KR20240056619A - Lpa 억제제 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

LPA RNA간섭(RNAi)제는 LPA(apo(a))를 코딩하는 핵산 분자를 표적으로 하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 92 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 12개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 하나 이상의 RNA 간섭제를 포함하는 약학적 조성물, 및 간 세포에 대한 상기 RNA 간섭제의 생체내 전달, LPA 유전자 발현의 억제 및 이러한 핵산 기반 치료제를 사용하여 지질단백질(a)(Lp(a))의 순환 수준을 낮추고 심혈관 관련 질환을 치료 또는 예방하는 용도를 제공한다.

Description

LPA 억제제 및 이의 용도
본 출원은 2021년 9월 18일에 제출된 출원번호가 202111110773.1이고 명칭이 “LPA 억제제 및 이의 용도”인 중국 특허 출원, 및 2022년 1월 20일에 제출된 출원번호가 202210068123.3이고 명칭이 “siRNA 접합체 및 이의 용도”인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하며, 그 모든 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다.
본 발명은 생물 의약 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로 LPA 억제제 및 이의 용도에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 이중 가닥 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)에 의해 유도되어 진화 과정에서 고도로 보존되는 현상을 말하며, 상동성 mRNA의 효율적이고 특이적인 분해를 일으킨다. RNAi 기술은 특정 유전자의 발현을 특이적으로 녹아웃시키거나 차단할 수 있기 때문에(길이가 30을 초과하는 dsRNA는 인터페론 독성을 유발할 수 있음), 이 기술은 유전자 기능을 탐색하고 감염성 질환 및 악성 종양을 치료하는 데 널리 사용되고 있다. 짧은 dsRNA는 척추동물을 포함한 많은 유기체에서 유전자 특이적 전사 후 침묵을 지시하며, 이는 유전자 기능을 연구하는 데 유용한 도구가 되었다. RNAi는 아르고너트(Argonaute) 단백질 및 Dicer 효소와 결합된 siRNA에 의해 형성된 복합체인 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)에 의해 매개된다. 여기서, 작은 dsRNA 중간 분자, 즉 작은 RNA 이중 가닥이 먼저 Dicer 효소에 의해 절단된 다음, 이 작은 RNA 이중 가닥이 먼저 녹아서 "기능적" 단일 가닥을 형성함으로써 RISC 복합체의 "가이드" 역할을 한다. 각각의 작은 dsRNA 분자에 대해 단 하나의 가닥인 가이드 가닥만이 특정 Argonaute 단백질과 결합하여 활성화된 RISC 복합체를 형성할 수 있다. siRNA 및 마이크로 RNA 등의 RNA 간섭제는 유전자 침묵을 통해, 즉 mRNA 분자를 분해해 단백질 유전자 번역을 억제해 단백질의 형성을 막는 올리고뉴클레오타이드이다.
지질단백질(a)[Lp(a)]는 이질적인 저밀도 지질단백질(LDL) 유사 입자로서, 지질핵과 아포지질단백질 B(apoB-100), 및 독특한 성분을 함유하며, 즉, 이황화 결합을 통해 apoB-100의 아포지질단백질(a)(apo(a))에 부착된다.
LPA(Apo(a)) 유전자는 주로 간에서 발현되며 발현은 인간과 인간이 아닌 영장류로 제한된다. 인간의 Lp(a) 수준은 유전적으로 정의되며 식이, 운동 또는 기타 생활 방식 변화에 따라 크게 변하지 않는다. LPA의 길이는 Kringle KIV2 도메인의 수에 따라 달라지며, 이의 발현은 도메인의 수와 음의 상관관계를 가진다.
여러 연구에서 Lp(a) 수치를 분석한 결과 높은 Lp(a) 수치가 심혈관 질환, 중풍 및 기타 병증(죽상동맥경화성 협착증을 포함함)에 대한 독립적인 위험 요소인 것으로 나타났다. 또한, 전유전체 관련 분석에서는 LPA가 죽상동맥경화성 협착증과 같은 질환의 유전적 위험 인자임을 암시한다. 따라서, LPA 관련 질환에 관련된 치료제, 특히 LPA 발현 수준을 감소시키는 약물 제제의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적 중 하나는 세포, 대상체, 예컨대 포유동물(예를 들어 인간)에서 LPA(apo(a)) 수준을 조절(예를 들어 감소)할 수 있는 LPA RNAi제 및 방법을 제공하는 것이다. LPA는 아포지질단백질(a)(apo(a))(즉 지질단백질(a) 입자(Lp(a))의 핵심성분)을 코딩하는 유전자의 명칭으로, 인간 DNA 서열(SEQ ID NO.1)은 도 1a와 도 1b에 도시된 바와 같다. LPA(apo(a)라고도 불리움) RNA간섭(RNAi)제(제(RNAi 유발인자 또는 유발제로도 불리움) 및 LPA RNAi제를 함유하는 조성물은 LPA 유전자의 발현을 선택적이고 효과적으로 억제하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 LPA RNAi제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 질환 또는 병증의 예방 또는 치료, 또는 질환 또는 병증의 예방 또는 치료용 약물의 제조를 위한 상기 LPA RNAi제의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 183 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 12개의 연속 뉴클레오타이드, 또는 상기 적어도 12개의 연속 뉴클레오타이드와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오타이드는 변형되거나 변형되지 않은 상태인 LPA의 RNA 간섭제를 제공한다.
바람직하게, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 12 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성되고, 바람직하게는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드로 구성된다.
바람직하게, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 뉴클레오타이드이다.
바람직하게, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어 변형된 뉴클레오타이드를 형성된다.
바람직하게, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 표 2에 열거된 어느 하나의 변형된 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이다.
바람직하게, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 이중 가닥 구조를 포함한다.
바람직하게, 상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 독립적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직하게, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오타이드, 이환형 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 뉴클레오타이드, EVP, UNA 및 GNA 중 적어도 하나이다.
바람직하게, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번, 5번, 6번, 8번, 10번, 14번 및 16번 중 적어도 하나의 부위는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드에 의해 변형되고, 바람직하게는 5-7개의 부위가 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드에 의해 변형된다.
바람직하게, 상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 독립적으로 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고; 바람직하게, 상기 센스 가닥은 3' 및 5' 말단의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합을 포함하거나, 상기 안티센스 가닥은 3' 및 5' 말단의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 안티센스 가닥은 표 2 중 어느 하나의 변형된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은,(1) 상기 센스 가닥이 표 2에 열거된 변형된 센스 가닥 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 상기 안티센스 가닥이 표 2에 열거된 변형된 안티센스 가닥 서열을 포함하거나 이로 구성되는 특징을 갖는다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭제는 리간드를 더 포함한다.
바람직하게, 상기 리간드는 표적화기를 포함한다,
바람직하게, 상기 표적화기는 아시알로당단백질 수용체 리간드를 포함한다,
바람직하게, 상기 아시알로당단백질 수용체 리간드는 갈락토스 클러스터를 포함한다,
바람직하게, 상기 리간드는 상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 접합되고, 바람직하게, 센스 가닥에 접합된다.
일 실시형태에서, 상기 LPA RNA 간섭제는 구조 Z-X(I)를 포함하고,
상기 식에서, X는 뉴클레오타이드 서열이고, Z는 뉴클레오타이드 서열의 제1 링커 모이어티이며, Z는 X에 직접 연결되거나 화학적 그룹을 통해 연결되며, Z의 일반식은 (Z-1)과 같으며, 여기서 O기의 일단은 뉴클레오타이드 서열에 연결되며;
,
상기 식에서 R1은 O, S, NR3 또는 CR3R4이고, 상기 식에서 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환 지방족, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로고리 또는 치환 또는 비치환 사이클로알킬이며;
상기 식에서 R2는 -O-, -S-, -NH-, -CH2-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2NH-, -CH2O-, -NH-C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-NH-, 또는 -NH(CO)NH-이고, 상기 -CH2-는 할로겐, 알킬, 알콕시, 알킬아미노로부터 선택되는 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있으며; 상기 a1과 a2는 동일하거나 상이하며 각각 0 내지 20의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수로부터 선택된다.
바람직하게, X로 표시되는 뉴클레오타이드 서열은 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이다.
바람직하게, 상기 제1 링커 모이어티 Z는 제2 링커 모이어티 L1에 연결되고, 상기 제2 링커 모이어티 L1는 분지점 그룹 E에 연결된다.
바람직하게, 상기 분지점 그룹 E는 a개의 표적 조합체에 연결되고, 상기 a는 0 내지 10의 정수로부터 선택되며, 바람직하게 1 내지 5의 정수이고; 상기 표적 조합체는 1: 1 비율의 테더링 모이어티 L2 및 표적화 모이어티 T를 포함한다.
구체적으로, 상기 LPA RNA 간섭제 구조식은 다음과 같이 표현될 수 있다.
(I-0) .
일 실시형태에서, 상기 LPA RNA 간섭제는 하기 구조를 가진다.
(II),
일반식 (II)에서,
L3은 제3 링커 모이어티를 포함하고, L4는 표적화 모이어티이며, 구체적으로, L3 및 L4는 동일하거나 상이하며, 바람직하게, L3 및 L4은 각각 하기 구조를 갖는다.
X는 뉴클레오타이드 서열이고, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있으며,
Y는 O 또는 S이고,
b, c, d 및 e는 각각 0 내지 10의 정수로부터 선택되고, b 및 e가 다를 경우 0이다. 일 실시예에서, b는 0,이고 e는 3 내지 6의 정수이다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 약물의 제조를 위한 전술한 LPA RNA 간섭제의 용도를 더 제공하고, 상기 약물은 포유동물에서 LPA mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키거나, 관련 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하거나, 질환 또는 병증의 위험을 줄인다.
특정 실시형태에서, 상기 관련 질환 또는 병증은 LPA 단백질의 발현 수준이 100 nmol/L 이상을 가리킨다.
특정 실시형태에서, 상기 질환 또는 병증은 간 유래 질환을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 질환 또는 병증은 염증성 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환 또는 대사 질환을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 심혈관 및 뇌혈관 질환질환은 고지혈증, 중풍, 죽상 동맥 경화증, 혈전증, 관상동맥질환 또는 대동맥 협착증을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 약물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고, 바람직하게, 상기 약학적으로 허용 가능한 부형제는 PBS 완충액 또는 생리식염수를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 약물은 조성물은 LDL-C, 콜레스테롤 및 트리글리세리드 저하제 중 적어도 하나를 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 약물은 조성물은 PCSK9 RNAi 억제제, PCSK9 항체 억제제 및 PCSK9 소분자 억제제를 더 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포 또는 조직에서 LPA mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포 또는 조직을 유효량의 전술한 LPA RNAi제 또는 전술한 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 세포는 간 세포이다.
특정 실시형태에서, 상기 조직은 간 조직이다.
특정 실시형태에서, 상기 세포 및 조직은 시험관 내이다.
특정 실시형태에서, 상기 세포 및 조직은 대상체 체내에 위치한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대상체 체내 LPA mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 필요한 대상체에게 유효량의 전술한 LPA RNAi제 또는 전술한 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 질환 또는 병증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 타겟 대상체에게 유효량의 전술한 LPA RNAi제 또는 전술한 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 화합물 또는 상기 약학적 조성물은 피하, 정맥내, 경구, 직장 또는 복강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다.
유익한 효과: 실험을 통해 본 발명의 LPA RNAi제가 시험관 내 및 생체내 실험(마우스의 체내) 모두에서 Apo(a) 단백질 및 대응응하는 mRNA의 발현을 유의하게 억제할 수 있음이 입증되었다. 그 중, 마우스 실험에서는 고용량에서 Apo(a) 단백질 발현의 최대 99% 녹다운 억제가 달성될 수 있었다.
도 1a-1b는 SEQ ID NO.1의 구체적인 서열이다.
도 2는 본 발명의 실시예 7의 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 8의 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 9의 실험 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 10의 실험 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 11의 실험 결과이다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제, 과제 해결 수단 및 유익한 효과를 더욱 명확하게 하기 위하여, 이하에서 도면, 실시예 및 화학반응식을 결합하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 여기에 설명된 구체적인 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것일 뿐, 본 발명을 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 한다.
용어 정의
본 발명에서, 용어 "LPA", "Apo(a)" 또는 "apo(a)"는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 apo(a)를 코딩하는 임의의 핵산 또는 단백질 서열을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, apo(a)는 apo(a)를 코딩하는 DNA 서열, apo(a)를 코딩하는 DNA(인트론 및 엑손을 함유하는 게놈 DNA를 포함함)로부터 전사된 RNA 서열, apo(a)를 코딩하는 mRNA 서열 또는 apo(a)의 펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "apo(a) 특이적 억제제"는 apo(a) 핵산 및/또는 apo(a) 단백질의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 모든 제제를 의미한다. 예를 들어, apo(a) 특이적 억제제에는 핵산(안티센스 올리고뉴클레오타이드 포함), 펩타이드, 항체, 소분자 및 apo(a) 핵산 및/또는 apo(a) 단백질의 발현을 억제할 수 있는 기타 제제가 포함된다. 특정 실시형태에서, apo(a) 특이적 억제제는 apo(a) 핵산 발현 및/또는 apo(a) 단백질 발현을 특이적으로 조절함으로써 하류 구성요소를 포함하는 지질 수송 시스템의 다른 구성요소에 영향을 미칠 수 있다. 유사하게, 특정 실시형태에서, apo(a) 특이적 억제제는 동물의 다른 분자 과정에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에서, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며 이중 가닥 및 단일 가닥 분자일 수 있는 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드(데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체)를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 유전자 또는 유전자 단편(예: 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 라벨), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 분리된 DNA, 임의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, siRNA, miRNA, shRNA, RNAi제 및 프라이머를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 임의의 다양한 변형 또는 치환으로 하나 이상의 염기, 당 및/또는 포스페이트에서 변형되거나 치환될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드 구조는 중합체 조립 전이나 후에 변형될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 표지 성분과의 커플링에 의해 중합 후에 변형될 수 있다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드로서 본 명세서의 임의의 실시형태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려졌거나 예측되는 2개의 상보적인 단일 가닥 형태 각각을 포함한다.
본 발명에서, "표적 핵산" 또는 "표적 서열"은 일반적으로 안티센스 화합물이 혼성화되어 원하는 효과(예: 안티센스 활성)를 생성하도록 의도되는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 안티센스 화합물에는 생리학적 조건 하에서 혼성화를 허용하도록 표적 핵산에 충분한 상보성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 포함된다. 특정 실시형태에서, "표적 핵산"은 포유동물 LPA를 코딩하는 DNA 또는 RNA, 예컨대 인간 LPA mRNA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 포스포디에스테르 결합(또는 관련 구조적 변이체 또는 합성 유사체)를 통해 연결된 복수개의 뉴클레오타이드 잔기(데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 관련 구조적 변이체 또는 합성 유사체)로 구성된 중합체를 의미한다. 따라서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 뉴클레오타이드 잔기 및 이들 사이의 연결이 자연 발생 뉴클레오타이드의 중합체를 의미하지만, 이 용어의 범위에는 또한 펩타이드 핵산(PNA), 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 2-O-메틸리보핵산 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 유사체가 포함된다. 상기 분자의 정확한 크기는 구체적인 용도에 따라 달라질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 길이가 짧으며 일반적으로 약 10-30개의 뉴클레오타이드 잔기이이고, "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"이라는 용어는 일반적으로 더 큰 올리고뉴클레오타이드에 사용되지만 상기 용어는 임의의 길이의 분자를 나타낼 수도 있다.
특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형되지 않은 리보뉴클레오사이드(RNA) 및/또는 변형되지 않은 데옥시리보뉴클레오사이드(DNA) 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 용어 "변형된 올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드 및/또는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드 간 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "변형된 뉴클레오사이드"는 일반적으로 자연 발생 RNA 또는 DNA 뉴클레오사이드와 비교하여 적어도 하나의 화학적 변형을 함유하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 변형된 뉴클레오사이드는 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 핵염기를 포함한다.
본 발명에서, "핵염기"라는 용어는 일반적으로 모든 핵산의 구성요소이고 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)을 포함하는 헤테로고리 피리미딘 또는 퓨린 화합물을 의미한다. . 뉴클레오타이드에는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 모방체, 무염기 부위(Ab 또는 X) 또는 대체물 대체 부분이 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "핵염기 서열"은 일반적으로 임의의 당, 결합 또는 핵염기 변형과 무관한 연속 핵염기의 순서를 의미한다. "변형되지 않은 핵염기" 또는 "자연 발생 핵염기"라는 용어는 일반적으로 자연적으로 발생하는 RNA 또는 DNA의 헤테로고리형 핵염기, 즉 퓨린 염기인 아데닌(A)과 구아닌(G) 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C)(5-메틸C 포함) 및 우라실(U)을 의미한다. "변형된 핵염기"는 일반적으로 자연 발생 핵염기가 아닌 임의의 핵염기를 의미한다.
본 발명에서, "당 모이어티"라는 용어는 일반적으로 뉴클레오사이드의 자연 발생 당 모이어티 또는 변형된 당 모이어티를 의미한다. 용어 "자연 발생 당 모이어티"는 일반적으로 자연 발생 RNA에서 발견되는 리보푸라노실기 또는 자연 발생 DNA에서 발견되는 데옥시리보푸라노실기를 의미한다. "변형된 당 모이어티"은 치환된 당 모이어티 또는 당 대체물을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "뉴클레오사이드 간 결합"은 일반적으로 올리고뉴클레오타이드 내 인접한 뉴클레오사이드 사이의 공유 결합을 의미한다. "자연 발생 뉴클레오사이드 간 결합"은 3' 내지 5' 포스포디에스테르 결합을 의미한다. "변형된 뉴클레오사이드 간 결합"은 자연 발생 뉴클레오사이드 간 결합 이외의 모든 뉴클레오사이드 간 결합을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적 핵산(예를 들어, 표적 게놈 서열, mRNA 전구체 또는 mRNA 분자)의 상응하는 단편에 상보적인 핵염기 서열을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 특정 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 12 내지 30개의 핵염기이다. 특정 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산(예: LPA 폴리뉴클레오타이드)의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변형되지 않거나 변형된 핵산이다.
본 발명에서, 용어 "안티센스 가닥"은 일반적으로 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi제(예를 들어, dsRNA)의 가닥을 지칭한다. 본 발명에서 용어 "상보적인 영역"은 일반적으로 본원에 정의된 서열(예를 들어 표적 서열)에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보적인 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 불일치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 있을 수 있다. 일반적으로 가장 허용되는 불일치는 말단 영역, 예를 들어 5' 말단 및/또는 3' 말단의 5, 4, 3 또는 2개 뉴클레오타이드 내에 있다.
본 발명에서, 용어 "센스 가닥"(S)은 일반적으로 용어가 본원에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥인 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi제의 가닥을 의미한다. 상기 가닥은 때때로 "센스" 가닥이라고도 불린다. 그들의 서열 덕분에 안티센스 가닥은 원하는 mRNA를 표적으로 삼는 반면, 센스 가닥은 다른 표적을 표적으로 삼는다. 따라서 안티센스 가닥이 RISC에 통합되면 올바른 표적이 타겟팅된다. 센스 가닥을 통합하면 표적을 벗어난 효과가 발생할 수 있다. 이러한 표적 이탈 효과는 센스 가닥의 변형을 사용하거나 5' 엔드 캡을 사용하여 제한할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상보적"은 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, RNAi제 안티센스 가닥)에 대해 제1 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, RNAi제 센스 가닥 또는 LPA mRNA)을 설명하는 데 사용될 때 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 특정 조건 하에서 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화(염기쌍 수소 결합을 형성)하여 이중 가닥 몸체 또는 이중 나선 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 상보적 서열에는 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairs) 또는 비-왓슨-크릭 염기쌍이 포함되며, 자연 발생 또는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 모방체를 포함하며, 이는 상기 이들의 혼성화 능력에 관한 요건이 충족되는 한이다. "상보적"은 각 뉴클레오사이드에서 핵염기 상보성을 반드시 요구하지는 않는다. 대신 일부 불일치는 허용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "완전히 상보적"은 일반적으로 제1 폴리뉴클레오타이드의 연속 서열에 있는 염기의 전부(100%)가 제2 폴리뉴클레오타이드의 연속 서열에 있는 동일한 수의 염기에 혼성화된다는 것을 의미한다. 연속 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 본 발명에서, "부분적으로 상보적"이라는 것은 일반적으로 혼성화된 염기 서열 쌍에서 제1 폴리뉴클레오타이드의 연속 서열에 있는 염기의 약 70% 이상이 제2 폴리뉴클레오타이드의 연속 서열에 있는 동일한 수의 염기에 혼성화된다는 것을 의미한다. 본 발명에서, "실질적으로 상보적"이라는 것은 일반적으로 혼성화된 염기 서열 쌍에서 제1 폴리뉴클레오타이드의 연속 서열에 있는 염기의 약 90% 이상이 제2 폴리뉴클레오타이드의 연속 서열에 있는 동일한 수의 염기에 혼성화된다는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "상보적", "완전히 상보적" 및 "실질적으로 상보적"은 RNAi제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이 또는 RNAi제의 안티센스 가닥과 LPA mRNA의 서열 사이의 염기 매칭에 대하여 사용될 수 있다. 서열 동일성 또는 상보성은 변형에 의존하지 않는다. 예를 들어, 동일성 또는 상보성을 측정하기 위해 A와 Af는 U(또는 T)에 상보적이고 A와 동일한다.
본 발명에서, 용어 "리간드"는 일반적으로 생물학적 활성 물질(올리고뉴클레오타이드)에 공유적으로 또는 화학적으로 결합할 수 있는 임의의 화합물 또는 분자를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 리간드는 수용체와 같은 다른 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용할 수 있으며, 리간드와 상호작용하는 수용체는 세포 표면에 존재할 수 있거나 대안적으로 세포내 및/또는 세포간 수용체일 수 있으며, 리간드와 수용체의 상호 작용은 생화학적 반응을 일으킬 수도 있거나, 단순히 물리적 상호작용이나 결합일 수도 있다.
본 발명에서, "유도", "억제", "향상", "상승", "증가", "감소", "저하" 등의 용어는 일반적으로 두 상태 사이의 정량적 차이를 나타낸다. 예를 들어, "apo(a)의 활성 또는 발현을 억제하는 데 효과적인 양"은 처리된 샘플의 apo(a) 활성 또는 발현 수준이 미처리된 샘플의 apo(a) 활성 또는 발현 수준보다 낮음을 의미한다. 상기 용어는 예를 들어 발현 수준 또는 활성 수준에 적용된다. "감소"와 "저하"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 원래보다 작은 임의의 변화를 의미한다."감소"와 "저하"는 상대적인 용어이며 측정 전후의 비교가 필요하다. "감소" 및 "낮추기"에는 완전한 고갈이 포함된다.
특정 실시형태에서, 용어 “감소”는 당업계에 공지된 표준 방법(본 발명에 기술된 것과 같은 방법)에 의해 검출될 수 있는 제1 샘플에서 유전자, 단백질과 같은 유전자 산물 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 제2 샘플에서 상응한 유전자, 단백질과 같은 유전자 산물 또는 바이오마커의 발현 수준/양과 비교하여 약 5% 내지 95% 또는 100% 전체적으로 감소한 것일 수 있다. 특정 실시형태에서, 용어 “감소”는 시험 샘플 중 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 감소를 지칭하고, 여기서 감소는 상응하는 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 0.9배 내지 0.01배 감소한 것을 의미한다.
본 발명에서, "발현"이라는 용어는 일반적으로 유전자가 궁극적으로 단백질을 생산하는 과정을 의미한다. 발현에는 전사, 전사후 변형(예: 스플라이싱, 폴리아데닐화, 5'-캡 추가) 및 번역이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 일반적으로 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 하나 이상의 무독성 물질을 의미한다. 이러한 제제는 일반적으로 염, 부형제, 완충제, 방부제, 상용성 담체 및 선택적으로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 의약에 사용되는 경우에는 염은 약학적으로 허용 가능한 염이어야 하나, 약학적으로 허용되지 않는 염도 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하는데 편리하게 사용될 수 있으며 본 발명의 범위에서 제외될 수 없다. 이러한 약리학적 및 약학적으로 허용 가능한 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 붕산, 포름산, 말론산, 숙신산 등의 산으로 제조된 염일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염으로 제조될 수도 있다.
본 발명에서, "예방 및/또는 치료"라는 용어는 질환의 예방 및/또는 치료를 포함할 뿐만 아니라 일반적으로 질환의 발병을 예방하는 것, 질환의 진행을 늦추거나 역전시키는 것, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 발생을 예방하거나 늦추는 것, 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 완화시키는 것, 질환 및/또는 이와 관련된 임의의 증상의 심각도 및/또는 지속 기간을 감소시키는 것, 및/또는 질환 및/또는 이와 관련된 임의의 증상의 심각도 추가적인 증가를 예방하는 것, 질환으로 인한 생리학적 손상을 예방, 감소 또는 역전시키는 것, 현재 치료받는 환자에게 일반적으로 유익한 약리학적 효과를 포함한다. 본 발명의 RNAi제 또는 약학적 조성물이 질환의 임의의 증상 또는 발현의 완전한 치료 또는 근절을 달성하기 위해 실행 가능한 치료제일 필요는 없다. 관련 기술 분야에서 인식된 바와 같이, 치료제로 사용되는 약물은 주어진 질환 상태의 심각도를 감소시키지만 유용한 치료제로 간주되기 위해 질환의 모든 징후를 제거할 필요는 없다. 유사하게, 예방적으로 투여된 치료는 실행 가능한 예방제를 구성하기 위해 병증의 발병을 예방하는 데 완전히 효과적일 필요는 없다. 단순히 대상체에게 질환의 영향을 줄이거나(예를 들어 증상의 수나 심각도를 줄이거나 다른 치료의 효과를 높이거나 다른 유익한 효과를 생성함으로써) 또는 질환의 발생 또는 악화 가능성을 줄이기만 해도 충분하다.
본 발명에서, "질환" 또는 "병증"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 기능 수행을 방해하거나 교란하는 신체 또는 특정 기관의 임의의 상태 변화와 같이 대상체가 정상 상태로부터 벗어나는 것, 및/또는 및/또는 환자 또는 환자와 접촉한 사람이 불편함, 불편함, 기능 장애, 고통, 심지어 사망과 같은 증상을 유발을 의미한다. 질환 또는 병증는 장애(distemper), 불편함(ailing), 작은 질병(ailment), 질환(malady), 기능 장애(disorder), 질환(sickness), 아픔(illness), 불편함(complaint), inderdisposion 또는 affectation으로도 불릴 수 있다.
본 발명에서 용어 "투여"는 일반적으로 임의의 도입 또는 전달 경로에 의해 대상체의 신체 내로 본 발명의 약물 제제를 도입하는 것을 의미한다. 세포, 기관 또는 조직을 상기 약물과 접촉시키기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이러한 투여에는 정맥내, 동맥내, 비강내, 복강내, 근육내, 피하 또는 경구가 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 1일 용량은 일정 기간 동안 1회, 2회 이상 투여하기에 적합한 형태로 1회, 2회 또는 그 이상의 용량으로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "접촉"은 일반적으로 두 개 이상의 서로 다른 유형의 물질이 임의의 순서, 임의의 방식 및 임의의 기간 동안 함께 접촉하는 것을 의미한다. 접촉은 생체 내(in vivo), 생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 본 발명의 RNAi제 또는 조성물이 세포 또는 조직과 직접 접촉된다는 것을 의미할 수 있다. 다른 일부 실시형태에서, 이 용어는 본 발명의 RNAi제 또는 조성물을 세포 또는 조직과 간접적으로 접촉시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 대상체가 본 발명의 RNAi제 또는 조성물에 접촉하고, 이후 RNAi제 또는 조성물이 확산 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 능동 또는 수동 수송 과정에 의해(화합물이 이 과정을 통해 체내에서 순환) 세포 또는 조직과 접촉하는 방법을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "유효량" 또는 "유효 용량"은 일반적으로 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 약물 또는 치료제의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"은 일반적으로 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 사용되는 경우 질환의 해소를 촉진(이는 질병 증상의 심각도 감소, 질병 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속시간 증가, 질환으로 인한 손상 또는 장애 예방으로 입증)하는 임의의 약물의 양을 의미한다. 약물의 "예방 유효량" 또는 "예방적 유효 용량"은 일반적으로 질환 진행 또는 질환 재발 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 사용되는 경우 질환 진행 또는 질환 재발을 억제할 수 있는 약물의 양을 의미한다. 특정 실시형태에서, "유효량"은 원하는 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 RNAi제의 양을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "대상체"은 일반적으로 진단, 예후, 개선, 예방 및/또는 치료가 필요한 인간 또는 인간이 아닌 동물(포유류 포함), 예를 들어 인간, 인간이 아닌 영장류(유인원, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 미후), 가축(개, 고양이), 농장동물(말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험동물(마우스, 래트, 토끼, 기니피그)을 의미한다. 인간 대상에는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체가 포함된다. 대상체에는 동물 질환 모델이 포함된다.
본 발명에서, 용어 "포함한다", "갖는다", "할 수 있다", "함유한다" 및 이들의 변형은 일반적으로 추가적인 동작이나 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 전환 문구, 용어 또는 단어로 의도된다. "...로 구성된다"라는 용어는 일반적으로 다른 구성요소(또는 유사하게 특징, 정수, 단계 등)가 존재할 수 없음을 의미한다. 문맥상 명확하게 달리 명시되지 않는 한, 개수가 한정되지 않은 명사는 복수 지시대상도 포함한다.
"약"이라는 용어가 값의 범위를 나타내기 위해 사용되는 경우, 명시된 값이 나열된 값에서 최대 10%까지 달라질 수 있음을 나타내기 위해 컷오프 또는 특정 값이 사용된다. 따라서, 용어 "약"은 ±10% 이하의 변동, ±5% 이하의 변동, ±1% 이하의 변동, ±0.5% 이하의 변동, 또는 ±0.1% 이하의 변동을 포함할 수 있다.
LPA RNAi제
본 발명에 기술된 LPA 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi제(본 발명에서 LPA RNAi제로 지칭됨)는 LPA 유전자를 발현하는 세포에 전달 또는 발현된 후 RNA 간섭(RNAi)의 생물학적 과정을 통해 시험관 내 및/또는 체내에서 LPA의 발현을 억제하거나 녹다운한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, LPA는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 적절한 경우LPA 유전자, LPA mRNA 또는 LP(a) 단백질을 의미할 수 있다. RNAi제에는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일 양태에서, 본 발명은 LPA(apo(a))를 코딩하는 핵산 분자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 LPA RNAi제를 제공하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 183 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22 또는 적어도 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 변형된 상태(및 변형 후 리간드 추가) 및 변형되지 않은 원래 상태일 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 12개 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는뉴클레오타이드 서열: SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 183 중 어느 하나의 또는 이와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO:183 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 다른 경우에는 최대 1개, 2개 또는 3개까지의 뉴클레오타이드 치환(예를 들어, 아데노신이 우라실로 대체됨)이 일어나거나, 결실되거나 첨가될 경우, 유래된 RNAi제는 여전히 유도체의 공급원인 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 183 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오타이드 서열보다 20% 미만으로 감소된 억제 활성을 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드이다.
예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드는 siRNA이다.
예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 가닥만 포함할 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 LPA RNAi제 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 길이는 독립적으로 17 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 19-26개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 RNAi제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 26개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 23개의 뉴클레오타이드 길이이고 안티센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 22개의 뉴클레오타이드 길이이고 안티센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 길이이고 안티센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 19개의 뉴클레오타이드 길이이고 안티센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
특정 실시형태에서, 안티센스 가닥 서열은 LPA mRNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열(때때로 표적 서열로 지칭됨)에 100%(완전히) 상보적이거나 적어도 90%(실질적으로) 상보적이다. 센스 가닥 서열은 안티센스 가닥의 서열과 100%(완전) 상보적이거나 적어도 90%(실질적으로) 상보적이므로, 센스 가닥 서열은 LPA mRNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열(표적 서열)과 완전하게 동일하거나 적어도 90% 동일하다.
특정 실시형태에서, 상기 LPA RNAi제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 어닐링하여 듀플렉스를 형성한다. LPA RNAi제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 상보적 듀플렉스 영역 내에서, 센스 가닥 코어 서열은 안티센스 코어 서열에 적어도 90% 상보적이거나 100% 상보적이다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥 코어 서열은 안티센스 가닥 코어 서열의 상응하는 17, 18, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오타이드 서열에 적어도 90% 또는 100% 상보적인 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20 또는 적어도 21개의 뉴클레오타이드 서열을 함유한다(즉, LPA RNAi제의 센스 가닥 및 안티센스 코어 서열은 적어도 90％의 염기쌍 또는 100％의 염기쌍의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20 또는 적어도 21개의 뉴클레오타이드 영역을 갖는다).
특정 실시형태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 코어 서열의 3' 말단, 5' 말단 또는 3' 및 5' 말단 두곳에 선택적으로 그리고 독립적으로 추가적인 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오타이드(연장)를 함유할 수 있다. 안티센스 가닥에 추가적인 뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 이는 LPA mRNA의 상응하는 서열에 상보적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 센스 가닥에 추가 뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 이는 LPA mRNA의 상응하는 서열과 동일하거나 동일하지 않을 수(identical) 있다. 안티센스 가닥에 추가 뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 이는 상응한 센스 가닥의 추가 뉴클레오타이드에 상보적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
특정 실시형태에서, 상기 LPA RNAi제는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오타이드 길이인 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 LPA RNAi제는 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드 길이인 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 안티센스 가닥 연장 뉴클레오타이드는 우라실 또는 티미딘 뉴클레오타이드 또는 상응하는 LPA mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이인 5' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시형태에서, LPA RNAi제는 1 또는 2개의 뉴클레오타이드 길이인 5' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 안티센스 가닥 연장 뉴클레오타이드는 우라실 또는 티미딘 뉴클레오타이드 또는 상응하는 LPA mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 가닥은 상술한 임의의 3' 연장부와 상술한 임의의 5' 연장부의 조합을 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 LPA RNAi제는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이인 3' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 센스 가닥 연장 뉴클레오타이드는 아데노신, 우라실 또는 티미딘 뉴클레오타이드, AT 디뉴클레오타이드, 또는 LPA mRNA 서열의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오타이드 길이인 5' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 센스 가닥 연장 뉴클레오타이드는 우라실 또는 아데노신 뉴클레오타이드 또는 LPA mRNA 서열의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 센스 가닥은 3' 연장부 및/또는 5' 연장부를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 92 중 어느 하나의 또는 이와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 센스 가닥은 SEQ ID NO: 93-183 중 어느 하나의 또는 이와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 LPA RNAi제의 안티센스 및 센스 가닥 서열은 표 1에 제시된 바와 같다.
본 명세서에 기술된 LPA RNAi제는 안티센스 가닥을 센스 가닥에 어닐링함으로써 형성될 수 있다. 표 1에 나열된 서열을 포함하는 센스 가닥은 연속되는 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오타이드 서열에서 적어도 90% 상보적인 한 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제 안티센스 가닥은 표 1의 임의의 안티센스 가닥 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제 안티센스 가닥은 표 1의 임의의 안티센스 가닥 서열 중 뉴클레오타이드 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 2-21, 1-22, 2-22, 3-22, 1-23, 2-23, 3-23 또는 4-23의 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제 센스 가닥은 표 1의 임의의 센스 가닥 서열 중 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 센스 가닥은 표 1의 임의의 센스 서열의 뉴클레오타이드 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21 또는 2-21의 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 기술된 LPA RNAi제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오타이드를 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 기술된 LPA RNAi제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상이한 수의 뉴클레오타이드를 함유한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 센스 가닥의 5' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단은 평활 말단을 형성한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 평활 말단을 형성한다. 특정 실시형태에서, RNAi제의 양쪽 말단은 평활 말단을 형성한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 2개의 말단 중 어느 것도 평활 말단이 아니다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 평활 말단은 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오타이드가 상보적인(상보적인 염기 쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi제의 말단을 의미한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 센스 가닥의 5' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단은 프레이드 말단을 형성한다. 특정 실시형태에서, RNAi제의 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 프레이드 말단을 형성한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 양쪽 말단은 프레이드 말단을 형성한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 말단 중 어느 것도 프레이드 말단이 아니다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 프레이드 말단은 일반적으로 어닐링된 2개의 가닥의 말단 뉴클레오타이드가 쌍을 형성하지만(즉, 돌출 말단을 형성하지 않음) 상보적이지 않은(즉, 상보적 쌍이 아님) 이중 가닥 RNAi제의 말단을 의미한다. 본 발명에서 돌출 말단은 이중 가닥 RNAi제의 하나의 가닥 말단에 있는 하나 이상의 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 세그먼트이다. 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 있을 수 있으며 3' 또는 5' 돌출부를 형성한다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 평활 말단 및 프레이드 말단, 평활 말단 및 5' 돌출 말단 말단, 평활 말단 및 3' 돌출 말단 말단, 프레이드 말단 및 5' 돌출 말단 말단, 프레이드 말단 및 3' 돌출 말단 말단, 2개의 5' 돌출 말단 말단, 2개의 3' 돌출 말단 말단, 5' 돌출 말단 말단 및 3' 돌출 말단 말단, 2개의 프레이드 말단 또는 2개의 평활 말단을 포함한다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 염, 혼합 염 또는 유리산으로 제조된다.
변형된 뉴클레오타이드
본 발명의 LPA RNAi제에는 변형되지 않은 핵산뿐만 아니라 효능을 향상시키기 위해 변형된 핵산, 및 뉴클레오사이드 치환의 중합체가 포함된다. 변형되지 않은 핵산은 당, 염기 및 인산염 구조 성분이 자연 발생 성분, 바람직하게는 인체 내 자연 발생 성분과 동일하거나 실질적으로 동일함을 의미한다. 선행 기술은 희귀하거나 특이하지만 자연 발생 RNAs를 변형된 RNAs로 취급한다(Limbach et al.,(1994)Nucleic Acids Res.22: 2183-2196 참조). 이러한 희귀하거나 특이한 변형된 RNAs는 일반적으로 변형된 RNAs라고 하며(분명히 전사 후 변형의 결과이기 때문에) 본 발명에서는 변형되지 않은 RNA로 간주된다. 본 발명에 사용된 변형된 RNA는 핵산의 하나 이상의 성분, 즉 당, 염기 및 인산염 구조 중 하나 이상의 성분을 의미하며, 이는 자연 발생 성분과 다르며, 바람직하게는 인체에 의해 생성된 자연 발생 성분과 다르다. 뉴클레오사이드 대체물은 리보스 인산염 백본이 보여지는 바와 같은 리보스 인산염 백본과의 혼성화와 실질적으로 유사하도록 올바른 공간 관계에 염기를 배치하는 비-리보스 인산염 구조로 대체된 분자이며, 예를 들어 하전되지 않은 리보스 인산염 백본의 유사체이다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제 중 뉴클레오타이드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 변형된다.
특정 실시형태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 독립적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
RNAi제를 변형하는 두 가지 주요 목적은 생물학적 환경에서 분해에 대한 안정성을 얻고 약력학적 특성과 같은 약리학적 특성을 개선하는 것이다. RNAi제는 비자연 발생 염기, 또는 비당류 원형 운반체 분자와 같은 RNAi 시약에 사용되는 비천연 당의 일반적인 특성을 위한 비자연 발생 당을 함유할 수 있다. RNAi제는 증가된 뉴클레아제 저항성을 위해 뉴클레오타이드 사이의 결합(예: 키랄 포스포로티오에이트 결합)을 포함할 수 있다. RNAi제은 추가적으로 또는 대안적으로 뉴클레아제 저항성을 증가시키기 위해 리보스 유사체를 함유할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드에는 데옥시뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 모방체, 무염기 뉴클레오타이드(본 발명에서 X, Ab로 표시됨), 2'-변형된 뉴클레오타이드, 3'에서 3으로 연결된(역) 뉴클레오타이드(본 발명에서 invdN, invN, invn, invX, invAb로 표시됨), 비자연 발생 염기를 함유하는 뉴클레오타이드, 브리지된 뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(PNA), 2', 3'-세코뉴클레오타이드 모방체(잠금 해제된 핵염기 유사체, 본 발명에서는 NUNA 또는 NUNA로 표시됨), 잠긴 뉴클레오타이드(본 발명에서 NLNA 또는 NLNA로 표시됨), 3'-O-메톡시(2' 뉴클레오사이드 간 결합된) 뉴클레오타이드(본 발명에서 3'-OMen으로 표시됨), 2'-F-아라비노스 뉴클레오타이드(본 발명에서 NfANA 또는 NfANA로 표시됨), 5 '-Me, 2'-플루오로 뉴클레오타이드(본 발명에서 5Me-Nf로 표시됨), 모르폴리노 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오타이드(본 발명에서 vpdN으로 표시됨), 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오타이드 및 사이클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오타이드(cPrpN)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 2 '-변형된 뉴클레오타이드(즉, 5원 당고리의 2' 부위에 수산기 이외의 기를 갖는 뉴클레오타이드)에는 2'-O-메틸 뉴클레오타이드(본 발명에서 뉴클레오타이드 서열에서 소문자 n으로 표시됨), 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오타이드(본 발명에서 Nf로 표시됨, 또한 본 발명에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드로 표시됨), 2'-데옥시뉴클레오타이드(본 발명에서 dN으로 표시됨), 2'-메톡시에틸(2'-O-2-메톡시에틸) 뉴클레오타이드(본 발명에서 NM 또는 2'-MOE로 표시됨), 2'-아미노뉴클레오타이드 및 2'-알킬 뉴클레오타이드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 하나 이상의 변형이 단일 LPA RNAi제에, 또는 심지어 이의 단일 뉴클레오타이드 내에 통합될 수 있다. LPA RNAi제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 당업계에 공지된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 하나의 뉴클레오타이드의 변형은 다른 뉴클레오타이드의 변형과 독립적이다.
변형된 뉴클레오타이드에는 변형된 염기를 갖는 뉴클레오타이드도 포함된다. 변형된 염기에는 합성 및 자연 발생 염기, 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린이 포함되나 이제 제한되지 않고, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸시토신, 잔틴, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로겐화 우라실 및 시토신, 5-프로피닐우라실 및 시토신, 6-아조라실, 시토신 및 티민, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-술파닐, 8-히드록시 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌이 포함된다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 비표준 결합 또는 백본(즉, 변형된 뉴클레오사이드 간 결합 또는 변형된 백본)에 의해 연결된다. 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 간 결합은 비-포스페이트-함유 공유 뉴클레오사이드 간 결합이다. 변형된 뉴클레오사이드 간 결합 또는 백본에는 정상적인 3'-5' 연결이 있는 5'-포스포로티오에이트 그룹(본 발명에서 sN, sn, sNf 또는 sdN에서와 같이 뉴클레오타이드 앞에 소문자 s로 표시됨), 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 포스페이트 트리에스테르, 아미노알킬-포스페이트 트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 에스테르, 포스피네이트, 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬 포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트(phosphinate)가 포함되고, 포스포라미데이트에는 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬 포스포르아미데이트, 티오카르보닐 포스포라미데이트, 티오카르보닐알킬-포스포네이트, 티오카르보닐알킬 포스페이트 트리에스테르, 모르폴리노 결합 및 보란 포스페이트 에스테르, 이들 물질의 2'-5' 연결된 유사체 및 역극성을 갖는 물질이 포함되며; 뉴클레오사이드의 인접한 단위 쌍은 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연된다. 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 간 결합 또는 백본은 인 원자가 없다. 인 원자가 없는 변형된 뉴클레오사이드 간 결합에는 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당류내 결합, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 당류내 결합, 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로고리형 당내 결합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 간 백본에는 실리콘 백본, 황화물, 설폭사이드 및 설폰 백본, 포르밀(formacetyl) 및 티오포르밀 백본, 메틸렌포르밀 및 티오포르밀 백본, 올레핀 함유 백본, 설파메이트 산성 에스테르 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본, 설포네이트 및 설폰아미드 백본, 아미드 백본 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 함유하는 기타 백본이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
리간드
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 리간드를 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 리간드는 그것이 결합하는 RNAi제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 특정 실시형태에서, 리간드는 리간드가 결여된 종에 비해 선택된 표적의 친화성을 향상시킨다. 선택된 표적은 예를 들어 분자, 세포 또는 세포 클래스 및 세포 또는 기관 공동, 조직, 기관 또는 신체 특정 부위이다.
특정 실시형태에서, 리간드는 수송, 혼성화 및 특이성 특성을 촉진할 수 있고, 생성된 자연 발생 또는 변형된 올리고리보뉴클레오타이드의 뉴클레아제 저항성을 촉진하거나, 본 명세서에 기술된 임의의 특성을 함유하는 단량체 및/또는 또는 자연 발생 또는 변형된 리보뉴클레오타이드의 접합체의 다량체 분자의 뉴클레아제 저항성을 촉진할 수 있다.
예를 들어, 리간드는 또한 표적화기, 예를 들어 간세포 또는 공장 세포와 같은 특정 세포에 결합하는 항체와 같은 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질과 같은 세포 또는 조직 표적화제를 포함할 수 있다. 표적화기는 갑상선 자극 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 유당, 다가 갈락토스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 다가 만노스, 다가 트레할로스, 글리코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르트산염, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 콜산, 엽산, 비타민 B12 또는 비오틴일 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 리간드는 표적화기를 포함한다.
특정 실시형태에서, 표적화기는 1가, 2가, 3가, 4가이거나 더 높은 원자가를 가질 수 있다. 대표적인 표적화기에는 세포 표면 분자에 친화성을 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 합텐, 항체, 단클론 항체, 항체 단편 및 체세포 표면 분자에 친화성을 갖는 항체 모방체가 포함된다.
특정 실시형태에서, 표적화기는 간세포 또는 간을 표적화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 표적화기는 아시알로당단백질 수용체 리간드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 아시알로당단백질 수용체 리간드는 하나 이상의 갈락토스 유도체 또는 갈락토스 클러스터를 포함하거나 이로 구성된다. 본 발명에서, 갈락토스 유도체라는 용어는 갈락토스 및 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성(갈락토스의 친화도와 동일하거나 그 이상)을 갖는 갈락토스 유도체를 모두 포함한다. 갈락토스 유도체에는 갈락토스, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸-갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부티릴-갈락토사민 및 N-이소-부티릴갈락토사민이 포함된다. 갈락토스 유도체는 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)에 결합하여 분자를 간세포로 표적화하기 위해 생체 내에서 사용되어 왔다. ASGPr 리간드와 ASGPr의 결합은 간세포에 대한 세포 특이적 표적화 및 간세포로의 분자의 세포내 이입을 촉진한다. 갈락토스 클러스터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 RNAi 폴리뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 리간드는 상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 접합된다. 예를 들어, 리간드는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 접합될 수 있다.
전달 비히클
특정 실시형태에서, LPA RNAi제를 세포 또는 조직에 전달하기 위해 전달 비히클을 사용할 수 있다. 전달 비히클은 LPA RNAi제의 세포 또는 조직으로의 전달을 향상시키는 화합물이다. 전달 비히클은 양친매성 중합체, 가역적으로 변형된 중합체 또는 펩타이드, 또는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민과 같은 중합체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 당업계에서 이용 가능한 지질, 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀 또는 기타 전달 시스템과 조합될 수 있다. LPA RNAi제는 또한 표적화기, 지질(콜레스테롤 및 콜레스테롤 기반 유도체 포함), 나노입자, 중합체, 또는 당업계에서 이용 가능한 기타 전달 시스템에 화학적으로 접합될 수 있다.
본 발명은 포유동물 간세포에 LPA RNAi제를 생체내 전달하는 방법을 설명한다. 특정 실시형태에서 전달 비히클이 사용될 수 있다. 전달 비히클은 중합체(예: 양친매성 중합체, 막 활성 중합체), 리간드 등일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 아시알로당단백질 리간드를 포함하는 표적화 리간드에 연결된다. 예를 들어, LPA RNAi제는 갈락토스 클러스터를 포함하거나 이로 구성된 표적화 리간드에 연결될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 하기 일반식으로 표시되는 siRNA 접합체를 제공한다.
(I-0) 또는
(II),
일반식 (I)에서:
X는 뉴클레오타이드 서열이고 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있으며, Z는 뉴클레오타이드 서열의 제1 링커 모이어티이고 Z는 X에 직접 연결되거나 화학적 그룹을 통해 연결되며, Z의 일반식은 (Z-1)과 같으며, 여기서 O기의 일단은 뉴클레오타이드 서열에 연결되며;
상기 식에서 R1은 O, S, NR3 또는 CR3R4이고, 상기 식에서 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환 지방족, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로고리 또는 치환 또는 비치환 사이클로알킬이며;
상기 식에서 R2는 -O-, -S-, -NH-, -CH2-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2NH-, -CH2O-, -NH-C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-NH-, 또는 -NH(CO)NH-이고, 상기 -CH2-는 할로겐, 알킬, 알콕시, 알킬아미노로부터 선택되는 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있으며; 상기 a1과 a2는 동일하거나 상이하며 각각 0 내지 20의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수로부터 선택되며, 더욱 바람직하게 1 내지 5의 정수로부터 선택된다.
바람직하게, X로 표시되는 뉴클레오타이드 서열은 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이다.
바람직하게, 상기 제1 링커 모이어티 Z는 제2 링커 모이어티 L1에 연결되고, 상기 제2 링커 모이어티 L1는 분지점 그룹 E에 연결된다.
바람직하게, 상기 분지점 그룹 E는 a개의 표적 조합체에 연결되고, 상기 a는 0 내지 10의 정수로부터 선택되며, 바람직하게 1 내지 5의 정수이고; 상기 표적 조합체는 1: 1 비율의 테더링 모이어티 L2 및 표적화 모이어티 T를 포함한다.
일반식 (II)에서,
L3은 제3 링커 모이어티를 포함하고, L4는 표적화 모이어티이며, 구체적으로, L3 및 L4는 동일하거나 상이하며, 바람직하게, L3 및 L4은 각각 하기 구조를 갖는다.
X는 뉴클레오타이드 서열이고, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있으며,
Y는 O 또는 S이고,
b, c, d 및 e는 각각 0 내지 10의 정수로부터 선택되고, b 및 e가 다를 경우 0이다. 일 실시예에서, b는 0,이고 e는 3 내지 6의 정수이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 제2 링커 모이어티 L1은 하기 구조를 가지며;
상기 식에서 f, g, h 및 i는 각각 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수이다.
일 실시예에서, 리간드에서 L1의 위치는 아래의 블록 구조와 같다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 테더링 모이어티 L2는 하기 구조식을 가지며;
상기 식에서 j, k, l, m, n 및 o는 각각 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수이다.
일 실시예에서, 리간드에서 L2의 위치는 아래의 블록 구조와 같다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 센스 가닥 및 안티센스 가닥, 및 상기 siRNA 접합체를 포함하는 LPA RNA 간섭제를 제공한다.
본 발명의 실시예의 다른 목적은 상기 RNA 간섭제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에서 제공되는 siRNA 접합체는 표적화 모이어티가 세포 또는 세포 수용체에 접합되는 효율을 향상시켜 RNA 간섭의 작용 효과를 향상시킨다.
일 바람직한 실시형태에서, 상기 표적화 리간드 중 화합물 Z의 일반식은 하기(Z-2)로 표시되는 바와 같고;
바람직하게 R2는 -NH-이고, 이때 화합물 Z는,
이며;
바람직하게 R2는 -C(O)-이고, 이때 화합물 Z는
이다.
바람직하게, L1은
일 실시형태에서, 일반식 (I)에서, 상기 화합물 E는 하기 5가지 구조 중 하나로부터 선택된다.
일 실시예에서, 일반식 (I)에서 화합물 L2는
상기 식에서 j, k, l, m, n 및 o는 각각 1 내지 20의 정수이며;
바람직하게, L2는,
의 구조식을 가진다.
바람직한 실시형태에서, 일반식 (I)에서 상기 표적 리간드(X 모이어티를 포함하지 않음)는 하기 구조를 가지며;
(I-I),
(I-II),
(I-III),
(I-IV),
(I-V),
(I-VI),
(I-VII), 또는
(I-VIII)이다.
일 실시형태에서, 상기 표적화 리간드 중 T는 N-아세틸-갈락토사민, 갈락토스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부티릴 갈락토사민 및 N--이소부티릴-갈락토사민 중 하나로부터 선택되고, 바람직하게는 N-아세틸-갈락토사민이며, 구조식은 다음과 같다.
바람직한 실시예에서, 일반식 (I)의 표적화 리간드는 포스페이트 그룹 또는 포스포로티오에이트 그룹 또는 포스폰산 그룹을 통해 siRNA 말단에 연결된다.
바람직한 실시예에서, 상기 표적화 리간드는 하기 구조를 가지며;
(I-1),(Gal-5-3)
(I-2),
(I-3),
(I-4),
(I-5),
(I-6),
(I-7),
(I-8),
(I-9),
(I-10),
(I-11),
(I-12),
(I-13),
(I-14),
(I-15), 또는
(I-16);
일반식 (II)의 일 실시형태에서, 상기 표적화 리간드 중 H―O―L3은,
(II-a-I),
(II-a-II),
(II-a-III), 또는
(II-a-III)이며,
상기 식에서 R2는 각각 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -CH2-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2NH-, -CH2O-, -NH-C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-NH-, -NH(CO)NH-이고, 상기 -CH2-는 할로겐 또는 알킬에 의해 임의로 치환될 수 있으며, 상기 알킬은 히드록시, 아미노, 할로겐, 알콕시 및 알킬아미노로부터 선택되는 하나의 치환기에 의해 추가로 치환될 수 있으며;
상기 p, q, r, s, t 및 u는 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수로부터 선택된다.
바람직한 실시예에서, H―O―L3은 하기 구조를 가지며;
(II-a-1),
(II-a-2),
(II-a-3),
(II-a-4),
(II-a-5), 또는
(II-a-6)이다.
일반식 (II)의 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 표적화 리간드 중 H―O―L4는,
(II-a-IV),
(II-a-V),
(II-a-VI), 또는
(II-a-VII)이다.
일 바람직한 실시예에서, H―O―L4는 하기 구조를 가지며;
(II-a-7),
(II-a-8),
(II-a-9),
(II-a-10),
(II-a-11), 또는
(II-a-12)이다.
일 바람직한 실시형태에서, 일반식 (II)는 하기 구조를 가지며;
(II-1),
(II-2),
(II-3),
(II-4),
(II-5),
(II-6),
(II-7),
(II-8),
(II-9),
(II-10),
(II-11),
(II-12),
(II-13),
(II-14)이다.
상기 식에서 Y는 O 또는 S이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 siRNA 접합체는 하기 구조를 가지며;
(II-15),
(II-16),
(II-17),
(II-18),
(II-19),
(II-20),
(II-21),
(II-22),
(II-23),
(II-24),
(II-25),
(II-26),
(II-27), 또는
(II-28),
상기 식에서 Y는 O 또는 S이다.
다른 양태에서, 3' 말단에 결합되는 구조는 모두 X의 5'말단에 결합될 수 있다.
약학적 조성물의 실시예
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술한 LPA RNAi제 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 예를 들어 대상체의 세포, 세포 집단 또는 조직에서 LPA의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 대상체에게 투여하기 위한 조성물, 즉 약학적 조성물 또는 약제를 제제화하는 데 사용된다. 예를 들어, 약학적 조성물 또는 약제는 약리학적 유효량의 적어도 하나의 이러한 LPA RNAi제 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제(부형제)는 안전성이 적절하게 평가되고 의도적으로 약물 전달 시스템에 포함되는 활성 약학적 성분(API, LPA RNAi제와 같은 치료 제품) 이외의 물질이다. 부형제는 의도된 용량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 발휘할 의도가 없다. 부형제는 a) 제조 중 약물 전달 시스템의 취급을 보조하고, b) API의 안정성, 생체 이용률 또는 환자 수용성을 보호, 지원 또는 강화하고, c) 생성물 식별을 보조하고, 및/또는 d) 보관 또는 사용 중에 전달된 API의 전반적인 안전성과 효율성을 향상시키는 임의의 기타 속성을 위해 사용될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 불활성 물질일 수도 있고 아닐 수도 있다.
부형제는 흡수 강화제, 접착 방지제, 소포제, 항산화제, 결합제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 안료, 전달 강화제, 전달 중합체, 글루칸, 포도당, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 보습제, 윤활제, 오일, 중합체, 방부제, 염수, 염, 용제, 설탕, 현탁화제, 서방형 매트릭스, 감미료, 증점제, 긴장제, 비히클, 소수성제 및 습윤제를 포함한다.
약학적 조성물은 약학적 조성물에서 흔히 사용되는 다른 추가 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가 성분에는 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제(예: 항히스타민제, 디펜히드라민 등)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 정의된 RNAi제를 발현하거나 함유하는 세포, 조직 또는 분리된 기관이 "약학적 조성물"로 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 소분자 약물, 항체, 항체 단편 및/또는 백신을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 치료제 또는 치료와 조합된다. RNAi제 및 본 명세서에 개시된 LPA RNAi제를 포함하는 약학적 조성물은 키트, 용기, 패키지 또는 디스펜서에 포장되거나 포함될 수 있다. LPA RNAi제 및 상기 LPA RNAi제를 함유하는 약학적 조성물은 사전충전된 주사기 또는 바이알에 포장될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 세포, 조직 또는 유기체에서 LPA 유전자의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 LPA 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 질병, 질환, 병증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 상기 약학적 조성물은 LPA 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 질병, 질환, 병증이 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용된다. LPA 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 질병, 질환, 병증에는 버거병, 말초 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 대사 증후군, 급성 관상 동맥 증후군, 대동맥 협착증, 대동맥 판막 역류, 대동맥 박리, 망막동맥폐쇄, 뇌혈관 질환, 장간막허혈, 상장간막동맥폐쇄, 신장동맥협착증, 안정/불안정 협심증, 급성 관상 동맥 증후군, 이형 접합성 또는 동형 접합 가족성 고혈압 콜레스테롤혈증, 고 아포지단백β 지단백혈증, 뇌혈관 죽상경화증, 뇌혈관 질환 및 정맥 혈전증이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 대상체는 포유동물이고 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 적어도 하나의 LPA RNAi제를 함유하는 세포, 조직 및 비인간 유기체가 고려된다. 세포, 조직 또는 비인간 유기체는 당업계에서 이용 가능한 임의의 방식으로 LPA RNAi제를 세포, 조직 또는 비인간 유기체에 전달함으로써 제조된다. 특정 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이이고, 인간 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포, 조직 또는 비인간 유기체는 연구 또는 연구 도구(예: 약물 테스트 또는 진단)로 사용될 수 있다.
용도
또 다른 양태에서, 본 발명은 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하거나 질환 또는 병증의 위험을 감소시키기 위한 약물의 제조에 있어서 전술한 LPA RNAi제 또는 전술한 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 질환 또는 병증은 Lp(a) 함유 입자의 증가된 수준과 연관된 질환 또는 병증을 포함한다. 본 발명에서, "Lp(a)"라는 용어는 일반적으로 apo(a) 함유 및 apoB 함유 LDL 유사 입자를 의미한다. apo(a)는 이황화 결합을 통해 apoB에 연결된다.
특정 실시형태에서, 상기 질환 또는 병증은 간 유래 질환을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 질환 또는 병증은 염증성 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환 또는 대사 질환을 포함한다.
본 발명에서, "대사 질환 또는 병증"이라는 용어는 일반적으로 대사 기능의 변화 또는 장애를 특징으로 하는 상태를 의미한다. "대사되는" 및 "대사"는 당업계에 잘 알려진 용어이며 일반적으로 살아있는 유기체 내에서 발생하는 생화학적 과정의 전체 범위를 포함한다. 대사 병증에는 고혈당증, 당뇨병 전증, 당뇨병(제1형 및 제2형), 비만, 인슐린 저항성, 대사 증후군 및 제2형 당뇨병으로 인한 이상지질혈증이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, "염증성 질환 또는 병증"이라는 용어는 질환, 질환 상태, 증후군 또는 염증을 초래하는 기타 상태를 의미한다. 예를 들어, 류마티스 관절염과 간 섬유증은 염증성 질환이다. 염증성 질환의 다른 예로는 패혈증, 심근 허혈/재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 신장염, 이식 거부, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 동맥 경화증, 죽상 동맥 경화증 및 혈관염이 있다.
본 발명에서, "심혈관 및 뇌혈관 질환 또는 병증의 증상"이라는 용어는 일반적으로 심혈관 및 뇌혈관 질환 또는 병증에 의해 유발되거나 이에 동반되는 현상을 의미하며, 심혈관 및 뇌혈관 질환 또는 병증의 지표 역할을 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 대상체에게 유효량의 전술한 LPA RNAi제 및/또는 전술한 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 상태를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 기술된 LPA RNAi제는 LPA 발현 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질환 또는 병증의 예에는 버거병, 말초 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 대사 증후군, 급성 관상 동맥 증후군, 대동맥 협착증, 대동맥 판막 역류, 대동맥 박리, 망막동맥폐쇄, 뇌혈관 질환, 장간막허혈, 상장간막동맥폐쇄, 신장동맥협착증, 안정/불안정 협심증, 급성 관상 동맥 증후군, 이형 접합성 또는 동형 접합 가족성 고혈압 콜레스테롤혈증, 고 아포지단백β 지단백혈증, 뇌혈관 죽상경화증, 뇌혈관 질환 및 정맥 혈전증이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 조성물, 예컨대 본 명세서에서 기술된 LPA RNAi제를 포함하는 약학적 조성물을 표적 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 유효량의 하나 이상의 LPA RNAi제를 대상체에게 투여하여 대상체에서 LPA의 발현을 억제한다(예를 들어, 대상체에서 LPA의 발현량을 억제하는 데 유효한 양).
특정 실시형태에서, 상기 방법은 제2 치료제 또는 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 치료제는 또 다른 LPA RNAi제(예를 들어, LPA 표적 내의 상이한 서열을 표적으로 하는 LPA RNAi제)이다. 다른 실시형태에서, 제2 치료제는 소분자 약물, 항체, 항체 단편 및 백신으로부터 선택될 수 있다.
투여 경로는 RNAi제가 신체와 접촉하는 방식이다. 일반적으로, 대상체를 치료하기 위한 약물 및 핵산의 투여 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 조성물의 투여에 적용될 수 있다. 본원에 기술된 화합물은 특정 경로에 적절하게 맞춰진 제형으로 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 화합물은 주사, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 기술된 LPA RNAi제 또는 조성물은 당업계에 공지된 올리고뉴클레오타이드 전달 기술을 사용하여 세포, 세포 집단, 조직 또는 대상체에 전달될 수 있다. 일반적으로, 핵산 분자를 전달하기 위해(시험관 내 또는 생체내) 당업계에서 인정된 임의의 적합한 방법이 본원에 설명된 LPA RNAi제에 적용될 수 있다. 예를 들어, 전달은 국소 투여(local administration)(예를 들어, 직접 주사, 이식 또는 국소 투여(topical administering)), 전신 투여, 또는 피하, 정맥내, 경구, 복강내 또는 두개내(예를 들어 뇌실내, 실질내 및 척수강내), 근육내, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 직장 또는 국소(협측 및 설하 포함)와 같은 비경구 경로에 의해 투여된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 피하 또는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 당업계에서 이용 가능한 지질, 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀 또는 기타 전달 시스템과 조합될 수 있다. RNAi제는 또한 표적화기, 지질(콜레스테롤 및 콜레스테롤 기반 유도체 포함), 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, 또는 당업계에서 이용 가능한 기타 전달 시스템에 화학적으로 접합될 수 있다.
특정 실시형태에서, LPA RNAi제는 지질, 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀 또는 당업계에서 이용 가능한 다른 전달 시스템과 조합될 수 있다. RNAi제는 또한 표적화기, 지질(콜레스테롤 및 콜레스테롤 기반 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, 또는 당업계에서 이용 가능한 기타 전달 시스템에 화학적으로 접합될 수 있다. LPA RNAi제는 전달 중합체에 접합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 전달 중합체는 가역적으로 차폐된/개질된 양친매성 막 활성 폴리아민이다.
발현의 억제
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 유효량의 전술한 LPA RNAi제 또는 전술한 약학적 조성물과 접촉시키는 단계 포함하는, 세포 또는 조직에서 LPA mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 세포는 간세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 조직은 간 조직이다.
특정 실시형태에서, 상기 세포 및 조직은 생체외에 있다. 다른 실시형태에서, 세포 및 조직은 생체 내에 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 전술한 LPA RNAi제 또는 전술한 약학적 조성물을 표적 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 LPA mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 LPA 유전자를 언급할 때 사용된 용어 "침묵화", "감소", "억제", "하향 조절" 또는 "유전자 발현 녹다운"은 상기 LPA RNAi제로 세포, 세포 집단 또는 조직이 처리할 때, LPA RNAi제 투여 전의 동일한 세포, 세포 집단 또는 조직에 비해 유전자의 발현(예를 들어, LPA 유전자가 전사되는 세포, 세포 집단 또는 조직의 유전자로부터 전사된 RNA의 수준에 의해, 또는 mRNA로부터 번역된 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 하위 단위 수준에 의해 측정됨)의 감소를 의미한다.
특정 실시형태에서,LPA RNAi제를 투여한 대상체에서 LPA의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 LPA RNAi제를 투여하기 전의 대상체 또는 LPA RNAi제를 투여받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5% 이상, 예를 들어 5% 내지 98％ 감소된다. 대상체의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포 집단 및/또는 조직에서 감소될 수 있다. 특정 실시형태에서, LPA RNAi제를 투여한 대상체에서 LPA의 단백질 수준은 LPA RNAi제를 투여하기 전의 대상체 또는 LPA RNAi제를 투여받지 않은 대상체에 비해 5% 이상, 예를 들어 5% 내지 98％ 감소된다. 대상체의 단백질 수준은 대상체의 세포, 세포 집단, 조직, 혈액 및/또는 기타 체액에서 감소될 수 있다. 유전자 발현, mRNA 또는 단백질 수준의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. LPA mRNA 수준 및/또는 단백질 수준의 감소 또는 저하는 본원에서 LPA의 감소 또는 저하, 또는 LPA 발현의 억제 또는 감소로서 집합적으로 지칭된다.
LPA RNAi제를 언급할 때 사용된 “세포 내로 도입”은 LPA RNAi제가 세포 내로 기능적으로 전달되는 것을 의미한다. 기능적 전달은 RNAi제가 세포에 전달되고 원하는 생물학적 활성(예: 유전자 발현의 서열 특이적 억제)을 갖는다는 것을 의미한다.
본 발명은 구체적인 실시예를 통해 아래에서 더 설명된다.
실시예 1: 화합물 GENO-Gal-6의 합성
(1) 합성 경로
(2) 구체적인 합성 단계
1) 화합물 Int-11-2 의 제조
Int-11-1(10 g)을 DCM(Dichloromethane)(140 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 후 TMSCN(Trimethylsilyl cyanide, 트리메틸실릴 시안화물(TMSCN))(4.01 g) 및 BF3.Et2O(2.83 mL)를 적가하고 10분간 반응시켰다. TLC 플레이트로(Hexane: EtOAc = 5: 1, KMnO4 발색, 원료 Rf =0.3, α 구조 Rf = 0.28, β 구조 Rf = 0.27) 원료 반응의 완료를 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 100 mL 포화 NaHCO3 수용액을 반응 용액에 첨가하고, 100 ml DCM를 추가로 첨가하여 유기상을 분리한 후, 유기상을 포화 식염수로 1회 세척하여 유기상을 농축시킨 다음 EtOAc(200 mL)에 용해시키고 NaHCO3 수용액(100 mL)으로 1회 세척하고 포화 식염수로 1회 세척한 후, 유기상을 무수황산나트륨으로 건조시키고 농축시켰다. 그 후, 순방향 실리카 겔 컬럼을 사용하여 정제하고 극성을 천천히 증가시켰다. Hexane/EtOAc = 20%일 때 α 구조가 얻어지고, 25%일 때 β 구조가 얻어졌으며, α 구조는(5.3 g) 백색 고체가 얻어지고, β 구조는(3.7 g) 무색 오일이 얻어졌다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ 6.03~6.06(dt, 1H), 5.91~5.94(dt, 1H), 5.35(dq, 1H), 5.12(m, 1H), 4.30(dd, 1H), 4.30(dd, 1H), 3.82(ddd, 1H), 2.10~2.12(2s, 6H).
2) 화합물 Int-11-3 의 제조
HCl 수용액(1 M, 17.2 mL)을 Int-11-2(3.7 g, β 구조, 무색 오일) 및 10% Pd/C(377 mg)의 현탁액에 첨가하고, 에틸 아세테이트/2-프로판올/에탄올(2:1:1, 총 90 mL)의 혼합물에 첨가하고 수소(40 Psi) 하에서 교반하면서 48시간 동안 반응시켰다. TLC로 반응을 모니터링하고, 　셀라이트 여과로 촉매를 제거하고, 용매를 감압 농축하였다. 얻어진 조생성물을 톨루엔으로 2회 세척한 후 10 mL 메탄올에 용해시키고 28% NH3.H2O(30 mL)를 첨가하여 실온에서 16 시간 동안 교반한 후 반응 용액을 농축시키고 톨루엔 아세토니트릴 1:1 혼합 용액(50 mL)으로 3회 세척하였다. 상기 조생성물 1 g을 취하여 H2O(40 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 후 NaHCO3(1.4 g), Na2CO3(0.88 g)를 첨가하여 FmocOSu(2.13 g)를 디옥산(dioxane)(40 mL) 용매에 용해시키고, 상기 수용액에 적가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TLC로 반응을 모니터링하였다(DCM: MeOH=10: 1, 254nm, Rf = 0.5). 순방향 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH/DCM=5%에서 생성물을 얻었고 Int-11-3(340 mg) 무색 고체를 얻었다. 1H NMR(CDCL3): δ 7.76-7.78(d, 2H), 7.58-7.60(d, 2H), 7.39-7.42(t, 2H), 7.30-7.34(t, 2H), 5.12(t, 1H), 4.42-4.52(m, 2H), 4.22(t, 1H), 3.84(br. s, 2H). 3.47-3.57(m, 3H), 3.11-3.24(m, 2H), 1.30-1.56, 1.67-1.72, 2.05-2.22(m, 4H).
3) 화합물 Int-11-4 의 제조
Int-11-3(340 mg)를 피리딘 2 ml에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 후, DMTrCl(450 mg)을 피리딘 2 ml 에 용해시킨 다음 상기 용액에 적가하였다. TLC를 사용하여 원료 반응의 완료를 모니터링하였다. 5 ml 수용액을 첨가하여 반응을 퀀칭하고 역방향 컬럼 C18로 정제를 수행하여 MeCN/H2O=80%에서 생성물 int-11-4(290 mg)을 얻었다.
4) 화합물 GENO-Int-11의 제조
Int-11-4(700 mg, 1.02 mmol) 를 염화메틸렌 2 mL에 용해시키고, DBU(310 mg, 2.04 mmol)를 상기 용액에 첨가하고, TLC를 사용하여 원료 반응의 완료를 모니터링하였다. 5 ml 포화 Na2CO3용액을 첨가하여 반응을 퀀칭하고 염화메틸렌 20 mL로 추출하고, 유기상은 DCM: MeOH = 10: 1,(254nm, Rf = 0.5)로 농축하였다. 순방향 컬럼을 사용하여 정제하고, MeOH/DCM=5% 에서 생성물을 얻었고, GENO-Int-11(550 mg) 노란색 고체를 얻었다.
5) 화합물 Int-6-1의 제조
Gal-3-5B(1.45g, 3.24 mmol)를 무수 DMF(10 mL) 용매에 용해시키고, HATU(1.64 g, 4.32 mmol), 3A 분자체(1g) 및 DIEA(1.07 mL, 6.47 mmol)를 첨가하였다. 반응 용액은 실온에서 30분간 교반한 다음 GENO-int-11(1g, 2.16 mmol)을 DMF(10 mL)에 용해시키고 상기 반응 용액에 첨가하였다. 반응 용액은 아르곤 보호하에 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 여과하고 역방향 컬럼 C18로 정제를 수행하였으며, MeCN/H2O=60%에서 생성물 Int-6-1(1.8 g)을 얻었다. 1H NMR:(400 MHz, DMSO-d6)δ 7.80(d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.71-7.73(m, 1H), 7.39-7.41(m, 2H), 7.24-7.30(m, 6H), 7.18-7.21(m, 2H), 6.87(d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.21(d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.95-4.98(m, 1H), 4.59(d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.47(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.00-4.05(m, 2H), 3.83-3.90(m, 1H), 3.64-3.73(m, 7H), 3.23-3.38(m, 8H), 2.97-3.14(m, 3H), 2.04-2.14(m, 5H), 1.98(s, 3H), 1.89(s, 3H), 1.77(s, 3H), 1.64-4.66(m, 1H)1.42-1.50(m, 4H).
5) 화합물 Geno-Gal-6의 제조
Int-6-1(2.1g, 2.35 mmol)을 DCM(30 mL)에 용해시키고 Tetrazole(33 mg, 0.47 mmol),NMI(77.2 mg, 0.94 mmol) 및 2g 분자체를 첨가하였다. 반응 용액은 아르곤으로 3회 교체하고 실온에서 20분간 교반하였다. 인 시약(920.81 mg, 3.06 mmol)을 소량의 염화메틸렌에 용해시키고 반응 용액에 첨가하며, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액은 포화 NaHCO3 수용액으로 2회, 물로 1회, 식염수로 1회 세척한 후실온에서 농축하였다. 역방향 컬럼 C18로 정제를 수행하였으며, MeCN/H2O=65%에서 생성물 GENO -Gal-6(1.5 g)을 얻었다. 1H NMR:(400 MHz, CD3CN) δ 7.48-7.50(m, 2H), 7.20-7.36(m, 7H), 6.83-6.87(m, 4H), 6.45-6.51(m, 1H), 5.28(d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.98-5.02(m, 1H), 4.49(d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.90-4.12(m, 4H), 3.24-3.76(m, 20H), 3.02-3.11(m, 1H), 2.49-2.59(m, 1H), 2.36-2.39(m, 1H), 2.08-2.25(m, 9H), 1.97(s, 3H), 1.91(s, 3H), 1.83(s, 3H), 1.71-1.74(m, 1H), 1.46-1.63(m, 5H), 0.85-1.39(m, 20H).
6) 화합물 Gal-5-1 의 제조
1,12-도데칸디오산 모노벤질 에스테르(387 mg, 1.2 mmol)를 무수 DMF(N,N-Dimethylformamide)(10 mL) 용매에 용해시키고, HBTU(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate)(546 mg, 1.44 mmol), DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)(0.65 mL, 3.6 mmol), HOBT(1-Hydroxybenzotriazole)(324 mg, 2.4 mmol) 및 GENO-Int-11(560 mg, 1.2 mmol을 첨가한 후 아르곤 보호 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액은 역방향 컬럼 C18로 정제를 수행하였고, MeCN/H2O=70%에서 생성물 Gal-5-1(200 mg)을 얻었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ 7.68(t, 1H), 7.49 - 7.12(m, 14H), 6.86(d, 4H), 5.07(s, 2H), 4.58(d, 1H), 3.73(s, 6H), 3.38(dd, 1H), 3.28 - 3.16(m, 3H), 3.22-2.85(m, 3H), 2.41 - 2.25(m, 2H), 2.11 - 2.00(m, 2H), 1.92(dd, 1H), 1.64(d, 1H), 1.57 - 1.41(m, 4H), 1.27 - 1.06(m, 14H).
7) 화합물 Gal-5-2의 제조
Gal-5-1(200 mg, 0.26mmol)을 5mL에틸 아세테이트에 용해시키고 팔라듐탄소 50mg과 트리에틸아민(0.11mL, 0.78mmol)을 첨가하고 반응 용액을 수소(15psi)) 하에 실온에서 16시간 교반하였다. 반응 용액을 여과, 농축하여 Gal-5-2(150 mg)을 얻었다.
8) 화합물 Gal-5-3의 제조
Gal-5-2(식 I-1에 대응)(150 mg, 0.22 mmol)를 5 mL무수 DMF에 용해시키고 이 용액에 HBTU(101 mg, 0.27 mmol), DIEA(0.16 mL), 3A 분자체(1 g) 및 Gal-3-4C(441 mg. 0.22mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액은 역방향 컬럼 C18로 정제를 수행하였고 MeCN/H2O=60%에서 생성물 Gal-5-3(380 mg)을 얻었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ 7.91 - 7.67(m, 10H), 7.42(d, 2H), 7.34 - 7.24(m, 6H), 7.20(d, 1H), 6.99(s, 1H), 6.87(d, 4H), 5.21(d, 3H), 4.97(dd, 3H), 4.60(s, 1H), 4.48(d, 3H), 4.09 - 3.95(m, 10H), 3.93 - 3.82(m, 3H), 3.77 - 3.66(m, 9H), 3.61 - 3.48(m, 12H), 3.45 - 3.20(m, 16H), 3.09 - 2.95(m, 15H), 2.27(t, 6H), 2.10(s, 9H), 2.05(dd, 10H), 1.99(s, 9H), 1.89(s, 9H), 1.76(d, 9H), 1.63 - 1.38(m, 24H), 1.16(s, 14H).
9) 화합물 Gal-5-4의 제조
Gal-5-3(370 mg, 0.15 mmol), 숙신산 무수물(75 mg, 0.76 mmol), 3A 분자체(0.5 g) 및 DMAP(4-Dimethylaminopyridine)(46 mg, 0.38 mmol)를 5mL THF(Tetrahydrofuran)에 용해시키고 반응 용액을 40℃에서 밤새 교반하였다. 반응 용액은 역방향 컬럼 C18로 정제를 수행하였고, MeCN/H2O=40%에서 생성물 Gal-5-4(220 mg)을 얻었다.
10) 고체 담체에 연결된 아미노 갈락토스 화합물 GENO-Gal-5의 합성
Gal-5-4(220 mg, 0.086 mmol)를 4 ml CH3CN 및 2 mL DMF에 현탁시키고 DIEA(0.035 mL, 0.216mmol) 및 HBTU(49.07 mg, 0.129 mmol)를 적가하고 실온에서 5분간 교반하였다. 반응 용액에 아미노메틸수지(99.51 mg, 100-200메쉬, 아미노 로딩량 250umol/g)를 첨가하고 25℃에서 220회/분의 속도로 16시간 동안 진탕 반응시킨 후 여과하고, 케이크는 DCM로 3회(회당 30ml) 헹궈주고, 아세토니트릴로 3회(회당 30ml) 헹궈주고, n-헥산으로 3회(회당 30ml) 헹궈주고 진공 오일 펌프로 2시간 건조한후 혼합 제제(CapB1, 4-디메틸아미노피리딘, N-메틸이미다졸 및 아세토니트릴, 11.2 mL/12.4 mg/0.50 mL/4.32 mL)을 첨가하여 캡핑 반응을 수행하였다. 25℃에서 진탕기에 놓고 220회/분의 속도로 16시간 동안 반응시킨 후, 반응 용액을 여과하고 케이크는 아세토니트릴로 3회(회당 30ml) 헹궈주고 건조될 때까지 여과한 다음 진공 오일 펌프로 감압하면서 밤새 건조하여 목적 생성물인 GNEO-Gal-5 화합물 160 mg을 얻었다.
실시예 2: siRNA의 합성
변형되지 않은 siRNA는 WuXi AppTec에서 제공되었다(서열은 표 1 참조). 변형된 siRNA(표 2 및 표 3 참조) 합성 과정을 간단히 설명하면 다음과 같다. Dr. Oligo 48 합성기(Biolytic)에서 Universal CPG 벡터를 시작으로 합성 절차에 따라 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 단량체를 하나씩 연결하였다. 여기서 2'-F RNA, 2'-O-메틸RNA 등의 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 단량체 원료는 Wuhu Huaren 및 Shanghai Zhaowei에서 구입하였다. 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)을 활성제(0 .6M 아세토니트릴 용액)로 사용하였고, 0.22M의 PADS를 1:1 부피비의 아세토니트릴 및 트리메틸피리딘(Lingjiang, Shanghai) 혼합 용매에 용해시켜 얻은 용액을 황화제로 사용하였고, 요오도피리딘/수용액(Lingjiang, Shanghai)을 산화제로 사용하였다.
올리고뉴클레오타이드에서, 뉴클레오타이드 단량체는 5'-3'-포스포디에스테르 결합을 통해 서로 연결되고, 포스포로티오에이트 결합 및 포스포디에스테르 결합을 포함한다.
고상 합성이 완료된 후, 올리고리보뉴클레오타이드는 상기 고체 지지체로부터 분리되고, 3:1의 28% 암모니아수 및 에탄올 용액을 사용하여 50℃ 조건에서 15시간 동안 침지하였다. 원심분리하여 상등액을 다른 원심분리 튜브로 옮기고 농축 증발 건조시킨 후, C18 역크로마토그래피로 정제하였으며, 이동상은 0.1M TEAA 및 아세토니트릴이고, 3% 트리플루오로아세트산 용액을 사용하여 DMTr을 제거하였다. 목적 올리고뉴클레오타이드를 수집한고 동결건조한 후, LC-MS를 통해 표적 생성물 식별하고 UV(260nm)로 정량화하였다.
얻어진 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 등몰비를 기준으로 상보적인 쌍에 따라 어닐링되며, 최종적으로 얻어진 이중 가닥 siRNA를 1×PBS 또는 멸균수에 용해시켜 실험에 필요한 농도로 조절하였다.
표 1, 표 2 및 표 3의 서열에서 각 기호는 다음과 같은 변형된 뉴클레오타이드(에스테르)를 나타낸다.
A = 아데노신-3'-포스페이트
C = 시티딘-3'-포스페이트
G = 구아노신-3'-포스페이트
U = 우리딘-3'-포스페이트
Am = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트
Ams = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트
Cm = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트
Cms = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트
Gm = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트
Gms = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스포로티오에이트
Um = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트
Ums = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
Af = 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트
Afs = 2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트
Cf = 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트
Cfs = 2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트
Gf = 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트
Gfs = 2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트
Uf = 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트
Ufs = 2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트
여기서, 그 중 소문자 m은 문자 m의 왼쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 의미하고, 소문자 f는 문자 f의 왼쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오 변형된 뉴클레오타이드임을 의미하며;
소문자 s가 대문자 중간에 있는 경우, 문자 s의 좌우에 인접한 두 뉴클레오타이드 사이의 연결이 포스포로티오에이트기 연결임을 의미하며;
소문자 s가 3' 말단의 첫 번째 문자인 경우, 문자 s의 왼쪽에 인접한 하나의 뉴클레오타이드의 말단이 포스포로티오에이트기임을 의미한다.
인간 LPA mRNA를 표적으로 하는 변형되지 않은 siRNA번호 및 서열
LPA RNAi제
ID		 안티센스 가닥 염기 서열
(5'→3')		 SEQ ID NO. 센스 가닥 염기 서열
(5'→3')		 SEQ ID NO.
Geno-1-001 UAAUCUCAGCAUCUGGAUUCCUG 2 GGAAUCCAGAUGCUGAGAUUA 93
Geno-1-002 AAACAGCCGUGGACGUCGCAAGG 3 UUGCGACGUCCACGGCUGUUU 94
Geno-1-003 AUAGACGACCAAGACUGACAUGU 4 AUGUCAGUCUUGGUCGUCUAU 95
Geno-1-004 AUUGACAUGUCCUUCCUGUGACA 5 UCACAGGAAGGACAUGUCAAU 96
Geno-1-005 AUGCUUCCAGGACAUUUCUUCGG 6 GAAGAAAUGUCCUGGAAGCAU 97
Geno-1-006 UCAUUCUCAAUAACAAGGAGCUG 7 GCUCCUUGUUAUUGAGAAUGA 98
Geno-1-007 UAACAAACCUUGAAACACGAGCA 8 CUCGUGUUUCAAGGUUUGUUA 99
Geno-1-008 AUAACUCUGUCCAUUACCAUU 9 UGGUAAUGGACAGAGUUAUUU 100
Geno-1-009 AUAACUCUGUCCAUUACCAUGGU 10 CAUGGUAAUGGACAGAGUUAU 101
Geno-1-010 AACUCUGUCCAUCACCAUGGUAG 11 ACCAUGGUGAUGGACAGAGUU 102
Geno-1-011 AUAACUCUGUCCAUCACCAUGGU 12 CAUGGUGAUGGACAGAGUUAU 103
Geno-1-012 AUGUGCCUCGAUAACUCUGUCCA 13 GACAGAGUUAUCGAGGCACAU 104
Geno-1-014 AAGUAACAAACCUUGAAACACGA 14 GUGUUUCAAGGUUUGUUACUU 105
Geno-1-015 UUCAUUCUCAAUAACAAGGAGCU 15 CUCCUUGUUAUUGAGAAUGAA 106
Geno-1-016 UACAAUGCUUCCAGGACAUUUCU 16 AAAUGUCCUGGAAGCAUUGUA 107
Geno-1-017 AAGAUUGACAUGUCCUUCCUGUG 17 CAGGAAGGACAUGUCAAUCUU 108
Geno-1-018 AUUCUGUCACUGGACAUCGUGUC 18 CACGAUGUCCAGUGACAGAAU 109
Geno-1-019 AUGUCCUUCCUGUAACAGUGGUG 19 CCACUGUUACAGGAAGGACAU 110
Geno-1-020 AAGGACUAAUCUCAGCAUCUGGA 20 CAGAUGCUGAGAUUAGUCCUU 111
Geno-1-021 AACACCAAGGACUAAUCUCAGCA 21 CUGAGAUUAGUCCUUGGUGUU 112
Geno-1-022 AUUCUGUGGUUCUCUGAUGCCAG 22 GGCAUCAGAGAACCACAGAAU 113
Geno-1-023 UUUCUCAGGUGGUGCUUGUUCAG 23 GAACAAGCACCACCUGAGAAA 114
Geno-1-024 UUCCUGCAGUAGUUCAUUGUCAG 24 GACAAUGAACUACUGCAGGAA 115
Geno-1-025 UUGUUCUGAGACUGACUUGCCAG 25 GGCAAGUCAGUCUCAGAACAA 116
Geno-1-026 UUGCACACUUCAUUCUCAAUAAC 26 UAUUGAGAAUGAAGUGUGCAA 117
Geno-1-027 UGAGCCUCGAUAACUCUGUUU 27 ACAGAGUUAUCGAGGGCUCATT 118
Geno-1-029 UAUGUGCCUCGAUAACUCUGUCC 28 ACAGAGUUAUCGAGGCACAUA 119
Geno-1-030 AUGAGCCUCGAUAACUCUGUCCA 29 GACAGAGUUAUCGAGGCUCAU 120
Geno-1-031 AAUGAGCCUCGAUAACUCUGUCC 30 ACAGAGUUAUCGAGGCUCAUU 121
Geno-1-032 UUCUUCCUGUGACAGUGGUGGAG 31 CCACCACUGUCACAGGAAGAA 122
Geno-1-034 UUCGUUUGAUUGCUGUCUAUUAU 32 AAUAGACAGCAAUCAAACGAA 123
Geno-1-035 UAUAGUGAUUGCACACUUCAUUC 33 AUGAAGUGUGCAAUCACUAUA 124
Geno-1-036 UUCCAAACCUUGUUCUGAGACUG 34 GUCUCAGAACAAGGUUUGGAA 125
Geno-1-037 UACAGUCUUGUUCAGAAGGAGGC 35 CUCCUUCUGAACAAGACUGUA 126
Geno-1-038 UUUUCUCAGGUGGUGCUUGUUCA 36 AACAAGCACCACCUGAGAAAA 127
Geno-1-039 UAGUAUUCUGUGGUUCUCUGAUG 37 UCAGAGAACCACAGAAUACUA 128
Geno-1-040 UAACACCAAGGACUAAUCUCAGC 38 UGAGAUUAGUCCUUGGUGUUA 129
Geno-1-041 AUAACACCAAGGACUAAUCUCAG 39 GAGAUUAGUCCUUGGUGUUAU 130
Geno-1-042 UUGAUUCCAUCACUGGACAUUGC 40 AAUGUCCAGUGAUGGAAUCAA 131
Geno-1-043 AUAUGCCUCGAUAACUCCGUCCA 41 GACGGAGUUAUCGAGGCAUAU 132
Geno-1-044 AUACAGUCUUGUUCAGAAGGAGG 42 UCCUUCUGAACAAGACUGUAU 133
Geno-1-045 UUCAAGCAGUGAGCAGCAGUCAG 43 GACUGCUGCUCACUGCUUGAA 134
Geno-1-046 UACUUAUAGUGAUUGCACACUUC 44 AGUGUGCAAUCACUAUAAGUA 135
Geno-1-047 UACAGAAUUUGUCAGUCAGACCU 45 GUCUGACUGACAAAUUCUGUA 136
Geno-1-049 UUCAUGAUCAAGCCAGCAUUUGG 46 AAAUGCUGGCUUGAUCAUGAA 137
Geno-1-050 UUCCUGUGACAGUGGUAGAGAAU 47 UCUCUACCACUGUCACAGGAA 138
Geno-1-051 AAUAUUCUGUUGUCCUCUGAUGC 48 AUCAGAGGACAACAGAAUAUU 139
Geno-1-052 CAGUAGUUCAUGAUCAAGCCAGC 49 UGGCUUGAUCAUGAACUACUG 140
Geno-1-054 AUACAGAAUUUGUCAGUCAGACC 50 UCUGACUGACAAAUUCUGUAU 141
Geno-1-055 UAUUUGUCCUUCUCGAAGCAAAC 51 UUGCUUCGAGAAGGACAAAUA 142
Geno-1-056 UUCUUCAAGCAGUGAGCAGCAGU 52 UGCUGCUCACUGCUUGAAGAA 143
Geno-1-057 AACAUACAGUCUUGUUCAGAAGG 53 UUCUGAACAAGACUGUAUGUU 144
Geno-1-058 UUCUGUUUCUGAGCAUUGUGUCA 54 ACACAAUGCUCAGAAACAGAA 145
Geno-1-059 UUCAGUUGGUGCUUCUUCAGAAG 55 UCUGAAGAAGCACCAACUGAA 146
Geno-1-060 UAUAACACCAAGGACUAAUCUCA 56 AGAUUAGUCCUUGGUGUUAUA 147
Geno-1-061 UUCUGUCACUGGACAUUGUGUCA 57 ACACAAUGUCCAGUGACAGAA 148
Geno-1-062 AUAACUCUGUCCAUCACCUCGGU 58 CGAGGUGAUGGACAGAGUUAU 149
Geno-1-063 AUUCUGUUUCUGAGCAUUGUGUC 59 CACAAUGCUCAGAAACAGAAU 150
Geno-1-064 UUUCUUGGAUUCAUUGUGUAGCA 60 CUACACAAUGAAUCCAAGAAA 151
Geno-1-065 UAUUUCCUGAACAUGAGAUUCGA 61 GAAUCUCAUGUUCAGGAAAUA 152
Geno-1-066 AAUGUAUUUGUCCUUCUCGAAGC 62 UUCGAGAAGGACAAAUACAUU 153
Geno-1-067 AAUACAGAAUUUGUCAGUCAGAC 63 CUGACUGACAAAUUCUGUAUU 154
Geno-1-069 AUUCCUGCAGUAGUUCAUGAUCA 64 AUCAUGAACUACUGCAGGAAU 155
Geno-1-070 UAAUAUUCUGUUGUCCUCUGAUG 65 UCAGAGGACAACAGAAUAUUA 156
Geno-1-071 AUAAUAUUCUGUUGUCCUCUGAU 66 CAGAGGACAACAGAAUAUUAU 157
Geno-1-072 AUAACAAUAAGGAGCUGCCACAG 67 GUGGCAGCUCCUUAUUGUUAU 158
Geno-1-074 UAAUACAGAAUUUGUCAGUCAGA 68 UGACUGACAAAUUCUGUAUUA 159
Geno-1-075 AAACACGAGCAUAGACACCAGGC 69 CUGGUGUCUAUGCUCGUGUUU 160
Geno-1-076 UCUAUUUCCUGAACAUGAGAUUC 70 AUCUCAUGUUCAGGAAAUAGA 161
Geno-1-077 AUCACAGUAGUCAAAAAGUUUUC 71 AAACUUUUUGACUACUGUGAU 162
Geno-1-078 UCUAGGACACCUGAUUCUGUUUC 72 AACAGAAUCAGGUGUCCUAGA 163
Geno-1-079 UUCUUCCUGUGAUAGUGGUGGAG 73 CCACCACUAUCACAGGAAGAA 164
Geno-1-080 AUUCUGUCACUGGACAUUGUGUC 74 CACAAUGUCCAGUGACAGAAU 165
Geno-1-081 UUGAUUCUGUCACUGGACAUUGU 75 AAUGUCCAGUGACAGAAUCAA 166
Geno-1-082 UGUUCUUCCUGUGAUAGUGGUGG 76 ACCACUAUCACAGGAAGAACA 167
Geno-1-083 UUCAGAAUGAGCCUCCAUGCUUG 77 AGCAUGGAGGCUCAUUCUGAA 168
Geno-1-084 AAUCAAAUGAAGAGGAUGCACAG 78 GUGCAUCCUCUUCAUUUGAUU 169
Geno-1-085 AUUACUUUGUCAGUGAUGACGGC 79 CGUCAUCACUGACAAAGUAAU 170
Geno-1-086 UGAAACACGAGCAUAGACACCAG 80 GGUGUCUAUGCUCGUGUUUCA 171
Geno-1-087 UUAAUACAGAAUUUGUCAGUCAG 81 GACUGACAAAUUCUGUAUUAA 172
Geno-1-089 UAUAACAAUAAGGAGCUGCCACA 82 UGGCAGCUCCUUAUUGUUAUA 173
Geno-1-090 AUCUCAGCAUCUGGAUUCCUGCA 83 CAGGAAUCCAGAUGCUGAGAU 174
Geno-1-091 AAUCUCAGCAUCUGGAUUCCUGC 84 AGGAAUCCAGAUGCUGAGAUU 175
Geno-1-092 UCGUAUAACAAUAAGGAGCUGCC 85 CAGCUCCUUAUUGUUAUACGA 176
Geno-1-094 UUCAAAUCAAAAUAAGUGCAGAG 86 CUGCACUUAUUUUGAUUUGAA 177
Geno-1-095 UUGAAACACGAGCAUAGACACCA 87 GUGUCUAUGCUCGUGUUUCAA 178
Geno-1-096 AUGUAACAUUCAGUCCUGGCGGU 88 CGCCAGGACUGAAUGUUACAU 179
Geno-1-097 UUCCCACAAUCAAAUGAAGAGGA 89 CUCUUCAUUUGAUUGUGGGAA 180
Geno-1-098 AUGUCCUUCCUGUGACAGUGGUG 90 CCACUGUCACAGGAAGGACAU 181
Geno-1-099 AUGUUCUUCCUGUGAUAGUGGUG 91 CCACUAUCACAGGAAGAACAU 182
Geno-1-100 AAGGACACUUGAUUCUGUCACUG 92 GUGACAGAAUCAAGUGUCCUU 183
인간 LPA mRNA를 표적으로 하는 변형된 siRNA번호 및 서열
이중 가닥 번호 안티센스 가닥 번호 안티센스 가닥 5'→3' 원래 SEQ ID NO. 센스 가닥 번호 센스 가닥
5'→3'		 원래 SEQ ID NO.
Geno-1-010M LPA-1AS AmsAfsCm UmCmUf GmUmCm CmAmUm CmAfCm CfAmUm GmGmUms AmsGm 11 LPA-69SS AmsCmsCm AmUmGm GfUmGf AfUfGm GmAmCm AmGmAm GmUmUm 102
Geno-1-011M LPA-2AS AmsUfsAm AmCmUf CmUmGm UmCmCm AmUfCm AfCmCm AmUmGms GmsUm 12 LPA-70SS CmsAmsUm GmGmUm GfAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUm 103
Geno-1-019M LPA-3AS AmsUfsGm UmCmCf UmUmCm CmUmGm UmAfAm CfAmGm UmGmGms UmsGm 19 LPA-71SS CmsCmsAm CmUmGm UfUmAf CfAfGm GmAmAm GmGmAm CmAmUm 110
Geno-1-022M LPA-4AS AmsUfsUm CmUmGf UmGmGm UmUmCm UmCfUm GfAmUm GmCmCms AmsGm 22 LPA-72SS GmsGmsCm AmUmCm AfGmAf GfAfAm CmCmAm CmAmGm AmAmUm 113
Geno-1-023M LPA-5AS UmsUfsUm CmUmCf AmGmGm UmGmGm UmGfCm UfUmGm UmUmCms AmsGm 23 LPA-73SS GmsAmsAm CmAmAm GfCmAf CfCfAm CmCmUm GmAmGm AmAmAm 114
Geno-1-030M LPA-6AS AmsUfsGm AmGmCf CmUmCm GmAmUm AmAfCm UfCmUm GmUmCms CmsAm 29 LPA-74SS GmsAmsCm AmGmAm GfUmUf AfUfCm GmAmGm GmCmUm CmAmUm 120
Geno-1-031M LPA-7AS AmsAfsUm GmAmGf CmCmUm CmGmAm UmAfAm CfUmCm UmGmUms CmsCm 30 LPA-75SS AmsCmsAm GmAmGm UfUmAf UfCfGm AmGmGm CmUmCm AmUmUm 121
Geno-1-035M LPA-8AS UmsAfsUm AmGmUf GmAmUm UmGmCm AmCfAm CfUmUm CmAmUms UmsCm 35 LPA-76SS AmsUmsGm AmAmGm UfGmUf GfCfAm AmUmCm AmCmUm AmUmAm 20126
Geno-1-041M LPA-9AS AmsUfsAm AmCmAf CmCmAm AmGmGm AmCfUm AfAmUm CmUmCms AmsGm 039 LPA-77SS GmsAmsGm AmUmUm AfGmUf CfCfUm UmGmGm UmGmUm UmAmUm 130
Geno-1-050M LPA-10AS UmsUfsCm CmUmGf UmGmAm CmAmGm UmGfGm UfAmGm AmGmAms AmsUm 47 LPA-78SS UmsCmsUm CmUmAm CfCmAf CfUfGm UmCmAm CmAmGm GmAmAm 138
Geno-1-051M LPA-11AS AmsAfsUm AmUmUf CmUmGm UmUmGm UmCfCm UfCmUm GmAmUms GmsCm 48 LPA-79SS AmsUmsCm AmGmAm GfGmAf CfAfAm CmAmGm AmAmUm AmUmUm 139
Geno-1-060M LPA-12AS UmsAfsUm AmAmCf AmCmCm AmAmGm GmAfCm UfAmAm UmCmUms CmsAm 56 LPA-80SS AmsGmsAm UmUmAm GfUmCf CfUfUm GmGmUm GmUmUm AmUmAm 147
Geno-1-061M LPA-13AS UmsUfsCm UmGmUf CmAmCm UmGmGm AmCfAm UfUmGm UmGmUms CmsAm 57 LPA-81SS AmsCmsAm CmAmAm UfGmUf CfCfAm GmUmGm AmCmAm GmAmAm 148
Geno-1-064M LPA-14AS UmsUfsUm CmUmUf GmGmAm UmUmCm AmUfUm GfUmGm UmAmGms CmsAm 60 LPA-82SS CmsUmsAm CmAmCm AfAmUf GfAfAm UmCmCm AmAmGm AmAmAm 151
Geno-1-070M LPA-15AS UmsAfsAm UmAmUf UmCmUm GmUmUm GmUfCm CfUmCm UmGmAms UmsGm 65 LPA-83SS UmsCmsAm GmAmGm GfAmCf AfAfCm AmGmAm AmUmAm UmUmAm 156
Geno-1-076M LPA-16AS UmsCfsUm AmUmUf UmCmCm UmGmAm AmCfAm UfGmAm GmAmUms UmsCm 70 LPA-84SS AmsUmsCm UmCmAm UfGmUf UfCfAm GmGmAm AmAmUm AmGmAm 161
Geno-1-080M LPA-17AS AmsUfsUm CmUmGf UmCmAm CmUmGm GmAfCm AfUmUm GmUmGms UmsCm 74 LPA-85SS CmsAmsCm AmAmUm GfUmCf CfAfGm UmGmAm CmAmGm AmAmUm 165
Geno-1-081M LPA-18AS UmsUfsGm AmUmUf CmUmGm UmCmAm CmUfGm GfAmCm AmUmUms GmsUm 75 LPA-86SS AmsAmsUm GmUmCm CfAmGf UfGfAm CmAmGm AmAmUm CmAmAm 166
Geno-1-082M LPA-19AS UmsGfsUm UmCmUf UmCmCm UmGmUm GmAfUm AfGmUm GmGmUms GmsGm 76 LPA-87SS AmsCmsCm AmCmUm AfUmCf AfCfAm GmGmAm AmGmAm AmCmAm 167
Geno-1-086M LPA-20AS UmsGfsAm AmAmCf AmCmGm AmGmCm AmUfAm GfAmCm AmCmCms AmsGm 80 LPA-88SS GmsGmsUm GmUmCm UfAmUf GfCfUm CmGmUm GmUmUm UmCmAm 171
Geno-1-072M LPA-21AS AmsUfsAm AmCmAf AmUmAm AmGmGm AmGfCm UfGmCm CmAmCms AmsGm 67 LPA-89SS GmsUmsGm GmCmAm GfCmUf CfCfUm UmAmUm UmGmUm UmAmUm 158
Geno-1-089M LPA-22AS UmsAfsUm AmAmCf AmAmUm AmAmGm GmAfGm CfUmGm CmCmAms CmsAm 82 LPA-90SS UmsGmsGm CmAmGm CfUmCf CfUfUm AmUmUm GmUmUm AmUmAm 173
Geno-1-001M LPA-23AS UmsAfsAm UmCmUf CmAmGm CmAmUm CmUfGm GfAmUm UmCmCms UmsGm 2 LPA-91SS GmsGmsAm AmUmCm CfAmGf AfUfGm CmUmGm AmGmAm UmUmAm 93
Geno-1-018M LPA-24AS AmsUfsUm CmUmGf UmCmAm CmUmGm GmAfCm AfUmCm GmUmGms UmsCm 18 LPA-92SS CmsAmsCm GmAmUm GfUmCf CfAfGm UmGmAm CmAmGm AmAmUm 109
Geno-1-055M LPA-25AS UmsAfsUm UmUmGf UmCmCm UmUmCm UmCfGm AfAmGm CmAmAms AmsCm 51 LPA-93SS UmsUmsGm CmUmUm CfGmAf GfAfAm GmGmAm CmAmAm AmUmAm 142
Geno-1-100M LPA-26AS AmsAfsGm GmAmCf AmCmUm UmGmAm UmUfCm UfGmUm CmAmCms UmsGm 92 LPA-94SS GmsUmsGm AmCmAm GfAmAf UfCfAm AmGmUm GmUmCm CmUmUm 183
Geno-1-099M LPA-27AS AmsUfsGm UmUmCf UmUmCm CmUmGm UmGfAm UfAmGm UmGmGms UmsGm 91 LPA-95SS CmsCmsAm CmUmAm UfCmAf CfAfGm GmAmAm GmAmAm CmAmUm 182
Geno-1-005M LPA-28AS AmsUfsGm CmUmUf CmCmAm GmGmAm CmAfUm UfUmCm UmUmCms GmsGm 6 LPA-96SS GmsAmsAm GmAmAm AfUmGf UfCfCm UmGmGm AmAmGm CmAmUm 97
Geno-1-075M LPA-29AS AmsAfsAm CmAmCf GmAmGm CmAmUm AmGfAm CfAmCm CmAmGms GmsCm 69 LPA-97SS CmsUmsGm GmUmGm UfCmUf AfUfGm CmUmCm GmUmGm UmUmUm 160
Geno-1-085M LPA-30AS AmsUfsUm AmCmUf UmUmGm UmCmAm GmUfGm AfUmGm AmCmGms GmsCm 79 LPA-98SS CmsGmsUm CmAmUm CfAmCf UfGfAm CmAmAm AmGmUm AmAmUm 170
Geno-1-084M LPA-31AS AmsAfsUm CmAmAf AmUmGm AmAmGm AmGfGm AfUmGm CmAmCms AmsGm 78 LPA-99SS GmsUmsGm CmAmUm CfCmUf CfUfUm CmAmUm UmUmGm AmUmUm 169
Geno-1-092M LPA-32AS UmsCfsGm UmAmUf AmAmCm AmAmUm AmAfGm GfAmGm CmUmGms CmsCm 85 LPA-100SS CmsAmsGm CmUmCm CfUmUf AfUfUm GmUmUm AmUmAm CmGmAm 176
Geno-1-026M LPA-33AS UmsUfsGm CmAmCf AmCmUm UmCmAm UmUfCm UfCmAm AmUmAms AmsCm 26 LPA-101SS UmsAmsUm UmGmAm GfAmAf UfGfAm AmGmUm GmUmGm CmAmAm 117
Geno-1-059M LPA-34AS UmsUfsCm AmGmUf UmGmGm UmGmCm UmUfCm UfUmCm AmGmAms AmsGm 55 LPA-102SS UmsCmsUm GmAmAm GfAmAf GfCfAm CmCmAm AmCmUm GmAmAm 146
Geno-1-071M LPA-35AS AmsUfsAm AmUmAf UmUmCm UmGmUm UmGfUm CfCmUm CmUmGms AmsUm 66 LPA-103SS CmsAmsGm AmGmGm AfCmAf AfCfAm GmAmAm UmAmUm UmAmUm 157
Geno-1-037M LPA-36AS UmsAfsCm AmGmUf CmUmUm GmUmUm CmAfGm AfAmGm GmAmGms GmsCm 35 LPA-104SS CmsUmsCm CmUmUm CfUmGf AfAfCm AmAmGm AmCmUm GmUmAm 124
Geno-1-066M LPA-37AS AmsAfsUm GmUmAf UmUmUm GmUmCm CmUfUm CfUmCm GmAmAms GmsCm 62 LPA-105SS UmsUmsCm GmAmGm AfAmGf GfAfCm AmAmAm UmAmCm AmUmUm 153
Geno-1-036M LPA-38AS UmsUfsCm CmAmAf AmCmCm UmUmGm UmUfCm UfGmAm GmAmCms UmsGm 34 LPA-106SS GmsUmsCm UmCmAm GfAmAf CfAfAm GmGmUm UmUmGm GmAmAm 125
Geno-1-098M LPA-39AS AmsUfsGm UmCmCf UmUmCm CmUmGm UmGfAm CfAmGm UmGmGms UmsGm 90 LPA-107SS CmsCmsAm CmUmGm UfCmAf CfAfGm GmAmAm GmGmAm CmAmUm 181
Geno-1-058M LPA-40AS UmsUfsCm UmGmUf UmUmCm UmGmAm GmCfAm UfUmGm UmGmUms CmsAm 54 LPA-108SS AmsCmsAm CmAmAm UfGmCf UfCfAm GmAmAm AmCmAm GmAmAm 145
Geno-1-090M LPA-41AS AmsUfsCm UmCmAf GmCmAm UmCmUm GmGfAm UfUmCm CmUmGms CmsAm 83 LPA-109SS CmsAmsGm GmAmAm UfCmCf AfGfAm UmGmCm UmGmAm GmAmUm 174
Geno-1-039M LPA-42AS UmsAfsGm UmAmUf UmCmUm GmUmGm GmUfUm CfUmCm UmGmAms UmsGm 37 LPA-110SS UmsCmsAm GmAmGm AfAmCf CfAfCm AmGmAm AmUmAm CmUmAm 128
Geno-1-003M LPA-43AS AmsUfsAm GmAmCf GmAmCm CmAmAm GmAfCm UfGmAm CmAmUms GmsUm 4 LPA-111SS AmsUmsGm UmCmAm GfUmCf UfUfGm GmUmCm GmUmCm UmAmUm 95
Geno-1-014M LPA-44AS AmsAfsGm UmAmAf CmAmAm AmCmCm UmUfGm AfAmAm CmAmCms GmsAm 14 LPA-112SS GmsUmsGm UmUmUm CfAmAf GfGfUm UmUmGm UmUmAm CmUmUm 105
Geno-1-040M LPA-45AS UmsAfsAm CmAmCf CmAmAm GmGmAm CmUfAm AfUmCm UmCmAms GmsCm 38 LPA-113SS UmsGmsAm GmAmUm UfAmGf UfCfCm UmUmGm GmUmGm UmUmAm 129
Geno-1-047M LPA-46AS UmsAfsCm AmGmAf AmUmUm UmGmUm CmAfGm UfCmAm GmAmCms CmsUm 45 LPA-114SS GmsUmsCm UmGmAm CfUmGf AfCfAm AmAmUm UmCmUm GmUmAm 136
Geno-1-045M LPA-47AS UmsUfsCm AmAmGf CmAmGm UmGmAm GmCfAm GfCmAm GmUmCms AmsGm 43 LPA-115SS GmsAmsCm UmGmCm UfGmCf UfCfAm CmUmGm CmUmUm GmAmAm 134
Geno-1-057M LPA-48AS AmsAfsCm AmUmAf CmAmGm UmCmUm UmGfUm UfCmAm GmAmAms GmsGm 53 LPA-116SS UmsUmsCm UmGmAm AfCmAf AfGfAm CmUmGm UmAmUm GmUmUm 144
Geno-1-097M LPA-49AS UmsUfsCm CmCmAf CmAmAm UmCmAm AmAfUm GfAmAm GmAmGms GmsAm 89 LPA-117SS CmsUmsCm UmUmCm AfUmUf UfGfAm UmUmGm UmGmGm GmAmAm 180
Geno-1-046M LPA-50AS UmsAfsCm UmUmAf UmAmGm UmGmAm UmUfGm CfAmCm AmCmUms UmsCm 44 LPA-118SS AmsGmsUm GmUmGm CfAmAf UfCfAm CmUmAm UmAmAm GmUmAm 135
Geno-1-021M LPA-51AS AmsAfsCm AmCmCf AmAmGm GmAmCm UmAfAm UfCmUm CmAmGms CmsAm 21 LPA-119SS CmsUmsGm AmGmAm UfUmAf GfUfCm CmUmUm GmGmUm GmUmUm 112
Geno-1-024M LPA-52AS UmsUfsCm CmUmGf CmAmGm UmAmGm UmUfCm AfUmUm GmUmCms AmsGm 24 LPA-120SS GmsAmsCm AmAmUm GfAmAf CfUfAm CmUmGm CmAmGm GmAmAm 115
Geno-1-020M LPA-53AS AmsAfsGm GmAmCf UmAmAm UmCmUm CmAfGm CfAmUm CmUmGms GmsAm 20 LPA-121SS CmsAmsGm AmUmGm CfUmGf AfGfAm UmUmAm GmUmCm CmUmUm 111
Geno-1-091M LPA-54AS AmsAfsUm CmUmCf AmGmCm AmUmCm UmGfGm AfUmUm CmCmUms GmsCm 84 LPA-122SS AmsGmsGm AmAmUm CfCmAf GfAfUm GmCmUm GmAmGm AmUmUm 175
Geno-1-004M LPA-55AS AmsUfsUm GmAmCf AmUmGm UmCmCm UmUfCm CfUmGm UmGmAms CmsAm 5 LPA-123SS UmsCmsAm CmAmGm GfAmAf GfGfAm CmAmUm GmUmCm AmAmUm 96
Geno-1-009M LPA-56AS AmsUfsAm AmCmUf CmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 LPA-124SS CmsAmsUm GmGmUm AfAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUm 101
Geno-1-062M LPA-57AS AmsUfsAm AmCmUf CmUmGm UmCmCm AmUfCm AfCmCm UmCmGms GmsUm 58 LPA-125SS CmsGmsAm GmGmUm GfAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUm 149
Geno-1-079M LPA-58AS UmsUfsCm UmUmCf CmUmGm UmGmAm UmAfGm UfGmGm UmGmGms AmsGm 73 LPA-126SS CmsCmsAm CmCmAm CfUmAf UfCfAm CmAmGm GmAmAm GmAmAm 164
Geno-1-006M LPA-59AS UmsCfsAm UmUmCf UmCmAm AmUmAm AmCfAm AfGmGm AmGmCms UmsGm 7 LPA-127SS GmsCmsUm CmCmUm UfGmUf UfAfUm UmGmAm GmAmAm UmGmAm 98
Geno-1-017M LPA-60AS AmsAfsGm AmUmUf GmAmCm AmUmGm UmCfCm UfUmCm CmUmGms UmsGm 17 LPA-128SS CmsAmsGm GmAmAm GfGmAf CfAfUm GmUmCm AmAmUm CmUmUm 108
Geno-1-063M LPA-61AS AmsUfsUm CmUmGf UmUmUm CmUmGm AmGfCm AfUmUm GmUmGms UmsCm 59 LPA-129SS CmsAmsCm AmAmUm GfCmUf CfAfGm AmAmAm CmAmGm AmAmUm 150
Geno-1-096M LPA-62AS AmsUfsGm UmAmAf CmAmUm UmCmAm GmUfCm CfUmGm GmCmGms GmsUm 88 LPA-130SS CmsGmsCm CmAmGm GfAmCf UfGfAm AmUmGm UmUmAm CmAmUm 179
Geno-1-044M LPA-63AS AmsUfsAm CmAmGf UmCmUm UmGmUm UmCfAm GfAmAm GmGmAms GmsGm 42 LPA-131SS UmsCmsCm UmUmCm UfGmAf AfCfAmAmGmAm CmUmGm UmAmUm 133
Geno-1-015M LPA-64AS UmsUfsCm AmUmUf CmUmCm AmAmUm AmAfCm AfAmGm GmAmGms CmsUm 15 LPA-132SS CmsUmsCm CmUmUm GfUmUf AfUfUm GmAmGm AmAmUm GmAmAm 106
Geno-1-077M LPA-65AS AmsUfsCm AmCmAf GmUmAm GmUmCm AmAfAm AfAmGm UmUmUms UmsCm 71 LPA-133SS AmsAmsAm CmUmUm UfUmUf GfAfCm UmAmCm UmGmUm GmAmUm 162
Geno-1-042M LPA-66AS UmsUfsGm AmUmUf CmCmAm UmCmAm CmUfGm GfAmCm AmUmUms GmsCm 40 LPA-134SS AmsAmsUm GmUmCm CfAmGf UfGfAm UmGmGm AmAmUm CmAmAm 131
Geno-1-027M LPA-67AS UGAGCCUmCGAUAACU CUmGUdTdT 27 LPA-135SS ACmAGAmGmUUA CGmAGmGm CmUmCAmdTdT 118
Geno-1-008M LPA-68AS AUAACUCmUGUCCAUU ACmCAdTdT 9 LPA-136SS UGmGUAmAmUGG ACAmGAmGm UmUmAUmdTdT 100
인간 LPA mRNA을 표적으로 하는 접합 리간드의 변형된 siRNA 번호 및 서열
이중 가닥 번호 안티센스 가닥 번호 안티센스 가닥
5'→3'		 원래
SEQ ID NO.		 센스 가닥 번호 센스 가닥
5'→3'		 원래 SEQ ID NO.
Geno-1-105M 359AS AmsUfsAm AmCfUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 368SS [Gal-6]sCmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6] 101
Geno-1-106M 359AS AmsUfsAm AmCfUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 369SS [Gal-6]s[Gal-6]sCmAmUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUm[Gal-6][Gal-6] 101
Geno-1-107M 359AS AmsUfsAmAmCfUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-108M 359AS AmsUfsAm AmCfUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 371SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-5] 101
Geno-1-109M 382AS AmsUfsAmAmCmUfCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 396SS CmsAmsUm GmGmUm AfAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-110M 383AS AmsUfsAm AmCmUfCmUfGf UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 396SS CmsAmsUm GmGmUm AfAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-111M 384AS VP(U)sUfsAmAmCfUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-112M 385AS AmsUfsAm AmCfUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCf AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-113M 386AS AmsUfsAm AmCmUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCf AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-114M 387AS AmsUfsAm AmCfUfCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-115M 388AS AmsUfsAm AmCmUfCfUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-116M 389AS AmsUfsAf AmCmUfCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-117M 359AS AmsUfsAm AmCfUmCmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 397SS CmsAmsUm GmGmUm AfAmUf GfGfAf CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-118M LPA-60AS AmsAfsGm AmUmUf GmAmCm AmUmGm UmCfCm UfUmCm CmUmGms UmsGm 17 398SS CmsAmsGm GmAmAm GfGmAf CfAfUm GmUmCm AmAmUm CmUmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 108
Geno-1-119M 494AS AmsUfsAm AmCfUm(UNA-C)UmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 370SS CmsAmsUm GmGmUm AmAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 101
Geno-1-120M 498AS AmsAfsGm AmUfUm GmAmCm AmUmGm UmCfCm UfUmCm CmUmGms UmsGm 17 511SS CmsAmsGm GmAmAm GmGmAf CfAfUm GmUmCm AmAmUm CmUmUms[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 108
Geno-1-1001M LPA-56AS AmsUfsAm AmCmUf CmUmGm UmCmCm AmUfUm AfCmCm AmUmGms GmsUm 10 330SS CmsAmsUm GmGmUm AfAmUf GfGfAm CmAmGm AmGmUm UmAmUm[L96] 101
Geno-1-1002M 331AS AmsUfsAm AfCmUf CmUfGm UfCmCf AmUfUm AfCmsCfs Gm 184 332SS CfsGmsGfUm AfAmUf GmGfAm CfAmGf AmGfUm UfAmUfs[L96] 187
Geno-1-1003M AM-AS UmsCfsGmUfAmUfAmAmCmAmAmUfAmAfGmGfGmGfCmsUfsGm 185 AM-SS [NAG25]sCmsAmGmCmCmCmCmUmUfAfUfUmGmUmUmAmUmAmCmGms[invdA] 188
Geno-1-1004M 331AS AmsUfsAm AfCmUf CmUfGm UfCmCf AmUfUm AfCmsCfs Gm 186 365SS [ST23sST23sST23sC6XLT]sCfsGmsGfUmAf AmUfGmGfAmCfAmGf
AmGfUmUfsAmsUf		 189
상기 Geno-1-1002M의 변형되지 않은 서열은 AUAACUCUGUCCAUUACCG(SEQ ID No. 184)이고; 대응하는 센스 가닥의 변형되지 않은 서열은 CGGUAAUGGACAGAGUUAU(SEQ ID No. 188)이다. Geno-1-1003M의 변형되지 않은 서열은 UCGUAUAACAAUAAGGGGCUG(SEQ ID No. 185)이고; 대응하는 센스 가닥의 변형되지 않은 서열은 CAGCCCCUUAUUGUUAUACGA(SEQ ID No. 189)이다. 상기 Geno-1-1004M의 변형되지 않은 서열은 AUAACUCUGUCCAUUACCG(SEQ ID No. 186)이고; 대응하는 센스 가닥의 변형되지 않은 서열은 CGGUAAUGGACAGAGUUAU(SEQ ID No. 189)이다.
[Gal-5] 구조식:
Gal-6은 실시예 1의 단계 5)에서 제조한 목적 생성물 Geno-Gal-6의 약어이다.
[Gal-6]s[Gal-6]s[Gal-6] 구조식:
[ST23sST23sST23sC6XLT] 구조식 :
실시예 3: LPA RNAi제의 시험관 내 실험
컴퓨터로 결정된 잠재적인 LPA RNAi제(표 1) 91개를 합성하고 이에 대해 시험관 내 효능 스크리닝을 수행하였다.
스크리닝 목적을 위해, 인간 LPA cDNA 서열(수탁 번호 NM_005577.1) 또는 이의 단편을 시판되는 포유동물 발현 벡터(Origene)로부터 시판되는 리포터 기반 스크리닝 플라스미드 psiCHECK2(Promega)로 서브클로닝하여 레닐라 루시퍼라제/LPA 융합 mRNA를 생산하였다. 인간 맥락에서 LPA RNAi제의 효능을 알아보기 위해, Huh7 세포(인간 간세포 암종 계통)를 96웰에 약 10,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 각 LPA RNAi제를 웰당 25ng의 psiCHECK2-LPA 플라스미드 DNA 및 웰당 0.2μL의 LipoFectamine 2000과 함께 두 가지 농도(1nM 및 0.1nM)로 공동 형질감염시켰다. 이중 루시퍼라제 리포터 분석(Promega)을 사용하여 psiCHECK2 플라스미드에도 존재하는 구성적으로 발현된 반딧불이 루시퍼라제의 수준으로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 수준을 측정하여 유전자 녹다운을 결정하였다(표 4).
표 4에 나타난 바와 같이, 91개 서열 중 66개 서열은 1nM에서 60% 이상의 녹다운 효율을 나타냈고, 61개 서열은 0.1nM에서 50% 이상의 녹다운 효율을 나타냈다.
이중 루시퍼라제 리포터 분석을 통해 결정된 LPA RNAi제의 시험관 내 효능 스크리닝 결과
화합물 번호Compound ID 억제율(Inhibition)%
1nM 0.1nM
Geno-1-001 78.18 60.57
Geno-1-002 18.19 0.79
Geno-1-003 65.09 55.86
Geno-1-004 69.45 56.78
Geno-1-005 76.00 67.92
Geno-1-006 75.74 57.81
Geno-1-007 -10.00 -9.37
Geno-1-010 93.06 86.75
Geno-1-011 86.65 77.88
Geno-1-014 82.13 69.88
Geno-1-015 62.17 40.78
Geno-1-016 -0.04 -5.14
Geno-1-017 71.17 55.74
Geno-1-018 68.30 64.22
Geno-1-019 84.44 81.88
Geno-1-020 67.32 43.77
Geno-1-021 77.85 60.29
Geno-1-022 75.88 68.58
Geno-1-023 83.04 80.59
Geno-1-024 77.55 60.52
Geno-1-025 51.88 25.06
Geno-1-026 78.57 65.11
Geno-1-030 86.03 80.89
Geno-1-031 83.81 75.38
Geno-1-035 86.58 82.78
Geno-1-036 70.26 60.91
Geno-1-037 81.46 74.44
Geno-1-038 5.10 3.16
Geno-1-039 77.03 66.79
Geno-1-040 69.92 55.90
Geno-1-041 81.97 73.79
Geno-1-042 63.01 44.87
Geno-1-043 -6.86 -11.04
Geno-1-044 69.39 48.30
Geno-1-045 73.01 61.20
Geno-1-046 66.89 53.89
Geno-1-050 72.83 65.84
Geno-1-051 86.40 74.10
Geno-1-055 73.37 66.42
Geno-1-056 -6.78 -5.78
Geno-1-057 74.65 57.12
Geno-1-058 86.67 73.20
Geno-1-059 77.75 70.33
Geno-1-060 91.34 81.49
Geno-1-061 90.34 83.21
Geno-1-062 67.81 51.32
Geno-1-063 75.74 64.82
Geno-1-064 94.24 88.92
Geno-1-065 11.71 -0.21
Geno-1-066 71.04 60.00
Geno-1-070 80.00 67.11
Geno-1-071 78.50 57.74
Geno-1-075 71.01 58.21
Geno-1-076 82.21 72.31
Geno-1-077 78.06 60.96
Geno-1-078 41.18 14.44
Geno-1-079 63.34 47.73
Geno-1-080 90.15 80.39
Geno-1-081 93.02 86.90
Geno-1-082 80.40 74.00
Geno-1-083 5.59 2.06
Geno-1-084 78.77 68.91
Geno-1-085 77.73 66.81
Geno-1-086 79.34 74.16
Geno-1-090 69.09 55.55
Geno-1-091 60.89 33.31
Geno-1-095 -10.72 -9.86
Geno-1-096 75.27 55.43
Geno-1-097 77.78 71.38
Geno-1-098 81.48 72.03
Geno-1-099 75.57 60.84
Geno-1-100 74.28 60.79
Geno-1-027 84.03 75.13
Geno-1-009 64.75 50.17
Geno-1-012 3.07 -7.03
Geno-1-029 5.67 0.99
Geno-1-032 7.26 -0.51
Geno-1-049 7.32 6.57
Geno-1-052 2.96 4.52
Geno-1-069 5.85 -1.42
Geno-1-072 83.39 80.69
Geno-1-089 86.55 74.21
Geno-1-092 80.11 69.67
Geno-1-008 50.89 37.03
Geno-1-034 5.35 -10.01
Geno-1-047 55.57 62.42
Geno-1-054 -13.83 -13.81
Geno-1-067 -18.62 -13.62
Geno-1-074 -12.83 -15.93
Geno-1-087 -16.56 -17.15
Geno-1-094 -22.42 -19.66
실시예 4: LPA RNAi제EC50 측정
실시예 3에서와 동일한 세포 및 형질감염 조건을 사용하여 7점 EC50 곡선을 생성하였고, LPA RNAi제 농도는 0.1fM-10M 범위였다. EC50 값은 "S자형 용량-반응(가변 기울기)"를 사용하여 GraphPad Prism을 통해 용량-반응 곡선을 피팅하여 결정하였다(표 5).
표 5에 나타난 바와 같이, 테스트된 화합물의 EC50 범위는 1pM ~ 60pM 사이였다.
시험관 내에서 결정된 지정된 LPA RNAi제의 EC50 값(pM)
LPA RNAi제의 ID EC50(pM) LPA RNAi제의 ID EC50(pM)
Geno-1-001 13.16 Geno-1-050 8.102
Geno-1-003 NA Geno-1-051 5.861
Geno-1-004 19.72 Geno-1-055 9.449
Geno-1-005 10.46 Geno-1-057 16.05
Geno-1-006 17.01 Geno-1-058 11.55
Geno-1-010 3.495 Geno-1-059 8.994
Geno-1-011 12.61 Geno-1-060 18.58
Geno-1-014 10.32 Geno-1-061 8.115
Geno-1-015 NA Geno-1-062 55.48
Geno-1-017 NA Geno-1-063 15.12
Geno-1-018 NA Geno-1-064 3.104
Geno-1-019 6.852 Geno-1-066 16.99
Geno-1-020 8.324 Geno-1-070 14.51
Geno-1-021 16.65 Geno-1-071 16.84
Geno-1-022 5.928 Geno-1-072 18.87
Geno-1-023 3.388 Geno-1-075 11.3
Geno-1-024 21.88 Geno-1-076 9.823
Geno-1-026 9.508 Geno-1-077 20.88
Geno-1-027 5.44 Geno-1-079 27.85
Geno-1-030 3.114 Geno-1-080 8.466
Geno-1-031 5.853 Geno-1-081 11.46
Geno-1-035 6.414 Geno-1-082 9.531
Geno-1-036 7.389 Geno-1-084 7.988
Geno-1-037 1.974 Geno-1-085 11.92
Geno-1-039 13.55 Geno-1-086 6.002
Geno-1-040 5.001 Geno-1-090 19.78
Geno-1-041 4.361 Geno-1-096 39.39
Geno-1-042 26 Geno-1-097 10.19
Geno-1-044 8.591 Geno-1-098 4.67
Geno-1-045 3.016 Geno-1-099 15.63
Geno-1-046 27.33 Geno-1-100 38.62
실시예 5: 변형된 LPA RNAi제의 시험관 내 테스트 결과 분석변형 후 예비 스크리닝을 통과한 서열을 실시예 3에서와 동일한 세포 및 형질감염 조건을 사용하여 웰당 25ng의 psiCHECK2-LPA 플라스미드 DNA 및 웰당 0.2μL의 LipoFectamine 2000과 함께 1nM의 농도로 공동 형질감염시켰다. 이중 루시퍼라제 리포터 분석(Promega)을 사용하여 psiCHECK2 플라스미드에도 존재하는 구성적으로 발현된 반딧불이 루시퍼라제의 수준으로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 수준을 측정하여 유전자 녹다운을 결정하였다(표 6).
표 6에 나타난 바와 같이, 71개 서열 중 41개 서열은60% 이상의 녹다운 효율을 나타냈다.
이중 루시퍼라제 리포터 분석을 통해 결정된 LPA RNAi제의 시험관 내 효능 스크리닝 결과
화합물 번호Compound ID 억제율(Inhibition) %(1nM)
Geno-1-001M 58.00
Geno-1-003M 47.13
Geno-1-004M 71.11
Geno-1-005M 52.21
Geno-1-006M 70.00
Geno-1-009M 89.39
Geno-1-010M 78.45
Geno-1-011M 84.58
Geno-1-014M 80.29
Geno-1-015M 73.55
Geno-1-017M 71.98
Geno-1-018M 67.59
Geno-1-019M 61.85
Geno-1-020M 61.80
Geno-1-021M 44.08
Geno-1-022M 62.18
Geno-1-023M 32.89
Geno-1-024M 55.27
Geno-1-026M 73.35
Geno-1-030M 84.39
Geno-1-031M 56.31
Geno-1-035M 68.26
Geno-1-036M 64.07
Geno-1-037M 52.63
Geno-1-039M 72.51
Geno-1-040M 58.20
Geno-1-041M 54.25
Geno-1-042M 65.20
Geno-1-044M 65.44
Geno-1-045M 33.35
Geno-1-046M 75.78
Geno-1-047M 3.80
Geno-1-050M 55.11
Geno-1-051M 61.79
Geno-1-055M 55.97
Geno-1-057M 54.52
Geno-1-058M 60.63
Geno-1-059M 64.08
Geno-1-060M 47.53
Geno-1-061M 56.16
Geno-1-062M 80.93
Geno-1-063M 71.69
Geno-1-064M 69.74
Geno-1-066M 65.90
Geno-1-070M 71.81
Geno-1-071M 55.91
Geno-1-072M -10.82
Geno-1-075M 61.53
Geno-1-076M 53.98
Geno-1-077M 79.55
Geno-1-079M 29.32
Geno-1-080M 65.69
Geno-1-081M 75.32
Geno-1-082M 42.32
Geno-1-084M 50.80
Geno-1-085M 51.56
Geno-1-086M 71.99
Geno-1-089M 7.90
Geno-1-090M 61.57
Geno-1-091M 52.38
Geno-1-092M 1.15
Geno-1-096M 45.30
Geno-1-097M 62.95
Geno-1-098M 57.05
Geno-1-099M 62.93
Geno-1-100M 66.52
Geno-1-009M 80.82
Geno-1-072M 62.73
Geno-1-089M 53.75
Geno-1-092M 62.58
Geno-1-047M 66.07
실시예 6: 인간 RT-4 세포에서 LPA mRNA 발현 억제를 통한 비접합 LPA RNAi제의 스크리닝각 LPA RNAi제를 웰당 0.4μL의 RNAiMax(Invitrogen)와 50nM의 농도로 공동 배양하였다. RT-4 세포(인간 방광 이행 세포 유두종 세포주)를 24웰 플레이트에 약 70,000개 세포/웰로 플레이팅하고 인큐베이션된 형질감염 복합체에 시딩하였다. 형질감염 24시간 후, RNeasy 96 키트(Qiagen)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. Novizan cDNA 역전사 키트 및 qPCR 키트를 사용하여 cDNA 합성 및 해당 샘플에 대한 하우스키핑 전사체로서 GAPDH mRNA 발현의 PCR 검출을 수행하였고, LPA mRNA 수준은 qRT-PCR에 의해 결정되었다(표 7).
qRT-PCR 측정을 통해 결정한 LPA RNAi제의 시험관 내 효능 스크리닝 결과
Compound ID 억제율(Inhibition) %(50 nM)
Geno-1-004M -60.71
Geno-1-006M -51.12
Geno-1-009M 46.29
Geno-1-010M -0.08
Geno-1-011M 44.31
Geno-1-014M 2.73
Geno-1-015M 22.70
Geno-1-017M 14.12
Geno-1-026M -91.64
Geno-1-030M 13.43
Geno-1-039M 23.94
Geno-1-046M 1.06
Geno-1-062M 25.41
Geno-1-063M -11.46
Geno-1-064M 1.71
Geno-1-070M -18.22
Geno-1-077M -108.01
Geno-1-081M -45.73
Geno-1-086M 11.98
Geno-1-092M 6.23
실시예 7: 피하 투여 후 야생형 마우스의 간 및 신장에서 접합 LPA RNAi제의 분포 비율
30마리의 C57BL6/J 마우스를 10개 그룹으로 나누고, 지정된 5개 그룹에 LPA RNAi제를 첫날 10mg/Kg의 용량으로 각 그룹의 마우스에 피하 주사하였다. 5개 그룹의 마우스는 투여 후 1시간 후에 조직을 수집하였고, 다른 5개 그룹은 투여 후 24시간 후에 조직을 수집하였다. 수집된 조직 샘플은 급속 냉동되었으며 -80℃로 옮겨 보고나하였다. 조직 균질화 후, 간 조직 균질액과 신장 조직 균질액 중 대응하는 LPA RNAi제의 농도를 혼성화 형광 프로브-효소 결합 면역흡착 분석법으로 측정하고, 간 조직 균질액의 농도를 신장 조직의 농도로 나누어 간-신장 비율을 계산하고 평가하였다. 결과를 표 8에 나타내었다.
도 2는 10mg/Kg LPA RNAi제의 SC 투여 후 야생형 마우스의 간과 신장의 화합물 농도 비율을 보여준다. 결과는 서로 다른 시점에서 표적 장기 간의 Geno-1-105M ~ Geno-1-108M의 농도가 비표적 장기 신장의 농도보다 훨씬 높았으며 신장에 대한 간의 약물 농도 비율은 1보다 훨씬 컸다. 동시에 2개의 시험 시점에서 비표적 장기 신장에서의 Geno-1-1004M 농도는 모두 간에서의 농도보다 높았으며, 신장에 대한 간의 약물 농도 비율은 1보다 작았다.
10mg/Kg LPA RNAi제의 SC 투여 후 야생형 마우스의 간과 신장의 화합물 농도 비율
1시간 평균 간-신장 비율 SD% 24시간 평균 간-신장 비율 SD%
Geno-1-105M 12.1 21% 65.9 30%
Geno-1-106M 29.5 14% 128.6 39%
Geno-1-107M 16.5 1% 94.2 8%
Geno-1-108M 19.3 24% 74.8 25%
Geno-1-1004M 0.2 13% 0.3 21%
실시예 8: C57 일시적 트랜스제닉 마우스에서 LPA RNAi제의 효능에 대한 생체내 시험
LPA RNAi제 투여 2주 전, 고압 꼬리 정맥 주입을 통해 야생형 마우스(수컷, C57 BL/6)에 마우스 알부민 프로모터의 조절 하에 SEAP 유전자를 함유한 플라스미드(인간 LPA 유전자 표적 서열 클론을 함유한 플라스미드)를 주입하였다. 이들 마우스를 SEAP-LPA-HDI 마우스로 명명하였다. 0일차에 SEAP-LPA-HDI 마우스에게 1mg/Kg 또는 3mg/Kg의 LPA RNAi Geno-1-1001M 또는 Geno-1-1002M 용액을 5ml/Kg의 투여부피로 피하 주사하였다. 대조군의 마우스에는 동일한 부피의 인산염 완충액(PBS)이 제공되었다. 투여 14일 전(Day-14), 투여 당일(Day0), 및 투여 후 7, 14, 21, 28 및 35일차에 마우스 혈청을 수집하였다(21~35일차에는 Geno-1-1001M 그룹만 수집하였음).
LPA 발현의 녹다운은 화학발광 리포터 시스템 Phospha-LightTM(Life Technologies)을 사용하여 마우스 혈청에서 SEAP 단백질 수준을 검출함으로써 평가되었다. 정규화를 위해, 주어진 시점에서의 각 동물의 SEAP 수준을 해당 동물의 전처리 수준으로 나누어 "정규화된 또는 전처리된" 발현 비율을 결정하고, 각 동물의 "정규화된 또는 전처리된" 비율을 대조군의 모든 마우스의 "정규화된 또는 전처리된" 비율의 평균으로 나누어 특정 시점에서의 발현을 대조군으로 정규화하였다. 이는 각 시점의 발현을 대조군의 발현으로 정규화한 것이다.
도 3은 본 실시예의 검출 결과를 보여준다.
접합된 LPA RNAi제를 상술한 바와 같이 SEAP-LPA-HDI 마우스에 투여하였다. 각 마우스에 1mg/kg 또는 3mg/kg LPA RNAi제 Geno-1-1001M 또는 Geno-1-1002M 용액의 단일 피하 주사(SC) 용량을 투여하고 혈청 SEAP 단백질 수준을 35일 동안 모니터링하였다. 녹다운 수준과 응답 기간은 표 9에 나와 있다. 1mg/kg 및 3mg/kg LPA RNAi제 Geno-1-1002M은 투여 후 7일차에 SEAP 단백질 수준이 ≥57% 및 ≥67%로 최대 녹다운을 나타냈으며, SEAP 단백질 수준은 투여 14일 후 대조군 수준으로 돌아와 녹다운 효과가 나타나지 않았다. 1mg/kg 및 3mg/kg LPA RNAi제 Geno-1-1001M은 투여 후 7일차에 SEAP 단백질 수준이 ≥87% 및 ≥57%로 최대 녹다운을 나타냈으며, 3mg/Kg LPA RNAi제 Geno-1-1001M는 투여 35일차에도 여전히 단백질 수준이 ≥72%의 녹다운을 나타냈다. 동일한 용량에서 LPA RNAi제 Geno-1-1001M은 LPA RNAi제 Geno-1-1002M에 비해 SEAP 단백질 수준에 대한 녹다운 효과와 녹다운 기간이 훨씬 더 우수함을 의미한다.
다양한 용량의 접합 LPA RNAi제의 피하 투여 후 마우스 혈청 내 상대적 Apo(a) 수준

처리		 0일차 7일차 14일차 21일차 28일차 35일차
평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차
PBS 1.00 0.00 1.00 0.39 1.00 0.64 1.00 0.78 1.00 0.79 1.00 0.86
Geno-1-1001M-1.0mpk 1.00 0.00 0.42 0.16 0.75 0.28 0.82 0.33 0.97 0.25 1.04 0.36
Geno-1-1001M-3.0mpk 1.00 0.00 0.13 0.07 0.16 0.08 0.17 0.09 0.17 0.08 0.27 0.15
Geno-1-1002M-1.0mpk 1.00 0.00 0.43 0.23 1.14 0.71 / / / / / /
Geno-1-1002M-3.0mpk 1.00 0.00 0.32 0.17 1.05 0.71 / / / / / /
실시예 9 : NOD SCID 일시적 트랜스제닉 마우스에서 LPA RNAi제의 효능에 대한 생체내 시험LPA RNAi제 투여 10일 전, 고압 꼬리 정맥 주입을 통해 NOD SCID 마우스(수컷)에 인간 LPA 유전자 표적 서열의 클론을 함유한 미니서클 DNA(MC hLPA)를 주사하였다. 이들 마우스를 MC hLPA HDI 마우스로 명명하였다. 0일차에 이들 마우스에게 0.3mg/Kg, 1mg/Kg, 3mg/Kg 또는 9mg/kg LPA RNAi제(Geno-1-107M, Geno-1-1003M 및 Geno-1-1004M) 용액을 5ml/Kg의 투여부피로 피하 주사하였다. 대조군의 마우스에는 동일한 부피의 인산염 완충액(PBS)이 제공되었다. 투여 3일 전(Day-3), 투여 당일(Day0), 및 투여 후 4, 7, 14, 21, 28 및 35일차에 마우스 혈청을 수집하였다
LPA 발현의 녹다운은 ELISA 방법(Apo(a), Abcam)을 사용하여 마우스 혈청에서 Apo(a) 단백질 수준을 검출함으로써 평가되었다. 정규화를 위해, 주어진 시점에서의 각 동물의 Apo(a) 수준을 해당 동물의 전처리 수준(Day0)으로 나누어 "정규화된 또는 전처리된" 발현 비율을 결정하고, 각 동물의 "정규화된 또는 전처리된" 비율을 대조군의 모든 마우스의 "정규화된 또는 전처리된" 비율의 평균으로 나누어 특정 시점에서의 발현을 대조군으로 정규화하였다. 이는 각 시점의 발현을 대조군의 발현으로 정규화한 것이다.
도 4는 본 실시예의 검출 결과를 보여준다.
접합된 LPA RNAi제를 상술한 바와 같이 MC hLPA HDI 마우스에 투여하였다. 각 마우스에 0.3mg/Kg, 1mg/Kg, 3mg/Kg 또는 9mg/kg LPA RNAi제(Geno-1-107M, Geno-1-1003M 및 Geno-1-1004M) 용액의 단일 피하 주사(SC) 용량을 투여하고 혈청 Apo(a) 단백질 수준을 35일 동안 모니터링하였다. 녹다운 수준과 응답 기간은 표 10에 나와 있다. 0.3mg/Kg, 1mg/Kg 또는 3mg/Kg LPA RNAi제(Geno-1-1004M) 용액은 투여 후 7일차에 Apo(a) 단백질 수준이 최대 녹다운을 나타냈으며, 녹다운이 각각 33%, 58% 및 79%에 달하였다, 투여 28일차에 0.3mg/Kg, 1mg/Kg 또는 3mg/Kg LPA RNAi제(Geno-1-1004M)는 Apo(a) 단백질 수준에 대한 녹다운이 각각 20%, 42% 및 45%에 달하였다. 3mg/Kg LPA RNAi제(Geno-1-1004M)는 투여 후 35일차에도 여전히 Apo(a) 단백질 수준이 ≥20％의 녹다운을 나타냈다. 1mg/Kg 또는 3mg/Kg LPA RNAi제(Geno-1-1003M) 용액은 투여 후 7일차에 Apo(a) 단백질 수준이 최대 녹다운을 나타냈으며, 녹다운이 각각 79% 및 92%에 달하였다, 투여 28일차에 1mg/Kg 또는 3mg/Kg LPA RNAi제(Geno-1-1003M)는 Apo(a) 단백질 수준에 대한 녹다운이 각각 52% 및 90%에 달하였다. 3mg/Kg LPA RNAi제(Geno-1-1003M)는 투여 후 35일차에도 여전히 Apo(a) 단백질 수준이 ≥83％의 녹다운을 나타냈다. 0.3mg/Kg, 1mg/Kg, 3mg/Kg 또는 9mg/kg LPA RNAi(Geno-1-107M) 용액은 투여 후 7일차에 Apo(a) 단백질 수준이 최대 녹다운을 나타냈으며, 녹다운이 각각 45%, 71%, 96% 및 99%에 달하였다, 투여 28일차에 0.3mg/Kg, 1mg/Kg, 3mg/Kg 또는 9mg/kg LPA RNAi제(Geno-1-107M)는 Apo(a) 단백질 수준에 대한 녹다운이 각각 33%, 45%, 88% 및 98%에 달하였다, 3mg/Kg LPA RNAi제 Geno-1-107M는 투여 후 35일차에도 여전히 Apo(a) 단백질 수준이 ≥74％의 녹다운을 나타냈다. 9mg/Kg LPA RNAi제 Geno-1-107M는 투여 후 35일차에도 여전히 Apo(a) 단백질 수준이 ≥97％의 녹다운을 나타냈다. 동일한 용량의 3mg/kg LPA RNAi제는 투여 후 같은 시점에 Geno-1-107M은 Apo(a) 단백질 수준에 대한 녹다운 효과가 Geno-1-1004M보다 유의하게 우수행ㅆ으며 Geno-1-1003M의 녹다운 효과에 상당하였다.
다양한 용량의 접합 LPA RNAi제의 피하 투여 후 마우스 혈청 내 상대적 Apo(a) 수준
처리 0일차 4일차 7일차 14일차 21일차 28일차 35일차
평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값 표준편차 평균값
PBS 1.00 0.00 1.00 0.22 1.00 0.34 1.00 0.32 1.00 0.44 1.00 0.29 1.00
Geno-1-107M 0.3mpk 1.00 0.00 0.56 0.11 0.55 0.18 0.55 0.12 0.61 0.21 0.67 0.08 0.93
Geno-1-107M 1mpk 1.00 0.00 0.35 0.13 0.29 0.12 0.33 0.18 0.35 0.26 0.55 0.29 0.75
Geno-1-107M 3mpk 1.00 0.00 0.06 0.05 0.04 0.02 0.04 0.02 0.07 0.03 0.12 0.05 0.26
Geno-1-107M 9mpk 1.00 0.00 0.02 0.01 0.01 0.01 0.02 0.03 0.04 0.02 0.02 0.03 0.03
Geno-1-1004M 0.3mpk 1.00 0.00 0.85 0.15 0.67 0.08 0.81 0.11 0.72 0.20 0.80 0.26 1.20
Geno-1-1004M 1mpk 1.00 0.00 0.52 0.10 0.42 0.11 0.47 0.12 0.42 0.10 0.58 0.11 0.70
Geno-1-1004M 3mpk 1.00 0.00 0.23 0.12 0.21 0.10 0.23 0.11 0.28 0.06 0.55 0.15 0.80
Geno-1-1003M 1mpk 1.00 0.00 0.40 0.06 0.21 0.05 0.21 0.03 0.25 0.09 0.48 0.15 0.61
Geno-1-1003M 3mpk 1.00 0.00 0.17 0.05 0.08 0.01 0.04 0.03 0.07 0.03 0.10 0.03 0.17
실시예 10: NOD SCID 일시적 트랜스제닉 마우스에서 LPA RNAi제의 효능에 대한 생체내 시험(단일 용량)
LPA RNAi제 투여 10일 전, 고압 꼬리 정맥 주입을 통해 NOD SCID 마우스(수컷)에 LPA 유전자 표적 서열의 클론을 함유한 미니서클 DNA(MC hLPA)를 주사하였다. 이들 마우스를 MC hLPA HDI 마우스로 명명하였다. 0일차에 이들 마우스에게 1mg/Kg LPA RNAi제 시험 용액을 5ml/Kg의 투여부피로 피하 주사하였다. 대조군의 마우스에는 동일한 부피의 인산염 완충액(PBS)이 제공되었다. 투여 3일 전(Day-3), 투여 당일(Day0), 및 투여 후 4, 7, 14, 21, 28일차에 마우스 혈청을 수집하였다(일부 그룹은 21일 및 28차에만 수집하였음).
LPA 발현의 녹다운은 ELISA 방법(Apo(a), Abcam)을 사용하여 마우스 혈청에서 Apo(a) 단백질 수준을 검출함으로써 평가되었다. 정규화를 위해, 주어진 시점에서의 각 동물의 Apo(a) 수준을 해당 동물의 전처리 수준(Day0)으로 나누어 "정규화된 또는 전처리된" 발현 비율을 결정하고, 각 동물의 "정규화된 또는 전처리된" 비율을 대조군의 모든 마우스의 "정규화된 또는 전처리된" 비율의 평균으로 나누어 특정 시점에서의 발현을 대조군으로 정규화하였다. 이는 각 시점의 발현을 대조군의 발현으로 정규화한 것이다.
도 5는 본 실시예의 검출 결과를 보여준다.
접합된 LPA RNAi제를 상술한 바와 같이 MC hLPA HDI 마우스에 투여하였다. 각 마우스에 1mg/Kg LPA RNAi제 용액의 단일 피하 주사(SC) 용량을 투여하고 혈청 Apo(a) 단백질 수준을 28일 동안 모니터링하였다. 녹다운 수준과 응답 기간은 표 11에 나와 있다. 투여 7일차에 LPA RNAi제 1mg/Kg을 투여한 10개는 50%를 초과하는 녹다운을 나타냈고, 그 중 LPA RNAi제 1mg/Kg을 투여한 3개는 70%를 초과하는 녹다운을 나타냈으며; 그 중 하나의 Geno-1-107M는 Apo(a) 단백질 수준에 대한 녹다운이 84%를 초과하였다. 투여 14일차에 LPA RNAi제 1mg/Kg을 투여한 8개는 50%를 초과하는 녹다운을 나타냈고, 그 중 LPA RNAi제Geno-1-112M 1mg/Kg을 투여한 1개는 70%를 초과하는 녹다운을 나타냈으며; 그 중 LPA RNAi제Geno-1-107M 및 Geno-1-1003M을 투여한 2개는 Apo(a) 단백질 수준에 대한 녹다운이 80%를 초과하였다. 투여 28일차에 LPA RNAi제Geno-1-107M 및 Geo-1-111M을 투여한 2개는 Apo(a) 단백질 수준에 대한 녹다운이 여전히 65% 및 54%를 유지하였다.
접합된 LPA RNAi제 1mg/Kg의 피하 투여 후 마우스 혈청 내 상대적 Apo(a) 수준
실시예 11: NOD SCID 일시적 트랜스제닉 마우스에서 LPA RNAi제의 효능에 대한 생체내 시험
LPA RNAi제 투여 27일 전, 고압 꼬리 정맥 주입을 통해 NOD SCID 마우스(수컷)에 LPA 유전자 표적 서열의 클론을 함유한 미니서클 DNA(MC hLPA)를 주사하였다. 이들 마우스를 MC hLPA HDI 마우스로 명명하였다. 0일차에 이들 마우스에게 1mg/Kg LPA RNAi제 시험 용액을 5ml/Kg의 투여부피로 피하 주사하였다. 대조군의 마우스에는 동일한 부피의 인산염 완충액(PBS)이 제공되었다. 투여 3일 전(Day-3), 투여 당일(Day0), 및 투여 후 4, 11, 18일차에 마우스 혈청을 수집하였다.
LPA 발현의 녹다운은 ELISA 방법(Apo(a), Abcam)을 사용하여 마우스 혈청에서 Apo(a) 단백질 수준을 검출함으로써 평가되었다. 정규화를 위해, 주어진 시점에서의 각 동물의 Apo(a) 수준을 해당 동물의 전처리 수준(Day0)으로 나누어 "정규화된 또는 전처리된" 발현 비율을 결정하고, 각 동물의 "정규화된 또는 전처리된" 비율을 대조군의 모든 마우스의 "정규화된 또는 전처리된" 비율의 평균으로 나누어 특정 시점에서의 발현을 대조군으로 정규화하였다. 이는 각 시점의 발현을 대조군의 발현으로 정규화한 것이다.
도 6은 본 실시예의 검출 결과를 보여준다.
Gal-6 접합된 LPA RNAi제를 상술한 바와 같이 MC hLPA HDI 마우스에 투여하였다. 각 마우스에 1mg/Kg LPA RNAi제 용액의 단일 피하 주사(SC) 용량을 투여하고 혈청 Apo(a) 단백질 수준을 18일 동안 모니터링하였다. 녹다운 수준과 응답 기간은 표 12에 나와 있다. 투여 4일차에는 LPA RNAi제인 Geno-1-107M 및 Geno-1-120M 1mg/Kg가 69%와 66%의 녹다운을 나타냈고, 투여 11일차에 LPA RNAi제인 Geno-1-107M 및 Geno-1-120M 1mg/Kg가 70% 및 73%의 녹다운을 나타냈으며, 투여 18일차에 LPA RNAi제인 Geno-1-107M 및 Geno-1-1003M 1mg/Kg가 64% 및 56%의 녹다운을 나타냈다.
Gal-6-접합 LPA RNAi제 1mg/Kg의 피하 투여 후 마우스 혈청 내 상대적 Apo(a) 수준
상술한 내용은 본 발명의 바람직한실시예일 뿐 본 발명을 제한하려는 의도가 아니며 본 발명의 원칙 내에서 이루어진 모든 수정, 등가 대체 및 개선 등은 본 발명의 보호범위에 속해야 한다.

Claims (29)

  1. LPA의 RNA 간섭제로서,
    제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 183 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 12개의 연속 뉴클레오타이드, 또는 상기 적어도 12개의 연속 뉴클레오타이드와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오타이드는 변형되거나 변형되지 않은 상태인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 12 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성되고, 바람직하게는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드로 구성되는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어 변형된 뉴클레오타이드를 형성하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 표 2의 변형된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 이중 가닥 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 독립적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  9. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    변형된 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오타이드, 이환형 핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드 뉴클레오타이드, EVP, UNA 및 GNA 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번, 5번, 6번, 8번, 10번, 14번 및 16번 중 적어도 하나의 부위가 2'-플루오로 변형되거나 메톡시 변형되고, 바람직하게는 5-7개의 부위가 2'-플루오로 변형되거나 메톡시 변형되는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  11. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 독립적으로 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고; 바람직하게, 상기 센스 가닥은 3' 및 5' 말단의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합을 포함하거나, 상기 안티센스 가닥은 3' 및 5' 말단의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥은 표 2의 안티센스 가닥 번호 중 어느 하나 또는 이와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 간섭제는 접합 리간드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 리간드는 표적화기를 포함하고, 바람직하게, 상기 표적화기는 아시알로당단백질 수용체 리간드를 포함하며; 더욱 바람직하게, 상기 아시알로당단백질 수용체 리간드는 갈락토스 클러스터를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 리간드는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 접합되고, 바람직하게, 센스 가닥에 접합되는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는 구조 Z-X(I)를 포함하고,
    상기 식에서, Z는 뉴클레오타이드 서열의 제1 링커 모이어티이고 Z의 일반식은 (Z-1)과 같으며;

    상기 식에서 R1은 O, S, NR3 또는 CR3R4이고, 상기 식에서 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환 지방족, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로고리 또는 치환 또는 비치환 사이클로알킬이며;
    상기 식에서 R2는 -O-, -S-, -NH-, -CH2-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2NH-, -CH2O-, -NH-C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-NH-, 또는 -NH(CO)NH-이고, 상기 -CH2-는 할로겐, 알킬, 알콕시, 알킬아미노로부터 선택되는 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있으며; 상기 a와 b는 동일하거나 상이하며 각각 0 내지 20의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수로부터 선택되 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제1 링커 모이어티 Z는 제2 링커 모이어티 L1에 연결되고, 상기 제2 링커 모이어티 L1은 분지점 그룹 E에 연결되는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 분지점 그룹 E는 또한 표적화 모이어티에 연결되는 a개의 테더링 모이어티 L2에 연결되고, 상기 a는 0 내지 10의 정수로부터 선택되고, 바람직하게 1 내지 5의 정수로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는 하기 구조를 가지며;
    ,
    일반식 (II)에서
    L4는 표적화 모이어티이고,
    X는 뉴클레오타이드 서열이고,
    Y는 O 또는 S이고,
    b, c, d 및 e는 각각 0 내지 10의 정수로부터 선택되고, b와 e가 다를 경우 0인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 링커 모이어티 L1은 하기 구조를 가지며;

    상기 식에서 f, g, h 및 i는 각각 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 테더링 모이어티 L2는 하기 구조식을 가지며;

    상기 식에서 j, k, l, m, n 및 o는 각각 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는 화학식 I-1 내지 I-16 중 적어도 하나를 포함하고,

    (I-1),

    (I-2),

    (I-3),

    (I-4),

    (I-5),

    (I-6),

    (I-7),

    (I-8),

    (I-9),

    (I-10),

    (I-11),

    (I-12),

    (I-13),

    (I-14),

    (I-15),

    (I-16);
    또는 구조식 II-1 내지 II-28 중 적어도 하나를 포함하고:

    (II-1),

    (II-2),

    (II-3),

    (II-4),

    (II-5),

    (II-6),

    (II-7),

    (II-8),

    (II-9),

    (II-10),

    (II-11),

    (II-12),

    (II-13),

    (II-14),

    (II-15),

    (II-16),

    (II-17),

    (II-18),

    (II-19),

    (II-20),

    (II-21),

    (II-22),

    (II-23),

    (II-24),

    (II-25),

    (II-26),

    (II-27),

    (II-28),
    상기 식에서 Y는 O 또는 S인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    표 3의 서열 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭제.
  24. 약물 제조를 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 RNA 간섭제의 용도로서,
    상기 약물은 포유동물에서 LPA mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키거나, LPA 발현 관련 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하거나, 질환 또는 병증의 위험을 줄이는 것을 특징으로 하는 용도.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 Lp(a) 단백질의 발현 수준은 34.100 nmol/L 이상인 것을 특징으로 하는 용도.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 질환 또는 병증은 간 유래 질환, 염증, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 심근경색, 또는 대사 질환을 포함하고; 바람직하게, 상기 심혈관 및 뇌혈관 질환질환은 고지혈증, 중풍, 죽상 동맥 경화증, 혈전증, 관상동맥질환, 심장마비, 뇌경색 또는 대동맥 협착증을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 약물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고, 바람직하게, 상기 약학적으로 허용 가능한 부형제는 PBS 완충액 또는 생리식염수인 것을 특징으로 하는 용도.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 약물은 조성물이고, LDL-C, 콜레스테롤 및 트리글리세리드 저하제 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 약물은 조성물은 PCSK9 RNAi 억제제, PCSK9 항체 억제제 및 PCSK9 소분자 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
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