CN105647921A - 有效跳跃人杜兴肌营养不良基因外显子43、46、50-53中至少一个的方法和手段 - Google Patents

有效跳跃人杜兴肌营养不良基因外显子43、46、50-53中至少一个的方法和手段 Download PDF

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Abstract

本发明涉及方法，其中使用分子诱导和/或促进患者中，优选患者分离的细胞中DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外显子50-53中至少一个的跳跃，所述方法包括向所述细胞和/或所述患者提供分子。本发明还涉及所述分子本身。

Description

有效跳跃人杜兴肌营养不良基因外显子43、46、50-53中至少一个的方法和手段
发明领域
本发明涉及遗传学领域，更具体而言涉及人类遗传学领域。本发明尤其涉及人杜兴肌营养不良前mRNA剪接的调节。
发明背景
肌病是导致肌肉功能性损伤的病症。肌营养不良(MD)是指特征为骨骼肌的逐渐衰弱和退化的遗传学疾病。杜兴肌营养不良(Duchennemusculardystrophy,DMD)和贝克肌营养不良(Beckermusculardystrophy,BMD)是最常见的儿童形式的肌营养不良。它们是隐性遗传疾病，因为负责DMD和BMD的基因位于X染色体上，突变主要影响男性，发病率为每3500名男孩中约1例。
DMD和BMD是由编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因的遗传学缺陷导致，所述抗肌萎缩蛋白是细胞骨架和细胞外基质之间相互作用所必需的肌肉蛋白，用于在收缩期间维持肌纤维的稳定性。DMD是严重且致死的神经肌肉病症，导致在12岁之前依靠轮椅维持，并且由于呼吸或心脏衰竭，DMD患者通常在30岁之前死去。相比之下，BMD患者通常直至晚年仍能走动，并具有近乎正常的预期寿命。DMD基因中的DMD突变特征为移码插入或缺失或无义点突变，导致功能性抗肌萎缩蛋白的缺乏。通常，BMD突变保持阅读框完整，允许合成具有部分功能性抗肌萎缩蛋白。
最近十年，已经出现为了恢复抗肌萎缩蛋白转录本的破坏的阅读框而进行的剪接的特定修饰，作为杜兴肌营养不良(DMD)的有希望的疗法(vanOmmen,vanDeutekom,Aartsma-Rus,CurrOpinMolTher.2008；10(2):140-9,Yokota,Duddy,Partidge,ActaMyol.2007；26(3):179-84,vanDeutekometal.,NEnglJMed.2007；357(26):2677-86)。
使用干扰剪接信号的反义寡核苷酸(AON)，可以在DMD前mRNA中诱导特定的外显子跳跃，从而恢复开放阅读框并将严重的DMD转变成较轻微的BMD表型(vanDeutekometal.HumMolGenet.2001；10:1547-54；Aartsma-Rusetal.,HumMolGenet2003；12(8):907-14.)。在由于外显子23中无义突变导致抗肌萎缩蛋白缺乏的mdx小鼠模型中首次获得体内概念验证(proof-of-concept)。肌内注射和静脉内注射靶向突变的外显子23的AON恢复抗肌萎缩蛋白的表达持续至少三个月(Luetal.NatMed.2003；8:1009-14；Luetal.,ProcNatlAcadSciUSA.2005；102(1):198-203)。这是通过纤维膜处抗肌萎缩蛋白关联蛋白的恢复以及处理的肌肉的功能性改善来实现的。还在hDMD小鼠模型中实现人外显子的体内跳跃，所述hDMD小鼠模型包含整合在小鼠染色体5中的人DMD基因的完整拷贝(Bremmer-Boutetal.MolecularTherapy.2004；10:232-40；'tHoenetal.JBiolChem.2008；283:5899-907)。
最近，成功完成了首次用于人体的研究，其中将诱导外显子51跳跃的AON注入4名DMD患者胫骨前肌的小区域内。在治疗的所有四名患者的大多数肌纤维中观察到新抗肌萎缩蛋白表达，并且该AON是安全且耐受良好的(vanDeutekometal.NEnglJMed.2007；357:2677-86)。
发明的详细描述
方法
第一方面，本发明提供了诱导和/或促进患者中，优选在患者分离的细胞中，DMD前mRNA的外显子43、46、50-53中至少一个的跳跃的方法，所述方法包括向所述细胞和/或所述患者提供与所述外显子中的至少8个核苷酸的连续区段结合的分子。应当理解，所述方法包括体外、体内或离体方法。
因此，提供了诱导和/或促进患者中，优选在所述患者分离的细胞中，DMD前mRNA的外显子43、46、50-53中至少一个的跳跃的方法，所述方法包括向所述细胞和/或所述患者提供与所述外显子中的至少8个核苷酸的连续区段结合的分子。
如本文所定义，DMD前mRNA优选表示DMD或BMD患者DMD基因的前mRNA。
优选地，患者意图表示患有本文随后所定义的具有DMD或BMD的患者，或由于他或她的遗传学背景而易于发展为DMD或BMD的患者。就DMD患者而言，所用的寡核苷酸优选纠正所述患者DMD基因所呈现的一个突变，并且因此优选会产生看起来与BMD蛋白类似的DMD蛋白：所述蛋白优选是如本文随后所定义的功能性抗肌萎缩蛋白。就BMD患者而言，所用的寡核苷酸优选纠正所述患者BMD基因所呈现的一个突变，并且因此优选会产生抗肌萎缩蛋白，其比原来存在于所述BMD患者中的抗肌萎缩蛋白功能性更强。
外显子跳跃是指诱导细胞中的成熟mRNA不包含正常存在其中的特定外显子。通过向表达所述mRNA的前mRNA的细胞提供能干扰关键序列的分子能干扰外显子包含信号的分子来进行外显子跳跃，所述关键序列例如所述外显子剪接所必需的剪接受体序列的剪接供体，所述外显子包含信号是识别一段核苷酸作为待包括在mRNA中的外显子所必需的。术语前mRNA是指通过转录从细胞核中的DNA模板合成的未加工的或部分加工的前体mRNA。
在本发明的语境中，本文所指的诱导和/或促进外显子跳跃表示治疗的患者的一个或多个(肌肉)细胞中至少1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的DMDmRNA不包含所述外显子。如实施例中所述，这优选通过PCR来评价。
优选地，本发明方法通过诱导和/或促进患者的一个或多个(肌肉)细胞中的DMD前mRNA的外显子43、46、50-53中至少一个的跳跃，向所述患者提供功能性抗肌萎缩蛋白和/或减少所述患者中异常抗肌萎缩蛋白的产生和/或增加所述患者中功能性抗肌萎缩蛋白的产生。向患者提供功能性抗肌萎缩蛋白和/或减少所述患者中异常抗肌萎缩蛋白的产生通常应用于DMD患者中。增加所述患者中功能性抗肌萎缩蛋白的产生通常应用于BMD患者。
因此，优选的方法是这样的方法：其中向患者或所述患者的一个或多个细胞提供功能性抗肌萎缩蛋白和/或其中减少所述患者中异常抗肌萎缩蛋白的产生和/或其中增加所述患者中功能性抗肌萎缩蛋白的产生，其中所述异常或功能性抗肌萎缩蛋白的水平是通过与开始方法时所述患者中的所述抗肌萎缩蛋白的水平比较来评价。
减少异常抗肌萎缩蛋白的产生可以在mRNA水平上评价，并且优选表示通过RTPCR仍然可检测到异常抗肌萎缩蛋白mRNA最初数量的99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少。异常抗肌萎缩蛋白mRNA或蛋白在本文也被称为非功能性抗肌萎缩蛋白mRNA或蛋白。非功能性抗肌萎缩蛋白优选的是不能与肌动蛋白和/或DGC蛋白复合物成员结合的抗肌萎缩蛋白。非功能性抗肌萎缩蛋白或抗肌萎缩蛋白mRNA通常没有或不编码具有蛋白的完整C-末端的抗肌萎缩蛋白。
增加所述患者或所述患者细胞中功能性抗肌萎缩蛋白的产生可以在mRNA水平上评价(通过RT-PCR分析)，并且优选表示通过RTPCR可以检测到可检测数量的功能性抗肌萎缩蛋白mRNA。在另一个实施方案中，可检测到的抗肌萎缩蛋白mRNA的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多是功能性抗肌萎缩蛋白mRNA。增加所述患者或所述患者细胞中功能性抗肌萎缩蛋白的产生可以在蛋白水平上评价(通过免疫荧光和western印迹分析)，并且优选表示通过免疫荧光或western印迹分析可以检测到可检测数量的功能性抗肌萎缩蛋白。在另一个实施方案中，可检测到的抗肌萎缩蛋白的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多是功能性抗肌萎缩蛋白。
如本文所定义，功能性抗肌萎缩蛋白优选是与具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的蛋白相应的野生型抗肌萎缩蛋白。功能性抗肌萎缩蛋白优选是这样的抗肌萎缩蛋白，其具有在它的N末端部分中的肌动蛋白结合结构域(N末端的前240个氨基酸)、半胱氨酸富集结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端的最后325个氨基酸)，如本领域技术人员所已知的，这些结构域的每一个都存在于野生型抗肌萎缩蛋白中。本文所指的氨基酸与SEQIDNO:1表示的野生型抗肌萎缩蛋白的氨基酸相符合。换而言之，功能性抗肌萎缩蛋白是至少在一定程度上表现出野生型抗肌萎缩蛋白活性的抗肌萎缩蛋白。“至少在一定程度上”优选表示野生型功能性抗肌萎缩蛋白的相应活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在本文中，功能性抗肌萎缩蛋白的活性是优选与肌动蛋白和与抗肌萎缩蛋白关联的糖蛋白复合物(DGC)结合(Aartsma-RusAetal,(2006),莱顿杜兴肌营养不良突变数据库条目：确定阅读框规则的突变类型反常情况的综述,MuscleNerve,34:135-144)。通过使用总蛋白提取物的免疫共沉淀或来自肌肉活检的横断面的免疫荧光分析可以显现抗肌萎缩蛋白与肌动蛋白和与DGC复合物的结合，这对本领技术人员是已知的。
患杜兴肌营养不良的个体或患者通常在编码抗肌萎缩蛋白的基因中具有突变，其阻止完整蛋白的合成，即提前的终止阻止C-末端的合成。在贝克肌营养不良中，DMD基因与野生型基因比较也包含突变，但是所述突变通常不会诱导提前的终止且通常合成C-末端。因此合成的功能性抗肌萎缩蛋白具有至少与野生型蛋白一样的活性，尽管没有必要是相同的活性量。BMD个体的基因组通常编码这样的抗肌萎缩蛋白，其包含N末端部分(N末端的前240个氨基酸)、半胱氨酸富集结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端的最后325个氨基酸)，但是它的中央杆状结构域可以短于野生型抗肌萎缩蛋白之一(Aartsma-RusAetal,(2006),莱顿杜兴肌营养不良突变数据库条目：确定阅读框规则的突变类型和反常情况的综述,MuscleNerve,34:135-144)。用于DMD治疗的外显子跳跃通常通过跳跃杆状结构域中的外显子以纠正阅读框和允许包含C-末端的抗肌萎缩蛋白的残余部分的合成，克服前mRNA中的提前终止，尽管由于较小的杆状结构域，所述蛋白略小。在优选的实施方案中，患有DMD并通过本文所定义的方法治疗的个体会提供至少在一定程度上表现出野生型抗肌萎缩蛋白活性的抗肌萎缩蛋白。更优选地，如果所述个体是杜兴患者或疑似杜兴患者，功能性抗肌萎缩蛋白是患有BMD个体的抗肌萎缩蛋白：通常所述抗肌萎缩蛋白能与肌动蛋白和DGC两者相互作用，但是它的中央杆状结构域可以短于野生型抗肌萎缩蛋白的中央杆状结构域(Aartsma-RusAetal,(2006),莱顿杜兴肌营养不良突变数据库条目：确定阅读框规则的突变类型和反常情况的综述,MuscleNerve,34:135-144)。野生型抗肌萎缩蛋白的中央杆状结构域包含24个血影蛋白样重复(Aartsma-RusAetal,(2006),莱顿杜兴肌营养不良突变数据库条目：确定阅读框规则的突变类型和反常情况的综述,MuscleNerve,34:135-144)。例如，本文所提供的抗肌萎缩蛋白的中央杆状结构域可以包含5-23个、10-22个或12-18个血影蛋白样重复，只要它能与肌动蛋白和与DGC结合。
本发明方法可以缓解患者生肌细胞或肌细胞的一个或多个特征或缓解具有下述缺失的DMD患者的一种或多种症状：所述缺失包括但不限于DMD基因中的外显子44、44-46、44-47、44-48、44-49、44-51、44-53(可通过外显子43跳跃纠正)、19-45、21-45、43-45、45、47-54、47-56(可通过外显子46跳跃纠正)、51、51-53、51-55、51-57(可通过外显子50跳跃纠正)、13-50、19-50、29-50、43-50、45-50、47-50、48-50、49-50、50、52(可通过外显子51跳跃纠正)、外显子8-51、51、53、53-55、53-57、53-59、53-60(可通过外显子52跳跃纠正)和外显子10-52、42-52、43-52、45-52、47-52、48-52、49-52、50-52、52(可通过外显子53跳跃纠正)，这共占所有具有缺失的DMD患者的68％(Aartsma-Rusetal.,Hum.Mut.2009)。
可选择地，本发明方法可以改善患者肌细胞的一个或多个特征或缓解DMD患者的一种或多种症状，所述DMD患者在DMD基因中具有小突变或具有外显子43、46、50-53的单一外显子重复，这共占所有具有缺失的DMD患者的36％(Aartsma-Rusetal,Hum.Mut.2009)。
此外，对于一些患者，除外显子43、外显子46和/或外显子50-53之外还需要一个其他外显子的同时跳跃以恢复开放阅读框，包括具有特定缺失、小(点)突变或双重或多重外显子重复的患者，例如(但不限于)外显子44-50的缺失需要外显子43和51的共跳跃、外显子46-50的缺失需要外显子45和51的共跳跃、外显子44-52缺失需要外显子43和53的共跳跃、外显子46-52的缺失需要外显子45和53的共跳跃、外显子51-54的缺失需要外显子50和55的共跳跃、外显子53-54的缺失需要外显子52和55的共跳跃、外显子53-56的缺失需要外显子52和57的共跳跃、外显子43或外显子44中的无义突变需要外显子43和44的共跳跃、外显子45或外显子46中的无义突变需要外显子45和46的共跳跃、外显子50或外显子51中的无义突变需要外显子50和51的共跳跃、外显子51或外显子52中的无义突变需要外显子51和52的共跳跃、外显子52或外显子53中的无义突变需要外显子52和53的共跳跃、或双重或多重外显子重复涉及外显子43、46、50、51、52和/或53。
在优选的方法中，诱导外显子43的跳跃、或诱导外显子46的跳跃、或诱导外显子50的跳跃、或诱导外显子51的跳跃、或诱导外显子52的跳跃、或诱导外显子53的跳跃。本发明方法还包括诱导这些外显子中的两个的跳跃。例如，优选外显子50和51、或52和53、或43与51、或43和53、或51和52的跳跃。根据患者中识别的突变的类型和身份(涉及的特定外显子)，本领域技术人员应当知道需要在所述患者中跳跃哪种外显子组合。
在优选的方法中，缓解DMD或BMD患者的一种或多种症状和/或改善来自DMD或BMD患者的一个或多个肌细胞的一个或多个特征。可以在细胞、组织水平或患者自身评价这类症状或特征。
可以通过对来自患者的生肌细胞或肌细胞进行下述任何测定来评价一个或多个特征缓解：减少的肌细胞钙摄取、减少的胶原蛋白合成、改变的形态学、改变的脂质合成、减少的氧化胁迫和/或改善的肌纤维功能、完整性和/或存活。通常使用肌肉活检的横断面的免疫荧光和/或组织化学分析来评价这些参数。
可以使用下述测定中的至少一个来评价肌纤维功能、完整性和/或存活的改善：血液中肌酸激酶可检测地减少、疑似营养不良的肌肉的活检横断面中肌纤维坏死可检测地减少和/或疑似营养不良的肌肉的活检横断面中肌纤维直径的同质性可检测地增加。这些测定中的每一种都是本领域技术人员已知的。
可以如Hodgettsetal(HodgettsS.,etal,(2006),NeuromuscularDisorders,16:591-602.2006)所述检测血液中的肌酸激酶。肌酸激酶可检测地减少可以表示与治疗前的同一DMD或BMD患者中的肌酸激酶浓度相比减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
肌纤维坏死可检测地减少优选在肌肉活检中评价，更优选如Hodgettsetal(HodgettsS.,etal,(2006),NeuromuscularDisorders,16:591-602.2006)所述使用活检横断面来评价。坏死可检测地减少可以是其中使用活检的横断面鉴定为坏死区域减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。通过与治疗前的同一DMD或BMD患者中评价的坏死比较来测量所述减少。
肌纤维直径的同质性可检测地增加优选在肌肉活检横断面中评价，更优选如在Hodgettsetal(HodgettsS.,etal,(2006),NeuromuscularDisorders,16:591-602.2006)中所述评价。通过与治疗前的同一DMD或BMD患者中肌纤维直径的同质性比较测量所述增加。
可以通过对患者自身进行任何下述测定来评价一种或多种症状的缓解：将丧失行走的时间延长、肌力的改善、举重物能力的改善、从地上站起来所需时间的改善、9米行走时间改善、攀爬四层楼梯所需时间的改善、腿功能等级的改善、肺功能的改善、心脏功能的改善、生活质量改善。这些测定中的每一种都是本领域技术人员已知的。举例而言，Manzuratal(ManzurAYetal,(2008),GlucocorticoidcorticosteroidsforDuchennemusculardystrophy(杜兴肌营养不良的糖皮质激素皮质甾类)(综述),Wileypublishers,TheCochranecollaboration.)的公开对这些测定中的每一种都给出大量的说明。对于这些测定中的每一种，一旦发现测定中测量的参数可检测地改善或延长，则将优选表示使用本发明方法已经缓解了个体的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的一种或多种症状。可检测地改善或延长优选统计学上显著的改善或延长，如Hodgettsetal(HodgettsS.,etal,(2006),NeuromuscularDisorders,16:591-602.2006)所述。可选择地，可以通过测量如本文后所定义的肌纤维功能、完整性和/或存活的改善来评价杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良一种或多种症状的缓解。
本发明方法的治疗可以持续至少一周、至少一个月、至少七个月、至少一年、至少2、3、4、5、6年或更长。
如本文所定义的用于本发明的每个分子或寡核苷酸或其等同物都可以适用于向受DMD或BMD影响的或有风险发展成DMD或BMD的个体体内的细胞、组织和/或器官直接给药，并且都可以体内、离体或体外直接给药。本发明分子或寡核苷酸或组合物的给药频率可以依赖于数个参数，例如患者年龄、患者突变、分子数(剂量)、所述分子的剂型。所述频率可以在两周至少一次、或三周至少一次或四周至少一次或五周至少一次或更长的时间周期之间改变。
可以将分子或寡核苷酸或其等同物递送至细胞。当将所述分子、寡核苷酸或其等同物给药至个体时，优选将它溶解在与递送方法相容的溶液中。对于静脉内给药、皮下给药、肌内给药、膜内给药和/或心室内给药，所述溶液优选是生理盐水。特别优选的本发明方法是使用赋形剂，所述赋形剂将进一步增强本文所定义的所述分子、寡核苷酸或其功能等同物递送至细胞或细胞中，优选肌细胞。优选的赋形剂在题目为“药物组合物”的部分中界定。
在本发明优选的方法中，使用能诱导和/或促进患者DMD前mRNA的另一个外显子跳跃的其他分子。优选地，第二外显子选自：患者DMD前mRNA的外显子6、7、11、17、19、21、43、44、45、50、51、52、53、55、57、59、62、63、65、66、69或75。可以使用的分子在表1-7中的任何一个中有描述。这样，阻止了从该前mRNA产生包含DMD前mRNA两个或多个外显子的mRNA。该实施方案也被称为双重或多重外显子跳跃(Aartsma-RusA,JansonAA,KamanWE,etal.Antisense-inducedmultiexonskippingforDuchennemusculardystrophymakesmoresense(杜兴肌营养不良的反义诱导的多重外显子跳跃更有意义).AmJHumGenet2004；74(1):83-92,Aartsma-RusA,KamanWE,WeijR,denDunnenJT,vanOmmenGJ,vanDeutekomJC.ExploringthefrontiersoftherapeuticexonskippingforDuchennemusculardystrophybydoubletargetingwithinoneormultipleexons(通过双重靶向一个或多个外显子来开发对杜兴肌营养不良治疗的外显子跳跃的前沿).MolTher2006；14(3):401-7)。在大多数情况下，双重外显子跳跃导致DMD前mRNA仅排除两个靶向外显子。然而，在其他情况下，发现所述前mRNA中的靶向外显子和所述外显子之间的全部区域在产生的mRNA中都不存在了，即使这些区域中存在其他外显子(其间的外显子)。该多重跳跃显然是来自DMD基因的寡核苷酸组合的结果，其中将外显子45的一个寡核苷酸和外显子51的一个寡核苷酸添加到转录DMD基因的细胞中。这种安排导致产生的mRNA不包含外显子45-51。显然地，在所提及寡核苷酸存在的情况下，前mRNA的结构是这样的：刺激剪接体系使外显子44和52彼此连接。
通过在两条互补的寡核苷酸之间提供连接，也有可能特定地促进其间的外显子跳跃。因此，在一个实施方案中，通过连接部分使与至少两个抗肌萎缩蛋白外显子互补的核苷酸区段分离。因此在该实施方案中，所述至少两段核苷酸连接形成单个分子。
如果多于一个化合物或分子用在本发明方法中，则可以以任何顺序将所述化合物给予个体。在一个实施方案中，所述化合物可以被同时给药(意思是在10小时之内，优选在1小时之内给予所述化合物)。尽管如此，这是没有必要的。在另一个实施方案中，相继给予所述化合物。
分子
第二方面，提供了如前部分题目为“方法”所述的方法中使用的分子。如本文所定义的分子优选寡核苷酸或反义寡核苷酸(AON)。
本发明人发现，使用优选与外显子43、46、50-53中任何一个的至少8个核苷酸的连续区段结合的分子，所述外显子被高频率地特异跳跃。尽管该效应与所述分子相对于结合少于8个核苷酸的连续区段的分子的较高结合亲和力有关，但是可能有其他细胞内参数参与促成杂交双链的热动力、动力或结构特征。在优选的实施方案中，使用与所述外显子中的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸的连续区段结合的分子
在优选的实施方案中，包含与DMD前mRNA的外显子43、46、50-53中的任何一个的一部分互补的序列的本发明分子或寡核苷酸是这样的：所述互补部分至少是本发明寡核苷酸长度的50％，更优选至少是60％，更优选至少是70％，更优选至少是80％，更优选至少是90％或更优选至少是95％甚至更优选至少是98％和最优选高达100％。“所述外显子的一部分”优选表示至少8个核苷酸的区段。在最优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸由与本文所定义的所述外显子DMD前mRNA的一部分互补的序列组成。例如，寡核苷酸可以包含与本文所定义的所述外显子DMD前mRNA的一部分互补的序列和其他侧翼序列。在更优选的实施方案中，所述寡核苷酸的互补部分的长度至少为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸。优选地，其他侧翼序列用来修饰蛋白与所述分子或寡核苷酸的结合，或用来修饰寡核苷酸的热动力特征、更优选地用来修饰靶RNA结合亲和力。
用于本发明方法中的优选分子与选自下述核苷酸序列之一的至少8个核苷酸的连续区段结合或互补：
5’-AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG-3’(SEQIDNO:2)用于外显子43的跳跃；
5'-UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC-3’(SEQIDNO:3)用于外显子46的跳跃；
5’-GGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG-3’(SEQIDNO:4)用于外显子50的跳跃；
5'-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUAC-3’(SEQIDNO:5)用于外显子51的跳跃；
5’-AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3’(SEQIDNO:6)用于外显子52的跳跃；以及
5’-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG-3’(SEQIDNO:7)用于外显子53的跳跃.
在理论上可以制备的与所述外显子之一中通过SEQIDNO2-7所定义的连续核苷酸区段结合的多种分子之中，本发明提供了可以在本方法中使用的用于有效跳跃外显子43、外显子46和/或外显子50-53中至少一个的不同的分子。尽管跳跃效应可以针对所述区段中相对高密度的推定的SR蛋白结合位点，但是可能有其他参数参与促成所述分子或其他分子的摄取，细胞内参数例如杂交双链的热动力、动力或结构特征。
发现与包括在SEQIDNO2-7中任一个的连续区段或组成SEQIDNO2-7中任一个的连续区段结合的分子分别导致被提供该分子的细胞和/或患者中外显子43、外显子46和/或外显子50-53的高效跳跃。因此，在优选的实施方案中，提供了这样的方法：其中分子与SEQIDNO2-7中至少8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸的连续区段结合。
在用于诱导和/或促进跳跃外显子43、外显子46和/或外显子50-53中任一个的优选实施方案中，本发明提供的分子包含反义核苷酸序列或由其组成，所述反义核苷酸序列选自表1-6中任一个所述的反义核苷酸序列。本发明分子优选包含SEQIDNO16、SEQIDNO65、SEQIDNO70、SEQIDNO91、SEQIDNO110、SEQIDNO117、SEQIDNO127、SEQIDNO165、SEQIDNO166、SEQIDNO167、SEQIDNO246、SEQIDNO299、SEQIDNO:357的反义核苷酸序列或由SEQIDNO16、SEQIDNO65、SEQIDNO70、SEQIDNO91、SEQIDNO110、SEQIDNO117、SEQIDNO127、SEQIDNO165、SEQIDNO166、SEQIDNO167、SEQIDNO246、SEQIDNO299、SEQIDNO:357的反义核苷酸序列组成。
本发明的优选分子包含8-50个核苷酸或碱基的核苷酸类或核苷酸或反义寡核苷酸序列，更优选10-50个核苷酸，更优选20-40个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，例如20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、26个核苷酸、27个核苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸、30个核苷酸、31个核苷酸、32个核苷酸、33个核苷酸、34个核苷酸、35个核苷酸、36个核苷酸、37个核苷酸、38个核苷酸、39个核苷酸、40个核苷酸、41个核苷酸、42个核苷酸、43个核苷酸、44个核苷酸、45个核苷酸、46个核苷酸、47个核苷酸、48个核苷酸、49个核苷酸或50个核苷酸。本发明的最优选分子包含25个核苷酸的核苷酸类序列。
此外，所示的序列没有一个源自剪接点的保守部分。因此，所述分子不可能介导来自DMD前mRNA的其他外显子或来自其他基因的外显子的差异剪接。
在一个实施方案中，本发明的分子是与确定序列结合的化合物分子，或者是已经被修饰得能与DMD前RNA分子上的对应核苷酸序列结合的诸如RNA结合蛋白或非天然的锌指蛋白的蛋白。用于筛查与特定核苷酸序列结合的化合物分子的方法例如在PCT/NL01/00697和美国专利第6,875,736号中公开，通过引用将二者并入本文。用于设计与特定核苷酸序列结合的RNA结合锌指蛋白的方法在FriesenandDarby,NatureStructuralBiology5:543-546(1998)中公开，通过引用将其并入本文。
本发明的优选分子与SEQIDNO2:5’-AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG-3’序列的至少一部分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子43中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQIDNO8-SEQIDNO69的反义核苷酸序列或由SEQIDNO8-SEQIDNO69的反义核苷酸序列组成。
在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO16和/或SEQIDNO65的反义核苷酸序列或由SEQIDNO16和/或SEQIDNO65的反义核苷酸序列组成。
在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO65的反义核苷酸序列或由SEQIDNO65的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD前mRNA外显子43的剪接中是非常有效的。
本发明的另一个优选分子与SEQIDNO3:5'-UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC-3’序列的至少一部分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子46中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQIDNO70-SEQIDNO122的反义核苷酸序列或由SEQIDNO70-SEQIDNO122的反义核苷酸序列组成。在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO70、SEQIDNO91、SEQIDNO110和/或SEQIDNO117的反义核苷酸序列或由SEQIDNO70、SEQIDNO91、SEQIDNO110和/或SEQIDNO117的反义核苷酸序列组成。
在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO117的反义核苷酸序列或由SEQIDNO117的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD前mRNA外显子46的剪接中是非常有效的。
本发明的另一个优选分子与SEQIDNO4:5’-GGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG-3’序列的至少一部分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子50中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQIDNO123-SEQIDNO167和/或SEQIDNO529-SEQIDNO535的反义核苷酸序列或由SEQIDNO123-SEQIDNO167和/或SEQIDNO529-SEQIDNO535的反义核苷酸序列组成
在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO127、或SEQIDNO165、或SEQIDNO166和/或SEQIDNO167的反义核苷酸序列或由SEQIDNO127、或SEQIDNO165、或SEQIDNO166和/或SEQIDNO167的反义核苷酸序列组成。
在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO127的反义核苷酸序列或由SEQIDNO127的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD前mRNA外显子50的剪接中是非常有效的。
本发明的另一个优选分子与SEQIDNO5:5'-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUAC-3’序列的至少一部分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子51中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQIDNO168-SEQIDNO241的反义核苷酸序列或由SEQIDNO168-SEQIDNO241的反义核苷酸序列组成。
本发明的另一个优选分子与SEQIDNO6:5’-AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3’序列的至少一部分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子52中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQIDNO242-SEQIDNO310的反义核苷酸序列或由SEQIDNO242-SEQIDNO310的反义核苷酸序列组成。在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO246和/或SEQIDNO299的反义核苷酸序列或由SEQIDNO246和/或SEQIDNO299的反义核苷酸序列组成。在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO299的反义核苷酸序列或由SEQIDNO299的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD前mRNA外显子52的剪接中是非常有效的。
本发明的另一个优选分子与SEQIDNO7:5’-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG-3’序列的至少一部分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子53中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQIDNO311-SEQIDNO358的反义核苷酸序列或由SEQIDNO311-SEQIDNO358的反义核苷酸序列组成。
在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQIDNO357的反义核苷酸序列或由SEQIDNO357的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD前mRNA外显子53的剪接中是非常有效的。
本发明分子的核苷酸序列可以包含RNA残基、一个或多个DNA残基和/或一个或多个核苷酸类似物或等同物，这将在下文进一步详述。
优选地，本发明分子包含一个或多个被修饰的残基，以增加核酸酶抗性和/或增加反义核苷酸与靶序列的亲和力。因此，在优选的实施方案中，所述反义核苷酸序列包含至少一个核苷酸类似物或等同物，其中将核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰碱基和/或具有修饰主链和/或具有非天然核苷间连接或这些修饰的组合的残基。
在优选的实施方案中，所述核苷酸类似物或等同物包含修饰的主链。这类主链的实例通过下述修饰提供：吗啉代主链、氨基甲酸酯主链、硅氧烷主链、硫化、亚砜和砜主链、甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基主链、亚甲基甲酰乙酰基(methyleneformacetyl)主链、乙酰核糖主链、含有烯烃的主链、氨基磺酸、磺酸和磺胺主链、亚甲基亚胺和亚甲基肼主链，以及氨基主链。磷酰二胺吗啉代寡聚物是之前已被证实为反义试剂的修饰的主链寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电的主链，其中DNA的脱氧核糖由六元环取代，且磷酸二酯连接由磷酰二胺连接取代。吗啉代寡核苷酸对酶降解是抗性的，并且似乎是通过阻止翻译或干扰前mRNA剪接而非通过激活RNaseH而发挥反义试剂的功能。通过物理破坏细胞膜的方法已成功地将吗啉代寡核苷酸递送至组织培养细胞中，并且一项比较数种这些方法的研究发现划痕标记是最有效的递送方法；然而，由于吗啉代主链不带电，阳离子脂质不是吗啉代寡核苷酸摄入细胞中的有效介导物。一项最近的报道表明吗啉代寡核苷酸形成三螺旋，并且由于非离子型主链，这些研究表明在不存在镁的条件下，吗啉代寡核苷酸能形成三螺旋。
优选地，主链残基之间的连接不包含磷原子，例如通过短链烷基或环烷基核苷间连接形成的连接、混合的杂原子和烷基或环烷基的核苷间连接或一个或多个短链杂原子或杂环的核苷间连接。
优选的核苷酸类似物或等同物包括具有修饰的聚酰胺主链的肽核酸(PNA)(Nielsen,etal.(1991)Science254,1497-1500)。基于PNA的分子就碱基对识别而言是真正的DNA分子模拟物。PNA的主链由通过肽键连接的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成，其中核苷碱基通过亚甲羰键与主链连接。可选的主链包含一碳延伸的吡咯烷PNA单体(GovindarajuandKumar(2005)Chem.Commun,495–497)。由于PNA分子的主链包含不带电的磷酸基，因此PNA-RNA杂合体通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂合体更稳定(Egholmetal(1993)Nature365,566-568)。
更优选的主链包括吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由六元吗啉环取代。最优选的核苷酸类似物或等同物包括磷酸二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)，其中核糖或脱氧核糖由六元吗啉环取代，并且邻近的吗啉环之间的阴离子磷酸二酯连接由非离子的磷二酰胺连接取代。
在另一个实施方案中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯连接的一个非桥氧的取代。该修饰轻微地使碱基对不稳定，但是显著增加了对核酸酶降解的抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包含硫代磷酸，手性硫代磷酸，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨烷基磷酸三酯，H-磷酸酯，包括3'-烃基亚磷酸酯、5'-烃基亚磷酸酯和手性磷酸酯的甲基和其他烷基磷酸酯，亚膦酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯，硫羰氨基磷酸酯，硫羰烷基磷酸酯，硫羰烷基磷酸三酯，硒磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)。
本发明的另一个优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个糖部分，其在2'、3'和/或5'位置处单取代或双取代，例如-OH；-F；取代的或非取代的、线性的或分支的低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基、芳基或芳烷基，以上基团可以由一个或多个杂原子打断；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；-氨基氧；甲乙氧基；-二甲氨基乙氧基；以及-二甲氨基乙烯乙氧基。所述糖部分可以是吡喃糖或吡喃糖衍生物、或脱氧吡喃糖或脱氧吡喃糖衍生物、优选是核糖或核糖衍生物、或脱氧核糖或脱氧核糖衍生物。这类优选的衍生化的糖部分包括锁核酸(LNA)，其中2'-碳原子与糖环的3'或4'碳原子连接，因而形成双环糖部分。优选的LNA包括2'-O,4'-C-乙烯-桥核酸(Moritaetal.2001.NucleicAcidResSupplementNo.1:241-242)。这些取代使得核苷酸类似物或等同物耐受RNaseH和核酸酶，并增加了对靶RNA的亲和力。
本领域技术人员应当理解，没有必要均匀地修饰反义寡核苷酸中的所有位置。此外，可以将多于一个前述类似物或等同物并入单反义寡核苷酸中，或甚至并入反义寡核苷酸的单一位置中。在某些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有至少两种不同类型的类似物或等同物。
本发明优选的反义寡核苷酸包含2’-O烷基磷硫酰反义寡核苷酸，例如2'-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2'-O-乙基修饰的核糖、2'-O-丙基修饰的核糖和/或这些修饰的取代衍生物，例如卤代衍生物。本发明最优选的反义寡核苷酸包含2’-O-甲基磷硫酰核糖。
可将本发明分子的功能性等同物定义为本文所定义的寡核苷酸，其中至少在一定程度上保留了所述功能性等同物的活性。优选地，所述功能性等同物的活性是诱导外显子43、46、50、51、52或53跳跃，并提供功能性抗肌萎缩蛋白。因此优选地，通过检测外显子43、46、50、51、52或53跳跃并通过确定功能性抗肌萎缩蛋白的数量来评价所述功能性等同物的所述活性。本文优选将功能性抗肌萎缩蛋白定义为能与肌动蛋白和DGC蛋白复合物成员结合的抗肌萎缩蛋白。对寡核苷酸所述活性的评价优选通过RT-PCR或免疫荧光或Western印迹分析来进行。优选至少在一定程度上保留所述活性，此时，它表现出功能性等同物来源的所述寡核苷酸相应活性的至少50％、或至少60％、或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或更高。遍及在本申请，当使用词语寡核苷酸时，它可以由本文所定义的其功能性等同物代替。
本领域技术人员应当理解，可以将不同的反义寡核苷酸组合，用于有效地跳跃人DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和/或外显子53中任何一个。本发明包括使用一个、两个、三个、四个、五个或更多个寡核苷酸用于跳跃所述外显子之一(即外显子43、46、50、51、52或53)。还包括使用至少两个寡核苷酸用于跳跃至少两个所述外显子。优选跳跃两个所述外显子。更优选地，这两个外显子是：
-43和51，或
-43和53，或
-50和51，或
-51和52，或
-52和53。
本领域技术人员会知道，根据DMD或BMD患者中存在突变的类型、数量和位置，跳跃外显子的哪种组合是优选的。
可以将反义寡核苷酸与增强所述反义寡核苷酸摄入细胞中，优选肌细胞中的部分连接。这些部分的实例是胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、细胞穿透肽(包括但不限于触角足突变蛋白(antennapedia)、TAT、transportan以及诸如寡精氨酸、聚精氨酸、寡赖氨酸或聚赖氨酸的带正电荷氨基酸)、诸如由抗体提供的抗原结合结构域、抗体的Fab片段、或诸如骆驼状单结构域抗原结合结构域的单链抗原结合结构域。
优选的反义寡核苷酸包含肽连接的PMO。
当系统性递送时，包含本发明一个或多个核苷酸类似物或等同物的优选反义寡核苷酸调节一个或多个包括心肌细胞在内的肌细胞中的剪接。在本方面中，包含特定核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸的系统性递送可能导致靶向肌细胞的子集，而包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸可能导致靶向肌细胞的不同子集。因此，在一个实施方案中，优选使用包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸组合来诱导人DMD前mRNA的外显子43、46、50、51、52或53跳跃。
通过基于腺病毒或腺相关病毒的载体所提供的质粒来源的反义寡核苷酸表达或病毒表达可以将能干扰必需序列的分子提供给细胞，这导致高效跳跃人DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52或外显子53。在优选的实施方案中，提供了基于病毒的表达载体，其包含驱动本文所示分子表达的表达盒。表达优选由诸如U1、U6或U7RNA启动子的聚合酶III启动子驱动。通过提供水性溶液中的质粒可以将所述质粒提供给肌细胞或生肌细胞，用于反义寡核苷酸表达。可选择地，可以通过使用已知转染药剂的转染来提供质粒，例如LipofectAMINETM2000(Invitrogen)或聚乙烯亚胺(PEI；ExGen500(MBIFermentas))或它们的衍生物。
一个优选的反义寡核苷酸表达系统是基于腺病毒相联病毒(AAV)的载体。已经开发出可以用于小反义核苷酸序列高效表达的基于单链和双链AAV的载体，用于高效跳跃DMD前mRNA的外显子43、46、50、51、52或53。
优选的基于AAV的载体包含由聚合酶III-启动子(PolIII)驱动的表达盒。优选的PolIII启动子例如是U1、U6或U7RNA启动子。
因此，本发明还提供了基于病毒的载体，其包含用于表达本发明的一个或多个反义序列的PolIII-启动子驱动的表达盒，用于诱导人DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52或外显子53跳跃。
药物组合物
如果需要，通过添加药物可接受的载体可以将本发明的分子或表达反义寡核苷酸的载体并入药学上有活性的混合物或组合物中。
因此，另一方面，本发明提供了组合物，优选药物组合物，所述药物组合物包含含有本发明的反义寡核苷酸的分子和/或表达本发明反义序列的基于病毒的载体分子和药物可接受的载体。
优选的药物组合物包含本文所定义的分子和/或本文所定义的载体，以及药物可接受的载体或赋形剂，所述药物可接受的载体或赋形剂与能诱导DMD前mRNA的外显子6、7、11、17、19、21、43、44、45、50、51、52、53、55、57、59、62、63、65、66、69或75跳跃的本文所定义的分子和/或载体任意组合。能诱导任何这些外显子跳跃的优选分子显示在表1-7的任一个中。
优选的赋形剂包括能形成递送本文所定义的这类分子的复合物、介质和/或脂质体的赋形剂，优选将寡核苷酸复合在或捕获在囊泡或脂质体中通过细胞膜。这些赋形剂中许多是本领域内已知的。合适的赋形剂包括聚乙醇胺和衍生物、或包括聚丙烯亚胺或聚乙醇胺共聚物(PEC)和衍生物在内的相似的阳离子聚合物、ExGen500、合成的两性物(SAINT-18)、lipofectinTM、DOTAP和/或能自我组装成颗粒的病毒衣壳蛋白，所述颗粒可以将这类分子，优选本文所定义的寡核苷酸递送至细胞，优选肌细胞。这种赋形剂已经表现出有效地将(寡核苷酸，例如反义)核酸递送至包括肌细胞在内的大量培养细胞中。它们的高转染潜能与对总细胞存活的去除的低至中度的毒性结合。可以利用结构修饰的便利来对它们其他的(体内)核酸转移特征或毒性进行进一步的修饰和分析。
Lipofectin代表脂质体转染试剂的实例。它由两种脂质组分组成，阳离子脂质N-[1-(2,3二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵基氯化物(DOTMA)(化学纯(cp.)，DOTAP，其是甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组递送系统是聚合纳米颗粒。
聚阳离子，例如公知的作为DNA转染试剂的二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖，可以与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)结合，以配制成能将本文所定义的分子或化合物，优选寡核苷酸穿过细胞膜递送入细胞中的阳离子纳米颗粒。
除了这些常用的纳米颗粒材料之外，阳离子肽鱼精蛋白为将本文所定义化合物，优选的寡核苷酸配制成胶体提供了可选的方式。该胶状纳米颗粒系统可通过简单的自我组装过程形成所谓的微粒(proticles)，以包装和介导本文所定义的化合物，优选寡核苷酸的细胞内释放。本领域技术人员可选择和修改任何上述的或其他可商购的可选择的赋形剂和递送系统，来包装和递送本文所定义的化合物，优选寡核苷酸，用于在本发明中递送治疗人杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的所述化合物。
此外，可以将本文所定义的化合物，优选寡核苷酸与特别设计的促进摄入细胞、细胞质和/或它的核的靶向配基共价或非共价连接。这类配基可以包括(i)识别细胞、组织或器官特异性元件促进细胞摄取的化合物(包括但不限于肽(-样)结构)和/或(ii)能促进本文所定义的化合物的细胞摄取和/或细胞内释放的化合物，优选从诸如内涵体或溶酶体的囊泡释放寡核苷酸。
因此，在优选的实施方案中，将本文所定义的化合物，优选寡核苷酸配制在药物中，所述药物提供有至少一种用于递送的赋形剂和/或靶向配基和/或将所述化合物递送至细胞和/或增强它的细胞内递送的递送装置。因此，本发明还包括药学上可接受的组合物，其包含本文所定义的化合物，优选寡核苷酸且还包含至少一种用于递送的赋形剂和/或靶向配基和/或将所述化合物递送至细胞和/或增强它的细胞内递送的递送装置。应当理解，不可以将分子或化合物或寡核苷酸配制在一种单一的组合物或制剂中。根据它们的特性，本领域技术人员会了解对于每种化合物哪种类型的剂型是最合适的。
在优选的实施方案中，使用的本文所定义的分子或寡核苷酸的浓度范围为0.1nM-1□M。更优选地，所用的浓度范围为0.3-400nM，更优选1-200nM。可以以范围为0.1-20mg/kg的剂量使用本文所定义的分子或寡核苷酸，优选0.5-10mg/kg。如果使用数种分子或寡核苷酸，这些浓度可以指寡核苷酸的总浓度或每种寡核苷酸的浓度。如上文给出的寡核苷酸浓度的范围是体外或离体使用的优选浓度。本领域技术人员应当理解，根据所用的寡核苷酸、待处理的靶细胞、基因靶标和它的表达水平、所用的培养基以及转染与孵育条件、所用的寡核苷酸浓度可以进一步改变，并且需要进一步的优化。
更优选地，用于在发明中预防、治疗DMD或BMD的化合物，优选寡核苷酸是通过合成产生的，并且以配制在药学可接受的组合物或制剂中的形式直接给予细胞、组织、器官和/或患者。药物组合物至个体的递送优选通过一种或多种肠胃外注射实施，例如静脉内给药和/或皮下给药和/或肌内给药和/或膜内给药和/或心室内给药，优选在人体的一个或多个位点注射。
当系统性递送时，任选地包含本发明的一种或多种核苷酸类似物或等同物的本文所定义的优选寡核苷酸调节一个或多个包括心肌细胞在内的肌细胞中的剪接。本方面中，包含特定核苷酸类似物或等同物的寡核苷酸的系统性递送可能导致靶向肌细胞的子集，在本方面中，包含特定核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸的系统性递送可能导致靶向肌细胞的子集，而包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸可能导致靶向肌细胞的不同子集。
在本方面中，包含特定核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸的系统性递送可能导致靶向肌细胞的子集，而包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸可能导致靶向肌细胞的不同子集。因此，在本实施方案中，优选使用包含不同核苷酸类似物或等同物的寡核苷酸组合来调节至少一类肌细胞中的DMDmRNA的剪接。
在优选的实施方案中，提供了用作药物的分子或基于病毒的载体，优选用于调节DMD前mRNA的剪接，更优选用于促进或诱导本文所示的外显子43、46、50-53中任一个的跳跃。
用途
另一方面，本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或分子和/或表达本发明一段或多段反义序列的基于病毒的载体和/或药物组合物在调节DMD前mRNA剪接中的用途。优选在体外人生肌细胞或肌细胞中调节所述剪接。更优选的是在体内人肌细胞中调节剪接。因此，本发明还涉及本文所定义的分子和/或本文所定义的载体和/或本文所定义的药物组合物在调节DMD前mRNA剪接中的作用或在制备用于治疗DMD或BMD患者的药物中的用途。
在本文及其权利要求书中，动词“包含”与它的同源词用的是它的非限制性意义，表示包括紧接着该词的项目但并不排除未具体提到的项目。此外，动词“由…组成”可以用“基本上由…组成”取代，表示本文所定义的分子或基于病毒的载体或组合物可以包括具体指出的组分之外的其他组分，所述其他组分不会改变本发明的特有特征。此外，由不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”提及的元件不排除存在多于一个所述元件的可能性，除非文中明确指出有且只有一个所述元件。因此，不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”通常表示“至少一个”。
可以将本文所示的每个实施方案组合起来，除非另有所指。通过引用将本说明书所引用的所有专利和参考文献整体并入本文。
下面提供的实施例仅为说明性目的，并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-4
材料和方法
(部分地)基于通过m-fold程序所预测的靶外显子RNA的重叠开放的二级结构，(部分地)基于通过ESE-finder软件所预测的重叠潜在的SR-蛋白结合位点来设计AON。AON由ProsensaTherapeuticsB.V.(Leiden,Netherlands)合成，且包含2’-O-甲基RNA和全长磷硫酰(PS)主链。
组织培养、转染和RT-PCR分析
如前述处理来自健康个体(“人对照”)(实施例1、3和4；外显子43、50、52跳跃)或携带外显子45缺失的DMD患者(实施例2；外显子46跳跃)的肌管培养物(Aartsma-Rusetal.,Neuromuscul.Disord.2002；12:S71-77以及HumMolGenet2003；12(8):907-14)。为了筛查AON，用50nM和150nM(实施例2)、200nM和500nM(实施例4)或只有500nM(实施例1和3)的每种AON转染肌管培养物。使用转染试剂UNIFectylin(ProsensaTherapeuticsBV,Netherlands)，每□gAON加2□lUNIFectylin。通过用靶向外显子(43、46、50、51、52或53)侧翼外显子中引物的巢式RT-PCR分析来确定外显子跳跃效率。从琼脂糖凝胶分离PCR片段用于序列确认。为了定量，使用Agilent2100生物分析仪(AgilentTechnologies,USA)上的DNA1000LabChipsKit分析PCR产物。
结果
DMD外显子43跳跃。
设计靶向外显子43序列的一系列AON，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQIDNO2的外显子43中连续核苷酸区段的几乎所有的AON都确实能诱导外显子43跳跃。如图1所示，PS237(SEQIDNO:65)在500nM时可重复地诱导外显子43跳跃的最高水平(高达66％)。为了比较，还显示了PS238和PS240，诱导外显子43跳跃的水平分别高达13％和36％(图1)。通过对新的更小的转录本片段的序列分析来确认外显子43的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显子43跳跃。
DMD外显子46跳跃。
设计靶向外显子46序列的一系列AON，并转染进来自DMD基因中携带外显子45缺失的DMD患者的肌管培养物中。对于携带这类突变的患者，反义诱导的外显子46跳跃将诱导确实可以缓解所述疾病的一种或多种症状的新的BMD-样抗肌萎缩蛋白的合成。随后对分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQIDNO3的外显子46中连续核苷酸区段的几乎所有的AON都确实能诱导外显子46跳跃，甚至在50nM的相对低的AON浓度时。如图2所示，PS182(SEQIDNO:117)可重复地诱导外显子46跳跃的最高水平(在50nM时高达50％且在150nM时高达74％)。为了比较，还显示了PS177、PS179和PS181，在150nM时诱导外显子46跳跃的水平分别高达55％、58％和42％(图2)。通过对新的更小的转录本片段的序列分析来确认外显子46的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显子46跳跃。
DMD外显子50跳跃。
设计靶向外显子50序列的一系列AON，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQIDNO4的外显子50中连续核苷酸区段的几乎所有的AON都确实能诱导外显子50跳跃。如图3所示，PS248(SEQIDNO:127)可重复地诱导外显子50跳跃的最高水平(在500nM时高达35％)。为了比较，还显示了PS245、PS246和PS247，在500nM时诱导外显子50跳跃水平高达14-16％(图3)。通过对新的更小的转录本片段的序列分析来确认外显子50的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显子50跳跃。
DMD外显子51跳跃。
设计靶向外显子51序列的一系列AON，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQIDNO5的外显子51中连续核苷酸区段的几乎所有的AON都确实能诱导外显子51跳跃。SEQIDNO180的AON可重复地诱导外显子51跳跃的最高水平(未示出)。
DMD外显子52跳跃。
设计靶向外显子52序列的一系列AON，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQIDNO6的外显子52中连续核苷酸区段的几乎所有的AON都确实能诱导外显子52跳跃。如图4所示，PS236(SEQIDNO:299)可重复地诱导外显子52跳跃的最高水平(在200nM时高达88％且在500nM时高达91％)。为了比较，还显示了PS232和AON52-1(之前由Aartsma-Rusetal.公开，寡核苷酸2005)，当以500nM施用时，诱导外显子52跳跃水平分别高达59％和10％(图4)。通过对新的更小的转录本片段的序列分析来确认外显子52的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显子52跳跃。
DMD外显子53跳跃。
设计靶向外显子53序列的一系列AON，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQIDNO7的外显子53中连续核苷酸区段的几乎所有的AON都确实能诱导外显子53跳跃。SEQIDNO328的AON可重复地诱导外显子53跳跃的最高水平(未示出)。
序列表：
DMD基因氨基酸序列
SEQIDNO1:
MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETVTTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVDSEIRKRLDVDITELHSWITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEKVNAIEREKAEKFRKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQNNIIAFYNQLQQLEQMTTTAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSGLQPQIERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTNHFKQVFSDVQAREKELQTIFDTLPPMRYQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQSGLYYLSTTVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQNHIQTLKKWMAEVDVFLKEEWPALGDSEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEGGQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQWDHMCQQVYARKEALKGGLEKTVSLQKDLSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTESVNSVIAQAPPVAQEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSYLEKANKWLNEVEFKLKTTENIPGGAEEISEVLDSLENLMRHSEDNPNQIRILAQTLTDGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKSLHLIQESLTFIDKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQIDVAQKKLQDVSMKFRLFQKPANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVVQSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQKKQTENPKELDERVTALKLHYNELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMPSNLDSEVAWGKATQKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAVTSRAEEWLNLLLEYQKHMETFDQNVDHITKWIIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLKRLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANRGDHCRKLVEPQISELNHRFAAISHRIKTGKASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQRGDNLQQRITDERKREEIKIKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEIDRELQKKKEELNAVRRQAEGLSEDGAAMAVEPTQIQLSKRWREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQKNILSEFQRDLNEFVLWLEEADNIASIPLEPGKEQQLKEKLEQVKLLVEELPLRQGILKQLNETGGPVLVSAPISPEEQDKLENKLKQTNLQWIKVSRALPEKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLEEQLNHLLLWLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFDVQETEIAVQAKQPDVEEILSKGQHLYKEKPATQPVKRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPALADFNRAWTELTDWLSLLDQVIKSQRVMVGDLEDINEMIIKQKATMQDLEQRRPQLEELITAAQNLKNKTSNQEARTIITDRIERIQNQWDEVQEHLQNRRQQLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESWKEGPYTVDAIQKKITETKQLAKDLRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENINASWRSIHKRVSEREAALEETHRLLQQFPLDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQWQDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDAVLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPSTSLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTM
SEQIDNO2(外显子43):
AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG
SEQIDNO3(外显子46):
UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC
SEQIDNO4(外显子50):
GGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG
SEQIDNO5(外显子51):
CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUC
UCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUAC
SEQIDNO6(外显子52):
AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU
SEQIDNO7(外显子53):
AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG
表1:用于跳跃DMD基因外显子43的寡核苷酸
表2:用于跳跃DMD基因外显子46的寡核苷酸
表3:用于跳跃DMD基因外显子50的寡核苷酸
表4:用于跳跃DMD基因外显子51的寡核苷酸
表5:用于跳跃DMD基因外显子52的寡核苷酸
表6:用于跳跃DMD基因外显子53的寡核苷酸
表7:用于跳跃示出的DMD基因其他外显子的寡核苷酸
附图说明
图1.在人对照肌管中，在500nM检验靶向外显子43的一系列AON(PS237、PS238和PS240；分别为SEQIDNO65、66、16)。PS237(SEQIDNO65)可重复地诱导外显子43跳跃的最高水平(M：DNA大小标志物；NT：未处理的细胞)。
图2.在来自外显子45缺失的DMD患者的肌管中，在两种不同浓度(50和150nM)检验靶向外显子46的一系列AON(PS177、PS179、PS181和PS182；分别为SEQIDNO91、70、110和117)。PS182(SEQIDNO117)可重复地诱导外显子46跳跃的最高水平(M：DNA大小标志物)。
图3.在人对照肌管中，在500nM检验靶向外显子50的一系列AON(PS245、PS246、PS247和PS248；分别为SEQIDNO167、165、166和127)。PS248(SEQIDNO127)可重复地诱导外显子50跳跃的最高水平(M：DNA大小标志物；NT：未处理的细胞)。
图4.在人对照肌管中，在两种不同浓度(200和500nM)检验靶向外显子52的两个新的AON(PS232和PS236；分别为SEQIDNO246和299)，并直接与以前描述的AON(52-1)进行比较。PS236(SEQIDNO299)可重复地诱导外显子52跳跃的最高水平(M：DNA大小标志物；NT：未处理的细胞)。

Claims (11)

1.分子，所述分子与选自以下核苷酸序列之一中的至少8个核苷酸的连续区段结合：
用于外显子50的跳跃的
5’-GGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGC
AAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG-3’(SEQIDNO:4)；
用于外显子43的跳跃的
5’AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG-3’(SEQIDNO:2)；
用于外显子46的跳跃的
5'UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC-3’(SEQIDNO:3)；
用于外显子51的跳跃的
5'CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUAC-3’(SEQIDNO:5)；
用于外显子52的跳跃的
5’AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3’(SEQIDNO:6)；以及
用于外显子53的跳跃的
5’AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG-3’(SEQIDNO:7)。
2.如权利要求1所述的分子，其中所述分子包含选自表1-6中所示的SEQIDNO:8-358和/或SEQIDNO529-535的反义核苷酸序列或由选自表1-6中所示的SEQIDNO:8-358和/或SEQIDNO529-535的反义核苷酸序列组成。
3.如权利要求2所述的分子，其中所述分子包含选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:65、SEQIDNO:70、SEQIDNO:91、SEQIDNO:110、SEQIDNO:117、SEQIDNO:127、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:246、SEQIDNO:299和SEQIDNO:357的反义核苷酸序列或由选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:65、SEQIDNO:70、SEQIDNO:91、SEQIDNO:110、SEQIDNO:117、SEQIDNO:127、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:246、SEQIDNO:299和SEQIDNO:357的反义核苷酸序列组成。
4.如权利要求1-2任一项所述的分子，其包含2’-O-烷基磷硫酰反义寡核苷酸。
5.如权利要求4所述的分子，其包含2’-O甲基磷硫酰核糖。
6.基于病毒的载体，其包含驱动权利要求1-5中任一项所定义的分子表达的表达盒。
7.用作药物的权利要求1-5中的任一项所述的分子或权利要求6所述的基于病毒的载体，其优选用于调节DMD或BMD患者的DMD前mRNA的剪接或用于治疗DMD或BMD患者。
8.药物组合物，包含权利要求1-5中任一项所定义的分子和/或权利要求6所述的载体，药物可接受的载体，并且任选地与能诱导或促进患者DMD前mRNA的外显子6、7、11、17、19、21、43、44、45、50-53、55、57、59、62、63、65、66、69或75中至少一个的跳跃的分子组合。
9.用于诱导和/或促进患者中，优选患者分离的细胞中DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外显子50-53中至少一个的跳跃的方法，所述方法包括向所述细胞和/或所述患者提供权利要求1-5中任一项所述的分子或权利要求6所述的载体。
10.如权利要求9所述的方法，其中使用能诱导或促进患者DMD前mRNA的外显子6、7、11、17、19、21、43、44、45、50-53、55、57、59、62、63、65、66、69或75中至少一个的跳跃的其他分子。
11.权利要求1-5中任一项所述的分子、权利要求6所述的载体或权利要求8所述的药物组合物在调节DMD前mRNA的剪接中的用途或制备用于治疗DMD或BMD患者的药物中的用途。
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