KR20210112343A - 재조합 단순 헤르페스 바이러스 2 (hsv-2) 백신 벡터를 사용한 면역의 수동 전달 - Google Patents

재조합 단순 헤르페스 바이러스 2 (hsv-2) 백신 벡터를 사용한 면역의 수동 전달 Download PDF

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벳시 헤롤드
쥬니어 윌리엄 제이콥스
파블로 에이. 곤잘레스-무노즈
크리스토퍼 페트로
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Abstract

재조합 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2) 백신 벡터, 이의 비리온, 이를 포함하는 조성물 및 백신을 사용한 면역의 수동 전달 방법.

Description

재조합 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2) 백신 벡터를 사용한 면역의 수동 전달
관련 출원에 대한 상호-참조
본 PCT 국제 출원은, 2014년 3월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/946,965호 및 2014년 11월 17일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/080,663호에 대한 우선권을 주장하는 2015년 3월 2일자로 출원된 PCT 국제 출원 PCT/US2015/018272의 일부 계속 출원인, 2016년 2월 4일자로 출원된 미국 특허 출원 제15/015,322호 (현재 2018년 6월 19일자로 등록된 미국 특허 제9,999,665호)의 계속 출원인, 2018년 6월 1일자로 출원된 미국 시리즈 제15/995,471의 일부 계속 출원인, 2019년 1월 3일자로 출원된 미국 시리즈 제15/995,471호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 모두의 내용은 본원에 참조로 통합된다.
정부 지원 진술서
본 발명은 국립 보건원 (the National Institutes of Health)에서 수여하는 과제 번호 AI061679, AI51519, AI097548, AI026170 및 AI065309에 따라 정부의 지원을 받아 수행하였다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 가지고 있다.
본 출원 전체에서 대괄호 안의 숫자로 표시되는, 다양한 간행물이 참조된다. 이러한 참고문헌에 대한 전체 인용은 명세서 끝에서 찾을 수 있다. 본원에 언급된 이들 간행물, 및 모든 특허, 특허 출원 공개 및 서적의 개시내용은 본 발명이 속하는 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
단순 헤르페스 바이러스 (Herpes simplex virus) 타입 1 및 타입 2 (HSV-1 및 HSV-2)는 전 세계적으로 심각한 건강 문제로 지속되어, 전 세계의 개발 도상국 및 가난한 지역 사회에 불균형적으로 영향을 미치고, HIV 전염병을 유발한다. 현재 HSV-1, HSV-2 또는 HIV에 대한 효과적인 백신이 없기 때문에 이러한 감염에 대한 백신이 시급히 필요하다. HSV-1은 감염성 실명의 주요 원인이고, HSV-2는 전 세계적으로 생식기 궤양 (genital ulcers)의 주요 원인이지만, HSV-1은 이제 선진국에서 생식관 질환 (genital tract disease)과 관련하여 더 일반적으로 확인되고 있다. 생식기 포진 (Genital herpes)은 감염된 사람에게 홍반이 생기고 (stigmatize) 심리적으로 영향을 미칠 수 있는, 평생 지속되는 재발성 질환이다. HSV-2 감염은 HIV를 획득하고 전파할 가능성을 크게 증가시키는 반면, 각 혈청형의 수직 전파는 종종 심각한 유아 이환율 또는 사망으로 이어진다. 바이러스 당단백 D를 단독으로 사용하거나 또는 당단백 B와 함께 사용하는 (gD 및 gB) 서브-유닛 제제 (sub-unit formulations)에 기반한 HSV-2 백신의 최근 임상 시험은 전신 중화 항체를 유도함에도 불구하고 실패하였다. 놀랍게도 HSV-2 gD 서브유닛 (gD-2) 백신은 HSV-1에 대한 부분 보호 (partial protection)를 제공하였지만, HSV-2에 대해서는 보호 (protection)를 제공하지 않았다. 여러 약독화된 바이러스가 전임상에서 평가되었지만, 현재까지의 임상 연구는 치료적 적용 (재발 빈도 감소)으로 제한되었으며, 또한 효능을 보여주지 못하였다. 따라서 신규 백신 전략을 설계하고, 평가해야 한다.
본 발명은 새롭고 개선된 HSV-1 및 HSV-2 백신에 대한 이러한 요구를 다룬다.
제1 대상체에서 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2로 면역화된 임신한 여성으로부터의 산물을 제1 대상체에서 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로, 상기 제1 대상체에게 수동 전달 (passive transfer)을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포 (complementing cell)에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 (phenotypically) 보완된 것이며, 상기 산물은 이에 의해 유도된 항체를 포함하고, 상기 제1 대상체는 태아 또는 신생아이다.
신생아에서 주산기 (perinatal) HSV-1 및/또는 HSV-2 감염을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 신생아가 될 태아를 임신한 여성에게, 게놈에서 HSV-1 및/또는 HSV-2 당단백 D-코딩 유전자를, 신생아에서 주산기 HSV-1 및/또는 HSV-2 감염을 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것이다.
모체로부터 그녀의 신생아에게 HSV-1 및/또는 HSV-2 바이러스의 전파 (dissemination)를 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 모체에게 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를, 모체로부터 그녀의 신생아에게 HSV-1 및/또는 HSV-2 바이러스의 전파를 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것이다.
HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자 (U s6 )가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자 (U s6 )가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 게놈 또는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-1 유전자를 그 안에 포함하는 단리된 세포가 제공되며, 상기 세포는 인간에게 존재하지 않는다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 바이러스 또는 비리온의 게놈은 적어도 제2 유전자의 결실을 포함하고, 상기 제2 유전자는 HSV-2 바이러스 복제 또는 독성 (virulence)에 필요하다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또한, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을 대상체에서 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체에서 HSV-1, HSV-2, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염 (co-infection)을 치료하거나 또는 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염을 치료하거나 또는 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 백신화 (vaccinating)하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 백신화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 면역화 (immunizing)하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 면역화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
백신, 조성물 및 약학적 조성물, 및 이의 사용 방법의 일 구체예에서, 상기 재조합 HSV-2의 양은 명시된 목적을 달성하는데 효과적인 재조합 HSV-2의 pfu의 양이다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 이의 지질 이중층 상에 HSV-1 또는 HSV-2 당단백질 D를 포함하는, 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 비리온을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 HSV-1 또는 HSV-2 당단백질 D를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)로, 상기 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 복제를 허용하는 조건하에 감염시키는 단계 및 상기 세포에 의해 생성된 HSV-2 비리온을 회수하는 단계를 포함한다.
또한, 재조합 핵산이 HSV-2 당단백질 D를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 것을 제외하고는 야생형 HSV-2의 게놈과 동일한 서열을 갖는 재조합 핵산이 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염을 치료 또는 예방하기 위해, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염을 치료 또는 예방하기 위해 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다.
HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 그 안에 포함하는 단리된 세포가 제공되며, 상기 세포는 인간에게 존재하지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 바이러스 또는 비리온의 게놈은 적어도 제2 유전자의 결실을 포함하고, 상기 제2 유전자는 HSV-2 바이러스 복제에 필요하다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스, 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또한, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을 대상체에서 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료하거나 또는 대상체에서 HSV-2로 인한 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료하거나 또는 HSV-2 감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2 감염에 대해 대상체를 백신화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-2에 대해 대상체를 백신화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2 감염에 대해 대상체를 면역화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-2에 대해 대상체를 면역화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 이의 지질 이중층 상에 HSV-1 당단백질 D를 포함하는, 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 비리온을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 HSV-1 당단백질 D를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)로, 상기 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 복제를 허용하는 조건하에 감염시키는 단계, 및 상기 세포에 의해 생성되는, 지질 이중층 상에 HSV-1 당단백질 D를 포함하는 재조합 HSV-2 비리온을 회수하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 이의 지질 이중층 상에 비-HSV-2 표면 당단백질을 포함하는, 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 비리온을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 비-HSV-2 표면 당단백질을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)로, 상기 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 복제를 허용하는 조건하에 감염시키는 단계, 및 상기 세포에 의해 생성되는, 지질 이중층 상에 비-HSV-2 표면 당단백질을 포함하는 재조합 HSV-2 비리온을 회수하는 단계를 포함한다.
또한, 서열이 HSV-2 당단백질 D를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 것을 제외하고는 HSV-2의 게놈과 동일한 서열을 갖는 재조합 핵산이 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료 또는 예방하기 위해, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-1 감염을 치료 또는 예방하기 위해 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료 또는 예방하기 위해, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염을 치료하거나, 또는 대상체에서 HSV-2 감염 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료하거나 또는 HSV-2 감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양 또는 대상체에서 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염을 치료하거나 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 백신화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 백신화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 면역화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 면역화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 병원체의 이종 항원을 추가로 포함하는, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, 대상체에서 항원 표적에 대해 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (antibody dependent cell mediated cytotoxicity: ADCC)을 유도하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 이의 지질 이중층 상에 이종 항원을 추가로 포함하는, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)를, 항원 표적에 대해 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도하는데 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1: HSV-2 ΔgD는 불현 감염 (abortive infection)을 개시한다: HSV-2 ΔgD-/+는 트란스로 gD를 제공하는 세포에서만 성공적으로 복제되고 (예: VD60 [40, 41]), 그러나 U S 6을 코딩하지 않는 세포 예컨대 Vero 세포 (ATCC CCL-81, Green monkey kidney) 또는 CaSki (ATCC CRL-1550, Homo sapiens, cervix)에서는 복제되지 않는다. 비-보완된 HSV-2 ΔgD (Vero 세포로부터 수득된 ΔgD-/-)는 U S6 을 코딩하지 않는 세포 예컨대 Vero 및 CaSki를 감염시킬 수 없다.
도 2A-C: A. HSV-2 ΔgD-/+ 바이러스의 최대 107개의 플라크-형성 단위 (plaque-forming units: pfu)를 접종한 중증 복합 면역결핍 (severe combined immunodeficiency: SCID) 마우스는 고용량의 질내 또는 피하 접종 후에 질병 징후를 나타내지 않았다. 대조적으로, 1,000-배 더 낮은 바이러스 용량 (104 pfu)으로 야생형 바이러스를 접종한 SCID 마우스는 질병에 걸렸다. 도 2A에는 생존율 곡선을 나타내고, 도 2B에는 홍반, 부종 또는 생식기 궤양의 증거로 상피 스코어 (스케일 0 내지 5)를 나타내며, 도 2C에는 신경세포 감염 (neuronal infection)의 증거로 신경학적 스코어 (스케일 0 내지 5)를 나타낸다.
도 3A-C: HSV-2 ΔgD-/+ 바이러스를 사용한 면역화는 항-HSV-2 항체를 유발한다. sc.-sc. 면역화는 상당한 수준의 전신 및 점막 (질 세척액) 항-HSV-2 항체 모두를 유발하고, HSV-2 ΔgD-/+를 사용한 sc.-i.vag. 면역화는 더 낮은 수준의 전신 항-HSV-2 항체를 유발하고, 질 세척액에서 항체 수준의 증가는 없었다. 도 3A에는 혈청 중 항-HSV-2 항체 수준을 나타내고, 도 3B에는 질 세척액에서 항-HSV-2 항체 수준을 나타낸다. ΔgD-/+로 면역화된 마우스는 용균성 HSV-2로 챌린지한 후에 혈청 중 중화 항-HSV-2 항체를 나타낸다. 도 3C에는 ΔgD-/+ 면역화에 의해 유발된 항체의 중화 능력 (neutralizing capacity)을 나타낸다 (* p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).
도 4A-C: 도 4A: Tg T 세포로 전달된 후에, HSV-2 ΔgD-/+ 또는 VD60 용균물 (대조군)로 프라임 (prime) 및 부스트 (boost)한 C57Bl/6 마우스의 비장에서 CD8+ gBT-I T 세포 수. 도 4B: 백신화된 마우스 또는 대조군 마우스의 비장에서 gBT-I 기억 T 세포의 퍼센트. 도 4C: 부스트 14일 후에, 비장세포 (splenocytes)를 단리하고, gB498-505 펩티드로 인 비트로에서 재-자극하고, 6시간 후에 세포내 사이토킨 염색 및 유세포 분석에 의해 사이토킨 생성에 대해 분석하였다. (*p<0.05; **p< 0.01; ***p<0.001).
도 5A-F: HSV-2 ΔgD-/+ (106 pfu/마우스)를 사용한 면역화는 치사 HSV-2 챌린지로부터 마우스를 보호한다. 마우스를 피하로 프라임하고, 3주 후에 sc. 또는 i.vag.로 부스트한 후에, 부스트하고 3주 후에 용균성 야생형 HSV-2 (4674)의 LD90으로 챌린지하였다. 대조군 (VD60 세포 용균물로 면역화됨) 마우스는 상당한 체중 감소 (5A) 및 사망 (5B)으로 나타난 바와 같이 질병에 걸린 반면에, ΔgD-/+-면역화된 마우스는 현저히 적은 병리를 나타내었다. 더욱이, ΔgD-/+-면역화된 마우스는 치사량의 챌린지 후에 더 적은 상피 질환 (C) 및 신경학적 병리 (D)를 보였다. 또한, ΔgD-/+-백신화된 마우스는 대조군으로서 VD60 세포 용균물로 면역화된 마우스와 비교하여, 용균성 HSV-2의 치사량 (lethal dose)으로 질내 챌린지 후에 질 세척액 (E), 질 조직 및 배근 신경절 (dorsal root ganglia: DRG) (F)에서 현저히 적은 바이러스 로드 (viral loads)를 나타내었다. 4일차의 질 세척액 또는 5일차의 질 조직 및 DRG에서 ΔgD-/+-면역화된 마우스로부터 감염성 바이러스를 회수할 수 없었다. (*p<0.05; **p< 0.01; ***p<0.001).
도 6A-C: HSV-2 ΔgD-/+로 면역화된 마우스는 용균성 HSV-2로 챌린지한 후에 질 세척액에서 염증성 사이토킨을 적게 분비한다. HSV-2 ΔgD-/+로 면역화된 마우스는 VD60 용균물로 면역화되고 용균성 HSV-2로 챌린지된 마우스보다 질 세척액에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 적게 분비한다. 염증성 사이토킨 발현의 차이는 챌린지 후 다양한 시점에서 관찰된다. (*p<0.05; **p< 0.01; ***p<0.001).
도 7A-D: HSV-2 ΔgD-/+를 사용한 면역화는 T 세포를 감염 부위 및 관련 LN으로 동원한다. ΔgD-/+로 sc.-sc. 면역화된 마우스는 용균성 HSV-2로 챌린지 후에 천골 (sacral) 림프절 (lymph nodes: LNs)에서 활성화된 항-HSV-2 gBT-I CD8+ (A) 및 CD4+ T 세포 (B)의 퍼센트 증가를 나타내었다. LN을 추출하고, UV-불활성화된 ΔgD-/-와 6시간 동안 인큐베이션한 후에, 유세포 분석기 분석을 위해 항체로 염색하였다. ΔgD-/+로 sc.-i.vag. 면역화된 마우스는 용균성 HSV-2로 챌린지한 후에 질내 항-HSV-2 gBT-I CD8+ (C) 및 CD4+ T 세포 (D) 수가 증가되었음을 나타내었다. 질 조직을 처리하여 T 세포를 추출하고, 유세포 분석기 분석을 위해 항체로 염색하였다. 세포 계수는 (CountBrightTM, Life Technologies)로 수행하였다. (*p<0.05; **p< 0.01).
도 8A-8C. HSV-2 ΔgD-2는 5x104 PFU의 낮은 백신 용량으로 질내 또는 피부 챌린지 후에 질병에 대한 완전한 보호를 제공한다. C57BL/6 마우스를 프라임한 다음에 21일 후에, 5x104 PFU, 5x105 PFU, 5x106 PFU의 HSV-2 ΔgD-2 또는 VD60 용균물 (대조군)로 피하로 (sc) 부스트하였다. 후속하여 부스트 21일 후에 마우스를 HSV-2(4674)의 LD90으로 (A) 질내로 또는 (B) 피부 난절 (skin scarification)을 통해 챌린지한 후에, 생존율 (n=5 마우스/그룹) 및 질병 스코어 (C)를 추적하였다. HSV-2 항체에 대해, 프라임 전 (PreBleed), 프라임 후 7일차, 및 부스트 후 7일 차에 ELISA를 통해 혈청을 평가하였다 (선은 평균을 나타냄). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, two-way ANOVA를 통한 ΔgD-2 백신화 그룹 대 대조군-백신화 그룹. Kaplan Meier 분석을 생존 곡선에 사용하였다.
도 9A-9D. HSV-2 ΔgD-2로 백신화된 마우스는 HSV-1 및 HSV-2의 임상적 단리 물 (clinical isolates)로부터 보호된다. C57BL/6 (n=7 마우스/그룹) 또는 Balb/C (n=5 마우스/그룹) 마우스를 ΔgD-2 또는 VD60 세포 용균물 (대조군)로 면역화하고, 후속하여 가장 용균성인 단리물의 LD90 용량으로 챌린지하고, 피부 병변 (9A; C57BL/6 마우스의 대표적인 이미지), 생존율 (9B; C57BL/6 마우스 및 9C; Balb/C)에 대해 매일 모니터링하였다. 추가 C57BL/6 마우스를 SD90의 LD90 용량의 10배 및 100배 (10x 및 100x) 및 Bx31.1의 LD90의 10배로 챌린지하고, 생존율 (9D)을 모니터링하였다. HSV-2 ΔgD-2-백신화 그룹 대 대조군-백신화 그룹에 대한 생존율을 Kaplan Meier 분석에 의해 비교하였다, ***p<0.001).
도 10A-10D. HSV-2 ΔgD-2 면역화된 마우스를 임상적 단리물로 챌린지한 후에, 바이러스는 빠르게 제거되고, 잠복성 바이러스 (latent virus)도 검출되지 않았다. 마우스를 ΔgD-2 또는 VD60 세포 용균물 (대조군)로 면역화하고, 후속하여 HSV-1 (B3x1.1)의 LD90의 1x 또는 10x, 또는 HSV-2 (SD90)의 LD90의 1x, 10x 또는 100x로 피부 난절에 의해 챌린지하였다 (그룹당 n=5 마우스). 피부 생검을 챌린지 후 2일차 및 5일차에 수득하였고, 플라크 분석 (plaque assay)에 의해 Vero 세포에서 바이러스 로드에 대해 분석하였다 (10A) (n=3 샘플/그룹, 선은 평균을 나타냄). ΔgD-2 백신화된 마우스 (챌린지 후 14일차) 또는 대조군 백신화된 마우스 (안락사 시에)로부터 수득된 DRG 조직에서 복제 또는 잠복성 HSV의 존재를 각각 플라크 분석 (10B) 및 qRT-PCR (10C)에 의해 수행하였다 (n=5 마우스/그룹). 잠복성 (latency)은 챌린지 후 5일차에 HSV-2 SD90의 LD90으로 챌린지된 ΔgD-2 및 대조군 면역화된 마우스로부터 단리된 DRG와 함께 Vero 세포를 공동-배양함으로써 추가로 평가되었다 (10D). 패널 B 및 C의 데이터는 박스로 나타내었고, 검정색 점을 가진 whisker 플롯은 이상치 (outliers)를 나타낸다. HSV-2 ΔgD-2-백신화 그룹 및 대조군-백신화 그룹은 student's t-test로 비교되었다; *p<0.05; **p< 0.01; ***p<0.001.
도 11A-11D. HSV-2 IgG2 특이적 항체는 바이러스 챌린지 후에 HSV-2 ΔgD-2 백신화 마우스의 피부로 빠르게 동원된다. (11A) 마우스를 ΔgD-2 또는 VD60 세포 용균물 (대조군)로 면역화한 후에, 피부에서 HSV-1 (B3x1.1) 및 HSV-2 (SD90) 임상적 단리물로 챌린지하였다. 피부 생검은 부스트 후 21일차 및 챌린지 후 2일차에 수득하고, 항원으로서 HSV-2 (좌측) 또는 HSV-1 (우측) 감염된 세포 용균물을 사용하여 ELISA로 균질물 (1:103 희석)에서 항-HSV 항체의 존재에 대해 평가하였다 (그룹당 n=3 마우스, 선은 평균을 나타냄). 피부에서 HSV-특이적 항체를 추가로 정량분석하기 위해, 피부 균질물의 풀 (pool)을 계열 희석하고, HSV-2 ELISA에서 분석하였다 (풀당 6마리의 마우스 및 결과는 중복으로부터 수득된 평균±SD임) (11B). 챌린지 후 2일차에 피부 균질물 풀에서 항-HSV-2 IgG 서브-이소타입들의 비율을 서브-이소타입 특이적 2차 항체를 사용하여 결정하였다 (11C). 부스트 후 7일 차에 HSV-2 ΔgD-2 또는 대조군 백신화 마우스로부터 혈청 중 항체-의존성-세포-포식작용 (Antibody-dependent-cellular-phagocytosis: ADCP) 활성 (좌측 패널)을 THP-1 단핵구 세포주 및 HSV-2 바이러스 세포 용균물 (v) 또는 세포 용균물 (c)로 코팅된 비드를 사용하여 정량분석하였다. IFN-γ 수준 (우측 패널)을 THP-1 및 Ab/비드 인큐베이션 8시간 후에 상등액에서 측정하였다 (11D). 상기 % ADCP는 106으로 나눈 양성 세포의 MFI를 곱한 비드에 대해 양성인 세포의 퍼센트로 계산된다 (좌측 패널). (*p<0.05; **p< 0.01; ***p<0.001, HSV-2 ΔgD-2 대 대조군-백신화 그룹, student's t-test)
도 12A-12H. HSV-2 ΔgD-2 백신화된 마우스에서 챌린지 후 5일까지 적응 및 내재 면역 세포를 감염된 피부로 동원한다. ΔgD-2 또는 VD60 용균물 (대조군)로 면역화된 후에, SD90 또는 Bx31.1의 LD90으로 챌린지된 마우스 또는 비백신화된 모의-감염된 대조군 마우스의 피부 절편을 CD3+ (T 세포) (12A), B220+ (B 세포) (12B) 또는 Iba1+ (범 대식세포 (pan macrophage)) (12C)에 대해 염색하였고; HSV-1 (B3x1.1) 또는 HSV-2 (SD90)로 챌린지한 후에 대표적인 면역조직화학 이미지가 개시된다. CD3+ (12D), B220+ (12E) 및 Iba1+ (12F) 세포의 퍼센트는 마우스 당 3개의 무작위 필드를 계수하여 열거되었다 (그룹당 5마리의 마우스). 피부 절편은 또한 면역 형광법에 의해 CD4+ (12G) 및 CD8+ (12H)에 대해 염색하였고, 양성 세포 퍼센트를 정량분석하였다. 각 기호는 개별 마우스에 대한 2개의 필드의 평균이며, 선은 평균을 나타내고; 점선은 비백신화, 모의-감염된 마우스로부터의 수를 나타낸다 (1개의 마우스에 대한 3개 필드의 평균) (*p<0.05, student's t-test에 의한 ΔgD-2- 대 대조군-백신화 그룹).
도 13. ΔgD-2가 아닌 대조군으로 백신화된 마우스는 피부 생검에서 지속성 호중구 침윤 (persistent neutrophil infiltration)을 갖는다. 비면역화 모의-감염된 마우스 또는 HSV-2 ΔgD-2 또는 VD60 용균물 (대조군)로 면역화되고 HSV-1 (B3x1.1) 바이러스로 감염된 마우스의 피부 절편을 챌린지 후 5일차에 수확하고, Ly6G를 사용하여 호중구에 대해 염색하였다 (적색). 핵은 DAPI로 청색으로 염색된다.
도 14A-14F. ΔgD-2로 면역화된 마우스는 대조군 면역화된 마우스와 비교하여 챌린지 후 5일까지 피부에서 염증성 사이토킨 및 케모카인을 감소시켰다. 챌린지 후 2일차 또는 5일차에 ΔgD-2 또는 VD60 용균물 (대조군)로 면역화된 마우스 (또는 비면역화, 비감염된 대조군)로부터의 피부 생검을 균질화하고, TNF (14A), IL-1β (14B), IL-6 (14C), CXCL9 (14D), CXCL10 (IP-10) (14E), 및 IL-33 (14F)에 대해 평가하였다 (n=6 동물/그룹, 선은 평균, 점선은 비면역화, 모의-감염된 동물로부터의 수를 나타냄). (*p<0.05; **p< 0.01; ***p<0.001, HSV-2 ΔgD-2-백신화 그룹 대 대조군-백신화 그룹, students t-test.
도 15A-15C. ΔgD-2를 사용한 모성 면역화 (Maternal immunization)는 신생아를 보호한다; 연령 의존성 반응. 그래프는 일수 대비 생존율 퍼센트를 나타낸다. HSV-1 및 HSV-2에 대한 유의미한 보호가 ΔgD-2 백신화된 어미 (vaccinated dams)로부터 태어난 7일 (15A) 및 14일 (15B)된 새끼에서 관찰되었지만, 새끼를 생애 1일차에 챌린지한 경우 보호가 감소되었다 (15C).
도 16A-16D. 보호는 HSV-특이적 FcγRIV-활성화 항체의 전달과 관련이 있다. ΔgD-2 또는 VD60 (대조군) 백신화된 어미로부터 태어난 7일령 새끼를 105 pfu의 HSV-1 또는 HSV-2로 비강내로 챌린지하였고, 희생 시점 또는 챌린지 후 14일차에 새끼로부터 혈청을 수집하였고, 하기와 같이 평가하였다: 16A: 1:1000 희석으로 ELISA에 의해 정량분석된 HSV-1 (닫힌 기호) 또는 HSV-2 (열린 기호) 특이적 IgG; 16B: HSV-1-특이적 또는 HSV-2-특이적 항체의 IgG 서브타입은 ΔgD-2가 IgG1 및 IgG2 모두를 유도하는 것을 입증하였고, 여기서 IgG2가 약간 우세함; 16C: 중화 항체 역가는 ΔgD-2 면역 혈청 (1:5 희석)에 의한 보완-비의존성 중화 (complement-independent neutralization)를 거의 또는 전혀 나타내지 않음; 16D: FcγRIV-활성화 항체 역가.
도 17. ΔgD-2 모성 백신화 (maternal vaccination)는 잠복성 부위인 삼차 신경절 (trigeminal ganglia)에서 HSV 바이러스 DNA의 검출량을 감소시킨다. 백신화된 모체로부터 태어난 신생아 마우스는 이들의 삼차 신경절 (비강내 감염으로 인한 잠복성 부위)에서 qPCR에 기반하여 HSV 카피의 로그 #를 감소시켰다.
도 18A-18D. ΔgD-2 모성 백신화는 중요 장기 (폐, 간, 뇌, 신장)으로의 전파를 감소시켰다.
도 19A-19B. 태반경유 (transplacental) 및 모유 (breastmilk) 획득된 Ab는 뮤린 모델 (murine model)에서 최적의 보호를 제공한다. ΔgD-2 또는 VD60 (대조군) 면역화된 어미로부터 태어난 새끼는 출생시 전환 (switch)하여, 반대쪽 어미에 의해 양육한 다음에, 생애 7일 또는 14일차에 HSV-1 (19A) 또는 HSV-2 (19B)로 챌린지하였다. ΔgD-2 백신화된 모체로부터 태어난 새끼는 해당 어미에 의해 양육되는 경우 상당한 보호를 받았지만, VD60-면역화된 모체에 의해 양육되는 경우 보호를 상실하였다. 반대로, VD60-면역화된 모체로부터 태어난 새끼는 ΔgD-2 백신화된 어미에 의해 양육된 경우 7일 또는 14일차에 바이러스 챌린지로부터 상당히 보호되었다.
도 20. 태반경유 및 모유 획득된 Ab를 통해 잠복에 대한 최적의 보호.
도 21A-21B. 보호는 챌린지 시에 신생아의 혈청 중에 존재하는 Ab 수준과 관계가 있다.
도 22A-22D. 치사량 이하 (sublethal dose)의 HSV로 감염된 마우스로부터 회복기 면역 혈청 (convalescent immune serum)은 후속하는 바이러스 챌린지로부터 새끼를 보호하지 못하였다.
제1 대상체에서 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2로 면역화된 임신한 여성으로부터의 산물을 제1 대상체에서 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로, 상기 제1 대상체에게 수동 전달을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것이며, 상기 산물은 이에 의해 유도된 항체를 포함하고, 상기 제1 대상체는 태아 또는 신생아이다.
구체예에서, 상기 산물은 임신한 여성의 혈청을 포함한다.
구체예에서, 상기 산물은 임신한 여성의 모유를 포함한다.
구체예에서, 상기 제1 대상체는 태아이다.
구체예에서, 상기 제1 대상체는 신생아이다.
구체예에서, 상기 제1 대상체는 제2 대상체로부터 태어난다.
구체예에서, 상기 임신한 여성은 태아를 임신하고 있다.
구체예에서, 상기 제1 대상체 및 임신한 여성은 인간이다.
구체예에서, 상기 산물은 결실이 있는 HSV-2로 임신한 여성을 면역화하여 유발된 항체를 포함한다. 구체예에서, 상기 산물은 FcγRIV-활성화 항체를 포함한다. 구체예에서, 상기 산물은 IgG1 및 IgG2 항체를 포함한다. 구체예에서, 상기 산물은 항-HSV-1 IgG 또는 항-HSV-2 IgG를 포함한다.
구체예에서, 상기 방법은 제1 대상체에서 HSV-2에 대해 면역 반응을 유발한다.
구체예에서, 상기 방법은 제1 대상체에서 HSV-1에 대해 면역 반응을 유발한다.
구체예에서, 상기 산물은 면역 보강제 (immunological adjuvant)를 추가로 포함한다.
구체예에서, 상기 산물은 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를 추가로 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것이다.
신생아에서 주산기 HSV-1 및/또는 HSV-2 감염을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 신생아가 될 태아를 임신한 여성에게, 전장 HSV-2 당단백 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를, 신생아에서 주산기 HSV-1 및/또는 HSV-2 감염을 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것이다.
모체로부터 그녀의 신생아에게 HSV-1 및/또는 HSV-2 바이러스의 전파를 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 모체에게 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를, 모체로부터 그녀의 신생아에게 HSV-1 및/또는 HSV-2 바이러스의 전파를 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것이다.
구체예에서, 상기 모체는 신생아가 될 태아를 임신하고 있다.
구체예에서, 상기 HSV-1 감염 및/또는 HSV-1 바이러스 전파가 억제된다.
구체예에서, 상기 HSV-2 감염 및/또는 HSV-2 바이러스 전파가 억제된다.
구체예에서, 면역 반응은 HSV-1에 대해 유발된다.
구체예에서, 면역 반응은 HSV-2에 대해 유발된다.
구체예에서, 상기 보완 세포는 VD60 세포이다.
구체예에서, 임신한 여성, 모체 또는 제2 대상체는 HSV-1에 대해 혈청 음성 (seronegative), HSV-2에 대해 혈청 음성, 또는 HSV-1 및 HSV-2 모두에 대해 혈청 음성이다.
구체예에서, 상기 임신한 여성 또는 모체에게 상기 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를 피하로 투여한다.
구체예에서, 상기 임신한 여성 또는 모체에게 상기 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 결실된 HSV-2의 초기 피하 투여 (initial subcutaneous administration) 후에, 상기 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2의 피하 부스트 용량 (subcutaneous boost does)을 투여한다.
HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00001
일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2는 지질 이중층 상에 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 상기 HSV-1 당단백질 D는 서열번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00002
일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 U S6 유전자이다. (예를 들어, Dolan et al. J Virol. 1998 March; 72(3): 2010-2021. (PMCID: PMC109494) "The Genome Sequence of Herpes Simplex Virus Type 2" for HSV-2 genome and U S6 gene를 참조하고, 이의 전체가 본원에 참조로 통합됨).
일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 결실된 HSV-2는 하기 Genbank 열거된 서열 중 하나에 제시된 게놈 (결실되기 전)을 갖는 HSV-2이다: HSV-2(G) (KU310668), HSV-2(4674) (KU310667), B3x1.1 (KU310657), B3x1.2 (KU310658), B3x1.3 (KU310659), B3x1.4 (KU310660), B3x1.5 (KU310661), B3x2.1 (KU310662), B3x2.2 (KU310663), B3x2.3 (KU310664), B3x2.4 (KU310665), B3x2.5 (KU310666).
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다.
일 구체예에서, 상기 비리온은 이의 지질 이중층 상에 HSV-1 당단백질 D를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 U S6 유전자이다.
일 구체예에서, 상기 바이러스는 이의 지질 이중층 상에 HSV-1을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 U S6 유전자이다.
HSV-2 U S6 유전자를 포함하지 않는 재조합 HSV-2 게놈을 그 안에 포함하는, 단리된 세포가 제공된다.
일 구체예에서, 상기 재조합 HSV-2 게놈은 HSV-2 당단백질 D 유전자가 이로부터 결실됨으로써 재조합된다.
일 구체예에서, 상기 세포는 상기 재조합 HSV-2 게놈에 의해 코딩되지 않는 발현된 HSV 1 또는 2 당단백질을 제공하는 보완 세포 (complementing cell)이다. 일 구체예에서, 상기 보완 세포는 HSV-1 당단백질 D를 코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 세포는 이의 막 상에서 HSV-1 당단백질 D를 발현한다. 상기 세포의 일 구체예에서, 상기 HSV-1 당단백질 D는 이종 핵산에 의해 코딩되며, 상기 이종 핵산은 HSV-1 당단백질 D 유전자이거나, 또는 HSV-1 당단백질 D 유전자와 동일한 서열을 갖는 핵산이다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 백신 조성물이 제공된다. 일 구체예에서, 상기 백신은 면역 보강제를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 백신은 면역 보강제를 포함하지 않는다. 재조합 HSV-2를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 백신, 조성물 또는 약학적 조성물의 일 구체예에서, 상기 HSV-2는 살아 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 바이러스 또는 비리온의 게놈은 적어도 제2 유전자의 결실을 포함하고, 상기 제2 유전자는 HSV-2 바이러스 복제 또는 독성에 필요하다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 구체예에서, 상기 조성물 또는 약학적 조성물 또는 백신은 인간 대상체에게 피하 투여에 적합하도록 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 조성물 또는 약학적 조성물 또는 백신은 인간 대상체에게 질내 투여에 적합하도록 제제화된다. 일 구체예에서, 상기 조성물 또는 약학적 조성물 또는 백신은 인간 대상체에게 근육내, 비강내 또는 점막 투여에 적합하도록 제제화된다.
또한, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스, (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료하거나 또는 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스, (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염을 치료하거나 또는 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 인한 HSV-1 또는 HSV-2 병리를 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법의 일 구체예에서, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 인한 질병은 생식기 궤양이다. 상기 방법의 일 구체예에서, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 인한 질병은 포진 (herpes), 구강 포진 (oral herpes), 생인손 포진 (herpes whitlow), 생식기 포진 (genital herpes), 포진상 습진 (eczema herpeticum), 검상 포진 (herpes gladiatorum), HSV 각막염 (HSV keratitis), HSV 망막염 (HSV retinitis), HSV 뇌염 (HSV encephalitis) 또는 HSV 수막염 (HSV meningitis)이다.
HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염 (즉, HSV-1 및 HSV-2 모두에 의한 감염)의 치료 또는 백신화에 관한 본원의 방법의 일 구체예에서, HSV-1 감염의 치료, HSV-2 감염의 치료, 동시-감염의 치료, HSV-1 감염에 대한 백신화, HSV-2 감염에 대한 백신화, 및 동시-감염에 대한 백신화의 개별의 각 구체예가 각각 제공된다.
또한, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 백신화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스, (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 백신화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 면역화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 HSV-2 바이러스, (ii) 본원에 기재된 바와 같은 이의 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염에 대해 대상체를 면역화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일 구체예에서, 상기 대상체에게 프라임 용량이 피하 또는 질내로 투여되고, 제2 용량이 피하 또는 질내로 투여된다. 상기 방법의 일 구체예에서, 상기 대상체에게 항-HSV 항체 및 T 세포를 유발하기 위해 피하 또는 질내로 다회의 프라임 용량이 투여된다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 이의 지질 이중층 상에 HSV-1 또는 HSV-2 당단백질 D를 포함하는, 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 비리온을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 HSV-1 또는 HSV-2 당단백질 D를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)로 상기 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 복제를 허용하는 조건하에 감염시키는 단계 및 상기 세포에 의해 생성된 HSV-2 비리온을 회수하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 세포는 이의 막에서 HSV-1 또는 HSV-2 당단백질 D를 발현시킨다.
또한, 재조합 핵산이 HSV-2 당단백질 D를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 것을 제외하고는 야생형 HSV-2의 게놈과 동일한 서열을 갖는 재조합 핵산이 제공된다. 일 구체예에서, 상기 재조합 핵산은 DNA이다. 일 구체예에서, 상기 재조합 핵산은 RNA이다.
또한, 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염을 치료 또는 예방하기 위해, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2는 이의 지질 이중층 상에 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 또는 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2) 당단백질 D를 추가로 포함한다. 상기 단리된 재조합 HSV-2의 일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 U S6 유전자이다.
또한, 대상체에서 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염을 치료 또는 예방하기 위해 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다. 일 구체예에서, 상기 비리온은 이의 지질 이중층 상에 HSV-1 또는 HSV-2 당단백질 D를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 US6 유전자이다.
본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 비리온의 일 구체예에서, 상기 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염은 생식기 궤양을 유발한다.
HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D인 이의 지질 이중층 상에 표면 당단백질을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2는 이의 지질 이중층 상에 비-HSV-2 바이러스 표면 당단백질을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2는 이의 지질 이중층 상에 박테리아 표면 당단백질을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2는 이의 지질 이중층 상에 기생충 표면 당단백질을 추가로 포함하고, 상기 기생충은 포유동물의 기생충이다.
일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 US6 유전자이다. 일 구체예에서, 상기 표면 당단백질은 재조합 HSV-2의 게놈에 삽입된 이식유전자에 의해 코딩된다. 일 구체예에서, 상기 표면 당단백질은 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 결실된 재조합 HSV-2로 세포를 감염시킴으로써 이의 지질 이중층 상에 존재하며, 상기 세포는 형질감염되었거나 또는 형질감염되어 이의 세포막 상에서 상기 표면 당단백질을 발현하고, 지질 이중층 상에 존재하는 표면 당단백질을 포함하는 재조합 HSV-2가 상기 세포로부터 생성된다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 당단백질은 HIV, 엔테로바이러스 (enterovirus), RSV, 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus), 돼지 코로나 호흡기 바이러스 (Pig corona respiratory virus), 광견병 바이러스 (rabies virus), 라싸 바이러스 (Lassa virus), 부니아 바이러스 (bunyavirus), CMV 또는 필로바이러스 (filovirus)로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 당단백질은 HIV gp120이다. 일 구체예에서, 상기 필로바이러스는 에볼라 바이러스 (ebola virus)이다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 HIV, M. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis), 클라미디아 (chlamydia), 미코박테리움 울세란스 (Mycobacterium ulcerans), M. 마리눔 (M. marinum), M. 레프레 (M. leprae), M. 아브센센스 (M. absenscens), 네이세리아 곤노르헤 (Neisseria gonnorhea) 또는 트레포네메 (Treponeme)이다. 일 구체예에서, 상기 트레포네메는 트레포네메 팔리둠 (Treponeme palidum)이다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다.
일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2의 비리온은 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D인, 이의 지질 이중층 상에 표면 당단백질을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2의 비리온은 이의 지질 이중층 상에 비-HSV-2 바이러스 표면 당단백질을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2의 비리온은 이의 지질 이중층 상에 박테리아 표면 당단백질을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2의 비리온은 이의 지질 이중층 상에 기생충 표면 당단백질을 추가로 포함하고, 상기 기생충은 포유동물의 기생충이다. 일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 U S6 유전자이다. 일 구체예에서, 상기 표면 당단백질은 비리온의 재조합 HSV-2의 게놈에 삽입된 이식유전자에 의해 코딩된다. 일 구체예에서, 상기 표면 당단백질은 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 결실된 재조합 HSV-2로 세포를 감염시킴으로써 이의 지질 이중층 상에 존재하며, 상기 세포는 형질감염되었거나 또는 형질감염되어 이의 세포막 상에서 표면 당단백질을 발현시키고, 지질 이중층 상에 존재하는 표면 당단백질을 포함하는 재조합 HSV-2는 상기 세포로부터 생성된다. 일 구체예에서, 상기 비리온은 이로부터 회수되었다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 당단백질은 HIV, 엔테로바이러스, RSV, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 돼지 코로나 호흡기 바이러스, 광견병 바이러스, 라싸 바이러스, 부니아 바이러스, CMV 또는 필로바이러스로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 당단백질은 HIV gp120이다. 일 구체예에서, 상기 필로바이러스는 에볼라 바이러스이다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 HIV, M. 투베르쿨로시스, 클라미디아, 미코박테리움 울세란스, M. 마리눔, M. 레프레, M. 아브센센스, 네이세리아 곤노르헤 또는 트레포네메이다. 일 구체예에서, 상기 트레포네메는 트레포네메 팔리둠이다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 그 안에 포함하는 단리된 세포가 제공되며, 상기 세포는 인간에게 존재하지 않는다. 상기 세포의 일 구체예에서, 상기 세포는 HSV-1 당단백질 D를 코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 상기 세포의 일 구체예에서, 상기 세포는 이의 막상에 HSV-1 당단백질 D를 발현한다.
상기 세포의 일 구체예에서, 상기 HSV-1 당단백질 D는 이종 핵산에 의해 코딩되며, 상기 이종 핵산은 HSV-1 당단백질 D 유전자이거나, 또는 HSV-1 당단백질 D 유전자와 동일한 서열을 갖는 핵산이다.
본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 백신 조성물이 제공된다. 상기 백신 조성물의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 면역 보강제를 포함한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 바이러스 또는 비리온의 게놈은 적어도 제2 유전자의 결실을 포함하고, 상기 제2 유전자는 HSV-2 바이러스 복제에 필요하다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 면역 반응을 유발하기 위해 바이러스 또는 비리온이 이전에 도입된 포유동물로부터 유래된 혈청을 포함하거나 또는 상기 포유동물로부터의 혈청으로부터 유래된다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 본원에 기재된 바와 같은 비리온, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또한, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료하거나 또는 대상체에서 HSV-2로 인한 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료하거나 또는 HSV-2 감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2에 대해 대상체를 백신화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-2에 대해 대상체를 백신화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2 감염에 대해 대상체를 면역화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-2에 대해 대상체를 면역화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
HSV-2 및 HSV-1 질병이 당해 분야에 알려져 있고, 또한 본원에 기재되어 있다. HSV-2 및 HSV-1 질병의 치료 및 예방 모두를 각각 별개로 포함한다. 또한, HSV-2 및 HSV-1 동시-감염의 치료 또는 예방이 포함된다. 예방은 비치료된 대상체와 비교하여, 본원에 기재된 바이러스, 비리온, 백신 또는 조성물로 치료된 대상체에서 관련 질병 또는 감염의 발병 정도의 개선을 의미하는 것으로 이해된다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고, 이의 지질 이중층 상에 HSV-1 당단백질 D를 포함하는, 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 비리온을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 HSV-1 당단백질 D를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)로 상기 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 복제를 허용하는 조건하에 감염시키는 단계 및 상기 세포에 의해 생성되는, 이의 지질 이중층 상에 HSV-1 당단백질 D를 포함하는 재조합 HSV-2 비리온을 회수하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고, 이의 지질 이중층 상에 비-HSV-2 표면 당단백질을 포함하는, 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 비리온을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 비-HSV-2 표면 당단백질을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)로 상기 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)의 복제를 허용하는 조건하에 감염시키는 단계 및 상기 세포에 의해 생성되는, 이의 지질 이중층 상에 비-HSV-2 표면 당단백질을 포함하는 재조합 HSV-2 비리온을 회수하는 단계를 포함한다.
또한, 서열이 HSV-2 당단백질 D를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 것을 제외하고는 HSV-2의 게놈과 동일한 서열을 갖는 재조합 핵산이 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-2를 치료 또는 예방하기 위해, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-1 감염을 치료 또는 예방하기 위해, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료 또는 예방하기 위해, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된, 단리된 재조합 HSV-2의 비리온이 제공된다.
또한, 대상체에서 HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염을 치료하거나 또는 대상체에서 HSV-2 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, 대상체에서 HSV-2 감염을 치료하거나 또는 HSV-2 감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양, 또는 대상체에서 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염을 치료하거나 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염으로 인한 질병을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 백신화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 백신화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 면역화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 (i) 본원에 기재된 바와 같은 바이러스; (ii) 본원에 기재된 바와 같은 비리온, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 백신; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 조성물; 또는 (v) 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을, HSV-1 감염, 또는 HSV-1 및 HSV-2의 동시-감염에 대해 대상체를 면역화하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 면역화, 백신화 또는 면역 반응을 유발하는 방법의 일 구체예에서, 상기 비리온 또는 바이러스 또는 이에 의해 유도된 항체 또는 면역 인자의 수동 전달은 한 대상체로부터 다른 대상체로 영향을 줄 수 있다. 한 대상체로부터 입수된 후에 제2 대상체에게 투여하기 전에 상기 관련 산물로 치료될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 대상체는 포유동물 대상체이다. 일 구체예에서, 상기 포유동물 대상체는 인간 대상체이다.
제1 대상체에서 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2로 면역화된 제2 대상체로부터의 산물을 상기 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로, 상기 대상체에게 수동 전달을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것이며, 상기 산물은 HSV-2 또는 이에 의해 유도된 항체 또는 면역 인자를 포함한다.
구체예에서, 상기 산물은 제2 대상체의 혈청을 포함한다.
구체예에서, 상기 제2 대상체는 임신한 여성이다.
구체예에서, 상기 제1 대상체는 태아 또는 신생아이다. 구체예에서, 상기 제2 대상체는 제1 대상체를 임신하고 있다.
구체예에서, 상기 산물은 상기 HSV-2로 제2 대상체를 면역화하여 유발된 항체를 포함한다.
또한, HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 병원체의 이종 항원을 추가로 포함하는, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)가 제공된다. 일 구체예에서, 상기 이종 항원은 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 또는 당단백질이다. 일 구체예에서, 상기 이종 항원은 HSV-2와 관련된 이종 항원이지만, 관련 "병원체" 상에 또는 상기에서 발견되는 항원이다. 병원체, 바이러스 및 박테리아가 본원에 기재되어 있다. 일 구체예에서, 상기 병원체는 포유동물의 박테리아 병원체 또는 포유동물의 바이러스 병원체이다. 일 구체예에서, 상기 병원체를 코딩하는 이식유전자 또는 항원은 실제로 상기 병원체로부터 채취되거나 또는 물리적으로 제거되지 않지만, 그럼에도 불구하고 상기 병원체 항원 또는 핵산 서열을 코딩하는 서열과 동일한 서열을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2는 이의 지질 이중층 상에 병원체의 이종 항원을 포함한다. 상기 단리된 재조합 HSV-2의 일 구체예에서, 상기 병원체는 박테리아 또는 바이러스이다. 일 구체예에서, 상기 병원체는 포유동물의 기생충이다. 일 구체예에서, 상기 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자는 HSV-2 U S6 유전자이다. 일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2, 이종 항원은 재조합 HSV-2의 게놈에 삽입된 이식유전자에 의해 코딩된다.
또한, 대상체에서 항원 표적에 대해 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실되고 이의 지질 이중층 상에 이종 항원을 추가로 포함하는, 단리된 재조합 단순 헤르페스 바이러스-2 (HSV-2)를 항원 표적에 대해 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도하는데 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
적절한 이식유전자를 발현하는 재조합 HSV-2 ΔgD -/+ gD-/+ 는 병원체에 의한 피부 또는 점막 감염으로부터 보호하는 항체 및 세포 면역 반응을 선택적으로 유도할 것이다.
일 구체예에서, 상기 이종 항원은 표면 항원이다.
일 구체예에서, 상기 이식유전자는 HIV, M. 투베르쿨로시스, 클라미디아, 미코박테리움 울세란스, M. 마리눔, M. 레프레, M. 아브센센스, 네이세리아 곤노르헤 또는 트레포네메 유래의 항원을 코딩한다. 일 구체예에서, 상기 트레포네메는 트레포네메 팔리둠이다. 일 구체예에서, 상기 이식유전자는 M. 투베르쿨로시스 생물막-코딩 유전자이다. 일 구체예에서, 상기 이식유전자는 HIV gp120-코딩 유전자이다.
일 구체예에서, 상기 이종 항원은 항원 표적의 표면 항원이다. 일 구체예에서, 상기 이종 항원은 기생충 항원이다. 일 구체예에서, 상기 이종 항원은 박테리아 항원 또는 바이러스 항원이다.
일 구체예에서, 상기 항원 표적은 바이러스이고, 라싸 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, RSV, 엔테로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 돼지 코로나 호흡기 바이러스, 라싸 바이러스, 부니아 바이러스 또는 필로바이러스이다.
일 구체예에서, 상기 항원 표적은 박테리아이고, 미코박테리움 투베르쿨로시스, M. 울세란스, M. 마리눔, M. 레프레, M. 아브센센스, 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 네이세리아 곤노르헤 또는 트레포네마 팔리둠이다.
일 구체예에서, 상기 단리된 재조합 HSV-2 이식유전자는 M. 투베르쿨로시스 생물막-코딩 유전자이거나 또는 상기 이식유전자는 HIV gp120-코딩 유전자이다.
본원에 기재된 방법의 바람직한 일 구체예에서, 상기 대상체는 인간이다. 본원에 기재된 방법의 일 구체예에서, 상기 대상체는 아직 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 감염되지 않았다. 본원에 기재된 방법의 일 구체예에서, 상기 대상체는 HSV-1, HSV-2 또는 동시-감염으로 감염되었다.
본원에 기재된 바와 같이, 동시-감염은 HSV-1 및 HSV-2로 동시-감염을 의미한다.
본원에 기재된 다양한 요소들의 모든 조합은 본원에서 달리 지시되지 않거나 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 하기의 실험 세부 사항으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 당업자는 논의된 특정 방법 및 결과가 본 발명을 단지 예시하고, 하기 청구 범위에서 보다 완전하게 설명된다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
실험 세부 사항
실시예 1
본원에는 HSV-2의 gD (U S6 ) 유전자의 유전자 조작된 결실 돌연변이체가 개시되고, 마우스 감염 모델에서 질내 HSV-2 챌린지에 대한 이의 안전성, 면역원성 및 백신 효능이 평가된다. 상기 gD 유전자를 녹색 형광 단백질 (gfp)을 코딩하는 DNA 단편으로 대체하고, HSV-1 gD (VD60 세포)를 발현하는 Vero 세포를 이러한 구조체로 형질감염시키고, 녹색 플라크를 형성하는 상동성 재조합 바이러스에 대해 스크리닝하였다. 분자 분석 (molecular analysis)에 따르면, 정확하게 재조합이 조작되었고, 이는 보완 VD60 세포에서 높은 역가로 복제되지만 비-보완 세포 상에 증식되는 경우 비감염성이다. 보완된 gD-null 바이러스의 107 pfu/마우스로 야생형 또는 SCID 마우스의 질내 챌린지 (gD가 유전자 결실되었지만 VD60 세포에서의 성장에 의해 표현형으로 보완된 바이러스에 대해 본원에서 HSV-2 ΔgD -/+ 로 지정함)로 독성이 없는 것으로 밝혀진 반면에, 모체 야생형 바이러스의 104 pfu/마우스만큼 낮은 용량은 100% 치명적이었다. 더욱이 HSV-2 ΔgD -/+ 를 사용한 마우스의 면역화는 HSV-2의 임상적 단리물로 질내 챌린지에 대한 완전한 보호를 수득하였다. HSV-2 ΔgD -/+ 에 의해 유발된 강건성 체액 및 세포성 면역 (robust humoral and cellular immunity)을 측정하였고, 이는 gD가 인 비보 생산 감염 (productive infection)에 필요하고, 이러한 필수 당단백질에서 결실된 약독화된 균주가 HSV-2에 대한 보호 면역을 유발한다고 결론을 내렸다. 따라서, HSV-2 ΔgD -/+ 는 생식기 포진의 예방 또는 치료를 위한 유망한 백신이다.
HSV-2 ΔgD-/+에 의해 유발된 보호 기전 및 상관관계. gD-2 null 바이러스를 생성하였고, 이는 면역적격 및 면역손상 마우스 모두에서 고도로 약독화되고, 백신 후보체로 테스트한 경우 HSV-2로 질내 챌린지에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 것으로 입증되었다. HSV-2 ΔgD-/+를 사용한 피하 면역화는 HSV의 혈청형 모두 (HSV-2 및 HSV-1)로 질내 챌린지에 대한 보호에 필요한 체액 및 세포성 면역 반응을 유도할 것이다.
HSV-2 ΔgD-/+는 불현 감염을 개시한다: U S 6에 대해 결실된 HSV-2 균주를 제작하여 세포 감염 중에 발생하는 초기 신호전달 이벤트에 대한 이의 기여를 평가하였다 [41]. 이러한 바이러스는 이의 내인성 프로모터 (예를 들어, 일 구체예에서, gD-1 프로모터)의 제어하에 U S 6을 코딩하는 gD-보완 세포주 (예: gD-1을 코딩하는 VD60 세포 [40, 41])에서 성장하지 않는 한, 숙주 세포를 감염시킬 수 없다. 실제로, 비-보완 세포로부터 단리된 HSV-2 ΔgD 입자는 상피 (도 1) 또는 신경 세포 (SK-N-SH, 도시되지 않음)를 감염시키지 못한다. 그러나, VD60 세포에서 증식되는 경우, 표현형으로 보완된 바이러스 (ΔgD-/+)가 수득되며, 이는 야생형 HSV-2에 대한 공통 표적인 세포를 완전히 감염시킬 수 있다. 그러나, ΔgD-/+로 감염시킨 후에, 이들 세포로부터 감염성 입자 또는 바이러스 플라크 (pfu)가 생성되지 않았고, 상기 바이러스가 감염된 세포로부터 비감염된 세포로 확산되지 않았고, 이는 이러한 과정에서 gD에 대한 필요성을 반영하므로; 따라서 이는 불현 감염이다.
HSV-2 ΔgD-/+는 뮤린 감염 모델에서 안전하다: ΔgD-/+를 고용량으로 피하 또는 질내로 접종함으로써 야생형 마우스 및 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스에서 인 비보 안전성에 대해 ΔgD-/+를 평가하였다. ΔgD-/+의 107 pfu (보완 세포에 대한 역가)를 질내로 접종한 마우스는 실험 내내 바이러스-유도된 병리의 어떠한 징후도 나타내지 않은 반면에, 야생형 바이러스를 1,000-배 적게 (104 pfu) 접종한 동물은 HSV-2 질병에 걸렸고, 접종 후 8일차부터 사망하였다 (도 2A). ΔgD-/+의 107 pfu를 질내로 접종한 마우스는 실험 내내 바이러스-유도된 상피 또는 신경학적 질환의 어떠한 징후도 나타내지 않았다 (도 2B 및 2C). 플라크 분석 또는 Vero 세포와 DRG의 동시-배양에 의해 결정된 바와 같이, 생식기 조직 또는 DRG에서 감염성 바이러스가 회수되지 않았다 (도시되지 않음).
HSV-2 ΔgD-/+는 HSV-2에 대한 전신 및 점막 항체를 유발한다: ΔgD-/+로 피하로 접종 및 부스트한 (sc.-sc.) 마우스 또는 이러한 후보 백신 균주 (106 pfu/마우스)로 피하로 접종 및 질내로 부스트한 (sc.-i.vag.) 마우스는 혈청 및 질 세척액에서 항-HSV-2 항체의 증가에 의해 입증된 바와 같이, HSV-2에 대한 체액 면역 반응을 유발하였다 (도 3A 및 3B). 대조군 동물을 비감염된 VD60 세포 용균물로 면역화하였다 (대조군이라고 함). 상기 항체는 감염된 세포 용균물을 항원으로 사용하여 ELISA로 측정하였다 (비감염된 세포 용균물에 대한 반응을 배경으로 차감 함). 주목할 점은 항체 반응의 크기는 면역 경로에 따라 다르다. 실제로, s.c.-s.c. 면역화는 s.c.-i.vag. 면역화보다 HSV-2에 대한 혈청 및 질 세척액 중 항체를 훨씬 더 많이 유발하였다. 이러한 발견은 상기 질 세척액 중 항체가 혈액으로부터 IgG의 누출액 (transudate)을 나타낼 가능성이 있음을 시사하고, sc.-sc.는 HSV-2에 대한 전신 및 국소 IgG 항체를 높은 수준으로 유발하는 더 적절한 경로임을 시사한다. 또한, ΔgD-/+ (106 pfu/마우스)로 피하로 접종 및 부스트 (sc.-sc.)한 마우스는, 이들 마우스로부터의 혈청 및 바이러스로 Vero 세포 단일층의 인 비트로 중화에 의해 입증된 바와 같이, 중화 항-HSV-2를 유발하였다 (도 3C).
HSV-2 ΔgD-/+는 HSV-2-특이적 T 세포 활성화를 유발한다: gB498-505-특이적 유전자이식 CD8+ T 세포 (gBT-I)를 백신화 전에 C57BL/6 마우스로 전달하였다. 백신화된 마우스에게 106 pfu ΔgD-/+ 또는 VD60 세포 용균물 (대조군)을 접종하였다. 부스트 후 14일차에 비장을 수확하고, 카운팅 비드 (counting beads) (CountBrightTM, Lifetechnologies)를 사용하여 유세포 분석으로 정량분석하였다 (도 4A). 동일자로, 비장을 기억 표면 마커 (memory surface markers)로 염색하고, 유세포 분석으로 분석하였다 (도 4B). 마지막으로, 같은 날 수확된 비장 세포 (splenocytes)를 효능제인 gB498-505-펩티드로 6시간 동안 인 비트로에서 재-자극하였고, 이들 세포에 의한 IFN-γ 생성을 측정하기 위해 세포내 사이토킨 염색을 수행하였다. ΔgD-/+를 사용한 면역화로 대조군 마우스와 비교하여 백신화된 그룹에서 IFN-γ 생성이 증가하였다 (도 4C). 대조군 마우스의 반응은 아마도 전달 후에 나이브한 (naive) 마우스에서 gBT-I T 세포의 지속성 (persistence)을 반영한다. gB498-505-펩티드로 인 비트로에서 재-자극된 비장 세포의 상등액에 대한 다중 사이토킨 분석을 사용하여 유사한 결과를 수득하였다 (도시되지 않음). 이러한 발견은 상기 백신이 T 세포 반응을 유도한다는 것을 입증하였다.
HSV-2 ΔgD-/+로 면역화된 마우스는 질내 HSV-2 치사량의 챌린지에 대해 보호된다: HSV-2 ΔgD-/+로 sc.-sc. 또는 sc.-i.vag. 백신화된 동물은 LD90 (5x104 pfu/마우스)에 동등한 질내 치사량의 챌린지 및 생존 챌린지 후에 체중이 덜 감소한 반면에, VD60 대조군 용균물로 면역화된 마우스는 10일까지 질병에 걸렸다 (도 5A 및 5B). 상기 백신은 또한 10배의 LD90에 대한 완전한 보호를 제공하였다 (5x105 pfu/마우스, 데이터는 개시되지 않음). 이러한 보호는 현저하게 감소된 상피 질병 스코어 (도 5C) 및 신경학적 징후의 완전한 부재 (도 5D)와 관련이 있었다. 스코어링은 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다 [44]. 더욱이, 질 챌린지 후 2일차에 대조군 마우스와 비교하여, ΔgD-/+-면역화된 마우스에서 질 세척액 중에 훨씬 적은 바이러스가 회수되었고, 이는 빠른 제거를 시사한다 (도 5E). 더욱이 챌린지 후 4일차의 질 세척액 (도 5E) 또는 5일차의 질 조직 또는 단리된 DRG (도 5F)에서 감염성 바이러스가 회수되지 않았다. 후자는 상기 바이러스가 DRG에 도달하고 및/또는 여기에서 복제되는 것을 상기 백신이 방지하는 것을 시사한다.
HSV-2 ΔgD-/+로 면역화하면 용균성 HSV-2로 챌린지한 후에 감염 부위에서 염증을 예방한다: HSV-2 ΔgD-/+로 백신화하고 용균성 HSV-2로 질내 챌린지한 마우스는 VD60 용균물 (대조군)이 접종된 동물과 비교하여 감염 부위에서 염증성 사이토킨이 상당히 적게 나타난다. 실제로, 백신화된 마우스는 감염 후 2일차 및 7일차에 대조군 마우스보다 질 세척액에서 TNF-α (도 6A), IL-6 (도 6B) 및 IL-1β (도 6C)를 상당히 적게 분비하였다. 주목할만한 점은 염증성 사이토킨 수준의 증가는 HSV-2 및 HIV에 동시-감염된 경우 생식기에서 배출 (shedding) 및 HIV 복제 증가와 관련이 있다 [45, 46]. 유사한 현상이 또한 인 비트로에서도 관찰된다 [47].
HSV-2 ΔgD-/+를 사용한 면역화는 T 세포를 감염 부위 및 관련 LN으로 동원한다. ΔgD-/+로 sc.-sc. 면역화된 마우스는 용균성 HSV-2로 챌린지한 후에 천골 림프절 (LN)에서 활성화된 항-HSV-2 gBT-I CD8+ (도 7A) 및 CD4+ T 세포 (도 7B)의 증가된 퍼센트를 나타내었다. ΔgD-/+로 sc.-i.vag. 면역화된 마우스는 용균성 HSV-2로 챌린지한 후에 질내 항-HSV-2 gBT-I CD8+ (도 7C) 및 CD4+ T 세포 (도 7D) 수의 증가를 나타내었고, 이는 ΔgD-/+로 백신화하면 항-HSV-2 CD8+ T 세포 및 활성화된 CD4+ T 세포 (유망한 항-HSV-2)를 감염 부위 및 관련 림프절로 동원하는 것을 시사한다.
추가 실험에서, HSV-2-ΔgD-/+gD-1로 면역화하면 C57BL/6 및 Balb/C에서 용균성 HSV-2로 질 챌린지에 대한 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 질내 HSV-2로 챌린지된 ΔgD-/+gD-1로 면역화된 마우스는 챌린지 5일 후에 질 또는 신경 조직에서 검출 가능한 HSV-2가 없었다. HSV-2 ΔgD-/+gD-1 sc.sc. 항체는 HSV-2 병적-결합 마우스 (morbid-bound mice)와 달리 다수의 HSV-2 단백질 (gD 및 gB 모두)을 인식하는 것으로 밝혀졌다. 백신화된 동물로부터의 혈청 항체는 인 비트로에서 HSV-1 및 HSV-2의 중화를 나타내었다. 더욱이, ΔgD-/+gD-1 백신화된 마우스로부터의 혈청은 인 비트로에서 HSV-2 감염된 세포의 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)을 유발하였다.
요약하면, HSV-2 ΔgD-/+gD-1은 wt 및 SCID 마우스에서 약독화되고 완전히 안전하다. 재조합 HSV-2 ΔgD-/+gD-1은 치사량의 HSV-2 질내 및 HSV-2/HSV-1 피부 감염으로부터 보호하였다. 보호는 2마리의 상이한 마우스 균주에서 관찰되었다. 감지 가능한 감염은 없었고, 불임 면역 (sterilizing immunity)이었다. 또한, HSV-2 특이적 CD8+ T 세포 및 전신 및 점막 HSV Ab의 유도가 관찰되었다. IgG2a 및 IgG2b는 우세한 항-HSV 이소타입이었다. 또한, FcyRIII/II-의존성 ADCC가 관찰되었다. 놀랍게도, 면역 혈청의 수동 전달로 나이브한 마우스를 보호하고, FcRn 및 FcyR 녹아웃 마우스 (knockout mice)는 면역 혈청으로 보호되지 않았다.
토의
세계 보건 기구 (WHO)는 전 세계적으로 5억 명이 넘는 사람들이 단순 헤르페스 바이러스 타입 2 (HSV-2)에 감염되었고, 매년 약 2천만 건의 새로운 사례가 발생하는 것으로 추정하였다 [1]. 감염 위험은 나이가 들면서 증가하고, 상기 바이러스가 빈번한 무증상 (subclinical) 또는 임상 (clinical) 재활성화와 함께 잠복기를 수립하기 때문에, 감염의 영향은 평생 지속된다. 놀랍게도, HSV-2는 HIV를 획득 및 전파할 위험을 상당히 증가시킨다 [2-4]. HSV-2의 유병률 (prevalence)은 전 세계 지역마다 다르며, 일본의 경우 8.4%에서, HIV 유병률이 유행하는 지역인 사하라-이남 아프리카 (sub-Saharan Africa)의 경우 70%까지 변동한다 [5, 6]. 미국의 경우, HSV-2의 유병률은 ~16%이고, HSV-1의 유병률은 ~54%로 감소하였다. 미국 (및 기타 유럽 국가)에서 HSV-1의 유병률 감소는 생식기 HSV-1의 증가와 관련이 있고, 이는 최근 실망스러운 당단백질 D (gD) 서브유닛 백신 시험 결과로 입증된 바와 같이, 생식기 포진 질환 사례의 대부분은 HSV-1에 의해 유발되었다 [7-9]. HSV-1은 HSV-2와 비교하여 재발이 적고 생식기 바이러스 배출이 적지만, 두 혈청형은 모두 주산기에 전파되어 신생아 질환을 유발하고; 신생아 질병은 아시클로비어 (acyclovir) 치료를 하더라도 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있다 [10-12]. 생식기 포진과 관련된 이환율, 이의 HIV 전염병과의 시너지 효과, 미국에서만 5억 달러를 초과하는 이의 직접 의료 비용은 안전하고 효과적인 백신 개발의 필요성을 강조한다 [13].
보강제와 조합된 바이러스 외피 당단백질로 구성된 서브유닛 제제는 거의 20년 동안 HSV-2 백신 분야를 지배하였고, 대부분의 임상 시험은 이러한 전략에 중점을 두었다 [8, 14-19]. 서브유닛 제제는 안전하고 중화 항체를 유발하지만, 이러한 제제는 임상 시험에서 HSV-2 감염 또는 질병에 대한 효능이 거의 없다 [8, 14]. 놀랍게도, HSV-2 gD 서브유닛 백신은 생식기 HSV-1에 대한 보호를 제공하였지만, HSV-2에 대한 보호는 제공하지 않았다 [8, 20]. 후속 연구로부터, 혈청 HSV-2 gD 항체 수준은 HSV-1에 대한 보호와 관계가 있음이 밝혀졌고, 이는 HSV-2 보호에 필요한 항체 역가가 HSV-1에 대한 보호에 필요한 항체 역가보다 더 높을 수 있음을 시사한다 [21]. 대조적으로, 세포 매개 면역 (중복하는 gD 펩티드에 대한 세포내 사이토킨 반응)은 두 혈청형에 대한 보호와 상관 관계가 없었다 [21]. 상기 백신은 CD4+를 유발하였지만, CD8+ T 세포 반응은 유발하지 않았고, 백신화된 감염된 여성과 비감염된 여성 사이에 CD4+ T 세포 반응에는 차이가 없었다 [21]. 생식기 또는 기타 점막 항체 반응은 측정되지 않았다. 게놈으로부터 gH가 결실된 HSV-2 백신 후보는 비록 상기 백신의 1차 감염에 대한 효능을 평가하지 않았지만, 혈청양성 (seropositive) 대상체를 대상으로 실시한 임상 시험에서 바이러스 재발 빈도를 줄이는데 실패하였다 [29].
중화 혈청 항체의 유도에도 불구하고 gD 서브유닛 백신이 CD8+ T 세포 반응을 유발하지 못하는 것과 조합된 HIV-감염된 환자에서 HSV-2 재활성화율의 증가를 보여주는 임상 연구로부터 효과적인 백신은 보호 T 세포 반응을 유발해야 함을 시사한다 [28, 30-32]. T 세포의 중요성은 인간 삼차 신경절에서 HSV-1 반응성 T 세포의 선택적 유지를 보여주는 연구에 의해 더욱 강조된다. CD4+ 및 CD8+ T 세포가 뉴런 주위에서 확인되었고, 표적화된 바이러스 단백질에는 이질성 (heterogeneity)이 있었지만, 표피 단백질 (tegument protein)인 비리온 단백질 16 (virion protein 16: VP16)은 다양한 HLA-A 및 -B 대립 유전자의 맥락에서 다수의 삼차 신경절 T 세포에 의해 인식되었고; 이러한 발견은 표피 단백질이 중요한 면역원일 수 있음을 시사한다 [33]. 유사하게, 표피 단백질에 대한 세포독성 T 세포는 HSV-2에 잠복으로 감염된 인간 연구에서도 확인되었다 [34]. CD8+ T 세포 (CD8αα+ T 세포 포함)는 HSV 재활성화 후에 피부-표피 접합부의 점막 및 생식기 피부에서 지속되고, 이들은 면역 조절에 역할을 한다는 것을 시사한다 [35].
본원에는 네이티브 HSV-2 gD에 대해 유전자 조작으로 결실된 HSV-2 바이러스가 개시되어 있다. 상기 HSV-2 gD 유전자는 바이러스 진입 및 세포 간 확산에 필수적인 외피 당단백질을 코딩한다. 당단백질 D는 또한 헤르페스바이러스 진입 매개인자 (herpesvirus entry mediator: HVEM)로도 알려진 면역-조절 스위치인 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 14 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 14: TNFRSF14)에 결합한다. HVEM은 1개 초과의 리간드에 대한 도킹 부위를 보유하고 있으며, 이러한 분자가 시스 또는 트란스로 HVEM에 결합하는지 여부에 따라 신호전달이 상이하기 때문에, gD는 면역 세포에 대한 조절 효과를 가질 수 있다 [36, 37]. 실제로, 최근 연구에 따르면 gD는 이러한 수용체에 대해 천연 리간드와 경쟁하고, 상기 바이러스에 대한 사이토킨 반응을 조절한다 [38, 39]. 상기 gD 유전자를 녹색 형광 단백질 (gfp)을 코딩하는 DNA 단편으로 대체하고, 이러한 구조체로 형질전환된 HSV-1 gD (VD60 세포 [40]) (예: gD-1 프로모터 하에 gD-1)를 발현하는 보완 Vero 세포가 녹색 플라크를 형성한 동종 재조합 바이러스에 대해 스크리닝되었다. 상기 돌연변이체 바이러스는 보완 Vero 세포주에서 높은 역가로 복제되지만 (보완 세포에서 계대되는 경우 HSV-2 ΔgD -/+ 로 지정됨), 비-보완 세포에서는 비감염성이다 (비-보완 세포로부터 단리되는 경우 HSV-2 ΔgD -/- 로 지정됨). 이러한 바이러스가 인 비트로에서 정제 및 특성 규명되었다 [41]. 면역적격 또는 면역손상 (SCID) 마우스의 질내 또는 피하 접종은 모체 야생형 바이러스에 의해 유발되는 치명적인 감염에 비해 독성이 없음을 나타내었다. 면역화 (피하로 프라임 후에 피하 또는 질내로 단일 부스트 투여)는 용균성 HSV-2로 질내 챌린지에 대해 100% 보호하였다. HSV-2 ΔgD -/+ 에 의해 강건성 체액 및 세포성 면역이 유발되었고, 인 비보에서 생산 감염을 위해서는 U S 6 (gD-2)가 필요하다는 결론을 내렸다. 이러한 약독화된 생 바이러스 균주는 HSV에 대한 멸균 면역을 제공할 것이다. 또한, 수동 혈청 또는 혈청 산물 전달이 사용될 수 있다.
실시예 2
임상 HSV-1 및 HSV-2 단리물에 대해 보호하는 백신의 능력이 추가로 확인되었고, 감염 부위에서 국소 면역 반응도 확인되었다. 고전적으로, HSV는 인간에서 피부 또는 점막층의 손상으로 인해 생식기 또는 구강 유핵 표피 세포 (nucleated epidermal cells)를 주로 감염시킨다 (75). 인간 HSV 감염을 보다 밀접하게 모델링하기 위해, 이러한 연구에 피부 난절 모델 (skin scarification model)을 사용하였고, 이는 인간과 유사한 조직병리학 및 바이러스 키네틱스를 나타낸다 (76).
결과
ΔgD-2의 저용량으로의 면역화는 치명적인 질내 및 피부 챌린지에 대한 보호이다. 이전 연구는 백신 접종물로 ΔgD-2의 5x106 PFU (보완 VD60 세포에서 결정된 역가)를 사용하여 수행되었다. 더 적은 용량의 백신화에서의 보호를 결정하기 위해 용량 감량 연구 (dose de-escalation study)를 수행하였다. C57BL/6 마우스 (5 마리의 마우스/그룹)를 피하로 (sc) 프라임하고, 21일 후에 ΔgD-2의 5x106 PFU, 5x105 PFU, 또는 5x104 PFU로 부스트하였다. 3주 후에, 상기 마우스를 이전에 기재된 임상적 단리물인, HSV-2 (4674)의 LD90 (5x105 PFU)으로 질내 또는 피부 난절에 의해 챌린지하였다 (77). 모든 HSV-2 ΔgD-2 면역화된 마우스는 생존한 반면 (그룹당 5/5), 대조군-백신화된 마우스 (VD60 세포 용균물로 면역) 모두는 질병에 걸렸다 (도 8A, 8B). 최저 용량 (5x104)으로 백신화된 마우스는 경증 상피 질환을 보였지만, 신경학적 질환의 징후는 관찰되지 않았고, 질 및 피부 챌린지 모델 모두에서 14일까지 모든 동물이 완전히 회복되었다. HSV 항체 (ELISA로 측정)는 부스트 1주일 후에 모든 백신화된 마우스의 혈청에서 검출되었지만, 프라임에서는 검출되지 않았고, 더 높은 백신 용량을 투여하면 항체 역가가 증가하였다 (도 8C).
ΔgD-2로 면역화된 마우스는 용균성 HSV-1 및 HSV-2 임상적 단리물의 높은 바이러스 챌린지로부터 보호된다. 상기 ΔgD-2 백신으로 다양한 HSV-1 및 HSV-2 균주로부터 보호되는지를 평가하기 위해, South African HSV-2 임상적 단리물 (SD90)뿐만 아니라 the Bronx, NY에 위치한 Montefiore의 the Clinical Virology Lab으로부터의 5개의 HSV-1 (B3x1.1 - B3x1.5로 표시) 및 5개의 HSV-2 (B3x2.1 - B3x2.5로 표시)를 입수하였다. 상기 단리물들을 Vero 세포에서 성장시켰고, 서열분석 및 표현형 분석 전에 3회 이하로 계대하였다. Illumina 서열분석으로 상기 균주는 B3x1.5 및 다른 B3x1 단리물들 간에 6.3%, 및 B3x2.2 및 다른 B3x2 단리물들 간에 5.0%의 높은 쌍별 거리 (pairwise distances)로 실질적인 유전적 다양성을 나타내었음 보여주었다. 각 임상 균주의 인 비보 독성은, HSV-1 균주의 1x105 PFU 또는 HSV-2 균주의 5x104 PFU로 피부 난절 모델을 사용하여 Balb/C 마우스를 챌린지함으로써 실험실 균주와 비교되었다. 상기 임상적 단리물은 B3x1.1, B3x1.3, B3x2.3 및 SD90으로 다양한 독성을 나타내었고, 나이브한 마우스에서 최고 이환율로 더 빠르게 질병을 유도하였다. 유사한 결과가 가장 치명적인 질병을 나타내는 동일한 4개의 단리물을 사용한 질 챌린지 모델에서 관찰되었다 (개시되지 않음). 흥미롭게도, Vero 세포에 대한 인 비트로 단일 및 다단계 성장 곡선에 의해 상기 단리물들 간의 차이는 관찰되지 않았다.
ΔgD-2로 다른 단리물로부터 보호되는지를 평가하기 위해, C57BL/6 또는 Balb/C 마우스를 ΔgD-2의 5x106 PFU/마우스 (또는 대조군 면역원으로서 VD60 용균물)로 프라임 및 부스트한 다음에, 피부 난절 모델을 사용하여 용균성이 더 강한 4개의 임상적 단리물 (표 1)의 LD90 용량으로 챌린지하였다. 모든 ΔgD-2 백신화된 마우스는 챌린지에서 생존하였다 (그룹당 n=7 C57BL/6 마우스; 도 3A, 및 그룹당 n=5 Balb/C 마우스, 도 9B). 일부 마우스는 경증 상피 질환을 나타내었고, 이는 4일차에 정점에 이르렀지만, 대부분의 동물은 챌린지 후 8일차까지 완전히 회복되었다. 신경학적 질환의 징후는 임의의 시점에서 어떤 마우스에서도 검출되지 않았다.
백신 효능 연구에 사용된 HSV 균주
바이러스 균주 단리물의 기원 HSV 혈청형 치사 용량 90 *
B3x1.1 미국 타입 1 5x105pfu
B3x1.3 미국 타입 1 1x105pfu
SD90 사우스 아프리카 타입 2 5x104pfu
B3x2.3 미국 타입 2 1x105pfu
4674 미국 타입 2 5x105pfu
참고: *Balb/C 마우스 피부 챌린지 모델에서 90% 이환율을 유발하는 플라크 형성 단위
상기 면역 반응의 강건성을 추가로 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에서 챌린지 용량을 SD90의 LD90 용량의 10배 및 100배, B3x1.1의 LD90의 10배로 증가시켰다. 모든 ΔgD-2 백신화된 마우스는 신경학적 질환의 징후없이 생존하였다 (도 9D). 상기 ΔgD-2 백신화된 마우스는 챌린지 후 5일차까지 피부 생검에서 바이러스가 상당히 감소하였고, 대부분은 바이러스 플라크가 검출되지 않았다 (도 10A, 그룹당 n=3 마리의 마우스). 바이러스의 빠른 제거와 일치하는, 피부 생검의 조직병리학에서 궤양 및 괴사가 대조군-백신화된 마우스에서 상피의 75-95%를 차지하는데 비해, ΔgD-2 백신화된 마우스 및 모의 (비백신화, 비감염) 처리된 마우스 모두에서 <10%의 상피 괴사 및 궤양를 나타내었다. 더욱이, 상기 ΔgD-2 백신화된 마우스 (각 챌린지 용량 및 균주 당 n=5 마우스)에서 챌린지 후 14일차에 단리된 DRG에서, 플라크 분석 (도 10B) 또는 qPCR (도 10C) 각각에 의해 복제 또는 잠복성 바이러스가 검출되지 않았다. 유사하게, ΔgD-2 백신화된 마우스로부터의 DRG (SD90의 LD90으로 챌린지 후 5일차에 단리됨)가 Vero 세포와 3주 동안 동시-배양된 경우 재활성화 바이러스는 검출되지 않았다. 대조적으로, 바이러스 DNA 및 재활성화 가능한 바이러스는 모든 대조군 (VD60 세포 용균물)-백신화된 마우스로부터 회수되었다 (안락사 시에 단리된 DRG) (도 10D, 그룹당 n=5 마우스).
HSV-2 ΔgD-2는 챌린지 후에 HSV-2 특이적 IgG2 항체 및 면역 세포를 피부로 동원한다: 피부에서 백신 및 바이러스 챌린지에 대한 면역 반응을 특성 규명하기 위해, 부스트 후 21일차 및 챌린지 후 2일차 또는 5일차에 생검을 수득하였고, 조직학 및/또는 균질화를 위해 처리한 다음에, HSV-2 (4674) 또는 HSV-1 (17) 감염된 세포 용균물을 항원으로서 사용하여 ELISA에 의해 HSV-특이적 Ab의 존재를 평가하였다. 상기 ΔgD-2 면역화된 마우스는 부스트 후에 피부에서 HSV-특이적 Abs가 낮은 수준으로 검출되었고, 이는 챌린지 후 2일차에 빠르게 증가하였다 (도 11A). B3x1.1은 SD90과 비교하여 더 높은 역가의 Ab 반응을 유발하였다. 예상한 바와 같이, 챌린지 후 2일차 또는 5일차에 대조군-백신화된 마우스의 피부에서 HSV-특이적 Ab가 검출되지 않았다 (도 11A 및 11B). 피부로부터 회수된 Ab는 검출 가능한 항-HSV IgA 또는 IgM이 없이 (데이터는 개시되지 않음) 주로 IgG이었고 [1:24,000 역가, (도 11B)], IgG2 (IgG2a 및 IgG2b의 동일한 유도) HSV 특이적 항체가 풍부하였다 (모든 HSV IgG의 ~ 80%) (도 11C).
뮤린 IgG2 항체는 FcγR에 결합한다 (78). 상기 ΔgD-2 백신 매개 ADCC에 의해 Ab가 유발되고, 본 연구는 HSV 코팅된 비드에 대한 항체-의존성-세포-포식작용 (ADCP)을 측정하여 확장되었다. 부스트 1주일 후에 수득된 ΔgD-2 백신화된 마우스로부터의 혈청은 더 높은 HSV 특이적 포식작용을 유발하였고, 대조군 면역화된 마우스 또는 세포 용균물로 코팅된 비드로부터의 혈청과 비교하여 더 많은 IFN-γ 분비를 유도하였다 (도 11D).
챌린지 후 5일차에 수득된 ΔgD-2-면역화되고 대조군 백신화된 마우스, 또는 비면역화되고 비감염된 마우스 (모의)로부터의 피부 생검들을 또한 면역 세포 반응에 대해 면역조직화학 및/또는 면역형광에 의해 평가하였다. 상기 ΔgD-2-면역화된 마우스는 대조군 면역화된 마우스와 비교하여, CD3+ T 세포 (평균 ± SD 8.0% ± 2.1 대 2.5% ± 0.7, p< 0.001; 도 12A, 12D) 및 B220+ B 세포 (3.8% ± 1.1 대; 2.4% ± 1.1, p=0.09; 도 12B, 12E)가 현저하게 증가하였다. 상기 T-세포는 CD4 또는 CD8에 대한 염색에 의해 추가로 특성 규명되었고; 대조군-면역화된 마우스와 비교하여 ΔgD-2에서 CD4+ 집단의 상당한 증가가 있었지만, CD8+ 집단은 증가하지 않았다 (p<0.05) (도 12F 및 12G). 반대로, 대조군 면역화된 마우스와 비교하여, ΔgD-2에서 Iba1+ 단핵구/대식세포 (도 12C 및 12H) 및 Ly6G+ 호중구 (도 13)는 감소하였다.
염증 세포의 감소 및 바이러스의 빠른 제거와 일치하는, 챌린지 후 5일차에 대조군 면역화된 마우스와 비교하여, 상기 ΔgD-2에서 피부 균질물 중에 검출된 염증성 사이토킨/케모카인의 감소가 있었다 (도 14). HSV-1 및 HSV-2-감염된 마우스는 면역화와 무관하게, 2일차에 모의-감염된 마우스와 비교하여, 높은 수준의 TNFα (도 14A), IL-1β (도 14B), 및 IL-6 (도 14C)을 가졌다. 그러나, ΔgD-2에서 5일차까지 상기 수준이 감소하였지만, 대조군-면역화된 마우스에서는 감소하지 않았다. 케모카인 CXCL9 (도 14D) 및 CXCL10 (도 14E)에 대해서도 유사한 결과가 수득되었다. 흥미롭게도, IL-33 수준은 시점들 모두에서 대조군-면역화된 마우스와 비교하여, ΔgD-2-면역화된 마우스에서 지속적으로 더 높았다 (도 14F).
토의
본 연구로부터 HSV-2 ΔgD-2로의 백신화는 유전적으로 다양한 HSV-1 및 HSV-2 임상적 단리물의 패널에 대한 완전한 보호를 제공하고, 잠복기의 수립을 방지하는 것을 확인하였다. 백신 효능은 인간 원발성 질환을 반영하는, 최적화된 피부 모델에서 확인되었다. 상기 ΔgD-2는 피부로 빠르게 동원된 고역가의 항체를 유발하여, 최고 용균성 균주인 SD90의 LD90의 100배로 챌린지 후에도 5일차까지 바이러스를 제거하였다. HSV-1 및 HSV-2 임상적 단리물의 광범위 어레이에 대한 ΔgD-2의 보호 효과는, 임상적 단리물 SD90에 대해 완전히 보호하지 못한 HSV-2 ΔUL5/ΔUL29와 같은 다른 후보 백신, 또는 gD 서브유닛 백신 및 하나 또는 2개의 실험실 바이러스 균주에 대해서만 테스트된 기타 백신과 구별된다.
ΔgD-2가 제공하는 광범위한 보호는 유발된 면역 반응의 고유한 특성을 반영할 가능성이 높다. 유도된 Ab는 IgG2 서브타입이 풍부하고 (모든 HSV-특이적 IgG의 ~80%), 낮은 수준의 중화 활성을 가졌으며 (개시되지 않음), 챌린지 후 2일차까지 피부 생검에서 1:24,000에 도달하는 역가로 피부에 빠르게 동원되었고, ADCP (본원에 개시됨) 및 ADCC를 포함한 Fc 이펙터 기능 (78)을 매개하였다. ΔgD-2에 대한 항체 반응은 용량-의존적이었고, 질병 스코어에 의해 입증된 바와 같이 바이러스 제거 속도와 관계가 있으며, 잠복기의 수립을 완전히 방지하는 백신의 능력에 기여하였을 가능성이 높다. 더 적은 용량의 ΔgD-2로 면역화하면 혈청 중에 HSV-특이적 항체의 역가를 더 적게 유발하였지만, 모든 마우스가 치명적인 챌린지로부터 보호되었다. 이러한 발견은 FcγR-이펙터 기능에 더 적은 수준의 항체로도 충분할 수 있음을 시사한다. gD의 넥틴-1 결합 도메인이 변경된 다른 HSV-2 바이러스 균주 (gD27)는 또한 재조합 보강된 gD와 비교하여 더 적은 역가의 혈청 중화 Ab를 유발하였지만, 반대로 마우스의 질 챌린지에 대해 재조합 gD 단백질보다 더 많이 보호하였다 (59). 다른 항체 기능 예컨대 ADCC 또는 ADCP는 평가되지 않았다. 그러나, 이러한 발견으로부터 중화 Ab 역가는 마우스, 코튼 래트 (cotton rats) (80) 또는 인간에서 보호의 예측 연관성 (predictive correlate)은 아니라는 개념을 추가로 뒷받침한다.
사이토킨 및 케모카인의 증가를 특징으로 하는 급속한 염증 반응이 챌린지 후 2일 차에 ΔgD-2 백신화된 마우스 및 대조군 백신화된 마우스 모두에서 관찰되었지만, 염증 반응은 백신화된 마우스에서 5일차까지 해결되었으며, 이는 바이러스의 급속한 제거와 일치한다. 대조적으로, 대조군 백신화된 마우스에서 염증이 지속되었지만, 이는 진행성 질환과 일치한다. 후자는 사이토킨/케모카인 (IL-1β, IL6, CXCL9 및 CXCL10)의 지속적인 상승 및 단핵구/대식세포 및 호중구의 지속을 특징으로 하며, 이는 대조군-백신화된 마우스에서 상피 전체 및 피부층 내에서 관찰되었다. 대조적으로, CD4+ T 세포 및 B220+ B 세포의 더 높은 퍼센트가 5일차에 ΔgD-2 백신화된 마우스의 피부에서 관찰되었으며, 이는 아마도 세포 기억 반응 (cellular memory response)을 반영한 것으로 보인다.
흥미롭게도, IL-33은 대조군과 비교하여 ΔgD-2 면역화된 마우스로부터의 피부에서 더 높은 경향을 보이는 유일한 사이토킨이었다. IL-33의 정확한 역할은 알려져 있지 않다. 이전 연구로부터, rIL-33 투여는 마우스의 피부 상처 치유를 증진시키고, 선천성 림프계 세포 (lymphoid cells)의 활성화 및 단핵구의 타입 2 대식세포로의 분화와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (81, 82). IL-33의 마우스로의 전신 투여는 FcgR2b의 증가와 관련이 있었고, 이는 염증 감소와 관련이 있다 (88). 아마도, ΔgD-2 백신화된 마우스의 피부에서 관찰된 IL-33의 증가는 상처 치유 및 염증 해소를 촉진하였다.
상기 임상적 단리물은 유사한 인 비트로 성장 키네틱스에도 불구하고 뮤린 피부 (및 질) 모델에서 다양한 독성을 나타내었다 (76, 84). 그러나 흥미롭게도, HSV-1 단리물 중에 이전 연구에서 개시된 것과 유사한 수준의 유전적 다양성을 보였지만, Bronx에서 수집된 HSV-2 단리물 중에 이전 보고서에 개시된 것보다 실질적으로 더 큰 유전적 다양성이 발견되었다. 본원에서 관찰된 차이가 더 커지면 Bronx 커뮤니티의 다양한 지리적 기원을 반영할 수 있다. 이러한 이질성에도 불구하고, 테스트된 모든 단리물은 ΔgD-2 백신에 의해 완전히 보호되었고, 아마도 다항원 반응 (polyantigenic response)을 반영할 수 있다. 더욱이, HSV-1 및 HSV-2에 대한 완전한 보호가 관찰되었고, 이는 HSV-1이 선진국에서 생식기 질환의 더 흔한 원인으로 대두됨에 따라 임상적으로 관련된다. 잠복성 바이러스의 부재로 입증된 "멸균 면역"과 조합된 본원에서 관찰된 보편적인 보호는 이러한 ΔgD-2 백신의 효과를 뒷받침한다.
물질 및 방법
세포 및 바이러스: Vero (아프리카 그린 원숭이 신장 세포주; CCL-81; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA) 세포, VD60 세포 [내인성 프로모터 하에 gD-1을 코딩하는 Vero 세포 (85)], 및 CaSki (인간 자궁경부 상피 세포주; CRL-1550; ATCC)를 10% 우태아 혈청 (FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)이 보충된 DMEM에서 계대배양하였다. THP-1 (인간 단핵구 세포주; TIB-202; ATCC) 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 (Life Technologies)에서 계대배양하고, ATCC 지침에 따라 서브-배양하였다. HSV-2(G) ΔgD-2의 제작 및 VD60 세포에서 이의 증식은 이전에 개시되었다 (95, 94). 5가지의 상이한 바이러스 제제를 비교하여 백신 효능의 변동성은 관찰되지 않았다. HSV-2(4674) (86)를 CaSki 세포에서 증식하였다. 실험실 균주 HSV-2(G) (87), HSV-2 (333-ZAG) (86), HSV-1(17) (89), 및 HSV-1(F) (87)를 Vero 세포에서 증식하였다. 사우스 아프리카 단리물 HSV-2(SD90) (97)는 David Knipe에 의해 제공되었고, Vero 세포에서 증식되었다. 5개의 HSV-1 (B3x1.1 내지 B3x1.5) 및 5개의 HSV-2 (B3x2.1 내지 B3x2.5) 비-식별 (de-identified) 임상적 단리물은 Montefiore의 the Clinical Virology Lab이 제공하였고, 저-계대 연구 스톡을 위해 Vero 세포에서 3회 계대배양하였다.
인 비트로 성장 곡선: 단일 단계 및 다단계 성장 곡선은 이전에 개시된 바와 같이 수행되었다 (86). 각 바이러스의 단일 단계 성장의 경우, Vero 세포를 5 PFU/세포의 감염 다중도 (multiplicity of infection: moi)로 바이러스로 감염시켰고, 상등액 및 세포를 감염 후 (post-infection: pi) 4, 8, 16 및 24시간 (h) 마다 수집하였고, -80℃에 저장하였다. 각 바이러스의 다단계 성장의 경우, Vero 세포를 0.01 PFU/세포의 moi로 감염시키고, 상등액 및 세포를 최대 72시간까지 pi 12시간 마다 수확하였다. 감염성 바이러스는 상등액 및 용균된 세포로 플라크 분석을 수행하여 측정되었다.
바이러스 DNA 단리 및 임상적 단리물의 서열분석: MOI 10으로 각 B3x 임상적 단리물로 T150 플라스크 내에 융합성 Vero 세포를 감염시켜서 HSV DNA를 준비하였다. 세포를 16 hpi에서 수확하고, PBS로 2회 세척하였다. 제조자의 권장 사항에 따라 DNeasy® Blood and Tissue (Qiagen)를 사용하여 DNA를 추출하였다. DNA는 Qubit dsDNA hs 분석 (Life Technologies)에 의해 정량분석하였다. 페어드-엔드 라이브러리 (Paired-end libraries)를 제조자의 지침에 따라 Nextera XT DNA 라이브러리 제조 키트 (Illumina)로 제조하였다. 라이브러리는 Illumina MiSeq Desktop Sequencer에서 서열분석하였다. 바이러스 게놈 서열은 불완전한 클로로세부스 사베우스 (Chlorocebus sabaeus) (Vero 세포의 출처) 게놈에 대해 대체물로서 마카카 물라타 (Macaca mulatta) 게놈에 대해 정렬하여 숙주 서열을 제거한 후에 VirAmp 파이프라인 (89)으로 조립되었다. HSV-1 및 HSV-2 게놈은 GenBank에 제출하기 전에 HSV-1(96) (GenBank accession no. JN555585.1) 및 HSV-2(HG52) (JN561323)와 비교하여, ViPR에서 Genome Annotation Transfer Utility로 주석을 달았다. 이전에 서열분석된 HSV-2 (SD90e) (KF781518), HSV-2 (333) (KP192856), ChHV 105640 (NC_023677.1), 및 HSV-1(F) (GU734771.1)를 포함한 전체 게놈 정렬은 ClustalW를 사용하여 수행되었고 (90), 계통발생 수 (phylogenetic trees)는 MEGA6에서 1000개의 부트스트랩 복제물 (bootstrap replicates)로 UPGMA 방법을 사용하여 제작되었다 (91). 갭 또는 누락된 데이터가 포함된 모든 위치를 제거하였다. 게놈 서열에 대한 GenBank 번호는 하기와 같다: HSV-2(G) (KU310668), HSV-2(4674) (KU310667), B3x1.1 (KU310657), B3x1.2 (KU310658), B3x1.3 (KU310659), B3x1.4 (KU310660), B3x1.5 (KU310661), B3x2.1 (KU310662), B3x2.2 (KU310663), B3x2.3 (KU310664), B3x2.4 (KU310665), B3x2.5 (KU310666).
뮤린 면역화 및 바이러스 챌린지 연구: 실험은 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee, Protocol #20130913 및 #20150805의 승인을 받아 수행하였다. 암컷 C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 4-6주령으로 Jackson Laboratory (JAX, Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. 마우스를 100μl/마우스로, ΔgD-2의 5x104 - 5x106 PFU 또는 VD60 세포 용균물 (대조군)의 동등한 양으로 피하로 (sc, 뒷다리와 골반의 중간)로 프라임 및 3주 후에 부스트하였다. 역가는 보완 세포 (VD60)에서 플라크 분석에 의해 결정되었다.
질내 HSV 감염의 경우, 마우스를 챌린지 5일 전에 메독시프로게스테론 아세테이트 (medoxyprogesterone acetate: MPA; Sicor Pharmaceuticals, Irvine, CA)의 2.5 mg으로 sc로 처리하였다. 그 다음에 마우스를 30μl/마우스로 HSV-2 (4674)의 LD90 (5x105 pfu/마우스)으로 질내 접종하고, 질병에 대해 스코어를 매기고, 이전에 기재된 바와 같이 14일 동안 생존을 모니터링하였다 (21). HSV 피부 감염의 경우, 마우스를 Nair로 우측 옆구리를 제모하고, 24시간 동안 휴식하도록 하였다. 제모된 마우스를 이소플루란 (Isothesia, Henry-Schein)으로 마취한 다음에, 노출된 피부를 일회용 에머리 보트 (disposable emory board)로 20 - 25회의 스트로크 (strokes)로 마모시킨 후에, 인 비보 독성 연구를 위해 1x105 PFU HSV-1 또는 5x104 PFU HSV-2 균주로 챌린지하거나, 또는 백신 효능 연구를 위해 선택된 HSV 균주 (표 1 참조)의 LD90, 10xLD90, 또는 100xLD90으로 챌린지하였다. 마우스를 14일 동안 모니터링하고, 하기와 같이 스코어링하였다: 1: 원발성 병변 또는 홍반, 2: 원거리 부위 띠헤르페스 모양 병변 (zosteriform lesions), 경증 부종/홍반, 3: 중증 궤양 및 부종, 표피 확산 증가, 4: 뒷다리 불완전마비/마비, 및 5: 사망. 스코어 4에서 안락사시킨 마우스는 통계 분석을 위해 모든 후속 일수에 값을 5로 배정하였다.
HSV RT-qPCR: 제조자의 권장 사항에 따라 DNeasy® Blood and Tissue (Qiagen)를 사용하여 칭량된 조직 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 그 다음에 추출된 DNA를 반응 당 DNA 10 ng로 정규화하였고, ABsolute qPCR ROX Mix (Thermo Scientific)를 사용하여 실시간 정량적 PCR (RT-qPCR, qPCR)을 사용하여 바이러스 DNA를 정량분석하였다. HSV 폴리머라제 (UL30)용 프라이머는 Integrated DNA Technologies (Cat#: 1179200494)에서 구입하고, 이를 사용하여 바이러스 게놈 DNA를 검출하였다. 단리된 HSV-2 바이러스 DNA는 QuantStudio® 3D Digital PCR (dPCR, ThermoFisher Scientific)을 사용하여 절대 카피 양 (absolute copy amounts)에 대해 보정한 다음에, 이후에 표준 곡선으로 사용하여 HSV 바이러스 게놈 카피를 결정하였다. 4개 이하의 카피 수로 판독하는 샘플은 음성 (negative)으로 간주되었다. 데이터는 DRG (배근 신경절) 조직의 그람 당 log10 HSV 게놈으로 제시된다.
피부 생검에서 항체 및 사이토킨의 검출: 피부 생검은 HSV-2 ΔgD-2 또는 VD60 용균물 (대조군) 면역화된 마우스 (기계적 절제에 의해 직경 ~ 5-10 mm)로부터 부스트 후 21일차, 또는 바이러스 피부 챌린지 후 2일차 및 5일차에 수득하였다. 상기 조직을 칭량하고, FastPrep-24TM 5G (MP Biomedicals)에서 3회의 30초 주기 동안 6.0 m/초로 무-혈청 DMEM을 갖는 무 RNase/DNase Lysing Matrix A 튜브 (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)에서 균질화하였다. 샘플을 4℃에서 5000 rpm으로 10분 동안 회전시키고, 수득된 상등액을 항-HSV 항체, 사이토킨 및 케모카인에 대해 평가하였다. 항-HSV 항체는 비감염된, HSV-1 (96) 또는 HSV-2 (4674)-감염된 Vero 세포 용균물을 코팅 항원으로 (94) 사용하여 이전에 개시된 바와 같이 ELISA로 검출되었다). 바이오틴 항-마우스 Ig κ 또는 바이오틴 항-마우스 IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3의 1 μg/ml (Becton Dickenson, San Diego)을 2차 검출 항체로서 사용하였다. 웰 (wells)을 450 nm의 흡광도에서 SpectraMax (M5 시리즈) ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다. 수득된 흡광도는 비감염된 세포 용균물에 대해 수득된 값을 감염된 세포 용균물로부터 수득된 값으로부터 차감하여 결정하였다. 총 항-HSV Ig는 조직 균질물의 1 : 1000 희석으로 상대 조직 중량에 대해 정규화된 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)로 보고된다. 항-HSV IgG, IgA, IgM 또는 IgG1-3은, 피부 균질물의 1 : 100 희석으로만 보고되는 IgG1-3을 제외한 모든 희석에서 450 nm에서 광학 밀도 (OD)로 보고된다.
Milliplex 마우스 사이토킨/케모카인 면역분석 (Millipore, Danvers, MA) 및 Luminex Magpix 시스템을 사용하여 인터루킨-6 (IL-6), IL-1 베타 (IL-1β), IL-33, 종양 괴사 인자 알파 (tumor necrosis factor alpha: TNFα), 인터페론-감마에 의해 유도된 모노카인 (monokine induced by interferon-gamma: MIG, CXCL9), 인터페론-유도성 사이토킨 (IP-10, CXCL10)에 대해 피부 균질물 상등액을 분석하였고, Milliplex Analyst (Version 3.5.5.0; VigeneTech Inc.)로 분석하였다.
피부 조직의 조직병리학, 면역조직화학 및 면역형광: 마우스를 챌린지 후 5 일차에 안락사시키고, 바이러스 (또는 모의) 감염 부위의 피부를 절제하고, 포르말린으로 RT에서 48시간 동안 고정시켰다. 샘플은 파라핀 포매 및 절편화를 위해 일상적으로 처리되었다. 조직 병리학용 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신 (hematoxylin and eosin: H&E)으로 염색하였다. 샘플 식별자를 블라인딩하고, 보드 인증 수의학 병리학자에 의해 조직학적으로 샘플을 평가하였다. 면역조직화학 (IHC)의 경우, 샘플을 5 μm로 절편화하고, 크실렌 그 다음에, 등급별 알코올에서 탈파라핀화하였다. 항원 회수 (antigen retrieval)는 30분 동안 96℃로 가열된, pH 6.0의 10 mM 시트르산 나트륨 버퍼에서 수행되었다. 내인성 퍼옥시다제 활성은 수중 3% 과산화수소를 사용하여 차단하였다. 항-CD3 (Ready to use format, ThermoFisher Scientific, Cat: RM-9107-R7), 항-B220 (BD Biosciences Cat: 550286), 또는 항-Iba1 (1:3000 dilution Wako Pure Chemical Industries, Richmond, VA)에 대한 토끼 1차 항체에 대해 SuperPicTureTM (ThermoFisher Scientific, Cat:87-9673)를 사용하여 일상적인 IHC 방법에 의해 상기 절편을 염색한 다음에, 최종 색소원 (chromogen)으로서 디아미노벤지딘으로 염색하였다. 모든 면역염색된 절편을 헤마톡실린으로 가볍게 대조염색하였다. 염색된 단면을 Zeiss Axio Observer 도립 광학 현미경을 사용하여 샘플당 3개의 상이한 위치들에서 정점층 (표피)에서 기저층 (횡문근)까지 20x 배율로 현미경 사진을 촬영하였다. 염색된-양성 세포는 Bologna-Molina et al., 2011 (92)에 의해 기재된 바와 같이 열거되었다. 데이터는 샘플 당 3개의 현미경 사진 섹션의 % 양성 세포 = (양성 유핵 세포/총 유핵 세포)의 평균으로 나타낸다.
면역형광 연구를 위해, 피부 조직을 HSV 또는 모의 피부 챌린지하고 5일 후에 절제한 다음에, OCT 배지에서 동결하였다. 샘플을 5 μm 절편으로 절단하고, -80℃에 저장하였다. 그 다음에 동결된 슬라이드를 -20℃ 아세톤에서 15분 동안 고정하고, 세척 버퍼 (WB, PBS 중 0.05% Tween 20)로 세척한 다음에 차단 버퍼 (2% BSA, PBS 중 5% 열 불활성화된 염소 혈청)로 RT에서 2시간 동안 차단하였다. 슬라이드를 2회 세척하고, 차단 버퍼 중 항-CD4 (GK1.5, 1:200), 항-CD8 (YTS169.4, 1:250), 항-Ly6G (1A8, 1:500)로 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 철저히 세척하고, Alexa flour 555 또는 Alexa flour 488 (각각 1:500 또는 1:200)과 접합된 염소 항-래트 2차 항체와 함께 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세척하고, DAPI (ProLong® Diamond Antifade Mountant with DAPI, ThermoFisher Scientific)를 함유하는 배지에 장착하였다. 슬라이드를 Nikon Eclipse Ti-U 도립 광학 현미경을 사용하여 샘플당 2개의 상이한 위치에서 정점층 (표피)에서 기저층 (횡문근)까지 20x 배율로 촬영하였다. %CD4+ 및 %CD8+ 정량 분석을 위해, 총 유핵 세포는 Velocity (version 6.3, Perkin Elmer)의 소프트웨어 알고리즘을 통해 ≥5μm의 DAPI 양성 대상체 (DAPI positive objects)에 의해 계산되었다. CD4 또는 CD8 양성 세포는 피부 절편에서 모낭 및 세포 데브리스의 비-특이적 염색을 배제하기 위해 DAPI+ 핵의 혼입 및 형광에 대해 수동으로 계수하였다. 데이터는 샘플 당 2개의 이미지의 %양성 세포=(양성 세포/총 DAPI 세포)의 평균으로 나타낸다.
항체 의존성 세포 포식작용 (ADCP) 분석. HSV 특이적 ADCP를 결정하기 위해, Ackerman et al., 2011 (93)로부터 수정된 프로토콜을 사용하였다. 간단히 말해서, 2x108 1μm 뉴트라바딘-레드 형광 비드 (Neutravadin-red fluorescent beads) (Invitrogen, F-8775)를 500μl의 BlockAidTM (ThermoFisher Scientific, B-10710) 중에서 바이오티닐화 HSV-2 감염된 또는 비감염된 (대조군) Vero 세포 0.3 mg으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 비드를 PBS 중 1% BSA로 2회 세척한 다음에, 96 둥근 바닥 플레이트에 1x106 비드/웰을 부가하였다. 부스트 1주일 후에 면역화된 마우스로부터의 혈청을 56℃에서 30분 동안 열-불활성화시키고, 무-혈청 RPMI에서 1:5로 희석하였다. 50 μl의 희석된 혈청을 HSV 용균물 또는 대조군 세포 용균물 코팅된 비드를 함유하는 웰에 부가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2x104 세포/웰 THP-1 세포를 최종 부피 200 μl/웰로 각각에 부가하고, 5% CO2에서 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 100 μl의 상등액을 꺼내고, -20℃에서 저장한 다음에, 100 μl의 4% 파라포름알데히드로 재현탁하였다. 그 다음에 샘플을 the Einstein Flow Cytometry Core Facility의 5-레이저 LSRII 유세포 분석기 (Becton Dickenson, San Diego)에서 판독하였다. 포식작용 스코어를 THP-1 세포를 나타내는 이벤트에서 게이팅한 다음에 FlowJo 소프트웨어 (version 10, Tree Star Inc.)를 사용하여 식 [(세포 비드 양성의 % X 비드에 대해 양성인 세포의 MFI)/106]을 적용하여 보고된다. 항체 포식작용을 통해 활성화된 THP-1 세포로부터의 IFN-γ 분비는 이전에 개시된 바와 같이 Milliplex 인간 맞춤형 면역분석 (Millipore, Danvers, MA) 및 Luminex Magpix 시스템을 사용하여 저장된 배양된 상등액을 분석하여 결정하였다.
조직에서 바이러스 검출. 피부 및 배근 신경절 (DRG)을 칭량하고, 상기에 개시된 바와 같이 균질화하였다. 그 다음에 균질화된 조직의 상등액을 1시간 동안 융합성 Vero 세포 단일층 (48-웰 플레이트에서 2x105 세포/웰) 상에 오버레이하였다. 웰을 PBS로 세척한 다음에, 1% 열-불활성화된 FBS를 함유하는 199 배지 (Gibco®)로 세척하고, 0.5% 메틸셀룰로스로 오버레이하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드로 고정하고, 크리스탈 바이올렛 용액 (crystal violet solution)으로 염색하고, PFU의 수를 정량분석하였다. 신경세포 엑스-비보 동시-배양 분석은 이전에 개시된 바와 같이 수행하였다 (94).
통계 분석. GraphPad Prism 버전 6 (San Diego, CA)을 사용하여 다중 비교 (multiple comparisons) 또는 언페어드 student's t-테스트 (unpaired student's t-tests)와 함께 2-원 ANOVA (two-way analysis of variance)로 결과들을 비교하였다. log rank 테스트로 Mantel-Cox 생존 곡선들을 비교하였다. P 값 <0.05 (*), <0.01 (**), <0.001 (***)은 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 3
전 세계적으로 신생아 HSV 감염은 연간 약 14,000건이다. 일차 모성 생식기 HSV는 신생아 사례의 50-80%를 차지한다. 상기 주산기 전파는 효과적인 치료로도 심각한 사망률 및 이환율을 초래한다. 기존의 모체 항체는 재발된 모성 HSV 질환에서 주산기 HSV 전파의 위험이 1-3%로 감소하기 때문에 분명히 어느 정도 보호를 제공할 수 있다는 것이 명백하다. 그러나, HSV1/2 모두에 대해 혈청음성인 임신한 여성의 수가 증가하고 있다.
마우스 및 윤리 진술서: 뮤린 연구는 Albert Einstein College of Medicine, Protocol #2016-1205의 the Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다. C57BL/6 마우스는 Jackson Laboratory (JAX, Bar Harbor, ME)에서 구입하였다.
세포 및 바이러스: Vero (아프리카 그린 원숭이 신장 세포주; CCL-82; ATCC), HaCAT (인간 각질형성세포, ATTC CLS 300493) 및 VD60 세포 (내인성 프로모터 하에 gD-1을 코딩하는 Vero 세포)를 10% 우태아 혈청 (FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen)이 보충된 DMEM에서 계대배양하였다. 임상적 단리물인 HSV-2 (4674) 및 HSV-1 (B3x1.1), 및 상기 바이러스내에 유전자간 부위에 삽입된 CMV 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 실험실 균주인 HSV-2 (333) ZAG를 Vero 세포에서 증식하였다. HSV-2(G) ΔgD-2를 VD60 세포를 발현하는 보완 gD-1 상에서 증식시키고, 바이러스 역가는 VD60 및 Vero 세포에서 플라크 분석에 의해 동시에 결정되고, 비-보완 Vero 대조군 세포에서 플라크가 검출되지 않았다.
면역화 및 바이러스 챌린지 연구: 암컷 마우스를 5 x 106 pfu의 ΔgD-2 (VD60 세포에서 성장시킴), 비감염된 대조군 VD60 세포 용균물, 또는 150 μg의 알루미늄 (Alum) (Imject Alum; Pierce Biotechnology, Rockland, IL) 및 12.5 μg의 모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl lipid A: MPL) (Invivogen, San Diego, CA)와 조합된 재조합 gD-2 단백질 (rgD-2/Alum-MPL) 5 μg으로 백신화하였다. 백신은 생후 4주 (프라임) 및 7주 (부스트)에 최종 부피 100 μl/마우스로 피하 투여하였다. 부스트 1주일 후에, 면역화된 암컷을 수컷과 함께 수용하였고 (2:1), 질 플러그 (vaginal plug)를 모니터링하였다. 후속하여 수컷 마우스를 꺼내고, 임신한 암컷을 분만까지 매일 모니터링하였다. 새끼 (pups)를 생후 1일, 7일 또는 14일에, 비백신화된 7일령의 신생아 마우스 (LD90) (전형적으로 ~105 pfu/HSV-1 (B3x1.1)의 마우스 또는 103-104 pfu/마우스 HSV-2 (4674))에서 90% 치사율 (LD90)을 초래하는 용량으로 양쪽 콧 구멍에 마이크로피펫으로 5 μl의 바이러스를 투여하여, 비강내로 접종하였다. 새끼를 질병 징후가 있는지를 매일 모니터링하고, 뇌염 징후 (예: 마비, 떨림, 보행 불안정 (gai instability), 구부정한 자세 (hunched posture))가 발생하면 즉시 안락사시켰다.
정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의한 HSV DNA 검출: 안락사 시에 (마우스가 질병에 걸리거나 또는 챌린지 후 14일차에), 삼차 신경절을 수집하고, DNA를 DNeasy Blood and Tissue (Qiagen)를 사용하여 추출하였고, 샘플 당 10ng의 DNA를, HSV 폴리머라제 (UL30)를 표적으로 하는 프라이머 (포워드 프라이머 서열, 5'-GGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA-3' (서열번호:3); 리버스 프라이머 서열, 5'-ATCACCGACCCGGAGAGGGA-3' (서열번호:4); 프로브 서열, 5'-CCGCCGAACTGAGCAGACACCCGC-3' (서열번호:5))(Integrated DNA Technologies)를 사용하여 실시간 qPCR (Absolute qPCR ROX Mix (Thermo Scientific)에 의해 HSV의 존재에 대해 분석하였다. 마우스 β-액틴을 로딩 대조군 (Applied Biosystems, Foster City, CA)으로 사용하고, qPCR을 Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex에서 실행하였다. 카피가 4개 미만인 샘플은 음성으로 간주하였다.
항체 반응의 정량분석, 중화 역가 및 FcγR 활성화: HSV-특이적 전체 또는 이소타입 특이적 IgG는 혈청 또는 모유에서 이전에 기재된 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정되었다. 분만 후 8-12일차에 임신한 암컷 마우스로부터의 모유는, 적어도 2시간 동안 이들을 새끼로부터 분리하고 착유 5분 전에 복강내 주사를 통해 2 IU/kg의 옥시토신을 단일-용량으로 투여함으로써 수집되었다. 우유 액적들을 수동으로 짜낸 다음에, 멸균 에펜도르프 튜브로 피펫팅하고, 사용할 때까지 -20 ℃에서 동결하였다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트를 감염 다중도 (MOI) 0.1 pfu/세포의 HSV-1 (B3x1.1) 또는 HSV-2 (4674)로 감염시키고 24시간 후에 수확된 Vero 세포 용균물 또는 비감염된 대조군 용균물로 코팅하였다. 혈청의 계열 희석물을 코팅된 플레이트와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 결합된 IgG, IgG1, IgG2 또는 IgG3을 특정 바이오틴-표지된 2차 Ab (BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 정량분석하였다. 상기 항-HSV IgG 수준은 비감염된 세포 용균물에 대해 수득된 광학 밀도측정 (OD) 값을 차감한 후 결정되었다. 중화 역가는 면역 혈청의 부재 시에 형성된 플라크 (웰당 ~100개의 플라크)에 비해 플라크의 수가 50% 감소하는 최대 열-불활성화된 혈청 희석으로 정의되었다. FcγRIV 활성화는 HSV-2 (4674) 또는 HSV-1 (B3x1.1)-감염된 Vero 세포를 표적으로 하는 mFcγIV ADCC Reporter Bioassay (Promega, Madison, WI)를 사용하여 결정되었다.
항체-의존성 세포-매개 사멸 (Antibody-Dependent Cell-Mediated Killing: ADCK) 분석: 이펙터 면역 세포를 비장 및 간으로부터 단리하고, 5-10마리의 나이브한 신생아 또는 3-5마리의 나이브한 성체 마우스로부터 풀링 (pooling)하였다. 적혈구는 암모늄-클로라이드-포타슘 (ammonium-chloride-potassium: ACK) 용균 버퍼 (Gibco, Grand Island, NY)로 용균하여 제거하였다. 풀링된 세포를 계수하고, 완전 RPMI 배지에 재현탁시켰다. 표적 세포는 1 pfu/HSV-2 (333) ZAG의 세포의 MOI로 37℃에서 4시간 동안 감염시킨 HaCaT 세포, 또는 대조군으로서 비감염된 HaCaT 세포였다. 상기 표적을 CellStripper (Corning)로 해리시키고, DMEM 중에 107 세포/ml로 재현탁하고, 2 x 105 세포 (100 μl)를 96-웰 U 바닥 플레이트의 각 웰에 부가하였다. 상기 표적을 실온에서 15분 동안 ΔgD-2 또는 VD60 대조군 백신화된 성체 마우스로부터 단리된 풀링된 열-불활성화된 혈청 (DMEM 중에서 1:5 희석)과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음에 상기 풀링된 이펙터 세포를 1시간 동안 10:1의 이펙터 대 표적 세포 비율로 부가하였다. 배양물을 30분 동안 Live/Dead Red 고정 가능한 염료 (Invitrogen)로 염색하고, 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 5% 파라포름알데히드로 고정하고, FAC 버퍼 (PBS 중 2% 열-불활성화된 FBS)에 재현탁하였다. LSRII (Becton Dickinson)에서 유세포 분석법으로 세포를 분석하고, FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 GFP-양성 (HSV-2 감염된) 사멸된 세포의 퍼센트를 결정하였다.
FcγR 발현: ADCK 분석에 대해 성체 또는 신생아 마우스의 비장 및 간으로부터 단리된 면역 세포를 FACS 버퍼 중에 1x107 세포/mL로 조정하고, 세포 현탁액 100 μl를 96-웰 둥근-바닥 마이크로타이터 플레이트에 부가하였다. CD11b-APC-Cy7, Ly6G-AlexaFluor700, Ly6C-PE, F4/80-APC, CD3-PE-Cy7, Live/dead Red 고정 가능한 염료 (BD Biosciences, Invitrogen) 및 관련 항-mFcγ-FITC (I, II, III, IV; BioLegend)로 세포를 4℃의 어두운 곳에서 30분 동안 염색한 다음에 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하였다. 분석을 위해, 전방 및 측면 광 산란 면적 (FSC-A, SSC-A) 대 너비 (FSC-W, SSC-W)에 기반하여 이중선 (doublets)을 제외하였다. 세포 집단은 하기와 같이 정의되었다: 대식세포, CD11bintF4/80hi; 호중구, CD11bhiF4/80loLy6GhiLy6Cint; 단핵구, CD11bhiF4/80loLy6GintLy6Chi. LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)에서 샘플을 판독하고, FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. FcγR 양성 세포의 퍼센트는 %FMO FITC 양성-%FITC 양성에 기반하여 계산하였다.
통계 분석: GraphPad Prism version 7.0 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. p 값이 0.05 이하이면 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. Mantel-Cox 테스트를 사용하여 생존 곡선을 비교하였고; 기타 결과는 지시된 바와 같이 다중 테스트와 분산 분석을 사용하여 비교하였다.
결과
ΔgD-2를 사용한 모성 백신화로 HSV-1 또는 HSV-2 챌린지로부터 7-14일된 새끼를 보호하였다: 모성 백신화가 출생 후 HSV로부터 새끼를 보호할 수 있는지를 결정하기 위해, 성체 암컷 마우스를 교미 (mating) 전에 2회 용량의 ΔgD-2, rgD-2/Alum-MPL, 또는 대조군으로서 비감염된 VD60 세포 용균물로 백신화하였고, 이들의 새끼를 ~LD90 용량의 HSV-1 또는 HSV-2의 임상적 단리물로 비강내로 챌린지하였다. 새끼를 생후 7일차에 처음 챌린지하였고, 이는 면역학적으로 인간 유아기에 해당하는 것으로 추정된다. 치명적인 HSV-1 및 HSV-2 질병에 대한 유의미한 보호가 대조군-백신화된 어미로부터 태어난 새끼와 비교하여, ΔgD-2 면역화된 어미로부터 태어난 새끼에서 관찰되었다 (p< 0.001) (도 15A). 대조적으로, 모성 rgD-2/Alum-MPL은 7일령 새끼에서 HSV-1 (1/5 (20%) 생존율) 또는 HSV-2 (3/18 (16.7% 생존율)에 대해 보호를 거의 제공하지 않았다. 새끼를 생애 14일차에 챌린지한 경우 보호가 지속되었지만 (도 15B, p<0.001), 새끼를 생애 1일차에 챌린지한 경우 보호는 감소하였다 (HSV-1보다 HSV-2에 대해 더 많이 감소됨) (도 15C).
7일 또는 14일령 새끼에서 관찰된 치명적인 질병에 대한 보호가 잠복성 감염원 (latent reservoir)의 수립에 대한 보호와 관련이 있는지를 결정하기 위해, HSV DNA에 대해 삼차 신경절을 qPCR로 마우스의 사망 시에, 또는 마우스가 생존한 경우 바이러스 챌린지 후 14일차에 분석하였다. rgD2-Alum/MPL 또는 VD60 대조군 용균물로 백신화된 마우스와 비교하여 ΔgD-2로 백신화된 어미로부터 태어난 새끼로부터 회수된 바이러스 DNA는 현저한 감소하였고, 이는 모성 유래 Ab에 의한 빠른 바이러스 제거를 시사한다. (도 17 참조).
보호는 FcγRIV-활성화 항체와 관련이 있다: 생애 7일차에 HSV-1 또는 HSV-2로 감염시킨 새끼로부터 수득된 혈액에서, HSV 결합 (ELISA), 중화 및 FcγRIV 활성화 Ab 수준을 질병에 대한 안락사 시에 (챌린지 후 평균 6일) 또는 챌린지에서 살아남은 새끼의 경우 실험 종료 시에 (챌린지 후 14일차) 정량분석하였다. gD-2/Alum-MPL 및 ΔgD-2를 사용한 백신화는 HSV-1 또는 HSV-2 결합 IgG Ab의 유사한 역가를 유발한 반면에, 예상된 바와 같이 VD60 면역화된 마우스로부터 태어난 HSV-감염된 새끼에서는 HSV-특이적 IgG가 거의 또는 전혀 검출되지 않았다 (도 16A, 16B). 그러나, 상기 Ab들의 기능 (functionality)은 상이했다. gD-2/Alum-MPL로 면역화된 어미로부터 태어난 새끼의 혈청 중 Ab는 주로 중화 활성이었고 (평균 NT 1:25) (도 16C), 뮤린 FcγRIV를 활성화하지 못했다 (도 16D). 반대로, ΔgD-2-면역화된 어미로부터 태어난 마우스의 혈청 중 Ab는 ADCC 활성을 나타내는 상당한 FcγRIV 활성화를 나타내었지만, 중화 활성은 거의 또는 전혀 나타내지 않았다.
최적의 보호는 모유로부터 획득된 항체를 필요로 한다: 새끼를 생후 1일차에 챌린지하는 경우를 7일차 또는 14일차에 챌린지하는 경우와 비교하여 관찰된 보호의 차이는 태반경유로 획득한 항체만으로는 충분하지 않고 및/또는 FcγR 이펙터 세포 기능(들)에 있어서 연령-의존적 차이가 있음을 시사한다. 이러한 가능성을 탐구하기 위해, ΔgD-2-면역화된 모체로부터 태어난 새끼를 출생시 전환하고, VD60 세포 용균물로 면역화된 모체에 의해 양육하며 (태반경유-획득된 Ab 단독), 반대로 VD60 대조군-면역화된 모체로부터 태어난 마우스는 ΔgD-2-면역화된 모체에 의해 양육되었다 (모유로 획득한 Ab 단독). 양성 대조군은 ΔgD-2-면역화된 모체로부터 태어나고 양육된 마우스 였고, 음성 대조군은 VD60 대조군 용균물-면역화된 모체로부터 태어나고 양육된 마우스였다. 그 다음에 상기 새끼들은 생후 7일 또는 14일차에 비강내로 챌린지하고, 2주일 동안 모니터링하였다. 대조군 (VD60-면역화된 어미로부터 태어나고 양육된 새끼)과 비교하여, ΔgD-2-면역화된 어미로부터 태어난 새끼는 이들이 ΔgD-2 면역화된 어미에 의해 양육되는 경우 7일 또는 14일차에 챌린지될 때 HSV-1의 LD90으로부터 유의미하게 보호되었지만, 상기 새끼가 출생시 전환되고 대조군-면역화된 어미에 의해 양육된 경우에는 보호되지 않았다 (p<0.001, 다중 비교를 위한 보정을 통한 Kaplan-Meier). 반대로, VD60-면역화된 어미로부터 태어났지만 ΔgD-2 면역화된 마우스에 의해 양육된 새끼는 또한 14일차에 챌린지된 경우 유의미하게 보호되었지만, 7일차에는 보호되지 않았다 (p<0.001). 새끼를 HSV-2로 챌린지한 경우 유사한 결과가 수득되었다. (도 19A-C) 태반경유 및 모유 중 Ab들을 모두 받은 신생아에서는 잠복기에 대한 보호 (Protection against latency)가 또한 최적이다. (도 20)
결과는 챌린지 시에 새끼의 혈청 중에 존재하는 신생아 Ab 수준의 양과 관계가 있다. (도 21A-21B) 이러한 연구를 위해, 바이러스로 챌린지하지 않은 "전환된" 마우스에서 3일, 7일 또는 14일차에 혈액을 수득하였다. (1일차에 혈액 채취는 실행 가능하지 않았음). HSV-2 특이적 IgG의 신생아 수준은 ΔgD-2 면역화된 모체로부터 태어났지만 양육되지 않은 마우스의 경우 급속히 감소하였고, 이는 뮤린 IgG의 짧은 반감기와 일치한다. 반대로, HSV-특이적 IgG는 ΔgD-2 면역화된 모체에 의해서 양육된 마우스에서는 빠르게 증가하였다. 모유 중에 HSV-특이적 항체의 존재는 8-12일차에 수집된 샘플에서 확인되었다.
1일차에 챌린지된 마우스에서 보호 감소는 항체-의존성 세포 사멸 활성과 관련이 있다: 생애 1일차에 HSV-특이적 Ab가 충분한 수준으로 존재함에도 불구하고 (ΔgD-2 면역화된 모체로부터 태어났지만 양육되지 않은 새끼에서 3일차에 측정된 수준에 기반함), 보호는 통계적으로 유의미하지 않았으며, 이는 FcγRIV 발현의 차이 및/또는 항체 의존성 세포 사멸 (ADCK)의 결함을 시사하였다. 성체 마우스와 비교하여 1-3일령의 마우스의 간 및 비장으로부터 단리된 면역 세포 서브-집단에서 FcγR의 발현에 있어서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 1-3일령의 새끼로부터 단리된 면역 세포의 ADCK 이펙터 기능은 7일차 또는 성체 세포와 비교하여 상당히 감소하였다. 이러한 연구를 위해, 상이한 연령의 마우스로부터 단리된 면역 세포의 풀링된 단일 세포 현탁액 (이펙터 세포)을, ΔgD-2 또는 VD60 면역화된 성체 마우스로부터 수확된 혈청의 존재하에 HSV-2(ZAG) (GFP를 발현)-감염된 HaCAT 표적 세포와 함께 인큐베이션하였고, 상기 이펙터 세포가 표적 세포를 사멸하는 능력을 정량분석하였다. (데이터는 개시되지 않음).
치사량 이하 용량의 HSV-2로 감염된 마우스로부터의 회복기 혈청 (convalescent serum)은 후속하는 바이러스 챌린지로부터 새끼를 보호하지 못하였다. 성체 암컷 마우스 (C567BL/6)를 HSV-2 (4674)의 105 pfu 용량 또는 PBS (대조군)로 비강내로 감염시켰다. 감염 2주 후에, 상기 마우스로부터 혈청을 수집하여, HSV-2 특이적 항체에 대해 테스트하였다. 치사량 이하로의 감염 (sublethal infection)으로 ΔgD-2 백신화된 마우스 (도 22C)와 비교하여 FcγRIV 활성화가 거의 없이 주로 중화되는 (도 22B) IgG 반응 (도 22A, ELISA 역가)을 유도하였다. 이후에 혈청양성 또는 대조군 마우스를 교미하고, 생성된 새끼를 7일차에 HSV-2로 비강내로 챌린지하였다. 유의미한 보호는 관찰되지 않았다 (도 22D).
토의
전 세계적으로, HSV는 100,000명의 출생 당 10명을 감염시키는 것으로 추정되며, 여기서 대부분의 사례는 모성 HSV-2의 높은 발생률을 반영하는 아프리카에서 발생한다. 그러나, HSV-1 및 HSV-2 혈청음성인 여성의 증가하는 수가 가임 연령에 도달하여 이들이 두 혈청형 중 하나에 의한 원발성 생식기 감염에 걸릴 위험이 더 커지는 경우 최고 전체 유병률은 미국에서 나타날 수 있다. 빈번한 재발 및/또는 분만 (labor) 시에 활성 병변이 검출되는 경우 제왕절개의 이력을 가진 여성에 대해 억제성 아시클로비어 치료로 HSV의 위험을 감소시킬 수 있지만, 대부분의 주산기 전파는 원발성 모체 HSV 환경 및 임상 병변의 부재시에 발생한다. 따라서, 최적의 예방을 위해서는 HSV-1 및 HSV-2 모두의 임상적 단리물에 대해 효과적이며 태반을 효율적으로 통과하는 IgG 반응을 생성하는 백신을 필요로 할 것이다.
현재 뮤린 연구의 결과로부터, ΔgD-2로 암컷 성체 마우스 (수태 전)의 면역화는 HSV-1 또는 HSV-2의 임상적 단리물을 사용한 비강내 바이러스 챌린지로부터 신생아 마우스 (생애의 7-14일)를 보호하는 Ab 반응을 유발한다는 것을 입증하였다. 보호는 뮤린 FcγRIV를 활성화하는 Ab의 ADCK를 유발하는 능력과 관계가 있다. 신생아 마우스의 혈청 중에 총 HSV-특이적 Ab를 유사한 수준으로 생성하였음에도 불구하고, 보강된 재조합 gD-2 단백질을 사용한 모성 면역화는 7일차에 제한된 보호만을 제공하였지만, 모유로부터 획득된 HSV-특이적 항체의 증가와 병행하여 14일차에 상당한 보호가 관찰되었다. 이러한 발견은 자연 감염에 대한 지배적인 반응인 중화 Ab가 신생아 질병에 대해 부분적인 보호를 제공한다는 임상적 관찰에 의해 뒷받침된다.
일부 보호 (통계적으로 유의미하지 않음)는 신생아 출생 시에 명백하였다 (도 15C 참조). 그러나, ΔgD-2 면역화된 어미로부터 태어난 새끼가 출생 시에 전환되고 대조군 백신화된 마우스에 의해 양육되는 경우에 보호가 상실되는 것으로 입증된 바와 같이, 태반경유 및 모유-획득된 Ab를 모두 받은 신생아 마우스의 경우에 보호가 최적이었다. 이는 IgG1, IgG2a/c 및 IgG3의 경우 ~ 6-8일, 및 IgG2b의 경우 4-6일인, 뮤린 IgG의 상대적으로 짧은 반감기뿐만 아니라 마우스의 근위 소장 (proximal small intestine)의 솔 가장자리 (brush border)에서 더 높은 수준의 Fc 신생아 수용체 발현을 반영한다. 대조적으로, 인간 IgG의 반감기는 훨씬 더 길고, 영아 (infant), 예컨대 태아는 융합세포영양막 (syncytiotrophoblasts)에서 신생아 FcR의 상대적으로 높은 수준의 발현으로 인해 대부분의 모체 IgG를 태반경유로 받는다. 따라서, 마우스의 태아 보호 (태반경유)는 태아 및 신생아 인간에서 상기 기술에 의해 수득 가능한 보호보다 적게 나타난다 (under-represent).
모성 면역화 전략을 통해 주산기 감염을 예방할 수 있으며 항체의 수동 전달로 나이브한 동물을 보호한다는 것이 명확하다.
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SEQUENCE LISTING <110> Albert Einstein College of Medicine <120> PASSIVE TRANSFER OF IMMUNITY USING RECOMBINANT HERPES SIMPLEX VIRUS 2 (HSV-2) VACCINE VECTORS <130> XVS0003PCTP2 <150> US 16/238,933 <151> 2019-01-03 <150> US 15/995,471 <151> 2018-06-01 <150> US 15/015,322 <151> 2018-06-19 <150> PCT/US2015/18272 <151> 2015-03-02 <150> US 62/080,663 <151> 2014-11-17 <150> US 61/946,965 <151> 2014-03-03 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Herpes Simplex Virus-2 <400> 1 Met Gly Arg Leu Thr Ser Gly Val Gly Thr Ala Ala Leu Leu Val Val 1 5 10 15 Ala Val Gly Leu Arg Val Val Cys Ala Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Pro 20 25 30 Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro 35 40 45 Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Lys Arg Val Tyr His 50 55 60 Ile Gln Pro Ser Leu Glu Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Ile Pro Ile 65 70 75 80 Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu 85 90 95 His Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Asp Glu 100 105 110 Ala Arg Lys His Thr Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Tyr Arg Met Gly 115 120 125 Asp Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Pro 130 135 140 Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Val Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp 145 150 155 160 Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe 165 170 175 Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu 180 185 190 Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His 195 200 205 Arg Ala Arg Ala Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro 210 215 220 Ala Ala Cys Leu Thr Ser Lys Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp 225 230 235 240 Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val 245 250 255 Ala Leu Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Pro Pro 260 265 270 Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Asp Thr Thr Asn Ala 275 280 285 Thr Gln Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu 290 295 300 Glu Asp Pro Ala Gly Thr Val Ser Ser Gln Ile Pro Pro Asn Trp His 305 310 315 320 Ile Pro Ser Ile Gln Asp Val Ala Pro His His Ala Pro Ala Ala Pro 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Leu Ile Ile Gly Ala Leu Ala Gly Ser Thr Leu Ala 340 345 350 Val Leu Val Ile Gly Gly Ile Ala Phe Trp Val Arg Arg Arg Ala Gln 355 360 365 Met Ala Pro Lys Arg Leu Arg Leu Pro His Ile Arg Asp Asp Asp Ala 370 375 380 Pro Pro Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 385 390 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Herpes Simplex Virus-1 <400> 2 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala 20 25 30 Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro 35 40 45 Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His 50 55 60 Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile 65 70 75 80 Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu 85 90 95 Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp 100 105 110 Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly 115 120 125 Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser 130 135 140 Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp 145 150 155 160 Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe 165 170 175 Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu 180 185 190 Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His 195 200 205 Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro 210 215 220 Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp 225 230 235 240 Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val 245 250 255 Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro 260 265 270 Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala 275 280 285 Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu 290 295 300 Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His 305 310 315 320 Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr 325 330 335 Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu 340 345 350 Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr 355 360 365 Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp 370 375 380 Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 385 390 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ggccaggcgc ttgttggtgt a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 atcaccgacc cggagaggga 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe <400> 5 ccgccgaact gagcagacac ccgc 24

Claims (25)

  1. 제1 대상체에서 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는 방법으로서, 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2로 면역화된 임신한 여성으로부터의 산물을 제1 대상체에서 HSV-2 및/또는 HSV-1 감염에 대해 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로, 상기 제1 대상체에게 수동 전달 (passive transfer)을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (herpes simplex virus-1: HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포 (complementing cell)에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 (phenotypically) 보완된 것이며, 상기 산물은 이에 의해 유도된 항체를 포함하고, 상기 제1 대상체는 태아 (fetus) 또는 신생아 (neonate)인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 산물은 임신한 여성의 혈청을 포함하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 산물은 임신한 여성의 모유를 포함하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 대상체는 태아인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 대상체는 신생아인 방법.
  6. .
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 제1 대상체는 제2 대상체로부터 태어나는 것인 방법.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 임신한 여성은 태아를 임신하고 있는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 대상체 및 상기 임신한 여성은 인간인 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산물은 결실이 있는 HSV-2로 임신한 여성을 면역화하여 유발된 항체를 포함하는 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제1 대상체에서 HSV-2에 대한 면역 반응을 유발하는 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제1 대상체에서 HSV-1에 대한 면역 반응을 유발하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산물은 면역 보강제 (immunological adjuvant)를 추가로 포함하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 산물은 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를 추가로 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것인 방법.
  15. 신생아에서 주산기 (perinatal) HSV-1 및/또는 HSV-2 감염을 억제하는 방법으로서, 신생아가 될 태아를 임신한 여성에게, 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를, 신생아에서 주산기 HSV-1 및/또는 HSV-2 감염을 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것인 방법.
  16. 모체로부터 그녀의 신생아에게 HSV-1 및/또는 HSV-2 바이러스의 전파 (dissemination)를 억제하는 방법으로서, 상기 모체에게 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를, 모체로부터 그녀의 신생아에게 HSV-1 및/또는 HSV-2 바이러스의 전파를 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 결실된 HSV-2는 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D를 발현하는 보완 세포에서 상기 HSV-2를 증식시킴으로써 상기 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) 당단백질 D가 표현형으로 보완된 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 모체는 신생아가 될 태아를 임신하고 있는 것인 방법.
  18. 청구항 15 또는 16에 있어서, 상기 HSV-1 감염 또는 HSV-1 바이러스 전파가 억제되는 방법.
  19. 청구항 15 또는 16에 있어서, 상기 HSV-2 감염 또는 HSV-2 바이러스 전파가 억제되는 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 면역 반응이 HSV-1에 대해 유발되는 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 면역 반응이 HSV-2에 대해 유발되는 방법.
  22. 청구항 1, 15 또는 16에 있어서, 상기 보완 세포는 VD60 세포인 방법.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임신한 여성, 모체 또는 제2 대상체는 HSV-1에 대해 혈청 음성 (seronegative), HSV-2에 대해 혈청 음성, 또는 HSV-1 및 HSV-2 모두에 대해 혈청 음성인 방법.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임신한 여성 또는 모체에게 상기 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2를 피하로 투여하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 임신한 여성 또는 모체에게 상기 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 결실된 HSV-2의 초기 피하 투여 (initial subcutaneous administration) 후에, 상기 전장 HSV-2 당단백질 D-코딩 유전자가 게놈에서 결실된 HSV-2의 피하 부스트 용량 (subcutaneous boost dose)을 투여하는 방법.
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