MX2013004149A - Antigeno gb de citomegalovirus. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un polipéptido gB de citomegalovirus (CMV) que comprende al menos una porción de un dominio extracelular de proteína gB que comprende un dominio de bucle de fusión 1 (FL1) y un dominio de bucle de fusión 2 (FL2), en donde al menos uno de los dominios FL1 y FL2 comprende al menos una eliminación o substitución de aminoácido.

Description

ANTIGENO GB DE CITOMEGALOVIRUS CAMPO TECNICO La presente invención se refiere al campo de la inmunología.

En particular, la invención proporciona composiciones, tales como, por ejemplo, vacunas, así como métodos para producir una respuesta inmune específica para Citomegalovirus (CMV).

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El citomegalovirus humano (HCMV) es un virus de ADN ubicuo que pertenece a la familia del virus de Herpes. El HCMV está hecho de un núcleo de ADN, y otra cápsida y está cubierto por une membrana de lípido la cual incorpora glicoproteínas específicas de virus.

El HCMV es endémico en la mayor parte del mundo. Sin embargo, la infección primaria normalmente da como resultado una enfermedad subclínica después de la cual el virus se vuelve latente reteniendo la capacidad de reactivarse en cualquier momento posterior. Entre dos poblaciones, el HCMV, sin embargo, es responsable de serias condiciones médicas. El HCMV es la mayor causa de defectos congénitos en recién nacidos infectados en el útero. Es la causa más común de infección congénita en el mundo desarrollado. La infección congénita se refiere a la infección transmitida de la madre al feto antes del nacimiento del recién nacido. Entre los recién nacidos congénitamente infectados, un 5-10% tienen síntomas clínicos mayores al nacer, tales como microcefalia, calcificaciones intracraneal, y hepatitis. Muchos bebés con infección por HCMV congénita son asintomáticos al nacer. Sin embargo, más estudios han mostrado que el 15% de dichos bebés tendrán secuelas tales como pérdida del oído o anormalidades del sistema nervioso central ocasionando, en particular, un deficiente desempeño intelectual.

La segunda población en riesgo son los pacientes inmunocomprometidos, tales como aquellos que padecen infección por VIH y aquellos que experimentan trasplantes. En esta situación, el virus se vuelve un patógeno oportunista y ocasiona una enfermedad severa con alta morbidez y mortalidad. La enfermedad clínica ocasiona una variedad de síntomas incluyendo fiebre, hepatitis, neumonitis y mononucleosis infecciosa.

Para dirigir enfermedades asociadas con HCMV, se desarrollaron vacunas candidato que incluyen vacunas vivas atenuadas y vacunas de subunidad. En particular, recientemente una vacuna de subunidad que comprende una glicoproteína B modificada (gB) eliminada de su dominio de transmembrana combinada con la emulsión MF59™ se probó en un ensayo clínico de fase II (WO 2009/037359, N . Engl. J. Med. 2009; 360: 1 191 -9).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido gB de citomegalovirus (CMV) que comprende al menos una porción de un dominio extracelular de proteína gB que comprende un dominio de bucle de fusión 1 (FL1) y un dominio de bucle de fusión 2 (FL2), en donde al menos uno de los dominios FL1 y FL2 comprende al menos una eliminación o substitución de aminoácido.

En un segundo aspecto, se proporciona un polipéptido gB de CMV que comprende una eliminación de al menos 40%,, al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% de los aminoácidos de la secuencia líder, o de toda la secuencia líder.

En un tercer aspecto, se proporciona un polipéptido gB de CMV que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias establecidas en: SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, SEC ID NO:18, SEC ID NO:19, SEC ID NO:20 y SEC ID NO:21.

En un cuarto aspecto se proporciona una preparación que comprende una población de polipéptidos gB de CMV, en donde al menos 50%, al menos 60%, o al menos 70% de la población está en una forma trimérica.

En un quinto aspecto, se proporciona una composición inmunogénica que comprende los polipéptidos gB de CMV de la invención mezclados con un vehículo farmacéutico adecuado.

En un aspecto adicional, se proporciona un polinucleótido que codifica los polipéptidos gB de CMV de la invención.

En otro aspecto más, se proporciona un polinucleótido que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias establecidas en: SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:11 , SEC ID NO:13, SEC ID NO:15, y SEC ID NO:17.

En otro aspecto adicional, se proporciona un vector recombinante que comprende los polinucleótidos de la invención.

En otro aspecto más, se proporciona una célula huésped transformada con el vector recombinante de la invención.

En un aspecto más, se proporciona el uso de los polipéptidos gB de C V de la invención en la preparación de un medicamento para evitar y/o tratar una infección por CMV.

En otro aspecto, se proporcionan los polipéptidos gB de CMV de la invención para usarse en la prevención y/o tratamiento de la infección de CMV.

En otro aspecto más, se proporciona un método para producir una respuesta inmune contra CMV que comprende el paso de administrar a un sujeto una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende los polipéptidos gB de CMV de la invención.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática del polipeptido gB de CMV derivado de la cepa AD169 que carece del dominio de transmembrana (gB-DeltaTM), así como tres polipéptidps gB de CMV ilustrativos descritos así: (i) CMV gB eliminado del dominio de transmembrana, en donde ambos bucles de fusión FL1 y FL2 están mutados (gb-SLP12) (ver, SEC ID NO:3), (¡i) CMV gB eliminado del dominio de transmembrana, en donde la mutación de manos bucles de fusión, FL1, y FL2, se conmina con la eliminación de una región (Del2) en el dominio citoplásmico C-terminal que comprende un dominio rico en prolina, un patrón hidrofóbico conservado y una región altamente hidrofílica, negativamente cargada (gB-SLP12-Del2) (ver, SEC ID NO:4, y (iii) CMV gB eliminado del dominio de transmembrana, en donde la mutación del bucle de fusión FL1 se combinó con la eliminación de la región antes descrita (Del2) en el dominio citoplásmico C-terminal del polipéptido (gB-SLP1 -Del2) (ver, SEC ID NO:5). gB-SLP12, g B-SLP 12-Del2 y gB-SLP1-Del2 todos comprenden dos mutaciones de punto adicionales substituyendo arginina (R) con serina (S) en la posición 50 y 357. gB-SLP12-Del2 y gB-SLP1 -Del2 ambos comprenden la mutación de punto adicional substituyendo una cisterna (C) por una alanina (A) en la posición 778. TM es para el dominio de transmembrana. FL1 es para Bucle de Fusión 1. FL2 es para Bucle de Fusión 2. La eliminación Del2 empieza con el aminoácido 825 y termina con el aminoácido 877, es decir, estos dos. aminoácidos son el primero y el último, respectivamente, de la región que es eliminada. Los números indicados se refieren a la posición de aminoácidos de la secuencia de CMV gB que se originan de la cepa AD169 y se establecen en SEC ID NO: 1.

La Figura 2 es una representación esquemática de polipéptidos gB de CMV ilustrativos aquí descritos. Todos los polipéptidos comprenden los bucles de fusión mutados FL1 y FL2. Además, gB-SLP12-Delta113 es eliminado del dominio de transmembrana y la parte C-terminal del dominio citoplásmico, es decir, los aminoácidos 794 a 906. Además, gB-SLP12-Delta725 es eliminado de todo el dominio citoplásmico y retiene parte del dominio de transmembrana. LVL759 (o gB-SLP12-Delta725-LVL759), LVL776 (o gB-SLP12-Delta725-LVL776) y CD33 (o gB-SLP12-Delta725-CD33) tienen una estructura de base idéntica a gB-SLP12-Delta725, excepto para el extremo N-terminal, en donde la secuencia de aminoácido varia, como se indica. Los números indicados se refieren a la posición de aminoácidos de la secuencia de CMV gB que se origina de la cepa AD169 y se establece en SEC ID NO: 1.

La Figura 3 muestra el mapa del plásmido pMax que corresponde a la construcción gB-SLP12.

La Figura 4 muestra el mapa del plásmido pTT5 que corresponde a la construcción gB-SLP12-Delta725.

La Figura 5 muestra el nivel de expresión y de secreción délos tres diferentes polipéptidos gB ilustrativos expresados recombinantemente en células CHO, según comparado con el nivel de expresión y secreción del polipéptido gB de CMV eliminado del dominio de transmembrana de la técnica anterior. Se muestra un análisis de Tinción Western utilizando un anticuerpo anti-gB indicando el nivel de la proteína gB (ubicada en la tinción entre 150 kDa y 100 kDa) presente tanto en fracciones celulares (representando la forma no secretada de gB) como en sobrenadantes de cultivo (representando la forma secretada de gB) de distintos cultivos transfectados con las construcciones idénticas de gB. Carril MW: escalera de Peso Molecular, Carril A: fracción celular (C-Fr) de un cultivo transfectado con g B-DeltaTM , Carril B: C-Fr de un cultivo transfectado con gB-SLP12, Carril C: C-Fr de un cultivó transfectado con gB-SLP1 -Del2, Carril D: C-Fr de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Del2, Carril E: sobrenadante de cultivo (C-Sn) de un cultivo transfectado con g B-DeltaTM, Carril F: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12, Carril G: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP1 -Del2, Carril H: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Del2.

La Figura 6 muestra el nivel de expresión y de secreción de tres diferentes polipéptidos gB ilustrativos de acuerdo con la presente invención, gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113, y gB-SLP12-Delta725, los cuales fueron recombinantemente expresados en células CHO, según comparado con el nivel de expresión y secreción del polipéptido gB de CMV de la técnica anterior eliminado del dominio de transmembrana. Se muestra un ensayo de Elisa cuantitativo utilizando un anticuerpo anti-gB presentando el nivel de proteína gB presente tanto en fracciones celulares (barras negras representando la forma no secretada de gB) como en sobrenadantes de cultivo (barras grises representando la forma secretada de gB).

La Figura 7 muestra el nivel de expresión y de secreción de polipéptidos gB ilustrativos adicionales de acuerdo con la presente invención, los cuales fueron recombinantemente expresados en células CHO. Se muestran tres análisis de tinción Western utilizando un anticuerpo anti-gB presentando el nivel de proteína gB (ubicada en la tinción entre 150 kDa y 100 kDa) presente tanto en fracciones celulares (C-Fr representando la forma no secretada de gB) como en sobrenadantes de cultivo (C-Sn, representando la forma secretada de gB) surgiendo de distintos cultivos transfectados con las construcciones de gB indicadas. La Figura 7A - Carriles A, B, E, F, I, J, M y N representan la cantidad de proteína presente en las 2600 células totales. Carriles C, D, G, H, K, L, O y P representan la cantidad de proteína presente en las 520 células totales. Carril MW: escalera de Peso Molecular, Carriles A y C: C-Fr de un cultivo transfectado con g B-DeltaTM , Carriles B y D: C-Sp de un cultivo transfectado con gB-DeltaTM, Carriles E y G: C-Fr de un cultivo transfectado con gB-SLP12, Carriles F y H: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12, Carriles I y K: C-Fr de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725, Carriles J y L: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725, Carriles M y O: C-Fr de un cultivo transfectado con gB-Delta725 (teniendo Bucles de Fusión intactos), Carriles N y P: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-Delta725 (teniendo Bucles de Fusión intactos). La Figura 7B, Carriles 1, 2, 5, 6, 1', 2\ 5' y 6' representan la cantidad de proteina presente en las 2600 células totales. Carriles 3, 4, 7, 8, 3', 4', 7' y 8' representan la cantidad de proteína presente en las 520 células totales. Carril MW: escalera de Peso Molecular, Carriles 1 y 3: C-Fr de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725, Carriles 2 y 4: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725, Carriles 5 y 7: C-Fr de un cultivo transfectado con gB- Delta725 (teniendo Bucles de Fusión intactos), Carriles 6 y 8: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-Delta725 (teniendo Bucles de Fusión intactos), Carriles 1' y 3': C-Fr de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta113, Carriles 2' y 4': C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta113, Carriles 5' y 7': C-Fr de un cultivo transfectado con gB-Delta113 (teniendo Bucles de Fusión intactos), Carriles 6' y 8': C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta113 (teniendo Bucles de Fusión intactos).

La Figura 8 muestra el nivel de expresión y secreción de polipéptidos gB ilustrativos adicionales de acuerdo con la presente invención, los cuales fueron recombinantemente expresados en células CHO. La Figura 8A muestra un análisis de tinción Western utilizando un anticuerpo anti-gB presentando el nivel de proteína gB (ubicada en la tinción entre 150 kDa y 100 kDa) presente tanto en fracciones celulares (C-Fr, representando la forma no secretada de gB) como sobrenadantes de cultivo (C-Sn, representando la forma secretada de gB) surgiendo de distintos cultivos transfectados con las construcciones de gB indicadas. Los carriles a, b, c, d, i, j, k y I representan la cantidad de proteína presente en 11700 células totales, mientras que los carriles e, f, g, h, m, n, o y p representan la cantidad de proteína presente en 5100 células totales. Carril MW: escalera de Peso Molecular, Carriles a y e: C-Sn de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725, Carriles i y m: C-Fr de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725, Carriles b y f: C-Sn de un cultivo transfectado con CD33, Carriles j y n: C-Fr de un cultivo transfectado con CD33, Carriles c y g: C-Sn de un cultivo transfectado con LVL759, Carriles k y o: C-Fr de un cultivo transfectado con LVL759, Carriles d y h: C-Sn de un cultivo transfectado con LVL776, Carriles I y p: C-Fr de un cultivo transfectado con LVL776. La Figura 8B muestra un análisis de Elisa cuantitativo utilizando un anticuerpo anti-gB presentando el nivel de proteína gB presente tanto en fracciones celulares (barras negras -representando la forma no secretada de gB) como en sobrenadantes de cultivo (barras grises - representando la forma secretada de gB).

La Figura 9 muestra el perfil de producto de los polipéptidos gB-DeltaTM, gB-SLP12 y gB-SLP1 -Del2, como se analizó a través de entrelazamiento inducido por glutaraldehído, después de su expresión recombinante en células CHO. Se muestra una imagen de un gel de poliacrilamida. Las flechas indican multímeros de diferentes tamaños. Se han utilizada dosis en incremento (0, 0.5, 1%) de glutaraldehído. Carril MW: escalera de Peso Molecular, Carril A: gB-DeltaTM - 0% glutaraldehído, Carril B: gB-DeltaTM -0.5% glutaraldehído, Carril C: gB-DeltaTM - 1% glutaraldehído, Carril D: gB-SLP12 - 0% glutaraldehído, Carril E: gB-SLP12 - 0.5% glutaraldehído, Carril F: gB-SLP12 - 1% glutaraldehído, Carril G: gB-SLP1-Del2 - 0% glutaraldehído, Carril H: gB-SLP1-Del2 - 0.5% glutaraldehído, y Carril I: gB-SLP1-Del2 - 1% glutaraldehído.

La Figura 10 muestra el perfil de producto de los polipéptidos gB-DeltaTM, gB-SLP12 y gB-SLP1 -Del2, según analizado a través de ultracentrifugación analítica (AUC), después de su expresión recombinante en células CHO. Los picos representan multímeros de tamaño variable, como se indica. El porcentaje de los multímeros identificados dentro de cada población de polipéptido también se especifica, como se indica.

La Figura 11 muestra el perfil de producto o polipéptidos gB de CMV ilustrativos adicionales, como se indica y como se analiza a través de ultracentrifugación analítica (AUC), después de su expresión recombinante en células CHO. Los picos representan multímeros de tamaño variable, como se indica. El porcentaje de multímeros identificados dentro de cada población de polipéptido también se especifica, como se indica. La Figura 11A presenta el perfil de producto del polipéptido gB-SLP12-Delta113 (indicado como gB-Delta113 en la figura) obtenido en presencia o ausencia de Pluronic. La Figura 11B presenta el perfil de producto del polipéptido gB-SLP12-Delta725 (indicado como gB-Delta725 en la figura) obtenido en presencia o ausencia de Pluronic.

La Figura 12 muestra un análisis de péptido a través de MS/MS trazando el extremo N-terminal de los polipéptidos indicados generados después de su expresión recombinante y secreción en células CHO y después la secuencia de señal se dividió. La Figura 12A indica la abundancia relativa de diferentes polipéptidos que tienen un aminoácido N-terminal diferente dentro de la población de g B-SLP 12-Delta725 recombinantemente expresada después de la secuencia de señal se dividió. La Figura 12B indica la abundancia relativa de los diferentes polipéptidos que tienen un aminoácido N-terminal diferente presente dentro de la población de gB-SLP12-Delta725-LVL759 recombinantemente expresado después de que la secuencia de señal se dividió. La Figura 12C indica la abundancia relativa de los diferentes polipéptidos que tienen un aminoácido N-terminal diferente presente dentro de la población de gB-SLP12-Delta725-LVL776 recombinantemente expresado después de que la secuencia de señal se dividió. La Figura 12D indica la abundancia relativa de los diferentes polipéptidos que tienen un aminoácido N-terminal diferente presente dentro de la población de gB-SLP12-Delta725-CD33 recombinantemente expresado después de que la secuencia de señal se dividió.

La Figura 13 muestra el perfil de producto de los polipéptidos gB-DeltaTM, gB-S50-DeltaTM y gB-SLP12, después de la expresión recombinante en células CHO, según analizado mediante Cromatografía de Exclusión de Tamaño basado en UV (SEC-UV). Los picos representan multímeros del tamaño indicado.

La Figura 14 muestra un análisis de tinción Western utilizando un anticuerpo anti-gB o un anticuerpo anti-His presentando el nivel de proteína gB después de que los polipéptidos indicados fueron recombinantemente expresados, secretados, purificados y desglicosilados. La Figura 14A corresponde a gB-DeltaT y muestra una tinción Western en sonda con un anticuerpo anti-gB. La Figura 14B corresponde a gB-SLP12 y muestra una tinción Western en sonda con un anticuerpo anti-His (carril 2) y con un anticuerpo anti-gB (carril 3). La Figura 14C corresponde a gB-SLP12-Delta 113 y muestra una tinción Western en sonda con un anticuerpo anti-His (carril A) y con un anticuerpo anti-gB (carril B). La Figura 14D corresponde a gB-SLP12-Delta725 y muestra una tinción Western en sonda con un anticuerpo anti-His (carril C) y con un anticuerpo anti-gB (carril D).

La Figura 15 presenta datos de inmunogenicidad. La Figura 15A muestra titulaciones de neutralización inducidas después de la administración de los polipéptidos indicados formulados para inyección. La Figura 15B muestra titulaciones de anticuerpo anti-gB de ELISA inducidas después de la administración de los polipéptidos indicados formulados para inyección.

La Figura 16 muestra las secuencias SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 21, como se describe más adelante.

DESCRIPCION DE LISTA DE SECUENCIA SEC ID NO:1 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB de longitud completa de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:2 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-DeltaTM de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:3 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:4 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Del2 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:5 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP1-Del2 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:6 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP12 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:7 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP1 -Del2 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:8 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP12-Del2 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:9 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP12-Delta725 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:10 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Delta725 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:11 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP12-Delta113 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:12 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12- Delta 113 de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO: 13 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP12-Delta725-LVL759 (o LVL759) de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO: 14 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Delta725-LVL759 (LVL759) de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO: 15 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP12-Delta725-LVL776 (o LVL776) de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO: 16 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Delta725-LVL776 (o LVL776) de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO:17 - Secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido gB-SLP12-Delta725-CD33 (o CD33) de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO: 18 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Delta725-CD33 (o CD33) de la cepa CMV AD169.

SEC ID NO: 19 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Delta725-LVL759 (o LVL759) de la cepa CMV AD169 en su forma madura.

SEC ID NO:20 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Delta725-LVL776 (o LVL776) de la cepa CMV AD169 en su forma madura.

SEC ID NO:21 - secuencia de aminoácido de polipéptido gB-SLP12-Delta725-CD33 (o CD33) de la cepa CMV AD169 en su forma madura.

DESCRIPCION DETALLADA La presente invención se refiere a un polipéptido gB de CMV novedoso, el cual presenta excelentes características de inmunogenicidad y procedimiento superior. El polipéptido gB de la invención es particularmente adecuado como un antígeno para incluirse en una composición inmunogénica, tal como vacunas. En particular, el polipéptido gB de la invención presenta un perfil de producto homogéneo mejorado. En realidad, los inventores observaron que después de la expresión, los polipéptidos gB de la técnica anterior, tal como un polipéptido gB que carece del dominio de transmembrana (gB-DeltaTM), se ensambló en multímeros de diferentes tamaños, incluyendo multímeros de alto peso molecular, haciendo a la población heterogénea. También se observó que el perfil de multímero no fue consistente, ya que la proporción de multímeros de un tamaño dado varió de un experimento a otro. Este tipo de variabilidad e inconsistencia no es aceptable en términos de formulaciones de vacuna. Por lo tanto, permanece una necesidad para un polipéptido gB de CMV, el cual presente un producto de perfil homogéneo y consistente mejorado. También, la agregación en multímeros de alto peso molecular puede tener un impacto negativo en el procedimiento subsecuente de purificación del polipéptido recombinante, ya que la agregación puede conducir, en particular, a una forma menos soluble del polipéptido. Por lo tanto, existe la necesidad de un polipéptido gB de CMV que presente características de procedimiento mejorado.

Un polipéptido gB de CMV que carece del dominio de transmembrana se describe en EP 0 802 979.

Sorprendentemente, los inventores de la presente observaron que la introducción de mutaciones en regiones específicas de dicho polipéptido gB de CMV que carece del dominio de transmembrana da como resultado un producto de perfil mejorado, de manera que la población no solo es más homogénea que el polipéptido no mutado correspondiente, sino que también exhibe un perfil que es consistente de un experimento a otro. En particular, se reducen los multímeros de alto pero molecular y la proporción de trímeros se incrementa por un factor de dos veces. Típicamente, los trímeros representan al menos 50%. Convenientemente al menos 60%, y más convenientemente al menos 70% de la población de polipéptidos gB de CMV de la presente invención. Estas mutaciones no impactan el nivel de expresión, ni el nivel de secreción de los mutantes resultantes, según comparado con el polipéptido gB de CMV que carece del dominio de transmembrana. Estas mutaciones están ubicadas fuera de los epítopos antigénicos de CMV gB conocidos por ser responsables de inducir una respuesta inmune. El desplazamiento observado de una población en donde los polipéptidos se ensamblaron en multímeros de alto peso molecular, tal como el polipéptido de la técnica anterior que carece del dominio de transmembrana, a un población en donde los polipéptidos tienen un perfil de trimerización mejorado y está asociado con una purificación más fácil y mejor de los polipéptidos. En particular, los inventores observaron . que el rendimiento de purificación de los polipéptidos de acuerdo con la invención es significativamente mayor que el desempeño de purificación obtenido con el polipéptido gB de CMV de la técnica anterior que carece del dominio de transmembrana. La 'mejora de rendimiento es al menos 2 veces, y posiblemente al menos 3 a 5 veces. Además, se muestra que más mutaciones en los polipéptidos novedosos de acuerdo con la invención dan como resultado polipéptidos que son más eficientemente expresados y secretados que los polipéptidos de la técnica anterior. Dicha propiedad presenta una ventaja importante en términos de producción de antígeno para la fabricación de vacuna, un campo en donde la producción de antígeno es típicamente un factor limitante.

Los inventores también observaron que los polipéptidos gB de la técnica anterior, tal como un polipéptido gB de CMV que carece del dominio de transmembrana, presentaron heterogeneidad en los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido. En realidad observaron que ocurrió un recorte en el dominio citoplásmico C-terminal de gB dando como resultado al menos dos diferentes formas del polipéptido teniendo un diferente tamaño después de la expresión recombinante en células y secreción. Con el propósito de incluir una composición inmunogénica, tal como en una vacuna, se prefiere tener una población homogénea de polipéptidos gB en el sentido que se hizo de una forma principalmente individual. Los inventores encontraron que cuando se elimina al menos parte del dominio citoplásmico C-terminal, el recorte ya no ocurrió más y la población resultante de los polipéptidos principalmente se hizo de una forma individual de gB.

Similarmente, se observó que los polipéptidos gB de la técnica anterior, tal como un polipéptido gB de CMV que carece del dominio de transmembrana, presentaron heterogeneidad en la parte N-terminal del polipéptido. En realidad, los inventores observaron que la secuencia de señal, después de expresión recombinante y secreción de los polipéptidos, se dividió a través de una peptidasa de señal en diferentes posiciones de aminoácido, generando así una población de polipéptidos gB mutantes teniendo un extremo variable en el término N, es decir, una población hecha de polipéptidos gB teniendo un aminoácido diferente en el término N. Este fenómeno también se denomina como "bamboleo" de peptidasa de señal. Para propósitos de eficacia, y en particular para consistencia, es importante, en el campo de vacuna, que un antígeno sea incluido en una vacuna que es lo más homogénea posible y lo más no degradada posible, de manera que son reproducibles y consistentes.

Se debe entender en el sentido de la presente invención que un perfil de producto homogéneo mejorado significa que la población de polipéptidos gB de CMV de la invención, después de su expresión recombinante, está hecha de al menos 50% de trímeros, por ejemplo, según medido a través de ultra-centrifugación analítica (Ver Ejemplo 2, sección 1.2). Típicamente, una preparación que comprende una población de polipéptidos gB de CMV de la invención está hecha de al menos 50%, convenientemente al menos 60%, y muy convenientemente al menos 70% de trímeros. Dicho perfil de al menos 50% de trímeros también será denominado como un "perfil de trimerización mejorado'' o un "perfil rico en trímero" en la presente especificación. Estos términos deben ser considerados como sinónimos e intercambiables.

Cuando se hace referencia a "homogeneidad/heterogeneidad" en la parte C-terminal de los polipéptidos, una población heterogénea significa que la población está hecha de al menos dos polipéptidos que tienen diferentes tamaños, mientras que una población homogénea se entiende que es una población hecha principalmente de un polipéptido individual de un tamaño dado.

Cuando se hace referencia a ""homogeneidad/heterogeneidad" en la parte N-terminal de los polipéptidos, una población heterogénea significa que la población está hecha de diferentes polipéptidos maduros empezando cada uno con un aminoácido diferente en el término N. De lo contrario, de acuerdo con la invención, se debe entender que una población homogénea es una población hecha principalmente de un polipéptido maduro individual, dicho polipéptido empezando invariablemente con un aminoácido dado idéntico en el extremo N-terminal. En la presente invención, un polipéptido "maduro" se refiere a un polipéptido, en donde la secuencia de señal ha sido dividida. Típicamente, en una población homogénea N-terminal en el sentido de la presente invención, mas del 30%, convenientemente al menos 80%, muy convenientemente de 80% a 90%, más convenientemente al menos 99% de los polipéptidos maduros producidos después de la escisión de la secuencia de señal empieza con el mismo aminoácido en el extremo N-terminal. Por consiguiente, en una modalidad, se proporciona una preparación que comprende una población madura de polipéptidos gB de CMV producidos después de la escisión de la secuencia de señal, en donde al menos 30%, al menos 80%, de 80% a 90% de los polipéptidos gB maduros comprenden el mismo aminoácido en el extremo N-terminal. En particular, los polipéptidos maduros de la invención convenientemente empiezan con una serina o una histidina en la posición N-terminal. gB es una glicoproteína B envolvente que tiene numerosos papeles, uno de los cuales es la implicación en la fusión del citomegalovirus con células huésped. Se codifica a través del gen UL55 del genoma de HCMV. El tamaño de la forma nativa de gB depende del tamaño del marco de lectura abierto (ORF) que puede variar un poco de acuerdo con la cepa. Por ejemplo, el ORF de la cepa AD169, el cual tiene una longitud de 2717 bp, codifica un gB de longitud completa de 906 aminoácidos, mientras que el ORF de la cepa Towne codifica un gB de longitud completa de 907 aminoácidos. Aunque la presente invención es aplicable a proteínas gB que se originan de cualquier cepa de CMV, con el fin de facilitar su entendimiento, cuando se hace referencia a posiciones de aminoácido en la presente especificación, la numeración es dada con relación a la secuencia de aminoácido del polipéptido gB de SEC ID NO: 1 que se origina de la cepa AD169, a menos que se establezca otra cosa. La presente invención, sin embargo, no está limitada a la cepa AD169. Las posiciones comparables de aminoácido en un polipéptido gB de cualquier otra cepa de CMV pueden ser determinadas por aquellos expertos en la técnica al alinear las secuencias de aminoácido utilizando algoritmos de alineación fácilmente aplicables y bien conocidos (tales como, BLAST). Por consiguiente, cuando se hace referencia "otros polipéptidos gB de CMV", esto se debe entender como polipéptidos gB de CMV de cualquier cepa diferente de AD169. La forma nativa de AD169 contiene, en la dirección N-terminal a C-terminal de la proteína (ver también Figura 1), (i) una secuencia de señal de aminoácido, o péptido de señal, que se sabe que está involucrada en. el tráfico intracelular de polipéptido incluyendo activación del polipéptido hacia la secreción, seguido por (ii) una región denominada la secuencia líder, (iii) un dominio extracelular conteniendo un sitio de escisión endoproteolítica de un tipo furina entre los aminoácidos 456 y 460 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, (ív) un dominio de transmembrana, y (v) un dominio citoplásmico C-terminal. Además, se han identificado estiramientos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de CMV gB como bucles de fusión putativa basados en alineación de secuencia con proteínas gB que se originan de distintos virus de herpes (Backovic et al. 2007. J. Virol. 81 (17): 9596-600), tales como HSV. Experimentalmente se determinaron bucles de fusión de HSV (Hannah, B.P. et al. 2009. J. Virol. 83(13): 6825-6836). D ichos estiramientos fueron así llamados por estar involucrados en la fusión de los virus con células huésped.

De acuerdo con la literatura anterior, se identificaron dos bucles de fusión putativa a través de la alineación de secuencia en CMV gB, los cuales se denominan FL1 y FL2, en el resto de la especificación. Dichos bucles de fusión están localizados en el dominio extracelular de la proteína corriente arriba al dominio de transmembrana.

Sorprendentemente, los inventores de la presente observaron que la disrupción de los bucles de fusión, FL1 y FL2 de un polipéptido gB de CMV, teniendo un dominio de transmembrana no funcional, al mutar aminoácidos específicos, dio como resultado un producto, el cual, después de expresión, presentó un perfil de trimerización mejorado, según comparado con un polipéptido gB de CMV, teniendo un dominio de transmembrana no funcional, pero teniendo bucles de fusión intactos. Por consiguiente, en algunas modalidades, el polipéptido gB de CMV de la invención comprende la mutación, tal como, por ejemplo, substitución, o eliminación de aminoácido, de al menos uno de los bucles de fusión FL1 o FL2, posiblemente ambos. De forma conveniente, el polipéptido de la invención comprende al menos una substitución, o eliminación de aminoácido, en el bucle de fusión FL1. Convenientemente, el polipéptido de la invención comprende al menos una substitución, o eliminación de aminoácido, en el bucle de fusión FL2. Más convenientemente, el polipéptido gB de CMV de la invención comprende una mutación de ambos bucles de fusión, FL1 y FL2, y dicho polipéptido gB de CMV mutado forma un objeto de la presente invención. Por ejemplo, el polipéptido gB de la invención comprende al menos una substitución, o eliminación de aminoácido, en el bucle de fusión FL1 y al menos una substitución, o eliminación de aminoácido, en el bucle de fusión FL2.

En el sentido de la presente invención, los aminoácidos que abarcan el bucle de fusión FL1 de CMV AD169 gB, es decir la secuencia de aminoácido de FL1, se definen como 155Y.I.Y157 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1. Asimismo, los aminoácidos que abarcan el bucle de fusión FL2, es decir, la secuencia de aminoácido de FL2, dentro del significado de la presente invención, se definen como 240W. L. Y242 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1. Se pueden identificar secuencias de los bucles de fusión, FL1 y FL2, correspondientes dentro de los polipéptidos gB a partir de otras cepas de CMV, por ejemplo, a través de alineación de secuencia. La disrupción de dichos bucles de fusión puede incluir cualquier tipo de mutación con relación a estos tripletes de aminoácido, ya sea a través de eliminación o mutaciones de punto, tales como substituciones de aminoácido, lo que da como resultado un producto, después de expresión recombinante, que tiene un perfil mejorado, rico en trímero, que es el producto que tiene una mayor proporción de polipéptidos en una forma trimérica según comparado on la forma no mutada. Una mutación adecuada no limitante concerniente a FL1 es la eliminación, o substitución, de al menos, convenientemente al menos dos, aminoácidos seleccionados de los aminoácidos 155Y.I.Y157 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV que se originan de diferentes cepas, como un aminoácido polar, en particular, un aminoácido polar no aromático, más particularmente, un aminoácido seleccionado del grupo de aminoácidos positivamente cargados que consisten de lisina (K), histidina (H), y arginina (R). Por consiguiente, en algunas modalidades, el polipéptido gB de CMV de la invención, en particular los polipéptidos que tienen un dominio de transmembrana no funcional, tiene un bucle de fusión mutado FL1, en donde al menos la isoleucina (I156), convenientemente al menos la tirosina (Y155), convenientemente al menos la tirosina (Y157), está substituida con una histidina (H), o se elimina. Alternativamente, el polipéptido gB de CMV de la invención tiene un bucle de fusión mutado FL1, en donde al menos la tirosina (Y157) es substituida con una arginina (R). En una modalidad particular, el polipéptido gB de CMV de la invención, en particular un polipéptido que tiene un dominio de transmembrana no funcional, tiene un bucle de fusión mutado FL1, en donde al menos la isoleucina (I156) y tirosina (Y155) están substituidas con histidina (H'56) y arginina (R157), respectivamente, o eliminadas. En una modalidad más, el polipéptido gB de CMV de la invención que tiene un dominio de transmembrana no funcional tiene un bucle de fusión mutado FL1, en donde al menos la tirosina (Y155) es substituida con un glicina (G), o es eliminada, opcionalmente, en combinación con la substitución, o eliminación, de la isoleucina (I156) con una histidina (H) o con la substitución, o eliminación, de la tirosina (Y157) con un arginina (R), o en combinación tanto con substituciones como eliminaciones. En una modalidad específica, el polipéptido gB de CMV de la invención que tiene un dominio de transmembrana no funcional tiene un bucle de fusión mutado FL1, en donde los tres aminoácidos, 155Y.I.Y157, de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV que se originan de diferentes cepas, están substituidos con aminoácidos 155G.H.R157, o eliminados. La mutación del dominio FL1 puede ser definida en una forma alternativa. Como se describe más adelante, la hidrofobicidad de una secuencia de aminoácido particular, puede ser determinada utilizando una escala de hidrofobicidad, tal como la escala de Kyte y Dolittle (Kyte et al. 1982. J. Mol. Bio. 157: 105-132). El dominio FL1, el cual abarca los aminoácidos 55Y.I.Y157, obtiene una clasificación de +1.9 en esa escala. En una modalidad, en el polipéptido gB de CMV de la invención, el estiramiento de los aminoácidos Y.I.Y localizados en la posición 155-157 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituido con un estiramiento de tres aminoácidos que tienen una escala de hidrofobicidad de menos de -3, en particular menos de -7, más particularmente menos de -8, según medido utilizando la escala de Kyte y Dolittle. Los tres aminoácidos pueden no ser substituidos simultáneamente, siempre que la escala global del estiramiento de aminoácido alcance los valores antes especificados. Por ejemplo, solo uno o dos aminoácidos del estiramiento largo de tres aminoácidos pueden ser substituidos, la clasificación siendo después calculada basándose en la identidad de los aminoácidos substituidos, es decir, uno o dos, más la identidad de los nativos, dos o uno, respectivamente.

Una mutación adecuada no limitante concerniente con el bucle de fusión FL2 es la eliminación, o substitución de al menos uno, convenientemente al menos dos aminoácidos seleccionados de 240W.L.Y242 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV que se originan de diferentes cepas, con un aminoácido positivamente cargado seleccionado del grupo que consiste de lisina (K), histidina (H) y arginina (R), convenientemente una histidina (H). Por consiguiente, en algunas modalidades, el polipéptido gB de CMV de la invención tiene un bucle de fusión mutado FL2, en dónde al menos la tirosina (Y242), convenientemente al menos la leucina (L241), convenientemente al menos el triptófano (W240), está substituido con una histidina (H), o eliminado, opcionalmente, en combinación con un bucle de fusión mutado FL1 como se descrió anteriormente. En modalidades particulares, el polipéptido gB de CMV de la invención tiene un bucle de fusión mutado FL2, en donde los tres aminoácidos 240W.L.Y242 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV que se originan de diferentes cepas, están substituidos con los aminoácidos 2 0A. F. H242, opcionalmente, en combinación con mutaciones FL1 como se describió anteriormente.

Las mutaciones con relación a los bucles de fusión FL1 y/o FL2, no están limitadas a las mutaciones anteriormente descritas. Se pueden realizar otras mutaciones, además de o no de las descritas anteriormente, tales como, por ejemplo, la mutación de los aminoácidos que rodean los tripletes anteriores 155Y.I.Y157 y 240W.L.Y242 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV que se originan de diferentes cepas, siempre que el polipéptido mutante resultante presente un perfil, rico en trímero, mejorado, y dichas mutaciones adicionales no interfieran con la producción (expresión y secreción), procesamiento o estabilidad del polipéptido cuando se expresa recombinantemente en células huésped.

Los inventores de la presente también observaron que la combinación de la mutación de al menos un bucle de fusión' (FL1 y/o FL2), tal como cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente, con una mutación adicional en el dominio citoplásmico C-terminal del polipéptido también proporcionó un polipéptido gB de CMV con un perfil de trimerización mejorado. En el sentido de la presente invención, se entiende que el dominio citoplásmico C-terminal de un polipéptido gB de CMV es el dominio ubicado corriente abajo al dominio de transmembrana (ver también Figura 1). En particular, la mutación adicional en el dominio citoplásmico C-terminal convenientemente concierne con la eliminación de una región hidrofóbica, convenientemente una región rica en prolina, adecuadamente una región altamente hidrofílica, negativamente cargada, posiblemente todas éstas. Como un ejemplo no limitante, una mutación adecuada corresponde a la eliminación de los aminoácidos 825 a 877 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, la cual es denominada Del2. La delineación de la secuencia anterior que está eliminada, no está estrictamente limitada a la posición de aminoácido 825 a 877 y puede variar, siempre que el polipéptido mutante resultante presente un perfil rico en trímero, mejorado, y no se vea afectado en términos de producción, procesamiento o estabilidad cuando se expresa recombinantemente en células huésped. Por consiguiente, en algunas modalidades, el polipéptido gB de CMV de la invención comprende tanto la mutación de al menos un bucle de fusión (FL1 y/o FL2), convenientemente FL1, como la eliminación de al menos una región hidrofóbica, una región rica en prolina y una región altamente hidrofílica en el dominio citoplásmico C-terminal, en particular la eliminación de los aminoácidos 825 a 877 (Del2) de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1.

La hidrofobicidad de una secuencia de aminoácido o un fragmento del mismo es dictada por el tipo de aminoácidos que componen esta secuencia o un fragmento de la misma. Los aminoácidos son comúnmente clasificados en distintos grupos de acuerdo con sus cadenas laterales. Por ejemplo, algunas cadenas laterales se consideran no polares, es decir, hidrofóbicas, mientras otras se consideran polares. En el sentido de la presente invención, se considera que la alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), prolina (P), fenilalanina (F) y triptófano (W) son parte de los aminoácidos hidrofóbicos, mientras que la serina (S), treonina (T), asparagina (N), glutamina (Q), tirosina (Y), cisteína (C), Usina (K), arginina (R), histidina (H), ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E) se consideran parte de los aminoácidos polares. Sin considerar su hidrofobicidad, los aminoácidos también se clasifican en subgrupos basándose en propiedades comunes compartidas por sus cadenas laterales. Por ejemplo, la fenilalanina, triptófano y tirosina están conjuntamente clasificados como aminoácidos aromáticos y serán considerados como aminoácidos aromáticos dentro del significado de la presente invención. El aspartato (D) y glutamato (E) son parte de los aminoácidos negativamente cargos o ácidos, mientras que la Usina (K), arginina (R) e histidina (H) son parte de los aminoácidos positivamente cargados o básicos, y serán considerados como tales en el sentido de la presente invención. Están disponibles escalas de hidrofobicidad que utilizan las propiedades hidrofobicas e hidrofílicas de cada uno de los 20 aminoácidos y distribuyen una escala hidrofóbica a cada aminoácido, creando así un rango de hidrofobicidad. Solo como un ejemplo ilustrativo, se puede citar la escala de Kyte y Dolittle previamente discutida (Kyte et al. 1982. J. Mol. Bio. 157: 105-132). Esta escala permite calcular la hidrofobicidad promedio dentro de un segmento de longitud predeterminada. Por consiguiente, las regiones hidrofobicas en una secuencia de aminoácido pueden ser identificadas por un experto en la técnica como objetivos potenciales para la mutación de acuerdo con la presente invención. La habilidad de la mutación de dichas regiones para inducir un perfil de producto mejorado de la proteína mutante resultante, es decir favoreciendo la proporción de. trímeros dentro de la población, entonces puede ser probada como se describe más adelante. La mutación de una región hidrofóbica puede consistir de una eliminación de dicha región como se indicó anteriormente, o parte de ella, o en mutaciones de punto substituyendo aminoácidos hidrofóbicos con aminoácidos polares dentro de dicha región. La relevancia de la mutación será determinada al analizar el efecto resultante de dicha mutación en el perfil de producto del polipéptido mutado, después de la expresión recombinante en células huésped, es decir, una mutación relevante es para inducir un perfil, rico en trímero, mejorado, en donde al menos 50%, convenientemente al menos 60% y más convenientemente al menos 70% de los trímeros están presentes dentro de la población del polipéptido mutado. Los inventores observaron que el dominio citoplásmico C-terminal puede ser eliminado a un grado variables mientras se mantiene el perfil de producto mejorado, como se describió anteriormente. Por consiguiente, la presente invención contempla polipéptidos gB de CMV, en donde convenientemente 10%, más convenientemente 20%, con mayor conveniencia 80%, mucho mejor 90% de los aminoácidos del dominio citoplásmico es eliminado. Posiblemente, todo el dominio citoplásmico puede ser eliminado. En particular, los inventores observaron que cuando se elimina al menos 70%, convenientemente 80%, o más del dominio citoplásmico, los polipéptidos gB de CMV resultantes mostraron una mejor expresión y mejor nivel de secreción cuando se expresan recombinantemente en células huésped. Por consiguiente, en algunas modalidades, los polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden tanto la mutación de al menos un bucle de fusión (FL1 y/o FL2), convenientemente FL1, o posiblemente ambos, como la eliminación de todo el dominio citoplásm ico, por ejemplo, los aminoácidos 776 al 906 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV.

Cualquier método que permita discriminar los constituyentes dentro de una población, tal como polipéptidos purificados posiblemente agregados entre sí, de acuerdo con su tamaño o densidad, puede ser utilizado para verificar el perfil de producto y, de esta manera, para determinar si mutaciones dadas están confiriendo un producto de perfil mejorado como se describió anteriormente. Los métodos adecuados pueden basarse en sedimentación, tal como ultracentrifugación analítica (AUC), o en cromatografía, en particular, cromatografía de exclusión de tamaño, tal como cromatografía de exclusión de tamaño basada en UV (SEC-UV). Alternativamente, un método para evaluar el nivel de agregación dentro de una muestra de proteína o polipéptido puede consistir de tratar la muestra con un agente de entrelazamiento, con el fin de formar enlaces entre dos proteínas, o polipéptidos, o más. Convenientemente, se puede utilizar glutaraldehído como un entrelazador. Después del entrelazamiento, de cargar la muestra en un gel en condiciones de desnaturalización, tales como SDS-PAGE, y de teñir el gel para la presencia de proteínas, por ejemplo, con azul de Coomassie o nitrato de plata, se presentarán agregados, si hay alguno, los cuales se separan de acuerdo con su peso molecular. La carga en paralelo de una escalera hecha de proteínas con un peso molecular conocido permitirá determinar el peso molecular de los diferentes agregados. Siempre que el peso molecular de la unidad mínima, tal como un polipéptido en su forma monomérica, sea conocido, entonces el peso molecular observado de los agregados será indicativo del nivel de multimerización dentro de los agregados. Por ejemplo, el polipéptido gB de CMV AD169 eliminado del dominio de transmembrana tiene una longitud de 838 aminoácidos. Si se considera que el peso molecular promedio de un aminoácido es de 110 kDa, entonces el peso molecular esperado de este polipéptido es de 92 kDa. Por lo tanto, si dicho polipéptido se agrega, entonces se podría esperar que el peso molecular promedio de los multímeros resultantes sea un múltiplo de 92. En particular, si se forman trímeros, el peso molecular promedio esperado de dichos trímeros, hechos de 3 moléculas de gB eliminado del dominio de transmembrana, es de 276 kDa.

Cualquiera de las mutaciones antes descritas en los bucles de fusión FL1 y/o FL2 puede ser combinada con mutaciones adicionales. En particular, se entiende que los polipéptidos gB de CMV de acuerdo con la presente invención tienen un dominio de transmembrana no funcional y comprenden mutaciones especificas adicionales, tales como las mutaciones de bucles de fusión. La ubicación de un dominio de transmembrana dentro de un polipéptido puede predecirse a través del uso de programas de computadora para formular una escala de hidropatía a partir de la secuencia de aminoácido, utilizando las propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas de los 20 aminoácidos (Kyte et al. 1982. J. Mol. Bio. 157: 105-132). La hidropatía promedio dentro de un segmento de longitud predeterminada de secuencia se calcula continuamente a medida que el programa se mueve a través de la secuencia. Estas clasificaciones de hidropatía consecutivas después son graficadas del término N al término C, y se imprime una línea de punto medio que corresponde a un promedio grande de hidropatía de composiciones de: aminoácido encontradas en la mayoría de las proteínas secuenciadas conocidas. Las proteínas unidas a membrana exhiben regiones no interrumpidas grandes en el lado hidrofóbico de la línea que corresponde a una porción de secuencia que está embebida en la bicapa de lípido de la membrana. Un dominio de transmembrana es responsable de anclar un polipéptido a la membrana de célula. En glicoproteínas envolventes virales, el dominio de transmembrana típicamente contiene estiramientos de 20-27 aminoácidos no cargados, principalmente hidrofóbicos cerca de la parte C-terminal del polipéptido. Como un ejemplo de la aplicación del análisis de hidropatía como se describió anteriormente, con respecto a CMV gB, puede ser la publicación de Spaete et al. (Spaete et al., 1988, Virology 167: 207-225) citada. En realidad, los autores identificaron en el polipéptido gB de CMV, a partir de las cepas AD169 y Towne, un dominio de transmembrana hidrofóbico putativo fácilmente evidente como dos picos hidrofóbicos adyacentes, anchos cerca del término C del polipéptido gB. El primero comprende los aminoácidos 715 a 748 y el segundo los aminoácidos 752 a 772 (la numeración corresponde a la secuencia de aminoácido del polipéptido gB de la cepa AD169 como se muestra en SEC ID NO: 1). Una publicación de Reschke et al. (Reschke et al., 1995, J. of Gen. Virology 76: 1 13-122) alternativamente identificó el segundo estiramiento de los aminoácidos 751 a 771 como el dominio de transmembrana putativo de AD169 CMV gB. Estas dos publicaciones sugieren de esta manera que el dominio de transmembrana putativo de AD169 CMV gB incluye al menos los aminoácidos 751 a 771, y posiblemente los aminoácidos 714 a 771. En el sentido de la presente invención, el domino de transmembrana del polipéptido gB de CMV abarca al menos los aminoácidos 701 a 775 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, y de esta manera la longitud de 74 aminoácidos.

Por "un dominio de transmembrana no funcional", se debe entender dentro del significado de la presente invención que al menos parte del dominio de transmembrana putativo se altera para permitir la secreción del polipéptido resultante a partir de una célula huésped después de la expresión en dicha célula. En una modalidad, el polipéptido gB de la invención se elimina de todo el dominio de transmembrana. En modalidades alternativas, los polipéptidos gB de CMV de la invención retienen una porción del dominio de transmembrana. En particular, los polipéptidos gB de CMV retienen al menos 5%, convenientemente al menos 10%, más convenientemente al menos 20%, con mayor conveniencia al menos 30%, o al menos 50% de los aminoácidos del dominio de transmembrana. Por consiguiente, en algunas modalidades, al menos 50% del número de aminoácido del dominio de transmembrana se elimina de los polipéptidos gB de CMV de la invención, convenientemente al menos 70%, más convenientemente al menos 80%, con mayor conveniencia al menos 90% y más aún 95% del número de aminoácido del dominio de transmembrana es eliminado. De acuerdo con una modalidad particular, el dominio de transmembrana del polipéptido gB de CMV de la invención se hace no funcional al eliminar los aminoácidos 701 a 775 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV. Con base en la predicción antes descrita para determinar la ubicación de un dominio de transmembrana dentro de un polipéptido, el grado de la eliminación además puede variar, siempre que el polipéptido gB de CMV eliminado resultante sea secretado de las células huésped después de la expresión en dichas células. La alteración funcional del dominio de transmembrana no está limitada a la eliminación de aminoácidos. La alteración puede consistir en cualquier otro tipo de mutaciones de aminoácido, tales como inserción y/o substituciones. Las eliminaciones, inserciones y substituciones de aminoácidos también puede ser combinada en cualquier forma, siempre que el polipeptido gB de CMV mutado resultante sea secretado de células huésped después de la expresión en dichas células. Está dentro de las habilidades del experto en la técnica valorar el impacto de una mutación dada, tal como, por ejemplo, la eliminación de una porción dada del dominio de transmembrana, sobre la habilidad del polipéptido mutado resultante a ser secretado de las células. La secreción de un polipéptido puede ser detectada y el nivel de secreción puede ser valorado a través de cualquier técnica conocida en el campo. Como un ejemplo ilustrativo no limitante, es posible medir en forma separada el contenido del polipéptido expresado que es retenido dentro de las células y el cual es secretado en el sobrenadante de cultivo de célula o medio de cultivo de célula después de expresión. Típicamente, después de la expresión, el sobrenadante de cultivo de célula se recolectó antes de que las células se Usaran de acuerdo con cualquier método común de lisis, proporcionando de esta manera dos fracciones, una celular y una sobrenadante. El contenido del polipéptido entonces puede ser medido en cada fracción a través de cualquier técnica de detección de proteína conocida en el campo. Por ejemplo, el polipéptido puede ser detectado a través de tinción Western o a través de un análisis de ELISA.

Por "que comprende al menos una porción del dominio extracelular", se debe entender en el sentido de presente invención como al menos la parte del dominio extracelular que comprende o abarca los bucles de fusión FL1 y FL2. El número de aminoácidos adicionales fuera de los bucles de fusión en el domino extracelular puede variar. El número apropiado de aminoácidos, o el porcentaje de aminoácidos del dominio extracelular presentado en los polipéptidos de la invención debe ser tal que los polipéptidos resultantes comprenden los epítopos antigénicos y presentan un perfil mejorado de trimerización. Convenientemente, al menos un 50%, más convenientemente al menos 70%, con mayor conveniencia al menos 80% y aún más 90% de los aminoácidos del dominio extracelular es retenido en los polipéptidos de la invención, dicho porcentaje necesariamente abarca los bucles de fusión FL1 y FL2. En una modalidad, el polipéptido gB de CMV de la invención retiene todo el dominio extracelular, dicho dominio comprende al menos una mutación en uno de los dos bucles de fusión FL1 y FL2, posiblemente ambos.

Por retención de "al menos una porción del dominio citoplásmico" significa el número de aminoácidos necesarios para la expresión y secreción. Convenientemente, los polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden al menos 5%, convenientemente al menos 10%, y puede ser 20%, o más, de los aminoácidos del dominio citoplásmico. Por consiguiente, en algunas modalidades al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% de los aminoácidos del dominio citoplásmico en los polipéptidos gB de CMV de la invención es eliminado. En una modalidad más, los polipéptidos gB de CMV de la invención son eliminados de todo el dominio citoplásmico.

Las mutaciones del dominio de transmembrana, tales como, por ejemplo, eliminaciones de al menos parte del mismo, pueden ser combinadas con mutaciones del dominio citoplásmico, tal como, por ejemplo, eliminaciones de al menos parte del mismo. Cualquier combinación se contempla en la presente invención, siempre que el polipéptido gB de CMV mutado resultante sea secretado de células huésped después de la expresión en dichas células, como se describió anteriormente y presente un perfil mejorado de trimerización. Por consiguiente, en modalidades particulares, los polipéptidos gB de CMV de la invención se eliminan tanto de todo el dominio de transmembrana como de todo el dominio citoplásmico. En modalidades alternativas, los polipéptidos gB de CMV de la invención son eliminados de todo el dominio de transmembrana y retienen al menos parte del dominio citoplásmico, tal como, por ejemplo, 10% de mismo. En modalidades alternativas adicionales, los polipéptidos gB de CMV de la invención son eliminados de todo el dominio citoplásmico y retiene al menos 30% del dominio de transmembrana.

Sorprendentemente, los inventores observaron que al combinar mutaciones de los bucles de fusión FL1 y/o FL2 con la detección de al menos parte del dominio citoplásmico, posiblemente la eliminación de todo esto, y la eliminación de al menos parte del dominio de transmembrana, posiblemente la eliminación de todo esto, proporcionó polipéptidos siendo más eficientemente expresados y secretados que los polipéptidos de la técnica anterior.

También, los inventores observaron que la secuencia de señal de los polipéptidos de CMV de la técnica anterior, después de expresión recombinante y secreción de los polipéptidos, fue dividida a través de peptidasa de señal en diferentes posiciones de aminoácido, generando así una población de polipéptidos gB maduros teniendo un extremo variable en el término N, es decir, una población hecha de polipéptidos gB teniendo un aminoácido diferente en el término N. Sorprendentemente, observaron que la introducción de mutaciones en la secuencia líder del polipéptido gB dio como resultado la división de la secuencia de señal principalmente en un sitio, generando así una población homogénea de polipéptidos gB maduros teniendo el mismo aminoácido en el término N. Por consiguiente, en una modalidad, se proporciona una preparación que comprende una población de polipéptidos gB de CMV maduros producidos después de la escisión de la secuencia de señal, en donde al menos 30%, al menos 80%, de 80% a 90% de los polipéptidos gB maduros comprende el mismo aminoácido en el término N. En particular, los polipéptidos maduros de la invención convenientemente empiezan con una serina o una histidina en la posición N-terminal. Es un objeto de la invención proporcionar un polipéptido gB de CMV que comprenda una eliminación de al menos 40%, convenientemente al menos 50%, más convenientemente al menos 70%, con mayor conveniencia al menos 80% o aún más al menos 90% de los aminoácidos de la secuencia líder. En una modalidad, se proporciona un polipéptido gB de CMV que comprende la eliminación de toda la secuencia líder. Los inventores también observaron que la eliminación anterior de la secuencia líder puede ser combinada con mutaciones que ocurren en la secuencia de señal, tal como al menos una substitución de aminoácido, convenientemente la parte C-terminal del péptido de señal. Alternativamente, dicha secuencia de señal puede comprender al menos una inserción de aminoácido, adecuadamente en la parte C-terminal del péptido de señal. El grado de la eliminación de la secuencia líder, así como el tipo de mutaciones en la secuencia de señal, puede ariar siempre que el polipéptido gB resultante, después de la expresión recombinante y secreción, sea dividido por una peptidasa de señal en un sitio principal, generando así una población de polipéptidos gB maduros teniendo el mismo aminoácido en el término N. La identidad del aminoácido N-terminal dentro de una población de polipéptidos puede ser determinada a través de cualquiera de las técnicas de secuenciación conocidas en el campo. Alternativamente, las diferentes formas de polipéptidos dentro de una población de polipéptidos pueden ser sometidas a una digestión tríptica, y los diferentes péptidos generados pueden ser analizados a través de espectroscopia de masas, tal como MS/MS. La comparación con péptidos estándares de secuencias conocidas permitirá determinar la composición de aminoácido de los péptidos digeridos.

Los inventores observaron que la eliminación anterior de la secuencia líder y/o la mutación de la secuencia de señal puede ser combinada con cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente con relación a los dominios de Bucles de Fusión FL1 y/o FL2 y/o a la eliminación de al menos una porción del dominio TM y/o a la detección de al menos una porción del dominio citoplásmico, mientras, mientras sigue manteniendo las propiedades conferidas por cada tipo de mutación, tales como un perfil mejorado de trimerización , una mejor expresión y secreción, la ausencia de la sujeción C-terminal, y la homogeneidad en el término N después de la escisión de la secuencia de señal, según comparado con los polipéptidos gB de CMV de la técnica anterior, tales como gB-DeltaT . Por consiguiente, en algunas modalidades, los polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden mutaciones en la secuencia líder opcionalmente combinadas con mutaciones en la secuencia de señal, cualquiera de las mutaciones de dominio FL1 y/o FL2 previamente descritas, y cualquiera de las mutaciones en el dominio citoplásmico y en el dominio TM ahí descrito.

Los polipéptidos gB de CMV de la invención no son de "existencia natural" en el sentido de que no están presentes en el mismo estado como en la naturaleza, es decir, su secuencia ha sido modificada artificialmente. Los términos "polipéptido" o "proteína" se refieren a un polímero en donde los monómeros son aminoácidos que están unidos conjuntamente a través de enlaces amida. Los términos "polipéptido" o "proteína", como se utiliza aquí, pretenden abarcar cualquier secuencia de aminoácido e incluyen secuencias modificadas tales como glicoproteínas. El termino "polipéptido" específicamente pretende cubrir tanto proteínas de existencia natural como proteínas de existencia no natural, las cuales son recombinante o sintéticamente producidas. El término "fragmento", con referencia a un polipéptido, se refiere a una porción (es decir, una sub-secuencia) de un polipéptido. El término "fragmento inmunogénico" se refiere a todos los fragmentos de un polipéptido que retienen al menos un epítopo inmunogénico predominante de la proteína o polipéptido de referencia de longitud completa. La orientación dentro de un polipéptido generalmente es dictada en una dirección N-terminal o C-terminal, definida por la orientación de las porciones amino y carboxi de aminoácidos individuales. Los polipéptidos son traducidos de la terminal N o término amino hacia la terminal C o término carboxi.

También es posible utilizar en la presente invención una polipéptido gB como se describió anteriormente realizando más mutaciones, tales como, por ejemplo, mutaciones en sitios endoproteolíticos de manera que dichos sitios se hacen ineficaces. Por ejemplo, el sitio de escisión de furina ubicado alrededor de los aminoácidos 456 a 460 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV que se originan de diferentes cepas, puede ser mutado. Convenientemente, al menos se realiza una de las substituciones de aminoácido a partir del grupo que consiste de: R456 substituido con T456, R458 substituido con Q458, y R459 substituido con T459, con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, Por consiguiente, en ciertas modalidades, los polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden mutaciones de punto adicionales, en donde la arginina R456, R458 y R459 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV que se originan de diferentes cepas, está substituida con una treonina (T456), un ácido glutámico (Q458) y una treonina (T459), respectivamente. En algunas otras modalidades, la arginina en la posición 50 y 357 de la secuencia como se establece en SEC ID NO: 1 fue substituida con una serina. En otras modalidades más, los polipéptidos gB de la invención, en particular, los que comprenden una eliminación de una región hidrofóbica en el dominio citoplásmico C-terminal, comprenden una mutación de punto adicional, en donde la cisteína en la posición 778 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1 está substituida con una alanina.

Opcionalmente, para facilitar la expresión y recuperación, el polipéptido gB de la presente invención puede incluir un péptido de señal en el término N. un péptido de señal puede ser seleccionado de entre numerosos péptidos de señal conocidos en la técnica, y típicamente se selecciona para facilitar la producción y procesamiento en un sistema seleccionado para la expresión recombinante del polipéptido gB de la presente invención. En ciertas modalidades, el péptido de señal es el naturalmente presente en la proteína gB nativa de la cepa AD169, es decir, aminoácidos 1-20 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1. Alternativamente, el péptido de señal puede ser una secuencia heteróloga ya que la secuencia surge de una proteína distinta de gB. Los péptidos de señal ilustrativos adecuados para usarse en el contexto de los polipéptidos gB de CMV de la invención incluyen péptidos de señal del activador de plasminógeno de tejido (tPA), proteína gD de Virus de Herpes Simple (HSV), endostatina humana, HIV gp120, CD33, Her2Neu humana, o gp350 de virus de Epstein Barr (EBV). Un "péptido de señal" es una secuencia corta de aminoácido (por ejemplo, una longitud de aproximadamente 18-25 aminoácidos) que dirige proteínas de secreción o de membrana recientemente sintetizada a y a raves de membranas, por ejemplo, del retículo endoplásmico. Los péptidos de señal están frecuentemente, pero no universalmente, localizados en el término N de un polipéptido, y con frecuencia se divididos por peptidasas de señal después de que la proteína ha cruzado la membrana. Esta escisión comúnmente es considerada como un paso en el procedimiento de "maduración" de proteína. En particular, una vez que el péptido de señal es dividido, la proteína se denomina como en su forma "madura". Las. secuencias de señal típicamente contienen tres características estructurales comunes: una región básica polar N-terminal (región n), un núcleo hidrofóbico, y una región c hidrof ílica). De acuerdo con una modalidad, el polipéptido gB de la invención comprende el péptido de señal naturalmente presente en el gB nativo. En upa modalidad alternativa, el polipéptido gB de la invención comprende un péptido de señal heterólogo, tal como el péptido de señal de la proteína CD33. Las secuencias de señal pueden ser no nativas y pueden comprender mutaciones, tales como substituciones, inserciones, o eliminaciones de aminoácidos. Por consiguiente, en algunas modalidades, en donde los polipéptidos gB de la invención comprenden un péptido de señal, en particular, el péptido de señal nativo, dicho péptido de señal comprende al menos una substitución de aminoácido, convenientemente en la parte C-terminal del péptido de señal. Alternativamente, dicho péptido de señal comprende al menos una inserción de aminoácido, convenientemente en la parte C-terminal del péptido de señal.

Opcionalmente, los polipéptidos gB de CMV de la invención, como se describe ahí, pueden incluir la adición de una secuencia de aminoácido que constituye una etiqueta, la cual facilita el procesamiento o purificación subsecuente de un polipéptido recombinantemente expresado. Dicha etiqueta puede ser una etiqueta antigénica o de epítopo, una etiqueta enzimática o una etiqueta de polihistidina. Típicamente, la etiqueta está situada en uno o el otro extremo del polipéptido, tal como en el término C o término N del polipéptido. Por consiguiente, en algunas modalidades, los polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden una etiqueta de polihistidina en el término C de los polipéptidos.

En ciertas modalidades, el polipéptido gB de CMV de la invención tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de: SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18, o una sub-secuencia de la misma (por ejemplo, una sub-secuencia que carece de la secuencia de señal de aminoácidos, o que tiene una substitución de una secuencia de señal diferente). Alternativamente, en distintas modalidades, el polipéptido gB de CMV de la invención tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de: SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21.

Otro aspecto de esta descripción se refiere a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos gB de CMV de la presente invención. Las células en las cuales dichos ácidos nucleicos o vectores son introducidos (es decir, células huésped) también son parte de la invención. Las células huésped pueden ser células bacterianas, pero más comúnmente serán células eucarióticas, tales como células de levadura (por ejemplo, Pichia), células vegetales, células de insecto, o células de mamífero (por ejemplo, células CHO). De acuerdo con una modalidad, los polipéptidos gB de CMV de la invención son recombinantemente expresados en células CHO.

Los términos "polinucleótido" y "secuencia de ácido nucleico" se refieren a una forma polimérica de nucleotidos con una longitud de al menos 10 bases. Los nucleotidos pueden ser ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos, o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye formas individuales y dobles de ADN. Por "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que no está inmediatamente continuo con ambas de las secuencias de codificación con las cuales está inmediatamente contiguo (uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3') en el genoma de existencia natural del organismo a partir del cual se deriva. En una modalidad, un polinucleótido codifica un polipéptido. La dirección de 5' y 3' de un ácido nucleico se define haciendo referencia a la conectividad de unidades de nucleótido individuales, y se designa de acuerdo con las posiciones de carbón del anillo de azúcar desoxiribosa (o ribosa). El contenido de información (codificación) de una secuencia de polinucleótido se lee en una dirección 5' a 3'.

Un ácido nucleico "recombinante" es uno que tiene una secuencia que no es de existencia natural o tiene una secuencia que se hace a través de una combinación artificial de dos segmentos, de otra manera separados, de secuencia. Esta combinación artificial puede lograrse a través de síntesis química o, más comúnmente, a través de la manipulación artificial de segmentos asilados de ácidos nucleicos, por ejemplo, a raves de técnicas de ingeniería genética. Una proteína "recombinante" es una que es codificada por un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, recombinante), el cual ha sido introducido en una célula huésped, tal como una célula bacteriana o eucariótica. El ácido nucleico puede ser introducido, en un. vector de expresión que tiene señales capaces de expresar la proteína codificada por el ácido nucleico introducido o el ácido nucleico puede ser integrado en el cromosoma de la célula huésped.

En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos recombinantes son codón optimizado para la expresión en una célula huésped procariótica o eucariótica seleccionada, tal como una célula de mamífero, vegetal o de insecto. Para facilitar la replicación y expresión, los ácidos nucleicos pueden ser incorporados en un vector, tal como un vector de expresión procariótico o eucariótico. Aunque los ácidos nucleicos aquí descritos pueden ser incluidos en cualquiera de una variedad de vectores (incluyendo, por ejemplo, plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vacuna, adenovirus, virus de viruela aviar, pseudorrabia, adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus y muchos otros), más comúnmente el vector será un vector de expresión adecuado para generar productos de expresión de polipéptido. En un vector de expresión, el ácido nucleico que codifica el polipéptido gB de CMV es típicamente dispuesto cerca y en orientación hacia una secuencia de control de transcripción apropiada (promotor, y opcionalmente, uno o más mejoradores) para dirigir la síntesis de ARNm. Es decir, la secuencia de polinucleótido de interés está operablemente enlazada a una secuencia de control de transcripción apropiada. Ejemplos de dichos promotores incluyen: el promotor temprano inmediato de CMV, LTR o promotor SV40, promotor de poliedro de baculovirus, promotor lac o trp de E. coli, fago T7 y promotor lambda PL, y otros promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión típicamente también contiene un sitio de unión de ribosoma para el inicio de traducción, y un terminador de transcripción. El vector opcionalmente incluye secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión opcionalmente comprenden uno o más genes marcadores para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas, tales como dihidrofolato reductasa, resistencia a neomicina o resistencia de canamicina para el cultivo de célula eucariótica, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector de expresión también puede incluir elementos de expresión adicionales, por ejemplo, para mejorar la eficiencia de la traducción. Estas señales pueden incluir un codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En algunos casos, por ejemplo, se insertan un codón de iniciación de traducción y elementos de secuencia asociados en el vector de expresión apropiado simultáneamente con la secuencia de polipéptido de interés (por ejemplo, un codón de inicio nativo). En dichos casos, no se requieren señales de control de traducción adicionales. Sin embargo, en casos en donde solo una secuencia de codificación de polipéptido, o una porción de la misma, sea insertada, se proporcionan señales de control de traducción exógena, incluyendo un codón de iniciación ATG para la expresión de la secuencia gB de CMV. El codón de iniciación se coloca en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción de la secuencia de polipéptido de interés. Los elementos de transcripción exógena y los codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto natural como sintético. Si se desea, la eficiencia de la expresión además puede ser incrementada a través de la inclusión de mejoradores apropiados al sistema celular en uso (Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bitter et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).

Los procedimientos ilustrativos suficientes para guiar a un experto en la técnica a través de la producción de ácidos nucleicos gB de CMV recombinantes se pueden encontrar en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2° ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3o ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greehe Publishing Associates, 1992 (y Suplementos del 2003); y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4o ed., Wiley & Sons, 1999.

Los ácidos nucleicos ilustrativos que codifican los polipéptido gB de CMV de la invención están representados por SEC ID NOs: 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15 y 17. Expertos en la técnica pueden producir variantes de secuencia adicionales que comparte identidad de secuencia con las variantes ilustrativas. Típicamente, las variantes de ácido nucleico codificarán polipéptidos que difieren por no más de 1%, o 2%, o 5%, o 10%, o 15%, o 20% del nucleótido o aminoácidos. Es decir, los polipéptidos codificados comparten al menos 80%, u 85%, más comúnmente, al menos alrededor de 90% o más, tal como 95%, o aún 98% o 99% de identidad de secuencia. Se entenderá inmediatamente por aquellos expertos en la técnica, que las secuencias de polinucleótido que codifican los polipéptidos gB de CMV, pueden por si mismas compartir menos identidad de secuencia debido a la redundancia del código genético.

Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que la similitud entre los polipéptidos gB de CMV y las secuencias de polinucleótido, como para las secuencias de polipéptido y nucleótido en general, puede ser expresada en términos de similitud entre las secuencias, de otra forma denominada como identidad de secuencia. La identidad de secuencia frecuentemente es medida en términos de porcentaje de identidad (o similitud); entre más alto es el porcentaje, más similares son las estructuras primarias de las dos secuencias. En general, entre más similares sean las estructuras primarias de dos secuencias de aminoácido (o polinucleótido), más similares son las estructuras de orden superior que resultan del pliegue y ensamble. Las variantes de polipéptidos gB de CMV y secuencias de polipéptido pueden tener una o un número pequeño de eliminaciones, adiciones o substituciones de aminoácido pero, sin embargo, compartirán un porcentaje muy alto de su aminoácido, y en general su secuencia de polinucleótido. En la técnica son bien conocidos métodos para determinar la identidad de secuencia. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins y Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; y Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:1 19, 1994, presentan una consideración detallada de métodos de alineación de secuencia y cálculos de homología. The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para usarse junto con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia utilizando este programa está disponible en el sitio web de NCBI en Internet.

Otro indicio de similitud de secuencia entre dos ácidos nucleicos es la habilidad de hibridizar. Entre las similares sean las secuencias de los dos ácidos nucleicos, más severas serán las condiciones a las cuales se hibridiza. La severidad de las condiciones de hibridación es dependiente de secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. De esta manera, las condiciones de hibridación que dan como resultado grados particulares de severidad variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación de elección y la composición y longitud déla hibridación de las secuencias de ácido nucleico. Generalmente, la temperatura de hibridación y la resistencia iónica (especialmente la concentración de Na+ y/o Mg + ) del regulador de pH de hibridación determinarán la severidad de la hibridación, aunque los tiempos de lavado también tienen influencia sobre la severidad. En general, las condiciones severas se seleccionan para ser de aproximadamente 5eC a 20°C más bajas que el punto de fusión término (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente coincidente. Las condiciones para la hibridación de ácido nucleico y el cálculo de severidades se pueden encontrar en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques ¡n Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993, y Ausubel et al. Short Protocols en Molecular Biology, 4o ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

Para los propósitos de la presente descripción, "condiciones severas" abarcan condiciones bajo las cuales la hibridación solo ocurrirá si existe menos de un 25% de desigualdad entre la molécula de hibridación y la secuencia objetivo. Las "Condiciones severas" pueden ser divididas en niveles particulares de severidad para una definición más precisa. De esta manera, como se utiliza aquí, las condiciones de "severidad moderada" son aquellas bajo las cuales las moléculas con más de un 25% de desigualdad no se hibridizarán; las condiciones de "severidad media" son aquellas bajo las cuales las moléculas con más de 15% de desigualdad no se hibridizarán, y las condiciones de "severidad alta" son aquellas bajo las cuales las secuencias con más de 10% de desigualdad no hibridizarán. Las condiciones de "severidad muy alta" son aquellas bajo las cuales las secuencias con más de 6% de desigualdad no hibridizarán. En contraste, los ácidos nucleicos que hibridizan bajo condiciones de "severidad baja" incluyen aquellos con una identidad de secuencia mucho menor, o con una identidad de secuencia solo sobre sub-secuencias cortas del ácido nucleico. Por lo tanto, se entenderá que las varias variantes de ácidos nucleicos que están abarcadas por esta descripción son capaces de hibridizar a al menos una de SEC ID NOs: 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15 y 17, sobre substancialmente toda su longitud.

Los polipéptidos gB de CMV aquí descritos se producen utilizando procedimiento bien establecidos para la expresión y purificación de proteínas recombinantes. Los procedimientos suficientes para guiar a un experto en la técnica se pueden encontrar en, por ejemplo, las referencias de Sambrook y Ausubel antes citadas. Más adelante se proporcionan detalles adicionales y específicos. Se introducen en células huésped, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos gB de CMV, tales como (pero no limitado a) los ácidos nucleicos ilustrativos representados por SEC ID NOs: 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15 y 17, a través de cualquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos, tal es como electroporación, transfeccíón mediada por liposoma, precipitación de fosfato de calcio, infección, transfeccíón y similares, dependiendo de la selección de vectores y células huésped. Las células huésped que incluyen ácidos nucleicos que codifican al polipéptido gB de CMV recombinante, de esta forma, también son una característica de esta descripción. Las células huésped favorables incluyen células huésped procarióticas (es decir, bacterianas), tales como E. coli, así como numerosas células huésped eucarióticas, incluyendo células fúngicas (por ejemplo, levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae y Picchia pastoris), células de insecto, células vegetales, y células de mamífero (tales como células CHO). Los ácidos nucleicos de CMV gB recombinantes se introducen (por ejemplo, transducidos, transformados o transfectados) en células huésped, por ejemplo, a través de un vector, tal como un vector de expresión. Como se describió anteriormente, el vector muy típicamente es un plásmido, pero dichos vectores también pueden ser, por ejemplo, una particular viral, un fago, etc. ejemplos de huéspedes de expresión adecuados incluyen: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris, y Neurospora crassa; células de insecto, tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda; células de mamífero, tales como 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 o melanoma de Bowes, incluyendo células de algas, etc.

Las células huésped pueden ser cultivadas en medios convencionales de nutriente modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar las secuencias de polinucleótido insertadas. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son típicamente aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para aquellos expertos en la técnica y en las referencias aquí citadas, incluyendo, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley- Liss, New York y las referencias ahí citadas. Los productos de expresión que corresponden a los ácidos nucleicos de la invención también pueden ser producidos en células que no son de animal, tales como, plantas, levadura, hongos, bacterias, y similares. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, detalles con respecto al cultivo de célula pueden encontrarse en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. En sistemas bacterianos, se puede seleccionar un número de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el producto expresado. Por ejemplo, cuando, para la producción de anticuerpos, se necesitan grandes cantidades de un polipéptido o fragmentos del mismo, favorablemente se emplean vectores que dirigen una expresión de alto nivel de proteínas que son rápidamente purificadas. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, clonación multifuncional de E. coli y vectores de expresión tales como BLUESCRIPT (Stratagene) , en donde la secuencia de codificación de interés, por ejemplo, un polipéptido de la invención como se describió anteriormente, puede ser ligada en el vector enmarco con secuencias para la traducción amino-terminal que inicia metionina y los 7 residuos subsecuentes de beta-galactosidasa que produce una proteína de fusión de beta-galactosidasa catalíticamente activa; ventores pIN (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison Wl), en donde la metionina amino-terminal está ligada en marco con una etiqueta de histidina; y similares. Similarmente, en levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae, se puede utilizar un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como, factor alfa, oxidasa alcohólica y PGH, para la producción de los productos de expresión deseados. Para revisiones, ver Berger, Ausubel, y, por ejemplo, Grant et al. (1987; Methods in Enzymology 153:516-544). En células huésped de mamífero, se puede utilizar un número de sistemas de expresión, incluyendo tanto plásmidos como sistemas de base viral.

Una célula huésped opcionalmente se selecciona por su habilidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Dichas modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, (así como, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, lipidación y acilación). El procesamiento de pos-traducción, por ejemplo, el cual divide una forma de precursor en una forma madura de la proteína (por ejemplo, a través de furina proteasa) es opcionalmente reali-zado en el contexto de la célula huésped. Diferentes células huésped, tales como, 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38, etc., tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades de pos-traducción y se pueden seleccionar para asegurar la modificación correcta y procesamiento de la proteína extraña, introducida. Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo del polipéptido gB de CMV recombinante codificado por los ácidos nucleicos aquí descritos, se utilizan típicamente sistemas de expresión estable. Por ejemplo, las líneas de célula que establemente expresan un polipéptido gB de CMV de la invención se obtienen al introducir los vectores de expresión de célula huésped que contienen orígenes vírales de replicación o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, las células se dejan desarrollar durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que sean conmutadas a medios selectivos. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que exitosamente expresan las secuencias introducidas. Por ejemplo, se pueden hacer proliferar grupos o colonias resistentes de células establemente transformadas utilizando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula. Las células huésped transformadas con un ácido nucleico que codifica un polipéptido gB de CMV son opcionalmente cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada a partir del cultivo de célula.

Después de la transducción de una línea de célula huésped adecuada y del desarrollo de las células huésped a una densidad apropiada de célula, el promotor seleccionado es inducido a través de medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se cultivaron durante un periodo adicional, el producto de polipéptido secretado después es recuperado del medio de cultivo y se purifica. Alternativamente, las células pueden ser cosechadas a través de centrifugación, separación a través de medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante es retenido para purificación adicional. Las células eucarióticas o microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser separadas a través de cualquier método convencional, incluyendo ciclización de congelación-descongelación, aplicación de sonido, disrupción mecánica, o el uso de polipéptidos gB de C V de célula, pueden ser recuperadas y purificadas de cultivos de célula recombinante a través de cualquiera de un número de métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando cualquiera de los sistemas de etiquetado vistos aquí), cromatografía de hidroxiapatita, y cromatografía de lectina. Se pueden utilizar pasos de replegado de proteína, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, se puede emplear cromatografía de liquido de alto rendimiento (HPLC) en los pasos de purificación finales. Además de las referencias observadas anteriormente, una variedad de métodos de purificación son bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, aquellos establecidos por Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag et al. (1996) Protein ethods, 2o Edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3o Edición Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

En un ejemplo, los polinucleótidos que codifican los poMpéptidos gB de CMV son clonados en un vector adecuado para la introducción en células de mamífero (por ejemplo, células CHO). En esta modalidad ilustrativa, la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido gB de CMV es introducido en el vector pMax desarrollado por Amaxa. El polipéptido es expresado bajo un promotor constitutivo, el promotor de CMV temprano inmediato. La selección de las células establemente transfectadas que expresan la quimera se hace con base en la habilidad de las células transfectadas para crecer en presencia de canamicina. Las células que se han integrado exitosamente a pMax son capaces de creer en presencia de canamicina, ya que el vector pMax expresa un gen de resistencia a canamicina. Las células seleccionadas pueden ser clonalmente expandidas y caracterizadas para la expresión de los polipéptidos gB de CMV. Alternativamente, las secuencias de polinucleótido que codifican los polipéptidos gB de CMV de la invención pueden ser introducidas en el vector pTT5 desarrollado por NRC, el cual expresa un gen de resistencia a ampicilina.

Después de la transfección e inducción de expresión (de acuerdo con el promotor seleccionado y/o mejoradores u otros elementos reguladores), los polipéptidos de expresión son recuperados (por ejemplo, purificados o enriquecidos). Lo siguiente es un procedimiento ilustrativo para purificar los poüpéptido gB de CMV. Para facilitar la purificación, los poüpéptido gB de CMV incluyen una etiqueta de polihistidina C-terminal. En resumen, el sobrenadante de cultivo de célula se recolectó 6 días después de la transfección . Después de la clarificación, los sobrenadantes se cargaron a columnas de níquel.

El término "purificación" se refiere al procedimiento de remover componentes de una composición, la presencia de los cuales no es necesaria. La purificación es un término relativo, y no requiera que todas las huellas del componente indeseable sean removidas de la composición. En el contexto de producción de vacuna, la purificación incluye procedimientos tales como centrifugación, diálisis, cromatografía de intercambio de ion, y cromatografía de exclusión de tamaño, purificación de afinidad o precipitación. De esta forma, el término "purif icado(a)" no requiere de pureza absoluta; más bien, se considera como un término relativo. Una preparación de ácido nucleico o proteína substancialmente pura puede ser purificada de manera que el ácido nucleico deseado, o proteína, representa al menos un 50% del contenido total de ácido nucleico de la preparación. En ciertas modalidades, un ácido nucleico substancialmente puro, o proteína, representará al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% o más del total de ácido nucleico o contenido de proteína de la preparación.

En el sentido de la presente invención, un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, o proteína) ha sido substancialmente separado o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en donde el componente ocurre naturalmente, tal como, otros ADN y ARN cromosomales y extra-cromosomales, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aisladas" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas a través de métodos de purificación estándares. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparadas a través de expresión recombinante en una célula huésped así como ácidos nucleicos químicamente sintetizados y proteínas.

Los polipéptidos gB de CMV y ácidos nucleicos de la invención son útiles en la preparación de medicamentos para tratar una infección por CMV. Los polipéptidos gB de CMV de la invención son particularmente adecuados como antígenos para incluirse en una composición inmunogénica, tales como vacunas. Por consiguiente, la presente invención también abarca métodos para producir una respuesta inmune contra CMV al administrar a un sujeto una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que contiene cualquiera de los polipéptidos gB de CMV de la invención. Los sujetos pueden ser sujetos ya sea HCMV-seropositivos o HCMV-seronegativos. En algunas modalidades, los sujetos son niñas adolescentes, típicamente de 12 a 16 años de edad. Alternativamente, los sujetos pueden ser mujeres en edad de reproducción. Típicamente, el grupo de mujeres en edad de reproducción representan mujeres que tienen entre 16 y 45 años de edad que han quedado embarazadas. En una modalidad particular, la invención contempla un método para producir una respuesta inmune contra CMV, que comprende los pasos de administrar a mujeres en edad de reproducción HCMV-seronegativas, una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende un polipéptido gB de la invención, en una modalidad alternativa, los polipéptidos gB de CMV de la invención se utilizan en la preparación de un medicamento para evitar y/o tratar una infección por CMV. Convenientemente, la composición, o medicamento, produce una respuesta inmune protectora que reduce o evita la infección con CMV y/o reduce o evita una respuesta patológica después de infección con CMV. En particular, el método de la invención, en donde a mujeres en edad de reproducción se les administra una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que contiene cualquiera de los polipéptidos gB de CMV de la invención, evita la transmisión de CMV de la madre al feto, es decir, evita la infección congéníta por CMV. Los términos "prevención de infección congénita por HCMV en un recién nacido" significa que el recién nacido está libre de infección por HCMV al nacer. Alternativamente, los sujetos adecuados para recibir la composición inmunogénica de la invención son sujetos inmunocomprometidos, tales como, por ejemplo, pacientes trasplantados. Por consiguiente, en algunas modalidades, la presente invención contempla el uso de polipéptidos gB de CMV de la invención para reducir y/o evitar la infección por CMV en sujetos inmunocomprometidos. En modalidades adicionales, la presente invención contempla métodos para producir una respuesta inmune contra CMV que comprende los pasos de administrar polipéptidos gB de CMV de la invención a sujetos inmunocomprometidos.

Un "sujeto" es un organismo viviente vertebrado multi-celular. En el contexto de esta descripción, el sujeto puede ser un sujeto experimental, tal como un animal que no es un ser humano, por ejemplo, un ratón, una rata algodonera, o un primate no humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un sujeto ser humano, como se indicó anteriormente.

Un "antígeno" es un compuesto, composición, o substancia que puede estimular una respuesta inmune al producir anticuerpos y/o una respuesta de célula Ten un animal, incluyendo composiciones que son inyectadas, absorbidas, o de otra manera introducidas en el animal. El término "antígeno" incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al cual responden las células B y/o T. Los "epítopos antigénicos predominantes" son aquellos epítopos para los cuales se hace una respuesta inmune huésped funcionalmente importante, por ejemplo, una respuesta de anticuerpo de una respuesta de célula T. De esta manera, con respecto a una respuesta inmune protectora contra un patógeno, los epítopos antigénicos predominantes son aquellas porciones antigénicas que cuando son reconocidas por el sistema inmune huésped dan como resultado protección contra la enfermedad causada por el patógeno. El término "epítopo de célula T" se refiere a un epítopo que cuando se une a una molécula MHC apropiada específicamente se une a través de una célula T (mediante un receptor de célula T). Un "epítopo de célula B" es un epítopo que es específicamente unido a través de un anticuerpo (o molécula de receptor de célula B).

Una "respuesta inmune" es una respuesta de una célula del sistema inmune, tal como una célula B, célula T, o monocito, a un estímulo. Una respuesta inmune puede ser una respuesta de célula B, la cual da como resultado la producción de anticuerpos específicos, tales como anticuerpos de neutralización de antígeno específico. Una respuesta inmune también puede ser una respuesta de célula T, tal como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8 + . En algunos casos, la respuesta es específica para un antígeno particular (es decir, una "respuesta específica para antígeno"), en particular, CMV. Si el antígeno se deriva de un patógeno, la respuesta especifica para antígeno en una "respuesta específica para patógeno". Una "respuesta inmune protectora" es una respuesta inmune que inhibe una función o actividad peligrosa de un patógeno, reduce la infección por un patógeno, o disminuye los síntomas (incluyendo la muerte) que resultan de la infección por el patógeno. Una respuesta inmune protectora puede ser medida, por ejemplo, a través de la inhibición de replicación viral o formación de placa en un ensayo de reducción de placa o ensayo de neutralización de ELISA, o al medir la resistencia al ataque del patógeno in vivo.

Típicamente, la respuesta inmune produce una respuesta inmune caracterizada por la producción de citocinas de tipo Th1, por ejemplo, una respuesta inmune de tipo Th1. Una respuesta inmune de tipo "Th1" se caracteriza por células colaboradoras T CD4+ que producen IL-2 e IFN-?. En contraste, una respuesta inmune de tipo "TH2" se caracteriza por células colaboradoras CD4+ que producen IL-4, IL-5 e IL-13.

Una "cantidad inmunológicamente efectiva" es una cantidad de una composición (típicamente, una composición inmunogénica) usada para producir una respuesta inmune en un sujeto. Comúnmente, el resultado deseado es la producción de una respuesta inmune específica para antígeno (por ejemplo, patógeno) que es capaz de o contribuye a proteger al sujeto contra el patógeno, tal como CMV. Sin embargo, para obtener una respuesta inmune protectora contra un patógeno se pueden requerir de múltiples administraciones de la composición inmunogénica. De esta forma, en el contexto de esta descripción, el término cantidad inmunológicamente efectiva abarca una dosis fraccionar que contribuye en combinación con administraciones previas o subsecuentes para obtener una respuesta inmune protectora.

También se proporcionan composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, incluyendo un polipéptido gB de CMV y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Una "composición inmunogénica" es una composición de materia adecuada para administrarse a un ser humano o animal que sea capaz de producir una respuesta inmune específica, por ejemplo, contra un patógeno, tal como CMV. Como tal, una composición inmunogénica incluye uno o más antígenos (por ejemplo, antígenos polipeptídicos) o epítopos antigénicos, tales como, por ejemplo, los polipéptidos gB de CMV de la invención. Una composición inmunogénica también puede incluir uno o más componentes adicionales capaces de producir o mejorar una respuesta inmune, tal como un excipiente, vehículo, y/o auxiliar. En ciertos casos, las composiciones inmunogénicas se administran para producir una respuesta inmune que protege al sujeto contra síntomas o condiciones inducidas por un patógeno. En algunos casos, se evitan (o se reducen o mejoran) los síntomas o la enfermedad causada por un patógeno al inhibir la replicación del patógeno (por ejemplo, CMV) después de la exposición del sujeto al patógeno. En el contexto de la esta descripción, se entenderá que el término composición inmunogénica abarca composiciones que pretende ser para administrarse a un sujeto o población de sujetos con el propósito de producir una respuesta inmune protectora o paliativa contra CMV (es decir, composiciones de vacuna o vacunas). Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención no están limitadas a composiciones que comprenden polipéptidos gB de CMV. La presente invención también contempla composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, que comprenden los polipéptidos gB de CMV de la invención y al menos uno o más antígenos de CMV seleccionados del grupo que consiste de pp65, IE1 , pUL131 , gL, gH, pUL128, pUL130, o cualquier combinación de los mismos. La presente invención también contempla composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, que comprenden los polipéptidos gB de CMV de la invención y al menos uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste de HPV, Chlamydia, RSV, Toxoplasma gondii. Zoster, y Aspergillús.

Numerosos diluyentes y vehículos farmacéuticamente aceptables y/o excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15° Edición (1975). El adjetivo "farmacéuticamente aceptable" indica que el diluyente, o vehículo, o excipiente para administrarse a un sujeto (por ejemplo, un ser humano o animal). En general, la naturaleza del diluyente, vehículo y/o excipiente dependerá del modo particular de administración que se utilice. Por ejemplo, la formulaciones parenterales usualmente incluyen fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, salina fisiológica, soluciones equilibradas de sal, dextrosa acuosa, glicerol o similares, como un vehículo. En ciertas formulaciones (por ejemplo, composiciones sólidas, tales como formas en polvo), no se emplea un diluyente líquido. En dichas formulaciones, se pueden utilizar .vehículos sólidos no tóxicos, incluyendo, por ejemplo, grados farmacéuticos de trehalosa, manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio.

Por consiguiente, los excipientes y vehículos adecuados pueden ser seleccionados por aquellos expertos en la técnica para producir una formulación adecuada para suministrarse a un sujeto a través de una ruta seleccionada de administración. Los excipientes incluyen, sin limitación: glicerol, polietilen glicol (PEG), polioles formadores de vidrio (tales como, sorbitol, trehalosa), N-lauroilsarcosina (por ejemplo, sal de sodio), L-prolina, sulfobetaína no detergente, clorhidrato de guanidina, urea, óxido de trimetilamina, KCI, C2 + , Mg2+, Mn2 + , Zn2+ (y otras sales relacionadas, de catión divalente), ditiotreitol (DTT) , ditioeritrol, ß-mercaptoetanol, detergentes (incluyendo, por ejemplo, Tween80, Tween20, Tritón X-100, NP-40, Empigen BB, Octilglucósido, Lauroil maltósido, Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12, Zwittergent 3-14, Zwittergent 3-16, CHAPS, desoxicolato de sodio, dodecil sulfato de sodio, y bromuro de cetiltrimetilamonio.

En ciertos ejemplos, la composición inmunogénica también incluye un auxiliar. Los auxiliares adecuados para usarse en composiciones inmunogénicas que contienen polipéptidos gB de CMV de la invención son auxiliares que, en combinación con dichos polipéptidos aquí descritos, son seguras y mínimamente reactogénicas cuando se administran a un sujeto.

Un "auxiliar" es un agente que mejora la producción de una respuesta inmune en una forma no específica. Los auxiliares comunes incluyen suspensiones de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) sobre los cuales el antígeno es adsorbido; emulsiones, incluyendo agua en aceite, y aceite en agua (y sus variantes, incluyendo emulsiones dobles y emulsiones reversibles), liposacáridos, lipopolisacáridos, ácidos nucleicos inmunoestimulantes (tales como oligonucleótidos CpG), liposomas, agonistas de Receptor Toll (particularmente, agonistas de TLR2, TLR4, TLR7/8 y TLR9), y varias combinaciones de dichos componentes.

Los auxiliares adecuados para usarse en combinación con los polipéptidos gB de CMV de la invención son saponinas. Por consiguiente, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender la saponina QS21 (WO8809336A1 ; US5057540A). QS21 es bien conocida en la técnica como una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina, la cual incluye células T citotóxicas CD8+ (CTLs), células Th1 y una respuesta de anticuerpo de lgG2a predominante. Para evitar duda la referencia a QS21 incluye OPT-821. En una forma adecuada de la presente invención, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden QS21 en una forma substancialmente pura, es decir, QS21 es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% pura, por ejemplo, al menos 95%, o al menos 98% pura. Las composiciones de la invención pueden comprender QS21 en una cantidad de entre aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 pg, por ejemplo, de entre aproximadamente 1 pg a aproximadamente 60 pg, o de entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 50 pg, por ejemplo, 10 pg, aproximadamente 12.5 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 20 pg, aproximadamente 25 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 40 pg o en particular aproximadamente 50 pg. En particular, QS21 está presente en una cantidad de entre aproximadamente 40 pg y 60 pg o entre 45 y 55 pg o entre 47 y 53 pg o entre 48 y 52 pg o entre 49 y 51 o aproximadamente 50 pg. Alternativamente, QS21 está presente en una cantidad de entre 21 pg y 29 pg o entre aproximadamente 22 pg y aproximadamente 28 pg o entre aproximadamente 23 pg y aproximadamente 27 pg o entre aproximadamente 24 pg y aproximadamente 26 pg, o aproximadamente 25 pg. En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden QS21 en una cantidad de aproximadamente 10 pg, por ejemplo, entre aproximadamente 5 pg y 15 pg, aproximadamente 6 pg y aproximadamente 14 pg, aproximadamente 7 pg y aproximadamente 13 pg, aproximadamente 8 pg y aproximadamente 12 pg o aproximadamente 9 pg y aproximadamente 11 pg, o aproximadamente 10 pg. En otras modalidades más, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden QS21 en una cantidad de aproximadamente 5 pg, por ejemplo, entre aproximadamente 1 pg y 9 pg, aproximadamente 2 pg y aproximadamente 8 pg, aproximadamente 3 pg y aproximadamente 7 pg, aproximadamente 4 pg y aproximadamente 6 pg, o aproximadamente 5 pg. Una cantidad adecuada de QS21 en la dosis para ser humano de las composiciones de la invención es, por ejemplo, de cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 µ?.

Las composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos gB de CMV de la invención pueden comprender QS21 y un esterol, colesterol en particular. Dichas composiciones muestran una reactogenicidad reducida cuando se comparan con composiciones en donde el esterol está ausente, mientras se mantiene el efecto del auxiliar. Los estudios de reactogenicidad pueden ser valorados de acuerdo con los métodos descritos en WO 96/33739. El esterol, de acuerdo con la invención, representa un esterol exógeno, es decir, un esterol, el cual no es endógeno al organismo a partir del cual se puede tomar la preparación de antigeno ß-amiloide. Convenientemente, el esterol exógeno está asociado al auxiliar de saponina como se describe en WO 96/33739. En una modalidad particular, el colesterol está presente en un exceso a aquel de QS21, por ejemplo, la relación de QS21:esterol típicamente será del orden de 1:100 a 1:1 (p/p), convenientemente de entre 1:10 a 1:1 (p/p), y de preferencia de 1:5 a 1:1 (p/p). En particular, la relación de QS21:esterol e,s de al menos 1:2 (p/p). En una modalidad particular, la relación de QS21:esterol es de 1:15 (p/p). Los esteróles adecuados incluyen ß-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una modalidad particular, las composiciones de la invención comprenden colesterol como esterol. Estos esteróles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el colesterol se describe en Merck Index, 11° Edn, página 341, como un esterol de existencia natural encontrado en grasa animal. Por consiguiente, en una modalidad específica, las composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos gB de CMV de la invención, comprenden QS21 en su composición menos reactogénica, en donde se extingue con un esterol exógeno, tal como colesterol, por ejemplo. Existen varias formas particulares de composiciones menos reactogénicas, en donde QS21 se extinguió con un colesterol exógeno. En una modalidad específica, la saponina/esterol está en la forma de una estructura de líposoma (WO 96/337391). De esta manera, por ejemplo, los polipéptidos gB de CMV de la invención convenientemente pueden ser empleados en composiciones inmunogénicas con un auxiliar que comprende una combinación de QS21 y colesterol.

El término "liposoma(s)" generalmente se refiere a estructuras de lípido uni- o multi-laminares (en particular, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 láminas dependiendo del número de membranas de lípido formadas) que encierran un interior acuoso. Los liposomas y formulaciones de liposomas con bien conocidos en la técnica. Los lípidos, los cuales son capaces de formas liposomas, incluyen todas las substancias que tienen propiedades grasas o de tipo graso. Los lípidos que pueden formar los lípidos en los liposomas pueden ser seleccionado del grupo que comprende glicéridos, glicerofosfolípiods, glicerofosfinolí pidos, glicerofofonolí pidos, sulfolípidos, esfingolípidos, fosfolípidos, isoprenoides, esteroides, estearinas, esteróles, arqueolípidos, I í p id os catiónicos sintéticos y lipidos que contiene carbohidrato. Los liposomas convenientemente pueden comprender un fosfolípido. Los fosfolípidos adecuados incluyen (pero no se limitan a): fosfocolina (PC), la cual es un intermediario en la síntesis de fosfatidilcolina; derivados naturales de fosfolípidos: fosfocolina de huevo, fosfocolina de soya, fosfocolina de soya hidrogenada, esfingomielina como fosfolípidos naturales; y derivados sintéticos de fosfolípidos: (didecanoíl-L-a-fosfatidilcolina [DDPC], dilauroilfosfatidilcolina [DLPC], dimiristoilfosfatidilcolina [DMPC], dipalmitoil fosfatidilcolina [DPPC], Distearoil fosfatidilcolina [DSPC], Dioleoil fosfatidilcolina [DOPC], 1-palmitoil, 2-oleoilfosfatidilcolina [POPC], Dielaidoil fosfatidilcolina [DEPC]), fosfoglicerol (1 ,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DMPG], 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DPPG], 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DSPG], 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol [POPG]), ácido fosfatídico ácido (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatídico [DMPA], ácido dipalmitoil fosfatídico [DPPA], ácido diestearoil-fosfatídico [DSPA]), fosfoetanol amina (1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DMPE], 1 ,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DPPE], 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DSPE 1 ,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina [DOPE]), fosfoserina, polietilen glicol [PEG] fosfolípido (mPEG-fosfoíipido, poliglicerin-fosfolípido, fosfolípido funcionalizado, fosfolípido activado terminal). En una modalidad, los liposomas comprenden 1 -palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfoetanolamina. En una modalidad, se utiliza fosfatidilcolina altamente purificada y puede ser seleccionado del grupo que comprende fosfatidilcolina (EGG), fosfatidilcolina hidrogenada (EGG), fosfatidilcolina (SOYA), fosfatidilcolina hidrogenada (SOYA). En otra modalidad, los liposomas comprenden fosfatidiletanolamina [POPE] o un derivado del mismo. El tamaño del liposoma puede variar de 30 nm a varios m dependiendo de la composición de fosfolípido y el método usado para su preparación. En modalidades particulares de la invención, el tamaño del liposoma estará en la escala de 50 nm a 500 nm y en modalidades adicionales de 50 nm a 200 nm. La dispersión de luz láser dinámica es un método usado para medir el tamaño de liposomas bien conocido por aquellos expertos en la técnica. los liposomas de la invención pueden comprender dioleoil fosfatidilcolina [DOPC] y un esterol, en particular, colesterol. De esta manera, en una modalidad particular, las composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos gB de CMV de la invención, tales como polipéptidos gB que tienen un dominio de transmembrana no funcional y al menos uno de los Bucles de Fusión FL1 y FL2 mutado, posiblemente ambos, comprenden QS21 en cualquier cantidad aquí descrita en la forma de un liposoma, en donde dicho liposoma comprende dioleoil fosfatidilcolina [DOPC] y un esterol, en particular, colesterol.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender uno o más ¡nmunoestimulantes adicionales. En una modalidad, las composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos gB de CMV de la invención, como se describe aquí, además comprenden un lipopolisacárido, convenientemente un derivado no tóxico del lípido A, en particular, lípido A de monofosforilo o más particularmente, lípido A de monofosforilo 3-desacilado (3D-MPL). 3D-MPL se vende bajo el nombre de MPL por GlaxoSmithKIine Biologicals N.A., y se denomina a través de la especificación como MPL o 3D-MPL. Ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,436,727; 4,877,611 ; 4,866,034 y 4,912,094. 3D-MPL principalmente promueve respuestas de célula T CD4+ con ün fenotipo IFN-? (Th1). 3D-MPL puede ser producido de acuerdo con los métodos descritos en GB2220211 A. Químicamente es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. En las composiciones de la presente invención se puede utilizar 3D-MPL de partícula pequeña. El 3D-MPL de partícula pequeña tiene un tamaño de partícula de manera que puede ser filtrado de forma estéril a través de un filtro de 0.22 pm. Dichas preparaciones se describen en WO 94/21292.

Las composiciones de la invención pueden comprenden 3D-MPL en una cantidad de entre aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 pg, por ejemplo, de entre aproximadamente 1 pg a aproximadamente 60 pg o de entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 50 pg, por ejemplo, aproximadamente 10 pg, aproximadamente 12 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 20 pg, aproximadamente 25 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 40 pg o en particular aproximadamente 50 pg. En particular, 3D-MPL está presente en una cantidad de entre aproximadamente 40 µg y 60 g o entre 45 y 55 g o entre 47 y 53 pg o entre 48 y 52 pg o entre 49 y 51 o aproximadamente 50 pg. Alternativamente, 3D-MPL está presente en una cantidad de entre 21 pg y 29 pg o entre aproximadamente 22 pg y aproximadamente 28 pg o entre aproximadamente 23 pg y aproximadamente 27 pg o entre aproximadamente 24 pg y aproximadamente 26 pg, o aproximadamente 25 pg.

En otra modalidad, la dosis para ser humano de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 10 pg, por ejemplo, entre 5 y 15 pg, convenientemente entre 6 y 14 pg, por ejemplo, entre 7 y 13 pg o entre 8 y 12 pg o entre 9 y 11 pg, o 10 pg. En una modalidad más, la dosis para ser humano de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 5 pg, por ejemplo, entren 1 y 9 pg, o entre 2 y 8 pg o convenientemente entre 3 y 7 pg o 4 y 6 pg, o 5 pg. Una cantidad adecuada de 3D-MPL en las composiciones de la invención es de, por ejemplo, cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 pg. En otras modalidades, el lipopolisacárido puede ser un disacárido ß 1 -6) glucosamina, como se en la Patente de E.U.A. No. 6,005,099 y la Patente EP No. 0 729 473 B1. Un experto en la técnica fácilmente podría ser capaz de producir varios lipopolisacáridos, tales como 3D-MPL, basándose en las enseñanzas de estas referencias. Además de los inmunoestimulantes antes mencionados (que son similares en estructura a aquella de LPS o MLP o 3D-MPL), los derivados acilados de monosacárido y disacárido que son una sub-porción para la estructura anterior también son auxiliares adecuados. En otras modalidades, el auxiliar es un derivado sintético de lípido A, algunos de los cuales se describen como TLR-4, e incluyen, pero no se limitan a: OM174 (2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono-D-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-h id roxitetradecanoilamino]-D-D-glucopiranosil fosfato diácido), (WO 95/14026) OM 294 DP (3S, 9 R) -3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecánoilamino]decan-1,10-diol, 1,10-bis(fosfato diácido) (WO 99/64301 y WO 00/0462 ) OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-D(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1 -fosfato diácido 10-(6-aminohexanoato) (WO 01/46127).

Las combinaciones de diferentes auxiliares, tales como aquellos mencionados anteriormente, también pueden ser utilizados en las composiciones con polipéptidos gB de CMV. Por ejemplo, como ya se observó, QS21 puede ser formulado junto con 3D-MPL. La relación de QS21 :3D-MPL típicamente estará en el orden de 1:10 a 10:1; tal como 1:5 a 5:1, y por lo regular substancialmente 1:1. Típicamente, la relación está en la escala de 2.5:1 a 1:1 3D-MPL:QS21. Por consiguiente, en algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden al menos QS21 y 3D-MPL.

Las composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos gB de CMV de la invención también pueden ser convenientemente formuladas con una emulsión de aceite en agua. La emulsión de aceite en agua comprende un aceite metabolizable (es decir, biodegradable). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite sintético, el cual es no tóxico para el receptor y es capaz de ser transformado mediante metabolismo. Las nueces, semillas y granos son fuentes comunes de aceites vegetales. Los aceites sintéticos también son adecuados. Por consiguiente, las emulsiones de aceite en agua usadas en combinación con los polipéptidos gB de CMV de la invención comprenden un aceite metabolizable, En una modalidad particular, las emulsiones de aceite en agua comprenden escualeno (por ejemplo, entre aproximadamente 4% y 6% [v/v]). La emulsión de aceite en agua además comprende un agente tensoactivo. Las emulsiones de aceite en agua de la invención comprenden uno o más agentes tensoactivos. Los agentes tensoactivos adecuados son bien conocidos a los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80, Polisorbato 80), triolato de sorbitán (Span 85), fosfatidilcolina (lecitina), polioxietilen (12) cetoestearil éter y octoxinol-9 (Tritón X-100). En una modalidad particular de la invención, las emulsiones de aceite en agua comprenden monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80, Polisorbato 80). En una modalidad adicional, las emulsiones de aceite en agua de la invención comprenden monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80), y un agente tensoactivo adicional, en particular, triolato de sorbitán (Span 85). Las emulsiones de aceite en agua de la invención también pueden comprender un tocol. Los tocóles son bien conocidos en la técnica y se describen en EP0382271. En particular, el tocol es a-tocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa-tocoferol (también conocido como succinato de vitamina E). En una modalidad particular de la invención, se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos gB de CMV de la invención en combinación con una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno (por ejemplo 5% [v/v]) y ct-tocoferol (por ejemplo, aproximadamente 5% [v/v]). En una modalidad particular, la emulsión de aceite en agua comprende un aceite metabolizable (por ejemplo, escualeno), un tocol (por ejemplo, ot-tocoferol) y un agente tensoactivo (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán [Polisorbato 80]). En otra modalidad de la invención, las emulsiones de aceite en agua de la invención comprenden un aceite metabolizable (por ejemplo, escualeno), un agente tensoactivo (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán [Polisorbato 80]), y opcionalmente un segundo agente tensoactivo (por ejemplo, trioleato de sorbitán [Span 85]). En una modalidad más de la invención, las emulsiones de aceite en agua de la invención comprenden un aceite metabolizable (por ejemplo, escualeno), un polioxietilen alquil éter, agente tensoactivo no iónico hidrofílico (por ejemplo, polioxietilen (12) cetoestearil éter) y un agente tensoactivo no iónico hidrofóbico (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán [Polisorbato 80]), o trioleato de sorbitán [Span 85]). En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas que comprende los polipéptidos gB de CMV de la invención, tales como polipéptidos gB que tienen un dominio de transmembrana no funcional y al menos uno de los Bucles de Fusión FL1 y FL2 mutado, posiblemente ambos, comprenden una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol, y Polisorbato 80.

Convenientemente, la emulsión de aceite en agua comprende 11 mg de aceite metabolizable (tal como escualeno) o más bajo, por ejemplo, entre 0.5-1 1 mg, 0.5-10 mg o 0.5-9 mg 1-10 mg, 1-1 1 mg, 2-10 mg, 4-8 mg, o 4.5-5.5 mg, y 5 mg de agente emulsificante (tal como monooleato de polioxietilen sorbitán) o más bajo, por ejemplo, entre 0.1-5 mg, 0.2-5 mg, 0.3-5 mg, 0.4-5 mg, 0.5-4 mg, 1-2 mg o 2-3 mg por dosis de la vacuna. Adecuadamente, el tocol (por ejemplo, alfa-tocoferol), cuando está presente, está en 12 mg o por abajo, por ejemplo entre 0.5-12 mg, 10-1 1 mg, 1 -1 1 mg, 2-10 mg, 4-9 mg, o 5-7 mg por dosis de vacuna para ser humano.

Por el término "dosis de vacuna para ser humano" se refiere a una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano.

Generalmente, está entre 0.25 y 1.5 mi. En una modalidad, una dosis para ser humano es de 0.5 mi. En una modalidad más, una dosis para ser humano es mayor que 0.5 mi, por ejemplo, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o 1 mi. En otra modalidad, en particular cuando la composición inmunogénica es para la población pediátrica, una dosis para ser humano puede ser menor que 0.5 mi tal como entre 0.25 y 0.5 mi.

Una composición inmunogénica típicamente contiene una cantidad inmunoprotectora (o una dosis fraccional del mismo) del antígeno y se puede preparar a través de técnicas convencionales. La preparación de composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, incluyendo aquellas para administración a seres humanos, generalmente se describen en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, editado por Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al. , University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S. A. 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, Patente de E.U.A. 4,235,877. La conjugación de proteínas se describe, por ejemplo, por la Patente de E.U.A. 4,372,945 y por Armor et al., Patente de E.U.A.. 4,474,757. Típicamente, la cantidad de proteína en cada dosis de la composición inmunogénica se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos laterales adversos, importantes en el sujeto típico. La inmunoprotección, en este contexto, no necesariamente significa una completa protección contra la infección; significa protección contra síntomas o la enfermedad, especialmente una enfermedad severa asociada con el virus. La cantidad de antígeno puede variar dependiendo de cual inmunógeno especifico es empleado. En general, se espera que cada dosis para ser humano comprenderá 1-1000 pg de proteína, tal como de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 10 pg, por ejemplo, de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 50 pg, tal como aproximadamente 1 pg, aproximadamente 2 pg, aproximadamente 5 µg, aproximadamente 10 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 20 pg, aproximadamente 25 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 40 pg, o aproximadamente 50 pg. La cantidad utilizada en una composición inmunogénica se selecciona con base en la población de sujeto (por ejemplo, bebés o adultos mayores). Una cantidad óptima para una composición particular puede ser determinada a raves de estudios estándares que involucran la observación de titulaciones de anticuerpo y otras respuestas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un refuerzo en aproximadamente 4 semanas.

A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado como el comúnmente entendido por un experto en la técnica a cual pertenece esta descripción. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamín Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd; 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. eyers (ed.). Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8).

Los términos "un", "una", "uno", y "el", "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Además se debe entender que todos los tamaños de base o tamaños de aminoácido, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximaciones y se proporcionan para descripción. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Además se debe entender que todos los tamaños de base o tamaños de aminoácido, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos, son aproximaciones, y se proporcionan para descripción. Además, las limitaciones numéricas dadas con respecto a concentraciones o niveles de una substancia, tal como un antígeno, pretenden ser aproximaciones. De esta manera, cuando una concentración es indicado como al menos (por ejemplo) 200 pg, se pretende que la concentración se entienda que sea al menos aproximadamente (o "alrededor de" o "~") 200 pg.

Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos en la práctica o prueba de esta descripción, más adelante se describen métodos y materiales adecuados. El término "comprende" significa "incluye". De esta manera, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprender" y "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un compuesto o composición establecido (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido, antígeno) o paso, o grupo de compuestos o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro compuesto, composición, pasos, o grupo del mismo. La abreviatura, "e.g.", se deriva del latín exempli gratia, y se utiliza aquí para indicar un ejemplo no limitante. De esta forma, la abreviatura "e.g." es sinónima con el término "por ejemplo".

Las siguientes modalidades se contemplan en la presente invención: a) Un polipéptido gB de citomegalovirus (CMV) que comprende, en una orientación N-terminal a C-terminal; al menos una porción de un dominio extracelular que comprende un dominio de bucle de fusión 1 (FL1) y un dominio de bucle de fusión 2 (FL2), opcionalmente al menos una porción de un dominio de transmembrana ™, y al menos una porción de un dominio citoplásmico, en donde al menos un aminoácido del dominio FL1 está substituido o eliminado, y en donde el dominio T o porción del mismo, si está presente, es no funcional. b) El polipéptido gB de CMV de la modalidad a), en donde el domino TM se hace no funcional al eliminar los aminoácidos en la posición 701-775 son relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros pol ipéptidos gB de CMV.

El polipéptido gB de CMV de la modalidad a) o b), que además comprende al menos una substitución de aminoácido, o eliminación, en el dominio de bucle de fusión FL2.

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a c), que además comprende al menos la eliminación de una región de aminoácido hidrofobica en el dominio citoplásmico del polipéptido.

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a d), en donde la substitución de aminoácido en el dominio de bucle de fusión FL1 consiste de la substitución de al menos un aminoácido entre Y.I.Y según localizado en la posición 155-157 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, con un aminoácido polar, el cual no es aromático. El polipéptido gB de CMV de la modalidad e), en donde la substitución consiste de la substitución de al menos dos aminoácidos entre Y.I.Y según localizado en la posición 155-157 con relación a la secuencia como se establece en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, con una aminoácido polar, el cual no es un aromático.

El polipéptido gB de CMV de la modalidad e) o f), en donde el aminoácido polar se selecciona del grupo de aminoácidos positivamente cargados consistiendo de Usina (k), histidina (H) y arginina (R).

El polipéptido gB de CMV de la modalidad g), en donde la isoleucina (I) ubicada en la posición 156 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una histidina (H).

El polipéptido gB de CMV de la modalidad g) o modalidad h), en donde la tirosina (Y) ubicada en la posición 157 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una arginina (R).

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades e) a i), en donde la tirosina (Y) ubicada en la posición 155 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una glicina (G).

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a d), en donde los aminoácidos Y.I.Y según ubicados en la posición 155-157 en el dominio de bucle de fusión FL1 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, están substituidos con aminoácidos G.H.R, respectivamente.

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a d), en donde el estiramiento de aminoácidos Y.I.Y según ubicado en la posición 155-157 en el dominio de bucle de fusión FL1 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, teniendo una clasificación de hidrofobicidad de + 1.9, según medido a través de la escala de Kyte y Doolittle, está substituido con un estiramiento de tres aminoácidos teniendo una clasificación de hidrofobicidad menor que -3, menor que -7, menor que -8, según medido a través de la escala de Kyte y Doolittle.

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades c) a I), en donde la substitución de aminoácido en el dominio de bucle de fusión FL2 consiste de la substitución de al menos un aminoácidos entre W.L.Y según ubicado en la posición 240-242 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, con un aminoácido positivamente cargado seleccionado del grupo que consiste de lisina (K), histidina (H), y arginina (R).

El polipéptido gB de CMV de la modalidad m), en donde el aminoácido entre W.L.Y según ubicado en la posición 240-242 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituido con una histidina (H).

El polipéptido gB de CMV de la modalidad m) o n), en donde al menos la tirosina (Y) ubicada en la posición 242 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una histidina (H).

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades c) a n), en donde los aminoácidos W.L.Y según ubicados en la posición 240-242 en el dominio de bucle de fusión FL2 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, están substituidos con los aminoácidos A.F.H, respectivamente. El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades d) a p), en donde la eliminación en el dominio citoplásmico corresponde a la región de aminoácidos 825 a 877 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1.

El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a q), en donde dicho polipéptido es mutado en un sitio endoproteolítico.

El polipéptido gB de CMV de la modalidad r), en donde se realiza al menos una de las substituciones de aminoácido, que se selecciona del grupo que consiste de: R456 substituido con T456, R458 substituido con Q458, y R459 substituido con T459, con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV. t) El polipéptido gB de CMV de la modalidad s), en donde R 56 p458 y R459 con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, están substituidos con T456, Q458, y T459, respectivamente. u) El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a t), en donde la arginina (R357) con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1 está substituida con una serina (S 357). v) El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a u), en donde la arginina (R50) con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1 está substituida con una serina (S50). w) El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a v), en donde la cisteína (C778) con relación a la secuencia establecida en SEC ID NO: 1 está substituida con una alanina (A778). x) El polipéptido gB de CMV de la secuencia establecida en SEC ID NO: 3. y) El polipéptido gB de CMV de la secuencia establecida en SEC ID NO: 4. z) El polipéptido gB de CMV de la secuencia establecida en SEC ID NO: 5. aa) Una preparación que comprende un polipéptido gB de CMV, en donde más del 50% de dicho polipéptido está en una forma trimérica, según medido a través de AUC (Ultracentrifugación Analítica), bb) Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a z) mezclado con una vehículo farmacéutico adecuado. ce) La composición inmunogénica de la modalidad bb), que además comprende un auxiliar, dd) Un polinucleótido que codifica al polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a)-z). ee) Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de la modalidad dd). ff) Una célula huésped transformada con el vector recombinante de la modalidad ee). gg) El polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a z), para usarse en la prevención y/o tratamiento de una infección por CMV. hh) Uso del polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a z), en la preparación de un medicamento para evitar y/o tratar una infección por CMV. ¡i) Un método para producir una respuesta inmune contra CMV, que comprende el paso de administrar a un sujeto una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende el polipéptido gB de CMV de cualquiera de las modalidades a) a z).

La invención además será descrita haciendo referencia los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Polipéptidos gB de CMV Todas las variantes del polipéptido gB (ver Figura 1 y Figura 2 para una representación esquemática), designados a continuación, se originan de la secuencia de aminoácido de gB de la cepa de CMV, AD169. Por consiguiente, la numeración de aminoácidos cuando se especifica la posición de las mutaciones es relativa a la secuencia de gB de CMV, AD169, establecida en SEC ID NO: 1. También, además de las mutaciones específicas que cada una contiene como se describe más adelante, las siguientes construcciones son (i) todas eliminadas del dominio de transmembrana (eliminación de aminoácidos 701 a 775), y (ii) todas comprenden las siguientes mutaciones de punto: aminoácidos R50 y R357 substituidos con el aminoácido S.

Aunque las variantes, que se presentan más adelante, comprenden una etiqueta histidina en el extremo C-terminal del polipéptido para transfección pasajera, la secuencia de dicha etiqueta no está incluida en la SEC ID descrita ahí. 1.1 qB-SLP12 La variante gB-SLP12 comprende 2 series de mutaciones de punto apuntando a los bucles de fusión putativos de gB, FL1 y FL2, respectivamente. FL1 fue mutado al substituir los aminoácidos ? 55? | ?? 57 con |os amjnoác¡dos 155G . H . R 157 , mientras que FL2 fue mutado al substituir los aminoácidos 240W. L. Y242 con los aminoácidos 2 0A.F.H 242. Esta construcción codifica para una proteína de longitud de 830 aminoácidos. La secuencia completa de aminoácido de gB-SLP12 se proporciona en SEC ID NO: 3. 1.1.1 Construcción del vector de expresión. pMax-AD169-gB-SLP12 La secuencia de gen de gB-SLPÍ2 (SEC ID NO: 6) se sintetizó a través de la compañía GeneArt. La secuencia de codificación fue de codón optimizado para expresión en células CHO. Se introdujeron sitios de restricción, Hindlll y BamHI, en el extremo 5' (en frente del codón de inicio) y el extremo 3' (justo después del codón de terminación), respectivamente. La secuencia de gen de codón optimizado lleva mutaciones tanto en el primer bucle de fusión putativa (155Y.I.Y157 reemplazado con 155G.H.R157) como en el segundo bucle de fusión putativa (2 0W. L. Y242 reemplazado con 240A.F.H 242). El fragmento de ADN sintético fue recibido como un inserto de ADN con una longitud de 2558 bp clonado en el vector pMA (plásmido propietario GeneArt) utilizando los sitios de clonación Kpnl y Sacl, generando el plásmido AD169-gB-SLP12-pMA. El plásmido AD169-gB-SLP12-pMA fue restringido con Hindlll y BamHI. El fragmento de ADN de 2530 bp conteniendo el gen gB-SLP12 fue purificado con gel y se ligó al vector de expresión de mamífero, pMax, una versión modificada del vector pMaxCloning de Amaxa. La estructura de base del vector pMaxCloning ha sido modificada con el fin de eliminar un codón de inicio, ATG, presente en múltiples sitios de clonación del vector comercial de Amaxa (entre Kpnl y Hindlll). Después de la verificación de secuencia a través de secuenciación automática de ADN, se utilizó el plásmido recombinante, pMax-AD169-gB-SLP12, para transfectar pasajeramente células CHO-S. 1.2 gB-SLP12-Del2 La eliminación de una región hidrofóbica que abarca los aminoácidos Pro825 a Lys877 se introdujo en la variante gB-SLP12, generando la variante gB-SLP12-Del2. Esta construcción codifica para una proteína con una longitud de 777 aminoácidos. La secuencia de aminoácido completa de la variante gB-SLP12-Del2 se da en SEC ID NO: 4. La secuencia de nucleótido que codifica para gB-SLP12-Del2 se muestra en SEC ID NO: 8. 1.2.1 Construcción del vector de expresión, p ax-AD169-qB-SLP12-Del2 Un fragmento de ADN de 2159 bp abarcando los sitios de restricción únicos, Hindlll y Clal, presente en la secuencia de codificación AD169-gB-SLP12, se amplificó a través de PCR, utilizando el plásmido AD169-gB-SLP12-pMA, como una plantilla y los iniciadores SLP-Fw (SEC ID NO: . 22) (5'-GAAAGCGGGCAGTGAGCGGAAGGC-3') y SLP-Rv (SEC ID NO: 23) (S'-TGTCCTCCACGTACTTCACGCGCTGC-S ). La parte C-terminal del gen AD169-gB-SLP12Del2, también se amplificó mediante PCR como un fragmento de 745 bp abarcando los sitios de restricción Clal y Sacl, utilizando el vector Del2-pMA como plantilla y los iniciadores Del-Fw (SEC ID NO: 24) (5'-CCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCA-3') y Del-Rv (SEC ID NO: 25) (5'- CCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3'). El vector Del2-pMA, el lleva un fragmento de ADN sintético que codifica para la parte del término C del gen gB-SLP12-Del2, se construyó por la compañía GeneArt. Después de la restricción con las enzimas apropiadas, los fragmentos de PCR fueron clonados en el vector pMax restringido con Hindlll y Sacl. Después de la verificación de secuencia a través de secuenciación automática de ADN, se utilizó el plásmido recombinante pMax-AD169-gB-SLP12 para transfectar pasajeramente células CHO-S. 1.3 gB-SLP1-Del2 La eliminación de una región hidrofóbica abarcando los aminoácidos Pro825 a Lys 877 fue introducida en la variante gB-SLP1, generando la variante gB-SLP1 -Del2. Esta variante codifica una proteina con una longitud de 777 aminoácidos. La secuencia de aminoácido completa de gB-SLP1-Del2 se da en SEC ID NO: 5. 1.3.1 Construcción del vector de expresión pMax-AD169-gB-SLP1-Del2 El gen gB-SLP1 primero se sintetizó mediante GeneArt. La secuencia de gen de codón optimizado lleva mutaciones en el primer bucle de fusión putativo ( 55Y.I.Y157 reemplazado con 55G.H.R157). Este gen sintético se recibió como un fragmento de ADN de 2558 bp, se clonó en el vector pMA utilizando los sitios de clonación Kpnl y SacI, generando el plásmido AD169-gB-SLP1 -pMA. El vector de expresión pMax-AD 169-gB-SLP 1 -Del2 se construyó a partir de AD169-gB-SLP1-pMA y el vector plásmido Del2-pMA. El vector pMA-gB-SLP1 fue restringido con Hindlll y Clal, y el fragmento de ADN de 1964 bp que codifica para la parte N-terminal de la proteína SLP1-Del-2 se aisló a través de purificación de gel. El vector plásmido Del2-pMA fue digerido con Clal y SacI, y el fragmento de ADN de 420 bp que codifica para la parte C-terminal de la proteína gB-SLP1-Del2 se aisló a través de purificación de gel. Estos dos fragmentos se ligaron conjuntamente al vector de expresión, pMax, restringido con Hindlll y SacI, generando el vector de expresión final, pMax-AD169-gB-SLP1-Del2. Después de la verificación de secuencia a través de secuenciación automática de ADN, se utilizó el plásmido recombinante, pMax-AD169-gB-SLP1-Del2 para transfectar pasajeramente células CHO-S. La secuencia de nucleótido que codifica para gB-SLP1-Del2 se muestra en SEC ID NO: 7. 1.4 QB-SLP12-Delta113 La eliminación de la parte C-terminal del dominio citoplásmico, empezando en el aminoácido 793 se realizó en la variante gB-SLP12-Delta113, así como la eliminación de los aminoácidos 701-775 del dominio de transmembrana. Esta variante codifica para una proteína con una longitud de 717 aminoácidos. La secuencia de aminoácido completa de gB-SLP12-Delta113 se da en SEC ID NO: 12. 1.4.1 Construcción del vector pTT5-gB-SLP12-Delta113 La estrategia usada para construir el vector de expresión pTT5-gB-SLP-Delta 113 es como sigue. Primero, el vector pMax-AD169-gB-SLP12 (ver sección 1.1.1) fue restringido con Hindlll y Clal. El fragmento de gB de 1970 bp, que corresponde a la parte N-termínal de la construcción gB-SLP12-Delta113, se aisló a través de purificación de gel. El extremo C-terminal de la construcción gB-SLP12-Delta113 abarcando los sitios Clal y BamHI (justo después del codón de terminación), se sintetizó mediante GeneArt y se recibió como un inserto de ADN con una longitud de 230 bp (nombrado nuevo-2) clonado en el vector pMA (plásmido propietario de GeneArt). El vector nuevo-2-??? se restringió con Clal y BamHI y el inserto de 230 bp se purificó mediante gel. Los dos fragmentos de ADN purificados con gel se ligaron conjuntamente en el vector de expresión pMax previamente restringido con Hindlll y BamHI, generando el plásmido p ax-AD169-gB-SLP12-Delta113. Después, las serinas en la posición 50 y 357 de la construcción AD169-gB-SLP12-Delta 113 ambas fueron invertidas a la arginina nativa, utilizando el equipo "QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis" de Stratagene (No. 200513). El plásmido resultante, después de la verificación de secuencia, fue digerido con enzimas de restricción Hindlll y BamHI. El fragmento gB de 2200 bp fue purificado con gel y se ligó en el vector pTT5 (NCR, Canadá) previamente restringido con Hindlll y BamHI, generando el vector de expresión final pTT5-gB-SLP12-Delta113. Este vector se utilizó para transfectar pasajeramente células CHO-S. La secuencia de nucleótido que codifica para gB-SLP12-Delta113 se muestra en SEC ID NO: 11. 1.5 qB-SLP12-Delta113 La eliminación de la parte del dominio de transmembrana, empezando en el aminoácido 725, y del dominio citoplásmico entero se realizó en gB-SLP12-Delta725. Esta variante codifica para una proteína con una longitud de 724 aminoácidos. La secuencia completa de aminoácido de la variante gB-SLP12-Delta725 se da en SEC ID NO: 10. 1.5.1 Construcción del vector de expresión pTT5-gB-SLP12-Delta725 Primero, la serina en la posición 50 y 357 de la construcción gB-SLP12-Del2 (ver sección 1.2) se invirtió a la arginina nativa, utilizando el equipo "QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis" de Stratagene (No. 200513). El plásmido resultante, después de la verificación de secuencia, fue digerido con enzimas de restricción Hindlll y Clal, y el fragmento de gB de 1970 bp resultante se asiló a través de purificación de gel. También se generó un fragmento de PCR abarcando los sitios de restricción, Clal y BamHI (SEC ID NO: 26) y comprendiendo la siguiente secuencia: A TCGA 7OCCCTGGAGAACACCGACTTCAGGGTGCTGGAGCTGTACTCC CAGAAGGAACTGAGGTCCAGCAACGTGTTCGACCTGGAGGAAATCAT GAGAGAGTTCAACAGCTACAAGCAGCGCGTGAAGTACGTGGAGG ACA AGGTGGTGGACCCCCTGC CCCCCTACCT GAAGGGCCTGGACGACCTGATGAGCGGACTCGGGGCTGCTGGAAAG GCCTGAGG/4 TCC. El fragmento Hindlll-Clal de 1970 bp y el ADN de PCR restringido con Clal y BamHI fueron ligados conjuntamente en el vector pTT5 (NCR, Canadá), entre los sitios de clonación Hindlll y BamHI con el fin de generar el vector de expresión final, pTT5-gB-SLP12-Delta725. Después de la verificación de secuencia a través de secuenciación automática de ADN, el plásmido recombinante, pTT5-gB-SLP12-Delta725, se utilizó para transfectar pasajeramente células CHO-S. La secuencia de nucleótido que codifica para gB-SLP12-Delta725 se muestra en SEC ID NO: 9. 1.6 qB-SLP12-Delta725-LVL759 Esta variante codifica para una proteína con una longitud de 683 aminoácidos. La secuencia de aminoácido completa de gB- SLP12-Delta725-LVL759 se da en SEC ID NO: 14. 1.6 Construcción del vector de expresión pTT5-AD169-Delta725-LVL759 El plásmido pTT5-gB-SLP12-Delta725-RR-l Íder2 fue mutado utilizando el equipo QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis de Stratagene (No. 200522) y el iniciador CAN1498 5'-gtgcatcgtgtgcctgggatccgaggccgtgagccacagg-3' y CAN 1499 5'-cctgtggctcacggcctcggatcccaggcacacgatgcac-3' dando como resultado el plásmido intermediario, pTT5-694-13. Este plásmido intermediario fue mutado utilizando el mismo equipo QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis y el iniciador CAN1650 5'-gtgaacctgtgcatcgtgtgcctggccctggccagccaccgggccaacgagacaa-3' y CAN1651 5'-ttgtctcgttggcccggtggctggccagggccaggcacacgatgcacaggttcac-3' dando como resultado el vector de expresión final, pTT5-gB-SLP12-725-LVL759. La secuencia de nucleótido que codifica para gB-SLP12-Delta725-LVL759 se muestra en SEC ID NO: 13. 1.7 qB-SLP12-Delta725-LVL776 Esta variante codifica para una proteína con una longitud de 683 aminoácidos. La secuencia de aminoácido completa de la variante gB-SLP12-Delta725-LVL776 se da en SEC ID NO: 16. 1.7 Construcción del vector de expresión pTT5-AD169-Delta725- LVL776 El plásmido intermediarlo anterior, pTT5-694-13, fue mutado utilizando el mismo equipo QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis y los iniciadores CAN1648 5'-cctgtgcatcgtgtgcctgggagccctggccagccaccgggccaacgagacaatc-3' y CAN1649 5'-gattgtctcgttggcccggtggctggccagggctcccaggcacacgatgcacagg-3' dando como resultado un plásmido intermediario adicional, pTT5-LVL758-1. Esta plásmido intermediario fue mutado utilizando el mismo equipo QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis y los iniciadores CAN1697 5'-tggtgtgcgtgaacctgtgcatcgtgctcctgggagccctggcccaccgggccaacgagacaat ctac-3' y CAN1698 5'-gtagattgtctcgttggcccggtgggccagggctcccaggagcacgatgcacaggttcacgcac acca-3' dando como resultado el vector de expresión fina pTT5-gB-SLP12-Delta725-LVL776. La secuencia de nucleótido que codifica para gB-SLP12-Delta725-LVL759 se muestra en SEC ID NO: 15. 1.8 B-SLP12-Delta725-CD33 La variante, gB-SLP12-Delta725-CD33, codifica para una proteína con una longitud de 677 aminoácidos. Esta construcción es casi idéntica a la construcción gB-SLP12-Delta725, excepto que la parte N-terminal del gen gB, que abarca los nucleótidos 1 a 192 (la secuencia de señal y los primeros 64 aminoácidos de la proteína gB madura), fueron reemplazados con la secuencia de señal de CD33 (Taylor et al. 1999, Vol. 274, No. 17: p 11505-11512). La secuencia de aminoácido completa de la variante gB-SLP12Delta725-CD33 se da en SEC ID NO: 18. 1.8.1 Construcción del vector de expresión pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33 El gen, gB-SLP12-Delta725-CD33, se construyó a través de amplificación de PCR utilizando el plásmido pTT5-gB-SLP12-Delta725 como una plantilla y los iniciadores CD33 (SEC ID NO: 27) (5*-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTGCTT CTGCTGCCCCTGCTTTGGGCAGGGGCCCTGGCCCACCGGGGCAACG-3') y CM0578 (SEC ID NO: 28) (5'- GTAATAGGATCCGGTACCTCATCAGGCCTTTCCAGCAG-3'). El iniciador hacia adelante contiene el sitio Hindlll y la secuencia de señal CD33. El iniciador reverso contiene el codón de terminación y el sitio BamHI. Después de la restricción con las enzimas apropiadas, el fragmento de PCR fue clonado en el vector pEE14 restringido con Hindlll y Bglll. El plásmido recombinante pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33 fue seleccionado después de la verificación de secuencia. Finalmente, el gen gB-SLP12-Delta725-CD33 fue sub-clonado en el vector pTT5 como sigue. La secuencia de codificación fue amplificada por PCR utilizando el vector pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33 como una plantilla y los iniciadores CD33F (SEC ID NO: 29) (5'-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCC TGCTG-3') y Ecto-Rv (SEC ID NO: 30) (5'-GACTTATAGGATCCTCATCAGTGGTGGTGATGATGGTGGCCGCCGGC CTTTCCAGCAGC-3'). Los iniciadores hacia adelante y reverso contienen los sitios de clonación HindIII y BamHI, respectivamente. El ADN amplificado y el vector pTT5 fueron restringidos con HindIII y BamHI, antes de la ligación. El vector de expresión pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33 resultante, después de la verificación de secuencia, se utilizó para transfectar pasajeramente células CHO-S. La secuencia de nucleótido que codifica para g B-SLP 12-Delta725-CD33 se muestra en SEC ID NO: 17.

Ejemplo 2: Expresión de polipéptidos qB de CMV Las diferentes construcciones de ADN descritas anteriormente fueron pasajeramente transfectadas en células CHO (Ovario de Hámster Chino), utilizando el sistema de expresión FreeStyle™ MAX CHO de Invitrogen. La construcción que codifica el polipéptido gB-DeltaTM se utilizó como un control. La secuencia de aminoácido de gB-DeltaTM se muestra en SEC ID NO: 2. El vector de expresión usado para la expresión de gB-DeltaTM fue pMax-AD169. El sistema FreeStyle™ MAX CHO utiliza la línea de célula CHO-S, un sub-clon separado de la línea de célula CHO-K1 común se adaptó a suspensión y un polímero a base de lípido catiónico sintético como reactivo de transfección. El ADN de plásmido para transfección se aisló utilizando el equipo Qiagen Maxiprep (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. El complejo de transfección se preparó como se recomendó por Invitrogen. En resumen, 37.5 g de plásmido y 37.5 µ? de reactivo de transfección FreeStyle MAX se diluyeron en forma separada en 0.6 mi de un medio Opti-Pro™. Justo después, el reactivo de transfección FreeStyle MAX diluido se agregó a la solución de ADN diluido. La mezcla de ADN-FreeSty le MAX se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de agregarse al cultivo de célula. Los cultivos transfectados se incubaron a 37°C durante 3 días. Después, los cultivos se mantuvieron a 29°C durante un período de otros 3 días. En el día 6 después de la transfección, se recolectó 1 mi de cada cultivo de célula comprendiendo las células transfectadas en suspensión así como el medio de cultivo de célula. Los sobrenadantes de cultivo de célula se separaron de las células suspendidas a través de centrifugación a 12,000 g. Los sobrenadantes se recolectaron y las pellas celulares se solubilizaron con 1 mi de regulador de pH de lísis (PBS suplementado con 1% Tritón X-100). El material ¡nsoluble se removió de los lisados de célula a través de centrifugación a 12,000 g a 4°C durante 5 minutos. Las alícuotas (15 µ?) de los sobrenadantes de cultivo y fracciones celulares solubílizadas se corrieron en gel Criterion XT 4-12% Bis Tris (Board) utilizando un regulador de pH MOPS. Las proteínas fueron transfectadas a membranas de nitrocelulosa y las membranas se sondearon con el anticuerpo anti-gB, MAb 27-156 (Spaete et al., 1990). Alternativamente, la expresión y el nivel de secreción fueron detectados a través del análisis Elisa utilizando un anticuerpo anti- gB. El ensayo se realizó en placas de 96 cavidades. Las placas se recubrieron con un anticuerpos anti-gB policlonal (el anticuerpo se produjo al inyectar el polipéptido gB + + -descrito en EP0759995- e n conejos). Después de un paso de saturación en 3% de leche descremada durante 1 hora a 37°C, el anticuerpo se incubó durante la noche a 4°C. Las cavidades después se lavaron 4 veces. Una serie de diez diluciones dobles de cada muestra a ser probada (sobrenadante y fracciones celulares transfectadas con construcciones de gB dadas) se agregó a las placas recubiertas en presencia de un anticuerpo anti-gB monoclonal (el anticuerpo se produjo inyectando ratones con un virus entero de CMV), el cual se conjugó con biotina durante 2 horas a 37°C. Después de 4 lavados con PBS/Tween 20 0.1%, se agregaron 100 µ? de estreptavidina-peroxidasa de rábano y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Las placas se lavaron 4 veces con PBS/Tween 20 0.1% y una vez con agua. Después, las placas se incubaron durante 10 minutos a 37°C con 100 µ? de tetra-metil-bencidina 75% (TMB) en 0.1 M de regulador de pH de citrato, pH 5.8 (25%). Esta reacción se detuvo con 100 pl de H2S0 0.4N y se leyó la colorimetría en un espectrofotómetro a 450/620 nm. Un lote previo de gB-DeltaTM purificado cuya concentración es conocida, se utilizó como un estándar en este experimento. Al utilizar el software SoftMax Pro, la concentración de cada muestra a ser probada se cuantificó. 2.1 Expresión y secreción de gB-SLP12, gB-SLP1 -Del2 y gB- SLP12-Del2 - análisis de tinción Western En la Figura 3 se muestra una tinción Western representativa de tres experimentos realizados independientemente. Los carriles A, B, C y D representan las fracciones celulares de los cultivos transfectados con gB-DeltaTM, gB-SLP12, gB-SLP1-Del2 y gB-SLP12-Del2, respectivamente. El nivel de gB presente en dichas fracciones celulares es indicativo del nivel de gB que es intracelular. Los carriles E, F G y H representan los sobrenadantes de los cultivos transfectados con gB-DeltaTM, gB-SLP12, gB-SLP1-Del2 y gB-SLP12-Del2, respectivamente. El nivel de gB presente en dichos sobrenadantes es indicativo del nivel de gB, el cual es secretado. Si se compara el nivel de gB presente en los carriles B, C y D con el nivel de gB presente en el carril A, se observa que el nivel de gB intracelular permanece sin cambio cuando se mutan los bucles de fusión, es decir, los polipéptidos de la invención, según comparado con gB-DeltaTM con bucles de fusión intactos, es decir, el polipéptido de la técnica anterior, sugiriendo que las mutaciones en los bucles de fusión no afectan la secreción. En realidad, si se compara el nivel de gB presente en los carriles F, G, y H con el nivel de gB presente en el carril E, se observa que la expresión de los polipéptidos gB de la invención (con bucles de fusión mutados) y su secreción son al menos tan eficientes como la expresión y secreción del polipéptido gB de la técnica anterior (gB-DeltaTM con bucles de fusión intactos). 2.2 Expresión y secreción de gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113 v gB-SLP12-Delta725 - ensayo de Elisa La cuantificación de los resultados a través del ensayo de ELISA y representada en la forma de una gráfica se muestra en la Figura 4. Las barras en negro representan las fracciones celulares de cultivos transfectados con gB-DeltaTM, gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113 y gB-Delta725, respectivamente, mientras que las barras en gris representan los sobrenadantes de los mismos cultivos. Por consiguiente, la suma de la barra gris y de la barra negra por variante expresada representa el nivel de expresión total logrado después de la transfección en células CHO. Con respecto a gB-DeltaTM, se observó que dentro de la población del polipéptido expresado, alrededor de la mitad del polipéptido se retiene intracelularmente (barra gris) y alrededor de la mitad del polipéptido es secretado (barra negra). Sorprendentemente, cuando se expresa gB-SLP12, se observó que el nivel de expresión total fue significativamente más alto que para gB-DeltaTM, alrededor de 2 veces. Además, si se compara el nivel respectivo de la forma intracelular y la forma secretada, se observó que más del 80% del polipéptido fue secretado, mientras que solo un 10-20% permaneció intracelular, sugiriendo que gB-SLP12 también fue más eficientemente secretado que gB-DeltaTM. Esto sugiere que la mutación de los bucles de fusión tiene un impacto positivo sobre la expresión y secreción. Similarmente se observó el nivel más alto de expresión y de secreción sobre gB-DeltaTM con los polipéptidos gB- SLP12-Delta 113 y gB-SLP12-Delta725. Sin embargo, sorprendentemente, los dos polipéptidos fueron aún más significativamente expresados que gB-SLP12, más de 2 veces y alrededor de 1.6 veces, respectivamente, sugiriendo que la combinación de la eliminación de al menos parte del dominio citoplásmico con la mutación de bucle de fusión además mejora la expresión, y de esta manera, el rendimiento final de los polipéptidos secretados resultantes. 2.3 Expresión v secreción de gB-SLP12. gB-SLP12-Delta113. gB-SLP12-Delta725. gB-SLP12 - Papel de los bucles de fusión En la Figura 5 se muestran tinciones Western. La Figura 5A muestra que gB-SLP12 fue secretado al menos tan eficientemente como gB-SLP12-Delta725, ambos mostrando un nivel de secreción mayor que g B-DeltaTM (comparar carriles F y J con el carril B), confirmando los resultados observados por el ensayo de Elisa. Los carriles M y N representan las fracciones celulares y el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725 teniendo bucles de fusión intactos FL1 y FL2. La ausencia de detección de gB en el sobrenadante de cultivo (ver carril N) sugiere que el buen nivel de expresión/secreción de gB requiere que los bucles de fusión sean mutados. Se hizo una observación similar en la Figura 5B, en donde no se detectó nada de gB en el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-Delta725 teniendo bucles de fusión, FL1 y FL2, intactos, según comparado con el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725 (comparar carriles 6 y 2, respectivamente). El requerimiento de la mutación de los bucles de fusión FL1 y FL2 para lograr una mejor secreción que gB-DeltaTM fue similarmente observado para los polipéptidos gB-SLP12-Delta113. gB fue escasamente detectable en el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta113 teniendo bucles de fusión FL1 y FL2 intactos, según comparado con el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta113 (comparar carriles 6' y 4', respectivamente). 2.4 Expresión y secreción de gB-SLP12-Delta725. gB-SLP12-Delta725-LVL759, y gB-SLP12-Delta725-LVL776 En la Figura 5C se muestra una tinción Western. El nivel de gB presente en el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725-LVL759 es al menos tan bueno como el nivel de gB presente en el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725 (comparar carriles f y h con los carriles b y d, respectivamente). El nivel de gB presente en el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725-LVL776 es solo ligeramente más bajo que el nivel de gB presente en el sobrenadante de un cultivo transfectado con gB-SLP12-Delta725 (comparar carriles j y I con los carriles b y d, respectivamente). Estos resultados indican que la mutación en la parte N-terminal en los polipéptidos (ver Figura 2) de la invención no impacta significativamente el nivel de secreción de dichos polipéptidos.

Ejemplo 3: Perfil de producto de polipéptidos gB de CMV Se expresaron pasajeramente gB-DeltaTM, gB-SLP12 y gB-SLP1-Del2 en células CHO como se describió en el Ejemplo 2, y los sobrenadantes de cultivo se recogieron en el día 6 después de la transfección . Después de la clarificación, los sobrenadantes se suplementaron con 350 mM NaCI y 0.4% Empigen y después se filtraron a través de 0.22 µ??. Se utilizaron columnas de níquel para purificar los polipéptidos transfectados y secretados de los sobrenadantes de cultivo de célula correspondientes. Se equilibraron 16 columnas XK (Qiagen) con un regulador de pH comprendiendo 10 mM TRIS-HCI, 350 mM NaCI, 10 mM imidazol y 0.4% Empigen pH 8.0. Los sobrenadantes de cultivo de célula, previamente clarificados, suplementados y filtrados, se cargaron a una. velocidad de flujo de 4 ml/minuto y las proteínas retenidas se lavaron con el regulador de pH de equilibrio. La elución se realizó a una velocidad de flujo de 4 ml/minuto con un regulador de pH comprendiendo 10 mM TRIS HCI, 350 mM NaCI, 350 mM imidazol y 0.4% Empigen pH 8.0. Las fracciones eluídas después se inyectaron a una velocidad de flujo de 2 ml/minuto en 26 columnas 26 (GE) equilibradas con un regulador de pH comprendiendo 10 mM de regulador de pH de fosfato (K) y 0.4% Empigen pH 7.2. El primer pico de proteína fue cosechado para análisis adicional. Las fracciones diluidas que corresponden a este pico después se cargaron en columnas de sulfato de celufina (Chisso Corporation) equilibradas con un regulador de pH comprendiendo 10 mM de regulador de pH de fosfato (K) y 0.4% Empigen pH 7.2. La elución se realizó a una velocidad de flujo de 3 ml/minuto con un regulador de pH comprendiendo 5 mM fosfato (K), 1 M NaCI y 0.1% Pluronic F68 pH 7.2. Los polipéptidos purificados que resultan del procedimiento de purificación anterior después fueron sometidos a los siguientes experimentos. 3.1 Experimentos de entrelazamiento con glutaraldehído Directamente se agregó glutaraldehído a 15 µ? de cada polipéptido purificado (correspondiendo a aproximadamente 7 pg de proteína total) con el fin de obtener una concentración final de glutaraldehído de 0.5% y 1%. Como un control, una muestra de cada polipéptido purificado se dejó sin glutaraldehído. Las mezclas se dejaron incubar durante 150 minutos y, después, la reacción de glutaraldehído se detuvo al agregar NaBH4 ( Aldrich) y las muestras se incubaron en hielo durante 20 minutos. Las muestras después se corrieron en el gel Criterion XT 4-12% Bis Tris (Biorad) utilizando el regulador de pH MOPS. El gel se tiñó con azul de Coomassie R-250 y se muestra en la Figura 9.

Resultados Si están presentes multímeros de polipéptidos en las muestras antes de ser tratadas con glutaraldehído, luego los multímeros de cualquier tamaño dado, ya sea dímeros, trímeros, o cualquier otro multímero de peso molecular alto, se entrelazaron y, de esta manera, se mantuvieron como tales cuando emigraron en un gel en condiciones de desnaturalización. Por consiguiente, dichos multímeros emigraron de acuerdo con su peso molecular. En forma contraria, con muestras de control que no fueron tratadas con glutaraldehído, cualquier multímero presente en dicha muestra fue desnaturalizado en monómeros cuando emigran e un gel en condiciones de desnaturalización, de manera que los polipéptidos en las muestras de control emigraron de acuerdo con el peso molecular equivalente a un monómero del polipéptido (ver una banda individual, un bit menor que 150 kDa en los carriles A, D y G). Si se considera el perfil de multímero de gB-DeltaTM (carriles A, B y C), se observan 2 bandas de peso molecular muy alto (indicado por las flechas) en las muestras tratadas con glutaraldehído. También se muestra que estas dos bandas son de la misma intensidad, sugiriendo que la muestra de gB-DeltaTM comprende la mayoría de los dos tipos de multímeros y que la proporción de cada multímero dentro de la muestra debe ser casi igual. De lo contrario, cuando se considera el perfil de gB-SLP12, en particular, carriles E y F, en donde las muestras se trataron con glutaraldehído, mientras que también se observaron dos bandas de peso molecular alto, la intensidad de cada banda es significativamente diferente. En realidad, la intensidad de la banda de peso molecular más bajo es al menos 3-5 veces más fuerte que la más alta, sugiriendo que la población de multímero de peso molecular más bajo dentro de la muestra de gB-SLP12 es mucho mayor que la población del multímero de peso molecular más alto. Se hizo una observación similar cuando se consideró la muestra de gB-SLP12-Del2 (carriles G, H e I), en donde la intensidad de la banda más baja es alrededor de 2-3 veces más fuerte que la intensidad de la banda más alta. Esto sugiere que gB-SLP12 y gB-SLP1-Del2 tienen un perfil de multímero similar con una proporción enriquecida de los multímeros de peso molecular más bajo, que es diferente de g B-DeltaTM , el polipéptido de la técnica anterior. Se observa que el gel utilizado en ese experimento no proporciona una resolución lo suficientemente buena para determinar si las bandas de peso molecular más bajo observadas en los carriles con relación a gB-DeltaTM son del mismo tamaño como las observadas en los carriles con relación a gB-SLP12 y gB-SLP 1 -Del2. Por la misma razón, no es posible determinar con precisión el tamaño real de cada banda, por lo que la identificación de los multímeros observados como dímeros o trímeros, etc., a partir de ese experimento es difícil. Con el fin de obtener esta información, se realizaron los dos siguientes experimentos con los polipéptidos purificados. 3.2 Ultracentrifugación analítica - gB-DeltaTM, qB-SLP12. gB-SLP1 -Del2 Se utilizó ultracentrifugación analítica (AUC) para determinar la homogeneidad y distribución de tamaño en solución de las diferentes especies (por ejemplo, multímeros de diferentes tamaños de un polipéptido purificado al cual se agrega) dentro de una muestra de polipéptido purificado al medir la velocidad a la cual las moléculas se mueven en respuesta a una fuerza centrífuga. Esto se basa en el cálculo del coeficiente de sedimentación de las diferentes especies que se obtuvieron mediante un experimento de velocidad de sedimentación, que depende de su forma molecular y masa. Después de la purificación, gB-DeltaTM , gB-SLP12 y gB-SLP1-Del2 re-suspendidos en 10 m fosfato de sodio, 1 M BaCI y 0.1% Pluronic, pH 7.2, se hicieron girar en una ultracentrífuga analítica Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1 a 28 000 rpm después de que el rotor AN-60Ti se equilibró a 15°C. Para la recolección de datos, se registraron 160 escaneos a 280 nm y 230 nm cada 5 minutos. Se realizó un análisis de datos utilizando el programa SEDFIT para la determinación de la distribución C(S). La determinación del volumen específico parcial de las proteínas se realizó con el software SEDNTERP a partir de una combinación de su secuencia de aminoácido y de su composición esperada de glicano. También se utilizó, SEDNTERP para determinar la viscosidad y la densidad del regulador de pH, descuidando la contribución del Pluronic F68, el cual no está representado en la base de datos de este software. Los resultados se presentan en la forma de una gráfica que muestra la concentración de cada especie graficada contra peso molecular. La determinación de la abundancia relativa de todas las especies ha sido realizada al considerar el área total bajo la curva de toda la distribución como 100% de la muestra al calcular el porcentaje de esta área total representada por la contribución de cada especie.

Resultados La Figura 10 presenta exitosamente el perfil de gB-DeltaTM, gB-SLP12 y gB-SLP1-Del2 purificados según analizados a través de ultracentrif ugación analítica. La gráfica que corresponde a la muestra gB-DeltaTM indica una distribución heteróloga representada por una pluralidad de picos. En particular, la población principal observada en dicha muestra son las especies de 417 kDa (35%) y 723 kDa (30%), las cuales probablemente representan trímeros y hexámeros, respectivamente. Dentro de dicha muestra también se presentan multímeros de peso molecular más alto. De forma contraria, cuando los bucles de fusión FL1 y FL2 fueron mutados, el perfil del polipéptido gB-SLP12 purificado correspondiente indica una población más homogénea, ya que la población principal es una especie de 327 kDa (63%), la cual es muy probable que represente trímeros. La presencia de multímeros de peso molecular más alto es escasamente notoria. Se observó un perfil similar en la muestra de gB-SLP1 -Del2, en donde la población principal es una especie de 311 kDa (67%), la cual es muy probable que represente trímeros también, mientras que la presencia de multímeros de peso molecular más alto es solo marginal.

En conclusión, los polipéptidos gB de la invención (gB-SLP12 y gB-SLP1 -Del2) p resentan un perfil mejorado de producto, ya que la población de trímeros se incrementa en un factor de aproximadamente 2 veces, según comparado con la población de trímero del polipéptido gB de la técnica anterior (gB-DeltaTM). 3.3 Ultracentrif ugación Analítica - gB-SLP12-Delta725. gB-SLP12-Delta113 Se realizó ultracentrifugación analítica como se describió anteriormente en la sección 3.2 para determinar la homogeneidad y la distribución de tamaño en solución de las diferentes especies dentro de los polipéptidos purificados gB-SLP12-Delta725 y gB-SLP12-Delta 113. los polipéptidos fueron recombinantemente expresados como se describe en el Ejemplo 2 y se purificaron como se describió en el primer párrafo del Ejemplo 3 de la presente. Después de la purificación, gB-SLP12-Delta725 y gB-SLP12-Delta113 cada uno se volvieron a suspender ya sea en un regulador de pH comprendiendo 0.1% Pluronic o en un regulador de pH sin Pluronic.

Resultados La Figura 11 A exitosamente muestra el perfil del polipéptido gB-SLP12-Delta113 purificado según analizado a través de ultracentrifugación analítica en presencia o ausencia de 0.1% Pluronic, el perfil observado fue similar al perfil observado para gB-SLP12 y gB-SLP12-Del2 en la Figura 10, con una población similar al 72% representando trímeros dentro de la población del polipéptido purificado, es decir, un perfil mejorado de producto según comparado con el polipéptido gB de la técnica anterior (g B-DeltaTM) . Sin embargo, en presencia de Pluronic, el porcentaje de trímeros se redujo con un incremento concomitante del porcentaje de monómeros (25%) y la presencia de multímeros de un tamaño de alrededor de 230 kDa. Esta tendencia del polipéptido gB-SLP12-Delta113 a monomerizarse en presencia de Pluronic es indicativa de una susceptibilidad a detergente.

La Figura 11B exitosamente presenta el perfil del polipéptido purificado g B-SLP 12-Delta725 según analizado a través de ultracentrifugación analítica en presencia o ausencia de 0.1% Pluronic. El perfil observado con este polipéptido purificado es similar si está o no presente Pluronic. En realidad, el porcentaje de trímeros en ambos casos es alrededor de 70%, es decir, tan alto como el porcentaje de trímero observado con los polipéptidos gB-SLP12 y gB-SLP12-Del2, y de esta manera, gB-SLP12-Delta725 también presenta un perfil mejorado de producto según comparado con el polipéptido gB de la técnica anterior (gB-DeltaTM).

Conclusión Aunque tanto gB-SLP12-Delta113 como gB-SLP12-Delta725 muestran un perfil mejorado de producto, con una proporción enriquecida de trímeros, los resultados obtenidos indican que gB-SLP12-Delta725 presenta la ventaja adicional de tener una estabilidad estructural mejorada en solución, ya que su perfil de trímero es mantenido en presencia o ausencia de Pluronic. En realidad, un tratamiento detergente no presentó un impacto observable en las propiedades de sedimentación de ese polipéptido. 3.4 Cromatografía de exclusión de tamaño El tamaño de proteína de gB-DeltaTM y gB-SLP12 también se determinó a través de cromatografía de exclusión de tamaño utilizando un detector UV a 280 nm y una columna TKS G5000PWXL (Tosoh Bioscience). Las muestras se cargaron a temperatura ambiente a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto. La elución se realizó con PBS + 0.1% Pluronic a la misma velocidad de flujo y a temperatura ambiente. Para la calibración se utilizaron Tiroglobulina (669 kDa), ferritina (440 kDa), catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina (68 kDa), conalbúmina (75 kDa), ovoalbúmina (43 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa), y ribonucleasa (13.7 kDa).

Resultados Como se muestra en la Figura 13, gB-SLP12 tiene un tamaño de 357 kDa, según medido a través de cromatografía de exclusión de tamaño, que probablemente es para representar la forma trimérica. Dos polipéptidos de la técnica anterior, gB-DeltaTM y gB-S50-DeltaTM, es decir, los polipéptidos con bucles de fusión intactos, tienen un tamaño similar de 710 kDa, que representan multímeros de peso molecular más alto. Estos resultados confirman los resultados anteriores obtenidos con ultracentrifugación analítica ya que los polipéptidos de la invención (gB-SLP12) tienen un perfil de producto distinto a los polipéptidos de la técnica anterior (gB-DeltaTM).

Ejemplo 4: Sujeción C-terminal de polipéptidos qB-SLP12 4.1 Expresión y purificación Los polipéptidos gB-DeltaTM, gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113 y gB-SLP12-Delta725 fueron pasajeramente transfectados y expresados como se describió en el Ejemplo 2. Los polipéptidos gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113 y gB-SLP12-Delta725 se purificaron como se describe en el primer párrafo del Ejemplo 3. Después de la recolección en el día 6 después de la transfección, el sobrenadante gB-DeltaTM se suplemento con Bis-Tris y Empigen BB para alcanzar la concentración final de 20 mM y 0.4%, respectivamente. Después se cargó en una columna Q-Sepharose (GE Healthcare) equilibrada en un regulador de pH comprendiendo 20 mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB, pH 6.0. El polipéptido unido se eluyó a partir de la columna con una mezcla de 75% del regulador de pH comprendiendo 20 mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB, pH 6.0 y 25% del regulador de pH comprendiendo 20 mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB, 1 M NaCI, pH 6.0. El producto eluido después se suplemento con fosfato de sodio para alcanzar una concentración final de 10 mM y se ajustó a un pH 6.8. Después se cargó en una columna de hidroxiapatita de tipo II (Bio-Rad) equilibrada en un regulador de pH comprendiendo 10 mM fosfato de sodio - 0.4% Empigen BB - 0.25 M NaCI, pH 6.8. El flujo pasado que contiene el polipéptido se recuperó y se cargó en una columna de Sulfato de Celufina (JNC Corporation) equilibrada en un regulador de pH comprendiendo 10 mM fosfato de sodio - 0.4% Empigen BB - 0.25 M NaCI, regulador de pH, pH 6.8. El flujo pasado conteniendo el polipéptido se recuperó, se concentró a través de ultrafiltración utilizando una membrana de 10 kD Pellicon (Mlllipore), y se cargó en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada en un regulador de pH comprendiendo 10 mM fosfato de sodio - 4.0% Empigen BB, pH 7.2. El producto eluido se recolectó, se concentró y se le realizó diafiltración con 10 mM fosfato de potasio, pH 7.2. 4.2 Análisis de tinción Western Los polipéptidos purificados anteriores se desglicosilaron utilizando el equipo de desglicosilación de N-glicosidasa F (Roche, No. 11836552001) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las cantidades equivalentes de cada uno de los polipéptidos desglicosilados purificados se corrieron en el gel Criterion XT 4-12% Bis Tris (Biorad) utilizando el regulador de pH, MOPS. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y a las membranas se les puso una sonda ya sea con al anticuerpo anti-gB MAb 27-156 (Spaete et al., Virology 167, 207-225 (1988) (FIG. 14A, FIG. 14B, carril 3, FIG. 14C, carriles B, y FIG. 14D, carril D) o el anticuerpo de etiqueta His anti-6X (Abeam, No. ab9108) (FIG. 14B, carril 2, FIG. 14C, carriles A, y FIG. 14D, carril C).

Resultados La Figura 14A muestra que el anticuerpo anti-gB reconoce dos diferentes formas en la población del polipéptido g B-DeltaTM purificado, sugiriendo que el polipéptido existe en al menos dos formas de diferentes tamaños, 92 kDa y 80 kDa, respectivamente, en la población purificada. Con base en el valor medio del peso molecular de un aminoácido (110 Da), el peso molecular de gB-DeltaTM, el cual comprende 830 aminoácidos, debe ser de alrededor de 91 kDa. Por lo tanto, la banda de 92 kDa probablemente corresponde al polipéptido g B-DeltaTM de longitud completa, mientras que la banda de 80 kDa es probable que corresponda a una versión más corta del polipéptido, sugiriendo que dentro de la población, se producen algunos polipéptidos que son productos de escisión y de sujeción de alrededor de 80 kDa.

La Figura 14B muestra que, después de la expresión recombinante del polipéptido gB-SLP12 en células, el anticuerpo anti-gB (carril 3) proporciona un perfil idéntico que reconoce dos formas de tamaños similares, 92 kDa y 80 kDa, respectivamente, sugiriendo que ocurrió una escisión similar en este polipéptido. Se observa aquí que el peso molecular esperado de gB-SLP12 también está alrededor de 92 kDa, ya que el número de aminoácidos es igual al de g B-DeltaTM. Cuando se aplica una sonda a la membrana con un anticuerpo de etiqueta anti-His (carril 2), solo se detectó la banda a alrededor de 92 kDa. Ya que la etiqueta His está ubicada en el extremo C-terminal del polipéptido, estos datos sugieren que la escisión ocurre en la parte C-terminal del polipéptido, y genera de esta manera un fragmento de 80 kDa faltando el extremo C-terminal.

La Figura 14C muestra que, después de la expresión recombinante del polipéptido gB-SLP12-Delta113 en células, el anticuerpo anti-gB (carril B) solo reconoce una banda (a alrededor de 80 kDa). Ya que gB-SLP12-Delta113 comprende 717 aminoácidos, entonces se espera que el peso molecular medio deba ser alrededor de 79 kDa. Por lo tanto, la observación de una banda solo alrededor de 80 kDa indica que la población de este polipéptido purificado se hace solo del polipéptido de longitud completa, sugiriendo que la escisión previamente observada en la parte C-terminal ya no ocurre más en esta población de polipéptidos. Esto fue confirmado al sondear la membrana con un anticuerpo de etiqueta anti-His (carril A) y al observar una banda idéntica a alrededor de 80 kDa, indicando que el extremo C-terminal del polipéptido está presente.

Se puede sacar una conclusión similar de la tinción de Western presentada en la Figura 14D con relación al polipéptido gB-SLP12-Delta725. El carril D representa la membrana con sonda con un anticuerpo anti-gB que reconoce solo una banda (a alrededor de 80 kDa). El peso molecular medio expresado de este polipéptido que comprende 824 aminoácidos debe ser de alrededor de 79 kDa también. El carril C representa la membrana con sonda con un anticuerpo de etiqueta anti-His y similarmente reconoce solo una banda a alrededor de 80 kDa, indicando que el extremo C-terminal del polipéptido está presente.

Los polipéptidos pueden precipitarse en el curso de la desglicosilación, lo cual puede dar como resultado una desglicosilación incompleta. Algunos polipéptidos permanecen en su forma glicosilada, dichas formas típicamente emigran en el gel en una forma difusa, tal como se observa para los polipéptidos gB-SLP12-Delta113 y gB-SLP12-Delta725 en tinciones Western presentadas en las Figuras 14C y 14D.

Conclusión Los datos presentados en la Figura 14 muestran que la sujeción que ocurre con los polipéptidos g B-DeltaTM y gB-SLP12 en la parte C-terminal del polipéptido no ocurre cuando al menos parte del dominio citoplásmico es eliminado.

Ejemplo 5: Heterogeneidad N-terminal de gB-Delta725 de polipéptidos Como se muestra en la Figura 12A, el polipéptido gB-SLP12- Delta725 de CMV, cuando se expresa recombinantemente en células, da como resultado una población de polipéptidos maduros que son heterogéneos en el extremo N-terminal. En realidad, la peptidasa de señal parece dividirse fuera de la secuencia de señal en diferentes posiciones de aminoácido, como se indica. Este fenómeno también es denominado como "bamboleo" de peptidasa de señal. 5.1 Expresión v purificación Los polipéptidos gB-SLP12-Delta725, g B-SLP 12-Delta725-LVL759, gB-SLP12-Delta725-LVL776 y gB-SLP12-Delta725-CD33 que contienen la etiqueta His, como se describe en el Ejemplo 1, fueron recombinantemente expresados como se describe en el Ejemplo 2. En el día 6 después de la transfección, los sobrenadantes de cultivo se recolectaron. Se agregó un coctel de inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche, No. 11873580001) a los sobrenadantes, y se ajustó la concentración de NaCI a 500 mM, y el pH final a 8.3. Se empacó IMAC Sepharose 6 FF (GE Healthcare) en columnas de vidrio con un •diámetro de 5 cm (Waters). Las columnas se equilibraron con 5 volúmenes de columna de regulador de pH de unión (10 mM Tris, 500 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH 8.3). Los sobrenadantes se cargaron en las columnas equilibradas a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto. El material no unido se lavó con dos volúmenes de columna del regulador de pH de unión anterior. Se cosecharon fracciones de 50 mi. Las columnas además se lavaron con dos volúmenes de columna adicionales del regulador de pH anterior. Se cosecharon fracciones de 10 mi. Las proteínas unidas a las columnas se eluyeron con 6 volúmenes de columna de regulador de pH de elución (Tris, 500 mM NaCI, 350 mM imidazol, pH 8.30). Se cosecharon fracciones de 10 mi. las fracciones se cargaron en un gel de SDS-PAGE y se combinaron fracciones positivas y se concentraron con el dispositivo de ultrafiltración Centricon (Millipore). La proteína concentrada se cuantíficó a través del ensayo calorimétrico de Lowry modificado por OCDC (Biorad). Se desglicosilaron de 5 a 10 g de la proteína purificada utilizando el equipo de desglicosilación N-Glycosidase F (Roche No. 11836552001) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteina desglicosilada se precipitó a través de un reactivo de precipitación RCDC (Biorad), se volvió a suspender en SDS-PAGE reduciendo la carga de regulador de pH y se cargó en SDS-PAGE. La banda de proteína que emigra a la posición correspondiente a la proteína desglicosilada se cortó para la digestión tríptica y análisis de mapeo de péptido MS/MS. 5.2 Digestión de tripsina Las piezas de gel conteniendo la proteína purificada se deshidrataron con acetonitrilo (ACN). Las proteínas se redujeron al agregar el regulador de pH de reducción (10 mM DTT, 100 mM bicarbonato de amonio) durante 30 minutos a 40°C, y se alquilaron al agregar el regulador de pH de alquilación (55 mM yodoacetamida, 10 mM bicarbonato de amonio) durante 20 minutos a 40°C. Las piezas de gel después se deshidrataron adicionalmente y se lavaron a 40°C al agregar ACN durante 5 minutos antes de desechar todos los reactivos. Las piezas de gel después se secaron durante 5 minutos a 40°C y después se volvieron a hidratar a 4°C durante 40 minutos con la solución de tripsina (6 ng/µ? de grado de secuenciación de tripsina de Promega, 25 mM bicarbonato de amonio). Se realizó la digestión de proteína a 58°C durante 1 hora y se detuvo con 15 µ? de una mezcla de 1% ácido fórmico y 2% ACN. El sobrenadante se transfirió a una placa de 96 cavidades y la extracción de los péptidos digeridos con tripsina se realizó con dos pasos de extracción de 30 minutos a temperatura ambiente utilizando el regulador de pH de extracción (1% ácido fórmico y 50% ACN). Todos los péptidos extraídos se combinaron en la placa de 96 cavidades y después se secaron por completo en una centrífuga a vacío. La placa se selló y se almacenó a -20°C hasta procesarse más al análisis LC-MS/MS. 5.3 Espectroscopia de Masas Antes del análisis de LC-MS/MS, los péptidos extraídos se volvieron a solubilizar bajo agitación durante 15 minutos en 12 µ? de 0.2% de ácido fórmico y después se centrifugó a 2000 rpm durante 1 minuto. La columna LC es una columna de fase inversa C18 empacada con una celda de empaque a alta presión. Se empacó un capilar de sílice fusionado i.d. de 75 mi con una longitud de 100 mm con un material de fase inversa C18 Júpiter 5 Im300 A (Phenomex). Esta columna se instaló en un sistema nano LC-2D (Eksigent) y se acopló a LTQ Orbitrap (ThermoFisher Scientific). Los reguladores de pH usados para cromatografía fueron 0.2% ácido fórmico (regulador de pH A) y 100% ACN/0.2% ácido fórmico (regulador de pH B). Durante los primeros 12 minutos, se cargaron 5 µ? de la muestra en la columna con un flujo de 650 nl/minuto y, subsecuentemente, el gradiente va de 2-80% de regulador de pH B en 20 minutos y después de regreso a 2% de regulador de pH B durante 10 minutos. La adquisición de datos de LC-MS/MS se logró utilizando un ciclo de evento de 4 escaneos compuesto de una MS de escaneo completo para 1 evento de escaneo adquirido en el Orbitrap.

Resultados La Figura 12 muestra el resultado de la evaluación cuantitativa de "bamboleo" de peptidasa de señal que ocurre en el sitio de escisión de la secuencia de señal de los diferentes polipéptidos probados. El bamboleo de la peptidasa de señal conduce a la generación de varias formas de polipéptidos maduros empezando con un aminoácido diferente en su extremo N-terminal dentro de cada población del polipéptido indicado.

La Figura 12A muestra que, después de la digestión tríptica del extracto total de proteína, seguido por la cuantificacion relativa de los péptidos resultantes comprendiendo el extremo N-terminal a través de MS/MS, se observó que la población del polipéptido gB-SLP12-Delta725, después de la escisión de la secuencia de señal, estuvo principalmente presente en solución como cinco formas diferentes de polipéptido en una proporción relativamente equivalente (variando de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%), cada una empezando con un aminoácido diferente, como se indica.

Las Figuras 12B y 12C muestran una análisis similar de la cuantificacion relativa de MS/MS de las diferentes formas de los polipéptidos presentes en la población de gB-SLP12-Delta725-LVL759 y gB-SLP12-Delta725-LVL776, respecti amente. Se observó que la población de esos dos polipéptidos, después de la escisión de la secuencia de señal, estuvo principalmente presente en solución como una forma principal de polipéptido en un porcentaje mayor que 99%, empezando con el aminoácido en la posición 23 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 14, y con el aminoácido en la posición 24 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 16, respectivamente. Los dos sitos de escisión alternativos divididos por la peptidasa de señal y generando dos formas de polipéptido adicionales que tienen un aminoácido distinto en el extremo N-terminal representado tan pequeño como 1% dentro de la población respectiva de polipéptidos.

La Figura 12D muestra una análisis similar de la cuantif icación relativa de MS/MS de las diferentes formas de los polipéptidos presentes en la población del polipéptido gB-SLP12-Delta725-CD33. Se observó que esta población, después de la escisión de la secuencia de señal, estuvo principalmente presente en solución como una forma principal de polipéptido en un porcentaje mayor que 99%, empezando con el aminoácido en la posición 18 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 18. El otro sitio de escisión dividido por la peptidasa de señal y generando una forma de polipéptido adicional que tiene un aminoácido diferente en el extremo N-terminal representó tan poco como menos de 1% dentro de la población del polipéptido gB-SLP12-Delta725-CD33.

Conclusión Esos resultados indican que el bamboleo ya no ocurrió más en los polipéptidos gB-SLP12-Delta725-LVL759, gB-SLP12-Delta725- LVL776, y gB-SLP12-Delta725-CD33, ya que la peptidasa de señal consistentemente reconoció solo un sitio de escisión principal. Esto sugiere que las modificaciones hechas a la secuencia de señal y a la secuencia líder del polipéptido gB tienen un impacto positivo significante en la heterogeneidad de la población de polipéptido maduro, haciendo dichas poblaciones homogéneas a un grado mayor que 99%.

Ejemplo 6: Inmunogenicidad de composiciones inmunogénicas conteniendo polipéptidos gB de CMV ilustrativos de la invención La inmunogenicidad de las composiciones inmunogénicas que contienen los siguientes polipéptidos que comprenden una etiqueta His C-terminal y que se expresan y se purifican como se describe en la sección, se probaron gB-DeltaTM, gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113, gB-SLP12-Delta725, LVL759, LVL776 y CD33, como sigue. 6.1 Diseño de experimento Se vacunaron grupos de diez ratones C57BL/6 con dos dosis en 21 días de intervalo con las composiciones inmunogénicas ilustrativas anteriores, como se indica en el Cuadro 1. Las inmunizaciones se hicieron intramuscularmente (1.5 g de cada polipéptido gB ayudado con el sistema auxiliar ASA comprendiendo 2.5 ig de 3D-MPL y 2.5 VQ de QS21 en una formulación liposomal en un volumen total de 50 µ?).

Cuadro 1 - Grupos de Estudio * Regulador de pH de polipéptido: 10 mM Fosfato K/K2 Regulador de pH - 500 mM NaCI - pH 8 + Arginina ** Regulador de pH de polipéptido: 10 mM Tris - 500 mM NaCI - pH 8.3 + Arginina La inmunogenicidad se evaluó al analizar las respuestas inmunes humorales a la vacunación, según medido a través de un ensayo de neutralización (NT) y ELISA (Ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas) 21 días después de inmunización, 1 y 14 días después de inmunización 2 (ver sección 6.3 y 6.4, respectivamente). 6.2 Análisis Estadístico Se diseñaron grupos de 10 ratones C57BL/6 con el fin de obtener 90% de poder con una diferencia doble para la lectura primaria. Se realizó un análisis estadístico en los días 14 después de la inmunización 2 con datos usando UNISTAT. EL protocolo aplicado para análisis de variación pueden ser descritos en resumen como sigue: transformación de registro de datos; prueba de S apiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad; prueba de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de variación entre diferentes poblaciones (grupo): Análisis de variación en datos seleccionados (ANOVA 1 o 2); prueba de Turckey-HSD para múltiples comparaciones. 6.3 Ensayo de Neutralización Antes del ensayo, se sembraron células MRC5 en placas de 96 cavidades y se incubaron durante 3 días a 37°C. Se incubaron diluciones en serie de sueros inactivados con calor con una cantidad fija del virus AD169 de CMV humano durante 1 hora a 37°C. Después de la activación, la mezcla de sueros y virus se agregó a las placas de 96 cavidades conteniendo células MRC5. Las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 1 hora a 37°C. Después de una incubación nocturna a 37°C, las placas se fijaron con una solución de acetona al 80% (20-30 minutos a +4°C). La s olución d e acetona se removió y las cavidades positivas a CMV se detectaron utilizando un anticuerpo temprano I (IE-I) d e anti-intermediario conjugado con biotina monoclonal específico durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS. Después del lavado, se agregó estreptavidina-peroxidasa de rábano durante 30 minutos adicionales a 37°C. Las placas se lavaron 3 veces y se incubaron durante 10 minutos con una solución de True-Blue. Se registraron señales de color específicas a través de examen visual bajo microscopio. Las titulaciones de neutralización se expresaron como la forma recíproca de la dilución más alta de suero dando un 50% de reducción en el número de cavidades positivas a CMV cuando se compararon con el control de dosis de virus sin suero.

Resultados La respuesta de anticuerpo de neutralización se midió en muestras de suero recolectadas 21 días después de la primera inmunización y 14 días después de la segunda inmunización. Las muestras se probaron para su actividad de neutralización contra el virus AD169 de CMV humano. Los resultados se muestran en la Figura 15A. Todos los polipéptidos probados indujeron una respuesta importante 14 días después de la inmunización 2 (ver barras en gris). gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113, gB-SLP12-Delta725, y LVL759 indujeron titulaciones que fueron no significativamente* diferentes de gB-DeltaTM. CD33 (valor p: 0.0006) y LVL776 (valor p: 0.0116) indujeron titulaciones significativamente más bajas que gB-DeltaTM. * valor p > 0.05 ? ninguna diferencia estadística (con 95% de confidencia) ** valor p < 0.05 ? diferencia estadística 6.4 Ensayo de ELISA La cuantif icación de anticuerpos anti-gB se realizó a través de ELISA utilizando un polipéptido gB llamado gB** (descrito en EP0759995) como un antígeno de revestimiento. El antígeno se diluyó a una concentración final de 4 pg/ml en PBS (100 µ?/cavidad) y se incubó durante la noche a 4CC en placas de 96 cavidades. Las placas después se saturaron durante 1 hora a 37°C con 200 µ? de PBS conteniendo 1% de Albúmina de Suero Bovino. Se agregaron, a las cavidades, diluciones en serie dobles de suero (100 µ?/cavidad) y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37°C. Las placas se lavaron 4 veces con PBS/Tween 20 0.1%. Se agregaron 100 µ? de Ig anti-ratón conjugado con biotina a cada cavidad y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de 4 lavados con PBS/Tween 20 0.1%, se agregaron 100 µ? de estreptavidina/peroxidasa de rábano durante una incubación de 30 minutos adicionales a 37°C. Las placas se lavaron 4 veces con PBS/Tween 20 0.1% y una vez con agua. Después, las placas se incubaron durante 10 minutos a 22°C con 100 µ? de Tetra-metil-bencidina 75% en 0.1 M regulador dé pH de citrato pH 5.8. Esta reacción se detuvo con 100 µ? de H2S02 0.4 N y la colorimetría se leyó en un espectrómetro a 450/620 nm. Se utilizó un lote previo de g B-DeltaTM purificado cuya concentración fue conocida, como un estándar en este experimento. Utilizando el software SoftMax Pro, se determinaron las titulaciones de'ELISA y se expresaron en Unidad/ml de ELISA.

Resultados La titulación de ELISA se midió en muestras de sueros recolectadas 21 días después de primera inmunización y 14 días después de la segunda inmunización. Los resultados se muestran en la Figura 15B. Todos los polipéptidos probados ¡ ni dujeron una respuesta importante 14 días después de la inmunización 2 (ver barras en gris). gB-SLP12-Delta113 y gB-SLP12-Delta725 indujeron titulaciones que fueron no significativamente* diferentes de la titulación inducida por gB-DeltaTM. gB-SLP12, CD33, LVL759 y LVL779 indujeron titulaciones que fueron no significativamente* diferentes. gB-DeltaTM indujo titulaciones** sighificat!ivamente más altas que gB-SLP12 (valor p: 0.0002), CD33 (valor p: 0.0226), LVL759 (valor p: 0.0002) y LVL776 (valor p: 0.0001). j * valor p > 0.05 ? ninguna diferencia estadística} (con 95% de confidencia) ** valor p < 0.05 ? diferencia estadística

Claims (49)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido gB de citomegalovirus (CMV) que comprende al menos una porción de un dominio extracelular de proteína gB comprendiendo un dominio de bucle de fusión 1 (FL1) y un dominio de bucle de fusión 2 (FL2), en donde al menos uno de los dominios FL1 y FL2 comprende al menos una eliminación o substitución de aminoácido.

2. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% de los aminoácidos del dominio extracelular, o que comprende el dominio extracelular completo.

3. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende un dominio de transmembrana no funcional (TM).

4. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una eliminación de al menos una porción del dominio TM.

5. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 4 , en donde al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% de los aminoácidos del dominio TM es eliminado.

6. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5, que comprende una eliminación de aminoácidos en la posición 725-775 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV.

7. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, que comprende una eliminación de aminoácidos e n la posición 701-775 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV.

8. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende al menos una eliminación o substitución de aminoácido en el dominio FL1.

9. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende al menos una eliminación o substitución de aminoácido en el dominio FL2.

10. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende al menos una eliminación o substitución en los dominios tanto FL1 como FL2.

11. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende una eliminación de al menos una porción del dominio citoplásmico.

12. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende al menos una región de aminoácido hidrofobico del dominio citoplásmico.

13. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende una eliminación de aminoácidos 825 a 877 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV.

14. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende una eliminación de al menos 80%, ál menos 90%, al menos 95% de los aminoácidos del dominio citoplásmico, o una eliminación del dominio citoplásmico completo.

15. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde al menos una substitución de aminoácido en el dominio de bucle de fusión FL1 comprende una substitución de al menos un aminoácido seleccionado de Y.I.Y ubicado en la posición 155-157 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, con un aminoácido polar distinto a un aminoácido aromático.

16. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la substitución comprende la substitución de al menos dos aminoácidos seleccionados de Y.I.Y ubicados en la posición 155-157 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, con un aminoácido polar distinto a un aminoácido aromático.

17. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 16, en donde el aminoácido p olar se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos p ositivamente cargados que consisten de lisina (K), histidina (H), y arginina (R). j

18. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la isoleucina (I) ubicada en la posición 156 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una histidina (H).

19. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 17 o reivindicación 18, en donde la tirosina (Y) ubicada en la posición 157 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una arginina (R).

20. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde la tirosina (Y) ubicada en la posición 155 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una glicina (G).

21. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde los aminoácidos Y.I.Y ubicados en la posición 155-157 en el dominio de bucle de fusión FL1 de la secuencia SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, están substituidos con el aminoácido G.H.R, respectivamente.

22. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde los aminoácidos Y.I.Y ubicados en la posición 155-157 en el dominio de bucle de fusión FL1 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, están substituidos con un estiramiento de aminoácidos que tienen una clasificación de hidrofobicidad de menos de -3, menos de -7, menos de -8, según medido a través de la escala de Kyte y Doolittle.

23. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde al menos una substitución de aminoácido en el dominio de bucle de fusión FL2 comprende la substitución de al menos un aminoácido seleccionado de W.L.Y ubicado en la posición 240-242 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, con un aminoácido positivamente cargado del grupo que consiste de lisina (K), histidina (H) y arginina (R).

24. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el aminoácido seleccionado de W.L.Y ubicado en la posición 240-242 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituido con una histidina (H).

25. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 23 o reivindicación 24, en donde la tirosina (Y) ubicada en la posición 242 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, está substituida con una histidina (H).

26. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde los aminoácidos W.L.Y ubicados en la posición 240-242 en el dominio de bucle de fusión FL2 de la secuencia establecida en SEC ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB de CMV, están substituidos con el aminoácido A.F.H, respectivamente.

27. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que comprende una eliminación de al menos una porción de la secuencia líder.

28. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 27, que comprende una eliminación de al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% de los aminoácidos de la secuencia líder, o de la secuencia líder completa.

29. Un polipéptido gB de CMV que comprende una eliminación de al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% de los aminoácidos de la secuencia líder, o de la secuencia líder completa.

30. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con la reivindicación 29, que además comprende una o más de las características de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

31. Un polipéptido Gb de CMV que tiene la secuencia seleccionad del grupo que consiste de las secuencias establecidas en: SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 21.

32. Una preparación que comprende una población de polipéptidos gB de CMV, en donde al menos 50%, al menos 60%, o al menos 70% de la población está en forma trimérica.

33. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido gB de CMV de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 mesclado con un vehículo farmacéutico adecuado.

34. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 33, que además comprende al menos uno o más antígenos de CMV seleccionados del grupo que consiste de pUL131, gl_, gH, pUL128, pUL130, o cualquier combinación de los mismos.

35. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 33 a 34, que además comprende un auxiliar.

36. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el auxiliar comprende 3D-MLP y QS21 en una formulación liposomal.

37. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el auxiliar comprende una emulsión de aceite en agua.

38. Un polinucleótido que codifica al polipéptido gB de CMV de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31.

39. Un polinucleótido que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias establecidas en: SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, y SEC ID NO: 17.

40. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 38 o reivindicación 39.

41. Una célula huésped transformada con el vector recombinante de la reivindicación 40.

42. El polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, para usarse en la prevención y/o tratamiento de una infección por CMV.

43. Uso del polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, en la preparación de un medicamento para evitar y/o tratar una infección por CMV.

44. El uso de la reivindicación 42 o reivindicación 43 para evitar una infección congénita por CMV en un recién nacido.

45. Un método para producir una respuesta inmune contra CMV, que comprende el paso de administrar a un sujeto una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende el polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37.

46. Un método para evitar una infección congénita contra CMV en un recién nacido, que comprende el paso de administrar a un sujeto una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende el polipéptido gB de CMV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 y 33 a 37.

47. El uso de acuerdo con la reivindicaciones 42 a 44 o el método de acuerdo con la reivindicación 45 o reivindicación 46, en donde los sujetos son sujetos CMV-seronegativos.

48. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde los sujetos CMV-seronegativos son mujeres en edad de reproducción.

49. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde los sujetos CMV-seronegativos son niñas adolescentes.