CN110478483A - 一种多色上转换纳米探针及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种多色上转换纳米探针及制备方法与应用，由内而外依次包括上转换纳米粒子、二氧化硅层，上转换纳米粒子包括NaYF4内核和NaYF4外壳构成，NaYF4内核和NaYF4外壳之间设有NaYF4中间发光层，NaYF4中间发光层掺杂Y3+、Yb3+、Tm3+和Ho3+，上转换纳米粒子和二氧化硅层之间和/或二氧化硅层内掺杂多重光敏剂，二氧化硅层的厚度小于15nm，二氧化硅层的外表面修饰有线粒体靶向配体，多重光敏剂至少三种光敏剂，三种光敏剂中的一种为吲哚菁绿。该纳米探针通过ICG的敏化作用和980nm激光的深层组织穿透能力，制备的基于UCNPs的纳米探针可以实现对深层肿瘤的协同PDT治疗。

Description

一种多色上转换纳米探针及制备方法与应用
技术领域
本公开属于生物医药技术领域，涉及一种多色上转换纳米探针及制备方法与应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
光作为一种可激活热疗的外源性刺激物，具有时空选择性高、副作用小等优点，在光热、光动力和光触发化学/基因治疗中得到了广泛的应用。光动力疗法(PDT)使用光敏剂(PS)产生活性氧(ROSs)，其可以选择性地和不可逆地破坏癌细胞和肿瘤组织而不损害邻近的健康细胞。其临床应用主要局限于组织穿透深度短、PS分子容易聚集和不能足够的产生ROSs。
掺杂镧系元素的上转换纳米粒子(UCNPs)将近红外(NIR)光转换成可见光，具有高组织穿透深度，最小化自发荧光背景和生物样品中低毒性的明显优势。UCNPs作为PDT的最佳理论材料，其NIR激发光具有更深的组织穿透能力，并且其发射的紫外光或者可见光可用于活化光敏剂，产生具有高度反应性的ROSs，同时改善光敏剂体内递送困难、靶向性低等问题，实现直接杀死癌细胞或摧毁肿瘤部位血管及激活宿主免疫系统等目的。在近红外有机染料中，ICG基于-型能量转移，能有效地使Yb3+敏化，使发光强度提高1100倍以上。然而，据本公开发明人所知，ICG存在水溶液的不稳定性、快速清除、易于自漂白以及缺乏靶标等缺点，难以用于PDT。据本公开发明人研究发现，四种颜色的UCNPs量子产率低、发光效率低，限制了对其进行PDT的应用。
发明内容
为了解决UCNPs-PDT的局限性，包括从UCNPs到PS分子的低能量转移效率、ROSs产生不足和扩散距离有限等问题，本公开的目的是提供一种多色上转换纳米探针及制备方法与应用，该多色上转换纳米探针能够选择性地积聚在线粒体中并原位产生ROSs，其可以破坏线粒体并诱导线粒体介导的细胞凋亡。通过ICG的敏化作用和980nm激光的深层组织穿透能力，制备的基于UCNPs的纳米探针可以实现对深层肿瘤的协同PDT治疗。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
第一方面，本公开提供了一种多色上转换纳米探针，由内而外依次包括上转换纳米粒子、二氧化硅层，所述上转换纳米粒子包括NaYF4内核和NaYF4外壳构成，NaYF4内核和NaYF4外壳之间设有NaYF4中间发光层，NaYF4中间发光层掺杂Y3+、Yb3+、Tm3+和Ho3+，上转换纳米粒子和二氧化硅层之间和/或二氧化硅层内掺杂多重光敏剂，二氧化硅层的厚度小于15nm，二氧化硅层的外表面修饰有线粒体靶向配体，所述多重光敏剂为至少三种光敏剂，三种光敏剂中的一种为吲哚菁绿(ICG)。
首先，本公开利用ICG的敏化作用，提高了UCNPs掺杂光敏剂的掺杂率，并且实现了负载多重光敏剂。其次，本公开通过控制二氧化硅层的厚度，缩短了能量传递距离。从而解决了低能量转移效率、ROSs产生不足和扩散距离有限等问题。第三，本公开设置线粒体靶向配体，能够使得纳米探针在线粒体产生ROSs并积累，从而实现多色上转换纳米探针的靶向递送。
第二方面，本公开提供了一种上述多色上转换纳米探针的制备方法，油酸钇与氟化钠反应生成NaYF4内核，将NaYF4内核与油酸稀土盐(钇盐、镱盐、铥盐、钬盐按照一定比例合成)混合加热至不低于330℃进行反应，再加入油酸钇，继续反应形成三明治式上转换纳米粒子，利用反胶束在含有多重光敏剂和上转换纳米粒子的分散液中制备二氧化硅，使二氧化硅包覆在上转换纳米粒子表面形成二氧化硅层，同时使多重光敏剂被包覆进入上转换纳米粒子和二氧化硅层之间和/或多重光敏剂被掺杂至二氧化硅层内，在二氧化硅层的外表面修饰聚乙二醇，修饰后的聚乙二醇具有游离的氨基，氨基与线粒体靶向配体的羧基进行酰胺化反应，所述聚乙二醇的一端连接氨基。
本公开通过反胶束控制二氧化硅层的厚度，从而控制缩短了能量传递距离，保证了有效的LRET激活光敏剂。
第三方面，本公开提供了一种上述多色上转换纳米探针在制备光动力疗法药物制剂中的应用。
本公开提供的多色上转换纳米探针能引起细胞内ROSs增多，诱导细胞凋亡，对深层恶性肿瘤有明显的抑制作用。
本公开的有益效果为：
1.本公开通过ICG的敏化作用，提高了制备了具有高掺杂率活化剂的多色UCNPs，并用于负载多重PS分子。
2.本公开通过控制二氧化硅层的厚度，缩短了能量传递距离，保证了有效的LRET激活PS分子。
3.本公开线粒体靶向配体的修饰使制备的纳米探针在细胞线粒体中累积并原位产生ROSs；由于纳米探针能引起细胞内ROSs增多，诱导细胞凋亡，对深层恶性肿瘤有明显的抑制作用。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1制备的UCNPs及实施例2制备的UCNPs的结构表征图，a为荧光强度曲线，b为实施例1制备的UCNPs的XRD图像，c为实施例1制备的UCNPs的TEM图像，d为UCNPs@SiO2的TEM图像；
图2为实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG的结构表征图，a为UCNPs@SiO2/MB/HA/ICG的紫外-可见光谱，b为UCNPs@SiO2的Zeta电位分析图，c为UCNPs@SiO2/MB/HA/ICG的Zeta电位分析图；
图3为实施例1制备的UCNP@SiO2/HA/MB/ICG@TPP的结构表征图，a为UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP紫外-可见光谱，b为UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG的Zeta电位分析图，c为UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@PEG的Zeta电位分析图，d为UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP的Zeta电位分析图；
图4为实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG的在水溶液中产生ROSs的检测结果图，a为UCNPs@SiO2和UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG的荧光光谱以及HA、MB、ICG的紫外可见光谱，b为在980nm激光(1.5W/cm2)照射下HA、MB、ICG、UCNPs@SiO2、UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG以及UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG没有光照射条件下产生的ROSs对ABDA相对荧光猝灭率曲线，c为在980nm激光照射下UCNP@SiO2/HA/MB/ICG、UCNPs@SiO2/HA、UCNPs@SiO2/MB、UCNPs@SiO2/ICG产生的ROSs对ABDA相对荧光猝灭率曲线，d为在980nm激光照射下UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP、UCNP@SiO2/HA@TPP、UCNPs@SiO2/MB@TPP、UCNPs@SiO2/ICG@TPP产生的ROSs对ABDA相对荧光猝灭率曲线；
图5为用不同浓度的PS分子制备的UCNPs@SiO2/MB/HA/ICG的相对发光光谱。
图6为采用实施例1的用70μg/mLUCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP处理的MCF-7细胞不同时间的上转换发光成像，在980nm的激发下，在515～575nm处收集绿色通道，以获得UCNPs信息。
图7(a)采用实施例1的用70μg/mL UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG处理的MCF-7细胞的上转换发光成像；(b)采用实施例1的用70μg/mL UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP处理的MCF-7细胞的上转换发光成像。在980nm的激发下，在515～575nm处收集绿色通道，以获得UCNPs信息；在633nm的激发下在650～720nm处收集红色通道以获得线粒体信息(荧光染料，深红色)，绿色通道和红色通道的重合的图象，两种染料的选定细胞的ROI的强度分布。
图8为采用实施例1的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP处理的细胞内ROSs的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。将MCF-7癌细胞与70μg/mL制备的纳米探针孵育12h，在561nm激光的激发下，在600～650nm处收集红色通道以获得细胞膜信息，在405nm激光的激发下，在420～480nm处收集蓝色通道以获得核信息，在488nm的激发下，在500-540nm处收集绿色通道以获得ROSs信息。
图9为采用实施例1的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP处理的流式细胞仪分析图，a为流式细胞仪分析曲线，b为DCF荧光强度柱状图；
图10为用JC-1染料染色的细胞内线粒体膜电位的CLSM图像，将MCF-7癌细胞与70μg/mL制备的纳米探针孵育12h，在405nm的激发下在420-480nm处记录蓝色通道以获得核信息，在488nm的激发下，在500-550nm记录绿色通道，表明单体JC-1染料，在561nm的激发下在580-640nm处记录红色通道以指示聚集的JC-1染料，叠加三个图像；
图11为流式细胞仪用于评估用制备的实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针处理的MCF-7癌细胞的ΔΨm变化图；
图12为流式细胞仪用于评估用制备的实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针处理的MCF-7癌细胞的细胞凋亡图；对照组为仅PBS、激光照射、实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP；实验组为实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP加激光照射。
图13为异种移植小鼠的体内治疗效果图，a为不同组的小鼠的体重-时间曲线，b为不同组的小鼠肿瘤体积-时间曲线，c为H&E染色，d为tunel染色，e为caspase-3染色，第13天解剖肿瘤切片的不同处理方法：仅PBS、激光照射、实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针、实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针用激光照射；
图14为实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针对主要器官的生物毒性研究图；
图15为实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针在0～125μg/mL的浓度范围内孵育MCF-7癌细胞的成活率柱状图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于上转换纳米粒子存在的UCNPs到PS分子的低能量转移效率、ROSs产生不足和扩散距离有限等问题，本公开提出了一种多色上转换纳米探针及制备方法与应用。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种多色上转换纳米探针，由内而外依次包括上转换纳米粒子、二氧化硅层，所述上转换纳米粒子包括NaYF4内核和NaYF4外壳构成，NaYF4内核和NaYF4外壳之间设有NaYF4中间发光层，NaYF4中间发光层掺杂Y3+、Yb3+、Tm3+和Ho3 +，上转换纳米粒子和二氧化硅层之间和/或二氧化硅层内掺杂多重光敏剂，二氧化硅层的厚度小于15nm，二氧化硅层的外表面修饰有线粒体靶向配体，所述多重光敏剂至少三种光敏剂，三种光敏剂中的一种为吲哚菁绿(ICG)。
首先，本公开利用ICG的敏化作用，提高了UCNPs掺杂光敏剂的掺杂率，并且实现了负载多重光敏剂。其次，本公开通过控制二氧化硅层的厚度，缩短了能量传递距离。从而解决了低能量转移效率、ROSs产生不足和扩散距离有限等问题。第三，本公开设置线粒体靶向配体，能够使得纳米探针在线粒体累积并产生ROSs，从而实现多色上转换纳米探针的靶向递送。
该实施方式的一种或多种实施例中，二氧化硅层的厚度为小于10nm。当二氧化硅层的厚度为6.2～8.3nm时，通过实验表明，该厚度的二氧化硅层具有更好的能量转移效率，从而进一步提高ROSs产生。
该实施方式的一种或多种实施例中，NaYF4中间发光层中Y元素、Yb元素、Tm元素、Ho元素的摩尔比为54.5:40:0.5:5。经过实验证明，该摩尔比下的多色上转换纳米探针的效果更好。
该实施方式的一种或多种实施例中，多重光敏剂包含竹红菌甲素(HA)、亚甲基蓝(MB)和吲哚菁绿(ICG)。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述线粒体靶向配体为3-羧丙基三苯基溴化鏻。
本公开的另一种实施方式，提供了一种上述多色上转换纳米探针的制备方法，油酸钇与氟化钠反应生成NaYF4内核，将NaYF4内核与油酸稀土盐(钇盐、镱盐、铥盐、钬盐按照一定比例合成)混合加热至不低于330℃进行反应，在加入油酸钇，继续反应形成上转换纳米粒子，利用反胶束在含有多重光敏剂和上转换纳米粒子的分散液中制备二氧化硅，使二氧化硅包覆在上转换纳米粒子表面形成二氧化硅层，同时使多重光敏剂被包覆进入上转换纳米粒子和二氧化硅层之间和/或多重光敏剂被掺杂至二氧化硅层内，在二氧化硅层的外表面修饰聚乙二醇，修饰后的聚乙二醇具有游离的氨基，氨基与线粒体靶向配体的羧基进行酰胺化反应，所述聚乙二醇的一端连接氨基。
本公开通过反胶束控制二氧化硅层的厚度，从而控制缩短了能量传递距离，保证了有效的LRET激活光敏剂。
该实施方式的一种或多种实施例中，NaYF4内核的制备过程为：将油酸钇与NaF分散在油酸与1-十八烯的混合溶液中，惰性气氛下，加热至不低于330℃进行反应。
该系列实施例中，先加热至不低于100℃反应后，再加热至低于330℃进行反应。
该系列实施例中，油酸与1-十八烯的体积比为1:0.9～1.1。
为了获得更为纯净的上转换纳米粒子，该实施方式的一种或多种实施例中，对反应后的含有上转换纳米粒子的物料进行沉淀处理，将获得的沉淀分离、洗涤。
该实施方式的一种或多种实施例中，将Igepal CO-520加入至环己烷中混合均匀获得反胶束。
该实施方式的一种或多种实施例中，向含有多重光敏剂和上转换纳米粒子的分散液中添加氨水条件pH至碱性，然后添加原硅酸四乙酯，进行水解缩合反应。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述聚乙二醇的另一端进行硅烷化修饰。
该系列实施例中，聚乙二醇通过硅烷基团通过化学键与二氧化硅层连接。
该实施方式的一种或多种实施例中，酰胺化反应的催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
本公开的第三种实施方式，提供了一种上述多色上转换纳米探针在制备光动力疗法药物制剂中的应用。
本公开提供的多色上转换纳米探针能引起细胞内ROSs增多，诱导细胞凋亡，对深层恶性肿瘤有明显的抑制作用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例及对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例试剂：
稀土氧化物，包括Y2O3，Yb2O3，Tm2O3和Ho2O3，由Sigma-Aldrich Corp提供，而1-十八烯(ODE)，油酸(OA)和PS分子购自Aladdin Reagent，Ltd。(中国上海)。国药化学试剂有限公司(中国上海)提供其他分析级化学试剂。采用OKP净化系统(中国上海莱基仪器有限公司)净化的超纯水制备样品溶液。小鼠购自湖北生物科技股份有限公司(中国武汉)。
实施例1
稀土油酸盐的制备：
称取1.129g(5mmol)Y2O3于单口圆底烧瓶中，量取20ml的浓HCl加入圆底烧瓶中，盖上保鲜膜，用针头扎几个小孔，使其在60℃下搅拌，反应8h，8h后取下保鲜膜，然后将温度升至140℃，挥干浓HCl，即得到YCl3固体。将合成的YCl3固体加入10ml超纯水，超声溶解，再加入5ml超纯水，用带有滤头的注射器过滤YCl3溶液，注射至另外一个干净干燥的烧瓶中，再加入20ml乙醇，35ml正己烷，30mmol油酸钠，在78℃下回流4h。反应完之后降温至30～40℃，将溶液转移至分液漏斗中进行萃取，分层后将溶液下层去掉，加入20ml水和20ml乙醇，振荡摇匀，共萃取三次，最后将上层溶液转移至干燥的圆底烧瓶中，在50℃下进行旋蒸，直至溶液无气泡为止。在圆底烧瓶中加入12ml油酸和12ml十八烯，将其进行搅拌，直至混合成溶液为止，取出放在离心管中，即得Y(oleate)3,储存在4℃中备用。
发光层的油酸盐(Y:Yb:Tm:Ho＝54.5:40:0.5:5，摩尔比，总摩尔数为5mmol)也通过以上方法合成，记为Ln(oleate)3。
UCNPs的制备：
将1mmol Y(oleate)3和20mmol NaF分散在20mL OA/ODE混合溶剂(V:V＝1:1)中后，将反应体系脱气以除去残留的水和氧气，在氩气(Ar)保护下将温度升到至110℃反应1.0h后，进一步升高温度至340℃反应2.0h，生成上转换内核NaYF4。加入含有Ln(oleate)3(Y:Yb:Tm:Ho＝54.5:40:0.5:5,摩尔比)的8mL OA/ODE等体积比混合液。在340℃反应20min后，然后加入8.0mL 0.05mmol/mL Y(oleate)3溶液并再反应20min以制备外壳NaYF4。通过在2倍体积的乙醇中沉淀，离心收集，并用己烷/乙醇(V:V＝1:6)洗涤数次，最后在-20℃下储存以供进一步使用，获得制备的UCNPs。
UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG的制备：
首先将Igepal CO-520(0.660mL)均匀混合到环己烷(10.0mL)中形成反胶束。然后，将制备的油酸保护的0.450mmol UCNPs加入上述反胶束中并剧烈搅拌1.0h，使得UCNPs进入至反胶束内。依次加入光敏剂分子，包括HA溶液(90μL,5.0mg/mL，乙醇)，等量的ICG乙醇溶液和MB水溶液。然后，逐滴加入60μL氨水(30％)并搅拌2.0h以使溶液呈碱性。最后，将90μL原硅酸四乙酯(TEOS)缓慢加入到体系中，在pH8～9的碱性溶液中室温下缓慢搅拌24h水解和缩合，使二氧化硅层在UCNPs的表面上生长，获得UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG。
UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP的制备：
将10.0mg UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG加入至5.0mL 5.0mg/mL氨基聚乙二醇硅烷中。缓慢摇动12h，得到最终浓度为2.0mg/mL的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@PEG。离心分离获得UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@PEG，将UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@PEG加入至8.0mL甲醇溶液(0.86mg/mL 3-羧丙基三苯基溴化鏻(CTPB)，3.46mg/mL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC))，震荡反应12h，获得UCNP@SiO2/HA/MB/ICG@TPP，即为多色上转换纳米探针，将UCNP@SiO2/HA/MB/ICG@TPP用水洗涤数次。
实施例2
本实施例与实施例1相同，不同之处在于：UCNPs中Y:Yb:Tm:Ho的摩尔比为77.8:20:0.2:2。
实施例3
本实施例与实施例1相同，不同之处在于：HA乙醇溶液、ICG乙醇溶液和MB水溶液中的浓度均为2.0mg/mL。
实施例4
本实施例与实施例1相同，不同之处在于：HA乙醇溶液、ICG乙醇溶液和MB水溶液中的浓度均为3.0mg/mL。
实施例5
本实施例与实施例1相同，不同之处在于：HA乙醇溶液、ICG乙醇溶液和MB水溶液中的浓度均为4.0mg/mL。
对比例1
UCNPs@SiO2的制备：
首先将Igepal CO-520(0.660mL)均匀混合到环己烷(10.0mL)中形成反胶束。然后，将制备的油酸保护的0.450mmol UCNPs(实施例1制备)加入上述反胶束中并剧烈搅拌1.0h，使得UCNPs进入至反胶束内。然后，逐滴加入60μL氨水(30％)并搅拌2.0h以使溶液呈碱性。最后，将90μL原硅酸四乙酯(TEOS)缓慢加入到体系中，并通过在pH8～9的碱性溶液中室温下缓慢搅拌24h水解和缩合，使二氧化硅层在UCNPs的表面上生长，获得UCNPs@SiO2。
对比例2
UCNPs@SiO2/HA的制备：
首先将Igepal CO-520(0.660mL)均匀混合到环己烷(10.0mL)中形成反胶束。然后，将制备的油酸保护的0.450mmol UCNPs(实施例1制备)加入上述反胶束中并剧烈搅拌1.0h，使得UCNPs进入至反胶束内。加入HA溶液(90μL,5.0mg/mL，乙醇)，然后，逐滴加入60μL氨水(30％)并搅拌2.0h以使溶液呈碱性。最后，将90μL原硅酸四乙酯(TEOS)缓慢加入到体系中，在pH8～9的碱性溶液中室温下缓慢搅拌24h水解和缩合，使二氧化硅层在UCNPs的表面上生长，获得UCNPs@SiO2/HA。
UCNPs@SiO2/HA@TPP的制备：
将10.0mg UCNPs@SiO2/HA加入至5.0mL的silance-PEG-NH2中。缓慢摇动12h，得到最终浓度为2.0mg/mL的UCNPs@SiO2/HA@PEG。离心分离获得UCNPs@SiO2/HA@PEG，将UCNPs@SiO2/HA@PEG加入至8.0mL甲醇溶液(0.86mg/mL 3-羧丙基三苯基溴化鏻(CTPB)，3.46mg/mL1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC))，震荡反应12h，获得UCNP@SiO2/HA@TPP，即为多色上转换纳米探针，将UCNP@SiO2/HA@TPP用水洗涤数次。
对比例3
UCNPs@SiO2/MB的制备：
首先将Igepal CO-520(0.660mL)均匀混合到环己烷(10.0mL)中形成反胶束。然后，将制备的油酸保护的0.450mmol UCNPs(实施例1制备)加入上述反胶束中并剧烈搅拌1.0h，使得UCNPs进入至反胶束内。加入MB溶液(90μL,5.0mg/mL，水)，然后，逐滴加入60μL氨水(30％)并搅拌2.0h以使溶液呈碱性。最后，将90μL原硅酸四乙酯(TEOS)缓慢加入到体系中，在pH8～9的碱性溶液中室温下缓慢搅拌24h水解和缩合，使二氧化硅层在UCNPs的表面上生长，获得UCNPs@SiO2/MB。
UCNPs@SiO2/MB@TPP的制备：
将10.0mg UCNPs@SiO2/MB加入至5.0mL的silance-PEG-NH2中。缓慢摇动12h，得到最终浓度为2.0mg/mL的UCNPs@SiO2/MB@PEG。离心分离获得UCNPs@SiO2/MB@PEG，将UCNPs@SiO2/MB@PEG加入至8.0mL甲醇溶液(0.86mg/mL 3-羧丙基三苯基溴化鏻(CTPB)，3.46mg/mL1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC))，震荡反应12h，获得UCNPs@SiO2/MB@TPP，即为多色上转换纳米探针，将UCNPs@SiO2/MB@TPP用水洗涤数次。
对比例4
UCNPs@SiO2/ICG的制备：
首先将Igepal CO-520(0.660mL)均匀混合到环己烷(10.0mL)中形成反胶束。然后，将制备的油酸保护的0.450mmol UCNPs(实施例1制备)加入上述反胶束中并剧烈搅拌1.0h，使得UCNPs进入至反胶束内。加入ICG溶液(90μL,5.0mg/mL，乙醇)，然后，逐滴加入60μL氨水(30％)并搅拌2.0h以使溶液呈碱性。最后，将90μL原硅酸四乙酯(TEOS)缓慢加入到体系中，在pH8～9的碱性溶液中室温下缓慢搅拌24h水解和缩合，使二氧化硅层在UCNPs的表面上生长，获得UCNPs@SiO2/ICG。
UCNPs@SiO2/ICG@TPP的制备：
将10.0mg UCNPs@SiO2/ICG加入至5.0mL的silance-PEG-NH2中。缓慢摇动12h，得到最终浓度为2.0mg/mL的UCNPs@SiO2/ICG@PEG。离心分离获得UCNPs@SiO2/ICG@PEG，将UCNPs@SiO2/ICG@PEG加入至8.0mL甲醇溶液(0.86mg/mL 3-羧丙基三苯基溴化鏻(CTPB)，3.46mg/mL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC))，震荡反应12h，获得UCNPs@SiO2/ICG@TPP，即为多色上转换纳米探针，将UCNPs@SiO2/ICG@TPP用水洗涤数次。
对以上实施例及对比例中的多色上转换纳米探针进行结构及性能表征。
表征仪器：
在透射电子显微镜(TEM，型号：JEM-2010，JEOL)下观察制备的纳米颗粒的尺寸和形态，并且通过X射线粉末衍射仪测定它们的结晶相(D8ADVANCE，CuKα辐射，)。使用配备有外部980连续波激光的荧光分光光度计(模式：F-4600，Hitachi)来获得上转换发光光谱。用Agilent UV-Vis分光光度计(型号：Cary 60)表征制备的纳米颗粒的UV-Vis吸收光谱，并用Zeta尺寸的纳米仪器(Zen 3600，Malvern Instruments Ltd.)获得它们的ζ电位。双光子激光扫描共聚焦显微镜(型号：Leica TCS SP5)用于追踪荧光信息并获得荧光图像。通过CCK-8测试评估制备的纳米诊断剂的体外细胞毒性，该测试在Microplate Reader(Thermo Scientific Multi-skan Mk3)上进行。流式细胞仪(cytoflex，beckmancoulter，America)用于分析细胞荧光信息和细胞凋亡。
表征结果：
结构表征如图1所示，从图1a中可以看出，通过ICG染料的敏化作用可以减轻Yb3+的发光浓度猝灭效应，选择发光层的掺杂比(Y:Yb:Tm:Ho＝54.5:40:0.5:5)来获得多色UCNPs具有强烈的荧光强度。从图1b～c中可以看出，实施例1制备的UCNPs具有纯六方相及均质颗粒尺寸(为41.4nm)。
从图1d中可以看出，实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG中的二氧化硅层均匀致密，厚度为6.2～8.3nm。
通过UV-vis分析(图2a)和zeta-电位(图2b-c)证明，在硅烷化过程中，PS分子(HA、MB和ICG)可以很容易地掺入二氧化硅层而无需进一步改性。通过硅烷化反应，制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG纳米探针用PEG-NH2修饰，PEG-NH2进一步与线粒体识别配体TPP连接，通过碳二亚胺反应得到最终的纳米探针，UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP，如图3所示。较短的能量传递距离和匹配良好的光谱保证了较高的能量传递效率。
在水溶液中产生ROSs的检测：
如图4a所示，随着PS分子浓度的增加，在峰值478nm、648nm和808nm处，猝灭率分别提高到91.4％、89.2％和85.9％(图5)。ROSs指示剂9,10-蒽二基-双(亚甲基)二酮酸(ABDA)进一步用于评价由制备的纳米探针在水溶液中产生的ROSs。如图4b所示，只有在980nm激发下制备的纳米探针才能产生ROSs。如图4c所示，由于合作的光动力效应，制备的纳米探针加载三重光敏剂可以产生比其他报道的基于UCNPs的PDT纳米探针更多的ROSs，因为它可以在照射21.0min后淬灭ABDA 66.3％的荧光强度。用TPP修饰后，构建的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP产生的ROSs也显示出明显的优势。
细胞内ROSs的检测：
通过CCK-8测定研究其细胞毒性。细胞培养溶液含有90％Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，10％热灭活的胎牛血清(FBS)，青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)将MCF-7细胞在上述培养液中于37℃在含有5％CO2的潮湿空气中培养。
在CCK-8检测中，将密度为15000个细胞/孔的MCF-7癌细胞转移到96孔平底微量滴定板中培养。然后，将制备的浓度范围为0-0.125mg/mL的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针分别加入相应的孔中，并在四个平行孔中进行检测。MCF-7癌细胞经纳米探针孵育24小时后，用PBS缓冲液洗涤3次。然后，向每个孔中加入10μL CCK-8试剂，并在37℃下继续孵育MCF-7癌细胞2小时。最后，用酶标仪记录MCF-7癌细胞在450nm处的吸光度。根据以下等式计算细胞活力(％)：细胞活力(％)＝平均吸光度处理的孔/平均吸光度对照孔×100％。
如图15所示，当与实施例1制备的纳米探针在0～125μg/mL的浓度范围内孵育时，MCF-7癌细胞成活率可以保持95％以上。
基于产生的ROSs和ΔΨm损伤，预期线粒体依赖性细胞凋亡。首先用CCK-8测定细胞凋亡。当用实施例1制备的UCNP@SiO2/HA/MB/ICG@TPP处理时，MCF-7癌细胞的活力显着降低至仅17.3％。此外，引入的三重PS分子带来了更高的PDT功效，归因于ROSs的产生增加。通过流式细胞仪进一步分析细胞凋亡。在对照组(图12(a)、(b)和(c))中，超过91％的癌细胞位于左下象限，具有高活力。与制备的纳米探针一起孵育并用NIR激光激发后，约51.71％和33.64％的癌细胞分别从高活力转变为早期凋亡和晚期凋亡。因此，细胞凋亡是由制备的纳米探针诱导的主要细胞死亡方式。
本公开进一步研究了内化的纳米探针用荧光染料2,7-二氯呋喃二乙酸酯(DCFH-DA)在活细胞中产生ROSs的能力。用流式细胞仪和共聚焦显微镜对绿色荧光成像并记录，结果如图8和图9所示。如图9所示，当仅用980nm激光照射处理时，MCF-7癌细胞没有显示明显增加的绿色荧光，证明所用的激光功率对于激发PDT是安全的。此外，MCF-7细胞在仅与制备的纳米探针孵育后也未显示明显增加的绿色荧光，证明制备的纳米探针显示出良好的生物相容性，低细胞毒性并且在没有980nm激光照射的情况下不产生ROSs。相反，细胞内的纳米探针可以在980nm激光照射下产生ROSs。在共聚焦显微镜下进一步观察产生的ROSs。如图8所示，980nm激光的照射可以激活分布在MCF-7癌细胞的线粒体中的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针以产生ROSs。
在双光子共聚焦激光扫描显微镜图像下观察细胞生物相容性和分布。如图6所示，实施例1制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针首先被内吞到MCF-7癌细胞中，并在前7h逐渐被溶酶体/核内体中捕获。随着孵育时间延长至12h，纳米探针释放到细胞质中。
进一步检测制备的纳米探针在细胞内的定位。如图7所示，制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG纳米探针主要分布在细胞质中(图7a)。相比之下，在UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@TPP纳米探针处理组(图7b)中，UCNPs和MitoTracker染料的荧光信号重叠良好，证明TPP官能团可以驱动制备的UCNPs@SiO2/HA/MB/ICG@PEG纳米探针在线粒体中积累，这将实现原位PDT治疗。
线粒体膜电位的检测：
线粒体膜电位(ΔΨm)在线粒体的生物活性中起重要作用，其降低是评估线粒体功能障碍的关键指标。JC-1荧光染料倾向于聚集在红色荧光中，具有高ΔΨm和在具有低ΔΨm的绿色荧光中变成单体。因此，其荧光强度的变化(Fred/Fgreen)将反映线粒体膜状态。如图10所示，纳米探针和NIR激光治疗组中的JC-1染料显示出更强的绿色荧光和更弱的红色荧光，这归因于产生的ROSs降低的ΔΨm。用流式细胞仪进一步评估ΔΨm的降低，如图11所示。在没有NIR激光照射的情况下，Fred/Fgreen约为0.16，而用NIR激光激发后约有56.13％的MCF-7细胞移入下象限，Fred/Fgreen比率(0.05)大幅下降。
在动物体内的治疗效果：
用异种移植小鼠研究了制备的纳米探针在体内的治疗效果。将肿瘤体积为100-130mm3的荷瘤裸鼠随机分为4组，分别进行不同处理：(a)注射PBS缓冲液，(b)注射制备的纳米探针，(c)NIR激光照射，(d)注入制备的纳米探针，12小时后在NIR激光下照射。在13天的时间内每两天测量并记录动物体重和肿瘤体积的变化。第7天再次处理小鼠。没有显着的体重减轻(图13a)，并且在所有组中的H&E染色(图14)中都没有显示出明显的组织异常，证明了制备的纳米探针对小鼠毒性很小。如所预期的，b组和c组肿瘤增加6.2-6.3倍，生长速率与组a相似(图13b)。归因于原位协同PDT效率，制备的纳米探针将显着抑制肿瘤生长而不复发，这将导致第13天肿瘤体积减少66％。用组织学结果进一步验证制备的纳米探针的PDT功效。相比之下，由于PDT，第4组中的肿瘤切片显示出明显的空白区域以及核收缩和碎裂(图13c)。此外，用TUNEL染色和Caspase-3染色进一步研究由制备的纳米探针诱导的细胞死亡机制。如图13d所示，组a-c的肿瘤切片中的大多数癌细胞保持其球形完整的细胞核，表明肿瘤正常生长并且不受纳米探针或单独NIR的影响，而增加量的癌细胞显示TUNEL阳性是由DNA断裂引起的细胞核。用caspase-3染色进一步分析肿瘤切片。由TUNEL染色组成，第4组肿瘤部分的癌细胞也显示出caspase染色阳性，提示产生的ROSs可诱导caspase模式的细胞凋亡，包括线粒体向胞质溶胶释放细胞色素C、caspase激活和其他细胞因子导致细胞凋亡(图13e)。
结论：
本公开提供了一种基于多色UCNPs的纳米探针，由于ICG的敏化作用，制备了具有高掺杂率活化剂的多色UCNPs，并用于负载三重PS分子。控制的薄层缩短了能量传递距离，保证了有效的LRET激活PS分子。线粒体靶向配体TPP的修饰使制备的纳米探针在原位产生ROSs的线粒体中积累。由于所设计的纳米探针能引起细胞内ROSs增多，诱导细胞凋亡，对深层恶性肿瘤有明显的抑制作用。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多色上转换纳米探针，其特征是，由内而外依次包括上转换纳米粒子、二氧化硅层，所述上转换纳米粒子包括NaYF4内核和NaYF4外壳构成，NaYF4内核和NaYF4外壳之间设有NaYF4中间发光层，NaYF4中间发光层掺杂Y3+、Yb3+、Tm3+和Ho3+，上转换纳米粒子和二氧化硅层之间和/或二氧化硅层内掺杂多重光敏剂，二氧化硅层的厚度小于15nm，二氧化硅层的外表面修饰有线粒体靶向配体，所述多重光敏剂至少三种光敏剂，三种光敏剂中的一种为吲哚菁绿。
2.如权利要求1所述的多色上转换纳米探针，其特征是，二氧化硅层的厚度为小于10nm；优选的，二氧化硅层的厚度为6.2～8.3nm。
3.如权利要求1所述的多色上转换纳米探针，其特征是，NaYF4中间发光层中Y元素、Yb元素、Tm元素、Ho元素的摩尔比为54.5:40:0.5:5。
4.如权利要求1所述的多色上转换纳米探针，其特征是，多重光敏剂包含竹红菌甲素、亚甲基蓝和吲哚菁绿。
5.如权利要求1所述的多色上转换纳米探针，其特征是，所述线粒体靶向配体为3-羧丙基三苯基溴化鏻。
6.一种权利要求1～5任一所述的多色上转换纳米探针的制备方法，其特征是，油酸钇与氟化钠反应生成NaYF4内核，将NaYF4内核与油酸稀土盐混合加热至不低于330℃进行反应，再加入油酸钇，继续反应形成三明治式上转换纳米粒子，利用反胶束在含有多重光敏剂和上转换纳米粒子的分散液中制备二氧化硅，使二氧化硅包覆在上转换纳米粒子表面形成二氧化硅层，同时使多重光敏剂被包覆进入上转换纳米粒子和二氧化硅层之间和/或多重光敏剂被掺杂至二氧化硅层内，在二氧化硅层的外表面修饰聚乙二醇，修饰后的聚乙二醇具有游离的氨基，氨基与线粒体靶向配体的羧基进行酰胺化反应，所述聚乙二醇的一端连接氨基；所述油酸稀土盐为钇盐、镱盐、铥盐、钬盐的混合物。
7.如权利要求6所述的多色上转换纳米探针的制备方法，其特征是，NaYF4内核的制备过程为：将油酸钇与NaF分散在油酸与1-十八烯的混合溶液中，惰性气氛下，加热至不低于330℃进行反应；
优选的，先加热至不低于100℃反应后，再加热至低于330℃进行反应；
优选的，油酸与1-十八烯的体积比为1:0.9～1.1。
8.如权利要求6所述的多色上转换纳米探针的制备方法，其特征是，将Igepal CO-520加入至环己烷中混合均匀获得反胶束；
或，向含有多重光敏剂和上转换纳米粒子的分散液中添加氨水条件pH至碱性，然后添加原硅酸四乙酯，进行水解缩合反应。
9.如权利要求6所述的多色上转换纳米探针的制备方法，其特征是，所述聚乙二醇的另一端进行硅烷化修饰；
优选的，聚乙二醇通过硅烷基团通过化学键与二氧化硅层连接；
或，酰胺化反应的催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
10.一种权利要求1～5任一所述的多色上转换纳米探针在制备光动力疗法药物制剂中的应用。
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