JP2002101893A - 修飾リボザイム - Google Patents

修飾リボザイム

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JP2002101893A
JP2002101893A JP2001205286A JP2001205286A JP2002101893A JP 2002101893 A JP2002101893 A JP 2002101893A JP 2001205286 A JP2001205286 A JP 2001205286A JP 2001205286 A JP2001205286 A JP 2001205286A JP 2002101893 A JP2002101893 A JP 2002101893A
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ribose sugar
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Fritz Eckstein
フリッツ エクシュタイン,
Wolfgang A Pieken
ヴォルフガング エイ. ピーケン,
Fritz Benseler
フリッツ ベンゼラー,
David B Olsen
デイヴィド ビー. オルセン,
David M Williams
デイヴィド エム. ウィリアムズ,
Olaf Heidenreich
オラーフ ハイデンライヒ,
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】治療剤として使用することもでき、生化学的又
は生物工学的方法で生体触媒として使用することもでき
る。触媒活性と、化学的崩壊及び酵素的崩壊に対する増
大された安定性の双方を有するRNA分子の提供。 【解決手段】リボース糖の2’−でのヒドロキシ基が,
ハロゲン原子,スルフヒドリル基,アジド基,アミノ
基,モノ置換アミノ基及びジ置換アミノ基から選択され
た1つの修飾基によって代替されている,少なくとも1
つの修飾ヌクレオチドからなる触媒活性を有するRNA
分子,修飾RNA分子の調製法並びに治療剤及び生体触
媒としての修飾RNA分子、その合成並びに精製方法、
及び治療剤又は生体触媒としての使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、触媒活性を有する
RNA分子に関する。
【0002】
【従来の技術】一定の天然に生じるリボ核酸(RNA
s)は,自己切断を行なう。第1に報告された例は,補
助因子としてのグアノシンを必要とする原生動物テトラ
ヒメナ(Cech,Ann.Rev.Biochem.
59(1990),543−568参照)のリボソーム
RNA前駆物質の切断である。その後に,RNA切断の
多数の例がウイロイド,ウイルソイドおよびサテライト
RNA中に見い出された(Sheldon他,Nucl
eic Acids and MolecularBi
ology(1990)第4巻,第227〜242頁,
F.EcksteinおよびD.M.J.Lilley
編,Springer Verlag Berlin
Heidelberg;Symons,TIBS 14
(1989),445−450)。この切断は,5’−
ヒドロキシルおよび2’,3’−環式ホスホジエステル
末端を生じるMg2+のような二価陽イオンの存在下にホ
スホジエステル結合の部位特異的切断を包含する。この
ような幾つかのRNAの自己切断の部位の周囲の連続的
分析により,"ハンマーヘッド(hammerhea
d)"構造と名付けられた切断にとって本質的な共通の
構造特徴の一致を導いた(Hutchins他,Nuc
leic Acids Res.14(1986)36
27−3640)。この構造は,1つの特殊な位置で切
断を受け入れる三次元構造を形成する,3個の螺旋およ
び13個の保存ヌクレオチド(下記の図の中で枠で囲ん
だ部分)から構成されている。自己触媒された切断は,
通常,筋肉内プロセスであり,即ち単RNA分子は,切
断に必要な全ての機能を有する。しかし,ウーレンべッ
ク(Uhlenbeck)(Nature 328(1
987),596−600)は,このハンマーへッド構
造が一本鎖中に埋封されなければならないのではなく,
二本鎖から構成させることができることが証明された。
これら2つの鎖は結合してハンマーヘッド構造を形成
し,このハンマーヘッド構造は,鎖の1つ(S鎖)中で
(矢印で示されたような)ホスホジエステル結合の切断
を導き,これとは異なり,鎖の他方(AE鎖)は,老化
しないままでありかつ多数の切断反応を期待することが
できる。この鎖は酵素の定義に適合し,リボザイムと呼
ばれる。枠で囲まれた配列(下記の図)は,保存されて
いるけれども,他のものは変化可能であり,但し,一対
の塩基構造および一本鎖領域は,無傷のままである。
【化1】
【0003】トリヌクレオチドGUC後の切断反応は,
詳細に研究された(Ruffner他,Gene 82
(1989),31−41;Fedor and Uh
lenbeck,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87(1990),1668−167
2)。新しい特異性を有するリボザイムも構成され(H
aseloffおよびGerlach,Nature
334 (1988),585−591),この場合に
は,例えば配列GUA,GUU,CUC,AUCおよび
UUCの後に切断が起こり得ることが指摘されている。
【0004】更に,RNA酵素の例は,ヘアピンRNA
(Hampel他,NucleicAcids Re
s.18(1990),299−304),ならびにタ
ンパク質を含有するRNA,例えばテロメラ−ゼ(Gr
eiderおよびBlackburn,Nature
337(1989),331−337)およびRNア−
ゼP(Baer他,Nucleic Acids an
d Molecular Biology(198
8),第3巻,第231〜250頁,F.Eckste
inおよびD.M.J.Lilley編,Spring
er Verlag,Berlin/Heidelbe
rg)である。
【0005】リボザイムは,治療剤としての使用に特に
重要である(Rossi andSarver, TI
BTECH 8(1990),179−183,参
照)。1つの可能な方法により,例えばウイルス遺伝子
および特殊な内因性遺伝子のような2つの異質遺伝子の
表現に必要とされるRNAは破壊されうる。このこと
は,標的RNAと一緒にハンマーヘッド構造またはへア
ピン構造を形成することができかつこの構造を予め定め
られた位置で切断することができるRNA分子の構成を
必要とする。この方法によりHIV−1ウイルスを阻害
するための最初の適用は,報告された(Sarver
他,Science 247(1990),1222−
1224)。生体内での標的ハンマーヘッドリボザイム
の作用の他の例は,カンメロン(Cammeron)お
よびジェニングス(Jennings)によって報告さ
れており(Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 86(1986),9139−9143),かつ
試験管内での場合は,コッテン(Cotten)他によ
って報告されている(Mol.Cell.Biol.9
(1989),4479−4487)。
【0006】更に,リボザイムの他の有用な触媒作用の
性質,例えばデホスホリラーゼ活性およびヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼ活性は,公知である(国際公開W
O88/04300,参照)。この場合には,公知のタ
ンパク質酵素と区別される,高い配列特異性を有するオ
リゴヌクレオチド基質をデホスホリル化することができ
るRNA酵素が開示されている。RNA分子は,RNA
ポリメラーゼとして作用することができ,外側鋳型より
もむしろ内側鋳型を使用するようなタンパク質酵素と区
別される。従って,種々のヘテロポリマーは,変異型R
NA酵素形によって構成されうる。このことは,例えば
特殊なタンパク質またはペプチドのためにメッセンジャ
ーRNA分子を形成することができる。更に,ヘルシュ
ラーク(Herschlag)およびチェック(Cec
h)(Nature 344,(1990),405−
409)は,DNアーゼ活性を有するRNA酵素を記載
している。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】RNA酵素は,治療剤
として有用であるために,標的細胞中に導入されなけれ
ばならない。リボザイムを標的細胞中に運搬するために
主要な2つの方法が存在する: (a)予め形成された合成RNAの外因性の運搬; (b)プラスミド上に位置したリボザイム解読遺伝子の
内因性転写。
【0008】方法(a)の重大な欠点は,生存している
細胞内に存在する種々のリボヌクレアーゼ酵素による迅
速な崩壊に基づく生理的条件下でのRNA分子の著しく
低い安定性にある。方法(b)の欠点は,特異的および
安定的にリボザイム解読遺伝子を高級有機物の細胞中に
挿入することの著しい困難さをまねく。更に,生体内で
合成されたRNA分子を用いた場合には,崩壊の問題も
起こる。
【0009】従って,本発明の基礎を為す問題は,治療
剤として使用することもでき,生化学的または生物工学
的方法で生体触媒として使用することもできる,触媒活
性と,化学的崩壊および酵素的崩壊に対する増大された
安定性の双方を有するRNA分子を提供することであっ
た。
【0010】しかし,パーロールト(Perreaul
t)他による最近の刊行物(Nature 344(1
990),565−567)の記載から,RNA酵素の
一定の修飾,例えばリボザイムの少数の位置での2’−
デオキシリボヌクレオチドの取り込みにより触媒活性の
著しい損傷が生じることは,知られていた。
【0011】
【課題を解決するための手段】ところで,意外なこと
に,一定の化学的修飾は,RNA分子の安定性を増大さ
せるリボース糖の2’位でリボザイムの触媒作用の性質
に殆ど影響を与えずおよび/またはこの性質を破壊しな
いことが見い出された。
【0012】従って,本発明の目的は,リボース糖の
2’位でのヒドロキシ基がハロゲン原子,スルフヒドリ
ル基,アジド基,アミノ基,モノ置換アミノ基およびジ
置換アミノ基から選択された変更因子基によって代替さ
れているような少なくとも1つの修飾ヌクレオシドから
なる触媒活性を有するRNA分子を提供することであ
る。
【0013】
【発明の実施の形態】本発明によるRNA分子の触媒活
性は,有利にヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性,
デホスホリラーゼ活性,デオキシリボヌクレアーゼ活性
および配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性からなる
群の少なくとも1つを有する。有利に触媒活性は,配列
特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を有する。よりいっ
そう有利には,RNAは,上記のようなハンマーヘッド
リボザイムである。殊に有利なのは,リボザイムが別の
RNA鎖と結合することができ,2本の鎖からなるハン
マーヘッド構造を形成することであり,この場合修飾R
NA鎖は,上記のようにE鎖である。
【0014】ハンマーヘッドリボザイムは殊に好ましい
けれども,他のRNA酵素,例えば天然に生じる形また
はその短縮された形(Zang他,Biochemis
try 27(1988),8924−8931)のテ
トラヒメナリボザイム(Cech,Ann.Rev.B
iochem.59(1990),543−568)お
よび殊にヘアピンRNA(Hampel他,Nucle
ic Acids Res.18(1990)299−
304)またはRNA含有タンパク質,例えばRNア−
ゼ P(Baer他,Nucleic Acids&M
olecular Biology(1988),第3
巻,第231〜250頁,F.Ecksteinおよび
D.M.J.Lilley,Springer Ver
lagHeidelberg),トロメラーゼ(Gre
iderおよびBlackburn,Nature 3
37(1989),331−337)も,本発明によっ
て包含される。
【0015】また,リボース糖の2’位での変更因子基
の配合は,選択の二者択一的作業周期(Tuerkおよ
びGold,Science 249(1990),5
05−510;EllingtonおよびSzosta
rk,Nature 346(1990),818−8
22)に依存する方法によって誘導されたかまたは任意
の他の方法によって誘導された新しい官能基を有するR
NAに特に有用であると思われる。
【0016】リボース糖の2’位のヒドロキシ基の代わ
りの変更因子基は,ハロゲン原子,スルフヒドリル基,
アジド基,アミノ基,モノ置換アミノ基およびジ置換ア
ミノ基から選択される。ハロゲン原子は,弗素原子,塩
素原子,臭素原子または沃素原子であることができ,こ
の場合には弗素原子が好ましい。置換アミノ基の置換分
は,有利にC1〜C3アルキル基および/またはヒドロキ
シアルキル基である。最も好ましくは,変更因子基は,
ハロゲン原子または非置換アミノ基である。
【0017】リボース糖の2’位での変更因子基の配合
は,酵素切断に対するRNA安定性を著しく増大させ
る。リボザイムの特異的位置で配合された2’−デオキ
シ−2’−フルオロウリジンおよび2’−デオキシ−
2’−アミノウリジンは,これらの位置でRNアーゼ
Aによって切断を阻止することが確認された(第3図お
よび第4図,参照)。この酵素は,ピリミジンヌクレオ
シドの3’位で切断され,かつ2’−ヒドロキシル基の
存在を必要とする(UchidaおよびEgami(1
971),The Enzymes 第IV巻,第3編
(P.D.Boyer編),Academic Pre
ss,第205〜250頁)。更に,ポリヌクレオチド
を用いて得られた結果は,2’−アミノ官能基の存在に
より,へビ毒ホスホジエステラーゼのような非特異的ヌ
クレアーゼによる分解が減退されることを示す(Hob
bs他,Biochemistry 12(197
3),5138−5145)。2’−ハロゲン原子の存
在は,DNアーゼ Iのようなヌクレアーゼを阻害する
(Hobbs他,Biochemistry 11(1
972),4336−4344)。また,ポリヌクレオ
チドを用いての結果は,ヌクレオチドの2’位でのハロ
ゲン原子の存在により,ヒト血清ヌクレアーゼの作用か
ら保護されることを示す(Black他,Virolo
gy 48(1972)537−545)。従って,修
飾リボース糖の配合による保護は,むしろ一般的であ
り,かつ2’−ヒドロキシル基の存在に依存するRNア
ーゼに制限されない。
【0018】リボ核酸の場合,リボース糖は,N−グリ
コシド結合を介してヌクレオチド塩基に結合されてい
る。本発明のRNA分子において修飾リボース糖に結合
されているヌクレオチド塩基は,RNA中で天然に生じ
る塩基および置換塩基からなる群から選択されている。
有利に修飾リボースは,RNA中の天然塩基であるアデ
ニン,グアニン,サイトシンおよび/またはウラシルに
結合している。しかし,修飾リボースは,有利にキサン
チン,ハイポキサンチン,2,6−ジアミノプリン,2
−ヒドロキシ−6−メルカプトプリンから選択された置
換塩基および硫黄により6位で置換されたプリン塩基ま
たはハロゲン原子もしくはC1〜C5アルキル基,殊に臭
素原子もしくはメチル基により5位で置換されたピリミ
ジン塩基に結合されていてもよい。修飾リボースに結合
された最も有利なヌクレオチド塩基はウラシルである。
【0019】RNA分子中に配合されている修飾ヌクレ
オシドは,早期に記載された化合物であるかまたは公知
化合物と同様に製造することができる化合物である。リ
ボヌクレオシドの最も好ましいフルオロ類縁物およびア
ミノ類縁物,例えば2’−デオキシ−2’−フルオロサ
イチジン(Doerr&Fox,J.Org.Che
m.32(1967),1462;Mengel&Gu
schlbauer,Ang.Chem.90(197
8),557−558);2’−デオキシ−2’−フロ
オロアデノシン(Ikehara&Miki,Che
m.Pharm.Bull.26(1978),244
9−2453),2’−デオキシ−2’−フロオロウリ
ジン(Codington他,J.Org.Chem.
29(1964),558−564),2’−デオキシ
−2’−アミノウリジン(aVerheyden他,
J.Org.Chem.36(1971),250)お
よび2’−デオキシ−2−アミノサイチジン(Verh
eyden他,(1971)上掲書)は,早期に記載さ
れたものである。前記化合物の幾つかの合成には,最近
の合成法を使用することができる。2’−デオキシ−
2’−フルオロサイチジンは,サング(J.Org.C
hem.47(1982),3623−3628)の方
法により2’−デオキシ−2’−フロオロウリジンから
得ることができる。同様の方法は,2’−デオキシ−
2’−アジドサイチジンへの2’−デオキシ−2’−ア
ジドウリジンの形質転換に使用することができる(Ve
rheyden他,(1971)上掲書)。この2’−
デオキシ−2’−アジドサイチジンは,ムンガル(Mu
ngall)他(J.Org.Chem.40(197
5),1659)の方法によって2’−デオキシ−2’
−アミノサイチジンに還元することができる。
【0020】2’−フルオロヌクレオシド 5’−トリ
ホスフェートの合成は,ルートビッヒ(Ludwig)
(Acta Biochem.et Biophys,
Acad.Sci.Hung.16(1981),13
1−133)の方法により実施することができるかまた
はルートビッヒ(Ludwig)およびエックシュタイ
ン(Eckstein)(J.Org.Chem.54
(1989),631−635)の方法により実施する
ことができる。2’−デオキシ−2’−アミノウリジン
および−サイチジン 5’−トリホスフェートは,ホッ
ブス(Hobbs)他(Biochemistry 1
2(1973),5138−5145)によるジホスフ
ェ−トに関する記載と同様にして,ピロホスフェートを
ホスフェートの代わりに使用する変法を用いて得ること
ができる。自動化オリゴヌクレオチド合成のための2’
−デオキシ−2’−フルオロヌクレオチド 3’−ホス
ホルアミダイトは,シンハ(Sinha)他(Nucl
eic Acids Res.12(1984),45
39−4557)の方法によって得ることができる。相
応する2’−アミノ誘導体の合成に関連して,アミノ基
は,イマザワ(Imazawa)およびエックシュタイ
ン(Eckstein)(J.Org.Chem.44
(1979),2039−2041)の記載によりトリ
フルオロアセチル化によって保護されていてもよい。
【0021】本発明によるRNAは,少なくとも1つの
修飾ヌクレオシドを有し,この場合リボースの2’位で
のヒドロキシ基は,変更因子基によって代替されてい
る。本発明の1つの好ましい実施態様は,残存する3個
のヌクレオシドは非修飾糖を含有するけれども,1種類
の全部のヌクレオシド(即ち,アデノシンまたはグアノ
シンまたはサイチジンまたはウリジン)が修飾糖を含有
するような1つのRNA分子にある。よりいっそう好ま
しくは,修飾ヌクレオシドは,ピリミジンヌクレオシ
ド,即ちサイチジンもしくはウリジンまたはその置換誘
導体である。最も好ましくは,修飾糖は,2’−フルオ
ロリボ−スまたは2’−アミノリボースである。この実
施態様の例は,フェドール(Fedor)およびウーレ
ンべック(Uhlenbeck)(Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA87(1990),16
68−1672)によって記載されたハンマーヘッドリ
ボザイムE1から誘導されたハンマーへッドリボザイム
E2およびE3である。E2の場合,全てのウリジン残
基は2’−デオキシ−2’−フルオロウリジンによって
代替されており,E3の場合には,全てのウリジン残基
は,2’−デオキシ−2’−アミノウリジン残基によっ
て代替されている。リボザイムE2およびE3は,非修
飾RNA分子E1の場合と比較可能であるリボヌクレア
ーゼ活性を示す。
【0022】本発明のもう1つの好ましい実施態様の場
合,残存する2個のヌクレオシドは非修飾糖を含有する
けれども,2つの異なる種類の全てのヌクレオシドは,
修飾糖を含有する。よりいっそう好ましくは,全てのピ
リミジンヌクレオシド,即ちサイチジンおよびウリジン
(置換ピリミジン塩基を含む)は,修飾糖を含有し,最
も好ましくは,2’−フルオロまたは2’−アミノリボ
ース誘導体を含有する。
【0023】更に,なお本発明による実施態様は,所
謂"選択的修飾パターン"と表わされる(即ち,ヌクレオ
シドが修飾されており,非修飾である)修飾パターンを
有するRNA分子にある。他の特異的に選択された位置
でのヌクレオシドは非修飾であることができるけれど
も,選択的修飾パターンを有するRNAは,特異的に選
択された位置でのヌクレオシドが修飾されていてもよい
1つの分子にある。例えば,リボヌクレアーゼに対する
高感受性部位であることが知られている(例えば,RN
A分子の二次構造に基づく)ヌクレオシドは,修飾さ
れ,RNA分子の延長された生存時間を達成する。リボ
ヌクレアーゼ高感受性部位の1つの例は,リボザイムE
1の21位で得られる。第3図で示したように,RNA
分子は,この位置でRNアーゼによって著しく強力に切
断される。
【0024】更に,本発明のもう1つの実施態様は,付
加的に少なくとも1つの修飾インターヌクレオチドホス
ホジエステル結合を有するRNA分子にある。適当な修
飾ホスホジエステル結合の例は,メチルホスホネート基
またはホスホロチオエート基であり,このホスホロチオ
エート基は,殊に好ましい。好ましくは,少なくともR
NA分子の5’−末端ホスホジエステル結合および/ま
たは3’−ホスホジエステル結合は,修飾されている。
よりいっそう好ましくは,5’−末端ホスホジエステル
結合および最後の3個の3’−末端ホスホジエステル結
合は,修飾されている。
【0025】分解に対する増大された安定性を得るため
には,修飾インターヌクレオチド結合だけの存在では不
十分であることが見い出された。しかし,2’−修飾リ
ボースと,修飾インターヌクレオチド結合との合わされ
た存在により,付加的な安定性を向上させる効果を示し
た。双方の修飾による50倍を上廻る安定性の増大によ
り,非修飾リボザイムと比較して切断の減少された効率
は凌駕される。
【0026】修飾インターヌクレオチド結合を有するR
NA分子の合成は,有利に下記したような化学合成によ
り達成される。
【0027】本発明のもう1つの目的は,RNA鎖中に
少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを配合し,その際に
リボース糖の2’位でのヒドロキシ基をハロゲン原子,
スルフヒドリル基,アジド基,アミノ基,モノ置換アミ
ノ基およびジ置換アミノ基から選択された変更因子基に
よって代替することを特徴とする,触媒活性を有するR
NA分子の合成法である。
【0028】有利に,変更因子基は,ハロゲン原子(即
ち,弗素原子,塩素原子,臭素原子または沃素原子)ま
たはアミノ基であり,よりいっそう有利には,弗素原子
または非置換アミノ基である。また,本発明による方法
が少なくとも2個の異なる変更因子基(即ち,弗素原子
およびアミノ基)を有するヌクレオチドを配合するよう
なRNA分子の合成からなることは,注目すべきであ
る。
【0029】この修飾ヌクレオチドをRNA中に配合す
るためには,有利に2つの方法が存在する。1つの方法
は,有利にヌクレオチド前駆物質としてのそれぞれのホ
スホルアミダイトまたはH−ホスホネートを用いて固体
支持体上または溶液中で実施することができるRNA分
子の自動化化学合成によるものであり,他の方法は,
2’−修飾ヌクレオシド5’−トリホスフェートを使用
して適当な核酸,有利に核酸ポリメラーゼを有するDN
A鋳型の転写による酵素配合を包含する。自動化化学合
成を用いて,修飾インターヌクレオチド結合を有するR
NA分子は,相応する化学的に修飾されたヌクレオチド
前駆物質,例えばメチルホスホネート誘導体をRNA鎖
中に配合することによって得ることができる。ホスホロ
チオエート結合を配合するためには,標準ホスホルアミ
ダイト誘導体は,ヌクレオチド前駆物質として使用され
る。しかし,RNA鎖に対する前駆物質のカップリング
が起こった後に,その後の酸化工程は,非修飾結合の場
合と同様に沃素を用いて実施されないが,しかし硫黄ま
たは硫化剤を用いて実施され,それによってホスホロチ
オエート基が得られる。
【0030】修飾RNA分子の化学合成は,当業界で知
られている,非修飾RNAまたはDNA分子の場合と同
様に実施される。よりいっそう詳細には,RNA合成
は,それぞれのヌクレオチド前駆物質の段階的添加を包
含する固体支持体上での化学合成によって実施される。
望ましい長さのRNA生産物を合成した後,RNAは,
常用の方法によって固体支持体から除去され,かつ有利
にゲル電気泳動法によって精製される。また,化学的R
NA合成は,固体支持体を使用することなしに任意の他
の公知技術によって実施することもできる。即ち,RN
Aは,溶解可能な形で合成させることができ,かつその
後に当業界で知られた方法で精製させることができる。
【0031】2’−アミノ変更因子基をRNA鎖中に配
合する場合には,この基は,ホスフィチル化反応(即
ち,ヌクレオチド前駆物質の製造)の前に保護されなけ
ればならず,かつその後の使用のためにカップリング反
応で保護されなければならない。この目的のために,ホ
リフルオロアセチル基は,有利に保護基として使用され
る。それというのも,この基は,核酸合成剤上での合成
の作業周期の間に安定であり,かつアンモニアを用いて
常用の処理をしながら除去可能である。
【0032】また,RNA鎖の合成は,適当な核酸ポリ
メラーゼによる核酸鋳型からの転写によって実施するこ
とができる。好ましくは,鋳型はDNA鋳型であり,核
酸ポリメラ−ゼはDNA依存RNAポリメラーゼであ
る。よりいっそう好ましくは,DNA依存RNAポリメ
ラーゼは,著しく進行的なバクテリオファージRNAポ
リメラーゼであるT7,T3およびSP6ポリメラーゼ
からなる群から選択される。これらのポリメラーゼの中
で,T7RNAポリメラーゼが最も好ましい。修飾RN
A分子の合成のためのDNA鋳型は,本発明によれば,
有利に望ましいRNA配列を解読する合成DNA断片を
プラスミドの適当な部位中に挿入することによって構成
され,この場合このプラスミドは,それぞれのRNAポ
リメラーゼに対するプロモーターからなり,部位は,プ
ラスミドのこのような1つの位置に位置しており,した
がって合成DNA断片は,プロモーターから転写される
ことができる。転写反応は,有利にランオフ転写として
実施される。また,合成DNA断片は,プラスミド部分
なしに転写鋳型として役立つことができる。しかし,効
果的なRNA合成を可能にする断片は,転写出発信号を
有する。
【0033】2’−デオキシ−2’−ハロゲンヌクレオ
チド,例えば2’−デオキシ−2’−フルオロウリジ
ン,−オクチジン,−アデノシン,−グアノシンおよび
それぞれのクロロ化合物の重合は,有利に補助因子とし
てのMn2+イオンの存在下にT7ポリメラーゼによって
実施される。また,2’−アミノヌクレオチド,例えば
2’−デオキシ−2’−アミノウリジン,2’−デオキ
シ−2’−アミノサイチジン,2’−デオキシ−2’−
アミノアデノシンおよび2’−デオキシ−2’−アミノ
グアノシンの重合は,有利に補助因子としてのMg2+
オンの存在下に実施される。
【0034】次の実施例の実験データから,ハンマーヘ
ッドリボザイム中での2’−デオキシ−2’−フルオロ
ウリジンおよび2’−デオキシ−2’−アミノウリジン
の存在により,触媒活性が破壊されないことは明らかで
ある。このことは,基質部分で2’−フルオロウリジン
の存在に関して第3図に品質的に示されており,種々の
他の1対の酵素/基質に関して第1表に量的に示されて
いる。実際に,全ての修飾によりアミノ置換の最も代表
的な例であるKm値が増大した。しかし,活性構造のこ
の摂動は,異なる塩基組成物を用いてハンマーへッド系
について観察されるKm変量の範囲内に十分存在する
(Fedor&Uhlenbeck,上掲書)。付加的
に,著しく意外なことに,単独の2’−アミノウリジ
ン,直接に切断部位の5’を基質中に配合することによ
り,kcatは著しく増大し(第1表),したがって特異
的部位での2’−修飾ヌクレオシドの選択的な導入によ
って向上された活性のリボザイムを生産するものと考え
られる。この結果は,明らかに,触媒活性に関してハン
マーヘッド構造の酵素部分を通じての2−ヒドロキシル
基の存在は不必要であるが,しかし本発明による修飾は
少なくとも一定の位置で許容されることを示す。これと
は異なり,2’−デオキシヌクレオチド15%のみをハ
ンマーヘッドリボザイム中に配合することは,Kmに影
響を及ぼすことはないけれども,触媒作用の効率を2程
度のマグニチュードで減少させることが報告されている
(Perreault他(1990),前掲書)。切断
速度は,切断部位で燐上への2’−ヒドロキシルの攻撃
角度によって定められるので,この切断速度はハンマー
ヘッド系の全ての構造によって著しく影響を及ぼされ
る。従って,速度に対する2’−修飾の観察される影響
により,2’−フルオロ類縁物は,デオキシリボヌクレ
オタイドの場合よりも類似したリボヌクレオタイドの構
造に適合していることに注目すべきである。このこと
は,明らかに,アミノ類縁物に対しても支持される。本
発明による他の2’−修飾ヌクレオシドは,同様に触媒
活性を示す。
【0035】更に,本発明の他の目的は,殊にウイルス
もしくは他の異質遺伝的物質またはウイルスもしくは他
の異質遺伝的物質からの転写物の特異的切断のために治
療剤としてかまたは生化学的もしくは生物工学的方法に
おける生体触媒として,少なくとも1つの修飾ヌクレオ
チドからなる触媒活性を有するRNA分子の使用にあ
る。前記目的のために,本発明のRNA分子は,非修飾
の類縁物よりも適当であると思われる。それというの
も,このRNA分子により,化学的切断および/または
酵素的切断に対しての安定性が増大するからである。
【0036】更に,本発明は,第1図〜第7図の組合せ
で次の実施例によって詳説される。しかし,これらの実
施例は,本発明の範囲を狭くする意図のものではない。
【0037】
【実施例】例1 オリゴリボヌクレオチドの調製 オリゴリボヌクレオチドの自動化合成:自動化オリゴリ
ボヌクレオチド合成を,ミリゲン/バイオサーチ社(M
illigen/Biosearch)によって供給さ
れる単量体リボヌクレオチドホスホルアミダイトを使用
して1マイクロモルの規模でアプライドバイオシステム
ズ(Applied Biosystems)380B
DNA 合成装置を用いて実施した。対照多孔質ガラ
スカラムにカップリングしたリボヌクレオシドを有する
対照多孔質ガラスカラムは,ミリゲン/バイオサーチ社
(Milligen/Biosearch)またはペニ
ンスラ社(Peninsu1a)の製品であった。オリ
ゴマーをリボヌクレオチドホスホルアミダイトの供給業
者(Milligen/Biosearch)の仕様書
に応じて後処理した。保護基の除去後,オリゴリボヌク
レオチドをアミコン(Amicon)フィルター膜セン
トリコン(centricon)10上でスピン透析
(spin dialysis)によって濃縮し,エタ
ノールを沈殿させた。乾燥したぺレットを水50μl中
に入れ,PAGEを行なった。バンドをUV照射によっ
て可視化し,切断し,RNAを緩衝液(酢酸アンモニウ
ム0.25モル,トリス/HCl 10ミリモル pH
8.0,EDTA1ミリモル)(Feder&Uhle
nbeck,PNAS USA87(1990),16
68−1672)中で37℃で1晩中溶離することによ
って単離した。刊行物(Feder&Uhlenbec
k 1990)に記載された6600M-1cm-1のヌク
レオチドにつき吸光係数を使用して濃度を測定した。オ
リゴリボヌクレオチドの水溶液を−20℃で貯蔵した。
【0038】ランオフ転写のための鋳型を含有するプラ
スミドの構成:次のオリゴデオキシヌクレオチドをアプ
ライドバイオシステムズ(Applied Biosy
stems)380B DNA 合成装置を用いてホス
ホルアミダイト方法によってプラスミド構成のために合
成した:RS2−T,5’−d(GATATCCTGA
CTCCCTATAGTGAGTCGTATTA)−
3;RS2−T,5’−d(TAATACGACTCA
CTATAGGGAGTCAGGATATCTGCA)
−3’;RE1−T,5’−d(GGAGTTTCGG
CCTAACGGCCTCATCAGAGGACCCT
ATAGTGAGTCGTATTA)−3’およびRE
2−C,5’−d(TAATACGACTCACTAT
AGGGTCCTCTGATGAGGCCGTTAGG
CCGAAACTCCTGCA)−3’。
【0039】リボザイムpUCRSおよびpUCRE1
6クローンの調製:市場で入手できるプラスミドpUC
19を1工程反応で制限酵素Iso−SacIおよびP
stIを使用して切断した。次に,DNAを2%の寒天
ゲル電気泳動によって精製し,引続きアミコン(Ami
con)社によって供給されるセントリコン(Cent
ricon)30中心溶離装置(centroelut
ion apparatus)を使用して電気溶離によ
って精製した。1対のオリゴヌクレオチドプライマー,
RE1−TおよびRE2−C(リボザイム酵素)または
RS2−TおよびRS2−C(リボザイム基質)を前記
の記載のようにしてホスホリル化した(Taylor
他,Nucleic Acids Res,13(19
85),8749−8764)。これらの1対のオリゴ
ヌクレオチドを,キングおよびブレイクスレー(Kin
g&Blakesley)(Focus8(198
6),1−3)の方法によりpUCRE16を生じるリ
ボザイムのDNA配列またはpUCRSを生じるリボザ
イム基質と一緒にT7プロモーターのクローニングに使
用した。感応細胞(Olsen&Eckstein,P
NASUSA 87(1990),1451−145
6)の形質転換後に,白色コロニーを,pUCRE16
の場合には第2AvaII部位の存在に対してスクリー
ニングし,pUCRSに関してはユニークEcoRV部
位の存在に対してスクリーニングした。それぞれのクロ
ーンからの精製二本鎖DNAの配列をオルセン(Ols
en)およびエックシュタイン(Eckstein)
(NucleicAcids Res.17 198
9),9613−9620)の方法によって測定した。
【0040】T7 RNAポリメラーゼランオフ転写
物:T7 RNAポリメラーゼランオフ転写物を,ミリ
ガン(Milligan)およびウーレンべック(Uh
lenbeck)(Meth.in Enzymolo
gy 180A(1989),51−62)によって記
載された方法に適合させることによって150μl〜5
00μlの規模で合成させた。転写反応をトリス40ミ
リモル pH8.0,スペルミジン1ミリモル,DTT
5ミリモル,トリトンx−100 0.01%,MgC
220ミリモル,ヌクレオチド2.5ミリモル,DN
A鋳型200nM,ヒト胎盤RNアーゼ阻害剤0.2U
/μlおよびT7 RNA100U/μl中で実施し
た。2’−デオキシ−2’−フルオロヌクレオチドトリ
ホスフェートを使用した場合には,MgCl2をMnC
220ミリモルによって代替した。反応を37℃で3
時間実施した。転写物を上記のようにPAGEによって
精製した。オリゴリボヌクレオチドの水溶液を−20℃
で貯蔵した。
【0041】第1図は,PAGE後のpUCRSのT7
RNAポリメラーゼ ランオフ転写のオートラジオグ
ラフを示す。A:転写を150μlの規模でMgCl2
20ミリモルおよび4つのヌクレオシドトリホスフェー
トそれぞれ2.5ミリモル宛の存在下に37℃で3時間
実施した。反応混合物をアルカリホスファターゼでデホ
スホリル化し,かつポリヌクレオチドキナーゼおよび
[γ−32P]−ATPとの反応によって5’−32P標識
化した。標識化された転写混合物にPAGEを行なっ
た。B:150μlの規模でMnCl220ミリモル,
ATP0.5ミリモル,[α−32P]−ATP2μC
i,CTPおよびGTP2.5ミリモルおよび2’−フ
ルオロウリジントリホスフェート2.5ミリモルの存在
下に37℃で3時間転写を実施した。転写混合物に直接
PAGEを行なった。記号アステリスクは,32P−標識
化されたホスフェートを示す。’N’は,鋳型DNAの
全長に及ぶT7 RNAポリメラーゼによって添加され
た任意のヌクレオチドを表わす(Milligan a
nd Uhlenbeck,Meth,in Enzy
mology 180A(1989),51−62)。
【0042】第2図は,PAGE後の2’−アミノウリ
ジンを含有するpUCRE16のT7 RNAポリメラ
ーゼ ランオフ転写物のオートラジオグラフを示す。方
法1:化学的に合成された,34番目の遺伝標識E3を
含有する2’−アミノウリジン。方法2:150μlの
規模でMgCl220ミリモル,[α−32P]−ATP
60μCi,CTPおよびGTP1ミリモルおよび2’
−アミノウリジントリホスフェ−ト1ミリモルの存在下
に37℃で3時間転写を実施した。転写混合物に直接に
PAGEを施こした。
【0043】オリゴリボヌクレオチドの調製:次のオリ
ゴリボヌクレオチドを a.)ランオフ転写によって調製した(5’−トリホス
フェートなしに記載される配列): E1,5’−GGGUCCUCUGAUGAGGCCG
UUAGGCCGAAACUCC−3’; E2,5’−GGG(2’−FU)CC(2’−FU)
C(2’−FU)GA(2’−FU)GAGGCCG
(2’−FU)(2’−FU)AGGCCGAAAc
(2’−FU)cc−3’および E3,5’−GGG(2’−NH2U)CC(2’−N
2U)C(2’−NH2U)GA(2’−NH2U)G
AGGCCG(2’−NH2U)(2’−NH2U)AG
GCCGAAAC(2’−NH2U)CC−3’; S1,5’−GGGAGUCAGGAU−3’;S3,
5’−GGGAG(2’−FU)CAGGA(2’−F
U)−3’およびS4,5’GGGAGU(2’−F
C)AGGAU−3’ b)化学合成によって調製した:オリゴリボヌクレオチ
ドE1,E2,E3,S1およびS2,5’−GGGA
G(2’−NH2U)CAGGAU−3’。
【0044】オリゴリボヌクレオチドの5’−32P−標
識化:ランオフ転写から得られたオリゴリボヌクレオチ
ドを,製造業者(Diagen Inc.)によって記
載された記録によるキアゲンチップ(Quiagent
ip)20−カラムによって精製されかつT4 ポリヌ
クレオチドキナーゼおよびγ−32P−ATPで処理され
たRNアーゼ遊離牛アルカリホスファターゼを用いての
処理によってデホスホリル化した。標識化オリゴリボヌ
クレオチドをPAGEによって精製した。
【0045】実施例2:RNアーゼAを用いてのオリゴ
リボヌクレオチドの消化 RNアーゼAを用いてのオリゴリボヌクレオチドの部分
的消化:オリゴリボヌクレオチドE1およびE2にドニ
ス−ケラー(Donis−Keller)他(Nucl
eic Acids Res.4(1977),252
7−2538)の方法による5’−32P標識化後にRN
アーゼA消化を行ない,次に変化させた。5’−32P−
標識化RNA約25μモルを,尿素7モル,EDTA5
0ミリモル,ブロモフェノールブルー0.04%,キシ
レンシアノールFF0.04%および氷上のtRNA
0.25mg/mlを含有する緩衝液50μlに添加し
た。次に,RNAを5本の標識化管中に等量に分配し,
5分間50℃に加熱し,次いで直接に氷上に置いた。リ
ボヌクレアーゼA,2μl(2×10-4単位)を第1の
管に添加し,かつピペットを用いて混合した。次に,酵
素を5倍に希釈して連続的に,1つの管から次の管への
そのつどの転写の後に新しいピペットチップを使用して
3本の付加的な管中に入れた。5本目の管は対照の試料
であり,これには,酵素を添加しなかった。次に,全て
の管を50℃で5分間恒温保持し,氷上に置き,かつP
AGEによって分析した。
【0046】RNアーゼAによるオリゴリボヌクレオチ
ドの全崩壊:オリゴリボヌクレオチドS1およびS2を
次の記録による5’−32P標識化後にRNアーゼAで消
化した:オリゴマー(20μlの最終的容量中8.5μ
モル)をRNアーゼA1.25×10-3単位と,トリス
/HCl50ミリモル pH7.5およびMgCl2
0ミリモルを含有する緩衝液中で37℃で10分間反応
させた。生成物をPAGEによって分析した。
【0047】第3図は,PAGEによって分離された
5’−標識化ランオフ転写物E1およびE2の部分的リ
ボヌクレアーゼA切断のオートラジオグラフを示す。条
件は,前記のものと同様である。番号付けされた方法
は,1)添加された酵素なし,2)RNアーゼA2×1
-4単位,3)RNアーゼA3×10-5単位,4)RN
アーゼA8×10-4,5)RNアーゼA16×10-7
相当する。塩基の番号付けを,非修飾転写物のMn2+
介切断のバンドをカウントすることによって簡易化した
(MnCl210ミリモル中で3分間90℃に加熱した
RNA10μモル)。丸付け数字は,RNアーゼAの敏
感な切断位置から予想されるバンドを示す。矢印は,切
断位置3’からウリジンを生じかつリボザイムを含有す
る2’−フルオロウリジンが切断されるような方法で不
在であるバンドを示す。
【0048】第4図は,PAGE後のRNアーゼAによ
るS1およびS2の全崩壊のオートラジオグラフを示
す。この反応の詳細は,上記に記載されている。方法
1:12番目のS2の全消化;方法2:12番目のS1
の全消化;方法3:長さ標準として90℃で3分間Mn
Cl220ミリモルと反応させることによる34番目の
E1の切断ラダー。S2の切断生成物は,6位で2’−
アミノウリジンの存在を示すS1よりも長いヌクレオチ
ドである。
【0049】実施例3 リボザイムによるオリゴリボヌクレオチド基質の切断 切断速度の測定:切断反応をフェーダー(Fedor)
およびウーレンべック(Uhlenbeck)(199
0,上掲書)からの適した方法によって実施した。リボ
ザイム酵素(典型的に最終的容量20μl,最終的濃度
100nM,トリス/HCl50ミリモル,pH7.
5)および基質(典型的に40μl,最終的濃度2μモ
ル)の貯蔵溶液を別々に90℃で1分間加熱し,2価金
属イオン(MnCl2またはMgCl2,最終的濃度10
ミリモル)の添加前に15分間室温に冷却した。この貯
蔵溶液を分解反応の開始前に25℃で15分間別々に恒
温保持した。酵素10nMおよび基質50〜5000n
Mの典型的な濃度で,酵素を基質(トリス/HCl50
ミリモル,pH7.5,MgCl2,最終的容量20μ
l,最終的濃度10ミリモル)に添加することによって
反応を開始させた。規定時間でアリコート10μlを尿
素停止混合物10μl中に移し,かつPAGEを行なっ
た。オートラジオグラフをLKB ULTROSCAN
XLレーザーデンシトメー夕ー上で分析した。
【0050】研究されたハンマーヘッドリボザイム系の
場合には,12番目の基質オリゴヌクレオチド(Sとし
て示した)を冒頭の構造式中で矢印で示したサイチジン
−7の3’位で34番目の酵素オリゴヌクレオチド(E
として示した)によって分解した。この分解により,
2’−3’−環式ホスフェート末端を有するへプタマー
(生産物1)および5’−ヒドロキシル末端を有するへ
プタマー(生産物2)が発生する(Ruffner他,
Gene 82(1989),31−41)。これらの
型の切断生産物は,オリゴリボヌクレオチドE1および
S1を有するだけでなく,2’−フルオロウリジン含有
基質S3をも有することが観察される(第5図)。予想
されたように,2’−フルオロサイチジンを分解位置で
含有する基質オリゴヌクレオチドS4は,同一の条件下
では分解されなかった。これら2つの反応は,基質のオ
リゴヌクレオチド中に2’−フルオロウリジンを含有し
ていた。
【0051】しかし,有利に将来の用途によりいっそう
重要なことは,リボザイムの酵素部分中でのこの修飾の
存在により,このリボザイムの触媒活性が干渉されるか
否かの問題にある。従って,2’−フルオロウリジン含
有リボザイムE2と非修飾基質S1との反応が研究され
た。実際に,ゲル分析により,基質は1対のE1および
S1と同じ効率をもって分解されることが指摘された。
2’−フルオロウリジン含有リボザイムE2の触媒定数
は,測定され(第6図),かつ非修飾リボザイムE1の
場合と比較された。この比較により,前者の速度定数の
第2次数(kca t/Km=0.0026nM-1)は,後者
(kcat/Km=0.0023nM-1)の場合よりも小さ
いマグニチュードの1つの次数であることは明らかであ
る(Feder&Uhlenbeck(1990),上
掲書)。この触媒効率の減少は,第1に切断速度の減少
に基づくものであり,これとは異なり,リボザイム双方
のKm値は,ほぼ同一のものである。しかし,この減少
された切断速度は,異なる塩基組成物を用いて種々のハ
ンマーヘッド系に関して観察される切断効率の範囲内に
十分存在する(Feder&Uhlenbeck(19
90),上掲書)。ハンマーヘッドリボザイム反応は,
金属イオン補助因子としてのMgCl2ならびにMnC
2を用いて実施することができ,切断の半減期は,後
者の補助因子の存在下にほぼ10倍減少される(Uhl
enbeck,Nature 328(1987),5
96−609)。また,このようにMg2+からMn2+
のスイッチングの下で切断条件下で基質の半減期が減少
することにより,2’−フルオロウリジン含有酵素E2
と基質S1との反応が観察された。従って,切断反応に
必要とされる金属イオンは,2’−フルオロヌクレオチ
ド類縁物の配合では老化されない。
【0052】リボザイム中の2’−アミノウリジンの存
在の効果は,研究された。2’−アミノウリジン含有リ
ボザイムE3を非修飾基質S1と反応させる場合には,
触媒効率は,kcat/Km=0.0015nM-1のマグニ
チユードの程度に減少する。kcatは殆んど非老化のま
まであるけれども,この効率の減少は,明らかにより高
いKmに基づくものである。従って,2’−アミノウリ
ジンリボザイムの全効率は,2’−フルオロウリジン含
有リボザイムの1つと比較可能である。非修飾リボザイ
ムE1と選択的2’−アミノウリジン修飾基質S2との
補足的な反応の場合には,触媒効率は,上記反応と比較
されてkcat/Km=0.0063nM-1に増大される。
この効果は,全体的にkcatの増大に基づく。この傾向
は,2’−アミノウリジン含有リボザイムE3とS2と
の反応の場合により一層顕著になり,この場合触媒効率
は,kcat/Km=0.0011nM-1に増大され,また
主として増大されたkcatに基づくものである。上記反
応の全ての反応速度パラメーターは,第1表にまとめら
れている。
【表1】
【0053】従って,本明細書中に記載された反応速度
のデータは,2’−フルオロ−および2’−アミノウリ
ジン修飾リボザイムの切断効率が若干減少されるけれど
も,なお異なる塩基組成物のハンマーヘッド系に関して
観察される範囲内にあることを示す。また,特異的位置
で選択的に2’−修飾を導入することによって触媒効率
を増大させることが可能であることも明らかになる。後
者の効果は基質のオリゴリボヌクレオチドに関して証明
されたけれども,触媒の対する同様の影響を酵素の中で
選択的修飾に関して見い出すことができることが期待さ
れる。
【0054】第5図は,リボザイムE1による2’−フ
ルオロウリジンおよび32P−AMP含有基質S3の切断
のオートラジオグラフを示す。この切断反応は,MgC
210ミリモルの存在下にトリス/HCl 50ミリ
モル,pH7.5中で40μlの規模で25℃で実施さ
れた。E1およびS3の濃度は,それぞれ2.5μMお
よび7.5μMであった。他の全ての詳細は,上記に記
載されている(Determination of C
leavage Kinetics)。記載された時間
で,アリコート10μlをPAGEの前に水10μlお
よび尿素停止混合物10μl中に移した。方法1:0.
5分間後の反応;方法2:15分間後の反応;方法3:
3分間後の反応。アステリスクは,32P−標識化ホスフ
ェートを示す。
【0055】第6図は,E2とS1とのリボザイム反応
のエディー−ホフステーのプロットを示す。この切断反
応は,20μlの規模でMgCl210mMの存在下に
E2の10nMの濃度ならびに50nM,100nM,
200nM,400nM,500nおよび700nMの
S1濃度を用いて実施された。7分間後に,アリコート
10μlをPAGE前に水10μlおよび尿素停止混合
物10μl中に移した。この時間ポイントは,開始速度
の線状範囲内で減少することが先に確立された。オート
ラジオグラフをレーザーデンシトメーター上での光学密
度の組込みによって評価した。
【0056】第7図は,E3とS1とのリボザイム反応
のラインウィーヴァー−バークのプロットを示す。この
切断反応は,20μlの規模でMgCl210mMの存
在下にE3の10nMの濃度ならびに50nM,100
nM,200nM,400nM,500nおよび700
nMのS1濃度を用いて実施された。他の全ての詳細
は,第6図の場合と同様である。
【0057】実施例4 リボザイムを使用してのHIV−1 LTR RNAの
切断 プラスミドの構成:プラスミド,pOTH33,を位置
−525〜386のHIV−1配列(Ratner他,
Nature313(1985),277−284の配
列番号付けによる)を市場で入手し得るプラスミドpS
PT19(Pharmacia)にクローン化すること
によって構成させた。HIV配列は,T7プロモーター
(T7)の転写制御下にある。pOTH33の場合のH
IV挿入の図面による提示は,第8図に記載されてい
る。HIV−1 LTR領域は,U3領域,R領域およ
びU5領域からなる。このHIV−1 LTR領域は,
ポリプレントラクトによって5’−末位に隣接し,かつ
プライマー結合部位(PBS),リーダー配列およびg
ag遺伝子の一部によって3’−末位に隣接している。
位置−525および386での矢印は,pOTH33の
構成に使用される制限部位を示す。位置115の矢印
は,リボザイム仲介切断のための部位を示す。
【0058】ヌクレオチド−453〜182の長い末端
繰り返し配列を有する位置−525〜386のHIV−
1のRNAを,EcoRI切断プラスミドpOTH33
(DNA鋳型100ng/μl,DTT 10mM,そ
れぞれrNTP500μM,トリス−Cl 50mM,
pH7.5,スペルミジン2mM,MgCl26mM,
[α−32P]−ATP 2μCi/μl,RNアーゼ阻
害剤50U/μlおよびT7 RNAポリメラーゼ15
U/μl,4℃で2時間)をランオフ転写し,その後に
DNアーゼI(1U/μl,37℃で10分間)(RN
アーゼ不含)との反応混合物を恒温保持し,かつフェノ
ール−クロロホルム抽出することによって得た。得られ
たRNAは,LTR RNAとして記載されている。
【0059】有用な切断部位GUCを含有するHIV−
1 LTR RNAの位置115をリボザイム触媒切断
のための標的として選択した。この部位に対する標的の
ハンマーヘッドリボザイムを,化学的に合成した。非修
飾ハンマーヘッド酵素RE115のヌクレオチド配列
は,第9図に記載されている。
【0060】LTR RNAを用いての切断反応速度:
cat/Km値を単代謝回転の条件下で測定した。リボザ
イムをトリス−C1 50mM,pH7.5の存在下に
75℃で1分間予め恒温保持し,引続き37℃で5分間
恒温保持することによって測定した。MgCl2を10
mMの最終濃度に添加し,この溶液を再び37℃で5分
間恒温保持した。LTR RNAを直接に水溶液として
使用した。反応混合物(10μl)は,リボザイム20
nM〜1μM,トリス−Cl 50mM,pH7.5お
よびMgCl210mMを含有していた。LTR RN
Aを10nMの最終濃度に添加することによって反応を
開始させた。37℃で1時間後に,停止混合物10μl
を添加することによって反応を停止させ,かつPAGE
4%(長さ40cm,尿素8モル)によって分析した。
50Wでの1時間の電気泳動および引続くオートラジオ
グラフィーの後に,非切断LTR RNAの画分をレー
ザー走査デンシトメーター測定によって測定した。k
cat/Km値を,次の等式:
【数1】 〔式中,kは観察される反応速度であり,tは1時間の
反応時間である〕により,リボザイム濃度([RE])
に対してLTR RNAの残留断片(FracS)をプ
ロットすることによって得た。
【0061】2’−フルオロまたは2’−デオキシ置換
基および/または末端ホスホロチオエート結合を含有す
るRE115のリボザイムの幾つかの類縁物の触媒効率
に対する化学修飾の影響を研究するために,合成した。
2’−フルオロサイチジン置換基は触媒効率に対して何
らの効果も有しないけれども[第2表,RE115(F
C)],フルオロウリジン置換基は,kcat/Kmの5倍
の減少を生じた[第2表,RE115(FU)]。3個
の3’−末端ホスホロチオエート基との組合せ物中の1
つの5’−末端ホスホロチオエート基は,無視できる程
度にのみ触媒効率を減少させた[第2表,RE115
(S)]。同様のことは,2’−フルオロウリジン置換
基と一緒の末端ホスホロチオエート結合の組合せに関し
て実際のことであり,この場合には,kcat/Kmの他の
減少は観察されなかった[第2表,RE115(F
U),S]。全てのピリミジンリボヌクレオチドを2’
フルオロ類縁物によって置換し,かつ4個のホスホロチ
オエート結合を導入することにより,非修飾リボザイム
と比較して7倍だけ触媒効率は減少した[第2表,RE
115(FC,FU,S)]。これとは異なり,全ての
ピリミジンリボヌクレオチドをホスホロチオエートと結
合した2’−デオキシヌクレオシド類縁物によって置換
することにより,50倍のkcat/Kmの減少を生じた
[第2表,RE115(dC,dU,S)]。従って,
RE115(dC,dU,S)は,RE115(FC,
FU,S)よりも7倍少ない効率を有する。
【表2】
【0062】実施例5 オリゴリボヌクレオチドの安定性 実施例4のリボザイムをヌクレアーゼ消化に対する安定
性に関して試験した。 試験条件:媒体RMPI 1640中で細胞約106
mlの細胞濃度に成長した脱皮4クローン8細胞(Ju
rkierwicz,Deutsches Prinm
atenzentrum,Gottingenから入手
可能)の1000gをヘラオイス ミニヒユーゲ(He
raeus Minifuge)中で5分間遠心分離し
た。5’−32P−標識化リボザイムを90℃で1分間予
め加熱し,氷上で冷却し,細胞上澄み液に添加して30
0nMの最終濃度にし,かつ37℃で恒温保持した。ア
リコートを指摘された時間ポイントで取り出し,尿素8
モルを含有する20%のPAGEによって分析し,引続
きオートラジオグラフィー処理した。
【0063】結果:80%を上廻るRE115が,PA
GEを変性することによって指摘されるように細胞上澄
み液中での2分間の恒温保持後に分解された。しかし,
1時間以内のRE115(FC,FU,S)の分解は観
察されなかった。非修飾リボザイムの分解速度との比較
により,2’−修飾ピリミジンヌクレオシドと末端ホス
ホロチオエート結合との組合せにより,T細胞上澄み液
中に存在するヌクレアーゼによる消化に対するリボザイ
ム安定性よりも50倍増大したものと評価される。ホス
ホロチオエート基なしの2’−修飾リボザイムは,RE
115(FC,FU,S)の安定性よりも約2倍低い安
定性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】 第1図は,PAGE後のプラスミドpUCR
SのT7 RNAポリメラーゼ ランオフ転写物のオー
トラジオグラフを示す。
【図2】 第2図は,PAGE後の2’−アミノウリジ
ンを含有するプラスミドpUCREのT7 RNAポリ
メラーゼ ランオフ転写物のオートラジオグラフを示
す。
【図3】 第3図は,PAGEによって分離された5’
−標識化ランオフ転写物E1およびE2の部分的リボヌ
クレアーゼA切断のオートラジオグラフを示す。
【図4】 第4図は,RNア−ゼAによるS1およびS
2の全崩壊のオートラジオグラフを示す。
【図5】 第5図は,リボザイムE1による2’−フル
オロウリジンおよび 32P−AMP含有基質S3の切断の
オートラジオグラフを示す。
【図6】 第6図は,E2とS1とのリボザイム反応の
エディー−ホフステーのプロットを示す。
【図7】 第7図は,E3とS1とのリボザイム反応の
ラインウィーヴァー−バークのプロットを示す。
【図8】 第8図は,HIV−1配列をpOTH33中
にクローン化した体制を示す。
【図9】 第9図は,リボザイムRE115のヌクレオ
チド配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エクシュタイン, フリッツ ドイツ連邦共和国 D−3400 ゲッチンゲ ン ホルンダーシュテーク 6 (72)発明者 ピーケン, ヴォルフガング エイ. ドイツ連邦共和国 D−3400 ゲッチンゲ ン アウフ デア ヴェッセル 22 (72)発明者 ベンゼラー, フリッツ ドイツ連邦共和国 D−3400 ゲッチンゲ ン ハインリッヒ−ヴァルネッケ−シュト ラーセ 4 (72)発明者 オルセン, デイヴィド ビー. アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア 19486 ウェストポイント ダヴリュー ピー 42−300 ケア オヴ メルク,シ ャープ アンド ドーム リサーチ ラボ ラトリー (72)発明者 ウィリアムズ, デイヴィド エム. ドイツ連邦共和国 D−3400 ゲッチンゲ ン ヴィーゼンシュトラーセ 15 (72)発明者 ハイデンライヒ, オラーフ ドイツ連邦共和国 D−3400 ゲッチンゲ ン カロリーネンヴェーク 15 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 AA20 BA07 CA11 HA08 HA17 4B050 CC01 CC03 CC10 DD20 EE10 LL01 LL04 LL05 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 ZB33 ZC19 ZC55

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドから
    なる触媒活性を有するRNA分子において、リボース糖
    の2’−でのヒドロキシ基が、ハロゲン原子によって代
    替されていることを特徴とする、触媒活性を有するRN
    A分子。
  2. 【請求項2】 触媒活性がヌクレオチジルトランスフェ
    ラーゼ活性、デホスホリラーゼ活性、デオキシリボヌク
    レアーゼ活性および配列特異的エンドリボヌクレアーゼ
    活性からなる群の少なくとも1つを有する、請求項1記
    載のRNA。
  3. 【請求項3】 触媒活性が配列特異的エンドリボヌクレ
    アーゼ活性を有する、請求項2記載のRNA。
  4. 【請求項4】 ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピ
    ンRNAである、請求項3記載のRNA。
  5. 【請求項5】 修飾リボース糖に結合したヌクレオチド
    塩基がRNA中で天然に生じる塩基および置換塩基から
    なる群から選択されたものである、請求項1から4まで
    のいずれか1項に記載のRNA。
  6. 【請求項6】 置換ヌクレオチド塩基がキサンチン、ハ
    イポキサンチン、2,6−ジアミノプリン、2−ヒドロ
    キシ−6−メルカプトプリンおよび硫黄により6位で置
    換されたプリン塩基またはハロゲン原子もしくはC1
    5アルキル基により5位で置換されたピリミジン塩基
    から選択されている、請求項5記載のRNA。
  7. 【請求項7】 修飾リボース糖に結合したヌクレオチド
    塩基がRNA中で天然に生じる塩基である、請求項5記
    載のRNA。
  8. 【請求項8】 修飾リボース糖に結合したヌクレオチド
    塩基がピリミジン塩基である、請求項7記載のRNA。
  9. 【請求項9】 1つの特異的種類の全てのヌクレオチド
    塩基が修飾リボース糖に結合している、請求項1から8
    までのいずれか1項に記載のRNA。
  10. 【請求項10】 全てのウラシルヌクレオチド塩基が修
    飾リボース糖に結合している、請求項9記載のRNA。
  11. 【請求項11】 全てのサイトシンヌクレオチド塩基が
    修飾リボース糖に結合している、請求項9記載のRN
    A。
  12. 【請求項12】 2つの特異的種類の全てのヌクレオチ
    ド塩基が修飾リボース糖に結合している、請求項1から
    8までのいずれか1項に記載のRNA。
  13. 【請求項13】 全てのサイトシンおよびウラシルヌク
    レオチド塩基が修飾糖に結合している、請求項12記載
    のRNA。
  14. 【請求項14】 ヌクレオチド配列E2:5’−GGG
    (2’−FU)CC(2’−FU)C(2’−FU)G
    A(2’−FU)GAGGCCG(2’−FU)(2’
    −FU)AGGCCGAAAC(2’−FU)CC−
    3’からなるRNAにおいて、2’−FUが2’−デオ
    キシ−2’−フルオロウリジンモノホスフェートを表す
    ことを特徴とする、RNA。
  15. 【請求項15】 ヌクレオチド配列E3:5’−GGG
    (2’−NH2U)CC(2’−NH2U)C(2’−N
    2U)GA(2’−NH2U)GAGGCCG(2’−
    NH2U)(2’−NH2U)AGGCCGAAAC
    (2’−NH2U)CC−3’からなるRNAにおい
    て、2’−NH2Uが2’−デオキシ−2’−アミノウ
    リジンモノホスフェートを表すことを特徴とする、RN
    A。
  16. 【請求項16】 少なくとも1つの非修飾ヌクレオシド
    を含む、請求項1から8までのいずれか1項に記載のR
    NA。
  17. 【請求項17】 リボヌクレアーゼに対する高感受性部
    位でのヌクレオチドが修飾されている、請求項16記載
    のRNA。
  18. 【請求項18】 さらに少なくとも1つの修飾インター
    ヌクレオチドホスホジエステル結合を有する、請求項1
    から17までのいずれか1項に記載のRNA。
  19. 【請求項19】 修飾ホスホジエステル結合がホスホロ
    チオエートである、請求項18記載のRNA。
  20. 【請求項20】 少なくとも5’−末端ホスホジエステ
    ル結合が修飾されている、請求項18または19に記載
    のRNA。
  21. 【請求項21】 少なくとも3’−末端ホスホジエステ
    ル結合が修飾されている、請求項18から20までのい
    ずれか1項に記載のRNA。
  22. 【請求項22】 5’−末端ホスホジエステル結合およ
    び最後の3つの3’−末端ホスホジエステル結合が修飾
    されている、請求項18から21までのいずれか1項に
    記載のRNA。
  23. 【請求項23】 RNA鎖中に少なくとも1つの修飾ヌ
    クレオチドを配合することにより、触媒活性を有するR
    NA分子を合成する方法において、リボース糖の2’位
    でのヒドロキシ基をハロゲン原子によって代替すること
    を特徴とする、触媒活性を有するRNA分子の合成方
    法。
  24. 【請求項24】 RNA鎖の合成を固体支持体上でヌク
    レオチド前駆物質からの化学合成によって実施し、RN
    A生産物を固体支持体から除去し、かつ除去したRNA
    生産物を精製する、請求項23記載の方法。
  25. 【請求項25】 RNA鎖の合成を溶液中でヌクレオチ
    ド前駆物質からの化学合成によって実施し、かつRNA
    生産物を精製する、請求項23記載の方法。
  26. 【請求項26】 ホスホルアミダイトまたはH−ホスホ
    ネートをヌクレオチド前駆物質として使用する、請求項
    24または25に記載の方法。
  27. 【請求項27】 アミノ修飾基をトリフルオロアセチル
    アミド基の形でRNA鎖中に配合し、その後にトリフル
    オロアセチル保護基をアンモニアとの処理によって除去
    する、請求項24から26までのいずれか1項に記載の
    方法。
  28. 【請求項28】 さらにRNA鎖中に少なくとも1つの
    修飾インターヌクレオチドホスホジエステル結合を配合
    する、請求項23から27までのいずれか1項に記載の
    方法。
  29. 【請求項29】 修飾ホスホジエステル結合がホスホロ
    チオエート基である、請求項28記載の方法。
  30. 【請求項30】 RNA鎖の合成を核酸ポリメラーゼを
    用いて核酸鋳型からの転写によって実施する、請求項2
    3記載の方法。
  31. 【請求項31】 核酸鋳型がDNA鋳型であり、核酸ポ
    リメラーゼがDNA依存RNAポリメラーゼである、請
    求項30記載の方法。
  32. 【請求項32】 DNA依存RNAポリメラーゼがT
    7、T3およびSP6ポリメラーゼからなる群より選択
    される、請求項31記載の方法。
  33. 【請求項33】 DNA依存RNAポリメラーゼがT7
    ポリメラーゼである、請求項32記載の方法。
  34. 【請求項34】 RNA鎖の合成をMn2+イオンの存在
    下に実施する、請求30から33までのいずれか1項に
    記載の方法。
  35. 【請求項35】 請求項1から22までのいずれか1項
    に記載のRNAを使用している治療剤。
  36. 【請求項36】 請求項1から22までのいずれか1項
    に記載のRNAを使用している生体触媒。
  37. 【請求項37】 治療剤において、作用成分としての請
    求項1から22までのいずれか1項に記載のRNAを、
    場合によっては常用の充填剤、賦形剤、担持剤および希
    釈剤と一緒に含有することを特徴とする、治療剤。
  38. 【請求項38】 治療剤を製造する方法において、治療
    剤が作用成分としての請求項1から22までのいずれか
    1項に記載のRNAを場合によっては常用の充填剤、賦
    形剤、担持剤および希釈剤と一緒に含有することを特徴
    とする、治療剤の製造法。
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