EA026660B1 - Введение олигонуклеотидов в виде хелатных комплексов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению хелатных комплексов олигонуклеотидов в составе композиций для подавления или уменьшения объема реакции на олигонуклеотид при подкожном введении или для улучшения переносимости олигонуклеотидов при введении путем внутривенной капельной инфузии (IV инфузия).

Description

Настоящее изобретение относится к применению хелатных комплексов олигонуклеотидов в составе композиций для подавления или уменьшения объема реакции на олигонуклеотид при подкожном введении или для улучшения переносимости олигонуклеотидов при введении путем внутривенной капельной инфузии (IV инфузия).

Предшествующий уровень техники

Соли представляют собой ионные соединения, образующиеся при взаимодействии (нейтрализации) кислоты и основания. Соли состоят из катионов и анионов, которые взаимодействуют с переходом в нейтральное состояние. Анионы могут быть неорганическими (такими как С1^-) или органическими, такими как ацетат (СН₃СОО^-). Водные растворы, содержащие растворенные соли (электролиты), способны проводить электрический ток из-за диссоциированного состояния пар анионов и катионов в водной среде. Олигонуклеотиды представляют собой полианионы, и раньше считалось, что они ведут себя только как соли, где катионные эквиваленты находятся в растворе в диссоциированном состоянии.

Введение людям ΟΝ обычно сопровождается несколькими генерализованными побочными эффектами, не связанными с существующей последовательностью нуклеотидов. Эти эффекты включают антикоагуляцию (увеличение протромбинового времени или РТТ времени) крови (КапбпитПа е! а1., 1998, Вюогдап. Меб. СЬет. Ье!., 8: 2103; 8ЬееЬап е! а1., В1ооб, 1998, 92: 1617; №ск1ш е! а1., 1197, №с1ео81бе8 & №.1с1со0бс5. 16: 1145; Κ\\ό1ι. 2008, АпШепке Эгид ТесЬ. 2пб Еб., р374) и реакцию в месте введения Ι8Ρ (затвердение, воспаление, болезненность и боль) при подкожном введении (АеЬЬ е! а1., 1997, Ьапсе!, 349: 9059; 8сЬг1еЬег е! а1., 2001, СаЧтоеШегоЕ 120: 1339; 8еа\\е11 е! а1., 2002, 1. РЬагтасо1. Ехр. ТЬегар., 303: 1334; КлуоЕ 2008, Апбкепке Эгид ТесЬ. 2пб Еб., р383; Каа1 е! а1., 2010, Ьапсе!, 375: 998). Считается, что антикоагулянтные эффекты опосредованы не связанным специфически с последовательностью взаимодействием с белками коагуляционного каскада. Поскольку показано, что ΟΝ обладают иммуностимулирующими свойствами (благодаря То11-подобному рецептору или опосредованной этим рецептором (ТЬК) индукции цитокинов), Ι8Ρ обычно приписывали требованиям введения высоких концентраций ΟΝ в малом объеме (обычно 1 см³) для подкожного (8С) введения, приводящего, как полагают, к локальному воспалению в месте введения.

С появлением в последние годы терапии, основанной на нуклеиновых кислотах, было повышено количество применяемых в клинике основанных на ΟΝ-соединений. Исторически было разработано большинство режимов дозировки ΟΝ, включающих несколько доз в неделю или одну дозу в неделю, которые следует давать парентерально из-за слабой оральной биоактивности ΟΝ. Поскольку внутривенное введение ΟΝ обычно ограничено по реактивности величиной дозы и скорости (лихорадка, тремор, слабость) и должно логистически осуществляться по сценарию хронического введения, клиническое применение ΟΝ в последнее время осуществляют подкожным (8С) способом введения.

Таким образом, полезно и желательно обеспечить лекарственную форму ΟΝ, которая может снизить реактивность как при внутривенном, так и при подкожном способах введения. Поэтому хотя антикоагулянтные эффекты введения ΟΝ считаются минимальными, полезно также нейтрализовать побочный эффект ΟΝ для большего запаса безопасности у людей и других млекопитающих.

Поэтому имеется необходимость создания улучшенной лекарственной формы ΟΝ.

Сущность изобретения

В данной заявке раскрыто применение фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотидный хелатный комплекс, содержащий по меньшей мере два олигонуклеотида, связанных межмолекулярно двухвалентным катионом металла, в котором по меньшей мере один олигонуклеотид имеет по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и фармацевтические приемлемый носитель, для подавления или уменьшения области реакции на олигонуклеотид при подкожном введении субъекту.

Кроме того, раскрыто применение фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотидный хелатный комплекс, содержащий по меньшей мере два олигонуклеотида, связанных межмолекулярно двухвалентным катионом металла, в котором по меньшей мере один олигонуклеотид имеет по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и фармацевтически приемлемый носитель, для улучшения переносимости олигонуклеотида при введении субъекту путем внутривенной капельной инфузии (IV инфузия).

В одном из вариантов раскрыто применение, при котором упомянутый комплекс является кальциевым. В другом из вариантов раскрыто применение, при котором упомянутый комплекс является магниевым. Еще в одном из вариантом ракрыто применение, при котором упомянутый комплекс представляет собой смешанный кальций/магний олигонуклеотидный хелатных комплекс.

Предпочтительно катион двухвалентного металла представляет собой кобальт, железо (2+), марганец, медь или цинк.

Предпочтительно, если хелатный комплекс по изобретению содержит два или большее число разных дивалентных катионов металла.

В одном из вариантов указанный хелатный комплекс содержит по меньшей мере один двухцепочечный олигонуклеотид.

В другом варианте хелатный комплекс содержит по меньшей мере один олигонуклеотид, полностью модифицированный фосфотиоатными группами.

- 1 026660

В еще одном варианте указанный хелатный комплекс содержит по меньшей мере один олигонуклеотид с одной 2' модифицированной рибозой.

В другом варианте хелатный комплекс содержит по меньшей мере один олигонуклеотид с одной 2'0-метилированной рибозой.

Предпочтительно хелатный комплекс содержит олигонуклеотид, выбранный из группы, состоящей из 8 ЕС) ГО N0: 3-14.

Более предпочтительно, когда этот по меньшей мере один олигонуклеотид содержит по меньшей мере один 5-метилцитозин.

В одном из вариантов, по меньшей мере, один олигонуклеотид состоит из 8ЕЦ ГО N0:6, содержащей, по меньшей мере, один 5-метилцитозин.

В другом варианте по меньшей мере один олигонуклеотид состоит из 8ЕЦ ГО N0:6, где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

Термин антикоагуляция предназначен для обозначения ингибирования нормального свертывания крови или образования сгустка.

Термин хелатирование предназначен для обозначения секвестрации или удаления из свободного реакционного раствора противоиона (отрицательного или положительного) с помощью другой молекулы, способной связываться с противоионом с образованием хелатного комплекса.

Термин двухвалентный катион металла предназначен для обозначения любого катиона металла, который может в норме присутствовать в состоянии 2+ и включает щелочно-земельные металлы (элементы второй группы по номенклатуре ШРЛС), переходные металлы, постпереходные металлы, металлоиды или лантаноиды.

Термин трехвалентный катион металла предназначен для обозначения любого катиона металла, который может в норме присутствовать в состоянии 3+ и включает переходные металлы, постпереходные металлы, металлоиды, лантаноиды или актиноиды.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 иллюстрирует общие физико-химические свойства 0Ν: А) одновременное отделение РЕР 2006 и содержащего 21 мономер 0Ν фосфотиоата с определением последовательности с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения. В) Идентификация видов в 21-мерном 0Ν с помощью масс-спектроскопии. С) Идентификация видов в РЕР 2006 0Ν с помощью масс-спектроскопии.

Фиг. 2 иллюстрирует образование хелатных комплексов 0Ν с кальцием с участием флуоресцентно меченых вырожденных фосфоротиоатных 0Ν: А) различных размеров 6-мерного (РЕР 2032-РЬ), 10мерного (РЕР 2003-РЬ), 20-мерного (РЕР 2004-РЬ), 40-мерного (РЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных 0Ν с использованием фосфоротиоата (РЕР 2006-РЬ), фосфоротиоата+2'О метилрибозы (РЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (РЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (ро1у С-РЕР 2031-РЬ; 8ЕЦ ГО Ν0:4). Не зависящая от последовательности природа 0Ν хелатного комплекса была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (РЕР 2031; 8ЕЦ ГО Ν0:4). Образование хелатных комплексов 0Ν с кальцием было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида кальция степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения +/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 3 иллюстрирует образование хелатных комплексов 0Ν с магнием с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных 0Ν: А) различных размеров 6-мерного (РЕР 2032-РЬ), 10-мерного (РЕР 2003РЬ), 20-мерного (РЕР 2004-РЬ), 40-мерного (РЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных 0Ν с участием фосфотиоата (РЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (РЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (РЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -РЕР 2031-РЬ; 8ЕЦ ГО Ν0:4). Не зависящая от последовательности природа 0Ν хелатного комплекса была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (РЕР 2С31; 8ЕЦ ГО Ν0:4). Образование хелатных комплексов 0Ν с магнием было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида магния степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 4 иллюстрирует образование хелатных комплексов 0Ν с кобальтом с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных 0Ν: А) различных размеров 6-мерного (РЕР 2032-РЬ), 10-мерного (РЕР 2003РЬ), 20-мерного (РЕР 2004-РЬ), 40-мерного (РЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных 0Ν с участием фосфоротиоата (РЕР 2006-РЬ), фосфоротиоата+2'О метилрибозы (РЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (РЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -РЕР 2031-РЬ; 8ЕЦ ГО Ν0:4). Не зависящая от последовательности природа 0Ν хелатного комплекса была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (РЕР 2031; 8ЕЦ ГО Ν0:4). Образование хелатных комплексов 0Ν с кобальтом было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида кобальта степени чис- 2 026660 тоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 5 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с железом с участием флуоресцентно меченых фосфоротиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003-РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфоротиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфоротиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8ЕО ГО N0:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с железом было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида железа степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 6 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с марганцем с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с марганцем было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида марганца степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 7 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с барием с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с барием было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида бария степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 8 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с никелем с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Не зазисящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с никелем было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида никеля степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/- стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 9 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с медью с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003-РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с медью было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида меди степени чистоты АС8 с Р1ТСмечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние зна- 3 026660 чения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 10 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с цинком с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8ЕО ГО ΝΟ:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с цинком было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида цинка степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 11 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с кадмием с участием флуоресцентно меченых фосфоротиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003-РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с кадмием было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида кадмия степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 12 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ с ртутью с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфоротиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ с ртутью было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида ртути степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 13 иллюстрирует образование хелатных комплексов ΟΝ со свинцом с участием флуоресцентно меченых фосфотиоатных ΟΝ: А) различных размеров 6-мерного (КЕР 2032-РЬ), 10-мерного (КЕР 2003РЬ), 20-мерного (КЕР 2004-РЬ), 40-мерного (КЕР 2006-РЬ) и В) флуоресцентно меченых вырожденных ΟΝ с участием фосфотиоата (КЕР 2006-РЬ), фосфотиоата+2'О метилрибозы (КЕР 2107-РЬ) или 2'О метилрибозы (КЕР 2086-РЬ) и различных последовательностей (поли С -КЕР 2031-РЬ; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Не зависящая от последовательности природа хелатного комплекса ΟΝ была продемонстрирована путем использования вырожденных олигонуклеотидов, а также путем использования олигонуклеотидов со специфической последовательностью (КЕР 2031; 8Е0 ГО ΝΟ:4). Образование хелатных комплексов ΟΝ со свинцом было показано путем комбинации повышенных концентраций хлорида свинца степени чистоты АС8 с Р1ТС-мечеными олигонуклеотидами в растворе и регистрации образования олигонуклеотидных хелатных комплексов по увеличению поляризации флуоресценции, как описано в примере 1. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 14А иллюстрирует общие химические свойства олигонуклеотидов, не зависящие от последовательности ΟΝ. Независимо от последовательности любой ΟΝ существует как полимер, обладающий как гидрофобной, так и гидрофильной активностью. Фосфотиоация (указанная в химической структуре на данном рисунке) способствует увеличению гидрофобности ΟΝ полимера, но не влияет на гидрофильность.

Фиг. 14В концептуализирует природу хелирования олигонуклеотидом двувалентных и трехвалентных катионов металла. Катионы металла (представленные серыми сплошными кружками) связывают гидрофильные поверхности ΟΝ полимеров через мостики ионов металла (представленные эллипсами) между двумя или тремя не связанными атомами кислорода или серы в фосфодиэфирных связях.

Фиг. 15 иллюстрирует модель поведения ΟΝ в растворе в присутствии двувалентных катионов металлов при различных концентрациях ΟΝ и двухвалентных катионов металлов. А) Низкие концентрации двухвалентных/трехвалентных катионов металлов, низкие концентрации ΟΝ образуют димерные или хелатные комплексы ΟΝ низкого порядка. В) Повышенные концентрации двухвалентных/трехвалентных

- 4 026660 катионов металлов приводят к более полному образованию хелатного комплекса ΟΝ в растворе. С) Дальнейшее увеличение концентраций ΟN в присутствии двухвалентных или трехвалентных металлов может привести к образованию хелатных комплексов ΟΝ с ростом концентраций металлов. Все хелатные комплексы от (А) до (С) растворимы в водных растворах благодаря наличию гидрофильных поверхностей, обеспечивающих растворимость при взаимодействии с водной средой. Ό) При достаточной концентрации ΟΝ и металла все гидрофильные поверхности теперь помещены внутрь ΟΝ хелатных комплексов, оставляя взаимодействующими с водной поверхностью только гидрофобные поверхности. Это приводит к преципитации хелатного комплекса ΟΝ.

Фиг. 16 иллюстрирует эффект растворимости флуоресцентных ΟΝ хелатных комплексов на поляризацию флуоресценции. С увеличением концентрации металла размер (и масса) хелатного комплекса ΟΝ также увеличивается (см. фиг. 15) и поэтому более медленно разрушается в растворе. Это более медленное разрушение комплекса в растворе приводит к повышенной поляризации флуоресценции и увеличенному значению тР.

Фиг. 17 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом кальция или сульфатом кальция по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) образование ΟΝ хелатных комплексов с КЕР 2055-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:6) и КЕР 2056-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:7). В) образование ΟΝ хелатных комплексов с КЕР 2033-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:5) и КЕР 2029-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:2). Приведены средние значения+/стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 18 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом кальция или сульфатом кальция по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) отсутствие образования хелатного комплекса ΟΝ с КЕР 2028-РЬ и образования хелатного комплекса с КЕР 2057-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:8). В) образование хелатного комплекса ΟΝ с КЕР 2120-РЬ и КЕР 2030-РЬ. Приведены средние значения+/стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 19 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом кальция или сульфатом кальция по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) образование ΟΝ хелатных комплексов с КЕР 2129-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:12) и КЕР 2126-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:9). В) образование хелатного комплекса ΟΝ с КЕР 2128-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:11) и КЕР 2127-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:10). Приведены средние значения+/стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 20 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом кальция или сульфатом кальция по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) образование ΟΝ хелатных комплексов с КЕР 2139-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:13) и КЕР 2006-РЬ. В) образование хелатного комплекса ΟΝ с КЕР ΟΝ 2045-РЬ и КЕР 2007-РЬ. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 21 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом магния или сульфатом магния по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) образование ΟΝ хелатных комплексов с 2055-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:5) и КЕР 2006-РЬ. В) образование хелатного комплекса ΟΝ с КЕР с КЕР 2033РЪ(8ЕЭ ГО ΝΟ:5) и КЕР 2029-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:12). Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 22 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом магния или сульфатом магния по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) отсутствие образования ΟΝ хелатного комплекса с КЕР 2028-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:11) и ΟΝ хелатного комплекса с КЕР 2057-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:8). В) образование ΟΝ хелатного комплекса с КЕР 2120-РЬ и КЕР 2030-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:3). Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 23 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом магния или сульфатом магния по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) образование ΟΝ хелатного комплекса с КЕР 2129-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ: 12) и КЕР 2126-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:9). В) образование ΟΝ хелатного комплекса с КЕР 2128-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:11) и КЕР 2127-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:10). Приведены средние значения+/стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 24 демонстрирует образование ΟΝ хелатных комплексов с хлоридом магния или сульфатом магния по результатам измерения поляризации флуоресценции. А) образование ΟΝ хелатного комплекса с КЕР 2139-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:13) и КЕР 2006-РЬ. В) образование ΟΝ хелатного комплекса с КЕР 2045-РЬ и КЕР 2007-РЬ. Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в двух измерениях.

Фиг. 25 демонстрирует образование двух разных двухспиральных ΟΝ хелатньгх комплексов в присутствии хлорида кальция или хлорида магния по результатам поляризации флуоресценции. Двухспиральные ΟΝ готовили путем гибридизации КЕР 2055-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:6) с КЕР 2033-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:5) и КЕР 2057-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:8) с КЕР 2056-РЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ:7). Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в трех измерениях.

Фиг. 26 демонстрирует образование различных ΟΝ хелатных комплексов только в присутствии катионов двухвалентных металлов (Мд²' и Са²+), но не одновалентных катионов (№⁺, К+ или ΝΗ₄+). Приведены средние значения+/-стандартные отклонения в трех измерениях.

Фиг. 27 демонстрирует антикоагулянтный эффект добавления в кровь человека различных концентраций ΟΝ различных размеров (КЕР 2004, КЕР 2006) и разного химического состава (КЕР 2006, КЕР 2107). Не зависящий от последовательности характер этого взаимодействия был продемонстрирован с

- 5 026660 помощью вырожденных олигонуклеотидов (КЕР 2004, КЕР 2006, КЕР 2107), а также показан с помощью последовательности специфических олигонуклеотидов (КЕР 2031; 8ЕО ГО N0:4). Антикоагулянтное действие на кровь этих соединений оценивали, измеряя протромбиновое время (РТТ) и сравнивая его с РТТ в присутствии нормального физиологического раствора в крови с помощью общепринятых клинических лабораторных методик. Отношение РТТ в присутствии и в отсутствие добавленного препарата это нормализованное отношение (ΝΚ). ΝΚ, равное 1, означает нормальную коагуляционную активность крови, а ΝΚ свыше 1 означает, что коагуляционная активность крови ухудшилась (антикоагуляция).

Фиг. 28 демонстрирует подавление антикоагулянтного эффекта олигонуклеотидов при добавлении СаС1₂. К крови добавляли КЕР 2055 (40-мерный фосфотиоат с последовательностью (АС)₂₀; 8ЕО ГО N0:6) в концентрации 2.5мМ, индуцирующей значительный антикоагулянтный эффект. КЕР 2055 комбинировали с различными комбинациями СаС12 и оценивали эффекты каждой добавленной концентрации СаС12 с помощью общепринятых клинических лабораторных методик. Антикоагулянтное действие на кровь этих соединений оценивали по измерению протромбинового времени (РТТ) и сравнивали его с РТТ в присутствии нормального физиологического раствора, измеренного с помощью общепринятых клинических лабораторных методик. Антикоагулянтное действие на кровь этих соединений оценивали, измеряя протромбиновое время (РТТ) и сравнивая его с РТТ в присутствии нормального физиологического раствора в крови с помощью общепринятых клинических лабораторных методик. Отношение РТТ в присутствии и в отсутствие добавленного препарата - это нормализованное отношение (ΝΡ). ΝΚ равное 1, означает нормальную коагуляционную активность крови, а NΚ свыше 1 означает, что коагуляционная активность крови ухудшилась (антикоагуляция).

Фиг. 29 демонстрирует хелатирующий эффект хронического лечения 0Ν на общий кальций у пациентов с хроническим заболеванием печени. Пациенты, не получавшие минеральных добавок, показаны на (А), а пациенты, получавшие добавки в процессе лечения 0Ν, показаны на (В).

Подробное описание

В данной заявке представлено доказательство, что 0Ν образуют хелатные комплексы с различными катионами двухвалентных металлов, включая кальций, магний, кобальт, железо, марганец, барий, никель, медь, цинк, кадмий, ртуть и свинец. Кроме того, показано, что хелатирование этих двухвалентных катионов приводит к образованию 0Ν хелатных комплексов, состоящих из двух или большего числа 0Ν, связанных через катионы металла, и являющихся примерами, но не ограничивающимися 0Ν, имеющими от 6 до 80 нуклеотидов в длину и содержащими фосфодиэфирные или фосфотиоатные олигонуклеотиды. Кроме того, образуются хелаты с олигонуклеотидами, содержащие или не содержащие 2' модификации рибозы. Помимо того, хелатирование катионов металлов не зависит от последовательности нуклеотидов, но зависит от физико-химических свойств всех олигонуклеотидов (см. фиг. 14А).

В данной заявке представлены данные, согласно которым олигонуклеотиды в водных растворах, содержащих любой простой катион двухвалентного металла (например, такой как Са²+, Мд²'. Ре²+, но не ограничивающийся ими), существуют не в форме соли, но скорее в форме хелатных комплексов 0Ν. Эти комплексы состоят из олигонуклеотидных димеров или молекулярных структур более высокого порядка, в которых 0Ν соединены фосфодиэфирными скелетными связями через ионные мостики двухвалентного металла (см. фиг. 14В). При определенных концентрациях 0Ν и катионов металла эти хелатные комплексы стабильны и растворимы в водных растворах и эффективно отличают 0Ν хелатные комплексы любых двухвалентных катионов от ионных взаимодействий. Это образование хелатных комплексов напоминает образующееся с простыми катионами металла, имеющими заряд 3+ или больше (как показано на фиг. 14В). Таким образом, 0Ν функционируют как хелаторы двухвалентных катионов и не образуют с двухвалентными катионами соли.

Существенно, что не происходит образования олигонуклеотидных хелатных комплексов с одновалентными катионами, такими как Να', К+ или ΝΗ₄+, и поэтому маловероятно, что они образуются с другими одновалентными катионами. Таким образом, термин олигонуклеотидная соль конкретно относится только к олигонуклеотидным солям с одновалентными катионами или с катионами, которые на самом деле образуют хелатные комплексы с олигонуклеотидами, и некорректно применять этот термин для описания олигонуклеотидов, существующих в форме раствора или порошка в случае с катионами двухвалентных катионов металла (или даже трехвалентных катионов металла).

Стандарт в практике применения с очевидностью предполагает введение 0Ν только в виде натриевых солей. Это иллюстрируется введением многочисленных олигонуклеотидов при клинических испытаниях в виде солей натрия, включающих РопиПпзеп (1818 2922), М1ротет8еп (1818 301012), ТгесоПюеп (ОЕМ 91), Си5ЙТ5еи (00Χ-011/Ι8Ι8 112989), Оепазепзе (03139) аиб Арттосагеет (1818 3531/ЬУ 900003) (Оеагу е! а1., 2002, С1ш. РЬаттасоктебсз, 41: 255-260; Уи е! а1., 2009, С1ш. РЬаттасоктебсз, 48: 39-50; 8егеп1 е! а1., 1999, 1. С1ш. РНагтасоЬ 39: 47-54; СП е! а1., 2005, 1. ΝηΙ. Сапс. Ιηδΐ, 97: 1287-1296; Мат8Йа11 е! а1., 2004, Апп. 0псо1., 15: 1274-1283; Отоззтап е! а1., 2004, №ито-0псо1, 6: 32-40).

В данной заявке приведены данные, согласно которым антикоагулянтный эффект олигонуклеотидов вызван хелированием кальция олигонуклеотидами, что следует из факта обращения индуцированного олигонуклеотидами антикоагулянтного эффекта при восстановлении нормального уровня кальция в крови путем добавления хлорида кальция. В данной заявке приведены также данные, согласно которым

- 6 026660 реакции, наблюдаемые при подкожных инъекциях олигонуклеотидов в месте введения (уплотнение, воспаление, чувствительность и боль) объясняются, по меньшей мере, частично локальным хелатированием кальция и, возможно, других двухвалентных катионов, таких как магний, в месте инъекции олигонуклеотидами, что видно по ингибированию реакций в месте инъекциии (Ι8Κ) введением ΟΝ, приготовленном в форме хелатного комплекса кальция.

Поляризация флуоресценции - это общая методика, используемая для изучения межмолекулярных взаимодействий. В этой методике молекула (то есть любой ΟΝ) помечена флуоресцентной меткой (например, Р1ТС). В растворе исследуемые молекулы перемещаются свободно в растворе из-за Броуновского движения, что приводит к слабо поляризованному флуоресцентному излучению, если молекулу возбуждают соответствующей длиной волны. С лигандом достаточного молекулярного веса (по крайней мере, с тем же размером, что и молекула), взаимодействие между молекулой и лигандом вызывает заметное ингибирование движения комплекса в растворе. В результате с помощью этой техники можно измерить взаимодействия в растворе без физического воздействия на связывающиеся компоненты. Поляризация флуоресценции является безразмерной величиной тР, которая прямо пропорциональна доле связанных молекул в реакции. Например, если очень малая часть меченых молекул связана с данным лигандом, будет наблюдаться очень небольшая поляризация флуоресценции и, следовательно, малые значения тР. С другой стороны, если значительная часть молекул связана с данным лигандом (или с большей концентрацией лиганда), будет наблюдаться значительная поляризация флуоресценции, и, следовательно, большие значения тР. Таким образом, изотермы связывания конкретных взаимодействий молекула-лиганд можно получить, варьируя концентрации лиганда в присутствии фиксированного количества флуоресцентно меченых молекул.

В данной заявке использовали различные флуоресцентно меченые ΟΝ для изучения образования ими комплексов в присутствии одновалентных и двухвалентных катионов. Хотя мониторинг образования комплекса с помощью поляризации флуоресценции требует, чтобы эти ΟΝ были флуоресцентно мечеными, эту метку прикрепляют к ΟΝ на 3' конце, чтобы она не взаимодействовала ни с азотистым основанием, ни с фофодиэфирным скелетом исследуемого ΟΝ. Кроме того, флуоресцентную метку отводят в сторону от ΟΝ с помощью жесткого 3-углеродного линкера, чтобы в дальнейшем исключить любые пертурбации нормального поведения ΟΝ в растворе. Таким образом, образование любого ΟΝ комплекса, наблюдаемое в данной заявке, с помощью поляризации флуоресценции флуоресцентно меченого ΟΝ точно соответствуют представлениям поведения в растворе немеченых ΟΝ (как в составе комплекса, так и вне его).

Термин олигонуклеотид (ΟΝ) относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (ΚΝΑ) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ΌΝΆ) и/или их аналогов. Этот термин включает олигонуклеотиды, состоящие из натуральных нуклеиновых оснований, сахаров и ковалентных интернуклеозидных (скелетных) связей, так же как олигонуклеотидов, содержащих не встречающиеся в норме части, которые функционируют аналогично. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто имеют преимущества по сравнению с нативной формой благодаря некоторым желаемым свойствам, например повышенному поглощению клеток, повышенному сродству к определенной нуклеиновой кислоте и повышенной стабильности в присутствии нуклеаз.

В настоящей заявке термин вырожденный олигонуклеотид должен обозначать одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий нестрогое соответствие (Ν) в каждой позиции, например Ν Ν Ν Ν Ν Ν. Каждое основание синтезируется как нестрогое соответствие, так что этот ΟΝ действительно существует как популяция различных произвольно генерированных последовательностей одинаковой длины и одинаковых физико-химических свойств. Например, для ΟΝ, вырожденного до 40 оснований в длину, любая определенная последовательность в популяции представят теоретически только 1/4⁴⁰ или 8.3х10^-25 от всей фракции. Учитывая, что 1 моль=6,022х10²³ молекул и тот факт, что синтез вырожденного полимера не превышает на сегодняшний день 2 ммолей, любой эффективно представленный олигонуклеотид со специфической последовательностью в любом препарате не встречается чаще одного раза. Таким образом, любое образование комплекса в таком препарате не должно иметь зависящих от последовательности (или должно не иметь зависящих от последовательности) физико-химических свойств олигонуклеотидов, поскольку для любого определенного олигонуклеотида с данной последовательностью, уникального в данном препарате, нельзя ожидать, что он внесет активность, зависящую от его специфической нуклеотидной последовательности.

В качестве дополнительной иллюстрации этой концепции пример Ι сравнивает с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и масс-спектрометрии характеристики КЕР 2006 (40-мерный ΟΝ с вырожденной фосфотиоатной последовательностью) с 21-мерным ΟΝ с определенной последовательностью и ясно показывает, что любой ΟΝ с данным размером и данной химической модификацией (то есть фосфотиоатной) будет обладать очень похожими (если не идентичными) физико-химическими свойствами, на которые не влияет существующая последовательность нуклеотидов.

Олигонуклеотиды могут включать различные модификации, например стабилизирующие модификации, и поэтому могут включать по меньшей мере одну модификацию в фосфодиэфирной связи и/или

- 7 026660 на сахаре и/или на основании. Например, олигонуклеотид может включать без ограничения одну или несколько фосфотиоатных связей, фосфодитиоатных связей и метилфосфонатных связей. Различные химически совместимые модифицированные связи могут комбинироваться, например модификации, в которых условия синтеза химически совместимы. Если модифицированные связи полезны, олигонуклеотиды могут включать фосфодиэфирные связи, в которых общие физико-химические свойства олигонуклеотидного полимера не изменяются существенно. Дополнительные полезные модификации включают без ограничений модификации во 2'-позиции сахара, такие как 2'-О-алкил модификации, такие как 2'-Ометилмодификации, 2'-аминомодификации, 2'-галомодификации, такие как 2'-флуоро; нециклические нуклеотидные аналоги. В технике известны и могут применяться также другие модификации, такие как замкнутые нуклеиновые кислоты. В частности, олигонуклеотиды имеют все модифицированные связи, например фосфотиоат; имеют 3'- и/или 5'-головку; включают терминальную 3'-5' связь; олигонуклеотид является или включает конкатемер, состоящий из двух или большего числа олигонуклеотидных последовательностей, соединенных линкером(ами).

Представлена также фармацевтическая ΟΝ композиция, которая предотвращает индуцированную олигонуклеотидами антикоагуляцию с помощью терапевтически эффективного количества фармакологически приемлемого олигонуклеотидного хелатного комплекса, описанного в данной заявке, приготовленного с помощью любого из следующих катионов металлов: кальция, магния, кобальта, марганца, железа, меди и/или цинка. ΟΝ хелатный комплекс может быть также приготовлен с помощью двух или большего числа разных катионов, как было описано выше. В частности, фармацевтическая композиция принята для введения людям или животным, например другим приматам.

Представлена также фармацевтическая ΟΝ композиция, предотвращающая реакцию в месте подкожного введения, которая содержит терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемого описанного в данной заявке ΟΝ хелатного комплекса, приготовленного с использованием любого из следующих катионов металлов: кальция, магния, кобальта, марганца, железа, меди и/или цинка. ΟΝ хелатный комплекс может быть также приготовлен с помощью двух или большего числа разных катионов, как было описано выше. В частности, фармацевтическая композиция принята для введения людям или животным, например другим приматам.

Представлена также фармацевтическая ΟΝ композиция, которая улучшает переносимость внутривенной инфузии, содержащая терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемого описанного в данной заявке ΟΝ хелатного комплекса, приготовленного с использованием любого из следующих катионов металлов: кальция, магния, кобальта, марганца, железа, меди и/или цинка. ΟΝ хелатный комплекс может быть также приготовлен с помощью двух или большего числа разных катионов, как было описано выше. В частности, фармацевтическая композиция принята для введения людям или животным, например другим приматам.

Представлена также фармацевтическая ΟΝ композиция, которая предотвращает индуцированный олигонуклеотидами дефицит кальция, магния, железа, марганца, меди или цинка, используя терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемого описанного в данной заявке ΟΝ хелатного комплекса, приготовленного с использованием любого из следующих катионов металлов: кальция, магния, кобальта, марганца, железа, меди и/или цинка. ΟΝ хелатный комплекс может быть также приготовлен с помощью двух или большего числа разных катионов, как было описано выше. В частности, фармацевтическая композиция принята для введения людям или животным, например другим приматам.

Представлена также фармацевтическая ΟΝ композиция с улучшенной стабильностью при хранении, содержащая терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемого описанного в данной заявке ΟΝ хелатного комплекса, приготовленного с использованием любого из следующих катионов металлов: кальция, магния, кобальта, марганца, железа, меди и/или цинка. ΟΝ хелатный комплекс может быть также приготовлен с помощью двух или большего числа разных катионов, как было описано выше. В частности, фармацевтическая композиция принята для введения людям или животным, например другим приматам.

Представлена также фармацевтическая ΟΝ композиция со сниженным временем полужизни или со сниженным взаимодействием с сывороточными белками, содержащая терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемого описанного в данной заявке ΟΝ хелатного комплекса, приготовленного с использованием любого из следующих катионов металлов: кальция, магния, кобальта, марганца, железа, меди и/или цинка. ΟΝ хелатный комплекс может быть также приготовлен с помощью двух или большего числа разных катионов, как было описано выше. В частности, фармацевтическая композиция принята для введения людям или животным, например другим приматам.

К тому же описанные рецептуры могут включать физиологически и/или фармацевтически приемлемые переносчики, адьюванты, носитель и/или наполнитель. Характеристики переносчика могут зависеть от способа введения. Термин фармацевтически приемлемый переносчик, адьювант, носитель и/или наполнитель относится к переносчику, адьюванту, носителю и/или наполнителю, который может быть введен субъекту, будучи включенным в композицию по настоящему изобретению, и который не нарушает ее фармакологическую активность. Фармацевтически приемлемые переносчики, адьюванты, носители и наполнители, которые могут использоваться в описанных в данной заявке фармацевтических компози- 8 026660 циях, включают, не ограничиваясь ими, следующие компоненты: ионно-обменники, алюминий, стеарат алюминия, лецитин, самоэмульсифицирующие системы, поставляющие лекарственные препараты (8ΕΌΌ8), сурфактанты, применяемые в форме фармацевтических расфасовок, такие как твины, или другие аналогичные полимерные матриксы для доставки, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные соединения, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных жирных кислот растительного происхождения, вода, соли или электролиты, такие как протамин сульфат, двузамещенный фосфорно-кислый натрий, однозамещенный фосфорно-кислый калий, хлористый натрий, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат магния, поливинил пирролидон, соединения на основе целлюлезы, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлеза натрия, полиакрилаты, воск, полиэтилен-полиоксипропиленовые полимеры, полиэтиленгликоль и панолин. Циклодекстрины, такие как α-, β- и γ-циклодекстрин, или химически модифицированные производные, такие как гидроксиалкилциклодекстрины, включая 2- и З-гидроксипропил-βциклодекстрины, или другие растворимые производные также могут использоваться для улучшения транспорта рецептур по настоящему изобретению.

Описанные в данной заявке рецептуры могут содержать другие терапевтические агенты типа описанных ниже и могут быть составлены, например, с использованием подходящих твердых или жидких носителей или растворителей, а также фармацевтических добавок, соответствующих желаемому способу введения (например, наполнителей, связывающих соединений, предохранителей, стабилизаторов, ароматизаторов и т. д.) в соответствии с методиками, хорошо известными в области приготовления фармацевтических композиций.

Описанные в настоящей заявке рецептуры можно вводить любым подходящим способом, например орально в форме таблеток, капсул, гранул или порошков; подъязычно; буккально; парентерально, в том числе подкожно, внутривенно, внутримышечно или с помощью внутригрудинных инъекций или инфузий (например, как стерильные инъектируемые водные или неводные растворы или суспензии); назально, например в форме спрея для ингаляций; локально, в форме крема или мази; или ректально, например, в форме суппозиториев; в форме дозированных единиц, содержащих не токсичные фармацевтически приемлемые переносчики или разбавители. Настоящие рецептуры могут, например, вводиться в форме, пригодной для немедленного высвобождения или расширенного высвобождения. Немедленное высвобождение или расширенное высвобождение могут быть достигнуты с использованием подходящих фармацевтических композиций или, в частности, в случае расширенного высвобождения с помощью таких механизмов, как подкожные импланты или осмотические насосы. Таким образом, эти рецептуры могут быть адаптированы для введения одним из следующих путей: внутриглазно, оральное введение, внутрикишечно, ингаляция, кожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение, внутритрахеальное введение или инфузия, внутритрахеальное, внутривенное введение или инфузия или локальное введение.

Примеры рецептур для орального введения включают суспензии, которые могут содержать, например, микрокристаллическую целлюлезу для передающей массы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспендирующего агента, метилцеллюлезу как агент, повышающий вязкость, и подсластители или ароматизаторы, известные в технике приготовления рецептур; и таблетки для немедленного высвобождения, которые могут содержать, например, микрокристаллическую целлюлезу, дикальций фосфат, крахмал, стеарат магния и/или лактозу и/и другие наполнители, связывающие вещества, расширители, разрыхлители, разбавители и смазывающие вещества, известные в технике. Настоящие рецептуры могут также вводиться через ротовую полость путем подъязычного и/или буккального введения. Формованные таблетки, прессованные таблетки или лиофильно высушенные таблетки - это примеры форм, которые могут быть использованы. Примеры рецептур включают рецептуры с быстро растворяющимися разбавителями, такие как маннитол, лактоза, сахароза и/или циклодекстрины. Кроме того, в эти рецептуры могут быть включены высокомолекулярные вспомогательные вещества, такие как целлюлезы (авицел) или полиэтиленгликоли (ΡΕΟ). Такие рецептуры могут также включать вспомогательное вещество, способствующее адгезии к слизистой, такие как гидроксипропил целлюлеза (НРС), гидроксипропил метил целлюлеза (НРМС), карбоксиметил целлюлеза натрия (8СМС), сополимер малеинового ангидрида (например, ΟαηΐΓβζ), и агенты, контролирующие высвобождение, такие как сополимер полиакрила (например, СагЬоро1 934). Для облегчения производства и использования могут быть также добавлены смазывающие вещества, вещества, способствующие скольжению, ароматизаторы, красящие агенты и стабилизаторы.

Эффективное количество описанного в данной заявке соединения может быть определено обычным специалистом в данной области и включает типичные дозировки для взрослых от приблизительно 0,1 до 500 мг активного соединения на кг веса тела в день, которые могут вводиться в виде одной дозы или в форме индивидуально разделенных доз, например, от 1 до 5 раз в день. Следует иметь в виду, что определенный уровень дозировки и частота приема для каждого данного субъекта может изменяться и будет зависеть от различных факторов, включая активность определенных используемых соединений, метаболическую стабильность и длительность действия этих соединений, видов, возраста, веса тела общего

- 9 026660 здоровья, пола и диеты субъекта, способа и времени введения, скорости выведения и удаления, комбинации лекарственных средств и тяжести определенного состояния. Предпочтительные субъекты для лечения включают животных, наиболее предпочтительно разные виды млекопитающих, такие как люди, и домашние животные, такие как собаки, кошки и подобные им, страдающие от ангиогенно зависящих или связанных с ангиогенезом нарушений.

Фармацевтическая композиция может также содержать другие активные факторы и/или агенты, повышающие активность. Фармацевтические композиции и составы для введения могут включать чрезкожные патчи, мази, примочки, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости, порошки и аэрозоли. Общепринятые фармакологические переносчики на основе воды, порошка или масел, уплотнители и т. д. могут быть необходимыми или желательными. В других композициях ΟΝ смешены с агентами, способствующими локальной доставке, такими как липиды, липосомы, жирные жирно-кислотные эфиры, стероиды, хелаторы и сурфактанты. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеилфосфатидил ΌΟΡΕ этаноламин, димистроилфосфатидил холин ΌΜΡΟ, дистеаролифосфатидил холин), негативные (например, димистроилфосфатидил глицерин ΌΜΡΟ) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил ΌΟΤΛΡ, диолеилфосфосфатидил этаноламин ΌΟΤΜΆ) и другие доставляющие агенты или молекулы. ΟΝ могут быть заключены внутрь липосом или могут образовывать, кроме того, комплексы, в частности, внутрь катионных липосом. В другом варианте ΟΝ могут вступать в комплексы с липидами, в частности с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и эфиры включают арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту эйкозаноевую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил 1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или С_1-10 алкил эфир (например, изопропилмиристат ΙΡΜ), моноглицерид, диглицерид или фармацевтически приемлемую их соль, не ограничиваясь ими.

Настоящее открытие будет лучше понято с учетом ссылок на следующие примеры.

Пример 1. Описание вырожденных ΟΝ.

Фиг. 1А подробно демонстрирует разделение методом ΗΡΕ-С (с использованием гидрофобной колонки) двух олигонуклеотидных препаратов, одновременно совместно инъектированных в колонку. Первый из них называется внутренним стандартом и состоит из 21 фосфотиоатного олигонуклеотида со специфически определенной последовательностью, второй - это ΚΕΡ 2006 (40-мерный вырожденный фосфотиоатный олигонуклеотид). Оба эти соединения разделяются на отдельно определяемые пики на основе только их физико-химических свойств (то есть по величине и гидрофобности); последовательность нуклеотидов в каждом из этих ΟΝ оказывает значимое влияние на физико-химические свойства ΝΟ и их разделение. Как таковой, внутренний стандарт выходит из колонки в виде четко определенного пика с меньшим временем задержки по сравнению с ΡΕΡ 2006 только благодаря разнице в размерах этих двух ΟΝ полимеров. Отметим, что плечи с каждой стороны пика ΚΕΡ 2006 обусловлены недостаточностью последовательностей, типичных для образования более длинных олигонуклеотидов. Несмотря на гетерогенную природу ΡΕΡ 2006 он проявляется как также хорошо определенный пик на ΗΡΕί, 21-мерная специфическая последовательность, которая иллюстрирует общие физико-химические свойства всех видов в препарате ΚΕΡ 2006, несмотря на то что имеется очень большое число разных последовательностей. После разделения с помощью ΗΡΕί пиков ΚΕΡ 2006 и 21-мерный пик не могут быть подвергнуты массспектроскопии (Μδ) для идентификации соединений, присутствующих в этих определенных пиках (фиг. 1В и 1С).

На фиг. 1В 21-мерный олигонуклеотид проявляется в виде одиночных соединений с Μν 7402,6 Оа, совместимых с Ρδ-ΟΝ, имеющим определенную последовательность. Однако Μδ анализ ΡΕΡ 2006 (фиг. 1С) показывает чрезвычайно большое число соединений со значениями массы, имеющими почти нормальное распределение, совпадающее с его полностью вырожденной природой. Эти значения массы находятся в интервале от С₄₀ (наименьшие соединения) до А₄₀ (наибольшие соединения), и распространенность этих соединений чрезвычайно мала с возрастанием числа соединений (интенсивностью пиков), если их масса приближается к центру интервала масс. Причина этого состоит в том, что все большее число разных последовательностей приведет к одинаковым значениям массы. Тот факт, что все различные формы ΟΝ, присутствующие в ΚΕΡ 2006, имеют одинаковые времена задержки в гидрофобной колонке при разделении методом ΗΡΕί ясно показывает, что все ΟΝ одного и того же размера и с одинаковыми химическими модификациями (то есть под действием фосфотиоата) будут иметь близко сходные (если не идентичные) физико-химические свойства и поэтому могут считаться функционально подобными при любом приложении или свойстве, не зависящих от последовательности нуклеотидов, присутствующих в данной ΟΝ молекуле. Таким образом, наблюдаемое образование любого ΟΝ хелатного комплекса, наблюдаемое с любым конкретным вырожденным ΟΝ (например, ΚΕΡ 2003, ΡΕΡ 2004), не может зависеть от последовательности присутствующих олигонуклеотидов и должно зависеть от постоянных физико-химических свойств любого ΟΝ.

Пример 2. ΟΝ образуют хелатные комплексы с разными катионами двухвалентных металлов.

Взаимодействие аммониевых солей олигонуклеотида с различными катионами двухвалентных ме- 10 026660 таллов исследовали, как описано ранее, с помощью поляризации флуоресценции (РР). В процессе синтеза олигонуклеотидов каждый олигонуклеотид конъюгировали с изотиоцианатом флуоресцеина (Р1ТС) в З'-окончании с помощью жесткого 3-углеродного линкера с применением хорошо определенных реагентов и протоколов синтеза. Эти олигонуклеотиды отделяли от синтеза и оставляли в виде солей аммония. Использованные в этом примере олигонуклеотиды описаны в табл. 1.

Таблица 1

ΟΝ, использованные в примере 1

Олигонуклеотид	Последовательность (5’-3>)	Модификации
КЕР 2032-РЬ	Ν6	РЬЕАЗЕ
КЕР 2003-РЬ	Νιο	РЬЕАЗЕ
КЕР 2004-РЬ	Яю	РЬЕАЗЕ
КЕР 2006-РЬ	N40	РЬЕАЗЕ
КЕР 2107-РЬ	N40	Р5 + 2’ О Ме
КЕР 2086-РЬ	ν40	2’ОМе
КЕР 2031-РЬ	С4о (5Е<3 ГО N0:4)	РЬЕАЗЕ

N - вырожденная последовательность (произвольное включение А, О, С или Т),

Р8 - действие фосфотиоата на каждую связь,

2'О Ме - 2'О метилирование каждой рибозы.

Использованные меченые 3' Р1ТС олигонуклеотиды представляли собой КЕР 2032-РЬ (состоящий из 6 мономеров фосфотиоатный вырожденный олигодезоксинуклеотид), КЕР 2003-РЬ (состоящий из 10 мономеров фосфотиоатный вырожденный олигодезоксинуклеотид), КЕР 2004-РЬ (состоящий из 20 мономеров фосфотиоатный вырожденный олигодезоксинуклеотид), КЕР 2006-РЬ (состоящий из 40 мономеров фосфотиоатный вырожденный олигодезоксинуклеотид), КЕР 2031-РЬ (состоящий из 40 мономеров полицитозин фосфотиоатный олигодезоксинуклеотид; 8ЕЭ ГО ΝΟ:4), КЕР 2107-РЬ (состоящий из 40 мономеров фосфотиоатный вырожденный олигодезоксинуклеотид, в котором каждая рибоза модифицирована 2'О метилированием) и КЕР 2086-РЬ (состоящий из 40 мономеров вырожденного фосфодиэфирного олигонуклеотида, в котором каждая рибоза модифицирована 2'О метилированием). Каждый из этих ΟΝ готовили в виде 0.5 мМ сток-раствора в 1 мМ ТК18 (рН 7.2). Эти сток-растворы использовали для приготовления 3 нМ флуоресцентных ΟΝ растворов в РР буфере (10 мМ ТК18, 80 мМ №С1, 1мМ ЕИТА, 10 мМ β-меркаптоэтанол и 0.1%-ный твин®-20). Присутствие ЕИТА определяется необходимостью удалить из раствора любой двухвалентный металл перед измерениями ЕР. Каждый из этих буферных растворов содержит также 80 мМ ΝαΟ для оценки образования ΟΝ комплекса в присутствии молярного избытка одновалентных катионов (на каждом графике фиг. 1-12 это продемонстрировано как нулевая концентрация хлорида металла). К каждому флуоресцентному ΟΝ в растворе добавляли различные количества АС8 фракции хлоридной соли двухвалентных (2+) металлов. Эти соли включают хлорид кальция, хлорид магния, хлорид кобальта, хлорид железа, хлорид марганца, хлорид бария, хлорид никеля, хлорид меди, хлорид цинка, хлорид кадмия, хлорид ртути и хлорид свинца. Образование димеров или хелатных комплексов ΟΝ более высокого порядка соответствовало увеличению поляризации флуоресценции (количественно оцениваемое безразмерной единицей тР), так что повышенное образование ΟΝ хелатных комплексов проявляется в больших изменениях поголовно. Более медленное разрушение этих ΟΝ хелатных комплексов в растворе ведет к повышенной поляризации испускаемой флуоресценции (см. фиг. 16). Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 2-13. В каждом случае значительные увеличения поляризации были видны со всеми ΟΝ в присутствии всех двухвалентных катионов, но не в присутствии высоко молярного избытка Να+ (поставляемого в форме №С1), указывая на образование ΟΝ хелатных комплексов только с катионами двухвалентных металлов. Эти результаты свидетельствуют о следующем:

ΟΝ в присутствии 80 мМ №С1 не обнаруживают какого-либо заметного образования димеров или любых других олигонуклеотидных комплексов более высокого порядка.

ΟΝ образуют димеры и комплексы более высокого порядка в присутствии следующих катионов двухвалентных металлов, когда они существуют в 2+ состоянии: кальция, магния, кобальта, железа, марганца, бария, никеля, меди, цинка, кадмия, ртути и свинца. Образование этих ΟΝ комплексов включает взаимодействие одигонуклеотидов с этими катионами двухвалентных металлов.

Образование комплексов не может быть обусловлено гибридизацией между азотистыми основаниями через обычные взаимодействия Уотсона-Крика вследствие вырожденной природы исследуемых олигонуклеотидов. Кроме того, невозможна самогибридизация КЕР 2031 (8ЕЭ ГО ΝΟ:4) в используемых экспериментальных условиях.

Образование ΟΝ комплексов стабильно и водорастворимо, и поскольку эти комплексы включают упомянутые двухвалентные металлы как часть образующегося комплекса, эти олигонуклеотидные комплексы оказывают хелатирующее действие на рассматриваемые двухвалентные металлы в растворе, где образовались олигонуклеотидные комплексы.

Хелатирование этих металлов и образование ΟΝ хелатных комплексов не зависят от определенной

- 11 026660 нуклеотидной последовательности, что следует из хелатирования, наблюдаемого с вырожденными олигонуклеотидами, не зависят также от модификации нуклеотидов, включая модификацию фосфодиэфирных связей 2' рибозную часть.

Хелатирование этих металлов осуществляется олигоонуклеотидами, имеющими 6-40 нуклеотидов в длину.

Хелатирование этих металлов осуществляется в присутствии или в отсутствие фосфотиоации или модификации 2' рибозы.

Повышенное образование ΟΝ хелатных комплексов с многочисленными катионами двухвалентных металлов со всеми ΟΝ в этом примере позволяет с высокой вероятностью предположить следующее: поскольку двухвалентные катионы катализируют образование ΟΝ комплексов, а одновалентные нет, и поскольку образование комплекса ΟΝ должно включать некоторую форму мостика, образованного ионом металла между двумя олигонуклеотидами в местах, которые легко делят электрон, способный занимать пустую электронную орбиталь катиона, места, наиболее пригодные для разделения электрона, это не образующие мостиков атомы кислорода (или серы в случае фосфотиоации) в фосфодиэфирной связи (см. фиг. 14В).

Можно ожидать, что двухцепочечные ΟΝ, как ΌΝΆ, так и Κ.ΝΆ образуют одинаковые хелатные комплексы и поэтому имеют одинаковую способность хелатировать катионы металла из раствора.

Эти мостики, образованные атомом металла, должны включать межмолекулярные взаимодействия, поскольку межмолекулярные взаимодействия не должны приводить к значительно повышенной поляризации флуоресценции (см. фиг. 15А-С и 16).

Растворимые ΟΝ хелатные комплексы существуют при любых концентрациях ΟΝ и двухвалентных катионов, которые не образуют преципитатов хелатных комплексов (см. фиг. 14Ό).

ΟΝ не могут образовывать соли с катионами двухвалентных металлов и не ведут себя как соли в водном растворе. Это контрастирует с одновалентными катионами (представляемыми натрием в данном примере, но также применимыми к другим одновалентным катионам, например, калию, литию или аммонию), которые образуют соли с ΟΝ и ведут себя как соли (электролиты) в растворах. Более того, хотя все ΟΝ, использованные в данном примере, являлись солями аммония, в водном растворе ион аммония, вероятно, диссоциирует от ΟΝ (как следовало бы ожидать от соли) и не обеспечивает ингибирования образования ΟΝ хелатных комплексов с двухвалентными катионами. Это дополнительно подтверждается наблюдением, что дополнительная одновалентная соль (в данном случае 80 мМ №С1) не влияет на образование ΟΝ хелатных комплексов с двухвалентными катионами.

Можно ожидать, что образование ΟΝ хелатных комплексов происходит с любым металлом, переходным металлом, лантанидом или актинидным элементом с 2+ зарядом, а также может случиться с ионами металла с зарядом 3+ или больше (например, хромом).

Можно ожидать, что ΟΝ, содержащие больше чем 40 мономеров в длину или содержащие другие модификации или имеющие любые определенные последовательности, образуют ΟΝ хелатные комплексы с двухвалентными катионами металла, настолько длинные, что они содержат связи, способные обобществлять электроны таким же образом, как не образующие мостиков атомы кислорода (или серы) в обычных фосфодиэфирных связях.

ΟΝ соли (например, соли натрия) могут быть полезны для хелатирования у человека или других пациентов двухвалентных металлов, таких как кадмий, ртуть, свинец, но не ограничиваются ими. Кроме того, хелатирование любого определенного катиона металла (например, железа) натриевой солью олигонуклеотида может быть подавлено с помощью приготовления натриевой соли ΟΝ как ΟΝ хелатного комплекса с другим катионом двухвалентного металла (например, кальция).

Иные, чем хлориды, соли металла тоже могут допустить образование ΟΝ хелатных комплексов. Рассматривая соли кальция в качестве примера, другие соли кальция, совместимые с образованием ΟΝ хелатных комплексов, могут включать без ограничений глюконат кальция, цитрат кальция, лактат кальция, малат кальция, аспартат кальция, фумарат кальция, аскорбат кальция, бензоат кальция, эриторбат кальция и/или пропионат кальция.

Пример 3. ΟΝ образуют хелатные комплексы с разными солями кальция и магния.

Чтобы далее продемонстрировать универсальную природу образования ΟΝ хелатного комплекса и продемонстрировать также роль разных солей катионов двухвалентных металлов в образовании ΟΝ хелатных комплексов, использовали две разные формы кальциевых и магниевых солей для приготовления разных ΟΝ хелатных комплексов ΟΝ с разными специфическими последовательностями. Использовали следующие соли: хлорид кальция, сульфат кальция, хлорид магния и сульфат магния. Использованные ΟΝ перечислены в приведенной ниже табл. 2. Условия реакции РР были идентичны условиям в примере 1 с тем отличием, что был пропущен БИТА, чтобы продемонстрировать образование ΟΝ хелатных комплексов в отсутствие эффектов, опосредованных БИТА.

- 12 026660

Таблица 2

ΟΝ, использованные в примере 2

Олигонуклеотид	Последовательность (5’ - 3’)	8Е<У Ιϋ ΝΟ.	Модификации
КЕР 2055-РЬ	(АС)20	6	РЗ
КЕР 2056-РЬ	(ТС)20	7	РЗ
КЕР 2033-РЬ	(ТО)20	5	РЗ
КЕР 2029-РЬ	Адо	2	РЗ
КЕР 2028-РЬ	О4о	1	РЗ
КЕР 2057-РЬ	(АО)2о	8	РЗ
КЕР2120-РЬ	N40 (С = 5’метилцитидин)	ΝΑ	РЗ
КЕР 2030-РЬ	Тдо	3	РЗ
КЕР2129-РЬ	Сбо	12	РЗ
КЕР2126-РЬ	С2о	9	РЗ
КЕР2128-РЬ	С50	11	РЗ
КЕР 2127-РЕ	Сзо	10	РЗ
КЕР 2006-РЬ	N40	ΝΑ	РЗ
КЕР2139-РЬ	(А5’МеС)го	13	РЗ + 2’ О Ме
КЕР 2045-РЬ	Ν60	ΝΑ	РЗ
КЕР 2007-РЬ	Νβο	ΝΑ	РЗ

N - вырожденная последовательность (произвольное включение А, О, С или Т),

Ρδ - фосфотиоация на каждой связи,

2'О Ме - 2'О метилирование каждой рибозы,

ΝΑ - не применимо (последовательность вырождена).

Результаты этих экспериментов проиллюстрированы на фиг. 17-24 и демонстрируют, что все исследованные ΟΝ могут образовать ΟΝ комплексы с разными солями кальция и магния. Два исключения из этого общего наблюдения - это ΚΕΡ 2028-РЕ (состоящий из 40 мономеров поли О, δΕ^ ГО N0:1; фиг. 18А и 22А) и ΚΕΡ 2029-РЕ (состоящий из 40 мономеров поли А, δΕ^ ГО N0:2; фиг. 17В и 21В). Известно, что оба эти ΟΝ - полипурины, и особенно в случае поли О они образуют термодинамически стабильные внутримолекулярные связи (названные О-четвертинками в случае поли О 1гас1з), что приводит к образованию олигонуклеотидами жестких внутримолекулярных комплексов, в которых фосфодиэфирный молекулярный скелет, вероятно, частично изогнут внутри этого комплекса, или не способны более участвовать во взаимодействиях в растворе (подобно образованию хелатных комплексов). ΚΕΡ 2029-РВ (δΕ^ ГО ΝΟ:2) мало способен образовывать хелатные комплексы, которые, вероятно, объясняются слабыми А-четвертичными взаимодействиями с данным ΟΝ. Таким образом, в данной заявке не охвачены ΟΝ, которые включают только поли А и поли О и аптамеры, образующие термодинамически стабильные внутримолекулярные взаимодействия. Охваченные в данной заявке ΟΝ - это не только поли А или поли О ΟΝ и/или аптамеры.

Результаты из примера 2 показывают, что разные формы солей магния и кальция могут использоваться для приготовления ΟΝ хелатных комплексов и, кроме того, иллюстрируют следующее: все ΟΝ в примере 2 (исключая ΚΕΡ 2006-РВ) содержат специфические последовательности, которые не содержат никаких палиндромических последовательностей, не способных образовывать шпильки, а также не являющиеся самокомплементарными. Таким образом, ни один из образующихся ΟΝ хелатного комплекса не приписывают процессам гибридизации.

Плохая способность ΚΕΡ 2028-РВ (δΕ^ ГО ΝΟ:1) и ΚΕΡ 2029-РВ (δΕ^ ГО ΝΟ:2) образовывать ΟΝ хелатные комплексы позволяет предположить, что требуется релаксированный фосфодиэфирный скелет для образования ΟΝ хелатного комплекса, и вновь указывает на фосфодиэфирный скелет как химическое свойство ΟΝ з, требуемое для связывания двух или большего числа ΟΝ для образования хелатных комплексов.

Ожидается, что любой ΟΝ, который содержит фосфодиэфирный скелет, способен образовывать хелатные комплексы независимо от других существующих модификаций, таких как фосфотиоатная модификация 2' рибозы или замкнутая модификация нуклеиновой кислоты.

ΟΝ хелатные комплексы, образованные с такими большими ΟΝ, как 80-мерные в длину и с ΟΝ больше 80-мерных в длину, демонстрируют такое же поведение в присутствии двухвалентных катионов металлов.

Пример 4. Образование ΟΝ хелатных комплексов с двухцепочечными ΟΝ.

Двухцепочечные олигонуклеотиды образуются из двух одноцепочечных комплементарных олигонуклеотидов, которые в водном растворе гибридизируются между собой путем взаимодействий А’а1зопСпск. Если двухцепочечные ΟΝ имеют фосфодиэфирный скелет, обращенный к наружной стороне образованной спирали ΏΝΑ, они должны быть способны образовать хелатные комплексы в присутствии двувалентных катионов. Чтобы проверить эту гипотезу, готовили два различных двухцепочечных ΏΝΑ олигонуклеотида путем гибридизации ΚΕΡ 2055-ЕЕ (состоящих из 40 мономеров поли АС; δΕ^ ГО ΝΟ:6) с ΚΕΡ 2033-РЕ (состоящих из 40 мономеров ТО; δΕ^ ГО ΝΟ:5) и ΚΕΡ 2057-РЕ (состоящих из 40 мономеров АО; δΕ^ ГО ΝΟ:8) с ΚΕΡ 2056-РЕ (состоящих из 40 мономеров ТС; δΕ^ ГО ΝΟ:7). Поскольку гибри- 13 026660 дизация ΟΝ проявляется в форме двойной структуры, результирующее увеличение массы может быть отмечено по увеличению поляризации флуоресценции по сравнению с одноцепочечными ОН использованными для приготовления комплекса. Одноцепочечные ΟΝ (ВЕР 2055-РЬ (8Еф ГО ΝΟ:6), ВЕР 2033-РЬ (8Еф ГО N0:5), ВЕР 2057-РЬ (δΗΟ ГО N0:8) и ВЕР 2056-РЬ (δΗΟ ГО N0:7)) разбавляли до 20 нМ в IX РР буфере. Гибридизацию двух идентифицированных выше комплементарных пар также осуществляли в IX РР буфере (10 нМ каждого 0Ν), и гибридизация подтверждалась увеличением поляризации флуоресценции. Двухцепочечные конструкты затем экспонировали в присутствии 100 мМ СаС1₂ или 100 мМ МдС1₂. Образование хелатных комплексов прослеживали по увеличению поляризации флуоресценции (см. фиг. 25). Результаты этого эксперимента подтверждают успешную гибридизацию обеих комплементарных пар ΟΝ в двухцепочечные ΟΝ, как следует из увеличения поляризации флуоресценции. Более того, добавление как СаС1₂, так и МдС1₂ к этим двухцепочечным ΟΝ проявлялось в дальнейшем увеличении поляризации флуоресценции, указывая, что эти двухцепочечные ΟΝ могли бы образовывать хелатные комплексы в присутствии двухвалентных катионов металлов. Эти результаты также существенно предполагают, что двухцепочечные ΟΝ могут образовывать ΟΝ хелатные комплексы с любыми двухвалентными катионами и как можно ожидать оказывают эффект на выделение упомянутых двухвалентных катионов из раствора.

Пример 5. Разные одновалентные катионы не образуют хелатных комплексов с ΟΝ.

Для того чтобы более специфично показать, что образование ΟΝ хелатных комплексов не может осуществиться в присутствии одновалентных катионов и требует для их образования присутствия двухвалентных катионов, наблюдали обраование ΟΝ комплекса со многими ΟΝ (см. пример 2) в РР буфере, содержащем только один источник катионов. Готовили IX РР буфер, содержащий только одну из следующих солей: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид аммония, хлорид кальция или хлорид магния, все в концентрациях 80 мМ, так что концентрации катионов в РР буфере были эквивалентны. Флуоресцентно меченые ΟΝ, описанные в примере 2, были разбавлены до 10 нМ различными РР буферами, и оценивали образование ΟΝ хелатных комплексов по поляризации флуоресценции (см фиг. 26). В случае каждого исследованного ΟΝ наблюдали образование хелатных комплексов только с катионами М§²⁺ и Са²'. а не с любым из исследованных одновалентных катионов (№⁺, К+ или ΝΗ₄+). Как наблюдали в примере 3, ВЕР 2029-РЬ (8Еф ГО ΝΟ:2) и ВЕР 2028-РЬ (8Е0 ГО ΝΟ:1) в присутствии кальция или магния не осуществлялось или осуществлялось умеренное образование комплексов соответственно в присутствии кальция или магния. Это дополнительно подтверждает, что ΟΝ могут образовывать хелатные комплексы с двухвалентными катионами, в то время как ΟΝ с одновалентными катионами могут существовать только в форме солей.

Пример 6. Оценка содержания металла в ΟΝ хелатных комплексах, приготовленных в воде для инъекций (ХУР1).

Чтобы продемонстрировать широкую применимость приготовления ΟΝ хелатных комплексов ко всем олигонуклеотидам, были приготовлены несколько ΟΝ хелатных комплексов с помощью ΟΝ и солей хлоридов двухвалентных металлов, как указано в табл. 3. Все ΟΝ, использованные в этих препаратах, представляли собой натриевые соли, которые были обессолены для удаления натрия из Ναί'Ί и только интегральный натрий, образующий соль ΟΝ в окончательном лиофилизованном ΟΝ. ΟΝ хелатные комплексы готовили в воде для инъекций (УР1) путем первоначального растворения определенного количества натриевой соли ΟΝ до концентрации 50 мг/мл и добавления определенного количества хлорида двухвалентного металла к раствору ΟΝ. Растворы ΟΝ перед добавлением хлорида двухвалентного металла/образованием ΟΝ хелата анализировали на содержание натрия и существенный металл с помощью индуктивно-сопряженной плазмооптической эмиссионной спектроскопии (^Γ-ΟΡδ). После образования ΟΝ хелатного комплекса образцы обессоливали с помощью ультрафильтрации, используя 5000 МХУСЮ регенерированный целлюлезный фильтр. Для этого фильтра ранее было показано, что он позволяет пропускать свободную соль, но не ΟΝ или катионы, связанные с ΟΝ. Задержанный раствор (содержащий ΟΝ хелатные комплексы) анализировали, определяя содержание натрия и металла с помощью IСР-ΟЕδ и содержание хлорида с помощью ионной хроматографии для подтверждения, что присутствующие двухвалентные металлы были хелатированы ΟΝ. а не относятся к солям двухвалентных металлов, присутствующим в задержанном растворе (табл. 4).

- 14 026660

Т аблица 3

Приготовление различных ΟΝ хелатных комплексов

ΟΝ	Последовательность / химия	Приготовленный хелат металла	Добавленный хлорид металла (мг/ 100мг ΟΝ)	Концентрация ΟΝ
КЕР 2004	Ν20/Ρ3	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2006	Ν40/Ρ3	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2006	Ν40/Ρ3	Са	20	50 мг/мл
КЕР 2006	Ν40/Ρ3	Са	30	25 мг/мл
КЕР 2006	Ν4ο / РЗ	Мв	20	50 мг/мл
КЕР 2006	Ν40/Ρ3	Ре5+	2	25 мг/мл
КЕР 2107	Ν40 / РЗ,2’ОМе	Са	10	37,5 мг/мл
КЕР 2107	Ν40/Ρ5, 2’ОМе	Мв	15	37,5 мг/мл
КЕР 2107	Ν40/Ρ3, 2’ОМе	Ре^+	2	37,5 мг/мл
КЕР 2138 (3Εζ) ГО N0:14)	С4о 12’ОМе	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2126 (8Е<3 ГО N0:9)	С2о/Р5	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2031 (5Е<3 ГО N0:4)	С40 / Р5	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2129 (ЗЕ<3 ГО N0:12)	С60 / РЗ	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2057 (5Е0 ГО N0:8)	(ΑΟ)20ΖΡδ	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2057 (5Е<3 ГО N0:8)	(АО)20 / РЗ	Мв	15	50 мг/мл
КЕР 2057 (5Е<3 ГО N0:8)	(ао)20 / рз	Ре2+	2	50 мг/мл
КЕР 2055 (5Е0 ГО N0:6)	(АС)20 / РЗ	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2139 (5Е<3 ГО N0:13)	(А,5МеС)20 / РЗ,2’ОМе	Са	10	50 мг/мл
КЕР 2139 (5Ες ГО N0:13)	(А,5МеС)20 / РЗ,2’ОМе	Са	30	25 мг/мл
КЕР 2139 (5Е<3 ГО N0:13)	(А,5МеС)20 / РЗ,2’ОМе	м§	15	50 мг/мл
ΟΝ	Последовательность / химия	Приготовленный хелат металла	Добавленный хлорид металла (мг/100мг ΟΝ)	Концентрация ΟΝ
КЕР 2139 (5Ер ГО N0:13)	(А,5МеС)20 / РЗ,2’ОМе	Са, Ме	5/7.5	50 мг/мл

N - вырожденное основание (произвольное распределение А, О, Т или С),

Р8 - фосфотиоат,

2'ОМе - 2'О метилированная рибоза,

5МеС - 5'метилцитидин.

Т аблица 4

Валидация содержания металла в растворах различных ΟΝ хелатных комплексов

ΟΝ	Хелат металла (мг/100мг ΟΝ)	Прехелатный раствор ΟΝ	ΟΝ хелатный комплекс после обессоливания
натрий	Металл	хлорид	натрий	металл
КЕР 2004	Са (10)	0,276%	< 2.0 ррт	< 10 ррт	<0,03%	664 ррт
КЕР 2006	Са(10)	0,381%	< 11 ррт	<8 ррт	400ррт	614 ррт
КЕР 2006	Са(20)	0,443%	1,21 ррт	<8 ррт	141 ррт	0,11%
КЕР 2006	Са (30)	0,399%	2,0 ррт	<8 ррт	< НО ррт	861 ррт
КЕР 2006	Мв(20)	0,390%	< 5 ррт	<9 ррт	110 ррт	564 ррт
КЕР 2006	Ре5* (2)	0,394%	< 5 ррт	< 10 ррт	979 ррт	176 ррт
КЕР2107	Са(10)	0,232%	с 6 ррт	< 9 ррт	215 ррт	539 ррт
КЕР2107	М§(15)	0,237%	< 0,9 ррт	<9 ррт	162 ррт	339 ррт
КЕР 2107	Ре7’(2)	0,219%	2,5 ррт	15 ррт	0,049%	141 ррт
КЕР2138 (5Е<3 ГО ΝΟ: 14)	Са(10)	0,210%	< 0,04%	<10 ррт	3,2 ррт	745 ррт
КЕР2126 (ЗЕО ГО N0:9)	Са (10)	0,266%	<2,3 ррт	< 10 ррт	< 0,04%	681 ррт
КЕР 2031 (&Е<2 ГО N0:4)	Са(10)	0,222%	< 2,4 ррт	<9 ррт	<0,03%	772 ррт
КЕР2129 (5ЕО ГО N0:12)	Са ¢10)	0,236%	<2,4 ррт	< Ιΰ ррт	<0,03%	681 ррт
КЕР 2057 (5Е0 ГО N0:8)	Са(10)	0,257%	5,5 ррт	< 10 ррт	398 ррт	743 ррт
КЕР 2057 (ЗЕО ГО N0:8)	Мё (15)	0,250%	< 1 ррт	<9 ррт	177 ррт	531 ррт
КЕР 2057 (5ЕО ГО N0:8)	Ре2* (2)	0,244%	0,7 ррт	<9 ррт	0,101%	195 ррт
КЕР 2055 (ЗЕО ГО N0:6)	Са (10)	0,238%	<6 ррт	<9 ррт	351 ррт	639 ррт
КЕР2139 (5Е0 ГО N0:13)	Са(!0)	0,244%	< 6 ррт	<8 ррт	347 ррт	638 ррт
КЕР2139 (5ЕО ГО N0:13)	Са (30)	0,236%	< 1,8 ррт	< 8 ррт	91 ррт	937 ррт
КЕР2139 (5ЕО ГО N0:13)	М§(15)	0,247%	< 1 ррт	<9 ррт	248 ррт	472 ррт
КЕР 2139 (5Е0 ГО ΝΟ: 13)	Са(5), Мй (7,5)	0,276%	< 9 ррт (са)	< 10 ррт	0,022%	0,033% (Са)
< 5 ррт (Мг)	0,314% (Мг)

ррт - частей/млн.

- 15 026660

Эти результаты подтверждают частичное замещение натрия кальцием, магнием или железом (2+) в 0Ν, имеющих длину 20-60 мономеров с последовательностью от полностью вырожденных 0Ν до трех специальных последовательностей (поли С, поли АС и поли АС) и в 0Ν, содержащих или не содержащих фосфотиоатные модификации, содержащих или не содержащих 2' рибозные модификации. Ожидается, что способность образовывать 2'0 метил рибозу в качестве хелатных комплексов распространится также на 0Ν, содержащие любую другую 2' модификацию рибозы, такую как 2' флуоро- и 2'О метилоксиэтил, но не ограничивающуюся ею. Кроме того, они показывают, что значительное замещение натрия достигается при минимальном увеличении содержания двухвалентного металла, совместимом со структурами 0Ν хелатного комплекса, описанными на фиг. 15. Эти результаты иллюстрируют также различные комбинации кальция, магния, железа (2+) и смешанные растворы солей кальция с магнием, которые могут использоваться для приготовления 0Ν хелатных комплексов, и показывают, что для приготовления 0Ν хелатных комплексов могут быть одинаково использованы растворы любых двухвалентных металлов или смесь растворов двухвалентных металлов.

Таким образом, 0Ν хелатные комплексы могут быть приготовлены из полностью или не полностью фосфотиоатированных 0Ν, содержащих любое число фосфотиоатных связей, содержащих по меньшей мере одну 2' рибозную модификацию или полную или не содержащих 2' рибозной модификации. 0Ν может быть РNА, или ΌΝΑ, или гибрид, содержащий ΕΝΑ и ΌΝΑ. Соли металла, использованные в приготовлении 0Ν хелатного комплекса, включают без ограничения соль кальция, соль магния, соль железа, любые другие соли двухвалентного металла.

Пример 7. Приготовление стабильных 0Ν хелатных комплексов в нормальном физиологическом растворе.

Продемонстрировав выраженную консервативную природу образования 0Ν хелатного комплекса и приготовления их с разными двухвалентными металлами в примерах 2 и 3, исследовали приготовление стабильных растворимых 0Ν комплексов хелата кальция в нормальном физиологическом растворе, более соответствующем растворителе для введения субъекту 0Ν хелатного комплекса. Для этого эксперимента в качестве источника 0Ν использовали 200 мг/мл раствора натриевой соли РЕР 2006 в нормальном физиологическом растворе. Источником кальция был 10%-ный раствор СаС1₂ в \УР1 (100 мг/мл СаС1₂). Различные хелатные комплексы кальция РЕР 2006 с разными концентрациями готовили в 1 мл растворов при комнатной температуре (см. табл. 5) согласно следующему протоколу: 1) добавить в колбу РЕР 2006, 2) добавить нормальный физиологический раствор и перемешать и 3) добавить СаС1₂ и перемешать. Наблюдали за этими кальциевыми хелатными растворами РЕР 2006 для обнаружения преципитата в течение 36 дней (см. табл. 6).

Таблица 5

Условия приготовления различных кальциевых хелатных комплексов РЕР 2006

[КЕР2006] (мг/мл)	СаСЬ (мг на 100 мг КЕР 2006)
15	20	25	30	35	40
	500 мкл	500 мкл КЕР 2006	500 мкл	500 мкл	500 мк	500 мкл
	КЕР 2006 +	КЕР 2006 +	КЕР 2006 +	КЕР 2006 +	КЕР 2006 +
500	350 мкл N8	300 мкл N5	250 мкл N8	200 мкл N8	150 мкл N8	3 00 мкл N8
	+	+	-I-	+	+
	150 мкл	200 мкл СаС12	250 мкл	300 мкл	350 мкл	400 мкл
	СаС12	СаСЬ	СаС12	СаСЬ	СаСЬ
	250 мкл	250 мкл	250 мкл	250 мкл	250 мкл	250 мкл
	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006
	+	+	+	+	+	+
50	675 мкл	650 мкл	625 мкл	600 мкл	575 мкл	550 мкл
N8	N5	N8	N3	N5	N8
	+	+	+	+	+	+
	75 мкл	100 мкл	125 мкл	150 мкл	175 мкл	200 мкл
	СаС12	СаС12	СаСЬ	СаСЬ	СаСЬ	СаСЬ
	125 мкл	125 мкл	125 мкл	125 мкл	125 мкл	125 мкл
	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006	КЕР 2006
	+	+	+	+	4*	+
25	837,5 мкл	825 мкл	812,5 мкл	800 мкл	787,5 мкл	775 мкл
	N3	N3	N8	N3	N3	N3
	+	+	+	+	+	+
	37,5 мкл	50 мкл	62,5 мкл	75 мкл	87,5 мкл	100 мкл
	СаС12	СаС12	СаСЬ	СаСЬ	СаС12	СаСЬ

- 16 026660

Таблица 6

Образование преципитата в кальциевых хелатных комплексах КЕР 2006 при различных концентрациях ΟΝ и кальция

+ - очень малое количество белого преципитата на дне колбы, ++ - тонкий коллоидальный полупрозрачный преципитат, +++ - тонкий коллоидальный непрозрачный преципитат, ++++ - первоначально преципитат на дне пробирки, но присутствуют остаточные коллоиды, +++++ - преципитат на дне пробирки, остаточный раствор прозрачный и пропускающий.

Во всех случаях растворы хелата кальция КЕР 2006 характеризуются сниженным поверхностным натяжением и повышенной вязкостью по сравнению с растворами КЕР 2006 без кальция (при всех исследованных концентрациях), о чем свидетельствует более выраженные мениски в колбе и поведение вязкого раствора при мягком покачивании колбы. Это поведение раствора соответствует образованию больших растворимых мультимерных комплексов (хелатных комплексов), как обозначено на фиг. 15 АС. Даже в тех колбах, где образовался преципитат, оставшийся раствор еще демонстрирует это характерное увеличение поверхностного натяжения и вязкости. Возможно, что образованные в этих растворах преципитаты содержат насыщенные (и нерастворимые) ΟΝ хелатные структуры, представленные на фиг. 15Ό с оставшимися непреципитированными ΟΝ и кальцием, еще образующими растворимые хелаты в растворе. Ожидается, что эти способы поведения вообще репрезентативны по отношению к поведению любого ΟΝ хелатного комплекса независимо от длины ΟΝ, химического состава, структуры (одноцепочечный или двухцепочечный) или присутствующего двухвалентного металла. Более того, эти эксперименты также демонстрируют, что хотя повышенные концентрации ΟΝ и кальция могут сначала образовывать полностью растворимые комплексы, они, вероятно, являются динамически нестабильными и медленно превращаются из растворимых хелатных комплексов (представленных на фиг. 15А-С) в нерастворимые хелатные комплексы (фиг. 15Ό). Таким образом, может оказаться желательным приготовить ΟΝ хелатные комплексы при концентрациях ΟΝ и металла, таких как представленные в табл. 5, которые имеют растворимые ΟΝ хелатные комплексы, стабильные в растворе. Для разных комбинаций ΟΝ и металла оптимальные концентрации ΟΝ и металла, приводящие к образованию растворимых ΟΝ хелатных комплексов, могут изменяться от концентраций, показанных для КЕР 2006 и кальция в табл. 5.

Примеры 6 и 7 описывают разные комбинации ΟΝ и солей двухвалентных металлов в разных растворителях, которые могут быть полезны при приготовлении ΟΝ хелатных комплексов и описывают комбинации ΟΝ и солей двухвалентных металлов, которые приводят к образованию растворов ΟΝ хелатных комплексов, которые быстро преципитируют в нормальном физиологическом растворе, медленно преципитируют или остаются полностью растворимыми в течение большого периода времени. Может оказаться предпочтительным использовать ΟΝ хелатные растворы с любыми из этих характеристик стабильности.

Таким образом, ΟΝ хелатные комплексы могут быть приготовлены с применением любой соли ΟΝ, включая, но, не ограничиваясь ею, ΟΝ натриевую соль или ΟΝ аммониевую соль или смешанную соль ΟΝ натрия/аммония. В идеальном варианте ΟΝ соль растворена в водном растворителе, включая воду для инъекций или нормальный физиологический раствор, но не ограничиваясь ими. Источником двухвалентного металла, используемого для образования ΟΝ хелата, может быть соль хлорида, соль сульфата или любая другая фармацевтически приемлемая соль, включая соль глюконата, соль цитрата, соль лактата, соль малата, соль аспартата, соль фумарата, соль аскорбата, соль бензоата, соль эриторбата и/или соль пропионата, но не ограничиваясь ими. Соль может содержать любые из следующих катионов двухвалентных металлов: кальций, магний, железо (2+), марганец, медь и/или цинк. Кроме того, может использоваться более чем одна соль металла. Упомянутая соль металла может быть использована непосредст- 17 026660 венно в форме порошка, но ее предпочтительно готовили в виде водного раствора с тем же наполнителем, что и ΟΝ. Соли металла могут быть приготовлены в любой концентрации для ограничения растворимости упомянутой соли металла с упомянутым наполнителем. ΟΝ хелатные комплексы предпочтительно готовили путем медленного добавления раствора соли металла в раствор ΟΝ раствора при постоянном перемешивании для предотвращения накопления преципитатов ΟΝ хелатов во время добавления раствора соли. В зависимости от концентрации использованных ΟΝ и солей металла растворы ΟΝ хелата могут медленно образовывать со временем ΟΝ хелатные преципитаты или оставаться полностью растворимыми (см. пример 7).

Пример 8. Хелатирование сывороточного кальция ΟΝ вызывает антикоагуляцию крови.

Ранее были описаны антикоагулянтные эффекты специфических ΟΝ. но чтобы продемонстрировать антикоагулянтные эффекты ΟΝ хелатных комплексов в настоящей заявке, готовили не меченные Р1ТС ΟΝ, чтобы соли высокой степени очистки были биологически совместимы. Эти ΟΝ, а именно КЕР 2004, КЕР 2006, КЕР 2107 и КЕР 2031 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:4), являются немечеными вариантами ΟΝ, описанных в примере 1. Эти ΟΝ при различных концентрациях (500 мкл в нормальном физиологическом растворе) добавляли к 5 мл свежей цельной крови человека, собранной в цитратные пробирки. Протромбиновое время (принятая мера коагулянтного статуса крови) в присутствии этих ΟΝ оценивали с помощью клинических лабораторных методик и сравнивали с протромбиновым временем в присутствии равных объемов нормального физиологическогог раствора. Относительное влияние на свертывание выражают как отношение (РТТ_олиго:РТТ_{нормальный} ф_из. _{раствор}) и обозначают как нормализованное отношение (ΝΚ). ΝΚ, равное 1, указывает на нормальный коагуляционный статус, а ΝΚ больше 1 указывает на антикоагулянтное состояние крови. Результаты этих экспериментов проиллюстрированы на фиг. 27. Для всех изученных ΟΝ было установлено дозозависимое увеличение антикоагуляции.

КЕР 2055 (8ЕО ГО ΝΟ:6) - (состоящий из 40 мономеров фосфотиоатированный ΟΝ с последовательностью (АС)₂₀. Эффект добавления 2,5 мМ натриевой соли РЬЕР 2055 на коагуляционный статус крови оценивали, как описано выше. Чтобы определить, объясняется ли антикоагуляционный эффект хелатированием кальция в крови, добавляли различные количества кальция (в форме хлорида кальция) на КЕР 2055 наблюдалось (8ЕО ГО ΝΟ:6) - индуцированная антикоагуляция. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 28. Как и ожидалось из результатов, представленных на фиг. 27, 2,5 мМ, КЕР 2055 (8ЕО ГО ΝΟ:6) индуцировали выраженный антикоагулянтный эффект на кровь. Эта антикоагуляция эффективно подавлялась при добавлении кальция и могла бы быть полностью обращена при концентрациях хлорида кальция больше чем 2.25 мМ. Эти результаты позволяют с высокой вероятностью предположить, что антикоагуляционный эффект олигонуклеотидов опосредован образованием ΟΝ хелатных комплексов в крови после введения в кровь хелатных комплексов, приводящего к хелатированию кальция, как описано в приведенных выше примерах. Кроме того, эти результаты демонстрируют способ предотвращения антикоагуляции крови с помощью ΟΝ, который должен нейтрализовать хелатирующий эффект ΟΝ, вводимый при приготовлении кальциевого хелатного комплекса. Нейтрализация хелатирования кальция может быть достигнута также с ΟΝ хелатным комплексом, приготовленным с помощью солей другого двухвалентного металла, включающих магний, марганец, железо (2+), медь и/или цинк, но не ограничивающихся ими. Можно ожидать, что эти способы подавления опосредованной олигонуклеотидами антикоагуляции будут эффективны при введении олигонуклеотидов людям или другим субъектам по 4 или другим способам введения.

Результаты этого эксперимента ставят также вопрос о природе взаимодействия ΟΝ с сывороточными белками. Ранее предположения о природе антикоагуляции ΟΝ заключались в том, что ΟΝ непосредственно взаимодействует с белками коагуляционного каскада, но мы отмечаем, что большая часть этих белков являются кальций-связывающими белками или белками, участвующими в кальций-зависящем коагуляционном каскаде (8ЬеегЬап апб Ьап, 1998, В1ооб 92: 1617). Тот факт, что антикоагуляционный эффект ΟΝ может быть нейтрализован добавлением кальция и тот факт, что ΟΝ действует как хелатор кальция, позволяет предположить следующее: белок, связывающий ΟΝ и участвующий в антикоагуляции, может быть необходимым, но не достаточным для антикоагуляции - удаление кальция из кальцийзависимых белков путем хелатирования его ΟΝ может быть механизмом, с помощью которого ΟΝ осуществляет антикоагуляцию.

Взаимодействия ΟΝ с белком и компонентами коагуляционного каскада могут сами по себе быть кальций-зависимыми.

Основной белок крови альбумин также связывает кальций и является частью механизма регуляции кальция в сыворотке. Известно также, что альбумин взаимодействует с ΟΝ и, вероятно, играет основную роль во времени полужизни (циркуляции) ΟΝ в крови. Из приведенных выше результатов экспериментов по антикоагуляции следует, что основная часть белковых взаимодействий в крови может в основном определяться способностью ΟΝ образовывать хелатные комплексы с кальцием. Таким образом, чтобы уменьшить взаимодействие сывороточных белков, которые также, по-видимому, влияют на время полужизни циркуляции ΟΝ и улучшают его переносимость при парентеральном введении. ΟΝ можно вводить субъекту в виде ΟΝ хелатных комплексов. Эти комплексы могли бы быть приготовлены из кальциевых солей, но могут также быть приготовлены из других подходящих солей металлов, так чтобы нейтрализо- 18 026660 вать склонность ΟΝ образовывать хелаты с кальцием при введении. Такие комплексы уже имели бы сниженную способность к образованию хелатов и соответственно значительно сниженное взаимодействие с сывороточными белками. Преимуществами этих уменьшенных взаимодействий сывороточных белков были бы улучшенная переносимость введенного ΟΝ (в форме хелатного комплекса) и более короткое времени полужизни свободного ΟΝ в крови.

Пример 9. Развитие и предотвращение гипокальцемии у людей при хроническом лечении ΟΝ.

Для дальнейшего выяснения того обстоятельства, имеет ли биологическое значение для людей описанное в приведенных выше примерах хелатирование двухвалентных катионов металлов, исследовали влияние хронического введения ΟΝ на пациентов с хроническими заболеваниями печени. Эти субъекты особенно хорошо подходят для изучения биологического эффекта (если он есть) хелатирования ΟΝ, поскольку было показано, что они страдают от дефицита витамина Ό, который обычно сопровождается нарушениями минерального метаболизма и сниженной минеральной плотностью костной ткани (Аг1сН с1 а1., 2010, Όί§. Όίδ. δοΐ., 55: 2624-2628 апй Оеогде е! а1., 2009 Аог1й 1 Оа81егоейего1., 15: 3516-3522). Таким образом, если эффект хелатирования хронически вводимых ΟΝ изменял у людей гомеостаз двухвалентного металла (такого как кальций), влияние этого изменения наиболее легко наблюдалось бы у этих пациентов, поскольку они обладают низкой способностью взаимодействовать с дисбалансом любого металла в сыворотке. Пациентов с инфекцией хронического гепатита В (с диагносцированным хроническим заболеванием печени) лечили раз в неделю с помощью ΟΝ КЕР 2055 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:6) (в форме натриевой соли ОМР высокой степени очистки) путем медленной инфузии IV в нормальном физиологическом растворе. Полные значения кальция в сыворотке прослеживали у субъектов с помощью принятых клинических лабораторных способов. У первых двух субъектов, получавших ΟΝ лечение, развилась существенная гипокальцемия в течение 12 недель лечения (фиг. 29А). Эта гипокальцемия изменялась по тяжести, но сохранялась в следующие 13 недель лечения. Последующим субъектам, получавшим хроническое лечение ΟΝ с помощью КЕР 2055 (8ЕО ГО ΝΟ:6), вводили минеральные добавки (включая кальций, магний и цинк) для противодействия эффектам хелатирования при обработке ΟΝ. Ни у кого из субъектов, получивших минеральные добавки, не развилась гипокальцемия несмотря на обработку ΟΝ (фиг. 29В). Эти результаты демонстрируют способности к хелатированию ΟΝ у людей. Это наблюдалось непосредственно с сывороточным кальцием, но может также наблюдаться с другими биологически важными катионами двухвалентных металлов, такими как магний, цинк и медь. Кроме того, дефициты металла, вызванные влиянием ΟΝ хелатирования, могут быть скорректированы добавлением минералов и могут также быть уменьшены путем введения ΟΝ как хелатных комплексов.

Поскольку было показано, что ΟΝ образуют у людей хелаты катионов двухвалентных металлов, введение нехелатированных ΟΝ могло бы быть полезным для хелатирования у субъектов вредных тяжелых металлов, таких как ртуть, кадмий, свинец или даже хром (6+). Такой способ будет включать введение фармацевтически приемлемой ΟΝ соли в соответствующем растворителе, причем ΟΝ предназначен не иметь зависящей от последовательности функциональности (такой как специфическая последовательность, описанная в примере 3, но не ограниченная ими), предпочтительно путем внутривенного введения, но также и другими парентеральными способами. Ожидалось, что пациенты с нормальной функцией печени способны противостоять хелатированию кальция, которое могло бы происходить при минеральных добавках (как в примере 9), чтобы убедиться в том, что будет предотвращен распад в сыворотке биологически значимых двухвалентных катионов. Такие нехелатированные ΟΝ могли бы отделить тяжелые металлы в крови, немедленно уменьшая или ликвидируя повреждающие эффекты этих металлов, а также, возможно, ускорить их вывод из организма рассматриваемых субъектов.

Поскольку было также показано, что двухцепочечные ΟΝ могут также образовать ΟΝ хелатные комплексы (и таким образом, отделить двухвалентные металлы), ожидается, что введение любой двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, δίΚΝΑ) могло бы оказывать, по меньшей мере, некоторые эффекты хелатирования, описанные для одноцепочечных ΟΝ в предыдущем примере. Таким образом, может быть желательно готовить двухцепочечные ΟΝ как хелатные комплексы перед введением.

Пример 10. ΟΝ хелатные комплексы могут подавлять реакции в месте инъекции олигонуклеотидов при подкожном введении.

Реакции в месте инъекции (Ι8Κ) подкожно вводимых пациентам олигонуклеотидов являются обычными даже с сильно модифицированными для минимизации иммуностимуляторных свойств олигонуклеотидами. Если подкожное введение включает инъекцию высококонцентрированных олигонуклеотидов (обычно >100 мг/мл), эффект хелатирования (наиболее вероятно кальция, но может быть также других двухвалентных металлов, таких как магний), локализованный вокруг места инъекции, должен быть значительным и мог бы внести вклад в обычно наблюдаемую Ι8Κ. Чтобы проверить эту гипотезу, вводили пациентам подкожно КЕР 2055 (8ЕО ГО ΝΟ:6) или КЕР 2139 (8ЕО ГО ΝΟ:13, аналог КЕР 2055, в котором все рибозы 2'О метилированы и все цитозиновые основания 5' метилированы). Оба раствора готовили асептически в нормальном физиологическом растворе в форме натриевой соли или в форме хелатного комплекса кальция (см. табл. 7 и 8 и согласно процедуре в примере 8). Чтобы проконтролировать различия между пациентами, исследовали обе рецептуры каждого ΟΝ на предмет реактивности на инъекцию у каждого субъекта. Субъектов обследовали на 18К при каждом месте инъекции в течение 12 ч после вве- 19 026660 дения КЕР 2055 (8ЕЭ ΙΌ ΝΟ:6) и 72 ч после введения КЕР 2139 (8ЕЭ ГО ΝΟ:13). Результаты этого эксперимента представлены в табл. 7 и 8.

Таблица 7

Подавление реактивности места инъекции КЕР 2055 (8ЕЭ ГО ΝΟ:6) с помощью его приготовления в виде хелатного комплекса кальция (инъекция объема 1сс, 20 мг СаС1₂ /100 мг ΟΝ)

Субъект	Реакция места инъекции 25 мг КЕР 2055 (8Ер ГО N0:6); 12 часов после инъекции)
25 мг КЕР 2055 (соль натрия)	25 мг КЕР 2055 (хелат Са)	100 мг КЕР 2055 (хелат Са)
1	Затвердение: +++ воспаление:+++, слабость: ++, боль: ++	Затвердение: нет воспаление: нет слабость: нет боль: нет	Затвердение: + воспаление: нет слабость: нет боль: нет
2	Затвердение: +++ воспаление:+++, слабость: +++, боль: +++	Не оценивали	Затвердение: + воспаление: ++ слабость: нет боль: нет

Таблица 8

Подавление реактивности места инъекции КЕР 2139 (8ЕЭ ГО ΝΟ:13) с помощью его приготовления в виде хелатного комплекса кальция (инъекция объема 2сс, 30 мг СаС1₂/100 мг ΟΝ)

Субъект	Введение в реакцию 100 мгКЕРКЕР 2139 (ЗЕ<3 Ю КО: 13)
ГЗК побочный эффект	24 часа	48 часов	72 часа
Соль натрия	Хелат кальция	Соль натрия	Хелат кальция	Соль натрия	Хелат кальция
1	Затвердение воспаление: слабость: боль	++	-	++	-	+	-
++	+	++	-	+	-
2	Затвердение	++	+	++	+/-	+	-
Воспаление	+++	+	++	+/-	4-	-
Слабость	+	-	+/-	-
Боль		-	+/-	-	+/-

Эти результаты показывают, что введение ΟΝ в виде хелатного комплекса кальция существенно снижает или уменьшает 18К при двух подкожно введенных ΟΝ. Эти результаты, кроме того, показывают, что хелатирование кальция (и потенциально других двухвалентных металлов) олигонуклеотидами играет роль в проявлении 18К, обычно связанных с подкожным введением ΟΝ. Кроме того, эти результаты идентифицируют способ предотвращения 18К с помощью любого подкожно вводимого ΟΝ, выполняя введение упомянутого ΟΝ в виде хелатного комплекса. В этих примерах кальций использовали как переносчик для образования хелатных комплексов, но можно ожидать облегчения 18К с ΟΝ хелатными комплексами, приготовленными с другими подходящими двухвалентными металлами, иными, чем кальций. Можно ожидать, что любой хелатный комплекс ΟΝ с металлом имеет способность хелатировать кальций, нейтрализация которого могла бы лечь в основу механизма улучшения переносимости 8С ΟΝ при введении хелатного комплекса. Ожидается, что способность ΟΝ хелатных комплексов подавлять индуцированные олигонуклеотидом 18К эффективна для любого ΟΝ с любой специфической последовательностью или модификацией или одно- или двухтяжевыми ΟΝ в свете широко консервативной природы образования ΟΝ хелатного комплекса, описанного в приведенных примерах. Используя кальций как пример дваухвалентного металла в данном примере, можно использовать другие кальциевые соли для приготовления ΟΝ хелатных комплексов и можно ожидать получения ΟΝ хелатных комплексов, оказывающих такие же супрессивные эффекты, зависящие от олигонуклеотидов 18К при подкожном введении, включая глюконат кальция, цитрат кальция, лактат кальция, малат кальция, аспартат кальция, фумарат кальция, аскорбат кальция, бензоат кальция, эриторбат кальция и/или пропионат кальция, но, не ограничиваясь ими. ΟΝ хелатные комплексы могли быть приготовлены с помощью солей других двухвалентных катионов металлов, таких как магний, марганец, железо, медь, цинк, не ограничиваясь ими.

При приготовлении ΟΝ хелатных комплексов может быть желательно использовать другие катионы, не являющиеся двухвалентными атоиами, но могут аналогично им предотвращать хелатный эффект олигонуклеотидов. ΟΝ хелатные комплексы, приготовленные с этими катионами, могли бы также быть использованы в композициях для подавления антикоагулянтных эффектов под действием ΟΝ или подавления реакций в местах введения ΟΝ при подкожном введении или для предотвращения секвестрации биологически значимых двухвалентных металлов после введения ΟΝ. Такие противоионы могут включать без ограничений зарядов состояние 3+ или большее.

При приготовлении ΟΝ хелатных комплексов предпочтительно приготовить ΟΝ хелаты, используя смесь двухвалентных катионов (то есть кальциевых и магниевых солей). Может оказаться, что такие смешанные ΟΝ хелаты легче производить и получить большую растворимость, чем хелаты, приготовленные с одним двухвалентным катионом и поэтому больше подходящие для применения в высоких

- 20 026660 концентрациях.

Считая, что приведенные выше примеры с разными ΟΝ последовательностями, с разными модификациями и находящимися в однотяжевом или двухтяжевом состоянии и использующими разные двухвалентные металлы, образование ΟΝ хелатных комплексов можно рассматривать как универсальную характеристику любого и всех ΟΝ, имеющих фосфодиэфирного скелета (фосфотиоатного или нет), независимо от других модификаций. Поэтому образование ΟΝ хелатных комплексов в крови или в подкожном пространстве является нормальным явлением при любом введении ΟΝ, если ΟΝ вводят в виде солей (обычно солей натрия), приводя к секвестрации катионов двухвалентных металлов, даже несмотря на то что вторичные эффекты этого хелатирования могут быть асимптоматичными в специфической популяции лиц, получающих данный ΟΝ. Существенно, что имеется несколько примеров ΟΝ (ΡΚ.Ο051/О8К2402968 - Ооешапз е! а1., 2011 Νβ№ Епд1апй I. Мей., 364: 1513-1522 и 1818 301012 (мипомерсен) νίδβΓ е! а1., 2010, Сигг. Ορίη. Ыр1Йо1. 21: 319-323), для которых ясно показаны Ι8Κ реакции при подкожном введении (в виде натриевых солей), которые аналогичны Ι8Κ, наблюдаемым в примере 9, и являются поэтому признаком образования ΟΝ хелатного комплекса после введения. Даже несмотря на то что оба эти ΟΝ имеют разные последовательности и разные модификации 2' рибозы, они оба имеют фосфодиэфирный скелет (в обоих случаях фосфотиоатный) и поэтому могут образовывать ΟΝ хелатные комплексы и могут секвестрировать двухвалентные металлы от локального окружения (в этом случае подкожного пространства). Более того, было показано, что оба эти ΟΝ способны проявлять свои биологические эффекты, несмотря на то что должно происходить хелатирование ΟΝ, и, следовательно, ΟΝ хелатные комплексы в биологических системах не влияют на биологическую активность ΟΝ.

В технике широко принято и хорошо продемонстрировано, что все фосфотиоатные ΟΝ (безотносительно к нуклеотидной последовательности) обычно достигают самых высоких концентраций препарата в почках и печени. Исторически показано, что хроническое введение множества разных фосфотиоатных ΟΝ было связано с мягкой дисфункцией печени или почек. Хотя причина этих дисфункций не была ясно объяснена, принимая постоянные эффекты хелатирования ΟΝ в целом, кажется вероятным, что хелатирование двухвалентных металлов в печени и почках при хроническом введении ΟΝ существенно, поскольку активность хелатирования может быть наиболее выражена в этих органах благодаря высоким концентрациям присутствующего ΟΝ. Введение ΟΝ в виде хелатных комплексов не изменит органное биораспределение (или как показано выше, повлияет на биоактивность), но может служить для предотвращения дефицита металла в печени и почках, который влияет на нормальную функцию этих органов.

Имея в виду, что ΟΝ хелатные комплексы приводят к образованию мультимерных ΟΝ комплексов в растворе, причем эти комплексы, по-видимому, имеют гораздо большую устойчивость к деградации под действием нуклеазы и потенциально могут гидролизовать и подвергать фосфотиоации ΟΝ, которые могут быть также более устойчивыми к окислению. Таким образом, хранение любого ΟΝ как хелатного комплекса может существенно увеличить его стабильность в водном растворе без значительного изменения его биоактивности при введении субъекту.

Список последовательностей <110> КЕРИСОК 1ИС.

Апйгеи ΫΑΙΙ-Ι-ΑΝΤ МтсНе1 ΒΑΖΙΝΕΤ <120> ΟΙ-ΙΟΟΝΙΚΙ-ΕΟΤΙΟΕ снеьате сомрьехез <130> 05016051-32РСТ <150> и5 61/375257 <151> 2010-08-20 <160> 14 <170> Ра515Е<5 Сог Νΐηάοννδ νβΓδίοη 4.0 <210> 1 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓΐίТтс4а1 Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2028, ГиП рКозрКогоТКтоате <400> 1 дддддддддд дддддддддд дддддддддд дддддддддд 40 <210> 2 <211> 40 <212> ΟΝΑ <213> Аг1тЯс1а1 Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2029, ίυΐ 1 рИозрИогогМоаТе <400> 2 аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа 40 <210> 3 <211> 40 <212> ΟΝΑ <213> АгеЖста! Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2030, ίιιΠ рНозрКогохКтоаТе <400> 3 ΐΐΐΐΐΐΐΐΐΐ ΐΐΐΐΐΐΐΐΐΐ ΐΐΐΐΐΐΐΐΐΐ ΐΐΐΐΐΐΐΐΐΐ 40 <210> 4 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓΐΐΐίст а! Зедиепсе <22О>

<223> ΚΕΡ 2031, ίυΐΐ рКозрКоготКтоаТе <400> 4

СССССССССС СССССССССС СССССССССС СССССССССС 40 <210> 5 <211> 40 <212> ΡΝΑ <213> ΑΓΐΐίιείβΙ Зедиепсе

- 21 026660 <220>

<223> КЕР 2033, Ти!! рНозрКогохКтоаХе <400> 5 хдхдхдхдхд хдхдхдхдхд хдхдхдхдхд хдхдхдхдхд 40 <210> 6 <211> 40 <212> 0ΝΑ <213> АП1Лс1а1 Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2055, *РиП рКозрНогохКпоахе <400> б асасасасас асасасасас асасасасас асасасасас 40 <212> ϋΝΑ <213> АгхтТтста! Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2056, Ти1! рКозрпогохКтоаХе <400> 7

ХСХСХСХСХС ХСХСХСХСХС ХСХСХСХСХС ХСХСХСХСХС 40 <210> 8 <211> 40 <212> ΡΝΑ <213> АгхтТтста! 5еяиепсе <220>

<223> КЕР 2057, ТиП рНозрЬогохНтоаХе <400> 8 ададададад ададададад ададададад ададададад 40 <210> 9 <211> 20 <212> 0ΝΑ <213> АгхтТлста! Зечиепсе <220>

<223> КЕР 2126, Ти!1 рНозрНогохкп'оахе <400> 9 сссссссссс сссссссссс 20 <210> 10 <211> 30 <212> ΟΝΑ <213> АгХтТтсла! 5едиепсе <220>

<223> КЕР 2127, Ти! 1 рпозрКогохЫоахе <400> 10 сссссссссс сссссссссс сссссссссс 30 <210> 11 <211> 50 <212> 0ΝΑ <213> АгхтГтс1а! 5ечиепсе <220>

<223> КЕР 2128, Ти!1 рКозрНогохКтоаХе <400> 11 сссссссссс сссссссссс сссссссссс сссссссссс сссссссссс 50 <210> 12 <211> 60 <212> ΡΝΑ <213> АгхтТтста! Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2129, Ти!1 рНозрНогоХНтоаХе <400> 12 сссссссссс сссссссссс сссссссссс сссссссссс сссссссссс сссссссссс 60 <210> 13 <211> 40 <212> ΡΝΑ <213> АгхтШста! Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2139, Ти1! рКозрКогохКтоаХе, Ти11 2' О техКу! п'Ьозе, С = 5' техНу1суХтсКпе <400> 13 асасасасас асасасасас асасасасас асасасасас 40 <210> 14 <211> 40 <212> ΡΝΑ <213> АгхтТтс1а1 Зеяиепсе <220>

<223> КЕР 2138; ТиП 2' О техНу! прозе <400> 14 сссссссссс сссссссссс сссссссссс сссссссссс 40

Claims (15)

1. Применение фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотидный хелатный комплекс, содержащий по меньшей мере два олигонуклеотида, связанных межмолекулярно двухвалентным катионом металла, в котором по меньшей мере один олигонуклеотид имеет по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и фармацевтически приемлемый носитель, для подавления или уменьшения области реакции на олигонуклеотид при подкожном введении субъекту.

2. Применение фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотидный хелатный комплекс, содержащий по меньшей мере два олигонуклеотида, связанных межмолекулярно двухвалентным катионом металла, в котором по меньшей мере один олигонуклеотид имеет по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и фармацевтически приемлемый носитель, для улучшения переносимости олигонуклеотида при введении субъекту путем внутривенной капельной инфузии (IV инфузия).

3. Применение по п. 1 или 2, при котором упомянутый комплекс является кальциевым.

4. Применение по п. 1 или 2, при котором упомянутый комплекс является магниевым.

5. Применение по п.1 или 2, при котором упомянутый комплекс представляет собой смешанный кальций/магний олигонуклеотидный хелатный комплекс.

6. Применение по п. 1, при котором упомянутый катион двухвалентного металла представляет собой кобальт, железо (2+), марганец, медь или цинк.

7. Применение по любому из пп.1, 2, 6, при котором указанный хелатный комплекс содержит два

- 22 026660 или большее число разных дивалентных катиона металла.

8. Применение по любому из пп.1-7, при котором указанный хелатный комплекс содержит по меньшей мере один двухцепочечный олигонуклеотид.

9. Применение по любому из пп.1-8, при котором указанный хелатный комплекс содержит по меньшей мере один олигонуклеотид, полностью модифицированный фосфотиоатными группами.

10. Применение по любому из пп.1-9, при котором указанный хелатный комплекс содержит по меньшей мере один олигонуклеотид с одной 2'-модифицированной рибозой.

11. Применение по любому из пп.1-10, при котором указанный хелатный комплекс содержит по меньшей мере один олигонуклеотид с одной 2'0-метилированной рибозой.

12. Применение по любому из пп.1-11, при котором указанный хелатный комплекс содержит олигонуклеотид, выбранный из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 3-14.

13. Применение по любому из пп.1-12, при котором указанный по меньшей мере один олигонуклеотид содержит по меньшей мере один 5-метилцитозин.

14. Применение по любому из пп.1-13, при котором указанный по меньшей мере один олигонуклеотид состоит из 8ЕЦ ГО N0:6, содержащей по меньшей мере один 5-метилцитозин.

15. Применение по любому из пп.1-14, при котором указанный по меньшей мере один олигонуклеотид состоит из 8ЕЦ ГО N0:6, где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.