CN109486813A - 一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用 - Google Patents

一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于修复TPP1基因剪接异常的U1‑snRNA以及含有表达U1‑snRNA的碱基序列的载体，其中，表达所述U1‑snRNA的碱基序列依次包括U1‑snRNA起始碱基、与TPP1基因Exon12剪接供体位点或下游内含子序列靶向互补的序列以及一段U1‑snRNA下游序列，U1‑snRNA下游序列如SEQ ID NO.20所示。本发明的U1‑snRNA来源于针对TPP1基因剪接供体位点或剪接供体位点下游内含子序列而制备的核酸分子；应用U1‑snRNA技术，用靶向目标基因的U1‑snRNA作为靶向药物，在Pre‑mRNA的剪接过程进行修复，从而有效抑制剪接位点突变导致的异常mRNA表达。具有特异性强，高效，副作用小的优点，且能弥补目前治疗异常剪接所致疾病的治疗手段不足，在不久的将来可能成为一种治疗特定类型疾病的新方法。

Description

一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其 应用
技术领域
本发明涉及基因修复技术领域，尤其是一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用。
背景技术
已有研究通过对全基因组数据和细胞系数据进行大量分析，发现Pre-mRNA(mRNA前体)剪接可以将突变与疾病关联在一起。大量的突变被发现通过影响Pre-mRNA剪接而对神经系统疾病，如杜氏肌营养不良症(DMD)和多发性硬化症等疾病进行基因调节。剪接位点突变大约占与疾病相关总突变数的10％，Pre-mRNA剪接在疾病发生中的作用需要重视。
神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinosis,NCLs)是一组不同类型的溶酶体储存障碍疾病，是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，大约每十万新生儿中有2－4例。晚发婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积症(late infantile neuronalceroid lipofuscinosis,LINCL)是NCLs的一种常见类型，由TPP1/CLN2基因突变导致三肽氨基肽酶1(TPP1)活性缺乏引起。在缺乏TPP1时，原本应由该酶分解代谢的溶酶体储存物蓄积在多个器官之中，尤其在大脑和视网膜。这些储存物在神经系统细胞中的蓄积导致持续进行性的神经退行性变，其表现为认知、运动和视觉功能的丧失。该病进展迅速，症状常于2－4之间产生。患者最初表现为语言延迟和癫痫，随后出现活动障碍、运动退化、痴呆和失明。在该病的晚期，进食和完成日常所需变得非常困难，死亡通常发生在8-12岁。
在LINCL患者中检测出TPP1基因的剪接位点突变(c.1551+1G>A，表示编码碱基1551后的第一个内含子碱基G突变为A)，该突变引起第12号外显子丢失，影响了该酶的功能。在另一个LINCL患者也检测出TPP1基因剪接位点突变(c.1551+1G>T)，可见该位点为容易发生突变的位点。
在晚发婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积症中发现TPP1基因剪接异常，目前的治疗方案是酶替代疗法，它的活性成分(cerliponasealfa)是人类TPP1的重组形式，这正是CLN2患者所需要的。3岁和3岁以上的儿科患者，每隔一周通过脑室内输注一次，推荐剂量为300mg，之后进行电解质输注。输注TPP1重组酶的完整过程，包括了所需的脑室内电解质输注，持续约4.5个小时。为避免过敏反应建议在开始输液前30-60分钟，先施用抗组胺药物或皮质类固醇。
在临床试验中，酶替代疗法的疗效得到了验证，但尚未建立3岁以下患者使用酶替代疗法的安全性和有效性。同时，FDA也公布了一些常见的不良反应，比如发烧、呕吐等。该疗法注射重组酶到患者脑室需要进行手术,由于有创伤性，副作用大，且价格非常昂贵。
随着RNA技术的迅猛发展，为RNA异常剪接导致的疾病，尤其是晚发婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积症开辟了新的治疗途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗方向。该技术通过用U1小核snRNA(U1-small nuclear RNA，U1-snRNA)修复特定靶基因的表达以达到治疗疾病的目的，是基因治疗的重要组成部分。5'剪接位点(splicing site，ss)能被U1-snRNA识别，U1-snRNA的5'端与互补的5'ss位点序列相互作用可以启动剪接。5'ss由9个碱基序列CAG/GURAGU组成，R是嘌呤碱基。通过人工定点突变获得靶向结合5'ss以及下游内含子序列的U1-snRNA，可以用来修复5'ss突变，作为基因治疗的新方案。然而针对5'ss+1位点突变所致异常剪接的修复一直是国际上的难题，尚未发现较高修复效率的报道。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，而提供一种可修复TPP1基因剪接异常的U1-snRNA。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了一种用于修复TPP1基因剪接异常的U1-snRNA，表达所述U1-snRNA的碱基序列，依次包括U1-snRNA起始碱基、与TPP1基因Exon12剪接供体位点或剪接供体位点下游内含子序列靶向互补的序列以及一段U1-snRNA下游序列，所述U1-snRNA下游序列如SEQ ID NO.20所示。其中，起始碱基优选为ATA；剪接供体位点优选为GATGTAAGT；剪接供体位点下游内含子序列优选SEQ ID NO.19中除剪接供体位点外的序列。
优选地，表达所述U1-snRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1～4任一碱基序列所示。其中，U1-snRNA的碱基序列仅在SEQ ID NO.1～4基础上将T替换为U即可。
在第二个方面，本发明提供了一种DNA载体，所述载体含有能表达第一个方面的U1-snRNA的碱基序列。
优选地，所述载体为线性或环形。
优选地，所述载体含有U1启动子和U1终止子。
优选地，所述载体为环形，由第一方面的U1-snRNA片段插入到质粒pcDNA3.1(-)制得。
在第三个方面，本发明提供了第一个方面的U1-snRNA、第二个方面的载体在制备治疗神经元蜡样质脂褐素沉积症的药物中的应用。
在第四个方面，本发明提供了一种治疗神经元蜡样质脂褐素沉积症的药物，所述药物含有第一个方面的U1-snRNA、或第二个方面的DNA载体。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明的U1-snRNA来源于针对TPP1基因剪接供体位点附近的保守序列而制备的核酸分子；U1-snRNA的制备采用载体表达的方法，体外转录，化学合成法；这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好的获得剪接修复效率；应用U1-snRNA技术，用靶向目标基因的U1-snRNA作为靶向药物，在基因的剪接过程进行修复，从而有效抑制剪接位点突变导致的异常mRNA表达。具有特异性强，高效，副作用小的优点，且能弥补目前治疗异常剪接所致疾病的治疗手段不足，在不久的将来可能成为一种治疗特定类型疾病的新方法。
附图说明
图1指示特异性U1-snRNA在Exon12上结合的位置，剪接供体位点和上下游的序列已在图中列出，上游是外显子，下游是内含子；每一条线对应于特异性U1-snRNA结合于前体mRNA上的位置；
图2为U1-snRNA对TPP1基因Exon11-Exon13异常剪接修复的电泳结果图，其中，泳道1是单独转染WT型PcDNA3.1-TPP1(Exon11-Exon13)载体；
泳道2是WT型PcDNA3.1-TPP1(Exon11-Exon13)载体和ex12-WT型pcDNA3.1-U1-snRNA载体共转染；
泳道3是WT型PcDNA3.1-TPP1(Exon11-Exon13)载体和ex12-Mut型pcDNA3.1-U1-snRNA载体共转染；
泳道4是单独转染(c.1551+1G>A)Mut型PcDNA3.1-TPP1(Exon11-Exon13)载体；
泳道5-9是(c.1551+1G>A)Mut型PcDNA3.1-TPP1(Exon11-Exon13)载体分别和不同的U1-snRNA(U1 WT，ex12Mut，Cln2-1，Cln2-9和Cln2-16)表达载体共转染；
通过RT-PCR以及2％的琼脂糖凝胶电泳，对剪接产物进行分析，采用100bp DNAMarker，小的黑色框代表Exon12；
图3为柱状图，代表每组正常剪接产物的定量结果，数据是由三次独立重复实验的结果表示。
具体实施方式
本发明提供了一种用U1-snRNA技术来修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的方法，为分子靶向治疗TPP1剪接异常导致的疾病提供了一种潜在的基因治疗手段。本发明的U1-snRNA分子可以作为抗LINCL疾病的有效成分。作为该U1-snRNA的另一种表达形式，可以将其制备成DNA表达框形式，比如U1启动子--U1-snRNA--U1终止子。
为了实现本发明的设计思路和验证U1-snRNA的修复效率或疗效，采用了如下技术方案进行实施：
作为该U1-snRNA的另一种表达形式，将其制备成DNA表达框形式，比如U1启动子--U1-snRNA--U1终止子。
基于应用的目的，在一些实施例中，将U1-snRNA分子，表达U1-snRNA的DNA表达框，或者包含U1-snRNA分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上。本发明的药物剂型可以为多种形式，只要适应相应疾病的给药，并且保持U1-snRNA分子的活性即可。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉等。
在一些实施例中，本发明采用了如下技术方案：
(1)构建了针对TPP1基因的U1-snRNA，包含靶向至TPP1基因Exon12剪接供体位点或剪接供体位点下游内含子序列的多个U1-snRNA效应分子，筛选到对异常剪接具有高达93％修复效率的U1-snRNA；
(2)制备了具有相应效应的U1-snRNA表达框，其结构为U1启动子--U1-snRNA--U1终止子，使其更易于体外筛选；
(3)运用RT-PCR技术和测序，检测上述U1-snRNA表达框在细胞转录的U1-snRNA效应分子对TPP1基因异常剪接的抑制作用。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本申请中的实验方法，例如PCR、酶切、连接，RT-PCR、转染和电泳等均采用本领域通用技术。根据本说明书公开的内容，采用有限次实验即可得出与本发明相同或接近的实验结果，为节省篇幅，本发明中并未进行详细的说明。
实施例1
本发明的U1-snRNA单链分子的一种实施例，靶向作用于TPP1基因第12号外显子的剪接供体位点下游位置，该165bp单链分子对应的DNA碱基序列如ex12Mut、Cln2-1、Cln2-9或Cln2-16所示，其中，下划线示出与TPP1基因Exon12剪接供体位点或剪接供体位点下游内含子序列(如SEQ ID NO.19所示，其中包括Exon12剪接供体位点及其下游内含子序列)靶向互补的序列，ATA为与野生型TPP1基因上的碱基互补序列，以利于U1-snRNA的转录起始。转录得到的U1-snRNA单链分子，例如，U1-snRNA Cln2-16与SEQ ID NO.1相比，将T替换为U即可；相应的，U1-snRNA ex12 Mut、Cln2-9、Cln2-16的RNA序列与SEQ ID NO.2～4相比，将T替换为U即可。
ex12Mut：ATAACTTATATCGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTG(SEQ ID NO.4)
Cln2-1：ATACATACTTATGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTG(SEQ ID NO.3)
Cln2-9：ATATTCCCTTCCGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTG(SEQ ID NO.2)
Cln2-16：ATACACACCCTTGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTG(SEQ ID NO.1)
SEQ ID NO.19(黑框标记剪接供体位点序列):
SEQ ID NO.20:
GCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTG
实施例2靶向性U1-snRNA表达载体构建的方法
以人基因组DNA为模板扩增U1-snRNA片段，用NEB的Q5高保真酶PCR扩增641bp的人源U1-snRNA，其中下划线标记164bp为U1-snRNA的表达序列。U1-snRNA片段扩增引物序列为:
F:5'-TTTGGATCCGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAA-3'(SEQ ID NO.6)；
R:5'-TTTAAGCTTTTCCAAAAAACACCAACCAAGACACAAACCA-3'(SEQ ID NO.7)。
人U1-snRNA基因序列如SEQ ID NO.5所示，其中，第一处下划线为U1启动子序列，第二处下划线为U1-snRNA表达序列，第三处下划线为U1转录终止子序列:
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCTCTTGGCGACTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACT GTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCT TCGCCACGAAGGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTG TCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCACAACGTTTCATACTTACCTGGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCG AGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTG TGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTGACTTTCTGGAGTTTCAAAAACAGACTGTACGCCAAGGGTCATATCTTTTTTTGTATTGGTTTGTGTCTTGGTTGGTGTCTTAG(SEQ ID NO.5)
将上述引物扩增的PCR片段插入到pcDNA3.1(-)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间，使用BglII和XbalI双酶切去除上游的CMV启动子和T7启动子即得U1-snRNA表达载体，以免影响U1-snRNA启动子活性。
实施例3体外转录制备靶向性U1-snRNA的方法
使用北京百奥莱博科技有限公司含有T7 RNA聚合酶的U1-snRNA体外转录试剂盒进行体外转录制备。
a、制备DNA模板。
将实施例1的U1-snRNA片段插入到pcDNA3.1(-)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间，用作体外转录的模板，用BglII内切酶将载体切成线性。载体pcDNA3.1(-)-U1-snRNA片段上游存在T7启动子，可用于体外转录。
b、体外转录反应。
在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下按次序加入下列成分：2μg的DNA模板(即步骤a所得载体pcDNA3.1(-)-U1-snRNA片段)，25μl转录预配液(2×T7)，2μl T7RNA聚合酶，补Rnase-free的水到50μl。37℃保温1-2小时。70℃加热10分钟灭活T7RNA聚合酶。取1-3uL电泳检测转录效果。得到的RNA可以放-80℃保存。
c、去除DNA模板。
在体外转录体系中加入1uL自备的RNase-free DNase(3-5U/uL)。37℃保温15-30分钟。用自备的等体积(100uL)的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。加200uL微量核酸沉淀剂，振荡后15000rpm离心3-5分钟，弃上清。加入1mL 75％乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3-5分钟，弃上清。短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
另外，为了增加U1-snRNA的稳定性，可在生物公司(例如上海生工生物工程公司)合成靶向性的U1-snRNA目标片段，并对临近5’端的核糖2'位进行甲氧基修饰。
实施例4 TPP1基因Exon11-Exon13剪接分析报告载体构建的方法
以正常人和TPP1基因(c.1551+1G>A)突变LINCL患者基因组DNA为模板扩增TPP1基因Exon11-Exon13(包含11号外显子、11号内含子、12号外显子、12号内含子和13号外显子)片段，大小为775bp，扩增引物的碱基序列如下(其中，小写的碱基为酶切位点对应的碱基序列)：
F:5’-tttgaattcCTGGGTGGTCAGCAACAGAGT(SEQ ID NO.8)，
R:5’-tttaagcttCAATAGTTGAGGGTTCAGCAGG(SEQ ID NO.9)。
TPP1基因Exon11-Exon13片段的序列：
CTGGGTGGTCAGCAACAGAGTGCCCATTCCATGGGTGTCCGGAACCTCGGTGAGAATCAGCCCATCTCCAAACTCTCACTCAGGAACTACCCTTACCCCCTAACACCTTGAACACCTTGCACCTAGAACCCCTGACTCCTTAGAGATGTCTGATACTTTAAAGCATCACTCCCAAAAAGTCCAATCACTCAGAACCCCTGACCTCTACTTGCACCTTCACTCTTGTAGGCCTCTACTCCAGTGTTTGGGGGGATCCTATCCTTGATCAATGAGCACAGGATCCTTAGTGGCCGCCCCCCTCTTGGCTTTCTCAACCCAAGGCTCTACCAGCAGCATGGGGCAGGACTCTTTGATGTAAGTATGGAAGGGAAGGGTGTGGACGTTTTCAAACAACTATGGGGAGTGCTAAGGGGGACTTGGGGGCAGTTAGGGTGGTGTGGAATAGCCTTTGAAATGTGAGTACAGGGTGAGGAGATATACTCTTTAAGTACTGGTACTAGTAGGCCCAGATCTGATGCCAGCCTCCTCCCTAGGTAACCCGTGGCTGCCATGAGTCCTGTCTGGATGAAGAGGTAGAGGGCCAGGGTTTCTGCTCTGGTCCTGGCTGGGATCCTGTAACAGGCTGGGGAACACCCAACTTCCCAGCTTTGCTGAAGACTCTACTCAACCCCTGACCCTTTCCTATCAGGAGAGATGGCTTGTCCCCTGCCCTGAAGCTGGCAGTTCAGTCCCTTATTCTGCCCTGTTGGAAGCCCTGCTGAACCCTCAACTATTG(SEQ ID NO.10)
将该片段插入到pcDNA3.1(-)载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间，构建WT和Mut型PcDNA3.1-TPP1(Exon11-Exon13)剪接分析报告载体，用来检测U1-snRNA对TPP1基因pre-mRNA异常剪接的修复效率。
实施例5构建靶向性U1-snRNA表达载体的方法
以pcDNA3.1-U1-snRNA载体为模板，用NEB的Q5高保真酶进行PCR扩增，将PCR产物进行纯化回收，用宝生物工程(大连)有限公司的Blunting Kination Ligation(BKL)kit对线性PCR纯化产物自身环化和连接，PCR产物自身环化后转化DH5a感受态细胞，培养过夜后提取质粒进行酶切鉴定，通过测序确认突变成功。U1-snRNA定点突变之后可以与TPP1基因Exon12剪接供体位点或剪接供体位点下游内含子序列(除剪接供体位点序列外的SEQ IDNO.19序列)靶向互补，突变引物的碱基序列如下所示：
通用正向引物F：5'GCAGGGGAGATACCATGATCAC3'(SEQ ID NO.11)和
U1-Cln2E12WT-R:5'-GATGTAAGTtatgaAACGTTGTGCCTCTGC-3'(SEQ ID NO.12)，
U1-Cln2E12Mut-R：5'-GATaTAAGTtatgaAACGTTGTGCCTCTGC-3'(SEQ ID NO.13)，
U1-Cln2E12-1-R:5’-aTAAGTATGtatgaAACGTTGTGCCTCTGC-3'(SEQ ID NO.14)，
U1-Cln2E12-9-R:5’-GGAAGGGAAtatgaAACGTTGTGCCTCTGC-3'(SEQ ID NO.15)，
Cln2-16-R：5'-AAGGGTGTGtatgaAACGTTGTGCCTCTGC-3'(SEQ ID NO.16)，突变之后的U1-snRNA表达片段为165bp，如SEQ ID NO.1～4所示，引物中tat与ATA互补，引物中下划线碱基序列与SEQ ID NO.1～4中下划线碱基序列对应。
实施例6 U1-snRNA对异常剪接的修复效率的检测
用lip2000转染试剂将pcDNA3.1-TPP1(Exon11-Exon13)剪接分析报告载体和实施例6制备的pcDNA3.1-U1-snRNA载体转染到HEK293细胞中，用来检测U1-snRNA对异常剪接的修复效率。载体转染浓度为1μg/ml，转染后培养48小时，采用RT-PCR检测mRNA的表达情况，以证明靶向性U1-snRNA对TPP1基因c.1551+1G>A剪接位点突变的剪接修复；RT-PCR引物序列为：
F:5’-TGGGTGGTCAGCAACAGAGT(SEQ ID NO.17)和
R:5’-GATAGGAAAGGGTCAGGGGT(SEQ ID NO.18)。
结果如图2和3所示，表明U1-snRNA ex12 Mut、Cln2-1、Cln2-9和Cln2-16对异常剪接的修复效率分别为33％、85.8％、63.7％和93.3％。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学附属第二医院
<120> 一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用
<130> 2018
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atacacaccc ttgcagggga gataccatga tcacgaaggt ggttttccca gggcgaggct 60
tatccattgc actccggatg tgctgacccc tgcgatttcc ccaaatgtgg gaaactcgac 120
tgcataattt gtggtagtgg gggactgcgt tcgcgctttc ccctg 165
<210> 2
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atattccctt ccgcagggga gataccatga tcacgaaggt ggttttccca gggcgaggct 60
tatccattgc actccggatg tgctgacccc tgcgatttcc ccaaatgtgg gaaactcgac 120
tgcataattt gtggtagtgg gggactgcgt tcgcgctttc ccctg 165
<210> 3
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atacatactt atgcagggga gataccatga tcacgaaggt ggttttccca gggcgaggct 60
tatccattgc actccggatg tgctgacccc tgcgatttcc ccaaatgtgg gaaactcgac 120
tgcataattt gtggtagtgg gggactgcgt tcgcgctttc ccctg 165
<210> 4
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ataacttata tcgcagggga gataccatga tcacgaaggt ggttttccca gggcgaggct 60
tatccattgc actccggatg tgctgacccc tgcgatttcc ccaaatgtgg gaaactcgac 120
tgcataattt gtggtagtgg gggactgcgt tcgcgctttc ccctg 165
<210> 5
<211> 641
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
ctaaggacca gcttctttgg gagagaacag acgcaggggc gggagggaaa aagggagagg 60
cagacgtcac ttcctcttgg cgactctggc agcagattgg tcggttgagt ggcagaaagg 120
cagacgggga ctgggcaagg cactgtcggt gacatcacgg acagggcgac ttctatgtag 180
atgaggcagc gcagaggctg ctgcttcgcc acttgctgct tcgccacgaa gggagttccc 240
gtgccctggg agcgggttca ggaccgctga tcggaagtga gaatcccagc tgtgtgtcag 300
ggctggaaag ggctcgggag tgcgcggggc aagtgaccgt gtgtgtaaag agtgaggcgt 360
atgaggctgt gtcggggcag aggcacaacg tttcatactt acctggcagg ggagatacca 420
tgatcacgaa ggtggttttc ccagggcgag gcttatccat tgcactccgg atgtgctgac 480
ccctgcgatt tccccaaatg tgggaaactc gactgcataa tttgtggtag tgggggactg 540
cgttcgcgct ttcccctgac tttctggagt ttcaaaaaca gactgtacgc caagggtcat 600
atcttttttt gtattggttt gtgtcttggt tggtgtctta g 641
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttggatccg accagcttct ttgggagaga a 31
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tttaagcttt tccaaaaaac accaaccaag acacaaacca 40
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tttgaattcc tgggtggtca gcaacagagt 30
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttaagcttc aatagttgag ggttcagcag g 31
<210> 10
<211> 775
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
ctgggtggtc agcaacagag tgcccattcc atgggtgtcc ggaacctcgg tgagaatcag 60
cccatctcca aactctcact caggaactac ccttaccccc taacaccttg aacaccttgc 120
acctagaacc cctgactcct tagagatgtc tgatacttta aagcatcact cccaaaaagt 180
ccaatcactc agaacccctg acctctactt gcaccttcac tcttgtaggc ctctactcca 240
gtgtttgggg ggatcctatc cttgatcaat gagcacagga tccttagtgg ccgcccccct 300
cttggctttc tcaacccaag gctctaccag cagcatgggg caggactctt tgatgtaagt 360
atggaaggga agggtgtgga cgttttcaaa caactatggg gagtgctaag ggggacttgg 420
gggcagttag ggtggtgtgg aatagccttt gaaatgtgag tacagggtga ggagatatac 480
tctttaagta ctggtactag taggcccaga tctgatgcca gcctcctccc taggtaaccc 540
gtggctgcca tgagtcctgt ctggatgaag aggtagaggg ccagggtttc tgctctggtc 600
ctggctggga tcctgtaaca ggctggggaa cacccaactt cccagctttg ctgaagactc 660
tactcaaccc ctgacccttt cctatcagga gagatggctt gtcccctgcc ctgaagctgg 720
cagttcagtc ccttattctg ccctgttgga agccctgctg aaccctcaac tattg 775
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcaggggaga taccatgatc ac 22
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatgtaagtt atgaaacgtt gtgcctctgc 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gatataagtt atgaaacgtt gtgcctctgc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ataagtatgt atgaaacgtt gtgcctctgc 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggaagggaat atgaaacgtt gtgcctctgc 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aagggtgtgt atgaaacgtt gtgcctctgc 30
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgggtggtca gcaacagagt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gataggaaag ggtcaggggt 20
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
gatgtaagtatgg aagggaaggg tgtggacgtt ttcaaccaac tatgggga 51
<210> 20
<211> 153
<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
gcaggggaga taccatgatc acgaaggtgg ttttcccagg gcgaggctta tccattgcac 60
tccggatgtg ctgacccctg cgatttcccc aaatgtggga aactcgactg cataatttgt 120
ggtagtgggg gactgcgttc gcgctttccc ctg 153

Claims (8)

1.一种用于修复TPP1基因剪接异常的U1-snRNA，其特征在于，表达所述U1-snRNA的碱基序列依次包括U1-snRNA起始碱基、与TPP1基因Exon12剪接供体位点或剪接供体位点下游内含子序列靶向互补的序列以及一段U1-snRNA下游序列，所述U1-snRNA下游序列如SEQ IDNO.20所示。
2.根据权利要求1所述的U1-snRNA，其特征在于，表达所述U1-snRNA的碱基序列如SEQID NO.1～4任一碱基序列所示。
3.一种DNA载体，其特征在于，所述载体含有能表达权利要求1或2所述的U1-snRNA的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为线性或环形。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体含有U1启动子和U1终止子。
6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为环形，由权利要求1或2所述的U1-snRNA片段插入到质粒pcDNA3.1(-)制得。
7.根据权利要求1或2所述的U1-snRNA、权利要求3～6任一项所述的载体在制备治疗神经元蜡样质脂褐素沉积症的药物中的应用。
8.一种治疗神经元蜡样质脂褐素沉积症的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1或2所述的U1-snRNA、或权利要求3～6任一项所述的DNA载体。
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