CN117940567A - 调控wfdc2的表达的反义化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调控WFDC2的表达的反义化合物。根据本发明的调控WFDC2的表达的反义化合物可以在各种癌症中显示出抗癌效果。

Description

调控WFDC2的表达的反义化合物

技术领域

本发明涉及调控WFDC2的表达的反义化合物。

背景技术

WFDC2是在人类附睾组织中最早被观察到的糖化蛋白质，被报告为在包括卵巢癌在内的各种癌症中过度表达。WFDC2基因产物是稳定的4-二硫化物核心域蛋白质的家族成员，在涉及WFDC2蛋白质及编码其的基因的研究中，人类附睾-特异cDNA编码与细胞外蛋白质分解酶抑制剂具有序列同源性的蛋白质，为了发现在卵巢癌症中过度表达的基因，进行了卵巢cDNA阵列的比较杂交，分析了附睾蛋白质的分子特性，完成了在人类附睾中特异性表达的mRNA的克隆和分析等，通过这样的研究，WFDC2的过度表达提示了上述蛋白质可以被用作癌特别是卵巢癌的生物标记。

美国授权专利第7811778号涉及诊断胃肠道癌的方法，上述文献中提示了氧化性萎缩后，在主细胞分化为SPEM的期间，表达显著增加，向上调控的基因中的一部分为WFDC2。

另外，韩国授权专利第10-2055305号涉及用于胃食管交界腺癌的诊断和靶向治疗的标记，提示了作为表达量增加的各种基因中的一个的WFDC2是测定BCCP(贝叶斯混合协变量模型，Bayesian Compound Covariate Predictor)分数的基因，具有作为诊断胃癌或食道癌的生物标记的可能性。

如上所述，存在示出WFDC2是癌症产生时表达增加的各种基因之一，具有可以被用作卵巢癌、胃癌等的生物标记的可能性的现有文献，但事实上，通过抑制或阻碍其表达的反义化合物来确认癌症的治疗效果的研究几乎处于停滞状态。

发明内容

本发明的一个方式提供一种反义化合物，其包括修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸与编码WFDC2(WAP四二硫化物核心域蛋白2，WAP Four-Disulfide Core Domain 2)的基因的转录体的核酸碱基序列互补结合，并且由10个至30个连续连接的核苷组成。

本发明的另一方式提供一种缀合物，该缀合物在一个以上的非-核苷酸部分共价结合有上述反义化合物。

本发明的另一方式提供一种癌症预防或治疗用药物组合物，该癌症预防或治疗用药物组合物包含上述反义化合物或上述缀合物作为有效成分。

本发明的一个方式提供一种反义化合物，其包括修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸与编码WFDC2(WAP四二硫化物核心域蛋白2，WAP Four-Disulfide Core Domain 2)的基因的转录体的核酸碱基序列互补结合，并且由10个至30个连续连接的核苷组成。

根据一具体例，上述编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列可以为SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2。

根据一具体例，上述反义化合物可以包括由16个至20个连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。

根据一具体例，上述修饰的寡核苷酸可以包含选自一个以上的修饰的核苷之间的连接子、包含修饰的糖部分(moiety)的一个以上的修饰的核苷、以及包含修饰的核碱基的一个以上的修饰的核苷中的一个以上的修饰。

根据一具体例，上述修饰的核苷可以包含一个以上的修饰的糖部分，上述一个以上的修饰的糖部分选自被2’-O-甲基(methyl)、2’-O-甲氧基乙基(methoxyethyl)、2’-氨基(amino)、2’-氟(fluoro)、2’-阿拉伯糖(arabino)-氟(fluoro)、2’-O-苄基(benzyl)或2’-O-甲基(methyl)-4-吡啶(pyridine)取代的糖部分。

根据一具体例，上述修饰的核苷可以为选自锁核酸(locked nucleic acid，LNA)、限制性乙基双环核酸(constrained ethyl bicyclic nucleic acid，cEt)、2’-O,4’-C-亚乙基-桥联核酸(2’-O,4’-C-ethylene-bridged nucleic acid，ENA)和三环(tricyclo)-DNA中的一个以上的修饰的核苷。

根据一具体例，上述修饰的核苷可以为包含具有六元环或无环部分的糖代替物的修饰的核苷。

根据一具体例，上述修饰的核苷可以为包含选自假尿苷(psudouridine)、2'-硫代尿苷(thiouridine)、N6'-甲基腺苷(methyladenosine)、5'-甲基胞苷(methylcytidine)、5'-氟(fluoro)-2-脱氧尿苷(deoxyuridine)、N-乙基哌啶7'-EAA三唑修饰腺嘌呤(N-ethylpiperidine 7'-EAA triazol modified adenine)、N-乙基哌啶6'-三唑修饰腺嘌呤(N-ethylpiperidine6'-triazol modified adenine)、6'-苯基吡咯并胞嘧啶(6'-phenylpyrrolocytosine)、2',4'-二氟甲苯酰基核糖核苷(2',4'-difluorotoluylribonuleoside)和5'-硝基吲哚(5'-nitroindole)中的一个以上的修饰的核碱基(nucleobase)的修饰的核苷。

根据一具体例，上述修饰的核苷之间的连接子可以为选自磷酸三酯(phosphotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、甲磺酰基氨基磷酸酯(mesylphosphoramidate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、甲基膦酸酯(methylphosphonate)和甲氧基丙基-膦酸酯(methoxypropyl-phosphonate)中的一个以上的修饰的核苷之间的连接子。

根据一具体例，上述修饰的寡核苷酸包含由连接的脱氧核苷组成的间隔段、由连接的核苷组成的5’翼段、以及由连接的核苷组成的3’翼段，上述间隔段位于5’翼段和3’翼段之间，各个翼段的核苷可以包含修饰的糖部分或糖代替物。

根据一具体例，上述修饰的寡核苷酸包含：由8个至10个连接的脱氧核苷组成的间隔段；

由3个至5个连接的核苷组成的5’翼段；以及

由3个至5个连接的核苷组成的3’翼段，上述间隔段位于5’翼段和3’翼段之间，各个翼段的各个核苷可以包含修饰的糖部分。

根据一具体例，上述反义化合物具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的任意的序列至少70％以上、至少80％以上、至少90％以上互补或者完全互补的碱基序列，上述反义化合物包括具有如下碱基序列的修饰的寡核苷酸：包含与选自SEQ ID NO:1的碱基序列的起始位点25到终止位点46、起始位点284到终止位点305、起始位点520到终止位点545、起始位点2222到终止位点2344、起始位点7334到终止位点9301、起始位点9506到终止位点9551、起始位点9733到终止位点10143、起始位点10271到终止位点10302、起始位点10360到终止位点10905、起始位点10977到终止位点11292、起始位点11448到终止位点11563、以及起始位点11633到终止位点11773中的寡核苷酸碱基序列中的任意序列完全互补的至少8个以上的连续相邻的核碱基的碱基序列，上述修饰的寡核苷酸可以使WFDC的mRNA水平和蛋白质水平中的任一个或更多个降低。

根据一具体例，上述反义化合物为与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2互补结合的修饰的寡核苷酸，包括具有如下碱基序列的修饰的寡核苷酸：包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:210、SEQID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:243、SEQID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255、SEQID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:289、SEQID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQID NO:317、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQID NO:381、SEQ ID NO:382、以及SEQ ID NO:383中的任一个寡核苷酸碱基序列完全一致的至少8个以上的连续相邻的核碱基的碱基序列，上述修饰的寡核苷酸可以使WFDC的mRNA水平和蛋白质水平中的任一个或更多个降低。

根据一具体例，上述反义化合物可以为具有选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:83、SEQID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:165、SEQID NO:169、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:282、SEQID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:295、SEQID NO:300、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:343、SEQID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、以及SEQ ID NO:383中的任一个碱基序列的修饰的寡核苷酸。

本发明的另一方式提供一种缀合物，该缀合物在一个以上的非-核苷酸部分共价结合有上述反义化合物。

根据一具体例，上述非-核苷酸部分可以包括蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白质、聚合物或它们的组合。

本发明的另一方式提供一种癌症预防或治疗用药物组合物，该癌症预防或治疗用药物组合物包含上述反义化合物或上述缀合物作为有效成分。

根据一具体例，上述癌症可以选自胃癌、食道癌、胆管癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部癌、脑肿瘤、肺癌、肝癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胆囊癌、肠癌和胰腺癌。

根据本发明的调控WFDC2的表达的反义化合物可以在各种癌症中显示出抗癌效果。

附图说明

图1是示出SNU638细胞株异种移植(Xenograft)小鼠模型中根据一具体例的反义化合物的皮下给药的癌增殖抑制效果(癌细胞大小)的图表。

图2是示出SNU638细胞株异种移植(Xenograft)小鼠模型中根据一具体例的反义化合物的静脉给药的癌增殖抑制效果(癌细胞大小)的图表。

图3是示出SNU638细胞株异种移植(Xenograft)小鼠模型中根据一具体例的反义化合物的皮下或静脉给药的癌增殖抑制效果(癌细胞重量)的图表。

图4是示出SNU638细胞株异种移植(Xenograft)小鼠模型中根据一具体例的反义化合物的皮下或静脉给药的癌增殖抑制效果的照片。

图5是示出SF268细胞株异种移植(Xenograft)小鼠模型中根据一具体例的反义化合物的静脉给药的癌增殖抑制效果(癌细胞大小)的图表。

图6是示出SF268细胞株异种移植(Xenograft)小鼠模型中根据一具体例的反义化合物的静脉给药的癌增殖抑制效果的照片。

具体实施方式

本发明的一个方式提供一种反义化合物，其包括修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸与编码WFDC2(WAP四二硫化物核心域蛋白2，WAP Four-Disulfide Core Domain 2)的基因的转录体的核酸碱基序列互补结合，并且由10个至30个连续连接的核苷组成。

WFDC2(WAP四二硫化物核心域蛋白2，WAP Four-Disulfide Core Domain 2)

WFDC2基因产物是WAP4-二硫化物核心域蛋白质的家族成员(family member)，WFDC2是在人类附睾组织中最先被观察到的分泌和糖化蛋白质，已知在包括卵巢癌在内的一部分癌症中过度表达。癌细胞中WFDC2的过度表达提示了可以成为用于检测本体蛋白质及其各种异构体(isoform)或者诊断癌发病可能性高的患者的生物标记。

反义化合物

在本说明书中，“核苷酸(nucleotide)”是指组成由核碱基(nucleobase)、糖部分(sugar moiety)和磷酸基(phosphate group)的结合构成的核酸的单体分子，上述核苷酸可以解释为如核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非-天然核苷酸、非-标准核苷酸等那样的将核碱基、糖部分和/或磷酸基的非修饰或修饰全部包括在内的概念。

在本说明书中，“核苷(nucleoside)”是一种糖苷胺(glycosylamine)，即被看作从核苷酸中排除磷酸基的部分，是指由核碱基和糖部分组成的单体分子，上述核苷与核苷酸一样，可以解释为将核碱基"G/或糖部分经修饰或未经修饰的核苷全部包括在内的概念。

在本说明书中，“寡核苷酸(oligonucleotide)”是指核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)或脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)或它们的类似物的低聚物或聚合物，上述寡核苷酸通常情况下包括在存在于生物体内的核碱基、糖和核苷(骨骼)之间通过共价结合形成的寡核苷酸，不仅如此，还包括由与其发挥类似作用的核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非-天然核苷酸、非-标准核苷酸构成的经修饰或取代的寡核苷酸。这样的经修饰或取代的寡核苷酸在核酸酶的存在下，与未经修饰或取代的寡核苷酸相比，具有细胞吸收增进、核酸靶向亲和性增进和稳定性增加等特性。

在本说明书中，“反义化合物(antisense compound)”解释为包括可以通过氢键与靶向核酸序列杂交(hybridization)的寡核苷酸。反义化合物包括与靶向核酸序列杂交而调控其表达的寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义寡核苷酸、siRNA、单链siRNA(ss siRNA)、短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)、微RNA模仿物、核酶(ribozyme)、外部引导序列(external guide sequence)寡核苷酸和其它寡核苷酸，但并不限定于此，上述反义化合物解释为包括单链和双链寡核苷酸的概念。

根据一具体例，上述反义化合物被从5'向3'的方向记载时，具有包含靶向化的靶向核酸序列的靶向部分的反向互补的核酸碱基序列。优选地，上述反义化合物可以与编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列互补结合。上述编码WFDC2的基因的转录体是成为上述反义化合物的靶向的核酸，可以选自mRNA以及包含内含子、外显子和非翻译区域的前(pre)-mRNA。

根据一具体例，上述编码WFDC2的基因的转录体的碱基序列为SEQ ID NO:1或SEQID NO:2，SEQ ID NO:1的碱基序列是人类WFDC2基因组序列(从核苷酸45469753至45481532被切断的GenBank保藏号NC_000020.11的互补物，pre-mRNA序列)，SEQ ID NO:2是人类WFDC2 mRNA序列(RefSeq或GenBank保藏号NM_006103.4)。

根据一具体例，上述反义化合物与编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列即SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的任意的序列至少70％以上、至少80％以上、至少90％以上互补或者完全互补，可以包括如下的修饰的寡核苷酸：包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的任意的序列完全互补的至少8个以上的相邻的核碱基的、由10个至30个连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，上述连续连接的核苷优选为12个至25个、更优选为14个至23个、最优选为16个至20个。

根据一具体例，上述反义化合物具有与编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列即SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的任意的序列至少70％以上、至少80％以上、至少90％以上互补或完全互补的碱基序列，可以包括如下的修饰的寡核苷酸：包含SEQ ID NO:7至386中的任一个核酸碱基序列的一部分，由10个至30个连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。

根据一具体例，上述反义化合物具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的任意的序列至少70％以上、至少80％以上、至少90％以上互补或完全互补的碱基序列，上述反义化合物可以包括具有如下的碱基序列的修饰的寡核苷酸：包含与选自SEQ ID NO:1的碱基序列起始位点25到终止位点46、起始位点284到终止位点305、起始位点520到终止位点545、起始位点2222到终止位点2344、起始位点7334到终止位点9301、起始位点9506到终止位点9551、起始位点9733到终止位点10143、起始位点10271到终止位点10302、起始位点10360到终止位点10905、起始位点10977到终止位点11292、起始位点11448到终止位点11563、以及起始位点11633到终止位点11773中的寡核苷酸碱基序列中的任意序列完全互补的至少8个以上的连续相邻的核碱基的碱基序列。

根据一具体例，上述反义化合物具有与编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列中的任意序列完全互补的碱基序列，上述反义化合物可以包括如下的修饰的寡核苷酸：包含与SEQ ID NO:7至386中的任一个核酸碱基序列内的任意的序列完全互补的至少8个以上的相邻的核碱基，由10个至30个连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。

根据一具体例，上述反义化合物具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的任意的序列至少70％以上、至少80％以上、至少90％以上互补或完全互补的碱基序列，可以包括具有如下碱基序列的修饰的寡核苷酸：包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:20、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQID NO:89、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:135、SEQID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:169、SEQID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:237、SEQID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:284、SEQID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:300、SEQID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:376、SEQID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、以及SEQ ID NO:383中的任一个寡核苷酸碱基序列完全一致的至少8个以上的连续相邻的核碱基的碱基序列。

根据一具体例，上述反义化合物可以包括由SEQ ID NO:7至386中的任一个碱基序列组成的修饰的寡核苷酸。

根据一具体例，上述反义化合物可以为具有选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:83、SEQID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:165、SEQID NO:169、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:282、SEQID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:295、SEQID NO:300、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:343、SEQID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、以及SEQ ID NO:383中的任一个碱基序列的修饰的寡核苷酸。

根据一具体例，可以与编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列互补结合的反义化合物的长度可以包含由10个至30个连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。优选地，上述反义化合物可以由如下的修饰的寡核苷酸组成：由12个至28个、15个至25个、18个至24个、19个至22个或20个长度的连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，优选地，上述反义化合物可以为由其长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个长度的连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。

根据一具体例，上述反义化合物可以为单链或双链。上述反义化合物为双链时，上述双链可以包括具有与靶向核酸互补的区域的第一修饰的寡核苷酸和具有与上述第一修饰的寡核苷酸互补的区域的第二修饰的寡核苷酸。

杂交(hybridization)

上述反义化合物通过在编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列中选择一个以上的靶向位点，选择与上述靶向充分互补的寡核苷酸，与靶向位点充分地特异性杂交，从而可以得到对于WFDC2的表达调控的所期待的效果。

在本说明书中，“杂交(hybridization)”是指互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键，该氢键可以是华森-克里克(Watson-Crick)氢键、胡斯坦(Hoogsteen)氢键或反向胡斯坦(Hoogsteen)氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是形成氢键而组成对的互补的核酸碱基。

本发明中的“可杂交的”或“互补”或“实质性互补”的含义是指包括如下的核苷酸碱基序列：在温度和溶液离子强度的合适的体外和/或体内条件下，核酸(例如，RNA、DNA)通过序列-特异性、反平行(antiparallel)方式(即，核酸特异性结合于互补核酸)非-共价结合于其它核酸即可以进行腺嘌呤(A)和胸苷(T)配对、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)配对、以及鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)配对的形成、“退火(anneal)”、“杂交(hybridization)”的核苷酸碱基序列。

根据一具体例，上述杂交发生在本说明书中公开的反义化合物与编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列之间。杂交的最常规的机制伴随核酸分子的互补核酸碱基之间的氢键。

杂交可以发生在各种条件下。苛刻的条件(stringent condition)依赖于序列，并且取决于杂交的核酸分子的性质和组成。确认序列是否可以与靶向核酸特异性杂交的方法是本技术领域中公知的。

互补性(complementarity)

在本说明书中，“互补(complementary)”这一用语是指两核苷酸之间可以精致地组成对的特性。例如，寡核苷酸的两种彼此不同的核酸或寡核苷酸的碱基序列被从5'朝向3'的方向记载时，在将一种核酸或寡核苷酸的固定部分的碱基序列以相反方向对齐时，与其余一种核酸或寡核苷酸的固定部分非-共价结合即形成腺嘌呤(A)和胸苷(T)的配对、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)的配对、以及鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的配对时，两核酸或寡核苷酸称为互补。

因此，“可以特异性杂交的(specifically hybridizable)”和“互补(complementary)”可以解释为用于表示可以使寡核苷酸与DNA或RNA靶向之间的稳定的特异性结合发生的互补性或精致的对形成的充分程度的用语。在本技术领域中，反义化合物的序列已知为不必与特异性杂交的靶向核酸的序列100％互补。

上述反义化合物与靶向DNA或RNA的结合经特异性杂交，可以阻碍靶向DNA或RNA的正常的功能，在特异性结合优选的条件下，即体内分析或治疗时在生理性条件下，体外分析时在分析执行条件下，解释为具有防止与反义化合物的非-靶向序列的非特异性结合的充分程度的互补性。

即，若上述反义化合物可以与靶向核酸特异性杂交，则反义化合物与靶向核酸之间的非互补的核酸碱基可被接收。而且，反义化合物可以与一个以上的核酸部分杂交，以使夹杂或相邻部分不参与杂交(例如，环结构、失配或发夹结构)。

根据一具体例，构成本发明的反义化合物或上述反义化合物的修饰的寡核苷酸可以与编码WFDC2的基因的转录体(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)内的核酸碱基序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。与反义化合物的靶向核酸的互补性百分比可以通过本技术领域中已知的常规的方法确定。例如，反义化合物的20个核酸碱基中的18个与靶向区域互补的反义化合物可以特异性杂交，具有90％的互补性。在上述例示中，剩余的非互补的核酸碱基与互补核酸碱基形成基团或者配置在其内部，无需彼此或与互补核酸碱基相邻。因此，具有配置在与靶向核酸完全互补的两区域的两个侧面的四个非互补核酸碱基的18个核酸碱基长度的反义化合物与靶向核酸具有77.8％整体互补性，因此解释为包括在本发明的范畴内。反义化合物与靶向核酸区域的互补性百分比可以利用本技术领域中已知的BLAST程序和PowerBLAST程序通过常规方法确定(Altschul et al.,J.MoI.Biol.,1990,215,403 410；Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649 656)。另一方面，同源性百分比、序列同一性或互补性可以通过利用利用了史密斯-沃特曼算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的基本设定的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)等来确定。

根据一具体例，构成本发明的反义化合物或上述反义化合物的修饰的寡核苷酸可以与编码WFDC2的基因的转录体(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)内的核酸碱基序列80％以上互补，优选地，可以90％以上互补，最优选地，可以完全互补(100％互补)。在本说明书中，“完全互补(fully complementary)”是指反义化合物的各核酸碱基可以与靶向核酸的对应核酸碱基形成精致的碱基对。

根据一具体例，非互补的核酸碱基的位置可以位于上述反义化合物的5'末端或3'末端。或者，非互补核酸碱基或核酸碱基可以位于上述反义化合物的内部。存在2个以上的非互补核酸碱基时，它们可以相邻(即，结合)或不相邻。根据一具体例，上述非互补核酸碱基可以位于缺口聚物(gapmer)反义寡核苷酸的翼(wing)部分。

根据一具体例，本发明的反义化合物可以包含与编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列部分互补者。在本说明书中，“部分(portion)”是指与靶向核酸的区域或部分内相邻(即，结合)的规定的核酸碱基数。上述部分也是指反义化合物的相邻的核酸碱基的固定数。根据一具体例，反义化合物可以与靶向部分的至少8个核酸碱基部分互补，可以与至少12个核酸碱基部分互补，可以与至少15个核酸碱基部分互补。与靶向部分的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或其以上或者由这些值中的两个值定义的范围的核酸碱基部分互补的反义化合物也解释为包括在上述范围内。

修饰(modification)寡核苷酸

本发明的根据一具体例，上述反义化合物可以包括修饰的寡核苷酸，上述修饰的寡核苷酸可以包含选自一个以上的修饰的核苷之间的连接子、包含修饰的糖部分的一个以上的修饰的核苷、以及包含修饰的核碱基的一个以上的修饰的核苷中的一个以上的修饰。

糖部分(sugar moiety)的修饰

根据一具体例，上述修饰的核苷可以为包含修饰的糖部分的修饰的核苷，该修饰的糖部分经非-双环修饰的糖部分和/或、双环或三环糖部分、和/或糖代替物或糖模拟物等修饰。

根据一具体例，上述修饰的核苷可以包含被选自例如2'-O-甲基(methyl)之类的2'-O-烷基(alkyl)、例如2'-O-甲氧基乙基(methoxyethyl)之类的2'-O-烷氧基烷基(alkoxyalkyl)、2'-氨基(amino)、2'-烯丙基(allyl)、2'-氟(fluoro)、2'-阿拉伯糖(arabino)-氟(fluoro)、例如2'-OCH₂C(＝O)-NHCH₃(NMA)之类的2'-O-N-取代乙酰胺、2'-O-苄基(benzyl)、2'-O-甲基(methyl)-4-吡啶(pyridine)、4'-O-甲基(methyl)、5'-甲基(methyl)、5'-乙烯基(vinyl)和5'-甲氧基(methoxy)中的一个以上的取代基取代的糖部分，但并不限定于此。

本发明的根据一具体例的反义化合物可以包含选择性具有取代或修饰的糖部分的一个以上的修饰的核苷。糖部分的修饰赋予上述反义化合物核酸酶稳定性、结合亲和性或其它有利的生物学特性。上述天然核苷的(呋喃)核糖((pento)furanosyl)糖环可以通过包括取代基的加成(特别是2'位置)；形成双环核酸(BNA)的两个其它位置的环原子的交联；以及4'-位置的环氧上-S-、-N(R)-或-C(R1)(R2)等原子或基团的取代在内的各种方法修饰，但并不限定于此。修饰的糖部分包括取代糖，特别是，具有2'-F、2'-OCH₂(2'-OMe)或2'-O(CH₂)₂-OCH₃(2'-O-甲氧基乙基或2'-MOE)取代基的2'-取代糖；以及具有4'-(CH₂)n-O-2'(n＝l或n＝2)交联的双环修饰糖(BNA)，但并不限定于此。这样的修饰糖的制造方法在本技术领域中是公知的。在包含修饰的糖部分的核苷中，碱基部分可以保持为与靶向核酸杂交。

根据一具体例，上述修饰的核苷在2'位置包含F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-烷基-O-烷基；O-烷基-O-烷基-N(二烷基)；或O-烷基-羧基酰胺中的一个(其中，烷基、烯基和炔基为取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基)。特别地，优选为O[(CH₂)nO]mCH₃、O(CH₂)nOCH₃、O(CH₂)nNH₂、O(CH₂)nCH₃、O(CH₂)nONH₂、O(CH₂)n0(CH₂)nN[(CH₂)mCH₃]₂、O(CH₂)nC(＝O)-NHCH₃和O(CH₂)n0N[(CH₂)mCH₃]₂(其中，n和m为0至约10)。其它优选的修饰的寡核苷酸在2'位置包含C₁至C₁₀低级烷基、取代低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基或聚烷基氨基取代基中的一个。优选地，上述修饰可以包含2'-甲氧基乙氧基(也作为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE被已知的2'-O-CH₂CH₂OCH₃)(Martin et al.,HeIv.Chim.Acta,1995,78,486-504)，即烷氧基烷氧基，上述修饰可以包含2'-二甲基氨基氧基乙氧基(即，也作为2'-DMAOE被已知的(CH₂)₂ON(CH₃)₂基)、以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基[即，也作为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE被已知的2'-O(CH₂)₂O(CH₂)₂--N(CH₃)₂基]。

另一优选的修饰可以包含2'-甲氧基(2'-O-CH₃)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、2'-烯丙基(2'-CH₂-CH＝CH₂)、2'-O-烯丙基(2'-O-CH₂-CH＝CH₂)和2'-氟(2'-F)。2'-修饰可以是阿拉伯糖(上部)位置或核糖(下部)位置。优选的2'-阿拉伯糖修饰为2'-F，核苷的其它位置(特别是，3'末端核苷的糖的3'位置或5'末端核苷的5'位置)也可以通过类似的方法修饰。

上述双环或三环糖部分可以选自例如锁核酸(locked nucleic acid，LNA)、限制性乙基双环核酸(constrained ethyl bicyclic nucleic acid，cEt)、2'-O,4'-C-亚乙基-桥联核酸(2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid，ENA)和三环(tricyclo)-DNA，但并不限定于此。

根据一具体例，上述修饰的核苷可以包含具有六元环或无环部分的糖代替物。上述糖代替物可以选自例如吗啉代寡核苷酸(phodphorodiamidate morpholino oligomer，PMO)之类的吗啉环；环己烯基环；环己基环；以及例如己糖醇、安尼妥、甘露醇、氟己糖醇之类的四氢吡喃环，但并不限定于此。可以用于修饰由根据本发明的反义化合物导入的核苷的其它各种二环和三环糖取代环系是本技术领域中公知的。这样的环系的活性可以通过各种取代过程而得到增进。

另外，上述糖代替物可以为例如非锁核酸(unlocked nucleic acid，UNA)或肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)之类的无环部分，但并不限定于此。

肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)是核碱基通过不是磷酸键的肽键连接的核酸类似物的一种，磷酸二酯键被肽键(peptide bond)代替，具有腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶之类的核碱基，可以引起与特异性核酸杂交反应。PNA在自然界中未被发现，通过人工化学方法合成，可以通过与互补的碱基序列的核酸杂交反应而形成双链。此外，PNA是电中性的，因此具有的特征在于，不仅化学稳定，还不被核酸分解酶(nuclease)或蛋白质分解酶(protease)分解，生物学也稳定。PNA的N-氨基乙基甘氨酸骨架使用最为广泛，但根据本技术领域中公知的技术，也使用具有修饰骨架的PNA(P.E.Nielsen and M.Egholm"AnIntroduction to PNA"in P.E.Nielsen(Ed.)"Peptide Nucleic Acids:Protocols andApplications"2nd Ed.Page 9(Horizon Bioscience,2004))。

非锁核酸(unlocked nucleic acid，UNA)是不具有核糖(ribose)的C2'-C3'键的修饰的核苷，由于开链结构，不受立体配置制约，可以调整寡核苷酸的柔性。已知反义寡核苷酸内包含UNA时，可以使Tm值下降5℃至10℃左右，可以减少脱靶。

核碱基(nucleobase)的修饰

根据一具体例，上述修饰的核苷可以为包含选自假尿苷(psudouridine)、2'-硫代尿苷(thiouridine)、N6'-甲基腺苷(methyladenosine)、5'-甲基胞苷(methylcytidine)、5'-氟(fluoro)-2-脱氧尿苷(deoxyuridine)、N-乙基哌啶7'-EAA三唑修饰腺嘌呤(N-ethylpiperidine 7'-EAA triazol modified adenine)、N-乙基哌啶6'-三唑修饰腺嘌呤(N-ethylpiperidine6'-triazol modified adenine)、6'-苯基吡咯并胞嘧啶(6'-phenylpyrrolocytosine)、2',4'-二氟甲苯酰基核糖核苷(2',4'-difluorotoluylribonuleoside)和5'-硝基吲哚(5'-nitroindole)中的一个以上的修饰的核碱基(nucleobase)的修饰的核苷。

未经修饰的或自然的核酸碱基是指嘌呤碱基即腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)、以及嘧啶碱基即胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

上述修饰的核苷也可以包含核碱基的修饰或取代。核碱基的修饰或取代虽然是结构上有区别的形态，但可以与自然产生或未经合成修饰的核碱基在功能上相互替换。自然产生核碱基和修饰的核碱基可以参与氢键。这样的核碱基修饰赋予上述反义化合物核酸酶稳定性、结合亲和性或其它有利的生物化学特性。例如，5-甲基胞嘧啶取代之类的特定的核碱基取代已知将核酸双链稳定性提高到0.6-1.2℃，特别是，可以有用于增进反义化合物对靶向核酸的结合亲和性。

例如，上述修饰的核碱基包括：5'-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2'-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6'-甲基及其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2'-丙基及其它烷基衍生物；2'-硫代尿嘧啶、2'-硫代胸腺嘧啶和2'-硫代胞嘧啶；5'-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5'-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其它炔基衍生物；6'-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5'-尿嘧啶(尿嘧啶类似物)；4'-硫代尿嘧啶；8'-卤代、8'-氨基、8'-氧硫杂环戊二烯、8'-硫代烷基、8'-羟基及其它8'-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5'-卤代(特别是，5'-溴)、5'-三氟甲基及其它5'-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7'-甲基鸟嘌呤和7'-甲基腺嘌呤；2'-F-腺嘌呤；2'-氨基-腺嘌呤；8'-氮杂鸟嘌呤和8'-氮杂腺嘌呤；7'-去氮鸟嘌呤和7'-去氮腺嘌呤；以及3'-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤；吩嗪胞苷(lH-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并/>嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(lH-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)等三环嘧啶；9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并/>嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)之类的取代的吩/>嗪胞苷等的G-形夹，但并不限定于此。/>

另外，杂环碱基也可以包括嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环取代的7'-去氮-腺嘌呤、7'-去氮鸟苷、2'-氨基吡啶和2'-吡啶酮等的杂环碱基。对提高上述反义化合物的结合亲和性特别有用的核酸碱基包括例如5'-取代嘧啶、6'-氮杂嘧啶、2'-氨基丙基腺嘌呤、以及5'-丙炔基尿嘧啶和5'-丙炔基胞嘧啶，并包含N-2、N-6和O-6取代嘌呤，但并不限定于此。同时，上述修饰的核碱基包括在美国专利第3687808号文献[The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990,Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613]和文献[Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.ed.,CRC Press,1993]中公开的核碱基。

修饰的核苷之间的连接子

根据一具体例，在上述反义化合物中，修饰的核苷之间的连接子可以为选自磷酸三酯(phosphotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、甲磺酰基氨基磷酸酯(mesylphosphoramidate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、甲基膦酸酯(methylphosphonate)和甲氧基丙基-膦酸酯(methoxypropyl-phosphonate)中的一个以上的修饰的核苷之间的连接子。

如本技术领域中所公知的那样，核苷是核碱基和糖部分的组合。核苷酸还包含与核苷的糖部分共价结合的磷酸基。在包含呋喃戊糖的核苷酸中，磷酸基可以与结合糖的2'、3'或5'羟基结合。在寡核苷酸形成中，磷酸基与彼此相邻的核苷共价结合而形成线型聚合物化合物。依次地，线型聚合物结构的各末端也结合而形成圆型结构，但通常优选为开链线型结构。在寡核苷酸结构中，磷酸基通常形成寡核苷酸的核苷之间的骨架，RNA和DNA的自然产生的键或骨架是3'至5'磷酸二酯(phosphodiester)键。根据一具体例的反义化合物除了自然产生的核苷之间的键以外，还可以包含一个以上的修饰的核苷之间的键，其由于细胞吸收增进、靶向核酸亲和性增进、核酸酶存在下稳定性增加等特性，相较于包含自然产生的核苷之间的键的反义化合物，经常被选择。

本发明中可以利用的优选的反义化合物的一具体例是包含修饰骨架或非自然的核苷之间的键的寡核苷酸。如上述定义上述，具有修饰骨架的寡核苷酸包括骨架中含有磷原子的核苷酸和骨架中不包含磷原子的核苷酸。同时，如本技术领域中所引用的那样，在本说明书中，核苷之间的骨架中不包含磷原子的修饰的寡核苷酸也即使为是寡核苷酸。

在根据一具体例的反义化合物中，核苷之间的修饰键不仅可以包括含有磷酸的核苷之间的键，还可以包括不包含磷酸的核苷之间的键。代表的含有磷酸的核苷之间的键可以是包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯在内的甲基及其它烷基膦酸酯；亚磷酸酯、具有它们的正常的3'-5'键、2'-5'键类似物的3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯；包括甲磺酰基氨基磷酸酯、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、丝氨醇磷酸酯和硼烷磷酸酯在内的亚磷酰胺和一个以上的核苷酸之间的键为3'-3'、5'-5'或2'-2'键的具有相反的极性的化合物，但并不限定于此。此外，具有相反极性的寡核苷酸包含3'-大部分的核苷酸之间的键中的3'-3'单键，即可以为碱基消失部分的一个逆转核苷残部(缺少核酸碱基，具有羟基将其代替)。也可以包含各种的盐、盐混合物的游离酸形态。

不包含磷的优选的修饰的寡核苷酸的骨架可以是通过单链烷基或环烷基核苷之间的键、混合杂原子与烷基或环烷基核苷之间的键、或者一个以上的单链杂原子或杂环核苷之间的键修饰的骨架。它们包括具有吗啉键(一部分从核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫醚、亚砜和砜骨架；甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；乙酰核糖骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基联氨基骨架；磺酸酯和砜酰胺骨架；酰胺骨架；具有N、O、S和CH₂混合成分要素的骨架，但并不限定于此。这样的含有磷酸的核苷之间的键和不含有磷酸的核苷之间的键的制造方法在本技术领域中是公知的。

在另一具体例中，上述反义化合物可以将5'末端的羟基用选自5'-(E)-乙烯基膦酸酯(vinylphosphonate)、5'-甲基膦酸酯(methylphosphonate)、(S)-5'-C-甲基含磷酸酯(methyl with phosphate)和5'-硫代磷酸酯(phosphorothioate)中的一个取代。已知像这样的修饰反义化合物良好地装载于RNA-诱导沉默复合体(RISC)，通过单链短干扰RNA(sssiRNA)或双链短干扰RNA(ds siRNA)运转。

反义化合物模体

根据一具体例，上述反义化合物具有Lx-Dy-Lz形态的嵌合(chimeric)形态，L可以为修饰的核苷。其中，D为DNA，x和z为1至7的任意的整数，可以相同或彼此不同，y为5至25的任意的整数。优选地，上述x和z为1至5的任意的整数，y可以为7至24的任意的整数，更优选地，上述x和z为3至5的任意的整数，y可以为8至23的任意的整数。至少D区域和最相邻的L区域的糖部分经修饰，可以定义L区域和D区域的边界。此外，在上述全部的区域(L区域和D区域)中，各核苷之间的连接子可以包含一个以上的磷酸二酯或上述说明的修饰的核苷之间的连接子(例如，硫代磷酸酯)，上述核苷内的核碱基也可以包含一个以上的天然核碱基或上述说明的修饰的核碱基。

根据一具体例，上述修饰的寡核苷酸包含由连接的脱氧核苷组成的间隔段、由连接的核苷组成的5’翼段和由连接的核苷组成的3’翼段，上述间隔段位于5’翼段和3’翼段之间，各个翼段的核苷可以包含修饰的糖部分或糖代替物。

嵌合体反义化合物可以含有经修饰的至少一个区域，以赋予例如核酸酶耐分解性增加、细胞吸收增加、对靶向核酸的结合亲和性增加和/或阻碍活性增加。嵌合体反义化合物可以形成为2个以上的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的混合结构。如上所述的化合物在本技术领域中还被称作杂化物(hybrid)或缺口聚物(gapmer)，缺口聚物结构的制造公开在美国专利第5013830号；第5149797号；第5220007号；第5256775号；第5366878号；第5403711号；第5491133号；第5565350号；第5623065号；第5652355号；第5652356号；以及第5700922号中。

在缺口聚物中，具有支援RNaseH切割多个核苷酸的内部区域位于具有与内部区域的核苷化学性不同的多个核苷的外部区域之间。就具有缺口聚物模体的反义寡核苷酸而言，间隔(gap)段(本说明书的反义化合物中的D区域)支援靶向核酸的分割，相反，翼(wing)段(本说明书的反义化合物中的L区域)可以包含含有用于提高稳定性、亲和性和外切核酸酶耐受性的修饰的核苷的修饰的寡核苷酸。根据需要，上述间隔段同样也可以包含修饰的寡核苷酸。上述修饰的寡核苷酸可以包含选自一个以上的修饰的核苷之间的连接子、包含修饰的糖部分的一个以上的修饰的核苷、以及包含修饰的核碱基的一个以上的修饰的核苷中的一个以上的修饰，对于各个修饰的说明与上述说明相同。

优选地，缺口聚物中的不同的各区域可以包含均匀的糖部分。此外，不同的各区域由彼此不同的糖部分划分其边界，但各区域内的糖部分在非-修饰的核苷酸和修饰的核苷酸中可以是自由地被选择的(mixer)形态。根据本发明的一具体例，这样的翼段-间隔段-翼段模体可以表示为Lx-Dy-Lz之类的形态(其中，x表示5'翼段的长度，y表示间隔段的长度，z表示3'翼段的长度)。根据一具体例的反义化合物可以具有缺口聚物模体。在根据一具体例的反义化合物中，x、y、z包括例如5-10-5、3-10-3、1-12-1、2-10-3、3-9-4、3-8-3、1-9-2、2-13-5、4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-16-2、1-18-1、2-10-2、1-10-1或2-8-2，但并不限定于此。根据另一具体例，上述反义化合物可以具有翼段-间隔段或间隔段-翼段结构，即上述x或z为0时的“翼体(wingmer)”模体。上述翼体结构包括例如10-10、8-10、5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10或8-2，但并不限定于此。

在一具体例中，上述反义化合物的3'翼段的特征和5'翼段的特征可以独立地被选择。此外，在上述具体例中，5'翼段的单体数字(上述Lx中的x)和3'翼段的单体(上述Lz中的z)的数字可以相同或不同。此外，5'翼段的修饰(如果存在的话)可以与3'翼段的修饰(如果存在的话)相同，或者上述修饰(如果存在的话)可以不同，5'翼段的单体的连接和3'翼段的单体的连接可以相同或不同。即，并不是整个区域必须均匀地被修饰，而是可以将上述修饰中的一个以上导入反义寡核苷酸内部的一个以上的核苷酸。

缀合物

本发明的一个方式提供一种缀合物，是在一个以上的非-核苷酸部分共价结合上述反义化合物而成的，根据一具体例，上述非-核苷酸部分可以包括蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白质、聚合物或它们的组合。

在本说明书中，“缀合物(conjugate)”是指与非-核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的反义化合物或反义寡核苷酸。这样的接合对例如反义寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞吸收或稳定性产生影响，从而可以改善反义寡核苷酸的药理学。根据一具体例，上述非-核苷酸部分改善反义寡核苷酸的细胞分布、生物利用率、代谢、排泄、渗透性和/或细胞吸收，从而可以修饰或提高反义寡核苷酸的药动力学特性。此外，上述非-核苷酸部分将反义寡核苷酸与特异性器官、组织或细胞类型靶向化，因此可以提高该器官、组织或细胞类型中的反义寡核苷酸的有效性。同时，上述非-核苷酸部分可以降低非-靶细胞类型、组织或器官中的反义寡核苷酸的活性例如脱靶活性或者非-靶细胞类型、组织或器官中的活性。国际专利公报WO93/07883和WO2013/033230公开了合适的非-核苷酸部分。

根据一具体例，上述非-核苷酸部分包括嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、胆酸部分、PLAT、脂质、磷脂质、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光团和染料，但并不限定于此。

根据一具体例，上述非-核苷酸部分可以包括活性药物物质例如阿司匹林、华法林、酮洛芬、卡洛芬、地西平、抗菌剂、抗生剂。

根据一具体例，上述非-核苷酸部分还可以包括抗体(antibody)。

根据一具体例，上述非-核苷酸部分可以连接在上述反义化合物或反义寡核苷酸的5'末端或3'末端。

根据一具体例，上述非-核苷酸部分可以包含至少1个至3个N-乙酰葡萄糖胺(GalNAc)。

剂型

为了易于寡核苷酸的使用，利用例如最小化分解、易于递送和/或吸收、或者在剂型中为寡核苷酸提供其它的有益的性质的剂型，从而开发了可以将寡核苷酸递送到目标物或细胞环境的各种剂型。

在一具体例中，用于减少WFDC2的表达的反义寡核苷酸以靶细胞的所处环境或全身对目标给药时，寡核苷酸的足够的部分进入细胞，可以以减少WFDC2的表达的方式合适地成型。根据一具体例，上述反义寡核苷酸可以成型为缓冲剂溶液，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构体或衣壳的形态。此外，无修饰的(naked)寡核苷酸或其缀合物可以在水或水性溶液(例如，经pH调节的水)或碱性缓冲水性溶液(例如，PBS)内成型。

根据一具体例，利用具有阳离子性脂质的寡核苷酸的剂型，可以容易地将寡核苷酸导入细胞。例如，可以利用阳离子性脂质，例如脂质转染、阳离子性甘油衍生物、以及多价阳离子性分子(例如聚赖氨酸)，合适的脂质可以包括低聚果胶胺、脂联素(LifeTechnologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.)或转染试剂(FuGene)6(Roche)，它们均可以按照制造商的协议来使用。在这样的剂型中可以包含脂质纳米粒子。

另外，上述剂型可以包含赋形剂。赋形剂包含脂质体、脂质、脂质复合体、微球、微粒、纳米球或纳米粒子，或者为了给药到需要它的目标物的细胞、组织、器官或身体而可以差异化成型(例如，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22ndedition,Pharmaceutical Press,2013)。赋形剂赋予组合物活性成分的改善的稳定性、改善的吸收、改善的可用性和/或治疗增强。此外，赋形剂可以为缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、三碱基或氢氧化钠)或溶媒(例如，缓冲的溶液、凡士林、二甲基亚砜或矿物油)。

在一部分实施方式中，寡核苷酸为了延长其保存寿命，可以在冻结干燥后，使用前，制造为溶液。因此，包含构成根据本发明的反义化合物的寡核苷酸的组合物中的赋形剂可以使用冻结干燥保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)、或崩解温度调节剂(例如，右旋糖酐、分离液(ficoll)或明胶)。

为了灭菌注射溶液或分散液的当即制造，适于注射用途的药物组合物可以包括灭菌水性溶液(水溶性时)或分散液和灭菌粉末。静脉内或皮下给药时，合适的载体包括生理盐水、无菌水、增溶剂(Cremophor)EL.T M.(BASF)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。此外，载体可以为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等)、以及它们的合适的混合物的溶剂或分散介质。在许多情况下，优选组合物中包含张度剂例如糖、多元醇/>(例如，甘露醇、山梨醇)和氯化钠。灭菌型注射溶液可以在将所需的量的寡核苷酸按需与上述列举的成分中的一个或它们的组合物一同投入到所选择的溶剂中后通过除菌过滤进行制造。上述药物组合物可以含有至少约0.1％的治疗剂(例如，用于减少WFDC2的表达的反义寡核苷酸)或其以上的用量，但活性成分的百分率优选为总组合物的重量或皮肤的约1％至约80％。这不仅是出于可用性、生物利用率、生物学半衰期、给药途径、产品保存寿命的考虑，其它的药理学考虑事项之类的因素也在剂型的制造中被考虑到了。

治疗疾病和方法

根据本发明的反义化合物或包含其的缀合物作为癌症预防或治疗用药物组合物，可以用作癌治疗剂。“癌(cancer)”是指具有如下的特征的疾病群：正常的细胞凋亡的平衡被打破时，细胞过度增殖，可以浸润到周围组织。“治疗(treatment)”是指通过根据本发明的药物组合物的给药，癌症的病情得到好转、改善，或者使之得到有益变化的所有行为。

根据一具体例，上述癌可以为选自胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈部癌、脑肿瘤、甲状腺癌、肺癌、咽喉癌、大肠/直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、乳房癌、子宫癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌等来源于上皮细胞等的恶性肿瘤(carcinoma)；骨癌、肌肉癌、脂肪癌、纤维细胞癌等来源于结合组织细胞的肉瘤(sarcoma)；白血病、淋巴癌、多发性骨髓瘤等来源于造血细胞的血癌、神经组织中产生的肿瘤中的1种以上。优选地，上述癌可以为实性癌。

利用了根据本发明的药物组合物的治疗方法为目标伴有组合物的有效量，即，给药优选的可以产生治疗结果的量。治疗上可接受的量优选为可以治疗疾病的合适的用量，其取决于包括目标的大小、身体表面积、年龄、给药的特定的组合物、组合物中的活性成分(若干)、给药时间和途径、总的健康情况、以及同时给药的其它药物在内的特定因素。根据本发明的组合物的给药可以是例如经口(例如，胃管、十二指肠管、胃瘘形成术或直肠)或非经口(例如皮下注射、静脉内注射或注入、动脉内注射或注入、肌肉内注射)、局部(例如表皮、吸入、滴眼或黏膜)、或向靶向器官(例如目标物的肝)通过直接注射给药。优选地，根据本发明的反义化合物可以经静脉内或皮下给药，可以以0.1mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至30mg/kg、0.1mg/kg至20mg/kg、0.1mg/kg至5mg/kg范围或0.5mg/kg至5mg/kg范围的用量给药。在一部分的具体例中，治疗目标优选为人或非-人类灵长类或其它哺乳类目标物，但可以包括狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、老鼠、大白鼠、豚鼠或仓鼠。

联合治疗

本发明的根据一具体例，上述药物组合物可以与一种以上的其它药剂一起给药。根据一具体例，上述一种以上的其它药剂可以设计为治疗与本发明的治疗目标相同的疾病或病理。或者上述一种以上的其它药剂可设计为治疗一个以上的本发明的药物组合物的不优选的效果，或者可以与治疗其它治疗剂的不优选的效果的其它药剂一起给药。

根据一具体例，本发明的药物组合物可以与一种以上的其它药剂同时给药，或者可以在不同的时间点给药。同时，本发明的药物组合物和一种以上的其它药剂可以一起制造为一个剂型，或者可以单独制造。

根据一具体例，与本发明的药物组合物一起给药的药剂可以增进治疗效果，带来优异的治疗效果，即协同效应。换言之，本发明可以提供包含反义化合物和通过非-反义机制而作用的一种以上的药剂的药物组合物。上述药剂可以为化学治疗剂，上述化学治疗剂可以为例如道诺霉素、唐诺霉素、放射菌素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、异红素、博来霉素、马福斯夫酰胺、伊福斯酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖胞苷、双-氯乙基亚硝脲、白消安、丝裂霉素C、更新霉素D、丝裂霉素、强的松、羟型酯酮、睾丸素、他莫昔芬、达卡巴嗪、普鲁苄肼、六甲基密胺、五甲基密胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝脲、氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧科氟霉素、4-羟基苯甲基环磷-酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、紫杉醇、长春新碱、长春花碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓扑替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂或硫酸二乙酯(DES)，但并不限定于此。将上述化学治疗剂与本发明的反义化合物一同使用时，它们可以个别地(例如，5-FU和寡核苷酸)依次地(例如，一定期间利用5-FU和寡核苷酸后，MTX和寡核苷酸)或者可以与一种以上的其它化学治疗剂(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸、或者5-FU、放射性治疗和寡核苷酸)联合利用。抗炎剂(包括但不限于非甾体类抗炎剂和皮质类固醇)、抗病毒剂(包括但不限于三氮唑核苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦和甘西克洛韦)也可以混合在本发明的组合物中。

实施发明的方式

下面，将一个以上的具体例通过实施例而更详细地进行说明。但是，这些实施例用于对一个以上的具体例例示性地进行说明，本发明的范围不限定于这些实施例。

实验方法

1.细胞培养

将来源于人类胃癌细胞株SNU638、胶质母细胞瘤细胞株SF268以包含10％(v/v)的FBS(#SH30084.03HI，Hyclone)、1％(v/v)的抗生剂(Penicillin-Streptomycin，#LS202-02，Welgene)溶液的RPM1-1640(#Sh30027.01，Hyclone)作为培养基，在二氧化碳浓度5％(v/v)、37℃的培养内进行了培养。

来源于胰腺癌上皮组织的PANC-1细胞株在包含10％的FBS、1％的抗生剂(青链霉素(Penicillin-Streptomycin)，#LS202-02，Welgene)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)培养基中以37℃、二氧化碳浓度5％(v/v)的条件进行了培养。传代培养每4天进行一次，用于转化实验的细胞只使用了经过5至10次以内传代培养的细胞。

2.反义寡核苷酸(ASO)的制作

本实施例中使用的反义寡核苷酸(ASO)设计成靶向WFDC2的pre-mRNA(SEQ ID NO:1)或mRNA(SEQ ID NO:2)中的各种区域，在Integrated DNA technology下订单制作，或者在自动化DNA合成仪(BioAutomation model MerMade 12)或自动化肽合成仪(Biotagemodel Syro 1)中，对与可控多孔玻璃(Controlled-pore glass)(CPG)固体支撑物结合的通用连接子(universal linker)反复适用如下述表1所示经标准化的亚磷酰胺化学循环(亚磷酰胺chemistry cycle)，从而进行了合成。

[表1]

为了硫代磷酸酯连接子，使用了3-[(二甲基氨基-亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(3-[(Dimethylamino-methylidene)amino]-3H-1,2,4-dithia zole-3-thione)(DDTT)的0.1M的吡啶(pyridine)溶液或0.05M的吡啶-乙腈(Acetonitrile)1:1的溶液代替上述表1的氧化步骤。

寡核苷酸合成结束时，加入浓缩的氨溶液，在60℃反应12至18小时，在CPG处切割，同时，将保护基团(protection group)全部脱除。然后，将CPG过滤去除，将氨适当地浓缩后，将残留物经Sephdex(模型G-25)树脂过滤，脱盐，冻结干燥后即使用，或者利用高压液相制备色谱(prep-HPLC)纯化后，从0.3M的氯化钠(NaCl)或醋酸钠(NaOAc)溶液中用2-3倍用量的冷却的乙醇(ethanol)沉淀而使用。

合成-纯化的寡核苷酸用分析用高性能液相色谱(Analytical HPLC)分析，确认纯度为80％以上，用紫外-可见光谱仪(UV-VIS spectrometer)测定260nm波长下的吸光度，定量后，通过MALDI-TOF或Q-TOF质量分析仪确认寡核苷酸的分子量，然后进行了使用。

3.通过实时定量PCR(qRT-PCR)分析给药ASO的细胞的WFDC2mRNA表达量

将转化日前经过5至10次内的传代培养的细胞在9cm²(6well)的培养盘(#3006，SPL)中以0.25x10⁶个细胞(cell)的程度进行了细胞培养。第二天确认了9cm²(6well)培养盘面积的约80％左右的细胞增殖后，进行转化实验。作为转化试剂，使用了脂质体(lipofectamine)3000(#L3000008，Thermofisher)。将培养溶液用Opti-MEM(#A3635101，Gipco)替换，利用脂质体(lipofectamine)3000并根据制造商提供的协议，将0nM(对照(control))至100nM的ASO分别处理了24小时后，进行了细胞分析。

转化后，将培养基从培养盘中摘除后，用PBS(#ML 008-01，Welgene)洗涤两遍。然后，使用TRIzol(#15596018，Ambion)并根据制造商的协议从细胞中提取total RNA。将提取的RNA作为模板，利用ImProm-IITM逆转录系统(Reverse Transcription System)(#A3800，Promega)并根据制造商的协议合成了cDNA。然后，利用合成的cDNA和表2的引物以及TBFast qPCR Mix(#RR430，Takara)并根据制造商的协议进行了qRT-PCR。以分析用仪器StepOne^TM实时荧光定量PCR系统(Real-Time PCR System)(#4376357，Appliedbiosystems)qRT-PCR的结果为基础，将相对于0nM(对照(control))ASO处理组的WFDC2表达量换算为百分比。

[表2]

引物名称	碱基序列	SEQ ID NO：
			WFDC2 1-F	TGCTCTCTGCCCAATGATAA	3
WFDC2 1-R	TTGGGAGTGACACAGGACAC	4
			GAPDH-F	CTGACTTCAACAGCGACACC	5
GAPDH-R	GGTGGTCCAGGGGTCTTACT	6

4.通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)(ELISA)分析给药ASO的细胞的WFDC2蛋白质表达量

将转化日前经过5至10次内的传代培养的细胞在9cm²(24well)的培养盘(#30024，SPL)中以5.0x10⁴个细胞(cell)的程度进行了细胞培养。第二天确认了1.9cm²(24well)培养盘面积的约80％左右的细胞增殖后，进行转化实验。作为转化试剂，使用了脂质体(lipofectamine)(#L3000008，Invitrogen)。将培养溶液用Opti-MEM(#A3635101，Gipco)替换，利用脂质体(lipofectamine)3000并根据制造商提供的协议，将0nM(对照(control))至400nM的ASO分别处理了48小时。48小时后，将细胞培养液移取至1.5ml的微管(MCT-150-C，AXYGEN)，用4℃状态下的离心分离机以1000rpm的转速用时20分钟使细胞培养液中包含的残留物沉降后，只将上清液移取至1.5ml的微管，在-80℃的超低温冰箱中保存试样。

使用WFDC2 Duoset ELISA试剂盒(kit)(DY6274-05，R&D system，Minneapolis，MN，USA)并根据制造商提供的如下所示的协议测定了WFDC2的浓度。将人(Human)WFDC2捕捉抗体(capture Antibody)(#844347，R&D system)稀释于PBS后，分注于96微孔板(wellmicro-plate)(#DY990，R&D system)，在常温下反应30分钟后，在4℃的冰箱中保存一天。然后，将用Reagent diluent(#DY995，R&D system)稀释2倍的上述细胞培养液100μl或WFDC2重组蛋白质标准溶液100μl分注于96微孔板(well micro-plate)，在常温下反应2小时。接着，对各个96微孔板(well micro-plate)分注经Reagent diluent稀释的生物素化的人(Human)WFDC2捕捉抗体(capture Antibody)(#844348，R&D system)，在常温下反应2小时后，分注链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(Streptavidin-peroxidase)溶液(Streptavidin-HRP，#893975，R&D system)100μl后，在常温下反应20分钟。然后，对各个96微孔板(wellmicro-plate)分注四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine)溶液(底物溶液(Substratesolution)，#DY999，R&D system)100μl，反应7分钟后，分注2N浓度的硫酸溶液50μl，抑制反应，利用酶标仪(microplate reader)在450nm波长下测定了吸光度。各试样内的WFDC2的浓度是将测定的各试样的吸光度代入基于已知浓度的WFDC2重组蛋白质标准溶液的吸光度绘制的标准曲线而计算的。将相对于阴性对照组的WFDC2生成抑制率如下所示进行了计算。

5.利用SNU638异种移植(Xenograft)小鼠模型确认ASO的癌增殖抑制效果

在上述实施例中描述的细胞培养条件下，使生长的SNU638细胞漂浮于Matrigel(#354230，Corning)/PBS(#ML 008-01，Welgene)1:1的溶液后，为呼吸麻醉8周的雄性(Male)NOD.SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdcsscid/NCrKoat)注入3x10⁶个细胞(cell)。然后，为了癌细胞扎根、增殖，注入后进行了3周监测。癌细胞移植3周后，通过尾静脉注射(tail veininjection)途径(IV组)和皮下注射(subcutaneous injection)途径(SC组)，将7.5mpk、30mpk浓度的化合物3按照每周2次4周进行了注射(共8次)。IV7.5mpk组、IV30mpk组、SC7.5mpk组、SC30mpk组的N数各为8只，对照组(control)为5只。28天当中，使用游标卡尺测定癌细胞的尺寸(mm³)，从而确认了ASO的癌增殖抑制效果。

6.利用SF268异种移植(Xenograft)小鼠模型确认ASO的癌增殖抑制效果

使在上述实施例中描述的细胞培养条件下生长的SF268细胞漂浮于Matrigel(#354230，Corning)/PBS(#ML 008-01，Welgene)1:1的溶液后，为呼吸麻醉8周的雄性(Male)NOD.SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdcsscid/NCrKoat)注入5x10⁶个细胞。然后，为了癌细胞扎根、增殖，注入后进行了3周监测。癌细胞移植3周后，通过尾静脉注射途径(IV组)，将20mpk的化合物3按照每周3次4周进行了注射(共12次)。IV20mpk组的N数为8只，对照组为4只。24天当中，使用游标卡尺测定癌细胞的尺寸(mm³)，从而确认了ASO的癌增殖抑制效果。

7.统计分析

全部的统计分析是通过GraphPad prism 9.0.0完成的，显著性检验是用双因素方差分析多重比较试验(Two-way ANOVA Multiple Comparisons test)进行的，表示统计显著性的值记载为*、**、***。*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001。

实验结果

1.ASO的制造结果

通过上述实验方法的反义寡核苷酸的制作方法，合成了共380种反义寡核苷酸，包括5'和3'翼由5个连续的经2'-MOE修饰的核苷组成，间隔由8个至10个连续的天然DNA核苷组成，核苷之间的连接子均为经硫代磷酸酯修饰的5-8-5或5-10-5MOE缺口聚物的反义寡核苷酸；或者5'和3'翼由3个连续的经2'-LNA修饰的核苷组成，间隔由10个连续的天然DNA核苷组成，核苷之间的连接子均经硫代磷酸酯修饰的3-10-3LNA缺口聚物的反义寡核苷酸，将WFDC2的包含pre-mRNA(SEQ ID NO:1)或mRNA(SEQ ID NO:2)的起始位点和终止位点的碱基序列和缺口聚物模体示于下述表3。

[表3]

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2.ASO影响mRNA水平的效果确认

确认了在来源于人类的胶质母细胞瘤细胞株SF268中，上述制造的ASO是否使WFDC2 mRNA的表达减少。通过相对于0nM(对照(control))进行100nM的ASO处理，将WFDC2表达量被换算为百分比的结果示于表4。

[表4]

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另外，将在SNU638和SF268细胞株中显示出mRNA浓度依赖性生成抑制效果的化合物示于表5和表6。

[表5]

[表6]

3.ASO影响蛋白质水平的效果确认

通过ELISA确认了在来源于人类的胃癌细胞株SNU638和胰腺癌细胞株PANC1中，上述制造的ASO是否使WFDC2蛋白质的表达减少。

通过ELISA确认ASO对胃癌细胞株SNU638和胰腺癌细胞株PANC1的WFDC2蛋白质表达减少程度的结果如表7和表8所示，确认了化合物2、化合物3、化合物32、化合物43、化合物59、化合物80、化合物103、化合物113、化合物114、化合物115、化合物116、化合物117、化合物125、化合物130、化合物136、化合物142、化合物148、化合物149、化合物151、化合物159、化合物163、化合物199、化合物204、化合物208、化合物209、化合物223、化合物232、化合物233、化合物234、化合物237、化合物239、化合物244、化合物245、化合物246、化合物247、化合物248、化合物249、化合物279、化合物285、化合物286、化合物294、化合物304、化合物307、化合物308、化合物310、化合物311、化合物314、化合物324、化合物325、化合物330、化合物337、化合物370、化合物373、化合物374、化合物375、化合物376和化合物377分别使SNU638细胞株和PANC1细胞株中表达显著减少。

[表7]

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[表8]

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另外，如表9和表10所示，确认了化合物1、化合物3、化合物57、化合物58、化合物76、化合物77、化合物79、化合物80、化合物88、化合物113、化合物114、化合物115、化合物116、化合物117、化合物125、化合物136使SNU638细胞株中WFDC2的表达浓度依赖性减少，化合物2、化合物14、化合物24、化合物30、化合物32、化合物36、化合物37、化合物40、化合物41、化合物42和化合物43使PANC1细胞株中WFDC2的表达浓度依赖性减少。

[表9]

[表10]

4.由于WFDC2表达受阻产生的癌增殖抑制效果

对胃癌细胞株SNU638异种移植(Xenograft)小鼠模型给药化合物3的结果可以确认具有统计显著性的浓度依赖性癌增殖抑制效果并且无关乎给药途径，特别是，可以确认随着长期给药，其效果进一步增大(图1至图4)。

另外，对胶质母细胞瘤细胞株SF638异种移植(Xenograft)小鼠模型通过尾静脉注射给药化合物3的结果可以确认在20mpk浓度下具有统计显著性的癌增殖抑制效果，特别是，可以确认随着长期给药，其效果进一步增大(图5和图6)。

到目前为止，对本发明围绕其优选的实施例进行了研究。本发明所属技术领域的技术人员可以理解本发明在不脱离本发明的本质性的特性的范围内可以以变形的形态实现。因此，公开的实施例应从说明性的角度进行考虑而不是从限制性的角度进行考虑。本发明的范围显示在权利要求书中而不是上述的说明中，并且应被解释为在与其等同范围内的所有的差异包括在本发明中。

Claims (18)

1.一种反义化合物，其包括修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸与编码WFDC2即WAP四二硫化物核心域蛋白2的基因的转录体的核酸碱基序列互补结合，由10个至30个连续连接的核苷组成。

2.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述编码WFDC2的基因的转录体的核酸碱基序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

3.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述反义化合物包含由16个至20个连续连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸。

4.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含选自一个以上的修饰的核苷之间的连接子、包含修饰的糖部分的一个以上的修饰的核苷、以及包含修饰的核碱基的一个以上的修饰的核苷中的一个以上的修饰。

5.根据权利要求4所述的反义化合物，其中，所述修饰的核苷为包含一个以上的修饰的糖部分的修饰的核苷，所述一个以上的修饰的糖部分选自被2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-氨基、2’-氟、2’-阿拉伯糖-氟、2’-O-苄基或2’-O-甲基-4-吡啶取代的糖部分。

6.根据权利要求4所述的反义化合物，其中，所述修饰的核苷为选自锁核酸即LNA、限制性乙基双环核酸即cEt、2’-O,4’-C-亚乙基-桥联核酸即ENA和三环-DNA中的一个以上的修饰的核苷。

7.根据权利要求4所述的反义化合物，其中，所述修饰的核苷为包含糖代替物的修饰的核苷，所述糖代替物具有六元环或无环部分。

8.根据权利要求4所述的反义化合物，其中，所述修饰的核苷为包含一个以上的修饰的核碱基的修饰的核苷，所述一个以上的修饰的核碱基选自假尿苷、2'-硫代尿苷、N6'-甲基腺苷、5'-甲基胞苷、5'-氟-2-脱氧尿苷、N-乙基哌啶7'-EAA三唑修饰腺嘌呤、N-乙基哌啶6'-三唑修饰腺嘌呤、6'-苯基吡咯并胞嘧啶、2',4'-二氟甲苯酰基核糖核苷和5'-硝基吲哚。

9.根据权利要求4所述的反义化合物，其中，所述修饰的核苷之间的连接子为一个以上的修饰的核苷之间的连接子，所述一个以上的修饰的核苷选自磷酸三酯、氨基磷酸酯、甲磺酰基氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和甲氧基丙基-膦酸酯。

10.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含由连接的脱氧核苷组成的间隔段、由连接的核苷组成的5’翼段、以及由连接的核苷组成的3’翼段，所述间隔段位于5’翼段和3’翼段之间，各个翼段的核苷包含修饰的糖部分或糖代替物。

11.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含：由8个至10个连接的脱氧核苷组成的间隔段；

由3个至5个连接的核苷组成的5’翼段；以及

由3个至5个连接的核苷组成的3’翼段，所述间隔段位于5’翼段和3’翼段之间，各个翼段的各个核苷包含修饰的糖部分。

12.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述反义化合物为与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2互补结合的修饰的寡核苷酸，所述反义化合物包括具有如下碱基序列的修饰的寡核苷酸：包含与选自SEQ ID NO:1的碱基序列的起始位点25到终止位点46、起始位点284到终止位点305、起始位点520到终止位点545、起始位点2222到终止位点2344、起始位点7334到终止位点9301、起始位点9506到终止位点9551、起始位点9733到终止位点10143、起始位点10271到终止位点10302、起始位点10360到终止位点10905、起始位点10977到终止位点11292、起始位点11448到终止位点11563、以及起始位点11633到终止位点11773中的寡核苷酸碱基序列中的任意序列完全互补的8个以上的连续相邻的核碱基的碱基序列，所述修饰的寡核苷酸使WFDC的mRNA水平和蛋白质水平中的任一个或更多个降低。

13.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述反义化合物为与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2互补结合的修饰的寡核苷酸，包括具有如下碱基序列的修饰的寡核苷酸：包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:109、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ IDNO:205、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ IDNO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ IDNO:240、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ IDNO:254、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ IDNO:287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ IDNO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ IDNO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、以及SEQ ID NO:383中的任一个寡核苷酸碱基序列完全一致的8个以上的连续相邻的核碱基的碱基序列，所述修饰的寡核苷酸使WFDC的mRNA水平和蛋白质水平中的任一个或更多个降低。

14.根据权利要求1所述的反义化合物，其中，所述反义化合物为具有选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQID NO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:205、SEQID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:254、SEQID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ IDNO:264、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQID NO:316、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、以及SEQ ID NO:383中的任一个碱基序列的修饰的寡核苷酸。

15.一种缀合物，其在一个以上的非-核苷酸部分共价结合权利要求1至权利要求14中的任一项所述的反义化合物。

16.根据权利要求15所述的缀合物，其中，所述非-核苷酸部分包括蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白质、聚合物或它们的组合。

17.一种癌症预防或治疗用药物组合物，其包含权利要求1至权利要求14中的任一项所述的反义化合物或者权利要求15至权利要求16中的任一项所述的缀合物作为有效成分。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述癌症选自胃癌、食道癌、胆管癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部癌、脑肿瘤、肺癌、肝癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胆囊癌、肠癌和胰腺癌。