CN102741279A - B7-h4融合蛋白和其使用方法 - Google Patents

B7-h4融合蛋白和其使用方法 Download PDF

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约瑟夫·R·波多基尔
斯特芬·D·米勒
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Abstract

本发明揭示含有B7-H4多肽的融合蛋白。所述B7-H4融合蛋白可包括全长B7-H4多肽，或者可含有全长B7-H4多肽的片段，包括所述B7-H4多肽的一部分或全部细胞外结构域。本发明还揭示使用所述融合蛋白下调T细胞活化以及治疗发炎性和自体免疫疾病和病症的方法。所述B7-H4融合蛋白适用于通过以下途径治疗炎症：抑制或减少ThI、ThI 7、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，所述发炎性分子包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP；或增进Treg对IL-IO的分泌；增加Treg的分化；增加Treg的数量；或其组合。

Description

B7-H4融合蛋白和其使用方法
技术领域
本发明涉及B7-H4融合蛋白和使用B7-H4融合蛋白调节受试者的免疫应答的方法。
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2009年8月31日申请的美国临时专利申请案第61/238,605号、2009年12月4日申请的美国临时专利申请案第61/266,854号、2009年10月26日申请的美国临时专利申请案第61/254,930号、2009年12月15日申请的美国临时专利申请案第61/286,537号以及2010年8月30日申请的美国临时专利申请案第61/378,361号的优先权。
背景技术
抗原特异性T细胞应答是由两种信号介导：第一，TCR与在MHC情形下提呈的抗原肽接合(信号1)；和第二，由不同受体/配体对之间接触所传递的第二抗原独立信号(信号2)。此“第二信号”对于确定T细胞应答的类型(活化与容忍)以及所述应答的强度和持续时间至关重要，并且受来自共刺激分子(例如B7蛋白质家族)的正信号和负信号调控。最详尽表征的T细胞共刺激路径是B7-CD28，其中B7-1(CD80)和B7-2(CD86)各自可接合刺激性CD28受体和抑制性CTLA-4(CD152)受体。结合经由T细胞受体进行的信号传导，CD28连接将增加T细胞的抗原特异性增殖；增进细胞因子产生；刺激分化和效应功能；并促进T细胞存活(兰萧(Lenshow)等人，免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)，14：233-258(1996)；查姆博(Chambers)和埃里森(Allison)，免疫学当代视点(Curr.Opin.Immunol.)，9：396-404(1997)；以及雷斯梅尔(Rathmell)和汤普森(Thompson)，免疫学年鉴，17：781-828(1999))。相比之下，经由CTLA-4进行的信号传导被认为传递抑制T细胞增殖、IL-2产生和细胞周期进程的负信号(克鲁梅尔(Krummel)和埃里森(Allison)，实验医学杂志(J.Exp.Med)，183：2533-2540(1996)；和沃伦斯(Walunas)等人，实验医学杂志，183：2541-2550(1996))。B7家族的其它成员包括B7-H1(董(Dong)等人，自然-医学(Nature Med)，5：1365-1369(1999)；和弗雷曼(Freeman)等人，实验医学杂志，192：1-9(2000))、B7-DC(曾(Tseng)等人，实验医学杂志，193：839-846(2001)；和拉奇曼(Latchman)等人，自然-免疫学(NatureImmunol)，2：261-268(2001))、B7-H2(王(Wang)等人，血液(Blood)，96：2808-2813(2000)；斯瓦洛(Swallow)等人，免疫学(Immunity)，11：423-432(1999)；和吉永(Yoshinaga)等人，自然(Nature)，402：827-832(1999))、B7-H3(查普沃(Chapoval)等人，自然-免疫学，2：269-274(2001))和B7-H4(崔(Choi)等人，免疫学杂志(J.Immunol)，171：4650-4654(2003)；西卡(Sica)等人，免疫学，18：849-861(2003)；普拉萨德(Prasad)等人，免疫学，18：863-873(2003)；和臧(Zang)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad Scl U.S.A.)，100：10388-10392(2003))。B7-H1和B7-DC是PD-1的配体，B7-H2是ICOS的配体，且B7-H3此时仍为孤儿配体(orphan ligand)(董(Dong)等人，免疫学研究(Immunol Res.)，28：39-48(2003))。
B7-H4是B7家族的成员，其为T细胞应答的负调控子。人类与小鼠B7-H4共有87％氨基酸一致性，表明重要的在进化上保守的功能。人类和小鼠B7-H4mRNA在淋巴(脾和胸腺)和非淋巴器官(包括肺、肝、睾丸、卵巢、胎盘、骨骼肌、胰腺和小肠)中广泛表达。关于B7-H4蛋白表达的有限研究表明，B7-H4不在新分离的人类T细胞、B细胞、DC和单核细胞上表达，但其可在体外刺激后在这些细胞类型上诱导。免疫组织化学染色显示，B7-H4在乳房、肾、肺和卵巢肿瘤中高度表达，并且逆转录酶聚合酶链反应(reverse-transcriptase polymerase chain reacti on，RT-PCR)分析表明，小鼠B 7-H4也在包括前列腺、肺和结肠癌在内的大量肿瘤细胞系中高度表达。B7-H4是由肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage，TAM)高度表达，并且存在于肿瘤血管系统中。调控性T细胞(Treg)经由IL-6和IL-10诱导TAM上的B7-H4上调；此举被认为是Treg引起免疫抑制的一种机制。(克雷泽克J.I.(Kryczek，J.I.)，免疫学杂志(J.Immunol)，177(1)：40-44(2006))。也曾在患病的肾的肾小管上皮细胞中观察到B7-H4表达(陈Y.(Chen，Y.)，国际肾脏(Kidney Int.)，70(12)：2092-9(2006)Epub 2006年10月18日)。
B7-H4的受体还未得到克隆。经显示，B7-H4不结合于已知的CD28家族成员，例如CD28、CTLA-4、ICOS和PD-1(西卡等人，免疫学，18：849-861(2003))，且因此这些CD28家族成员并非B7-H4的潜在受体。使用B7-H4转染子和B7-H4-Ig融合蛋白进行的功能研究证实，B7-H4传递抑制TCR介导的CD4+和CD8+T细胞增殖、细胞周期进程和IL-2产生的信号。B7-1共刺激不能克服B7-H4-Ig诱导的抑制作用。与体外活性一致，B7-H4基因敲除小鼠产生自体免疫性。B7-H4的广泛可诱导表达结合功能研究表明，B7-H4用于下调周围组织的免疫应答。
近期的结果证实，B7-H4也充当嗜中性粒细胞应答的负调控子。嗜中性粒细胞是固有免疫系统的关键组分，并且是宿主针对病原体的第一线防御。然而，嗜中性粒细胞也会引起慢性炎症和自体免疫疾病。B7-H4基因敲除小鼠呈现增加的Th1应答，并且因嗜中性粒细胞依赖性免疫应答增加而对单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)引起的感染更具抗性(苏W.K.(Suh.W.K.)等人，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)，26(17)：6403-11(2006)；和朱G.(Zhu，G.)等人，血液学，113(8)：1759-67(2009)Epub 2008年12月24日)。用单体B7-H4IgV结构域或细胞外结构域(ECD)水动力转染小鼠使嗜中性粒细胞对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和李斯特菌感染的应答增加，而二聚体B7-H4-Ig减少骨髓源性嗜中性粒细胞前体增殖(朱G.等人，血液学，113(8)：1759-67(2009)Epub 2008年12月24日)。
某些免疫细胞和免疫细胞信号转导路径是用于治疗免疫病症的新型试剂的理想目标。举例来说，Th1、Th17、Th22和调控性T细胞(Treg)在介导自体免疫性和炎症方面起到重要作用。来自多项研究的越来越多的证据显示了这些免疫细胞在例如类风湿性关节炎、发炎性肠病、多发性硬化、牛皮癣、红斑狼疮和葡萄膜炎等病症中的重要性。大部分现有疗法一次只靶向一种路径。因此，需要靶向自体免疫和炎症中所涉及的多种细胞和路径的疗法，所述细胞例如Th1、Th17、Th22、Treg，或者分泌或使其它细胞分泌例如细胞因子、金属蛋白酶、趋化因子以及包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21、IL-10和MMP的其它分子等发炎性分子的其它细胞。
因此，本发明一个目的是提供用于调节Th1、Th17、Th22，或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的组合物和方法。
本发明另一目的是提供用于调节至少两个使得优选由Th1、Th17或Th22细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的一种或一种以上发炎性分子的免疫路径的组合物和方法。
本发明另一目的是提供用于调节Treg细胞和路径(例如IL-10和TGF-β分泌)的组合物和方法。
本发明另一目的是提供用于调节Th1、Th17或Th22T细胞的促炎性活性，同时增加或促进Treg活性的组合物和方法。
本发明一个目的是提供含有B7-H4多肽的组合物，其用于减少或抑制T细胞的抗原特异性增殖；减少或抑制T细胞产生促炎性分子；减少或抑制Th1、Th17或Th22细胞的分化和效应功能；以及减少或抑制Th1、Th17或Th22细胞的存活率。
本发明另一目的是提供含有B7-H4多肽的组合物，其用于增加或促进Treg活性；增加由Treg产生例如IL-10等发炎性分子；增加原生T细胞分化成Treg；增加Treg的数量；或增加Treg的存活率。
本发明另一目的是提供含有B7-H4多肽的组合物，其用于抑制或降低Th1、Th17或Th22T细胞的促炎性活性，同时增加或促进Treg活性。
本发明另一目的是提供编码B7-H4组合物的分离的核酸分子。
本发明另一目的是提供含有表达编码B7-H4组合物的核酸分子的载体的细胞。
本发明另一目的是提供通过使促炎性T细胞与B7-H4组合物接触来减少或抑制促炎性T细胞活化的方法。
本发明另一目的是提供用于治疗发炎性和自体免疫疾病和病症的方法。
本发明另一目的是提供用于对有需要的哺乳动物投予B7-H4组合物、编码B7-H4组合物的核酸或用编码B7-H4组合物的核酸转染或转导的细胞的方法。
另一目的是提供用于增加Treg生物活性的组合物和方法。
另一目的是提供用于抑制或减少表位扩展的组合物和方法。
另一目的是提供用于抑制原生T细胞分化成Th1、Th17、Th22，或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的促炎性分子的其它细胞的组合物和方法。
另一目的是提供用于抑制不成熟抗原提呈细胞的分化和成熟的组合物和方法。
本发明另一目的是通过测量将从用所揭示的组合物和方法进行的治疗获益的患者体内例如发炎性趋化因子、细胞因子或其它分子等生物标记物的水平或生物标记物的基因表达来监测所述患者。
本发明另一目的是通过测量将从用所揭示的组合物和方法进行的治疗获益的患者体内例如发炎性趋化因子、细胞因子或其它分子等生物标记物的水平来鉴别所述患者。
本发明另一目的是通过鉴别将从用所揭示的组合物和方法进行的治疗获益的患者的编码例如发炎性趋化因子、细胞因子或其它分子等生物标记物的基因的多形性来鉴别所述患者。
本发明另一目的是提供用于治疗患有发炎性和自体免疫疾病和病症的患者的组合疗法。
本发明另一目的是提供用于治疗对TNF阻断剂无应答的患者的组合物。
本发明另一目的是提供用于治疗慢性和持久性炎症的组合物。
发明内容
本发明揭示含有B7-H4多肽的融合蛋白。B7-H4融合多肽具有第一融合搭配物，其包含与第二多肽直接融合或经由与第二多肽融合的连接肽序列间接融合的B7-H4蛋白的全部或一部分。B7-H4多肽可属于任何起源物种。在优选实施例中，B7-H4多肽具有鼠类、非人类灵长类动物或人类起源。在一个实施例中，B7-H4融合蛋白抑制Th1、Th17、Th22，或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的发炎性活性。B7-H4融合蛋白也可通过增加例如细胞因子IL-10等分子的产生来增加Treg的抑制能力。
B7-H4融合蛋白可包括全长B7-H4多肽或其片段。在一个实施例中，B7-H4多肽是全长B7-H4的可溶性片段。片段包括保留结合于其天然受体的能力且并入B7-H4多肽的一部分或全部细胞外结构域，并且缺乏一部分或全部细胞内和/或跨膜结构域的片段。在一个实施例中，B7-H4多肽片段包括B7-H4多肽的整个细胞外结构域。在其它实施例中，可溶性B7-H4多肽片段包括保持B7-H4生物活性的细胞外结构域的片段。B7-H4多肽细胞外结构域可包括跨膜结构域的1、2、3、4、5个或更多个连续氨基酸，和/或信号序列的1、2、3、4、5个或更多个连续氨基酸。或者，细胞外结构域的C末端、N末端或二者可去除1、2、3、4、5个或更多个连续氨基酸。也可使用B7-H4多肽的变异体和其片段。
在一个实施例中，B7-H4多肽可与Ig重链恒定区的一个或一个以上结构域融合，所述结构域优选具有对应于人类免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、CH2区和CH3区或对应于鼠类免疫球蛋白Cγ2a链的铰链区、CH2区和CH3区的氨基酸。
融合蛋白可发生二聚或多聚反应以形成均二聚体、杂二聚体、均多聚体或杂多聚体。二聚/多聚反应搭配物可呈平行或反平行定向布置。
也提供编码所述融合蛋白的分离的核酸分子、并有所述核酸的载体和宿主细胞以及含有所述融合蛋白的药物组合物和免疫原性组合物。免疫原性组合物含有抗原、融合蛋白来源和任选存在的佐剂。
本发明揭示使用所述融合蛋白减少或抑制促炎性T细胞活化的方法。所揭示组合物的治疗用途包括治疗或减轻发炎性和自体免疫疾病和病症的一种或一种以上症状。B7-H4融合蛋白适用于通过以下任一或所有方式来治疗炎症：抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞的分化；抑制或降低Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞的活性；抑制或减少Th1和/或Th17路径；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞对发炎性分子的产生和/或分泌；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞的增殖；与Treg相互作用；增强Treg活性；增强Treg对IL-10的分泌；增加Treg的数量；增加Treg的抑制能力；或其组合。
在一个实施例中，B7-H4多肽或融合蛋白增强Treg对免疫系统的抑制活性。Treg可抑制Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌。在一个优选实施例中，B7-H4多肽或融合蛋白增强Treg对原生T细胞的抑制活性，以抑制或减少原生T细胞分化成Th1、Th17或Th22细胞，并由此减少受试者中Th1或Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞的数量，所述发炎性分子包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP
一个实施例提供一种通过对受试者投予有效量的B7-H4多肽或其融合蛋白来抑制或减少受试者的表位扩展的方法。一个优选实施例提供一种投予有效量的B7-H4多肽或其融合蛋白以抑制或减少多发性硬化(MS)或系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus，SLE)患者的表位扩展的方法。
B7-H4多肽、其片段或融合物可与一种或一种以上其它治疗剂组合投予，所述其它治疗剂包括(但不限于)针对其它淋巴细胞表面标记物(例如CD40、α-4整合素(integrin))或针对细胞因子的抗体；其它融合蛋白，例如CTLA4-Ig(贝拉西普(belatacept))、TNFR-Ig
Figure BDA0000158191410000062
TNF-α阻断剂(例如Remicade、Cimzia和Humira)；CD73-Ig；环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)(即
Figure BDA0000158191410000063
RevimmuneTM)、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)(即
Figure BDA0000158191410000065
)、贝利单抗(belimumab)(即)、Tysabri或其它免疫抑制药物；抗增殖剂；细胞毒性剂；或可能有助于免疫抑制的其它化合物。
在一个实施例中，所述其它治疗剂靶向免疫活化所涉及的不同路径。在一个优选实施例中，所述其它治疗剂是CTLA-4融合蛋白，例如CTLA-4Ig(阿巴西普(abatacept))。在一个优选实施例中，所述其它治疗剂是称为贝拉西普的CTLA4-Ig融合蛋白，其含有在体内明显增加其与CD86的亲合力的两个氨基酸取代(L104E和A29Y)。
在另一实施例中，第二治疗剂是环磷酰胺(CTX)。在一个优选实施例中，B7-H4-Ig与CTX以有效量共投予以治疗慢性自体免疫疾病或病症，例如系统性红斑狼疮(SLE)。
在另一实施例中，第二治疗剂增加血清中腺苷的量。在一个优选实施例中，第二治疗剂是CD73-Ig、重组CD73或另一增加CD73表达的试剂(例如细胞因子或单克隆抗体或小分子)。在另一实施例中，第二治疗剂是干扰素-β。
在另一实施例中，第二治疗剂是Tysabri或另一MS治疗剂。在一个优选实施例中，B7-H4-Ig与Tysabri一起循环或在停药期期间使用以便降低给与第二治疗剂的频率并降低例如PML等副作用的风险，且防止对第二治疗剂产生抗性。
在另一实施例中，第二治疗剂是抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌的小分子。在另一实施例中，第二治疗剂是与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增进Treg对IL-10的分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合的小分子。在一个实施例中，小分子是视黄酸或其衍生物。
在另一实施例中，B7-H4多肽、其融合蛋白或片段可用于治疗对TNF阻断剂无应答的患者。
附图说明
图1A和1B是说明使用B7-H4-Ig抑制炎症的作用模式的图。在图1A中，B7-H4-Ig靶向T细胞。在图1B中，B7-H4-Ig阻止树突状细胞(dendritic cell，DC)成熟。
图2是说明胶原蛋白诱发的关节炎(collagen induced arthritis，CIA)的预防模型的关节炎诱发和治疗的图。
图3是在预防模型中用B7-H4-Ig治疗的小鼠(实心圆)和用媒剂治疗的小鼠(空心圆)的关节炎评分随胶原蛋白II(CII)激发后变化的线图。
图4是说明CIA治疗模型的关节炎诱发和治疗的图。
图5是在治疗模型中用B7-H4-Ig治疗的小鼠(实心圆)和用媒剂治疗的小鼠(空心圆)的关节炎评分随CII激发后变化的线图。
图6是说明CIA治疗模型的代表性疾病诱发和给药方案的图。
图7是显示雌性小鼠(AA#79)的关节炎评分随CII免疫后时间(天数)而变化的线图。图中显示了媒剂、鼠类IgG、鼠类B7-H4-Ig、
Figure BDA0000158191410000071
B7-H4-Ig和RPA110010治疗。
图8是显示雄性小鼠(AA#80)的关节炎评分随CII免疫后时间(天数)而变化的线图。图中显示了媒剂、鼠类IgG、鼠类B7-H4-Ig、
Figure BDA0000158191410000072
B7-H4-Ig和RPA110010治疗。
图9是显示在对来自用B7-H4-Ig或
Figure BDA0000158191410000073
治疗的小鼠的血清样品进行定量免疫分析多分析物并行检测(multi-analyte profiling)以鉴别可用于监测疾病发展和对B7-H4-Ig治疗的应答的生物标记物后得到的完整数据集的第一部分的图表。
图10是显示在对来自用B7-H4-Ig或
Figure BDA0000158191410000074
治疗的小鼠的血清样品进行定量免疫分析多分析物并行检测分析以鉴别可用于监测疾病发展和对B7-H4-Ig治疗的应答的生物标记物后得到的完整数据集的第二部分的图表。
图11是显示有关图7和图8的完整数据集的定量免疫分析多分析物并行检测数据分析概要的图表。如果在第27天、第34天、第41天或总的说来，
Figure BDA0000158191410000081
与B7-H4-Ig治疗组之间存在差异(p小于0.05)，那么分析物画有阴影。如果分析物与临床评分之间的相关系数小于0.3，那么分析物也画有阴影。
图12是显示C反应性蛋白(C-Reactive Protein，CRP)的血清水平(μg/ml)与临床评分的关系的线图。
图13是在CII免疫后第27天、第34天和第41天用B7-H4-Ig(-■-)或
Figure BDA0000158191410000082
(-●-)治疗的小鼠的血清内皮素1(ET-1)水平(pg/ml)的图。
图14是显示IL-6的血清水平(μg/ml)与临床评分的关系的线图。
图15是显示在CII免疫后第27天、第34天和第41天用B7-H4-Ig(-■-)或
Figure BDA0000158191410000083
(-●-)治疗的小鼠的血清单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1，MPC-1)水平(pg/ml)的图。
图16是显示血清单核细胞趋化蛋白-3(MPC-3)水平(pg/ml)与临床评分的关系的线图。
图17是显示在CII免疫后第27天、第34天和第41天用B7-H4-Ig(-■-)或
Figure BDA0000158191410000084
(-●-)治疗的小鼠的血清单核细胞趋化蛋白-3(MPC-3)水平(pg/ml)的图。
图18是显示在CII免疫后第27天、第34天和第41天用B7-H4-Ig(-■-)或
Figure BDA0000158191410000085
(-●-)治疗的小鼠的血清噬菌体发炎性蛋白-2(MIP-2)水平(pg/ml)的图。
图20A、20B和20C是显示对于指定的促炎性细胞因子/趋化因子，用B7-H4-Ig(实心柱形)或媒剂对照物(空心柱形)治疗的小鼠的血浆促炎性细胞因子和趋化因子水平的柱形图。TNFα(图6a)、IL-6(图6b)和MCP-1(图6c)。
图21是在CD4+Th1促进条件下利用结合于培养板或在溶液中的对照IgG(空心柱形)或B7-H4-Ig(实心柱形)培养并用结合于珠粒的抗CD3/CD28或用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞活化的小鼠原生T细胞的T细胞增殖情况([3H]胸苷并入)的柱形图。
图22是在Th1促进条件下利用结合于培养板或在溶液中的对照IgG(空心柱形)或B7-H4-Ig(实心柱形)培养并用结合于珠粒的抗CD3/CD28或用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞活化的小鼠原生CD4+T细胞产生的IFN-γ(ng/ml)的柱形图。
图23是在Th17促进条件下利用结合于培养板或在溶液中的对照IgG(空心柱形)或B7-H4-Ig(实心柱形)培养并用结合于珠粒的抗CD3/CD28或用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞活化的小鼠原生CD4+T细胞的T细胞增殖情况([3H]胸苷并入)的柱形图。
图24是在Th17促进条件下利用结合于培养板或在溶液中的对照IgG(空心柱形)或B7-H4-Ig(实心柱形)培养并用结合于珠粒的抗CD3/CD28或用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞活化的小鼠原生T细胞产生的IL17(ng/ml)的柱形图。
图25是在Th17促进条件下利用结合于培养板或在溶液中的对照IgG(空心柱形)或B7-H4-Ig(实心柱形)培养并用结合于珠粒的抗CD3/CD28或用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞活化的小鼠原生T细胞产生的TNF-α(ng/ml)的柱形图。
图26是在Th2促进条件下利用结合于培养板或在溶液中的对照IgG(空心柱形)或B7-H4-Ig(实心柱形)培养并用结合于珠粒的抗CD3/CD28或用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞活化的小鼠原生CD4+T细胞的T细胞增殖情况([3H]胸苷并入)的柱形图。
图27是显示由在Th1促进条件下培养并用卵清蛋白肽刺激的小鼠原生T细胞产生的IFN-γ(ng/ml)随对照IgG(-○-)或B7-H4-Ig第22批(-●-)或B7-H4-Ig第23批(-▲-)的浓度而变化的线图。
图28是显示由在Th17促进条件下培养并用卵清蛋白肽刺激的小鼠原生T细胞产生的IL-17(ng/ml)随对照IgG(-○-)或B7-H4-Ig第22批(-●-)或B7-H4-Ig第23批(-▲-)的浓度而变化的线图。
图29是在Th1(-●-)或Th17(-▲-)促进条件下培养，用结合于珠粒的抗CD3/CD28刺激并用直接添加到培养物(溶液)中的递增浓度的人类B7-H4-Ig(μg/ml)处理的小鼠原生CD4+T细胞的T细胞增殖情况([3H]胸苷并入)的线图。
图30是在Th1(-●-)或Th17(-▲-)促进条件下培养，用结合于珠粒的抗CD3/CD28刺激并用直接添加到培养物(溶液)中的递增浓度的人类B7-H4-Ig(μg/ml)处理的小鼠原生CD4+T细胞产生的IFN-γ(ng/ml)的线图。
图31是在Th1(-●-)或Th17(-▲-)促进条件下培养，用结合于珠粒的抗CD3/CD28刺激并用直接添加到培养物(溶液)中的递增浓度的人类B7-H4-Ig(μg/ml)处理的小鼠原生CD4+T细胞产生的IL17(ng/ml)的线图。
图32A和32B是在CD25+T细胞存在或不存在下在Th1促进条件下培养，用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞刺激并用不同浓度(μg/ml)的对照IgG或B7-H4-Ig处理的CD4+CD62+原生小鼠T细胞产生的IFN-γ(ng/ml)(A)和IL-10(ng/ml)(B)的线图。用对照IgG处理的含有CD25+T细胞的T细胞以(●)显示，而B7-H4-Ig以(▲)显示。CD25+T细胞耗尽且用IgG处理的T细胞以(○)显示，而B7-H4-Ig以(△)显示。
图33A和33B是在CD25+T细胞存在或不存在下在Th17促进条件下培养，用以卵清蛋白肽冲击的抗原提呈细胞刺激并用不同浓度(μg/ml)的对照IgG或B7-H4-Ig处理的CD4+CD62+原生小鼠T细胞产生的IL-17A(ng/ml)(A)和IL-10(ng/ml)(B)的线图。用对照IgG处理的含有CD25+T细胞的T细胞以(●)显示，而B7-H4-Ig以(▲)显示。CD25+T细胞耗尽且用IgG处理的T细胞以(○)显示，而B7-H4-Ig以(△)显示。
图34是说明nTreg抑制分析法的流程图。
图35是针对比例为1∶0、1∶0.12、1∶0.25、1∶0.5、1∶1和1∶2的原生CD4+/GFP-应答T细胞与CD4+/GFP+nTreg细胞加经过照射的作为抗原提呈细胞(APC)的未纯化脾细胞、抗CD3抗体以及不同量的鼠类B7-h4-Ig(0(-●-)、1(-■-)、5(-▲-)或10μg/mL)的T细胞增殖情况([3H]胸苷并入)的线图。
图36是在利用自体免疫R-EAE鼠类多发性硬化(MS)模型的体内研究中实验性自体免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)诱发和治疗方案的示意图。
图37是在60μg(3mg/kg)对照IgG(○)或60μg(3mg/kg)B7-H4-Ig(●)的治疗天数＝0时EAE诱发的SJL小鼠的平均临床评分与疾病诱发后天数的关系的线图。
图38是在60μg(3mg/kg)对照IgG(○)或60μg(3mg/kg)B7-H4-Ig(●)的治疗天数＝21时EAE诱发的SJL小鼠的平均临床评分与疾病诱发后天数的关系的线图。
图39是利用平均耳肿胀(Mean Ear Swelling)(×10-4英寸)测量的在第50天用PLP139-151或PLP178-191进行耳激发后第0天或第21天用对照IgG或鼠类B7-H4-Ig治疗的EAE小鼠在第55天的迟发型超敏反应(Delayed-Type Hypersensitivity，DTH)应答的柱形图。空心矩形是在t＝0时投予的对照IgG，实心矩形是在t＝0时投予的B7-H4-Ig，带向右斜线的矩形是在t＝21时投予的对照IgG，且带向左斜线的矩形是在t＝21时投予的B7-H4-Ig。*DTH应答显著小于注射对照IgG的小鼠，p小于0.01。
图40是从在体外用PLP139-151(诱发疾病的优势表位)和PLP178-191(扩展表位特异性肽)处理后第0天或第21天用B7-H4-Ig和对照IgG治疗的EAE小鼠的淋巴结分离的T细胞的T细胞增殖情况(ΔCPU(每分钟计数))的柱形图。空心矩形是在t＝0时投予的对照IgG，实心矩形是在t＝0时投予的B7-H4-Ig，带向右斜线的矩形是在t＝21时投予的对照IgG，且带向左斜线的矩形是在t＝21时投予的B7-H4-Ig。*[3H]-胸苷并入显著小于注射对照IgG的小鼠，p小于0.01。
图41是从在体外用PLP139-151(诱发疾病的优势表位)和PLP178-191(扩展表位特异性肽)处理后第0天或第21天用B7-H4-Ig和对照IgG治疗的EAE小鼠的淋巴结分离的T细胞所产生的IFN-γ(pg/ml)的柱形图。空心矩形是在t＝0时投予的对照IgG，实心矩形是在t＝0时投予的B7-H4-Ig，带向右斜线的矩形是在t＝21时投予的对照IgG，且带向左斜线的矩形是在t＝21时投予的B7-H4-Ig。*IFN-γ产量显著小于注射对照IgG的小鼠，p小于0.01。
图42是在第10天用PLP139-151或OVA323-339肽(负对照)进行耳激发后，通过在疾病诱发后第0天与第10天之间5次注射60μgB7-H4-Ig、300μgB7-H4-Ig或对照IgG治疗的EAE小鼠的Δ平均耳肿胀(×10-4英寸)-OVA应答的柱形图。*DTH应答显著小于注射对照IgG的小鼠。
图43是从在体外在抗CD3(0.1-10μg/mL)、PLP139-151(1-20μg/mL)或OVA323-339(1-20μg/mL)存在下再活化的图42中所述的EAE小鼠的淋巴结分离的T细胞的增殖情况(ΔCPU(每分钟计数))的线图。
图44是在利用自体免疫R-EAE鼠类多发性硬化(MS)模型的体内研究中实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)诱发和治疗方案的示意图。
图45A、45B和45C是显示在第50天从用50μg在CFA中乳化的PLP肽免疫的SJL小鼠分离的脾(A)、引流淋巴结(B)和CNS中总淋巴细胞数量(×106)的柱形图。缓解期间，用对照IgG或B7-H4-Ig治疗小鼠：每剂60或300μg，每周3剂，持续2周(6剂)。
图46A、46B和46C是显示从如图45中所述的脾(A)、引流淋巴结(B)或CNS分离的T细胞子集数量(×106)的柱形图，所述T细胞子集为CD4+(T细胞)、CD4+/FoxP3+(Treg)和CD4+/CD44+(效应/记忆T细胞)。提供的数据为来自个别小鼠的每一表型的细胞的平均数量。
图47是显示对于对照IgG、60μg或300μg B7-H4-Ig治疗，来自图46的CD4+T细胞中Treg百分含量的柱形图。
图48A和48B是显示在第35天从用50μg在CFA中乳化的PLP肽免疫并在体外在抗CD3(1μg/ml)、PLP139-151或PLP178-191(20μg/ml)存在下活化的SJL小鼠分离的总脾细胞(A)和淋巴结细胞(B)的增殖情况(CPU(每分钟计数))的柱形图。缓解期间，用对照IgG或B7-H4-Ig治疗小鼠：每剂60或300μg，每周3剂，持续2周(6剂)。
图49是显示在疾病诱发后的50天时间过程(天)中SJL小鼠的平均临床评分的线图。从疾病诱发后第23天开始，一周三次用60μgB7-H4-Ig(-●-)、300μgB7-H4-Ig(-▲-)或对照IgG(-△-)治疗小鼠。
图50是在利用自体免疫R-EAE鼠类多发性硬化(MS)模型的体内研究中实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)诱发和人类B7-H4-Ig治疗方案的示意图。
图51A和51B是显示在疾病诱发后55天时间过程(天)中SJL小鼠的平均临床评分(A)和长期复发率(B)的线图。从疾病诱发后第23天开始，一周三次用100μg人类B7-H4-Ig(5mg/kg)、500μg人类B7-H4-Ig(25mg/kg)或100μg对照IgG
Figure BDA0000158191410000121
(5mg/kg)治疗小鼠，持续4周。
图52是CTLA4KD/NOD糖尿病小鼠％与连续4周每周3次用B7-H4-Ig治疗(15mg/kg，每次均为腹膜内注射)后的周数的关系的线图。小鼠为两周龄。
图53是CTLA4KD/BDC2.5/NOD糖尿病小鼠％与连续4周每周3次用B7-H4-Ig治疗(15mg/kg，每次均为腹膜内注射)后的周数的关系的线图。小鼠为11周龄。
图54是来自对照小鼠和用不同剂量B7-H4-Ig治疗的小鼠的Treg细胞增殖百分比的柱形图。Treg细胞滴定到5天肠抗原特异性CD4+CD25-增殖分析法中。每一柱形表示以未暴露于Treg的培养物的百分比表示的四个重复培养物的平均cpm值，且条形表示SD。在本图中，从左到右每组三个柱形表示来自用对照物、B7-H4-Ig(60μg)或B7-H4-Ig(300μg)治疗的小鼠的Treg。
图55是从对照小鼠或用B7-H4-Ig治疗且暴露于肠抗原冲击的脾细胞APC达5天的小鼠回收的CD4+CD25-细胞的增殖情况(cpm)的柱形图。每一柱形表示四个重复培养物的平均cpm值，且条形表示SD。在本图中，从左到右每组三个柱形表示来自用对照物、B7-H4-Ig(60μg)或B7-H4-Ig(300μg)治疗的小鼠的Treg。
图56是显示在第9天、4天培养期的第1天或第2天添加到培养物中的Th17分化混合液(differentiation cocktail)以及鼠类B7-H4-Ig、鼠类同种型IgG2a对照物或视黄酸(RA)存在下由用抗CD3/CD28活化的Balb/C小鼠原生T细胞分泌的IL-17A的量(ng/ml)的柱形图。
图57是显示由抗CD3/CD28和鼠类B7-H4-Ig活化的小鼠原生T细胞的mRNA相对于鼠类同种型对照物的上调或下调倍数的柱形图。所有细胞都在Th17分化混合液存在下培养。Th17细胞、Treg、自体免疫病症和/或炎症中所涉及的mRNA的表达是借助定量RT-PCR测试。
图58是显示在由抗CD3/CD28和在融合蛋白46位具有Q或L的人类B7-H4-Ig(1μg/mL)或者作为同种型对照物的针对呼吸道合胞病毒F蛋白A抗原位点中的表位的人化单克隆IgG抗体(Synagis)活化的人类T细胞中mRNA上调或下调倍数的柱形图。所有细胞都在Th17分化混合液存在下培养。Th17细胞、Treg、自体免疫病症和/或炎症中所涉及的mRNA的表达是借助定量RT-PCR测试。
图59是由用指定浓度的鼠类B7-H4-Ig、鼠类IgG对照物或视黄酸处理的TH17细胞产生的IL-17A(ng/ml)浓度的柱形图。
图60是IL-17A(ng/ml)随蛋白质浓度(μg/ml)变化的线图，其显示了B7-H4-IgQ(■)、B7-H4-IgL(▲)与Synagis(◆)(不相关的人类IgG1抗体)对小鼠Th17细胞的活性的比较。
图61是IL-17A(ng/ml)随蛋白质浓度(μg/ml)变化的线图，其显示了鼠类B7-H4-Ig(第22批(■)和第23批(▲))与小鼠IgG(◆)和视黄酸对照物
Figure BDA0000158191410000131
对Th17细胞的活性的比较。
图62是利用MRL/lpr狼疮小鼠模型的体内研究的治疗方案的示意图。
图63是显示在从预先治疗(4周)并定期治疗直到21周龄的对照组、B7-H4-Ig和环磷酰胺(CTX)组合治疗组、仅B7-H4-Ig治疗组和仅CTX治疗组的MRL/lpr小鼠收集的血浆中检测的抗ds DNA自身抗体(单位)的柱形图。对于每一治疗组，从左到右，各柱形显示在4、7、8、9、10、11、15、19和21周时的抗ds DNA自身抗体。
图64是显示在21周时对照组、B7-H4-Ig和环磷酰胺(CTX)组合治疗组、仅B7-H4-Ig治疗组和仅CTX治疗组的蛋白质指数(单位)的柱形图。
具体实施方式
I.定义
本文中使用的术语“分离的”是指相关化合物(例如聚核苷酸或多肽)所处环境不同于所述化合物天然存在的环境，举例来说，例如通过将肽浓缩到不能在自然界中发现的浓度而与其自然环境分离。“分离的”包括化合物在实质上富集相关化合物的样品内和/或其中相关化合物部分或实质上纯化。
“免疫细胞”是指造血系统起源的任何细胞，包括(但不限于)T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞。
本文中使用的术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，不管是否存在修饰(例如磷酸化或糖基化)。
本文中使用的“共刺激多肽”或“共刺激分子”是在与T细胞上的细胞表面分子相互作用时调节T细胞应答的多肽。
本文中使用的“共刺激信号传导”是在抗原特异性T细胞应答期间由抗原提呈细胞上的共刺激多肽与其在T细胞上的受体之间相互作用所产生的信号传导活性。抗原特异性T细胞应答是由两种信号介导：1)T细胞受体(TCR)与在MHC情形下提呈的抗原肽接合(信号1)；和2)，由不同共刺激受体/配体对之间接触所传递的第二抗原独立信号(信号2)。此“第二信号”对于确定T细胞应答的类型(活化与抑制)以及所述应答的强度和持续时间至关重要，并且受来自共刺激分子(例如B7蛋白质家族)的正信号和负信号调控。
本文中使用的术语“B7多肽”意指B7蛋白质家族的成员，其共刺激T细胞，包括(但不限于)B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4和其生物活性片段和/或变异体。代表性生物活性片段包括共刺激T细胞的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。
本文中使用的“可溶性B7-H4”或“sH4”是指可由表达B7-H4的细胞脱出、分泌或以其它方式提取的B7-H4片段。可溶性B7-H4片段包括B7-H4多肽的一部分或全部细胞外结构域，并且缺乏一部分或全部细胞内和/或跨膜结构域。在一个实施例中，可溶性B7-H4多肽片段包括B7-H4多肽的整个细胞外结构域。在其它实施例中，可溶性B7-H4多肽片段包括细胞外结构域的片段。B7-H4多肽的细胞外结构域可易于由所属领域技术人员使用例如水疗法图谱(hydropathy plotting)等标准方法确定。
本文中使用的“发炎性分子”是指产生发炎性应答的分子，包括(但不限于)细胞因子和金属蛋白酶，例如包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP。
本文中使用的“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体或柯斯质粒(cosmid)，其中可插入另一DNA区段以引起插入的区段的复制。本文所述的载体可以是表达载体。
本文中使用的“表达载体”是包括一个或一个以上表达控制序列的载体。
本文中使用的“表达控制序列”是控制和调控另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。
“按可操作方式连接”是指各元件的布置使得所述各组件经过配置以执行其常见或预定功能。因此，按可操作方式连接在一起的两个不同多肽保持其相应的生物功能，同时以物理方式连接在一起。
本文中使用的“价态”是指每一分子可用的结合位点的数量。
本文中使用的“变异”多肽相比相应野生型多肽的氨基酸序列含有至少一个氨基酸序列变化。
本文中使用的“保守”氨基酸取代是经过取代的氨基酸具有类似结构或化学性质的取代。
本文中使用的术语“宿主细胞”是指可引入重组载体的原核和真核细胞。
本文中使用的“转化”和“转染”涵盖借助此项技术中已知的多种技术将核酸(例如载体)引入细胞中。
本文中使用的短语分子“特异性结合”于目标或与目标“呈现特异性结合”是指在其它异源生物群体存在下决定所述分子的存在的结合反应。在指定免疫分析条件下，特定分子优先结合于特定目标，并且不会大量结合于样品中存在的其它生物。抗体与目标在所述条件下的特异性结合需要选择对所述目标具有特异性的抗体。可使用多种免疫分析型式来选择与特定蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体。举例来说，常常使用固相ELISA免疫分析法来选择与某一蛋白质具有特异性免疫反应性的单克隆抗体。有关可用于确定特异性免疫反应性的免疫分析型式和条件的描述，参见例如哈罗瓦(Harlow)和莱恩(Lane)(1988)，抗体：实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications)，纽约(New York)。
本文中使用的术语“免疫的”、“免疫学的”或“免疫”应答是产生针对受体患者中某一肽的有益体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答。此类应答可为通过投予免疫原诱导的主动应答或通过投予抗体或预致敏T细胞诱导的被动应答。细胞免疫应答是由提呈多肽表位与I类或II类MHC分子的组合以活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞所引起。所述应答也可能涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱细胞、树突状细胞、星形细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化，嗜中性粒细胞或固有免疫性的其它组分的活化或募集。细胞介导的免疫学应答的存在可由增殖分析法(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)分析法确定。体液和细胞应答对免疫原的预防或治疗作用的相对贡献可通过从经过免疫的同种同基因动物单独分离出抗体和T细胞，并测量在另一受试者中的预防或治疗作用来辨识。
“免疫原性试剂”或“免疫原”能够在任选与佐剂组合投予哺乳动物后诱导针对其自身的免疫应答。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，包括(但不限于)人类、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)和其它实验动物。
II.融合蛋白
B7-H4融合多肽具有第一融合搭配物，其包含与第二多肽直接融合或经由与第二多肽融合的连接肽序列融合的B7-H4蛋白的全部或一部分。融合蛋白任选含有用以使两种或两种以上融合蛋白二聚或多聚的结构域。肽/多肽连接子结构域可为独立结构域，或者可包含在融合蛋白其它结构域(B7-H4多肽或第二多肽)中的一者内。类似地，用以使融合蛋白二聚或多聚的结构域可为独立结构域，或者可包含在融合蛋白其它结构域(B7-H4多肽、第二多肽或肽/多肽连接子结构域)中的一者内。在一个实施例中，二聚/多聚结构域与肽/多肽连接子结构域是相同的。
本文揭示的融合蛋白具有式I：
N-R1-R2-R3-C
其中“N”表示融合蛋白的N末端，“C”表示融合蛋白的C末端。在一个优选实施例中，“R1”是B7-H4多肽，“R2”是任选存在的肽/多肽连接子结构域，且“R3”是第二多肽。或者，R3可为B7-H4多肽，且R1可为第二多肽。
二聚或多聚反应可通过二聚或多聚结构域在两种或两种以上融合蛋白之间发生。或者，融合蛋白的二聚或多聚反应可通过化学交联发生。形成的二聚体或多聚体可为均二聚体/均多聚体或杂二聚体/杂多聚体。
A.B7-H4多肽
在一个优选实施例中，B7-H4多肽来自哺乳动物物种。在最优选的实施例中，B7-H4多肽为鼠类、非人类灵长类动物(黑猩猩(Pan troglodytes)、恒河猴(Macaca mulatto)或食蟹猴(Macaca fascicularis))或人类来源。适用的鼠类B7-H4多肽与由基因库寄存编号(GenBank Accession Number)NM_178594或AY280973的核酸所编码的B7-H4多肽具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。适用的鼠类B7-H4多肽与根据基因库寄存编号AAH32925.1或NP_848709.2的B7-H4多肽具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。适用的人类B7-H4多肽与由基因库寄存编号AK026071的核酸所编码的B7-H4多肽具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。适用的人类B7-H4多肽与根据基因库寄存编号NP_078902.2或BAB15349.1的B7-H4多肽具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。
鼠类B7-H4多肽可由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核苷酸序列编码：
atggcttcct tggggcagat catcttttgg agtattatta acatcatcat catcctggct    60
ggggccatcg cactcatcat tggctttggc atttcaggca agcacttcat cacggtcacg    120
accttcacct cagctggaaa cattggagag gacgggaccc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tcaacggcat cgtcatccag tggctgaaag aaggcatcaa aggtttggtc    240
cacgagttca aagaaggcaa agacgacctc tcacagcagc atgagatgtt cagaggccgc    300
acagcagtgt ttgctgatca ggtggtagtt ggcaatgctt ccctgagact gaaaaacgtg    360
cagctcacgg atgctggcac ctacacatgt tacatccgca cctcaaaagg caaagggaat    420
gcaaaccttg agtataagac cggagccttc agtatgccag agataaatgt ggactataat    480
gccagttcag agagtttacg ctgcgaggct cctcggtggt tcccccagcc cacagtggcc    540
tgggcatctc aagtcgacca aggagccaat ttctcagaag tctccaacac cagctttgag    600
ttgaactctg agaatgtgac catgaaggtc gtatctgtgc tctacaatgt cacaatcaac    660
aacacatact cctgtatgat tgaaaacgac attgccaaag ccaccgggga catcaaagtg    720
acagattcag aggtcaaaag gcgaagtcag ctgcagttgc tgaactctgg gccttccccg    780
tgtgtttttt cttctgcctt tgtggctggc tgggcactcc tatctctctc ctgttgcctg    840
atgctaagat ga                                                        852
(SEQ ID NO：1)。
鼠类B7-H4多肽可与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MASLGQIIFW SIINIIIILA GAIALIIGFG ISGKHFITVT TFTSAGNIGE DGTLSCTFEP    60
DIKLNGIVIQ WLKEGIKGLV HEFKEGKDDL SQQHEMFRGR TAVFADQVVV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYTC YIRSSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEINVDYN ASSESLRCEA PRWFPQPTVA    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TDSEVKRRSQ LQLLNSGPSP CVSSSAFVAG WALLSLSCCL MLR                      283
(SEQ ID NO：2)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGKHFIT VTTFTSAGNI GEDGTLSCTF EPDIKLNGIV    60
IQWLKEGIKG LVHEFKEGKD DLSQQHEMFR GRTAVFADQV VVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
TCYIRSSKGK GNANLEYKTG AFSMPEINVD YNASSESLRC EAPRWFPQPT VAWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTDSEVKRR    240
SQLQLLNSGP SPCVSSSAFV AGWALLSLSC CLMLR                               275
(SEQ ID NO：3)、
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRSSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEINV DYNASSESLR CEAPRWFPQP TVAWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTDSEVKR RSQLQLLNSG PSPCVSSSAF    240
VAGWALLSLS CCLMLR                                                    256
(SEQ ID NO：4)、
MASLGQIIFW SIINIIIILA GAIALIIGFG ISGKHFITVT TFTSAGNIGE DGTLSCTFEP    60
DIKLNGIVIQ WLKEGIKGLV HEFKEGKDDL SQQHEMFRGR TAVFADQVVV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYTC YIRTSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEINVDYN ASSESLRCEA PRWFPQPTVA    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TDSEVKRRSQ LQLLNSGPSP CVFSSAFVAG WALLSLSCCL MLR                      283
(SEQ ID NO：5)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGKHFIT VTTFTSAGNI GEDGTLSCTF EPDIKLNGIV    60
IQWLKEGIKG LVHEFKEGKD DLSQQHEMFR GRTAVFADQV VVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
TCYIRTSKGK GNANLEYKTG AFSMPEINVD YNASSESLRC EAPRWFPQPT VAWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTDSEVKRR    240
SQLQLLNSGP SPCVFSSAFV AGWALLSLSC CLMLR                               275
(SEQ ID NO：6)或
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRTSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEINV DYNASSESLR CEAPRWFPQP TVAWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTDSEVKR RSQLQLLNSG PSPCVFSSAF    240
VAGWALLSLS CCLMLR                                                    256
(SEQ ID NO：7)
人类B7-H4多肽可由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核苷酸序列编码：
atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct    60
ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact    120
actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc    240
catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg    300
acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg    360
caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat    420
gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat    480
gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc    540
tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag    600
ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac    660
aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg    720
acagaatcgg agatcaaaag gcggagtcac ctacagctgc taaactcaaa ggcttctctg    780
tgtgtctctt ctttctttgc catcagctgg gcacttctgc ctctcagccc ttacctgatg    840
ctaaaataa                                                            849
(SEQ ID NO：8)。
人类B7-H4多肽可与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKASL CVSSFFAISW ALLPLSPYLM LK                       282
(SEQ ID NO：9)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
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SHLQLLNSKA SLCVSSFFAI SWALLPLSPY LMLK                                274
(SEQ ID NO：10)、
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK ASLCVSSFFA    240
ISWALLPLSP YLMLK                                                     255
(SEQ ID NO：11)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKASL CVSSFFAISW ALLPLSPYLM LK                       282
(SEQ ID NO：12)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVTINNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR     240
SHLQLLNSKA SLCVSSFFAI SWALLPLSPY LMLK                                274
(SEQ ID NO：13)或
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK ASLCVSSFFA    240
ISWALLPLSP YLMLK                                                     255
(SEQ ID NO：14)。
非人类灵长类动物的B7-H4多肽可与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MKPLTSRIIS IIIILAGAIA LIIGFGISGR HSITVTTVAS AGNIGEDGIL SCTFEPDIKL    60
SDIVIQWLKE GVLGLVHEFK EGKDELSEQD EMFRGRTAVF ADQVIVGNAS LRLKNVQLTD    120
AGTYKCYIIT SKGKGNANLE YKTGAFSMPE VNVDYNASSE TLRCEAPRWF PQPTVVWASQ    180
IDQGANFSEV SNTSFELNSE NVTMKVVSVL YNATINNTYS CMIENDIAKA TGDIKVTESE    240
IKRRSHLQLL NSKASLCVSS FFAISWALLP LSPYLMLK                            278
(SEQ ID NO：15)或
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQIDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNA TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK ASLCVSSFFA    240
ISWALLPLSP YLMLK                                                     255
(SEQ ID NO：16)或
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKASL CVSSFLAISW ALLPLAPYLM LK                       282
(SEQ ID NO：17)或
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK ASLCVSSFLA    240
ISWALLPLAP YLMLK                                                     255
(SEQ ID NO：18)或
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKASL CVSSFLAISW ALPPLAPYLM LK                       282
(SEQ ID NO：19)或
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWA8QVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK ASLCVSSFLA    240
ISWALPPLAP YLMLK                                                     255
(SEQ ID NO：20)，
其中SEQ ID NO：15和16是黑猩猩(chimapanzee/Pan troglodytes)多肽序列，SEQID NO：17和18是恒河猴(rhesus monkey/Macaca mulatto)多肽序列，且SEQ ID NO：19和20是食蟹猴(cynomolgus monkey/Macaca fascicularis)多肽序列。
编码B7-H4多肽的核酸可经过优化以在所选表达宿主中表达。密码子可用编码同一氨基酸的替代性密码子取代，以说明获得B7-H4核酸序列的哺乳动物与表达宿主之间密码子用法的差异。按这种方式，可使用表达宿主优选的密码子合成核酸。
1.B7-H4多肽的片段
B7-H4蛋白在细胞外含有两个免疫球蛋白结构域，即IgV结构域(或V结构域)和IgC结构域(或C结构域)，其与抗体的可变结构域和恒定结构域相关。这些结构域可由所属领域技术人员通过搜索家族和结构域数据库来鉴别。根据来自分离的IgV结构域的功能数据，以及通过类比其它B7家族成员，相信IgV结构域负责受体结合。细胞外结构域中的每一Ig结构域都包括在结构域内半胱氨酸残基之间形成的一个二硫键，这是此折叠特有的并且对于结构-功能极为重要。在SEQ ID NO：2、5、9和12中，对于IgV结构域，这些半胱氨酸位于残基56和130处，且对于IgC结构域则位于残基168和225处。此外，在IgV结构域中存在一个预测的N连接糖基化位点，并且在IgC结构域中存在6个糖基化位点，这些糖基化位点在小鼠与人类B7-H4序列之间保持不变。
在一个实施例中，第一融合搭配物是B7-H4的片段。如本文中所用，B7-H4的片段是指比全长蛋白质少至少一个氨基酸的多肽的任何子集。适用的片段是保持结合于其一个或一个以上天然受体的能力的片段。作为全长B7-H4的片段的B7-H4多肽结合其天然受体的能力通常是全长B7-H4的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％或甚至超过100％。
B7-H4多肽的片段包括可溶性片段。可溶性B7-H4多肽片段是可由产生细胞脱出、分泌或以其它方式提取的B7-H4多肽的片段。可溶性B7-H4多肽片段包括一部分或全部受体多肽细胞外结构域，并且缺乏一部分或全部细胞内和/或跨膜结构域。在一个实施例中，B7-H4多肽片段包括B7-H4多肽的整个细胞外结构域。在其它实施例中，可溶性B7-H4多肽片段包括保持B7-H4生物活性的细胞外结构域的片段。细胞外结构域可包括跨膜结构域的1、2、3、4或5个连续氨基酸，和/或信号序列的1、2、3、4或5个连续氨基酸。或者，细胞外结构域的C末端、N末端或二者可去除1、2、3、4、5个或更多个氨基酸。在一些实施例中，细胞外结构域仅为IgV结构域，或在位于全长蛋白质的残基56和130处的IgV结构域保守半胱氨酸之间的区域。
一般说来，B7-H4多肽或其片段是由包括编码信号序列的序列的核酸表达。信号序列一般从不成熟多肽裂解，产生不含信号序列的成熟多肽。SEQ ID NO：4、7、11、14、16、18和20各自不含信号肽。可使用标准分子生物学技术，用另一多肽的信号序列代替B7-H4的信号序列，以影响多肽的表达水平、分泌、溶解性或其它性质。用来代替B7-H4信号序列的信号序列可以是此项技术中已知的任何序列。SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19各自含有信号肽。
在一个优选实施例中，融合蛋白包括B7-H4的细胞外结构域，或其与Ig Fc区融合的片段。如先前所述，可通过将B7-H4或其片段的细胞外结构域的编码区与人类IgG1或小鼠IgG2a的Fc区融合，来制备重组B7-H4-Ig融合蛋白(查普沃(Chapoval)等人，分子医学方法(Methods Mol Med.)，45：247-255(2000))。
a.鼠类B7-DC细胞外结构域融合搭配物
在一个实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括鼠类B7-H4细胞外结构域或其片段。第一融合搭配物可由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核苷酸序列编码：
atggcttcct tggggcagat catcttttgg agtattatta acatcatcat catcctggct    60
ggggccatcg cactcatcat tggctttggc atttcaggca agcacttcat cacggtcacg    120
accttcacct cagctggaaa cattggagag gacgggaccc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tcaacggcat cgtcatccag tggctgaaag aaggcatcaa aggtttggtc    240
cacgagttca aagaaggcaa agacgacctc tcacagcagc atgagatgtt cagaggccgc    300
acagcagtgt ttgctgatca ggtggtagtt ggcaatgctt ccctgagact gaaaaacgtg    360
cagctcacgg atgctggcac ctacacatgt tacatccgca cctcaaaagg caaagggaat    420
gcaaaccttg agtataagac cggagccttc agtatgccag agataaatgt ggactataat    480
gccagttcag agagtttacg ctgcgaggct cctcggtggt tcccccagcc cacagtggcc    540
tgggcatctc aagtcgacca aggagccaat ttctcagaag tctccaacac cagctttgag    600
ttgaactctg agaatgtgac catgaaggtc gtatctgtgc tctacaatgt cacaatcaac    660
aacacatact cctgtatgat tgaaaacgac attgccaaag ccaccgggga catcaaagtg    720
acagattcag aggtcaaaag gcgaagtcag ctgcagttgc tgaactctgg g             771
(SEQ ID NO：21)、
atggagtggt catgggtttt tctgttcttt cttagcgtga ctacaggcgt ccattcagga    60
ttcggcataa gcggcaagca cttcatcaca gttacaacgt ttacaagtgc ggggaacatt    120
ggggaagatg gaacattgtc atgtacattt gagccagata tcaaactcaa tggaatagta    180
attcagtggc ttaaggaggg catcaagggc ctggtccacg aatttaagga ggggaaagac    240
gatctgtctc agcagcacga gatgttcagg ggcagaaccg ccgtcttcgc agaccaggtt    300
gtggtaggca acgccagttt gcggctgaaa aacgtgcagc tgactgacgc cggcacctac    360
acatgctata tccggtcctc taagggcaag gggaacgcta atctcgagta caaaacaggc    420
gccttttcta tgccagagat caacgtggac tataacgcaa gctctgaaag tctgagatgc    480
gaggcgccaa ggtggttccc tcagcccacc gtcgcgtggg cttcccaggt ggatcaaggc    540
gccaactttt ctgaggtttc taacaccagc ttcgaactga acagcgaaaa tgtgacaatg    600
aaggtagtca gcgttctgta taacgtgacc atcaacaata cttactcctg tatgatagaa    660
aatgatatag ccaaggctac aggagatatt aaagtgacgg attcagaagt gaaaaggagg    720
agtcaactgc aactcttgaa tagcggc                                        747
(SEQ ID NO：22)或
atggagtggt catgggtttt tctgttcttt cttagcgtga ctacaggcgt ccattcagga    60
ttcggcataa gcggcaagca cttcatcaca gttacaacgt ttacaagtgc ggggaacatt    120
ggggaagatg gaacattgtc atgtacattt gagccagata tcaaactcaa tggaatagta    180
attcagtggc ttaaggaggg catcaagggc ctggtccacg aatttaagga ggggaaagac    240
gatctgtctc agcagcacga gatgttcagg ggcagaaccg ccgtcttcgc agaccaggtt    300
gtggtaggca acgccagttt gcggctgaaa aacgtgcagc tgactgacgc cggcacctac    360
acatgctata tccggacctc taagggcaag gggaacgcta atctcgagta caaaacaggc    420
gccttttcta tgccagagat caacgtggac tataacgcaa gctctgaaag tctgagatgc    480
gaggcgccaa ggtggttccc tcagcccacc gtcgcgtggg cttcccaggt ggatcaaggc    540
gccaactttt ctgaggtttc taacaccagc ttcgaactga acagcgaaaa tgtgacaatg    600
aaggtagtca gcgttctgta taacgtgacc atcaacaata cttactcctg tatgatagaa    660
aatgatatag ccaaggctac aggagatatt aaagtgacgg attcagaagt gaaaaggagg    720
agtcaactgc aactcttgaa tagcggc                                        747
(SEQ ID NO：23)。
在另一实施例中，第一融合搭配物可与以下鼠类氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGKHFIT VTTFTSAGNI GEDGTLSCT FEPDIKLNGIV    60
IQWLKEGIKG LVHEFKEGKD DLSQQHEMFR GRTAVFADQV VVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
TCYIRSSKGK GNANLEYKTG AFSMPEINVD YNASSESLRC EAPRWFPQPT VAWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTDSEVKRR    240
SQLQLLNSG                                                            249
(SEQ ID NO：24)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGKHFIT VTTFTSAGNI GEDGTLSCTF EPDIKLNGIV    60
IQWLKEGIKG LVHEFKEGKD DLSQQHEMFR GRTAVFADQV VVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
TCYIRTSKGK GNANLEYKTG AFSMPEINVD YNASSESLRC EAPRWFPQPT VAWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTDSEVKRR    240
SQLQLLNSG                                                            249
(SEQ ID NO：25)、
MASLGQIIFW SIINIIIILA GAIALIIGFG ISGKHFITVT TFTSAGNIGE DGTLSCTFEP    60
DIKLNGIVIQ WLKEGIKGLV HEFKEGKDDL SQQHEMFRGR TAVFADQVVV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYTC YIRSSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEINVDYN ASSESLRCEA PRWFPQPTVA    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TDSEVKRRSQ LQLLNSG                                                   257
(SEQ ID NO：26)或
MASLGQIIFW SIINIIIILA GAIALIIGFG ISGKHFITVT TFTSAGNIGE DGTLSCTFEP    60
DIKLNGIVIQ WLKEGIKGLV HEFKEGKDDL SQQHEMFRGR TAVFADQVVV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYTC YIRTSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEINVDYN ASSESLRCEA PRWFPQPTVA    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TDSEVKRRSQ LQLLNSG                                                   257
(SEQ ID NO：27)。
成熟蛋白质中的信号序列被去除。此外，在制造期间还可使用来自其它多肽或生物体的信号肽增进宿主对融合蛋白的分泌。SEQ ID NO：28提供了不含信号序列的鼠类氨基酸序列SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26：
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRSSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEINV DYNASSESLR CEAPRWFPQP TVAWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTDSEVKR RSQLQLLNSG               230
(SEQ ID NO：28)。
SEQ ID NO：29提供了不含信号序列的鼠类氨基酸序列SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：27：
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRTSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEINV DYNASSESLR CEAPRWFPQP TVAWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTDSEVKR RSQLQLLNSG               230
(SEQ ID NO：29)。
在另一实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括鼠类B7-H4的IgV结构域。在一个实施例中，IgV结构域至少包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的56位半胱氨酸到SEQID NO：2或SEQ ID NO：5的130位半胱氨酸。在另一实施例中，IgV结构域含有所述多肽由此氨基酸范围界定的至少25个或50个氨基酸的片段。
第一融合搭配物可由与以下编码示范性IgV结构域的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核苷酸序列编码：
ggattcggca taagcggcaa gcacttcatc acagttacaa cgtttacaag tgcggggaac    60
attggggaag atggaacatt gtcatgtaca tttgagccag atatcaaact caatggaata    120
gtaattcagt ggcttaagga gggcatcaag ggcctggtcc acgaatttaa ggaggggaaa    180
gacgatctgt ctcagcagca cgagatgttc aggggcagaa ccgccgtctt cgcagaccag    240
gttgtggtag gcaacgccag tttgcggctg aaaaacgtgc agctgactga cgccggcacc    300
tacacatgct atatccggtc ctctaagggc aaggggaacg ctaatctcga gtacaaaaca    360
ggcgcctttt ctatgccaga gatcaac                                        387
(SEQ ID NO：30)或
ggattcggca taagcggcaa gcacttcatc acagttacaa cgtttacaag tgcggggaac    60
attggggaag atggaacatt gtcatgtaca tttgagccag atatcaaact caatggaata    120
gtaattcagt ggcttaagga gggcatcaag ggcctggtcc acgaatttaa ggaggggaaa    180
gacgatctgt ctcagcagca cgagatgttc aggggcagaa ccgccgtctt cgcagaccag    240
gttgtggtag gcaacgccag tttgcggctg aaaaacgtgc agctgactga cgccggcacc    300
tacacatgct atatccggac ctctaagggc aaggggaacg ctaatctcga gtacaaaaca    360
ggcgcctttt ctatgccaga gatcaac                                        387
(SEQ ID NO：31)。
第一融合搭配物可与以下鼠类氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRSSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEIN                                                            129
(SEQ ID NO：32)或
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRTSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEIN                                                            129
(SEQ ID NO：33)。
b.人类细胞外结构域融合搭配物
在另一实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括人类B7-H4细胞外结构域或其片段。第一融合搭配物可由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核苷酸序列编码：
atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct    60
ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact    120
actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc    240
catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg    300
acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg    360
caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat    420
gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat    480
gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc    540
tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag    600
ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac    660
aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg    720
acagaatcgg agatcaaaag gcggagt                                        747
(SEQ ID NO：34)、
atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct    60
ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact    120
actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc    240
catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg    300
acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg    360
caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat    420
gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat    480
gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc    540
tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag    600
ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac    660
aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg    720
acagaatcgg agatc                                                     735
(SEQ ID NO：35)、
atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct    60
ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact    120
actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc    240
catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg    300
acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg    360
caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat    420
gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat    480
gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc    540
tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag    600
ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac    660
aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg    720
acagaatcgg agatcaaaag gcggagtcac ctacagctgc taaactcaaa ggcttct       777
(SEQ ID NO：36)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatccagtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tct                                                                  723
(SEQ ID NO：37)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatccagtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat c             711
(SEQ ID NO：38)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatccagtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tctcacctac agctgctaaa ctcaaaggct tct                                 753
(SEQ ID NO：39)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatcctgtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tct                                                                  723
(SEQ ID NO：40)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatcctgtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat c             711
(SEQ ID NO：41)或
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatcctgtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    S40
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tctcacctac agctgctaaa ctcaaaggct tct                                 753
(SEQ ID NO：42)。
在另一实施例中，第一融合搭配物可与以下人类氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
S                                                                    241
(SEQ ID NO：43)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEI       237
(SEQ ID NO：44)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
SHLQLLNSKA S                                                         251
(SEQ ID NO：45)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
S                                                                    241
(SEQ ID NO：46)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEI       237
(SEQ ID NO：47)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
SHLQLLNSKA S                                                         251
(SEQ ID NO：48)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRS                                                            249
(SEQ ID NO：49)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEI                                                                245
(SEQ ID NO：50)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKAS    259
(SEQ ID NO：51)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRS                                                            249
(SEQ ID NO：52)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEI                                                                245
(SEQ ID NO：53)或
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKAS                                                 259
(SEQ ID NO：54)。
成熟蛋白质中的信号序列将被去除。此外，在制造期间还可使用来自其它多肽或生物体的信号肽增进宿主对融合蛋白的分泌。SEQ ID NO：55提供了不含信号序列的人类氨基酸序列SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：49：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGDIKVTESEIKR RS                        222
(SEQ ID NO：55)。
SEQ ID NO：56提供了不含信号序列的人类氨基酸序列SEQ ID NO：46和SEQ IDNO：52：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RS                       222
(SEQ ID NO：56)。
SEQ ID NO：57提供了不含信号序列的人类氨基酸序列SEQ ID NO：44和SEQ IDNO：50：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEI                            218
(SEQ ID NO：57)。
SEQ ID NO：58提供了不含信号序列的人类氨基酸序列SEQ ID NO：47和SEQ IDNO：53：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEI                            218
(SEQ ID NO：58)。
SEQ ID NO：59提供了不含信号序列的人类氨基酸序列SEQ ID NO：45和SEQ IDNO：51：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK AS            232
(SEQ ID NO：59)。
SEQ ID NO：60提供了不含信号序列的人类氨基酸序列SEQ ID NO：48和SEQ IDNO：54：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK AS            232
(SEQ ID NO：60)。
在其它实施例中，最后的丙氨酸和丝氨酸残基从SEQ ID NO：45、48、51、54、59和60去除。
在另一实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括人类B7-H4的IgV结构域。在一个实施例中，IgV结构域至少包括SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12的56位半胱氨酸到SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12的130位半胱氨酸。在另一实施例中，IgV结构域含有所述多肽由此氨基酸范围界定的至少25个或50个氨基酸的片段。
第一融合搭配物可由与以下编码示范性IgV结构域的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核苷酸序列编码：
ggcttcggca tcagtggacg gcacagtatc acagtgacca ccgtcgcctc cgctggcaat    60
ataggtgagg atggcatcca gtcctgtacc tttgagccgg acatcaaact gtctgacata    120
gtgatacaat ggctgaagga gggggtgctc ggtctggtac atgagtttaa ggaagggaag    180
gatgaactgt ccgagcagga tgagatgttc cgggggagga ccgctgtgtt cgccgatcag    240
gtaatcgtcg gaaatgcaag tctcagattg aaaaatgtgc aactgactga tgctggcacg    300
tataaatgct acattatcac aagtaagggc aaaggaaatg ctaaccttga gtataaaaca    360
ggcgcattct caatgcccga ggt caat                                       387
(SEQ ID NO：61)或
ggcttcggca tcagtggacg gcacagtatc acagtgacca ccgtcgcctc cgctggcaat    60
ataggtgagg atggcatcct gtcctgtacc tttgagccgg acatcaaact gtctgacata    120
gtgatacaat ggctgaagga gggggtgctc ggtctggtac atgagtttaa ggaagggaag    180
gatgaactgt ccgagcagga tgagatgttc cgggggagga ccgctgtgtt cgccgatcag    240
gtaatcgtcg gaaatgcaag tctcagattg aaaaatgtgc aactgactga tgctggcacg    300
tataaatgct acattatcac aagtaagggc aaaggaaatg ctaaccttga gtataaaaca    360
ggcgcattct caatgcccga ggtcaat                                        387
(SEQ ID NO：62)。
第一融合搭配物可与以下人类氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVN                                                            129
(SEQ ID NO：63)或
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVN                                                            129
(SEQ ID NO：64)。
c.非人类灵长类动物细胞外结构域融合搭配物
在另一实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括非人类灵长类动物B7-H4细胞外结构域或其片段。示范性非人类灵长类动物包括(但不限于)黑猩猩、恒河猴和食蟹猴。
第一融合搭配物可与以下黑猩猩氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MKPLTSRIIS IIIILAGAIA LIIGFGISGR HSITVTTVAS AGNIGEDGIL SCTFEPDIKL    60
SDIVIQWLKE GVLGLVHEFK EGKDELSEQD EMFRGRTAVF ADQVIVGNAS LRLKNVQLTD    120
AGTYKCYIIT SKGKGNANLE YKTGAFSMPE VNVDYNASSE TLRCEAPRWF PQPTVVWASQ    180
IDQGANFSEV SNTSFELNSE NVTMKVVSVL YNATINNTYS CMIENDIAKA TGDIKVTESE    240
IKRRS                                                                245
(SEQ ID NO：65)、
MKPLTSRIIS IIIILAGAIA LIIGFGISGR HSITVTTVAS AGNIGEDGIL SCTFEPDIKL    60
SDIVIQWLKE GVLGLVHEFK EGKDELSEQD EMFRGRTAVF ADQVIVGNAS LRLKNVQLTD    120
AGTYKCYIIT SKGKGNANLE YKTGAFSMPE VNVDYNASSE TLRCEAPRWF PQPTVVWASQ    180
IDQGANFSEV SNTSFELNSE NVTMKVVSVL YNATINNTYS CMIENDIAKA TGDIKVTESE    240
I                                                                    241
(SEQ ID NO：66)或
MKPLTSRIIS IIIILAGAIA LIIGFGISGR HSITVTTVAS AGNIGEDGIL SCTFEPDIKL    60
SDIVIQWLKE GVLGLVHEFK EGKDELSEQD EMFRGRTAVF ADQVIVGNAS LRLKNVQLTD    120
AGTYKCYIIT SKGKGNANLE YKTGAFSMPE VNVDYNASSE TLRCEAPRWF PQPTVVWASQ    180
IDQGANFSEV SNTSFELNSE NVTMKVVSVL YNATINNTYS CMIENDIAKA TGDIKVTESE    240
IKRRSHLQLL NSKAS                                                     255
(SEQ ID NO：67)。
成熟蛋白质中的信号序列将被去除。此外，在制造期间还可使用来自其它多肽或生物体的信号肽增进宿主对融合蛋白的分泌。
SEQ ID NO：68提供了不含信号序列的黑猩猩氨基酸序列SEQ ID NO：65：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQIDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNA TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RS                       222
(SEQ ID NO：68)。
SEQ ID NO：69提供了不含信号序列的黑猩猩氨基酸序列SEQ ID NO：66：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQIDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNA TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEI                            218
(SEQ ID NO：69)。
SEQ ID NO：70提供了不含信号序列的黑猩猩氨基酸序列SEQ ID NO：67：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQIDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNA TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK AS            232
(SEQ ID NO：70)。
第一融合搭配物可与以下恒河猴氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRS                                                            249
(SEQ ID NO：71)、
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEI                                                                245
(SEQ ID NO：72)或
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKAS                                                 259
(SEQ ID NO：73)。
成熟蛋白质中的信号序列将被去除。此外，在制造期间还可使用来自其它多肽或生物体的信号肽增进宿主对融合蛋白的分泌。
SEQ ID NO：74提供了不含信号序列的恒河猴氨基酸序列SEQ ID NO：71：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RS                       222
(SEQ ID NO：74)。
SEQ ID NO：75提供了不含信号序列的恒河猴氨基酸序列SEQ ID NO：72：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEI                            218
(SEQ ID NO：75)。
SEQ ID NO：76提供了不含信号序列的恒河猴氨基酸序列SEQ ID NO：73：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK AS            232
(SEQ ID NO：76)。
第一融合搭配物可与以下食蟹猴氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRS                                                            249
(SEQ ID NO：77)、
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP     60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEI                                                                245
(SEQ ID NO：78)或
MASLGQILFW SIISIIFILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVIGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESE IKRRSH LQLLNSKAS                                                259
(SEQ ID NO：79)。
成熟蛋白质中的信号序列将被去除。此外，在制造期间还可使用来自其它多肽或生物体的信号肽增进宿主对融合蛋白的分泌。
SEQ ID NO：80提供了不含信号序列的食蟹猴氨基酸序列SEQ ID NO：77：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RS                       222
(SEQ ID NO：80)。
SEQ ID NO：81提供了不含信号序列的食蟹猴氨基酸序列SEQ ID NO：78：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEI                            218
(SEQ ID NO：81)。
SEQ ID NO：82提供了不含信号序列的食蟹猴氨基酸序列SEQ ID NO：79：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK AS            232
(SEQ ID NO：82)。
在其它实施例中，最后的丙氨酸和丝氨酸残基从SEQ ID NO：67、70、73、76、79和82去除。
在另一实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括黑猩猩B7-H4的IgV结构域。在另一实施例中，IgV结构域至少包括SEQ ID NO：15的52位半胱氨酸到SEQ ID NO：15的126位半胱氨酸。在另一实施例中，IgV结构域含有所述多肽由此氨基酸范围界定的至少25个或50个氨基酸的片段。
第一融合搭配物可与以下示范性IgV结构域的以下黑猩猩氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVN                                                            129
(SEQ ID NO：83)。
在另一实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括恒河猴B7-H4的IgV结构域。在一个实施例中，IgV结构域至少包括SEQ ID NO：17的56位半胱氨酸到SEQ ID NO：17的130位半胱氨酸。在另一实施例中，IgV结构域含有所述多肽由此氨基酸范围界定的至少25个或50个氨基酸的片段。
第一融合蛋白可与以下示范性IgV结构域的恒河猴氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVN                                                            129
(SEQ ID NO：84)。
在另一实施例中，融合蛋白的第一融合搭配物包括食蟹猴B7-H4的IgV结构域。在一个实施例中，IgV结构域至少包括SEQ ID NO：19的56位半胱氨酸到SEQ ID NO：19的130位半胱氨酸。在另一实施例中，IgV结构域含有所述多肽由此氨基酸范围界定的至少25个或50个氨基酸的片段。
第一融合蛋白可与以下示范性IgV结构域的食蟹猴氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVI GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVN                                                            129
(SEQ ID NO：85)。
d.B7-H4细胞外结构域片段
B7-H4细胞外结构域可含有信号肽的一个或一个以上氨基酸或B7-H4的假定跨膜结构域。在分泌期间，裂解的信号肽的氨基酸的数量可视表达系统和宿主而变化。此外，C末端或N末端失去一个或一个以上氨基酸并且保持结合B7-H4受体的能力的B7-H4细胞外结构域的片段可用作所揭示的融合蛋白的融合搭配物。
举例来说，可用作第一融合搭配物的适合的鼠类B7-H4片段包括(但不限于)以下各片段：
SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的32-257、32-256、32-255、32-254、32-253、32-252、32-251、32-250、32-249、31-257、31-256、31-255、31-254、31-253、31-252、31-251、31-250、31-249、30-257、30-256、30-255、30-254、30-253、30-252、30-251、30-250、30-249、29-257、29-256、29-255、29-254、29-253、29-252、29-251、29-250、29-249、28-257、28-256、28-255、28-254、28-253、28-252、28-251、28-250、28-249、27-257、27-256、27-255、27-254、27-253、27-252、27-251、27-250、27-249、26-257、26-256、26-255、26-254、26-253、26-252、26-251、26-250、26-249、25-257、25-256、25-255、25-254、25-253、25-252、25-251、25-250、25-249、24-257、24-256、24-255、24-254、24-253、24-252、24-251、24-250、24-249，或
SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的24-249、24-248、24-247、24-246、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241、23-249、23-248、23-247、23-246、23-245、23-244、23-243、23-242、23-241、22-249、22-248、22-247、22-246、22-245、22-244、22-243、22-242、22-241、21-249、21-248、21-247、21-246、21-245、21-244、21-243、21-242、21-241、20-249、20-248、20-247、20-246、20-245、20-244、20-243、20-242、20-241、19-249、19-248、19-247、19-246、19-245、19-244、19-243、19-242、19-241、18-249、18-248、18-247、18-246、18-245、18-244、18-243、18-242、18-241、17-249、17-248、17-247、17-246、17-245、17-244、17-243、17-242、17-241、16-249、16-248、16-247、16-246、16-245、16-244、16-243、16-242、16-241。
其它适合的鼠类B7-H4片段包括(但不限于)以下各片段：
SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的28-257、28-258、28-259、28-260、28-261、28-262、28-263、29-257、29-258、29-259、29-260、29-261、29-262、29-263、30-257、30-258、30-259、30-260、30-261、30-262、30-263、31-257、31-258、31-259、31-260、31-261、31-262、31-263、32-257、32-258、32-259、32-260、32-261、32-262、32-263，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。信号肽可为本文中揭示的任一者，包括SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19内所含者，或者可为此项技术中已知的任何信号肽。
其它适合的鼠类B7-H4片段包括(但不限于)含有SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33中所述IgV结构域的至少25、20、75、100或125个氨基酸的片段。示范性片段包括(但不限于)：
SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的16-144、16-145、16-146、16-147、16-148、16-149、16-150、16-151、16-152、17-144、17-145、17-146、17-147、17-148、17-149、17-150、17-151、17-152、18-144、18-145、18-146、18-147、18-148、18-149、18-150、18-151、18-152、19-144、19-145、19-146、19-147、19-148、19-149、19-150、19-151、19-152、20-144、20-145、20-146、20-147、20-148、20-149、20-150、20-151、20-152、21-144、21-145、21-146、21-147、21-148、21-149、21-150、21-151、21-152、22-144、22-145、22-146、22-147、22-148、22-149、22-150、22-151、22-152、23-144、23-145、23-146、23-147、23-148、23-149、23-150、23-151、23-152、24-144、24-145、24-146、24-147、24-148、24-149、24-150、24-151、24-152，或
SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的24-152、24-153、24-154、24-155、24-156、24-157、24-158、24-159、24-160、25-152、25-153、25-154、25-155、25-156、25-157、25-158、25-159、25-160、26-152、26-153、26-154、26-155、26-156、26-157、26-158、26-159、26-160、27-152、27-153、27-154、27-155、27-156、27-157、27-158、27-159、27-160、28-152、28-153、28-154、28-155、28-156、28-157、28-158、28-159、28-160、29-152、29-153、29-154、29-155、29-156、29-157、29-158、29-159、29-160、30-152、30-153、30-154、30-155、30-156、30-157、30-158、30-159、30-160、31-152、31-153、31-154、31-155、31-156、31-157、31-158、31-159、31-160、32-152、32-153、32-154、32-155、32-156、32-157、32-158、32-159、32-160，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。信号肽可为本文中揭示的任一者，包括SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19内所含者，或者可为此项技术中已知的任何信号肽。
可用作第一融合搭配物的示范性适合的人类B7-H4片段包括(但不限于)以下各片段：
SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52的32-249、32-248、32-247、32-246、32-245、32-244、32-243、32-242、32-241、31-249、31-248、31-247、31-246、31-245、31-244、31-243、31-242、31-241、30-249、30-248、30-247、30-246、30-245、30-244、30-243、30-242、30-241、29-249、29-248、29-247、29-246、29-245、29-244、29-243、29-242、29-241、28-249、28-248、28-247、28-246、28-245、28-244、28-243、28-242、28-241、27-249、27-248、27-247、27-246、27-245、27-244、27-243、27-242、27-241、26-249、26-248、26-247、26-246、26-245、26-244、26-243、26-242、26-241、25-249、25-248、25-247、25-246、25-245、25-244、25-243、25-242、25-241、24-249、24-248、24-247、24-246、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241，或
SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：53的32-245、32-244、32-243、32-242、32-241、32-240、32-239、32-238、32-237、31-245、31-244、31-243、31-242、31-241、31-240、31-239、31-238、31-237、30-245、30-244、30-243、30-242、30-241、30-240、30-239、30-238、30-237、29-245、29-244、29-243、29-242、29-241、29-240、29-239、29-238、29-237、28-245、28-244、28-243、28-242、28-241、28-240、28-239、28-238、28-237、27-245、27-244、27-243、27-242、27-241、27-240、27-239、27-238、27-237、26-245、26-244、26-243、26-242、26-241、26-240、26-239、26-238、26-237、25-245、25-244、25-243、25-242、25-241、25-240、25-239、25-238、25-237、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241、24-240、24-239、24-238、24-237，或
SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54的32-259、32-258、32-257、32-256、32-255、32-254、32-253、32-252、32-251、31-259、31-258、31-257、31-256、31-255、31-254、31-253、31-252、31-251、30-259、30-258、30-257、30-256、30-255、30-254、30-253、30-252、30-251、29-259、29-258、29-257、29-256、29-255、29-254、29-253、29-252、29-251、28-259、28-258、28-257、28-256、28-255、28-254、28-253、28-252、28-251、27-259、27-258、27-257、27-256、27-255、27-254、27-253、27-252、27-251、26-259、26-258、26-257、26-256、26-255、26-254、26-253、26-252、26-251、25-259、25-258、25-257、25-256、25-255、25-254、25-253、25-252、25-251、24-259、24-258、24-257、24-256、24-255、24-254、24-253、24-252、24-251，或
SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：46的24-241、24-240、24-239、24-238、24-237、24-236、24-235、24-234、24-233、23-241、23-240、23-239、23-238、23-237、23-236、23-235、23-234、23-233、22-241、22-240、22-239、22-238、22-237、22-236、22-235、22-234、22-233、21-241、21-240、21-239、21-238、21-237、21-236、21-235、21-234、21-233、20-241、20-240、20-239、20-238、20-237、20-236、20-235、20-234、20-233、19-241、19-240、19-239、19-238、19-237、19-236、19-235、19-234、19-233、18-241、18-240、18-239、18-238、18-237、18-236、18-235、18-234、18-233、17-241、17-240、17-239、17-238、17-237、17-236、17-235、17-234、17-233、16-241、16-240、16-239、16-238、16-237、16-236、16-235、16-234、16-233，或
SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：47的24-237、24-236、24-235、24-234、24-233、24-232、24-231、24-230、24-229、23-237、23-236、23-235、23-234、23-233、23-232、23-231、23-230、23-229、22-237、22-236、22-235、22-234、22-233、22-232、22-231、22-230、22-229、21-237、21-236、21-235、21-234、21-233、21-232、21-231、21-230、21-229、20-237、20-236、20-235、20-234、20-233、20-232、20-231、20-230、20-229、19-237、19-236、19-235、19-234、19-233、19-232、19-231、19-230、19-229、18-237、18-236、18-235、18-234、18-233、18-232、18-231、18-230、18-229、17-237、17-236、17-235、17-234、17-233、17-232、17-231、17-230、17-229、16-237、16-236、16-235、16-234、16-233、16-232、16-231、16-230、16-229，或
SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：48的24-251、24-250、24-249、24-248、24-247、24-246、24-245、24-244、24-243、23-251、23-250、23-249、23-248、23-247、23-246、23-245、23-244、23-243、22-251、22-250、22-249、22-248、22-247、22-246、22-245、22-244、22-243、21-251、21-250、21-249、21-248、21-247、21-246、21-245、21-244、21-243、20-251、20-250、20-249、20-248、20-247、20-246、20-245、20-244、20-243、19-251、19-250、19-249、19-248、19-247、19-246、19-245、19-244、19-243、18-251、18-250、18-249、18-248、18-247、18-246、18-245、18-244、18-243、17-251、17-250、17-249、17-248、17-247、17-246、17-245、17-244、17-243、16-251、16-250、16-249、16-248、16-247、16-246、16-245、16-244、16-243。
其它适合的人类B7-H4片段包括(但不限于)以下各片段：
SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12的27-249、27-250、27-251、27-252、27-253、27-254、27-255、27-256、27-257、27-259、27-260、
28-249、28-250、28-251、28-252、28-253、28-254、28-255、28-256、28-257、28-259、28-260、
29-249、29-250、29-251、29-252、29-253、29-254、29-255、29-256、29-257、29-259、29-260、
30-249、30-250、30-251、30-252、30-253、30-254、30-255、30-256、30-257、30-259、30-260、
31-249、31-250、31-251、31-252、31-253、31-254、31-255、31-256、31-257、31-259、31-260、
32-249、32-250、32-251、32-252、32-253、32-254、32-255、32-256、32-257、32-259、32-260，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。信号肽可为本文中揭示的任一者，包括SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19内所含者，或者可为此项技术中已知的任何信号肽。
其它适合的人类B7-H4片段包括(但不限于)含有SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64中所述IgV结构域的至少25、20、75、100或125个氨基酸的片段。示范性片段包括(但不限于)：
SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48中任一者的16-144、16-145、16-146、16-147、16-148、16-149、16-150、16-151、16-152、17-144、17-145、17-146、17-147、17-148、17-149、17-150、17-151、17-152、18-144、18-145、18-146、18-147、18-148、18-149、18-150、18-151、18-152、19-144、19-145、19-146、19-147、19-148、19-149、19-150、19-151、19-152、20-144、20-145、20-146、20-147、20-148、20-149、20-150、20-151、20-152、21-144、21-145、21-146、21-147、21-148、21-149、21-150、21-151、21-152、22-144、22-145、22-146、22-147、22-148、22-149、22-150、22-151、22-152、23-144、23-145、23-146、23-147、23-148、23-149、23-150、23-151、23-152、24-144、24-145、24-146、24-147、24-148、24-149、24-150、24-151、24-152，或
SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54中任一者的24-152、24-153、24-154、24-155、24-156、24-157、24-158、24-159、24-160、25-152、25-153、25-154、25-155、25-156、25-157、25-158、25-159、25-160、26-152、26-153、26-154、26-155、26-156、26-157、26-158、26-159、26-160、27-152、27-153、27-154、27-155、27-156、27-157、27-158、27-159、27-160、28-152、28-153、28-154、28-155、28-156、28-157、28-158、28-159、28-160、29-152、29-153、29-154、29-155、29-156、29-157、29-158、29-159、29-160、30-152、30-153、30-154、30-155、30-156、30-157、30-158、30-159、30-160、31-152、31-153、31-154、31-155、31-156、31-157、31-158、31-159、31-160、32-152、32-153、32-154、32-155、32-156、32-157、32-158、32-159、32-160，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。信号肽可为本文中揭示的任一者，包括SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19内所含者，或者可为此项技术中已知的任何信号肽。
可用作第一融合搭配物的示范性适合的非人类灵长类动物B7-H4片段包括(但不限于)以下各片段：
SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：77的32-249、32-248、32-247、32-246、32-245、32-244、32-243、32-242、32-241、31-249、31-248、31-247、31-246、31-245、31-244、31-243、31-242、31-241、30-249、30-248、30-247、30-246、30-245、30-244、30-243、30-242、30-241、29-249、29-248、29-247、29-246、29-245、29-244、29-243、29-242、29-241、28-249、28-248、28-247、28-246、28-245、28-244、28-243、28-242、28-241、27-249、27-248、27-247、27-246、27-245、27-244、27-243、27-242、27-241、26-249、26-248、26-247、26-246、26-245、26-244、26-243、26-242、26-241、25-249、25-248、25-247、25-246、25-245、25-244、25-243、25-242、25-241、24-249、24-248、24-247、24-246、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241，或
SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78的32-245、32-244、32-243、32-242、32-241、32-240、32-239、32-238、32-237、31-245、31-244、31-243、31-242、31-241、31-240、31-239、31-238、31-237、30-245、30-244、30-243、30-242、30-241、30-240、30-239、30-238、30-237、29-245、29-244、29-243、29-242、29-241、29-240、29-239、29-238、29-237、28-245、28-244、28-243、28-242、28-241、28-240、28-239、28-238、28-237、27-245、27-244、27-243、27-242、27-241、27-240、27-239、27-238、27-237、26-245、26-244、26-243、26-242、26-241、26-240、26-239、26-238、26-237、25-245、25-244、25-243、25-242、25-241、25-240、25-239、25-238、25-237、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241、24-240、24-239、24-238、24-237，或
SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：79的32-259、32-258、32-257、32-256、32-255、32-254、32-253、32-252、32-251、31-259、31-258、31-257、31-256、31-255、31-254、31-253、31-252、31-251、30-259、30-258、30-257、30-256、30-255、30-254、30-253、30-252、30-251、29-259、29-258、29-257、29-256、29-255、29-254、29-253、29-252、29-251、28-259、28-258、28-257、28-256、28-255、28-254、28-253、28-252、28-251、27-259、27-258、27-257、27-256、27-255、27-254、27-253、27-252、27-251、26-259、26-258、26-257、26-256、26-255、26-254、26-253、26-252、26-251、25-259、25-258、25-257、25-256、25-255、25-254、25-253、25-252、25-251、24-259、24-258、24-257、24-256、24-255、24-254、24-253、24-252、24-251，或
SEQ ID NO：65的28-245、28-244、28-243、28-242、28-241、28-240、28-239、28-238、28-237、27-245、27-244、27-243、27-242、27-241、27-240、27-239、27-238、27-237、26-245、26-244、26-243、26-242、26-241、26-240、26-239、26-238、26-237、25-245、25-244、25-243、25-242、25-241、25-240、25-239、25-238、25-237、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241、24-240、24-239、24-238、24-237、23-245、23-244、23-243、23-242、23-241、23-240、23-239、23-238、23-237、22-245、22-244、22-243、22-242、22-241、22-240、22-239、22-238、22-237、21-245、21-244、21-243、21-242、21-241、21-240、21-239、21-238、21-237、20-245、20-244、20-243、20-242、20-241、20-240、20-239、20-238、20-237，或
SEQ ID NO：66的28-241、28-240、28-239、28-238、28-237、28-236、28-235、28-234、28-233、27-241、27-240、27-239、27-238、27-237、27-236、27-235、27-234、27-233、26-241、26-240、26-239、26-238、26-237、26-236、26-235、26-234、26-233、25-241、25-240、25-239、25-238、25-237、25-236、25-235、25-234、25-233、24-241、24-240、24-239、24-238、24-237、24-236、24-235、24-234、24-233、23-241、23-240、23-239、23-238、23-237、23-236、23-235、23-234、23-233、22-241、22-240、22-239、22-238、22-237、22-236、22-235、22-234、22-233、21-241、21-240、21-239、21-238、21-237、21-236、21-235、21-234、21-233、20-241、20-240、20-239、20-238、20-237、20-236、20-235、20-234、20-233，或
SEQ ID NO：67的28-255、28-254、28-253、28-252、28-251、28-250、28-249、28-248、28-247、27-255、27-254、27-253、27-252、27-251、27-250、27-249、27-248、27-247、26-255、26-254、26-253、26-252、26-251、26-250、26-249、26-248、26-247、25-255、25-254、25-253、25-252、25-251、25-250、25-249、25-248、25-247、24-255、24-254、24-253、24-252、24-251、24-250、24-249、24-248、24-247、23-255、23-254、23-253、23-252、23-251、23-250、23-249、23-248、23-247、22-255、22-254、22-253、22-252、22-251、22-250、22-249、22-248、22-247、21-255、21-254、21-253、21-252、21-251、21-250、21-249、21-248、21-247、20-255、20-254、20-253、20-252、20-251、20-250、20-249、20-248、20-247。
其它适合的非人类灵长类动物B7-H4片段包括(但不限于)以下各片段：
SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19的27-249、27-250、27-251、27-252、27-253、27-254、27-255、27-256、27-257、27-259、27-260、
28-249、28-250、28-251、28-252、28-253、28-254、28-255、28-256、28-257、28-259、28-260、
29-249、29-250、29-251、29-252、29-253、29-254、29-255、29-256、29-257、29-259、29-260、
30-249、30-250、30-251、30-252、30-253、30-254、30-255、30-256、30-257、30-259、30-260、
31-249、31-250、31-251、31-252、31-253、31-254、31-255、31-256、31-257、31-259、31-260、
32-249、32-250、32-251、32-252、32-253、32-254、32-255、32-256、32-257、32-259、32-260，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。信号肽可为本文中揭示的任一者，包括SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19内所含者，或者可为此项技术中已知的任何信号肽。
其它适合的非人类灵长类动物B7-H4片段包括(但不限于)以下各片段：
SEQ ID NO：15的23-245、23-246、23-247、23-248、23-249、23-250、23-251、23-252、23-253、23-254、23-255、
24-245、24-246、24-247、24-248、24-249、24-250、24-251、24-252、24-253、24-254、24-255、
25-245、25-246、25-247、25-248、25-249、25-250、25-251、25-252、25-253、25-254、25-255、
26-245、26-246、26-247、26-248、26-249、26-250、26-251、26-252、26-253、26-254、26-255、
27-245、27-246、27-247、27-248、27-249、27-250、27-251、27-252、27-253、27-254、27-255、
28-245、28-246、28-247、28-248、28-249、28-250、28-251、28-252、28-253、28-254、28-255，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。信号肽可为本文中揭示的任一者，包括SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19内所含者，或者可为此项技术中已知的任何信号肽。
其它适合的非人类灵长类动物B7-H4片段包括(但不限于)含有SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85中所述IgV结构域的至少25、20、75、100或125个氨基酸的片段。示范性片段包括(但不限于)：
SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67中任一者的20-148、20-149、20-150、20-151、20-152、20-153、20-154、20-155、20-156、21-148、21-149、21-150、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、21-156、22-148、22-149、22-150、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、22-156、23-148、23-149、23-150、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、23-156、24-148、24-149、24-150、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、20-156、25-148、25-149、25-150、25-151、25-152、25-153、25-154、25-155、25-156、26-148、26-149、26-150、26-151、26-152、26-153、26-154、26-155、26-156、27-148、27-149、27-150、27-151、27-152、27-153、27-154、27-155、27-156、28-148、28-149、28-150、28-151、28-152、28-153、28-154、28-155、28-156，或
SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：79中任一者的24-152、24-153、24-154、24-155、24-156、24-157、24-158、24-159、24-160、25-152、25-153、25-154、25-155、25-156、25-157、25-158、25-159、25-160、26-152、26-153、26-154、26-155、26-156、26-157、26-158、26-159、26-160、27-152、27-153、27-154、27-155、27-156、27-157、27-158、27-159、27-160、28-152、28-153、28-154、28-155、28-156、28-157、28-158、28-159、28-160、29-152、29-153、29-154、29-155、29-156、29-157、29-158、29-159、29-160、30-152、30-153、30-154、30-155、30-156、30-157、30-158、30-159、30-160、31-152、31-153、31-154、31-155、31-156、31-157、31-158、31-159、31-160、32-152、32-153、32-154、32-155、32-156、32-157、32-158、32-159、32-160，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。信号肽可为本文中揭示的任一者，包括SEQ ID NO：2、3、5、6、9、10、12、13、15、17和19内所含者，或者可为此项技术中已知的任何信号肽。
2.B7-H4多肽变异体
有用的变异体包括由本文所述任一分析法指示增加生物活性或者增加蛋白质半衰期或稳定性的变异体。B7-H4多肽和B7-H4片段，或其具有B7-H4活性的融合物可经过工程改造以增加生物活性。在一个优选实施例中，已经用至少一个增加分子与免疫细胞(例如T细胞)的结合并将抑制信号传输到T细胞中的氨基酸取代、缺失或插入来修饰B7-H4多肽或融合蛋白。
其它优选的变异体是工程改造成相对于其它免疫细胞选择性结合于一种类型的T细胞的B7-H4多肽。举例来说，B7-H4多肽可经过工程改造以优先结合于Treg、ThO、Th1、Th17或Th22细胞。优先结合是指与一种类型的细胞的结合比与另一种类型的细胞的结合高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。
B7-H4的其它变异体可工程改造成与免疫细胞的结合低于野生型B7-H4。这些变异体可与具有较强结合性质的变异体组合使用，以适度的影响调节免疫应答。
最后，变异的B7-H4多肽可工程改造成具有比野生型长的半衰期。这些变异体通常经过修饰以抵抗酶降解作用。示范性修饰包括抵抗酶降解作用的经过修饰的氨基酸残基和经过修饰的肽键。此项技术中已知实现此目的的各种修饰。举例来说，B7-H4的近膜区包括二碱性基元KRRS，其可潜在地被例如蛋白酶的蛋白原转化酶家族成员识别并裂解。此基元(KRRS)可被去除以增加半衰期。这些变异体可经过修饰以调整在血清和内体pH下与受体的亲和力对B7-H4多肽、其片段或融合物的半衰期的影响。
B.第二多肽
B7-H4多肽可与第二多肽融合。第二多肽的存在可改变B7-H4融合多肽的溶解性、稳定性、亲和力和/或价态。本文中使用的“价态”是指每一分子可用的结合位点的数量。在一个实施例中，第二多肽是来自不同来源或不同蛋白质的多肽。
在一个实施例中，第二多肽含有免疫球蛋白重链恒定区的一个或一个以上结构域，优选具有对应于人类免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、CH2区和CH3区或对应于鼠类免疫球蛋白Cγ2a链的铰链区、CH2区和CH3区的氨基酸序列。SEQ ID NO：88和89提供了人类免疫球蛋白Cγ1的铰链区、CH2区和CH3区的示范性序列。
在一种优选的二聚融合蛋白中，所述二聚体由两个Ig重链的铰链区中Cys残基共价键接产生，所述Cys残基是在二聚化正常Ig重链中以二硫键连接的相同Cys残基。所述蛋白质称为B7-H4-Ig。
在一个实施例中，免疫球蛋白恒定结构域可含有一个或一个以上增强B7-H4多肽、其融合蛋白或片段与特定细胞类型的结合、增加其生物利用率或增加其稳定性的氨基酸插入、缺失或取代。适合的氨基酸取代包括保守性和非保守性取代，如上文所述。
在另一实施例中，第二多肽可具有可使其它分子结合于B7-H4融合蛋白的连结结构域(conjugation domain)。在一个此类实施例中，连结的分子能够使融合蛋白靶向特定器官或组织。在另一此类实施例中，连结的分子是可增强或加强B7-H4融合蛋白的作用的另一免疫调节剂。在另一实施例中，连结的分子是聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)。
融合蛋白的Fc部分可随同种型或亚类而变化，可为嵌合或杂交的，和/或可经过修饰例如以改进效应功能、半衰期的控制、组织可接近性，加强生物物理特性(例如稳定性)并改进生产效率(且降低成本)。可用于构建所揭示的融合蛋白的许多修饰以及其制备方法是此项技术中已知的，参看例如穆勒(Mueller)等人，分子免疫学(Mol Immun.)，34(6)：441-452(1997)；许旺(Swann)等人，免疫学当代视点(Cur.Opin.Immun.)，20：493-499(2008)；和普雷斯塔(Presta)，免疫学当代视点，20：460-470(2008)。在一些实施例中，Fc区是原生IgG1、IgG2或IgG4Fc区。在一些实施例中，Fc区是杂交区，例如由IgG2/IgG4Fc恒定区组成的嵌合区。Fc区修饰包括(但不限于)经修饰以防止结合于Fcγ受体和补体的IgG4；经修饰以改进与一种或一种以上Fcγ受体的结合的IgG1；经修饰以使效应功能(氨基酸变化)最少的IgG1；具有改变的/无聚糖(通常通过改变表达宿主)的IgG1；以及具有改变的与FcRn的pH依赖性结合的IgG1。Fc区可包括完整铰链区，或不完整铰链区。
用利妥昔单抗(rituximab)(针对CD20的嵌合小鼠/人类IgG1单克隆抗体)治疗非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)或瓦尔登史特姆氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)患者的治疗成果与个体对与人类IgG1的Fc结构域具有不同固有亲和力的Fcγ受体等位基因变异体的表达有关。具体说来，具有低亲和力活化Fc受体CD16A的高亲和力等位基因(FcγRIIIA)的患者显示出较高的应答率，并且在非霍奇金氏淋巴瘤的情况下显示出提高的无发展存活率。在另一实施例中，Fc结构域可含有一个或一个以上减少与低亲和力抑制性Fc受体CD32B(FcγRIIB)结合并保持与低亲和力活化Fc受体CD16A(FcγRIIIA)结合的野生型水平或增进与低亲和力活化Fc受体CD16A(FcγRIIIA)结合的氨基酸插入、缺失或取代。
另一实施例包括与FcR的结合减少且半衰期增加的IgG2-4杂交物和IgG4突变体。代表性IG2-4杂交物和IgG4突变体描述于安格S.(Angal，S.)等人，分子免疫学(Molecular Immunology)，30(1)：105-108(1993)；穆勒J.(Mueller，J.)等人，分子免疫学，34(6)：441-452(1997)；以及颁予王(Wang)等人的美国专利第6,982,323号中。在一些实施例中，例如缺失IgG1和/或IgG2结构域，安格等人描述IgG1和IgG2的丝氨酸241被脯氨酸置换。
在一个优选实施例中，Fc结构域含有增强与CD16A的结合的氨基酸插入、缺失或取代。人类IgG1Fc结构域中增加与CD16A的结合并减少与CD32B的结合的大量取代是此项技术中已知的，并描述于斯塔文哈根(Stavenhagen)等人，癌症研究(Cancer Res.)，57(18)：8882-90(2007)中。与CD32B的结合减少和/或与CD16A的结合增加的示范性人类IgG1Fc结构域变异体含有F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可在人类IgG1Fc结构域中以任何组合形式存在。在一个实施例中，人类IgG1Fc结构域变异体含有F243L、R929P和Y300L取代。在另一实施例中，人类IgG1Fc结构域变异体含有F243L、R929P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一实施例中，人类IgG1Fc结构域变异体含有N297Q取代，而此突变消除了FcR结合。
C.肽或多肽连接子结构域
所揭示的B7-H4融合蛋白任选含有使B7-H4多肽与第二多肽分离的肽或多肽连接子结构域。
1.抗体的铰链区
在一个实施例中，连接子结构域含有免疫球蛋白铰链区。在一个优选实施例中，铰链区源自于人类免疫球蛋白。可获得铰链的适合的人类免疫球蛋白包括IgG、IgD和IgA。在一个优选实施例中，铰链区源自于人类IgG。此项技术中众所周知免疫球蛋白铰链区和其它结构域的氨基酸序列。
在一个实施例中，B7-H4融合多肽含有由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核酸编码的人类免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、CH2区和CH3区：
gagcctaagt catgtgacaa gacccatacg tgcccaccct gtcccgctcc agaactgctg    60
gggggaccta gcgttttctt gttcccccca aagcccaagg acaccctcat gatctcacgg    120
actcccgaag taacatgcgt agtagtcgac gtgagccacg aggatcctga agtgaagttt    180
aattggtacg tggacggagt cgaggtgcat aatgccaaaa ctaaacctcg ggaggagcag    240
tataacagta cctaccgcgt ggtatccgtc ttgacagtgc tccaccagga ctggctgaat    300
ggtaaggagt ataaatgcaa ggtcagcaac aaagctcttc ccgccccaat tgaaaagact    360
atcagcaagg ccaagggaca accccgcgag ccccaggttt acacccttcc accttcacga    420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtctctg acttgtctgg tcaaaggttt ctatccttcc    480
gacatcgcag tggagtggga gtcaaacggg cagcctgaga ataactacaa gaccacaccc    540
ccagtgcttg atagcgatgg gagctttttc ctctacagta agctgactgt ggacaaatcc    600
cgctggcagc agggaaacgt tttctcttgt agcgtcatgc atgaggccct ccacaaccat    660
tatactcaga aaagcctgag tctgagtccc ggcaaa                              696
(SEQ ID NO：86)或
gacaagaccc atacgtgccc accctgtccc gctccagaac tgctgggggg acctagcgtt    60
ttcttgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctcatgatct cacggactcc cgaagtaaca    120
tgcgtagtag tcgacgtgag ccacgaggat cctgaagtga agtttaattg gtacgtggac    180
ggagtcgagg tgcataatgc caaaactaaa cctcgggagg agcagtataa cagtacctac    240
cgcgtggtat ccgtcttgac agtgctccac caggactggc tgaatggtaa ggagtataaa    300
tgcaaggtca gcaacaaagc tcttcccgcc ccaattgaaa agactatcag caaggccaag    360
ggacaacccc gcgagcccca ggtttacacc cttccacctt cacgagacga gctgaccaag    420
aaccaggtgt ctctgacttg tctggtcaaa ggtttctatc cttccgacat cgcagtggag    480
tgggagtcaa acgggcagcc tgagaataac tacaagacca cacccccagt gcttgatagc    540
gatgggagct ttttcctcta cagtaagctg actgtggaca aatcccgctg gcagcaggga    600
aacgttttct cttgtagcgt catgcatgag gccctccaca accattatac tcagaaaagc    660
ctgagtctga gtcccggcaa a                                              681
(SEQ ID NO：87)。
由SEQ ID NO：86编码的人类免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、CH2区和CH3区具有以下氨基酸序列：
EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF    60
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT    120
ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP    180
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK            232
(SEQ ID NO：88)。
由SEQ ID NO：87编码的人类免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、CH2区和CH3区具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD    60
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK    120
GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS    180
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK                  227
(SEQ ID NO：89)。
铰链可进一步缩短成去除SEQ ID NO：89的氨基酸1、2、3、4、5或其组合。在一个实施例中，SEQ ID NO：89的氨基酸1和2缺失。
在另一实施例中，B7-H4融合多肽含有由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核酸编码的鼠类免疫球蛋白Cγ2a链的铰链区、CH2区和CH3区：
gagccaagag gtcctacgat caagccctgc ccgccttgta aatgcccagc tccaaatttg    60
ctgggtggac cgtcagtctt tatcttcccg ccaaagataa aggacgtctt gatgattagt    120
ctgagcccca tcgtgacatg cgttgtggtg gatgtttcag aggatgaccc cgacgtgcaa    180
atcagttggt tcgttaacaa cgtggaggtg cataccgctc aaacccagac ccacagagag    240
gattataaca gcaccctgcg ggtagtgtcc gccctgccga tccagcatca ggattggatg    300
agcgggaaag agttcaagtg taaggtaaac aacaaagatc tgccagcgcc gattgaacga    360
accattagca agccgaaagg gagcgtgcgc gcacctcagg tttacgtcct tcctccacca    420
gaagaggaga tgacgaaaaa gcaggtgacc ctgacatgca tggtaactga ctttatgcca    480
gaagatattt acgtggaatg gactaataac ggaaagacag agctcaatta caagaacact    540
gagcctgttc tggattctga tggcagctac tttatgtact ccaaattgag ggtcgagaag    600
aagaattggg tcgagagaaa cagttatagt tgctcagtgg tgcatgaggg cctccataat    660
catcacacca caaagtcctt cagccgaacg cccgggaaa                           699
(SEQ ID NO：90)。
由SEQ ID NO：90编码的鼠类免疫球蛋白Cγ2a链的铰链区、CH2区和CH3区具有以下氨基酸序列：
EPRGPTIKPC PPCKCPAPNL LGGPSVFIFP PKIKDVLMIS LSPIVTCVVV DVSEDDPDVQ    60
ISWFVNNVEV HTAQTQTHRE DYNSTLRVVS ALPIQHQDWM SGKEFKCKVN NKDLPAPIER    120
TISKPKGSVR APQVYVLPPP EEEMTKKQVT LTCMVTDFMP EDIYVEWTNN GKTELNYKNT    180
EPVLDSDGSY FMYSKLRVEK KNWVERNSYS CSVVHEGLHN HHTTKSFSRT PGK           233
(SEQ ID NO：91)
在另一实施例中，连接子结构域含有如上文所述的免疫球蛋白铰链区，并且进一步包括一个或一个以上额外的免疫球蛋白结构域。
2.其它肽/多肽连接子结构域
其它适合的肽/多肽连接子结构域包括天然存在或非天然存在的肽或多肽。肽连接子序列为至少2个氨基酸长。优选肽或多肽结构域为柔性肽或多肽。“柔性连接子”在本文中是指含有两个或两个以上由肽键连接的氨基酸残基的肽或多肽，柔性连接子使两个以此方式连接的多肽的旋转自由度高于在柔性连接子不存在下两个连接的多肽的旋转自由度。此种旋转自由度使得由柔性连接子连接的两个或两个以上抗原结合位点各自更有效地接近目标抗原。示范性柔性肽/多肽包括(但不限于)氨基酸序列Gly-Ser、Gly-Ser-Gly-Ser(SEQ ID NO：92)、Ala-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：93)、(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：94)和(Gly4-Ser)4(SEQ ID NO：95)。此项技术中众所周知其它的柔性肽/多肽序列。
D.二聚、多聚和靶向结构域
本文中揭示的融合蛋白任选含有用以使两种或两种以上融合蛋白二聚或多聚的二聚或多聚结构域。用以使融合蛋白二聚或多聚的结构域可为独立结构域，或者可包含在融合蛋白其它结构域(B7-H4多肽、第二多肽或肽/多肽连接子结构域)中的一者内。
 1.二聚结构域
“二聚结构域”是由至少两个氨基酸残基或至少两个肽或多肽(其可具有相同或不同的氨基酸序列)缔合形成。所述肽或多肽彼此可通过共价和/或非共价缔合相互作用。优选二聚结构域含有至少一个半胱氨酸，其能够与搭配物融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键。二聚结构域可含有一个或一个以上半胱氨酸残基，以致二硫键可形成于搭配物融合蛋白之间。在一个实施例中，二聚结构域含有1、2或3个到约10个半胱氨酸残基。在一个优选实施例中，二聚结构域是免疫球蛋白铰链区。
其它示范性二聚结构域可为此项技术中已知的任何结构域，并且包括(但不限于)卷曲螺旋、酸片(acid patch)、锌指、钙手(calcium hand)、CH1-CL对、与工程改造的“鼓起(knob)”和/或“突起(protruberance)”的“界面(interface)”(如美国专利第5,821,333号中所述)、亮氨酸拉链(例如来自jun和/或fos)(美国专利第5,932,448号)、SH2(src同系物2)、SH3(src同系物3)(韦德尔(Vidal)等人，生物化学(Biochemistry)，43，7336-44((2004))、磷酸酪氨酸结合(phosphotyrosine binding，PTB)(周(Zhou)等人，自然(Nature)，378：584-592(1995))、WW(苏朵(Sudol)，生物物理学与分子生物学进展(Prog.Biochys.MolBio.)，65：113-132(1996))、PDZ(金(Kim)等人，自然(Nature)，378：85-88(1995)；科曼(Komau)等人，科学(Science)，269：1737-1740(1995))14-3-3、WD40(胡(Hu)等人，生物化学杂志(J Biol Chem.)，273，33489-33494(1998))EH、Lim、异亮氨酸拉链、受体二聚体对(例如白细胞介素-8受体(IL-8R)；和整合素(integrin)杂二聚体，例如LFA-1和GPIIIb/IIIa)或其二聚区域、二聚配体多肽(例如神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT-3)、白细胞介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)(阿卡瓦(Arakawa)等人，生物化学杂志，269(45)：27833-27839(1994)和雷德结瓦斯基(Radziejewski)等人，生物化学(Biochem.)，32(48)：1350(1993))，并且也可为这些结构域的亲和力改变的变异体。多肽对可借助此项技术中已知的方法(包括酵母双杂交筛选法)鉴别。酵母双杂交筛选法描述于美国专利第5,283,173号和第6,562,576号中。一对相互作用结构域之间的亲和力可使用此项技术中已知的方法确定，包括如片平(Katahira)等人，生物化学杂志，227，9242-9246(2002))中所述的方法。或者，可例如使用WO 01/00814中所述的方法，针对杂二聚化筛选肽序列文库。适用于蛋白质-蛋白质相互作用的方法也描述于美国专利第6,790,624号中。
2.多聚结构域
“多聚结构域”是使三个或三个以上肽或多肽彼此通过共价和/或非共价缔合相互作用的结构域。适合的多聚结构域包括(但不限于)卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋是通常在组装(折叠)形成多聚螺旋束的7个氨基酸(七肽重复区)或11个氨基酸(十一肽重复区)的序列中具有主要疏水性残基间隔3和4个残基的邻近模式的肽序列。也涵盖序列包括具有3和4个残基间隔的一些不规则分布的卷曲螺旋。疏水性残基尤其是疏水性氨基酸Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe和Trp。“主要疏水性”意指至少50％的残基必须选自所提到的疏水性氨基酸。
卷曲螺旋结构域可来源于层粘连蛋白(laminin)。在细胞外空间中，杂三聚的卷曲螺旋蛋白层粘连蛋白在基底膜形成中起到重要作用。很明显，多官能寡聚结构是层粘连蛋白的功能所必需的。卷曲螺旋结构域也可来源于三个(TSP-1和TSP-2)或五个(TSP-3、TSP-4和TSP-5)链连接的凝血栓蛋白(thrombospondin)，或来源于COMP(COMPcc)(郭(Guo)等人，欧洲分子生物学学会会刊(EMBO J.)，1998，17：5265-5272)，其折叠成平行的五条链的卷曲螺旋(马拉斯科维奇(Malashkevich)等人，科学(Science)，274：761-765(1996))。
来源于其它蛋白质的其它卷曲螺旋结构域以及介导多肽多聚作用的其它结构域是此项技术中已知的，并且适用于所揭示的融合蛋白。
在另一实施例中，B7-H4多肽、其融合蛋白或片段可经过诱导以结合于第二多价多肽(例如抗体)形成多聚体。适用于使B7-H4多肽、其融合蛋白或片段多聚的抗体包括(但不限于)IgM抗体和交联的多价IgG、IgA、IgD或IgE复合物。
3.靶向结构域
B7-H4多肽和融合蛋白可含有靶向结构域以使分子靶向体内特定部位。优选的靶向结构域使分子靶向炎症区域。示范性靶向结构域是对发炎组织或包括(但不限于)IL17、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-22和IL-23的促炎性细胞因子具有特异性的抗体或其抗原结合片段。在例如多发性硬化等神经病症的情况下，靶向结构域可使分子靶向CNS，或可结合于血管上皮上的VCAM-1。其它靶向结构域可为对促炎性分子具有特异性的肽适体。在其它实施例中，B7-H4融合蛋白可包括对例如T细胞等免疫细胞表面上呈现的多肽具有特异性的结合搭配物。在其它实施例中，靶向结构域特异性靶向活化的免疫细胞。优选作为目标的免疫细胞包括Th0、Th1、Th17和Th22T细胞；分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP和Treg的发炎性分子的其它细胞。举例来说，针对Treg的靶向结构域可特异性结合CD25。
E.示范性融合蛋白
代表性鼠类B7-H4融合蛋白是由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核酸编码：
atggcttcct tggggcagat catcttttgg agtattatta acatcatcat catcctggct    60
ggggccatcg cactcatcat tggctttggc atttcaggca agcacttcat cacggtcacg    120
accttcacct cagctggaaa cattggagag gacgggaccc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tcaacggcat cgtcatccag tggctgaaag aaggcatcaa aggtttggtc    240
cacgagttca aagaaggcaa agacgacctc tcacagcagc atgagatgtt cagaggccgc    300
acagcagtgt ttgctgatca ggtggtagtt ggcaatgctt ccctgagact gaaaaacgtg    360
cagctcacgg atgctggcac ctacacatgt tacatccgca cctcaaaagg caaagggaat    420
gcaaaccttg agtataagac cggagccttc agtatgccag agataaatgt ggactataat    480
gccagttcag agagtttacg ctgcgaggct cctcggtggt tcccccagcc cacagtggcc    540
tgggcatctc aagtcgacca aggagccaat ttctcagaag tctccaacac cagctttgag    600
ttgaactctg agaatgtgac catgaaggtc gtatctgtgc tctacaatgt cacaatcaac    660
aacacatact cctgtatgat tgaaaacgac attgccaaag ccaccgggga catcaaagtg    720
acagattcag aggtcaaaag gcgaagtcag ctgcagttgc tgaactctgg ggagccaaga    780
ggtcctacga tcaagccctg cccgccttgt aaatgcccag ctccaaattt gctgggtgga    840
ccgtcagtct ttatcttccc gccaaagata aaggacgtct tgatgattag tctgagcccc    900
atcgtgacat gcgttgtggt ggatgtttca gaggatgacc ccgacgtgca aatcagttgg    960
ttcgttaaca acgtggaggt gcataccgct caaacccaga cccacagaga ggattataac    1020
agcaccctgc gggtagtgtc cgccctgccg atccagcatc aggattggat gagcgggaaa    1080
gagttcaagt gtaaggtaaa caacaaagat ctgccagcgc cgattgaacg aaccattagc    1140
aagccgaaag ggagcgtgcg cgcacctcag gtttacgtcc ttcctccacc agaagaggag    1200
atgacgaaaa agcaggtgac cctgacatgc atggtaactg actttatgcc agaagatatt    1260
tacgtggaat ggactaataa cggaaagaca gagctcaatt acaagaacac tgagcctgtt    1320
ctggattctg atggcagcta ctttatgtac tccaaattga gggtcgagaa gaagaattgg    1380
gtcgagagaa acagttatag ttgctcagtg gtgcatgagg gcctccataa tcatcacacc    1440
acaaagtcct tcagccgaac gcccgggaaa                                     1470
(SEQ ID NO：96)、
atggagtggt catgggtttt tctgttcttt cttagcgtga ctacaggcgt ccattcagga    60
ttcggcataa gcggcaagca cttcatcaca gttacaacgt ttacaagtgc ggggaacatt    120
ggggaagatg gaacattgtc atgtacattt gagccagata tcaaactcaa tggaatagta    180
attcagtggc ttaaggaggg catcaagggc ctggtccacg aatttaagga ggggaaagac    240
gatctgtctc agcagcacga gatgttcagg ggcagaaccg ccgtcttcgc agaccaggtt    300
gtggtaggca acgccagttt gcggctgaaa aacgtgcagc tgactgacgc cggcacctac    360
acatgctata tccggtcctc taagggcaag gggaacgcta atctcgagta caaaacaggc    420
gccttttcta tgccagagat caacgtggac tataacgcaa gctctgaaag tctgagatgc    480
gaggcgccaa ggtggttccc tcagcccacc gtcgcgtggg cttcccaggt ggatcaaggc    540
gccaactttt ctgaggtttc taacaccagc ttcgaactga acagcgaaaa tgtgacaatg    600
aaggtagtca gcgttctgta taacgtgacc atcaacaata cttactcctg tatgatagaa    660
aatgatatag ccaaggctac aggagatatt aaagtgacgg attcagaagt gaaaaggagg    720
agtcaactgc aactcttgaa tagcggcgag ccaagaggtc ctacgatcaa gccctgcccg    780
ccttgtaaat gcccagctcc aaatttgctg ggtggaccgt cagtctttat cttcccgcca    840
aagataaagg acgtcttgat gattagtctg agccccatcg tgacatgcgt tgtggtggat    900
gtttcagagg atgaccccga cgtgcaaatc agttggttcg ttaacaacgt ggaggtgcat    960
accgctcaaa cccagaccca cagagaggat tataacagca ccctgcgggt agtgtccgcc    1020
ctgccgatcc agcatcagga ttggatgagc gggaaagagt tcaagtgtaa ggtaaacaac    1080
aaagatctgc cagcgccgat tgaacgaacc attagcaagc cgaaagggag cgtgcgcgca    1140
cctcaggttt acgtccttcc tccaccagaa gaggagatga cgaaaaagca ggtgaccctg    1200
acatgcatgg taactgactt tatgccagaa gatatttacg tggaatggac taataacgga    1260
aagacagagc tcaattacaa gaacactgag cctgttctgg attctgatgg cagctacttt    1320
atgtactcca aattgagggt cgagaagaag aattgggtcg agagaaacag ttatagttgc    1380
tcagtggtgc atgagggcct ccataatcat cacaccacaa agtccttcag ccgaacgccc    1440
gggaaa                                                               1446
(SEQ ID NO：97)或
atggagtggt catgggtttt tctgttcttt cttagcgtga ctacaggcgt ccattcagga    60
ttcggcataa gcggcaagca cttcatcaca gttacaacgt ttacaagtgc ggggaacatt    120
ggggaagatg gaacattgtc atgtacattt gagccagata tcaaactcaa tggaatagta    180
attcagtggc ttaaggaggg catcaagggc ctggtccacg aatttaagga ggggaaagac    240
gatctgtctc agcagcacga gatgttcagg ggcagaaccg ccgtcttcgc agaccaggtt    300
gtggtaggca acgccagttt gcggctgaaa aacgtgcagc tgactgacgc cggcacctac    360
acatgctata tccggacctc taagggcaag gggaacgcta atctcgagta caaaacaggc    420
gccttttcta tgccagagat caacgtggac tataacgcaa gctctgaaag tctgagatgc    480
gaggcgccaa ggtggttccc tcagcccacc gtcgcgtggg cttcccaggt ggatcaaggc    540
gccaactttt ctgaggtttc taacaccagc ttcgaactga acagcgaaaa tgtgacaatg    600
aaggtagtca gcgttctgta taacgtgacc atcaacaata cttactcctg tatgatagaa    660
aatgatatag ccaaggctac aggagatatt aaagtgacgg attcagaagt gaaaaggagg    720
agtcaactgc aactcttgaa tagcggcgag ccaagaggtc ctacgatcaa gccctgcccg    780
ccttgtaaat gcccagctcc aaatttgctg ggtggaccgt cagtctttat cttcccgcca    840
aagataaagg acgtcttgat gattagtctg agccccatcg tgacatgcgt tgtggtggat    900
gtttcagagg atgaccccga cgtgcaaatc agttggttcg ttaacaacgt ggaggtgcat    960
accgctcaaa cccagaccca cagagaggat tataacagca ccctgcgggt agtgtccgcc   1020
ctgccgatcc agcatcagga ttggatgagc gggaaagagt tcaagtgtaa ggtaaacaac   1080
aaagatctgc cagcgccgat tgaacgaacc attagcaagc cgaaagggag cgtgcgcgca   1140
cctcaggttt acgtccttcctccaccagaa  gaggagatga cgaaaaagca ggtgaccctg   1200
acatgcatgg taactgactt tatgccagaa gatatttacg tggaatggac taataacgga   1260
aagacagagc tcaattacaa gaacactgag cctgttctgg attctgatgg cagctacttt    1320
atgtactcca aattgagggt cgagaagaag aattgggtcg agagaaacag ttatagttgc    1380
tcagtggtgc atgagggcct ccataatcat cacaccacaa agtccttcag ccgaacgccc    1440
gggaaa                                                               1446
(SEQ ID NO：98)
在另一实施例中，代表性鼠类B7-H4融合蛋白与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MASLGQIIFW SIINIIIILA GAIALIIGFG ISGKHFITVT TFTSAGNIGE DGTLSCTFEP    60
DIKLNGIVIQ WLKEGIKGLV HEFKEGKDDL SQQHEMFRGR TAVFADQVVV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYTC YIRSSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEINVDYN ASSESLRCEA PRWFPQPTVA    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TDSEVKRRSQ LQLLNSGEPR GPTIKPCPPC KCPAPNLLGG PSVFIFPPKI KDVLMISLSP    300
IVTCVVVDVS EDDPDVQISW FVNNVEVHTA QTQTHREDYN STLRVVSALP IQHQDWMSGK    360
EFKCKVNNKD LPAPIERTIS KPKGSVRAPQ VYVLPPPEEE MTKKQVTLTC MVTDFMPEDI    420
YVEWTNNGKT ELNYKNTEPV LDSDGSYFMY SKLRVEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHT    480
TKSFSRTPGK                                                           490
(SEQ ID NO：99)、
MASLGQIIFW SIINIIIILA GAIALIIGFG ISGKHFITVT TFTSAGNIGE DGTLSCTFEP    60
DIKLNGIVIQ WLKEGIKGLV HEFKEGKDDL SQQHEMFRGR TAVFADQVVV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYTC YIRTSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEINVDYN ASSESLRCEA PRWFPQPTVA    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TDSEVKRRSQ LQLLNSGEPR GPTIKPCPPC KCPAPNLLGG PSVFIFPPKI KDVLMISLSP    300
IVTCVVVDVS EDDPDVQISW FVNNVEVHTA QTQTHREDYN STLRVVSALP IQHQDWMSGK    360
EFKCKVNNKD LPAPIERTIS KPKGSVRAPQ VYVLPPPEEE MTKKQVTLTC MVTDFMPEDI    420
YVEWTNNGKT ELNYKNTEPV LDSDGSYFMY SKLRVEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHT    480
TKSFSRTPGK                                                           490
(SEQ ID NO：100)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGKHFIT VTTFTSAGNI GEDGTLSCTF EPDIKLNGIV    60
IQWLKEGIKG LVHEFKEGKD DLSQQHEMFR GRTAVFADQV VVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
TCYIRSSKGK GNANLEYKTG AFSMPEINVD YNASSESLRC EAPRWFPQPT VAWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTDSEVKRR    240
SQLQLLNSGE PRGPTIKPCP PCKCPAPNLL GGPSVFIFPP KIKDVLMISL SPIVTCVVVD    300
VSEDDPDVQI SWFVNNVEVH TAQTQTHRED YNSTLRVVSA LPIQHQDWMS GKEFKCKVNN    360
KDLPAPIERT ISKPKGSVRA PQVYVLPPPE EEMTKKQVTL TCMVTDFMPE DIYVEWTNNG    420
KTELNYKNTE PVLDSDGSYF MYSKLRVEKK NWVERNSYSC SVVHEGLHNH HTTKSFSRTP    480
GK                                                                   482
(SEQ ID NO：101)或
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGKHFIT VTTFTSAGNI GEDGTLSCTF EPDIKLNGIV    6D
IQWLKEGIKG LVHEFKEGKD DLSQQHEMFR GRTAVFADQV VVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
TCYIRTSKGK GNANLEYKTG AFSMPEINVD YNASSESLRC EAPRWFPQPT VAWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTDSEVKRR    240
SQLQLLNSGE PRGPTIKPCP PCKCPAPNLL GGPSVFIFPP KIKDVLMISL SPIVTCVVVD    300
VSEDDPDVQI SWFVNNVEVH TAQTQTHRED YNSTLRVVSA LPIQHQDWMS GKEFKCKVNN    360
KDLPAPIERT ISKPKGSVRA PQVYVLPPPE EEMTKKQVTL TCMVTDFMPE DIYVEWTNNG    420
KTELNYKNTE PVLDSDGSYF MYSKLRVEKK NWVERNSYSC SVVHEGLHNH HTTKSFSRTP    480
GK                                                                   482
(SEQ ID NO：102)。
不含信号序列的鼠类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：101的氨基酸序列为：
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRSSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEINV DYNASSESLR CEAPRWFPQP TVAWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTDSEVKR RSQLQLLNSG EPRGPTIKPC    240
PPCKCPAPNL LGGPSVFIFP PKIKDVLMIS LSPIVTCVVV DVSEDDPDVQ ISWFVNNVEV    300
HTAQTQTHRE DYNSTLRVVS ALPIQHQDWM SGKEFKCKVN NKDLPAPIER TISKPKGSVR    360
APQVYVLPPP EEEMTKKQVT LTCMVTDFMP EDIYVEWTNN GKTELNYKNT EPVLDSDGSY    420
FMYSKLRVEK KNWVERNSYS CSVVHEGLHN HHTTKSFSRT PGK                      463
(SEQ ID NO：103)。
不含信号序列的鼠类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：102的氨基酸序列为：
GFGISGKHFI TVTTFTSAGN IGEDGTLSCT FEPDIKLNGI VIQWLKEGIK GLVHEFKEGK    60
DDLSQQHEMF RGRTAVFADQ VVVGNASLRL KNVQLTDAGT YTCYIRTSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEINV DYNASSESLR CEAPRWFPQP TVAWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTDSEVKR RSQLQLLNSG EPRGPTIKPC    240
PPCKCPAPNL LGGPSVFIFP PKIKDVLMIS LSPIVTCVVV DVSEDDPDVQ ISWFVNNVEV    300
HTAQTQTHRE DYNSTLRVVS ALPIQHQDWM SGKEFKCKVN NKDLPAPIER TISKPKGSVR    360
APQVYVLPPP EEEMTKKQVT LTCMVTDFMP EDIYVEWTNN GKTELNYKNT EPVLDSDGSY    420
FMYSKLRVEK KNWVERNSYS CSVVHEGLHN HHTTKSFSRT PGK                      463
(SEQ ID NO：104)。
代表性人类B7-H4融合蛋白是由与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性的核酸编码：
atggcttccc tggggcagat cctcttctgg agcataatta gcatcatcat tattctggct    60
ggagcaattg cactcatcat tggctttggt atttcaggga gacactccat cacagtcact    120
actgtcgcct cagctgggaa cattggggag gatggaatcc tgagctgcac ttttgaacct    180
gacatcaaac tttctgatat cgtgatacaa tggctgaagg aaggtgtttt aggcttggtc    240
catgagttca aagaaggcaa agatgagctg tcggagcagg atgaaatgtt cagaggccgg    300
acagcagtgt ttgctgatca agtgatagtt ggcaatgcct ctttgcggct gaaaaacgtg    360
caactcacag atgctggcac ctacaaatgt tatatcatca cttctaaagg caaggggaat    420
gctaaccttg agtataaaac tggagccttc agcatgccgg aagtgaatgt ggactataat    480
gccagctcag agaccttgcg gtgtgaggct ccccgatggt tcccccagcc cacagtggtc   540
tgggcatccc aagttgacca gggagccaac ttctcggaag tctccaatac cagctttgag   600
ctgaactctg agaatgtgac catgaaggtt gtgtctgtgc tctacaatgt tacgatcaac   660
aacacatact cctgtatgat tgaaaatgac attgccaaag caacagggga tatcaaagtg   720
acagaatcgg agatcaaaag gcggagtgag cctaagtcat gtgacaagac ccatacgtgc   780
ccaccctgtc ccgctccaga actgctgggg ggacctagcg ttttcttgtt ccccccaaag   840
cccaaggaca ccctcatgat ctcacggact cccgaagtaa catgcgtagt agtcgacgtg   900
agccacgagg atcctgaagt gaagtttaat tggtacgtgg acggagtcga ggtgcataat   960
gccaaaacta aacctcggga ggagcagtat aacagtacct accgcgtggt atccgtcttg  1020
acagtgctcc accaggactg gctgaatggt aaggagtata aatgcaaggt cagcaacaaa  1080
gctcttcccg ccccaattga aaagactatc agcaaggcca agggacaacc ccgcgagccc  1140
caggtttaca cccttccacc ttcacgagac gagctgacca agaaccaggt gtctctgact  1200
tgtctggtca aaggtttcta tccttccgac atcgcagtgg agtgggagtc aaacgggcag  1260
cctgagaata actacaagac cacaccccca gtgcttgata gcgatgggag ctttttcctc  1320
tacagtaagc tgactgtgga caaatcccgc tggcagcagg gaaacgtttt ctcttgtagc  1380
gtcatgcatg aggccctcca caaccattat actcagaaaa gcctgagtct gagtcccggc  1440
aaa                                                                1443
(SEQ ID NO：105)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata   120
ggtgaggatg gcatccagtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg   180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat   240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta   300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat   360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc   420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt   480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg   540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg   600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa   660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg   720
tctgagccta agtcatgtga caagacccat acgtgcccac cctgtcccgc tccagaactg   780
ctggggggac ctagcgtttt cttgttcccc ccaaagccca aggacaccct catgatctca   840
cggactcccg aagtaacatg cgtagtagtc gacgtgagcc acgaggatcc tgaagtgaag   900
tttaattggt acgtggacgg agtcgaggtg cataatgcca aaactaaacc tcgggaggag   960
cagtataaca gtacctaccg cgtggtatcc gtcttgacag tgctccacca ggactggctg  1020
aatggtaagg agtataaatg caaggtcagc aacaaagctc ttcccgcccc aattgaaaag  1080
actatcagca aggccaaggg acaaccccgc gagccccagg tttacaccct tccaccttca  1140
cgagacgagc tgaccaagaa ccaggtgtct ctgacttgtc tggtcaaagg tttctatcct  1200
tccgacatcg cagtggagtg ggagtcaaac gggcagcctg agaataacta caagaccaca  1260
cccccagtgc ttgatagcga tgggagcttt ttcctctaca gtaagctgac tgtggacaaa  1320
tcccgctggc agcagggaaa cgttttctct tgtagcgtca tgcatgaggc cctccacaac  1380
cattatactc agaaaagcct gagtctgagt cccggcaaa                         1419
(SEQ ID NO：106)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatccagtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tctgacaaga cccatacgtg cccaccctgt cccgctccag aactgctggg gggacctagc    780
gttttcttgt tccccccaaa gcccaaggac accctcatga tctcacggac tcccgaagta    840
acatgcgtag tagtcgacgt gagccacgag gatcctgaag tgaagtttaa ttggtacgtg    900
gacggagtcg aggtgcataa tgccaaaact aaacctcggg aggagcagta taacagtacc    960
taccgcgtgg tatccgtctt gacagtgctc caccaggact ggctgaatgg taaggagtat   1020
aaatgcaagg tcagcaacaa agctcttccc gccccaattg aaaagactat cagcaaggcc   1080
aagggacaac cccgcgagcc ccaggtttac acccttccac cttcacgaga cgagctgacc   1140
aagaaccagg tgtctctgac ttgtctggtc aaaggtttct atccttccga catcgcagtg   1200
gagtgggagt caaacgggca gcctgagaat aactacaaga ccacaccccc agtgcttgat   1260
agcgatggga gctttttcct ctacagtaag ctgactgtgg acaaatcccg ctggcagcag   1320
ggaaacgttt tctcttgtag cgtcatgcat gaggccctcc acaaccatta tactcagaaa   1380
agcctgagtc tgagtcccgg caaa                                          1404
(SEQ ID NO：107)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatccagtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat cgacaagacc    720
catacgtgcc caccctgtcc cgctccagaa ctgctggggg gacctagcgt tttcttgttc    780
cccccaaagc ccaaggacac cctcatgatc tcacggactc ccgaagtaac atgcgtagta    840
gtcgacgtga gccacgagga tcctgaagtg aagtttaatt ggtacgtgga cggagtcgag    900
gtgcataatg ccaaaactaa acctcgggag gagcagtata acagtaccta ccgcgtggta    960
tccgtcttga cagtgctcca ccaggactgg ctgaatggta aggagtataa atgcaaggtc   1020
agcaacaaag ctcttcccgc cccaattgaa aagactatca gcaaggccaa gggacaaccc   1080
cgcgagcccc aggtttacac ccttccacct tcacgagacg agctgaccaa gaaccaggtg   1140
tctctgactt gtctggtcaa aggtttctat ccttccgaca tcgcagtgga gtgggagtca   1200
aacgggcagc ctgagaataa ctacaagacc acacccccag tgcttgatag cgatgggagc   1260
tttttcctct acagtaagct gactgtggac aaatcccgct ggcagcaggg aaacgttttc   1320
tcttgtagcg tcatgcatga ggccctccac aaccattata ctcagaaaag cctgagtctg   1380
agtcccggca aa                                                       1392
(SEQ ID NO：108)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatccagtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tctcacctgc agctgctgaa ctccaaggac aagacccata cgtgcccacc ctgtcccgct    780
ccagaactgc tggggggacc tagcgttttc ttgttccccc caaagcccaa ggacaccctc    840
atgatctcac ggactcccga agtaacatgc gtagtagtcg acgtgagcca cgaggatcct    900
gaagtgaagt ttaattggta cgtggacgga gtcgaggtgc ataatgccaa aactaaacct    960
cgggaggagc agtataacag tacctaccgc gtggtatccg tcttgacagt gctccaccag   1020
gactggctga atggtaagga gtataaatgc aaggtcagca acaaagctct tcccgcccca   1080
attgaaaaga ctatcagcaa ggccaaggga caaccccgcg agccccaggt ttacaccctt   1140
ccaccttcac gagacgagct gaccaagaac caggtgtctc tgacttgtct ggtcaaaggt   1200
ttctatcctt ccgacatcgc agtggagtgg gagtcaaacg ggcagcctga gaataactac   1260
aagaccacac ccccagtgct tgatagcgat gggagctttt tcctctacag taagctgact   1320
gtggacaaat cccgctggca gcagggaaac gttttctctt gtagcgtcat gcatgaggcc   1380
ctccacaacc attatactca gaaaagcctg agtctgagtc ccggcaaa                1428
(SEQ ID NO：109)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatcctgtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tctgagccta agtcatgtga caagacccat acgtgcccac cctgtcccgc tccagaactg    780
ctggggggac ctagcgtttt cttgttcccc ccaaagccca aggacaccct catgatctca    840
cggactcccg aagtaacatg cgtagtagtc gacgtgagcc acgaggatcc tgaagtgaag    900
tttaattggt acgtggacgg agtcgaggtg cataatgcca aaactaaacc tcgggaggag    960
cagtataaca gtacctaccg cgtggtatcc gtcttgacag tgctccacca ggactggctg   1020
aatggtaagg agtataaatg caaggtcagc aacaaagctc ttcccgcccc aattgaaaag   1080
actatcagca aggccaaggg acaaccccgc gagccccagg tttacaccct tccaccttca  1140
cgagacgagc tgaccaagaa ccaggtgtct ctgacttgtc tggtcaaagg tttctatcct  1200
tccgacatcg cagtggagtg ggagtcaaac gggcagcctg agaataacta caagaccaca  1260
cccccagtgc ttgatagcga tgggagcttt ttcctctaca gtaagctgac tgtggacaaa  1320
tcccgctggc agcagggaaa cgttttctct tgtagcgtca tgcatgaggc cctccacaac  1380
cattatactc agaaaagcct gagtctgagt cccggcaaa                         1419
(SEQ ID NO：110)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatcctgtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tctgacaaga cccatacgtg cccaccctgt cccgctccag aactgctggg gggacctagc    780
gttttcttgt tccccccaaa gcccaaggac accctcatga tctcacggac tcccgaagta    840
acatgcgtag tagtcgacgt gagccacgag gatcctgaag tgaagtttaa ttggtacgtg    900
gacggagtcg aggtgcataa tgccaaaact aaacctcggg aggagcagta taacagtacc    960
taccgcgtgg tatccgtctt gacagtgctc caccaggact ggctgaatgg taaggagtat   1020
aaatgcaagg tcagcaacaa agctcttccc gccccaattg aaaagactat cagcaaggcc   1080
aagggacaac cccgcgagcc ccaggtttac acccttccac cttcacgaga cgagctgacc   1140
aagaaccagg tgtctctgac ttgtctggtc aaaggtttct atccttccga catcgcagtg   1200
gagtgggagt caaacgggca gcctgagaat aactacaaga ccacaccccc agtgcttgat   1260
agcgatggga gctttttcct ctacagtaag ctgactgtgg acaaatcccg ctggcagcag   1320
ggaaacgttt tctcttgtag cgtcatgcat gaggccctcc acaaccatta tactcagaaa   1380
agcctgagtc tgagtcccgg caaa                                          1404
(SEQ ID NO：111)、
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatcctgtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat cgacaagacc    720
catacgtgcc caccctgtcc cgctccagaa ctgctggggg gacctagcgt tttcttgttc    780
cccccaaagc ccaaggacac cctcatgatc tcacggactc ccgaagtaac atgcgtagta    840
gtcgacgtga gccacgagga tcctgaagtg aagtttaatt ggtacgtgga cggagtcgag    900
gtgcataatg ccaaaactaa acctcgggag gagcagtata acagtaccta ccgcgtggta    960
tccgtcttga cagtgctcca ccaggactgg ctgaatggta aggagtataa atgcaaggtc    1020
agcaacaaag ctcttcccgc cccaattgaa aagactatca gcaaggccaa gggacaaccc    1080
cgcgagcccc aggtttacac ccttccacct tcacgagacg agctgaccaa gaaccaggtg    1140
tctctgactt gtctggtcaa aggtttctat ccttccgaca tcgcagtgga gtgggagtca    1200
aacgggcagc ctgagaataa ctacaagacc acacccccag tgcttgatag cgatgggagc    1260
tttttcctct acagtaagct gactgtggac aaatcccgct ggcagcaggg aaacgttttc    1320
tcttgtagcg tcatgcatga ggccctccac aaccattata ctcagaaaag cctgagtctg    1380
agtcccggca aa                                                        1392
(SEQ ID NO：112)或
atggaatgga gctgggtatt tctgtttttc ctgtcagtaa cgactggcgt ccattcaggc    60
ttcggcatca gtggacggca cagtatcaca gtgaccaccg tcgcctccgc tggcaatata    120
ggtgaggatg gcatcctgtc ctgtaccttt gagccggaca tcaaactgtc tgacatagtg    180
atacaatggc tgaaggaggg ggtgctcggt ctggtacatg agtttaagga agggaaggat    240
gaactgtccg agcaggatga gatgttccgg gggaggaccg ctgtgttcgc cgatcaggta    300
atcgtcggaa atgcaagtct cagattgaaa aatgtgcaac tgactgatgc tggcacgtat    360
aaatgctaca ttatcacaag taagggcaaa ggaaatgcta accttgagta taaaacaggc    420
gcattctcaa tgcccgaggt caatgtcgac tataatgcca gcagtgaaac attgcgctgt    480
gaagctcccc gctggttccc ccagccaacc gtggtctggg cctctcaggt tgatcagggg    540
gctaactttt ccgaggtgag caacaccagc ttcgaactca actctgagaa tgtgaccatg    600
aaagttgtgt ctgtcctgta taatgtaaca atcaacaaca cttattcatg catgattgaa    660
aacgacatcg ccaaggcaac aggtgatatt aaggtaactg aatccgagat caaacggcgg    720
tctcacctgc agctgctgaa ctccaaggac aagacccata cgtgcccacc ctgtcccgct    780
ccagaactgc tggggggacc tagcgttttc ttgttccccc caaagcccaa ggacaccctc    840
atgatctcac ggactcccga agtaacatgc gtagtagtcg acgtgagcca cgaggatcct    900
gaagtgaagt ttaattggta cgtggacgga gtcgaggtgc ataatgccaa aactaaacct    960
cgggaggagc agtataacag tacctaccgc gtggtatccg tcttgacagt gctccaccag    1020
gactggctga atggtaagga gtataaatgc aaggtcagca acaaagctct tcccgcccca    1080
attgaaaaga ctatcagcaa ggccaaggga caaccccgcg agccccaggt ttacaccctt    1140
ccaccttcac gagacgagct gaccaagaac caggtgtctc tgacttgtct ggtcaaaggt    1200
ttctatcctt ccgacatcgc agtggagtgg gagtcaaacg ggcagcctga gaataactac    1260
aagaccacac ccccagtgct tgatagcgat gggagctttt tcctctacag taagctgact    1320
gtggacaaat cccgctggca gcagggaaac gttttctctt gtagcgtcat gcatgaggcc    1380
ctccacaacc attatactca gaaaagcctg agtctgagtc ccggcaaa                 1428
(SEQ ID NO：113)。
在另一实施例中，代表性人类B7-H4融合蛋白与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKY    240
TESEIKRRSE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV    300
SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK    360
ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ    420
PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG    480
K                                                                    481
(SEQ ID NO：114)。
在另一实施例中，代表性人类B7-H4融合蛋白与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列一致性：
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP    300
EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP    360
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY    420
KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK        476
(SEQ ID NO：115)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF    300
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT    360
ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP    420
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK            472
(SEQ ID NO：116)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGIQSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV    300
VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV    360
SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES    420
NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL    480
SPGK                                                                 484
(SEQ ID NO：117)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV    300
SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK    360
ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ    420
PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG    480
K                                                                    481
(SEQ ID NO：118)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITV TTVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP    300
EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP    360
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY    420
KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK        476
(SEQ ID NO：119)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF    300
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT    360
ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP    420
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK            472
(SEQ ID NO：120)、
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP    60
DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV    120
QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV    180
WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV    240
TESEIKRRSH LQLLNSKDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV    300
VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV    360
SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES    420
NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL    480
SPGK                                                                 484
(SEQ ID NO：121)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
SEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK    300
FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK    360
TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT    420
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK           473
(SEQ ID NO：122)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI
KVTESEIKRR 240
SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV    300
DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA    360
KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD    420
SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK                 468
(SEQ ID NO：123)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIDKT    240
HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE    300
VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP    360
REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS    420
FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK                     464
(SEQ ID NO：124)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGIQSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
SHLQLLNSKD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP    300
EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP    360
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY    420
KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK        476
(SEQ ID NO：125)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
SEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK    300
FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK    360
TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT    420
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK           473
(SEQ ID NO：126)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV    300
DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA    360
KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD    420
SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK                 468
(SEQ ID NO：127)、
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIDKT    240
HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE    300
VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP    360
REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS    420
FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK                     464
(SEQ ID NO：128)或
MEWSWVFLFF LSVTTGVHSG FGISGRHSIT VTTVASAGNI GEDGILSCTF EPDIKLSDIV    60
IQWLKEGVLG LVHEFKEGKD ELSEQDEMFR GRTAVFADQV IVGNASLRLK NVQLTDAGTY    120
KCYIITSKGK GNANLEYKTG AFSMPEVNVD YNASSETLRC EAPRWFPQPT VVWASQVDQG    180
ANFSEVSNTS FELNSENVTM KVVSVLYNVT INNTYSCMIE NDIAKATGDI KVTESEIKRR    240
SHLQLLNSKD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP    300
EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP    360
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY    420
KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK        476
(SEQ ID NO：129)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：122的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSEPKSCDKT HTCPPCPAPE    240
LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE    300
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP    360
SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD    420
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK                                454
(SEQ ID NO：130)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：123的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSDKTHTCPP CPAPELLGGP    240
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS    300
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL    360
TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ    420
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK                                      449
(SEQ ID NO：131)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：124的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL    240
FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV    300
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ    360
VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV    420
FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LS PGK                                         445
(SEQ ID NO：132)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：125的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK DKTHTCPPCP    240
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK    300
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT    360
LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL    420
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK                             457
(SEQ ID NO：133)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：126的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSEPKSCDKT HTCPPCPAPE    240
LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE    300
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP    360
SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD    420
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK                                454
(SEQ ID NO：134)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：127的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSDKTHTCPP CPAPELLGGP    240
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS    300
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL    360
TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ    420
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLS PGK                                     449
(SEQ ID NO：135)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：128的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL    240
FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV    300
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ    360
VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV    420
FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK                                          445
(SEQ ID NO：136)。
不含信号序列的人类B7-H4融合蛋白SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：129的氨基酸序列为：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGILSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK    60
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT    120
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT    180
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSHLQLLNSK DKTHTCPPCP    240
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK    300
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT    360
LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL    420
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLS PGK                            457
(SEQ ID NO：137)。
上述示范性融合蛋白可并入本文所述变异体的任何组合。在另一实施例中，上述示范性融合蛋白的末端赖氨酸缺失。
所揭示的融合蛋白可使用标准分子生物学技术分离。举例来说，将含有编码B7-H4-Ig融合蛋白的DNA序列的表达载体通过磷酸钙沉淀转染到293细胞中并在无血清DMEM中培养。72小时时收集上清液并通过蛋白质G或优选蛋白质A
Figure BDA0000158191410000651
柱(法玛西亚公司(Pharmacia)，位于瑞典乌普萨拉(Uppsala，Sweden))纯化融合蛋白。
F.融合蛋白二聚体和多聚体
B7-H4融合多肽可发生二聚或多聚。二聚或多聚反应可通过二聚或多聚结构域(包括上文所述者)在两种或两种以上融合蛋白之间发生。或者，融合蛋白的二聚或多聚反应可通过化学交联发生。融合蛋白二聚体可为均二聚体或杂二聚体。融合蛋白多聚体可为均多聚体或杂多聚体。
本文揭示的融合蛋白二聚体具有式II：
N-R1-R2-R3-C
N-R4-R5-R6-C
或者具有式III：
N-R1-R2-R3-C
C-R4-R5-R6-N
其中由式II提供的二聚体的融合蛋白是以平行定向定义，且由式III提供的二聚体的融合蛋白是以反平行定向定义。平行和反平行二聚体又分别称为顺式和反式二聚体。“N”和“C”分别表示融合蛋白的N末端和C末端。融合蛋白成分“R1”、“R2”和“R3”如上文关于式I所定义。对于式II和式III，“R4”是B7-H4多肽或第二多肽，“R5”是任选存在的肽/多肽连接子结构域，且“R6”是B7-H4多肽或第二多肽，其中当“R4”是第二多肽时，“R6”是B7-H4多肽，且当“R4”是B7-H4多肽时，“R6”是第二多肽。在一个实施例中，“R1”是B7-H4多肽，“R4”也是B7-H4多肽，且“R3”和“R6”都是第二多肽。
当“R1”＝“R4”、“R2”＝“R5”且“R3”＝“R6”时，式II的融合蛋白二聚体定义为均二聚体。类似地，当“R1”＝“R6”、“R2”＝“R5”且“R3”＝“R4”时，式III的融合蛋白二聚体定义为均二聚体。当这些条件出于任何原因而未得到满足时，融合蛋白二聚体定义为杂二聚体。举例来说，杂二聚体可含有满足这些条件(即，对于根据式II的二聚体，“R1”和“R4”都为B7-H4多肽，“R2”和“R5”都为肽/多肽连接子结构域，且“R3”和“R6”都为第二多肽)的结构域定向，但这些结构域中一者或一者以上的种类不同。举例来说，尽管“R3”和“R6”可都为B7-H4多肽，但一个多肽可含有野生型B7-H4氨基酸序列，而另一多肽可为变异的B7-H4多肽。示范性变异B7-H4多肽是经过修饰而与目标细胞的结合增加或减少、对免疫细胞的活性增加、半衰期或稳定性增加或降低的B7-H4多肽。含有免疫球蛋白CH1或CL区作为多肽连接子结构域一部分的融合蛋白二聚体优选形成杂二聚体，其中二聚体的一个融合蛋白含有CH1区且二聚体的另一融合蛋白含有CL区。
融合蛋白也可用于形成多聚体。与二聚体一样，多聚体可为平行多聚体，其中多聚体的所有融合蛋白都关于其N末端和C末端呈相同定向排列。多聚体可为反平行多聚体，其中多聚体的融合蛋白另外关于其N末端和C末端呈相反定向排列。多聚体(平行或反平行)可为均多聚体或杂多聚体。
G.肽和多肽修饰
融合蛋白可利用可存在于处于正常细胞环境中的多肽中的化学部分来修饰，例如磷酸化、甲基化、酰胺化、硫酸化、酰化、糖基化、小泛素样因子修饰(sumoylation)和泛素化。融合蛋白也可用能够直接或间接提供可检测信号的标记修饰，所述标记包括(但不限于)放射性同位素和荧光化合物。
融合蛋白也可用通常未添加到处于细胞环境的多肽中的化学部分来修饰。举例来说，所揭示的融合蛋白也可通过共价附接聚合物链，包括(但不限于)聚乙二醇聚合物(PEG)链(即聚乙二醇化)来修饰。近来，将大分子连结到PEG已经成为改变多种药物的药物动力学(PK)曲线并由此改进其治疗潜力的有效策略。PEG连结通过防止酶促降解，减慢肾过滤以及减少中和抗体的产生来增加药物在循环中的滞留时间。此外，PEG连结物还可用于使融合蛋白发生多聚作用。
可通过使多肽的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生化剂反应来将修饰引入分子中。另一修饰是蛋白质的环化。
多肽的化学衍生物的实例包括用琥珀酸酐或其它羧酸酐衍生化的赖氨酰基和氨基末端残基。用环状羧酸酐衍生化具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。其它适用于衍生化含氨基残基的试剂包括酰亚胺基酯，例如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯氢硼化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。羧基侧基、天冬氨酰基或谷氨酰基可通过与碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R′)，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺反应来选择性修饰。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基可通过与氨反应而转化成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。融合蛋白也可包括一个或一个以上可取代一个或一个以上L-氨基酸的D-氨基酸。
H.改变的结合性质
B7-H4多肽、其片段和融合物(统称为B7-H4多肽)的结合性质与待投予的剂量和剂量方案有关。在一个实施例中，所揭示的B7-H4多肽具有结合T细胞上至少一种受体的结合性质，对免疫细胞上的受体分子展现出比受体分子的其它配体更高级或更高百分比的占有率。在其它实施例中，所揭示的B7-H4多肽与T细胞上受体的结合亲和力低于野生型B7-H4，使蛋白质在投药后不到3个月、2个月、1个月、3周、2周、1周或数天的时间里解离。
在一些实施例中，B7-H4多肽或者其片段或融合物对其受体具有相对较高的亲和力，并且因此可具有相对较慢的解离速率。在其它实施例中，B7-H4多肽经数天、数周或数月时间间歇性投予以阻止免疫应答，此举允许在下一次投药前恢复免疫应答，可用于减少免疫应答，而不是完全切断免疫应答，并且可避免长期副作用。
III.分离的核酸分子
本文中揭示编码B7-H4多肽、其片段和融合物的分离的核酸序列。适用的鼠类B7-H4核酸与具有基因库寄存编号NM_178594或AY280973的B7-H4核酸具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。适用的人类B7-H4核酸与具有基因库寄存编号AK026071的B7-H4核酸具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。本文中使用的“分离的核酸”是指与哺乳动物基因组中存在的其它核酸分子分离的核酸，所述其它核酸分子包括通常在哺乳动物基因组中侧接所述核酸的一侧或两侧的核酸(例如编码非B7-H4蛋白的核酸)。本文中使用的关于核酸的术语“分离的”也包括与任何非天然存在的核酸序列的组合，因为这些非天然存在的序列未在自然界中发现，并且在天然存在的基因组中不具有直接邻近的序列。
分离的核酸可为例如DNA分子，条件是在天然存在的基因组中通常发现的直接侧接所述DNA分子的一个核酸序列被去除或不存在。因此，分离的核酸包括(不限于)以独立于其它序列的单独分子形式存在的DNA分子(例如化学合成的核酸，或者由PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及并入载体、自主复制的质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)或并入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可包括经过工程改造的核酸，例如作为杂交或融合核酸的一部分的重组DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库或者含有基因组DNA限制性消化物的凝胶切片内的数百到数百万其它核酸间的核酸不能视为分离的核酸。
编码B7-H4融合多肽的核酸可经过优化以在所选表达宿主中表达。密码子可用编码同一氨基酸的替代性密码子取代，以说明获得B7-H4核酸序列的哺乳动物与表达宿主之间密码子用法的差异。按这种方式，可使用表达宿主优选的密码子合成核酸。
核酸可呈有义(sense)或反义定向，或者可与编码B7-H4多肽的参考序列互补。核酸可为DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物的碱基部分、糖部分或磷酸酯主链可经修饰。此种修饰可改进例如核酸的稳定性、杂交性或溶解性。碱基部分的修饰可包括脱氧尿苷(对于脱氧胸苷)和5-甲基-2′-脱氧胞苷或5-溴-2′-脱氧胞苷(对于脱氧胞苷)。糖部分的修饰可包括核糖的2′羟基修饰，由此形成2′-O-甲基或2′-O-烯丙基糖。脱氧核糖磷酸酯主链可经过修饰以产生吗啉基核酸，其中每一碱基部分连接到一个6元吗啉环；或产生肽核酸，其中脱氧磷酸酯主链经假肽(pseudopeptide)主链置换并保留4个碱基。参看例如萨姆顿(Summerton)和维勒(Weller)(1997)反义核酸药物开发(AntisenseNucleic Acid Drug Dev.)7：187-195；和海鲁普(Hyrup)等人(1996)生物有机与药物化学(Bioorgan.Med Chem.)4：5-23。此外，脱氧磷酸酯主链可用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、氨基磷酸酯或烷基磷酸三酯主链置换。
编码多肽的核酸可投予有需要的受试者。核酸传递涉及将“外来”核酸引入细胞中并最终引入活动物中。用于将核酸传递到受试者的组合物和方法是此项技术中已知的(参看基因疗法知识(Understanding Gene Therapy)，乐莫宁N.R.(Lemoine，N.R.)编辑，BIOS科技出版社(BIOS Scientific Publishers)，牛津(Oxford)，2008)。
IV.载体和宿主细胞
也提供编码B7-H4多肽、其片段和融合物的载体。核酸，例如上文所述者，可插入载体中以在细胞中表达。本文中使用的“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体、病毒或柯斯质粒，其中可插入另一DNA区段以引起插入的区段的复制。载体可为表达载体。“表达载体”是包括一个或一个以上表达控制序列的载体，且“表达控制序列”是控制并调控另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。
载体中的核酸可按可操作方式连接到一个或一个以上表达控制序列。本文中使用的“按可操作方式连接”意指并入遗传构建体中以使表达控制序列能有效地控制相关编码序列的表达。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是由通常在转录开始点(一般接近RNA聚合酶II的起始位点)上游100个核苷酸以内的DNA分子区构成的表达控制序列。为了使编码序列处于启动子控制下，需要将多肽翻译阅读框的翻译起始位点定位在启动子下游1与约50个核苷酸之间。增强子在时间、位置和水平方面提供表达特异性。与启动子不同，增强子当位于距转录位点各种距离处时皆可起作用。增强子也可位于转录起始位点下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录到mRNA中，所述mRNA随后可翻译成所述编码序列所编码的蛋白质时，编码序列在细胞中“按可操作方式连接”并且处于表达控制序列的“控制下”。
适合的表达载体包括(不限于)来源于例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus)、疱疹病毒、巨细胞病毒(cytomegalo virus)、逆转录病毒、牛痘病毒(vacciniavirus)、腺病毒和腺相关病毒的质粒和病毒载体。多种载体和表达系统可从例如以下公司购得：诺瓦杰公司(Novagen)(位于威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))、克隆泰克公司(Clontech)(位于加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto，CA))、斯塔杰公司(Stratagene)(位于加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla，CA))和英杰生命技术公司(Invitrogen LifeTechnologies)(位于加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。
表达载体可包括标签序列(tag sequence)。标签序列通常表达成与编码的多肽的融合物的形式。所述标签可插入多肽内的任何位置，包括羧基或氨基末端。适用的标签的实例包括(但不限于)绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、聚组氨酸、c-myc、血凝素、FlagTM标签(柯达公司(Kodak)，位于康乃狄克州纽黑文(New Haven，CT))、麦芽糖E结合蛋白和蛋白质A。在一个实施例中，编码B7-H4融合多肽的核酸分子存在于含有编码Ig重链恒定区的一个或一个以上结构域的核酸的载体中，所述结构域优选具有对应于人类免疫球蛋白Cγ1链铰链区、CH2区和CH3区的氨基酸序列。
含有待表达的核酸的载体可转移到宿主细胞中。术语“宿主细胞”拟包括可引入重组表达载体的原核和真核细胞。本文中使用的“转化”和“转染”涵盖通过多种技术中的一种将核酸分子(例如载体)引入细胞中。尽管不局限于特定技术，但多种所述技术是此项技术中充分确立的。原核细胞可利用核酸通过例如电穿孔法或氯化钙介导的转化法来转化。可通过包括例如磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、电穿孔或显微注射在内的技术将核酸转染到哺乳动物细胞中。宿主细胞(例如原核细胞或真核细胞，例如CHO细胞)可用于例如产生本文所述的B7-H4融合多肽。
所述载体可用于在细胞(例如移植细胞，例如胰岛细胞)中表达B7-H4。示范性载体包括(但不限于)腺病毒载体。一种方法包括将核酸转移到培养的原代细胞中，随后将离体转化的细胞经全身自体移植到宿主中或自体移植到特定器官或组织中。离体方法可包括例如从受试者采集细胞、培养细胞、用表达载体转导细胞以及在适于表达编码的多肽的条件下维持细胞的步骤。这些方法是分子生物学技术中已知的。转导步骤可通过用于离体基因疗法的任何标准方式，包括例如磷酸钙法、脂转染法、电穿孔法、病毒感染法和生物射弹基因转移法(biolistic gene transfer)实现。或者，可使用脂质体或聚合物微粒。接下来，可例如针对编码序列或药物抗性基因的表达来选择成功转导的细胞。接着，可对细胞进行致死性照射(必要时)并注入或植入受试者中。在一个实施例中，将含有编码融合蛋白的核酸的表达载体转染到投予有需要的受试者的细胞中。
体内核酸疗法可通过在体内将功能活性DNA直接转移到哺乳动物体细胞组织或器官中来实现。举例来说，编码本文揭示的多肽的核酸可直接投予淋巴组织或肿瘤。或者，可以使用淋巴组织特异性转录调控元件(transcriptional regulatory element，TRE)，例如B淋巴细胞特异性TRE、T淋巴细胞特异性TRE或树突状细胞特异性TRE，实现淋巴组织特异性靶向。淋巴组织特异性TRE是此项技术中已知的。
核酸也可通过病毒方式在体内投予。此项技术中众所周知，编码融合蛋白的核酸分子可使用产生复制缺陷型逆转录病毒的包装细胞系包装到逆转录病毒载体中。也可使用其它非复制性病毒载体，包括重组腺病毒和牛痘病毒。除裸DNA或RNA或者病毒载体外，经过工程改造的细菌也可用作载体。核酸也可通过其它载体，包括脂质体、聚合物微粒和纳米粒子以及例如脱唾液酸糖蛋白/聚赖氨酸等聚阳离子来传递。
除病毒和载体介导的体内基因转移外，也可使用此项技术中众所周知的物理方式直接转移DNA，包括投予质粒DNA和粒子轰击介导的基因转移。
V.药物组合物
本发明提供包括本文中揭示的B7-H4多肽、片段、融合多肽、核酸和载体的药物组合物。含有肽或多肽的药物组合物可通过肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、透皮(被动或使用离子电渗疗法或电穿孔实现)或透粘膜(鼻、阴道、直肠或舌下)投药途径或使用生物腐蚀性插入物投予，并且可配制成适于每一投药途径的剂型。
在一些体内方法中，本文揭示的组合物是以治疗有效量投予受试者。本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制或减轻所治疗病症的一种或一种以上症状或以其它方式提供所需药理和/或生理作用的剂量。确切剂量将根据例如受试者相关性变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病和实现的治疗等多种因素而变化。
对于本文揭示的多肽组合物以及编码所述多肽组合物的核酸，随着进一步研究的进行，将得出关于适于治疗各种患者的各种病况的剂量的信息，并且所属领域技术人员考虑受体的治疗情况、年龄和一般健康状况将能够确定适宜的给药方案。所选剂量取决于所需治疗效果、投药途径和所需治疗持续时间。对于多肽组合物，一般以每日每公斤体重0.001到20mg的剂量投予哺乳动物。一般说来，对于静脉内注射或输注，剂量可较低。
在某些实施例中，通过例如直接注射到待治疗部位来局部投予多肽组合物。通常，注射使多肽组合物的局部浓度增加，高于通过全身投药所达到的程度。举例来说，在如多发性硬化等神经病症的情况下，可将蛋白质局部投予靠近CNS的部位。多肽组合物可与上述基质组合以通过减少多肽被动扩散到待治疗部位外来帮助产生增加的局部多肽组合物浓度。
A.供肠胃外投药的制剂
在一个优选实施例中，本文揭示的组合物，包括含有肽和多肽者，是以水溶液形式通过肠胃外注射投予。所述制剂也可为悬浮液或乳液的形式。一般说来，提供的药物组合物包括有效量的肽或多肽，并且任选包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。所述组合物任选包括以下一者或一者以上：稀释剂，无菌水、具有各种缓冲剂含量(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲生理盐水；和添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)、TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)和防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和增积物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。制剂可冻干并且在即将使用前再溶解/再悬浮。制剂可通过例如滤过细菌截留过滤器、通过将灭菌剂并入组合物中、通过照射组合物或通过加热组合物来进行灭菌。
B.供表面投药的制剂
本文揭示的融合蛋白可施用于表面。表面投药对于大多数肽制剂来说作用并不理想，但其在施用于肺、鼻、口(舌下、口腔)、阴道或直肠粘膜时特别有效。
组合物可在吸入的同时传递到肺部，并且当传递时以空气动力学直径小于约5微米的气雾剂或喷雾干燥粒子形式横过肺上皮内层进入血流。
可以使用设计用于肺传递治疗产品的多种机械装置，包括(但不限于)雾化器、定剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些装置都是所属领域技术人员熟知的。市售装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林斯科特有限公司(Mallinckrodt Inc.)，位于密苏里州圣路易斯(St.Louis，Mo.))；Acorn II雾化器(马奎斯特医疗产品公司(Marquest MedicalProducts)，位于科罗拉多州恩格尔伍德(Englewood，Colo.))；Ventolin定剂量吸入器(葛兰素有限公司(Glaxo Inc.)，位于北卡罗来纳州三角研究园(Research Triangle Park，N.C.))；和Spinhaler粉末吸入器(费森斯公司(Fisons Corp.)，位于马萨诸塞州贝德福德(Bedford，Mass.))。纳克塔(Nektar)、艾克姆斯(Alkermes)和曼恩凯德(Mannkind)都具有获批准或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中所述技术可适用于本文所述的制剂。
投予粘膜的制剂通常将为喷雾干燥的药物粒子，其可并入片剂、凝胶、胶囊、悬浮液或乳液中。标准药物赋形剂可从任何配方设计师获得。口服制剂可为咀嚼胶、凝胶带、片剂或锭剂的形式。
也可制备透皮制剂。这些制剂通常将为油膏、洗液、喷雾剂或贴片，都可使用标准技术制备。透皮制剂将需要包括渗透增强剂。
C.控制传递聚合物基质
本文揭示的融合蛋白也可以控制释放制剂形式投予。控制释放聚合物装置可制备用于在植入聚合物装置(杆、圆筒、膜、圆盘)或注射(微粒)后长期全身释放。基质可为微粒形式，例如微球，其中肽分散于固体聚合物基质内；或微胶囊，其中核心具有不同于聚合物壳的材料，且肽分散或悬浮于核心(其本质上可为液体或固体)中。除非本文中具体定义，否则微粒、微球和微胶囊可互换使用。或者，聚合物可浇铸为在数纳米到4厘米范围内的薄板或薄膜形式、通过研磨或其它标准技术产生的粉末形式，或甚至是凝胶形式，例如水凝胶。
非生物可降解或生物可降解基质可用于传递融合多肽或编码融合多肽的核酸，但优选生物可降解基质。这些基质可为天然或合成聚合物，但合成聚合物因为降解和释放曲线得到良好表征而成为优选的。聚合物是根据需要释放的时间段来选择。在一些情况下，线性释放可能最有用，但在其它情况下，脉冲释放或“大量释放(bulk release)”可提供更有效的结果。聚合物可为水凝胶形式(通常吸收高达约90重量％水)并且可任选与多价离子或聚合物交联。
基质可通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取和所属领域技术人员已知的其它方法形成。生物腐蚀性微球可使用开发用于制备供药物传递的微球的任何方法制备，例如，如麦索维兹(Mathiowitz)和朗阁(Langer)，控制释放杂志(J.ControlledRelease)，5：13-22(1987)；麦索维兹等人，反应性聚合物(Reactive Polymers)，6：275-283(1987)；和麦索维兹等人，应用聚合物科学杂志(J.Appl.Polymer Sci)，35：755-774(1988)中所述。
这些装置可配制用于局部释放以治疗植入或注射区域-其通常传递的剂量将比用于全身治疗或系统性传递的剂量少得多。这些装置可皮下植入或注射到肌肉、脂肪中或加以吞咽。
VI.制造方法
A.用于产生融合蛋白的方法
所揭示的融合蛋白可使用此项技术中已知的常规技术制造。分离的融合蛋白可通过例如化学合成或通过在宿主细胞中重组产生来获得。为了重组产生融合蛋白，可以使用含有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸来转化、转导或转染细菌或真核宿主细胞(例如昆虫、酵母或哺乳动物细胞)。一般说来，核酸构建体包括按可操作方式连接到编码融合蛋白的核苷酸序列的调控序列。调控序列(本文中又称作表达控制序列)通常不编码基因产物，而是影响其按可操作方式连接的核酸序列的表达。
适用于表达和产生多肽的原核和真核系统是此项技术中众所周知的，包括例如大肠杆菌菌株，例如BL-21，以及培养的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在真核宿主细胞中，可利用多种基于病毒的表达系统来表达融合蛋白。基于病毒的表达系统是此项技术中众所周知的，并且包括(但不限于)基于杆状病毒、SV40、逆转录病毒或牛痘的病毒载体。
稳定表达变异融合蛋白的哺乳动物细胞系可使用具有适宜控制元件和可选择标记物的表达载体产生。举例来说，真核表达载体pCR3.1(英杰生命技术公司)和p91023(B)(参看王(Wong)等人(1985)科学(Science)228：810-815)适于表达例如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、COS-1细胞、人胚肾293细胞、NIH3T3细胞、BHK21细胞、MDCK细胞和人血管内皮细胞(human vascular endothelial cell，HUVEC)中的变异多肽。其它适合的表达系统包括由龙沙集团有限公司(Lonza Group Ltd.)获得的GS Gene Expression SystemTM。
在通过电穿孔法、脂转染法、磷酸钙法或氯化钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法或其它适合的转染方法引入表达载体后，可选择稳定细胞系(例如通过代谢选择，或对G418、卡那霉素(kanamycin)或潮霉素(hygromycin)的抗生素抗性)。可培养转染的细胞以表达相关多肽，并且可从例如细胞培养物上清液或从溶解的细胞回收多肽。或者，可通过(a)将扩增的序列连接到例如pcDNA3(英杰生命技术公司)等哺乳动物表达载体中，和(b)在体外使用麦芽提取物或兔网织红细胞溶解产物进行转录和翻译，来产生融合蛋白。
融合蛋白可使用例如色谱法(例如亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、DEAE离子交换法、凝胶过滤法和羟磷灰石色谱法)分离。在一些实施例中，融合蛋白可工程改造成含有含使得多肽能够被捕获到亲和基质上的氨基酸序列的额外结构域。举例来说，细胞培养物上清液或细胞质提取物中的Fc-融合多肽可使用蛋白质A柱分离。此外，还可使用例如c-myc、血凝素、聚组氨酸或FlagTM(柯达公司)等标签来帮助多肽纯化。所述标签可插入多肽内的任何位置，包括羧基或氨基末端。可适用的其它融合物包括有助于检测多肽的酶，例如碱性磷酸酶。也可使用免疫亲和色谱法来纯化多肽。融合蛋白可另外工程改造成含有使产生所述融合蛋白的细胞分泌所述融合蛋白的分泌信号(如果还未存在分泌信号的话)。随后宜从细胞培养基分离出分泌的融合蛋白。
B.用于产生分离的核酸分子的方法
分离的核酸分子可通过标准技术，包括(不限于)常用分子克隆和化学核酸合成技术来产生。举例来说，可以使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术获得编码变异多肽的分离的核酸。PCR是一种酶促扩增目标核酸的技术。通常，可采用来自相关区域末端或之外的序列信息来设计序列与待扩增模板的相对链一致的寡核苷酸引物。可使用PCR扩增来自DNA以及RNA的特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物通常为14到40个核苷酸长，但长度可在10个核苷酸到数百个核苷酸的范围内。常用PCR技术描述于例如PCR引物：实验指南(PCR Primer：A Laboratory Manual)，达芬贝奇(Dieffenbach)和德维斯勒(Dveksler)编辑，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1995中。当使用RNA作为模板来源时，可使用逆转录酶来合成互补DNA(cDNA)链。也可使用连接酶链反应、链置换扩增、自身持续序列复制(self-sustained sequence replication)或基于核酸序列的扩增来获得分离的核酸。参看例如莱维斯(Lewis)(1992)遗传工程新闻(Genetic EngineeringNews)12：1；盖特里(Guatelli)等人(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：1874-1878；和维斯(Weiss)(1991)科学(Science)254：1292-1293。
分离的核酸可借助化学方式以单一核酸分子形式或以一系列寡核苷酸形式合成(例如使用在3′到5′方向上进行自动DNA合成的氨基磷酸酯技术)。举例来说，可合成含有所需序列的一个或一个以上长寡核苷酸对(例如＞100个核苷酸)，其中每一对含有短互补区段(例如约15个核苷酸)，由此当寡核苷酸对退火时形成双链体。可使用DNA聚合酶来延伸寡核苷酸，使每一寡核苷酸对产生单一双链核酸分子，随后可将其连接到载体中。分离的核酸也可通过诱变法获得。可使用标准技术，包括寡核苷酸引导的诱变法和/或定点诱变法经由PCR使编码融合蛋白的核酸发生突变。参看精编分子生物学实验 指南(Short Protocols in Molecular Biology).第8章，格林出版协会与约翰威立父子出版公司(Green Publishing Associates and John Wiley & Sons)，奥苏贝尔(Ausubel)等人编辑，1992。可修饰的氨基酸位置的实例包括本文所述的位置。
VII.治疗使用的方法
本文揭示的B7-H4多肽或者其片段或融合物可用作治疗剂。可使免疫细胞，优选T细胞在体外或离体与B7-H4融合多肽接触以减少或抑制免疫应答，包括(但不限于)炎症。与B7-H4融合多肽接触的T细胞可为表达T细胞受体的任何细胞，包括α/β和γ/δT细胞受体。T细胞包括表达CD3的所有细胞，包括也表达CD4和CD8的T细胞子集。T细胞包括原生和记忆细胞以及效应细胞(例如CTL)。T细胞也包括调控细胞，例如Th1、Tc1、Th2、Tc2、Th3、Th17、Th22、Treg和Tr1细胞。T细胞也包括NKT细胞和类似的独特T细胞谱系类别。举例来说，可使用组合物来调节Th1、Th17、Th22，或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞。组合物也可用于增加或促进Treg活性；增加Treg的细胞因子(例如IL-10)产生；增加Treg的分化；增加Treg的数量；或增加Treg的存活率。
在一些实施例中，所揭示的B7-H4多肽或者其片段或融合物是与第二治疗剂组合投予。组合疗法可用于免疫调节。在一些实施例中，可使用B7-H4多肽或片段或融合物来降低或逆转促炎性药物的活性和/或限制这些药物的副作用。
可用所揭示的B7-H4多肽、其片段或融合物处理的其它免疫细胞包括T细胞前体、抗原提呈细胞(例如树突状细胞和单核细胞)或其前体、B细胞或其组合。可使用B7-H4组合物，通过使B细胞与有效量的B7-H4组合物接触来相对于对照物抑制或减少B细胞的抗体产量，由此调节B细胞的抗体产量。B7-H4组合物也可调节B细胞的细胞因子产量。
A.治疗发炎性应答的方法
优选的实施例提供用于治疗或减轻一种或一种以上炎症症状的方法。在一个更优选的实施例中，所揭示的组合物和方法可用于治疗慢性和持久炎症。一般说来，可使用所揭示的B7-H4多肽或者其片段或融合物来治疗炎症。
可以通过投予有效量的B7-H4多肽或者其片段或融合物以抑制或降低免疫细胞的生物活性或减少炎症部位处促炎性分子的量来抑制或减少受试者(优选人类)的免疫应答(包括炎症)。示范性促炎性分子包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP。
Th1和Th17是可作为B7-H4多肽、其融合蛋白或片段的抑制目标以抑制或减少炎症的示范性T细胞。B7-H4融合蛋白可用于通过以下任一或所有方式来治疗炎症：抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的分化；抑制或降低Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的活性；抑制或减少Th1和/或Th17路径；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的细胞因子产生和/或分泌；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的增殖。
此外，B7-H4-Ig可使Treg对免疫应答的抑制作用增强。Treg可抑制Th1、Th17、Th22，和/或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌。举例来说，B7-H4-Ig可使Treg对Th1和/或Th17细胞的抑制作用增强，由此分别降低产生的IFN-γ和IL-17的水平。B7-H4-Ig也可直接作用于Treg以促进或增进IL-10的产生，由此抑制Th1和Th17路径，或增加Treg的数量。
图1A和1B显示B7-H4融合蛋白用于抑制炎症的两个推荐的作用模式。图1A显示B7-H4-Ig作用于多个T细胞路径中的多个点。举例来说，B7-H4-Ig可抑制原生T细胞分化成Th1或Th17细胞。或者，B7-H4-Ig可与Th1细胞或Th17细胞或二者相互作用，以抑制或减少促炎性分子的产生。此外，B7-H4-Ig可增加Treg的分化和/或使Treg对Th1和Th17路径的抑制作用增强，由此降低产生的INF-γ和/或IL-17的水平。B7-H4-Ig增进Treg的IL-10产生，且此结果抑制Th1和Th17细胞的活性。
图1B显示B7-H4-Ig靶向不成熟抗原提呈细胞(例如树突状细胞(DC))并抑制细胞成熟的第二模型。不成熟的抗原捕获性树突状细胞能够成熟成为抗原提呈性T细胞预致敏细胞；将抗原转化成免疫原并且表达例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子和蛋白酶等分子以起始免疫应答。DC调控免疫性的能力取决于DC成熟。多种因子可在DC内抗原吸收和处理后诱导成熟，包括：全细菌或细菌源性抗原(例如脂多糖，LPS)、发炎性分子、所选细胞表面受体(例如CD40)与病毒产物(例如双链RNA)的连接。成熟过程涉及信号传导到DC，使I类和II类MHC分子的表面表达以及共刺激分子的产生增加。
在图1B提供的模型中，B7-H4-Ig阻止DC成熟，从而防止原生T细胞发育成Th1或Th17细胞，并减少促炎性分子的产生。此外，B7-H4-Ig可增加有助于Treg的分化和/或使Treg对Th1和Th17路径的抑制作用增强并由此降低产生的INF-γ和/或IL-17的水平的不成熟DC池。以此方式，B7-H4-Ig增进Treg的IL-10产生，且此结果抑制Th1和Th17细胞的活性。
1.抑制Th1路径
a.抑制Th1发育
一种用于抑制或减少炎症的方法包括对有需要的受试者投予有效量的B7-H4多肽、融合蛋白、其变异体或其片段以抑制Th1发育。已经发现，通过投予B7-H4多肽、融合蛋白、其片段或其变异体，来阻止原生T细胞分化成Th1细胞，从而可抑制或减少炎症。在一个实施例中，B7-H4多肽或其融合蛋白增加Treg对原生T细胞的抑制能力，由此抑制或减少原生T细胞分化成Th1细胞，并借此减少受试者体内Th1细胞的数量。或者，B7-H4多肽或其融合蛋白抑制或减少Th1细胞增殖。B7-H4多肽、其片段或融合蛋白也可通过阻止抗原提呈细胞成熟来减少原生T细胞分化成Th1细胞。通过限制受试者体内可发育的Th1细胞的数量，可减少或遏制促炎性分子(例如INF-γ)的量。INF-γ刺激包括IL-1β、TNF-α和MMP在内的其它促炎性分子的产生或释放。因此，通过控制受试者体内Th1细胞的数量，可控制这些其它促炎性分子的水平，由此减少炎性应答。
b.抑制促炎性分子
另一实施例提供一种通过对受试者投予有效量的B7-H4多肽、其融合蛋白或其片段以抑制或减少Th1细胞的促炎性分子产生，来抑制或减少受试者的炎症的方法。示范性由Th1细胞产生的促炎性分子包括IFN-γ。在此实施例中，B7-H4多肽、其融合蛋白或其片段可与Th1细胞直接相互作用，并抑制或减少Th1细胞的IFN-γ产生。在此实施例中，促炎性分子的量而不是Th1细胞群受到调控。
2.抑制Th17路径
a.抑制Th17发育
也可通过投予有效量的B7-H4多肽、其片段或融合物以抑制或阻止原生T细胞发育成Th17细胞，来抑制或减少受试者的炎症。在一个实施例中，B7-H4多肽或融合蛋白以足以减少受试者体内Th17细胞数量的量增加Treg对原生T细胞分化成Th17细胞的抑制活性。或者，B7-H4多肽或其融合蛋白抑制或减少Th17细胞增殖。B7-H4多肽或其融合蛋白也可通过阻止抗原提呈细胞成熟来减少原生T细胞分化成Th17细胞。通过减少受试者体内的Th17细胞群，可减少产生的IL-17以及IL-22和IL-21的量。IL-17是使例如IL-1β、TNF-α和MMP等其它促炎性分子增加的促炎性分子。因此，通过减少IL-17的量，可减少这些其它促炎性分子，由此减少或抑制炎症。
b.抑制IL-17产生
另一实施例提供一种通过投予有效量的B7-H4多肽、其融合蛋白或其片段以抑制Th17细胞产生IL-17以及IL-22和IL-21，来治疗受试者的炎症的方法。在此实施例中，B7-H4多肽或融合蛋白可例如通过结合于Th17细胞来直接作用于Th17细胞，由此抑制这些Th17细胞产生IL-17(或IL-22和IL-21)。如上文所述，抑制或减少IL-17(和IL-22或IL-21)导致其它促炎性分子的减少，由此减少或抑制炎症。
3.抑制Th1和Th17路径
所揭示的B7-H4多肽、其融合蛋白和片段可用于同时抑制Th1和Th17路径。使用一种消炎剂抑制两种独立路径将更稳固地抑制或减少免疫应答。
4.Treg
也可通过对受试者投予有效增强产生IL-10的Treg的抑制活性的量的B7-H4多肽、其融合蛋白或其片段以增强对Th1和/或Th17路径的抑制活性，来治疗炎症。在此实施例中，所揭示的B7-H4多肽和融合蛋白使得对IFN-γ的抑制活性和/或IL-17的产生相对于单独Treg有所增加。
另一实施例提供一种通过投予有效量的B7-H4多肽、其融合蛋白或其片段以增加Treg的IL-10产生来治疗炎症的方法。IL-10的产生增加使Th17细胞产生的IL-17减少，并使Th1细胞产生的IFN-γ减少。在此实施例中，B7-H4多肽、其融合蛋白和片段可与Treg直接相互作用以增加Treg的IL-10产生。
另一实施例提供一种通过投予有效量的B7-H4多肽、其融合蛋白和其片段以抑制或干扰Th1路径、Th17路径并增强Treg对Th1和Th17路径的抑制作用来治疗炎症的方法(参看图1A)。B7-H4多肽或其融合蛋白也可通过阻止抗原提呈细胞成熟来增加Treg池(参看图1B)。
B7-H4多肽、其融合蛋白和其片段也可以有效增加Treg细胞群或数量的量投予受试者。
通过使Treg与有效量的B7-H4多肽、B7-H4融合蛋白或其具有B7-H4活性的片段接触，可相对于对照物增加Treg的IL-10和TGF-β产生。所述增加可在体外或体内发生。
5.可溶性B7-H4
可溶性B7-H4(sH4)充当诱饵分子(decoy molecule)，其与细胞表面B7-H4竞争结合于B7-H4受体，并且不对T细胞产生抑制信号。B7-H4在抗原刺激存在下抑制T细胞的细胞周期进程。B7-H4可通过抑制嗜中性粒细胞祖细胞增殖来抑制固有的免疫性。相信升高sH4水平将阻止内源性B7-H4的抑制作用。
因此，可例如通过对有需要的个体投予有效量的抑制或降低sH4结合于B7-H4受体的能力或增大内源抑制性B7-H4分子的活性的试剂在体内干扰sH4的生物活性，来治疗发炎性应答。干扰sH4生物活性可通过投予本文揭示的B7-H4融合多肽来实现。
投药不局限于治疗现有的病况、疾病或病症(即，现有的发炎性或自体免疫疾病或病症)，而且还可用于预防个体发生这些疾病或降低个体发生这些疾病的风险，即用于预防用途。适于预防接种的潜在候选者包括具有发生发炎性或自体免疫疾病或病症的高风险(即，具有某些类型自体免疫病症的个人或家族病史)的个体。
B.待治疗的发炎性疾病
可使用B7-H4融合多肽治疗的示范性发炎性或自体免疫疾病和病症包括(但不限于)类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合症、自体免疫性爱迪生氏病(autoimmune Addison′s disease)、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性内耳疾病、自体免疫性淋巴细胞增生综合症(autoimmunelymphoproliferative syndrome，alps)、自体免疫性血小板减少性紫癜(autoimmunethrombocytopenic purpura，ATP)、贝赫切特氏病(Behcet′s disease)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、心肌病(cardiomyopathy)、乳糜泻性皮炎(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳综合症免疫缺陷综合症(chronic fatigue syndrome immune deficiency syndrome，CFIDS)、慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素疾病(cold agglutinin disease)、肢端硬皮综合症(Crest syndrome)、克隆氏病(Crohn′s disease)、德戈氏病(Dego′s disease)、皮肌炎、青少年型皮肌炎、盘状狼疮(discoid lupus)、原发性混合型冷球蛋白血症(essentialmixed cryoglobulinemia)、纤维肌痛-纤维性肌炎、葛瑞夫茲氏病(grave′s disease)、格林-巴利综合症(guillain-barre)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto′s thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenia purpura，ITP)、Iga肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、青少年性关节炎、美尼尔氏病(Meniere′s disease)、混合型结缔组织疾病、多发性硬化、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合症、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏现象(Raynaud′s phenomenon)、瑞特氏综合症(Reiter′s syndrome)、风湿热、类肉瘤病、硬皮病、修格连氏综合症(Sjogren′ssyndrome)、僵人综合症(stiff-man syndrome)、高安氏动脉炎(Takayasu arteritis)、颞动脉炎(temporal arteritis)/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)。
B7-H4以较高水平作用于发炎路径中的多个点，由此其充当主要调控子以控制从而影响例如TNF-α等效应细胞因子的表达和/或活性。因此，本文所述的B7-H4组合物特别适用于治疗对TNF-α阻断剂(例如Enbrel、Remicade、Cimzia和Humira)无应答或TNF-α阻断剂不安全或无效的患者。此外，由于所揭示的B7-H4组合物具有作为发炎路径中的主要调控子的活性，故其特别适用于治疗慢性和持久炎症。在一个优选实施例中，使用本文所述的B7-H4组合物来治疗复发和/或缓解型多发性硬化。
C.抑制表位扩展
表位扩展是指B细胞和T细胞免疫应答能够同时在特异性层面上(从单一决定子到自体抗原上多个位点)和V基因用法层面上多样化(莫纳斯F.(Monneaux，F.)等人，关节炎与风湿病(Arthritis & Rheumatism)，46(6)：1430-1438(2002))。表位扩展不局限于系统性自体免疫疾病。其已描述于具有多种髓磷脂蛋白的人类和诱发EAE的实验动物的T细胞依赖性器官特异性疾病中，例如IDDM和多发性硬化。
表位扩展涉及同一自体分子中新表位的后天识别以及同一大分子复合物相关性蛋白质中的表位驻留。表位扩展可通过测量迟发型超敏反应(DTH)应答来评估，评估方法是此项技术中已知的。
一个实施例提供一种通过对受试者投予有效量的B7-H4多肽、其片段或融合蛋白来抑制或减少受试者体内的表位扩展的方法。在一个优选实施例中，B7-H4多肽、其片段或融合蛋白抑制患有多发性硬化的个体体内的表位扩展。优选B7-H4多肽或其融合物抑制或阻断发炎性路径的多个点。
另一实施例提供一种通过对受试者投予有效量的B7-H4多肽、其片段或融合蛋白以抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌来抑制或减少受试者体内的表位扩展的方法。另一实施例提供一种通过对受试者投予有效量的B7-H4多肽、其片段或融合蛋白以与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增进Treg对IL-10的分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合，来治疗多发性硬化的方法。
D.组合疗法
B7-H4融合多肽可单独使用或与其它治疗剂组合使用。所述其它治疗剂包括(但不限于)免疫抑制剂(例如针对其它淋巴细胞表面标记物(例如CD40、α-4整合素)或针对细胞因子的抗体)、其它融合蛋白(例如CTLA-4-Ig
Figure BDA0000158191410000811
TNFR-Ig)、TNF-α阻断剂(例如Enbrel、Remicade、Cimzia和Humira)、环磷酰胺(CTX)(即
Figure BDA0000158191410000813
Figure BDA0000158191410000814
RevimmuneTM)、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)(即
Figure BDA0000158191410000815
)、贝利单抗(belimumab)(即
Figure BDA0000158191410000816
)或其它免疫抑制药物(例如环孢霉素A(cyclosporin A)、类FK506化合物、雷帕霉素化合物或类固醇)、抗增生药、细胞毒性剂或可能有助于免疫抑制的其它化合物。
在一个优选实施例中，所述其它治疗剂用于抑制或减少通过单独路径的T细胞活化。在一个此类实施例中，所述其它治疗剂是CTLA-4融合蛋白，例如CTLA-4-Ig(阿巴西普)。CTLA-4-Ig融合蛋白与T细胞上的共刺激受体CD28竞争结合于抗原提呈细胞上的CD80/CD86(B7-1/B7-2)并由此用于抑制T细胞活化。在另一实施例中，所述其它治疗剂是称为贝拉西普(belatacept)的CTLA-4-Ig融合蛋白。贝拉西普含有在体内明显增加其对CD86的亲合力的两个氨基酸取代(L104E和A29Y)。在另一实施例中，所述其它治疗剂是Maxy-4。
在另一实施例中，第二治疗剂是环磷酰胺(CTX)。环磷酰胺(
Figure BDA0000158191410000817
Figure BDA0000158191410000821
RevimmuneTM的通用名称)，又称作塞托非安(cytophosphane)，是来自噁唑菲林(oxazophorine)组的氮芥烷化剂。其用于治疗各种类型的癌症和一些自体免疫病症。在一个优选实施例中，B7-H4-Ig与CTX以有效量共投予以预防或治疗慢性自体免疫疾病或病症，例如系统性红斑狼疮(SLE)。环磷酰胺(CTX)是用于肾狼疮患者的弥漫性增生性肾小球肾炎的主要药物。如下文实例18中详述，已经发现，低剂量环磷酰胺(50mg/kg，每2周一次)(当前用于人类的治疗形式)加B7-H4-Ig的组合治疗在MRL/lpr狼疮模型中引起对狼疮疾病进展的预防。在一些实施例中，以有效量投予所述组合疗法以降低有需要的患者体内的血液或血清抗双链DNA(抗ds DNA)自体抗体水平和/或减少蛋白尿。
在另一实施例中，第二治疗剂使血清中腺苷的量增加，参看例如WO 08/147482。在一个优选实施例中，第二治疗剂是CD73-Ig、重组CD73或另一增加CD73表达的试剂(例如细胞因子或单克隆抗体或小分子)，参看例如WO 04/084933。在另一实施例中，第二治疗剂是干扰素-β。
在另一实施例中，第二治疗剂是Tysabri或另一MS治疗剂。在一个优选实施例中，B7-H4-Ig与Tysabri一起循环或在停药期期间使用以便降低给与第二治疗剂的频率并降低例如PML等副作用的风险，且防止对第二治疗剂产生抗性。
在另一实施例中，第二治疗剂优先治疗慢性炎症，由此所述治疗方案同时靶向急性和慢性炎症。在一个优选实施例中，第二治疗剂是TNF-α阻断剂。
在另一实施例中，第二治疗剂是抑制或减少Th1、Th17、Th22，和/或分泌或使其它细胞分泌包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的发炎性分子的其它细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌的小分子。在另一实施例中，第二治疗剂是与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增进Treg对IL-10的分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合的小分子。
通常，有用小分子是有机分子，优选分子量大于100道尔顿(dalton)且小于约2,500道尔顿，更优选在100与2000之间，更优选在约100与约1250之间，更优选在约100与约1000之间，更优选在约100与约750之间，更优选在约200与约500道尔顿之间的小有机化合物。小分子包含与蛋白质发生结构相互作用，尤其氢键接必需的官能团，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。小分子通常包含经一个或一个以上上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或聚芳香族结构。小分子还包括生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。在一个实施例中，小分子是视黄酸或其衍生物。下文的实例证实，视黄酸抑制或减少Th17细胞分化和/或活性。
在一个优选实施例中，所述组合物与增加Treg活性或产生的化合物组合或相继使用。示范性Treg增强剂包括(但不限于)糖皮质激素氟替卡松(fluticasone)；沙美特罗(salmeteroal)；针对IL-12、IFN-γ和IL-4的抗体；维生素D3；和地塞米松(dexamethasone)，和其组合。针对其它促炎性分子的抗体也可与所揭示的B7-H4多肽、其融合蛋白或片段组合或间隔使用。优选抗体结合于IL-6、IL-23、IL-22或IL-21。
如本文所用，术语“雷帕霉素化合物”包括中性三环化合物雷帕霉素、雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物，和其它大环内酯类化合物，这些化合物被认为具有与雷帕霉素相同的作用机制(例如抑制细胞因子功能)。“雷帕霉素化合物”的表述包括结构类似于雷帕霉素的化合物，例如具有类似的大环结构的化合物，其经过修饰以增强其治疗功效。示范性雷帕霉素化合物是此项技术中已知的(参看例如WO95122972、WO 95116691、WO 95104738；美国专利第6,015,809号；第5,989,591号；美国专利第5,567,709号；第5,559,112号；第5,530,006号；第5,484,790号；第5,385,908号；第5,202,332号；第5,162,333号；第5,780,462号；第5,120,727号)。
“类FK506化合物”的表述包括FK506以及FK506衍生物和类似物，例如结构类似于FK506的化合物，例如具有类似的大环结构的化合物，其经过修饰以增强其治疗功效。类FK506化合物的实例包括例如WO 00101385中所述的化合物。优选本文中使用的“雷帕霉素化合物”的表述不包括类FK506化合物。
其它适合的治疗剂包括(但不限于)消炎剂。消炎剂可为非类固醇、类固醇或其组合。一个实施例提供含有约1％(w/w)到约5％(w/w)，通常约2.5％(w/w)或消炎剂的口服组合物。非类固醇消炎剂的代表性实例包括(不限于)昔康类(oxicams)，例如吡罗昔康(piroxicam)、伊索昔康(isoxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、舒多昔康(sudoxicam)；水杨酸类(salicylates)，例如阿司匹林(aspirin)、双水杨酯(disalcid)、贝诺酯(benorylate)、曲利塞特(trilisate)、萨法比恩(safapryn)、索尔比林(solprin)、二氟尼柳(diflunisal)和芬度柳(fendosal)；乙酸衍生物，例如双氯芬酸(diclofenac)、芬氯酸(fenclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、伊索克酸(isoxepac)、呋罗芬酸(furofenac)、硫平酸(tiopinac)、齐多美辛(zidometacin)、阿西美辛(acematacin)、芬替酸(fentiazac)、佐美酸(zomepirac)、克林达酸(clindanac)、奥昔平酸(oxepinac)、联苯乙酸(felbinac)和酮洛酸(ketorolac)；芬那酸类(fenamates)，例如甲芬那酸(mefenamic)、甲氯芬那酸(meclofenamic)、氟芬那酸(flufenamic)、尼氟酸(niflumic)和托芬那酸(tolfenamic acid)；丙酸衍生物，例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、氟洛芬(flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、芬布芬(fenbufen)、吲哚洛芬(indopropfen)、吡洛芬(pirprofen)、卡洛芬(carprofen)、奥沙普秦(oxaprozin)、普拉洛芬(pranoprofen)、咪洛芬(miroprofen)、硫噁洛芬(tioxaprofen)、舒洛芬(suprofen)、阿明洛芬(alminoprofen)和噻洛芬酸(tiaprofenic)；吡唑类，例如保泰松(phenylbutazone)、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、非普拉宗(feprazone)、阿扎丙宗(azapropazone)和三甲保泰松(trimethazone)。也可采用这些非类固醇消炎剂的混合物。
类固醇消炎药的代表性实例包括(不限于)皮质类固醇，例如氢化可的松(hydrocortisone)、羟基-曲安西龙(hydroxyl-triamcinolone)、α-甲基地塞米松(alpha-methyldexamethasone)、磷酸地塞米松、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、戊酸氯倍他索(clobetasol valerate)、地奈德(desonide)、去氧米松(desoxymethasone)、乙酸去氧皮质酮(desoxycorticosterone acetate)、地塞米松、二氯松(dichlorisone)、二乙酸二氟拉松(diflorasone diacetate)、戊酸二氟可龙(diflucortolone valerate)、氟氢缩松(fluadrenolone)、氟氯奈德(fluclorolone acetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、特戊酸二氟美松(flumethasone pivalate)、氟西奈德(fluosinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟吡汀丁基酯(flucortine butylester)、氟可龙(fluocortolone)、乙酸氟泼尼定(fluprednidene(氟甲叉龙(fluprednylidene))acetate)、氟氢缩松(flurandrenolone)、哈西奈德(halcinonide)、乙酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、丁酸氢化可的松、甲泼尼龙(methylprednisolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(cortisone)、可托多松(cortodoxone)、氟轻松(flucetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、二乙酸二氟拉松(difluorosone diacetate)、氟拉诺龙(fluradrenolone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、二乙酸二氟拉松、氟拉奈德(fluradrenolone acetonide)、甲羟松(medrysone)、安西那非(amcinafel)、安西非特(amcinafide)、倍他米松(betamethasone)和其其它酯、氯泼尼松(chloroprednisone)、乙酸氯泼尼松(chlorprednisone acetate)、氯可托龙(clocortelone)、克辛诺龙(clescinolone)、二氯松(dichlorisone)、二氟泼尼酯(diflurprednate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、戊酸氢化可的松(hydrocortisone valerate)、环戊基丙酸氢化可的松(hydrocortisonecyclopentylpropionate)、氢可他酯(hydrocortamate)、甲泼尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、曲安西龙(triamcinolone)和其混合物。
在另一实施例中，所述其它治疗剂包括抑制或干扰sH4活性以治疗受试者的发炎性病症的组合物。在一个实施例中，投予受试者B7-H4融合多肽以治疗发炎性疾病，其中所述受试者具有极少或不可检测量的sH4。在另一实施例中，投予B7-H4融合多肽以治疗sH4水平升高的受试者的发炎性疾病的一种或一种以上症状。sH4水平升高可通过将已知患有发炎性病症的受试者的sH4水平与未患发炎性病症的受试者的sH4水平相比较来确定。
E.药效标记物
使用B7-H4多肽、其片段或其融合蛋白进行治疗的功效可通过分析从接受用B7-H4多肽或其融合蛋白进行的治疗以改变例如血清蛋白，优选促炎性细胞因子、趋化因子、急性期标记物和/或抗体(例如总IgG，或特定疾病相关性IgG)或其它血清蛋白(例如sH4)等生物标记物的水平的受试者获得的样品来确定。举例来说，从受试者获得的血清样品中生物标记物的基线水平可在用B7-H4多肽或融合蛋白进行治疗前确定。在用B7-H4多肽或其融合蛋白进行治疗之后或期间，可监测来自受试者的血液样品中的生物标记物水平。生物标记物水平的改变(例如细胞因子水平相对于基线水平的下降)指示，所述治疗有效减少发炎性病症的一种或一种以上症状。或者，可将由经历用B7-H4多肽或其融合蛋白进行的治疗的受试者获得的血液样品中的细胞因子水平与由未患发炎性病症的受试者确定的预定生物标记物水平相比较。在一些实施例中，仅监测一种生物标记物的水平。在其它实施例中，监测2、3、4、5种或更多种生物标记物的水平。
使用B7-H4多肽、其片段或融合蛋白进行治疗的功效也可通过分析从接受用B7-H4多肽或其融合蛋白进行的治疗以改变淋巴细胞群水平(例如与对照物相比较，Treg数量增加，或活化的Th1或Th17细胞数量减少)的受试者获得的样品来确定。
在一些实施例中，使用B7-H4多肽、其片段或融合蛋白进行治疗的功效是通过使用此项技术中已知的方法监测疾病特异性标记物或症状来确定。举例来说，可采用成像法来评估针对多发性硬化的治疗的功效，或可监测迟发型超敏反应(DTH)以评估针对狼疮的治疗的功效。
使用B7-H4多肽、其片段或其融合蛋白进行治疗的功效也可通过分析从接受用B7-H4多肽或其融合蛋白进行的治疗以改变基因表达水平的受试者获得的样品来确定，所述基因包括(但不限于)编码血清蛋白，优选促炎性细胞因子和/或趋化因子，以及分泌的因子、细胞表面受体和Th1、Th17和Treg细胞特有的转录因子的基因。测量基因表达的方法是此项技术中众所周知的，并且包括(但不限于)定量RT-PCR和微阵列分析法。
可经过监测以确定用B7-H4多肽、其片段和融合蛋白进行治疗的功效的示范性标记物可见于下文的实例，尤其图7、8、9、57和58中，并且包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP中一者或一者以上。特别适用于监测关节炎的生物标记物描述于下文实例3以及图7、8和9中，并且优选包括(但不限于)CRP、ET-1、IL-6、MCP-1、MCP-3、MIP-2和TNF-α。适用于监测用B7-H4多肽、其片段和融合物以及并入这些蛋白质的组合疗法进行治疗的功效的另一标记物是患者组织液中的CD73水平，参看例如WO 09/05352。
F.患者选择
可通过针对生物标记物的水平或如上文所述的基因表达或在编码下游效应基因的基因内的多态现象预先筛选目标患者，来预测本文所述的B7-H4多肽、其片段和融合蛋白的功效。
在一个非限制性实例中，可选择一种或一种以上发炎性细胞因子或趋化因子水平相对于未患发炎性病症的受试者升高的患者以用B7-H4多肽、片段或融合蛋白进行治疗。或者，可选择在一个或一个以上发炎性细胞因子或趋化因子基因中具有多态现象的患者以用B7-H4多肽或融合蛋白进行治疗。举例来说，根据多态现象的性质，预期在IL-10基因内具有特定多态现象的患者可或多或少对用B7-H4组合物进行的治疗作出应答。可经过筛选以确定B7-H4组合物治疗是否会有效的示范性分子和其相应基因包括(但不限于)IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP中一者或一者以上。适用于选择患者以用B7-H4多肽、其片段和融合物以及并入这些蛋白质的组合疗法进行治疗的另一标记物是患者组织液中的CD73水平。可通过已知方法，包括(但不限于)定量RT-PCR和ELISA，来测量发炎性分子的水平。鉴别基因多态现象的方法是此项技术中众所周知的，并且包括(但不限于)DNA测序和DNA微阵列法。
也可通过针对在治疗过程期间一种或一种以上发炎性分子的水平来筛选患者，并在受试者体内一种或一种以上细胞因子水平相比未患发炎性病症的对照受试者体内水平有所升高的情况下，增加投予受试者的B7-H4的量，或在受试者体内一种或一种以上细胞因子水平相比未患发炎性病症的对照受试者体内水平有所降低的情况下，降低投予受试者的B7-H4的量，来监测患者用B7-H4多肽或融合蛋白治疗发炎性病症的功效。
实例
实例1：胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)的预防模型中的B7-H4-Ig(鼠类)
方法与材料
CIA是充分表征的人类RA的小鼠模型，其中将胶原蛋白II(CH)注射到DBA/1J小鼠中以在关节中诱发肿胀和进行性炎症，从而引起关节炎。如图2中所示，在用CII免疫的同一天，经腹膜内(IP)投予DBA/1J小鼠(杰克森实验室(Jackson Labs))0.5mgB7-H4-Ig(20mg/kg)。每周继续用B7-H4-Ig治疗2次，持续6周。第21天，用在IFA中乳化的CII对小鼠进行再激发。图2略述了简要实验设计。第40天进行最后一次B7-H4-Ig治疗。从第26天开始，每周2次使用表1中呈现的关节炎评分系统监测小鼠爪/关节。
表1：主观评价关节炎严重程度的评分系统。
  疾病评分   炎症程度
  0   无明显红斑及肿胀
  1   局限于跗骨或踝关节的红斑和轻微肿胀
  2   从踝延伸到跗骨的红斑和轻微肿胀
  3   从踝延伸到跖骨关节的红斑和中度肿胀
  4   覆盖踝、足和足趾的红斑和重度肿胀，或关节僵硬。
结果
如图3中所示，在第33天和之后，B7-H4-Ig治疗的CIA小鼠的总关节炎评分明显低于注射媒剂的CIA小鼠的评分。
实例2：治疗性CIA模型
方法与材料
图4略述了CIA治疗研究的简要实验设计。DBA/1J小鼠先用在CFA中乳化的鸡CII免疫。21天后，用在IFA中乳化的CII再激发小鼠，并随机分为2组。第1组(n＝10)腹膜内注射300μg B7-H4-Ig，一周3次，持续4周。第2组(n＝10)注射媒剂。一周3次监测小鼠爪/关节并评分。
结果
如图5中所示，B7-H4-Ig可明显抑制关节炎发生。在第38天和之后，B7-H4-Ig治疗的CIA小鼠的总关节炎评分明显低于注射媒剂的CIA小鼠的评分。
实例3：使用人类B7-H4-Ig治疗CIA
材料与方法
动物
DBA/1小鼠(塔康农场有限公司(Taconic Farms，Inc.)，DBA1B0)
耳标(国立标牌(National Band)1005-1)
电动剪毛机(奥斯特公司(Oster))
诱发CIA
Hooke KitTM鸡胶原蛋白/CFA乳液(虎克实验公司(Hooke Laboratories)EK-0210)
Hooke KitTM鸡胶原蛋白/IFA乳液(虎克实验公司EK-0211)
治疗
B7-H4-Ig
RPA110010
(帕利珠单抗(palivizumab)，麦德免疫公司(MedImmune)NDC#60574-4112-1)；用作人类IgG1同种型对照物
鼠类B7-H4-Ig
鼠类IgG2a同种型对照物(拜塞尔公司(BioXCell)C1.18)
注射器，3mL，带有鲁尔-卢克(Luer-Lok)针尖(BD 309585)
针，27号(BD 305109)
安普免疫公司(Amplimmune)制剂缓冲液(10mM磷酸钠，pH 7.5，8％w/w蔗糖、0.01％聚山梨醇酯-80)
血清收集
柳叶刀，(麦迪普特公司(Medipoint)Goldenrod 4mm)
Figure BDA0000158191410000882
血清分离管(BD 365956)
诱发关节炎
7-9周龄的DBA/1小鼠(每组10只)用于CIA模型。对来自数家供应商(杰克森实验公司、哈兰实验公司(Harlan Laboratories)和塔康农场有限公司)的小鼠进行测试，并确定塔康小鼠最适用于CIA研究。塔康小鼠显现较为一致且严重的疾病症状，并显示持续疾病进展，而来自其它供应商的小鼠通常显示稳定、不太严重的疾病，甚至在不治疗的情况下也是如此。对AA#79中的雌性(F)小鼠和AA#80中的雄性(M)小鼠进行测试以确定哪种性别适用于未来的实验中。
起始研究前一天，使用电动剪毛机除去每只小鼠右侧腹上的毛发。将金属标识标签放到每只小鼠的右耳上。第0天，在右侧腹中用100μL II型鸡胶原蛋白/完全弗氏佐剂(Complete Freund′s Adjuvant)(CII/CFA)乳液对小鼠免疫。第20天，使用电动剪毛机除去每只小鼠左侧腹上的毛发，并在第21天，在左侧腹中用100μL II型鸡胶原蛋白/不完全弗氏佐剂(CII/IFA)乳液对小鼠免疫。使用预先填充购自虎克实验公司的CII/CFA和CII/IFA乳液的注射器来确保一致的剂量以及免疫原效力。
疾病监测
早期关节炎症状，例如红斑和轻微肿胀，常常在第21天出现，并且在第28天，通常出现较为严重的症状，例如许多足趾肿胀以及炎症延伸到跗骨关节。一周三次使用普遍认可的关节炎严重程度评分系统(如表2所示)来评价每一肢体关节炎症状的严重程度。将四肢中每一者的评分相加，得到每只小鼠的疾病评分。
表2.用于评价每一肢体的关节炎严重程度的评分系统
Figure BDA0000158191410000891
治疗
在治疗性鼠类CIA模型中诱发疾病和进行治疗的代表性时间表显示于图6中。此治疗方案用于概念验证研究。使用较少剂量、较低投药频率和/或较低剂量的方案也可能有效。当研究动物的平均疾病评分大于4时，起始治疗。此对应于AA#79第29天和AA#80第24天。通过等待直到动物出现症状，确保所述模型是执行治疗而非预防模式。治疗组显示于表3中。
表3.AA#79和AA#80治疗组
Figure BDA0000158191410000892
一周3次通过腹膜内(IP)注射投予B7-H4-Ig、RPA110010和鼠类B7-H4-Ig蛋白，总计8剂。RPA110010是B7-H4-Ig的细胞外结构域变异体，SEQ ID NO：126。一周1次给与对照鼠类和人类IgG蛋白，总计3剂。循环中B7-H4-Ig的清除比对照IgG快，因此使用不同给药时程来补偿此差异。在即将注射前，用无菌PBS将所有蛋白质稀释到所需浓度(500μg/500μL，或1mg/mL)。媒剂对照小鼠接受在PBS中以1∶10稀释的安普免疫公司(Amplimmune)制剂缓冲液，且注射体积为500μL。
血清生物标记物分析
在AA#80中，在第27天、第34天、第41天和第55天，经由下颌下静脉收集血清样品。在
Figure BDA0000158191410000901
血清分离管中收集每只小鼠约200μL血液。离心后除去血清，并在＜-65℃下储存以待分析。
将所选血清样品送到规则医学公司(Rules-Based Medicine)(位于得克萨斯州奥斯汀(Austin，TX))进行血清样品的定量免疫分析多分析物并行检测，以达到鉴别可用于监测疾病进展和对B7-H4-Ig治疗的应答的生物标记物的目的。第27天、第34天和第41天，使用RodentMAP v2.9测试服务分析来自B7-H4-Ig组中三只代表性小鼠(标签号3332、3334和3338)和
Figure BDA0000158191410000902
组中三只代表性小鼠(标签号3324、3329和3330)的血清中58种分析物的水平。
使用Microsoft Excel和GraphPad Prism软件分析来自规则医学公司分析的数据。进行T测试以比较B7-H4-Ig与
Figure BDA0000158191410000903
处理的样品中每一分析物的水平。对于多重比较，不进行校正。此外，计算每一分析物相对于疾病评分的相关系数。
结果
CIA模型中B7-H4-Ig的功效
如图7和8以及表4A、4B、5A、5B、6和7中所示，在AA#79和AA#80中，用B7-H4-Ig和鼠类B7-H4-Ig治疗的小鼠的疾病评分低于对照组中的小鼠，与早前研究的结果一致。B7-H4-Ig在两项研究中都显示出优良的功效，并且在AA#79中，B7-H4-Ig组中的疾病稳定化在停止治疗后仍持续。RPA110010变异体在任一研究中都无效。
Figure BDA0000158191410000931
表6：AA#80CIA疾病评分
Figure BDA0000158191410000941
表7：AA#80CIA疾病评分
Figure BDA0000158191410000942
到CII免疫后21天，大部分动物开始显现发炎症状，并且疾病严重程度继续进展到第45天。B7-H4-Ig治疗的小鼠显示较长的稳定疾病评分阶段，且在AA#79中，在治疗停止后，此效果仍保持。在治疗期间(在AA#79中第29天到第46天，以及在AA#80中第24天到第41天)，在B7-H4-Ig治疗的鼠类动物中疾病评分短暂稳定，但迅速反弹。在对照治疗组和RPA110010中疾病进展都呈现类似特征。
血清生物标记物分析
据发现，数种蛋白质的血清水平与疾病进展有关和/或在B7-H4-Ig与
Figure BDA0000158191410000952
治疗的小鼠之间不同，如图9、10和11中所示且如下文所述。图9和10显示规则医学公司的完整数据集。图11显示规则医学公司的数据分析概要。如果在第27天、第34天、第41天或总的说来，
Figure BDA0000158191410000953
与B7-H4-Ig治疗组之间存在潜在显著的差异(p小于0.05)，那么分析物画有阴影。如果分析物与临床评分之间的相关系数小于0.3，那么分析物也画有阴影。这些标记物可用作疾病严重程度的客观量度和/或有关对B7-H4-Ig治疗的应答的生物标记物。
C反应性蛋白(CRP)
如图12中所示，CRP蛋白质水平与临床评分相关，但两个组的CRP水平无显著差异。CRP是炎症的常用临床生物标记物，并且公认为RA疾病活动度的标记物。高CRP浓度预示着关节侵蚀。CRP已经在恒河猴CIA模型中用作生物标记物，但不常在小鼠中用作生物标记物。如下文所述，SAP而非CRP被视为小鼠中的主要急性期蛋白。
内皮素1(ET-1)
如图13中所示，在第41天和总的说来，B7-H4-Ig治疗的小鼠中ET-1水平显著较低。内皮素充当有效血管收缩剂。已经在RA患者中报导血浆水平升高。ET-1也可在将嗜中性粒细胞募集到滑膜中起到作用。
谷胱甘肽S-转移酶α(GST-α)
在来自
Figure BDA0000158191410000961
治疗小鼠的9份血清样品中有7份不可检测到GST-α水平，但在来自B7-H4-Ig治疗小鼠的9份血清样品中有5份可检测到，包括3份第34天样品中的2份和3份第41天样品中的3份。GST-α涉及小分子解毒作用，并且水平升高可指示肝毒性。在所有情况下，检测到的水平仅略高于检测限。
白细胞介素-6(IL-6)
如图14中所示，IL-6水平随疾病评分增加。最高水平都出现在
Figure BDA0000158191410000962
治疗组中，但在本研究中，
Figure BDA0000158191410000963
与B7-H4-Ig组之间的差异未达到统计学显著水平。早期的研究显示，用鼠类B7-H4-Ig治疗会降低CIA模型中的IL-6水平。
生长相关α蛋白(Gro-α)
Gro-α(又称作趋化因子(C-X-C基元)配体1，CXCL1)的水平随疾病评分增加。最高水平都出现在治疗组中，但在本研究中，此未达到统计学显著水平。Gro-α涉及嗜中性粒细胞趋化作用和活化。
单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)
如图15中所示，在第41天和总的说来，在B7-H4-Ig治疗的小鼠中MCP-1(又称作趋化因子(C-C基元)配体2，CCL2)水平显著较低。MCP-1将单核细胞、记忆T细胞和树突状细胞募集到损伤或炎症部位。在RA中，MCP-1促进巨噬细胞募集到关节，由此维持炎症。早期的研究显示，鼠类B7-H4-Ig也降低CIA模型中的MCP-1水平。
单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)
如图16和17中所示，MCP-3(又称作趋化因子(C-C基元)配体7，CCL7)水平随疾病评分增加，并且在第41天和总的说来，在B7-H4-Ig治疗的小鼠中显著较低。MCP-3与MCP-1具有74％一致性。MCP-3是单核细胞和T细胞趋化蛋白。
巨噬细胞发炎性蛋白-2(MIP-2)
MIP-2(又称作趋化因子(C-X-C基元)配体14，CXCL14)的水平随疾病评分增加。如图18中所示，在第41天，B7-H4-Ig治疗的小鼠中水平显著低于治疗的小鼠。对于嗜中性粒细胞来说，MIP-2是有效的趋化蛋白。
血清淀粉样蛋白(SAP)
SAP水平随疾病评分增加，但B7-H4-Ig与Synagis治疗组之间无显著差异。SAP被认为是小鼠中的主要急性期蛋白以及通用的炎症标记物。
肿瘤坏死因子α(TNF-α)
如图19中所示，在来自
Figure BDA0000158191410000972
治疗小鼠的9份血清样品中有5份样品的水平高于检测限，但来自B7-H4-Ig治疗小鼠的血清水平都未超过检测限。TNF-α是RA疾病活动的关键介体。早期的研究显示，用鼠类B7-H4-Ig治疗会降低CIA模型中的TNF-α水平。
在实例3提供的数据中，B7-H4-Ig在鼠类CIA模型中显示较强功效，并且与媒剂和对照IgG治疗的动物相比较，其能够使疾病评分稳定。在雌性和雄性DBA/1小鼠中，B7-H4-Ig看起来比鼠类B7-H4-Ig有效，并且在雌性小鼠中诱导长期保护作用。雄性与雌性小鼠的疾病过程略有不同。在CIA模型中，人类B7-H4-Ig比其鼠类类似物有效，而RPA110010在AA#79或AA#80中不具活性。在鼠类TH17分化分析法中，B7-H4-Ig与RPA110010具有类似活性，且鼠类B7-H4-Ig更有效。这三种分子的药物动力学性质可能不同。将进行其它研究来评估这些分子在体外和体内的相对活性。
规则医学公司所进行的血清蛋白分析证实了早期的研究，并为CIA模型疾病进展和对B7-H4-Ig治疗的应答提供新的读数。最有前景的标记物包括CRP、ET-1、IL-6、MCP-1、MCP-3、MIP-2和TNF-α。血清生物标记物研究的结果以及先前公开的结果表明，B7-H4-Ig可影响嗜中性粒细胞成熟和向滑膜中的迁移(朱G.等人，血液学，113，1759-1767(2009)；阿祖玛T.(Azuma，T.)等人，PLoS医学(PLoS，Med.)6，e1000166(2009))。
实例4：B7-H4-Ig减少促炎性分子
方法与材料
在第33天，从如实例3中所述进行治疗的小鼠收集血浆，并使用BDTM流式微珠阵列(Cytometric Bead Array，CBA)Flex Set分析促炎性分子，例如TNFα、IL6和趋化因子(MCP-1)。
结果
图20A、20B和20C中提供的数据分别证实，B7-H4-Ig显著减少经治疗CIA小鼠中TNFα、IL6和MCP-1的产生。
实例5：B7-H4-Ig影响细胞因子产生和T细胞分化
材料与方法
小鼠
BALB/c小鼠D011.10和C57BL/6小鼠购自杰克森实验公司。SJL小鼠购自哈兰公司。所有小鼠都根据NIH指南喂养。本研究中所用小鼠的年龄介于6周与9周之间。
其它试剂
小鼠对照IgG：洛克兰公司(Rockland)，#010-0102；CD4+T细胞阴性分离试剂盒(CD4+T cell negative isolation kit)：美天旎公司(Miltenyi)，#130-090-860；CD62L+阳性选择磁珠：美天旎公司，#130-049-701；CD25+T细胞耗尽：抗mCD25-PE：美天旎公司，#120-000-900，和抗PE磁珠，美天旎公司：#120-000-294；
Figure BDA0000158191410000981
小鼠CD3/CD28T细胞扩增珠粒(Mouse CD3/CD28T Cell Expander bead)：英杰公司(Invitrogen)，#11452D；小鼠细胞因子试剂盒：密理博公司(Millipore)，MPXMCYTO-70K；96孔平底：科斯塔公司(Costar)，#3596；β-巯基乙醇：英杰公司，#21985-023；HL-1培养基：龙沙公司，#344017；合成OVA323-339：ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO：138)；PLP130-151：HSLGKWLGHPDKF(SEQ ID NO：139)；PLP130-151：NTWTTCQSIAFPSK(SEQ ID NO：140)；MOG35-55：MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQID NO：141)；MILLIPLEXTMMAP：密理博公司
细胞因子和抗体
表8列出有关用于体外T辅助细胞极化的细胞因子和抗体的详细信息。
表8.用于体外T辅助细胞极化的细胞因子和抗体
Figure BDA0000158191410000982
Figure BDA0000158191410000991
分离CD4+CD62L+原生T细胞
先从表达对OVA323-339具有特异性的II类MHC限制性T细胞受体的D011.10小鼠分离出小鼠脾细胞。使用美天旎公司的CD4+T细胞阴性分离试剂盒(目录号130-090-860)纯化小鼠CD4+T细胞。使用美天旎公司的抗CD62L阳性选择磁珠(目录号130-049-701)进一步纯化原生CD4+T细胞。
体外Th1极化
在无血清HL-1培养基中，在rIL-2(1ng/mL)、rIL-12(4ng/mL)和抗IL-4(1μg/mL)存在下培养带有或不带有CD25+T细胞的CD4+CD62L+原生T细胞。测试呈多种型式(B7-H4-Ig的可溶和不可溶形式)的鼠类B7-H4-Ig的活性。也评估鼠类B7-H4-Ig非特异性地或在抗原特异性刺激下对活化的T细胞的活性。为提供呈固定型式的鼠类B7-H4-Ig，先用每孔100μl(1μg/mL)鼠类B7-H4-Ig涂覆96孔平底板，并在37℃下培育2小时。为提供呈可溶形式的鼠类B7-H4-Ig，将鼠类B7-H4-Ig以1μg/mL或如图式简单说明和有关剂量依赖性研究的图式中指示添加到组织培养物中。对于非特异性抗原活化，将小鼠CD3/CD28T细胞扩增珠粒(
Figure BDA0000158191410000992
英杰公司，目录号11452D)添加到每孔中，细胞与珠粒比率为1∶1。对于OVA特异性活化，先从Balb/C小鼠分离出脾细胞作为抗原提呈细胞(APC)，随后以3000rad照射45分钟，接着添加到每一孔中，APC与应答细胞的比率为1∶1。将20μg/mL OVA323-339肽添加到培养物中。
体外Th17极化
在无血清HL-1培养基中，在rTGF-β(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(4ng/mL)、抗IL-4(1μg/mL)、抗IFN-γ(1μg/mL)和抗IL-2(1μg/mL)存在下，培养带有或不带有CD25+T细胞的CD4+CD62L+原生T细胞。为提供呈固定型式的鼠类B7-H4-Ig，先用每孔100μl(1μg/mL)鼠类B7-H4-Ig涂覆96孔平底板，并在37℃下培育2小时。为提供呈可溶形式的鼠类B7-H4-Ig，将鼠类B7-H4-Ig以1μg/mL或如图式简单说明和有关剂量依赖性研究的图式中指示添加到组织培养物中。对于非特异性抗原活化，将小鼠CD3/CD28T细胞扩增珠粒(
Figure BDA0000158191410000993
英杰公司，目录号11452D)添加到每孔中，细胞与珠粒比率为1∶1。对于OVA特异性活化，先从Balb/C小鼠分离出脾细胞作为抗原提呈细胞(APC)，随后以3000rad照射45分钟，接着添加到每一孔中，APC与应答细胞的比率为1∶1。将20μg/mL OVA323-339肽添加到培养物中。
增殖分析
共培育后20小时，将[3H]-胸苷(1μCi/孔)添加到各孔中。通过使用拓扑康微板闪烁计数器(Topcount Microplate Scintillation Counter)(帕卡德仪器公司(PackardInstruments)，位于康涅狄格州梅里登(Meridan，CT))在添加[3H]-胸苷后48小时检测的[3H]-胸苷吸收来确定增殖。结果表示为三份重复培养物的平均值±SEM。
细胞因子分析
在72小时时，从不含[3H]-胸苷的板收集上清液进行细胞因子分析。使用小鼠细胞因子10-Plex系统(密理博公司)和鲁美诺思液态芯片分析仪(Luminex Iiquidchipanalyzer)(凯杰公司(Qiagen)，位于加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia，CA))或ELISA进行细胞因子测量。
结果
为证实鼠类B7-H4-Ig的体外生物活性，将B7-H4-Ig添加到T细胞极化培养物中。经由MILLIPLEXTMMAP，由[3H]-胸苷并入量和细胞因子产量确定B7-H4-Ig抑制T细胞增殖的能力。此外，通过比较在CD4+CD25+Treg细胞存在或不存在下T细胞极化培养结果，来评价B7-H4-Ig与Treg细胞之间的相互作用。
在Th1细胞和Th17细胞体外极化培养条件下，B7-H4-Ig治疗改变CD4+T细胞活化和分化。先使用美天旎公司的试剂盒从D011.10小鼠分离出小鼠CD4+CD62L+T细胞。如图21中所示，原生CD4+CD62L+T细胞在体外Th1细胞促进条件存在下(在IL2、IL-12和抗IL4存在下)活化；在用
Figure BDA0000158191410001001
小鼠CD3/CD28T细胞扩增珠粒(抗CD3+抗CD28)(对于非特异性刺激)刺激后，以及在原生CD4+CD62L+T细胞在OVA323-339冲击的APC(APC/OVA)存在下活化时，在鼠类B7-H4-Ig存在下显著抑制小鼠CD4+CD62L+原生T细胞增殖。当CD4+T细胞在珠粒和APC活化条件下活化时，获得类似结果。此外，图22显示，在所述这些条件下，鼠类B7-H4-Ig显著降低由小鼠CD4+CD62L+原生T细胞产生的IFN-γ的水平。在所有情况下，不管B7-H4-Ig是以溶液形式(溶液)添加，还是结合(板)于板，都观察到类似结果。
相信MS和EAE都为Th1细胞/Th17细胞介导的，因此，接下来确定当在Th17细胞促进体外培养条件存在下活化时，B7-H4-Ig是否能够抑制原生CD4+CD62L+T细胞分化。如图23中所示，原生CD4+CD62L+T细胞在体外Th17细胞促进条件存在下(在rTGF-β、IL-6、IL-23、抗IL-4、抗IFN-γ和抗IL-2存在下)活化。在用
Figure BDA0000158191410001002
小鼠CD3/CD28T细胞扩增珠粒(抗CD3+抗CD28)(对于非特异性刺激)刺激后，或在原生CD4+CD62L+T细胞在OVA323-339冲击的APC(APC/OVA)存在下活化时，鼠类B7-H4-Ig显著抑制小鼠CD4+CD62L+原生T细胞增殖。当CD4+T细胞在珠粒和APC活化条件下活化时，获得类似结果。此外，图24和25分别显示，在所述这些条件下，鼠类B7-H4-Ig显著降低由小鼠CD4+CD62L+原生T细胞产生的IL-17和TNF-α的水平。当B7-H4-Ig以溶液形式(溶液)添加或结合(板)于板时，都观察到类似结果。
使用同一批次的B7-H4-Ig重复上述体外Th1/Th17分析法3次，其始终证实B7-H4-Ig抑制Th1/Th17细胞增殖和IFN-γ和IL17产生。使用相同目标，即原生CD4+CD62L+T细胞，在以下Th2体外极化条件下，B7-H4-Ig对Th2细胞无影响：IL-2、IL-4、抗IL12和抗IFN-γ(图26)。
经证实，来自不同批次的鼠类B7-H4-Ig的体外生物活性相同。如图27和28中所示，在Th1和Th17体外极化条件下，来自第22批和第23批的B7-H4-Ig分别以剂量依赖性方式对IFN-γ和IL17的产生具有类似抑制作用。此数据不仅证实Th1/Th17分析法的一致性，而且还证实B7-H4-Ig制备方法的一致性。
实例6：人类B7-H4-Ig抑制小鼠Th17细胞
材料与方法
人类B7-H4蛋白与小鼠B7-H4蛋白具有95％同源性。测试人类B7-H4-Ig与鼠类T细胞的交叉反应性。如上文所述分离原生CD4+T细胞。纯化后，如实例5中针对鼠类B7-H4-Ig体外生物活性所述，在IL-2、IL-12和抗IL4(对于Th1细胞促进条件)或TGF-β、IL-6、IL-23、抗IL4、抗IFNγ和抗IL-2(对于Th17细胞促进条件)存在下，使鼠类原生CD4+T细胞极化。将0、0.1、1或10μg/mL人类B7-H4-Ig直接添加到培养物中。将人类对照IgG1添加到培养物中以使最终蛋白质浓度达到10μg/mL。
结果
图29、30和31中提供的数据显示，人类B7-H4-Ig以剂量依赖性方式与小鼠原生CD4+T细胞交叉反应并阻止鼠类Th1/Th17增殖(图29)，这与减少的Th1细胞中IFN-γ产生(图30)和Th17细胞中IL-17产生(图31)相关。当使用不同批次的人类B7-H4-Ig时，获得相同结果。
实例7：B7-H4-Ig影响Treg
方法与材料
耗尽CD4+CD25+T细胞
使用抗mCD25-PE(美天旎公司，目录号120-000-900)和抗PE磁珠(美天旎公司，目录号120-000-294)耗尽CD4+CD25+Treg细胞，随后进行CD62L阳性选择。在耗尽CD4+CD25+T细胞后，CD25+/P3+细胞由约5％减少到1％。
结果
在OVA323-339肽冲击的APC和B7-H4-Ig存在下进行体外Th1极化前，任选耗尽(-CD25+T细胞)DO11.10小鼠CD4+CD62L+原生T细胞群的CD4+CD25+Treg细胞。
据发现，当在Th1细胞或Th17细胞促进条件存在下活化时，B7-H4-Ig使原生CD4+CD62L+T细胞增殖和细胞因子产生水平降低的程度与用于分离原生CD4+CD62L+T细胞的小鼠的年龄相关。原生CD4+CD62L+T细胞的初始选择是基于经由使用AutoMax进行的针对CD4+T细胞的负选择，随后针对CD62L+细胞的正选择。由于小鼠体内存在的Treg细胞的数量随年龄增加，且Treg细胞为CD4+CD62L+CD25+，故接下来确定在CD4+T细胞负选择期间，当在Th1细胞促进条件存在下活化时，耗尽CD25+细胞(即Treg和活化的CD4+T细胞)是否会改变B7-H4-Ig抑制原生CD4+CD62L+T细胞产生IFN-γ的能力。
先从DO11.10小鼠分离CD4+CD62L+原生T细胞，并在rIL-2(1ng/mL)、rIL-12(4ng/mL)和抗IL-4(1μg/mL)存在下极化成Th1细胞，且用OVA323-339冲击的APC(APC/OVA)刺激。将各种剂量的鼠类B7-H4-Ig或对照IgG直接添加到培养物中。如图32A中所示，与Treg细胞存在时的IFN-γ水平(实心圆)相比较，耗尽Treg(空心圆)产生较多的IFN-γ。B7-H4-Ig介导的IFN-γ产生的减少具有剂量依赖性(空心三角形)，并且在CD4+CD25+Treg细胞存在下抑制作用更强(实心三角形)。相反，B7-H4-Ig以剂量依赖性方式增加IL-10的产生(实心三角形，图32B)。
也测试在OVA323-339肽冲击的APC和各种量的鼠类B7-H4-I存在下进行体外Th17极化前，DO11.10小鼠CD4+CD62L+原生T细胞中CD4+CD25+Treg细胞耗尽(-CD25+T细胞)的影响。先从DO11.10小鼠中分离出CD4+CD62L+原生T细胞。在rTGF-β(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(4ng/mL)、抗IL-4(1μg/mL)、抗IFN-γ(1μg/mL)和抗IL-2(1μg/mL)存在下，使包括或耗尽(-CD25+T细胞)CD4+CD25+的细胞极化成Th17细胞，并用OVA323-339冲击的APC(APC/OVA)刺激。将各种剂量的鼠类B7-H4-Ig或对照IgG直接添加到培养物中。如图33A中所示，与Treg细胞存在时的IL-17水平(实心圆)相比较，耗尽Treg(空心圆)产生较多的IL-17。据发现，IL-17产生的减少具有剂量依赖性(空心三角形)。当CD4+CD25+Treg细胞存在时，抑制作用始终较高(实心三角形)。相比之下，图33B显示，鼠类B7-H4-Ig以剂量依赖性方式增加IL-10的产生(空心三角形)，并且当CD4+CD25+Treg细胞存在时IL-10增加较多(实心三角形)。
当用OVA323-339冲击的同种同基因APC或涂有抗原非特异性抗CD3/CD28的珠粒刺激时，B7-H4-Ig在体外抑制原生OVA323-339特异性转基因CD4+T细胞增殖，并抑制其分化成Th1或Th17细胞。此外，B7-H4-Ig降低分别由Th1细胞和Th17细胞产生的IFN-γ和IL-17/TNFα的水平。当纯化的CD4+CD62L+原生CD4+T细胞中CD4+CD25+T调控细胞耗尽时，IFN-γ和IL-17产生的减少不太明显。最重要的是，在Th1/Th17极化期间，当存在CD4+CD25+T调控细胞时，B7-H4-Ig以剂量依赖性方式增加IL-10的产生。这些数据显示，B7-H4-Ig可部分作用于Treg细胞以上调IL-10的表达，并抑制Th1和Th17的效应子分化和效应功能。
实例8：B7-H4-Ig促进iTreg诱导作用
材料与方法
体外诱导iTreg细胞
先在室温下用CFSE(5μM)标记CD4+CD62L+原生T细胞10分钟。通过添加0.5体积冰冷的胎牛血清来淬灭染料。在冰上培育细胞5分钟，随后离心以收集细胞小球。再在HL-1培养基中洗涤细胞2次。随后在TGF-β(10ng/mL)和IL-2(10、50、100U/mL)存在下培养细胞3天，随后用抗FoxP3APC进行细胞内染色。进行FACS分析以检测FoxP3+，体外扩增的iTreg细胞。
结果
上述发现表明，B7-H4-Ig诱导原生CD4+CD62L+T细胞向Treg细胞表型分化和/或直接增强Treg细胞功能。因此，接下来检查在可诱导Treg(iTreg)细胞促进条件存在下用B7-H4-Ig处理原生CD4+CD62L+T细胞是否会使CD4+CD25+FoxP3+iTreg细胞数量增加。首先，优化体外iTreg诱导培养条件，以使实验条件能够评估B7-H4-Ig对iTreg诱导具有何种额外作用(如果有的话)。从雌性SJL小鼠分离CD4+T细胞。先用CSFE标记纯化的小鼠CD4+CD62L+T细胞，并在TGF-β(10ng/mL)和0、50或100U/mL浓度IL-2存在下诱导产生iTreg细胞。3天后进行FACS分析以检测FoxP3的表达和CFSE含量。当使用100U/mL IL-2进行iTreg分化时，检测呈FoxP3阳性且用CFSE稀释的细胞群。当使用较少IL-2时，此细胞群的大小减小。
为评估B7-H4-Ig在iTreg分化中的作用，使用次优的iTreg条件(10ng/mL TGF-β和50U/mL IL-2)。此举使得如果B7-H4-Ig确实诱导CD4+CD25+FoxP3+细胞百分含量增加，那么很明显B7-H4-Ig诱导的增加被TGF-β/IL-2作用遮蔽。针对染色细胞的FACS分析揭露，当在次优iTreg细胞促进条件(10ng/mL TGF-β和50U/mL IL-2)存在下活化原生CD4+CD62L+T细胞时，诱导原生CD4+CD62L+T细胞在体外表达FoxP3和CD25，即iTreg。添加不同量的鼠类B7-H4-Ig(0、1、5或10μg/mL)。B7-H4-Ig以剂量依赖性方式增加FoxP3+CD25+iTreg的百分含量，其中当在10μg/mL B7-H4-Ig存在下活化原生CD4+CD62L+T细胞时，诱导最高百分含量的FoxP3+CD25+T细胞。相比之下，当在10μg/mL对照IgG存在下活化原生CD4+CD62L+T细胞时，未观察到FoxP3+CD25+iTreg增加。
实例9：B7-H4-Ig调节CD4+T细胞活化和nTreg抑制功能
材料与方法
体外抑制分析法
在B6背景下，从10只FoxP3-GFP小鼠采集脾和淋巴结。将细胞制成单细胞悬浮液，并收集总计1.76×109个细胞。在本分析法中，留出1×108个细胞以照射用于APC。如上文所述，纯化出剩余细胞中的原生CD4+T细胞。收集总计6.2×108个原生CD4+T细胞。留出5×107个细胞作为本实验中的效应T细胞。用抗CD4PE-Cy7对其余细胞(5.7×108个)染色，并经由MoFlo拣选PE-Cy7+/GFP+细胞。由MoFlo收集总计4×106个nTreg(CD4+/FoxP3+)，纯度99％。抑制分析法培养物由1×105个效应T细胞+1×105个经照射APC+αCD3(1μg/mL)在圆底板中建立，最终体积为200μl。培养孔也接受各种比率的nTreg细胞：B7-H4-Ig。
结果
为进一步确定B7-H4-Ig对Treg细胞功能的影响，使用从B6/FoxP3-GFP小鼠脾和淋巴结纯化的天然Treg(nTreg)细胞进行体外Treg抑制分析法。在此转基因小鼠中，GFP转基因处于FoxP3特异性启动子的调控下，允许通过绿色荧光检测表达内源FoxP3的nTreg细胞。
通过MoFLo拣选，从B6/FoxP3-GFP小鼠分离nTreg细胞(CD4+/CD62L+/FoxP3-GFP+)。使用原生GFP-T细胞(CD4+/CD62L+/FoxP3-GFP-)作为应答细胞。将递增数量的nTreg细胞添加到数量恒定的原生CD4+CD62L+T细胞、经照射脾细胞APC和抗CD3中(图34)。如图35中所示，通过使用固定的应答细胞数量(1×105)和递增的Treg细胞(0、1.25×104、2.5×104、5×104、1×105、2×105)，采用各种应答细胞∶nTreg比率，使固定应答细胞/nTreg比率为1∶0、1∶0.12、1∶0.25、1∶0.5、1∶1和1∶2。将各种量的B7-H4-Ig(0、1、5或10mg/mL)添加到抑制分析法中，并在3天后，借助[3H]-胸苷评估应答细胞增殖。
如图35中所示，在nTreg细胞不存在(比率为1∶0)下，B7-H4-Ig以剂量依赖性方式抑制CD4+T细胞活化和增殖。在B7-H4-Ig不存在(闭合圆)下，nTreg也以剂量依赖性方式阻止CD4+T细胞活化。在比率1∶2(1个应答细胞∶2个nTreg)下，nTreg细胞几乎消除CD4+T细胞活化。当存在nTreg和鼠类B7-H4-Ig时，观察到显著抑制作用。在应答T细胞∶nTreg比率为1∶0.12和1∶0.25下，在鼠类B7-H4-Ig不存在下未检测到抑制作用。然而，5或10μg/mL B7-H4-Ig完全阻止抗CD3诱导的T细胞活化。在B7-H4-Ig不存在下，抑制作用仅在较多nTreg存在下增加，应答细胞/nTreg比率为1∶0.5、1∶0、1∶1和1∶2。
实例10：B7-H4-Ig调节PLP139-151肽诱发的复发型EAE(R-EAE)中疾病的诱发和进展
方法与材料
PLP诱发的R-EAE模型
对于PLP139-151诱发的R-EAE，用100μL含有200μg结核杆菌(M.tuberculosis)H37Ra和50μg PLP130-151(HSLGKWLGHPDKF)(SEQ ID NO：139)的乳液对6到7周龄的雌性SJL小鼠进行皮下免疫，分布在侧腹上的三个点处。每天观察个别动物，并如表8中所示，根据0-5量表以不知情方式评估临床评分(米勒(Miller)等人，现代免疫 学实验指南(Curr.Protocols Immulo.)，第12章，第15.1单元)。除非另外提及，否则对于所有实验，所有小鼠都是年龄和性别相配的。
图36显示典型的B7-H4-Ig治疗方案。将小鼠随机分为四个组。对于疾病预防模型，在用PLP130-151预致敏的同一天，腹膜内(i.p.)注射3mg/kg B7-H4-Ig或对照IgG。对于治疗模型，从PLP130-151预致敏后约第21天开始，腹膜内给与3mg/kg B7-H4-Ig或对照IgG。在这两种情况下，一周3次投予B7-H4-Ig，持续2到4周。
迟发型超敏反应(DTH)应答
如先前所述，使用24小时耳肿胀分析法定量DTH应答。使用三丰型7326工程师测微计(Mitutoyo model 7326engineer′s micrometer)(施莱辛格仪器公司(Schlesinger′sTools)，位于纽约布鲁克林(Brooklyn，New York))测定预激发耳厚度。之后，立即通过使用配备有30号针的100μL汉密尔顿注射器(Hamilton syringe)将含有10μg肽的10μL PBS注射到耳背部表面中，来引发DTH应答。耳激发后24小时，确定耳厚度相对于预激发测量值的增加。结果表示为10-4英寸单位±SEM。结果表示为耳厚度改变(10-4英寸单位)±SEM。测量是由不了解实验组身份的2位研究人员独立进行。借助学生t测试(Student′s t test)评估鼠类B7-H4-Ig治疗的小鼠相对于注射对照IgG的小鼠的耳肿胀显著性。
体外抗原特异性回忆应答(Antigen-Specific Recall Response)
采集引流淋巴结(腋窝、臂和腹股沟)，并通过用无菌60目金属网筛捣碎来获得单细胞悬浮液。在96孔微量滴定板中，在37℃下7％CO2中，在补充或未补充抗原的培养基中培育每孔5×105个无红细胞(经过Tris-NH4Cl处理)的淋巴结细胞24小时，随后用1μCi/孔的[3H]-胸苷冲击，持续最后48小时培养期。通过使用拓扑康微板闪烁计数器(帕卡德仪器公司，位于康涅狄格州梅里登)检测的[3H]-胸苷吸收来确定增殖。结果表示为来自个别动物的三份重复培养物的平均值±SEM。72小时时，收集上清液进行细胞因子分析。使用小鼠细胞因子10-Plex系统和鲁美诺思液态芯片分析仪(凯杰公司，位于加利福尼亚州瓦伦西亚)或ELISA进行细胞因子测量。
结果
在PLP R-EAE动物模型中对诱导表位(PLP139-151肽)具有特异性的T细胞引起急性CNS损伤，由此诱导针对因初始急性损伤而暴露于免疫系统的内源致脑炎性髓磷脂表位的T细胞应答。经显示，在R-EAE中此复发-缓解型疾病的进展是由对PLP178-191肽具有特异性的原生T细胞的重新活化所介导，此过程称为表位扩展。在R-EAE疾病过程期间，小鼠发生以复发-缓解型临床过程为特征的上行性麻痹的脱髓鞘疾病(ascending paralytic demyelinating disease)，这是经过验证的MS模型(米勒等人，现代免疫学实验指南，第15章：第15.1单元(2010))。
为确定B7-H4-Ig的治疗益处，对于疾病预防(在诱发疾病的当天开始的治疗)和治疗干预(在疾病缓解期间开始的治疗)环境，在PLP139-151诱发的R-EAE小鼠模型中测试鼠类B7-H4-Ig(图36)。在这两种情况下，在接下来约2个月的疾病过程中，遵循表9中所示的分级系统评估临床疾病。
表9：用于临床评估EAE的分级系统
Figure BDA0000158191410001061
a尾不举：尾完全无力，并且当提起小鼠时，尾尖不发生卷缩。
b后肢无力：观察到步伐蹒跚，客观指征为，在步行时，小鼠的后肢下落穿过金属笼的顶部。
c部分后肢麻痹：小鼠不再使用后肢来维持臀部姿势或步行，但仍然能在某种程度上移动一个或两个肢体。
d后肢完全麻痹：后肢移动完全丧失；小鼠仅靠其前肢拖动自身。在笼子地板上，利用长吸管以及每日皮下注射生理盐水对此阶段的小鼠喂食，以防因脱水而死亡。
此评估伴随在用肽离体刺激T细胞后通过分析细胞因子分泌来监测DTH应答和针对扩展表位的体外回忆应答一起进行。
B7-H-4-Ig预防R-EAE模型复发疾病
先用在CFA中乳化的PLP139-151肽对雌性SJL小鼠免疫，随后随机分为预防性治疗或治疗性治疗2组。对于每一治疗方案，存在2个亚组，其中一个亚组接受对照IgG，且另一亚组接受鼠类B7-H4-Ig。一周3次给与3mg/kg对照IgG和鼠类B7-H4-Ig，持续4周。预防性治疗(图37)意味着从PLP免疫当天(t＝0)开始，投予鼠类B7-H4-Ig或对照IgG。治疗性治疗(图38)意味着从第21天(t＝21)开始，投予鼠类B7-H4-Ig或对照IgG。提供的数据为利用每组5只小鼠在55天时间段中的平均临床评分，且临床评分和注射都是在双盲情况下进行。
图37和38中提供的数据显示在预防性和治疗性治疗方案中针对鼠类B7-H4-Ig与对照IgG的临床评分的比较。数据显示，利用两种治疗方案，鼠类B7-H4-Ig减少和/或预防R-EAE疾病复发。针对注射对照IgG的R-EAE小鼠的临床评分平均为1.5到2.5，与B7-H4-Ig治疗的动物的0到0.5分相对。鼠类B7-H4-Ig治疗的小鼠与注射对照IgG的小鼠之间存在显著差异。
B 7-H4-Ig防止表位扩展
为确定B7-H4-Ig对阻断CD4+T细胞介导的初级髓磷脂源性表位PLP139-451特异性活性和表位扩展的作用，分析全部4个治疗组经由DTH进行的体内肽特异性应答。第50天，用10μg指定肽激发小鼠耳，并于24小时后测量肿胀情况。评价耳肿胀情况，并绘于图39中(*DTH应答显著小于注射对照IgG的小鼠，p小于0.01)。提供的数据显示，从第0天开始治疗，鼠类B7-H4-Ig治疗显著减少针对优势表位PLP139-151的应答，且如果从第21天开始鼠类B7-H4-Ig治疗，则不会抑制PLP139-151应答。相比之下，当从第0天和第21天开始鼠类B7-H4-Ig治疗时，针对扩展表位PLP178-191特异性应答的应答显著减少。
B7-H4-Ig减少PLP178-191特异性T细胞增殖
如上文所述，从注射鼠类B7-H4-Ig和对照IgG的EAE小鼠分离淋巴结。采集T细胞，并在体外用PLP139-151(诱发疾病的优势表位)和PLP178-191(扩展表位特异性肽)引发。将[3H]胸苷添加到体外刺激分析法中，以分析T细胞增殖。体外肽回忆刺激分析法(peptide recall stimulation assay)显示，鼠类B7-H4-Ig治疗方案在体外减少PLP178-191特异性(扩展表位)T细胞增殖(图40，*[3H]-胸苷并入量显著小于注射对照IgG的小鼠，p小于0.01)。PLP139-151特异性(初级肽)T细胞增殖无显著差异。
B7-H4-Ig下调PLP139-151和PLP178-191特异性T细胞应答
如上文所述，从对照IgG和鼠类B7-H4-Ig治疗的小鼠分离淋巴结。采集T细胞，并在体外用PLP139-151(诱发疾病的优势表位)和PLP178-191(扩展表位肽)引发免疫应答。收集上清液，并经由市售ELISA试剂盒分析IFN-γ。
上述实验清楚地显示，B7-H4-Ig影响复发性疾病。DTH分析(图39)和如在离体T细胞回忆研究中使用PLP139-151肽测量的IFN-γ的产生(图41，*IFN-γ的产生显著低于注射对照IgG的小鼠，p小于0.01)证实了当在第0天投予B7-H4-Ig时B7-H4-Ig对针对PLP139-151肽的免疫应答的特异性抑制作用，表明B7-H4-Ig可能影响急性疾病期。
B7-H4-Ig防止表位扩展
为阐明B7-H4-Ig对EAE急性期的作用，在PLP139-151诱发R-EAE模型中进行第二次体内实验。如上文所述，分析注射鼠类B7-H4-Ig和对照IgG的EAE小鼠中的DTH应答。第10天，用10μg PLP139-151激发小鼠耳，并于24小时后测量肿胀情况。在本研究中，在第0天给与SJL小鼠(每一治疗组n＝10)两种不同剂量的B7-H4-Ig：60μg(3mg/kg)或300μg(15mg/kg)。在注射5次B7-H4-Ig后，即诱发疾病后第10天，使用5只小鼠进行DTH分析，随后进行离体T细胞抗原回忆分析。如图42中所示(*DTH应答显著低于注射对照IgG的小鼠)，当在第0天给与B7-H4-Ig时，如通过针对PLP139-151肽与针对OVA323-339肽(负对照)的DTH应答的比较所测量，3mg/kg(60μg)和15mg/kg(300μg)剂量都显著抑制针对诱导性PLP139-151肽的免疫应答。
从动物采集引流淋巴结，并如上文所述制备单细胞悬浮液，并在体外在抗CD3(0.1-10μg/mL)、PLP139-151(1-20μg/mL)或OVA323-339(1-20μg/mL)存在下再活化。通过[3H]胸苷并入量分析体外T细胞增殖情况。图43(*[3H]-胸苷并入量显著低于注射对照IgG的小鼠，p小于0.01)显示当用抗CD3刺激时，来自注射对照IgG和注射B7-H4-Ig的小鼠组的细胞呈现稳定T细胞增殖，而负对照肽OVA323-339不引发任何应答。相比之下，来自注射3mg/kg和5mg/kg剂量的B7-H4-Ig的组的T细胞对PLP139-151肽刺激显示出极少或无应答。在初级PLP139-151肽回忆时的DTH应答和离体T细胞增殖证实，B7-H4-Ig除对复发性疾病具有明确作用外，还防止受EAE急性期影响。
实例11：B7-H4-Ig阻止致病性CD4+T细胞浸润并促进Treg积累
材料与方法
免疫化学染色
用戊巴比妥(nembutal)使小鼠麻醉，并灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。将每只小鼠的脑和脊髓以OCT(迈尔斯实验公司(Miles Laboratories)；位于伊利诺伊州埃尔克哈特(Elkhart，IN))冷冻于液氮中。在雷切特-江1800型冷冻切片机(Reichert-Jung 1800cryotome)上将来自脊髓下腰椎区的组织切成6μm切片，并安放在萨普夫特加(SuperfrostPlus)带静电载玻片上。对来自脑和脊髓的纵向切片进行横向切片(Cross-section)(对于脑，10μm厚；且对于脊髓，6μm厚)。用针对小鼠CD4、PLP和FoxP3的连结生物素的抗体对组织染色。根据制造商的说明书，利用酪胺信号放大(Tyramide SignalAmplification，TSA)直接检测试剂盒(Direct kit)(NEN，位于马萨诸塞州波士顿(Boston，MA))，以及荧光素抗小鼠IgG(维克特实验公司(Vector Laboratories))显现正染色的生物素化抗体。用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))对切片进行复染色，随后用维塔谢德(Vectashield)封固剂(维克特实验公司)盖片。检查载玻片并使用SPOT RT照相机(诊断仪器公司(DiagnosticInstruments)，位于密歇根州斯特灵海茨(Sterling Heights，MI))经由落射荧光获取图像。在40或100×放大倍率下，分析每一组的切片。
结果
用B7-H4-Ig进行的体外iTreg诱导研究证实，B7-H4-Ig促进iTreg分化(实例8)。在体外抑制分析法中使用来自FoxP3-GFP转基因小鼠的纯化的nTreg细胞，证实B7-H4-Ig减少CD4+T效应细胞的活化和增殖(实例9，图35)。在较少数量nTreg细胞存在下将B7-H4-Ig添加到抑制分析法中对在体外阻止效应T细胞活化和增殖具有显著影响。
在本研究中分析B7-H4-Ig治疗对体内Treg细胞数量的影响。确定在B7-H4-Ig治疗后B7-H4-Ig对浸润到CNS中的CD4+T细胞的数量和表型的影响(体内相关活性位点)。如图44中所示，遵循标准方案，用PLP139-151对SJL小鼠(每组10只小鼠)免疫以诱发R-EAE疾病。先用PLP139-151肽对SJL小鼠免疫。在缓解期间(第23天)开始B7-H4-Ig治疗。小鼠接受100μg小鼠对照IgG或60或300μgB7-H4-Ig，一周3次，持续2周或4周。第35天，在接受6剂B7-H4-Ig后，对半数动物(每组5只)实施安乐死。第50天，在接受12剂B7-H4-Ig后，对剩余动物(每组5只)实施安乐死。收集小鼠脾、引流淋巴结、脊髓和脑，将组织制成单细胞悬浮液并使用血球计进行计数，且分析效应/记忆CD4+T细胞(CD4+CD44+)和Treg细胞(CD4+CD25+FoxP3+)的存在。将全小脑和腰脊髓组织样品速冻，并如上文所述进行处理，以借助组织学分析CNS内存在的CD4+和FoxP3+细胞的数量。
如图45A、45B和45C中所证实，用鼠类B7-H4-Ig进行的治疗显示脾(45A)和引流淋巴结(45B)中CD4+T细胞数量增加的倾向，且相比之下，在6次治疗后，CNS内浸润CD4+T细胞的总数降低(45C)。
针对CD4、CD44和FoxP3对从脾、引流淋巴结和腰脊髓分离的细胞染色，随后进行FACS分析，以获得总CD4+T细胞、Treg(CD4+/Foxp3+)和效应/记忆CD4+T细胞(CD4+7CD44)的数量。数据提供于图46A、46B和46C中，表示为来自个别小鼠的每一表型的细胞的平均数量。当计算Treg(CD4+/FoxP3+)细胞的数量时，B7-H4-Ig治疗使脾(46A)和淋巴结(46B)内Treg细胞的数量明显增加，表明CD4+T细胞群的增加部分归因于Treg细胞增加。当与对照IgG治疗的小鼠相比较时，B7-H4-Ig治疗也减少CNS内的效应/记忆T细胞(CD4+/CD44+)(46C)。在12次治疗的完整过程后，获得类似数据。图46A、46B和46C也揭示，尽管浸润到CNS中的CD4+T细胞较少，但CNS中Treg细胞的量看起来恒定(46C)，表明B7-H4-Ig改变了CNS内Treg细胞与总CD4+T细胞的比率。实际上，如图47中所示，与来自注射对照IgG的小鼠的CNS相比较，在来自B7-H4-Ig治疗的小鼠的CNS中Treg细胞占CD4+T细胞的百分比明显较高。
也经由抗PLP染色分析在对照IgG与B7-H4-Ig治疗的小鼠中的脱髓鞘水平。结果表明，各组之间PLP染色水平无显著、可检测的差异，即脱髓鞘水平无显著差异。然而，也利用组织学方法，通过对从腰脊髓获取的横向切片样品中CD4+T细胞和FoxP3+细胞染色并计算其总数，来检查浸润到CNS中的T细胞。组织学数据与针对存在的CD4+T细胞总数和FoxP3+Treg细胞数量的流式细胞术分析相关。组织学数据与FACS数据一致，证实B7-H4-Ig治疗将增加CNS内FoxP3+细胞的数量。其也显示，FoxP3+细胞与效应CD4+T细胞共定位于CNS内，使其发挥其对致病性T细胞的抑制作用。
总的说来，这些数据清楚地证实，B7-H4-Ig治疗有利地改变CNS内Treg细胞与总CD4+T细胞的比率，并且与提出的作用机制相符，所述作用机制提出，B7-H4-Ig治疗抑制CD4+T细胞活化并增加Treg细胞功能和/或数量。在完整12次剂量后(诱发疾病后第50天)获得类似发现。
也检查B7-H4-Ig治疗对表位扩展的影响。为此，从同一小鼠收集脾和引流淋巴结，分析其CD4+T细胞数量和表型。用在CFA中乳化的50μgPLP139-151肽对SJL小鼠免疫。缓解期间，用B7-H4-Ig治疗小鼠：每剂60或100μg，每周3剂，持续2周(6剂)。第35天，在抗CD3(1μg/ml)、PLP139-151或PLP178-191(20μg/ml)存在下，在每只小鼠的单独孔中活化总脾细胞和淋巴结细胞(5×105个细胞/200μl培养物)。起始培养后24小时，将1μGi[3H]氚化胸苷添加到各孔中，并在起始培养后72小时分析各孔。此分析结果以平均CPM提供。如图48A和48B中所示，用B7-H4-Ig治疗小鼠会减少对PLP139-151和PLP178-191的增殖应答。因此，在SJL小鼠所患R-EAE缓解期间用B7-H4-Ig治疗看起来会经由增加Treg细胞的数量减少表位扩展。图49中提供的此研究的平均临床评分显示，3mg/kg(60μg/剂)和15mg/kg(300μg/剂)剂量的B7-H4-Ig明显预防原发灶复发。在稍后的时间点(起始疾病后第42天后)，较高剂量看起来更有效地降低疾病评分。
实例12：在PLP诱发的R-EAE模型中人类B7-H4-Ig的体内生物活性
也测试人类B7-H4-Ig在PLP139-151诱发的R-EAE小鼠模型中的治疗功效。先用PLP139-151肽对SJL小鼠免疫。先用在CFA中乳化的PLP139-151肽对雌性SJL小鼠免疫，并在第23天随机分为3组。一组接受5mg/kg对照人类IgG1(Synagis)(100μg)，一周3次，持续4周。其余两组给与5或25mg/kg B7-H4-Ig，一周3次，持续4周(图50)。疾病过程持续约2个月，以遵循表9中所示的分级系统评估临床疾病并如上文所述评估长期复发率。
如图51A和51B中所示，如由平均临床评分降低(51A)和长期复发率降低(51B)所确定，两种不同剂量水平(5或25mg/kg)的人类B7-H4-Ig都抑制原发性疾病复发。较高剂量(25mg/kg)看起来引起较低平均临床评分(51A)；然而，低剂量与高剂量组的复发频率无差异(51B)；两种剂量在预防复发发作方面同样有效。
实例5-12中提供的数据显示，B7-H4-Ig治疗对于PLP139-151诱发的复发-缓解型EAE(R-EAE)具有高度有效且可重现的治疗功效。此外，在体内和体外确定B7-H4-Ig的生物活性。数据显示，鼠类B7-H4-Ig在体外抑制在Th1和Th17谱系驱动条件下刺激的原生OVA323-339特异性转基因CD4+T细胞的增殖和分化。B7-H4-Ig还降低分别由Th1细胞和Th17细胞产生的IFN-γ和IL-17的水平。当AutoMax纯化的CD4+CD62L+原生CD4+T细胞中CD4+CD25+T调控细胞耗尽时，IL-17偏移(skewing)的减少不太明显，而这又表明B7-H4-Ig也直接作用于Treg以抑制Th17效应分化和功能。也使用在用于诱导iTreg分化的次优浓度TGF-β和IL-2存在下扩增的原生CD4+T细胞，测试鼠类B7-H4-Ig在体外对诱导可诱导调控T细胞(iTreg)的影响。数据显示，如由针对FoxP3+/CD25+细胞群的FACS分析所确定，B7-H4-Ig以剂量依赖性方式增进原生CD4+T细胞向iTreg表型的分化。因此，B7-H4-Ig同时靶向MS和其它自体免疫疾病所涉及的多个关键致病性发炎性路径，并且还通过诱导Treg抑制炎症。这是B7-H4-Ig促进iTreg诱导作用的第一个直接证据。结合B7-H4-Ig对Th1和Th17细胞分化的影响，这使得B7-H4-Ig与开发用于MS的所有其它药物相区分。
进一步在体外抑制分析法中测试B7-H4-Ig调节Treg抑制功能的能力。使用MoFIo细胞分拣器纯化FoxP3-GFP转基因小鼠中的天然Treg(nTreg)细胞，以获得CD4+/FoxP3-GFP+nTreg细胞。在CD4+/GFP+nTreg细胞和鼠类B7-H4-Ig存在或不存在下，用抗CD3抗体刺激CD4+/GFP-T应答细胞。在nTreg细胞不存在下，B7-H4-Ig以剂量依赖性方式抑制CD4+T细胞活化和增殖，证实了先前的发现。在鼠类B7-H4-Ig不存在下，nTreg细胞以细胞数量依赖性方式阻止CD4+T细胞活化和增殖。然而，当nTreg和B7-H4-Ig都存在时，观察到应答CD4+/GFP-T细胞的免疫抑制水平显著增加。上述针对B7-H4-Ig的体外分析支持了以下模型：B7-H4-Ig不仅阻止原生CD4+T细胞活化并抑制原生辅助T细胞分化成促炎性Th1和Th17子集，而且还增进原生CD4+T细胞分化成iTreg。
也测试B7-H4-Ig在体内调节R-EAE的诱发和进展的能力。在第一次体内研究中，在PLP139-151/CFA肽预致敏当天起始B7-H4-Ig治疗不会影响在R-EAE急性期期间疾病的症状，而是如由平均临床评分以及针对扩展的PLP178-191表位的DTH应答显著减少所确定的，抑制原发性疾病复发。同样，在疾病缓解期间(诱发疾病后第21天)起始B7-H4-Ig治疗会显著降低疾病复发的严重程度，同时抑制针对扩展的PLP178-191表位的T细胞应答。在重复R-EAE研究中，相比第一次体内研究，在PLP139-151/CFA肽预致敏当天开始B7-H4-Ig治疗显示可影响在R-EAE急性期期间疾病的症状。随后，研究证实鼠类B7-H4-Ig增加在经治疗小鼠的周围神经系统中Treg细胞的数量。B7-H4-Ig阻止致病性CD4+T细胞浸润到CNS中，并增加R-EAE小鼠CNS中保护性Treg的百分含量。这一点可解释B7-H4-Ig对疾病原发和复发状态的作用。
在体外和体内测试人类B7-H4-Ig。由体外生物分析得到的结果显示，人类B7-H4-Ig与鼠类原生CD4+T细胞交叉反应，并且其阻止鼠类Th1/Th17增殖和分化。由体内R-EAE实验得到的结果揭示，如由平均临床评分和长期复发率都降低所确定的，人类B7-H4-Ig抑制疾病。此外，来自不同批次(批)的B7-H4-Ig所显示的体外与体内生物活性相同，证实了B7-H4-Ig制备方法的一致性。总之，本发现表明B7-H4-Ig诱导Treg数量和/或功能增加，并减少Th1/Th17应答。
实例13：糖尿病小鼠模型
CTLA4KD/NOD小鼠
方法与材料
将2周龄的雌性和雄性CTLA4KD/NOD小鼠(陈(Chen)等人，美国科学院院刊(PNAS)，103(44)：16400-16405(2006))随机分到以下实验组中：媒剂(11只小鼠)和B7-H4-Ig(12只小鼠)。一周3次用B7-H4-Ig治疗小鼠，持续4周(15mg/kg，腹膜内注射)，并且一周3次先用糖试纸(Diastix)监测尿液中的葡萄糖含量。如果糖试纸显示阳性，那么收集血浆测定血糖水平。当血糖达到≥600mg/dL时，确定糖尿病。
结果
图52显示B7-H4-Ig预防CTLA4KD/NOD小鼠发生自体免疫性糖尿病。一周3次对2周龄的CTLA4KD/NOD小鼠注射媒剂或B7-H4-Ig，持续4周(15mg/kg，每次均为腹膜内注射)。与公开的数据(陈等人，美国科学院院刊，利用RNA干扰技术的CTLA4相关自体免疫小鼠模型(Modeling CTLA4-linked autoimmunity with RNA interference inmice)，2006)一致，当小鼠达到5周龄时(媒剂注射后3周)，30-40％注射媒剂的小鼠发生糖尿病。当小鼠达到24周龄时(B7-H4-Ig治疗后22周)，B7-H4-Ig治疗的CTLA4KD/NOD小鼠未发生糖尿病。
CTLA4KB/BDC2.5/NOD小鼠
方法与材料
将CTLA4KD/NOD小鼠(陈等人，美国科学院院刊(2006))与BDC2.5TCR转基因小鼠(凯兹(Katz)等人，细胞(Cell)，74(6)：1089-100(1993))一起喂养。将11周龄的雌性和雄性小鼠随机分到实验组中：媒剂(3只小鼠)和B7-H4-Ig(5只小鼠)。一周3次用B7-H4-Ig治疗小鼠，持续4周(15mg/kg，每次均为腹膜内注射)，并且一周3次先用糖试纸监测尿液中的葡萄糖含量。如果糖试纸显示阳性，那么收集血浆测定血糖水平。当血糖达到≥600mg/dL时，确定糖尿病。
结果
图53显示B7-H4-Ig延迟CTLA4KD/BDC2.5/NOD小鼠发生自体免疫性糖尿病。一周3次对11周龄的CTLA4KD/BDC2.5/NOD小鼠注射媒剂或B7-H4-Ig，持续4周(15mg/kg，每次均为腹膜内注射)。与历史数据(与陈博士联系)一致，当小鼠达到16周龄时(媒剂注射后5周)，100％注射媒剂的小鼠发生糖尿病。直到小鼠达到21周龄时(B7-H4-Ig治疗后10周)，B7-H4-Ig治疗的CTLA4KD/BDC2.5/NOD小鼠也未发生糖尿病。
实例14：B7-H4-Ig增强Treg活性
方法与材料
由排泄物提取物制备肠抗原
通过从小鼠取出结肠和盲肠，并将内容物放入PBS中来制备提取物。将其放在冰上超声处理3次，历时30秒，随后以10,000g离心10分钟，以除去不溶性物质。收集上清液，无菌过滤并在-60℃下储存。如由联辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)方法所测定，上清液中蛋白质的浓度通常为1到1.5mg/mL。
B7-H4-Ig治疗
一周3次对7到9周龄的雌性野生型Balb/c腹膜内(IP)注射60μg或300μgB7-H4-Ig，持续2周。每组5只小鼠。2周治疗后，对B7-H4-Ig治疗的小鼠和原生对照小鼠实施安乐死，分离T细胞。
制备CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞
如下获得CD4+CD25-T细胞：根据制造商的说明书，使用涂有小鼠抗CD4单克隆抗体的和系统(戴诺AS公司(Dynal AS)，位于挪威奥斯陆(Oslo，Norway))从脾单细胞悬浮液中正选择CD4+T细胞。接着，根据制造商的说明书，通过美天旎公司的磁珠技术(
Figure BDA0000158191410001143
美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotech)，位于德国贝尔吉施格拉德巴赫(Belgisch Gladbach，Germany))，使用PE标记的抗CD25单克隆抗体，随后添加抗PE微珠并耗尽，来将CD4+T细胞(＜98％纯度，通过流式细胞术评估)分成CD25+和CD25-T细胞群。
制备并冲击抗原提呈细胞
使用来自BALB/c小鼠的正常脾细胞作为抗原提呈细胞(APC)。将脾细胞调整到8×106个细胞/毫升，并将400μg提取物肠抗原(最终体积2mL)混入24孔板中以进行抗原提呈。培育18小时后，在培养基中洗涤细胞3次，并照射(3000rad)以消除APC增殖。
增殖分析法
将APC调整到1.0×106个细胞/毫升，并将100μL添加到96孔圆底培养板各孔中。将从Balb/C小鼠分离的CD4+CD25-T细胞调整到1.0×106个细胞/毫升，并将100μL添加到APC中。培养4天后，通过向各孔中添加0.5μCi[3H]-胸苷，培育18小时并采集细胞以计算并入的胸苷数量，来测量增殖。
结果
在标准体外肠抗原预致敏和增殖分析法中，先将正常小鼠的CD4+CD25-T细胞添加到96孔板中，并与肠抗原冲击的APC混合。从对照小鼠或B7-H4-Ig治疗的小鼠分离CD4+CD25+Treg细胞，并以0、6250、12500和25000个Treg/孔添加到上述培养物中。图54显示，当与来自对照小鼠的Treg相比较时，来自B7-H4-Ig治疗的小鼠的Treg在阻止肠抗原预致敏和T细胞增殖方面更有效。此外，当与较低剂量B7-H4-Ig(60μg)治疗的小鼠相比较时，用较高剂量B7-H4-Ig(300μg)治疗的小鼠产生更有效的Treg，表明剂量依赖性作用。
也评估来自B7-H4-Ig治疗的小鼠的CD4+CD25-T细胞对肠抗原预致敏和增殖的应答性。图55显示，来自B7-H4-Ig治疗的小鼠的CD4+CD25-T效应细胞对肠抗原冲击的APC应答良好，并且B7-H4-Ig治疗几乎不影响肠抗原特异性CD4+CD25-T效应细胞应答。
数据表明，从B7-H4-Ig治疗的动物的淋巴结回收的Treg细胞在阻止抗原预致敏和T细胞增殖方面展现的活性高于从对照小鼠获得的Treg细胞。B7-H4-Ig治疗略微影响肠抗原特异性CD4+CD25-T效应细胞。
实例15：B7-H4-Ig在原生细胞活化和分化成Th17细胞期间早期起作用以抑制IL-17A产生
方法与材料
如上述实例中所述，从BALB/c小鼠分离CD4+CD62L+原生T细胞，并在Th17分化混合液(TGF-β1(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(4ng/mL)、抗IL-4(10μg/mL)、抗IFN-γ(5μg/mL)和抗IL-2(5μg/mL))存在下利用抗CD3和抗CD28结合珠粒活化。在4天培养期的第0天、第1天或第2天，将鼠类B7-H4-Ig(10μg/mL)或视黄酸(RA)(10μM)添加到培养物中。在4天培养期结束时，借助ELISA测量IL-17A水平。
结果
Th17分析法持续4天时间。为了确定B7-H4-Ig何时起作用，通过在第0天、第1天或第2天添加10μg/mL鼠类B7-H4-Ig、10μg/mL小鼠IgG对照物或10mM视黄酸，来进行Th17分析法。
当在分析法开始(第0天)添加时，鼠类B7-H4-Ig和RA对IL-17A的抑制最有效，表明B7-H4-Ig在原生T细胞分化成Th17T细胞期间的早期起作用以抑制IL-17A产生和/或分泌(图56)。
实例16：B7-H4-Ig下调Th17细胞分化相关性基因的表达
方法与材料
如上述实例中所述，从BALB/c小鼠分离CD4+CD62L+原生T细胞，并在Th17分化混合液(TGF-β1(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(4ng/mL)、抗IL-4(10μg/mL)、抗IFN-γ(5μg/mL)和抗IL-2(5μg/mL))存在下利用抗CD3和抗CD28结合珠粒活化。将细胞与B7-H4-Ig(两个不同批次：第22批和第23批；1μg/mL)或同种型对照物一起培育。从细胞分离RNA，并用于定量RT-PCR以测试与Th17细胞、Treg、自体免疫病症和炎症相关的大量mRNA的表达水平(SA生物科技公司(SA Biosciences)小鼠Th17组)。
在Th17分化混合液(TGF-β1(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(4ng/mL)、抗IL-4(10μg/mL)、抗IFN-γ(5μg/mL)和抗IL-2(5μg/mL))存在下利用抗CD3和抗CD28结合珠粒活化人类T细胞。将细胞与标识为Q或L的两种不同B7-H4-Ig变异体(1ng/mL)，或作为同种型对照物的针对呼吸道合胞病毒F蛋白A抗原位点中的表位的人化单克隆IgG抗体(Synagis)一起培育。
结果
定量RT-PCR的结果显示，B7-H4-Ig下调Th17细胞分化中所涉及的mRNA(例如主要Th17转录因子RORc以及Th17效应分子IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22)的表达(表10以及图57和58)。
表10：B7-H4-Ig上调或下调活化的Th17细胞中的mRNA
Figure BDA0000158191410001171
Figure BDA0000158191410001181
实例17：鼠类B7-H4-Ig在小鼠TH17分析法中的活性
方法与材料
动物
使用5到7周龄的雌性BALB/c小鼠(哈兰公司)。
分离原生CD4细胞
细胞过滤网
ACK溶解缓冲液
10×汉氏平衡盐溶液(Hank′s Balanced Salt Solution)(西格玛H1641)
CD4负选择试剂盒(美天旎生物技术公司130-090-860)
抗小鼠CD25-生物素(美天旎生物技术公司130-092-569)
CD62L珠粒(美天旎生物技术公司130-049-701)
96孔细胞培养盘(科斯塔3595)
培养基
Figure BDA0000158191410001191
小鼠CD3/CD28T细胞扩增(英杰公司11452D)
HL-1培养基(龙沙公司344017)
1000×β-巯基乙醇(2-Me，英杰公司21985-023)
青霉素(Penicillin)/链霉素(streptomycin)(P/S，英杰公司15070-063)
非必需氨基酸(英杰公司11140-050)
L-谷氨酸(英杰公司25030-081)
TH17分化混合液
重组人类TGF-β1(R&D系统公司240-B-010)
重组小鼠IL-6(易生物科技公司4-8061)
重组小鼠IL-23(易生物科技公司14-8231)
抗小鼠IL-2(易生物科技公司16-7021)
抗小鼠IL-4(易生物科技公司16-7041)
抗小鼠IFN-γ(易生物科技公司16-7311)
B7-H4-Ig和鼠类B7-H4-Ig
鼠类B7-H4-Ig第22批
鼠类B7-H4-Ig第23批
人类B7-H4-Ig(Q)
人类B7-H4-Ig(L)
正和负对照物
全反式视黄酸(ATRA，西格玛公司R2625)
科摩普(ChromoPure)小鼠IgG(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)015-000-003)
Figure BDA0000158191410001192
(麦德免疫公司)
分析
小鼠IL-17AELISA试剂盒
通过用细胞过滤网机械破坏、随后溶解红细胞(RBC)，从6到9周龄的BALB/c小鼠的脾和腹股沟淋巴结获得周围T细胞。
使用美天旎生物技术公司的微珠系统获得原生辅助T细胞(CD4+CD62L+)。通过负选择富集CD4+细胞，随后进行CD62L+的正选择。在一些实验中，还耗尽CD25+细胞。
选择后，在TH17分化混合液(TGF-β1(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(4ng/mL)、抗IL-2(5μg/ml)、抗IL-4(10μg/mL)和抗IFN-γ(5μg/mL))存在下，在体外用抗CD3/CD28珠粒以1∶1细胞∶珠粒比率活化细胞。添加最终浓度为1.25到20μg/ml的鼠类B7-H4-Ig。使用视黄酸(RA)作为正对照，并使用小鼠IgG作为负对照。
培养4天后，对培养物进行短暂离心，并采集上清液且在＜-65℃下储存，直到借助ELISA分析IL-17A水平。
使用流式细胞术和细胞内染色(ICS)来评估初始细胞群的纯度和分化方案的成功性。
结果
进行初始实验以证实鼠类B7-H4-Ig用以减少鼠类Th17细胞的IL-17A表达。在Th17促进条件下，在鼠类B7-H4-Ig、对照小鼠IgG或视黄酸(RA)存在下，刺激CD4+CD62L+T细胞并培养4天。
第4天采集上清液并借助IL-17A ELISA进行分析。如图59中所示，相对于对照小鼠IgG，鼠类B7-H4-Ig和RA治疗都使IL-17A的表达减少。
进行实验以了解人类B7-H4-Ig在本分析法中是否具有活性。由于人类B7-H4与其鼠类类似物的B7-H4细胞外结构域具有95％一致性，故物种的交叉反应性应是可能的。测试的蛋白质浓度为20、10、5、2.5和1.25μg/mL。将两种人类B7-H4-Ig变异体与
Figure BDA0000158191410001201
(不相关的人类IgG1抗体治疗剂)相比较，并将两批鼠类B7-H4-Ig与小鼠IgG对照物相比较。
如图60和61中所示，在Th17分析法中，人类B7-H4-Ig和其鼠类类似物都对小鼠细胞具有活性。
实例18：MRL/lpr狼疮小鼠模型
材料与方法
治疗方案
在本实验中使用4周龄的MRL/lpr小鼠。在动物右耳上用金属标签作标记以进行标识。环磷酰胺(CTX)是用于肾狼疮患者的弥漫性增生性肾小球肾炎的主要药物，据戴克(Daikh)和沃夫斯(Wofsy)报导，利用CTX和CTLA4-Ig的组合治疗在减少肾病和延长患有晚期肾炎的NZB/NZW F1狼疮小鼠的存活率方面比任一单独试剂都有效(戴克和沃夫斯，免疫学杂志(J Immunol.)，166(5)：2913-6(2001))。在概念验证研究中，测试利用重组鼠类B7-H4-Ig和CTX的组合治疗。小鼠经由腹膜内注射接受5mg/kg鼠类B7-H4-Ig(批号DEV-110-5-006)结合或不结合50mg/kg CTX的单独或组合治疗，每2周1次(图62)。根据体内单克隆抗体和融合蛋白研究，选择一周2次的5mg/kg(100μg/小鼠/注射)鼠类B7-H4-Ig的给药方案。用PBS稀释单一治疗和组合治疗以产生类似的500μL注射样品，使用带27号针的3ml注射器进行投予。在蛋白质处理前3天以及在治疗期间和治疗后每隔一周，从下颌下静脉获取血液样品(约200μL)(ARC SOP8050.02.08)。将血液样品收集到血液收集管中，并在离心后从血液样品的上清液采集血浆，并储存于-80℃冷冻器中待用。
抗dsDNA自体抗体分析
通过从5岁的MRL/lpr小鼠(约8个月大)汇集血浆来产生抗dsDNA自体抗体正对照物。将正对照血浆分成数等份，并储存于-80℃冷冻器中待用。
首先，通过在37℃水浴中，将鲑鱼精DNA溶解于PBS中，随后经由0.45μm膜过滤器过滤，来产生dsDNA溶液(10mg/mL)。将dsDNA溶液分成数等份，并在-80℃下储存待用。
在进行自体抗体ELISA前一天，先将100μL dsDNA储备液添加到10mL PBS中，产生最终浓度100μg/ml。随后将100μl稀释过的dsDNA添加到英姆隆(Immulon)2HB96孔平底微量滴定板各孔中。将板放入37℃潮湿恒温箱中，不加盖涂覆过夜。使用微量滴定板洗涤器(hydroFLEX，帝肯公司(TECAN)。软件：HydroControl)，用300μLPBS/T[含0.1％(v/v)吐温-20(Tween-20)(聚山梨醇酯20)的PBS]洗涤板4次，随后在室温下用200μL阻断缓冲液(含10％胎牛血清的PBS)阻断至少1小时，之后用300μL PBS/T洗涤4次。用阻断缓冲液稀释负对照物(正常Balb/C小鼠血浆，1∶2000稀释)、正对照物(1∶5000、1∶10000、1∶20000稀释)和样品(1∶2000稀释)。接下来，将100μL稀释过的对照物和样品各自添加到对应孔(一式两份孔)中，并在室温下培育2小时或在4℃下培育过夜，随后用300μL PBS/T洗涤4次。对于检测，将100μL抗小鼠IgG-HRP(西格玛公司，A9309，在阻断缓冲液中稀释到1∶10000)添加到各孔中，并在室温下培育板1小时，随后用400μL PBS/T洗涤4次。
之后，将100μL室温下预先升温的TMB底物试剂(TMB Substrate Reagent)添加到各孔中。当颜色显现最理想时(约10分钟)，添加100μL停止溶液(1％硫酸)。随后使用微量滴定板读取器(SPECTRAmax，分子装置公司(Molecular Devices)。软件：SoftMax Pro5.2)，在450nm(OD450)下读取板的吸光度。在研究结束时，分析所有血液样品。将测试样品的OD450值相对于以1∶10000稀释的内部正对照物标准化。使用相对值而非绝对Ab浓度进行比较。
组织学分析
为评价肾小球肾炎，采集小鼠肾，并固定于10％福尔马林(formalin)(SAFEFIXII)中，且运送到AML实验公司(AML Laboratories)(位于马里兰州罗斯代尔(Rosedale，MD))。获得7nm切片并在AML实验公司经由标准H&E染色法进行染色。在光学显微镜下，以较低和较高放大倍率获取图像。
蛋白尿分析
通过使用尿分析试纸(urinalysis dipstick)(嘉而美实验公司(GermaineLaboratories)，目录号52100)测试新鲜尿液样品，来测量蛋白尿。将新鲜尿滴收集到预浸剂衬垫(dip reagent pad)上。约1到2分钟后，将衬垫的颜色与比色图表相比较，以在0到4+量表上确定蛋白尿水平，其中0/微量＝阴性，1+＝30mg/dl，2+＝100mg/dl，3+＝300mg/dl，且4+＝＞2,000mg/dl。
结果
将4周龄的雌性MRL/lpr小鼠分成4组(图62)：媒剂、单独CTX、单独鼠类B7-H4-Ig和CTX加鼠类B7-H4-Ig组合治疗(组合(Combo))。每2周一次，腹膜内给与50mg/kgCTX。每周2次，腹膜内投予100μg(5mg/kg)鼠类B7-H4-Ig。组合组每两周接受CTX注射且每周2次接受5mg/kg鼠类B7-H4-Ig。小鼠治疗7周。
表11：MRL/lpr小鼠dsDNA自体抗体数据表
Figure BDA0000158191410001221
Figure BDA0000158191410001231
PC：自体抗体正对照物；以1∶5000、1∶10000、1∶20000稀释
BW：空白孔
对照组：来自Balb/C小鼠的阴性血浆(1∶2000)
-所有MRL/lpr小鼠血浆都以1∶2000稀释。
-OD450读数针对在同一ELISA板上以1∶10000稀释的正对照物的读数标准化。
*在先前血液收集的时间点，偶尔有小鼠死亡。
预先治疗(4周)时且定期收集MRL/lpr小鼠的血浆，直到21周龄。评估抗ds-DNA自体抗体，并针对内对照物(从年龄较大的MRL/lpr小鼠收集的血浆池)标准化(表11)。
在MRL/lpr狼疮小鼠模型中，鼠类B7-H4-Ig和CTX的组合显著减少抗dsDNA自体抗体的产生。图63显示相对抗dsDNA自体抗体测量值，证实利用鼠类B7-H4-Ig和CTX的组合治疗防止经治疗MRL/lpr小鼠体内自体抗体的产生，并且所述组合治疗比单独CTX或鼠类B7-H4-Ig治疗有效。在稍后的时间点，即第19周和第21周，单独鼠类B7-H4-Ig治疗也显示明显较低的自体抗体水平，表明利用优化的给药方案，单独鼠类B7-H4-Ig也可能有效。
当小鼠达到21周龄时，本实验终止。从注射对照媒剂的小鼠和经治疗小鼠收集淋巴器官。在MRL/lpr狼疮小鼠模型中，鼠类B7-H4-Ig和CTX的组合显著减少淋巴细胞增殖。利用鼠类B7-H4-Ig和CTX的组合治疗防止脾和淋巴结扩大。在对动物实施安乐死之前，使用艾米普(AimStrip)蛋白质纸带分析蛋白尿。图64揭示，在利用鼠类B7-H4-Ig和CTX的组合治疗的小鼠中的蛋白尿相比其余组中的小鼠显著减少。
采集肾进行组织学分析。针对肾切片的H&E染色显示，鼠类B7-H4-Ig和CTX的组合治疗减少血管炎并防止肾小球损伤。在注射媒剂的小鼠肾中，在血管周围观察到大范围淋巴细胞浸润，并且在肾小球内观察到红细胞。
在MRL/lpr小鼠中，利用重组鼠类B7-H4-Ig蛋白和CTX的组合治疗明显防止狼疮疾病的进展，显示较少的抗dsDNA自体抗体、无扩大的淋巴器官、较少蛋白尿、肾中淋巴细胞浸润较少以及明显的完整肾小球。
实例19：产生不成熟树突状细胞
由约50mL全血小规模产生DC(n＝3-5个供体)
●每2天新鲜GM-CSF和IL-4+10％人类AB血清
●7天培养
与无血清方法相比较
●在分化开始时添加GM-CSF和IL-4
●5-6天培养
采集不成熟DC
●标记物分析：CD3、14、80、83、86、11C、HLA-DR
●APC-B7-H4-Ig结合，与抗B7-H4竞争
B7-H4-Ig体外分析法
●使用LPS+10、50、250μg/mL B7-H4-Ig或对照IgG1
●收集上清液进行细胞因子分析-先分析TNFa和IL-6；留出上清液以便日后进行其它细胞因子分析
●采集细胞进行DC成熟标记物分析：例如CD80、CD83、CCR7
确定B7-H4-Ig对DC成熟的作用
●使用DC成熟混合液并研究B7-H4对DC成熟的作用
●单独LPS；TNFa+PGE2；IL-lb+IL6+TNFa+PGE2...
●2天成熟与1天成熟的比较；规则培养皿或超低吸附培养皿；使分析法中每孔的细胞数量最少
●收集上清液进行细胞因子分析
●采集细胞进行DC成熟标记物分析：例如CD80、CD83、CCR7
●测试来自3到5个供体的细胞
●确定有关不成熟DC的释放标准，例如细胞标记物和B7-H4-Ig结合
●确定成熟混合液、时程和有关细胞因子和/或成熟标记物的抑制作用的标准
小规模重现
●使用确定的不成熟DC参数处理来自3个供体的细胞
●施用确定的DC成熟混合液和B7-H4-Ig
●分析混合液和成熟DC标记物
大规模产生不成熟DC
●使用由小规模实验确定的不成熟DC条件开始2到3份细胞混合物(leukopak)的处理
●1份细胞混合物一般产生5×108个到1×109个不成熟DC
●低温贮藏不成熟DC
●解冻细胞以进行DC成熟和B7-H4-Ig功能分析
●使用由小规模实验确定的成熟条件
●尝试使每孔细胞数量最少
●测试分析法的稳固性和重现性：细胞因子和成熟DC标记物
●提供不成熟DC以进行受体发现-如果受体发现需要少量细胞，那么在实证研究后，将从小规模细胞工艺获得不成熟DC。
除非另作定义，否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。
所属领域技术人员仅使用常规实验就能认识到或能够确定本文所述的本发明各具体实施例的许多等效物。所述等效物也打算涵盖在以上权利要求书中。
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Claims (35)

1.一种融合蛋白，其包含第一融合搭配物，所述融合搭配物包含与第二多肽直接融合或经由与所述第二多肽融合的连接肽或多肽序列间接融合的B7-H4多肽或其片段，其中所述B7-H4多肽或其片段包含SEQ ID NO：63的IgV或SEQ ID NO：64的IgV，或所述B7-H4融合蛋白缺乏SEQ ID NO：57的KRRS序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述B7-H4多肽是人类或鼠类B7-H4多肽。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述B7-H4多肽包含人类B7-H4的细胞外结构域，或其具有B7-H4结合活性的片段。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述B7-H4多肽是所述人类B7-H4细胞外结构域的至少50个氨基酸的片段，选自由以下组成的群组：
SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：52的32-249、32-248、32-247、32-246、32-245、32-244、32-243、32-242、32-241、31-249、31-248、31-247、31-246、31-245、31-244、31-243、31-242、31-241、30-249、30-248、30-247、30-246、30-245、30-244、30-243、30-242、30-241、29-249、29-248、29-247、29-246、29-245、29-244、29-243、29-242、29-241、28-249、28-248、28-247、28-246、28-245、28-244、28-243、28-242、28-241、27-249、27-248、27-247、27-246、27-245、27-244、27-243、27-242、27-241、26-249、26-248、26-247、26-246、26-245、26-244、26-243、26-242、26-241、25-249、25-248、25-247、25-246、25-245、25-244、25-243、25-242、25-241、24-249、24-248、24-247、24-246、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241，或
SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：53的32-245、32-244、32-243、32-242、32-241、32-240、32-239、32-238、32-237、31-245、31-244、31-243、31-242、31-241、31-240、31-239、31-238、31-237、30-245、30-244、30-243、30-242、30-241、30-240、30-239、30-238、30-237、29-245、29-244、29-243、29-242、29-241、29-240、29-239、29-238、29-237、28-245、28-244、28-243、28-242、28-241、28-240、28-239、28-238、28-237、27-245、27-244、27-243、27-242、27-241、27-240、27-239、27-238、27-237、26-245、26-244、26-243、26-242、26-241、26-240、26-239、26-238、26-237、25-245、25-244、25-243、25-242、25-241、25-240、25-239、25-238、25-237、24-245、24-244、24-243、24-242、24-241、24-240、24-239、24-238、24-237，或
SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：54的32-259、32-258、32-257、32-256、32-255、32-254、32-253、32-252、32-251、31-259、31-258、31-257、31-256、31-255、31-254、31-253、31-252、31-251、30-259、30-258、30-257、30-256、30-255、30-254、30-253、30-252、30-251、29-259、29-258、29-257、29-256、29-255、29-254、29-253、29-252、29-251、28-259、28-258、28-257、28-256、28-255、28-254、28-253、28-252、28-251、27-259、27-258、27-257、27-256、27-255、27-254、27-253、27-252、27-251、26-259、26-258、26-257、26-256、26-255、26-254、26-253、26-252、26-251、25-259、25-258、25-257、25-256、25-255、25-254、25-253、25-252、25-251、24-259、24-258、24-257、24-256、24-255、24-254、24-253、24-252、24-251，或
SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：46的24-241、24-240、24-239、24-238、24-237、24-236、24-235、24-234、24-233、23-241、23-240、23-239、23-238、23-237、23-236、23-235、23-234、23-233、22-241、22-240、22-239、22-238、22-237、22-236、22-235、22-234、22-233、21-241、21-240、21-239、21-238、21-237、21-236、21-235、21-234、21-233、20-241、20-240、20-239、20-238、20-237、20-236、20-235、20-234、20-233、19-241、19-240、19-239、19-238、19-237、19-236、19-235、19-234、19-233、18-241、18-240、18-239、18-238、18-237、18-236、18-235、18-234、18-233、17-241、17-240、17-239、17-238、17-237、17-236、17-235、17-234、17-233、16-241、16-240、16-239、16-238、16-237、16-236、16-235、16-234、16-233，或
SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：47的24-237、24-236、24-235、24-234、24-233、24-232、24-231、24-230、24-229、23-237、23-236、23-235、23-234、23-233、23-232、23-231、23-230、23-229、22-237、22-236、22-235、22-234、22-233、22-232、22-231、22-230、22-229、21-237、21-236、21-235、21-234、21-233、21-232、21-231、21-230、21-229、20-237、20-236、20-235、20-234、20-233、20-232、20-231、20-230、20-229、19-237、19-236、19-235、19-234、19-233、19-232、19-231、19-230、19-229、18-237、18-236、18-235、18-234、18-233、18-232、18-231、18-230、18-229、17-237、17-236、17-235、17-234、17-233、17-232、17-231、17-230、17-229、16-237、16-236、16-235、16-234、16-233、16-232、16-231、16-230、16-229，或
SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：48的24-251、24-250、24-249、24-248、24-247、24-246、24-245、24-244、24-243、23-251、23-250、23-249、23-248、23-247、23-246、23-245、23-244、23-243、22-251、22-250、22-249、22-248、22-247、22-246、22-245、22-244、22-243、21-251、21-250、21-249、21-248、21-247、21-246、21-245、21-244、21-243、20-251、20-250、20-249、20-248、20-247、20-246、20-245、20-244、20-243、19-251、19-250、19-249、19-248、19-247、19-246、19-245、19-244、19-243、18-251、18-250、18-249、18-248、18-247、18-246、18-245、18-244、18-243、17-251、17-250、17-249、17-248、17-247、17-246、17-245、17-244、17-243、16-251、16-250、16-249、16-248、16-247、16-246、16-245、16-244、16-243。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述B7-H4多肽包含如SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85中所述的IgV结构域的至少25个氨基酸。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述B7-H4多肽是所述人类B7-H4IgV结构域的至少50个氨基酸的片段，选自由以下组成的群组：
SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48中任一者的16-144、16-145、16-146、16-147、16-148、16-149、16-150、16-151、16-152、17-144、17-145、17-146、17-147、17-148、17-149、17-150、17-151、17-152、18-144、18-145、18-146、18-147、18-148、18-149、18-150、18-151、18-152、19-144、19-145、19-146、19-147、19-148、19-149、19-150、19-151、19-152、20-144、20-145、20-146、20-147、20-148、20-149、20-150、20-151、20-152、21-144、21-145、21-146、21-147、21-148、21-149、21-150、21-151、21-152、22-144、22-145、22-146、22-147、22-148、22-149、22-150、22-151、22-152、23-144、23-145、23-146、23-147、23-148、23-149、23-150、23-151、23-152、24-144、24-145、24-146、24-147、24-148、24-149、24-150、24-151、24-152，或
SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54中任一者的24-152、24-153、24-154、24-155、24-156、24-157、24-158、24-159、24-160、25-152、25-153、25-154、25-155、25-156、25-157、25-158、25-159、25-160、26-152、26-153、26-154、26-155、26-156、26-157、26-158、26-159、26-160、27-152、27-153、27-154、27-155、27-156、27-157、27-158、27-159、27-160、28-152、28-153、28-154、28-155、28-156、28-157、28-158、28-159、28-160、29-152、29-153、29-154、29-155、29-156、29-157、29-158、29-159、29-160、30-152、30-153、30-154、30-155、30-156、30-157、30-158、30-159、30-160、31-152、31-153、31-154、31-155、31-156、31-157、31-158、31-159、31-160、32-152、32-153、32-154、32-155、32-156、32-157、32-158、32-159、32-160，
SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67中任一者的20-148、20-149、20-150、20-151、20-152、20-153、20-154、20-155、20-156、21-148、21-149、21-150、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、21-156、22-148、22-149、22-150、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、22-156、23-148、23-149、23-150、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、23-156、24-148、24-149、24-150、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、20-156、25-148、25-149、25-150、25-151、25-152、25-153、25-154、25-155、25-156、26-148、26-149、26-150、26-151、26-152、26-153、26-154、26-155、26-156、27-148、27-149、27-150、27-151、27-152、27-153、27-154、27-155、27-156、28-148、28-149、28-150、28-151、28-152、28-153、28-154、28-155、28-156，或
SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：79中任一者的24-152、24-153、24-154、24-155、24-156、24-157、24-158、24-159、24-160、25-152、25-153、25-154、25-155、25-156、25-157、25-158、25-159、25-160、26-152、26-153、26-154、26-155、26-156、26-157、26-158、26-159、26-160、27-152、27-153、27-154、27-155、27-156、27-157、27-158、27-159、27-160、28-152、28-153、28-154、28-155、28-156、28-157、28-158、28-159、28-160、29-152、29-153、29-154、29-155、29-156、29-157、29-158、29-159、29-160、30-152、30-153、30-154、30-155、30-156、30-157、30-158、30-159、30-160、31-152、31-153、31-154、31-155、31-156、31-157、31-158、31-159、31-160、32-152、32-153、32-154、32-155、32-156、32-157、32-158、32-159、32-160，
任选在N末端附接信号肽的1到5个氨基酸。
7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二多肽包含免疫球蛋白恒定结构域。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定结构域包含鼠类免疫球蛋白Cγ2a链的铰链区、CH2区和CH3区。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定结构域是由与SEQID NO：86、SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：90具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％一致性的核苷酸序列编码。
10.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定结构域包含人类免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、CH2区和CH3区。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的融合蛋白，其进一步包含介导所述融合蛋白的二聚或多聚作用以形成均二聚体、杂二聚体、均多聚体或杂多聚体的结构域。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述介导二聚或多聚作用的结构域选自由以下组成的群组：一个或一个以上能够与所述搭配物融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键的半胱氨酸、卷曲螺旋结构域、酸片(acid patch)、锌指结构域、钙手(calciumhand)结构域、CH1区、CL区、亮氨酸拉链结构域、SH2(src同系物2)结构域、SH3(src同系物3)结构域、PTB(磷酸酪氨酸结合)结构域、WW结构域、PDZ结构域、14-3-3结构域、WD40结构域、EH结构域、Lim结构域、异亮氨酸拉链结构域和受体二聚体对的二聚结构域。
13.根据权利要求1所述的融合蛋白，其包含多肽SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：133。
14.根据权利要求1所述的融合蛋白，其包含多肽SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136或SEQ ID NO：137。
15.一种二聚蛋白，其包含第一和第二融合蛋白，其中所述第一和所述第二融合蛋白包含根据权利要求1到14中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述第一和所述第二融合蛋白通过共价或非共价键相互结合形成二聚体。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的二聚或多聚蛋白，其中所述融合蛋白借助二硫键结合在一起。
17.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1到16中任一权利要求所述的融合蛋白的核酸序列。
18.一种载体，其包含根据权利要求17所述的核酸。
19.一种宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的载体。
20.一种用于治疗或抑制有需要的个体的发炎性应答的一种或一种以上症状的方法，其包含：
对所述个体投予有效减少或抑制所述个体的所述发炎性应答的所述一种或一种以上症状的量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述发炎性应答与自体免疫疾病或病症有关。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述个体患有选自由以下组成的群组的自体免疫疾病：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合症、自体免疫性爱迪生氏病(autoimmune addison′s disease)、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性内耳疾病、自体免疫性淋巴细胞增生综合症(alps)、自体免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝赫切特氏病(Behcet′s disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻性皮炎(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳综合症免疫缺陷综合症(CFIDS)、慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、肢端硬皮综合症(Crest syndrome)、克隆氏病(Crohn′s disease)、德戈氏病(Dego′s disease)、皮肌炎、青少年型皮肌炎、盘状狼疮(discoid lupus)、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维性肌炎、葛瑞夫茲氏病(grave′s disease)、格林-巴利综合症(guillain-barre)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto′s thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、Iga肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、青少年性关节炎、美尼尔氏病(Meniere′s disease)、混合型结缔组织疾病、多发性硬化、复发-缓解型多发性硬化、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合症、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏现象(Raynaud′sphenomenon)、瑞特氏综合症(Reiter′s syndrome)、风湿热、类肉瘤病、硬皮病、修格连氏综合症(Sjogren′s syndrome)、僵人综合症、高安氏动脉炎(Takayasu arteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)。
23.一种用于治疗受试者的炎症的方法，其包含对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以抑制或减少选自由以下组成的群组的免疫细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌：Th1、Th17、Th22、分泌或使其它细胞分泌发炎性分子的其它细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中根据权利要求1到18中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白是以有效量投予以抑制或减少Th17、Th1或Th22细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌。
25.一种用于治疗受试者的炎症的方法，其包含对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以增强其对Th1或Th17细胞的抑制作用。
26.一种用于治疗受试者的炎症的方法，其包含对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以促进或增进Treg的IL-10产生。
27.一种用于治疗受试者的炎症的方法，其包含对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以增加Treg细胞数量或增加Treg群。
28.一种用于治疗受试者的炎症的方法，其包含对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以抑制Th1和Th17路径并增强Treg对所述Th17路径的抑制活性，或促进或增进Treg对IL-10的分泌。
29.一种用于减少受试者体内的促炎性分子产生的方法，其包含对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到18中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白或其片段以抑制所述受试者体内一种或一种以上细胞因子的产生。
30.根据权利要求20到29中任一权利要求所述的方法，其进一步包含投予第二治疗剂。
31.一种用于选择用B7-H4融合蛋白治疗的受试者的方法，其包含：
针对一种或一种以上选自由IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22和IL-21组成的群组的细胞因子或MMP的水平筛选受试者，
将所述细胞因子的水平与未患发炎性病症的对照受试者体内细胞因子或MMP的水平相比较，和
如果所述受试者体内一种或一种以上细胞因子的水平比所述未患发炎性病症的对照受试者体内的水平高，那么对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以抑制或减少发炎性病症的一种或一种以上症状。
32.一种用于选择用B7-H4融合蛋白治疗的受试者的方法，其包含针对编码一种或一种以上选自由IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22和IL-21组成的群组的细胞因子或MMP的mRNA的水平筛选受试者，
将所述编码细胞因子或MMP的mRNA的水平与未患发炎性病症的对照受试者体内所述编码细胞因子或MMP的mRNA的水平相比较，和
如果所述受试者体内一种或一种以上编码细胞因子的mRNA的水平比所述未患发炎性病症的对照受试者体内的水平高，那么对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以抑制或减少发炎性病症的一种或一种以上症状。
33.一种用于选择用B7-H4融合蛋白治疗的受试者的方法，其包含：
针对编码一种或一种以上选自由IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22和IL-21组成的群组的细胞因子或MMP的基因的多态现象筛选受试者，和
如果一个或一个以上所述编码细胞因子或MMP的基因具有多态现象，那么对所述受试者投予有效量的根据权利要求1到16中任一权利要求所述的B7-H4融合蛋白以抑制或减少发炎性病症的一种或一种以上症状。
34.根据权利要求20到31中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者先前对用TNF阻断剂进行的治疗无应答。
35.根据权利要求20到34中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者患有慢性和持久炎症。
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