ES2957882T3 - Nanocomposiciones de ácidos biliares poliméricos dirigidas al páncreas y al colon - Google Patents

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Abstract

Las composiciones farmacéuticas que contienen polímeros de ácido poli(biliar) (PBA) para la administración oral de agente(s) muestran una absorción mejorada por el páncreas, el hígado y el colon. Estas nanopartículas muestran una retención significativa en el páncreas y el colon y, por tanto, son útiles para la administración selectiva. Los ejemplos demuestran la eficacia de la administración oral de insulina para tratar la diabetes y la inducción oral de tolerancia mediante la administración de insulina u ovoalbúmina en combinación con rapamicina. Los animales diabéticos tratados con insulina o insulina con rapamicina mostraron una normalización de los niveles de glucosa en sangre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanocomposiciones de ácidos biliares poliméricos dirigidas al páncreas y al colon
Campo de la invención
La invención se dirige en general a nanoformulaciones de ácidos biliares poliméricos que se administran por vía oral para el transporte dirigido del agente al páncreas, el hígado y el colon.
Declaración relativa a la investigación o el desarrollo patrocinados por el gobierno federal
Esta invención se ha realizado con apoyo gubernamental en virtud del acuerdo 0747577 concedido a Tarek Fahmey por la National Science Foundation y en virtud del AI056363 concedido por los National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
La administración oral de péptidos y fármacos es uno de los mayores retos para la administración de fármacos debido a los numerosos obstáculos presentes en el tracto gastrointestinal. Estos obstáculos incluyen: (1) la acidez y la presencia de enzimas digestivas en el estómago, que están optimizadas para degradar muchas moléculas; (2) la baja absorción de productos terapéuticos desde el lumen intestinal debido a las uniones estrechas del revestimiento epitelial; (3) la desactivación o extrusión de muchos fármacos en el revestimiento epitelial; y (4) la exposición del revestimiento intestinal a niveles tóxicos del fármaco, lo que provoca efectos secundarios que limitan la dosis (Samsteinet al.,Biomaterials, 29:703-708 (2008)). Estas barreras disminuyen significativamente la biodisponibilidad de los fármacos y péptidos administrados por vía oral, al tiempo que limitan la dosis máxima tolerable, obligando así a la administración intravenosa de los productos terapéuticos. Sin embargo, la administración oral sigue siendo la vía de administración de fármacos más atractiva por su facilidad y comodidad, lo que redunda en una mejora de la calidad de vida de los pacientes y en una reducción de los costes administrativos.
Uno de los objetivos del diseño de un sistema de administración de fármacos por vía oral es mantener los niveles del fármaco en el intervalo terapéutico durante periodos de tiempo prolongados. El sistema de administración debe proteger el fármaco a pH bajo, facilitar la absorción en el tracto intestinal, evitar la degradación metabólica no deseada y limitar la exposición de las células intestinales. Los sistemas de partículas para la administración oral han intentado resolver algunos de estos problemas. En teoría, pueden proporcionar protección frente a la degradación y la desactivación metabólica, así como limitar la exposición intestinal. Las nanopartículas de poliésteres sintéticos, tales como el poli(ácido láctico), el poli(ácido glicólico) y sus copolímeros poli(lactida-co-glicolida) (PLGA) suelen elegirse por su biocompatibilidad y versatilidad para encapsular diversos fármacos y biologías, así como por la capacidad de ajustar la dinámica de liberación del fármaco variando las proporciones de monómeros y el peso molecular del polímero. La administración oral de partículas de PLGA y su absorción por las células intestinales también se han estudiado a fondo.
Sin embargo, la eficacia de absorción de las partículas suele ser muy baja, con estimaciones de solo un 1% absorbido tras la administración oral. Además, las partículas de PLGA se degradan por hidrólisis de ésteres catalizada por ácidos y, por tanto, liberan gran parte de su contenido en el bajo pH del estómago.
El transporte dirigido de agentes activos y/o agentes de obtención de imágenes a órganos internos tras su administración oral sigue siendo un reto, dado que el duro entorno bioquímico inherente al estómago, concretamente el pH muy ácido y la presencia de enzimas proteolíticas, degrada e inactiva muchos agentes terapéuticos. Sigue existiendo la necesidad de sistemas de administración oral mejorados que aumenten la biodisponibilidad de los fármacos administrados por vía oral a los órganos diana, preferentemente los que están formados por materiales que generalmente se consideran seguros y no requieren una fabricación costosa, y que son ampliamente aplicables para la administración sin el uso de agentes de transporte dirigido.
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un sistema de administración oral altamente eficiente que suministre agentes activos y/o agentes de imagen a órganos internos, especialmente el páncreas y el colon, sin el uso de agentes diana.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos para fabricar sistemas de administración oral muy eficientes.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos de utilización de los sistemas de administración oral muy eficientes.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar formulaciones para la captación selectiva en órganos, tales como el hígado y el bazo.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar formulaciones para inducir la tolerancia, especialmente formulaciones que puedan administrarse por vía oral, y más aún formulaciones que muestren entonces una captación selectiva en el hígado y el bazo.
El documento WO 2009/038591 se publicó el 26 de marzo de 2009 y se titula "Bile salt colloids and methods of making and using thereof".
El documento CN 102351967 se publicó el 15 de febrero de 2012 y se titula "High-molecular material containing cholic acid and live-targeting drug delivery nanoparticle modified by same".
Damge, C.,et al., J.Pharm. Sci., 86:1403-1409, (1997) y se titula "Poly(alkyl cyanoacrylate) nanospheres for oral administration of insulin".
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una formulación oral de nanopartículas sensibles al pH que comprende
(i) bien:
a) un éster de poli(ácido biliar) ("poly(bile)acid", PBA) polimérico formado por la esterificación de monómeros de ácido biliar, en el que el éster polimérico de PBA tiene un peso molecular entre 800 Da y 250000 Da; o bien
b) un éster de poli(ácido biliar) (PBA) polimérico formado por la esterificación de monómeros de ácido biliar, en el que el éster polimérico de PBA tiene un peso molecular entre 500 Da y 50000 Da; y
(ii) uno o más agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico encapsulados o atrapados dentro de las nanopartículas o unidos a las nanopartículas.
La presente invención también proporciona procedimientos para fabricar dichas formulaciones y usos de las mismas. La formulación puede contener excipientes, incluidos, entre otros, emulgentes, tensioactivos, agentes de suspensión, antioxidantes, agentes quelantes, humectantes y conservantes.
Normalmente, las nanopartículas de PBA están formadas por polímeros de PBA con un peso molecular que oscila entre 500 Da y 50000 Da. El tamaño de las nanopartículas oscila entre 1 y 1000 nm, preferentemente entre 60 y 600 nm, más preferentemente entre 100 y 400 nm.
Las nanopartículas de PBA no tienen que incluir agentes de transporte dirigido (moléculas), porque se localizan preferentemente en el páncreas, el hígado o el colon, en ausencia de restos de transporte dirigido, tras su administración oral. Por lo tanto, las nanopartículas de PBA son captadas selectivamente por los tejidos diana, tales como el páncreas, el hígado o el colon, sin necesidad restos de transporte dirigido para estos tejidos. Sin embargo, puede ser deseable incluir restos de transporte dirigido para dirigirse a tipos específicos de células, tales como las células dendríticas, que están presentes en los tejidos que muestra una captación selectiva o potenciada. Por ejemplo, en el caso de que las nanopartículas se utilicen para inducir tolerancia, las nanopartículas de PBA incluyen un agente, tal como la rapamicina y el antígeno frente al que se desea inducir tolerancia, y la nanopartícula de PBA tiene unida a ella una molécula de transporte dirigido específica de las células dendríticas.
Las nanopartículas encapsulan uno o más agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico y/o de obtención de imágenes. La formulación proporciona un medio para administrar por vía oral muchos agentes que normalmente solo pueden administrarse mediante inyección. El agente puede ser un agente terapéutico para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 (T1D) o la diabetes de tipo 2 (T2D). El agente puede ser un agente terapéutico para suprimir o resolver la inflamación en el páncreas, el hígado o el colon, tal como en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). El agente puede ser un producto terapéutico para suprimir o tratar neoplasias de páncreas, hígado o colon. El agente puede ser un inmunomodulador, tal como rapamicina, TGF-beta, rapamicina (análogos incluyen everolimus, ridaforolimus, remsirolimus, umirolimus, zotarolimus), ácido retinoico, agonistas de TLR, ciclosporina, metotrexato, un esteroide, azatioprina y tacrolimus para inducir tolerancia o un adyuvante tal como Cμg para provocar inmunoestimulación, en combinación con un antígeno. Puede encapsularse cualquier combinación de agentes terapéuticos, opcionalmente junto con un agente de obtención de imágenes.
Tras la administración oral de la formulación farmacéutica, las nanopartículas de PBA no dirigidas suelen ser más eficaces en el transporte de agentes a los tejidos diana que las nanopartículas no dirigidas formadas por ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA). Por ejemplo, las nanopartículas de PBA administradas por vía oral pueden administrar una cantidad al menos dos veces mayor de uno o más agentes al páncreas, hígado o colon, en comparación con la cantidad del mismo agente o agentes administrada a estos órganos por el mismo número de nanopartículas de PLGA no dirigidas administradas por vía oral que encapsulan la misma cantidad de agentes o agentes. Las nanopartículas de PBA aumentan la biodisponibilidad de los fármacos administrados por vía oral en el páncreas, el hígado y el colon, en comparación con la biodisponibilidad de los mismos fármacos administrados por vía oral en la misma dosis en forma libre o encapsulados en nanopartículas de PLGA.
Generalmente, las nanopartículas de PBA dirigidas al páncreas, el hígado o el colon, tras su administración oral, se formulan para administrar una cantidad eficaz del agente al páncreas, el hígado o el colon para aliviar uno o más síntomas de una enfermedad o un trastorno. Las nanopartículas de PBA dirigidas al páncreas, el hígado o el colon pueden administrar entre 0,1 ng y 200 |jg de agente/NP del agente al tejido diana, de forma que la dosis total depende del volumen administrado de NP Las nanopartículas de PBA pueden liberar los agentes a lo largo del tiempo, mediante liberación sostenida o a través de una liberación en ráfaga única. Por ejemplo, dicho uno o más agentes encapsulados en las nanopartículas de PBA pueden liberarse a lo largo de un periodo de tiempo que oscila entre una hora y varias semanas, o pueden liberarse en las primeras 24 horas tras alcanzar el órgano diana.
Se han desarrollado procedimientos de fabricación de NP mediante el uso de autoensamblaje y agregación de ácido biliar que comprenden la mezcla de un agente a encapsular o a atrapar con un polímero de éster de ácido de sal biliar. Dos procedimientos para fabricar los ensamblajes de ácidos biliares incluyen la fabricación de unidades de ácidos biliares poliméricos ramificados (en contraposición a las cadenas lineales) y la encapsulación por medio de interacciones entre huésped/anfitrión en cavidades que se forman con dichos bloques constitutivos ramificados; y autoensamblaje supramolecular por medio de unidades de ácidos biliares fluorados. La fluoración introduce un "efecto fluorófobo". Esto difiere claramente de las interacciones hidrófobas o hidrófilas, y da lugar al autoensamblaje en una estructura compleja de mayor tamaño sin necesidad de una formulación especial.
La formulación también puede usarse para prevenir, suprimir o tratar uno o más síntomas de un trastorno, una enfermedad o una afección y puede incluir la administración a un individuo que lo necesite de una forma farmacéuticas unitaria oral de la formulación farmacéutica que contiene las nanopartículas de PBA que encapsulan dicho uno o más agentes. Pueden administrarse a tejidos diana, tales como el páncreas, el hígado o el colon, o a células, tales como las células dendríticas, en los que se liberan dichos uno o más agentes. Los usos pueden estar dirigidos a prevenir, suprimir o tratar los síntomas de la diabetes de tipo 1 o de tipo 2 ("T1D", "T2D"), la enfermedad del intestino irritable ("IBD"), la pancreatitis, la hepatitis, la colitis y las neoplasias del páncreas, el hígado o el colon. Las formulaciones también pueden usarse como vacunas orales con una proteína, molécula pequeña, azúcar, ácido nucleico o combinación de los mismos, o para inducir tolerancia a uno o más antígenos, tales como antígenos autoinmunitarios (por ejemplo, diabetes, lupus, miastenia grave, esclerosis múltiple, psoriasis, gota), antígenos alergénicos (por ejemplo, alimentos, insectos, fármacos).
Algunos ejemplos demuestran la eficacia de la administración oral de proteínas, tales como la insulina. La insulina soluble administrada por vía oral (misma frecuencia y vía) tuvo muy poco efecto. La insulina administrada en partículas de poli(lactida-co-glicolida) ("PLGA") no tiene ningún efecto. La insulina en PUDCA es el único grupo en el que el nivel de azúcar se mantiene por debajo de la línea diabética durante los 21 días (es decir, curativo). El blanco de PUDCA (sin insulina) provoca un descenso inicial de la glucemia, pero luego aumenta. Esto se debe en parte a que el ácido biliar tiene efectos inmunosupresores y antiinflamatorios inherentes.
Los ejemplos muestran el tratamiento o la cura de la diabetes de tipo I. Las figuras 5d y 5e muestran la administración oral de partículas de ácido biliar (poli(ácido ursodesoxicólico)) ("PUDCA"), cargadas con el antígeno (insulina). Las partículas se administran por vía oral 7 veces (una vez al día durante una semana) a animales con diabetes y se controla el nivel de glucosa en sangre durante 21 días. En el grupo de solución salina de control (PBS), el nivel de glucosa en sangre vuelve a aumentar por encima de 250 mg/dl, es decir, el intervalo diabético. La figura 5e establece la supervivencia de los ratones diabéticos. Las figuras 5 g-J establecen el mecanismo de acción sobre las células citotóxicas (figura 5g), las células reguladoras (5h), la liberación de IFN de las células estimuladas después de la eutanasia de los animales (5j) y la liberación de IFN específico de antígeno de las células que han sido tratadas con PUDCA y ovoalbúmina como antígeno. La figura 5J muestra la inducción de la tolerancia.
En resumen, los ejemplos demuestran la inducción de tolerancia a dos antígenos diferentes (insulina) (figura 5 d-h) y con ovoalbúmina (figura 5j). La figura 4 muestra el efecto inmunosupresor del PUDCA cargado con rapamicina en la diabetes inducida por ciclofosmamida.
Los procedimientos de uso de las formulaciones pueden incluir procedimientos de obtención de imágenes no invasiva del órgano diana en su conjunto, o de microentornos diferenciados dentro del órgano diana, tales como focos de inflamación, vasculatura permeable o neoplasias, solos o junto con terapia.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un histograma que muestra la distribución del tamaño de las nanopartículas de poli(ácido biliar) (PBA) como intensidad (%) frente al diámetro (nm).
La figura 2A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de liberación del colorante DiR en condiciones estomacalesin vitro(con enzimas estomacales a pH 2,0) a partir de nanopartículas formadas por poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), PLGA recubierto con EUDRAGIT, PLGA y mezcla de poli(ácido ursodesoxicólico) (UDC) (50:50) (UDC50) o PUDC solo a las 2 horas o a las 4 horas. La figura 2B es un gráfico lineal que muestra el porcentaje de liberación de DiR en el estómago a lo largo del tiempo (días). La figura 2C es un gráfico de barras del tamaño de las partículas (nm) de PLGA, PLGA/PUDCA y PUDCA en condiciones estomacales incubadas durante 0, 4 o 24 horas. La figura 2D es un gráfico de barras que muestra las mediciones de resistencia en células colónicas humanas modelo (línea celular CaCo)in vitro.Mediciones de permeabilidad (aparente): (Papp*10-7 (cm/seg del colorante libre DiR o nanopartículas formadas de PLGA, poli(ácido cólico) (C), poli(ácido litocólico) (LC), poli(ácido desoxicólico) (DC), poli(cheno -ácido desoxicólico) (CDC), o UDC y que contiene DiR. La permeabilidad de las nanopartículas se midió en placas Transwell a través de monocapas de células CaC0-2. La figura 2E es un gráfico de barras que muestra la captación de NP en células Caco-2. Se sembraron células Caco-2 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo y se añadieron NP cargadas con Dir (Dir-NP, 100 μg/ml) al medio para evaluar la captación de las NP en las células Caco-2. Las células se incubaron durante 4 h y la captación de Dir-NP se midió utilizando un lector de placas después del lavado. La figura 2F es un gráfico de barras que muestra la permeabilidad a través de la capa de células Caco-2 (x 107, cm/s) de las NP DiR, PLGA y PAB. Para los estudios de permeabilidad, se sembraron células Caco-2 a 7 x 104 células/cm2 en filtros Transwell de 0,4 mm de poro durante aproximadamente 30 d a 37 °C y 5 % de CO2. Se añadieron NP cargadas con Dir (1 mg/ml) o Dir soluble a la cámara apical de los filtros Transwell y se tomaron muestras del medio en la cámara basolateral para medir la intensidad de fluorescencia (Aex: 750 nm, Aem: 790 nm). La figura 2G es un gráfico de barras que muestra la viabilidad celular (%) de las células Caco-2 y BMM incubadas con NP de PLGA o PAB. Se sembraron células Caco-2 o BMM en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo y se añadieron Dir-NP (1 mg/ml) al medio. Las células se incubaron durante 4 h y la viabilidad celular se midió mediante el uso de un ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue®. Las NP de PBA mostraron una captación más rápida y una mayor permeabilidad en las células Caco-2 que las NP de PLGA. Se observó una citotoxicidad moderada en células Caco-2 y BMM en las NP utilizadas en el estudio. La figura 2H es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia de macrófagos derivados de la médula ósea (del inglés "bone marrow derived macrophages", BMDM) tras la incubación con PLGA cargado con DiR, mezcla de PLGA y UDC (50:50) (UDC50) o nanopartículas de UDC durante 2, 4 u 8 horas. La figura 2I es un gráfico lineal que muestra la liberación de las nanopartículas de los BMM tras la captación celular. La figura 2J es un gráfico de barras que muestra la permeabilidad a través de la capa de células Caco-2 (x 107, cm/s) de las NP DiR, PLGA, PLGA/PUDCA y PUDCA.
Las figuras 3A y 3B son gráficos de barras que muestran la viabilidad (%) de las células CaC0-2, macrófagos (figura 3A) y NIH-3T3 (figura 3B) cuando se incuban durante 24 horas en cultivo con nanopartículas formadas por PLGA (L), poli(ácido cólico) (C), poli(ácido litocólico) (LC), poli(ácido desoxicólico) (DC), poli(ácido quenodesoxicólico) (CDC), o poli(ácido urso-desoxicólico) (UDC) como se describe con referencia a la Figura 2.
La figura 4A es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia por gramo de tejido de estómago, intestino grueso o intestino delgado 4 horas después de la administración oral de nanopartículas cargadas con DiR formadas por PLGA (L), poli(ácido cólico) (C), poli(ácido litocólico) (LC), poli(ácido desoxicólico) (DC), poli(ácido quenodesoxicólico) (CDC) o poli(ácido ursodesoxicólico) (UDC). Las nanopartículas se administraron en un volumen de 300 μl a una concentración de 5 mg/ml. La figura 4B es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia del páncreas, hígado, pulmón, bazo, riñón y corazón, cuatro horas después de la administración oral de 5 mg/ml de nanopartículas formadas por PLGA (2), poli(ácido cólico) (PCA, 3), poli(ácido litocólico) (PLCA, 4), poli(ácido desoxicólico) (PDCA, 5), poli(ácido quenodesoxicólico) (PCDCA, 6) o poli(ácido ursodesoxicólico) (PUDCA, 7), o colorante DiR libre (1). La figura 4C es un gráfico de barras de los datos de la figura 4B normalizados por gramo de páncreas, hígado, pulmón, bazo, riñón y corazón. La figura 4D es un gráfico de barras que muestra la biodistribución (% de dosis inicial/g de tejido) de las NP de PBA en los órganos 4 horas después de la ingestión por sonda oral. La figura 4E es un gráfico de barras que muestra la cinética de captación (% de dosis inicial/g de páncreas (oral)) de NP en el páncreas en función de la formulación de las partículas. La figura 4F es un gráfico de barras que muestra la captación pancreática de NP cargadas con cumarina 6 (intensidad de cumarina 6 en páncreas (x107)).
La figura 5A es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia por gramo de páncreas tras 4, 8, 12 y 24 horas después de la ingestión por sonda oral de colorante DiR libre o de nanopartículas cargadas con DiR formadas por PLGA, mezcla de P<l>G<a>y PUDCA (50:50, o PUDCA solo. La figura 5B es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia tras la administración oral del colorante cumarina 6 en PBS, en TWEEN®, o cargado en nanopartículas de PLGA o PUDCA. La figura 5C es un gráfico de barras apiladas que muestra la intensidad de fluorescencia del páncreas, hígado, pulmón, bazo, riñón y corazón cuatro horas después de la administración oral de nanopartículas de PLGA o PUDCA. La figura 5D muestra la captación acumulada de NP en los órganos tras la absorción intestinal. La figura 5E es un gráfico circular que muestra el porcentaje de biodistribución de las nanopartículas de PLGA y PUDCA cargadas con DiR cuatro horas después de su administración oral. Aunque la biodistribución no varía entre las dos partículas poliméricas, los datos de las figuras 4C y 5A demuestran que las nanopartículas de PUDCA transportan al páncreas una cantidad de colorante al menos 3,5 veces mayor que las nanopartículas de PLGA. La figura 5F es un gráfico circular que muestra la biodistribución de las NP por porcentaje de la fluorescencia total detectada.
La figura 6A es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia del páncreas dos horas después de la inyección intravenosa de un colorante DiR libre o de nanopartículas cargadas con DiR (5 mg/ml) formadas por P<l>G<a>, mezcla de PLGA y PUDCA (50:50) o PUDCA. La figura 6B es un gráfico de barras que muestra la captación pancreática de colorante o NP 2 h después de la inyección i.v. (% de dosis inicial/g de páncreas (i.v., 2 h)). La figura 6C es un gráfico de barras que muestra la captación de DiR o NP en órganos 4 h después de la administración oral. Se dejó en ayunas a ratones C57BL/6 durante 4 h y se trataron con NP que encapsulaban a Dir por sonda oral (500 mg/kg, 250 μl). El Dir libre y las NP de PLGA actuaron como controles. Se sacrificó a los ratones a las 4 h de la ingestión por sonda y se escanearon los órganosex vivopara medir la intensidad de la fluorescencia. Se observó una mayor captación de NP en el páncreas, los pulmones, el bazo, el estómago y los intestinos, mientras que su acumulación fue relativamente baja en el bazo, los riñones y el corazón.
La figura 6D es un gráfico de barras que muestra la captación de DiR o NP en órganos tras 2 h de administración i.v. El PUDCA, el PLGA y las NP compuestas (100 mg/kg, 50 μl) también se administraron por vía intravenosa (i.v.) a ratones por medio de inyección en la vena de la cola para compararlos con el Dir libre. Se recogieron los órganos y la sangre y se midieron al cabo de 2 h. Se observó una acumulación significativa de PUDCA y NP compuestas en el páncreas. La figura 6E es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia de los páncreas obtenidos de ratones sanos o empobrecidos en macrófagos dos horas después de la administración intravenosa de PUDCA cargado con DiR. La figura 6F es un gráfico de barras que muestra la captación pancreática de las NP de PUDCA en ratones sanos o empobrecidos en macrófagos. La figura 6G es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de macrófagos y linfocitos que contienen NP en páncreas, hígado, pulmón y bazo. La figura 6H es un gráfico de barras que muestra la biodistribución de macrófagos derivados de médula ósea (BMM) que contienen NP de PUDCA. Los BMM se incubaron con NP de PUDCA para cargar macrófagosex vivoy se lavaron para eliminar las NP que no estaban unidas específicamente a las células. Los BMM que contenían NP de PUDCA (1 * 106) se marcaron con Dir (10<j>M) durante 15 min y se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola para comparar la biodistribución con las NP de PUDCA solas (100 mg/kg, 50 j l) y los BMM solos (1 x 106). Los resultados de biodistribución entre estos grupos no fueron estadísticamente significativos, lo que indica que la interacción entre los macrófagos y las NP de PUDCA no redirigió estas células a ningún órgano específico. La figura 6I es un gráfico de barras que muestra la producción de citocinas proinflamatorias (IL-1 p) (ng/ml) a partir de BMM incubados con diversas concentraciones de PUDCA, UDCA o alumbre. La figura 6J es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de acumulación de PUDCA o BMM en los órganos. La figura 6K es un gráfico lineal que muestra el cambio en el número de partículas en las células (x106) a lo largo del tiempo (h) antes y después del lavado de partículas cuando se mantienen a 37 °C tras el lavado. La figura 6L es un gráfico lineal que muestra el cambio en el número de partículas en las células (x106) a lo largo del tiempo (h) antes y después del lavado de las partículas cuando se mantienen a 4 °C tras el lavado. La figura 6M es un diagrama esquemático de las NP de PUDCA que llegan al páncreas tras su administración oral.
La figura 7A es un diagrama que muestra un régimen de tratamiento para prevenir la diabetes de tipo 1 en ratones NOD. La figura 7B es un gráfico lineal que muestra el porcentaje de ratones que desarrollan diabetes a lo largo del tiempo (días) en cuatro grupos diferentes: Ratones NOD sin tratamiento, ratones NOD a los que se administró CY solo, ratones NOD a los que se administró CY y nanopartículas de rapamicina-PLGA, o ratones NOD a los que se administró CY y nanopartículas de rapamicina-PUDCA. La figura 7<c>es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia de los páncreas aislados de los ratones diabéticos tratados con rapamicina-PLGA o rapamicina-PUDCA. La figura 7D muestra los linfocitos Treg CD4+ Foxp3+CD25+ en la población de linfocitos (figura 8D) a los 0, 3, 5 y 7 días tras la administración de CY (sin tratar), o la administración de CY y nanopartículas de rapamicina-PUDCA administradas por vía oral una o dos veces según se indica en la figura.
La figura 8A es un gráfico de barras que muestra la cantidad de insulina (ng) en páncreas de ratones con T1D que recibieron PBS, insulina soluble, o nanopartículas PLGA o PUDCA cargadas de insulina por vía oral (sonda) a las 4, 8, y 24 horas (h) tras la administración. La figura 8B es un gráfico de barras que muestra la concentración de insulina (ng/ml) en el suero de ratones con T1D que recibieron PBS, insulina soluble o nanopartículas de PLGA o PUDCA cargadas de insulina por vía oral (sonda) a las 4, 8 y 24 horas (h) después de la administración. La figura 8C es un gráfico lineal que muestra los cambios en el nivel de glucosa en sangre (mg/dl) a lo largo del tiempo (días, d) en ratones con T1D que recibieron PBS, insulina soluble o nanopartículas de PLGA o PUDCA cargadas de insulina por vía oral (sonda). La figura 8D es un gráfico lineal que muestra el cambio en el peso corporal (gramos, g) a lo largo del tiempo (días, d) de ratones con T1D que recibieron PBS, insulina soluble o nanopartículas de PLGA o PUDCA cargadas de insulina por vía oral (sonda). La figura 8E es una curva de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia (%) a lo largo del tiempo (días, d) de ratones con T1D que recibieron PBS, insulina soluble o nanopartículas de PLGA o PUDCA cargadas de insulina por vía oral (sonda).
La figura 9A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de linfocitos CD8 activados (CD44+) y la figura 9B muestra el porcentaje de Treg CD4+CD25+Foxp3+ en los ganglios linfáticos pancreáticos después de los tratamientos. La figura 9C muestra la producción de IFN-y de linfocitos T CD4+, tratados directamente con NP de PUDCA, y estimulados con anti-CD3 y anti-CD28, la figura 9D es la respuesta de linfocitos T OT-II CD4+ después del cocultivo con CD tratadas con PUDCA que fueron estimuladas con LPS y ovoalbúmina. La figura 9E es un gráfico de barras que muestra la concentración de IL-2 secretada por linfocitos T CD4+ purificados (C57BL/6, 1,0 • 105 células/pocillo, placa de 96 pocillos) que fueron estimulados con anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 e incubados con NP de PUDCA durante 3 d para medir la IL-2. La figura 9F es un gráfico de barras que muestra la concentración de IL-2 secretada por las BMDC. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea ("bone-marrow derived dendritic cells", BMDC) (2,5 • 104) se pretrataron con NP de PUDCA durante 24 h, se lavaron y, a continuación, se estimularon con LPS (10 ng/ml) y ovoalbúmina (OVA, 20 jg/ml) durante 24 h, seguido de un cocultivo con linfocitos T CD4+ OT-II específicos de OVA (50 • 103) durante 3 d, seguido de la cuantificación de IL-2 mediante ELISA (figuras 9G, 9H y 91). Las BMDC (1,0 • 105 células por pocillo) se estimularon con LPS y OVA durante 24 h. A continuación, se lavaron las células y se trataron con PUDCA durante 3 días; después, se tiñeron las BMDC para detectar marcadores de superficie (MHC de clase II, CD86 y CD40) mediante el uso de citometría de flujo. La producción de IL-2 y la expresión del marcador de superficie de DC no se vieron afectadas por el tratamiento con PUDCA NP.
La figura 10A es un gráfico lineal que muestra un cambio en el porcentaje del peso corporal original en función del tiempo (días) en ratones de tipo salvaje y en ratones con colitis inducida por dextrano sulfato de sodio (DSS). La figura 10B es un gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia del tracto gastrointestinal de ratones sanos que reciben nanopartículas de PUDCA cargadas con DiR, ratones con EII que reciben nanopartículas de PUDCA cargadas con DiR o ratones con EII que reciben nanopartículas de PLGA cargadas con DiR después de 3 y 24 horas tras la administración oral (sonda) de 250 |jl de solución de una solución 4 mg/ml suspendida en solución salina tamponada de pH 7.4. (Jungseok, Por favor confirme).
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones.
Como se utiliza en el presente documento, el término "nanopartícula" se refiere generalmente a una partícula que tiene un diámetro de hasta aproximadamente 10 nm, pero sin incluir aproximadamente 1000 nm, preferentemente de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 450 nm. Las partículas pueden tener cualquier forma. Normalmente, las nanopartículas son esféricas y el tamaño se presenta como diámetro medido en nm.
Como se utiliza en el presente documento, el término "encapsulado" se refiere al agente, por ejemplo, un agente terapéutico y/o un agente de obtención de imágenes, encapsulado dentro de una matriz polimérica, rodeado por una matriz polimérica y/o disperso por toda una matriz polimérica de la nanopartícula. Como alternativa, o además, el agente puede asociarse a una matriz polimérica por medio de interacciones hidrófobas, interacciones de carga, fuerzas de van der Waals, etc.
Como se utiliza en el presente documento, el término "no dirigido" se refiere a nanopartículas formadas por un polímero, tal como PBA o PLGA, sin elementos adicionales, tales como restos de transporte dirigido, que tienen una mayor afinidad por un tipo de célula u órgano concreto.
Como se utiliza en el presente documento, el término "molécula diana" se refiere a cualquier molécula, tal como un anticuerpo, ligando, molécula de unión a receptores o un fragmento activo de la misma, o un agonista, antagonista o molécula diana específica de tejido o célula, que se utiliza para unir la nanopartícula a una célula del órgano diana. En el presente documento, las expresiones "agente activo" o "agente biológicamente activo" se utilizan indistintamente para referirse a un compuesto químico o biológico que induce un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, en el que el efecto puede ser profiláctico, terapéutico y/o de diagnóstico. Las expresiones también abarcan los derivados farmacológicamente activos y farmacéuticamente aceptables de los agentes activos, incluidos, entre otros, sales, ésteres, amidas, profármacos, metabolitos activos y análogos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "excipiente" o la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva añadida a la formulación para facilitar aún más la administración de la misma.
Como se utiliza en el presente documento, la "administración oral" se refiere a la administración de la formulación divulgada a un individuo por vía oral. La administración oral puede lograrse mediante sonda oral o ingestión de la formulación en forma líquida o sólida. Las formas líquidas de las formulaciones administradas por vía oral pueden presentarse en forma de solución, cápsula o gel. Las formas sólidas de las formulaciones administradas por vía oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico que es suficiente, cuando se administra a un individuo que padece o es susceptible de padecer una enfermedad, un trastorno y/o una afección, para tratar, aliviar, mejorar, aliviar los síntomas, prevenir, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de la enfermedad, el trastorno y/o la afección.
Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" se refiere a aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, un trastorno y/o una afección concretos. Por ejemplo, "tratar" una infección microbiana puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o la propagación del microbio. El tratamiento puede administrarse a un individuo que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección y/o a un individuo que muestra sólo signos tempranos de una enfermedad, trastorno y/o afección con el fin de disminuir el riesgo. de desarrollar patología asociada con la enfermedad, trastorno y/o afección.
Como se utiliza en el presente documento, "tolerancia" significa la incapacidad del sistema inmunitario para organizar una respuesta adaptativa (mediada por linfocitos T o B) frente a un antígeno determinado.
Como se utiliza en el presente documento, "tolerogénico" significa la condición o la capacidad de estimular o aumentar la tolerancia.
Como se usa en el presente documento, "Treg" incluye cualquier linfocito T que confiera supresión. De este modo, el término engloba a los CD4 tradicionales, Treg Foxp3+, así como a otros linfocitos CD4 que no expresan Foxp3, pero que pueden ser reguladoras al secretar IL-10 (linfocitos Tri) entre otras señales, y a los Treg CD8 (Foxp3+ y -) que también han sido identificados.
Como se utiliza en el presente documento, el término "prevención" o "prevenir" significa administrar una formulación a un individuo o sistema con riesgo o predisposición a uno o más síntomas causados por una enfermedad o un trastorno para provocar el cese de un síntoma concreto de la enfermedad o el trastorno, la reducción o la prevención de uno o más síntomas de la enfermedad o el trastorno, la reducción de la gravedad de la enfermedad o trastorno, la ablación completa de la enfermedad o el trastorno, la estabilización o el retraso del desarrollo o de la progresión de la enfermedad o el trastorno.
II. Formulaciones.
Las formulaciones de la invención incluyen nanopartículas formadas por polímeros de poli(ácido biliar) con agentes terapéuticos, profilácticos y/o de diagnóstico incorporados en ellas o sobre ellas, tal como se definen en la reivindicación 1, y, opcionalmente, excipientes farmacéuticamente aceptables.
A. Polímeros
Generalmente, los monómeros de ácidos biliares adecuados para formar polímeros de poli(ácido biliar), se definen con la Fórmula I:
Fórmula I
en la que:
Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o grupo hidroxilo, y
X es un grupo hidroxilo a pH bajo (2-5) que se desprotona a pH superior a 5,5.
El grupo hidroxilo totalmente protonado en la posición X hace que los monómeros sean insolubles en agua, y la pérdida del protón mejora la solubilidad en agua de los monómeros.
La estructura del monómero de ácido biliar, el ácido cólico (CA), se muestra en la Fórmula II:
La estructura del monómero de ácido biliar ácido litocólico (LCA) se muestra en la Fórmula III:
La estructura del monómero de ácido biliar ácido desoxicólico (DCA) se muestra en la Fórmula IV:
La estructura del monómero de ácido biliar quenodesoxicólico (CDCA) se muestra en la Fórmula V:
La estructura del monómero de ácido biliar ácido ursodesoxicólico (UDCA) se muestra en la Fórmula VI:
Otros ácidos biliares adecuados incluyen, entre otros, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurodesoxicólico, ácido litocólico, ácido taurolitolico, ácido tauroquenodesoxicólico, ácido tauroursodesoxicólico, ácido glicolitocólico, ácido glicoquenodesoxicólico y conjugados de taurina de 3-alfa- Ácido 7 alfa-12-alfa-22-xi-tetrahidroxi-5-beta-colestan-26-oico (ácido tetrahidroxiesterocolánico) y 3-alfa-12 alfa-22 xitrihidroxi-5-beta-colestan-26 -ácido oico.
Los monómeros mencionados se esterifican para producir polímeros de poli(ácido biliar) (PBA) con un peso molecular entre 500 y 50.000 daltons. La polimerización a temperatura ambiente de ácidos biliares puede llevarse a cabo utilizando una mezcla de diisopropilcarbodiimida (DIC) y una sal 1:1 de dimetilaminopiridina y ácido ptoluenosulfónico (DMAP/PTSA) en condiciones de reacción suaves y sin reticulación significativa. La activación de la carbodiimida conduce a una esterificación preferente en el carbono 3 y a cadenas poliméricas lineales. Aplicado al UDCA, el UDCA polimerizado puede definirse mediante la fórmula VII:
en la que n es un número que oscila entre 2 y 600, correspondiente a un Pm medio del polímero en el intervalo de 1000 a 240.000.
El grado de ramificación puede oscilar desde una generación 0 (sin ramificaciones) hasta un número ilimitado superior de generaciones.
Los polímeros pueden formarse a partir del mismo monómero, tal como el UDCA, formando poli(UDCA), o PUDCA. Los polímeros pueden estar formados por una mezcla de polímeros de ácidos biliares, formando copolímeros o monómeros que recubren un núcleo de polímero de ácidos biliares. Los monómeros o polímeros pueden mezclarse en cualquier combinación y en cualquier proporción para formar mezclas poliméricas de polímeros de ácidos biliares cuyo peso molecular oscila entre 800 y 250 000 dalton. Normalmente, los polímeros son lineales, pero pueden utilizarse otras estructuras de las cadenas poliméricas, tales como ramificadas, bifurcadas o dendriméricas. Un dendrímero de poli(ácidos biliares) (PUDCA dendrítico, por ejemplo) tendrá una respuesta al estímulo del pH similar a la de sus homólogos de cadena lineal. Este sistema dendrítico estará en estado hinchado o abierto a pH fisiológico o superior a 6,0. Por lo tanto, puede cargarse fácilmente con fármaco mediante asociación no covalente con el polímero dendrítico o por atrapamiento en las cavidades intersticiales formadas en el sistema ramificado. Un pH bajo encogerá el sistema, protegiendo el agente encapsulado y/o liberándolo lentamente. Como tal, un polímero dendrítico de ácido biliar puede actuar como nanopartícula en sí mismo, sin las condiciones de formulación utilizadas con los polímeros lineales.
Los monómeros, o las cadenas poliméricas formadas, pueden incluir elementos con uno o más radionucleidos, o trazadores ópticos (bioluminiscentes, quimioluminiscentes, fluorescentes u otros trazadores ópticos de alto coeficiente de extinción o alto rendimiento cuántico). Del mismo modo, los agentes de contraste no invasivos, como los agentes de RM T1 de la clase de los metales pesados (gadolinio, disprosio, etc.) o los agentes de contraste T2 (óxido de hierro, óxido de manganeso, etc.), los agentes yodados para la atenuación de rayos X (TC) y otras modalidades. La capacidad inherente de estos sistemas para responder a los cambios en el intervalo de pH de 7 a 2 tiene implicaciones significativas para el transporte de productos terapéuticos tanto a los compartimentos endocíticos de bajo pH dentro de las células y/o a sitios de inflamación caracterizados por un microentorno de pH bajo o el entorno circundante de los tumores. Las cadenas poliméricas pueden utilizarse para formar nanopartículas de PBA rastreables, lo que elimina la necesidad de encapsular agentes de obtención de imágenes/marcadores y mejora las modalidades de obtención de imágenes debido a la retención local del agente de obtención de imágenes (confinamiento de la sonda) en la zona.
La solubilidad en agua de los ácidos biliares aumenta exponencialmente con el incremento del pH (Hoffmanet al.,J. Lipid Res., 33:617-626 (1992)). Las cadenas poliméricas de PBA y las nanopartículas fabricadas a partir de ellas también se agregan a pH bajo y se vuelven cada vez más solubles/dispersas a medida que el pH aumenta por encima de 5,5. Estos polímeros y nanopartículas son especialmente adecuados para la administración oral de fármacos, ya que pueden proteger al agente o agentes encapsulados con las nanopartículas del entorno destructivo del estómago. A continuación, el agente o agentes pueden liberarse de forma segura a pH neutro en los intestinos y órganos diana, a medida que los polímeros comienzan a disolverse liberando el agente o agentes.
Las nanopartículas pueden tener un diámetro geométrico medio inferior a 600 nm, pero superior a 10 nm, más preferentemente entre 60 y 450 nm, o superior a 50 nm, pero inferior a 500 nm. El diámetro geométrico medio de una población de nanopartículas puede ser de aproximadamente 60 nm, 75 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm o 475 nm. El diámetro geométrico medio puede estar comprendido entre 100 y 400 nm, entre 100 y 300 nm, entre 100 y 250 nm o entre 100 y 200 nm. El diámetro geométrico medio puede estar comprendido entre 60 y 400 nm, entre 60 y 350 nm, entre 60 y 300 nm, entre 60 y 250 nm o entre 60 y 200 nm. El diámetro geométrico medio puede estar comprendido entre 75 y 250 nm. El 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de las nanopartículas de una población de nanopartículas pueden tener un diámetro que está entre 50 y 500 nm.
En la Tabla 1 del Ejemplo 1, a continuación, se presentan ejemplos de propiedades estructurales y capacidad de carga de las nanopartículas.
Las nanopartículas de PBA responden al pH. El esqueleto del polímero se contrae y las nanopartículas se agregan en un microentorno de pH bajo (pH 2 a 5), y se expande a pH más alto (pH 6 a 7,5) para liberar un agente encapsulado. El polímero PBA permite encapsular fármacos tanto hidrófilos como hidrófobos, péptidos, proteínas, oligonucleótidos. Los agentes encapsulados se liberan a lo largo del tiempo en el microentorno de pH más elevado del lumen intestinal o, en general, en órganos con un pH superior a 5,5-6,0.
B. Agentes terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico a encapsular.
Las nanopartículas de PBA pueden encapsular uno o más compuestos terapéuticos, nutricionales, diagnósticos y profilácticos. Pueden ser proteínas, péptidos, hidratos de carbono, polisacáridos, moléculas de ácido nucleico, moléculas orgánicas y compuestos inorgánicos de bajo peso molecular.
Los agentes terapéuticos y profilácticos incluyen antibióticos, antivirales, antiparasitarios (helmintos, protozoos), agente anticancerosos (denominados en el presente documento "quimioterápicos", incluidos fármacos citotóxicos, tales como doxorubicina, ciclosporina, mitomicina C, cisplatino y carboplatino, BCNU, 5FU, metotrexato, adriamicina, camptotecina y taxol) y antiproliferativos, anticuerpos y fragmentos bioactivos de los mismos (incluidos anticuerpos humanizados, monocatenarios y quiméricos), formulaciones de antígenos y vacunas, hormonas y otros fármacos peptídicos, citocinas, agentes inmunomoduladores (supresores o estimuladores) y antiinflamatorios. Las moléculas pequeñas que tienen un peso molecular de 2000 dalton o menos incluyen agentes antiinflamatorios, tales como esteroides, incluidos metil prednisona, dexametasona, agentes antiinflamatorios no esteroideos, tales como inhibidores de COX-2, agentes antiinflamatorios esteroideos, agentes antiinflamatorios, compuestos de oro, agentes antiangiogénicos, agentes antiinflamatorios salicilatos, ranibizumab, minociclina, agentes anti-VEGF, incluido aflibercept, y rapamicina.
Las formulaciones también pueden utilizarse para administrar proteínas, tales como insulina y análogos de insulina, así como otras proteínas pequeñas, a diferencia de muchos otros sistemas de transporte. Como demuestran los ejemplos, la insulina puede administrarse eficazmente por vía oral para normalizar los niveles de glucosa en sangre en animales diabéticos.
Los ejemplos de materiales de diagnóstico incluyen moléculas paramagnéticas, compuestos fluorescentes, moléculas magnéticas y radionúclidos.
C. Composiciones tolerogénicas
Se proporcionan formulaciones para administrar un antígeno tolerogénico (induce tolerancia), un inmunosupresor (por ejemplo, rapamicina) o, preferentemente, la combinación de los mismos, a células dendríticas o células presentadoras de antígenos ("antigen presenting cells", APC) en el hígado. El antígeno tolerogénico y el inmunosupresor pueden ser cotransportados, más preferentemente cocargados en la misma partícula para el cotransporte simultáneo a la misma célula. A continuación, las APC pueden volverse tolerogénicas y migrar a los ganglios linfoides periféricos, donde se cree que activan, inducen la proliferación, inducen la diferenciación o una combinación de ambas de los Treg, tales como los linfocitos CD4+Foxp3+. Estos Treg pueden entonces reprimir la activación y la producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B específicos para el antígeno tolerogénico. Es deseable que el antígeno y el fármaco inmunosupresor se ubiquen espacialmente en la misma célula dendrítica hepática o célula endotelial hepática para iniciar el programa tolerogénico. Por lo tanto, el antígeno y el fármaco inmunosupresor pueden cargarse, dispersarse, conjugarse o mostrarse en la misma partícula. El cotransporte de inmunosupresor y antígeno en la misma partícula puede tener dos efectos: 1) concentrar la dosis de antígeno y de fármaco en la misma célula, y 2) garantizar la supresión de las mismas células presentadoras de antígenos. Esta estrategia puede reducir o prevenir la inmunosupresión generalizada o la inmunogenicidad específica de antígeno. El inmunosupresor se administra con el antígeno a la misma célula presentadora de antígenos para mejorar el efecto inmunosupresor (por ejemplo, la inducción de tolerancia) de los fármacos. Pueden cotransportarse dos inmunosupresores, tales como el ácido micofenólico y la rapamicina. Preferentemente, la partícula se acumula en el hígado. La partícula puede incluir un resto diana, por ejemplo un resto diana que aumenta (o aumenta aún más) la acumulación de la partícula en el hígado o dirige las partículas a células específicas, tales como células dendríticas en el hígado.
El antígeno y el fármaco inmunosupresor pueden cargarse, dispersarse, conjugarse o mostrarse en partículas separadas o dentro de estas.
A. Antígenos
Las partículas pueden incluir uno o más antígenos, preferentemente un antígeno tolerogénico. Se selecciona un antígeno adecuado en función del resultado terapéutico deseado y de la enfermedad, el trastorno o la afección que se esté tratando. En la técnica se conocen ejemplos de antígenos. Véase, por ejemplo, la solicitud publicada en E<e>. UU. n.° 2014/0356384, en la que se analiza lo siguiente: El antígeno tolerogénico puede derivarse de una proteína de agente terapéutico frente a la que se desea obtener tolerancia. Algunos ejemplos son los fármacos proteicos en su tipo salvaje, por ejemplo, el factor VIII o el factor IX humanos, frente a los que los pacientes no desarrollaron tolerancia central porque eran deficientes en esas proteínas; o los fármacos proteicos no humanos utilizados en un ser humano. Otros ejemplos son los fármacos proteicos que están glucosilados en formas no humanas debido a su producción, o los fármacos proteicos diseñados, por ejemplo, que tienen secuencias no nativas que pueden provocar una respuesta inmunitaria no deseada. Los ejemplos de antígenos tolerogénicos que son proteínas terapéuticas diseñadas que no se encuentran de forma natural en seres humanos incluyen proteínas humanas con mutaciones diseñadas, por ejemplo, mutaciones para mejorar las características farmacológicas. Los ejemplos de antígenos tolerogénicos que comprenden una glucosilación no humana incluyen proteínas producidas en células de levadura o de insecto.
El antígeno tolerogénico puede derivarse de proteínas que se administran a seres humanos que son deficientes en la proteína. Deficiente significa que el paciente que recibe la proteína no la produce de forma natural en cantidad suficiente. Además, las proteínas pueden ser proteínas para las que el paciente sea genéticamente deficiente. Tales proteínas incluyen, por ejemplo, la antitrombina-III, la proteína C, el factor VIII, el factor IX, la hormona del crecimiento, la somatotropina, la insulina, el acetato de pramlintida, la mecasermina (IGF-1), la p-gluco cerebrosidasa, alglucosidasa-a, laronidasa (a-L-iduronidasa), idursufasa (iduronato-2-sulfatasa), galsulfasa, agalsidasa-p (a-galactosidasa), inhibidor de la proteinasa a-1 y albúmina.
El antígeno tolerogénico puede derivarse de anticuerpos terapéuticos y moléculas similares a anticuerpos, incluidos fragmentos de anticuerpos y proteínas de fusión con anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Estos incluyen anticuerpos no humanos (tales como de ratón), anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. En seres humanos se han observado respuestas inmunitarias incluso a anticuerpos humanizados (Getts D. R., Getts M. T., McCarthy D. P., Chastain E. M. L. y Miller S. D. (2010), mAbs, 2(6):682-694). Por consiguiente, las realizaciones incluyen una molécula de fusión para la tolerogénesis que comprende un resto de unión a eritrocitos y al menos un antígeno, un fragmento antigénico o u mimotopo antigénico de una o más de estas proteínas, uniéndose específicamente el resto de unión a eritrocitos, por ejemplo, a la glucoforina A o a una diana elegida del grupo que consiste en Band 3, glucoforina B, glucoforina C u otros miembros del grupo diana eritrocitario. El resto de unión a eritrocitos puede elegirse, por ejemplo, del grupo formado por anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFv, ligandos peptídicos y aptámeros.
El antígeno tolerogénico puede derivarse de proteínas no humanas. Los ejemplos de tales proteínas incluyen adenosina desaminasa, lipasa pancreática, amilasa pancreática, lactasa, toxina botulínica de tipo A, toxina botulínica de tipo B, colagenasa, hialuronidasa, papaína, L-asparaginasa, rasburicasa, lepirudina, estreptoquinasa, anistreplasa (complejo activador de plasminógeno estreptoquinasa anisoilada), globulina antitimocítica, Fab inmunitario polivalente de Crotalidae, Fab inmunitario de suero de digoxina, L-arginasa y L-metionasa.
El antígeno tolerogénico puede derivarse de antígenos de trasplante de aloinjertos humanos. Los ejemplos de estos antígenos son las subunidades de las diversas proteínas de haplotipos de MHC de clase I y de MHC de clase II, y polimorfismos de un solo aminoácido en antígenos de grupos sanguíneos minoritarios, incluidos RhCE, Kell, Kidd, Duffy y Ss.
El antígeno tolerogénico puede ser un autoantígeno contra el que el paciente ha desarrollado una respuesta autoinmunitaria o puede desarrollar una respuesta autoinmunitaria. Algunos ejemplos son la proinsulina (diabetes), los colágenos (artritis reumatoide), la proteína básica de mielina (esclerosis múltiple).
Por ejemplo, la diabetes mellitus de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmunitaria en la que los linfocitos T que reconocen las proteínas de los islotes se han liberado de la regulación inmunitaria y envían señales al sistema inmunitario para que destruya el tejido pancreático. Se han descubierto numerosos antígenos proteicos que son dianas de dichos linfocitos T diabetógenos, tales como la insulina, la GAD65 y la cromogranina-A, entre otros. En el tratamiento o la prevención de la T1D, sería útil inducir tolerancia inmunitaria específica de antígeno hacia antígenos diabetogénicos definidos para inactivar o eliminar funcionalmente los clones de linfocitos T diabetogénicos.
La tolerancia y/o el retraso de la aparición o progresión de enfermedades autoinmunes puede lograrse para diversas de las muchas proteínas que son proteínas autoinmunitarias humanas, expresión que se refiere a diversas enfermedades autoinmunitarias en las que la proteína o proteínas causantes de la enfermedad son conocidas o pueden determinarse mediante pruebas habituales.
El antígeno tolerogénico puede ser una o más de las siguientes proteínas, o un fragmento o péptido derivado de ellas. En la diabetes mellitus de tipo 1, se han identificado varios antígenos principales: insulina, proinsulina, preproinsulina, ácido glutámico descarboxilasa-65 (GAD-65), GAD-67, proteína 2 asociada al insulinoma (IA-2) y proteína 2p asociada al insulinoma (IA-213); otros antígenos incluyen ICA69, ICA12 (SOX-13), carboxipeptidasa H, Imogen 38, GLIMA 38, cromogranina-A, FISP-60, caboxipeptidasa E, periferina, transportador de glucosa 2, proteína asociada al hepatocarcinoma-intestino-páncreas/páncreas, S100p, proteína ácida fibrilar glial, gen regenerador II, homeobox pancreático duodenal 1, cinasa de la distrofia miotónica, proteína relacionada con la subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes y receptores acoplados a proteína G 1-5 de STT. En las enfermedades autoinmunitarias de la glándula tiroidea, tales como la tiroiditis de Hashimoto y la enfermedad de Graves, los principales antígenos son la tiroglobulina (TG), la peroxidasa tiroidea (TPO) y el receptor de tirotropina (TSHR); otros antígenos son el simportador de yoduro de sodio (NIS) y la megalina. En la oftalmopatía y la dermopatía asociadas a la glándula tiroidea, además de los autoantígenos tiroideos, incluida la TSHR, un antígeno es el receptor 1 del factor de crecimiento similar a la insulina. En el hipoparatiroidismo, un antígeno principal es el receptor sensible al calcio. En la enfermedad de Addison, los principales antígenos son la 21-hidroxilasa, la 17ahidroxilasa y la enzima de escisión de la cadena lateral de P450 (P450scc); otros antígenos son el receptor de ACTH, la P450c21 y la P450c17. En el fallo ovárico prematuro, los principales antígenos son el receptor de FSH y la a-enolasa. En la hipofisitis autoinmunitaria, o enfermedad autoinmunitaria hipofisaria, los principales antígenos incluyen el factor proteico específico de la glándula hipofisaria (PGSF) la y 2; otro antígeno es la yodotironina desiodinasa de tipo 2. En la esclerosis múltiple, los principales antígenos son la proteína básica de la mielina, la glucoproteína de los oligodendrocitos de la mielina y la proteína proteolipídica. En la artritis reumatoide, un antígeno principal es el colágeno II. En la inmunogastritis, un antígeno principal es la H+,K+-ATPasa. En la anemia perniciosa, un antígeno principal es el factor intrínseco. En la enfermedad celíaca, los principales antígenos son la transglutaminasa tisular y la gliadina. En el vitíligo, uno de los principales antígenos es la tirosinasa y las proteínas 1 y 2 relacionadas con la tirosinasa. En la miastenia grave, un antígeno principal es el receptor de acetilcolina. En el pénfigo vulgar y sus variantes, los principales antígenos son la desmogleína 3, 1 y 4; otros antígenos son la pemfaxina, las desmocolinas, la placoglobina, la perplaquina, las desmoplaquinas y el receptor de acetilcolina. En el penfigoide ampolloso, los principales antígenos son el BP180 y el BP230; otros antígenos son la plectina y la laminina 5. En la dermatitis herpetiforme de Duhring, los principales antígenos son el endomisio y la transglutaminasa tisular. En la epidermólisis ampollosa adquirida, un antígeno principal es el colágeno VII. En la esclerosis sistémica, los principales antígenos incluyen la metaloproteinasa de matriz 1 y 3, la chaperona molecular específica del colágeno, la proteína de choque térmico 47, la fibrilina-1 y el receptor PDGF; otros antígenos incluyen Scl-70, UI RNP, Th/To, Ku, Joi, NAG-2, proteínas del centrómero, topoisomerasa I, proteínas nucleolares, ARN polimerasa I, II y III, PM-Slc, fibrilarina y B23. En la enfermedad mixta del tejido conectivo, un antígeno principal es U1snRNP. En el síndrome de Sjogren, los principales antígenos son los antígenos nucleares SS-A y SS-B; otros antígenos son la fodrina, la poli(ADP-ribosa) polimerasa y la topoisomerasa. En el lupus eritematoso sistémico, los principales antígenos incluyen proteínas nucleares, tales como SS-A, caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1), nucleosomas, proteínas histonas y ADN bicatenario. En el síndrome de Goodpasture, los principales antígenos son las proteínas de la membrana basal glomerular, incluido el colágeno IV. En la cardiopatía reumática, un antígeno principal es la miosina cardíaca. Otros autoantígenos descubiertos en el síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo 1 incluyen la L-aminoácido descarboxilasa aromática, la histidina descarboxilasa, la cisteína ácido sulfámico descarboxilasa, el triptófano hidroxilasa, la tirosina hidroxilasa, la fenilalanina hidroxilasa, los citocromos hepáticos P450 P4501A2 y 2A6, SOX-9, SOX-10, la proteína receptora detectora de calcio y los interferones de tipo 1 interferón alfa, beta y omega.
El antígeno tolerogénico puede ser un antígeno extraño contra el que el paciente ha desarrollado una respuesta inmunitaria no deseada. Algunos ejemplos son los antígenos alimentarios. Las realizaciones incluyen realizar pruebas a un paciente para identificar un antígeno extraño y crear una fusión molecular que comprenda el antígeno y tratar al paciente para que desarrolle inmunotolerancia al antígeno o al alimento. Se proporcionan ejemplos de tales alimentos y/o antígenos. Los ejemplos son del cacahuete: conaraquina (Ara hl), alérgeno II (Ara h 2), aglutinina deArachis,conglutina (Ara h 6); de la manzana: homólogo de la proteína de resistencia a enfermedades/alérgenos principales de 31 kDa (Mal d 2), precursor de la proteína de transferencia lipídica (Mal d 3), alérgeno principal Mal d 1.03D (Mal d 1); de la leche: a-lactoalbúmina (ALA), lactotransferrina; del kiwi: actinidina (Act c 1, Act d 1), fitocistatina, proteína similar a la taumatina (Act d 2), kiwelina (Act d 5); de la mostaza: albúmina 2S (Sin al), globulina 11 S (Sin a 2), proteína de transferencia de lípidos (Sin a 3), profilina (Sin a 4); del apio: profilina (Api g 4), glucoproteína de alto peso molecular (Api g 5); de la gamba: alérgeno Pen a 1 (Pen al), alérgeno Pen m 2 (Pen in 2), isoforma rápida de la tropomiosina; del trigo y/u otros cereales: glutenina de alto peso molecular, glutenina de bajo peso molecular, alfa- y gamma-gliadina, hordeína, secalina, avenina; de la fresa: alérgeno principal de la fresa Fra a 1-E (Fra a 1), del plátano: profilina (Mus xp 1).
Muchos fármacos proteicos que se utilizan en medicina humana y veterinaria inducen respuestas inmunitarias, lo que crea riesgos para el paciente y limita la eficacia del medicamento. Esto puede suceder con proteínas humanas que han sido modificadas genéticamente, con proteínas humanas utilizadas en pacientes con deficiencias congénitas en la producción de esa proteína y con proteínas no humanas. Sería ventajoso inducir tolerancia en un receptor a estos fármacos proteicos antes de la administración inicial, y sería ventajoso inducir tolerancia en un receptor a estos fármacos proteicos después de la administración inicial y el desarrollo de una respuesta inmunitaria. En los pacientes con autoinmunidad, se conoce el autoantígeno o autoantígenos frente a los que se desarrolla la autoinmunidad. En estos casos, sería ventajoso inducir tolerancia en los sujetos en riesgo antes del desarrollo de autoinmunidad, y sería ventajoso inducir tolerancia en los sujetos en el momento o después del desarrollo de indicadores biomoleculares de autoinmunidad incipiente. Por ejemplo, en la diabetes mellitus de tipo 1, los indicadores inmunológicos de autoinmunidad están presentes antes de la destrucción generalizada de las células beta del páncreas y de la aparición de la enfermedad clínica relacionada con la homeostasis de la glucosa. Sería ventajoso inducir tolerancia en un sujeto tras la detección de estos indicadores inmunológicos antes de la aparición de la enfermedad clínica.
B. Inmunosupresores
La partícula puede incluir uno o más inmunosupresores (también denominados en el presente documento agentes inmunosupresores, fármacos inmunosupresores, agentes inmunosupresores y medicamentos inmunosupresores). Los inmunosupresores son conocidos en la técnica e incluyen glucocorticoides, citostáticos (tales como agentes alquilantes, antimetabolitos y anticuerpos citotóxicos), anticuerpos (tales como los dirigidos contra receptores de linfocitos T o receptores 11 —2), fármacos que actúan sobre las inmunofilinas (tales como la ciclosporina, el tacrolimus y el sirolimus) y otros fármacos (tales como los interferones, los opioides, las proteínas de unión al TNF, el micofenolato y otras moléculas pequeñas, tales como el fingolimod). Las pautas posológicas de los agentes inmunosupresores son conocidas en la técnica. La dosis específica dependerá del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento deseado. Por ejemplo, cuando se utiliza como inmunosupresor, un citostático puede administrarse a una dosis menor que cuando se utiliza en quimioterapia. Los inmunosupresores incluyen, entre otros, FK506, prednisona, metilprednisolona, ciclofosfamida, talidomida, azatioprina y daclizumab, fisalina B, fisalina F, fisalina G, seco-esteroides purificadosde Physalis angulata L.,15-desoxiespergualina, MMF, rapamicina y sus derivados, CCI-779, FR 900520, FR 900523, NK86-086, depsidomicina, kanglemicina-C, espergualina, prodigiosina25-c, camunomicina, demetomicina, tetranactina, tranilast, estevastelinas, miriocina, gliotoxina, FR 651814, SDZ214-104, bredinina, WS9482, ácido micofenólico, mimoribina, misoprostol, OKT3, anticuerpos contra el receptor IL-2, azasporina, leflunomida, mizoribina, azaspirano, paclitaxel, altretamina, busulfán, clorambucilo, ifosfamida, mecloretamina, melfalán, tiotepa, cladribina, fluorouracilo, floxuridina, gemcitabina, tioguanina, pentostatina, metotrexato, 6-mercaptopurina, citarabina, carmustina, lomustina, estreptozotocina, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, iproplatino, tetraplatino, lobaplatino, JM216, JM335, fludarabina, aminoglutetimida, flutamida, goserelina, leuprolida, acetato de megestrol, acetato de ciproterona, tamoxifeno, anastrozol, bicalutamida, dexametasona, dietilestilbestrol, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxirubicina, idarubicina, mitoxantrona, losoxantrona, mitomicina-c, plicamicina, paclitaxel, docetaxel, topotecán, irinotecán, 9-amino-camptotecán, 9-nitro-camptotecán, GS-211, etopósido, tenipósido, vinblastina, vincristina, vinorelbina, procarbazina, asparaginasa, pegaspargasa, octreotida, estramustina e hidroxiurea.
Otros agentes inmunosupresores incluyen, por ejemplo, anticuerpos contra otros marcadores de la superficie de células inmunitarias (por ejemplo, CD40) o contra citocinas, otras proteínas de fusión, por ejemplo, CTLA4Ig, u otros fármacos inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina A, compuestos similares a FK506, compuestos de rapamicina o esteroides).
En el presente documento, la expresión "compuesto de rapamicina" incluye el compuesto tricíclico neutro rapamicina, los derivados de rapamicina, los análogos de rapamicina y otros compuestos macrólidos que se cree que tienen el mismo mecanismo de acción que la rapamicina (por ejemplo, inhibición de la función de las citocinas). La expresión "compuestos de rapamicina" incluye compuestos con similitud estructural a la rapamicina, por ejemplo, compuestos con una estructura macrocíclica similar, que han sido modificados para mejorar su eficacia terapéutica. Los ejemplos de compuestos de rapamicina, así como otros procedimientos en los que se ha administrado rapamicina son conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO 95/22972, WO 95/16691, WO 95/04738, las patentes de EE. UU. Nos.
6.015.809; 5,989,591; 5,567,709; 5,559,112; 5,530,006; 5,484,790; 5,385,908; 5,202,332; 5,162,333; 5,780,462; 5,12 0,727).
Los análogos de la rapamicina incluyen, por ejemplo, everolimus, ridaforolimus, remsirolimus, umirolimus y zotarolimus.
La expresión "compuestos similares al FK506" incluye el FK506, y los derivados y análogos del FK506, por ejemplo, compuestos con similitud estructural al FK506, por ejemplo, compuestos con una estructura macrocíclica similar que han sido modificados para mejorar su eficacia terapéutica. Entre los ejemplos de compuestos similares al FK506 se incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento WO 00/01385. Preferentemente, la expresión "compuesto de rapamicina" no incluye los compuestos similares al FK506.
C. Otros agentes activos
Los siguientes son agentes que pueden utilizarse junto con un antígeno y un inmunosupresor, tal como la rapamicina, solos o junto con un antígeno sin inmunosupresor para la inmunomodulación.
El inmunosupresor puede ser un bloqueador del TNF-a. El inmunosupresor puede aumentar la cantidad de adenosina en el suero; véase, por ejemplo, el documento WO 08/147482. El inmunosupresor puede ser CD73-Ig, CD73 recombinante u otro agente (por ejemplo, una citocina o anticuerpo monoclonal o molécula pequeña) que aumente la expresión de CD73, véase por ejemplo el documento WO 04/084933. El inmunosupresor puede ser el interferón-beta.
Las formulaciones pueden utilizarse en combinación o sucesión con compuestos que aumenten la actividad o la producción de Treg. Los ejemplos de agentes potenciadores de Treg incluyen, entre otros, fluticasona glucocorticoide, salmeterol, anticuerpos contra IL-12, IFN-y e IL-4; vitamina D3 y dexametasona y combinaciones de los mismos. Los compuestos pueden aumentar o promover la actividad de Treg, aumentar la producción de citocinas como IL-10 a partir de Treg, aumentar la diferenciación de Treg, aumentar el número de Treg o aumentar la supervivencia de Treg. Véase también la solicitud publicada de EE. UU. n.° 2012/0276095.
También pueden utilizarse anticuerpos, moléculas pequeñas y otros compuestos que reduzcan la bioactividad de las citocinas proinflamatorias. Los compuestos pueden reducir la bioactividad de Il-1, IL-6, IL-8, TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa), TNF-p (linfotoxina a, LT) o una combinación de los mismos.
El agente activo puede ser un producto terapéutico utilizado para tratar enfermedades autoinmunitarias, tales como la artritis reumatoide y el lupus.
Otra categoría importante dentro de las biologías son los bloqueadores del factor de necrosis tumoral (TNF), que contrarrestan los altos niveles de proteínas inflamatorias. El etanercept (Enbrel), el infliximab (Remicade) y el adalimumab (Humira) son los más utilizados. Otro grupo prometedor es el de los bloqueantes de la interleucina-1 (IL-1), tal como la anakinra (Kineret).
El agente puede ser una citocina o quimiocina antiinflamatoria, por ejemplo, el factor de crecimiento transformantebeta (TGF-beta), el antagonista del receptor de la interleucina (IL)-l, la IL-4, la IL-6, la IL-10, la IL-11 y la IL-13. Los receptores específicos de citocinas para la IL-1, el factor de necrosis tumoral alfa y la IL-18 también actúan como inhibidores de citocinas proinflamatorias. La naturaleza de las citocinas antiinflamatorias y de los receptores solubles de citocinas es conocida en la técnica y se analiza en Opal y DePalo, Chest, 117(4):
El ácido retinoico es un compuesto terapéutico adicional que puede utilizarse como agente antinflamatorio. Véase, por ejemplo, Capurso,et al.,Self/Nonself, 1:4, 335-340 (20I0).
El mofetil micofenolato (MMF) y su metabolito activo, el ácido micofenólico (MPA), son agentes inmunosupresores muy eficaces. El MMF se ha utilizado para tratar enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias de la piel (Lipsky, Lancet, 348:L1357-1359 (1996)) y se ha convertido en una valiosa opción terapéutica en niños con enfermedades autoinmunitarias Filler,et al.,Reumatología Pediátrica, 8:1 (2010). El ácido micofenólico (MPA) es un fármaco adyuvante relativamente nuevo que inhibe selectivamente la proliferación de linfocitos T y B al suprimir la síntesisde novode purinas. Otros agentes inmunosupresores ahorradores de esteroides incluyen la azatioprina, el metotrexato y la ciclofosfamida.
El MPA es la forma activa del mofetil micofenolato, que actualmente se utiliza como inmunosupresor en seres humanos para el tratamiento del lupus y otras enfermedades autoinmunitarias (Ginzler,et al., N.Engl. J. Med., 353(21):2219-2228 (2005)). El MPA tiene amplios efectos inmunosupresores sobre varios tipos de células inmunitarias. El MPA bloquea la vía de síntesisde novode los nucleótidos de guanina. La proliferación de linfocitos T y B se ve afectada de forma aguda por el MPA porque estas células carecen de las vías biosintéticas de recuperación que podrían evitar la alteración de la producción de guaninade novo(Jonsson,et al.,Clin. Exp. Immunol., 124(3): 486-91 (2001); Quemeneur,et al.,J Immunol, 169(5):2747-55 (2002); Jonsson,et al.,Int Immunopharmacol, 3(1):31-7 (2003); and Karnell,et al.,J Immunol, 187(7): 3603-3612 (2011). Además, el MPA puede perjudicar la activación de las células dendríticas y su capacidad para estimular respuestas aloantigénicas (Mehling,et al.,J. Immunol., 165(5):2374-2381 (2000); Lagaraine,et al.,Int. Immunol., 17(4):351-363 (2005); y Wadia,et al.,Hum. Immunol., 70(9):692-700 (2009)), y estimula el desarrollo de células dendríticas tolerogénicas (Lagaraine,et al.,J. Leukoc. Biol., 84(4): 1057-64 (2008)). Como muchos fármacos inmunosupresores, el MPA es muy hidrófobo, con un coeficiente de reparto (log del valor P) notificado de 3,88 (Elbarbry,et al.,J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 859(2): 276-281(2007)).
Un inmunosupresor puede ser cualquier molécula pequeña que reprima la función del sistema inmunitario o que aumente la susceptibilidad a las enfermedades infecciosas. El inmunosupresor puede ser un inhibidor de la proliferación de linfocitos T, un inhibidor de la proliferación de linfocitos B o un inhibidor de la proliferación de linfocitos T y linfocitos B. Los inhibidores de la proliferación de linfocitos T o B pueden inhibir o regular la síntesis de monofosfato de guanina. Por ejemplo, el inmunosupresor puede ser el ácido micofenólico.
Como alternativa, el inmunosupresor puede ser un profármaco del ácido micofenólico, incluido, entre otros, el mofetil micofenolato (comercializado con los nombres comerciales CELLCEPT® por la empresa sueca F. Hoffmann-La Roche Ltd.).
También puede utilizarse una sal del inmunosupresor, por ejemplo, una sal del ácido micofenólico que incluye, entre otras, el micofenolato de sodio (comercializado con el nombre comercial MYFORTIC® por Novartis). El inmunosupresor puede ser un análogo de la purina que incluye, entre otros, la azatioprina (comercializada con diversos nombres comerciales, tal como AZASA<n>® de Salix e IMURAN® de GlaxoSmithKline) o la mercaptopurina (comercializada con el nombre comercial PURINETHOL® ((mercaptopurina). El inmunosupresor puede ser un antimetabolito que inhibe el uso y/o la síntesis de purinas, tal como un inhibidor de la purina nucleósido fosforilasa.
Además, o como alternativa, pueden utilizarse agentes antiinflamatorios. El agente antiinflamatorio puede ser no esteroideo, esteroideo o una combinación de los mismos. Los ejemplos representativos de agentes antiinflamatorios no esteroideos incluyen, entre otros, oxicams, tales como piroxicam, isoxicam, tenoxicam, sudoxicam; salicilatos, tal como aspirina, disalcid, benorilato, trilisato, safaprín, solprín, diflunisal y fendosal; derivados del ácido acético, tales como diclofenaco, fenclofenaco, indometacina, sulindaco, tolmetina, isoxepaco, furofenaco, tiopinaco, zidometacina, acematacina, fentiazaco, zomepiraco, clindanaco, oxepinaco, felbinaco y ketorolaco; fenamatos, tales como los ácidos mefenámico, meclofenámico, flufenámico, niflúmico y tolfenámico; derivados del ácido propiónico, tales como ibuprofeno, naproxeno, benoxaprofeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, indopropfeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno y tiaprofénico; pirazoles, tales como fenilbutazona, oxifenbutazona, feprazona, azapropazona y trimetazona. También pueden emplearse mezclas de estos agentes antiinflamatorios no esteroideos.
Ejemplos representativos de antiinflamatorios esteroideos incluyen, sin limitación, corticosteroides como hidrocortisona, hidroxil-triamcinolona, alfa-metil dexametasona, dexametasona-fosfato, dipropionatos de beclometasona, valerato de clobetasol, desonida, desoximetasona, acetato de desoxicorticosterona, dexametasona, diclorisona, diacetato de diflorasona, valerato de diflucortolona, fluadrenolona, acetónido de fluclorolona, fludrocortisona, pivalato de flumetasona, acetónido de fluosinolona, fluocinonida, butilester de flucortina, fluocortolona, acetato de fluprednideno (fluprednilideno), flurandrenolona, halcinonida, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, metilprednisolona, acetónido de triamcinolona, cortisona, cortodoxona, flucetonida, fludrocortisona, diacetato de difluorosona, fluradrenolona, fludrocortisona, diacetato de diflurosona, acetónido de fluradrenolona, medrisona, amcinafel, amcinafida, betametasona y el resto de sus ésteres, cloroprednisona, acetato de clorprednisona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, diflurprednato, flucloronida, flunisolida, fluorometalona, fluperolona, fluprednisolona, valerato de hidrocortisona, ciclopentilpropionato de hidrocortisona, hidrocortamato, meprednisona, parametasona, prednisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona, triamcinolona y sus mezclas.
Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) suelen administrarse para aliviar síntomas como el dolor, la hinchazón y la rigidez. Los AINE más utilizados son el ibuprofeno y el naproxeno. Los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FAME) son agentes que ralentizan (o incluso detienen) la progresión de una enfermedad. El más utilizado de este grupo es el metotrexato. Otros FAME son la sulfasalazina (marca Azulfidine) y la leflunomida (Arava).
Los corticosteroides más populares son la prednisolona, la hidrocortisona, la metilprednisolona, la dexametasona, la cortisona, la triamcinolona y la betametasona.
D. Resto de transporte dirigido al hígado o a células dendríticas
Uno o más restos de transporte dirigido (también denominados en el presente documento moléculas de transporte dirigido y señales de transporte dirigido) pueden cargarse en la partícula, adherirse a su superficie y/o quedar encerrados en ella. Los ejemplos de moléculas diana incluyen proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, lípidos, sacáridos o polisacáridos que se unen a una o más dianas asociadas a un tejido, célula o matriz extracelular del hígado. Preferentemente, el resto de transporte dirigido se muestra en la superficie exterior de la partícula y, preferentemente, se conjuga con ella. Preferentemente, el resto de transporte dirigido aumenta o mejora el transporte dirigido de las partículas hacia el hígado, o tejido o células del mismo, incluidas las células hepáticas y las células endoteliales.
Se pueden utilizar diversas técnicas para modificar la superficie de las partículas, tales como la unión covalente de moléculas (ligandos) a nanosistemas (polímeros o lípidos) (Tosi,etal., SfN Neurosci, San Diego (EE. UU.), 1:84 (2010)).
El grado de especificidad con el que se dirigen las partículas puede modularse por medio de la selección de una molécula diana con la afinidad y especificidad adecuadas. Por ejemplo, los anticuerpos son muy específicos. Pueden ser policlonales, monoclonales, fragmentos, recombinantes o monocatenarios, muchos de los cuales están disponibles en el mercado o se obtienen fácilmente mediante técnicas convencionales. Las moléculas diana pueden conjugarse con la terminación de una o más cadenas de PEG presentes en la superficie de la partícula.
El resto de transporte dirigido puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que reconozca específicamente un marcador hepatocelular o tisular. Se prefieren los fragmentos, ya que los anticuerpos son muy grandes y pueden tener una difusión limitada a través del tejido. En la técnica se conocen moléculas diana adecuadas que pueden usarse para dirigir la partícula a células y tejidos de interés, así como procedimientos para conjugar moléculas diana con nanopartículas. Véase, por ejemplo, Ruoslahti,et al.,Nat. Rev. Cancer, 2:83-90 (2002).
Las moléculas diana también pueden incluir neuropilinas y moléculas dirigidas a tejido endotelial, integrinas, selectinas, moléculas de adhesión, citocinas y quimiocinas.
El resto de transporte dirigido puede ser un anticuerpo o un dominio de unión a anticuerpos junto con un dominio de unión a anticuerpos. El anticuerpo puede ser policlonal, monoclonal, lineal, humanizado, quimérico o un fragmento de los mismos. El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, Fab', F(ab'), diacuerpo de Fv, anticuerpo lineal o anticuerpo monocatenario. Los dominios de unión a anticuerpos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, proteínas, tales como la proteína A y la proteína G deStaphylococcus aureus.Otros dominios conocidos por unirse a anticuerpos son conocidos en la técnica y pueden ser sustituidos.
Las moléculas de transporte dirigido pueden unirse covalentemente a la partícula mediante el uso de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. El resto de transporte dirigido puede unirse a la partícula mediante PEGilación o un puente de biotina-avidina.
Los restos de transporte dirigido al hígado son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la solicitud publicada de EE. UU. n.° 2014/0017329, en la que se analiza el ácido glicirretínico (GA), el ácido lactobiónico (LA) y sus combinaciones como agentes dirigidos al hígado.
Otros grupos dirigidos a lípidos se analizan en Mishra,et al.,BioMed Research International, volumen 2013, artículo ID 382184, 20 páginas. Véase, por ejemplo, la tabla 1, que se reproduce a continuación:
Tabla 1:Receptores para dianas hepáticas(adaptado de Mishra, et al., supra)
Las partículas pueden dirigirse al hígado mediante el uso de un resto de transporte dirigido que potencie la acumulación de las partículas en el hígado.
Una de las dianas preferentes es DEC205+. DEC205+ un receptor celular con una p.m. de 205 kDa (DEC205) (Ring,et al.,J. Immuno., doi:10.4049/jimmunol.1202592 (11 páginas) (2013)). Es expresado por células epiteliales y células dendríticas (CD) y facilita la presentación de antígenos. Las formulaciones dirigidas a DEC205+ son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-DEC205+ y fragmentos y fusiones de los mismos (véase, por ejemplo, Silva-Sánchez, PLoS ONE 10(4): e0124828. doi:10.1371/journal.pone.0124828; Spiering,et al.,J Immunol., 194(10):4804-13 (2015). doi: 10.4049/jimmunol. 1400986. Epub, 10 de abril de 2015). Se cree que las nanopartículas dirigidas a DEC205 utilizan la endocitosis mediada por DEC205 para entrar en las células diana, lo que reduce su capacidad para activar los linfocitos T CD4 específicos de antígeno. Se sabe que las CD que captan el antígeno a través de DEC205 se presentan de forma cruzada a través de MHC de clase I, lo que puede estimular la tolerancia delecional de linfocitos T CD8 en modelos de ratón de diabetes autoinmunitaria y EAE.
El resto de direccionamiento puede apuntar a otro receptor de lectina de tipo C. En un ejemplo concreto, la lectina de tipo C es Clec 9A.
La densidad del ligando de transporte dirigido puede modularse para ajustar el efecto inductor de tolerancia del vehículo.
D. Formulaciones farmacéuticas
Las nanopartículas pueden formularse en forma líquida o sólida para la administración oral como forma farmacéutica unitaria individual o múltiple.
1. Formas farmacéuticas unitarias
Las formulaciones descritas en el presente documento suelen presentarse en formas farmacéuticas unitarias para facilitar la administración y uniformizar la dosis. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de las formulaciones será decidido por el médico tratante dentro del ámbito del buen criterio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto u organismo concreto dependerá de una diversidad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del principio activo específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el momento de la administración, la vía de administración y la tasa de excreción del principio activo específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el principio activo específico empleado; y otros factores bien conocidos en las artes médicas.
Las formas farmacéuticas unitarias que contienen nanopartículas de PBA que encapsulan agentes activos y/o de obtención de imágenes pueden estar en cantidades que oscilan entre aproximadamente 0,001 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg, entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg, entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, o entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg del peso corporal del individuo por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado. La dosis deseada puede administrarse tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. La dosis deseada puede administrarse mediante múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).
2. Excipientes
Los excipientes y/o vehículos pueden elegirse en función de la forma farmacéutica que se vaya a administrar, los agentes activos que se vayan a administrar, etc. Los excipientes adecuados incluyen tensioactivos, emulsionantes, estabilizantes de la emulsión, antioxidantes, emulgentes, humectantes, agentes quelantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes oclusivos, conservantes, agentes estabilizantes, agentes modificadores del pH, agentes solubilizantes, disolventes, agentes aromatizantes, colorantes, fragancias y otros excipientes. Como se utiliza en el presente documento, "excipiente" no incluye ningún ácido biliar ni polímero del mismo.
Los emulgentes adecuados incluyen, entre otros, ácidos grasos de cadena lineal o ramificada, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilenado, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, estearato de propilenglicol, estearato de glicerilo, polietilenglicol, alcoholes grasos, copolímeros en bloque poliméricos de óxido de etileno y óxido de propileno y combinaciones de los mismos.
Los tensioactivos adecuados incluyen, entre otros, tensioactivos aniónicos, tensioactivos no iónicos, tensioactivos catiónicos y tensioactivos anfóteros.
Los agentes de suspensión adecuados incluyen, entre otros, ácido algínico, bentonita, carbómero, carboximetilcelulosa y sus sales, avena coloidal, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcristalina, dióxido de silicio coloidal, dextrina, gelatina, goma guar, goma xantana, caolín, silicato de magnesio y aluminio, maltitol, triglicéridos, metilcelulosa, ésteres polioxietilénicos de ácidos grasos, polivinilpirrolidona, alginato de propilenglicol, alginato de sodio, ésteres sorbitánicos de ácidos grasos, tragacanto y combinaciones de los mismos. Los antioxidantes adecuados incluyen, entre otros, hidroxitolueno butilado, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, ácido fumárico, ácido málico, butilhidroxianisol, galato de propilo, ascorbato de sodio, metabisulfito de sodio, palmitato de ascorbilo, acetato de ascorbilo, fosfato de ascorbilo, vitamina A, ácido fólico, flavonas o flavonoides, histidina, glicina, tirosina, triptófano, carotenoides, carotenos, alfa-caroteno, beta-caroteno, ácido úrico, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos.
Los agentes quelantes adecuados incluyen, entre otros, el EDTA y sus combinaciones.
Los humectantes adecuados incluyen, entre otros, glicerina, butilenglicol, propilenglicol, sorbitol, triacetina y combinaciones de los mismos.
Se pueden utilizar conservantes para evitar la proliferación de hongos y otros microorganismos. Los conservantes adecuados incluyen, entre otros, ácido benzoico, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio, propionato de sodio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetipiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, timerosal y combinaciones de los mismos.
Los excipientes pueden incluir agentes de suspensión, tales como agua estéril, solución salina tamponada con fosfato, solución salina o una solución no acuosa, tal como el glicerol.
Las partículas pueden suministrarse como polvos secos tras secado por pulverización o liofilización.
Las partículas pueden comprimirse en comprimidos, que a su vez pueden recubrirse con un material, tal como EUDRAGIT®, para evitar la liberación de las partículas tras su paso por el estómago.
Las partículas también pueden encapsularse en geles duros o blandos, tales como las cápsulas de gelatina y alginato y los geles blandos con fórmula entérica comercializados por Banner Pharmaceuticals.
Las partículas también pueden formularse para su administración en superficies mucosas, tales como la boca, la cavidad nasal, la cavidad bucal, el sistema pulmonar, el recto o la vagina.
Las partículas también pueden suministrarse en un kit, en el que el material que se va a transportar se suministra por separado de la forma farmacéutica unitaria, y luego se combina en polvo o en forma seca o en solución antes de su uso. El agente que se va a transportar puede quedar atrapado, encapsulado o unido química o físicamente a los polímeros de sales biliares.
111. Procedimientos de fabricación de nanopartículas.
Las nanopartículas de PBA descritas en el presente documento pueden prepararse por diversos procedimientos.
1. Evaporación del disolvente.
En este procedimiento, el polímero se disuelve en un disolvente orgánico volátil, tal como el cloruro de metileno. El fármaco (soluble o disperso en forma de partículas finas) se añade a la solución, y la mezcla se suspende en una solución acuosa que contiene un agente tensioactivo, tal como el poli(alcohol vinílico). La emulsión resultante se agita hasta que se evapora la mayor parte del disolvente orgánico, dejando las nanopartículas sólidas. Las nanopartículas resultantes se lavan con agua y se secan durante la noche en un liofilizador. Con este procedimiento se pueden obtener nanopartículas de diferentes tamaños y morfologías. Este procedimiento es útil para polímeros relativamente estables, tales como el PBA, los poliésteres y el poliestireno.
2. Policondensación interfacial
La policondensación interfacial se utiliza para encapsular un material de núcleo de la siguiente manera. Un monómero y el material de núcleo se disuelven en un disolvente. Un segundo monómero se disuelve en un segundo disolvente (normalmente acuoso) que es inmiscible con el primero. Se forma una emulsión suspendiendo la primera solución mediante agitación en la segunda solución. Una vez que se estabiliza la emulsión, se añade un iniciador a la fase acuosa que provoca la polimerización interfacial en la interfaz de cada gota de emulsión.
3. Microencapsulación por evaporación de disolventes
En la microencapsulación por evaporación de disolventes, el polímero se disuelve normalmente en un disolvente orgánico inmiscible en agua y el material que se va a encapsular se añade a la solución de polímero como una suspensión o solución en un disolvente orgánico. Se forma una emulsión añadiendo esta suspensión o solución a un vaso de precipitados con agua agitada enérgicamente (que a menudo contiene un agente tensioactivo, por ejemplo, polietilenglicol o poli(alcohol vinílico), para estabilizar la emulsión). Se evapora el disolvente orgánico sin dejar de agitar. La evaporación provoca la precipitación del polímero, formando nanopartículas sólidas que contienen material de núcleo.
El proceso de evaporación del disolvente puede utilizarse para atrapar un material de núcleo líquido en un polímero, tal como las microcápsulas de PBA, p La , copolímero de PLA/PGA o copolímero de PLA/PCL. El polímero o copolímero se disuelve en una mezcla miscible de disolvente y no disolvente, a una concentración de no disolvente inmediatamente inferior a la concentración que produciría la separación de fases (es decir, el punto de turbidez). El material de núcleo líquido se añade a la solución mientras se agita para formar una emulsión y dispersar el material en forma de gotas. El disolvente y el no disolvente se evaporan, evaporándose el disolvente a mayor velocidad, lo que hace que el polímero o copolímero se separe en una fase y migre hacia la superficie de las gotitas de material de núcleo. A continuación, esta solución separada en fases se transfiere a un volumen agitado de no disolvente, provocando la precipitación de cualquier resto de polímero o copolímero disuelto y extrayendo cualquier resto de disolvente de la membrana formada. El resultado son nanopartículas compuestas por una envoltura de polímero o copolímero con un núcleo de material líquido.
La microencapsulación por evaporación de disolventes puede dar lugar a la estabilización de partículas insolubles de agente activo en una solución polimérica durante un periodo de tiempo que oscila entre 0,5 horas y varios meses. Estabilizar un pigmento y un polímero insolubles dentro de la fase dispersa (normalmente un disolvente orgánico volátil) puede ser útil para la mayoría de los procedimientos de microencapsulación que dependen de una fase dispersa, incluyendo el colado de películas, la evaporación de disolventes, la eliminación de disolventes, el secado por pulverización, la inversión de fases y muchos otros.
La estabilización de las partículas insolubles de agente activo dentro de la solución polimérica podría ser crítica durante la transformación de escala. Al estabilizar las partículas de agente activo en suspensión dentro de la fase dispersa, las partículas pueden permanecer homogéneamente dispersas en toda la solución polimérica, así como en la matriz polimérica resultante que se forma durante el proceso de microencapsulación.
La microencapsulación por evaporación de disolventes (del inglés "solvent evaporation microencapsulation"-, SEM) presenta varias ventajas. La SEM permite determinar la mejor mezcla de polímero-disolvente-partícula insoluble que ayudará a la formación de una suspensión homogénea que pueda utilizarse para encapsular las partículas. La SEM estabiliza las partículas insolubles o los pigmentos dentro de la solución polimérica, lo que ayudarán durante la transformación de escala, porque se podrán dejar en reposo suspensiones de partículas insolubles o pigmentos durante largos periodos de tiempo, haciendo que el proceso dependa menos del tiempo y requiera menos mano de obra. La SEM permite crear micropartículas o nanopartículas con una liberación más optimizada del material encapsulado.
En la microencapsulación por eliminación de disolventes, el polímero se disuelve normalmente en un disolvente orgánico miscible en aceite y el material que se va a encapsular se añade a la solución de polímero como una suspensión o solución en disolvente orgánico. Pueden añadirse agentes tensioactivos para mejorar la dispersión del material a encapsular. Se forma una emulsión añadiendo esta suspensión o solución a un aceite que se agita enérgicamente, en el que el aceite es un no disolvente para el polímero y la solución de polímero/solvente es inmiscible en el aceite. El disolvente orgánico se elimina por difusión hacia la fase oleosa mientras se sigue agitando. La eliminación del disolvente provoca la precipitación del polímero, formando partículas sólidas que contienen el material del núcleo.
4. Microencapsulación por separación de fases
En la microencapsulación por separación de fases, el material a encapsular se dispersa en una solución polimérica con agitación. Mientras se agita continuamente para suspender uniformemente el material, se añade lentamente a la solución un no disolvente para el polímero para disminuir su solubilidad. En función de la solubilidad del polímero en el disolvente y en el no disolvente, el polímero precipita o se separa en una fase rica en polímeros y otra pobre en polímeros. En condiciones adecuadas, el polímero de la fase rica en polímeros migrará a la interfase con la fase continua, encapsulando el material de núcleo en una gotita con una envuelta exterior de polímero.
5. Emulsificación espontánea
La emulsificación espontánea consiste en solidificar las gotas de polímero líquido emulsionado cambiando la temperatura, evaporando el disolvente o añadiendo agentes químicos de reticulación. Las propiedades físicas y químicas del encapsulante y el material a encapsular determinan los procedimientos adecuados de encapsulación. Factores como la hidrofobicidad, el peso molecular, la estabilidad química y la estabilidad térmica afectan a la encapsulación.
6. Coacervación
Los procedimientos de encapsulación de diversas sustancias mediante técnicas de coacervación se han descrito en la técnica anterior, por ejemplo, en los documentos GB-B-929406; GB-B-929401; las patente de EE. UU. n.os 3266 987; 4794 000 y 4460563. La coacervación es un proceso que implica la separación de soluciones coloidales en dos o más capas líquidas inmiscibles (ref. Dowben, R., General Physiology, Harper & Row, Nueva York, 1969, pp.
142-143.). Mediante el proceso de coacervación se pueden producir composiciones formadas por dos o más fases y conocidas como coacervados. Los ingredientes que componen el sistema de coacervado bifásico están presentes en ambas fases; sin embargo, la fase rica en coloides tiene una mayor concentración de los componentes que la fase pobre en coloides.
7. Secado por pulverización
En este procedimiento, el polímero se disuelve en un disolvente orgánico. Una cantidad conocida del fármaco activo se suspende (fármacos insolubles) o se codisuelve (fármacos solubles) en la solución polimérica. A continuación, la solución o la dispersión se secan por pulverización. Los parámetros de proceso típicos para un secador minipulverizador (Buchi) son los siguientes: concentración de polímero = 0,04 g/mL, temperatura de entrada = - 24 °C, temperatura de salida = 13-15 °C, ajuste del aspirador = 15, ajuste de la bomba = 10 mL/minuto, caudal de pulverización = 600 Nl/h y diámetro de la boquilla = 0,5 mm. Se obtienen micropartículas de 1-10 micras con una morfología que depende del tipo de polímero utilizado.
8. Ensamblajes supramoleculares mediados por flúor:
Las unidades de ácidos biliares fluorados (lineales o ramificados) pueden sintetizarse por reacción de un grupo carboxilato o hidroxilo terminal con un anhídrido de alquilfluorato (AFAA). El producto puede extraerse en agua iniciando un efecto fluorofóbico, en el que la agregación espontánea de los bloques constitutivos fluorados tiene lugar preferentemente y de forma diferente a un efecto hidrófobo. Este ensamblaje depende tanto de la energía térmica como del grado de fluoración, lo que permite cierto control termodinámico y cinético sobre la morfología final. El autoensamblaje mediado por fluorofobia proporcionará las fuerzas cohesivas para la agregación y puede actuar como un sistema intrínsecamente fotografiable mediante RMN de 19F. Los ácidos biliares fluorados también tendrán una biodistribución y un tiempo de eliminación claramente diferentes, lo que puede servir para aumentar el tiempo de residencia del sistema en el tracto gastrointestinal o en las regiones pancreáticas.
IV. Formulaciones de uso.
Las partículas son especialmente útiles para la administración oral y muestran una mayor captación por órganos diana, tales como el páncreas, el hígado o el colon. Las formulaciones farmacéuticas pueden contener nanopartículas de PBA dirigidas o no dirigidas que encapsulan agentes terapéuticos y/o de diagnóstico/obtención de imágenes.
La administración oral puede lograrse por medio de sonda oral o ingestión de la formulación en forma líquida o sólida. Las formas líquidas de las formulaciones administradas por vía oral pueden presentarse en forma de solución o de gel líquido. Las formas sólidas de las formulaciones administradas por vía oral pueden presentarse en forma de cápsulas, geles blandos y duros, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos.
Aunque se describe con referencia a la administración oral, se entiende que la misma administración puede lograrse por medio de la administración a una superficie mucosa, tal como la boca, la cavidad nasal, el pulmón, el recto o la vagina.
La dosis deseada puede administrarse por vía oral una vez al día o varias veces al día. La dosis deseada puede administrarse tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. La dosis deseada puede administrarse mediante múltiples administraciones diarias (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).
La administración oral de las nanopartículas de PBA es especialmente ventajosa cuando resulta útil una respuesta al pH. La administración dirigida de las nanopartículas de PBA y la liberación sensible al pH de un agente terapéutico encapsulado permiten el tratamiento con dosis más bajas del producto terapéutico para lograr la misma eficacia que con un fármaco libre, y menores efectos secundarios. Los agentes encapsulados están protegidos del riguroso entorno ácido del estómago y se liberan en el lumen intestinal, o se liberan por exocitosis tras su captación por macrófagos, células dendríticas o células presentadoras de antígenos en lugares de inflamación pancreática o intestinal, el hígado, el bazo o el páncreas. Por lo tanto, las nanopartículas de PBA mejoran la biodisponibilidad de los agentes encapsulados tras la administración oral, protegiendo a los agentes de la degradación en el estómago y haciendo llegar los agentes al lugar de acción. Las nanopartículas de PBA aumentan la biodisponibilidad de los fármacos administrados por vía oral en el páncreas, el hígado y el colon, en comparación con la biodisponibilidad de los mismos fármacos administrados por vía oral en la misma dosis en forma libre o encapsulados en nanopartículas de PLGA.
A. Trastornos a tratar.
La formulación puede utilizarse para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad o afección, y puede incluir la administración a un individuo que lo necesite de una forma farmacéutica unitaria oral de la formulación farmacéutica que contiene las nanopartículas de PBA no dirigidas que encapsulan uno o más agentes; la administración de una cantidad eficaz de uno o más agentes, opcionalmente a tejidos diana, tales como el páncreas, el hígado o el colon; en la que el agente se libera de las nanopartículas de PBA en los tejidos diana, lo que da lugar a la prevención, la supresión o el tratamiento de la enfermedad.
Las formulaciones son especialmente útiles para el tratamiento de neoplasias de colon, hígado, bazo, páncreas o zonas adyacentes. Las formulaciones también son muy útiles en el tratamiento de enfermedades del tracto gastrointestinal, tales como úlceras, enfermedad del intestino irritable (EII) y cánceres de colon. Las formulaciones son útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias y alergénicas. Las formulaciones también son eficaces en el tratamiento de enfermedades como la diabetes.
Enfermedades y afecciones autoinmunitarias e inflamatorias
Se apreciará que las formulaciones y usos divulgados en el presente documento tienen una amplia gama de aplicaciones que incluyen, entre otras, el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tratamientos para el rechazo de trasplantes, adyuvantes para la mejora de la función inmunosupresora y terapias celulares relacionadas con Treg o CD tolerogénicas.
Las formulaciones y los usos pueden emplearse para tratar la inflamación crónica y persistente, que puede ser una causa importante de la patogénesis y la progresión de una enfermedad autoinmunitaria o una afección inflamatoria. En consecuencia, las formulaciones para tratar enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunitarios pueden incluir la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una formulación en partículas o una formulación farmacéutica de la misma, para reducir o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno. A continuación, se describen con más detalle algunas de estas aplicaciones.
Las enfermedades y trastornos inflamatorios o autoinmunes representativos que pueden tratarse usando las formulaciones y procedimientos divulgados incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmune (alps), púrpura trombocitopénica autoinmune (ATP), enfermedad de Behcet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, esprúe-dermatitis celíaca, síndrome de fatiga crónica inmunodeficiente, síndrome de fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, penfigoide cicatricial, enfermedad de la aglutinina fría, síndrome de Crest, enfermedad de Crohn, enfermedad de Dego, dermatomiositis, dermatomiositis -juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia - fibromiositis, enfermedad de grave, guillainbarre, tiroiditis de hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía Iga, diabetes insulinodependiente (tipo I), artritis juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.
Inhibición de la propagación de epítopos
La propagación de epítopos se refiere a la capacidad de la respuesta inmunitaria de los linfocitos B y T para diversificarse tanto a nivel de especificidad, desde un único determinante a muchos sitios en un autoantígeno, como a nivel del uso del gen V (Monneaux, F. et al., Arthritis & Rheumatism, 46(6): 1430-1438 (2002). La propagación de epítopos no se limita a las enfermedades autoinmunitarias sistémicas. Se ha descrito en enfermedades específicas de órgano dependientes de linfocitos T, tales como la DMID y la esclerosis múltiple en humanos y en animales de experimentación inducidos por EAE con una diversidad de proteínas de mielina.
La propagación de epítopos implica el reconocimiento adquirido de nuevos epítopos en la misma molécula propia, así como de epítopos que residen en proteínas asociadas en el mismo complejo macromolecular. La propagación de epítopos puede evaluarse midiendo las respuestas de hipersensibilidad retardada ("delayed-type hypersensitivity", DTH), cuyos procedimientos son conocidos en la técnica.
Por lo tanto, las formulaciones para su uso en la inhibición o la reducción de la propagación de epítopos en un individuo incluyen la administración al individuo de una cantidad eficaz de un nanoportador. La formulación en partículas puede inhibir la propagación de epítopos en individuos con esclerosis múltiple.
Alergias
Se puede utilizar una metodología similar para tratar las alergias, sustituyendo el alérgeno de interés por el estímulo autoinmunitario. Generalmente, las partículas se administran a un sujeto en una cantidad eficaz para reducir o inhibir una alergia o reacción alérgica.
Las alergias son reacciones anómalas del sistema inmunitario que se producen en respuesta a sustancias que, de otro modo, serían inofensivas. Las alergias son uno de los trastornos médicos más frecuentes. Se calcula que 60 millones de estadounidenses, es decir, más de una de cada cinco personas, padecen algún tipo de alergia, con proporciones similares en gran parte del resto del mundo. La alergia es el principal motivo de absentismo escolar y una fuente importante de pérdida de productividad en el lugar de trabajo.
Una alergia es un tipo de reacción inmunitaria. Normalmente, el sistema inmunitario responde a los microorganismos o partículas extrañas produciendo proteínas específicas denominadas anticuerpos. Estos anticuerpos son capaces de unirse a moléculas identificadoras, o antígenos, de la partícula extraña. Esta reacción entre el anticuerpo y el antígeno desencadena una serie de reacciones químicas destinadas a proteger al organismo de las infecciones. A veces, esta misma serie de reacciones se desencadena por sustancias cotidianas e inofensivas, tales como el polen, el polvo y la caspa de los animales. Cuando esto sucede, se desarrolla una alergia contra la sustancia agresora (un alérgeno).
Los mastocitos, uno de los principales protagonistas de las reacciones alérgicas, captan y despliegan un tipo concreto de anticuerpo, denominado inmunoglobulina de tipo E (IgE) que se une a los alérgenos. En el interior de los mastocitos hay pequeños paquetes llenos de sustancias químicas llamados gránulos. Los gránulos contienen diversas sustancias químicas potentes, incluida la histamina.
Los inmunólogos dividen las reacciones alérgicas en dos tipos principales: reacciones de hipersensibilidad inmediata, mediadas predominantemente por mastocitos y que se producen a los pocos minutos del contacto con el alérgeno; y reacciones de hipersensibilidad retardada, mediadas por linfocitos T (un tipo de glóbulos blancos) y que se producen entre horas y días después de la exposición.
Los alérgenos inhalados o ingeridos suelen provocar reacciones de hipersensibilidad inmediatas. Los alérgenos se unen a los anticuerpos IgE en la superficie de los mastocitos, que derraman el contenido de sus gránulos sobre las células vecinas, incluidos los vasos sanguíneos y las células nerviosas. La histamina se une a las superficies de estas otras células a través de unas proteínas especiales denominadas receptores de histamina. La interacción de la histamina con los receptores de los vasos sanguíneos provoca un aumento de la filtración, lo que conduce a la acumulación de líquido, hinchazón y aumento del enrojecimiento. La histamina también estimula los receptores del dolor, haciendo que los tejidos se vuelvan más sensibles e irritables. Los síntomas duran de una a varias horas tras el contacto. En las vías respiratorias superiores y los ojos, las reacciones de hipersensibilidad inmediata provocan el goteo nasal, el picor de ojos y los ojos enrojecidos típicos de la rinitis alérgica. En el tracto gastrointestinal, estas reacciones provocan hinchazón e irritación de la mucosa intestinal, lo que causa los calambres y la diarrea típicos de la alergia alimentaria. Los alérgenos que entran en la circulación pueden causar urticaria, angioedema, anafilaxia o dermatitis atópica.
Los alérgenos presentes en la piel suelen provocar reacciones de hipersensibilidad retardada. Los linfocitos T circulantes entran en contacto con el alérgeno, poniendo en marcha una respuesta inmunitaria más prolongada. Este tipo de respuesta alérgica puede desarrollarse durante varios días tras el contacto con el alérgeno, y los síntomas pueden persistir durante una semana o más.
Los alérgenos entran en el organismo a través de cuatro vías principales: las vías respiratorias, la piel, el tracto gastrointestinal y el sistema circulatorio. Los alérgenos transportados por el aire provocan los estornudos, el goteo nasal, el picor de ojos y los ojos enrojecidos de la fiebre del heno (rinitis alérgica). Los alérgenos transportados por el aire también pueden afectar al revestimiento de los pulmones y provocar asma o conjuntivitis. La exposición a los alérgenos de las cucarachas se ha asociado al desarrollo de asma. Los alérgenos transportados por el aire de los animales domésticos son otra fuente habitual de exposición ambiental. Los alérgenos de los alimentos pueden causar picor e hinchazón de labios y garganta, calambres y diarrea. Cuando se absorben hacia el torrente sanguíneo, pueden causar urticaria o reacciones más graves que implican hinchazón recurrente y no inflamatoria de la piel, las mucosas, los órganos y el cerebro (angioedema). Algunos alérgenos alimentarios pueden causar anafilaxia, una afección potencialmente mortal caracterizada por inflamación de los tejidos, constricción de las vías respiratorias y caída de la presión arterial. Son frecuentes las alergias a alimentos como la leche de vaca, los huevos, los frutos secos, el pescado y las legumbres (cacahuetes y soja). También pueden producirse alergias a frutas y verduras. En contacto con la piel, los alérgenos pueden provocar enrojecimiento, picor y ampollas, lo que se denomina dermatitis de contacto. También pueden producirse reacciones cutáneas por alérgenos introducidos a través de las vías respiratorias o el tracto gastrointestinal. Este tipo de reacción se conoce como dermatitis atópica. La dermatitis puede surgir de una respuesta alérgica (tal como la hiedra venenosa) o de la exposición a un irritante que cause daños no inmunitarios en las células de la piel (tales como el jabón, el frío y los agentes químicos). La inyección de alérgenos, procedentes de mordeduras y picaduras de insectos o de la administración de fármacos, puede introducir alérgenos directamente en la circulación, donde pueden provocar respuestas en todo el sistema (incluida la anafilaxia), así como las respuestas locales de hinchazón e irritación en el lugar de la inyección.
Éstas pueden tratarse por medio de la administración de antiinflamatorios o induciendo tolerancia al antígeno, como se explica con más detalle a continuación.
Diabetes
La diabetes, o diabetes mellitus, se debe a que el páncreas no produce suficiente insulina o a que las células del organismo no responden adecuadamente a la insulina producida. Existen tres tipos principales de diabetes mellitus: La diabetes de tipo 1 es el resultado de la incapacidad del páncreas para producir suficiente insulina o insulina activa; esta forma se denominaba anteriormente "diabetes mellitus insulinodependiente" (DMID) o "diabetes juvenil"; La diabetes de tipo 2 comienza con la resistencia a la insulina, un trastorno en el que las células no responden adecuadamente a la insulina. A medida que la enfermedad progresa también puede desarrollarse una falta de insulina; esta forma se denominaba anteriormente "diabetes mellitus no insulinodependiente" (DMNID) o "diabetes de inicio en la edad adulta"; y
la diabetes gestacional, la tercera forma principal, se produce cuando las mujeres embarazadas, sin antecedentes de diabetes, desarrollan un nivel elevado de azúcar en sangre.
La diabetes de tipo 1 debe controlarse con inyecciones de insulina. La diabetes de tipo 2 puede tratarse con medicamentos con o sin insulina. La diabetes gestacional suele desaparecer tras el nacimiento del bebé.
Los diabéticos de tipo 1 necesitan tratamiento con insulina para sobrevivir. Muchas personas con diabetes de tipo 2 o diabetes gestacional también necesitan tratamiento con insulina. Los medicamentos utilizados para tratar la T2D incluyen más de 20 tipos de insulina inyectable, y fármacos administrados por vía oral, tales como meglitinidas, sulfonilureas, metformina, canagliflozina, dapagliflozina, tiazolidindionas, pioglitazona, rosiglitazona, acarbosa, pramlintida, exenatida, liraglutida, exenatida de acción prolongada, albiglutida, dulaglutida e inhibidores de la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV) (sitagliptina, saxagliptina, linagliptina). Estos agentes se denominan colectivamente "antidiabéticos".
Las formulaciones pueden utilizarse para tratar la inflamación del páncreas (pancreatitis), el hígado (hepatitis) o el colon (EII). Las nanopartículas de PBA que encapsulan un agente terapéutico y/o de obtención de imágenes pueden atravesar la vasculatura fenestrada de un tejido inflamado y se mantienen más tiempo dentro del tejido inflamado, debido a su tamaño, en comparación con las biologías o los fármacos de moléculas pequeñas (de 1 a 10 nm). También son internalizadas eficazmente por las células presentadoras de antígenos (tales como macrófagos y células dendríticas), lo que hace que las nanopartículas de PBA sean adecuadas para la administración de agentes a los tejidos inflamados y a las células del sistema inmunitario.
Dos formas de pancreatitis, la aguda y la crónica, pueden tratarse con la administración oral de las formulaciones de PBA.
La pancreatitis aguda es una inflamación repentina que dura poco tiempo. Puede ir desde un malestar leve hasta una enfermedad grave que ponga en peligro la vida. En casos graves, la pancreatitis aguda puede provocar hemorragias en la glándula, daños graves en los tejidos, infección y formación de quistes. La pancreatitis grave también puede dañar otros órganos vitales, tales como el corazón, los pulmones y los riñones.
La pancreatitis crónica es una inflamación duradera del páncreas. Suele producirse tras un episodio de pancreatitis aguda. El consumo excesivo de alcohol es otra causa importante. Los daños en el páncreas por el consumo excesivo de alcohol pueden no causar síntomas durante muchos años, pero entonces el individuo puede desarrollar repentinamente síntomas graves de pancreatitis. Los sujetos con pancreatitis aguda son tratados con líquidos intravenosos y analgésicos en el hospital. La pancreatitis crónica puede ser difícil de tratar. Consiste en aliviar el dolor y mejorar la nutrición. Los sujetos suelen recibir enzimas pancreáticas o insulina.
La inflamación del hígado (hepatitis) se caracteriza por la presencia de células inflamatorias en el tejido del órgano. La hepatitis puede cursar con síntomas limitados o sin ellos, pero suele provocar ictericia (coloración amarillenta de la piel, las mucosas y la conjuntiva), inapetencia y malestar general. La hepatitis es aguda cuando dura menos de seis meses y crónica cuando persiste más tiempo.
La hepatitis aguda puede ser autolimitada (curarse por sí sola), puede evolucionar a hepatitis crónica o, en raras ocasiones, puede causar insuficiencia hepática aguda. La hepatitis crónica puede ser asintomática o evolucionar con el tiempo hacia la fibrosis (cicatrización del hígado) y la cirrosis (insuficiencia hepática crónica). La cirrosis hepática aumenta el riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular.
La hepatitis vírica es la causa más frecuente de inflamación hepática. Otras causas son las enfermedades autoinmunitarias y la ingestión de sustancias tóxicas (sobre todo alcohol), ciertos medicamentos (como el paracetamol), algunos disolventes orgánicos industriales y plantas. Para el tratamiento de la hepatitis B crónica se utilizan antirretrovirales como el tenofovir y el entecavir.
Enfermedad inflamatoria intestinal.
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un término amplio que describe afecciones con respuesta inmunitaria crónica o recurrente e inflamación del tracto gastrointestinal. Las dos enfermedades inflamatorias intestinales más comunes son la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. La inflamación afecta a todo el tubo digestivo en la enfermedad de Crohn y solo al intestino grueso en la colitis ulcerosa. Ambas enfermedades se caracterizan por una respuesta anómala del sistema inmunitario del organismo.
La enfermedad de Crohn se trata con medicamentos diseñados para suprimir la respuesta inflamatoria anómala del sistema inmunitario que causa los síntomas. La supresión de la inflamación ofrece alivio de síntomas comunes como fiebre, diarrea y dolor, y la curación de los tejidos intestinales. La terapia combinada podría incluir la adición de un producto biológico a un inmunomodulador. Como ocurre con todas las terapias, existen riesgos y beneficios de las terapias combinadas. La combinación de medicamentos con terapias inmunomoduladoras puede aumentar la eficacia del tratamiento de la EII.
Los ejemplos de agentes utilizados para tratar los síntomas de la EII incluyen, entre otros, sulfasalazina, mesalamina, olsalazina y balsalazida que contienen ácido 5-aminosalicilato (5-ASA), corticoesteroides, inmunomoduladores, antibióticos y terapias biológicas.
Neoplasias.
Las formulaciones descritas en el presente documento pueden utilizarse para tratar diversas neoplasias de páncreas, hígado o colon y otros cánceres del tracto gastrointestinal o adyacentes a este. Las neoplasias pancreáticas incluyen, entre otras, neoplasias pancreáticas primarias, tales como el adenocarcinoma ductal pancreático, la neoplasia quística, la neoplasia papilar intraductal nucinosa. Las neoplasias endocrinas incluyen el insulinoma, el gastrinoma, el glucagonoma y el somatostatinoma.
Las neoplasias del hígado incluyen neoplasias benignas y malignas, entre otras, adenoma hepatocelular, hiperplasia nodular focal, nódulo displásico, hemangioma, carcinoma hepatocelular, carcinosarcoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, hemangioendotelioma, linfomas primarios. Las neoplasias biliares benignas y malignas incluyen, entre otras, el quiste del conducto biliar, el hamartoma de la glándula peribiliar, el cistadenoma biliar, el cistadenocarcinoma biliar y el colangiocarcinoma (Goodman, Modern Pathology, 20:S49-S60 (2007)).
Aproximadamente el 95 % de los cánceres colorrectales surgen de adenomas (tumores de epitelio neoplásico benigno con potencial variable de malignidad), que pueden clasificarse en tipos polipoides, no polipoides o mixtos. Además, los individuos con colitis EII de larga duración tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer colorrectal que la población general (Facciorussoet al.,World J. Gastroenterol., 21(17):5149-5157 (2015)).
El tratamiento de las neoplasias puede incluir la administración dirigida de las nanopartículas de PBA que encapsulan agentes antiproliferativos, quimioterapéuticos, inmunomoduladores, radiológicos o inhibidores de quinasas, al páncreas, el hígado o el colon. Dado que las nanopartículas de PBA también son capaces de entrar en la circulación portal del hígado, son especialmente adecuadas para atacar neoplasias hepáticas.
Liberación del antígeno e inducción de la tolerancia
Se proporcionan formulaciones para inducir la tolerancia. Los usos se basan generalmente en el principio de que el fármaco inmunosupresor y/o el antígeno pueden dirigirse al hígado utilizando las partículas divulgadas y serán captados por las células dendríticas hepáticas (CD) y/o las células endoteliales hepáticas (CE). El hígado es un órgano de interés para dirigir agentes para la inducción de tolerancia frente a estos agentes. Se cree que las formulaciones cargadas con el antígeno de interés y/o junto con un agente inmunosupresor facilitarán la tolerancia periférica frente al antígeno de interés. El transporte dirigido puede ser pasivo (es decir, retención en el hígado) o activo (es decir, dirigido a células específicas del hígado). Por consiguiente, un resto de transporte dirigido al hígado es opcional.
Las partículas portadoras del antígeno y/o el fármaco inmunosupresor se localizan preferentemente en la misma célula dendrítica hepática o célula endotelial hepática para iniciar la tolerancia. Por lo tanto, aunque se contemplan diferentes partículas portadoras de antígenos en un conjunto y de agente inmunosupresor en otro conjunto que se inyectan conjuntamente, se prefieren las nanopartículas portadoras de ambos agentes y dirigidas a las células dendríticas hepáticas o a las células endoteliales.
Una estrategia preferida generalmente incluye la administración de partículas que incluyen un antígeno y un agente inmunosupresor que son retenidas en el hígado y captadas por células presentadoras de antígenos hepáticas o células endoteliales. A continuación, las células dendríticas tolerogénicas circularán por todo el organismo para inducir tolerancia (tolerancia periférica) al antígeno encapsulado. Los ejemplos de células que pueden actuar como células vivas presentadoras de antígenos incluyen células dendríticas hepáticas (CD), células endoteliales hepáticas, células de Kupffer, células estrelladas hepáticas, hepatocitos y otras células que presentan antígenos al hígado.
Las CD o CE hepáticas drenan a los ganglios linfáticos locales (celíacos). Adquieren un programa tolerogénico que induce la expansión de linfocitos T reguladores (Treg) específicos de antígeno. Las APC también pueden presentar el antígeno a los linfocitos T en los sinusoides sin migrar al exterior. Además, el antígeno puede ser procesado por las CD mientras se encuentra en el hígado o en los ganglios linfáticos, o incluso mientras migra entre ellos. En general, la acumulación intracelular, el traslado o la retención del portador en las células hepáticas son importantes para la inducción de la tolerancia.
Las células presentadoras de antígenos también expresan marcadores antiinflamatorios o marcadores que indican el inicio de un fenotipo tolerogénico. Los Treg migran de los ganglios linfáticos a la circulación e inducen tolerancia en todo el sistema.
La estrategia preferente puede resumirse en cinco etapas:
1) Transporte dirigido al hígado;
2) Captación por células dendríticas y/o APC en el hígado;
3) Drenaje a los linfáticos locales;
4) Expansión de linfocitos T reguladores;
5) Migración al torrente sanguíneo e inicio de la tolerancia periférica.
Los usos descritos en el presente documento generalmente incluyen la administración a un individuo que lo necesite de una cantidad eficaz de las partículas descritas, lo más habitualmente en una formulación farmacéutica, para inducir o aumentar la tolerancia a un antígeno de interés. La formulación puede aumentar el número o la actividad de los linfocitos T reguladores. En consecuencia, se proporcionan formulaciones farmacéuticas que incluyen partículas que incluyen un antígeno tolerogénico y/o un agente inmunosupresor presente en la formulación en una cantidad eficaz para inducir a las células dendríticas hepáticas y/o a las células endoteliales hepáticas a adquirir un fenotipo tolerogénico, inducir la expansión de linfocitos T reguladores (Treg) específicos de antígeno o una combinación de las mismas, y un procedimiento de uso de las mismas.
Se puede conseguir una tolerancia robusta por medio de la inducción de Treg específicos de antígeno, Treg policlonales, linfocitos Tri, otros linfocitos CD4 que expresen PD- PD-L1 o CTLA-4, deleción/anergia de linfocitos CD8, incluso Breg. Así, la formulación puede administrarse en una cantidad eficaz para adquirir un programa tolerogénico que reduzca o impida la inmunogenicidad frente a un antígeno deseado, por ejemplo, el antígeno administrado por la partícula.
La administración no se limita al tratamiento de una afección o enfermedad existente, sino que también puede utilizarse para prevenir o disminuir el riesgo de desarrollar dichas enfermedades en un individuo, es decir, para un uso profiláctico. Las formulaciones pueden utilizarse en vacunas o tratamientos profilácticos, o vacunas o tratamientos terapéuticos, que pueden utilizarse para iniciar o mejorar la tolerancia inmunitaria de un individuo a un antígeno preexistente, o a un nuevo antígeno.
El resultado deseado de una respuesta inmunitaria profiláctica, terapéutica o desensibilizante puede variar en función de la enfermedad, de acuerdo con principios bien conocidos en la técnica. Del mismo modo, la tolerancia inmunitaria puede tratar completamente una enfermedad, puede aliviar los síntomas o puede ser una faceta en una intervención terapéutica global contra una enfermedad.
Entre los candidatos potenciales para la vacunación profiláctica se encuentran los individuos con un alto riesgo de desarrollar autoinmunidad contra un determinado autoantígeno y los pacientes que reciben terapia con proteínas recombinantes (FVIII o FIX).
Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento, diagnóstico o cirugía se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento, diagnóstico o cirugía del cuerpo humano o animal por medio de terapia.
B. Obtención de imágenes
Los usos de las formulaciones farmacéuticas pueden incluir procedimientos de obtención de imágenes no invasiva del órgano diana en su conjunto, o de distintos microentornos dentro del órgano diana, tales como focos de inflamación, vasculatura permeable o neoplasias. Los usos pueden incluir la administración a un sujeto que lo necesite de una forma farmacéutica unitaria oral de la formulación farmacéutica que contiene las nanopartículas de PBA no dirigidas que encapsulan una cantidad eficaz de un agente de obtención de imágenes; la administración de la cantidad eficaz del agente de obtención de imágenes al tejido diana, tal como el páncreas, el hígado o el colon; opcionalmente, la liberación de la cantidad eficaz del agente de obtención de imágenes de las nanopartículas en los tejidos diana; lo que resulta en una detección mejorada del tejido diana o de un microentorno distinto dentro del tejido diana, mediante la obtención de imágenes no invasiva.
Las modalidades de imagen adecuadas para detectar las nanopartículas de PBA y/o los agentes que contienen incluyen la tomografía por emisión de positrones ("positron-emission tomography", PET), la tomografía computarizada (TC), la resonancia magnética (RM), la ecografía ("ultrasound imaging", US) y la obtención de imágenes óptica. Los agentes de formación de imágenes adecuados (trazadores) incluyen moléculas pequeñas marcadas con radionúclidos, tales como fluorodesoxiglucosa F-18, óxido de hierro superparamagnético (SPIO), gadolinio, europio, ácido dietilentriaminopentacético (DTPA), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1. Ácido ,4,7,10-tetraacético (DOTA) y sus derivados, gases y trazadores fluorescentes. Tales modalidades adecuadas con sus respectivos marcadores son conocidas en la técnica (Baumet al.,Theranostics, 2(5)437-447 (2012)).
C. Tratamiento combinado y diagnóstico
La formulación para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad o afección y la obtención de imágenes no invasiva del órgano o tejido diana pueden combinarse. Las formulaciones farmacéuticas contienen nanopartículas de PBA no dirigidas que encapsulan tanto un agente terapéutico como un agente de diagnóstico/obtención de imágenes. Los usos pueden incluir la administración a un sujeto que necesita prevenir, suprimir o tratar una enfermedad en un tejido diana y obtener imágenes de un tejido diana, de una forma farmacéutica unitaria oral de la formulación farmacéutica que contiene las nanopartículas de PBA no dirigidas que encapsulan una cantidad eficaz de uno o más agentes activos y una cantidad eficaz de un agente de obtención de imágenes; la administración de las nanopartículas de PBA al tejido diana, tal como el páncreas, el hígado o el colon; la liberación de la cantidad eficaz de dichos uno o más agentes y, opcionalmente, de la cantidad eficaz del agente de obtención de imágenes, desde las nanopartículas de PBA a los tejidos diana, lo que da lugar a la prevención, la supresión o el tratamiento de la enfermedad, y a la detección mejorada del tejido diana, o de un microentorno distinto dentro del tejido diana, mediante obtención de imágenes no invasiva.
La presente invención se comprenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
El ácido biliar es un componente crítico del sistema de circulación enterohepático que facilita la absorción y la degradación de los alimentos ingeridos. La recirculación de la bilis desde los intestinos hasta el hígado es la base de una digestión saludable y de la potenciación de los productos alimentarios ingeridos por vía oral. En los ejemplos, se formularon polímeros de ácidos biliares como nanopartículas para actuar como portadores orales eficaces de agentes terapéuticos encapsulados que mejoran su biodisponibilidad, limitada por la escasa absorción debida a la degradación en el bajo pH y por las enzimas digestivas del tracto gastrointestinal. Las nanopartículas fabricadas a partir de ácido biliar polimerizado (ácido ursodesoxicólico) sobreviven al tracto digestivo y transportan varios tipos diferentes de cargas útiles al páncreas, un lugar notablemente inaccesible de enfermedades debilitantes, tales como la diabetes de tipo 1 (T1D). Las nanopartículas (NP) de poli(ácido biliar) (PBA) llegan al páncreas tras su administración oral mediante un mecanismo que implica, en primer lugar, la protección de la carga útil en el microentorno estomacal, seguida de una mayor salida intestinal y, a continuación, una eficaz captación por los macrófagos y circulación hasta el microentorno pancreático. Las NP de PBA cargadas con el inmunosupresor rapamicina previenen y tratan la aparición de la diabetes de tipo 1 (T1D) en el modelo de ratón diabético sin obesidad (NOD). Las NP de PBA cargadas de insulina estabilizaron indefinidamente los niveles de azúcar en sangre en comparación con la insulina inyectada por vía subcutánea o las formulaciones de PLGA que encapsulaban insulina. Una formulación (ácido ursodesoxicólico) tenía propiedades inmunosupresoras por sí sola y sinergizó su efecto inmunosupresor con la rapamicina encapsulada y potenció la administración de insulina encapsulada.
Ejemplo 1. Preparación y caracterización de nanopartículas de PBA.
Materiales y procedimientos
Polimerización de los ácidos biliares
Los ácidos biliares (AB) se polimerizaron en PBA por medio de una reacción de esterificación, y la polimerización se confirmó por resonancia magnética nuclear (RMN) y cromatografía de permeación en gel (GPC). Las NP de PBA, PLGA o compuestas que encapsulan sondas o productos terapéuticos se formularon por medio de una técnica de doble emulsión de agua/aceite/agua como se ha descrito previamente (Kossenaet al.,J. Pharm. Sci., 92:634-638 (2002)). La morfología de las NP se evaluó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), y el diámetro hidrodinámico y la carga superficial de las NP se midieron con un Malvern Zetasizer (Worcestershire, Reino Unido). La fuga de colorante de las NP se controló en medio ácido (solución de tampón citrato, pH 2,0) a 37 °C en presencia de pepsina (10 mg/ml). Para más detalles, véase la Información complementaria.
El PBA o PLGA (viscosidad inherente de 0,55 a 0,75 dl/g, carboxilo terminal) o la mezcla (50:50) de NP que encapsulan colorantes (yoduro de l,l'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina (Dir) o cumarina 6 (C6)) o fármacos (rapamicina o insulina) se formularon mediante el uso de una técnica de doble emulsión de agua/aceite/agua (w/o/w). Los polímeros o la mezcla (100 mg) se disolvieron en 2 ml de cloroformo que contenía 1 mg de Dir o 10 mg de C6 o 10 mg de rapamicina. Se añadió PBS puro (100 μl) o el PBS que contenía insulina de ratón (10 μg) gota a gota a la solución de polímero en cloroformo mientras se agitaba en vórtice y se homogeneizaba mediante el uso de un IKA T25 Digital Ultra-Turrax. A continuación, esta fase dispersante se añadió gota a gota a una fase continua de poli(alcohol vinílico) (PVA) al 5 % y se homogeneizó. A continuación, la mezcla se añadió gota a gota a 200 ml de PVA al 0,2 % y se dejó en agitación durante 2 h para evaporar el disolvente. Las NP se recogieron por centrifugación a 12000 rpm durante 20 min a 4 °C y luego se lavaron 3 veces con agua desionizada. Las partículas se liofilizaron y se almacenaron a -20 °C.
Se seleccionaron los ácidos biliares ácido cólico, ácido litocólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico y ácido ursodesoxicólico para preparar NP de tipo de emulsión doble (W/O/W) después de polimerizar cada AB por esterificación de acuerdo con el Esquema 1. Tras la síntesis y purificación, los polímeros se caracterizaron por medio de resonancia magnética nuclear (RMN) y cromatografía de permeación en gel (GPC) para analizar la poliésterificación y determinar los pesos moleculares, respectivamente (tabla 1). Se añadieron ácidos biliares (AB) (5,4 mmol), ácido para-toluenosulfónico (0,652 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 0,652 mmol) en 60 ml de una mezcla de disolvente de cloruro de metileno anhidro a piridina anhidra 5:1 y se agitó a 40 C para obtener una solución transparente. A la mezcla de reacción se le añadieron 6,92 mmol de diisopropilcarbodiimida y se dejó que la reacción prosiguiera durante 2 h en una atmósfera de nitrógeno. El producto de poliéster, PBA, se precipitó en 400 ml de metanol anhidro frío, se recogió por centrifugación y se secó para obtener un polvo blanco.
Los pesos moleculares (Pm) de los PBA (10 mg/ml en cloroformo) se evaluaron con GPC mediante el uso de un sistema HPLC de Waters equipado con una bomba isocrática modelo 1515, un automuestreador 717 plus y un detector de índice de refracción (RI) 2414 con columnas Styragel HT6E y HT2 de Waters en serie. Se utilizó cloroformo como fase móvil con un caudal de 1 ml/min y tanto las columnas como el detector RI se mantuvieron a 40 °C. Los valores de PM se determinaron en relación con una curva de calibración generada a partir de estándares de poliestireno de polidispersidad estrecha de Aldrich Chemical. Se utilizó el software Empower II GPC para ejecutar los instrumentos de GPC y el posterior análisis cromatográfico.
La polimerización fue el resultado de la esterificación de monómeros de ácido biliar mediante el uso de ácido paratoluenosulfónico (PTSA), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y W,N-diisopropilcarbodiimida (DIC). A continuación, se presenta el esquema de la reacción de esterificación mediante el uso del monómero de ácido ursodesoxicólico (UDCA) para formar un polímero de poli(ácido biliar) lineal:
Formación de nanopartículasdeácido polifílico
Análisis de RMN
Los datos espectrales de RMN de0206H y 2D (COSY, DQFCOSY, HSQC y HMBC) para UDCA y PUDCA se registraron en un espectrómetro de RMN Agilent (EE. UU.) a 600 MHz con una sonda fría de 3 mm o 40o MHz, y los datos de RMN de 13C se midieron mediante el uso de un campo magnético de 100 MHz. Se utilizó cloroformod1 (99,96%, Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) como disolvente deuterado de RMN y señales de referencia de disolvente^ 7.25, 5<c>76.98) para todos los experimentos de RMN. La polimerización completa del monómero UDCA mediante el acoplamiento del grupo ácido carboxílico en C-24 con 2 grupos separados de alcohol secundario en C-3 y C-7 fue apoyada sin ambigüedad por los análisis de los datos espectrales de RMN, incluida la RMN bidimensional (COSY, DQFCOSY, HSQC y HMBC).
Análisis estadístico
A lo largo de los Ejemplos, las comparaciones experimentales con grupos múltiples utilizaron el análisis ANOVA con un análisis post hoc de Bonferroni. Se realizaron pruebas de la t de Student de dos colas para algunas comparaciones, tal como se indica en las leyendas de las figuras. Un valor depigual o inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
Los polímeros de poli(ácido biliar) (PBA) formados y sus respectivas nanopartículas (NP) se caracterizaron por su peso molecular, tamaño (diámetro medio), índice de polidispersidad, potencial Zeta (mV) y capacidad de carga de colorantes. Los resultados se resumen en la siguiente tabla 1. Para la comparación se utilizaron PLGA y nanopartículas formadas por PLGA. La distribución del tamaño de las nanopartículas de PBA se presenta en la figura 1.
Tabla 2. Características de los polímeros PBA sintetizados y sus respectivas nanopartículas.
a La masa molar media en número (cromatografía de permeación en gel, GPC)
b La masa molar media en peso (GPC)
c Índice de polidispersidad (GPC)
d Índice de polidispersidad (dispersión dinámica de la luz, DLS)
e (peso del colorante / peso de las nanopartículas) x 100
f Nanopartícula compuesta (PLGA:PUDCA=50:50, p/p)________________________________________________ La polimerización completa del monómero UDCA a través del acoplamiento del grupo ácido carboxílico en C-24 con grupos alcohol fue apoyada inequívocamente por los análisis de RMN de 1H y bidimensional.
Las NP de PBA representativas, las NP de PUDCA, mostraron una morfología esférica en las micrografías electrónicas de barrido (SEM), y se calculó que el diámetro de la NP era de 344,3 ± 4,7 nm. Para aislar los efectos biológicos de las propiedades de la PBA sobre la biodisponibilidad de la NP, se optimizó la formulación de la NP para normalizar por otros parámetros biofísicos, tales como el diámetro de la partícula y la carga superficial, que influyen en la biodisponibilidad. La Tabla 1 resume estos parámetros; el diámetro hidrodinámico promedio fue de 331,1 ± 20,3 nm, y el potencial zeta promedio fue de -25,3 ± 2,3 mV. Además, todas las NP se formularon para encapsular niveles similares de un colorante del infrarrojo cercano, el yoduro de l,l'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina (Dir), con el fin de garantizar que las dosis de NP contuvieran las mismas intensidades de fluorescencia.
Las NP de PBA se compararon con las NP de PLGA, que se han estudiado ampliamente en la administración oral. Las propiedades materiales conmensurables de los polímeros y las NP garantizaron que las diferencias en la biodisponibilidad tras la administración oral fueran el resultado de las propiedades físicas y bioquímicas de las PBA.
Ejemplo 2. Las nanopartículas de PBA muestran una mayor estabilidad, una mayor permeabilidad celular y una mejor captación celular, en comparación con las nanopartículas de PLGA.
Materiales y procedimientos
Liberación de colorantes en el entorno estomacal:Las Dir-NP se dispersaron en el medio (solución de tampón citrato, pH 2,0) a 37 °C en presencia de pepsina (10 mg/ml). En cada punto temporal, se centrifugaron las muestras y se utilizó el sobrenadante para medir la cantidad de Dir liberada desde las partículas. Se añadió EUDRAGIT® a dispersiones de NP de PLGA (al 5 %) y se comparó.Captación de NP en BMMSe recogieron células de médula ósea de ratones C57BL/6 y se cultivaron en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) con factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF, 10 ng/ml) a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2. Después de 7 días, se sembraron BMM en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo y se agregaron NP cargadas con Dir (Dir-NP) al medio. Las células se incubaron durante 2, 4 y 8 h y se midió la captación de Dir-NP mediante un lector de placas después del lavado.
También se sembraron BMM a 7 x 104 células/cm2 en filtros Transwell con poros de 0,4 μm para controlar la liberación de NP de las células. Las NP cargadas con Dir (1 mg/ml) se incubaron con BMM durante 4 h y se lavaron antes del experimento. Se tomaron muestras de los medios de liberación en la cámara basolateral y se midieron en cada punto temporal.
Ensayo de permeabilidad intestinalSe sembraron células Caco-2 a 7 x 104 células/cm2 en filtros Transwell con poros de 0,4 μm en medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml y aminoácidos no esenciales 0,1 mM. Las células se cultivaron hasta confluir y se dejaron madurar durante aproximadamente 30 días a 37 °C y 5% de CO2. Los medios de cultivo celular se cambiaron cada 2 o 3 d. Antes de realizar los estudios de permeabilidad, se midió la resistencia eléctrica transepitelial ("transepithelial electrical resistance", TEER) utilizando un voltímetro epitelial. A fin de llevar a cabo los estudios de permeabilidad y citotoxicidad se utilizaron capas celulares confluentes con valores de TEER superiores a 300 x cm2. A fin de llevar a cabo los estudios de permeabilidad, se preparó una dispersión de 1 mg/ml de NP cargadas con Dir o una solución de Dir en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin fenol que contenía glucosa 25 mM y se añadió a la cámara apical del filtro Transwell. Se añadió HBSS con glucosa 25 mM (400 μl) a la cámara basolateral y se tomaron muestras de 100 μl del medio de la cámara basolateral y se sustituyeron por 100 μl de medio fresco en cada punto temporal de la medición de la fluorescencia (Aex: 750 nm, Aem: 790 nm). La tasa de transporte acumulado de Dir a la cámara basolateral dio el flujo, dQ/dt. La permeabilidad (P) se calculó dividiendo el flujo por la concentración inicial de Dir total en la cámara apical (CO) y el área del filtro Transwell (A).
Resultados
Las figuras 2A y 2B muestran que las nanopartículas de PUDCA eran significativamente más estables en condiciones estomacales en comparación con las nanopartículas de PLGA. La estabilidad se midió como porcentaje (%) de liberación del colorante DiR en las nanopartículas. El porcentaje de liberación del colorante de las nanopartículas de PLGA a las 2 horas o a las 4 horas de incubación en condiciones estomacales fue de aproximadamente 5,04 ± 0,84 %, o de aproximadamente 7,50 ± 0,78 % (p< 0,0001) respectivamente, mientras que el de las nanopartículas de PUDCA fue de aproximadamente 0,82 ± 0,10% en ambos intervalos de tiempo. Esta diferencia fue estadísticamente significativa. En cada punto temporal, se centrifugaron las NP y se recogió el sobrenadante para medir la cantidad de Dir liberada de las partículas (Aex 750 nm; Aem 790 nm). Las NP de PLGA mostraron una fuga de colorante del 95 % a lo largo de 7 días, mientras que la liberación de colorante fue significativamente más lenta en el caso de las NP de PUDCA. Las partículas preparadas con una mezcla de PLGA y PUDCA presentaron un perfil de liberación similar al de las NP de PUDCA (n = 5).
En medios que imitan el estómago (una solución de pepsina en tampón citrato a pH 2,0, 37 °C), las NP de PLGA filtraron colorante tras 2 y 4 h de incubación (figura 2A), y las NP se agregaron debido a la desestabilización de las partículas por hidrólisis rápida (figura 2C), confirmando los hallazgos previos de que la degradación del PLGA se acelera en condiciones ácidas. En cambio, la fuga de colorante se redujo al mínimo en el PUDCA o en las NP compuestas (fabricadas como una mezcla 50/50 p/p de PLGA y PUDCA), y estas partículas mantuvieron su tamaño durante periodos de tiempo más largos. A fin de reducir la liberación en estallido del colorante, las NP de PLGA se recubrieron con un 5 % en peso de EUDRAGIT®, un recubrimiento entérico de poliacrilato que protege en condiciones de pH bajo, como control positivo.
Además, la permeabilidad de las nanopartículas de PBA a través de una monocapa de células CaCo2 en un sistema Transwell fue significativamente mayor que la de las nanopartículas de PLGA (figura 2D). En concreto, las nanopartículas de PUDCA mostraron una absorción cinco veces más rápida a través de la monocapa que las nanopartículas de PLGA (PUDCA: 50,63 x 107 cm/s, PLGA: 6,45 x 107 cm/s, p < 0,0001). Para evaluar otra métrica importante de la absorción de partículas en la capa intestinal, se realizó un experimento con Transwell en el que las NP cargadas con Dir atravesaron una monocapa de Caco-2, un modelo intestinal humano habitual. Las NP formuladas con PUDCA mejoraron significativamente la permeabilidad intestinal, mientras que el transporte del colorante libre y de las N<p>de PLGA fue significativamente más lento (figura 2J). Las NP compuestas (PLGA/PUDCA) mostraron una cinética entre las fabricadas puramente con PLGA o PUDCA.
Del mismo modo, las nanopartículas de PUDCA son captadas preferentemente por los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM). La intensidad de fluorescencia de BMDm incubados durante 4 u 8 horas con 1 mg/ml de nanopartículas de PUDCA fue significativamente mayor que con 1 mg/ml de nanopartículas de PLGA (figura 2H),p= 0,023.
Los estudios han demostrado que las propiedades materiales de las partículas son fundamentales para determinar la interacción partícula-macrófago y, de este modo, la captación de partículas en los macrófagos. La figura 2H muestra la captación de NP en B<m>M dependiente de la formulación en función del tiempo de incubación. A medida que aumentaba la proporción de PUDCA en las NP, se observaba una captación más rápida por parte de los macrófagos de las NP. Cabe destacar que la liberación de las nanopartículas de los BMM también fue más rápida en el caso de las nanopartículas de PUDCA (figura 21), quizá porque el PUDCA es colesterol polimerizado, una molécula que no daña la membrana celular, y puede entrar y salir fácilmente de las células abriendo las membranas celulares, del mismo modo que los AB penetran en las capas celulares intestinales para entrar en el torrente sanguíneo. De hecho, se ha demostrado que los AB alteran las uniones estrechas en el revestimiento epitelial, permitiendo vías de transporte paracelular y transcelular. Asimismo, las NP de PUDCA mostraron una elevada captación en células Caco-2 (Figuras 2E, 2F y 2G) y una rápida exocitosis, mostrando una permeabilidad sustancial a través de las capas de células Caco-2.
Ejemplo 3. Las nanopartículas de PBA no suelen ser tóxicas.
Materiales y procedimientos
A fin de evaluar la citotoxicidad de las formulaciones, se incubaron NP (1 mg/ml) con células Caco-2 o NIH-3T3, que se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 104 células por pocillo y se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2. Las células se incubaron durante 24 h y el número de células viables se determinó mediante un ensayo colorimétrico MTT. La placa de pocillos se incubó durante 4 h y se registró la absorbancia a 570 nm.
Resultados
Los resultados indican que la viabilidad celular depende de la formulación de las nanopartículas, así como de la línea celular (figuras 3A y 3B). En general, las nanopartículas de PBA no son tóxicas. En concreto, las nanopartículas formadas por PUDCA o PLGA tienen un efecto similar sobre la viabilidad celular (figuras 3A y 3B).Ejemplo 4. Biodistribución de nanopartículas de PBA tras la ingestión por sonda oral.
Materiales y procedimientos
Las nanopartículas cargadas con DiR formadas por PLGA, poli(ácido cólico) (C, o PCA), poli(ácido litocólico) (LC, o PLCA), poli(ácido desoxicólico) (DC, o PDCA), poli(ácido quenodesoxicólico) (CDC, o pCDcA), o UDC (o PUDCA) a una concentración de 5 mg/ml se administraron por sonda oral en un volumen de 300 μl. Cuatro horas después de la administración, se sacrificó a los ratones y se cuantificó la fluorescencia de DiR de diversos órganos. Los resultados se presentan en las figuras 4A-4C.
Se alojaron ratones C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) en jaulas de microaislamiento esterilizadas en autoclave que se situaron en un bastidor de contención de presión positiva y se mantuvieron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos experimentales y de control de 3 a 5 animales cada uno. Se dejó a los ratones en ayunas durante 4 h y se trataron con NP que encapsulaba Dir o C6 mediante inyección oral (0,5 g/kg). El Dir libre o el C6 solubilizado con TWEEN 20® actuaron como control.
Los ratones fueron sacrificados a las 4, 8, 12 o 24 horas después de la ingestión por sonda y se utilizó un instrumento de obtención de imágenes moleculares Bruker (Carestream Health, Inc., Rochester, EE. UU.) para escanear los órganosex vivoy medir la intensidad de la fluorescencia. Los páncreas de los ratones que recibieron las NP de PUDCA cargadas con óxido de hierro se fijaron para su análisis histológico mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y azul de Prusia. También se recogieron órganos de ratones que recibieron NP de PUDCA cargadas con C6 y se tiñeron con anticuerpos contra F480 para analizar los macrófagos asociados a las NP mediante citometría de flujo. Cada formulación también se administró por vía intravenosa (i.v.) a ratones por medio de inyección en la vena de la cola para evaluar la biodistribución (100 mg/kg, 50 μl). Se utilizó Clodrosome (liposomas que contienen clodronato, 100 mg/kg, i.p.) para conseguir un empobrecimiento en macrófagos.
Resultados
Las nanopartículas de PBA o PLGA se distribuyeron por todo el tracto gastrointestinal (GI) (figura 4A). En general, la intensidad de fluorescencia de las nanopartículas de PBA por gramo de tejido fue mayor que la de las nanopartículas de PLGA en los tres tejidos examinados: estómago, intestino grueso o intestino delgado. De todas las nanopartículas de PBA, las nanopartículas de PUDCA mostraron la menor retención en el estómago, lo que indica que pueden ser más adecuadas para la administración oral de fármacos (figura 4A).
Tras la administración oral de las nanopartículas, se detectó la fluorescencia de las nanopartículas en el páncreas, el hígado, el pulmón, el bazo, el riñón y el corazón (figuras 4B y 4C). Cuando se normalizó la intensidad de la fluorescencia por gramo de tejido (figura 4C), los datos revelaron que las nanopartículas de PBA eran más eficaces para dirigirse al páncreas que las nanopartículas de PLGA. Asimismo, la intensidad de fluorescencia por gramo de tejido de las nanopartículas de PUDCA fue mayor en todos los tejidos en comparación con la de las nanopartículas de PLGA.
Se observó una captación de NP significativamente mayor en los pulmones, en el bazo y, especialmente, en el páncreas en el caso de las NP de PBA, mientras que su acumulación fue relativamente baja en el hígado, el bazo, los riñones y el corazón (figuras 4D, 4E y 4F). Entre las NP de PBA, las NP de PUDCA mostraron la mayor captación en todos los órganos, mientras que la captación de las NP de PCA fue la más baja. La absorción pancreática podría estar relacionada con parámetros físicos de los AB monoméricos, tales como la hidrofobicidad y la constante de disociación (pKa). El UDCA es el AB más hidrófilo entre los AB ensayados, mientras que el CA tiene un valor pKa más bajo (4,98) que los demás ensayados (de 5 a 6,5). Se sabe que la actividad biológica de los AB está estrechamente relacionada con sus propiedades químicas, incluido el número y la orientación de los grupos hidroxilo, ya que estos parámetros afectan directamente a su hidrofobicidad, pKa, solubilidad en agua y formación de micelas. Sin embargo, los niveles de absorción de las NP de PBA en los órganos no estaban linealmente relacionados con las propiedades de los AB, incluida la hidrofobicidad (LCA < DCA < CDCA < CA < UDCA), el número de grupos hidroxilo (LCA < DCA = CDCA = UDCA < CA), o la pKa (LCA < CA < UDCA < DCA < CdCa ), probablemente debido a la imprevisibilidad de las interacciones biológicas y la diversidad de los microentornos de los órganos. Las NP de PLGA de control mostraron una captación relativamente baja en los órganos, y el colorante Dir libre se acumuló principalmente en los pulmones y el bazo.
Ejemplo 5. Las nanopartículas de PBA se dirigen al páncreas tras la ingestión por sonda oral.
Materiales y procedimientos
Los materiales y procedimientos fueron los descritos anteriormente.
Tanto las nanopartículas de PUDCA como las de PLGA se cargaron con aproximadamente la misma cantidad de DiR o cumarina 6 (Tabla 1).
Histología
Los páncreas de los ratones que recibieron NP de PUDCA cargadas de óxido de hierro (NP de IO-PUDCA) se fijaron en formol tamponado neutro al 10 % para su análisis histológico por medio de tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) y azul de Prusia. Las secciones teñidas fueron preparadas por el Servicio de Histopatología de la Universidad de Yale (New Haven, Connecticut, EE. UU.). Las imágenes de los tejidos se tomaron en un microscopio Nikon TE-2000U con una cámara en color Nikon DS Fil y el software NIS Elements AR (versión 2.30).
Resultados
La figura 5A muestra la cinética de absorción de las nanopartículas de PLGA, PLGA y PUDCA 50:50, o PUDCA en el páncreas, e indica que la absorción depende de la formulación de las nanopartículas. La absorción pancreática de las nanopartículas de PUDCA fue significativamente mayor que la de las nanopartículas de PLGA a las 4, 8 y 12 horas después de la ingestión por sonda. Esta captación preferente de las nanopartículas de PUDCA por el páncreas dependía de la formulación de las nanopartículas (figuras 5A y 5B). Como se indica en las figuras 5E y 5F, la biodistribución de las nanopartículas de PLGA y PUDCA fue similar. La figura 5E es el porcentaje de captación de partículas por los órganos y la figura 4B son datos cuantitativos reales, lo que significa que la cantidad absoluta de NP de PUDCA es mayor en los órganos.
Cuando se normaliza por gramo de tejido, las nanopartículas de PUDCA producen una mayor intensidad de fluorescencia en los órganos respectivos, lo que indica que una cantidad significativamente mayor de nanopartículas de PUDCA llegó a estos órganos en comparación con la cantidad de nanopartículas de PLGA (figuras 5C y 4C). Además, la ingestión oral de ratones con PBS o nanopartículas de PUDCA cargadas con óxido de hierro superparamagnético (SPIO) mostró acumulación de las nanopartículas en las células pancreáticas cuando se examinaron con tinción azul de Prusia para óxido de hierro.
Se examinó la cinética de captación y eliminación pancreática de las NP de PBA y PLGA, observándose que el pico de captación se producía 4 h después de la alimentación, seguido de la eliminación de las partículas (figura 4E). Por el contrario, la captación pancreática de colorante libre fue más lenta. Para garantizar que la notable captación pancreática no fuera un fenómeno dependiente del colorante, las NP también se formularon con cumarina 6, un colorante mucho más hidrófobo que el Dir. Tras variar la propiedad física de los colorantes, las lecturas de fluorescencia pancreática fueron coherentes y confirmaron que las NP de PUDCA alcanzan el páncreas en una medida significativamente mayor que las NP de PLGA o el colorante en suspensión, independientemente de las propiedades del colorante (figura 4F). Esta retención pancreática se verificó además mediante la administración de NP de PUDCA que encapsulaban óxido de hierro (IO), y la tinción con H&E confirmó que las NP de PBA no eran tóxicas. Curiosamente, la proporción de NP tanto de PLGA como de PUDCA que atravesaron los intestinos se distribuyó en compartimentos similares; no hubo diferencias significativas entre los porcentajes de biodistribución de las NP que atravesaron los intestinos (figura 5F). Sin embargo, cuando los ratones fueron alimentados con dosis de PLGA o PUDCA con igual intensidad de fluorescencia, se recuperó una fluorescencia total sustancialmente mayor en los órganos de los ratones que recibieron NP de PUDCA (figura 5D), lo que sugiere que más NP de PUDCA pasaron a través de los intestinos y alcanzaron los órganos.
Ejemplo 6. El traslado de nanopartículas de PBA desde el tracto gastrointestinal hasta el páncreas se produce a través del transporte sanguíneo.
Materiales y procedimientos
Cada formulación (10 mg/ml, 100 ul inyectados (total = 1 mg)) también se administró por vía intravenosa a los ratones por medio de inyección en la vena de la cola (i.v.) para evaluar la biodistribución y se midió la intensidad de fluorescencia de los órganos al cabo de 2 h.
Se estudió la capacidad de las nanopartículas de PLGA, PLGA y PUDCA (mezcla 50:50) o PUDCA para dirigirse al páncreas cuando se inyectaban por vía intravenosa, en lugar de administrarse por sonda oral.
Resultados
Dos horas después de la inyección intravenosa, las nanopartículas de PLGA, PLGA y PUDCA 50:50 o PUDCA cargadas con DiR quedaron retenidas en el páncreas y, de nuevo, con mayor retención las nanopartículas de PUDCA que las de PLGA (figura 6A y 6B). (PLGA: 13,0 x 108 (p= 0,047), 50/50: 58,2 x 108 (p = 0,002), PUDCA: 86,5 x 108 (p = 0,0008)).
El traslado a los órganos mejorado de las NP de PUDCA se explicó completamente por una protección estomacal y una permeación intestinal superiores por medio de la inyección intravenosa (i.v.) de NP (PLGA, PUDCA o compuestas) para eludir el tracto digestivo. Tras la administración i.v., la captación de NP de PUDCA en el páncreas (figura 6B), el hígado y los pulmones siguió siendo superior a la de PLGA o las NP compuestas (figuras 6C y 6D). Este resultado indicó que en la circulación existía otro factor impulsor de la elevada biodisponibilidad oral de la NP de PUDCA. Se eligieron los macrófagos para los estudios posteriores porque estas células a menudo gobiernan el destino de las partículasin vivo,desempeñando papeles clave en la internalización, el transporte y la eliminación de partículas en el torrente sanguíneo.
Dado que las nanopartículas de PUDCA son captadas preferentemente por los macrófagos de la médula ósea (figura 21), se comprobó si la inyección intravenosa de las nanopartículas de PUDCA cargadas con DiR en ratones sanos o empobrecidos en macrófagos afectaría a la retención pancreática de las nanopartículas. Tal como se demuestra en las figuras 6E y 6F, los páncreas de los ratones empobrecidos en macrófagos retenían una cantidad significativamente menor de nanopartículas de PUDCA cargadas con DiR que los páncreas de los ratones sanos, tal como indica la intensidad de fluorescencia significativamente menor (figuras 6E y 6F). (Sanos: 2,72 x 108, emp. en mac.: 1,45 x 108, p = 0,017).
Cuando se eliminaron los macrófagos de los ratones por medio de liposomas de clodronato, la captación pancreática de NP de PUDCA disminuyó significativamente (figura 6F), lo que demuestra que los macrófagos desempeñan un papel fundamental en el depósito de NP de PUDCA en el páncreas. El análisis por citometría de flujo confirmó que el 16 % de los macrófagos (el 11 % del total de linfocitos) estaban asociados a NP de PUDCA en el páncreas (figura 6G). A continuación, los macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) se incubaron con NPs PUDCA para cargar macrófagosex vivo, y se comparó la biodistribución de las NPs PUDCA tras la transferencia adoptiva de macrófagos cargados con la inyección directa de NPs PUDCA o BMM ingenuos. Los resultados de la biodistribución entre estos grupos no fueron estadísticamente significativos, lo que indica que las interacciones entre los macrófagos y las NP de PUDCA no redirigieron estas células a ningún órgano específico (figura 6H). También se observó que las NP de PUDCA no inducían la regulación al alza de la citocina proinflamatoria (IL-1p) de los BMM (figura 6I).
Estos datos indicaban que las nanopartículas de PUDCA administradas por vía oral podían llegar al páncreas a través de la sangre, bien en forma libre, bien engullidas en macrófagos.
A fin de confirmar que los macrófagos desempeñan un papel en el traslado y la retención de las nanopartículas de PBA, se examinó el porcentaje de acumulación de las nanopartículas de PUDCA o de macrófagos en diversos órganos. Las nanopartículas de PUDCA cargadas con DiR y los macrófagos marcados con DiR se inyectaron por vía intravenosa en ratones de tipo salvaje, tras dos horas se sacrificaron los ratones y se examinó el porcentaje de acumulación en el páncreas, el pulmón, el hígado, el bazo, el riñón y el corazón. Los resultados se presentan en la figura 6J, y demuestran que el porcentaje de acumulación de nanopartículas de PUDCA y el de macrófagos fue similar en todos los órganos examinados.
La cinética de captación y liberación de las NP de PUDCA, PLGA/PUDCA y PLGA por los macrófagos se presenta en las figuras 6K y 6L. En la figura 6M se muestra un diagrama esquemático de la llegada de las NP de PUDCA al páncreas tras su administración oral.
Ejemplo 7. Prevención de la diabetes de tipo 1 con nanopartículas de PBA cargadas de rapamicina.
Materiales y procedimientos
A ratones NOD (NOD/ShiLtJ, Jackson Laboratory, 7 semanas de edad) se les inyectó ciclofosfamida (CY, 200 mg/kg) por vía intraperitoneal para inducir la T1D. Transcurridas 24 horas, se administraron por sonda oral a los ratones NP cargadas de rapamicina (rapa-NP, 40mg/ml, 250 μl, 0,5 g/kg, 1 o 2 dosis, 0,1 mg de rapamicina/mg de NP) y se controló la glucosuria. Se tomaron dos lecturas (con dos días de diferencia) superiores a 250 mg/dl como indicio de inicio de T1D. Las Dir-NP se utilizaron para obtener imágenes de los páncreas diabéticos. Se adquirieron CD44+ de los linfocitos CD8 y Treg CD4+CD25+Foxp3+ utilizando un citómetro de flujo tras los tratamientos con CY y NP Se recogieron los ganglios linfáticos pancreáticos drenantes y se procesaron mediante el uso de un colador celular de 40 μm para aislar los esplenocitos. Los marcadores de la superficie celular se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para CD8 (PerCP-Cy5.5; 2 ug/ml), CD4 (Pacific Blue; 2 μg/ml), CD44 (Alexa Fluor-700; 2 ug/ml) y CD25 (FITC; 1 μg/ml) incubándolos durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se fijaron, permeabilizaron y tiñeron para Foxp3 (PE; 5 ug/ml) mediante el uso del kit de tinción Foxp3 de eBiosciences y siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Tras el lavado final, las muestras se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo multicolor BD LSR-II para cuantificar el porcentaje de linfocitos Treg CD44+, CD8+ y CD4+CD25+Foxp3+. El análisis posterior se realizó con el software de análisis FloJo FACS.
Resultados
Las figuras 7A a 7C demuestran que las nanopartículas de PUDCA cargadas con rapamicina, pero no las nanopartículas de PLGA cargadas con rapamicina, previenen el desarrollo de T1D en ratones NOD. La diabetes de tipo 1 (T1D) se indujo en ratones NOD mediante la inyección intraperitoneal de ciclofosfamida (CY), lo que condujo a la rápida aparición sincrónica de la T1D (figura 7A). Un día después de la inyección de CY, los ratones recibieron por sonda oral una o dos veces nanopartículas de PLGA o PUDCA cargadas con rapamicina. Los niveles de glucosa en sangre se midieron a partir del segundo día tras la inyección de CY
La figura 7B demuestra que mientras que el 80 % de los ratones tratados con CY desarrollaron diabetes después de 12 d, la enfermedad fue parcialmente atenuada por las NP de PUDCA que encapsulaban rapamicina durante 30 d.
El tratamiento con PLGA-rapamicina no fue, sin embargo, suficiente para suprimir la progresión de la enfermedad, dado que el 60% de los ratones sucumbieron a la T1D (figura 7B). Como se indica en la figura 7B, solo aproximadamente el 20% de los ratones que recibieron rapamicina-PUDCA desarrollaron T1D frente a aproximadamente el 60 % cuando fueron tratados con rapamicina-PLGA. Este efecto podría atribuirse a una mayor retención de las nanopartículas de PUDCA cargadas con rapamicina en los páncreas inflamados de los ratones con T1D, frente a la de las nanopartículas de PLGA cargadas con rapamicina (figura 7C).
Asimismo, se examinó el porcentaje de linfocitos T CD8 CD44+ de memoria efectores y de linfocitos T reguladores CD4 CD25+FoxP3+ (Treg) antes o 3, 5 y 7 días después de la inyección de ciclofosfamida. El porcentaje de linfocitos T reguladores (Treg), evaluado por la expresión de CD4+CD25+FoxP3+, fue rastreado en los ganglios linfáticos de drenaje, después del tratamiento, durante varios días (figura 7D). Mientras que el tratamiento con las NP de PLGA disminuyó el empobrecimiento en Treg inducido por CY en comparación con la ausencia de tratamiento, el tratamiento con las NP de PUDCA permitió una supresión más significativa del empobrecimiento en Treg. Además, el tratamiento con nanopartículas de PUDCA-rapamicina amortiguó la pérdida de Treg, ya que el porcentaje de Treg CD4 CD25+FoxP3+ en la población de linfocitos no se redujo tan intensamente como en los ratones no tratados.Ejemplo 8. Reversión de la diabetes de tipo 1 con nanopartículas de PBA cargadas de insulina.
Materiales y procedimientos
Ratones NOD fueron alojados durante aproximadamente 2 meses para permitirles desarrollar T1D de forma espontánea. Cuando dos mediciones aleatorias de glucosa en sangre en la vena de la cola (con dos días de diferencia) fueron superiores a 200 mg/dl, los ratones fueron tratados por vía oral con insulina libre o NP cargadas de insulina (insulina-NP) todos los días durante una semana y se controló la glucosuria y el peso corporal. Las concentraciones de insulina plasmática y pancreática se determinaron con el ELISA de insulina ultrasensible de ratón 4, 8 y 24 h después de la administración por sonda oral. Siete días después de los tratamientos con ins-NP, se recolectaron los ganglios linfáticos pancreáticos y se analizaron mediante citometría de flujo para cuantificar el porcentaje de linfocitos CD44+ CD8+, así como Treg CD4+CD25+Foxp3+.
Aislamiento y cultivo de células.
Se recogieron huesos largos y bazos de ratones (C57BL/6 o Rag2/OT-II) tras la dislocación cervical. La médula ósea eluida de los huesos largos, o de los bazos, se maceró con jeringas de plástico de 1 ml en medio RPMI-1640 (Life Technologies) suplementado con FBS al 10 % (Atlanta Biologicals). Los glóbulos rojos se lisaron utilizando el tampón Tris-NH4Cl. Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) se cultivaron en medio RPMI con factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 10 ng/ml) a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Las BMDC se generaron mediante el uso de un protocolo de expansión convencional en el que se sembraron 5 x 105 células/ml en RPMI suplementado con 20 ng/ml de GM-CSF y se cultivaron durante 5 días. El día 5 se recogieron las células no adherentes y se reprodujeron en medio GM-CSF durante 2 días más. Se recogieron las células no adherentes y la expresión de CD11c confirmó el fenotipo de CD. Los linfocitos T se purificaron a partir de poblaciones de esplenocitos utilizando kits de selección CD4+ negativos (EasySep).
Caracterización funcional de las respuestas celulares al PUDCA
Linfocitos T CD4+ purificados (C57BL/6, 1 x 105 células/pocillo, placa de 96 pocillos) se estimularon con anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3, y se incubaron con NP de PUDCA 50 μg/ml o 5 μg/ml. El día 3 se midió la proliferación celular mediante el marcaje con CFSE y se cuantificó la secreción de citocinas en los sobrenadantes mediante ensayos ELISA. Para los estudios específicos de antígeno, se utilizaron linfocitos CD4+ específicos de OVA en ensayos de cocultivo de OTII. Las BMDC (2,5 x 104) se pretrataron con NP de PUDCA durante 24 h, se lavaron y, a continuación, se estimularon con LPS (10 ng/ml) y ovoalbúmina (20 μg/ml) durante 24 h, seguido de un cocultivo con linfocitos T CD4+ OTII (5 x 104) durante 3 d. A continuación, se cuantificaron la proliferación celular y la producción de citocinas.
Citometría de flujo
Las poblaciones CD44+ de linfocitos CD8+ y el número de Treg CD4+CD25+Foxp3+ se determinaron por medio de citometría de flujo tras los tratamientos con NP Los ganglios linfáticos pancreáticos se recolectaron y se procesaron mediante el uso de un colador celular de 40 μm. Los marcadores de la superficie celular se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para CD8 (PerCP-Cy5.5), C<d>4 (Pacific Blue), CD44 (Alexa Fluor-700) y CD25 (FITC) incubándolos durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para Foxp3 (PE) mediante el uso del kit de tinción de Foxp3 de eBiosciences y siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Tras el lavado final, las muestras se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo multicolor BD LSR-II. El análisis de los datos se realizó con el programa de análisis FlowJo.
Los macrófagos CD11c-F4/80+ se caracterizaron por citometría de flujo tras el tratamiento con 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3-tetrametilindodicarbocianina perclorato (DiD) cargada con PUDCA NPs para estudios de captación. Se recogieron bazos, ganglios linfáticos pancreáticos, pulmones e hígados y se procesaron por medio de homogeneización mediante el uso de un colador celular de 40 μm y un émbolo de jeringa. Los marcadores de la superficie celular se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para F4/80 (Alexa Fluor-700), y CDllc (PE-Cy7) incubándolos durante 30 minutos a 4 °C. Tras 3 lavados con tampón FACS (FBS al 2 % en PBS), las muestras se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo multicolor Attune NxT (Life Technologies, Guilford, EE. UU.). Tras el tratamiento con NP de las BMDC cultivadas, se aislaron las células, se lavaron con tampón FACS (FBS al 2 % en PBS) y se tiñeron con Ab primarios diluidos en tampón FACS durante 30 minutos a 4 °C. Los anticuerpos utilizados en estos estudios fueron CD11c (eFluor450), Mh C de clase I (APC), MHC de clase II (PerCP-Efluor710), CD40 (FITC) y CD86 (PE). A continuación, las muestras se fijaron en paraformaldehído al 2 % y se analizaron en un citómetro de flujo LSRII. Se contaron 10000 acontecimientos para cada muestra y se analizaron con el software FlowJo. Todas las muestras se separaron inicialmente en compuertas de dispersión frontal y lateral, seguidas de la separación en singuletes CD11c lc+. A continuación, se evaluó la expresión de los marcadores de superficie MHC de clase I, MHC de clase II, CD40 y CD86 en estos acontecimientos celulares utilizando intensidades fluorescentes medias geométricas para los análisis estadísticos.
Resultados
Se alimentó a ratones con diabetes establecida (verificada por lecturas constantes de glucosa en sangre superiores a 200 mg/dl) con NP de PLGA o PUDCA fluorescentes. Tras 4 h, se detectó una mayor cantidad de fluorescencia en los ratones a los que se administró PUDCA y, a diferencia de los ratones tratados con PLGA, se detectó fluorescencia 24 h después, lo que demuestra una elevada retención de las NP de PUDCA.
La figura 8C demuestra que la ingestión por sonda oral de nanopartículas de PUDCA cargadas de insulina, pero no de nanopartículas de PLGA cargadas de insulina (un total de siete dosis administradas diariamente durante la primera semana de diabetes), mantiene los niveles de azúcar en sangre durante al menos 21 días e invierte la T1D. Durante el periodo de tratamiento, el peso corporal de los ratones permaneció prácticamente inalterado (figura 8D). Significativamente, las nanopartículas de PUDCA cargadas de insulina duplicaron la supervivencia esperada de los ratones con T1D (figura 8E).
El efecto terapéutico beneficioso de las nanopartículas de PUDCA cargadas de insulina y dirigidas al páncreas podría explicarse por unos niveles de insulina significativamente mayores en los páncreas de los ratones tratados con nanopartículas de PUDCA cargadas de insulina, en comparación con los de los ratones tratados con nanopartículas de PLGA cargadas de insulina, a las 4 y 8 horas de la administración oral de las nanopartículas (figura 8A). (PLGA 4 h: 4,10 ng, PLGA 8 h: 6,41 ng, PUDCA 4 h: 25,9 ng, PUDCA 8 h: 14,9 ng,p<0,001, n = 5). Del mismo modo, la concentración de insulina en el suero de los ratones tratados con nanopartículas de PUDCA cargadas de insulina fue significativamente mayor en comparación con la de los ratones tratados con nanopartículas de PLGA cargadas de insulina, a las 4 y 8 horas de la administración oral de las nanopartículas (figura 8B) (PLGA 4 h: 6,55 ng/ml, PLGA 8 h: 6,14 ng/ml, PUDCA 4 h: 14,94 ng/ml, PUDCA 8 h: 11,80 ng/ml, p < 0,01, n = 5).
A fin de determinar si esta retención sustancial y prolongada de las NP de PUDCA en ratones diabéticos podría aumentar sus niveles de insulina, se analizaron los niveles de insulina en el páncreas y el suero en varios momentos tras la ingestión por sonda oral de NP cargadas de insulina. Mientras que los grupos tratados con PLGA mostraron aumentos modestos de insulina, la administración de insulina con PUDCA dio lugar a cantidades significativamente mayores de insulina tanto en el páncreas (figura 8A) como en la sangre (figura 8B). Esta administración eficiente de insulina permitió niveles estables de glucosa en sangre en el intervalo no diabético durante varias semanas, mientras que la insulina soluble y la insulina encapsulada en PLGA no mostraron ningún beneficio terapéutico (figura 8B). La remediación de la enfermedad fue corroborada por la estabilización del peso corporal de los ratones tratados con ins-PUDCA, en contraste con la disminución del peso corporal de otros grupos de tratamiento (figura 8D). La supervivencia de los ratones diabéticos confirmó aún más la utilidad de la administración oral de insulina mediante NP de PUDCA; solo las NP de PUDCA permitieron una supervivencia de hasta 90 días tras el inicio del tratamiento, más del doble del tiempo de supervivencia de otros grupos (figura 8E). Como era de esperar, el número de células T CD8+ activadas se redujo (Fig. 9A), y se suprimió el agotamiento de Tregs CD4+CD25+FoxP3+ (Fig. 9B) en los ganglios linfáticos pancreáticos cuando los ratones diabéticos recibieron Ins-PUDCA.
La mitigación de la progresión de la enfermedad de T1D (figura 8C) por medio del tratamiento con NP de PUDCA vacías (blanco) sugirió que estas partículas podrían conferir un efecto inmunosupresor sobre el microentorno pancreático, quizás sinérgico con la insulina encapsulada. Se investigaron las respuestas celulares de los linfocitos T CD4+ y de las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) al tratamientoin vitrocon NP de PUDCA. El pretratamiento de linfocitos T CD4+ con dosis altas (50 μg/ml) y bajas (5 μg/ml) de NP de PUDCA dio lugar a una menor producción global de IFN-y cuando las células fueron estimuladas de forma inespecífica mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (figura 9C). De forma similar, los linfocitos CD4+ OT-II específicos de antígeno produjeron menos IFN-y cuando las CD y los linfocitos T fueron cocultivados tras el pretratamiento de las CD con LPS y el antígeno ovoalbúmina (figura 9D). En ambos casos, la producción de IL-2 no varió independientemente del tratamiento con PUDCA (figuras 9E y 9F). Además, el monocultivo de BMDC en presencia de PUDCA tras la estimulación con LPS y ovoalbúmina no produjo cambios fenotípicos en la expresión de marcadores de la superficie de las CD (figuras 9G, 9H y 9I). Estos resultados demuestran que el PUDCA puede suprimir la actividad efectora CD4+ de los linfocitos T dejando intacta la activación de las CD.
En conjunto, estos resultados demuestran que las NP de PUDCA son una plataforma prometedora tanto para la prevención como para el tratamiento de la T1D. Los datos de las figuras 8A a 9I demuestran que la administración oral de nanopartículas de PUDCA cargadas de insulina revierte la diabetes de tipo 1 en ratones NOD.
Ejemplo 9. Las nanopartículas de PBA se dirigen al intestino inflamado en la enfermedad inflamatoria intestinal.
Materiales y procedimientos
Se indujo colitis en ratones Balb/c alimentándolos con agua medicada con dextrano sulfato de sodio (DSS) (10 mg/ml) durante 2 semanas. Los ratones con EII recibieron nanopartículas de PLGA cargadas con DiR después de 3 y 24 horas tras la administración oral (por sonda) de 250 ul de solución de 4 mg/ml suspendida en solución salina tamponada con pH 7,4 (50 mg/kg).
Resultados
Los ratones con colitis inducida por DSS actuaron como modelos de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En estos modelos, se produce una pérdida progresiva de peso corporal con el tiempo si la afección no se trata (figura 10A).
La inflamación intestinal de los ratones con EII pudo combatirse con las nanopartículas de PBA. Como se muestra en la figura 10B, la ingestión por sonda oral de 250 μl de nanopartículas de PUDCA o PLGA 4 mg/ml en ratones sanos o con EII demuestra que se retiene una cantidad significativamente mayor de nanopartículas de PUDCA que de nanopartículas de PLGA en los intestinos inflamados de ratones con EII a las 3 y 24 horas de la ingestión por sonda oral. Por lo tanto, las nanopartículas de PUDCA pueden dirigirse a los intestinos inflamados del modelo de ratón de EII con mayor eficacia, y se retienen allí durante más tiempo (compárese la intensidad de fluorescencia a las 24 horas) que las nanopartículas de PLGA. 2,26*10®, PUDCA: 6,20*10®, n=3, p<0,01)
Este trabajo representa una plataforma de NP modular y versátil para la administración oral eficaz de diversas moléculas, dado que las NP de poli(ácido biliar) (PBA) tienen la capacidad de encapsular fármacos hidrófobos o anfifílicos de molécula pequeña, además de proteínas como la insulina. Estas NP de inspiración biológica se acumularon en el páncreas inflamado mediante protección estomacal, aumento de la permeabilidad intestinal y transporte por macrófagos. Además, la eficacia terapéutica de las NP formadas con polímeros de PBA puede deberse a la sinergia entre esta protección GI y el traslado pancreático, así como al desencadenamiento de procesos de transducción de señales antiinflamatorios.
En conclusión, las NP de PBA de diseño lógico demostrado sobreviven al tracto gastrointestinal, se acumulan en el páncreas y previenen y tratan la T1D. Esta tecnología de plataforma puede aprovecharse para otras enfermedades pancreáticas de incidencia creciente y resultados desalentadores, tales como la pancreatitis y el cáncer de páncreas, que tiene una tasa de mortalidad altísima.

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una formulación oral de nanopartículas sensibles al pH que comprende (i) bien: a) un éster de poli(ácido biliar) ("poly(bile)acid", PBA) polimérico formado por la esterificación de monómeros de ácido biliar, en el que el éster polimérico de PBA tiene un peso molecular entre 800 Da y 250000 Da; o bien b) un éster de poli(ácido biliar) (PBA) polimérico formado por la esterificación de monómeros de ácido biliar, en el que el éster polimérico de p Ba tiene un peso molecular entre 500 Da y 50000 Da; y (ii) uno o más agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico encapsulados o atrapados dentro de las nanopartículas o unidos a las nanopartículas.
  2. 2. La formulación de la reivindicación 1, en la que, antes de la esterificación, al menos uno de los monómeros de ácido biliar tiene una estructura de fórmula I:
    en la que Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxilo, y X es un grupo hidroxilo a pH 2-5 que está desprotonado a pH superior a 5,5.
  3. 3. La formulación de la reivindicación 1 o 2, en la que al menos uno de los ésteres poliméricos de PBA es un homopolímero formado a partir de un único tipo de monómero de ácido biliar.
  4. 4. La formulación de la reivindicación 1 o 2, en la que al menos uno de los ésteres poliméricos de PBA es un copolímero formado a partir de una mezcla de polímeros de ácidos biliares.
  5. 5. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el éster polimérico de PBA es un éster polimérico de ácido ursodesoxicólico polimerizado (PUDCA).
  6. 6. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el éster polimérico de PBA es lineal o ramificado.
  7. 7. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende una cantidad eficaz de un agente para el alivio de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno en el páncreas, el hígado o el colon.
  8. 8. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que las nanopartículas de PBA comprenden restos de transporte dirigido a tipos celulares específicos.
  9. 9. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el agente se selecciona del grupo que consiste en proteínas y péptidos, azúcares y polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos, moléculas pequeñas con un peso molecular inferior a 2000 daltons, y combinaciones de los mismos.
  10. 10. La formulación de la reivindicación 9, en la que el agente se selecciona del grupo que consiste en antígenos, citocinas, hormonas, agentes antiinfecciosos, agentes antiproliferativos, agentes antiinflamatorios y agentes inmunomoduladores.
  11. 11. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para inducir tolerancia a un antígeno, en la que el agente es un alérgeno, una proteína propia o un antígeno autoinmunitario, las partículas comprenden además un agente tolerogénico seleccionado del grupo que consiste en TGF-beta, ácido retinoico, agonistas de TLR, rapamicina y análogos de los mismos, tales como everolimus, ridaforolimus, remsirolimus, umirolimus y zotarolimus, y tacrolimus.
  12. 12. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la inmunosupresión, en la que el agente es ciclosporina, metotrexato, un esteroide o azatioprina.
  13. 13. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la formulación comprende insulina.
  14. 14. La formulación de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de la diabetes de tipo 1 o de tipo 2.
  15. 15. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 comprende un agente antiproliferativo o quimioterapéutico para el tratamiento del cáncer.
  16. 16. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 comprende una cantidad eficaz de las partículas que comprenden un agente de diagnóstico para su uso en la obtención de imágenes no invasiva de la inflamación pancreática, hepática o de colon en un sujeto que lo necesite.
  17. 17. La formulación de la reivindicación 16 para la obtención de imágenes no invasiva de la inflamación pancreática, hepática o de colon en un individuo que lo necesite, que comprende un agente de diagnóstico, opcionalmente en la que las partículas comprenden uno o más agentes de obtención de imágenes seleccionados del grupo que consiste en óxido de hierro superparamagnético (SPIO), gadolinio, europio, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) y sus derivados, gases y radionúclidos emisores de positrones.
  18. 18. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende agentes antiespasmódicos, agentes antiinflamatorios o combinaciones de los mismos para su uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
  19. 19. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento de la pancreatitis, la colitis o un trastorno proliferativo de las mismas, en la que las partículas contienen uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios, antiproliferativos y antiinfecciosos.
  20. 20. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en una forma farmacéutica líquida o sólida.
  21. 21. Un procedimiento de fabricación de la formulación definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 que comprende mezclar un agente a encapsular o atrapar con un polímero de éster de sal de ácido biliar.
  22. 22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el monómero de éster de sal de ácido biliar está en una solución, o en el que el agente se añade al polímero de éster de sal de ácido biliar en polvo o en forma agregada.
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