CN104162173B - 一种荧光‑mri双模态影像探针的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种荧光‑MRI双模态影像探针的制备方法及其应用，具体涉及一种荧光纳米粒子与顺磁性造影剂相结合的双模态影像探针及其制备方法，属于功能材料领域。本发明方法的主要过程是：以氨基化合物为表面钝化剂，钆基络合物为碳源材料，通过一步成型法，经透析和冷冻干燥除去残余物和水分，获得荧光‑MRI双模态钆掺杂型碳量子点。本方法具有工艺简单、成本低廉、易于大规模生产的特点。本方法制备的钆掺杂型碳量子点具有较强荧光性能、较高强弛豫效率以及良好的生物相容性等优异特性，且成功应用于体外活细胞荧光成像与体内核磁共振成像。本发明合成的钆掺杂型碳量子点在生物医学领域将具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光-MRI双模态影像探针的制备方法及其应用，具体涉及一步法制备的荧光-MRI双模态钆掺杂碳量子点及其在生物医学成像中应用，属于纳米材料与医学工程领域。
背景技术
磁共振成像( Magnetic resonance imaging，MRI) 是一种无损伤和无电离辐射的非侵入式影像学检查方法，是目前疾病诊疗和指导外科手术最为成熟，也是最为有效的方法之一。但由于灵敏度较低，在临床MRI诊断过程中往往需要MRI增强剂（造影剂）来提高病灶组织生理和解剖组织的成像效果。这些造影剂通常利用顺磁性物质影响体内局部组织中水分子的弛豫时间，改变信号强度，与周围组织形成对比而产生造影作用。目前，临床使用MRI造影剂主要是小分子量的钆螯合造影剂，如Gd-DTPA，Gd-TOPA等。但由于体内滞留时间短，肝肾毒副作用等严重影响其临床应用。因此，开发新型的具有高效性和生物亲和性的核磁共振造影剂是目前MRI分子影像探针的研究热点。一系列以纳米颗粒、脂质体、胶素等位载体的分子影像探针被广泛报道。
量子点(quantum dots，QDs)亦称半导体纳米晶体，指直径在1-10 nm、由少量原子构成的半导体纳米荧光颗粒。因此其内部电子在各方向上的运动都受到局限，能量在三个方向上都是量子化的，量子局限效应（quantum confinement）特别显著。由于量子点的吸收光谱宽而连续，而发射光谱则窄而对称，所以可以通过调节量子点的组成和大小达到光学性质可调性。这种独特的光学性能和易于表面功能化修饰，使得量子点被广泛应用于生物成像、细胞标记和DNA检测等生物医学领域。碳量子点（carbon dots，CDs）作为纳米荧光材料家族中的新秀，不仅具备类似于半导体量子点优异的光学性质，而且具有合成方便、原料丰富、良好的生物相容性等特点，具备符合在生物标记和生物医学成像中所需要的优良特性。因此，本发明以碳量子点为纳米载体荷载顺磁性钆，不仅降低传统造影剂因钆泄露导致的毒副作用，延长体内滞留时间，而且可以通过增加钆基荷载量和流体力学半径提高其弛豫效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有光学与磁学双重功能的荧光-MRI双模态影像探针，本发明提供的荧光-MRI双模态影像探针即是钆掺杂型碳量子点，具有优异的光学特性，可用于体外细胞水平的荧光分析与检测；同时还具有较强的顺磁性质，可用于体内的核磁造影成像。
本发明的另一目的是提供一种荧光-MRI双模态影像探针的制备方法，该方法制备工艺简单，所制备的探针生物相容性良好、具有较高荧光性能和弛豫效率双模态。本发明采用一步成型法，通过微波处理，碳量子点的成型、钆掺杂与表面钝化可同时完成。
本发明所述的一步法制备的荧光-MRI双模态影像探针通过以下技术方案予以实现：
（1） 一定质量的氨基化合物和钆基络合物溶解在双蒸水中，室温条件下磁力搅拌，使其充分分散溶解，获得均匀的透明溶液。
（2） 将上述透明溶液放入微波炉中高温加热处理，冷却后经离心去除大颗粒沉淀。
（3） 收集上清液装入透析袋（MWCO：2000）内进行透析。
（4） 将透析产物进行冷冻干燥至粉末状，即获得钆掺杂碳量子点（Gd-dopedCDs）。
其中步骤（1）中所述的氨基化合物和钆基络合物的投料质量比为1：1～10；所述的氨基化合物为甘氨酸；所述的钆基络合物为钆喷酸。
其中步骤（2）中所述的高温加热处理时间为1-15 min；所述的离心为12000g离心30分钟。
其中步骤（3）中所述的透析时间为72 h，每间隔12 h 换一次水。
其中步骤（4）中所述的冷冻干燥的温度为-50℃。
本发明的优点在于：
（1） 选用成本低廉、生物毒性小和环境友好型的甘氨酸和钆喷酸葡胺为前驱物。
（2） 反应设备简单，操作简便，绿色环保，产物不需要进一步纯化，适合大规模工业生产。
（3） 本发明制备的钆掺杂型碳量子点具有荧光和顺磁双重功能。钆掺杂型碳量子点不仅具有优异的光学特性，可用于体外细胞及亚细胞水平的荧光成像与标记检测，而且具有较强的顺磁性质，可用于体内精准病灶组织的核磁共振成像。
（4） 本发明制备的钆掺杂型碳量子点具有良好的生物相容性和较长的半衰期。作为非离子型造影剂，钆掺杂型碳量子点纳米颗粒的高度稳定性保护了掺杂顺磁物质钆，使之免受体内代谢物质的进攻和防止了泄漏，从而显著提高其安全性。另一方面，碳量子点纳米颗粒在体内循环滞留时间较长，可提高核磁共振信号的半衰期。
（5）本发明制备的钆掺杂型碳量子点具有较高的弛豫效率。相对于钆基络合物，碳量子点纳米颗粒可荷载更多的顺磁物质钆，且具有较大的流体力学半径，可显著缩短周围水分子的纵向弛豫时间T1，提高弛豫效率。
附图说明
图1. Gd-doped CDs物理形貌特征的表征。Gd-doped CDs在低倍镜（A）和高倍镜（B）下的扫描电镜图。
图2. Gd-doped CDs光学性质的表征。A. Gd-doped CDs的紫外吸收光谱。右上插图为Gd -doped CDs水溶液在365nm紫外灯照射下的荧光图片；B. Gd-doped CDs的荧光光谱图（从340nm到400nm）。
图3. Gd-doped CDs的A 光电子能谱(XPS) 和B傅里叶红外光（FTIR）谱图。
图4. Gd-doped CDs的弛豫效率。Gd-doped CDs（上排）和Gd-DTPA（下排）水溶液核磁成像图。
图5. Gd-doped CDs造影剂的小鼠核磁共振成像图（尾静脉注射）。
具体实施方式
本发明是采用甘氨酸和钆喷酸葡胺为前驱物，通过微波辅助水热合成方法，实现快速大量地制备钆掺杂型碳量子点。
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术路线。
实施例 1：
将1 g甘氨酸和1 g钆喷酸葡胺溶解在20 mL双蒸水中，室温条件下磁力搅拌，使其充分溶解获得均匀透明的溶液。将上述溶液加入到家用微波炉（功率；700W）高温加热1分钟，待溶液自然冷却后，用中速滤纸过滤去除不溶性黑色沉淀，12000 g离心30分钟除去大颗粒，收集上清液注入到分子截留量为2000 Da的透析袋内进行透析，透析时间为72 h，每间隔12 h 换一次水。将透析产物进行旋转蒸发，得到浓缩溶液。将浓缩溶液在-50℃条件下进行冷冻干燥至粉末状，获得钆掺杂型碳量子点。
实施例 2：
将1 g甘氨酸和2 g钆喷酸葡胺溶解在20 mL双蒸水中，室温条件下磁力搅拌，使其充分溶解获得均匀透明的溶液。将上述溶液加入到家用微波炉（功率；700W）高温加热4分钟，待溶液自然冷却后，用中速滤纸过滤去除不溶性黑色沉淀，12000 g离心30分钟除去大颗粒，收集上清液注入到分子截留量为2000 Da的透析袋内进行透析，透析时间为72 h，每间隔12 h 换一次水。将透析产物进行旋转蒸发，得到浓缩溶液。将浓缩溶液在-50℃条件下进行冷冻干燥至粉末状，获得钆掺杂型碳量子点（产率是0.82%）。
实施例 3：
将1 g甘氨酸和3 g钆喷酸葡胺溶解在20 mL双蒸水中，室温条件下磁力搅拌，使其充分溶解获得均匀透明的溶液。将上述溶液加入到家用微波炉（功率；700W）高温加热6分钟，待溶液自然冷却后，用中速滤纸过滤去除不溶性黑色沉淀，12000 g离心30分钟除去大颗粒，收集上清液注入到分子截留量为2000 Da的透析袋内进行透析，透析时间为72 h，每间隔12 h 换一次水。将透析产物进行旋转蒸发，得到浓缩溶液。将浓缩溶液在-50℃条件下进行冷冻干燥至粉末状，获得钆掺杂型碳量子点（产率是1.08%）。
实施例 4：
将0.1 g甘氨酸和0.5 g钆喷酸葡胺溶解在20 mL双蒸水中，室温条件下磁力搅拌，使其充分溶解获得均匀透明的溶液。将上述溶液加入到家用微波炉（功率；700W）高温加热8分钟，待溶液自然冷却后，用中速滤纸过滤去除不溶性黑色沉淀，12000 g离心30分钟除去大颗粒，收集上清液注入到分子截留量为2000 Da的透析袋内进行透析，透析时间为72 h，每间隔12 h 换一次水。将透析产物进行旋转蒸发，得到浓缩溶液。将浓缩溶液在-50℃条件下进行冷冻干燥至粉末状，获得钆掺杂型碳量子点（此投料比产率最佳，为1.38%）,。
实施例 5：
将0.1 g甘氨酸和1 g钆喷酸葡胺溶解在20 mL双蒸水中，室温条件下磁力搅拌，使其充分溶解获得均匀透明的溶液。将上述溶液加入到家用微波炉（功率；700W）高温加热15分钟，待溶液自然冷却后，用中速滤纸过滤去除不溶性黑色沉淀，12000 g离心30分钟除去大颗粒，收集上清液注入到分子截留量为2000 Da的透析袋内进行透析，透析时间为72 h，每间隔12 h 换一次水。将透析产物进行旋转蒸发，得到浓缩溶液。将浓缩溶液在-50℃条件下进行冷冻干燥至粉末状，获得钆掺杂型碳量子点。
所制备的钆掺杂型碳量子点通过以下表征予以验证：
（1）Gd-doped CDs的制备与形貌表征。
采用甘氨酸和钆喷酸葡胺为前驱物，通过微波反应成功制备Gd-doped CDs。利用TEM表征Gd-doped CDs的物理形貌(如图1)，表明制备的Gd-doped CDs颗粒具有较好分散性，均一的粒径分布，通过高分辨率透射电镜进一步表征，粒径大小约为22 nm。
（2）Gd-doped CDs的光学性能的表征。
利用荧光分光光度计和紫外吸收光度计表征Gd-doped CDs的光学特征 (如图2)。图2A表明，Gd-doped CDs水溶液在可见光-紫外区域没有有明显的吸收峰；图2A右上插图表明，Gd-doped CDs水溶液在自然光下呈浅黑色，在紫外灯照射下（365nm）发出蓝色荧光。图2B显示Gd-doped CDs表现出明显的激发光依赖的发射光谱。荧光发射光谱的半峰宽度为90nm，且发射光谱窄而对称。这部分结果说明Gd-doped CDs具有较好的水分散性和荧光特性。
（3）Gd-doped CDs的化学结构的表征。
利用XPS和FITR表征Gd-doped CDs的化学结构。如图3A所示，Gd-doped CDs主要由有碳，氮，氧和钆四种元素组成，表明钆元素已成功掺杂入碳量子点颗粒。图2B显示掺杂的钆元素在141.4和147.2eV有2个吸收峰，表明钆元素以2种成键方式存在碳量子点颗粒中。
如图3B所示，在Gd-doped CDs的红外光谱图上，3353 cm-1处有很强的伸缩振动峰表明Gd-doped CDs富含-COOH基团。1608 cm-1出现尖锐的振动峰表明存在大量C=O键。1413cm-1为C-N键的振动吸收峰，初步说明有氮元素掺杂到碳量子点颗粒当中。
（4）Gd-doped CDs的磁学性能的表征。
利用核磁共振成像仪表征Gd-doped CDs的弛豫效率。以临床常用核磁造影剂Gd-DTPA为对照组，分别检测不同浓度下自旋-晶格弛豫时间T1和自旋-自旋弛豫T2。如图4所示，Gd-doped CDs对照组T1信号强度与浓度之间存在明显正相关，而T2信号随浓度变化不明显。这与目前临床常用造影剂Gd-DTPA类似（见图4下排）。这部分结果初步表明，Gd-dopedCDs具有较好的弛豫效率，适合于作为高灵敏度的造影剂应用于MRI体内造影。
（5）Gd-doped CDs作为MRI造影剂的体内成像
利用小动物核磁共振成像仪表征Gd-doped CDs体内成像效果。注射Gd-doped CDs后，可以显著提高目标组织的成像清晰度。如图5所示，经尾静脉注射10 min之后，Gd-dopedCDs可到达并聚集在肾脏组织，进而显著增强肾脏的造影效果，可持续5 h以上。
Claims (5)
1.一种荧光-MRI双模态影像探针的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
（1） 一定质量的氨基化合物和钆基络合物溶解在双蒸水中，室温条件下磁力搅拌，使其充分分散溶解，获得均匀的透明溶液；
（2） 将上述透明溶液放入微波炉中高温加热处理，冷却后经离心去除大颗粒沉淀；
（3） 收集上清液装入MWCO为2000得透析袋内进行透析；
（4） 将透析产物进行冷冻干燥至粉末状，即获得钆掺杂碳量子点，记为Gd-doped CDs；
步骤（1）中所述的氨基化合物和钆基络合物的投料质量比为1：1～10；所述的氨基化合物为甘氨酸；所述的钆基络合物为钆喷酸；
步骤（2）中所述的高温加热处理时间为1-15 min。
2.根据权利要求1所述的一种荧光-MRI双模态影像探针的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的离心条件为12000g离心30分钟。
3. 根据权利要求1所述的一种荧光-MRI双模态影像探针的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的透析时间为72 h，每间隔12 h 换一次水。
4.根据权利要求1所述的一种荧光-MRI双模态影像探针的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的冷冻干燥的温度为-50℃。
5.根据权利要求1所述方法制备的探针应用于非诊断目的的细胞荧光成像、流式细胞术分析以及核磁共振成像的信息的获取。
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