirus particles to treat solid tumors

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