JPH09286795A - 核酸化合物 - Google Patents
核酸化合物Info
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- JPH09286795A JPH09286795A JP12114596A JP12114596A JPH09286795A JP H09286795 A JPH09286795 A JP H09286795A JP 12114596 A JP12114596 A JP 12114596A JP 12114596 A JP12114596 A JP 12114596A JP H09286795 A JPH09286795 A JP H09286795A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 内皮細胞の管腔形成を阻害する核酸の提供。
【解決手段】 核酸が内皮細胞の管腔形成を阻害するこ
とを見いだし、またいかなる塩基配列を有するものか゛
さらにはどの程度の塩基配列を有するものが適している
か同定した。
とを見いだし、またいかなる塩基配列を有するものか゛
さらにはどの程度の塩基配列を有するものが適している
か同定した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は血管新生の過程、特
に内皮細胞の管腔形成の過程を阻害する核酸化合物に関
するものであり、本発明の核酸化合物は管腔形成阻害
剤、さらには血管新生阻害剤としての効果を有するもの
であり、医薬や診断薬、特に癌、慢性関節リューマチ、
糖尿病性網膜症など血管新生に関わる疾患の治療剤とし
て有用なものであり、本発明は医薬、診断薬及び製薬技
術に属するものである。
に内皮細胞の管腔形成の過程を阻害する核酸化合物に関
するものであり、本発明の核酸化合物は管腔形成阻害
剤、さらには血管新生阻害剤としての効果を有するもの
であり、医薬や診断薬、特に癌、慢性関節リューマチ、
糖尿病性網膜症など血管新生に関わる疾患の治療剤とし
て有用なものであり、本発明は医薬、診断薬及び製薬技
術に属するものである。
【０００２】
【従来の技術】内皮細胞の管腔形成の過程は血管新生の
過程の一つであり、血管新生を阻害する物質としては、
サイトカインなどのペプチドや蛋白質、微生物二次代謝
産物などが知られており、これらの物質が内皮細胞の管
腔形成を阻害している可能性が示唆されている(寺野紘
細胞工学 14巻 426-431 1995年)。しかし、核酸化合物
による血管新生の阻害については、塩基性線維芽細胞増
殖因子をコードする遺伝子の一部に相補的な塩基配列を
有するホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレ
オチドである、いわゆるアンチセンス核酸（B. Ensoli
et al. The Journal of Clinical Investigation 94 巻
1736-46 1994年)が知られてはいるが、この様な核酸化
合物が管腔形成阻害作用を有するということに付いての
示唆は存在せず、もちろんどの様な核酸化合物が管腔形
成を阻害するかとういう知見も存在していない。
過程の一つであり、血管新生を阻害する物質としては、
サイトカインなどのペプチドや蛋白質、微生物二次代謝
産物などが知られており、これらの物質が内皮細胞の管
腔形成を阻害している可能性が示唆されている(寺野紘
細胞工学 14巻 426-431 1995年)。しかし、核酸化合物
による血管新生の阻害については、塩基性線維芽細胞増
殖因子をコードする遺伝子の一部に相補的な塩基配列を
有するホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレ
オチドである、いわゆるアンチセンス核酸（B. Ensoli
et al. The Journal of Clinical Investigation 94 巻
1736-46 1994年)が知られてはいるが、この様な核酸化
合物が管腔形成阻害作用を有するということに付いての
示唆は存在せず、もちろんどの様な核酸化合物が管腔形
成を阻害するかとういう知見も存在していない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、この様
な状況のなかで、内皮細胞の管腔形成を阻害する化合
物、特に核酸化合物が存在しないかについて検討したの
である。
な状況のなかで、内皮細胞の管腔形成を阻害する化合
物、特に核酸化合物が存在しないかについて検討したの
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み本発明者
等は鋭意研究を行い、内皮細胞の管腔形成を阻害する機
能を有する核酸化合物、特に管腔形成を一過程とする血
管新生を誘導する因子をコードする遺伝子の一部に相補
的な塩基配列を有する核酸化合物が、内皮細胞の管腔形
成を阻害することを見出し、本発明を完成したのであ
る。すなわち本発明は、内皮細胞の管腔形成を阻害する
機能を有することを特徴とする核酸化合物に関するもの
である。また本発明は、内皮細胞の管腔形成を阻害する
機能を有する１０乃至３０量体のオリゴマーからなるこ
とを特徴とする核酸化合物に関するものである。さらに
本発明は、内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を有し、
その塩基配列が血管新生誘導因子をコードする遺伝子の
一部に対して実質的に相補である、１０乃至３０量体の
オリゴマーであることを特徴とする核酸化合物に関する
ものであり、内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を有
し、その塩基配列が血管内皮細胞増殖因子をコードする
遺伝子の一部に対して実質的に相補である、１０乃至３
０量体のオリゴマーからなることを特徴とする核酸化合
物に関するものである。
等は鋭意研究を行い、内皮細胞の管腔形成を阻害する機
能を有する核酸化合物、特に管腔形成を一過程とする血
管新生を誘導する因子をコードする遺伝子の一部に相補
的な塩基配列を有する核酸化合物が、内皮細胞の管腔形
成を阻害することを見出し、本発明を完成したのであ
る。すなわち本発明は、内皮細胞の管腔形成を阻害する
機能を有することを特徴とする核酸化合物に関するもの
である。また本発明は、内皮細胞の管腔形成を阻害する
機能を有する１０乃至３０量体のオリゴマーからなるこ
とを特徴とする核酸化合物に関するものである。さらに
本発明は、内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を有し、
その塩基配列が血管新生誘導因子をコードする遺伝子の
一部に対して実質的に相補である、１０乃至３０量体の
オリゴマーであることを特徴とする核酸化合物に関する
ものであり、内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を有
し、その塩基配列が血管内皮細胞増殖因子をコードする
遺伝子の一部に対して実質的に相補である、１０乃至３
０量体のオリゴマーからなることを特徴とする核酸化合
物に関するものである。
【０００５】
【実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
の核酸化合物は、内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を
有する化合物であり、当該核酸化合物の管腔形成阻害効
果は、in vitro実験や in vivo実験で確かめることがで
きる(寺野紘 細胞工学 14巻 426-431、1995年；松沢・
谷口企画細胞工学別冊 医学実験マニュアルシリーズ２
pp304-305(林・井藤) pp306-313(松原・及川) 1996年；
赤松・松原 炎症とアレルギーＩ−２(大内編) pp239-25
6広川書店 1993年)。前者の例としては、マトリゲル上
における内皮細胞の管腔形成に及ぼす効果を調べること
により行うことができる。この際、核酸化合物の細胞内
導入効率を上げるための試薬(細胞内導入試薬)、すなわ
ち、いわゆるトランスフェクション試薬などを用いるこ
とができる。トランスフェクション試薬の例としては、
ＤＯＴＡＰ(Boehringer Mannheim Biochemica社)やリポ
フェクチン試薬(GibcoBRL社)などをあげることができ
る。マトリゲル上に内皮細胞を移すとともに核酸化合物
と細胞内導入試薬とを添加し、内皮細胞の管腔形成に及
ぼす効果を調べる。その方法としては、光学顕微鏡によ
る観察、その結果の写真撮影、および管腔の長さの測定
がある。後者の例としては、鶏受精卵しょう尿膜上にサ
ンプルをのせて培養し、サンプル周辺の血管の発達を観
察する方法(ＣＡＭ法)や兎の眼角膜に施した切れ目にサ
ンプルを植え込んで、角膜輪部からサンプルに向かって
新生する血管を調べる方法(ウサギ角膜法)がある。本発
明の核酸化合物としては、ホスホロチオエート型、天然
型あるいはその他のオリゴデオキシリボヌクレオチドが
挙げられ、それらはアミダイト法やチオフォスファイト
法などの方法を利用した自動合成機を用いて合成され、
逆相型又はイオン交換型のＨＰＬＣもしくは簡易型カー
トリッジなどを利用して精製され本発明に用いられる
(F. Eckstein編, Oligonucleotides and analogues - A
practical approach, IRL Press, Oxford, 1991 年)。
本発明の核酸化合物としては、１０乃至３０量体のオリ
ゴマーからなるものが好ましく、その塩基配列は任意に
選択され、前記した様に合成精製のうえ、管腔形成阻害
実験により適不適が決定されるが、本発明の核酸化合物
として好ましいものは、その塩基配列が血管新生誘導因
子をコードする遺伝子の一部に対して実質的に相補であ
るものである。より具体的には、血管新生を誘導する因
子をコードするmＲＮＡもしくはその前駆体の塩基配列
の一部に対して相補的な１０乃至３０量体からなる核酸
オリゴマーであるアンチセンス核酸を挙げることがで
き、無細胞実験や細胞実験で血管新生を誘導する因子に
対するアンチセンス核酸で、該因子の作用を阻害するア
ンチセンス核酸を用いるのが好ましい。また、その様な
アンチセンス核酸として、血管新生を誘導する因子をコ
ードするmＲＮＡもしくはその前駆体について、その２
次構造予測を計算で行い、その結果に基づいて選出した
ものも採用することができる
の核酸化合物は、内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を
有する化合物であり、当該核酸化合物の管腔形成阻害効
果は、in vitro実験や in vivo実験で確かめることがで
きる(寺野紘 細胞工学 14巻 426-431、1995年；松沢・
谷口企画細胞工学別冊 医学実験マニュアルシリーズ２
pp304-305(林・井藤) pp306-313(松原・及川) 1996年；
赤松・松原 炎症とアレルギーＩ−２(大内編) pp239-25
6広川書店 1993年)。前者の例としては、マトリゲル上
における内皮細胞の管腔形成に及ぼす効果を調べること
により行うことができる。この際、核酸化合物の細胞内
導入効率を上げるための試薬(細胞内導入試薬)、すなわ
ち、いわゆるトランスフェクション試薬などを用いるこ
とができる。トランスフェクション試薬の例としては、
ＤＯＴＡＰ(Boehringer Mannheim Biochemica社)やリポ
フェクチン試薬(GibcoBRL社)などをあげることができ
る。マトリゲル上に内皮細胞を移すとともに核酸化合物
と細胞内導入試薬とを添加し、内皮細胞の管腔形成に及
ぼす効果を調べる。その方法としては、光学顕微鏡によ
る観察、その結果の写真撮影、および管腔の長さの測定
がある。後者の例としては、鶏受精卵しょう尿膜上にサ
ンプルをのせて培養し、サンプル周辺の血管の発達を観
察する方法(ＣＡＭ法)や兎の眼角膜に施した切れ目にサ
ンプルを植え込んで、角膜輪部からサンプルに向かって
新生する血管を調べる方法(ウサギ角膜法)がある。本発
明の核酸化合物としては、ホスホロチオエート型、天然
型あるいはその他のオリゴデオキシリボヌクレオチドが
挙げられ、それらはアミダイト法やチオフォスファイト
法などの方法を利用した自動合成機を用いて合成され、
逆相型又はイオン交換型のＨＰＬＣもしくは簡易型カー
トリッジなどを利用して精製され本発明に用いられる
(F. Eckstein編, Oligonucleotides and analogues - A
practical approach, IRL Press, Oxford, 1991 年)。
本発明の核酸化合物としては、１０乃至３０量体のオリ
ゴマーからなるものが好ましく、その塩基配列は任意に
選択され、前記した様に合成精製のうえ、管腔形成阻害
実験により適不適が決定されるが、本発明の核酸化合物
として好ましいものは、その塩基配列が血管新生誘導因
子をコードする遺伝子の一部に対して実質的に相補であ
るものである。より具体的には、血管新生を誘導する因
子をコードするmＲＮＡもしくはその前駆体の塩基配列
の一部に対して相補的な１０乃至３０量体からなる核酸
オリゴマーであるアンチセンス核酸を挙げることがで
き、無細胞実験や細胞実験で血管新生を誘導する因子に
対するアンチセンス核酸で、該因子の作用を阻害するア
ンチセンス核酸を用いるのが好ましい。また、その様な
アンチセンス核酸として、血管新生を誘導する因子をコ
ードするmＲＮＡもしくはその前駆体について、その２
次構造予測を計算で行い、その結果に基づいて選出した
ものも採用することができる
【０００６】ここで、血管新生を誘導する因子として
は、直接的に血管内皮細胞に作用するものとして塩基性
線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor,
bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast gr
owth factor,aFGF)、血管内皮細胞増殖因子／血管透過
性因子(vascular endothelial growth factor/vascular
permeability factor,VEGF/VPF)、血小板由来内皮細胞
増殖因子(platelet-derived endothelial cell growth
factor,PD-ECGF)などが、また間接的に血管内皮細胞に
作用する物質としてtransforming growth factor-α(TG
F-α)、transforming growth factor-β(TGF-β)、angi
ogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-α)などをあげ
ることができる（渋谷正史 細胞工学14巻373-376 (199
5年)；鈴木日出夫 医学のあゆみ 175巻 517-521 (1995
年)；渋谷正史細胞工学 14巻 385-391 (1995年)；吉
田輝彦 細胞工学14巻 392-397 (1995年)）。血管内皮
細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)に関しては、マウス、ラット、
モルモット、ウシおよびヒトの正常または腫瘍細胞株で
分泌されており、また組織別では脳、下垂体、腎臓、卵
巣に存在することが明らかにされている[(Ferrara,N.,
et.al.Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ヒトＶＥＧＦ
遺伝子についてはそのｃＤＮＡがすでに単離されて塩基
配列が決定され、アミノ酸配列も推定されている。この
遺伝子からアミノ酸残基数の異なる４種類の蛋白(アミ
ノ酸残基数が１２１個、１６５個、１８９個、２０６個
の４種類)が作られ、それらの中で１２１個のアミノ酸
残基数のもの(ＶＥＧＦ121)と１６５個のアミノ酸残基
数のもの(ＶＥＧＦ165)が分泌型蛋白であると言われて
いる[(Ferrara,N., et.al. Endocrine Reviews 13:18(1
992)]。ＶＥＧＦ121はＶＥＧＦ165のカルボキシル末端
の４４個のアミノ酸が欠損したものであるが、ＶＥＧＦ
121とＶＥＧＦ165の間に、血管内皮細胞に対する作用の
違いがあるかどうかについては明らかでない。本発明の
核酸化合物は、管腔形成を阻害するため、管腔形成阻害
剤、さらには血管新生阻害剤としての効果があり、医薬
や診断薬として有用である。特に、癌、慢性関節リュー
マチ、糖尿病性網膜症、など血管新生に関わる疾患の治
療剤として有用である。
は、直接的に血管内皮細胞に作用するものとして塩基性
線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor,
bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast gr
owth factor,aFGF)、血管内皮細胞増殖因子／血管透過
性因子(vascular endothelial growth factor/vascular
permeability factor,VEGF/VPF)、血小板由来内皮細胞
増殖因子(platelet-derived endothelial cell growth
factor,PD-ECGF)などが、また間接的に血管内皮細胞に
作用する物質としてtransforming growth factor-α(TG
F-α)、transforming growth factor-β(TGF-β)、angi
ogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-α)などをあげ
ることができる（渋谷正史 細胞工学14巻373-376 (199
5年)；鈴木日出夫 医学のあゆみ 175巻 517-521 (1995
年)；渋谷正史細胞工学 14巻 385-391 (1995年)；吉
田輝彦 細胞工学14巻 392-397 (1995年)）。血管内皮
細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)に関しては、マウス、ラット、
モルモット、ウシおよびヒトの正常または腫瘍細胞株で
分泌されており、また組織別では脳、下垂体、腎臓、卵
巣に存在することが明らかにされている[(Ferrara,N.,
et.al.Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ヒトＶＥＧＦ
遺伝子についてはそのｃＤＮＡがすでに単離されて塩基
配列が決定され、アミノ酸配列も推定されている。この
遺伝子からアミノ酸残基数の異なる４種類の蛋白(アミ
ノ酸残基数が１２１個、１６５個、１８９個、２０６個
の４種類)が作られ、それらの中で１２１個のアミノ酸
残基数のもの(ＶＥＧＦ121)と１６５個のアミノ酸残基
数のもの(ＶＥＧＦ165)が分泌型蛋白であると言われて
いる[(Ferrara,N., et.al. Endocrine Reviews 13:18(1
992)]。ＶＥＧＦ121はＶＥＧＦ165のカルボキシル末端
の４４個のアミノ酸が欠損したものであるが、ＶＥＧＦ
121とＶＥＧＦ165の間に、血管内皮細胞に対する作用の
違いがあるかどうかについては明らかでない。本発明の
核酸化合物は、管腔形成を阻害するため、管腔形成阻害
剤、さらには血管新生阻害剤としての効果があり、医薬
や診断薬として有用である。特に、癌、慢性関節リュー
マチ、糖尿病性網膜症、など血管新生に関わる疾患の治
療剤として有用である。
【０００７】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 〇実施例１ ９６穴プレートの１０穴にマトリゲルマトリックス(Bec
ton Dickinson社製カタログ番号 40230A)を約２５μl/
穴ずつ入れ、５％ＣＯ2インキュベータに入れ、３７℃
で１２時間保った。ここへ、１８０μlの血清無添加Ｒ
ＰＭＩ培地に懸濁したヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を
各穴あたり１×１０4個入れた。ついで、自動合成機を
用いてアミダイト法で合成し、ＨＰＬＣで精製して５μ
Mに調製した下記塩基配列を有するホスホロチオエオー
ト型オリゴデオキシリボヌクレオチド、すなわち各核酸
化合物１０μｌ、トランスフェクション試薬（ＤＯＴＡ
Ｐ：Boehringer Mannheim Biochemica社製）と血清無添
加ＲＰＭＩ培地とを１：１５で混合した物５０μｌ、お
よび血清無添加のＲＰＭＩ培地４０μｌとを混ぜ、これ
を室温で１５分間放置し、その混合物の２０μｌを添加
する。 核酸化合物Ａ：ＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧ
ＡＡ(配列番号2) 核酸化合物Ｂ：ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＴＡ(配列番号3) 核酸化合物Ｃ：ＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧ
ＧＴ(配列番号4) 核酸化合物Ｄ：ＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣ
ＡＴ(配列番号5) 核酸化合物Ｅ：ＣＴＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧ
ＡＧ(配列番号6) 核酸化合物Ｆ：ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＣ
ＣＡ(配列番号7) 上記核酸化合物Ａは、配列番号１に示すＶＥＧＦをコー
ドする塩基配列のうち、２２７番目から２４６番目の塩
基配列に相補的な塩基配列を有するものであり、核酸化
合物Ｂは３１１番目から３３０番目の塩基配列に相補的
な塩基配列、核酸化合物Ｃは４０７番目から４２６番目
の塩基配列に相補的な塩基配列、核酸化合物Ｄは４１９
番目から４３８番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有
するものであり、核酸化合物Ｅは核酸化合物Ｄと同一の
塩基組成であるが、その塩基配列を入れ換えたものであ
り、核酸化合物Ｆは配列番号１に示すＶＥＧＦをコード
する塩基配列の４１９番目から４３８番目と同一の塩基
配列を有するものである。なお、配列番号１において、
１０１〜１０３番目がＶＥＧＦの翻訳開始コドンであ
り、５４２〜５４４番目が終止コドンである。対照とし
て核酸化合物を添加しない場合は、トランスフェクショ
ン試薬（ＤＯＴＡＰ：Boehringer Mannheim Biochemica
社製）と血清無添加ＲＰＭＩ培地とを１：１５で混合し
た物５０μｌ、及び血清無添加のＲＰＭＩ培地５０μｌ
を混合し１５分間室温で放置したもの、また、別の対照
としてトランスフェクション試薬を用いない場合は、５
μＭに調製した核酸化合物１０μｌと血清無添加のＲＰ
ＭＩ培地９０μｌを混ぜ１５分間室温で放置した混合物
の２０μｌを加えた。HUVECに核酸化合物などで処理し
たものを５％ＣＯ2インキュベータに入れ、３７℃で１
２時間保った。この結果を写真撮影したものを図として
示す。図の番号とその実験条件は次の通りである 図１ 核酸化合物及びトランスフェクション試薬共に無
添加の対照実験の結果図２ トランスフェクション試薬
のみを添加した場合の実験結果 図３ 核酸化合物Ａのみを添加した場合の実験結果 図４ 核酸化合物Ａとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図５ 核酸化合物Ｂとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図６ 核酸化合物Ｃとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図７ 核酸化合物Ｄとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図８ 核酸化合物Ｅとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図９ 核酸化合物Ｆとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図から明らかなように核酸化合物、特に血管内皮細胞増
殖因子のアンチセンス核酸であるホスホロチオエオート
型核酸化合物をトランスフェクション試薬とともに添加
した場合に管腔形成を著しく阻害することが分かる。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 〇実施例１ ９６穴プレートの１０穴にマトリゲルマトリックス(Bec
ton Dickinson社製カタログ番号 40230A)を約２５μl/
穴ずつ入れ、５％ＣＯ2インキュベータに入れ、３７℃
で１２時間保った。ここへ、１８０μlの血清無添加Ｒ
ＰＭＩ培地に懸濁したヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を
各穴あたり１×１０4個入れた。ついで、自動合成機を
用いてアミダイト法で合成し、ＨＰＬＣで精製して５μ
Mに調製した下記塩基配列を有するホスホロチオエオー
ト型オリゴデオキシリボヌクレオチド、すなわち各核酸
化合物１０μｌ、トランスフェクション試薬（ＤＯＴＡ
Ｐ：Boehringer Mannheim Biochemica社製）と血清無添
加ＲＰＭＩ培地とを１：１５で混合した物５０μｌ、お
よび血清無添加のＲＰＭＩ培地４０μｌとを混ぜ、これ
を室温で１５分間放置し、その混合物の２０μｌを添加
する。 核酸化合物Ａ：ＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧ
ＡＡ(配列番号2) 核酸化合物Ｂ：ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＴＡ(配列番号3) 核酸化合物Ｃ：ＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧ
ＧＴ(配列番号4) 核酸化合物Ｄ：ＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣ
ＡＴ(配列番号5) 核酸化合物Ｅ：ＣＴＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧ
ＡＧ(配列番号6) 核酸化合物Ｆ：ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＣ
ＣＡ(配列番号7) 上記核酸化合物Ａは、配列番号１に示すＶＥＧＦをコー
ドする塩基配列のうち、２２７番目から２４６番目の塩
基配列に相補的な塩基配列を有するものであり、核酸化
合物Ｂは３１１番目から３３０番目の塩基配列に相補的
な塩基配列、核酸化合物Ｃは４０７番目から４２６番目
の塩基配列に相補的な塩基配列、核酸化合物Ｄは４１９
番目から４３８番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有
するものであり、核酸化合物Ｅは核酸化合物Ｄと同一の
塩基組成であるが、その塩基配列を入れ換えたものであ
り、核酸化合物Ｆは配列番号１に示すＶＥＧＦをコード
する塩基配列の４１９番目から４３８番目と同一の塩基
配列を有するものである。なお、配列番号１において、
１０１〜１０３番目がＶＥＧＦの翻訳開始コドンであ
り、５４２〜５４４番目が終止コドンである。対照とし
て核酸化合物を添加しない場合は、トランスフェクショ
ン試薬（ＤＯＴＡＰ：Boehringer Mannheim Biochemica
社製）と血清無添加ＲＰＭＩ培地とを１：１５で混合し
た物５０μｌ、及び血清無添加のＲＰＭＩ培地５０μｌ
を混合し１５分間室温で放置したもの、また、別の対照
としてトランスフェクション試薬を用いない場合は、５
μＭに調製した核酸化合物１０μｌと血清無添加のＲＰ
ＭＩ培地９０μｌを混ぜ１５分間室温で放置した混合物
の２０μｌを加えた。HUVECに核酸化合物などで処理し
たものを５％ＣＯ2インキュベータに入れ、３７℃で１
２時間保った。この結果を写真撮影したものを図として
示す。図の番号とその実験条件は次の通りである 図１ 核酸化合物及びトランスフェクション試薬共に無
添加の対照実験の結果図２ トランスフェクション試薬
のみを添加した場合の実験結果 図３ 核酸化合物Ａのみを添加した場合の実験結果 図４ 核酸化合物Ａとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図５ 核酸化合物Ｂとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図６ 核酸化合物Ｃとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図７ 核酸化合物Ｄとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図８ 核酸化合物Ｅとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図９ 核酸化合物Ｆとトランスフェクション試薬を添加
した場合の実験結果 図から明らかなように核酸化合物、特に血管内皮細胞増
殖因子のアンチセンス核酸であるホスホロチオエオート
型核酸化合物をトランスフェクション試薬とともに添加
した場合に管腔形成を著しく阻害することが分かる。
【０００８】
【発明の効果】本発明によれば、管腔形成を阻害する核
酸化合物、および血管新生を阻害する核酸化合物を与え
ることができ、それらは、医薬や診断薬として有用であ
る。特に、癌、慢性関節リューマチ、糖尿病性網膜症、
など血管新生に関わる疾患の治療剤として有用である。
酸化合物、および血管新生を阻害する核酸化合物を与え
ることができ、それらは、医薬や診断薬として有用であ
る。特に、癌、慢性関節リューマチ、糖尿病性網膜症、
など血管新生に関わる疾患の治療剤として有用である。
【０００９】
【００１０】配列番号：１ 配列の長さ：７７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (cＤＮＡ to mＲＮＡ） 配列： TTATGTATCA TACACATACG ATTTAGGTGA CACTATAGAA TACAAGCTTA 50 TGCATGCGGC CGCATCTAGA GGGCCCGGCC CCGGTCGGGC CTCCGAAACC 100 ATGAACTTTC TGCTGTCTTG GGTGCATTGG AGCCTTGCCT TGCTGCTCTA 150 CCTCCACCAT GCCAAGTGGT CCCAGGCTGC ACCCATGGCA GAAGGAGGAG 200 GGCAGAATCA TCACGAAGTG GTGAAGTTCA TGGATGTCTA TCAGCGCAGC 250 TACTGCCATC CAATCGAGAC CCTGGTGGAC ATCTTCCAGG AGTACCCTGA 300 TGAGATCGAG TACATCTTCA AGCCATCCTG TGTGCCCCTG ATGCGATGCG 350 GGGGCTGCTG CAATGACGAG GGCCTGGAGT GTGTGCCCAC TGAGGAGTCC 400 AACATCACCA TGCAGATTAT GCGGATCAAA CCTCACCAAG GCCAGCACAT 450 AGGAGAGATG AGCTTCCTAC AGCACAACAA ATGTGAATGC AGACCAAAGA 500 AAGATAGAGC AAGACAAGAA AAATGTGACA AGCCGAGGCG GTGAGCCGGG 550 CAGGAGGAAG GAGCCTCCCT CAGGGTTTCG GGAACCAGAT CCACTAGTTC 600 TAGATGCATG CTCGAGCGGC CGCCAGTGTG ATGGATATCT GCAGAATTCC 650 AGCACACTGG CCGTTACTAG TGGATCCGAG CTCCCAAAAA AAAAAAAAAA 700 AAAAAAAAAA AAAAACCGAA TTAATTCGTA ATCATGGTCA TAGCTGTTTC 750 CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCA 774
【００１１】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アンチセンス核酸） 配列： ＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡ
【００１２】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アンチセンス核酸） 配列： ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡ
【００１３】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アンチセンス核酸） 配列： ＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴ
【００１４】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アンチセンス核酸） 配列： ＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴ
【００１５】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ＣＴＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧ
【００１６】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＡ
【図１】 核酸化合物及びトランスフェクション試薬共
に無添加の場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形
成に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
に無添加の場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形
成に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
【図２】 トランスフェクション試薬のみを添加した場
合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成に及ぼす効
果を示す顕微鏡写真である。
合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成に及ぼす効
果を示す顕微鏡写真である。
【図３】 核酸化合物Ａのみを添加した場合のマトリゲ
ル上におけるHUVECの管腔形成に及ぼす効果を示す顕微
鏡写真である。
ル上におけるHUVECの管腔形成に及ぼす効果を示す顕微
鏡写真である。
【図４】 核酸化合物Ａとトランスフェクション試薬を
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
【図５】 核酸化合物Ｂとトランスフェクション試薬を
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
【図６】 核酸化合物Ｃとトランスフェクション試薬を
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
【図７】 核酸化合物Ｄとトランスフェクション試薬を
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
【図８】 核酸化合物Ｅとトランスフェクション試薬を
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
【図９】 核酸化合物Ｆとトランスフェクション試薬を
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
添加した場合のマトリゲル上におけるHUVECの管腔形成
に及ぼす効果を示す顕微鏡写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 水島 裕 神奈川県川崎市宮前区菅生２−16−１ 聖 マリアンナ医科大学難病治療研究センター 内 (72)発明者 内多 潔 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を有
することを特徴とする核酸化合物。 - 【請求項２】 内皮細胞の管腔形成を阻害する機能を有
する１０乃至３０量体のオリゴマーであることを特徴と
する核酸化合物。 - 【請求項３】 オリゴマーの塩基配列が、血管新生誘導
因子をコードする遺伝子の一部に対して実質的に相補で
あることを特徴とする請求項２記載の核酸化合物。 - 【請求項４】 血管新生誘導因子が血管内皮細胞増殖因
子であることを特徴とする請求項３の核酸化合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12114596A JPH09286795A (ja) | 1996-04-18 | 1996-04-18 | 核酸化合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12114596A JPH09286795A (ja) | 1996-04-18 | 1996-04-18 | 核酸化合物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09286795A true JPH09286795A (ja) | 1997-11-04 |
Family
ID=14803980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12114596A Pending JPH09286795A (ja) | 1996-04-18 | 1996-04-18 | 核酸化合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09286795A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0979869A1 (en) * | 1998-08-07 | 2000-02-16 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Short oligonucleotides for the inhibition of VEGF expression |
-
1996
- 1996-04-18 JP JP12114596A patent/JPH09286795A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0979869A1 (en) * | 1998-08-07 | 2000-02-16 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Short oligonucleotides for the inhibition of VEGF expression |
| WO2000008141A3 (en) * | 1998-08-07 | 2000-05-18 | Aventis Pharma Gmbh | Short oligonucleotides for the inhibition of vegf expression |
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