CN108130069B - 稀土上转换纳米诊疗剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法，包括步骤：将Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4与吲哚青绿染料(ICG)分子结合，形成ICG‑LNPs复合物；以及采用偶联聚乙二醇修饰所述ICG‑LNPs复合物，得到DSPE‑mPEG‑ICG‑LNPs。本发明还公开了一种稀土上转换纳米诊疗剂。本发明利用稀土上转换纳米材料NaYF4：Er在近红外二区发射的优点，将ICG分子与其偶联，ICG可以增强Er3+的1520nm发光，解决了现有技术中上转换纳米材料掺杂三价稀土铒离子(Er3+)的氟化物纳米晶体的发光效率低的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及上转换发光材料领域，尤其涉及一种稀土上转换纳米诊疗剂及其制备方法。
背景技术
稀土掺杂的无机发光材料(LNPs)可以在近红外光的激发下发射出可见光或近红外光，这种材料已经广泛的应用在生物传感、生物成像及药物释放等，尤其是多模态功能在纳米诊疗剂在生物应用中尤为重要。这就要求纳米诊疗剂不仅具有治疗目的，而且能实时诊断监测的功能。
掺杂三价稀土铒离子(Er3+)的氟化物纳米晶体是光学生物成像中常用的纳米材料之一。这种纳米材料在近红外光808nm激光激发下发射绿色可见光(540nm)和红色可见光(650nm)，并且其斯托克斯发光在1520nm和2800nm都有发射。在1520nm处的发射光在第二光学透明度窗口(NIR-II)内，并与可见光相比，生物组织成分的吸收和散射较低，可用于更深组织的生物成像，可以实现更清晰的诊断功能。
尽管这种纳米材料在生物应用领域具有相当大的能力，但是与体材料相比，Er3+离子在800nm附近处的吸收和发光效率很低。通常需要优化纳米颗粒光学参数。通常Er3+最佳浓度为1～2摩尔％。进一步增加浓度会导致发光的淬灭。其他几种提高纳米颗粒发光的策略包括：(1)通过核壳结构钝化纳米粒子的表面缺陷，减少稀土离子表面配体分子与溶剂分子的相互作用，从而提高发光效率；(2)通过贵金属纳米材料的表面等离子体增强效应增强上转换纳米粒子的发光。
因此，有必要提供有效的提高纳米材料掺杂三价稀土铒离子(Er3+)的氟化物纳米晶体的发光效率的方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种稀土上转换纳米诊疗剂及其制备方法，旨在解决现有技术中上转换纳米材料掺杂三价稀土铒离子(Er3+)的氟化物纳米晶体的发光效率的技术问题。
为实现上述目的，本发明第一方面提供一种稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法，包括步骤：
将Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4与吲哚青绿染料(ICG)分子结合，形成ICG-LNPs复合物；以及
采用偶联聚乙二醇修饰所述ICG-LNPs复合物，得到DSPE-mPEG-ICG-LNPs复合物。
本发明提供一种稀土上转换纳米诊疗剂，所述稀土上转换纳米诊疗剂采用第一方面提供的所述稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法制备。
利用稀土上转换纳米材料NaYF4：Er在近红外二区发射的优点，将ICG分子与其偶联，一方面ICG可以增强Er3+的1520nm发光，另一方面，ICG与Er3+之间能量转移降低了ICG自身的光漂白作用，而且产生的热效应可以用于光热成像和光声成像，并且体外光热治疗效果显著。从而实现一种纳米诊疗剂的多功能化应用，相对于传统单一的药物，疗效诊断更加精确，因此对于临床精确治疗诊断方面有着广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本技术方案实施例提供的稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法的流程图；
图2为本技术方案实施方式提供的稀土上转换纳米诊疗剂的构建示意图；
图3为本技术方案实施例提供的不同Er3+浓度掺杂的上转换纳米粒子的透射电镜照片；
图4为本技术方案实施例提供的ICG最佳敏化浓度光谱；
图5为本技术方案实施例提供的体外光热治疗的细胞存活率图；
图6为本技术方案实施例提供的稀土上转换纳米诊疗剂用于近红外二区生物成像图；
图7为本技术方案实施例提供的稀土上转换纳米诊疗剂的光热成像图；
图8为本技术方案实施例提供的稀土上转换纳米诊疗剂光热成像图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
由于现有技术中针对上转换纳米材料掺杂三价稀土铒离子(Er3+)的氟化物纳米晶体的发光效率低的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明提出一种稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法，包括步骤：
将Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4与吲哚青绿染料(ICG)分子结合，形成ICG-LNPs复合物；以及
采用偶联聚乙二醇(DSPE-mPEG)修饰所述ICG-LNPs复合物，得到DSPE-mPEG-ICG-LNPs复合物。
请参阅图1，为本技术方案提供的一种稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法的流程图。
第一步，将Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4与吲哚青绿染料(ICG)分子结合，形成ICG-LNPs复合物。
在本实施方式中，本步骤具体包括：
首先，制备Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4。
本实施方式中，采用热-共沉淀法制备上转换NaYF4:Er纳米粒子。具体为：1、称量氯化钇YCl3·6H2O 0.2426g、氯化铒ErCl3·6H2O 0.0076g，放入装有6ml油酸和15ml十八烯的三口瓶中。2、通氩气30min，除去反应瓶中的水蒸气和氧气。3、升温到160℃,反应30min，降到室温，加入NH4F(0.1480g)和NaOH(0.1000g)的8ml甲醇溶液，反应30min，然后加热到70℃,除去甲醇后，温度迅速升温到300℃,反应1小时，最后降到室温，用乙醇离心，分散到正己烷溶液中。
本步骤中，可以通过控制不同的反应时间，从而控制NaYF4:Er纳米粒子中Er3+的浓度。含有不同浓度的Er3+NaYF4:Er纳米粒子透射电镜照片如图3所示。最优的，Er3+离子掺杂浓度为20％时，发光最强。
然后，采用四氟硼酸亚硝鎓(NOBF4)修饰上转换纳米粒子NaYF4:Er，得到NOBF4-LNPs复合物。
本步骤中，NOBF4用于替代前面制备的上转换纳米粒子NaYF4:Er表面的油酸配体。可以采用将分散在正己烷中的油酸的上转换纳米粒子NaYF4:Er与NOBF4混合，摇动至产生沉淀，将混合物离心并分散在二甲基甲酰胺溶液中，得到NOBF4-LNPs复合物，具体为：
将分散在约5mg/mL的正己烷中的4mL油酸的上转换纳米粒子NaYF4:Er与100μLNOBF4(0.1mg/mL)混合，然后轻轻摇动，直到观察到纳米粒子的沉淀。之后，将混合物以8000rpm离心10分钟并分散在4mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，得到NOBF4-LNPs复合物。
最后，采用ICG敏化所述NOBF4-LNPs复合物，得到ICG-LNPs复合物。
将DMF的NOBF4-LNPs溶液与ICG染料混合，得到混合物，将所述混合物摇动以形成ICG-LNPs。
具体的，将2mL的DMF(5mg/mL)的NOBF4-LNPs与不同量(0～20μg/mL)的ICG染料混合，得到混合物。具体的，可以采用0μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、16μg/mL以及20μg/mL ICG染料分别进行混合。将所述混合物轻轻摇动2分钟以形成ICG-LNPs。
由于ICG具有高光敏性，将所有制备的ICG-LNPs储存在棕色的小瓶中，并避光保存。
请参阅图4，由光谱图可以看出不同浓度ICG浓度的ICG-LNPs中，以浓度为14μg/mL最优。ICG敏化Er3+的发光最强，其斯托克斯发光1520nm处于NIR-II区，更有利于NIR-II生物成像，成像深度约为2mm。
第二步，采用偶联聚乙二醇(DSPE-mPEG)修饰所述ICG-LNPs复合物，得到DSPE-mPEG-ICG-LNPs，即得到稀土上转换纳米诊疗剂。
本步骤可以将DSPE-mPEG溶于CHCl3中，加入ICG，得到ICG-DSPE-mPEG溶液。然后，将ICG-LNPs溶解在所述ICG-DSPE-mPEG溶液中，将所得混合物超声处理，并在氩气流下蒸发氯仿，将得到干燥的固体部分分散在去离子水中，形成DSPE-mPEG-ICG-LNPs的溶液。
具体可以为：将2mg DSPE-mPEG溶于1mL CHCl3中，加入10μL 0.1mg/mL的ICG，得到ICG-DSPE-mPEG溶液。然后，将50μL 20mg/mL溶液的干燥的ICG-LNPs溶解在所述ICG-DSPE-mPEG溶液中。将所得混合物超声处理约10分钟，并在氩气流下蒸发氯仿。将干燥的固体部分分散在去离子水中，分散体以10000rpm离心8分钟，最后重新分散在去离子水中形成DSPE-mPEG-ICG-LNPs的溶液。
本技术方案实施例还提供一种稀土上转换纳米诊疗剂，所述稀土上转换纳米诊疗剂采用上面的实施方式制备。在本实施例中，过共价偶联的方法，将Er3+掺杂的上转换纳米粒子与ICG分子结合，然后通过偶联聚乙二醇(DSPE-mPEG)增加生物相容性。
进一步，所述稀土上转换纳米诊疗剂为DSPE-mPEG-ICG-LNPs的溶液，即所述稀土上转换纳米诊疗剂包括DSPE-mPEG-ICG-LNPs。所述Er3+掺杂的上转换纳米粒子可以为单掺杂不同Er3+离子浓度的NaYF4，优选的，Er3+离子掺杂浓度为20％时，发光最强。
ICG是FDA批准的医用的试剂，本发明中引入ICG分子不仅具有敏化稀土Er3+发光的作用，而且由于Er3+和ICG之间的共振能量转移作用阻碍了ICG的光漂白，增强了ICG的光热效应，并且可以用于光热治疗。
进一步，所述稀土上转换纳米诊疗剂的ICG的最优浓度是14μg/mL。此时ICG敏化Er3+的发光最强，其斯托克斯发光1520nm处于NIR-II区，更有利于NIR-II生物成像，成像深度约为2mm。，由于ICG分子还可以用于光声成像的造影剂，因此可以用于光声成像，成像深度约为1.5mm。
引入有机染料分子ICG增加稀土发光中心Er3+离子的吸收截面,解决了Er3+低掺杂的问题，ICG在808nm处具有强吸收，并且发射带与Er3+吸收带有交叠，使得能够从ICG到Er3+离子的有效能量传递。并且，ICG分子向Er3+的高效能量转移也降低了染料分子ICG的光漂白，并为生物成像应用提供了更好的光稳定性。
本实施例提供的稀土上转换纳米诊疗剂在的应用广泛，具体可以用于体外发热治疗、NIR-II荧光成像、光热成像及光声成像等，具体如下：
1、体外光热治疗：
为了研究光热效应对细胞活性的影响，将大鼠C6细胞接种在96孔板上。孵育24h后，加入不同浓度(0μg/mL，2μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL)的DSPE-mPEG-ICG-LNPs溶液加入96孔中，孵育4h。然后用808nm(0.67W/cm2)激光照射不同孔中的细胞0,5和10分钟。在激光照射后，将细胞再培养24小时，并通过MTT法检测细胞存活率。实验结果请参照图5。
2、NIR-II荧光成像。
使用InGaAs相机WiDy SWIR 640(NIT)进行近红外二区的荧光成像。使用具有连续激光器808nm光纤耦合激光二极管LU0808TO20(Lumix)作为激发源。为了排除成像时激发光的影响，将1350nm长波通滤光片(Semrock)插入相机前面。在活体鼠成像的实验中，照射区域为直径10mm的点，激光功率设定为600mW(0.7W/cm2)，成像情况请参阅图6。
3、光热成像
在808nm激光照射下，ICG-LNP的光热温度分布通过热成像相机FLIR A600(FLIRSystems)监测。对于活体光热成像，在小鼠肿瘤处注射DSPE-mPEG/ICG-LNPs溶液，然后用808nm激光(0.7W/cm2)照射麻醉小鼠的肿瘤，观察前后肿瘤热成像变化。成像情况请参阅图7。
4、光声成像
在实验过程中，将小鼠放在一个水箱下面，一个塑料窗在底部。800nm激光由10Hz脉冲、重复频率10ns脉冲、和持续时间的Nd：YAG泵浦光参量振荡器(SLIII-10，Continuum)提供。通过具有一个圆形输入和两个线性输出(约60％耦合效率)的分叉纤维束将束输送到肿瘤表面。肿瘤表面的光强度约为15mJ/cm2，此光强低于美国国家标准学会(ANSI)在800nm的安全限制的50％。通过具有5MHz中心频率的128元素线性换能器阵列(ATL L7-4，Philips)获得肿瘤的PA信号。以0.1mm的步长进行扫描，长度为40mm(肿瘤直径约25mm)。接收的光声信号通过128通道超声数据采集系统(Vantage，Verasonics)以20MHz采样率进行放大和数字化。使用通用反投影算法重构原始通道数据，为了形成肿瘤轮廓的2D图像，重建的3D图像。成像情况请参阅图8。
从而可以看出，利用稀土上转换纳米材料NaYF4：Er在近红外二区发射的优点，将ICG分子与其偶联，一方面ICG可以增强Er3+的1520nm发光，另一方面，ICG与Er3+之间能量转移降低了ICG自身的光漂白作用，而且产生的热效应可以用于光热成像和光声成像，并且体外光热治疗效果显著。达到实现一种纳米诊疗剂的多功能化应用，相对于传统单一的药物，疗效诊断更加精确，因此对于临床精确治疗诊断方面有着广阔的应用前景，为肿瘤的及早发现及治疗提供了新的思路。
以上为对本发明所提供的一种稀土上转换纳米诊疗剂及其制备方法的描述，对于本领域的技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (5)
1.一种稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法，包括步骤：
将Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4与吲哚青绿染料ICG分子结合，形成ICG-LNPs复合物；以及
采用偶联聚乙二醇DSPE-mPEG修饰所述ICG-LNPs复合物，得到DSPE-mPEG-ICG-LNPs；
其中Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4中Er3+离子掺杂浓度为20％；
所述Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4采用热-共沉淀法制备；
将Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4与吲哚青绿染料分子结合，形成ICG-LNPs复合物，包括：
制备Er3+掺杂的上转换纳米粒子NaYF4；
采用四氟硼酸亚硝鎓修饰上转换纳米粒子NaYF4:Er，得到NOBF4-LNPs复合物；以及
采用ICG敏化所述NOBF4-LNPs复合物，得到ICG-LNPs复合物；
采用DSPE-mPEG修饰所述ICG-LNPs复合物，包括：
将DSPE-mPEG溶于CHCl3中，加入ICG，得到ICG-DSPE-mPEG溶液，然后，将ICG-LNPs溶解在所述ICG-DSPE-mPEG溶液中，将所得混合物超声处理，并在氩气流下蒸发氯仿，将得到干燥的固体部分分散在去离子水中，形成DSPE-mPEG-ICG-LNPs的溶液。
2.如权利要求1所述的 稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，采用四氟硼酸亚硝鎓修饰上转换纳米粒子NaYF4:Er，得到NOBF4-LNPs复合物，包括：将分散在正己烷中的油酸的上转换纳米粒子NaYF4:Er与NOBF4混合，摇动至产生沉淀，将混合物离心并分散在二甲基甲酰胺溶液中，得到NOBF4-LNPs复合物。
3.如权利要求1所述的 稀土上转换纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，采用ICG敏化所述NOBF4-LNPs复合物，得到ICG-LNPs复合物，包括：
将DMF的NOBF4-LNPs溶液与ICG染料混合，得到混合物，将所述混合物摇动以形成ICG-LNPs。
4.一种稀土上转换纳米诊疗剂，其特征在于，所述稀土上转换纳米诊疗剂采用权利要求1所述的稀土上转换纳米诊疗剂制备方法制备。
5.如权利要求4所述的稀土上转换纳米诊疗剂，其特征在于，所述稀土上转换纳米诊疗剂中的ICG的浓度是14μg/mL。
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