CN103773369B - 钆(ш)-碳量子点和其制备方法以及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种钆(Ш)-碳量子点和制备方法以及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用，属于医学影像材料制备技术领域，包括以下步骤：1）将前驱体进行热处理，生产热解产物；2）将热解产物加入碱性溶液中进行超声分散处理，得到悬浊液；3）将悬浊液经水性微孔滤膜抽滤得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液；4）将含有钆(Ш)-碳量子点的滤液透析并干燥得到钆(Ш)-碳量子点。本发明简单易行，对设备要求低，反应条件易控制，无需有机试剂参与，制得的钆(Ш)-碳量子点能够均匀稳定地分散于水中，具有优良的磁共振响应和光致发光性能，适用于磁共振-荧光双模态成像探针。

Description

钆(Ш)-碳量子点和其制备方法以及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用

技术领域

本发明属于医学影像材料制备技术领域，具体涉及一种钆(Ш)-碳量子点和其制备方法及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用。

背景技术

磁共振-荧光双模态分子影像技术克服了单一分子影像技术的局限性，使不同分子影像技术的优势得到互补，大大拓宽了分子影像技术的研究范围与应用前景。临床中得到广泛应用的磁共振成像（MRI）技术能提供高分辨率的组织信息和三维结构成像，并且无需使用放射性物质作为对比剂，但其灵敏度较低，难以准确预测早期病变和微小病变。荧光成像技术具有相当高的灵敏度，但其穿透力有限。

磁共振-荧光双模态分子影像技术用探针的开发已经成为医学和材料领域的研究热点，其中钆(Ш)螯合物和半导体量子点结合而构筑的双模态探针最有研究价值。近年来，纳米技术的发展推动了稀土、荧光蛋白和半导体量子点等与超顺磁性铁剂或顺磁性钆(Ш)螯合物类MRI造影剂的结合（Chem.Soc.Rev.，2008，38(2)：372-90）。其中，钆(Ш)螯合物可以降低组织内水分子中质子的弛豫时间，表现出增强的信号，已广泛用于临床；半导体量子点光褪色过程长，发射波长根据尺寸可调，较荧光蛋白和稀土材料有着显著优势。但是半导体量子点含有镉或其它重金属具有毒性，将会限制钆(Ш)螯合物与半导体量子点结合的双模态探针的推广和应用。Heesum Yang等人通过两步反应制备了钆(Ш)功能化的SiO₂包覆的CdS：Mn/ZnS纳米探针[Biomaterials，2011，32(4)：1185-92]。通过SiO₂包覆可以降低半导体量子点的毒性，但使量子点的尺寸增加了4～7nm，且制备方法比较复杂。

具有优异生物相容性的荧光碳量子点可以替代半导体量子点和钆(Ш)螯合物组建双模态探针。碳量子点制备方法简单，主要包括激光消融法、电化学法、水热法、高温热解/煅烧有机物法和超声法。高温热解/煅烧有机物法是目前制备碳量子点最简单快速的方法，该法制得的荧光碳量子点的量子产率较高。碳量子点具有优异的生物相容性，在生化传感、成像分析和光热治疗等领域的研究工作已在国外大量开展（Analyst，2013，138:6551-57；J.Mat.Chem.B.，2013，1：4972-82）。但碳量子点用于组建双模态探针的研究才刚刚起步。仅Athanasios B.Bourlinos等选用三羟甲基氨基甲烷为碳源，二乙三胺五醋酸钆为钆源，盐酸甜菜碱为表面亲水改性剂，经过高温热解制得用于磁共振-荧光双模态成像探针的钆(Ш)掺杂的碳量子点（J.Mat.Chem.，2012，22(44)：23327-30）。这种技术选用的前驱体为独立的碳源和钆源，且制备过程复杂，且前驱体需经过在水溶液中的反应和复杂的有机试剂参与的后处理过程后才能进行热解。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种钆(Ш)-碳量子点和其制备方法及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用，该方法简单易行，对设备要求低，反应条件易控制，且无需有机试剂参与，环境友好，经该方法制得的钆(Ш)-碳量子点，能够均匀、稳定地分散于水中，并具有优良的磁共振响应和光致发光性能，适用于磁共振-荧光双模态成像探针。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

1）将前驱体置于高温电阻炉中，以1～30℃/min的升温速率由室温升至200～450℃之间的某个温度，然后在此温度下保温0～5h，最后降至室温，得到热解产物；

所述的前驱体为钆(Ш)螯合物或者为1份的氧化钆、氯化钆、硝酸钆或葡甲胺与1～5份钆(Ш)螯合物组成的混合物；

2）将2份热解产物加入20～50份质量浓度为0.01～0.1mol/L的碱性溶液中，超声分散处理，得到悬浊液；

3）将悬浊液经0.22～1μm的水性微孔滤膜抽滤，取滤液，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液；

4）将含有钆(Ш)-碳量子点的滤液透析，得到分散液，然后将分散液干燥至恒重，得到钆(Ш)-碳量子点。

步骤1）所述的钆(Ш)螯合物为二乙三胺五醋酸钆、乙二胺四乙酸钆、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸钆、钆喷酸单葡胺、钆喷酸葡胺、钆特酸单葡胺或钆特酸葡胺中的一种或几种。

步骤1）所述的热处理是在氦气、氮气、氩气或空气气氛中的一种或几种气氛中进行。

步骤2）所述的碱性溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。

步骤2）所述的超声分散处理是在功率为300～600W的条件下，分散处理20～60min。

在步骤3）所述的抽滤过程中持续用质量浓度为0.01～0.1mol/L的碱性溶液洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色；所述的碱性溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。

步骤4）所述的透析是将滤液装入截留分子量为500～3000D的再生纤维素透析袋中，经去离子水或pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析36～72h。

步骤4）所述的干燥为真空干燥或冷冻干燥。

钆(Ш)-碳量子点的直径分布在1.5～5nm，纵向弛豫率达5.6mM·L^-1·S^-1，量子产率达12.4%。

钆(Ш)-碳量子点在制备磁共振-荧光双模态成像探针中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明主要以兼作钆源和碳源的有机化合物为前驱体，采用一步热解形成牢固络合了钆(Ш)的碳量子点，即钆(Ш)-碳量子点。本发明具有以下优点：

1、与传统半导体量子点相比，碳量子点具有无毒、制备方法简单的优势，本发明由钆(Ш)和碳量子点结合制得的钆(Ш)-碳量子点，显示增强的磁共振信号，并表现出优异的光致发光性能，具有良好的生物相容性。

2、本发明方法以可兼作钆源和碳源的有机化合物为前驱体，经过一步热解得到钆(Ш)-碳量子点，保证了钆(Ш)和碳量子点的紧密结合。纯净的钆(Ш)-碳量子点中钆(Ш)被碳量子点牢固螯合，以螯合物形式存在的钆(Ш)基本保证了钆(Ш)-碳量子点在体内应用的安全性。

3、本发明方法通过调节热解温度和热解时间可以实现钆(Ш)-碳量子点的分子结构和性能的可控制备，该方法制备的钆(Ш)-碳量子点表面含有亲水的羟基和羧酸盐基团，可均匀、稳定地分散于去离子水、缓冲溶液或培养液中。

4、本发明方法简单易行，对设备要求低，前驱体发生热解之前无需复杂的处理过程，钆(Ш)-碳量子点的制备过程中条件容易控制、无需有机试剂的参与。

5、经本发明制得的钆(Ш)-碳量子点直径约为3nm，具有优异的磁共振响应（纵向弛豫率达5.6mM·L^-1·S^-1）和光致发光性能（量子产率达12.4%）；通过Hela细胞培养实验，证明该钆(Ш)-碳量子点具有良好的生物相容性，因此能够用于制备磁共振-荧光双模态成像探针。

附图说明

图1为本发明制得的钆(Ш)-碳量子点的TEM照片

图2为本发明制得的钆(Ш)-碳量子点的尺寸分布柱状图；

图3为Hela细胞在不同浓度的钆(Ш)-碳量子点溶液中的活力柱状图(CCK-8法)；

图4为Hela细胞在钆(Ш)-碳量子点溶液中培养后的细胞形态照片，其中，a为在浓度为200μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中培养24h后的形态照片；b为空白对照组中的细胞形态（即不含钆(Ш)-碳量子点）。

具体实施方式

下面结合具体的附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

1）以二乙三胺五醋酸钆为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通入氮气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以1℃/min的升温速率由室温升高至200℃，在200℃下保温5h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入20份浓度为0.01M的氢氧化钠水溶液中，然后置于超声波清洗器中（功率为300W）分散处理20min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.22μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.01M的氢氧化钠水溶液持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为500D的再生纤维素透析袋中，经去离子水透析36h，得到的分散液经旋转蒸发仪浓缩后置于真空烘箱中在50℃下干燥24h，制备出纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例2

1）以二乙三胺五醋酸钆为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通入氦气和氮气的混合气体的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以5℃/min的升温速率由室温升高至400℃，400℃下保温3h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入30份浓度为0.05M的氢氧化钠水溶液中，然后置于超声波清洗器中（功率为400W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.45μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.05M的氢氧化钠水溶液持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1500D的再生纤维素透析袋中，经pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析48h，得到的分散液经过旋转蒸发仪浓缩后置于真空烘箱中在50℃下干燥24h，制备出纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例3

1）以1份二乙三胺五醋酸钆、1份乙二胺四乙酸钆和1份1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸钆混合物为前驱体，将其置于预先设定升温程序的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以30℃/min的升温速率由室温升高至450℃，450℃下保温3h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入30份浓度为0.05M的氢氧化钾水溶液中，然后置于超声波清洗器中（功率为600W）分散处理60min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.65μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.05M的氢氧化钾水溶液持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为3000D的再生纤维素透析袋中，经pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析48h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样品真空干燥6h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例4

1）以钆喷酸单葡胺为前驱体，将其置于预先设定升温程序的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以1℃/min的升温速率由室温升高至450℃，然后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氨水中，然后置于超声波清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.8μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氨水持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1000D的再生纤维素透析袋中，经pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析72h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样品真空干燥10h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例5

1）以1份钆喷酸葡胺和1份氧化钆组成的混合物为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通入氩气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以1℃/min的升温速率由室温升高至450℃，然后保温0.5h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氨水中，然后置于超声波清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为1μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氨水持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1000D的再生纤维素透析袋中，经pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析72h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样品真空干燥10h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例6

1）以5份钆喷酸单葡胺和1份葡甲胺组成的混合物为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通入氮气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以20℃/min的升温速率由室温升高至350℃，350℃下保温3h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氢氧化钠水溶液中，然后置于超声波清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.45μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氢氧化钠水溶液持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1000D的再生纤维素透析袋中，经去离子水透析72h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样品真空干燥8h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例7

1）以3份钆特酸单葡胺和1份氯化钆组成的混合物为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通入氮气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以25℃/min的升温速率由室温升高至300℃，300℃下保温2.5h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氨水中，然后置于超声波清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.55μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氨水持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为3000D的再生纤维素透析袋中，经去离子水透析48h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样品真空干燥8h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例8

1）以4份钆特酸葡胺和1份硝酸钆组成的混合物为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通入氩气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以15℃/min的升温速率由室温升高至200℃，200℃下保温1h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入30份浓度为0.1M的氢氧化钾水溶液中，然后置于超声波清洗器中（功率为300W）分散处理60min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.22μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氢氧化钾水溶液持续洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1500D的再生纤维素透析袋中，经去离子水透析36h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样品真空干燥8h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

对制得的钆(Ш)-碳量子点性能进行试验测定，结果如下：

（1）尺寸

对制得的钆(Ш)-碳量子点通过JEOL的JEM-2100高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）测试，参见图1，测得钆(Ш)-碳量子点直径分布在1.5～5nm之间，平均粒径约为3nm，参见图2。

（2）磁共振响应

采用GE公司的医用3.0T MR仪扫描测试钆(Ш)-碳量子点的纵向弛豫时间T₁（反转恢复序列TI=100、TI=300、TI=600,TR/TE4000ms/9.2ms)，按公式（1）计算纵向弛豫率r₁，本方法制备的钆(Ш)-碳量子点的r₁值可达5.6mM·L^-1·S^-1，比含等浓度Gd(Ⅲ)离子的临床用马根维显（r₁=4.8mM·L^-1·S^-1）的高。

(1/T₁)_obsd=(1/T₁)_dia+r₁×[M](1)

式中：(1/T₁)_obsd为水质子的弛豫率，(1/T₁)_dia为含Gd(Ⅲ)的造影剂的弛豫率，[M]是样品中Gd(Ⅲ)的摩尔浓度。

（3）光致发光性能

采用FLsp920型荧光光谱仪扫描钆(Ш)-碳量子点在365nm波长下激发的发射光谱。以硫酸奎宁的0.1M H₂SO₄溶液为参比物（365nm波长下激发时，Q=0.55），通过公式（2）计算本方法制备的钆(Ш)-碳量子点的量子产率可达12.4%。

$Q=Q_R\frac{I}{I_R}\frac{A_R}{A}\frac{{\mathrm{\η}}^2}{{\mathrm{\η}}_R^2}---\left(2\right)$

式中：Q为量子产率，I为光致发光强度，A为激发波长下经UV-vis测得的碳量子点的吸光度，η为溶剂的反射系数，脚标R代表参比物。

（4）生物相容性

采用CCK-8方法研究了Hela细胞在不同浓度的钆(Ш)-碳量子点溶液中的活力：以Hela细胞在不含钆(Ш)-碳量子点的培养液中的活力作为空白对照组。Hela细胞在浓度低于80μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中的活力与空白对照组相当，甚至在浓度高达200μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中也有约83%的活力，如图3所示。钆(Ш)-碳量子点对人体Hela细胞未表现出明显的毒性。Hela细胞在浓度为200μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中培养24h后没有发生形态变化，如图4（a和b）所示。

综上所述，本发明主要以兼作钆源和碳源的有机化合物为前驱体，采用一步热解形成牢固络合了钆(Ш)的碳量子点，记为钆(Ш)-碳量子点。其直径约3nm，能够均匀、稳定地分散于水中，并具有优异的磁共振响应（纵向弛豫率可达5.6mM·L^-1·S^-1）和光致发光性能（量子产率可达12.4%）。通过Hela细胞培养实验，证明其具有良好的生物相容性，有望用作磁共振-荧光双模态成像探针。

Claims (8)

1.一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将前驱体置于高温电阻炉中，以1～30℃/min的升温速率由室温升至200～450℃之间的某个温度，然后在该温度下保温0～5h，最后降至室温，得到热解产物；高温电阻炉中连续通入氦气、氮气、氩气或空气气氛中的一种或几种；

所述的前驱体为钆(Ш)螯合物或者为1份的氧化钆、氯化钆、硝酸钆或葡甲胺与1～5份钆(Ш)螯合物组成的混合物；

所述的钆(Ш)螯合物为二乙三胺五醋酸钆、乙二胺四乙酸钆、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸钆、钆喷酸单葡胺、钆喷酸葡胺、钆特酸单葡胺或钆特酸葡胺中的一种或几种；

2)将2份热解产物加入20～50份质量浓度为0.01～0.1mol/L的碱性溶液中，超声分散处理，得到悬浊液；

3)将悬浊液经0.22～1μm的水性微孔滤膜抽滤，取滤液，得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液；

4)将含有钆(Ш)-碳量子点的滤液透析，然后干燥至恒重，得到钆(Ш)-碳量子点。

2.根据权利要求1所述的一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的碱性溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。

3.根据权利要求1所述的一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的超声分散处理是在功率为300～600W的条件下，分散处理20～60min。

4.根据权利要求1所述的一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，其特征在于，在步骤3)所述的抽滤过程中持续用质量浓度为0.01～0.1mol/L的碱性溶液洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色；所述的碱性溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。

5.根据权利要求1所述的一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤4)所述的透析是将滤液装入截留分子量为500～3000D的再生纤维素透析袋中，经去离子水或pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析36～72h。

6.根据权利要求1所述的一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，其特征在于，步骤4)所述的干燥为真空干燥或冷冻干燥。

7.一种采用权利要求1～6中任意一项所述的方法制得的钆(Ш)-碳量子点，其特征在于，该钆(Ш)-碳量子点的直径分布在1.5～5nm，纵向弛豫率达5.6mM·L^-1·S^-1，量子产率达12.4％。

8.一种如权利要求7所述的钆(Ш)-碳量子点在制备磁共振-荧光双模态成像探针中的应用。