PT2605794T

PT2605794T - Complexos de quelato de oligonucleótido

Info

Publication number: PT2605794T
Application number: PT118176189T
Authority: PT
Inventors: Vaillant Andrew; Bazinet Michel
Original assignee: Replicor Inc
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2011-08-18
Publication date: 2016-10-25
Also published as: CY1118207T1; ES2598556T3; BR112013003875A2; US20120046348A1; ZA201300497B; US8513211B2; CL2013000445A1; CA2806616C; SG187165A1; CO6670525A2; CN103768086B; HRP20161333T1; MX340294B; EA201300259A1; EA026660B1; CN103052405B; WO2012021985A1; US8716259B2; DOP2013000041A; CA2806616A1

Description

DESCRIÇÃO "COMPLEXOS DE QUELATO DE OLIGONUCLEÓTIDO"

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção revela complexos de quelato de oligonucleótido, suas composições e métodos para a formulação de oligonucleótidos (ONs) como complexos de quelato e refere-se à utilização destes Complexos de quelato com ON para a Administração de ON

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Os sais são compostos iónicos que resultam da interação (neutralização) de um ácido e de uma base. Os sais são compostos por catiões e aniões que interagem de modo a ser mantido um estado eletricamente neutral. Os aniões podem ser inorgânicos (tais como C1-) ou orgânicos tais como acetato (CH3COO·) . As soluções aquosas contendo sais dissolvidos (electrólitos) são capazes de conduzir eletricidade devido ao estado dissociado dos pares anião e catiões num ambiente aquoso. Os oligonucleótidos são polianiões e pensou-se anteriormente que se portavam apenas como sais quando os seus catiões parceiros existiam em solução num estado dissociado. A administração de ONs a doentes humanos foi tipicamente acompanhado por vários efeitos colaterais generalizados não relacionados com a sequência de nucleótidos presente. Isto inclui anticoagulação (elevação de tempo de pró-trombina ou tempo PTT) do sangue (Kandmimlla et al., 1998, Bioorgan. Med. Chem. Let., 8: 2103; Sheeban et al., Blood, 1998, 92: 1617; Nicklin et al., 1197, Nucleosides & Nucleotides, 16: 1145; Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech. 2a Ed., p374) e reações no sitio de injeção ou ISRs (induração, inflamação, sensibilidade e dor) com administração subcutânea (Webb et al., 1997,

Lancet, 349: 9059; Schrieber et al., 2001, Gastroenterol., 120: 1339; Seawell et al., 2002, J. Pharmacol. Exp.

Therap., 303: 1334; Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech. 2a Ed., p383; Raal et al., 2010, Lancet, 375: 998). Pensa-se que os efeitos anticoagulação são mediados por interação não especifica de sequência com proteínas da cascata de coagulação. Como os ONs mostraram possuir propriedades imunoestimuladoras (via recetor tipo Toll ou indução de citoquina mediada por TLR), as ISR foram tipicamente atribuídas ao requisito de administração de concentração elevada de ON num volume pequeno (tipicamente 1 cc) para injeção subcutânea (SC), que se pensa levar a inflamação local no sítio da injeção.

As publicações científicas "Influence of divalent cations on the conformation of phosphorothioate oligodesoxinucleotide: a circular dichroism study" de Patil e Rhodes, 2000, Nucleic Acids Research, estuda as alterações na conformação de oligonucleótidos fosforotioato induzidas por catiões divalentes.

Com o advento da terapia com base em ácidos nucleicos nos últimos anos, o número crescente de compostos com base em ON no desenvolvimento clinico aumentou. Historicamente a maioria dos regimes de dosagem de ON empregaram doses múltiplas numa semana ou doses únicas semanais que devem ser dadas parentericamente devido à baixa biodisponibilidade oral de ONs. Uma vez que a infusão intravenosa de ONs é tipicamente limitada pela reatividade da dose e velocidade (febre, tremores, fraqueza) e seria logisticamente exigente num cenário de dosagem crónica, aplicações clinicas mais recentes de ONS utilizaram a via de administração subcutânea (SC). Isto leva a efeitos colaterais mínimos sistémicos mas é tipicamente acompanhado de reações no sítio da injeção com vários graus de gravidade (como acima descrito) que também limita a dosagem alcançável por esta via de administração.

Deve deste modo ser útil e desejável proporcionar uma formulação ON que possa mitigar a reatividade para as vias de administração IV ou SC. Além disso, enquanto os efeitos anticoagulação da administração de ON são considerados mínimos, deve também ser útil neutralizar este efeito colateral de ONs para proporcionar uma maior margem de segurança em indivíduos humanos e não humanos.

Existe deste modo a necessidade de proporcionar uma formulação ON melhorada.

SUMÁRIO

De acordo com a presente descrição é agora descrita uma composição farmacêutica para utilização na supressão ou redução de reações subcutâneas no sitio da injeção num indivíduo de um oligonucleótido administrado subcutaneamente, compreendendo a referida composição farmacêutica: um complexo de quelato de oligonucleótido compreendendo dois ou mais oligonucleótidos ligados nas suas estruturas fosfodiéster através de um catião multivalente; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que pelo menos um oligonucleótido do referido complexo tem pelo menos uma ligação fosforotioato e em que o referido catião multivalente é um catião metálico divalente. É ainda revelado uma formulação de oligonucleótido para administração subcutânea, a formulação de oligonucleótido compreendendo o complexo de quelato de oligonucleótido como aqui descrito. É também revelada uma composição farmacêutica compreendendo o complexo de quelato de oligonucleótido ou a formulação de oligonucleótidos aqui descrita e um veiculo. São aqui revelados métodos para a supressão ou redução de reações no sítio de injeção com administração do ON como um complexo quelato de cálcio ou outros complexos de quelatos metálicos com ON apropriados, a formulação de oligonucleótido aqui descrita, ou uma composição farmacêutica aqui descrita. Particularmente, o ON é subcutaneamente administrada. É aqui também revelada uma formulação de oligonucleótido em que uma fonte de catião metálico divalente de qualquer um da lista seguinte é proporcionada com o oligonucleótido como um complexo de quelato com ON na altura da utilização do oligonucleótido: cálcio, magnésio, cobalto, ferro, manganês, bário, níquel, cobre, e/ou zinco. É deste modo aqui descrita uma formulação de oligonucleótido compreendendo cálcio; uma formulação de oligonucleótido compreendendo magnésio; uma formulação de oligonucleótido compreendendo cobalto; uma formulação de oligonucleótido compreendendo ferro (2+); uma formulação de oligonucleótido compreendendo manganês; uma formulação de oligonucleótido compreendendo cobre; uma formulação de oligonucleótido compreendendo zinco. São aqui revelados métodos para a preparação de complexos de quelato metálico com ON utilizando qualquer dos catiões metálicos que se seguem, individualmente ou em combinação: cálcio, magnésio, cobalto, ferro, manganês, bário, níquel, cobre, e/ou zinco. É também revelado um método para a preparação do complexo de quelato de oligonucleótido como aqui descrito, a formulação de oligonucleótido aqui descrita, ou a composição farmacêutica aqui descrita, o método compreendendo dissolvendo qualquer sal de sódio e oligonucleótido num excipiente aquoso farmaceuticamente aceitável, e adicionando gradualmente um solução de sal de metal divalente ao oligonucleótido dissolvido de modo que o complexo de quelato de oligonucleótido permanece solúvel. É aqui revelado um método para quelatar os seguintes catiões metálicos divalente num indivíduo utilizando um sal de sódio e oligonucleótido: cálcio, magnésio, cobalto, ferro, manganês, bário, níquel, cobre, zinco, cádmio, mercúrio, chumbo, berílio, estrôncio, rádio, e/ou qualquer outro metal, metal de transição, metal de pós-transição, elemento lantanídeo ou actinídeo capaz de existir no estado de carga 2+ ou 3+. É também aqui revelado um método de melhorar a estabilidade de qualquer ON em solução preparando o ON como um complexo quelato de cálcio ou outro complexo de quelato de metal e ON apropriado, formulação de oligonucleótido aqui descrita, ou uma composição farmacêutica aqui descrita. Particularmente, é revelado um método de estabilizar um oligonucleótido numa solução aquosa. É aqui assumido que o catião multivalente é um catião divalente. É aqui assumido que o catião divalente é um metal alcalino terroso com um estado de carga 2+. É aqui assumido que o catião divalente é um metal de transição ou pós-transição com um estado de carga 2+. É aqui assumido que o catião divalente é um metal lantanideo com um estado de carga 2+. É aqui assumido que o catião divalente é um metal actinideo com um estado de carga 2+. 0 catião divalente pode ser, individualmente ou em combinação: cálcio, magnésio, cobalto, ferro, manganês, bário, niquel, cobre, e/ou zinco.

Particularmente, o complexo quelato aqui descrito pode compreender dois ou mais diferentes catiões metálicos divalentes.

Numa outra forma de realização, o complexo quelato compreende pelo menos um oligonucleótido de cadeia dupla.

Noutra forma de realização, o complexo quelato compreende pelo menos um oligonucleótido com uma ligação fosforotioato. 0 complexo quelato pode também compreender pelo menos um oligonucleótido totalmente fosforotioatado. 0 complexo quelato pode também compreender pelo menos um oligonucleótido com uma ribose modificada em 2' . 0 complexo quelato pode também compreender pelo menos um oligonucleótido que tem, cada um, uma ribose 0-metilada em 2' . 0 complexo quelato ou formulação é adaptado para administração subcutânea. É ainda assumido que o oligonucleótido consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 14. É ainda assumido que a concentração do oligonucleótido dissolvido é 0,01 - 100 mg/mL antes da adição de sal metálico.

Particularmente, a proporção do sal metálico adicionado ao oligonucleótido dissolvido pode ser 0,1-40 mg de sal divalente por 100 mg de oligonucleótido. É ainda assumido que a concentração final de oligonucleótido é 0,1-100 mg/mL.

Numa outra forma de realização, o sal metálico é pelo menos um de um sal cloreto, um sal gluconato, um sal citrato, um sal lactato, um sal maleato, um sal aspartato, um sal fumarato, um sal ascorbato, um sal benzoato, um sal eritorbato e um sal propionato.

Em outra forma de realização, uma solução de sal metálico contém pelo menos um de cálcio, magnésio, cobalto, ferro (2+), manganês, cobre e/ou zinco. É também incluído um complexo quelato que é um complexo de quelato de cálcio; um complexo de quelato de magnésio; ou um complexo de quelato misto de magnésio/cálcio. É também revelada a utilização de um catião multivalente como aqui descrito na preparação de um complexo de quelato de oligonucleótido. É proporcionada a utilização do complexo de quelato de oligonucleótido como aqui descrito, a formulação de oligonucleótido aqui descrita, ou a composição farmacêutica aqui descrita para supressão ou redução de reações subcutâneas no sítio de injeção num indivíduo do referido oligonucleótido administrado subcutaneamente. É também revelada a utilização do complexo de quelato de oligonucleótido como aqui descrito, a formulação de oligonucleótido aqui descrita, ou a composição farmacêutica aqui descrita para a estabilização de um oligonucleótido numa solução aquosa. A expressão "anticoagulação" pretende significar a inibição de coagulação ou formação de coágulos no sangue normal. A expressão "guelação" pretende significar o seguestro ou remoção da solução de reacção de um contra-ião livre (negativo ou positivo) por outra molécula capaz de ligação ao contra-ião, formando um complexo quelatado. A expressão "catião metálico divalente" pretende significar qualquer catião metálico que pode naturalmente existir no estado de carga 2+ e inclui metais alcalino terrosos (elementos do grupo 2 de acordo com a nomenclatura IUPAC), metais de transição, metais pós-transição, metalóides ou lantanideos. A expressão "catiões metálicos trivalentes" pretende significar qualquer catião metálico que naturalmente existe no estado de carga 3+ e inclui metais de transição, metais pós-transição, metalóides, lantanideos ou actinóides.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Será feita referência às figuras em anexo:

Fig. 1 ilustra as caracteristicas fisico-quimicas comuns dos ONs. A) Co-separação de REP 2006 e um ON f osforotioato 21 mero com uma sequência definida por cromatografia liquida de elevado desempenho. B) Identificação de espécies no ON 21 mero por espectroscopia de massa. C) Identificação de espécies no ON REP 2006 por espectroscopia de massa.

Fig. 2 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-cálcio por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos:6 mero (REP 2032-FL), 10 mero (REP 2003-FL), 20 mero (REP 2004-FL), 40 mero (REP 2006-FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-cálcio foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de cálcio grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento da polarização de fluorescência como descrito no

Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 3 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-magnésio por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL), 20 mero (REP 2004-FL), 40 mero (REP 2006-FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-magnésio foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de magnésio de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 4 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-cobalto por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL) , 20 mero (REP 2004-FL), 40 mero (REP 2006- FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031- FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-cobalto foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de cobalto de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 5 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-ferro por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL), 10 mero (REP 2003-FL), 20 mero (REP 2004-FL) , 40 mero (REP 2006- FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C -REP 2031- FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON formação foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO 4) . A formação de complexos de quelato com ON-ferro foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de ferro de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 6 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-manganês por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL), 10 mero (REP 2003-FL) , 20 mero (REP 2004-FL), 40 mero (REP 2006-FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' 0 metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-manganês foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de manganês de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 7 ilustra a formação de complexos de quelato de ON-bário por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL) , 20 mero (REP 2004-FL), 40 mero (REP 2006-FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' 0 metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID N:4) . A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato de ON-bário foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de bário de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 8 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-níquel por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL) , 20 mero (REP 2004-FL) , 40 mero (REP 2006- FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031- FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-niquel foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de niquel de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 9 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-cobre por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL) , 20 mero (REP 2004-FL), 40 mero (REP 2006-FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-cobre foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de cobre de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 10 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-zinco por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL) , 20 mero (REP 2004-FL) , 40 mero (REP 2006- FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031- FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO: 4) . A formação de complexos de quelato com ON-zinco foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de zinco de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 11 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-cádmio por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL), 20 mero (REP 2004-FL) , 40 mero (REP 2006-FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID NO: 4) . A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-cádmio foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de cádmio de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 12 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-mercúrio por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL), 20 mero (REP 2004-FL) , 40 mero (REP 2006-FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' O metilribose (REP 2107-FL) ou 2' O metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID NO: 4) . A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A formação de complexos de quelato com ON-mercúrio foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de mercúrio de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 13 ilustra a formação de complexos de quelato com ON-chumbo por ON fosforotioatos degenerados marcados fluorescentemente: A) de vários tamanhos 6 mero (REP 2032-FL) , 10 mero (REP 2003-FL), 20 mero (REP 2004-FL), 40 mero (REP 2006- FL) e B) de ON degenerados marcados fluorescentemente utilizando fosforotioação (REP 2006-FL), fosforotioação + 2' 0 metilribose (REP 2107-FL) ou 2' 0 metilribose (REP 2086-FL) e diferentes sequências (poli C-REP 2031-FL; SEQ ID NO:4). A natureza não dependente da sequência da formação dos complexos de quelato com ON foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados mas é também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO: 4) . A formação de complexos de quelato com ON-chumbo foi demonstrada combinando concentrações crescentes de cloreto de chumbo de grau ACS com oligonucleótidos marcados com FITC em solução e monitorizando a formação do complexo de quelato de oligonucleótido através de um aumento na polarização da fluorescência como descrito no Exemplo 1. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 14A ilustra as caracteristicas químicas gerais dos ONs que não são dependentes da sequência de ON. Independentemente da sequência, qualquer ON existe como um polímero que tem atividades hidrofóbicas e hidrofílicas. A fosforotioação (apresentada na estrutura química nesta figura) serve para aumentar a hidrofobicidade do polímero do polímero ON mas não afeta a hidrofilicidade.

Fig. 14B conceptualiza a natureza da quelação do oligonucleótido do catião metálico divalente e trivalente. 0 catião metálico (representado pelos círculos cinzentos sólidos) liga as superfícies hidrofílicas dos polímeros ON através de pontes com o ião metálico (representado por elipses) entre dois ou três átomos de oxigénio ou enxofre nas ligações fosfodiéster.

Fig. 15 ilustra o modelo para o comportamento da solução de ONs na presença do catião metálico divalente em várias concentrações de ON e do catião metálico divalente. A) concentrações baixas de catião metálico divalente/trivalente, baixas de ON produzem dímeros ou complexos de quelato com ON de ordem baixa. B) concentrações crescentes de catião metálico divalente/trivalente produzem uma formação mais completa de complexos de quelato com ON na solução. C) Concentrações crescentes adicionais de ON na presença de metais divalentes ou trivalentes são capazes de produzir complexos de quelato com ON de ordem superior com concentrações crescentes de metal. Todos os complexos de quelato de (A) a (C) são solúveis em solução aquosa em virtude de ter superfícies hidrofílicas ainda expostas ao ambiente aquoso mantendo a solubilidade. D) A uma concentração suficiente de ON e metal, todas as superfícies hidrofílicas são agora restritas aos complexos de quelato com ON, deixando apenas as superficies hidrofóbicas expostas ao ambiente aquoso. Isto resulta na precipitação dos complexos de quelato com ON.

Fig. 16 ilustra o efeito do comportamento da solução de complexos de quelato com ON fluorescentes na polarização da fluorescência. Com a concentração crescente do metal, o tamanho (e massa) da formação dos complexos de quelato com ON também aumenta (ver Fig. 15) e deste modo cai mais lentamente na solução. Esta queda mais lenta do complexo na solução leva a uma polarização da fluorescência aumentada e um valor de mP aumentado.

Fig. 17 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de cálcio ou sulfato de cálcio como medido por polarização da fluorescência. A) formação de complexos de quelato com ON com REP 2055-FL (SEQ ID NO: 6) e REP 2056-FL (SEQ ID N0:7). B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2033-FL (SEQ ID N0:5) e REP 2029-FL (SEQ ID N0:2). Os valores representam a média +/-desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 18 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de cálcio ou sulfato de cálcio conforme medido por polarização da fluorescência. A) ausência de formação de complexos de quelato com ON com REP 2028-FL e formação de complexos de quelato com ON com REP 2057-FL (SEQ ID NO:8). B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2120-FL e REP 2030- FL. Os valores representam a média +/- desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 19 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de cálcio ou sulfato de cálcio conforme medido por polarização da fluorescência. A) formação de complexos de quelato com ON com REP 2129-FL (SEQ ID NO:12) e REP 2126-FL (SEQ ID NO:9). B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2128-FL (SEQ ID NO:11) e REP 2127-FL (SEQ ID NO:10). Os valores representam a média +/-desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 20 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de cálcio ou sulfato de cálcio conforme medido por polarização da fluorescência. A) quelato ON com REP 2139-FL (SEQ ID NO :13) e REP 2006-FL. B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2045-FL e REP 2007-FL. Os valores representam a média +/desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 21 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de magnésio ou sulfato de magnésio conforme medido por polarização da fluorescência. A) formação de complexos de quelato com ON com REP 2055-FL (SEQ ID NO: 6) e REP 2056- FL (SEQ ID NO:7). B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2033-FL (SEQ ID NO:5) e REP 2029-FL (SEQ ID NO:12). Os valores representam a média +/- desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 22 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de magnésio ou sulfato de magnésio conforme medido por polarização da fluorescência. A) ausência de formação de complexos de quelato com ON com REP 2028-FL (SEQ ID NO:11) e formação de complexos de quelato com ON REP 2057-FL (SEQ ID NO: 8) . B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2120-FL e REP 2030-FL (SEQ ID NO:3). Os valores representam a média + /- desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 23 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de magnésio ou sulfato de magnésio conforme medido por polarização da fluorescência. A) formação de complexos de quelato com ON com REP 2129-FL (SEQ ID NO: 12) e REP 2126- FL (SEQ ID NO:9). B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2128-FL (SEQ ID NO:11) e REP 2127-FL (SEQ ID NO:10). Os valores representam a média +/- desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 24 mostra a formação de complexos de quelato com ON com cloreto de magnésio ou sulfato de magnésio conforme medido por polarização da fluorescência. A) quelato ON com REP 2139-FL (SEQ ID NO:13) e REP 2006-FL. B) formação de complexos de quelato com ON com REP 2045-FL e REP 2007-FL. Os valores representam a média + /- desvio padrão de medições em duplicado.

Fig. 25 mostra a formação de dois diferentes complexos de quelato com ON de cadeia dupla na presença de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio conforme medido por polarização da

fluorescência. Os ONs de cadeia dupla foram preparados por hibridização de REP 2055-FL (SEQ ID NO: 6) com REP 2033-FL (SEQ ID N0:5) e REP 2 057-FL (SEQ ID N0:8) com REP 2056-FL (SEQ ID NO:7). Os valores representam a média + /- desvio padrão de medições em triplicado.

Fig. 26 mostra a formação de diversos complexos de quelato com ON apenas na presença de catião metálico divalente (Mg2+ e Ca2+) e não na presença de catiões monovalentes (Na+, K+ ou NH4+) . Os valores representam a média + /- desvio padrão de medições em triplicado.

Fig. 27 mostra o efeito anticoagulação da adição de várias concentrações de ONs de diferentes tamanhos (REP 2004, REP 2006) e diferentes químicas (REP 2006, REP 2107) no sangue humano. A maneira não dependente da sequência desta interação foi demonstrada utilizando oligonucleótidos degenerados (REP 2004, REP 2006, REP 2107) mas foi também demonstrada utilizando um oligonucleótido com sequência especifica (REP 2031; SEQ ID NO:4). A anticoagulação do sangue na presença destes compostos foi monitorizada medindo o tempo de protrombina (PTT) e comparando-o com o PTT na presença de salino normal no sangue utilizando metodologias de teste laboratorial clinico aceites. A proporção de PTT na presença e ausência de fármaco produz a proporção normalizada (NR) . Uma NR de 1 indica atividade de coagulação do sangue normal e uma NR acima de 1 indica que a atividade de coagulação do sangue foi diminuída (anticoagulação).

Fig. 28 mostra a supressão do efeito anticoagulação de oligonucleótidos pela adição de CaCl2. REP 2055 (um 40 mero fosforotioato com a sequência (AC) 20; SEQ ID NO: 6) foi adicionada ao sangue a 2,5 mM, uma concentração que induz anticoagulação do sangue significativa. O REP 2055 foi combinado com várias combinações de

CaC]_2 e os efeitos de cada concentração de CaC]_2 adicionada foram determinados utilizando metodologias de teste laboratorial clinico aceites. A anticoagulação do sangue na presença destes compostos foi monitorizada medindo tempo de protrombina (PTT) e comparando-o com PTT na presença de salino normal no sangue utilizando metodologias de teste aceites. A proporção de PTT na presença e ausência de fármaco produz a proporção normalizada (NR) . Uma NR de 1 indica atividade de coagulação do sangue normal e uma NR acima de 1 indica que a atividade de coagulação do sangue foi diminuída (anticoagulação).

Fig. 29 mostra o efeito da quelação de cálcio no tratamento com ON crónico no cálcio de soro total em doentes com doença hepática crónica. Os doentes que não receberam suplementação mineral são apresentados em (A) e doentes que receberam a suplementação enquanto estavam sob tratamento com ON como apresentado em (B).

DESCRIÇÃO DETALHADA É aqui revelada a demonstração que os ON quelatam diversos catiões metálicos divalentes incluindo cálcio, magnésio, cobalto, ferro, manganês, bário, níquel, cobre, zinco, cádmio, mercúrio e chumbo. É ainda demonstrado que a quelação deste catião divalente resulta na formação de complexos de quelato com ON compreendendo dois ou mais ONs ligados através de catião metálico e ocorrem como exemplificado, mas não se limitam a, ONs entre 6 e 80 nucleótidos de comprimento, e na presença de oligonucleótidos fosfodiéster ou fosforotioato. A quelação também ocorre com oligonucleótidos contendo modificações 2' na ribose ou não. Além disso, a quelação do catião metálico não é dependente da sequência de nucleótidos presente mas em vez disso baseia-se nas caracteristicas fisico-químicas comuns a todos os oligonucleótidos (ver Fig. 14A). É aqui apresentada a descoberta de que os oligonucleótidos nas soluções aquosas contendo qualquer catião metálico simples que é divalente (tal como por exemplo mas não limitado a, Ca2+, Mg2+, Fe2+) não existem como sais mas como complexos quelatados de ONs. Estes complexos estão compreendidos por dimeros de oligonucleótidos ou organizações moleculares de ordem superior em que os ONs estão ligados às suas estruturas fosfodiéster através de pontes metálicas divalentes (ver Fig. 14B) . Em concentrações especificas de ON e de catião metálico, estes complexos quelatados são estáveis e solúveis em solução aquosa e eficazmente sequestrar qualquer catião divalente nos complexos de quelato com ON da interação em solução. Esta formação de complexo quelato tem também probabilidade de ocorrer com um catião metálico simples com uma carga 3+ ou superior (como apresentado na Fig. 14B) . Deste modo os ONs funcionam como quelantes de catião divalente e não formam sais com um catião divalente.

De modo importante, a formação de complexos de quelato de oligonucleótido não ocorre com catiões monovalentes tais como Na+, K+ ou NH4+ e é deste modo pouco provável que ocorra com qualquer catião monovalente. Deste modo, o termo "sal de oligonucleótido" é especificamente limitado apenas a sais de oligonucleótido com catiões monovalentes ou com catiões que não formam complexos de quelato com oligonucleótidos e é incorretamente utilizado para descrever oligonucleótidos que existem em solução ou na forma de pó com catião metálico divalente (ou mesmo catião metálico trivalente). 0 convencional na técnica indica claramente a administração de ONs apenas como sais de sódio. Isto é exemplificado pela administração de vários oligonucleótidos nos ensaios clínicos como sais de sódio que incluem Fomivirisen (ISIS 2922), Mipomersen (ISIS 301012), Trecovirsen (GEM 91), Custirsen (OGX-Oll/ISIS 112989), Genasense (G3139) e Aprinocarsem (ISIS 3531/LY 900003) (Geary et al., 2002, Clin. Pharmacokinetics, 41: 255-260; Yu et al., 2009, Clin. Pharmacokinetics, 48: 39-50; Sereni et al., 1999, J. Clin. Pharmacol., 39: 47-54; Chi et al., 2005, J. Nat. Cane. Inst., 97: 1287-1296; Marshall et al., 2004, Ann. Oncol., 15: 1274-1283; Grossman et al., 2004, Neuro-Oncol, 6: 32-40). É também revelado que a anticoagulação de sangue por oligonucleótidos é causada pela quelação de cálcio por oligonucleótidos como apresentado pela reversão da anticoagulação induzida por oligonucleótido através do restauro de cálcio livre no sangue normal pela adição de cloreto de cálcio. É também aqui proporcionada uma demonstração de que as reações no sitio de injeção observadas com injeções subcutâneas de oligonucleótidos (endurecimento, inflamação, sensibilidade e dor) são devidas pelo menos em parte à quelação local de cálcio e possivelmente outro catião divalente tal como magnésio no sitio da injeção por oligonucleótidos como apresentado pela inibição das reações no sitio de injeção (ISRs) pela injeção do ON preparado como um complexo de quelato de cálcio. A polarização de fluorescência é uma metodologia comum utilizada para examinar as interações intermo-leculares. Nesta técnica, o isco (i. e. qualquer ON) é marcado com uma marca fluorescente (e. g. FITC). Em solução, a molécula isco cai livremente em solução devido ao movimento Browniano que resulta em emissão de fluorescência fracamente polarizada quando o isco é sujeito a excitação com o comprimento de onda correto da luz. Com um ligando de peso molecular suficiente (pelo menos do mesmo tamanho do isco), a interação entre o isco e o ligando introduz uma inibição substancial da queda do complexo em solução. Como resultado desta queda inibida em solução, emissão de fluorescência torna-se significativamente polarizada após excitação. Deste modo com esta técnica, as interações podem ser medidas em solução sem restrições físicas em qualquer ligação com um parceiro. A polarização de fluorescência é reportada como o mP adicional, que é diretamente proporcional à fração de moléculas isco ligadas na reação. Por exemplo, se uma fracção muito pequena de moléculas isco forem ligadas por um ligando particular, existirá uma muito baixa polarização da fluorescência e consequentemente valores baixos de mP. No outro lado do espetro, se uma grande proporção de moléculas isco for ligada por um ligando particular (ou com uma concentração mais elevada de ligando), haverá uma substancial polarização da fluorescência e consequentemente grandes valores de mP. Desta forma, as isotérmicas de ligação para particular interações isco ligando podem ser produzidas por concentrações crescentes do ligando na presença de uma quantidade fixa de isco fluorescentemente marcado.

Aqui são empregues vários ONs fluorescentemente marcados para ver se a formação do seu complexo na presença de catião monovalente e divalente. Embora a monitorização da formação do complexo por polarização da fluorescência necessite que estes ONs sejam fluorescentemente marcados, a questão está em se esta marcação está fixada no ON na extremidade 3' de modo a não interferir com a base azotada ou com a estrutura fosfodiéster do ON. Além disso a marca fluorescente é mantida afastada do ON por um ligante rígido de 3 carbonos para excluir adicionalmente qualquer perturbação do comportamento normal de ON em solução. Deste modo qualquer formação de complexo com ON aqui observada utilizando polarização da fluorescência com um ON fluorescentemente marcado é uma representação precisa do comportamento da solução de ONs não marcados (complexados ou não). 0 termo oligonucleótido (ON) refere-se a um oligómero ou polimero de ácido ribonucleico (RNA) e/ou ácido desoxirribonucleico (DNA) e/ou seus análogos. Este termo inclui oligonucleótidos compostos por nucleases que ocorrem naturalmente, ligações de açúcares e internu-cleósido covalente (estrutura) assim como oligonucleótidos possuindo porções que não ocorrem naturalmente que funcionam do mesmo modo. Estes oligonucleótidos modificados ou substituídos são frequentemente preferidos sobre as formas nativas devido às propriedades desejadas tais como, por exemplo, incorporação celular melhorada, afinidade melhorada para ácido nucleico alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases.

No presente pedido, o termo "oligonucleótido degenerado" pretende significar um oligonucleótido de cadeia única possuindo uma wobble (N) em todas as posições, tais como NNNNNNNNNN. Cada base é sintetizada como um wobble de modo que este ON existe actualmente como uma população de diferentes sequências aleatoriamente produzidas do mesmo comprimento e propriedades físico-químicas. Por exemplo, para um ON degenerado de 40 bases de comprimento, qualquer sequência particular na população representaria teoricamente apenas 1/440 ou 8,3xl0-25 da fração total. Atendendo a que 1 mole = 6, 022X1023 moléculas, e ao facto de que nenhuma sintese de degenerados excedeu as 2 mmoles atá à data, qualquer oligonucleótido com uma sequência especifica efetivamente presente não existe mars do que uma vez em qualquer preparação. Deste modo qualquer formação do complexo observado numa destas preparações deve ser devida às propriedades fisico-quimicas não dependentes da sequência (ou independentes da sequência) dos oligonucleótidos uma vez que qualquer oligonucleótido particular de uma sequência definida, sendo única na preparação, não pode se pode esperar que contribua para qualquer atividade derivada da sua sequência especifica de nucleótidos.

Como ilustração adicional deste conceito, o Exemplo I compara a caracterização de REP 2006 (um ON 40mero com uma sequência degenerada fosforotioada) com um 21mero de uma sequência definida pela cromatografia liquida de pressão elevada e espectrometria de massa e mostra claramente que qualquer ON com um tamanho semelhante e modificações químicas (í. e. fosforotioação) terá caracte-rísticas físico-químicas altamente semelhantes (se não idênticas) que não são afectadas pela sequência de nucleótidos presentes.

Os oligonucleótidos podem incluir várias modificações, e. g., modificações estabilizadoras, e deste modo pode incluir pelo menos uma modificação na ligação fosfodiéster e/ou no açúcar, e/ou na base. Por exemplo, o oligonucleótido pode incluir, sem restrição, uma ou mais ligações fosforotioato, ligações fosforoditioato, e/ou ligações metilfosfonato. As diferentes ligações quimicamente modificadas compativeis podem ser combinadas, e. g., modificações em que as condições de sintese são quimicamente compativeis. Enquanto as ligações modificadas são úteis, os oligonucleótidos podem incluir ligações fosfodiésteres em que as propriedades fisico-quimicas gerais dos polimeros oligonucleótido não são substancialmente afetadas. As modificações adicionais úteis incluem, sem restrição, modificações na posição 2' do açúcar, tais como modificações 2'-0-alquilo tais como modificações 2'-0-metilo, modificações 2'-amino, modificações 2'-halo tais como 2'-fluoro; análogos aciclicos de nucleótido. Outras modificações são também conhecidas na técnica e podem ser utilizadas tais como os ácidos nucleicos bloqueados. Em particular, o oligonucleótido tem ligações modificadas através de, e. g., fosforotioato; possui uma proteção 3' e/ou 5'; inclui uma ligação terminal 3'-5'; o oligonucleótido é ou inclui um concatâmero consistindo em duas ou mais oligossequências de nucleótidos ligadas por um ligante(s). É também revelada uma composição farmacêutica de ON que previne a anticoagulação induzida por oligonucleótido utilizando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um complexo de quelato de oligonucleótido farmaceuticamente aceitável como aqui descrito preparado utilizando qualquer dos catiões metálicos que se seguem: cálcio, magnésio, cobalto, manganês, ferro, cobre, e/ou zinco. Os complexos de quelato com ON podem também ser preparados utilizando dois ou mais catiões diferentes como descrito acima. Em particular, as composições farmacêuticas são aprovadas para administração a um humano, ou um animal não humano tal como um primata não humano. É também proporcionada uma composição farmacêutica de ON que previne a reação no sitio da injeção com administração subcutânea contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um complexo de quelato com ON farmacologicamente aceitável como aqui descrito, preparado utilizando qualquer um dos catiões metálicos que se seguem: cálcio, magnésio, cobalto, manganês, ferro, cobre, e/ou zinco. Os complexos de quelato com ON podem também ser preparados utilizando dois ou mais diferentes catiões como descrito acima. Em particular, as composições farmacêuticas são aprovadas para administração a um humano, ou um animal não humano tal como um primata não humano. É também revelada uma composição farmacêutica de ON com tolerabilidade melhorada a infusão IV contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um complexo de quelato com ON farmacologicamente aceitável preparada utilizando qualquer dos catiões metálicos seguintes: cálcio, magnésio, cobalto, manganês, ferro, cobre, e/ou zinco. Os complexos de quelato com ON podem também ser preparados utilizando dois ou mais diferentes catiões como descrito acima. Em particular, as composições farmacêuticas são aprovadas para administração a um humano, ou um animal não humano tal como um primata não humano. É também revelada uma composição farmacêutica de ON que previne a deficiência induzida por oligonucleótido em cálcio, magnésio, ferro, manganês, cobre ou zinco utilizando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um complexo de quelato com ON farmacologicamente aceitável utilizando qualquer dos catiões metálicos que se seguem: cálcio, magnésio, cobalto, manganês, ferro, cobre, e/ou zinco. Os complexos de quelato com ON podem também ser preparados utilizando dois ou mais diferentes catiões como descrito acima. Em particular, as composições farmacêuticas são aprovadas para administração a um humano, ou um animal não humano tal como um primata não humano. É também revelada uma composição farmacêutica de ON com estabilidade de armazenamento melhorada contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um complexo de quelato com ON farmacologicamente aceitável utilizando qualquer dos catiões metálicos que se seguem: cálcio, magnésio, cobalto, manganês, ferro, cobre, e/ou zinco. Os complexos de quelato com ON podem também ser preparados utilizando dois ou mais diferentes catiões como descrito acima. Em particular, as composições farmacêuticas são aprovadas para administração a um humano, ou um animal não humano tal como um primata não humano. É também revelada uma composição farmacêutica de ON com uma semivida no soro diminuída ou interação reduzida com proteínas do soro contendo uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de um complexo de quelato com ON farmacologicamente aceitável utilizando qualquer dos catiões metálicos que se seguem: cálcio, magnésio, cobalto, manganês, ferro, cobre, e/ou zinco. Os complexos de quelato com ON podem também ser preparados utilizando dois ou mais diferentes catiões como descrito acima. Em particular, as composições farmacêuticas são aprovadas para administração a um humano, ou um animal não humano tal como um primata não humano.

Além disso, as composições acima podem incluir veículos, adjuvantes, transportador e/ou excipiente fisio-logicamente e/ou farmaceuticamente aceitáveis. As características do veículo podem depender da via de administração. 0 termo "veículo, adjuvante, transportador e/ou excipiente fisiologicamente e/ou farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a um veículo, adjuvante, transportador ou excipiente que pode ser administrado a um indivíduo, incorporado numa composição da presente invenção, e que não destrói a sua atividade farmacológica. Os veículos, adjuvantes, transportadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados na composição farmacêutica como aqui descrito incluem, mas não estão limitados aos que se seguem: trocadores de iões, alumina, estearato de alumínio, lecitina, sistemas de distribuição de fármaco auto-emulsificantes ("SEDDS"), tensioativos utilizados em formas de dosagem farmacêutica tais como Tween ou outras matrizes de distribuição poli-méricas semelhantes, proteínas do soro tais como albumina do soro humano, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicérido parcial de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou electrólitos tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e lanolina. Ciclodextrinas tais como α-, β- e γ-ciclodextrina, ou derivados quimicamente modificados tais como hidroxialquil-ciclodextrinas, incluindo 2- e 3- hidroxipropil^-ciclo-dextrinas, ou outros derivados solubilizados podem também ser utilizados para melhorar a distribuição das composições da presente invenção.

As composições aqui descritas podem conter outros agentes terapêuticos como descrito a seguir, e podem ser formulados, por exemplo, empregando veículos ou diluentes sólidos ou líquidos convencionais, assim como aditivos farmacêuticos do tipo apropriado ao modo de administração pretendido (por exemplo, excipientes, ligantes, conservantes, estabilizantes, aromatizantes, etc.) de acordo com técnicas tais como as bem conhecidas na técnica da formulação farmacêutica.

As presentes composições podem, por exemplo, ser administradas numa forma adequada para libertação imediata ou libertação prolongada. A libertação imediata ou libertação prolongada podem ser conseguidas pela utilização de composições farmacêuticas adequadas, ou, particularmente no caso da libertação prolongada, pela utilização de dispositivos tais como implantes subcutâneos ou bombas osmóticas. A quantidade eficaz de um composto aqui descrito pode ser determinada por um normal especialista na técnica, e inclui quantidades de dosagem exemplificativas para um adulto humano de cerca de 0,1 a 500 mg/kg de peso corporal de composto ativo por dia, que podem ser administradas numa dose única ou na forma de doses divididas individualmente, tais como de 1 a 5 vezes por dia. Deverá ser considerado que o nivel de dose especifico e a frequência de dosagem para qualquer indivíduo particular pode ser variada e dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico empregue, a estabilidade metabólica e duração de ação desse composto, a espécie, idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo, o modo e tempo de administração, taxa de excreção e eliminação, combinação de fármaco, e gravidade do estado particular. Os indivíduos preferidos para o tratamento incluem animais, mais preferencialmente espécies de mamífero tais como humanos, e animais domésticos tais como cães, gatos e semelhantes, sujeitos a distúrbios dependentes de angio-génicos ou associados com angiogénicos. A composição farmacêutica pode também conter outros fatores e/ou agentes ativos que estimulam a atividade. As composições e formulações farmacêuticas para administração podem incluir pensos transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, rebuçados, supositórios, sprays, liquidos, pós e aerossóis. Os veiculos farmacêuticos convencionais, aquosos, bases pós ou oleosas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis. Outras formulações incluem aquelas em que os ONs são misturados com um agente de distribuição tópico tal como lipidos, lipossomas, ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, esteróides, agentes quelantes e tensioativos. Os lipidos e lipossomas preferidos incluem neutros (e. g. dioleoil-fosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, distearolifosfatidilcolina) negativos (e. g. dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) e catiónicos (e. g. dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP, dioleoilfosfatidileta-nolamina DOTMA) e outros agentes de distribuição ou moléculas. Os ONs podem ser encapsulados em lipossomas ou podem formar complexes com estes, em particular com lipossomas catiónicos. Alternativamente, os ONs podem ser complexados com lipidos, em particular com lipidos catiónicos. Os ácidos gordos e ésteres preferidos incluem mas não estão limitados a ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanóico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido miristico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1-dode-cilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilco-lina, ou um éster de alquilo Cl-10 (e. g. isopropilmi- ristato IPM) , monoglicérido, diglicérido ou um seus sais farmaceuticamente aceitáveis. A presente revelação será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos que se seguem.

EXEMPLO I

Caracterização de ON degenerados

Fig. IA detalha a separação por HPLC (utilizando uma coluna hidrofóbica) de duas preparações de oligo-nucleótido que são co-injetadas na coluna ao mesmo tempo. A primeira destas é denominada padrão interno e é um oligonucleótido 21mero fosforotioato com uma sequência especifica definida, a segunda é REP 2006 (um oligonucleótido 40 mero degenerado fosforotioato). Ambas as espécies se separam em picos distintos definidos com base apenas nas suas propriedades fisico-quimicas (i. e. tamanho e hidrofobicidade); a sequência de nucleótidos presente em cada um destes ONs NÃO tem impacto significativo nas suas propriedades fisico-quimicas e deste modo NÃO tem impacto na sua separação. Como tal, o padrão interno elui da coluna como um pico bem definido com um tempo de retenção mais pequeno em comparação com o REP 2006, apenas devido à diferença no tamanho destes dois polímeros ON. Note-se que os ombros em cada lado do pico de REP 2006 são devidos a falha nas sequências típicas na produção de oligonu- cleótidos mais longos. Apesar da natureza heterogénea da sequência do REP 2006, separa-se como um pico semelhante bem definido por HPLC como a sequência 21mero específica que ilustra as propriedades físico-químicas comuns de todas as espécies na preparação de REP 2006, mesmo assim existe um número muito grande das diferentes sequências presentes. Subsequentemente à separação dos picos de REP 2006 e 21-mero por HPLC, estes podem ser sujeitos a espectroscopia de massa (MS) para identificar as espécies presentes nestes picos definidos (Figs. IB e 1 C).

Na Fig. 1B, o 21mero é separado em espécies únicas um PM de 7402, 6 Da, consistente com este PS-ON possuindo uma sequência definida. No entanto, a análise MS de REP 2006 (Fig. 1C) revela um número extremamente grande das espécies presentes cujo intervalo de massa tem uma distribuição quase perfeita, consistente com a sua natureza completamente degenerada. Este intervalo de massa vai de C40 (a espécie mais pequena) à A40 (a espécie maior) e a prevalência destas espécies é extremamente pequena com o número de espécies crescente (intensidade do pico) uma vez que a sua massa se aproxima do centro do intervalo de massa. Isto é porque um número continuamente crescente de diferentes sequências resultará numa massa semelhante. O facto de que todas as espécies de ON diferentes presentes no REP 200 6 têm o mesmo tempo de retenção numa coluna hidrofóbica durante a separação por HPLC demonstra claramente que todos os ONs do mesmo tamanho e com as mesmas modificações químicas (i. e. fosforotioação) terão propriedades físico-químicas altamente semelhantes (se não idênticas) e como tal, podem ser consideradas funcionalmente semelhantes em quaisquer aplicações ou propriedade que não seja dependente da sequência dos nucleótidos presentes numa molécula ON particular. Deste modo, qualquer formação de complexos de quelato com ON observada com qualquer particular ON degenerado (e. g. REP 2003, REP 2004), não pode ser dependente da sequência dos oligonucleótidos presentes e deve ser dependente nas propriedades físico-químicas conservadas de qualquer ON.

EXEMPLO II ONs formam complexos de quelato com diversos catiões metálicos divalentes A interação dos sais de oligonucleótido e amónio com vários catiões metálicos divalentes foi examinada por polarização da fluorescência (FP) como descrito acima. Durante a síntese de oligonucleótido, cada oligonucleótido foi conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) na extremidade 3' por um ligante rígido de 3 carbonos utilizando reagentes e protocolos de síntese bem estabelecidos. Estes oligonucleótidos foram clivados da síntese e deixados como ais de amónio. Os oligonucleótidos utilizados neste exemplo são descritos na Tabela 1.

Tabela 1

Os oligonucleótidos marcados em 3' com FITC utilizados foram REP 2032-FL (um oligodeoxinucleótido 6mero fosforotioatado degenerado), REP 2003-FL (um oligodesoxinucleótido lOmero fosforotioatado degenerado), o REP 2004-FL (um oligodesoxinucleótido 20mero fosforo-tioatado degenerado), o REP 2006-FL (um oligodesoxinucleótido 40mero fosforotioatado degenerado) , o REP 2031-FL (um oligodesoxinucleótido 40mero policitosina fosforo-tioatada; SEQ ID N0:4), o REP 2107-FL (um oligonucleótido 40mero fosforotioatado degenerado possuindo cada ribose modificada por 0 metilação 2' ) e o REP 2086-FL (um oligonucleótido 40mero fosfodiéster degenerado possuindo cada ribose modificada por 0 metilação 2'). Cada um destes

ONs foi preparado como um 0,5 mM de stock em 1 mM de TRIS (pH 7,2). Estes stocks foram utilizados para preparar soluções de ON fluorescentes a 3 nM em tampão FP (10 mM de TRIS, 8 0 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10 mM de β-mercaptoetanol e 0,1% de Tween®-20). O EDTA estava presente para remover quaisquer metais divalentes presentes na solução antes das medições FP. Cada uma destas soluções tampão continha também 80 mM de NaCl para avaliar a formação de complexo com ON na presença de um excesso molar de catiões monovalentes (em cada gráfico nas Figs. 2-13 isto é reportado como uma concentração de cloreto de metal de 0 mM) . Para cada ON fluorescente em solução foram adicionadas várias quantidades de sais cloreto de metais divalentes (2+) de grau ACS. Estes sais incluem cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, cloreto de cobalto, cloreto de ferro, cloreto de manganês, cloreto de bário, cloreto de niquel, cloreto de cobre, cloreto de zinco, cloreto de cádmio, cloreto de mercúrio e cloreto de chumbo. A formação de dimeros ou complexos de quelato com ON de ordem superior foi monitorizada através de um aumento na polarização da fluorescência (quantificada pelas unidades "mP" adi-mensionais) de modo que a formação aumentada de complexos de quelato com ON resultou em maiores alterações de massa. A queda lenta resultante destes complexos de quelato com ON em solução leva à polarização aumentada da fluorescência emitida (ver Fig. 16). Os resultados destas experiências são apresentados nas Figs 2-13. Em cada caso, aumentos significativos na polarização da fluorescência foram observados com todos os ONs na presença de todos os catiões divalentes mas não na presença de um elevado excesso molar de Na+ (fornecido como NaCl), indicando a formação de complexos de quelato com ON apenas com catiões metálicos divalentes. Estes resultados demonstram o seguinte: • ONs na presença de 80 mM de NaCl não exibem qualquer formação de dimeros detetável ou quaisquer outros complexos ON de ordem superior. • ONs formam dimeros e complexes de ordem superior na presença dos seguintes catiões metálicos divalentes quando estes existem no estado de carqa 2+: cálcio, magnésio, cobalto, ferro, manganês, bário, níquel, cobre, zinco, cádmio, mercúrio e chumbo. A formação destes complexos ON envolve a interação de ONs com estes catiões metálicos divalentes. • A formação de complexos ON não pode ser devida a hibridação entre bases azotadas através de interações tradicionais de Watson-Crick devido à natureza degenerada dos ONs testados. Adicionalmente, o REP 2031 (SEQ ID NO:4) não pode auto-hibridar nas condições experimentais empregues. • A formação de complexos ON é estável e solúvel em solução aquosa e uma vez que estes complexes parecem incorporar o metal divalente em questão como parte do complexo formado, estes complexos ON têm o efeito de quelatar o metal divalente em questão a partir da solução em que o complexo ON foi formado. • A quelação destes metais e a formação dos complexos de quelato com ON não é dependente de uma sequência de nucleótidos particular, como evidenciado pela quelação observada com os oligonucleótidos degenerados e também não dependentes das modificações de nucleótidos envolvendo modificações da ligação fosfodiéster ou da unidade ribose 2' . • A quelação destes metais ocorre com oligonucleótidos de 6-40 nucleótidos de comprimento. • A quelação destes metais ocorre na presença ou ausência de fosforotioação ou modificações de ribose 2'. A formação expansiva de complexos de quelato com ON com vários catiões metálicos divalentes com todos os ONs neste exemplo também sugere fortemente o seguinte: • Porque o catião divalente catalisa a formação de complexo com ON e os catiões monovalentes não, e porque a formação de complexo com ON não ocorre através da hibridação de bases como descrito acima, a formação de complexos de quelato com ON deve envolver alguma forma de "ponte de ião metálico" entre dois ONs em localizações que partilham facilmente um eletrão capaz de preencher uma orbital de eletrão vazia nos catiões. As localizações mais adequadas a esta "partilha de eletrão" são os átomos de oxigénio sem ponte (ou enxofre no caso da fosforotioação) na ligação fosfodiéster (ver Fig. 14B). • Espera-se que os ONs de cadeia dupla, de DNA ou RNA exibam a mesma formação de complexo quelato e deste modo têm a mesma tendência para quelatar os catiões metálicos a partir da solução. • Estas pontes de metal devem envolver as interações intermoleculares como interações intramole-culares não resultarão em qualquer polarização da fluorescência significativamente aumentada (ver Figs. 15 A-C e 16) . • Os complexos de quelato com ON solúveis existem em qualquer concentração de ONs e catiões divalentes que não formam precipitados de complexos quelato (ver Fig. 14D) . • Os ONs não podem formar sais com catiões metálicos divalentes e não se comportam como sais em solução aquosa. Isto está em contraste com catiões monovalentes (exemplificados por sódio neste exemplo mas também aplicável a outros catiões monovalentes tais como potássio, litio ou amónio) que formam sais com ONs e comportam-se como sais (electrólitos) em solução. Além disso, embora todos os ONs utilizados neste exemplo foram sais de amónio, em solução aquosa, o ião amónio provavelmente dissocia-se a partir do ON (como seria de esperar de um sal) e não proporciona inibição para a formação de complexos de quelato com ON por catiões divalentes. Isto é ainda fortalecido pela observação de que o sal monovalente adicional (neste caso 80 mM de NaCl) não parece interferir com a formação de complexos de quelato com ON com catiões divalentes. • Pode esperar-se que a formação de complexos de quelato com ON ocorra com qualquer metal, metal de transição, elemento lantanideo ou actinídeo com um estado de carga 2+ e é também provável que ocorra com iões metálicos que podem existir num estado de carga 3+ ou superior (e.g. crómio). • Pode também esperar-se que os ONs superiores a 40mero de comprimento ou contendo modificações ou possuindo qualquer sequência de nucleótidos particular definida para formar complexos de quelato com ON com catiões metálicos divalentes desde que contenham ligações que são capazes de partilhar eletrões da esma maneira dos átomos de oxigénio (ou enxofre) sem ponte nas tradicionais ligações fosfodiésteres. • Sais ON (e. g. sais de sódio) podem ser úteis para quelatar metais divalentes num doente humano ou não humano tal como mas não se limitando a: cádmio, mercúrio, chumbo. Adicionalmente, a quelação de qualquer catião metálico divalente particular (e. g. ferro) por um sal de oligonucleótido de sódio pode ser suprimida por preparação do sal de ON de sódio como um complexo de quelato com ON com outro catião metálico divalente (e. g. cálcio). • Os sais metálicos para além de sais cloreto podem também permitir a formação de complexos de quelato com ON. Tomando os sais de cálcio como um exemplo, outros sais de cálcio compatíveis com a formação de complexos de quelato com ON podem incluir sem restrição gluconato de cálcio, citrato de cálcio, lactato de cálcio, malato de cálcio, aspartato de cálcio, fumarato de cálcio, ascorbato de cálcio, benzoato de cálcio, eritorbato de cálcio, e/ou propionato de cálcio.

EXEMPLO III ONs formam complexos de quelato com diferentes sais de cálcio e magnésio

De modo a ainda demonstrar a natureza universal da formação de complexos de quelato com ON e para demonstrar também a utilidade de diferentes sais de catião metálico divalente na formação de complexos de quelato com ON, duas diferentes formas de sais de cálcio e magnésio foram utilizadas para preparar diversos complexos de quelato com ON com os ONs de diferentes sequências especificas. Os sais utilizados foram cloreto de cálcio, sulfato de cálcio, cloreto de magnésio e sulfato de magnésio. Os ONs utilizados são listados na Tabela 2 a seguir. As condições de reação FP foram idênticas às do Exemplo 1 exceto que o EDTA foi omitido para demonstrar a formação de complexos de quelato com ON na ausência de quaisquer efeitos mediados pelo EDTA. _Tabela 2_

Os resultados destas experiências são ilustrados nas Figs. 17-24 e demonstram que todos os ONs testados podem formar complexos ON com diferentes sais de cálcio e magnésio. Duas exceções a esta observação geral são o REP 2028-FL (4 0mero poli G, SEQ ID NO:l; Figs 18A e 22A) e o REP 2029-FL (40mero poli A, SEQ ID NO:2; Figs 17B e 21 B). Ambos os ONs são polipurinas e, especialmente no caso de poli G, são conhecidos por formar interações intramo-leculares termodinamicamente estáveis (denominadas "G-quartetos" no caso de tratos poli G) que resultam nestes ONs a formar fortes complexos intramoleculares em que a estrutura fosfodiéster é provavelmente parcialmente organizada neste complexo ou não mais capazes de participar nas interações em solução (como a formação de complexo quelato. 0 REP 2029-FL (SEQ ID N0:2) foi fracamente capaz de formar complexos de quelato o que é provavelmente devido a interações fracas "A-quarteto" que ocorrem com este ON. Deste modo, não estão aqui incluídos os ONs que compreendem apenas poli A e poli G e aptâmeros que formam interações intramoleculares termodinamicamente estável. Os ONs aqui incluídos não são os ONs só poli A ou poli G e/ou haptâmeros.

Os resultados do Exemplo III mostram que diferentes formas de sal de magnésio e cálcio podem ser utilizadas para preparar complexos de quelato com ON e ainda ilustrar o seguinte: • Todos os ONs no Exemplo III (exceto REP 2006-FL) contêm sequências específicas que não contêm quaisquer sequências palindrómicas capazes de formar ganchos nem qualquer destas sequências são autocomplementares. Deste modo, nenhuma das formações de complexos de quelato com ON observadas é atribuível a eventos de hibridação. • A fraca capacidade de REP 2028-FL (SEQ ID NO:l) e REP 2029-FL (SEQ ID NO:2) para formar complexos de quelato com ON sugere que uma estrutura fosfodiéster relaxada é necessária para a formação de complexos de quelato com ON apontando de novo para a estrutura fosfodiéster como a característica química dos ONs necessária para a ligação de dois ou mais ONs para formar complexos de quelato. • Espera-se que qualquer ON que contenha uma estrutura fosfodiéster sela capaz de formar complexos de quelato, independentemente de outras modificações existentes tais como fosforotioação, modificações 2' ribose ou modificações de bloqueio de ácido nucleico. • Os complexos de quelato com ON podem ser formados com ONs com 80mero de comprimento e os ONs maiores do que 80mero comprimento também exibem o mesmo comportamento na presença do catião metálico divalente.

EXEMPLO IV

Formação de complexos de quelato com ON com ONs de cadeia dupla

Os oligonucleótidos de cadeia dupla são formados a partir de dois oligonucleótidos complementares de cadeia simples que em solução aquosa hibridam uma com a outra através de interações Watson-Crick. Uma vez que os ONs de cadeia dupla têm ainda uma estrutura fosfodiéster exposta para fora da hélice de DNA formada, estes devem ser capazes de formar complexos de quelato na presença de catião divalente. De modo a testar esta hipótese, dois diferentes oligonucleótidos de DNA de cadeia dupla foram preparados por hibridação de REP 2055-FL (40 mero poli AC; SEQ ID NO:6) com REP 2033-FL (40 mero poli TG; SEQ ID NO:5) e REP 2057-FL (40 mero poli AG; SEQ ID NO:8) com REP 2056-FL (40 mero poli TC; SEQ ID NO:7). Porque a hibridação de ON resulta num duplexo, o aumento de massa resultante pode ser detetado através de um aumento na polarização da

fluorescência relativamente aos ONs de cadeia simples utilizados para preparar o complexo. Os ONs de cadeia simples (REP 2055-FL (SEQ ID NO: 6), Rep 2033-FL (SEQ ID

NO: 5) , Rep 2057-FL (SEQ ID NO:8) e REP 2056-FL (SEQ ID

NO:7)) foram, cada um, diluídos para 20 nM em tampão FP IX. A hibridação dos dois pares complementares como identificado acima foi também efectuada em tampão FP IX (lOnM de cada ON) e a hibridação foi confirmada através de um aumento na polarização da fluorescência. As construções de cadeia dupla foram então expostas a 100 mM de CaCl2 ou 100 mM de MgCl2. A formação de complexo quelato foi monitorizada por um aumento adicional na polarização da fluorescência (ver Fig. 25) . Os resultados desta experiência confirmam o sucesso da hibridação dos pares complementares de ONs nos ONs de cadeia dupla como evidenciado pelo aumento na polarização da fluorescência. Além disso, a adição de CaCl2 ou MgCl2 a estes ONs de cadeia dupla resultaram num aumento adicional na polarização da fluorescência, indicando que estes ONs de cadeia dupla podem também formar complexos de quelato na presença de catião metálico divalente. Estes resultados também sugerem fortemente que os ONs de cadeia dupla podem formar complexos de quelato com ON com qualquer catião divalente e também se deve esperar que tenham o efeito de sequestrar o referido catião divalente a partir da solução.

EXEMPLO V

Diversos catiões monovalentes não formam complexos de quelato com ONs

De modo a demonstrar mais especificamente que a formação de complexos de quelato com ON não pode ocorrer na presença de catiões monovalentes e precisa especificamente de um catião divalente para a sua formação, a formação de complexo com ON com muitos ONs (ver Exemplo 2) foi observada em tampão FP que continha apenas uma fonte catiões. O tampão FP IX foi preparado contendo apenas um dos seguintes sais: cloreto de sódio, potássio cloreto de, amónio cloreto de, cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, todos a 80 mM concentração de modo que a concentração de catiões no tampão FP foi equivalente. Os ONs fluorescentemente marcados como descrito no Exemplo 2 foram diluidos para 10 nM em diferentes tampões FP e a formação de complexos de quelato com ON foi monitorizada por polarização da fluorescência (ver Fig. 26). No caso de cada ON testado, a formação de complexo quelato foi observada apenas com os catiões Mg2+ e Ca2+ e não com qualquer dos catiões monovalentes testados (Na+, K+ ou NH4+) . Como observado no Exemplo III, REP 2029-FL (SEQ ID NO:2) e REP 2028-FL (SEQ ID NO:l) apresentaram apenas moderada ou nenhuma formação de complexo, respetivamente na presença de cálcio ou magnésio. Isto confirma ainda que os ONs podem apenas formar complexos de quelato com catião divalente enquanto os ONs podem apenas existir como sais com sais monovalentes.

EXEMPLO VI

Avaliação do conteúdo em metal dos complexos de quelato com ON preparados no WFI

Para demonstrar a vasta aplicabilidade da preparação de complexos de quelato com ON para todos os ONs, vários diferentes complexos de quelato com ON foram preparados utilizando os ONs e sais cloreto de metal2+ como indicado na Tabela 3. Todos os ONs utilizados nestas preparações foram sais de sódio que foram dessalinizados para remover NaCl derivado de sódio e deixa apenas sódio integral para a formação de sal de ON no ON liofilizado final. Os complexos de quelato com ON foram preparados em água para injeção (WFI) por dissolução em primeiro lugar a quantidade prescrita no sal de sódio de ON para uma concentração de 50 mg/mL e adição da quantidade prescrita de sal cloreto de metal divalente na solução de ON. As soluções de ON antes da adição do cloreto de metal divalente/formação de quelato com ON foram analisadas para o sódio e o metal relevante por espectroscopia de emissão de plasma-ótica indutivamente acoplada (ICP-OES). Após a formação de complexos de quelato com ON, as amostras foram dessalinizadas por ultrafiltração utilizando um filtro de celulose regenerado de 5000 MWCO. Este filtro foi previamente validado para permitir a permeação de sais livres mas não de ONs ou catiões ligados a ONs. A solução do retido (contendo complexos de quelato com ON) foi analisada para o conteúdo em sódio e metal por ICP-OES e para o conteúdo em cloreto por cromatografia iónica para confirmar que os metais divalentes presentes foram quelados nos ONs e não derivaram dos sais de metal divalente presentes na solução do retido (Tabela 4).

Tabela 3

Tabela 4

Estes resultados confirmam a deslocação parcial do sódio por cálcio, magnésio ou ferro (2+) em ONs variando o comprimento de 20-60mero, variando na sequência de ONs totalmente degenerados em três sequências específicas (poli C, poli AC e poli AG) e em ONs com ou sem modificações fosforotioato, com ou sem modificações 2' ribose e contendo fosforotioato e modificações 2'ribose. Espera-se que a capacidade para formular ONs modificados com ribose 2'0 metilo como complexos de quelato se estenda também aos ONs contendo quaisquer outras modificações 2' ribose tais como mas não restritas a 2' fluoro e 2' 0 metioxietilo. Além disso, estes demonstram que a deslocação significativa de sódio é conseguida com aumentos mínimos no conteúdo em metal divalente, consistente com os complexos de quelato com as estruturas de ON descritas na Fig. 15. Estes resultados também ilustram as várias combinações de cálcio, magnésio, ferro (2+) e soluções de sal de cálcio/magnésio que podem ser utilizadas para preparar complexos de quelato com ON e mostram que qualquer solução de sal de metal divalente ou mistura de soluções de sal de metal divalente podem ser utilizadas de modo semelhante para preparar complexos de quelato com ON.

Deste modo, os complexos de quelato com ON podem ser preparados a partir de ONs que são totalmente fosforotioatados ou não, contendo qualquer número de ligações fosforotioatadas, contendo pelo menos uma modificação 2' ribose ou 2' ribose totalmente modificada ou não contendo modificações 2' ribose. Os ONs podem ser RNA ou DNA ou um hibrido contendo RNA e DNA. 0 sal metálico utilizado na preparação de um complexo de quelato com ON inclui sem restrição um sal de cálcio, um sal de magnésio, um sal de ferro, qualquer outro sal de metal divalente.

EXEMPLO VII

Preparação de Complexos de quelato com ON estáveis em salino normal

Tendo demonstrado a natureza amplamente conservada da formação de complexos de quelato com ON e a preparação com diferentes metais divalentes nos Exemplos II e III, a preparação de complexos de quelato com ON e cálcio estáveis, solúveis foi examinada em salino normal, um excipiente mais apropriado para administração a um indivíduo de complexos de quelato com ON. Para esta experiência, uma solução de 200 mg/mL do sal de sódio de REP 2006 em salino normal foi utilizada como a fonte de ON. A fonte de cálcio foi uma solução de CaCl2 a 10% em WFI (100 mg/mL CaCl2) . Vários complexos de quelato cálcio e REP 2006 utilizando diferentes concentrações de cálcio e REP 2006 foram preparados em soluções de 1 mL à temperatura ambiente (ver Tabela 5) de acordo com o protocolo que se segue: 1) adicionar REP 2006 ao frasco, 2) adicionar salino normal e misturar e 3) adicionar CaCl2 e misturar. Estas soluções de quelato de REP 2006 e cálcio foram observadas para o aparecimento de precipitado passados 36 dias (ver Tabela 6). _Tabela 5_

_ Tabela 6_

Em todos os casos, as soluções de quelatos de REP 2006 e cálcio demonstrou uma tensão de superfície reduzida e viscosidade aumentada em comparação com as soluções de REP 2006 na ausência de cálcio (em todas as concentrações testadas), como evidenciado por um menisco mais pronunciado no frasco e no comportamento da solução viscosa quando os frascos foram suavemente invertidas. Este comportamento da solução é consistente com a formação de grandes complexos multiméricos solúveis (complexos de quelato) como apresentado nas Figs. 15 A-C. Mesmo nos frascos onde o precipitado se formou, a solução restante apresentou ainda este aumento característico na tensão de superfície e viscosidade. É possível que os precipitados formados nestas soluções tenham adotado as estruturas de quelato com ON saturadas (e insolúveis) como ilustrado na Fig. 15D com o ON e cálcio residual não precipitados formando ainda quelatos solúveis na solução. Espera-se que estes comportamentos sejam geralmente representativos do comportamento de quaisquer complexos de quelato com ON, independentemente do comprimento, química, estrutura de ON (de cadeia simples ou de cadeia dupla) ou metal divalente presente. Além disso, estas experiências também demonstram que enquanto maiores concentrações de ON e cálcio podem inicialmente formar complexos completamente solúveis, estes são provavelmente dinamicamente instáveis e de transição lenta de complexos de quelato solúveis (as in Figs. 15 A-C) para complexos de quelato insolúveis (Fig. 15D) . Deste modo pode ser desejável preparar complexos de quelato com ON a concentrações de ON e de metal tais como as apresentadas na

Tabela 5 que tem complexos de quelato com ON solúveis que são estáveis em solução. Quatro diferentes combinações de ONs e metal, as concentrações óptimas de ON e metal que resultam em complexos de quelato com ON solúveis que permanecem solúveis em solução ao lonqo do tempo podem variar destas concentrações apresentadas para REP 2006 e cálcio na Tabela 5.

Os exemplos VI e VII descrevem várias combinações de concentrações ON e sal metálico divalente em diferentes excipientes que podem ser úteis na preparação de complexos de quelato com ON e descreve combinações de ON e sais de metal divalente ou misturas de sais de metal divalente que resultam em complexos de quelato com solução de ONs que em salino normal precipitam rapidamente, precipitam lentamente ou permanecem totalmente solúveis ao longo de um periodo de tempo estendido. Pode ser vantajoso utilizar soluções de quelato com ON com qualquer destas caracteristicas de estabilidade.

Deste modo, os complexos de quelato com ON podem ser preparados utilizando qualquer sal de ON incluindo mas não se restringindo a um sal de ON e sódio ou um sal de ON e amónio ou um sal de ON mistura sódio/amónio. Idealmente, o sal de ON é dissolvido em excipiente aquoso incluindo mas não se restringindo a água para injeção ou salino normal. A fonte de metal divalente a ser utilizada para a formação quelato ON podem ser um sal cloreto, um sal sulfato ou qualquer outro sal farmaceuticamente aceitável incluindo mas não se restringindo a sal gluconato, um sal citrato, um sal lactato, um sal maleato, um sal aspartato, um sal fumarato, um sal ascorbato, um sal benzoato, um sal eritorbato, e/ou um sal propionato. 0 sal pode compreender qualquer dos seguintes catiões metálicos divalentes: cálcio, magnésio, ferro (2+), manganês, cobre e/ou zinco. Adicionalmente, uma mistura de mais do que um sal metálico pode ser utilizada. Os referidos sais metálicos podem ser utilizado diretamente na forma pó mas é de um modo preferido preparado como uma solução aquosa no mesmo excipiente em que o ON está dissolvido. Os sais de metal podem ser preparados em qualquer concentração até ao limite de solubilidade para o referido sal metálico no referido excipiente. Os complexos de quelato com ON são de um modo preferido preparados pela adição lenta da solução do sal metálico a solução de ON com constante mistura para evitar a acumulação de quelato ON precipitados durante a adição da solução de sal. Dependendo da concentração de ON e sal metálico utilizado, as soluções de quelato com ON podem formar lentamente precipitados quelato ON ao longo do tempo ou permanecer completamente solúveis (ver Exemplo VII).

EXEMPLO DE REFERÊNCIA VIII

Quelação de cálcio no soro por ONs causa anticoagulação do sangue.

Os efeitos anticoagulação de ONs específicos foram previamente descritos mas para demonstrar os efeitos anticoagulação dos complexos de quelato de ONs na presente revelação, os ONs não marcados com FITC foram preparados como sais de sódio de pureza elevada de modo a serem biologicamente compatíveis. Estes ONs foram REP 2004, REP 2006, REP 2107 e REP 2031 (SEQ ID NO:4), estes são as versões não marcadas dos ONs descritos no Exemplo 1. Estes ONs em várias concentrações (em 500 yL de salino normal) foram adicionados a to 5 mL de sangue total fresco humano recolhido em tubos com citrato. O tempo de protrombina (uma medida aceite para o estado de coagulação do sangue) na presença destes ONs foi avaliada utilizando metodologias laboratoriais cinicas aceites e comparadas com o tempo de protrombina na presença volumes iguais de salino normal. O efeito relativo na coagulação foi expresso como uma proporção (PTToligo:PTTsalino normal) e reportada como a proporção normalizada (NR) . Uma NR de 1 indica estado de coagulação normal e uma NR maior do que 1 indica que o sangue é anticoagulado. Os resultados destas experiências são ilustradas na Fig. 27. Para todos os ONs avaliados, existiu um aumento dependente da dose na anticoagulação. REP 2055 (SEQ ID NO:6) é um ON 40 mero fosforotioatado com sequência (AC) 20. O efeito da adição de 2,5 mM do sal de sódio de REP 2055 no estado de coagulação do sangue foi avaliado como descrito acima. Para determinar se o efeito anticoagulação foi devido a quelação de cálcio do sangue, o efeito de várias quantidades de suplementação de cálcio (na forma de cloreto de cálcio) no REP 2055 (SEQ ID NO:6) - foi observada anticoagulação induzida. Os resultados desta experiência são ilustrados na Fig. 28. Como esperado a partir dos resultados da Fig. 27, 2,5 mM de REP 2055 (SEQ ID NO:6) induziram uma pronunciada anticoa-gulação do sangue. Esta anticoagulação foi eficazmente suprimida por suplementação de cálcio e pode ser completamente revertida em concentrações de cloreto de cálcio superiores a 2,25 mM. Estes resultados sugerem fortemente que o efeito de anticoagulação de oligonucleó-tidos é mediada pela formação de complexos de quelato com ON no sangue após administração de ON resultando na quelação do cálcio como descrito nos exemplos acima. Além disso, estes resultados identificam ainda um método para prevenir a anticoagulação de sangue pelos ONs que é para neutralizar o efeito quelante do ON a ser administrado pro preparação do ON como complexo de quelato de cálcio. A neutralização da quelação do cálcio pode também ser conseguida com complexos de quelato com ON preparados utilizando sais de outro metal divalente incluindo mas não se limitando a: magnésio, manganês, ferro (2 + ) , cobre, e/ou zinco. Espera-se que estes métodos de supressão de anticoagulação mediada por oligonucleótido sejam eficazes com oligonucleótidos administrados a um humano ou não humano sujeito a IV ou outras vias de administração.

Os resultados desta experiência também põem em questão a natureza da interação dos ONs com proteínas do soro. As prévias assunções sobre a natureza da anticoagulação por ON foram que os ONs interagem diretamente com as proteínas da cascata de coagulação mas note-se que a maioria destas proteínas são proteínas de ligação a cálcio ou proteínas envolvidas na cascata de coagulação dependente de cálcio (Sheerhan e Lan, 1998, Blood 92: 1617) . 0 facto de que a anticoagulação de sangue de ONs poder ser neutralizada por adição de cálcio e o facto de que os ONs atuam como quelantes de cálcio sugere o seguinte: • Pode ser necessária uma proteína de ligação a ON envolvida na anticoagulação mas não será suficiente para anticoagulação - a remoção do cálcio a partir de proteínas dependentes de cálcio através da sua quelação por ONs pode ser o mecanismo através do qual os ONs exercem atividade de anticoagulação. • As interações da proteína com ON com os componentes da cascata de coagulação podem ser, por si, dependentes do cálcio. A albumina, uma das principais proteínas do sangue, também liga cálcio e faz parte do mecanismo de regulação de cálcio no soro. A albumina é também conhecida por interagir com os ONs e provavelmente desempenha um papel de relevo no tempo de semivida dos ONs circulantes no sangue. Dos resultados da experiência de anticoagulação acima, parece que as interações globais de proteína no sangue podem ser catalisadas em grande parte pela funcionalidade quelante do cálcio dos ONs. Deste modo de modo a reduzir a interação com a proteína do soro que é também tem também um provável efeito de redução da semivida dos ONs circulantes e na melhoria da sua tolerabilidade a administração parentérica, os ONs podem ser administrado a um indivíduo como complexos de quelato com ON. Estes complexos podem ser preparados a partir de sais de cálcio mas podem também ser preparados a partir de outros sais metálicos de modo a neutralizar a propensão para os ONs para quelatar o cálcio quando administrados. Estes complexos podem já ter a sua atividade de quelação neutralizada e espera que deste modo tenham uma interação significativamente reduzida com as proteínas do soro. As vantagens desta redução na interação com as proteínas soro será a melhoria da tolerabilidade dos ON administrados (como um complexo de quelato) e uma semi-vida mais curta do ON no sangue.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA IX

Desenvolvimento de e prevenção de hipocalcemia em indivíduos humanos com tratamento crónico com ON

Para examinar ainda mais se a quelação de catião metálico divalente pelos ONs descritos nos exemplos acima possui relevância biológica em indivíduos humanos, o efeito da administração crónica de ON em cálcio no soro foi examinada em doentes com doença hepática crónica. Estes indivíduos são particularmente bem adequados para examinar o efeito biológico (se existir) da quelação de ON na medida em que demonstraram sofrer de deficiência em vitamina D que é tipicamente acompanhada por distúrbios do metabolismo mineral e densidade mineral no osso diminuida (Arteh et al.r 2010, Dig. Dis. Sci., 55: 2624-2628 e George et al., 2009 World J Gasteroenterol., 15: 3516-3522). Deste modo, se o efeito da quelação de ONs administrados cronicamente alterava a homeostasia em metal divalente em indivíduos humanos (tais como cálcio) o efeito desta alteração poderia ser mais facilmente observada nestes doentes na medida em que eles teriam pouca capacidade para contrariar qualquer desequilíbrio de metal no soro se tivesse ocorrido. Doentes com infeção crónica com hepatite B (com doença hepática crónica diagnosticada) foram tratados uma vez por semana com o ON REP 2055 (SEQ ID NO: 6) (como um sal de sódio de grau GMP) por infusão IV lenta em soto fisiológico normal. Os niveis totais de cálcio no soro foram monitorizados nos indivíduos através de métodos laboratoriais clinicamente aceites. Os primeiros dois indivíduos que receberam tratamento com ON desenvolveram hipocalcemia significativa num período de 12 semanas de tratamento (Fig. 29A) . Esta hipocalcemia variou na sua gravidade, mas persistiu durante as 13 semanas de tratamento seguintes. Os indivíduos subsequentes que receberam tratamento crónico de ON com REP 2055 (SEQ ID NO:6) foram administrados com suplementos minerais (proporcionando cálcio, magnésio e zinco) para contrariar os efeitos de quelação de tratamento com ON. Nenhum dos indivíduos que recebeu suplementos minerais desenvolveu hipocalcemia enquanto esteve em tratamento com ON (Fig. 29B). Estes resultados demonstram que a atividade de quelação de ONs não ocorre em indivíduos humanos. Isto foi observado diretamente com cálcio no soro, mas podem também ocorrer com outro catião metálico divalente biologicamente relevante tais como magnésio, zinco e cobre). Adicionalmente, as deficiências em metal provocadas pelos efeitos de quelação de ON podem ser corrigidas por suplementação mineral e podem também ser reduzidos por administração de ONs como complexos de quelato.

Como os ONs demonstraram quelar catiões metálicos divalentes em indivíduos humanos, a administração de um ON não quelado pode ser útil para a quelação de metais pesados lesivos para um indivíduo tais como mercúrio, cádmio, chumbo ou mesmo crómio (6+). Esse método iria envolver a administração de um sal de ON farmaceuticamente aceitável num excipiente apropriado, sendo o ON concebido para ser desprovido de funcionalidade dependente da sequência (tais como mas não limitados aos ONs de sequência específica descritos no Exemplo III) preferencialmente através da administração IV, mas também através de outras vias parentéricas. Seria de esperar que os doentes com uma função hepática normal fossem capazes de contrariar a quelação de cálcio que iria ocorrer, no entanto pode ser proporcionada suplementação mineral (como no Exemplo IX) para assegurar que o empobrecimento do soro em catiões divalentes biologicamente importantes seria prevenido. Esses ONs não quelados iriam sequestrar metais pesados presentes no sangue, imediatamente reduzir ou eliminar os efeitos prejudiciais destes metais e também potencialmente acelerar a sia eliminação dos indivíduos em questão.

Uma vez que também foi demonstrado que as ONs de cadeia dupla também podem formar complexos de quelato com ON (e deste modo também sequestras metais divalentes), é esperado que a administração de qualquer ácido nucleico de cadeia dupla (por exemplo um siRNA) seria também expectável que possuísse pelo menos alguns dos efeitos de quelação descritos para ONs de cadeia simples no exemplo acima. Deste modo, pode ser vantajoso preparar ONs de cadeia dupla como complexos de quelato antes da administração.

EXEMPLO X

Complexos de quelato com ON podem suprimir reações no sítio de injeção de oligonucleótidos administrados subcutaneamente

As reações no sítio da injeção (ISRs) com oligonucleótidos administrados subcutaneamente em doentes humanos são comuns, mesmo com oligonucleótidos altamente modificados para minimizar as suas propriedades imunoestimuladoras. Uma vez que a administração subcutânea envolve a injeção de oligonucleótidos altamente concentrados (tipicamente > 100 mg/ml), o efeito de quelação (muito provavelmente de cálcio mas também pode ser de outros metais divalentes tais como magnésio) localizado em volta do sítio da injeção deve ser substancial e pode contribuir para as ISRs observadas de rotina. Para testar esta hipótese, foram administrados REP 2055 (SEQ ID NO: 6) ou REP 2139 (SEQ ID NO: 13, um análogo de REP 2055 possuindo todas as riboses 2' 0 metiladas e todas as bases de citosina 5' metiladas) através de administração subcutânea a doentes humanos. Ambas as soluções foram preparadas asseticamente em solução salina normal, quer como um sal de sódio ou com um complexo quelato de cálcio (ver Tabelas 7 e 8 e de acordo com o processo no Exemplo VIII). Para controlar a variação de doente para doente, ambas as formulações de cada ON foram avaliadas para a reatividade à injeção no mesmo indivíduo humano. Os indivíduos foram monitorizados para ISRs m cada sítio da injeção durante 12 horas após administração de REP 2055 (SEQ ID NO: 6) e durante 72 horas após a administração de REP 2139 (SEQ ID NO:13). Os resultados desta experiência são apresentados na Tabela 7 e 8. _Tabela 7_

Tabela 8

Estes resultados demonstram que a administração de ONs como complexos de quelato de cálcio reduz substancialmente ou elimina ISRs com dois ONs diferentes administrados subcutaneamente. Estes resultados demonstram ainda que a quelação de cálcio (e potencialmente outros metais divalentes) por ONs desempenha um papel na manifestação de ISRs tipicamente associados com a administração subcutânea de ONs. Além disso, estes resultados identificam um método para a prevenção de ISRs com qualquer ON administrado subcutaneamente através do desempenho da administração do referido ON como complexo quelato. Nestes exemplos, o cálcio foi utilizado como o veiculo para formação de complexos de quelato com ON mas a mitigação de ISRs também é expectável que ocorra com complexos de quelato com ON que tenham sido preparados com outro metal divalente apropriado diferente do cálcio. Qualquer complexo quelato metal ON é expectável que possua a sua propensão para quelar cálcio neutralizado que seria o mecanismo subjacente para a tolerância de SC melhorada no ON quando administrado como um complexo de quelato. A capacidade de complexos de quelato com ON para suprimir ISRs induzidos por oligonucleótido é expectável que seja eficaz para qualquer ON de qualquer sequência especifica e ou modificações ou ONs de cadeia simples ou dupla à luz da natureza largamente conservada da formação de complexos de quelato com ON revelada nos exemplos aqui apresentados. Utilizando cálcio como o metal divalente exemplar neste exemplo, podem ser utilizados outros sais de cálcio na preparação de complexos de quelato com ON e ser expectável que produzam Complexos de quelato com ON possuindo os mesmos efeitos supressivos em ISRs mediados por oligonu-cleótido com administração subcutânea incluindo mas não restringido a gluconato de cálcio, citrato de cálcio, lactato de cálcio, malato de cálcio, aspartato de cálcio, fumarato de cálcio, ascorbato de cálcio, benzoato de cálcio, eritorbato de cálcio, e/ou propionato de cálcio. Os complexos de quelato com ON podem ser preparados com sais de outros catiões metálicos divalentes tais como mas não limitados a: magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco.

Na preparação de complexos de quelato com ON, pode ser desejável utilizar outros catiões que não são átomos divalentes mas que podem de um modo semelhante prevenir o efeito da quelação de oligonucleótidos. Complexos de quelato com ON preparados com estes catiões também podem ser utilizados nas formulações para suprimir a anti-coagulação por ONs ou para suprimir reações no sitio de injeção com ON quando administrados subcutaneamente ou para prevenir o sequestro de metais divalentes biologicamente importantes após administração de ON. Esses contra-iões podem incluir sem restrição: átomos de um estado de carga de 3+ ou superior ou catiões orgânicos.

Na preparação de complexos de quelato com ON, pode ser preferível preparar quelatos com ON utilizando uma mistura de catião divalente (i.e. com sais de cálcio e magnésio). Esses quelatos ON mistos podem ser mais fáceis de preparar e possuir maior solubilidade do que os quelatos preparados com um único catião divalente e deste modo seria mais adequado para aplicações de concentração elevada.

Dados os exemplos acima utilizando sequências de ON diversas, com diversas modificações e no estado de cadeia simples ou de cadeia dupla e utilizando metais divalentes diversos, a formação de complexos de quelação ON podem ser considerados como sendo uma caraterística universal de qualquer um e de todos os ONs que possuem uma estrutura fosfodiéster (seja fosforotioada ou não), independentemente de outras modificações. Assim, a formação de complexos de quelato com ON no sangue ou no espaço subcutâneo é uma caraterística normal de qualquer Administração de ON quando os ONs são administrados como sais (tipicamente sais de sódio), resultando no sequestro de catião metálico divalente mesmo se os efeitos secundários desta quelação puderem ser assintomáticos na população do indivíduo específico que recene o ON em questão. 0 que é importante, é que existem vários exemplos de ONs (PRO- 051 / GSK2402968 - Goemans et al., 2011 New

England J. Med., 364: 1513-1522 e ISIS 301012 (mipomersen) - Viser et al., 2010, Curr. Opin. Lipidol. 21: 319-323) que demonstraram claramente que as reações de ISR com administração subcutânea (como sais de sódio) que são semelhantes às ISRs observadas no Exemplo IX e são deste modo diagnóstico da formação de complexos de quelato com ON após administração. Mesmo se ambos estes ONs tivessem sequências diferentes e modificações de 2' ribose diferentes, eles possuem ambos uma estrutura fosfodiéster (em ambos os casos fosforotioatados) e assim podem formar Complexos de quelato com ON e sequestras metais divalentes do ambiente local (neste caso o espaço subcutâneo. Além disso, ambos estes ONs demonstraram ser capazes de exercer os seus efeitos biológicos, mesmo se a quelação ON tiver de ocorrer, deste modo os complexos de quelato com ON em sistemas biológicos não interferem com a atividade biológica de ONs. É largamente aceite e está bem demonstrado na técnica que todos os ONs fosforotioados (independentemente da sequência de nucleótidos) alcançam tipicamente as concentrações mais elevadas de fármaco no rim e no figado. Historicamente, a administração crónica de muitos ONs fosforotioatos diferentes foram associados a disfunção moderada do figado ou do rim. Embora a causa dessas disfunções não tenha sido ainda claramente elucidada, dados os efeitos conservados da quelação de ONs em geral, é provável que a quelação de metais divalentes no figado e no rim seja significativa com a Administração crónica de ON porque a atividade e quelação pode ser mais pronunciada nestes órgãos devido às concentrações elevadas de ONs presentes. A administração de ONs como complexos de quelato não irão alterar a biodistribuição no órgão (ou afetar a bioatividade como apresentado acima) mas podem servir para prevenir as deficiências em metal no figado e no rim que estão a ter um impacto no funcionamento normal desses órgãos.

Uma vez que os complexos de quelato com ON resultam na formação de complexos multiméricos com ON em solução, estes complexos provavelmente possuirão uma resistência muito maior à degradação por nuclease e potencialmente à hidrólise e os fosforotioatos com ON podem também ser mais resistentes à oxidação. Deste modo, o armazenamento de qualquer ON com um complexo quelato pode aumentar grandemente a sua estabilidade em solução aquosa sem alterar significativamente a sua bioatividade quando administrado a um indivíduo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> REPLICOR INC. Andrew VAILLANT Michel

BAZINET

<120> COMPLEXOS DE QUELATO DE OLIGONUCLEÓTIDO

<130> 05016051-32PCT <150> US 61/375257 <151> 2010-08-20 <160> 14 <170> FastSEQ para windows versão 4.0 <210> 1 <211> 40

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2028, fosforotioato completo <4 0 0> 1 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 40

<210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2029, fosforotioato completo <400> 2 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40

<210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2030, fosforotioato completo <4Ο0> 3 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40

<210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2031, fosforotioato completo <400> 4 cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 40

<210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2033, fosforotioato completo <400> 5 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 40

<210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2055, fosforotioato completo <400> 6 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2056, fosforotioato completo <400> 7 tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 40

<210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2057, fosforotioato completo <400> 8 agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 40

<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2126, fosforotioato completo <400> 9 cccccccccc cccccccccc 20

<210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2127, fosforotioato completo <4 0 0> 10 cccccccccc cccccccccc cccccccccc 30

<210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2128, fosforotioato completo <4 0 0> 11 cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 50

<210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2129, fosforotioato completo <4 0 0> 12 cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60 <210> 13 <211> 40

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2139, fosforotioato completo, 2' 0 metil ribose completo, C = 5' metilcitidina <4 0 0> 13 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40

<210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> REP 2138; 2' 0 metil ribose completa <4 0 0> 14 cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 40

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uma composição farmacêutica para utilização na supressão ou redução de reações subcutâneas no sitio de injeção num indivíduo de um oligonucleótido administrado subcutaneamente, a referida composição farmacêutica compreendendo: • um complexo de quelato de oligonucleótido compreendendo dois ou mais oligonucleótidos ligados às suas estruturas de fosfodiéster por um catião multivalente; e • um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que pelo menos um oligonucleótido do referido complexo possui pelo menos uma ligação fosforotioato e em que o referido catião multivalente é um catião metálico divalente.
2. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida ligação entre dois ou mais oligonucleótidos ocorre nos átomos de oxigénio que não formam ponte (ou no enxofre, no caso de fosforotioação) na ligação fosfosdiéster, e em que o referido oligonucleótido é selecionado a partir da seguinte Tabela:
3. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer um das revindicações 1 ou 2, em que o referido catião metálico divalente é cálcio.
4. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer um das revindicações 1 ou 2, em que o referido catião metálico divalente é magnésio.
5. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer as revindicações 1 ou 2, em que o referido catião metálico divalente é cobalto, ferro (2 + ) , manganês, cobre ou zinco.
6. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das revindicações 1 e 3 a 5, em que em que o referido complexo quelato compreende pelo menos um oligonucleótido de cadeia dupla.
7. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das revindicações 1 a 6, em que o referido complexo quelato compreende pelo menos um oligonucleótido totalmente fosforotioatado.
8. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das revindicações 1 a 7, em que o referido complexo quelato compreende pelo menos um oligonucleótido com uma ribose modificada em 2'.
9. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das revindicações 1 a 8, em que o referido complexo quelato compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 até 14.