JP2002101893A - 修飾リボザイム - Google Patents

修飾リボザイム

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JP2002101893A
JP2002101893A JP2001205286A JP2001205286A JP2002101893A JP 2002101893 A JP2002101893 A JP 2002101893A JP 2001205286 A JP2001205286 A JP 2001205286A JP 2001205286 A JP2001205286 A JP 2001205286A JP 2002101893 A JP2002101893 A JP 2002101893A
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ribose sugar
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フリッツ エクシュタイン，
Wolfgang A Pieken
ヴォルフガング エイ． ピーケン，
Fritz Benseler
フリッツ ベンゼラー，
David B Olsen
デイヴィド ビー． オルセン，
David M Williams
デイヴィド エム． ウィリアムズ，
Olaf Heidenreich
オラーフ ハイデンライヒ，
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】治療剤として使用することもでき、生化学的又
は生物工学的方法で生体触媒として使用することもでき
る。触媒活性と、化学的崩壊及び酵素的崩壊に対する増
大された安定性の双方を有するＲＮＡ分子の提供。 【解決手段】リボース糖の２’−でのヒドロキシ基が，
ハロゲン原子，スルフヒドリル基，アジド基，アミノ
基，モノ置換アミノ基及びジ置換アミノ基から選択され
た１つの修飾基によって代替されている，少なくとも１
つの修飾ヌクレオチドからなる触媒活性を有するＲＮＡ
分子，修飾ＲＮＡ分子の調製法並びに治療剤及び生体触
媒としての修飾ＲＮＡ分子、その合成並びに精製方法、
及び治療剤又は生体触媒としての使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、触媒活性を有する
ＲＮＡ分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】一定の天然に生じるリボ核酸（ＲＮＡ
ｓ）は，自己切断を行なう。第１に報告された例は，補
助因子としてのグアノシンを必要とする原生動物テトラ
ヒメナ（Ｃｅｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５９（１９９０），５４３−５６８参照）のリボソーム
ＲＮＡ前駆物質の切断である。その後に，ＲＮＡ切断の
多数の例がウイロイド，ウイルソイドおよびサテライト
ＲＮＡ中に見い出された（Ｓｈｅｌｄｏｎ他，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ（１９９０）第４巻，第２２７〜２４２頁，
Ｆ．ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ
編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｓｙｍｏｎｓ，ＴＩＢＳ １４
（１９８９），４４５−４５０）。この切断は，５’−
ヒドロキシルおよび２’，３’−環式ホスホジエステル
末端を生じるＭｇ2+のような二価陽イオンの存在下にホ
スホジエステル結合の部位特異的切断を包含する。この
ような幾つかのＲＮＡの自己切断の部位の周囲の連続的
分析により，"ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａ
ｄ）"構造と名付けられた切断にとって本質的な共通の
構造特徴の一致を導いた（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ他，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９８６）３６
２７−３６４０）。この構造は，１つの特殊な位置で切
断を受け入れる三次元構造を形成する，３個の螺旋およ
び１３個の保存ヌクレオチド（下記の図の中で枠で囲ん
だ部分）から構成されている。自己触媒された切断は，
通常，筋肉内プロセスであり，即ち単ＲＮＡ分子は，切
断に必要な全ての機能を有する。しかし，ウーレンべッ
ク（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）（Ｎａｔｕｒｅ ３２８（１
９８７），５９６−６００）は，このハンマーへッド構
造が一本鎖中に埋封されなければならないのではなく，
二本鎖から構成させることができることが証明された。
これら２つの鎖は結合してハンマーヘッド構造を形成
し，このハンマーヘッド構造は，鎖の１つ（Ｓ鎖）中で
（矢印で示されたような）ホスホジエステル結合の切断
を導き，これとは異なり，鎖の他方（ＡＥ鎖）は，老化
しないままでありかつ多数の切断反応を期待することが
できる。この鎖は酵素の定義に適合し，リボザイムと呼
ばれる。枠で囲まれた配列（下記の図）は，保存されて
いるけれども，他のものは変化可能であり，但し，一対
の塩基構造および一本鎖領域は，無傷のままである。
【化１】
【０００３】トリヌクレオチドＧＵＣ後の切断反応は，
詳細に研究された（Ｒｕｆｆｎｅｒ他，Ｇｅｎｅ ８２
（１９８９），３１−４１；Ｆｅｄｏｒ ａｎｄ Ｕｈ
ｌｅｎｂｅｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７（１９９０），１６６８−１６７
２）。新しい特異性を有するリボザイムも構成され（Ｈ
ａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ
３３４ （１９８８），５８５−５９１），この場合に
は，例えば配列ＧＵＡ，ＧＵＵ，ＣＵＣ，ＡＵＣおよび
ＵＵＣの後に切断が起こり得ることが指摘されている。
【０００４】更に，ＲＮＡ酵素の例は，ヘアピンＲＮＡ
（Ｈａｍｐｅｌ他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１８（１９９０），２９９−３０４），ならびにタ
ンパク質を含有するＲＮＡ，例えばテロメラ−ゼ（Ｇｒ
ｅｉｄｅｒおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ
３３７（１９８９），３３１−３３７）およびＲＮア−
ゼＰ（Ｂａｅｒ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎ
ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８
８），第３巻，第２３１〜２５０頁，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅ
ｉｎおよびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ編，Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅ
ｒｇ）である。
【０００５】リボザイムは，治療剤としての使用に特に
重要である（Ｒｏｓｓｉ ａｎｄＳａｒｖｅｒ， ＴＩ
ＢＴＥＣＨ ８（１９９０），１７９−１８３，参
照）。１つの可能な方法により，例えばウイルス遺伝子
および特殊な内因性遺伝子のような２つの異質遺伝子の
表現に必要とされるＲＮＡは破壊されうる。このこと
は，標的ＲＮＡと一緒にハンマーヘッド構造またはへア
ピン構造を形成することができかつこの構造を予め定め
られた位置で切断することができるＲＮＡ分子の構成を
必要とする。この方法によりＨＩＶ−１ウイルスを阻害
するための最初の適用は，報告された（Ｓａｒｖｅｒ
他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７（１９９０），１２２２−
１２２４）。生体内での標的ハンマーヘッドリボザイム
の作用の他の例は，カンメロン（Ｃａｍｍｅｒｏｎ）お
よびジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）によって報告さ
れており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６（１９８６），９１３９−９１４３），かつ
試験管内での場合は，コッテン（Ｃｏｔｔｅｎ）他によ
って報告されている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９
（１９８９），４４７９−４４８７）。
【０００６】更に，リボザイムの他の有用な触媒作用の
性質，例えばデホスホリラーゼ活性およびヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼ活性は，公知である（国際公開Ｗ
Ｏ８８／０４３００，参照）。この場合には，公知のタ
ンパク質酵素と区別される，高い配列特異性を有するオ
リゴヌクレオチド基質をデホスホリル化することができ
るＲＮＡ酵素が開示されている。ＲＮＡ分子は，ＲＮＡ
ポリメラーゼとして作用することができ，外側鋳型より
もむしろ内側鋳型を使用するようなタンパク質酵素と区
別される。従って，種々のヘテロポリマーは，変異型Ｒ
ＮＡ酵素形によって構成されうる。このことは，例えば
特殊なタンパク質またはペプチドのためにメッセンジャ
ーＲＮＡ分子を形成することができる。更に，ヘルシュ
ラーク（Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ）およびチェック（Ｃｅｃ
ｈ）（Ｎａｔｕｒｅ ３４４，（１９９０），４０５−
４０９）は，ＤＮアーゼ活性を有するＲＮＡ酵素を記載
している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ＲＮＡ酵素は，治療剤
として有用であるために，標的細胞中に導入されなけれ
ばならない。リボザイムを標的細胞中に運搬するために
主要な２つの方法が存在する： （ａ）予め形成された合成ＲＮＡの外因性の運搬； （ｂ）プラスミド上に位置したリボザイム解読遺伝子の
内因性転写。
【０００８】方法（ａ）の重大な欠点は，生存している
細胞内に存在する種々のリボヌクレアーゼ酵素による迅
速な崩壊に基づく生理的条件下でのＲＮＡ分子の著しく
低い安定性にある。方法（ｂ）の欠点は，特異的および
安定的にリボザイム解読遺伝子を高級有機物の細胞中に
挿入することの著しい困難さをまねく。更に，生体内で
合成されたＲＮＡ分子を用いた場合には，崩壊の問題も
起こる。
【０００９】従って，本発明の基礎を為す問題は，治療
剤として使用することもでき，生化学的または生物工学
的方法で生体触媒として使用することもできる，触媒活
性と，化学的崩壊および酵素的崩壊に対する増大された
安定性の双方を有するＲＮＡ分子を提供することであっ
た。
【００１０】しかし，パーロールト（Ｐｅｒｒｅａｕｌ
ｔ）他による最近の刊行物（Ｎａｔｕｒｅ ３４４（１
９９０），５６５−５６７）の記載から，ＲＮＡ酵素の
一定の修飾，例えばリボザイムの少数の位置での２’−
デオキシリボヌクレオチドの取り込みにより触媒活性の
著しい損傷が生じることは，知られていた。
【００１１】
【課題を解決するための手段】ところで，意外なこと
に，一定の化学的修飾は，ＲＮＡ分子の安定性を増大さ
せるリボース糖の２’位でリボザイムの触媒作用の性質
に殆ど影響を与えずおよび／またはこの性質を破壊しな
いことが見い出された。
【００１２】従って，本発明の目的は，リボース糖の
２’位でのヒドロキシ基がハロゲン原子，スルフヒドリ
ル基，アジド基，アミノ基，モノ置換アミノ基およびジ
置換アミノ基から選択された変更因子基によって代替さ
れているような少なくとも１つの修飾ヌクレオシドから
なる触媒活性を有するＲＮＡ分子を提供することであ
る。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明によるＲＮＡ分子の触媒活
性は，有利にヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性，
デホスホリラーゼ活性，デオキシリボヌクレアーゼ活性
および配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性からなる
群の少なくとも１つを有する。有利に触媒活性は，配列
特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を有する。よりいっ
そう有利には，ＲＮＡは，上記のようなハンマーヘッド
リボザイムである。殊に有利なのは，リボザイムが別の
ＲＮＡ鎖と結合することができ，２本の鎖からなるハン
マーヘッド構造を形成することであり，この場合修飾Ｒ
ＮＡ鎖は，上記のようにＥ鎖である。
【００１４】ハンマーヘッドリボザイムは殊に好ましい
けれども，他のＲＮＡ酵素，例えば天然に生じる形また
はその短縮された形（Ｚａｎｇ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２７（１９８８），８９２４−８９３１）のテ
トラヒメナリボザイム（Ｃｅｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９０），５４３−５６８）お
よび殊にヘアピンＲＮＡ（Ｈａｍｐｅｌ他，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１９９０）２９９−
３０４）またはＲＮＡ含有タンパク質，例えばＲＮア−
ゼ Ｐ（Ｂａｅｒ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ＆Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８），第３
巻，第２３１〜２５０頁，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎおよび
Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒ
ｌａｇＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ），トロメラーゼ（Ｇｒｅ
ｉｄｅｒおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３
３７（１９８９），３３１−３３７）も，本発明によっ
て包含される。
【００１５】また，リボース糖の２’位での変更因子基
の配合は，選択の二者択一的作業周期（Ｔｕｅｒｋおよ
びＧｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（１９９０），５
０５−５１０；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａ
ｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６（１９９０），８１８−８
２２）に依存する方法によって誘導されたかまたは任意
の他の方法によって誘導された新しい官能基を有するＲ
ＮＡに特に有用であると思われる。
【００１６】リボース糖の２’位のヒドロキシ基の代わ
りの変更因子基は，ハロゲン原子，スルフヒドリル基，
アジド基，アミノ基，モノ置換アミノ基およびジ置換ア
ミノ基から選択される。ハロゲン原子は，弗素原子，塩
素原子，臭素原子または沃素原子であることができ，こ
の場合には弗素原子が好ましい。置換アミノ基の置換分
は，有利にＣ1〜Ｃ3アルキル基および／またはヒドロキ
シアルキル基である。最も好ましくは，変更因子基は，
ハロゲン原子または非置換アミノ基である。
【００１７】リボース糖の２’位での変更因子基の配合
は，酵素切断に対するＲＮＡ安定性を著しく増大させ
る。リボザイムの特異的位置で配合された２’−デオキ
シ−２’−フルオロウリジンおよび２’−デオキシ−
２’−アミノウリジンは，これらの位置でＲＮアーゼ
Ａによって切断を阻止することが確認された（第３図お
よび第４図，参照）。この酵素は，ピリミジンヌクレオ
シドの３’位で切断され，かつ２’−ヒドロキシル基の
存在を必要とする（ＵｃｈｉｄａおよびＥｇａｍｉ（１
９７１），Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ 第ＩＶ巻，第３編
（Ｐ．Ｄ．Ｂｏｙｅｒ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，第２０５〜２５０頁）。更に，ポリヌクレオチド
を用いて得られた結果は，２’−アミノ官能基の存在に
より，へビ毒ホスホジエステラーゼのような非特異的ヌ
クレアーゼによる分解が減退されることを示す（Ｈｏｂ
ｂｓ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２（１９７
３），５１３８−５１４５）。２’−ハロゲン原子の存
在は，ＤＮアーゼ Ｉのようなヌクレアーゼを阻害する
（Ｈｏｂｂｓ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１（１
９７２），４３３６−４３４４）。また，ポリヌクレオ
チドを用いての結果は，ヌクレオチドの２’位でのハロ
ゲン原子の存在により，ヒト血清ヌクレアーゼの作用か
ら保護されることを示す（Ｂｌａｃｋ他，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ ４８（１９７２）５３７−５４５）。従って，修
飾リボース糖の配合による保護は，むしろ一般的であ
り，かつ２’−ヒドロキシル基の存在に依存するＲＮア
ーゼに制限されない。
【００１８】リボ核酸の場合，リボース糖は，Ｎ−グリ
コシド結合を介してヌクレオチド塩基に結合されてい
る。本発明のＲＮＡ分子において修飾リボース糖に結合
されているヌクレオチド塩基は，ＲＮＡ中で天然に生じ
る塩基および置換塩基からなる群から選択されている。
有利に修飾リボースは，ＲＮＡ中の天然塩基であるアデ
ニン，グアニン，サイトシンおよび／またはウラシルに
結合している。しかし，修飾リボースは，有利にキサン
チン，ハイポキサンチン，２，６−ジアミノプリン，２
−ヒドロキシ−６−メルカプトプリンから選択された置
換塩基および硫黄により６位で置換されたプリン塩基ま
たはハロゲン原子もしくはＣ1〜Ｃ5アルキル基，殊に臭
素原子もしくはメチル基により５位で置換されたピリミ
ジン塩基に結合されていてもよい。修飾リボースに結合
された最も有利なヌクレオチド塩基はウラシルである。
【００１９】ＲＮＡ分子中に配合されている修飾ヌクレ
オシドは，早期に記載された化合物であるかまたは公知
化合物と同様に製造することができる化合物である。リ
ボヌクレオシドの最も好ましいフルオロ類縁物およびア
ミノ類縁物，例えば２’−デオキシ−２’−フルオロサ
イチジン（Ｄｏｅｒｒ＆Ｆｏｘ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．３２（１９６７），１４６２；Ｍｅｎｇｅｌ＆Ｇｕ
ｓｃｈｌｂａｕｅｒ，Ａｎｇ．Ｃｈｅｍ．９０（１９７
８），５５７−５５８）；２’−デオキシ−２’−フロ
オロアデノシン（Ｉｋｅｈａｒａ＆Ｍｉｋｉ，Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６（１９７８），２４４
９−２４５３），２’−デオキシ−２’−フロオロウリ
ジン（Ｃｏｄｉｎｇｔｏｎ他，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．
２９（１９６４），５５８−５６４），２’−デオキシ
−２’−アミノウリジン（ａＶｅｒｈｅｙｄｅｎ他，
Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３６（１９７１），２５０）お
よび２’−デオキシ−２−アミノサイチジン（Ｖｅｒｈ
ｅｙｄｅｎ他，（１９７１）上掲書）は，早期に記載さ
れたものである。前記化合物の幾つかの合成には，最近
の合成法を使用することができる。２’−デオキシ−
２’−フルオロサイチジンは，サング（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ．４７（１９８２），３６２３−３６２８）の方
法により２’−デオキシ−２’−フロオロウリジンから
得ることができる。同様の方法は，２’−デオキシ−
２’−アジドサイチジンへの２’−デオキシ−２’−ア
ジドウリジンの形質転換に使用することができる（Ｖｅ
ｒｈｅｙｄｅｎ他，（１９７１）上掲書）。この２’−
デオキシ−２’−アジドサイチジンは，ムンガル（Ｍｕ
ｎｇａｌｌ）他（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４０（１９７
５），１６５９）の方法によって２’−デオキシ−２’
−アミノサイチジンに還元することができる。
【００２０】２’−フルオロヌクレオシド ５’−トリ
ホスフェートの合成は，ルートビッヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）
（Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ，
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ．１６（１９８１），１３
１−１３３）の方法により実施することができるかまた
はルートビッヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）およびエックシュタイ
ン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４
（１９８９），６３１−６３５）の方法により実施する
ことができる。２’−デオキシ−２’−アミノウリジン
および−サイチジン ５’−トリホスフェートは，ホッ
ブス（Ｈｏｂｂｓ）他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
２（１９７３），５１３８−５１４５）によるジホスフ
ェ−トに関する記載と同様にして，ピロホスフェートを
ホスフェートの代わりに使用する変法を用いて得ること
ができる。自動化オリゴヌクレオチド合成のための２’
−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド ３’−ホス
ホルアミダイトは，シンハ（Ｓｉｎｈａ）他（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１９８４），４５
３９−４５５７）の方法によって得ることができる。相
応する２’−アミノ誘導体の合成に関連して，アミノ基
は，イマザワ（Ｉｍａｚａｗａ）およびエックシュタイ
ン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４
（１９７９），２０３９−２０４１）の記載によりトリ
フルオロアセチル化によって保護されていてもよい。
【００２１】本発明によるＲＮＡは，少なくとも１つの
修飾ヌクレオシドを有し，この場合リボースの２’位で
のヒドロキシ基は，変更因子基によって代替されてい
る。本発明の１つの好ましい実施態様は，残存する３個
のヌクレオシドは非修飾糖を含有するけれども，１種類
の全部のヌクレオシド（即ち，アデノシンまたはグアノ
シンまたはサイチジンまたはウリジン）が修飾糖を含有
するような１つのＲＮＡ分子にある。よりいっそう好ま
しくは，修飾ヌクレオシドは，ピリミジンヌクレオシ
ド，即ちサイチジンもしくはウリジンまたはその置換誘
導体である。最も好ましくは，修飾糖は，２’−フルオ
ロリボ−スまたは２’−アミノリボースである。この実
施態様の例は，フェドール（Ｆｅｄｏｒ）およびウーレ
ンべック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７（１９９０），１６
６８−１６７２）によって記載されたハンマーヘッドリ
ボザイムＥ１から誘導されたハンマーへッドリボザイム
Ｅ２およびＥ３である。Ｅ２の場合，全てのウリジン残
基は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンによって
代替されており，Ｅ３の場合には，全てのウリジン残基
は，２’−デオキシ−２’−アミノウリジン残基によっ
て代替されている。リボザイムＥ２およびＥ３は，非修
飾ＲＮＡ分子Ｅ１の場合と比較可能であるリボヌクレア
ーゼ活性を示す。
【００２２】本発明のもう１つの好ましい実施態様の場
合，残存する２個のヌクレオシドは非修飾糖を含有する
けれども，２つの異なる種類の全てのヌクレオシドは，
修飾糖を含有する。よりいっそう好ましくは，全てのピ
リミジンヌクレオシド，即ちサイチジンおよびウリジン
（置換ピリミジン塩基を含む）は，修飾糖を含有し，最
も好ましくは，２’−フルオロまたは２’−アミノリボ
ース誘導体を含有する。
【００２３】更に，なお本発明による実施態様は，所
謂"選択的修飾パターン"と表わされる（即ち，ヌクレオ
シドが修飾されており，非修飾である）修飾パターンを
有するＲＮＡ分子にある。他の特異的に選択された位置
でのヌクレオシドは非修飾であることができるけれど
も，選択的修飾パターンを有するＲＮＡは，特異的に選
択された位置でのヌクレオシドが修飾されていてもよい
１つの分子にある。例えば，リボヌクレアーゼに対する
高感受性部位であることが知られている（例えば，ＲＮ
Ａ分子の二次構造に基づく）ヌクレオシドは，修飾さ
れ，ＲＮＡ分子の延長された生存時間を達成する。リボ
ヌクレアーゼ高感受性部位の１つの例は，リボザイムＥ
１の２１位で得られる。第３図で示したように，ＲＮＡ
分子は，この位置でＲＮアーゼによって著しく強力に切
断される。
【００２４】更に，本発明のもう１つの実施態様は，付
加的に少なくとも１つの修飾インターヌクレオチドホス
ホジエステル結合を有するＲＮＡ分子にある。適当な修
飾ホスホジエステル結合の例は，メチルホスホネート基
またはホスホロチオエート基であり，このホスホロチオ
エート基は，殊に好ましい。好ましくは，少なくともＲ
ＮＡ分子の５’−末端ホスホジエステル結合および／ま
たは３’−ホスホジエステル結合は，修飾されている。
よりいっそう好ましくは，５’−末端ホスホジエステル
結合および最後の３個の３’−末端ホスホジエステル結
合は，修飾されている。
【００２５】分解に対する増大された安定性を得るため
には，修飾インターヌクレオチド結合だけの存在では不
十分であることが見い出された。しかし，２’−修飾リ
ボースと，修飾インターヌクレオチド結合との合わされ
た存在により，付加的な安定性を向上させる効果を示し
た。双方の修飾による５０倍を上廻る安定性の増大によ
り，非修飾リボザイムと比較して切断の減少された効率
は凌駕される。
【００２６】修飾インターヌクレオチド結合を有するＲ
ＮＡ分子の合成は，有利に下記したような化学合成によ
り達成される。
【００２７】本発明のもう１つの目的は，ＲＮＡ鎖中に
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを配合し，その際に
リボース糖の２’位でのヒドロキシ基をハロゲン原子，
スルフヒドリル基，アジド基，アミノ基，モノ置換アミ
ノ基およびジ置換アミノ基から選択された変更因子基に
よって代替することを特徴とする，触媒活性を有するＲ
ＮＡ分子の合成法である。
【００２８】有利に，変更因子基は，ハロゲン原子（即
ち，弗素原子，塩素原子，臭素原子または沃素原子）ま
たはアミノ基であり，よりいっそう有利には，弗素原子
または非置換アミノ基である。また，本発明による方法
が少なくとも２個の異なる変更因子基（即ち，弗素原子
およびアミノ基）を有するヌクレオチドを配合するよう
なＲＮＡ分子の合成からなることは，注目すべきであ
る。
【００２９】この修飾ヌクレオチドをＲＮＡ中に配合す
るためには，有利に２つの方法が存在する。１つの方法
は，有利にヌクレオチド前駆物質としてのそれぞれのホ
スホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートを用いて固体
支持体上または溶液中で実施することができるＲＮＡ分
子の自動化化学合成によるものであり，他の方法は，
２’−修飾ヌクレオシド５’−トリホスフェートを使用
して適当な核酸，有利に核酸ポリメラーゼを有するＤＮ
Ａ鋳型の転写による酵素配合を包含する。自動化化学合
成を用いて，修飾インターヌクレオチド結合を有するＲ
ＮＡ分子は，相応する化学的に修飾されたヌクレオチド
前駆物質，例えばメチルホスホネート誘導体をＲＮＡ鎖
中に配合することによって得ることができる。ホスホロ
チオエート結合を配合するためには，標準ホスホルアミ
ダイト誘導体は，ヌクレオチド前駆物質として使用され
る。しかし，ＲＮＡ鎖に対する前駆物質のカップリング
が起こった後に，その後の酸化工程は，非修飾結合の場
合と同様に沃素を用いて実施されないが，しかし硫黄ま
たは硫化剤を用いて実施され，それによってホスホロチ
オエート基が得られる。
【００３０】修飾ＲＮＡ分子の化学合成は，当業界で知
られている，非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の場合と同
様に実施される。よりいっそう詳細には，ＲＮＡ合成
は，それぞれのヌクレオチド前駆物質の段階的添加を包
含する固体支持体上での化学合成によって実施される。
望ましい長さのＲＮＡ生産物を合成した後，ＲＮＡは，
常用の方法によって固体支持体から除去され，かつ有利
にゲル電気泳動法によって精製される。また，化学的Ｒ
ＮＡ合成は，固体支持体を使用することなしに任意の他
の公知技術によって実施することもできる。即ち，ＲＮ
Ａは，溶解可能な形で合成させることができ，かつその
後に当業界で知られた方法で精製させることができる。
【００３１】２’−アミノ変更因子基をＲＮＡ鎖中に配
合する場合には，この基は，ホスフィチル化反応（即
ち，ヌクレオチド前駆物質の製造）の前に保護されなけ
ればならず，かつその後の使用のためにカップリング反
応で保護されなければならない。この目的のために，ホ
リフルオロアセチル基は，有利に保護基として使用され
る。それというのも，この基は，核酸合成剤上での合成
の作業周期の間に安定であり，かつアンモニアを用いて
常用の処理をしながら除去可能である。
【００３２】また，ＲＮＡ鎖の合成は，適当な核酸ポリ
メラーゼによる核酸鋳型からの転写によって実施するこ
とができる。好ましくは，鋳型はＤＮＡ鋳型であり，核
酸ポリメラ−ゼはＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼであ
る。よりいっそう好ましくは，ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼは，著しく進行的なバクテリオファージＲＮＡポ
リメラーゼであるＴ７，Ｔ３およびＳＰ６ポリメラーゼ
からなる群から選択される。これらのポリメラーゼの中
で，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが最も好ましい。修飾ＲＮ
Ａ分子の合成のためのＤＮＡ鋳型は，本発明によれば，
有利に望ましいＲＮＡ配列を解読する合成ＤＮＡ断片を
プラスミドの適当な部位中に挿入することによって構成
され，この場合このプラスミドは，それぞれのＲＮＡポ
リメラーゼに対するプロモーターからなり，部位は，プ
ラスミドのこのような１つの位置に位置しており，した
がって合成ＤＮＡ断片は，プロモーターから転写される
ことができる。転写反応は，有利にランオフ転写として
実施される。また，合成ＤＮＡ断片は，プラスミド部分
なしに転写鋳型として役立つことができる。しかし，効
果的なＲＮＡ合成を可能にする断片は，転写出発信号を
有する。
【００３３】２’−デオキシ−２’−ハロゲンヌクレオ
チド，例えば２’−デオキシ−２’−フルオロウリジ
ン，−オクチジン，−アデノシン，−グアノシンおよび
それぞれのクロロ化合物の重合は，有利に補助因子とし
てのＭｎ2+イオンの存在下にＴ７ポリメラーゼによって
実施される。また，２’−アミノヌクレオチド，例えば
２’−デオキシ−２’−アミノウリジン，２’−デオキ
シ−２’−アミノサイチジン，２’−デオキシ−２’−
アミノアデノシンおよび２’−デオキシ−２’−アミノ
グアノシンの重合は，有利に補助因子としてのＭｇ2+イ
オンの存在下に実施される。
【００３４】次の実施例の実験データから，ハンマーヘ
ッドリボザイム中での２’−デオキシ−２’−フルオロ
ウリジンおよび２’−デオキシ−２’−アミノウリジン
の存在により，触媒活性が破壊されないことは明らかで
ある。このことは，基質部分で２’−フルオロウリジン
の存在に関して第３図に品質的に示されており，種々の
他の１対の酵素／基質に関して第１表に量的に示されて
いる。実際に，全ての修飾によりアミノ置換の最も代表
的な例であるＫm値が増大した。しかし，活性構造のこ
の摂動は，異なる塩基組成物を用いてハンマーへッド系
について観察されるＫm変量の範囲内に十分存在する
（Ｆｅｄｏｒ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，上掲書）。付加的
に，著しく意外なことに，単独の２’−アミノウリジ
ン，直接に切断部位の５’を基質中に配合することによ
り，ｋcatは著しく増大し（第１表），したがって特異
的部位での２’−修飾ヌクレオシドの選択的な導入によ
って向上された活性のリボザイムを生産するものと考え
られる。この結果は，明らかに，触媒活性に関してハン
マーヘッド構造の酵素部分を通じての２−ヒドロキシル
基の存在は不必要であるが，しかし本発明による修飾は
少なくとも一定の位置で許容されることを示す。これと
は異なり，２’−デオキシヌクレオチド１５％のみをハ
ンマーヘッドリボザイム中に配合することは，Ｋmに影
響を及ぼすことはないけれども，触媒作用の効率を２程
度のマグニチュードで減少させることが報告されている
（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ他（１９９０），前掲書）。切断
速度は，切断部位で燐上への２’−ヒドロキシルの攻撃
角度によって定められるので，この切断速度はハンマー
ヘッド系の全ての構造によって著しく影響を及ぼされ
る。従って，速度に対する２’−修飾の観察される影響
により，２’−フルオロ類縁物は，デオキシリボヌクレ
オタイドの場合よりも類似したリボヌクレオタイドの構
造に適合していることに注目すべきである。このこと
は，明らかに，アミノ類縁物に対しても支持される。本
発明による他の２’−修飾ヌクレオシドは，同様に触媒
活性を示す。
【００３５】更に，本発明の他の目的は，殊にウイルス
もしくは他の異質遺伝的物質またはウイルスもしくは他
の異質遺伝的物質からの転写物の特異的切断のために治
療剤としてかまたは生化学的もしくは生物工学的方法に
おける生体触媒として，少なくとも１つの修飾ヌクレオ
チドからなる触媒活性を有するＲＮＡ分子の使用にあ
る。前記目的のために，本発明のＲＮＡ分子は，非修飾
の類縁物よりも適当であると思われる。それというの
も，このＲＮＡ分子により，化学的切断および／または
酵素的切断に対しての安定性が増大するからである。
【００３６】更に，本発明は，第１図〜第７図の組合せ
で次の実施例によって詳説される。しかし，これらの実
施例は，本発明の範囲を狭くする意図のものではない。
【００３７】
【実施例】例１ オリゴリボヌクレオチドの調製 オリゴリボヌクレオチドの自動化合成：自動化オリゴリ
ボヌクレオチド合成を，ミリゲン／バイオサーチ社（Ｍ
ｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）によって供給さ
れる単量体リボヌクレオチドホスホルアミダイトを使用
して１マイクロモルの規模でアプライドバイオシステム
ズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ｂ
ＤＮＡ 合成装置を用いて実施した。対照多孔質ガラ
スカラムにカップリングしたリボヌクレオシドを有する
対照多孔質ガラスカラムは，ミリゲン／バイオサーチ社
（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）またはペニ
ンスラ社（Ｐｅｎｉｎｓｕ１ａ）の製品であった。オリ
ゴマーをリボヌクレオチドホスホルアミダイトの供給業
者（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）の仕様書
に応じて後処理した。保護基の除去後，オリゴリボヌク
レオチドをアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）フィルター膜セン
トリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０上でスピン透析
（ｓｐｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって濃縮し，エタ
ノールを沈殿させた。乾燥したぺレットを水５０μｌ中
に入れ，ＰＡＧＥを行なった。バンドをＵＶ照射によっ
て可視化し，切断し，ＲＮＡを緩衝液（酢酸アンモニウ
ム０．２５モル，トリス／ＨＣｌ １０ミリモル ｐＨ
８．０，ＥＤＴＡ１ミリモル）（Ｆｅｄｅｒ＆Ｕｈｌｅ
ｎｂｅｃｋ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ８７（１９９０），１６
６８−１６７２）中で３７℃で１晩中溶離することによ
って単離した。刊行物（Ｆｅｄｅｒ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃ
ｋ １９９０）に記載された６６００Ｍ-1ｃｍ-1のヌク
レオチドにつき吸光係数を使用して濃度を測定した。オ
リゴリボヌクレオチドの水溶液を−２０℃で貯蔵した。
【００３８】ランオフ転写のための鋳型を含有するプラ
スミドの構成：次のオリゴデオキシヌクレオチドをアプ
ライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）３８０Ｂ ＤＮＡ 合成装置を用いてホス
ホルアミダイト方法によってプラスミド構成のために合
成した：ＲＳ２−Ｔ，５’−ｄ（ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＡ
ＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ）−
３；ＲＳ２−Ｔ，５’−ｄ（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ
ＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡ）
−３’；ＲＥ１−Ｔ，５’−ｄ（ＧＧＡＧＴＴＴＣＧＧ
ＣＣＴＡＡＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＣＴ
ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ）−３’およびＲＥ
２−Ｃ，５’−ｄ（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ
ＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＡＧＧ
ＣＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡ）−３’。
【００３９】リボザイムｐＵＣＲＳおよびｐＵＣＲＥ１
６クローンの調製：市場で入手できるプラスミドｐＵＣ
１９を１工程反応で制限酵素Ｉｓｏ−ＳａｃＩおよびＰ
ｓｔＩを使用して切断した。次に，ＤＮＡを２％の寒天
ゲル電気泳動によって精製し，引続きアミコン（Ａｍｉ
ｃｏｎ）社によって供給されるセントリコン（Ｃｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ）３０中心溶離装置（ｃｅｎｔｒｏｅｌｕｔ
ｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して電気溶離によ
って精製した。１対のオリゴヌクレオチドプライマー，
ＲＥ１−ＴおよびＲＥ２−Ｃ（リボザイム酵素）または
ＲＳ２−ＴおよびＲＳ２−Ｃ（リボザイム基質）を前記
の記載のようにしてホスホリル化した（Ｔａｙｌｏｒ
他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１３（１９
８５），８７４９−８７６４）。これらの１対のオリゴ
ヌクレオチドを，キングおよびブレイクスレー（Ｋｉｎ
ｇ＆Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ）（Ｆｏｃｕｓ８（１９８
６），１−３）の方法によりｐＵＣＲＥ１６を生じるリ
ボザイムのＤＮＡ配列またはｐＵＣＲＳを生じるリボザ
イム基質と一緒にＴ７プロモーターのクローニングに使
用した。感応細胞（Ｏｌｓｅｎ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｐ
ＮＡＳＵＳＡ ８７（１９９０），１４５１−１４５
６）の形質転換後に，白色コロニーを，ｐＵＣＲＥ１６
の場合には第２ＡｖａＩＩ部位の存在に対してスクリー
ニングし，ｐＵＣＲＳに関してはユニークＥｃｏＲＶ部
位の存在に対してスクリーニングした。それぞれのクロ
ーンからの精製二本鎖ＤＮＡの配列をオルセン（Ｏｌｓ
ｅｎ）およびエックシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７ １９８
９），９６１３−９６２０）の方法によって測定した。
【００４０】Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼランオフ転写
物：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼランオフ転写物を，ミリ
ガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）およびウーレンべック（Ｕｈ
ｌｅｎｂｅｃｋ）（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ １８０Ａ（１９８９），５１−６２）によって記
載された方法に適合させることによって１５０μｌ〜５
００μｌの規模で合成させた。転写反応をトリス４０ミ
リモル ｐＨ８．０，スペルミジン１ミリモル，ＤＴＴ
５ミリモル，トリトンｘ−１００ ０．０１％，ＭｇＣ
ｌ2２０ミリモル，ヌクレオチド２．５ミリモル，ＤＮ
Ａ鋳型２００ｎＭ，ヒト胎盤ＲＮアーゼ阻害剤０．２Ｕ
／μｌおよびＴ７ ＲＮＡ１００Ｕ／μｌ中で実施し
た。２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドトリ
ホスフェートを使用した場合には，ＭｇＣｌ2をＭｎＣ
ｌ2２０ミリモルによって代替した。反応を３７℃で３
時間実施した。転写物を上記のようにＰＡＧＥによって
精製した。オリゴリボヌクレオチドの水溶液を−２０℃
で貯蔵した。
【００４１】第１図は，ＰＡＧＥ後のｐＵＣＲＳのＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ ランオフ転写のオートラジオグ
ラフを示す。Ａ：転写を１５０μｌの規模でＭｇＣｌ2
２０ミリモルおよび４つのヌクレオシドトリホスフェー
トそれぞれ２．５ミリモル宛の存在下に３７℃で３時間
実施した。反応混合物をアルカリホスファターゼでデホ
スホリル化し，かつポリヌクレオチドキナーゼおよび
［γ−32Ｐ］−ＡＴＰとの反応によって５’−32Ｐ標識
化した。標識化された転写混合物にＰＡＧＥを行なっ
た。Ｂ：１５０μｌの規模でＭｎＣｌ2２０ミリモル，
ＡＴＰ０．５ミリモル，［α−32Ｐ］−ＡＴＰ２μＣ
ｉ，ＣＴＰおよびＧＴＰ２．５ミリモルおよび２’−フ
ルオロウリジントリホスフェート２．５ミリモルの存在
下に３７℃で３時間転写を実施した。転写混合物に直接
ＰＡＧＥを行なった。記号アステリスクは，32Ｐ−標識
化されたホスフェートを示す。’Ｎ’は，鋳型ＤＮＡの
全長に及ぶＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって添加され
た任意のヌクレオチドを表わす（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａ
ｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｍｅｔｈ，ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ １８０Ａ（１９８９），５１−６２）。
【００４２】第２図は，ＰＡＧＥ後の２’−アミノウリ
ジンを含有するｐＵＣＲＥ１６のＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼ ランオフ転写物のオートラジオグラフを示す。方
法１：化学的に合成された，３４番目の遺伝標識Ｅ３を
含有する２’−アミノウリジン。方法２：１５０μｌの
規模でＭｇＣｌ2２０ミリモル，［α−32Ｐ］−ＡＴＰ
６０μＣｉ，ＣＴＰおよびＧＴＰ１ミリモルおよび２’
−アミノウリジントリホスフェ−ト１ミリモルの存在下
に３７℃で３時間転写を実施した。転写混合物に直接に
ＰＡＧＥを施こした。
【００４３】オリゴリボヌクレオチドの調製：次のオリ
ゴリボヌクレオチドを ａ．）ランオフ転写によって調製した（５’−トリホス
フェートなしに記載される配列）： Ｅ１，５’−ＧＧＧＵＣＣＵＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＧ
ＵＵＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＵＣＣ−３’； Ｅ２，５’−ＧＧＧ（２’−ＦＵ）ＣＣ（２’−ＦＵ）
Ｃ（２’−ＦＵ）ＧＡ（２’−ＦＵ）ＧＡＧＧＣＣＧ
（２’−ＦＵ）（２’−ＦＵ）ＡＧＧＣＣＧＡＡＡｃ
（２’−ＦＵ）ｃｃ−３’および Ｅ３，５’−ＧＧＧ（２’−ＮＨ2Ｕ）ＣＣ（２’−Ｎ
Ｈ2Ｕ）Ｃ（２’−ＮＨ2Ｕ）ＧＡ（２’−ＮＨ2Ｕ）Ｇ
ＡＧＧＣＣＧ（２’−ＮＨ2Ｕ）（２’−ＮＨ2Ｕ）ＡＧ
ＧＣＣＧＡＡＡＣ（２’−ＮＨ2Ｕ）ＣＣ−３’； Ｓ１，５’−ＧＧＧＡＧＵＣＡＧＧＡＵ−３’；Ｓ３，
５’−ＧＧＧＡＧ（２’−ＦＵ）ＣＡＧＧＡ（２’−Ｆ
Ｕ）−３’およびＳ４，５’ＧＧＧＡＧＵ（２’−Ｆ
Ｃ）ＡＧＧＡＵ−３’ ｂ）化学合成によって調製した：オリゴリボヌクレオチ
ドＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｓ１およびＳ２，５’−ＧＧＧＡ
Ｇ（２’−ＮＨ2Ｕ）ＣＡＧＧＡＵ−３’。
【００４４】オリゴリボヌクレオチドの５’−32Ｐ−標
識化：ランオフ転写から得られたオリゴリボヌクレオチ
ドを，製造業者（Ｄｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）によって記
載された記録によるキアゲンチップ（Ｑｕｉａｇｅｎｔ
ｉｐ）２０−カラムによって精製されかつＴ４ ポリヌ
クレオチドキナーゼおよびγ−32Ｐ−ＡＴＰで処理され
たＲＮアーゼ遊離牛アルカリホスファターゼを用いての
処理によってデホスホリル化した。標識化オリゴリボヌ
クレオチドをＰＡＧＥによって精製した。
【００４５】実施例２：ＲＮアーゼＡを用いてのオリゴ
リボヌクレオチドの消化 ＲＮアーゼＡを用いてのオリゴリボヌクレオチドの部分
的消化：オリゴリボヌクレオチドＥ１およびＥ２にドニ
ス−ケラー（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ）他（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４（１９７７），２５２
７−２５３８）の方法による５’−32Ｐ標識化後にＲＮ
アーゼＡ消化を行ない，次に変化させた。５’−32Ｐ−
標識化ＲＮＡ約２５μモルを，尿素７モル，ＥＤＴＡ５
０ミリモル，ブロモフェノールブルー０．０４％，キシ
レンシアノールＦＦ０．０４％および氷上のｔＲＮＡ
０．２５ｍｇ／ｍｌを含有する緩衝液５０μｌに添加し
た。次に，ＲＮＡを５本の標識化管中に等量に分配し，
５分間５０℃に加熱し，次いで直接に氷上に置いた。リ
ボヌクレアーゼＡ，２μｌ（２×１０-4単位）を第１の
管に添加し，かつピペットを用いて混合した。次に，酵
素を５倍に希釈して連続的に，１つの管から次の管への
そのつどの転写の後に新しいピペットチップを使用して
３本の付加的な管中に入れた。５本目の管は対照の試料
であり，これには，酵素を添加しなかった。次に，全て
の管を５０℃で５分間恒温保持し，氷上に置き，かつＰ
ＡＧＥによって分析した。
【００４６】ＲＮアーゼＡによるオリゴリボヌクレオチ
ドの全崩壊：オリゴリボヌクレオチドＳ１およびＳ２を
次の記録による５’−32Ｐ標識化後にＲＮアーゼＡで消
化した：オリゴマー（２０μｌの最終的容量中８．５μ
モル）をＲＮアーゼＡ１．２５×１０-3単位と，トリス
／ＨＣｌ５０ミリモル ｐＨ７．５およびＭｇＣｌ2１
０ミリモルを含有する緩衝液中で３７℃で１０分間反応
させた。生成物をＰＡＧＥによって分析した。
【００４７】第３図は，ＰＡＧＥによって分離された
５’−標識化ランオフ転写物Ｅ１およびＥ２の部分的リ
ボヌクレアーゼＡ切断のオートラジオグラフを示す。条
件は，前記のものと同様である。番号付けされた方法
は，１）添加された酵素なし，２）ＲＮアーゼＡ２×１
０-4単位，３）ＲＮアーゼＡ３×１０-5単位，４）ＲＮ
アーゼＡ８×１０-4，５）ＲＮアーゼＡ１６×１０-7に
相当する。塩基の番号付けを，非修飾転写物のＭｎ2+仲
介切断のバンドをカウントすることによって簡易化した
（ＭｎＣｌ2１０ミリモル中で３分間９０℃に加熱した
ＲＮＡ１０μモル）。丸付け数字は，ＲＮアーゼＡの敏
感な切断位置から予想されるバンドを示す。矢印は，切
断位置３’からウリジンを生じかつリボザイムを含有す
る２’−フルオロウリジンが切断されるような方法で不
在であるバンドを示す。
【００４８】第４図は，ＰＡＧＥ後のＲＮアーゼＡによ
るＳ１およびＳ２の全崩壊のオートラジオグラフを示
す。この反応の詳細は，上記に記載されている。方法
１：１２番目のＳ２の全消化；方法２：１２番目のＳ１
の全消化；方法３：長さ標準として９０℃で３分間Ｍｎ
Ｃｌ2２０ミリモルと反応させることによる３４番目の
Ｅ１の切断ラダー。Ｓ２の切断生成物は，６位で２’−
アミノウリジンの存在を示すＳ１よりも長いヌクレオチ
ドである。
【００４９】実施例３ リボザイムによるオリゴリボヌクレオチド基質の切断 切断速度の測定：切断反応をフェーダー（Ｆｅｄｏｒ）
およびウーレンべック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）（１９９
０，上掲書）からの適した方法によって実施した。リボ
ザイム酵素（典型的に最終的容量２０μｌ，最終的濃度
１００ｎＭ，トリス／ＨＣｌ５０ミリモル，ｐＨ７．
５）および基質（典型的に４０μｌ，最終的濃度２μモ
ル）の貯蔵溶液を別々に９０℃で１分間加熱し，２価金
属イオン（ＭｎＣｌ2またはＭｇＣｌ2，最終的濃度１０
ミリモル）の添加前に１５分間室温に冷却した。この貯
蔵溶液を分解反応の開始前に２５℃で１５分間別々に恒
温保持した。酵素１０ｎＭおよび基質５０〜５０００ｎ
Ｍの典型的な濃度で，酵素を基質（トリス／ＨＣｌ５０
ミリモル，ｐＨ７．５，ＭｇＣｌ2，最終的容量２０μ
ｌ，最終的濃度１０ミリモル）に添加することによって
反応を開始させた。規定時間でアリコート１０μｌを尿
素停止混合物１０μｌ中に移し，かつＰＡＧＥを行なっ
た。オートラジオグラフをＬＫＢ ＵＬＴＲＯＳＣＡＮ
ＸＬレーザーデンシトメー夕ー上で分析した。
【００５０】研究されたハンマーヘッドリボザイム系の
場合には，１２番目の基質オリゴヌクレオチド（Ｓとし
て示した）を冒頭の構造式中で矢印で示したサイチジン
−７の３’位で３４番目の酵素オリゴヌクレオチド（Ｅ
として示した）によって分解した。この分解により，
２’−３’−環式ホスフェート末端を有するへプタマー
（生産物１）および５’−ヒドロキシル末端を有するへ
プタマー（生産物２）が発生する（Ｒｕｆｆｎｅｒ他，
Ｇｅｎｅ ８２（１９８９），３１−４１）。これらの
型の切断生産物は，オリゴリボヌクレオチドＥ１および
Ｓ１を有するだけでなく，２’−フルオロウリジン含有
基質Ｓ３をも有することが観察される（第５図）。予想
されたように，２’−フルオロサイチジンを分解位置で
含有する基質オリゴヌクレオチドＳ４は，同一の条件下
では分解されなかった。これら２つの反応は，基質のオ
リゴヌクレオチド中に２’−フルオロウリジンを含有し
ていた。
【００５１】しかし，有利に将来の用途によりいっそう
重要なことは，リボザイムの酵素部分中でのこの修飾の
存在により，このリボザイムの触媒活性が干渉されるか
否かの問題にある。従って，２’−フルオロウリジン含
有リボザイムＥ２と非修飾基質Ｓ１との反応が研究され
た。実際に，ゲル分析により，基質は１対のＥ１および
Ｓ１と同じ効率をもって分解されることが指摘された。
２’−フルオロウリジン含有リボザイムＥ２の触媒定数
は，測定され（第６図），かつ非修飾リボザイムＥ１の
場合と比較された。この比較により，前者の速度定数の
第２次数（ｋca t／Ｋm＝０．００２６ｎＭ-1）は，後者
（ｋcat／Ｋm＝０．００２３ｎＭ-1）の場合よりも小さ
いマグニチュードの１つの次数であることは明らかであ
る（Ｆｅｄｅｒ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９９０），上
掲書）。この触媒効率の減少は，第１に切断速度の減少
に基づくものであり，これとは異なり，リボザイム双方
のＫm値は，ほぼ同一のものである。しかし，この減少
された切断速度は，異なる塩基組成物を用いて種々のハ
ンマーヘッド系に関して観察される切断効率の範囲内に
十分存在する（Ｆｅｄｅｒ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９
９０），上掲書）。ハンマーヘッドリボザイム反応は，
金属イオン補助因子としてのＭｇＣｌ2ならびにＭｎＣ
ｌ2を用いて実施することができ，切断の半減期は，後
者の補助因子の存在下にほぼ１０倍減少される（Ｕｈｌ
ｅｎｂｅｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３２８（１９８７），５
９６−６０９）。また，このようにＭｇ2+からＭｎ2+へ
のスイッチングの下で切断条件下で基質の半減期が減少
することにより，２’−フルオロウリジン含有酵素Ｅ２
と基質Ｓ１との反応が観察された。従って，切断反応に
必要とされる金属イオンは，２’−フルオロヌクレオチ
ド類縁物の配合では老化されない。
【００５２】リボザイム中の２’−アミノウリジンの存
在の効果は，研究された。２’−アミノウリジン含有リ
ボザイムＥ３を非修飾基質Ｓ１と反応させる場合には，
触媒効率は，ｋcat／Ｋm＝０．００１５ｎＭ-1のマグニ
チユードの程度に減少する。ｋcatは殆んど非老化のま
まであるけれども，この効率の減少は，明らかにより高
いＫmに基づくものである。従って，２’−アミノウリ
ジンリボザイムの全効率は，２’−フルオロウリジン含
有リボザイムの１つと比較可能である。非修飾リボザイ
ムＥ１と選択的２’−アミノウリジン修飾基質Ｓ２との
補足的な反応の場合には，触媒効率は，上記反応と比較
されてｋcat／Ｋm＝０．００６３ｎＭ-1に増大される。
この効果は，全体的にｋcatの増大に基づく。この傾向
は，２’−アミノウリジン含有リボザイムＥ３とＳ２と
の反応の場合により一層顕著になり，この場合触媒効率
は，ｋcat／Ｋm＝０．００１１ｎＭ-1に増大され，また
主として増大されたｋcatに基づくものである。上記反
応の全ての反応速度パラメーターは，第１表にまとめら
れている。
【表１】
【００５３】従って，本明細書中に記載された反応速度
のデータは，２’−フルオロ−および２’−アミノウリ
ジン修飾リボザイムの切断効率が若干減少されるけれど
も，なお異なる塩基組成物のハンマーヘッド系に関して
観察される範囲内にあることを示す。また，特異的位置
で選択的に２’−修飾を導入することによって触媒効率
を増大させることが可能であることも明らかになる。後
者の効果は基質のオリゴリボヌクレオチドに関して証明
されたけれども，触媒の対する同様の影響を酵素の中で
選択的修飾に関して見い出すことができることが期待さ
れる。
【００５４】第５図は，リボザイムＥ１による２’−フ
ルオロウリジンおよび32Ｐ−ＡＭＰ含有基質Ｓ３の切断
のオートラジオグラフを示す。この切断反応は，ＭｇＣ
ｌ2１０ミリモルの存在下にトリス／ＨＣｌ ５０ミリ
モル，ｐＨ７．５中で４０μｌの規模で２５℃で実施さ
れた。Ｅ１およびＳ３の濃度は，それぞれ２．５μＭお
よび７．５μＭであった。他の全ての詳細は，上記に記
載されている（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ
ｌｅａｖａｇｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）。記載された時間
で，アリコート１０μｌをＰＡＧＥの前に水１０μｌお
よび尿素停止混合物１０μｌ中に移した。方法１：０．
５分間後の反応；方法２：１５分間後の反応；方法３：
３分間後の反応。アステリスクは，32Ｐ−標識化ホスフ
ェートを示す。
【００５５】第６図は，Ｅ２とＳ１とのリボザイム反応
のエディー−ホフステーのプロットを示す。この切断反
応は，２０μｌの規模でＭｇＣｌ2１０ｍＭの存在下に
Ｅ２の１０ｎＭの濃度ならびに５０ｎＭ，１００ｎＭ，
２００ｎＭ，４００ｎＭ，５００ｎおよび７００ｎＭの
Ｓ１濃度を用いて実施された。７分間後に，アリコート
１０μｌをＰＡＧＥ前に水１０μｌおよび尿素停止混合
物１０μｌ中に移した。この時間ポイントは，開始速度
の線状範囲内で減少することが先に確立された。オート
ラジオグラフをレーザーデンシトメーター上での光学密
度の組込みによって評価した。
【００５６】第７図は，Ｅ３とＳ１とのリボザイム反応
のラインウィーヴァー−バークのプロットを示す。この
切断反応は，２０μｌの規模でＭｇＣｌ2１０ｍＭの存
在下にＥ３の１０ｎＭの濃度ならびに５０ｎＭ，１００
ｎＭ，２００ｎＭ，４００ｎＭ，５００ｎおよび７００
ｎＭのＳ１濃度を用いて実施された。他の全ての詳細
は，第６図の場合と同様である。
【００５７】実施例４ リボザイムを使用してのＨＩＶ−１ ＬＴＲ ＲＮＡの
切断 プラスミドの構成：プラスミド，ｐＯＴＨ３３，を位置
−５２５〜３８６のＨＩＶ−１配列（Ｒａｔｎｅｒ他，
Ｎａｔｕｒｅ３１３（１９８５），２７７−２８４の配
列番号付けによる）を市場で入手し得るプラスミドｐＳ
ＰＴ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローン化すること
によって構成させた。ＨＩＶ配列は，Ｔ７プロモーター
（Ｔ７）の転写制御下にある。ｐＯＴＨ３３の場合のＨ
ＩＶ挿入の図面による提示は，第８図に記載されてい
る。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ領域は，Ｕ３領域，Ｒ領域およ
びＵ５領域からなる。このＨＩＶ−１ ＬＴＲ領域は，
ポリプレントラクトによって５’−末位に隣接し，かつ
プライマー結合部位（ＰＢＳ），リーダー配列およびｇ
ａｇ遺伝子の一部によって３’−末位に隣接している。
位置−５２５および３８６での矢印は，ｐＯＴＨ３３の
構成に使用される制限部位を示す。位置１１５の矢印
は，リボザイム仲介切断のための部位を示す。
【００５８】ヌクレオチド−４５３〜１８２の長い末端
繰り返し配列を有する位置−５２５〜３８６のＨＩＶ−
１のＲＮＡを，ＥｃｏＲＩ切断プラスミドｐＯＴＨ３３
（ＤＮＡ鋳型１００ｎｇ／μｌ，ＤＴＴ １０ｍＭ，そ
れぞれｒＮＴＰ５００μＭ，トリス−Ｃｌ ５０ｍＭ，
ｐＨ７．５，スペルミジン２ｍＭ，ＭｇＣｌ2６ｍＭ，
［α−32Ｐ］−ＡＴＰ ２μＣｉ／μｌ，ＲＮアーゼ阻
害剤５０Ｕ／μｌおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ１５
Ｕ／μｌ，４℃で２時間）をランオフ転写し，その後に
ＤＮアーゼＩ（１Ｕ／μｌ，３７℃で１０分間）（ＲＮ
アーゼ不含）との反応混合物を恒温保持し，かつフェノ
ール−クロロホルム抽出することによって得た。得られ
たＲＮＡは，ＬＴＲ ＲＮＡとして記載されている。
【００５９】有用な切断部位ＧＵＣを含有するＨＩＶ−
１ ＬＴＲ ＲＮＡの位置１１５をリボザイム触媒切断
のための標的として選択した。この部位に対する標的の
ハンマーヘッドリボザイムを，化学的に合成した。非修
飾ハンマーヘッド酵素ＲＥ１１５のヌクレオチド配列
は，第９図に記載されている。
【００６０】ＬＴＲ ＲＮＡを用いての切断反応速度：
ｋcat／Ｋm値を単代謝回転の条件下で測定した。リボザ
イムをトリス−Ｃ１ ５０ｍＭ，ｐＨ７．５の存在下に
７５℃で１分間予め恒温保持し，引続き３７℃で５分間
恒温保持することによって測定した。ＭｇＣｌ2を１０
ｍＭの最終濃度に添加し，この溶液を再び３７℃で５分
間恒温保持した。ＬＴＲ ＲＮＡを直接に水溶液として
使用した。反応混合物（１０μｌ）は，リボザイム２０
ｎＭ〜１μＭ，トリス−Ｃｌ ５０ｍＭ，ｐＨ７．５お
よびＭｇＣｌ2１０ｍＭを含有していた。ＬＴＲ ＲＮ
Ａを１０ｎＭの最終濃度に添加することによって反応を
開始させた。３７℃で１時間後に，停止混合物１０μｌ
を添加することによって反応を停止させ，かつＰＡＧＥ
４％（長さ４０ｃｍ，尿素８モル）によって分析した。
５０Ｗでの１時間の電気泳動および引続くオートラジオ
グラフィーの後に，非切断ＬＴＲ ＲＮＡの画分をレー
ザー走査デンシトメーター測定によって測定した。ｋ
cat／Ｋm値を，次の等式：
【数１】 〔式中，ｋは観察される反応速度であり，ｔは１時間の
反応時間である〕により，リボザイム濃度（［ＲＥ］）
に対してＬＴＲ ＲＮＡの残留断片（ＦｒａｃＳ）をプ
ロットすることによって得た。
【００６１】２’−フルオロまたは２’−デオキシ置換
基および／または末端ホスホロチオエート結合を含有す
るＲＥ１１５のリボザイムの幾つかの類縁物の触媒効率
に対する化学修飾の影響を研究するために，合成した。
２’−フルオロサイチジン置換基は触媒効率に対して何
らの効果も有しないけれども［第２表，ＲＥ１１５（Ｆ
Ｃ）］，フルオロウリジン置換基は，ｋcat／Ｋmの５倍
の減少を生じた［第２表，ＲＥ１１５（ＦＵ）］。３個
の３’−末端ホスホロチオエート基との組合せ物中の１
つの５’−末端ホスホロチオエート基は，無視できる程
度にのみ触媒効率を減少させた［第２表，ＲＥ１１５
（Ｓ）］。同様のことは，２’−フルオロウリジン置換
基と一緒の末端ホスホロチオエート結合の組合せに関し
て実際のことであり，この場合には，ｋcat／Ｋmの他の
減少は観察されなかった［第２表，ＲＥ１１５（Ｆ
Ｕ），Ｓ］。全てのピリミジンリボヌクレオチドを２’
フルオロ類縁物によって置換し，かつ４個のホスホロチ
オエート結合を導入することにより，非修飾リボザイム
と比較して７倍だけ触媒効率は減少した［第２表，ＲＥ
１１５（ＦＣ，ＦＵ，Ｓ）］。これとは異なり，全ての
ピリミジンリボヌクレオチドをホスホロチオエートと結
合した２’−デオキシヌクレオシド類縁物によって置換
することにより，５０倍のｋcat／Ｋmの減少を生じた
［第２表，ＲＥ１１５（ｄＣ，ｄＵ，Ｓ）］。従って，
ＲＥ１１５（ｄＣ，ｄＵ，Ｓ）は，ＲＥ１１５（ＦＣ，
ＦＵ，Ｓ）よりも７倍少ない効率を有する。
【表２】
【００６２】実施例５ オリゴリボヌクレオチドの安定性 実施例４のリボザイムをヌクレアーゼ消化に対する安定
性に関して試験した。 試験条件：媒体ＲＭＰＩ １６４０中で細胞約１０6／
ｍｌの細胞濃度に成長した脱皮４クローン８細胞（Ｊｕ
ｒｋｉｅｒｗｉｃｚ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｐｒｉｎｍ
ａｔｅｎｚｅｎｔｒｕｍ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎから入手
可能）の１０００ｇをヘラオイス ミニヒユーゲ（Ｈｅ
ｒａｅｕｓ Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）中で５分間遠心分離し
た。５’−32Ｐ−標識化リボザイムを９０℃で１分間予
め加熱し，氷上で冷却し，細胞上澄み液に添加して３０
０ｎＭの最終濃度にし，かつ３７℃で恒温保持した。ア
リコートを指摘された時間ポイントで取り出し，尿素８
モルを含有する２０％のＰＡＧＥによって分析し，引続
きオートラジオグラフィー処理した。
【００６３】結果：８０％を上廻るＲＥ１１５が，ＰＡ
ＧＥを変性することによって指摘されるように細胞上澄
み液中での２分間の恒温保持後に分解された。しかし，
１時間以内のＲＥ１１５（ＦＣ，ＦＵ，Ｓ）の分解は観
察されなかった。非修飾リボザイムの分解速度との比較
により，２’−修飾ピリミジンヌクレオシドと末端ホス
ホロチオエート結合との組合せにより，Ｔ細胞上澄み液
中に存在するヌクレアーゼによる消化に対するリボザイ
ム安定性よりも５０倍増大したものと評価される。ホス
ホロチオエート基なしの２’−修飾リボザイムは，ＲＥ
１１５（ＦＣ，ＦＵ，Ｓ）の安定性よりも約２倍低い安
定性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図は，ＰＡＧＥ後のプラスミドｐＵＣＲ
ＳのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ ランオフ転写物のオー
トラジオグラフを示す。
【図２】 第２図は，ＰＡＧＥ後の２’−アミノウリジ
ンを含有するプラスミドｐＵＣＲＥのＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼ ランオフ転写物のオートラジオグラフを示
す。
【図３】 第３図は，ＰＡＧＥによって分離された５’
−標識化ランオフ転写物Ｅ１およびＥ２の部分的リボヌ
クレアーゼＡ切断のオートラジオグラフを示す。
【図４】 第４図は，ＲＮア−ゼＡによるＳ１およびＳ
２の全崩壊のオートラジオグラフを示す。
【図５】 第５図は，リボザイムＥ１による２’−フル
オロウリジンおよび 32Ｐ−ＡＭＰ含有基質Ｓ３の切断の
オートラジオグラフを示す。
【図６】 第６図は，Ｅ２とＳ１とのリボザイム反応の
エディー−ホフステーのプロットを示す。
【図７】 第７図は，Ｅ３とＳ１とのリボザイム反応の
ラインウィーヴァー−バークのプロットを示す。
【図８】 第８図は，ＨＩＶ−１配列をｐＯＴＨ３３中
にクローン化した体制を示す。
【図９】 第９図は，リボザイムＲＥ１１５のヌクレオ
チド配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エクシュタイン， フリッツ ドイツ連邦共和国 Ｄ−3400 ゲッチンゲ ン ホルンダーシュテーク ６ (72)発明者 ピーケン， ヴォルフガング エイ. ドイツ連邦共和国 Ｄ−3400 ゲッチンゲ ン アウフ デア ヴェッセル 22 (72)発明者 ベンゼラー， フリッツ ドイツ連邦共和国 Ｄ−3400 ゲッチンゲ ン ハインリッヒ−ヴァルネッケ−シュト ラーセ ４ (72)発明者 オルセン， デイヴィド ビー. アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア 19486 ウェストポイント ダヴリュー ピー 42−300 ケア オヴ メルク，シ ャープ アンド ドーム リサーチ ラボ ラトリー (72)発明者 ウィリアムズ， デイヴィド エム. ドイツ連邦共和国 Ｄ−3400 ゲッチンゲ ン ヴィーゼンシュトラーセ 15 (72)発明者 ハイデンライヒ， オラーフ ドイツ連邦共和国 Ｄ−3400 ゲッチンゲ ン カロリーネンヴェーク 15 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA07 CA11 HA08 HA17 4B050 CC01 CC03 CC10 DD20 EE10 LL01 LL04 LL05 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 ZB33 ZC19 ZC55

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドから
    なる触媒活性を有するＲＮＡ分子において、リボース糖
    の２’−でのヒドロキシ基が、ハロゲン原子によって代
    替されていることを特徴とする、触媒活性を有するＲＮ
    Ａ分子。
  2. 【請求項２】 触媒活性がヌクレオチジルトランスフェ
    ラーゼ活性、デホスホリラーゼ活性、デオキシリボヌク
    レアーゼ活性および配列特異的エンドリボヌクレアーゼ
    活性からなる群の少なくとも１つを有する、請求項１記
    載のＲＮＡ。
  3. 【請求項３】 触媒活性が配列特異的エンドリボヌクレ
    アーゼ活性を有する、請求項２記載のＲＮＡ。
  4. 【請求項４】 ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピ
    ンＲＮＡである、請求項３記載のＲＮＡ。
  5. 【請求項５】 修飾リボース糖に結合したヌクレオチド
    塩基がＲＮＡ中で天然に生じる塩基および置換塩基から
    なる群から選択されたものである、請求項１から４まで
    のいずれか１項に記載のＲＮＡ。
  6. 【請求項６】 置換ヌクレオチド塩基がキサンチン、ハ
    イポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−ヒドロ
    キシ−６−メルカプトプリンおよび硫黄により６位で置
    換されたプリン塩基またはハロゲン原子もしくはＣ1−
    Ｃ5アルキル基により５位で置換されたピリミジン塩基
    から選択されている、請求項５記載のＲＮＡ。
  7. 【請求項７】 修飾リボース糖に結合したヌクレオチド
    塩基がＲＮＡ中で天然に生じる塩基である、請求項５記
    載のＲＮＡ。
  8. 【請求項８】 修飾リボース糖に結合したヌクレオチド
    塩基がピリミジン塩基である、請求項７記載のＲＮＡ。
  9. 【請求項９】 １つの特異的種類の全てのヌクレオチド
    塩基が修飾リボース糖に結合している、請求項１から８
    までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
  10. 【請求項１０】 全てのウラシルヌクレオチド塩基が修
    飾リボース糖に結合している、請求項９記載のＲＮＡ。
  11. 【請求項１１】 全てのサイトシンヌクレオチド塩基が
    修飾リボース糖に結合している、請求項９記載のＲＮ
    Ａ。
  12. 【請求項１２】 ２つの特異的種類の全てのヌクレオチ
    ド塩基が修飾リボース糖に結合している、請求項１から
    ８までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
  13. 【請求項１３】 全てのサイトシンおよびウラシルヌク
    レオチド塩基が修飾糖に結合している、請求項１２記載
    のＲＮＡ。
  14. 【請求項１４】 ヌクレオチド配列Ｅ２：５’−ＧＧＧ
    （２’−ＦＵ）ＣＣ（２’−ＦＵ）Ｃ（２’−ＦＵ）Ｇ
    Ａ（２’−ＦＵ）ＧＡＧＧＣＣＧ（２’−ＦＵ）（２’
    −ＦＵ）ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣ（２’−ＦＵ）ＣＣ−
    ３’からなるＲＮＡにおいて、２’−ＦＵが２’−デオ
    キシ−２’−フルオロウリジンモノホスフェートを表す
    ことを特徴とする、ＲＮＡ。
  15. 【請求項１５】 ヌクレオチド配列Ｅ３：５’−ＧＧＧ
    （２’−ＮＨ2Ｕ）ＣＣ（２’−ＮＨ2Ｕ）Ｃ（２’−Ｎ
    Ｈ2Ｕ）ＧＡ（２’−ＮＨ2Ｕ）ＧＡＧＧＣＣＧ（２’−
    ＮＨ2Ｕ）（２’−ＮＨ2Ｕ）ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣ
    （２’−ＮＨ2Ｕ）ＣＣ−３’からなるＲＮＡにおい
    て、２’−ＮＨ2Ｕが２’−デオキシ−２’−アミノウ
    リジンモノホスフェートを表すことを特徴とする、ＲＮ
    Ａ。
  16. 【請求項１６】 少なくとも１つの非修飾ヌクレオシド
    を含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載のＲ
    ＮＡ。
  17. 【請求項１７】 リボヌクレアーゼに対する高感受性部
    位でのヌクレオチドが修飾されている、請求項１６記載
    のＲＮＡ。
  18. 【請求項１８】 さらに少なくとも１つの修飾インター
    ヌクレオチドホスホジエステル結合を有する、請求項１
    から１７までのいずれか１項に記載のＲＮＡ。
  19. 【請求項１９】 修飾ホスホジエステル結合がホスホロ
    チオエートである、請求項１８記載のＲＮＡ。
  20. 【請求項２０】 少なくとも５’−末端ホスホジエステ
    ル結合が修飾されている、請求項１８または１９に記載
    のＲＮＡ。
  21. 【請求項２１】 少なくとも３’−末端ホスホジエステ
    ル結合が修飾されている、請求項１８から２０までのい
    ずれか１項に記載のＲＮＡ。
  22. 【請求項２２】 ５’−末端ホスホジエステル結合およ
    び最後の３つの３’−末端ホスホジエステル結合が修飾
    されている、請求項１８から２１までのいずれか１項に
    記載のＲＮＡ。
  23. 【請求項２３】 ＲＮＡ鎖中に少なくとも１つの修飾ヌ
    クレオチドを配合することにより、触媒活性を有するＲ
    ＮＡ分子を合成する方法において、リボース糖の２’位
    でのヒドロキシ基をハロゲン原子によって代替すること
    を特徴とする、触媒活性を有するＲＮＡ分子の合成方
    法。
  24. 【請求項２４】 ＲＮＡ鎖の合成を固体支持体上でヌク
    レオチド前駆物質からの化学合成によって実施し、ＲＮ
    Ａ生産物を固体支持体から除去し、かつ除去したＲＮＡ
    生産物を精製する、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ＲＮＡ鎖の合成を溶液中でヌクレオチ
    ド前駆物質からの化学合成によって実施し、かつＲＮＡ
    生産物を精製する、請求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホ
    ネートをヌクレオチド前駆物質として使用する、請求項
    ２４または２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 アミノ修飾基をトリフルオロアセチル
    アミド基の形でＲＮＡ鎖中に配合し、その後にトリフル
    オロアセチル保護基をアンモニアとの処理によって除去
    する、請求項２４から２６までのいずれか１項に記載の
    方法。
  28. 【請求項２８】 さらにＲＮＡ鎖中に少なくとも１つの
    修飾インターヌクレオチドホスホジエステル結合を配合
    する、請求項２３から２７までのいずれか１項に記載の
    方法。
  29. 【請求項２９】 修飾ホスホジエステル結合がホスホロ
    チオエート基である、請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ＲＮＡ鎖の合成を核酸ポリメラーゼを
    用いて核酸鋳型からの転写によって実施する、請求項２
    ３記載の方法。
  31. 【請求項３１】 核酸鋳型がＤＮＡ鋳型であり、核酸ポ
    リメラーゼがＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼである、請
    求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがＴ
    ７、Ｔ３およびＳＰ６ポリメラーゼからなる群より選択
    される、請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがＴ７
    ポリメラーゼである、請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 ＲＮＡ鎖の合成をＭｎ2+イオンの存在
    下に実施する、請求３０から３３までのいずれか１項に
    記載の方法。
  35. 【請求項３５】 請求項１から２２までのいずれか１項
    に記載のＲＮＡを使用している治療剤。
  36. 【請求項３６】 請求項１から２２までのいずれか１項
    に記載のＲＮＡを使用している生体触媒。
  37. 【請求項３７】 治療剤において、作用成分としての請
    求項１から２２までのいずれか１項に記載のＲＮＡを、
    場合によっては常用の充填剤、賦形剤、担持剤および希
    釈剤と一緒に含有することを特徴とする、治療剤。
  38. 【請求項３８】 治療剤を製造する方法において、治療
    剤が作用成分としての請求項１から２２までのいずれか
    １項に記載のＲＮＡを場合によっては常用の充填剤、賦
    形剤、担持剤および希釈剤と一緒に含有することを特徴
    とする、治療剤の製造法。
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