JP2023532204A - 抗原特異的寛容を誘導する免疫調節剤を含むポリマー胆汁酸エステルナノ粒子 - Google Patents

Abstract

経口送達および対象における抗原特異的寛容の誘導のためのポリマー胆汁酸（ｐＢＡ）ナノ粒子およびポリマー胆汁酸ナノ粒子を含有する寛容原性製剤は、免疫抑制薬および／または疾患特異的抗原を含み得る。経口送達は、ナノ粒子の局所臓器蓄積および全身送達をもたらす。ナノ粒子による早期介入は、抗原特異的寛容を誘導し、自己免疫障害の発症を予防する。ナノ粒子による処置は、自己免疫疾患において、処置の停止後であっても、長期の抗原特異的免疫寛容をもたらす。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、イェール大学によって２０２０年６月１９日に米国特許商標庁に出願された米国特許出願第１６／９０７，０５５号（発明者Ｊｕｎｇ Ｓｅｏｋ Ｌｅｅ、Ｔａｒｅｋ Ｍ．Ｆａｈｍｙ、およびＤｏｎｇｉｎ Ｋｉｍ）の優先権を主張する。

（連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明）
本発明は、国立科学財団によって授与された０７４７５７７の下、ならびに国立衛生研究所によって授与されたＡＩ０５６３６３、ＣＡ１９９００４、およびＣＡ０２６４１２の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、一般に、抗原特異的免疫寛容を誘導するために使用することができる、免疫調節剤および／または抗原を含有するポリマー胆汁酸エステルナノ組成物に関する。

発明の背景
抗原およびアジュバントによる樹状細胞（ＤＣ）の直接プライミングは、免疫をプライミングするための強力なワクチン接種アプローチとして十分に確立されている。したがって、生分解性ナノ粒子は、感染およびがんにおける適用が実証されている有望なワクチンビヒクルである。免疫療法に魅力的なナノ粒子の１つの注目すべき特性は、抗原提示細胞によって取り込まれる傾向、および免疫原性アジュバントと共にタンパク質抗原を送達するための専門的な抗原提示細胞ＤＣの優先的標的化の可能性である。

しかしながら、ナノ粒子媒介性寛容の誘導は、ナノ粒子媒介性炎症応答のためにあまりよく理解されていない。以前の研究は、アレルギーにおける免疫寛容のための抗原および免疫抑制剤のナノ粒子媒介送達の有望性を示しているが、これらの系が細胞および組織レベルでどのように機能するかについて、したがって、それらを新しい自己免疫処置選択肢の開発に向けてどのように適切に調整することができるかということの基礎となる機構についてはほとんど知られていない。

別の課題は、注射の代わりに経口送達によって免疫寛容の抗原特異的誘導を達成することである。経口投与後の内臓への活性剤および／またはイメージング剤の送達は、胃に固有の厳しい生化学的環境、具体的には高酸性ｐＨおよびタンパク質分解酵素の存在が多くの治療剤を分解および不活性化するので、依然として課題が残る。経口薬物送達ビヒクルを形成するための材料は、活性薬剤を胃の過酷な条件から保護し、特定の所望の薬剤放出モードのために慎重に選択される。典型的には、その材料は、治療剤の効果に加えて標的臓器または細胞に治療効果を発揮するように選択されない。

抗原特異的寛容を誘導するために、送達ビヒクルを治療薬として利用し、かつ経口送達される薬剤のバイオアベイラビリティおよび／または有効性を増加させる改善された経口送達系が依然として必要とされている。

したがって、本発明の目的は、抗原特異的免疫寛容を誘導するための非常に効率的な経口送達系を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、非常に効率的な経口送達系を作製する方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、非常に効率的な経口送達系を使用する方法を提供することである。

発明の概要
対象において抗原特異的寛容を誘導するためのポリマー胆汁酸エステル（ｐＢＡ）ナノ粒子およびポリマー胆汁酸エステルナノ粒子を含有する寛容原性製剤は、典型的には、約８００～１，０００（２モノマー）～２４０，０００ダルトン（Ｄａ）（好ましくは約４００モノマー）の分子量を有する胆汁酸エステル化ポリマー（ｐＢＡ）から形成される。胆汁酸エステルポリマーは、典型的には、１またはそれを超えるポリマーウルソデオキシコール酸（ｐＵＤＣＡ）、ポリマーリトコール酸（ｐＬＣＡ）、ポリマーデオキシコール酸（ｐＤＣＡ）、ポリマーケノデオキシコール酸（ｐＣＤＣＡ）、およびポリマーコール酸（ｐＣＡ）から形成される。胆汁酸エステルポリマーは、直鎖および／または分岐ポリマーであってもよい。ｐＵＤＣＡへの言及は、一般に、他の胆汁酸エステルポリマーに当てはまる。ｐＢＡから形成されたナノ粒子は、６０ｎｍ～６００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ～４００ｎｍの直径を有し得、典型的な幾何平均径(average geometric diameter)は３５０ｎｍである。ポリマーナノ粒子は、ブレンドまたはコポリマーとして他の生体適合性ポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約８００～５，０００Ｄａの分子量を有し、１ポリマー当たり約２～２０個のＵＤＣＡモノマー単位を有するｐＵＤＣＡから形成される。

典型的には、胆汁酸エステルポリマーは、１００～５０００個の胆汁酸モノマー単位を含有するナノ粒子上の表面を形成する。ナノ粒子は、典型的には、胆汁酸エステルポリマーを形成するそれぞれのモノマーよりも胆汁酸受容体に対して少なくとも１．５倍大きい親和性かつ最大で約５０倍大きい親和性を有する。胆汁酸受容体には、Ｇタンパク質共役胆汁酸受容体１（ＧＰＢＡＲ１またはＴａｋｅｄａ Ｇタンパク質受容体５（ＴＧＲ５））およびファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）が含まれる。これらの受容体は、宿主免疫系と腸内微生物叢との界面に配置され、腸および肝臓マクロファージなどの自然免疫の細胞に高度に提示され、樹状細胞およびナチュラルキラーＴ細胞は、一般にマクロファージなどの自然免疫細胞の表面にある。

典型的には、ナノ粒子および／または製剤は、ラパマイシン（シロリムス）などの１またはそれを超える免疫抑制薬、ならびにエベロリムス、リダフォロリムス、レムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスなどのラパマイシンの類似体を含有する。免疫賦活剤は、ナノ粒子に封入され、カプセル化され、かつ／または会合され得る。ナノ粒子および／または製剤はまた、典型的には、疾患または障害特異的抗原を含有する。疾患特異的抗原は、ナノ粒子に封入され、カプセル化され、かつ／または会合され得る。

自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を有する対象においてナノ粒子を用いて抗原特異的寛容を誘導する方法は、典型的には、有効量のナノ粒子を対象に経口投与することを含む。典型的には、ナノ粒子は、経口投与後に、心臓、腎臓、脾臓、肺、肝臓、結腸および膵臓などの内臓に分布する。この分布は、典型的には、マクロファージ貪食（ＴＧＲ－５への結合、エンドサイトーシス、エキソサイトーシスによる）および腸肝循環（胆嚢蓄積および膵管進入）によって支援される粒子の腸輸送および腸上皮を通じた透過によって媒介される。この分布は、典型的には、組織または臓器特異的標的化剤の非存在下で達成される。

代表的な自己免疫疾患およびアレルギー性疾患としては、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、食物アレルギー、環境アレルギー、および抗薬物抗体（ＡＤＡ）を有する疾患が挙げられる。１型糖尿病を処置する方法が例示され、それを必要とする対象に、抗炎症剤および／またはラパマイシンなどの免疫抑制剤を含有する有効量のｐＢＡナノ粒子を含有する製剤を経口投与することを含む。

この方法は、典型的には、少なくとも１週間、少なくとも２週間、または少なくとも３週間の期間にわたって製剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、週に３回、週に２回、または１日に１回投与され得る。処置後、糖尿病動物モデルは、製剤の投与停止後、少なくとも約３日間、約５日間、約１週間、約２週間、約１ヶ月間またはそれを超えて健康な血糖を維持し得、対照と比較して制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数の増加を示し得る。対象は、寛容原性表現型を発生し得る。

ナノ粒子は、膵臓、肝臓および結腸に選択的に蓄積し、０．１ｎｇ～２００μｇ薬剤／ＮＰの薬剤を標的組織に送達し、したがって、総投与量はＮＰの投与された容積に依存する。ナノ粒子は、経時的に、持続放出によって、かつ／または単一バーストで薬剤を放出することができる。例えば、ナノ粒子にカプセル化された１またはそれを超える薬剤は、１時間～数週間の期間にわたって放出され得るか、または標的の臓器に到達してから最初の２４時間以内に放出され得る。炎症性疾患および／または自己免疫疾患を処置するための典型的な用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約４００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇである。

胆汁酸エステルポリマーの自己集合および凝集を使用してＮＰを作製する方法が開発されている。胆汁酸アセンブリを作製するための２つの方法には、（直鎖とは対照的に）分枝ポリマー胆汁酸単位の作製、およびそのような分枝構成要素と共に形成される空洞におけるゲスト／ホスト相互作用によるカプセル化と、フッ素化胆汁酸単位を介した超分子自己集合とが含まれる。フッ素化は、「疎フルオロ効果（fluorophobic effect）」をもたらす。これは、疎水性相互作用または親水性相互作用とは明らかに異なり、特別な製剤を必要とすることなく複雑なより大きな構造への自己集合をもたらす。

ＮＰは、（例えば、自己免疫疾患の処置に関する）炎症に対する治療効果および／もしくは予防効果、ならびに／または（例えば、血糖値および体重の制御に関する）代謝調節を示し得る。これは、ＴＧＲ５胆汁酸受容体に結合するｐＢＡ、より好ましくはｐＵＤＣＡに起因すると考えられる。胆汁酸受容体に対するＮＰの結合アビディティおよび親和性は、それぞれの胆汁酸モノマーの結合アビディティおよび親和性と比較して増強される。増強されたアビディティおよび親和性は、胆汁酸の重合および１００～５０００個の胆汁酸モノマー単位を露出させるＮＰの表面特性に起因する。これにより、ＮＰを胆汁酸モノマーの使用と比較して効力および有効性が増加した治療薬として使用することが可能になる。

抗炎症剤または免疫抑制剤などの治療剤の包含は、典型的には、ｐＢＡ、好ましくはｐＵＤＣＡの効果がカプセル化された薬物の効果によって増加するので、相加的な治療効果を超える効果が得られる。この相加的効果を超える効果は、１型糖尿病の予防および処置に関する実施例の結果に示されている。

胆汁酸受容体に結合するＰＢＡは、内因性インスリン分泌、エネルギー代謝、内因性インスリン受容体発現、ならびに活性酸素種の減少および炎症促進性シグナル伝達の減少などのその他多くの機能を促進する細胞内経路を活性化する。粒子がインスリンをカプセル化する実施形態では、細胞に対するこの抗炎症効果は、インスリンが粒子から放出され、その受容体に結合してグルコースを調節する前に起こる。

したがって、胆汁酸粒子は生理学的プロセスを自然に模倣し、この生体模倣のために、カプセル化インスリンによる相加的効果を超える効果を達成することができる。ｐＢＡ ＮＰは、最初に胆汁酸受容体に係合し、細胞内シグナル伝達を開始し、次いでカプセル化された薬剤を放出するので、ｐＢＡ ＮＰは、典型的には、カプセル化された薬剤の効果を増加させ、増強する。

したがって、胆汁酸の重合により、胆汁酸受容体に対するそれらの結合アビディティおよび親和性が有意に増加し、胆汁酸の治療効果が改善する。ｐＢＡ ＮＰは単独で治療的な抗炎症効果および免疫抑制効果を示す。治療剤のカプセル化により、薬剤の治療効果は、この効果がｐＢＡの作用によって増大するため、増強される。実施例に示されるように、ＮＰは、短期的にはＴ１Ｄに対処し、長期的には病理を逆転させ、内因性インスリン分泌および制御性免疫を回復させるように機能する広域スペクトル特性を有する治療薬である。

図１Ａ～図１Ｅは、エマルジョン条件下でＮＰに製剤化された胆汁酸モノマーおよびポリマーＢＡ（ｐＢＡ）の概略図である。 図１Ａ～図１Ｅは、コール酸（ＣＡ）（図１Ａ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）（図１Ｂ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）（図１Ｃ）、リトコール酸（ＬＣＡ）（図１Ｄ）、およびウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）（図１Ｅ）の構造である。 同上。 図２Ａ～図２Ｅは、ナノ粒子の重合および形成を示す。モノマーは、モノマーＢＡ上の炭素－２４位でエステル化され（図２Ａ）、加水分解性エステル結合ＢＡ（ｐＢＡ）をもたらす（図２Ｂ）。この重合工程の概略図は、ポリマー形成反応性末端基の位置を示す。薬物の存在下でのｐＢＡの乳化（図２Ｃ）により、３４４．３±４．７ｎｍの平均直径を有する固体ｐＢＡ ＮＰ（図２Ｄ）に捕捉された薬物が得られる（図２Ｅ）。 同上。 図３Ａ～図３Ｅは、インビトロおよびインビボでのポリマー胆汁酸（ｐＢＡ）の分布および取り込みを示すグラフである。 図３Ａは、非胃腸臓器、心臓、腎臓、脾臓、肺、肝臓および膵臓の生体内分布におけるｐＵＤＣＡおよび対照ＰＬＧＡ ＮＰについての総ＮＰを初期用量％／ｃｎとして示すグラフである。 図３Ｂは、膵臓におけるＮＰの色素非依存性局在化のグラフである。クマリン６をトレーサーとして使用してＮＰの膵臓蓄積を定量化し、ＮＰの膵臓蓄積のレベルが、負荷された薬剤の物理化学的特性とは無関係であるが、粒子組成に依存することを確認した。遊離クマリンは食塩水中１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に分散させた。 図３Ｃは、経口摂取の４時間後に、マウスの膵臓、肝臓、肺および脾臓におけるクマリン６負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰに会合したＣＤ１１ｃ－Ｆ４／８０＋マクロファージをフローサイトメーターを使用して取得したグラフである。 図３Ｄは、ｐＵＤＣＡ、ＵＤＣＡおよびＰＬＧＡの濃度（マイクログラム／ｍｌ）関数としての、４℃におけるマクロファージ上のＴＧＲ５に対するｐＵＤＣＡおよびＵＤＣＡの競合的結合のグラフである。 図３Ｅは、ｐＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ／ｐＵＤＣＡおよびＰＬＧＡについての３７℃でのエンドサイトーシスおよび４℃でのエキソサイトーシスの速度を示す、経時的（時間）な細胞中の粒子数（×１０^５）のグラフである（＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 図３Ｆは、膵臓β細胞由来のｐＵＤＣＡ及びＵＤＣＡによって誘導されたインスリン産生（ｎｇ／ｍｌ）を示すグラフである。 図３Ｇは、ｐＵＤＣＡ（５０および５マイクログラム／ｍｌ）で直接処理し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。 図４Ａ～図４Ｉは、Ｔ１Ｄの比較上の予防を示すグラフである。 図４Ａは、実験スキームを示す。０日目にシクロホスファミド（ＣＹ）のＩＰ注射により膵臓炎症を誘発した。 図４Ｂは、経口胃管栄養後の空のｐＵＤＣＡ（ｐＵＤＣＡ_空）、モノマーＵＤＣＡ（ＵＤＣＡ_空）、ｐＬＣＡ（ｐＬＣＡ_空）およびｐＤＣＡ（ｐＤＣＡ_空）によるＣＹ処置後の日数の関数としての血糖（ｍｇ／ｄｌ）として、Ｔ１Ｄの予防における製剤の比較評価を示すグラフである。 図４Ｃは、ＣＹ処置後の糖尿病動物（グルコース＞２００ｍｇ／ｄＬ）の割合のグラフである。 図４Ｄは、血糖値に対するｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡの効果のグラフである。 図４Ｅは、糖尿病になった動物の割合のグラフである。１日目の単回用量を用量Ｉと示し、連続する２日間の２回用量を用量ＩＩと示す。 図４Ｆは、食塩水ならびにｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡの用量Ｉおよび用量ＩＩについての、５日間にわたるＣＤ８＋Ｔ細胞頻度の用量後減少のグラフである。 図４Ｇは、食塩水、用量Ｉおよび用量ＩＩでの５日目の正規化されたＣＤ８Ｔ細胞％比較のグラフである。 図４Ｈは、５日間にわたるＴｒｅｇ％（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）頻度の用量後増大のグラフである。 図４Ｉは、炎症の徴候後５日目の正規化比較のグラフである。全ての実験は、１群当たり１０個の試料／動物を用いて実施し、２回繰り返した。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 同上。 同上。 同上。 図５Ａおよび図５Ｂは、ラパマイシン負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰ（ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡ）によるＴ１Ｄの予防における用量依存的治療有効性を示すグラフである。Ｒａｐａ負荷ｐＵＤＣＡの予防効果を、ＣＹ誘導Ｔ１Ｄ動物モデルにおいて用量の関数として試験した。用量は、５０，１００および５００ｍｇ／ｋｇ ｐＵＤＣＡとした。ｐＵＤＣＡは、ＣＹ誘導（０日目、ＣＹ矢印）の１日後に、２日間にわたって経口投与した（ＮＰ矢印）。この結果は、血糖値低下の程度（図５Ａ）および３０日後に非糖尿病であった動物の割合（図５Ｂ）によって評価した場合に用量依存的な予防効果（すなわち、疾患発症の予防）を示す。糖尿病発症の指標は、２００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値とした。 図６Ａ～図６Ｏは、ｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ ＮＰ経口摂取後のＴ１Ｄの短期処置および長期退行、ＴＧＲ５誘導性内因性ＧＬＰ－１およびインスリン分泌の活性化、ならびにｐＵＤＣＡの抗炎症効果を示すグラフである。 図６Ａは、ＵＤＣＡ－インスリン（５００ｍｇ／ｋｇ）、ｐＵＤＣＡ－インスリン（１００ｍｇ／ｋｇ）、ｐＵＤＣＡ－空（５００ｍｇ／ｋｇ）、およびｐＵＤＣＡ－インスリン（５００ｍｇ／ｋｇ）で処置した後の経時的（日）な短期血糖（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。 図６Ｂは、ＵＤＣＡと比較したｐＵＤＣＡの経時的（日）な短期血糖（ｍｇ／ｄｌ）のグラフである（ｎ＝１０）。経口処置は、グルコース≒２００ｍｇ／ｄＬ後に開始し、１００または５００ｍｇ／ｋｇのいずれかの１用量／日で、７回の用量であった。 図６Ｃは、経時的（日）な長期血糖（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。インスリン負荷ＮＰによる経口処置後の自然発症Ｔ１Ｄ疾患の長期逆転（ｎ＝６）。 図６Ｄは、食塩水、可溶性インスリン、ＰＬＧＡインスリン、およびｐＵＤＣＡインスリンに対する経時的（日）な体重（グラム）のグラフである。 図６Ｅは、ログランク検定およびＸ^２統計分析（最大９０日間）によるｐＵＤＣＡ処置後の生存プロファイルを示す、糖尿病マウスの経時的な生存パーセントのグラフである。 図６Ｆは、食塩水、可溶性経口、可溶性インスリン（皮下）、可溶性インスリン（腹腔内）、およびｐＵＤＣＡインスリン（経口）についての時間（日）に対するＴ１Ｄにおける血糖（ｍｇ／ｄｌ）のグラフである。 図６Ｇは、経時的（日）なブタの血糖（ｍｇ／ｄｌ）のグラフである。Ｔ１Ｄをアロキサンによる処置によってオサボーブタに誘導し、次いでこの動物をｐＵＤＣＡ_ＩＮＳで７回経口処置した。血糖値を３匹のブタから５分毎に測定し、平均して食塩水を投与した対照ブタと比較した。矢印は経口投与および食餌再開を示す。 図６Ｈおよび図６Ｉは、食塩水、遊離インスリン、ＰＬＧＡ－インスリン、ｐＵＤＣＡ－インスリンについての、経口摂取後４、８および２４時間における血清インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）（図６Ｈ）および膵臓インスリン（図６Ｉ）のグラフである。 図６Ｊおよび図６Ｋは、ｐＵＤＣＡによるＴＧＲ５活性化の結果としてのＧＬＰ－１分泌（ｐｍｏｌ／Ｌ）（図６Ｊ）およびインスリン産生（図６Ｋ）のグラフである。 図６Ｌおよび図６Ｍは、食塩水およびｐＵＤＣＡ－インスリンの投与後のＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞％（図６Ｌ）およびＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ％（図６Ｍ）のグラフである。膵臓リンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度および図６Ｍ、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ｎ＝１０）。 図６Ｎは、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ１０）およびケモカイン（ＣＣＬ１）の産生を示す、ｐＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ、ＰＬＧＡについてのＩＬ－１０レベル（ｐｇ／ｍｌ）およびＣＣＬ１（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。 図６Ｏは、ｐＵＤＣＡによって誘導されたＭ１（ＣＤ８６）からＭ２（ＣＤ２０６）へ傾斜したマクロファージ表現型を示す、ｐＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ、食塩水についてのＭ１／Ｍ２比のグラフである。全ての実験は、１群当たり６より多い試料／動物を用いて行い、ブタの実験を除いて２回繰り返した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図７Ａおよび図７Ｂは、２群のマウスの実験スキームであり、グループＡを使用してＯＴｉｉ養子移入による有効性を検出し（図７Ａ）、グループＢを使用してＯＴｉｉマウスにおける有効性を評価した（細胞移入なし、図７Ｂ）。図７Ｃは、ビヒクル、ｐＵＤＣＡ－ＯＶＡ ＮＰ（ＯＶＡ ＮＰ）またはｐＵＤＣＡ－ＯＶＡ－ＲＡＰＡ ＮＰ（ＯＲ ＮＰ）で処置した動物から得たＯＴｉｉ細胞のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋の割合を示すグラフである。 同上。 図８Ａは、１型糖尿病のマウスモデルにおける治療的抗原特異的寛容誘導の実験スキームである。 図８Ｂおよび図８Ｃは、７つの毎日経口用量の食塩水、空のｐＵＤＣＡ ＮＰ、高用量（１０ｍｇ／用量、図８Ｂ）または低用量（２ｍｇ／用量、図８Ｃ）でのｐＵＤＣＡ－ＢＤＣまたはｐＵＤＣＡ－ＢＤＣ－ＲＡＰＡを投与したマウスの血糖（ｍｇ／ｄＬ）の変化を示す。 図８Ｄおよび図８Ｅは、糖尿病の未処置マウスまたはＢＤＣ／ｐＵＤＣＡ－ＲＡＰＡで処置したマウスにおけるＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞パーセント（図８Ｄ）またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇパーセント（図８Ｅ）の変化を示すグラフである。 同上。 同上。 図９Ａおよび図９Ｂは、幼若ブタおよび成体ブタへのアロキサン投与から１ヶ月後（図９Ａ）および６ヶ月後（図９Ｂ）における絶食時血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。 図１０Ａは、ｐＵＤＣＡおよび０．０１％インスリン、６．４ｍｇ／ｋｇ用量（各１日用量は０．０１％インスリンを含有する６．４ｍｇ／ｋｇ粒子を送達した）を７日間にわたって累積的に毎日投与した後のアロキサン誘発糖尿病ブタにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）の変化を示すグラフである。 図１０Ｂは、単回用量の水の胃管栄養、ｐＵＤＣＡ－インスリン、または皮下インスリン７０／３０の後のアロキサン誘発糖尿病ブタにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）の変化を示すグラフである。ｐＵＤＣＡ－インスリン粒子は、平均血糖値６５ｍｇ／ｄＬで、より広いトラフおよび低下した食後効果をもたらした。 図１０Ｃは、皮下インスリンを４日間毎日反復投与し、続いてｐＵＤＣＡを単回投与した後のアロキサン誘発糖尿病ブタにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）の変化を示すグラフである（上の矢印）。下の矢印は、いかなる外部インスリンも存在しない場合の可能な食後効果を示す。単一のｐＵＤＣＡ投与により、次の３日間のインスリンが不要になった。 図１０Ｄは、ｐＵＤＣＡ処置の２週間後または１ヶ月後の成体アロキサン誘発糖尿病ブタのベースライン絶食時グルコース（ｍｇ／ｄＬ）の経時的（日）な変化を示す棒グラフである。インスリン負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰは、成体オサボーブタにおけるアロキサン誘発糖尿病を迅速に逆転させた。 図１０Ｅは、糖尿病治療におけるｐＵＤＣＡ ＮＰの効果を示す図である。ＮＰは、以下の３つの点、すなわち、後期Ｔ１ＤおよびＴ２Ｄを処置するための良好なバイオアベイラビリティを有する経口送達、早期Ｔ１Ｄを処置するための代謝回復、ならびに早期Ｔ１Ｄのための自己免疫反応性の低下、から糖尿病のケアおよび処置を提供する。 同上。 同上。 図１１Ａは、多発性硬化症のマウスモデルにおける治療的抗原特異的寛容誘導の実験スキームである。 図１１Ｂは、未処置で放置されたマウス、または可溶性ＭＯＧ、ｐＵＤＣＡ－ＭＯＧ、可溶性ＭＯＧ／ＲａｐａもしくはｐＵＤＣＡ－ＭＯＧ／Ｒａｐａで処置したマウスにおける経時的（日）な臨床スコアの変化を示すグラフである。 図１２Ａは、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）のマウスモデルにおける治療的抗原特異的寛容誘導の実験スキームである。 図１２Ｂは、ＣＩＡ：未処置（ビヒクル）、または可溶性ＭＯＧ、空のｐＵＤＣＡ、ｐＵＤＣＡ－Ｒａｐａ、ｐＵＤＣＡ－コラーゲン、もしくはｐＵＤＣＡ－コラーゲン－Ｒａｐａで処置したマウスにおける経時的（日）な臨床スコアの変化を示すグラフである。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、一般に、約１０ｎｍから最大約１０００ｎｍ（しかしこの値は含まない）、好ましくは約６０ｎｍから約４５０ｎｍの直径を有する粒子を指す。粒子は、任意の形状を有することができる。典型的には、ナノ粒子は球形であり、そのサイズは幾何平均としてｎｍ単位で測定される直径で示される。

本明細書で使用される場合、「カプセル化された」という用語は、ナノ粒子のポリマーマトリックス内にカプセル化された、それに囲まれた、かつ／またはその全体に分散された薬剤、例えば、治療薬および／またはイメージング剤を指す。代替的または追加的に、その薬剤は、疎水性相互作用、電荷相互作用、ファンデルワールス力などによってポリマーマトリックスと会合することができる。

本明細書で使用される場合、「非標的化」という用語は、特定の細胞型または臓器に対して増加した親和性を有する標的化部分などの追加の要素を含まない、ｐＵＤＣＡまたはＰＬＧＡなどのポリマーから形成されたナノ粒子を指す。本明細書で使用される場合、「標的化部分」という用語は、抗体、リガンド、受容体結合部分、もしくはその活性断片、またはアゴニスト、アンタゴニスト、または組織特異的もしくは細胞特異的標的化分子などの任意の分子を指し、標的臓器内の細胞にナノ粒子を付着させるために使用される。

本明細書で使用される場合、「活性剤」または「生物学的に活性な薬剤」という用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘導する化学的または生物学的化合物を指すために互換的に使用され、その効果は予防的、治療的および／または診断的であり得る。この用語はまた、限定するものではないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物および類似体などの活性薬剤の薬学的に許容され得る薬理学的に活性な誘導体を包含する。

本明細書で使用される場合、「賦形剤」または「薬学的に許容され得る賦形剤」という用語は、組成物の投与をさらに容易にするためにその組成物に添加される薬理学的に不活性な物質を指す。

本明細書で使用される場合、「経口投与」は、組成物を経口経路を介して対象へ送達することを指す。経口投与は、経口胃管栄養によって、または液体もしくは固体形態の組成物を嚥下することによって達成することができる。経口投与される組成物の液体形態は、溶液、エマルジョン、懸濁物、液体カプセルまたはゲルの形態であり得る。経口投与される組成物の固体形態としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に投与された場合に、その疾患、障害、および／または状態を処置し、緩和し、改善し、症状を軽減し、予防し、発症を遅延させ、進行を阻害し、重症度を軽減し、かつ／または発生率を低減させるのに十分な治療薬、予防薬、および／または診断薬の量を意味する。

本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１またはそれを超える状態または特徴を、部分的または完全に緩和し、改善し、軽減し、その発症を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその発生率を低減することを指す。例えば、微生物感染症を「処置する」とは、微生物の生存、増殖、および／または蔓延を阻害することを指し得る。処置は、疾患、障害および／または状態に関連する病態を発症するリスクを低下させる目的で、その疾患、障害および／または状態の徴候を示さない対象および／またはその疾患、障害および／または状態の初期徴候のみを示す対象に施され得る。

本明細書で使用される場合、「予防」または「予防する」という用語は、ある疾患または障害によって引き起こされる１またはそれを超える症状のリスクがあるか、またはその素因を有する対象もしくは系に対して、その疾患または障害の特定の症状の停止、その疾患または障害の１またはそれを超える症状の軽減または予防、その疾患または障害の重症度の低下、その疾患または障害の完全な消失、その疾患または障害の発症または進行の安定化または遅延をもたらすために組成物を投与することを意味する。

本明細書で使用される場合、「寛容」は、所与の抗原に対する適応（ＴまたはＢ媒介）反応を開始する免疫系の能力の低下を意味する。

本明細書で使用される場合、「寛容原性」は、寛容を刺激または増大させる条件または能力を意味する。

本明細書で使用される場合、「Ｔｒｅｇ」は、抑制を付与する任意のＴ細胞を含む。したがって、この用語は、従来のＣＤ４、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ、ならびにＦｏｘｐ３を発現しないが、他のシグナルの中でもＩＬ－１０（Ｔｒ１細胞）を分泌することによって制御性であり得る他のＣＤ４細胞、および同様に同定されているＣＤ８ Ｔｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３＋および－）を包含する。

ＩＩ．組成物
本組成物は、ポリ（胆汁酸）エステルポリマーから形成されたナノ粒子を含む。これらの粒子は、その中またはその上に組み込まれた、治療薬、予防薬および／または診断薬、また必要に応じて薬学的に許容され得る賦形剤の不在下で投与される。

胆汁酸は、薬物の経口取り込みを増強するために数十年にわたって使用されてきた。例えば、Ｓａｍｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９（２００８）７０３－７０８を参照されたい。胆汁酸塩を使用して、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子をそれらが消化管を通って輸送される間保護し、腸上皮によるそれらの吸収を増大させることによって、ＰＬＧＡナノ粒子のバイオアベイラビリティを改善した。デオキシコール酸エマルジョンは、酸性条件での分解からＰＬＧＡナノ粒子を保護し、ヒト上皮のモデルを通るそれらの透過性を高めることが示された。デオキシコール酸エマルジョンを使用して負荷されたＰＬＧＡナノ粒子のマウスへの経口投与は、２４～４８時間にわたる血中のカプセル材料（encapsulant）の持続的なレベルをもたらし、相対バイオアベイラビリティは１．８１であった。カプセル材料の濃度は肝臓で最も高く、経口経路による肝臓への標的化送達を示した。

現在、複数の研究により、ｐＵＤＣＡなどの胆汁酸エステルポリマーの使用が経口による取り込みを有意に増強するだけでなく、空の粒子が抗炎症特性を有することが実証されている。これは、ポリマー、例えば、ｐＵＤＣＡがＴＧＲ５受容体へ結合することによって生じると考えられる。重合と球状形態による表面アビディティの増強により、空の（すなわち、追加された治療薬または予防薬を含まない）ｐＵＤＣＡ ＮＰは、例えば、糖尿病の処置にあたって、炎症を軽減するのに有効である。複数の研究は、回腸におけるＴＧＲ５結合によるＧＬＰ－１のアップレギュレーションを示す。ＵＤＣＡの抗炎症性も同様に強まる。

これらの知見に基づいて、ｐＵＤＣＡ ＮＰは、糖尿病、膵炎、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ＩＢＤおよびｒＣＤＩ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）などの、膵臓、肝臓および結腸の自己免疫性および炎症性の疾患および状態の処置に有用であることが予想され、また示されている。一般に、ｐＵＤＣＡ ＮＰは、そのエステル結合が劣化するにつれてｐＵＤＣＡからのＵＤＣＡの持続放出をもたらす。

Ａ．ポリマー
一般に、ポリ（胆汁酸）ポリマーを形成するのに適した胆汁酸のモノマーは、式Ｉ：

によって定義され、式中、
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、独立して、水素またはヒドロキシル基であり、
Ｘは、低ｐＨ（２～５）でヒドロキシル基であり、５．５を超えるｐＨでは脱プロトン化される。必要に応じて、Ｘは、対応する胆汁酸のグリシンまたはタウリンコンジュゲート（胆汁酸塩としても知られる）を表す、ＮＨＣＨ_２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ_２ＣＯＯ^－、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ＨまたはＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ^－である。

位置Ｘの完全にプロトン化されたヒドロキシル基はモノマーを水に不溶性にし、プロトンの損失はモノマーの水溶解度を改善する。

胆汁酸モノマーのコール酸（ＣＡ）の構造を式ＩＩに示す。

胆汁酸モノマーのリトコール酸（ＬＣＡ）の構造を式ＩＩＩに示す。

胆汁酸モノマーのデオキシコール酸（ＤＣＡ）の構造を式ＩＶに示す。

胆汁酸モノマーのケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）の構造を式Ｖに示す。

胆汁酸モノマーのウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の構造を式ＶＩに示す。

他の好適な胆汁酸としては、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、タウロリトコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、グリコリトコール酸、グリコケノデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、ならびに、３－アルファ－７－アルファ－１２－アルファ－２２－キシ－テトラヒドロキシ－５－ベータ－コレスタン－２６－オイック酸（テトラヒドロキシステロ－コール酸）および３－アルファ－１２アルファ－２２－キシ－トリヒドロキシ－５－ベータ－コレスタン－２６－オイック酸のタウリンコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。

他の好適な胆汁酸としてはまた、ムリコール酸（α－ムリコール酸、β－ムリコール酸、γ－ムリコール酸、およびω－ムリコール酸など）、ヒオデオキシコール酸、ウルソコール酸、イソコール酸、イソデオキシコール酸、イソリトコール酸、イソケノデオキシコール酸、イソウルソデオキシコール酸、ノルコール酸、ノルデオキシコール酸、ノルリトコール酸、ノルケノデオキシコール酸、ノルウルソデオキシコール酸、アポコール酸、アロコール酸、およびそれらのタウリンコンジュゲートまたはグリシンコンジュゲートが挙げられる。

追加の好適な胆汁酸は、Ｈｅｉｎｋｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ２０１９，７：７５、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，２８５（１９）：１４４８６－９４、Ｃｈｉａｎｇ，Ｃｏｍｐｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１３，３（３）：１１９１－１２１２、Ｓａｒｅｎａｃ ａｎｄ Ｍｉｋｏｖ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１８，９：９３９、ｄｅ Ｈａａｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ，２０１８，４（１）：１－４６、ＬＩＰＩＤ ＭＡＰＳ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｍａｐｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ＬＭＳＤＳｅａｒｃｈ．ｐｈｐ？Ｍｏｄｅ＝ＰｒｏｃｅｓｓＣｌａｓｓＳｅａｒｃｈ＆ＬＭＩＤ＝ＬＭＳＴ０４）に記載されている。

上に列挙したモノマーをエステル化して、約８００ダルトン（少なくとも２つのモノマー）～２５０，０００ダルトン、より好ましくは８００ダルトン～５０，０００ダルトンの分子量を有するポリ（胆汁酸）（ＰＢＡ）ポリマーを生成する。いくつかの実施形態では、ｐＵＤＣＡポリマーは、約１０００～約１０，０００ダルトン、または約１２００～約５，０００ダルトンのＭｗ値を有する。胆汁酸の室温重合は、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）と、ジメチルアミノピリジンおよびｐ－トルエンスルホン酸（ＤＭＡＰ／ＰＴＳＡ）の１：１塩の混合物を用いて、穏やかな反応条件で、ほとんど架橋を伴うことなく行うことができる。カルボジイミド（Ｃａｒｂｏｉｉｍｉｄｅ）活性化により、３位の炭素における優先的なエステル化が起こり、直鎖ポリマー鎖をもたらす。ＵＤＣＡに適用すると、重合したＵＤＣＡは式ＶＩＩ：

によって定義することができ、
式中、ｎは、２～６００、好ましくは２～１００の範囲の数であり、８００～２４０，０００ダルトンの範囲のポリマーＭｗ平均に対応する。

分岐の程度は、世代０（分岐なし）から制限の無いより高い世代数まで変動し得る。分岐を有する例示的な重合したＵＤＣＡを式ＶＩＩＩに示す。

ポリマーは、ポリ（ＵＤＣＡ）またはＰＵＤＣＡを形成するＵＤＣＡなどの同じモノマーから形成され得る。他の実施形態では、ポリマーは、胆汁酸モノマーの混合物から形成され、ポリマー胆汁酸コアをコーティングするコポリマーまたはモノマーを形成し得る。これらの実施形態では、モノマーまたはポリマーを任意の組み合わせかつ任意の比で混合して、８００～２５０，０００ダルトンの分子量の範囲の胆汁酸エステルポリマーのポリマーブレンドを形成してもよい。典型的には、ポリマーは直鎖状であるが、分岐状、フォーク状、またはデンドリマーなどの他の構造を使用することができる。ポリ（胆汁酸）のデンドリマー（例えば、樹状ＰＵＤＣＡ）は、直鎖状の対応物と同様のｐＨ刺激応答を有する。この樹状系は、生理学的ｐＨまたは６．０を超えるｐＨで膨潤または開放状態になる。したがって、樹状ポリマーとの非共有結合によって、または分枝系に形成された間質腔に捕捉することによって、薬物を容易に負荷することができる。低いｐＨは、系を収縮させ、カプセル材料を保護し、かつ／またはそれをよりゆっくりと放出する。したがって、樹状胆汁酸エステルポリマーは、直鎖ポリマーで使用される製剤化条件を用いることなく、それ自体がナノ粒子として機能し得る。

ｐＵＤＣＡポリマーは、ウルソデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、またはそれらの組み合わせから形成することができる。

いくつかの実施形態では、モノマーまたは形成されたポリマー鎖は、１またはそれを超える放射性核種または光学トレーサー（生物発光、化学発光、蛍光、または他の高吸光係数または高量子収率の光学トレーサー）を有する部分を含み得る。同様に、重金属のクラスのＴ１ ＭＲ剤（ガドリニウム、ジスプロシウムなど）またはＴ２造影剤（酸化鉄、酸化マンガンなど）、Ｘ線減衰用のヨウ素化剤（ＣＴ）および他のモダリティなどの非侵襲性造影剤。７～２のｐＨ範囲の変化に応答するこれらの系の固有の能力は、細胞内の低ｐＨエンドサイトーシス区画、および／または低ｐＨ微小環境もしくは腫瘍の周囲環境を特徴とする炎症部位の両方への治療薬の送達に重要な意味を有する。これらの実施形態のポリマー鎖を使用して、追跡可能なｐＵＤＣＡナノ粒子を形成し、イメージング剤／追跡剤をカプセル化する必要性を排除し、領域内のイメージング剤の局所保持（プローブの閉じ込め）によりイメージングモダリティを向上させることができる。

ｐＵＤＣＡナノ粒子はｐＨ応答性である。ポリマー骨格は収縮し、ナノ粒子は低ｐＨ微小環境（ｐＨ２～５）で凝集し、より高いｐＨ（ｐＨ６～７．５）で膨張してカプセル化された薬剤を放出する。ｐＵＤＣＡポリマーは、親水性薬物および疎水性薬物の両方、ペプチド、タンパク質、ならびにオリゴヌクレオチドのカプセル化を可能にする。カプセル化された薬剤は、腸内腔のより高いｐＨの微小環境、または一般に５．５～６．０を超えるｐＨを有する臓器で経時的に放出される。

胆汁酸の水溶解度は、ｐＨの上昇と共に指数関数的に上昇する（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３３：６１７－６２６（１９９２））。ｐＵＤＣＡのポリマー鎖およびそれから作製されたナノ粒子は、低ｐＨで凝集し、ｐＨが５．５を超えて上昇するにつれて徐々に溶解／分散するようになる。これらのポリマーおよびナノ粒子は、ナノ粒子でカプセル化された薬剤を胃の破壊的環境から保護することができるので、経口薬物送達に特に適している。その後、ポリマーが溶解し始めて薬剤を放出するので、腸および標的臓器中の中性ｐＨ（典型的には６～７．４）で薬剤を安全に放出することができる。

ナノ粒子は、５０から５００ｎｍの間の幾何平均径を有することができる。いくつかの実施態様では、ナノ粒子の集団の幾何平均径は、約６０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、２２５ｎｍ、２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、３００ｎｍ、３２５ｎｍ、３５０ｎｍ、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、４２５ｎｍ、４５０ｎｍ又は４７５ｎｍである。いくつかの実施形態では、幾何平均径は、１００～４００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２５０ｎｍ、または１００～２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、幾何平均径は、６０～４００ｎｍ、６０～３５０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、または６０～２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、幾何平均径は、７５～２５０ｎｍである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子の集団のナノ粒子の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるものが、５０～５００ｎｍの直径を有する。好ましい実施形態では、平均粒径は３５０ｎｍである。サイズは、光学顕微鏡法などの従来の技術によって測定される。

Ｂ．寛容原性組成物
寛容を誘導するための組成物は、典型的には、樹状細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する寛容原性（寛容化する）抗原、免疫抑制薬（例えば、ラパマイシン）またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらと一緒に、もしくはそれらと一緒に投与するために製剤化される。いくつかの実施形態では、寛容原性抗原および免疫抑制薬は同じ細胞に共送達される。次いで、ＡＰＣは寛容原性になって、末梢リンパ節に遊走することができ、そこでそれらはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞などのＴｒｅｇの活性化、増殖の誘導、分化の誘導、またはそれらの組み合わせを行うと考えられている。次いで、これらのＴｒｅｇは、寛容原性抗原に特異的なＢ細胞による活性化および抗体産生を抑制することができる。抗原および免疫抑制薬は、寛容原性プログラムの開始のために同じ肝臓樹状細胞または肝臓内皮細胞に空間的に局在することが望ましい。したがって、最も好ましい実施形態では、抗原および免疫抑制薬は、同じ粒子内に負荷され、その中に分散され、それにコンジュゲートされ、またはそうでなければ同じ粒子の上もしくはその中に提示される。同じ粒子で免疫抑制薬を抗原と同時送達することは、１）同じ細胞中の抗原および薬物用量を濃縮する、および２）同じ抗原提示細胞が抑制されることを確実にする、という２つの効果を有することができる。このストラテジーによれば、広範な免疫抑制または抗原特異的免疫原性を低減または防止することができる。

免疫抑制薬は、抗原と共に同じ抗原提示細胞に送達され、薬物の免疫抑制効果を改善する（例えば、寛容誘導）。いくつかの実施形態では、ミコフェノール酸およびラパマイシンなどの２つの免疫抑制薬が同時送達される。好ましくは、粒子は肝臓に蓄積する。いくつかの実施形態では、粒子は、標的化部分、例えば、肝臓における粒子の蓄積を増加させる（またはさらに増加させる）か、または肝臓における樹状細胞などの特定の細胞に粒子を誘導する標的化部分を含む。

代替的な実施形態では、抗原および免疫抑制薬は、別々の粒子に負荷されるか、その中に分散されるか、それにコンジュゲートされるか、そうでなければその上または中に提示される。

Ｃ．抗原
粒子は、寛容が誘導される１またはそれを超える抗原を含むことができる。好適な抗原は、所望の処置転帰および処置される疾患、障害または状態に基づいて選択される。例示的な抗原は当技術分野で公知である。例えば、以下を論じている米国特許出願公開第２０１４／０３５６３８４号を参照されたい。

寛容原性抗原は、寛容が望まれる治療剤タンパク質に由来し得る。ヒトへの投与についての、その例は、野生型のタンパク質薬物（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子）（患者がこれらのタンパク質を欠損していたために中枢性寛容を確立しなかった）、非ヒト起源タンパク質薬物である。その例は、産生に起因して非ヒト形態でグリコシル化されるタンパク質薬物、または例えば、望ましくない免疫応答を引き起こし得る非天然配列を有する操作されたタンパク質薬物である。ヒトにおいて天然には見られない操作された治療用タンパク質である寛容原性抗原の例としては、操作された変異、例えば、薬理学的特徴を改善するための変異を有するヒトタンパク質が挙げられる。非ヒトグリコシル化を含有する寛容原性抗原の例としては、酵母または昆虫細胞で産生されるタンパク質が挙げられる。

寛容原性抗原は、タンパク質が欠損しているヒトに投与されるそのタンパク質に由来し得る。欠損とは、タンパク質を投与される患者がそのタンパク質の十分な量を天然に産生しないことを意味する。そのタンパク質は、機能不全であり、患者が遺伝的に欠損しているタンパク質であり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、抗トロンビン－ＩＩＩ、プロテインＣ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、成長ホルモン、ソマトトロピン、インスリン、酢酸プラムリンチド、メカセルミン（ＩＧＦ－１）、β－グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、イデュルスルファーゼ（ｉｄｕｒｓｕｐｈａｓｅ）（イズロネート－２－スルファターゼ）、ガルスルファーゼ（ｇａｌｓｕｌｐｈａｓｅ）、アガルシダーゼ－β（α－ガラクトシダーゼ）、α－１プロテイナーゼ阻害剤、およびフォン・ヴィレブランド因子が挙げられる。

寛容原性抗原は、抗体断片ならびに抗体と抗体断片の融合タンパク質などの治療用抗体および抗体様分子に由来し得る。これらには、非ヒト抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体が含まれる。ヒト化抗体に対する免疫応答がヒトにおいて観察されている（Ｇｅｔｔｓ Ｄ Ｒ、Ｇｅｔｔｓ Ｍ Ｔ、ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｄ Ｐ、Ｃｈａｓｔａｉｎ Ｅ Ｍ Ｌ，＆Ｍｉｌｌｅｒ Ｓ Ｄ（２０１０），ｍＡｂｓ，２（６）：６８２－６９４）。したがって、実施形態は、赤血球結合部分と、少なくとも１つの抗原、抗原断片、または１もしくはそれを超えるこれらのタンパク質の抗原ミモトープとを含有し、赤血球結合部分が、例えば、グリコホリンＡ、または、Ｂａｎｄ３、グリコホリンＢ、グリコホリンＣ、もしくは赤血球標的群の他のメンバーからなる群より選択される標的に特異的に結合する、寛容発生（tolerogenesis）のための融合分子を含む。赤血球結合部分は、例えば、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ペプチドリガンドおよびアプタマーからなる群より選択され得る。

寛容原性抗原は、ヒト同種移植片移植抗原に由来し得る。これらの抗原の例は、様々なＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩハプロタイプタンパク質のサブユニット、ならびにＲｈＣＥ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、ＤｕｆｆｙおよびＳｓなどの微量血液型抗原上の単一アミノ酸多型である。

寛容原性抗原は、患者が自己免疫応答を発症したことがあるか、または自己免疫応答を発症する可能性のある自己抗原であり得る。その例は、プロインスリン（糖尿病）、コラーゲン（関節リウマチ）、およびミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症）である。

例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、膵島タンパク質を認識するＴ細胞が免疫調節から解かれて、膵臓組織を破壊するように免疫系にシグナル伝達する自己免疫疾患である。このような糖尿病原性Ｔ細胞の標的である多数のタンパク質抗原、とりわけ、インスリン、ＧＡＤ６５、クロモグラニン－Ａなどが発見されている。Ｔ１Ｄの処置または予防において、糖尿病原性Ｔ細胞クローンを機能的に不活性化または欠失させるために、規定された糖尿病原性抗原に対する抗原特異的免疫寛容を誘導することが有用であろう。

寛容原性抗原は、以下のタンパク質、またはそれらに由来する断片もしくはペプチドのうちの１またはそれより多くであり得る。１型糖尿病では、いくつかの自己抗原、すなわち、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ－６５（ＧＡＤ－６５）、ＧＡＤ－６７、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ－２）、およびインスリン関連タンパク質２β（ＩＡ－２１３）が同定されており、他の抗原としては、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ－１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモゲン（imogen）３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニン－Ａ、ＦＩＳＰ－６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌－腸－膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア原線維酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼ、膵島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質、およびＳＳＴＧタンパク質共役受容体１～５が挙げられる。橋本甲状腺炎およびグレーブス病を含む甲状腺の自己免疫疾患では、自己抗原として、サイログロブリン（ＴＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）およびチロトロピン受容体（ＴＳＨＲ）が挙げられ、他の抗原としては、ナトリウムヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）およびメガリンが挙げられる。甲状腺関連眼症および皮膚症では、抗原は、ＴＳＨＲなどの甲状腺自己抗原に加えて、インスリン様成長因子１受容体である。副甲状腺機能低下症では、自己抗原はカルシウム感受性受容体である。アジソン病では、自己抗原として、２１－ヒドロキシラーゼ、１７α－ヒドロキシラーゼ、およびＰ４５０側鎖切断酵素（Ｐ４５０ｓｃｃ）が挙げられ、他の抗原としては、ＡＣＴＨ受容体、Ｐ４５０ｃ２１およびＰ４５０ｃ１７が挙げられる。早期卵巣不全では、自己抗原として、ＦＳＨ受容体およびα－エノラーゼが挙げられる。自己免疫性下垂体炎または下垂体自己免疫疾患では、自己抗原として、下垂体腺特異的タンパク質因子（ＰＧＳＦ）１ａおよび２が挙げられ、別の抗原は、２型ヨードチロニンデヨードナーゼである。多発性硬化症では、自己抗原として、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質およびプロテオリピドタンパク質が挙げられる。関節リウマチでは、自己抗原はＩＩ型コラーゲンである。免疫胃炎（immunogastritis）では、自己抗原はＨ^＋、Ｋ^＋－ＡＴＰアーゼである。悪性貧血では、自己抗原は内因性因子である。セリアック病では、自己抗原は組織トランスグルタミナーゼおよびグリアジンである。白斑では、自己抗原は、チロシナーゼならびにチロシナーゼ関連タンパク質１および２である。重症筋無力症では、自己抗原はアセチルコリン受容体である。尋常性天疱瘡および変種では、自己抗原は、デスモグレイン３、１および４であり、他の抗原としては、フェンファキシン、デスモコリン、プラコグロビン、パープラキン、デスモプラキンおよびアセチルコリン受容体が挙げられる。水疱性類天疱瘡では、自己抗原として、ＢＰ１８０およびＢＰ２３０が挙げられ、他の抗原としては、プレクチンおよびラミニン５が挙げられる。ジューリング疱疹状皮膚炎では、自己抗原として、筋内膜および組織トランスグルタミナーゼが挙げられる。後天性表皮水疱症では、自己抗原はＶＩＩ型コラーゲンである。全身性硬化症では、自己抗原として、マトリックスメタロプロテイナーゼ１および３、コラーゲン特異的分子シャペロン熱ショックタンパク質４７、フィブリリン－１、ならびにＰＤＧＦ受容体が挙げられ、他の抗原としては、Ｓｃｌ－７０、Ｕ１ＲＮＰ、Ｔｈ／Ｔｏ、Ｋｕ、Ｊｏ１、ＮＡＧ－２、セントロメアタンパク質、トポイソメラーゼＩ、核小体タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、ＰＭ－Ｓｌｃ、フィブリラリン、ならびにＢ２３が挙げられる。混合性結合組織病では、自己抗原はＵ１ｓｎＲＮＰである。シェーグレン症候群では、自己抗原は核抗原ＳＳ－ＡおよびＳＳ－Ｂであり、他の抗原としては、フォドリン、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼおよびトポイソメラーゼが挙げられる。全身性エリテマトーデスでは、自己抗原として、ＳＳ－Ａ、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）、ヌクレオソーム、ヒストンタンパク質および二本鎖ＤＮＡなどの核タンパク質が挙げられる。グッドパスチャー症候群では、自己抗原として、ＩＶ型コラーゲンなどの糸球体基底膜タンパク質が挙げられる。リウマチ性心疾患では、自己抗原は心臓ミオシンである。自己免疫性多腺性症候群１型において明らかにされる他の自己抗原としては、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素、ヒスチジン脱炭酸酵素、システインスルフィン酸脱炭酸酵素、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、肝臓Ｐ４５０シトクロムＰ４５０１Ａ２および２Ａ６、ＳＯＸ－９、ＳＯＸ－１０、カルシウム感知受容体タンパク質、ならびに１型インターフェロン、インターフェロンアルファ、ベータおよびオメガが挙げられる。

寛容原性抗原は、患者が望ましくない免疫応答を発症した外来抗原であり得る。その例は食物抗原である。実施形態は、外来抗原を同定するために患者を試験すること、および抗原を含有する分子融合物を作製すること、および抗原または食物に対する免疫寛容を発達させるために患者を処置することを含む。そのような食物および／または抗原の例が提供される。その例は、ピーナッツ由来のコナラキン（conarachin）（Ａｒａ ｈ １）、アレルゲンＩＩ（Ａｒａ ｈ ２）、アラキスアグルチニン、コングルチン（Ａｒａ ｈ ６）、リンゴ由来の３１ｋｄａ主要アレルゲン／疾患抵抗性タンパク質ホモログ（Ｍａｌ ｄ ２）、脂質転移タンパク質前駆体（Ｍａｌ ｄ ３）、主要アレルゲンＭａｌ ｄ１．０３Ｄ（Ｍａｌ ｄ １）、乳由来のα－ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン、キウイ由来のアクチニジン（Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｄ １）、フィトシスタチン、タウマチン様タンパク質（Ａｃｔ ｄ ２）、キウェリン（kiwellin）（Ａｃｔ ｄ ５）、マスタード由来の２Ｓアルブミン（Ｓｉｎ ａ １）、１１Ｓグロブリン（Ｓｉｎ ａ ２）、脂質転移タンパク質（Ｓｉｎ ａ ３）、プロフィリン（Ｓｉｎ ａ ４）、セロリ由来のプロフィリン（Ａｐｉ ｇ ４）、高分子量糖タンパク質（Ａｐｉ ｇ ５）、エビ由来のＰｅｎ ａ １アレルゲン（Ｐｅｎ ａ １）、アレルゲンＰｅｎ ｍ ２（Ｐｅｎ ｉｎ ２）、トロポミオシンファーストアイソフォーム（tropomyosin fast isoform）、小麦および／または他の穀類由来の高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、アルファ－およびガンマ－グリアジン、ホーデイン（hordein）、セカリン（secalin）、アベニン、イチゴ由来の主要なイチゴアレルギーＦｒａ ａ １－Ｅ（Ｆｒａ ａ １）、バナナ由来のプロフィリン（Ｍｕｓ ｘｐ １）である。

Ｄ．免疫調節剤
粒子は、制御性Ｔ細胞の免疫抑制薬または免疫刺激剤を含む１またはそれを超える免疫調節剤を含むことができる。免疫抑制薬は当技術分野で公知であり、グルココルチコイド、細胞増殖抑制薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、および細胞傷害性抗体）、抗体（例えば、Ｔ細胞受容体またはＩｌ－２受容体に対する抗体）、イムノフィリンに作用する薬物（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、およびシロリムス）および他の薬物（例えば、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノラート、およびフィンゴリモドなどの他の小分子）が挙げられる。免疫抑制薬としては、ＦＫ５０６、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、シクロホスファミド、サリドマイド、アザチオプリンおよびダクリズマブ、フィザリン（physalin）Ｂ、フィザリンＦ、フィザリンＧ、Ｐｈｙｓａｌｉｓ ａｎｇｕｌａｔａ Ｌ．から精製されたセコステロイド、１５デオキシスペルグアリン、ＭＭＦ、ラパマイシンおよびその誘導体、ＣＣＩ－７７９、ＦＲ９００５２０、ＦＲ９００５２３、ＮＫ８６－１０８６、デプシドマイシン、カングレマイシン－Ｃ、スペルグアリン、プロジギオシン２５－ｃ、カムノマイシン、デメトマイシン、テトラナクチン、トラニラスト、ステバステリン、ミリオシン、グリオトキシン、ＦＲ６５１８１４、ＳＤＺ２１４－１０４、ブレジニン、ＷＳ９４８２、ミコフェノール酸、ミモリビン、ミソプロストール、ＯＫＴ３、抗ＩＬ－２受容体、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン、パクリタキセル、アルトレタミン、ブスルファン、クロラムブシル、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、クラドリビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、ゲムシタビン、チオグアニン、ペントスタチン、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、シタラビン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾトシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、イプロプラチン、テトラプラチン、ロバプラチン、ＪＭ２１６、ＪＭ３３５、フルダラビン、アミノグルテチミド、フルタミド、ゴセレリン、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、酢酸シプロテロン、タモキシフェン、アナストロゾール、ビカルタミド、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキシルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ロソキサントロン、マイトマイシン－ｃ、プリカマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、トポテカン、イリノテカン、９－アミノカンプトテカン、９－ニトロカンプトテカン、ＧＳ－２１１、エトポシド、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プロカルバジン、アスパラギナーゼ、ペガスパルガーゼ、オクトレオチド、エストラムスチン、およびヒドロキシ尿素が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「ラパマイシン化合物」という用語は、ラパマイシンと同じ作用機序（例えば、サイトカイン機能の阻害）を有すると考えられる中性三環式化合物ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、および他のマクロライド化合物を含む。「ラパマイシン化合物」という言語は、ラパマイシンと構造的類似性を有する化合物、例えば、治療有効性を高めるために修飾されている類似の大環状構造を有する化合物を含む。例示的なラパマイシン化合物、ならびにラパマイシンが投与された他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第９５／２２９７２号、国際公開第９５／１６６９１号、国際公開第９５／０４７３８号、米国特許第６，０１５，８０９号、同第５，９８９，５９１号、同第５，５６７，７０９号、同第５，５５９，１１２号、同第５，５３０，００６号、同第５，４８４，７９０号、同第５，３８５，９０８号、同第５，２０２，３３２号、同第５，１６２，３３３号、同第５，７８０，４６２号、同第５，１２０，７２７号を参照されたい）。ラパマイシン類似体としては、例えば、エベロリムス、リダフォロリムス、レムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスが挙げられる。以下は、抗原およびラパマイシンなどの免疫抑制薬と組み合わせて、または単独で、または免疫調節のために免疫抑制薬なしで抗原と組み合わせて使用され得る薬剤である。一実施形態では、免疫抑制薬はＴＮＦ－α遮断剤である。別の実施形態では、免疫抑制薬は、血清中のアデノシンの量を増加させる（例えば、国際公開第０８／１４７４８２号を参照のこと）。

本組成物は、Ｔｒｅｇ活性または生産を増加させる化合物と組み合わせてまたは連続して使用することができる。例示的なＴｒｅｇ増強剤としては、グルココルチコイドフルチカゾン、サルメテロール、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－４に対する抗体、ビタミンＤ３、およびデキサメタゾン、ならびにそれらの組み合わせが挙げられが、これらに限定されない。これらの化合物は、Ｔｒｅｇの活性を増加または促進し、ＴｒｅｇからのＩＬ－１０などのサイトカインの産生を増加させ、Ｔｒｅｇの分化を増加させ、Ｔｒｅｇの数を増加させ、またはＴｒｅｇの生存を増加させることができる。米国特許出願公開第２０１２／０２７６０９５号も参照されたい。

炎症促進性サイトカインの生物活性を低下させる抗体、小分子および他の化合物も使用することができる。いくつかの実施形態では、その化合物は、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子α）、ＴＮＦ－β（リンホトキシンα、ＬＴ）またはそれらの組み合わせの生物活性を低下させる。

生物製剤内の別の主要なカテゴリーは、高レベルの炎症性タンパク質に対抗する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遮断剤である。エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）が最も広く使用されている。別の有望な群は、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）のようなインターロイキン－１（ＩＬ－１）遮断剤である。

いくつかの実施形態では、薬剤は、抗炎症性サイトカインまたはケモカイン、例えば、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）、インターロイキン（ＩＬ）－１受容体アンタゴニスト、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１およびＩＬ－１３である。ＩＬ－１、腫瘍壊死因子αおよびＩＬ－１８に対する特異的サイトカイン受容体もまた、炎症促進性サイトカイン阻害剤として機能する。抗炎症性サイトカインおよび可溶性サイトカイン受容体の性質は当技術分野で公知であり、Ｏｐａｌ ａｎｄ ＤｅＰａｌｏ，Ｃｈｅｓｔ，１１７（４）：１１６２－７２（２０００）で論じられている。

レチノイン酸は、抗炎症剤として使用することができるさらなる治療化合物である。例えば、Ｃａｐｕｒｓｏら、Ｓｅｌｆ／Ｎｏｎｓｅｌｆ，１：４，３３５－３４０（２０１０）を参照されたい。

ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）およびその活性代謝産物ミコフェノール酸（ＭＰＡ）は、両方とも非常に有効な免疫抑制剤である。ＭＭＦは、自己免疫性および炎症性皮膚疾患を処置するために使用されており（Ｌｉｐｓｋｙ，Ｌａｎｃｅｔ，３４８：Ｌ１３５７－１３５９（１９９６））、自己免疫疾患を有する小児における重要な治療選択肢となっている（Ｆｉｌｌｅｒら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，８：１（２０１０））。ミコフェノール酸（ＭＰＡ）は、デノボプリン合成を抑制することによってＴおよびＢリンパ球の増殖を選択的に阻害する比較的新しいアジュバント薬である。他のステロイドを節約する免疫抑制剤としては、アザチオプリン、メトトレキサートおよびシクロホスファミドが挙げられる。

ＭＰＡは、ミコフェノール酸モフェチルの活性形態であり、これは現在、ループスおよび他の自己免疫疾患治療のためのヒトにおける免疫抑制薬として使用されている（Ｇｉｎｚｌｅｒら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３５３（２１）：２２１９－２８（２００５））。ＭＰＡは、いくつかの免疫細胞型に対して広範な免疫抑制作用を有する。ＭＰＡは、グアニンヌクレオチドのデノボ合成経路を遮断する。これらの細胞は、デノボグアニン産生の低下を回避し得る生合成サルベージ経路を欠いているので、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖はＭＰＡによって急性に損なわれる（Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２４（３）：４８６－９１（２００１）、Ｑｕｅｍｅｎｅｕｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９（５）：２７４７－５５（２００２）、Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，３（１）：３１－７（２００３）、および、Ｋａｒｎｅｌｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７（７）：３６０３－１２（２０１１））。さらに、ＭＰＡは、樹状細胞の活性化およびアロ抗原応答を刺激する能力を損ない（Ｍｅｈｌｉｎｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６５（５）：２３７４－８１（２０００）、Ｌａｇａｒａｉｎｅら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７（４）：３５１－６３（２００５）、および、Ｗａｄｉａら、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７０（９）：６９２－７００（２００９））、寛容原性樹状細胞の発生を促進することができる（Ｌａｇａｒａｉｎｅら、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，８４（４）：１０５７－６４（２００８））。多くの免疫抑制薬と同様に、ＭＰＡは非常に疎水性であり、報告されている分配係数（ｌｏｇＰ値）は３．８８である（Ｅｌｂａｒｂｒｙら、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，８５９（２）：２７６－８１（２００７））。

免疫抑制薬は、免疫系の機能を抑制するか、または感染症に対する感受性を増加させる任意の小分子であり得る。特定の実施形態では、免疫抑制薬は、Ｔ細胞増殖の阻害剤、Ｂ細胞増殖の阻害剤、またはＴ細胞およびＢ細胞増殖の阻害剤である。特定の実施形態では、Ｔ細胞またはＢ細胞増殖阻害剤は、グアニンモノホスフェートの合成を阻害または調節する。例えば、免疫抑制薬はミコフェノール酸であり得る。

あるいは、免疫抑制薬は、限定するものではないが、ミコフェノール酸モフェチル（スウェーデンの会社であるＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．によってＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）の商品名で市販されている）などのミコフェノール酸のプロドラッグである。

免疫抑制薬の塩もまた使用することができ、例えば、ミコフェノール酸の塩としては、ミコフェノール酸ナトリウム（ノバルティスによって商品名ＭＹＦＯＲＴＩＣ（登録商標）として市販されている）が挙げられる、これに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫抑制薬は、限定するものではないが、アザチオプリン（ＳａｌｉｘによるＡＺＡＳＡＮ（登録商標）やグラクソ・スミスクラインによるＩＭＵＲＡＮ（登録商標）など、様々な商品名で市販されている）またはメルカプトプリン（ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標）メルカプトプリンの商品名で市販されている）を含むプリン類似体である。いくつかの実施形態では、免疫抑制薬は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤などのプリンの使用および／または合成を阻害する代謝拮抗物質である。

追加的または代替的に、抗炎症剤を使用することができる。抗炎症剤は、非ステロイド系、ステロイド系、またはそれらの組み合わせであり得る。非ステロイド系抗炎症剤の代表的な例としては、限定するものではないが、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなどのオキシカム、アスピリン、ジサルシド（disalcid）、ベノリレート、トリリセート、サファプリン（safapryn）、ソルプリン（solprin）、ジフルニサルおよびフィソサールなどのサリチレート、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセメタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナクおよびケトロラクなどの酢酸誘導体、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルム酸およびトルフェナム酸などのフェナメート類、イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェンおよびチアプロフェンなどのプロピオン酸誘導体、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾンおよびトリメタゾンなどのピラゾール類が挙げられる。また、これらの非ステロイド系抗炎症剤の混合物も使用され得る。

ステロイド系抗炎症薬の代表的な例としては、限定するものではないが、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシル－トリアムシノロン、アルファ－メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン（fluadrenolone）、フルクロロンアセトニド（fluclorolone acetonide）、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハロシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラレノロン、フルドロコルチゾン、ジフルロゾンジアセテート、フルラレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステルの残部、クロロプレドニソン、クロルプレドニゾンアセテート、クロコルテロン、クレシノロン（clescinolone）、ジクロリソン（dichlorisone）、ジフルルプレドネート（diflurprednate）、フルクロロニド（flucloronide）、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンバレレート、ヒドロコルチゾンシクロペンチルプロピオネート、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオネート、トリアムシノロンなどのコルチコステロイド、およびこれらの混合物が挙げられる。

より一般的なコルチコステロイドとしては、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、コルチゾン、トリアムシノロンおよびベタメタゾンが挙げられる。

Ｅ．標的化部分
いくつかの実施形態では、１またはそれを超える標的化部分（本明細書では標的化分子および標的化シグナルとも呼ばれる）を、粒子内に負荷し、粒子の表面に付着させ、および／または粒子内に封入することができる。これらは通常必要ではない。例示的な標的分子としては、肝臓の組織、細胞または細胞外マトリックスに関連する１またはそれを超える標的に結合するタンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖類または多糖類が挙げられる。好ましくは、標的化部分は、粒子の外面に提示され、好ましくは粒子の外面にコンジュゲートしている。好ましくは、標的化部分は、肝臓、または肝臓細胞および内皮細胞を含む組織もしくはその細胞への粒子の標的化を増大または増強する。

粒子の表面を操作するために、分子（リガンド）とナノシステム（ポリマーまたは脂質）との共有結合など、様々な技術を使用することができる（Ｔｏｓｉら、ＳｆＮ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（ＵＳＡ），１：８４（２０１０））。

粒子が標的化される特異性の程度は、適切な親和性および特異性を有する標的化分子を選択することによって調節することができる。例えば、抗体は非常に特異的である。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、断片、組換えまたは一本鎖であり得、その多くは市販されているか、または標準的な技術を用いて容易に得られる。標的化分子は、粒子の表面上に存在する１またはそれを超えるＰＥＧ鎖の末端にコンジュゲートされ得る。

いくつかの実施形態では、標的化部分は、肝細胞または組織マーカーを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片である。抗体は非常に大きく、組織を通って拡散することが制限され得るので、断片が好ましい。目的の細胞および組織に粒子を誘導するために使用することができる適切な標的化分子、ならびに標的分子をナノ粒子にコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で公知である。

特に好ましい標的は、ＤＥＣ２０５＋である。ＤＥＣ２０５＋２０５ｋＤａの分子量を有する細胞受容体（ＤＥＣ２０５）（Ｒｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１２０２５９２（１１ページ）（２０１３））。これは、上皮細胞および樹状細胞（ＤＣ）によって発現され、抗原提示を促進する。ＤＥＣ２０５＋を標的とするための組成物は当技術分野において公知であり、例えば、抗ＤＥＣ２０５＋抗体ならびにその断片および融合物が挙げられる（例えば、Ｓｉｌｖａ－Ｓａｎｃｈｅｚ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（４）：ｅ０１２４８２８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２４８２８、Ｓｐｉｅｒｉｎｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９４（１０）：４８０４－１３（２０１５）．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１４００９８６．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｐｒ １０を参照されたい）。ＤＥＣ２０５標的化ナノ粒子は、標的細胞へ侵入するためにＤＥＣ２０５媒介性エンドサイトーシスを利用すると考えられており、これはそれらの抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞を活性化する能力を低下させる。ＤＥＣ２０５を介して抗原を取り込むＤＣは、ＭＨＣクラスＩを介して交差提示することが知られており、これにより、自己免疫性糖尿病およびＥＡＥのマウスモデルにおいてＣＤ８ Ｔ細胞欠失寛容を促進することができる。

いくつかの実施形態では、標的化リガンドの密度を調節して、担体の寛容誘導効果を調整する。

Ｆ．医薬組成物
投薬単位
ナノ粒子は、単一または複数の投薬単位として経口投与するために、液体または固体形態で製剤化することができる。

本組成物は、典型的には、投与の容易性および投薬量の均一性のために投薬単位形態で製剤化される。しかしながら、組成物の１日の総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の対象または生物に対する具体的な処置有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度、使用される特定の活性成分の活性、使用される特定の組成物、対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事、使用される特定の活性成分の投与時間、投与経路、および排泄速度、処置期間、使用される特定の活性成分と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学分野で周知の他の要因などの種々の因子に依存する。

特定の実施形態では、投薬単位は、種、投与経路、用量の数および処置される障害に基づいて、約１マイクログラム／ｋｇ～５グラム／ｋｇの総投与量で活性剤および／またはイメージング剤をカプセル化するＰＢＡナノ粒子を含む。所望の治療効果を得るための代表的な範囲としては、１日に１またはそれを超える回数で、１日当たり、対象の体重１ｋｇにつき、０．００１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇ、約０．１ｍｇ～約５００ｍｇ、約０．５ｍｇ～約５００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０００ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、または約１ｍｇ～約１００ｍｇが挙げられる。所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、３日毎に、毎週、２週間毎に、３週間毎に、または４週間毎に送達され得る。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回またはそれを超える投与）を使用して送達され得る。

賦形剤
ナノ粒子は、単一または複数の投薬単位として経口投与するために、液体または固体形態で製剤化することができる。

有効投与量は、賦形剤の濃度およびそれらの添加方法に依存し得る。ＴＧＲ５の活性化は、脂肪組織におけるエネルギー消費の増加と共に、抗炎症性免疫、抗線維化活性、腸内分泌Ｌ細胞からのＧＬＰ－１の誘導および分泌をもたらす３２。ｐＵＤＣＡは、そのモノマー対応物であるＵＤＣＡが本質的に弱いＴＧＲ５アゴニストであるため、用量を有意に低下させるだけでなく、ＵＤＣＡ機能の範囲を増幅し得る。

本組成物は、典型的には、投与の容易性および投薬量の均一性のために投薬単位形態で製剤化される。しかしながら、組成物の１日の総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の対象または生物に対する具体的な処置有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度、使用される特定の活性成分の活性、使用される特定の組成物、対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事、使用される特定の活性成分の投与時間、投与経路、および排泄速度、処置期間、使用される特定の活性成分と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学分野で周知の他の要因などの種々の因子に依存する。

賦形剤および／または担体は、投与される剤形、送達される活性薬剤などに基づいて選択され得る。好適な賦形剤としては、界面活性剤、乳化剤、エマルジョン安定化剤、酸化防止剤、皮膚軟化剤、保湿剤、キレート剤、懸濁化剤、増粘剤、閉塞剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、溶媒、矯味矯臭剤、着色剤、および他の賦形剤が挙げられる。本明細書で使用される場合、「賦形剤」は、あらゆる胆汁酸もそのポリマーも含まない。

好適な乳化剤としては、直鎖または分岐脂肪酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコールステアレート、グリセリルステアレート、ポリエチレングリコール、脂肪アルコール、ポリマーエチレンオキシド－プロピレンオキシドブロックコポリマー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

好適な界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および両性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。

好適な懸濁化剤としては、アルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースおよびその塩、コロイド状オートミール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、コロイド状二酸化ケイ素、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガム、カオリン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルチトール、トリグリセリド、メチルセルロース、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリビニルピロリドン、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、ソルビタン脂肪酸エステル、トラガカント、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

好適な酸化防止剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、酢酸アスコルビル、リン酸アスコルビル、ビタミンＡ、葉酸、フラボンまたはフラボノイド、ヒスチジン、グリシン、チロシン、トリプトファン、カロテノイド、カロテン、アルファ－カロテン、ベータ－カロテン、尿酸、それらの薬学的に許容され得る塩、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

好適なキレート剤としては、ＥＤＴＡ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

好適な保湿剤としては、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール、トリアセチン、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

防腐剤は、真菌および他の微生物の増殖を防ぐために使用することができる。好適な防腐剤としては、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、チメロサール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

賦形剤は、滅菌水、リン酸緩衝食塩水、食塩水、またはグリセロールなどの非水性溶液などの懸濁化剤を含み得る。

粒子は、噴霧乾燥または凍結乾燥後に乾燥粉末として提供することができる。

粒子は、圧縮して錠剤にしてもよく、それを、胃を通過した後の粒子の放出を防ぐために、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（登録商標）などの材料でコーティングしてもよい。

粒子はまた、ゼラチンおよびアルギネートカプセルならびにＢａｎｎｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって販売されている腸溶性製剤化軟質ゲルなどの硬質ゲルまたは軟質ゲルにカプセル化してもよい。

粒子はまた、粘膜表面、例えば、口、鼻腔、口腔、肺系、直腸または膣表面に投与するために製剤化され得る。

粒子はまた、キットで提供されてもよく、送達される材料は、投薬単位とは別個に提供され、次いで、使用前に粉末もしくは乾燥形態または溶液で組み合わせられる。送達される薬剤は、化学的または物理的に胆汁酸塩ポリマーに捕捉され、カプセル化され、または結合され得る。

ＩＩＩ．ナノ粒子を作製する方法
本明細書に記載されるｐＵＤＣＡナノ粒子は、様々な方法によって調製することができる。代表的な方法を以下に示す。

Ａ．溶媒蒸発マイクロカプセル化
溶媒蒸発マイクロカプセル化では、ポリマーは典型的には水非混和性有機溶媒に溶解され、カプセル化される材料は有機溶媒の懸濁物または溶液の形でポリマー溶液に添加される。エマルジョンは、この懸濁物または溶液を激しく撹拌している水（エマルジョンを安定化するために、多くの場合、界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールを含有する）の入ったビーカーに添加することによって形成される。撹拌を継続しながら有機溶媒を蒸発させる。蒸発によって、ポリマーが沈殿し、コア材料を含有する固体ナノ粒子が形成される。

ポリマーまたはコポリマーは、相分離を生じる濃度（すなわち、曇点）のすぐ下の非溶媒濃度で、溶媒と非溶媒との混和性混合物に溶解される。液体コア材料は、攪拌しながら溶液に添加されて、エマルジョンを形成し、材料を液滴として分散させる。溶媒および非溶媒が気化され、溶媒はより速い速度で気化され、ポリマーまたはコポリマーを相分離させ、コア材料の液滴の表面に向かって移動させる。次いで、この相分離した溶液を攪拌された大量の非溶媒に移し、残っている溶解したポリマーまたはコポリマーを沈殿させ、形成された膜から残留溶媒を抽出する。その結果、液体材料のコアを有するポリマーまたはコポリマーシェルから構成されるナノ粒子が得られる。

溶媒除去マイクロカプセル化では、ポリマーは典型的には油混和性有機溶媒に溶解され、カプセル化される材料は有機溶媒の懸濁物または溶液としてポリマー溶液に添加される。界面活性剤を添加して、カプセル化される材料の分散を改善することができる。エマルジョンは、この懸濁物または溶液を激しく撹拌している油に添加することによって形成され、ここでは、油はポリマーに対する非溶媒であり、ポリマー／溶媒溶液は油に混和しない。撹拌を継続しながら、有機溶媒を油相へ拡散させることによって除去する。溶媒の除去により、ポリマーが沈殿し、コア材料を含有する固体粒子が形成される。

Ｂ．相分離マイクロカプセル化
相分離マイクロカプセル化では、カプセル化される材料は、撹拌しながらポリマー溶液に分散される。材料を均一に懸濁させるために絶えず撹拌しながら、ポリマー用の非溶媒を溶液にゆっくり添加してポリマーの溶解度を低下させる。溶媒および非溶媒中のポリマーの溶解度に応じて、ポリマーは沈殿するか、または相がポリマーに富む相とポリマーが乏しい相とに分離する。適切な条件下では、ポリマーに富む相のポリマーは連続相との界面に移動し、外側ポリマーシェルを有する液滴の中にコア材料をカプセル化する。

Ｃ．自発的乳化
自発的乳化は、温度を変えること、溶媒を蒸発させること、または化学的架橋剤を添加することによって、乳化された液体ポリマー液滴を凝固させることを含む。カプセル材料、およびカプセル化される材料の物理的および化学的特性は、適切なカプセル化方法に影響を与える。疎水性、分子量、化学的安定性、および熱的安定性などの要因がカプセル化に影響を及ぼす。

Ｄ．コアセルベーション
コアセルベーション技術を用いた様々な物質のカプセル化の手順は、先行技術、例えば、英国特許第９２９４０６号、英国特許第９２９４０１号、米国特許第３，２６６，９８７号、同第４，７９４，０００号、および同第４，４６０，５６３号に記載されている。コアセルベーションは、コロイド溶液を２またはそれを超える不混和性液体層に分離することを含むプロセスである（Ｄｏｗｂｅｎ，Ｒ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ＆Ｒｏｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６９，ｐｐ．１４２－１４３）。コアセルベーションのプロセスによって、２またはそれを超える相を含むコアセルベートとして知られている組成物を製造することができる。２相コアセルベート系を含有する成分は、両方の相に存在するが、コロイドに富む相は、コロイドが乏しい相よりも成分濃度が高い。

Ｅ．噴霧乾燥
この方法では、ポリマーは有機溶媒に溶解される。既知量の活性薬物をポリマー溶液に懸濁（不溶性薬物）または共溶解（可溶性薬物）する。次いで、溶液または分散物を噴霧乾燥する。ミニ噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ）の典型的なプロセスパラメーターは以下の通りである：ポリマー濃度＝０．０４ｇ／ｍＬ、入口温度＝－２４℃、出口温度＝１３～１５℃、アスピレータ設定＝１５、ポンプ設定＝１０ｍＬ／分、噴霧流量＝６００Ｎｌ／時間、ノズル直径＝０．５ｍｍ。１～１０ミクロンの範囲の微粒子が、使用されるポリマーのタイプに依存する形態で得られる。

Ｆ．フッ素媒介超分子集合
フッ素化胆汁酸単位（直鎖状または分枝状のいずれか）は、末端カルボキシレートまたはヒドロキシル基とアルキルフルオレート無水物（ＡＦＡＡ）との反応によって合成することができる。この生成物は、水に抽出されて疎フルオロ効果を開始することができ、ここでは、フッ素化構成要素の自発的な凝集が優先的に、かつ疎水性効果とは異なる形で起こる。そのような集合は、熱エネルギー、フッ素化の程度の両方に依存し、最終形態に対するある程度の熱力学的および動態制御を可能にする。疎フルオロ媒介自己集合は、凝集のための凝集力をもたらし、１９Ｆ ＮＭＲによって本質的にイメージング可能な系として機能し得る。フッ素化胆汁酸はまた、ＧＩ管または膵臓領域における系の滞留時間を延ばすのに役立ち得る明確に異なる生体内分布およびクリアランス時間を有する。

ＩＶ．使用方法
Ａ．投与経路
粒子は、好ましくは経口投与され、膵臓、肝臓または結腸などの標的臓器による取り込みの増大を示す。経口投与は、経口胃管栄養によって、または液体もしくは固体形態の組成物を嚥下することによって達成することができる。経口投与される組成物の液体形態は、溶液または液体ゲルの形態であり得る。経口投与される組成物の固体形態は、カプセル、軟質および硬質ゲル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒の形態であり得る。

経口投与に関して説明してきたが、同じ送達が、口、鼻腔、肺、肺、直腸または膣などの粘膜表面への送達、または静脈内（ｉ．ｖ．）注射による送達によって達成され得ることが理解される。

所望の投与量は、１日１回、または１日複数回経口送達され得る。例えば、所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、３日毎に、毎週、２週間毎に、３週間毎に、または４週間毎に経口送達され得る。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回の毎日の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回またはそれを超える投与）を使用して送達され得る。

Ｂ．処置される障害
疾患または状態を予防、抑制または処置する方法は、それを必要とする対象に１またはそれを超える薬剤をカプセル化する非標的化ＰＢＡナノ粒子を含有する医薬組成物の経口投薬単位を投与すること、および、有効量の１またはそれを超える薬剤を、必要に応じて、膵臓、肝臓、または結腸などの標的化された組織に送達することを含み得、上記薬剤が標的組織でＰＢＡナノ粒子から放出されて、疾患の予防、抑制または処置をもたらす。

本製剤は、結腸、肝臓、脾臓、膵臓または隣接領域の新生物の処置に特に有用である。本製剤はまた、潰瘍、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、および結腸がんなどの胃腸管の疾患の処置に非常に有用である。本製剤は、炎症性疾患ならびに自己免疫性およびアレルギー性疾患の処置に有用である。本製剤は、糖尿病などの疾患の処置にも有効である。

１．自己免疫疾患および状態ならびに炎症性疾患および状態
本明細書に開示される組成物および方法は、限定するものではないが、自己免疫疾患の処置、移植拒絶のための療法、免疫抑制機能の増強のためのアジュバント、およびＴｒｅｇまたは寛容原性ＤＣを含む細胞療法などの広範囲の適用を有することが理解されよう。

いくつかの実施形態では、本組成物および方法は、自己免疫疾患または炎症状態の発病および進行の主な原因であり得る、慢性および持続性炎症を処置するために使用される。したがって、炎症性および自己免疫性の疾患および障害を処置する方法は、それを必要とする対象に、有効量の粒子製剤またはその医薬組成物を投与して、その疾患または状態の１またはそれを超える症状を軽減または改善することを含み得る。いくつかの適用を、以下により詳細に説明する。

開示される組成物および方法を用いて処置することができる代表的な炎症性または自己免疫性の疾患および障害としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー－皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、クレスト症候群、クローン病、デゴ病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状狼瘡、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛－線維筋炎（fibromyositis）、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエル病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（polyglancular syndrome）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。

２．エピトープスプレッディングの阻害
エピトープスプレッディングとは、Ｂ細胞およびＴ細胞の免疫応答が、自己抗原上の単一の決定基から多くの部位への特異性のレベル、および、Ｖ遺伝子使用のレベルの両方で多様化する能力を指す（Ｍｏｎｎｅａｕｘ，Ｆら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４６（６）：１４３０－１４３８（２００２）。エピトープスプレッディングは、全身性自己免疫疾患に限定されない。それは、ヒトにおけるＩＤＤＭおよび多発性硬化症などのＴ細胞依存性臓器特異的疾患、ならびに様々なミエリンタンパク質を有するＥＡＥ誘導実験動物において報告されている。

エピトープスプレッディングは、同じ自己分子内の新しいエピトープ、ならびにこの同じ高分子複合体に会合しているタンパク質に存在するエピトープの後天的な認識を含む。エピトープスプレッディングは、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を測定することによって評価することができ、その方法は当技術分野で公知である。

したがって、いくつかの実施形態では、対象におけるエピトープスプレッディングを阻害または低減する方法は、有効量のナノキャリアを対象に投与することを含む。好ましい実施形態では、粒子製剤は、多発性硬化症を有する個体におけるエピトープスプレッディングを阻害する。
３．アレルギー
同様の方法を使用して、自己免疫刺激を目的のアレルゲンに置き換えてアレルギーを処置することができる。典型的には、粒子は、アレルギーまたはアレルギー反応を低減または阻害するのに有効な量で対象に投与される。

アレルギーは、その他の点では無害な物質に応答して起こる免疫系の異常な反応である。アレルギーは、医学的障害の最も一般的なものの１つである。６０００万人のアメリカ人、または５人に１人を超えるアメリカ人が何らかの形のアレルギーを患っていると推定されており、世界の残りの大部分の至るところで同様の割合である。アレルギーは、不登校の最大の単一の理由であり、職場での生産性の損失の主な原因である。

アレルギーは免疫反応の一種である。通常、免疫系は、抗体と呼ばれる特定のタンパク質を産生することによって、外来の微生物または粒子に応答する。これらの抗体は、外来粒子上の識別した分子または抗原に結合することができる。抗体と抗原との間のこの反応は、感染から身体を保護するように設計された一連の化学反応を引き起こす。時として、この同じ一連の反応は、花粉、埃、および動物のふけといった無害な日常的な物質によって引き起こされる。これが起こると、原因物質（アレルゲン）に対するアレルギーが発生する。

肥満細胞は、アレルギー反応における主要なプレイヤーの１つであり、アレルゲンに結合する免疫グロブリンＥ型（ＩｇＥ）と呼ばれる特定のタイプの抗体を捕捉して提示する。肥満細胞の内部には、顆粒と呼ばれる小さな化学物質が充填されたパケットがある。顆粒は、ヒスタミンなどの効能をもつ様々な化学物質を含有する。

免疫学者はアレルギー反応を２つの主なタイプ、すなわち、主にマスト細胞媒介性であり、アレルゲンと接触してから数分以内に起こる即時型過敏反応と、Ｔ細胞（白血球の一種）によって媒介され、曝露されてから数時間から数日後に起こる遅延型過敏反応とに分ける。

吸入または摂取されたアレルゲンは、通常、即時型過敏反応を引き起こす。アレルゲンは、肥満細胞の表面上のＩｇＥ抗体に結合し、肥満細胞は、それらの顆粒の内容物を、血管および神経細胞などの隣接細胞の方に吐き出す。ヒスタミンは、ヒスタミン受容体と呼ばれる特殊なタンパク質を介してこれらの他の細胞の表面に結合する。ヒスタミンと血管上の受容体との相互作用は、漏出の増加を引き起こし、液貯留、腫脹および充血の増加をもたらす。ヒスタミンはまた、痛覚受容器を刺激し、組織をより敏感かつ過敏にする。症状は接触後１時間から数時間続く。上気道および眼において、即時型過敏反応は、アレルギー性鼻炎に典型的な鼻水およびかゆみを伴う眼の充血を引き起こす。胃腸管では、これらの反応は腸内層の腫脹および過敏をもたらし、食物アレルギーに典型的な痙攣および下痢を引き起こす。循環に入るアレルゲンは、蕁麻疹、血管浮腫、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎を引き起こす場合がある。

皮膚上のアレルゲンは、通常、遅延型過敏反応を引き起こす。移動性Ｔ細胞がアレルゲンと接触し、より長い免疫応答を引き起こす。このタイプのアレルギー反応は、アレルゲンと接触してから数日間にわたって発症する場合があり、症状は１週間またはそれを超えて持続する場合がある。

アレルゲンは、気道、皮膚、消化管、および循環系という４つの主な経路を通って体内に入る。空中アレルゲンは、くしゃみ、鼻水、および花粉症（アレルギー性鼻炎）からくる目のかゆみ、充血を引き起こす。空中アレルゲンはまた、肺の内壁に影響を及ぼし、喘息または結膜炎（はやり目）を引き起こす場合がある。ゴキブリアレルゲンへの曝露は、喘息の発症に関連している。家庭のペットからの空中アレルゲンは、環境曝露のもうひとつの一般的な源である。食物中のアレルゲンは、唇および喉のかゆみや腫脹、痙攣、ならびに下痢を引き起こす場合がある。血流に吸収されると、それらは蕁麻疹（蕁麻疹）または皮膚、粘膜、臓器および脳の再発性非炎症性腫脹（血管浮腫）を含むより重篤な反応を引き起こす場合がある。いくつかの食物アレルゲンは、組織の腫脹、気道の収縮、および血圧の低下によって特徴付けられる生命を脅かす恐れがある症状であるアナフィラキシーを引き起こす場合がある。牛乳、卵、ナッツ、魚、および豆類（ピーナッツおよび大豆）などの食物に対するアレルギーが一般的である。果実および野菜に対するアレルギーが起こる場合もある。皮膚と接触すると、アレルゲンは、接触皮膚炎と呼ばれる発赤、かゆみ、および水疱形成を引き起こす場合がある。皮膚反応は、気道または消化管を通して導入されたアレルゲンからも起こり得る。この種の反応はアトピー性皮膚炎として知られている。皮膚炎は、アレルギー反応（ツタウルシなどによる）、または皮膚細胞に対する非免疫損傷を引き起こす刺激物（石鹸、寒気、化学薬品など）への曝露から生じ得る。昆虫の咬傷や刺傷または薬物投与に由来するアレルゲンの注入では、アレルゲンが血液循環に直接導入され得、この場合、系全体の応答（アナフィラキシーなど）、ならびに注射部位での腫脹および炎症からなる局所応答を引き起こす場合がある。

これらは、以下でより詳細に考察されるように、抗炎症薬の投与によって、または抗原に対する寛容を誘導することによって処置することができる。

４．糖尿病
糖尿病または真性糖尿病は、十分なインスリンを産生しない膵臓または産生されたインスリンに適切に応答しない身体の細胞のいずれかに起因する。真性糖尿病には３つの主な型がある。

１型糖尿病は、膵臓が十分なインスリンまたは活性インスリンを産生できないことに起因し、この形態は、以前は「インスリン依存性糖尿病」（ＩＤＤＭ）または「若年性糖尿病」と呼ばれていた。

２型糖尿病は、細胞がインスリンに適切に応答できない症状であるインスリン抵抗性から始まる。疾患が進行するにつれて、インスリンの不足も発症し得、この形態は以前は「インスリン非依存性糖尿病」（ＮＩＤＤＭ）または「成人発症糖尿病」と呼ばれていた。

第３の主要形態である妊娠糖尿病は、糖尿病の既往歴のない妊婦が高い血糖値を発症する場合に起こる。

１型糖尿病はインスリン注射で管理しなければならない。２型糖尿病は、インスリンを含む薬物または含まない薬物で処置され得る。妊娠糖尿病は、通常、赤ん坊の誕生後に解消する。

１型糖尿病患者は、生き続けるためにインスリン療法を必要とする。２型糖尿病または妊娠糖尿病を有する多くの人々もまた、インスリン療法を必要とする。Ｔ２Ｄを処置するために使用される薬剤としては、２０種類を超える注射可能なインスリン、および経口投与される薬物、例えば、メグリチニド、スルホニルウレア、メトホルミン、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、アカルボース、プラムリンチド、エキセナチド、リラグルチド、長時間作用型エキセナチド、アルビグルチド、ズラグルチド、およびジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤（シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン）が挙げられる。これらの薬剤はまとめて「抗糖尿病薬」と呼ばれる。

本組成物は、膵臓の炎症（膵炎）、肝臓の炎症（肝炎）、または結腸の炎症（ＩＢＤ）を処置するために使用することができる。治療薬および／またはイメージング剤をカプセル化するＰＢＡナノ粒子は、炎症組織の有窓脈管構造を通過することができ、それらのサイズのおかげで、生物製剤または小分子薬物（１～１０ｎｍ）と比べて炎症組織内でより長く保持される。それらはまた、抗原提示細胞（マクロファージおよび樹状細胞など）によって効果的に内在化され、ＰＢＡナノ粒子を炎症組織および免疫系の細胞への薬剤送達に適したものにする。

膵炎の２つの形態である急性膵炎および慢性膵炎は、ＰＢＡ組成物の経口投与で処置することができる。

急性膵炎は、突発性の炎症であり、短時間持続する。それは、軽度の不快感から、生命を脅かす重度の病気へと多岐にわたる。重篤なケースでは、急性膵炎は、腺への出血、重篤な組織損傷、感染および嚢胞形成をもたらし得る。重度の膵炎は、心臓、肺、および腎臓などの他の重要な臓器にも害を及ぼし得る。

慢性膵炎は、膵臓の長期にわたる炎症である。これは、ほとんどの場合、急性膵炎のエピソードの後に起こる。重度の飲酒はもうひとつの大きな原因である。アルコールの大量摂取による膵臓への損傷は、長年にわたって症状を引き起こさないかもしれないが、その後、対象は、重度の膵炎の症状を突然発症する場合がある。急性膵炎を有する対象は、病院でＩＶ液および鎮痛薬で処置される。慢性膵炎は、処置が困難な場合がある。それは疼痛緩和および栄養改善を伴う。対象には、一般に、膵臓酵素またはインスリンが与えられる。

肝臓の炎症（肝炎）は、臓器の組織中の炎症細胞の存在を特徴とする。肝炎は、症状が限られているかまたは全くない状態で起こり得るが、しばしば黄疸（皮膚、粘膜、および結膜の黄色化）、食欲不振、および倦怠感をもたらす。肝炎は、６ヶ月未満持続する場合は急性であり、より長く持続する場合は慢性である。

急性肝炎は、自己限定的（自然治癒）である場合、慢性肝炎に進行する場合、またはまれに急性肝不全を引き起こす場合がある。慢性肝炎は、症状がない場合、または線維症（肝臓の瘢痕化）および肝硬変（慢性肝不全）に経時的に進行する場合がある。肝臓の肝硬変は、肝細胞癌を発症するリスクを高める。

ウイルス性肝炎は、肝臓炎症の最も一般的な原因である。他の原因としては、自己免疫疾患および毒性物質（特にアルコール）、特定の薬物（パラセタモールなど）、いくつかの工業用有機溶媒、および植物の摂取が挙げられる。テノホビルおよびエンテカビルなどの抗レトロウイルス薬は、慢性Ｂ型肝炎の処置に使用される。

５．炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管の慢性または反復性の免疫応答および炎症を伴う状態を表す広義の用語である。２つの最も一般的な炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎およびクローン病である。炎症は、クローン病では消化管全体に影響を及ぼし、潰瘍性大腸炎では大腸のみに影響を及ぼす。両方の病気は、身体の免疫系に対する異常な応答を特徴とする。

クローン病は、症状を引き起こす免疫系の異常な炎症反応を抑制するように設計された薬物で処置される。炎症の抑制は、発熱、下痢、および疼痛などの一般的な症状の緩和、ならびに腸組織の治癒をもたらす。併用療法は、免疫調節薬に生物製剤を加えることを含み得る。全ての療法と同様に、併用療法にはリスクおよび利益がある。薬物療法を免疫調節療法と組み合わせることにより、ＩＢＤ処置の有効性を高めることができる。

ＩＢＤの症状を処置するために使用される薬剤の例としては、５－アミノサリチル酸（５－ＡＳＡ）を含有するスルファサラジン、メサラミン、オルサラジンおよびバルサラジド、コルチコステロイド、免疫調節薬、抗生物質および生物学的療法が挙げられるが、これらに限定されない。

６．抗原の送達および寛容の誘導
寛容を誘導する方法が提供される。本方法は、一般に、免疫抑制薬および／または抗原を、開示される粒子を使用して肝臓に標的化することができ、これは肝臓樹状細胞（ＤＣ）および／または肝臓内皮細胞（ＥＣ）によって取り込まれるという原理に基づく。肝臓は、それらの薬剤に対する寛容を誘導するための標的化剤の目的の臓器である。目的の抗原を負荷し、かつ／または免疫抑制剤と組み合わせた組成物は、目的の抗原に対する末梢寛容を促進すると考えられる。標的化は、受動的（すなわち、肝臓における保持）または能動的（すなわち、肝臓の特定の細胞を標的とする）であり得る。したがって、肝臓標的化部分は必要に応じたものである。

抗原および／または免疫抑制薬を担持する粒子は、寛容の開始のために同じ肝臓樹状細胞または肝臓内皮細胞に空間的に局在することが好ましい。したがって、１つのセットに抗原を担持し、別のセットに免疫抑制剤を担持して、一緒に注射される異なる粒子が考えられるが、両方の薬剤を担持して、肝臓樹状細胞または内皮細胞を標的とするナノ粒子が好ましい。

好ましいストラテジーは、一般に、肝臓に保持され、肝臓抗原提示細胞または内皮細胞によって取り込まれる抗原および免疫抑制剤を含む粒子の投与を含む。次いで、寛容原性樹状細胞が全身を循環して、カプセル化された抗原に対する寛容（末梢寛容）を誘導する。生きた抗原提示細胞として機能することができる例示的な細胞としては、肝臓樹状細胞（ＤＣ）、肝臓内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞、肝細胞、および肝臓に抗原を提示する他の細胞が挙げられる。

肝臓ＤＣまたはＥＣは局所リンパ節（腹腔）に排出される。それらは、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導する寛容原性プログラムを獲得する。ＡＰＣはまた、遊走することなく類洞内のＴ細胞に抗原を提示することができる。さらに、抗原は、それが肝臓またはリンパ節にある間、またはそれらの間を遊走している間であってもＤＣによってプロセシングされ得る。一般に、肝細胞における担体の細胞内蓄積、輸送または保持は、寛容誘導のために重要である。

抗原提示細胞はまた、抗炎症マーカーまたは寛容原性表現型の開始を示すマーカーを発現する。Ｔｒｅｇはリンパ節から循環へと遊走し、系全体の寛容を誘導する。

好ましいストラテジーは、以下の５つのステップにまとめることができる。
１）肝臓にホーミング
２）肝臓における樹状細胞および／またはＡＰＣによる取り込み
３）局所リンパ管への排出
４）制御性Ｔ細胞の増殖
５）血流中への遊走および末梢寛容の開始

本明細書に開示される方法は、一般に、それを必要とする対象に、最も典型的には医薬組成物の形で開示される粒子の有効量を投与して、目的の抗原に対する寛容を誘導または増加させることを含む。特定の実施形態では、本組成物は、制御性Ｔ細胞の数または活性を増加させる。したがって、肝樹状細胞および／または肝内皮細胞を誘導し、寛容原性表現型を獲得するか、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導するか、またはそれらの組み合わせを行うのに有効な量で本組成物中に存在する寛容原性抗原および／または免疫抑制剤を含む粒子を含む医薬組成物、ならびにその使用方法が提供される。

堅牢な寛容は、抗原特異的Ｔｒｅｇ、ポリクローナルＴｒｅｇ、Ｔｒ１細胞、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４を発現する他のＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞の欠失／アネルギー、さらにはＢｒｅｇの誘導によって達成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本組成物は、所望の抗原、例えば、粒子によって送達される抗原に対する免疫原性を低減または防止する寛容原性プログラムを獲得するのに有効な量で投与される。

投与は、既存の状態または疾患の処置に限定されず、個体においてそのような疾患を発症するリスクを予防または低下させるために、すなわち予防的使用のために使用することもできる。本組成物は、既存の抗原または新しい抗原に対する対象の免疫寛容を開始または増強するために使用することができる予防ワクチンもしくは療法、または治療ワクチンもしくは療法に利用することができる。

予防的、治療的または脱感作された免疫応答の所望の転帰は、当技術分野で周知の原理に従って、疾患に応じて異なり得る。同様に、免疫寛容は、疾患を完全に処置し得るか、症状を緩和し得るか、または疾患に対する全体的な処置的介入における１つの側面であり得る。

予防的ワクチン接種の考えられる候補としては、特定の自己抗原に対する自己免疫を発症するリスクが高い個体、および組換えタンパク質療法（ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ）を受けている患者が挙げられる。

Ｃ．イメージング
他の実施形態では、本医薬組成物を使用する方法は、標的臓器全体、または標的臓器内の別個の微小環境、例えば、炎症ポケット、漏出性脈管構造、または新生物を非侵襲的にイメージングする方法を含み得る。これらの実施形態では、本方法は、有効量のイメージング剤をカプセル化する非標的化ＰＢＡナノ粒子を含有する医薬組成物の経口投薬単位を、それを必要とする対象に投与すること、有効量のイメージング剤を膵臓、肝臓、または結腸などの標的組織に送達すること、必要に応じて、標的組織においてナノ粒子から有効量のイメージング剤を放出することを含み、これにより、非侵襲的イメージングによる標的組織または標的組織内の別個の微小環境の検出が向上する。

ＰＢＡナノ粒子および／またはその中の薬剤を検出するのに適したイメージングモダリティとしては、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、超音波イメージング（ＵＳ）および光学イメージングが挙げられる。好適なイメージング剤（トレーサー）としては、放射性核種標識小分子、例えば、Ｆ－１８フルオロデオキシグルコース、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、ガドリニウム、ユウロピウム、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）およびそれらの誘導体、ガス、ならびに蛍光トレーサーが挙げられる。それぞれのトレーサーを用いるそのような適切なモダリティは、当技術分野で公知である（Ｂａｕｍら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２（５）４３７－４４７（２０１２））。

Ｄ．併用療法および診断
他の実施形態では、疾患または状態を予防、抑制または処置する方法、および標的臓器または組織を非侵襲的にイメージングする方法が組み合わされる。この実施形態では、本医薬組成物は、治療薬および診断／イメージング剤の両方をカプセル化する非標的化ＰＢＡナノ粒子を含有する。この方法は、標的組織における疾患の予防、抑制、または処置、および標的組織のイメージングを必要とする対象に、有効量の１またはそれを超える活性剤と有効量のイメージング剤とをカプセル化する非標的化ＰＢＡナノ粒子を含有する医薬組成物の経口投薬単位を投与すること、膵臓、肝臓、または結腸などの標的組織にＰＢＡナノ粒子を送達すること、標的組織でＰＢＡナノ粒子から有効量の１またはそれを超える薬剤と、必要に応じて有効量のイメージング剤とを放出して、疾患の予防、抑制または処置と、非侵襲的イメージングを介した標的組織または標的組織内の別個の微小環境の検出の向上をもたらすこと、を含み得る。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。

本実施例は、ｐＵＤＣＡが、保護的輸送、認識の向上、代謝および抗炎症性免疫シグナルを含む並行機構を介して働くことを示す。ｐＵＤＣＡ ＮＰの製剤化は、その確立された医学的利益で周知のモノマーＵＤＣＡから開始し、その後重合し、次いでＮＰに製剤化した。重合および製剤化の工程は、以下の機序研究で検証されるように、モノマー単独で達成し得るもの、または粒子の表面上のモノマーが達成し得るものをも超えて利益を拡大した。ｐＵＤＣＡの有効性は、複数の機序によるものである。第１には、カプセル化された薬剤の薬物動態および生体内分布の改善を促進する保護的輸送である。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。

実施例１：ポリマーＢＡは、経口摂取可能な治療用ナノ粒子の製剤化を促進するだけでなく、広範囲の生物活性も提供する
ナノ粒子が広範囲の活性を提供する理由は２つある。
１）ナノ粒子は本質的に保護的であり、腸透過を増加させ、ひいては関連する薬剤の全身バイオアベイラビリティを増加させる。
２）ナノ粒子は、ＢＡ受容体の結合を介してグルコース代謝および免疫を調節することができ、ひいてはエフェクター治療系として機能することができるシグナル伝達機能を有する。

重合の理論的根拠は以下のことに基づいていた。１）重合はインスリンを含む広範囲の目的の治療薬のカプセル化および放出のためのストラテジーを促進する。換言すれば、本質的に不安定であるモノマーＢＡミセルとは対照的に、固体の安定な生分解性ポリマー担体。２）そのようにポリマーＮＰを製造することは、ポリマーが水性環境で分解可能である場合に、カプセル化された薬剤の持続放出を可能にする。３）堅牢な担体としてのポリマーＢＡ系は、例えば、別のタイプのポリマーＮＰの表面にハイブリダイズしたＢＡモノマーとは異なる方法で（近接しかつ高密度に）ＢＡを提示する。さらに、ＢＡモノマーが固有の治療効果を有する場合、このエフェクター機能は重合によって増幅され、そのバイオアベイラビリティは、経口摂取後に表面から容易に放出され得る粒子上のＢＡモノマーとは対照的に、より長く持続する。さらに、薬物放出期間にわたるＢＡの持続的な利用可能性は、相加的活性よりもコンビナトリアルな活性にとって望ましい要素であり得る。４）低ｐＨでのイオン化ポテンシャルおよびプロトン化に起因するＢＡのｐＨ刺激応答は、その受容体への結合について多価性でＢＡを増強しながら胃の保護を提供する。この多価応答は、イオン化の程度を増幅するだけでなく、粒子が胃から腸内環境に移行する際に、低ｐＨ保護および高ｐＨ脱保護の応答時間を動態学的に増幅する。５）ポリマーの多価性は、ＢＡ受容体に対する高い結合アビディティをもたらし、重合時に弱いＢＡアゴニストをより強い形態に変換する。より強力なアゴニストは、より低い用量でより大きな受容体活性化および治療的シグナル伝達の機能を可能にする。

ＵＤＣＡは、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性を低下させるための使用について確立された記録を有するが、この使用は、ドーズデンスである（典型的には、マウスにおいて４０～４５０ｍｇ／ｋｇおよび経口で２～２０週間）。ＵＤＣＡは主にインスリン感受性に影響を及ぼすため、Ｔ１Ｄで試験されることはまれである。ｐＵＤＣＡの機能的影響は、モノマーがそれ自体で達成することができるものを超えるそのエフェクター機能の増幅に加えて、カプセル化された薬剤（インスリンなど）の輸送の改善を超えて広がる。ＵＤＣＡは、細胞外Ｔａｋｅｄａ Ｇタンパク質共役受容体（ＴＧＲ５）に安定に結合し、核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）およびプロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）などのシグナルキナーゼを調節することができる場合、プロテインキナーゼカスケード細胞活性化を誘発し、グルコースおよびエネルギーホメオスタシスを調節することができる。ＴＧＲ５の活性化はまた、脂肪組織におけるエネルギー消費の増加と共に、抗炎症性免疫、抗線維化活性、腸内分泌Ｌ細胞からのＧＬＰ－１の誘導および分泌をもたらす。ｐＵＤＣＡは、そのモノマー対応物であるＵＤＣＡが本質的に弱いＴＧＲ５アゴニストであるため、用量を有意に低下させるだけでなく、ＵＤＣＡ機能の範囲を増幅し得る。

インスリン輸送、生体内分布および薬物動態の改善の観点から、ＢＡは天然乳化剤である。したがって、生分解性ポリマーＢＡは、体内の脂質および脂肪の可溶化においてさらに良好であろう。一般に、ＢＡは、脂質とミセルへの自己集合によって消化助剤として機能する。経口摂取された脂肪物質のより良好な分子生体内分布および血液循環を可能にする。胆汁および膵臓消化液は、十二指腸に分泌することが知られており、胆汁は、具体的には、回腸から門脈循環を通って肝臓に戻り、次いで、摂取された高脂肪食のさらなる消化のために再び腸に戻る。腸から胆管およびその後方へのＢＡのこの循環作用は、「腸肝循環」と呼ばれるプロセスである。ポリマーＢＡ ＮＰの結合が増強されるため、生体内分布が影響を受け、循環寿命が長くなる。

方法および材料
本実施例で用いた方法は以下の通りである。

試薬および抗体。全ての胆汁酸、パラ－トルエンスルホン酸、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ペプシン、トリアムテレン、リポ多糖（ＬＰＳ）、およびオボアルブミン（ＯＶＡ）は、ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。シクロホスファミド（ＣＹ）、無水塩化メチレン、無水ピリジン、ジイソプロピルカルボジイミド、および無水メタノールは、ＡＣＲＯＳから購入した。Ｄｕｒｅｃｔ製のポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、固有粘度０．５５～０．７５ｄＬ／ｇ、カルボキシル末端）を対照ポリマーとして使用した。ラパマイシン（ＲＡＰＡ、ＬＣＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウスインスリン（ＩＮＳ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’、３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（ＤＩＲ、Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ）、およびクマリン６（ＡＣＲＯＳ）をＮＰにカプセル化した。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ ３０ＤはＥｖｏｎｉｋから入手し、ＣｐＧはＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。ＣＤ８（ＡＰＣ）、ＣＤ４４（ＰＥ）、ＣＤ４（ＡＰＣ）、ＣＤ２５（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ－Ｃｙ７）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）及びＣＤ２０６（ＦＩＴＣ）に対する抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手した。Ｆｏｘｐ３（ＰＥ）およびＣＤ８６は、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。組換えヒトＧＰＣＲ ＴＧＲ５タンパク質、Ａｔｔｏ５６５コンジュゲートＴＧＲ５抗体、およびブロッキング緩衝液をＡｂｃａｍから入手し、競合結合実験に使用した。

細胞。ヒト結腸腺がんＣａｃｏ－２細胞はＡＴＣＣから購入した。この細胞を、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、抗生物質（１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。頸椎脱臼後のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６またはＲａｇ２／ＯＴＩＩ）から長骨および脾臓を採取した。長骨から骨髄を溶出し、１０％ＦＢＳを補充したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地を使用して脾臓を漬け込んだ。試料中の赤血球（ＲＢＣ）を、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を用いて溶解した。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）培地で培養した。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩに５×１０^５細胞／ｍＬでプレーティングし、５日間培養する従来の増殖プロトコルを使用して生成した。５日目に、非接着性細胞を回収し、ＧＭ－ＣＳＦ培地中でさらに２日間培養した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６の脾細胞集団からＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。全ての細胞を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で培養した。

ＴＧＲ５受容体の活性化によって促進される膵臓β細胞からのインスリン産生を試験するために、マウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６、ＡＴＣＣ）細胞を、３ｍＭのグルコースを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２時間インキュベートし、次いで、２５ｍＭのグルコース及びＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ又はｐＵＤＣＡ ＮＰ（４０μｇ／ｍＬ）を含むＨＢＳＳ中で３０分間インキュベートした。インスリンの濃度を、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＩｎｓｕｌｉｎＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ）を使用して測定した。同じ実験を、ＴＧＲ５アンタゴニスト、対照としてのトリアムテレン（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で行って、ＴＧＲ５活性化のない細胞からの固有のインスリン産生を区別し、結果を正規化するために使用した。ｐＵＤＣＡから放出されたインスリンの生物活性を、インスリン受容体（ＣＨＯ ＩＮＳＲ細胞、ＡＴＣＣ）を発現する遺伝子をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞を用いて測定した。３時間または２４時間でｐＵＤＣＡから放出されたインスリンをＣＨＯ ＩＮＳＲ細胞と１時間インキュベートし、リン酸化プロテインキナーゼＢ（ｐＡｋｔ）のレベルをＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）によって測定した。新鮮なインスリンまたは変性インスリンと共にインキュベートしたＣＨＯ細胞からのｐＡｋｔ産生を比較して、生物活性パーセントを計算した。

動物。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６、６～８週齢、雌）をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｉｎｃ．から入手した。ＮＯＤマウス（ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ、８週齢、雌）およびヌードマウス（無胸腺ヌード、ｎｕ／ｎｕ、７週齢、雌）はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから供給された。マウスを、陽圧封じ込めラックの中に入れられたオートクレーブされたマイクロアイソレータケージに収容した。オサボーバリアー島(Ossabaw barrier island)に由来するオサボーブタ（１７ヶ月齢、４２ｋｇ）を使用した。すべての実験およびメンテナンスは、イェール大学施設内動物管理使用委員会から承認されたプロトコルに従って実施した。

ポリマー合成およびナノ粒子（ＮＰ）製剤。図１Ａ～図１Ｅに示すように、胆汁酸モノマーの炭素２４基（図２Ａ～図２Ｅ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、およびウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）をそれぞれエステル化することによって、ポリ（胆汁酸）（ｐＢＡ）を合成した。ＢＡ（５．４ｍｍｏｌ）、パラトルエンスルホン酸（０．６５２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（０．６５２ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレンと無水ピリジンを５：１で混合した溶媒混合物６０ｍＬに添加し、４０℃で撹拌して透明な溶液を得た。反応混合物に、６．９２ｍｍｏｌのジイソプロピルカルボジイミドを添加し、反応を窒素雰囲気下で２時間進行させた。ポリエステル生成物ｐＢＡを、遠心分離（遠心分離機５８１０Ｒ、エッペンドルフ）によって回収した４００ｍＬの冷無水メタノール中に沈殿させ、乾燥させて白色粉末を保持した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって重合を確認した。ＵＤＣＡおよびポリ（ウルソデオキシコール酸）（ｐＵＤＣＡ）の^１Ｈおよび２Ｄ－（ＣＯＳＹ、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＮＭＲ分光計（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって、３ｍｍコールドプローブを用いて６００ＭＨｚでまたは４００ＭＨｚで記録し、^１３Ｃ ＮＭＲデータを１００ＭＨｚ磁場で測定した。クロロホルム－ｄ_１（９９．９６％、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、全てのＮＭＲ実験の重水素化ＮＭＲ溶媒および溶媒参照シグナル（δ_Ｈ７．２５、δ_Ｃ７６．９８）として使用した。ｐＢＡ（クロロホルム中１０ｍｇ／ｍＬ）の分子量（ＭＷ）は、モデル１５１５アイソクラティックポンプ、７１７ｐｌｕｓオートサンプラー、およびＷａｔｅｒｓ ＳｔｙｒａｇｅｌカラムＨＴ６ＥおよびＨＴ２を直列に備えた２４１４屈折率（ＲＩ）検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用したＧＰＣによって評価した。クロロホルムを移動相として１ｍＬ／分の流速で利用し、カラムおよびＲＩ検出器の両方を４０℃に維持した。ＭＷ特性は、狭い多分散性ポリスチレン標準（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から作成した較正曲線に対して決定した。Ｅｍｐｏｗｅｒ ＩＩ ＧＰＣソフトウェアを、ＧＰＣ機器の実行およびその後のクロマトグラフィー分析に使用した。色素（ＤＩＲもしくはクマリン６）、薬物（ＲＡＰＡもしくはＩＮＳ）もしくは酸化鉄をカプセル化したｐＢＡもしくはＰＬＧＡまたは混合物（５０／５０、ｗ/ｗ）ＮＰを、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルジョン技術を用いて製剤化した（図２Ｃ～図２Ｅ）。ポリマーまたは混合物（１００ｍｇ）を、ＤＩＲ（１ｍｇ）、クマリン６（１０ｍｇ）、ＲＡＰＡ（１０ｍｇ）または酸化鉄（１ｍｇ）を含有する２ｍＬのクロロホルムに溶解した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１００μＬ）またはＩＮＳ（１０μｇ）を含有するＰＢＳをボルテックスしながらクロロホルムポリマー溶液に滴下して添加し、ＩＫＡ Ｔ２５ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ（ＩＫＡ）を用いてホモジナイズした。次いで、この分散剤相を５％ＰＶＡの連続相に滴下して添加し、ホモジナイズした。次いで、混合物を２００ｍＬの０．２％ＰＶＡに滴下して添加し、２時間撹拌したままにして溶媒を蒸発させた。４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＮＰを回収し、次いで脱イオン水で３回洗浄した。粒子を凍結乾燥し、－２０℃で保存した。ＮＰの流体力学的直径および表面電荷は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒによって測定した。ＮＰの分散物を０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通してキュベットに濾過した後、測定した。動的光散乱は、５３２ｎｍの波長における１７３°の検出角での後方散乱によって測定し、流体力学的半径はストークス－アインシュタイン方程式を使用して計算した。ＮＰの形態は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４８００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＳＥＭ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ）によって観察した。エタノール（２μＬ）中のＮＰの分散物をウェハ基板上に置き、室温で乾燥させた。この試料をアルミニウム製試料ホルダに取り付けた後、金スパッタを行った。ＮＰは、作動距離４ｍｍで１５ｋＶの加速電圧で観察した。ＤＩＲおよびインスリンの放出を胃模倣媒体で測定した。ＮＰを、ペプシン（１０ｍｇ／ｍＬ）の存在下、３７℃で媒体（クエン酸緩衝溶液、ｐＨ２．０）に分散させた。各時点でＮＰを遠心分離し、上清を回収して、プレートリーダー（λ_ｅｘ７５０ｎｍ、λ_ｅｍ７９０ｎｍ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて粒子から放出されたＤＩＲの量を測定した。インスリン放出をＢＣＡアッセイによって定量化した。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）でコーティングされたＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ＠ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標））を、ＰＬＧＡを５重量％のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）溶液に分散させ、遠心分離することによって調製した。

ヒト腸上皮細胞層を通るＮＰの透過性
Ｃａｃｏ－２細胞を０．４μｍ細孔トランスウェルフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に７×１０^４細胞／ｃｍ^２で播種した。細胞をコンフルエントに達するまで成長させ、３７℃および５％ＣＯ_２で約３０日間成熟させた。透過性試験を行う前に、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、上皮電圧抵抗計（epithelial voltohmmeter）（ＥＶＯＭ（商標）上皮電圧／抵抗計、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。３００Ω・ｃｍ^２を超えるＴＥＥＲ値を有するコンフルエントな細胞層を透過性試験および細胞傷害試験に使用した。２５ｍＭのグルコースを含有するフェノールを含まないＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１ｍｇ／ｍＬのＤＩＲ負荷ＮＰの分散物または同等濃度の可溶性ＤＩＲを含有する溶液を調製し、トランスウェルフィルターの頂端チャンバーに加えた。基底外側チャンバー中のＨＢＳＳをサンプリングし、各時点で新鮮な培地と交換した。基底外側チャンバーへの累積的なＤＩＲ輸送速度は、フラックス（ｄＱ／ｄｔ）を与えた。見かけの透過性（Ｐ_ａｐｐ）は（１）により算出した。

式中、Ｃ_０は頂端チャンバー内の全ＤＩＲの初期濃度であり、Ａはトランスウェルフィルターの面積である。

ＴＧＲ５結合試験。Ａｔｔｏ５６５コンジュゲートＴＧＲ５抗体で飽和したマクロファージに対するｐＵＤＣＡ、ＵＤＣＡおよびＰＬＧＡ ＮＰの競合的結合を行った。９６ウェルプレート中の細胞（１０^５細胞／ウェル）を、アクセス量（４μｇ／ｍＬ）の蛍光標識ＴＧＲ５抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、続いて異なる濃度のＮＰに曝露した。インキュベーションの２時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、プレートリーダーを使用して細胞上に結合したＡｔｔｏ５６５－ＴＧＲ５抗体の数を測定した。特異的および非特異的ｋ_ｄは、部位飽和全結合方程式Ｙ＝Ｂ_ｍａｘ×Ｘ／（ｋ_ｄ＋Ｘ）＋ＮＳ×Ｘ（式中、Ｂ_ｍａｘは最大特異的結合であり、ｋ_ｄは平衡解離定数であり、ＮＳは非特異的結合の勾配である）を用いた非線形フィッティングによって計算した。膵臓β細胞（１０^６細胞／ウェル）上のＴＧＲ５に対する結合価依存性ＮＰ結合を調べるために、ＵＤＣＡモノマーをビオチン化し、アビジン化ＰＬＧＡ ＮＰ表面にコンジュゲートした。２ｍＬのクロロホルム中のＰＬＧＡ（１００ｍｇ）を、ＰＢＳ中のアビジン－パルミテート（１０ｍｇ／２ｍＬ）と５％ＰＶＡ２ｍＬとの混合物に滴下して添加し、ホモジナイズした。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いてＵＤＣＡをビオチンと結合させた後（１：１モル比）、ビオチン化ＵＤＣＡ（０、５０、２５０、１０００ｎｇ／ｍＬ）をアビジン化ＰＬＧＡ ＮＰ（５ｍｇ／ｍＬ）に固定化した。プレーティングしたＴＧＲ５を調製するために、組換えＴＧＲ５受容体（５μｇ／ｍＬ）をプレート上に一晩コーティングし、非特異的結合部位をタンパク質ブロッキング緩衝液を用いてブロッキングした。プレート上のＴＧＲ５受容体を、アクセス量（４μｇ／ｍＬ）の蛍光標識ＴＧＲ５抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、続いて異なる濃度のＮＰに曝露した。インキュベーションの２時間後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、受容体に結合したＡｔｔｏ５６５－ＴＧＲ５抗体の数をプレートリーダーを用いて測定した。

データを以下の競合阻害式に当てはめ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用）、これにより、標識抗体の５０％が競合して除去されるｐＵＤＣＡ（ＥＣ_５０）およびその親和定数（Ｋ_ｉ）の推定値が得られた。

式中、
Ｆ＝標識ＴＧＲ５抗体との競合による蛍光変化
［ｐＵＤＣＡ］＝ｐＵＤＣＡの濃度
Ｆ_{Ｉｎｉｔｉａｌ}＝蛍光の上のプラトーまたは初期蛍光
Ｆ_{Ｆｉｎａｌ}＝蛍光の下のプラトーまたは最終蛍光
ＥＣ_５０＝全蛍光を５０％低下させるｐＵＤＣＡの濃度
Ｋ_ｉ＝ｐＵＤＣＡ親和性定数
Ｃ_Ａｎｔｉ＝標識抗ＴＧＲ５抗体の濃度
Ｋ_{Ｄ，Ａｎｔｉ}＝ナノモル範囲で推定されたＴＧＲ５受容体に対する標識抗ＴＧＲ５抗体の親和定数

ＵＤＣＡの分子直径と同等の厚さのシェルは、直径３５０ｎｍのｐＵＤＣＡ粒子上に約２０００個のＵＤＣＡモノマーを組み込むことができると推定された。

ＮＰの細胞エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス速度の定量化
ＢＭＭを９６ウェルプレート（１０^５細胞／ウェル）にプレーティングし、ＤＩＲ負荷ｐＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ、およびＰＬＧＡ／ｐＵＤＣＡブレンドＮＰ（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加した。細胞を３７℃で１、３、および６時間インキュベートし、プレートリーダーを使用してＮＰのエンドサイトーシスを測定した。細胞を洗浄し、新しい培地と交換した後、ＢＭＭから培地への放出されたＤＩＲ標識ＮＰを経時的に測定することによって、ＮＰのエキソサイトーシスを３７℃または４℃でモニタリングした。

平衡エンドサイトーシス－エキソサイトーシス反応は、以下のように単純化することができる。

［式中、［Ｐ］＝培地中の粒子の濃度（粒子数／ｍＬ）
［Ｃ］＝培地中の細胞の濃度（細胞数／ｍＬ）
［ＰＣ］＝細胞に会合した粒子の濃度（粒子－細胞数／ｍＬ）
ｋ_ｅｘｏ＝エキソサイトーシス速度（ｔ^－１）
ｋ_ｅｎｄｏ＝エンドサイトーシス速度（（［Ｐ］・ｔ）^－１）］
次いで、

エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのプロセスを報告するシグナルに関して、これは各プロセス［Ｓ］に関連する蛍光シグナルである。

この微分方程式は、最大取込みに対する取込みなしの２つの極端な限界の間の解を有する。

Ｓ_０＝任意の開始時間ｔ_０における信号

ｋｅｎｄｏおよびｋｅｘｏに関するこの分析およびフィッティングは、２つのプロットを使用して行われる。
エキソサイトーシス相

式中、Ｓｔは任意の時間（ｔ）における信号であり、
Ｓ０は任意の時間（ｔ_０）の信号である

会合相
会合相は、以下の２つのプロットに関して分析される。
Ｓに対するｄＳ／ｄｔは

を与え、
上で述べたように、ｔに対するＬｎ（ｄＳ／ｄｔ）は、

を与える。

仮定：この分析では、エキソサイトーシス後の粒子の再取り込みは考慮されていない。

フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ。ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを、ＣＹ誘導マウスに対するＣＹ処置の３日後および５日後に取得した。自然発症Ｔ１Ｄ動物モデルの場合、最後のＮＰ用量後１日目にＴ細胞を採取した。いずれの場合も、膵臓リンパ節を採取し、４０μｍセルストレーナーを用いて処理した。細胞表面マーカーを、４℃で３０分間インキュベートすることによって、ＣＤ８（ＡＰＣ）、ＣＤ４４（ＰＥ）、ＣＤ４（ＡＰＣ）およびＣＤ２５（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）に対する蛍光抗体で確認した。次いで、細胞を固定し、透過処理し、Ｆｏｘｐ３染色キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦｏｘｐ３（ＰＥ）について染色した。最終洗浄後、試料を直ちにＬＳＲ－ＩＩマルチカラーフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して分析した。抗原特異的Ｔ細胞応答を調べるために、ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋細胞をＯＴＩＩ共培養アッセイで使用した。ＢＭＤＣ（２．５×１０^４細胞／ウェル、９６ウェルプレート）をｐＵＤＣＡ ＮＰで２４時間前処理し、洗浄し、次いでＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＯＶＡ（２０μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激し、引き続いてＯＴＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０^４細胞／ウェル、９６ウェルプレート）と３日間共培養した。次いで、細胞増殖およびサイトカイン産生を定量化した。

ＢＭＭ（１０^５細胞／ウェル、９６ウェルプレート）をｐＵＤＣＡ ＮＰ（５０μｇ／ｍＬ）、ＵＤＣＡモノマー（５０μｇ／ｍＬ）、ＰＬＧＡ（５０μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳと共に４時間インキュベートし、ＣｐＧ（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した。２０時間後、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＣＣＬ１の読み取りのために培地上清を回収した。細胞をＦ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７）、ＣＤ８６（ＰＥ）、およびＣＤ２０６（ＦＩＴＣ）について染色した。緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で３回洗浄した後、試料を２％パラホルムアルデヒドで固定し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴマルチカラーフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実行した。ＣＤ１１ｃ－Ｆ４／８０＋ＮＰ＋を、色素負荷粒子を用いたマクロファージのＮＰ追跡に使用した。ＮＰ＋の表示は、負荷された色素の蛍光を介した粒子の読み出しを指す。マウスを４時間絶食させ、経口胃管栄養（５００ｍｇ／ｋｇ、２５０μＬ）によって標識ｐＵＤＣＡ ＮＰで処置した。１日後、膵臓、肝臓、肺および脾臓を採取し、ホモジナイザーを用い、４０μｍセルストレーナーおよびプランジャーを用いて細胞を破片から分離するために穏やかに処理した。細胞表面マーカーを、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）およびＣＤ１１ｃ（ＰＥ－Ｃｙ７）に対する蛍光抗体で染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴマルチカラーフローサイトメーターによって測定した。すべての抗体をフローサイトメトリーのために１：５００に希釈し、サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＩＦＮγ）をＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。

生体内分布および組織学。Ｂ６マウス、ＮＯＤマウスまたはヌードマウスを４時間絶食させ、経口胃管栄養（５０、１００または５００ｍｇ／ｋｇ、２５０μＬ）によって、ＤＩＲまたはクマリン６カプセル化ＮＰで処置した。遊離ＤＩＲまたはクマリン６（１％Ｔｗｅｅｎ２０で可溶化）は対照としての役割をはたした。マウスを胃管栄養後、４、８、１２または２４時間の時点で屠殺し、Ｂｒｕｋｅｒ分子イメージング機器（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．）を使用してエクスビボで臓器をスキャンして蛍光強度を測定した。蛍光データを一成分指数関数的減衰モデル：Ｙ＝Ｙ_ｆ＋（Ｙ_ｏ－ｅ^－ｋｔ）にフィッティングした。ｐＵＤＣＡ、ＰＬＧＡまたは混合物（５０：５０、ｗ/ｗ）によって製剤化されたＤＩＲ負荷ＮＰもまた、それらの生体内分布を遊離色素と比較するために、尾静脈注射によってマウスに静脈内（ＩＶ）投与した（１００ｍｇ／ｋｇ、５０μＬ）。マクロファージ枯渇キット（Ｃｌｏｄｒｏｓｏｍｅ（登録商標）、Ｅｎｃａｐｓｕｌａ Ｎａｎｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ＩＰ）注射）を使用して、Ｂ６マウスのマクロファージを枯渇させた。組織学について、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにプルシアンブルー染色によって組織学的に分析するために、酸化鉄負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰを経口投与したマウス由来の膵臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。染色された切片は、イェール大学病理組織学サービスが調製した。Ｎｉｋｏｎ ＤＳ Ｆｉ１カラーカメラおよびＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェア（バージョン２．３０）を備えたＮｉｋｏｎ ＴＥ－２０００Ｕ顕微鏡で組織をイメージングした。

糖尿病動物モデルを用いた実験。ＮＯＤマウスにＣＹ（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、急性Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を誘導した（図８Ａ）。２４時間後、マウスに空のＮＰ、ＲＡＰＡ負荷ＮＰ（５０、１００、および５００ｍｇＮＰ／ｋｇ＝４０ｍｇＲＡＰＡ／ｋｇ）、可溶性ＲＡＰＡ（１％Ｔｗｅｅｎ２０で可溶化した４０ｍｇ／ｋｇ）および食塩水を経口胃管栄養した。ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡを１日目（用量Ｉ）に、または１日目および２日目に２回（用量ＩＩ）経口投与した。血糖値を、血糖モニター（ＴＲＵＥＲＥＳＵＬＴ（登録商標）メーター、ＨｏｍｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用してモニタリングした。２００ｍｇ／ｄＬより高い２つの測定値（１日間隔）をＴ１Ｄの発症の指標とした。ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡを、このモデルを使用して、インスリン投与の「ゴールドスタンダード」である、インスリンの皮下投与（ＳＱ）または腹腔内投与（ＩＰ）とも比較した。インスリンの７回の連続注射または同等のインスリン用量のｐＵＤＣＡ_ＩＮＳの経口胃管栄養の後、血糖を２５日間にわたって測定した。操作受容体枯渇モデルＹ＝Ｂａｓａｌ＋（Ｅｆｆｅｃｔ_ｍａｘＢａｓａｌ）／（１＋ｏｐｅｒａｔｅ）［式中、ｏｐｅｒａｔｅ＝（（（１０^{ｌｏｇｋＡ}）＋（１０^Ｘ）））／（１０^{（ｌｏｇｔａｕ＋Ｘ）}））^ｎであり、Ｅｆｆｅｃｔ_ｍａｘは考えられる系の最大応答であり、Ｂａｓａｌはアゴニストの非存在下での応答であり、ｋＡはアゴニスト－受容体解離定数であり、ｔａｕは最大応答の半分まで低下させる動態である］を使用してデータをフィッティングした。

自然発症Ｔ１Ｄモデルのために、ＮＯＤマウスをおよそ２ヶ月間収容して、Ｔ１Ｄを自然に発達させた。自然発症Ｔ１Ｄモデルの場合、同じ年齢（８週齢）のＮＯＤマウスを、同じ週（１６週齢、２００±１５ｍｇ／ｄＬの２回のランダムな尾静脈血糖測定値の後）に糖尿病になった場合にのみ、試験用に選択した。これらのマウスを、空のＮＰ、ＩＮＳ負荷ＮＰ（１００または５００ｍｇ ＮＰ／ｋｇおよび２８５ｍＩＵ ＩＮＳ／ｋｇ）または遊離ＩＮＳ（２８５ｍＩＵ／ｋｇ）で１週間７回経口処置して、糖尿および体重をモニタリングした。ＧＬＰ－１の濃度を、血漿由来のＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。ブタを水を飲める状態で１２時間超絶食させ、アロキサンをＩＶ投与した（２５０ｍＬ、１５０ｍｇ／ｋｇ）。アロキサン処置から１０日後に、動物（ｎ＝３）にｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ（マウスでの１００ｍｇ／ｋｇに相当する６．４ｍｇ／ｋｇ）を１日７回経口胃管栄養を行い、連続グルコースモニタリングシステムＤｅｘＣｏｍ６（Ｄｅｘｃｏｍ．Ｉｎｃ．）を用いてグルコース読み取り値をモニタリングした。較正は、Ｒｅｌｉｏｎ Ｐｒｉｍｅ ＢＧ Ｍｅｔｅｒ（Ｒｅｌｉｏｎ）を用いてイヤースティックによって行い、さらなる静脈較正は、Ａｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって全血試料から行った。

自然発症Ｔ１Ｄ試験で選択されたＩＮＳ用量の計算。ヒトの血糖値を５０ｍｇ／ｄＬ低下させるためには、１国際単位（ＩＵ）のＩＮＳが必要であることが知られている。高血糖値（４００ｍｇ／ｄＬ超）を高血糖閾値（２００ｍｇ／ｄＬ）未満に低下させるためには、少なくとも４ＩＵのＩＮＳが必要である。それは、以下の式（９）によれば０．０２ＩＵのマウスのＩＮＳである。

［式中、ＨＥＤ＝ヒト等価用量（ｍｇ／ｋｇ）、動物のＮＯＡＥＬ＝動物についての無毒性量（ｍｇ／ｋｇ）、１ＩＵのＩＮＳ＝世界保健機関の換算係数に基づく０．０３６ｍｇ］

ｐＵＤＣＡ ＮＰ中のＩＮＳの負荷は約２０ｎｇ／ｍｇのＮＰであり、これは５．６×１０^４ＩＵ／ｍｇのＮＰである。０．０２ＩＵのＩＮＳを与えるために、一匹のマウスに対して、３５ｍｇのｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ ＮＰを処置すべきである。したがって、糖尿病マウスを３用量の１０ｍｇのＮＰで処置し、グルコースレベルを低く保つためにさらに４用量でマウスを処置し続けた（合計で０．０４ＩＵのＩＮＳおよび７０ｍｇのＮＰ）。

ｐＵＤＣＡおよびＵＤＣＡの毒性学。急性毒性試験を１０週齢の雌Ｂ６マウスで行った。０日目にマウスにｐＵＤＣＡ（１００および５００ｍｇ／ｋｇ）およびＵＤＣＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。Ｔｅｃｏ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃからのキットを、アルカリホスファターゼ、アラニントランスフェラーゼ、総ビリルビンおよび血中尿素窒素濃度の血清濃度の分析のために３、５および７日目に使用した。ＥＤＴＡ抗凝固処理血液をＨｅｍａｖｅｔ血液カウンター（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。

統計。すべての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０１）を使用して行った。ボンフェローニの事後検定または両側スチューデントのｔ検定によるＡＮＯＶＡ分析を使用した複数の群との実験比較を行った。生存データについて、ログランク検定およびχ^２統計分析を行った。０．０５以下のＰ値を統計的に有意とみなした。

結果
胆汁ポリマー固体生分解性ＮＰの作製。ＢＡ担体を作製するために、生分解性ｐＢＡを最初に合成し、次いで、これらのポリマーをＮＰに製剤化した。この方法は、個々のＢＡモノマーの使用とは対照的に、以下の４つの理由によるものであった。１）ＢＡミセル濃度を超えて形成されるミセル小胞と比較して、消化管通過中のＢＡ薬物組み合わせ（それが存在する場合）の安定性を増加させること。２）カプセル化された薬物（それが存在する場合）を持続的に送達することができる担体を製剤化すること。３）送達および放出プロセス中のＢＡとカプセル化された薬物（それが存在する場合）の比が一定となることを担保すること。４）ＢＡ受容体に結合する潜在的なアビディティを増大させるためにＢＡの結合価を増大させること。

ＢＡの重合およびＮＰへの製剤化。スクリーニング目的のために、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、およびウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）を含むＢＡのパネルを試験した（図１Ａ～図１Ｅ）。ＢＡを穏やかな条件下、４０℃および大気圧で２時間重合した（方法を参照）。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびジメチルアミノピリジンとｐ－トルエンスルホン酸との１：１塩（ＤＭＡＰ／ＰＴＳＡ）を使用することにより、ＢＡの炭素２４位において選択的活性化およびエステル化が起こり、ＢＡポリマーが生じた（図１Ｆ～図１Ｊ）。重合は、負に帯電したモノマー末端から進行した。重合の程度および分子量は、それぞれ核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって確認した。重合および架橋は、二次元（２Ｄ）ヘテロ核単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）分光法および２Ｄ二重量子フィルター相関分光法（ＤＱＦ－ＣＯＳＹ）分析によって検証した。一般に、数平均分子量（Ｍｎ）範囲は１３６０～２２３０ｇ／ｍｏｌであり、重量平均分子量（Ｍｗ）は１６００～３２１０ｇ／ｍｏｌの範囲であった。ポリマー分散性は、多分散性指数（ＰＤＩ）で評価したところ、１．５を超えなかった（表１）。ポリマーの直線性を２Ｄ ＮＭＲによって評価したところ、Ｃ－３およびＣ－７の２つのヒドロキシル置換基が重合プロセス中に２．５：１のモル比でエステル化されたことが示された。

ナノ粒子製剤のために、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルジョン法を使用した（図１Ｈ～図１Ｊ）。ここでは、薬物送達についての比較対象としてポリエステルＰＬＧＡを使用した。ＰＬＧＡ機能に対するｐＢＡの相対的影響を実証するために、ｐＢＡとＰＬＧＡのブレンドを作製した。薬剤のカプセル化は、最初にポリマーをクロロホルムに溶解し、次いでエマルジョン製剤化中に薬剤を添加することによって達成された。この実験で利用される薬剤には、赤外蛍光色素（１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（ＤＩＲ））、緑色蛍光色素（クマリン６）、薬物ラパマイシン（ＲＡＰＡ）、鉄感受性プルシアンブルーによる組織学的染色に使用される１０～２０ｎｍの酸化鉄粒子、および食塩水緩衝マウスインスリンが含まれる（方法を参照）。ＤＩＲ、クマリン６、ＲＡＰＡ、酸化鉄及びインスリンの負荷効率は、それぞれ粒子１ｍｇ当たり、６．７、８４．３、８０．１、９．０及び０．０２μｇであった。ＮＰの球状形態は、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって確認され、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して定量化された３４４．３±４．７ｎｍの平均直径を有する一様に球状の粒子を示した（表１）。ｐＢＡ ＮＰの静電荷は、－２４．９±４．４ｍＶのゼータ電位で負であった。観察されたあらゆる生体内分布または機能上の違いが生物物理学的変動ではなく、厳密に固有の材料特性の関数であることを確実にするために、全ての調製物を、同様のサイズ、電荷、形態およびカプセル化効率を有するように操作した（表１）。

ａ 数平均分子量（ＧＰＣ）
ｂ 重量平均分子量（ＧＰＣ）
ｃ ポリマー多分散性指数（ＧＰＣ）
ｄ 粒子多分散性指数（ＤＬＳ）
ｅ（カプセル化された色素の重量／ＮＰの重量）×１００
ｆ（カプセル化された色素の重量／カプセル化に用いた色素の重量）×１００
ｇ ポリマーブレンドナノ粒子（ｐＵＤＣＡ：ＰＬＧＡ＝５０：５０、ｗ/ｗ）

ＧＩ輸送の改善：胃の保護および腸透過の向上
酸性条件下でのＢＡイオン化はその水溶解度に影響を及ぼし、酸性条件下で粒子間の疎水性相互作用を促進しながら個々の粒子への水の浸透を制限する。大部分の粒子の胃環境への曝露を制限するこの保護機構は、腸内腔のｐＨ条件の増加と共に反転する。

ＰＬＧＡ粒子は、インキュベーションの２時間後および４時間後に分解し始め、カプセル化された色素を８％まで放出した。対照的に、ｐＵＤＣＡは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ修飾ＰＬＧＡと同様の形で４時間にわたって色素を保持した。ｐＵＤＣＡとブレンドしたＰＬＧＡは、Ｅｕｄｒａｇｉｔに匹敵する安定性を付与し、ｐＵＤＣＡのｐＨ応答特性がさらに確かめられた。ｐＵＤＣＡの球状粒子形態も保持されたが、ＰＬＧＡの球状粒子形態は酸性条件下で経時的に有意な膨潤を示した。ＰＬＧＡとｐＵＤＣＡとのブレンドは、一過性安定化効果を有した。これらの所見は、ＧＩ輸送中にカプセル化されたインスリンに安定性を付与するｐＢＡの保護的性質を証明している。ＵＤＣＡミセルと比較して、ｐＵＤＣＡはカプセル化されたインスリンの最小の漏出を示した。さらに、ｐＵＤＣＡにカプセル化されたインスリンは、ｐＵＤＣＡ_ＩＮＳから放出されたインスリンがｐＡｋｔを産生するＣＨＯ細胞上のインスリン受容体に結合する能力を示したことによって示されるように、低ｐＨに曝露した後では、新鮮なインスリンと同程度に機能的であった（図３Ｇ）。

胃消化後、ＮＰはより高いｐＨの微小環境に遭遇し、より水透過性になる。腸内腔を通るＢＡ粒子の透過は、腸管上皮細胞を介した受動的トランスサイトーシスまたは結腸受容体の係合を介した能動的輸送を介して起こり得る。モデル上皮細胞株（Ｃａｃｏ－２ヒト細胞）を通る色素負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰの透過性は、ＰＬＧＡ、ｐＵＤＣＡとブレンドされたＰＬＧＡ、または他のｐＢＡ ＮＰよりも有意に大きかったことから（図３Ｈ）、ｐＵＤＣＡは腸内腔を通して受動的に輸送するようにみえる。実際、ｐＵＤＣＡの透過係数は約５０×１０^－６ｃｍ／秒であり、これはヒト６３の腸内腔に完全に吸収されることを意味する。

ＢＡの血液プール侵入は、腸肝循環または腸内腔の単球もしくはマクロファージなどの血球のいずれかによって媒介され得る。ｐＵＤＣＡ ＮＰの循環に対する機序を解明するために、ＮＰを静脈内（ＩＶ）注射し、ｐＵＤＣＡ ＮＰがＩＶ投与の２時間後に高い膵臓取り込みプロファイルを示すことを見出した。このように、膵臓の蓄積は血中の細胞輸送にも関与しており、腸肝循環によって完全に駆動されてはいなかった。腸マクロファージが体内の細胞の最大のプールの１つであり、健康な結腸の粘膜固有層に直接近接していることを考えると、クロドロネートリポソームなどの枯渇剤によるこのプール中の細胞数の減少は、膵臓の生体内分布に影響を及ぼすはずである。生体内分布に対する効果を図３Ｉに示し、膵臓への粒子生体内輸送におけるマクロファージの部分的な役割を裏付けている。この機序によって膵臓分布が完全に排除されれば、腸肝循環の役割が否定されることになるが、図３Ｊは、マクロファージの１６％しかｐＵＤＣＡ ＮＰと会合していなかったことを示している。ＮＰ循環に寄与する重複する機序を以下にまとめる。ここで、腸上皮を透過したＮＰは十二指腸に入り、総胆管を介して膵管にアクセスすることができる。粒子はまた、常在単球や循環単球およびマクロファージによって取り込まれ、膵臓に輸送されるか、またはそれら自体が毛細血管やリンパ管を通って細胞宿主なしで浸透する６６。ここでは調査されていないもうひとつの考えられる機序は、異なる胆汁酸に対する親和性を有する血清アルブミンへの結合である。

ｐＵＤＣＡ ＮＰは、細胞外胆汁酸受容体（ＴＧＲ５）に高いアビディティで結合し、グルカゴン様ペプチドおよび内因性インスリン分泌を促進する。
ＢＡは、ＣＤ３６、カベオリン、および脂肪酸輸送体（ＦＡＴ）などの頂端膜輸送体と係合して高脂肪食を能動的に輸送するため、高アビディティ結合によりエンドサイトーシスおよびＢＡ媒介シグナル伝達カスケードを増強することができる。さらに、モノマーＵＤＣＡは弱いＴＧＲ５受容体アゴニストであるため、結合親和性の変化を理解することは、モノマーと比較してポリマーＢＡの増幅された応答を解明するのに役立つだろう。抗ＴＧＲ５抗体で飽和したマクロファージへのｐＵＤＣＡの競合的結合を図３Ｋおよび表２に示す。

図３Ｆは、膵臓β細胞由来のｐＵＤＣＡ及びＵＤＣＡによって誘導されたインスリン産生（ｎｇ／ｍｌ）を示すグラフである。

図３Ｇは、ｐＵＤＣＡ（５０および５マイクログラム／ｍｌ）で直接処理し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生を示すグラフである。

ＵＤＣＡと比較して、ｐＵＤＣＡの親和性は最小の非特異的結合に対して約３０倍大きかった。陰性対照として使用したＰＬＧＡ ＮＰは親和性を示さなかった。細胞内ＮＰ輸送の速度もまた、より高い結合アビディティによって影響を受ける。３７℃でのマクロファージにおけるエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのｐＵＤＣＡ ＮＰ速度の定量的評価は、内在化（ｋｅｎｄｏ）が非結合対照（ＰＬＧＡ）と比較して３．６倍高く、エキソサイトーシスの速度（ｋｅｘｏ）が２．３倍速いことを示した。速度のこの定量的決定におけるアッセイの妥当性は、活性な内在化またはエキソサイトーシスが最小であるか、または全くないことが示されている４℃で行った（図３Ｌ）。興味深いことに、内在化の大きさの増加またはより速いエキソサイトーシスは、製剤中のｐＵＤＣＡの量に依存した。ＰＬＧＡとブレンドすることによるｐＵＤＣＡ濃度の５０％の減少は、ＰＬＧＡ自体と比較してそれぞれ、より大きい内在化率またはより速いエキソサイトーシス速度をもたらした。このように、ｐＵＤＣＡの結合アビディティの増加は、受容体媒介性細胞内輸送（エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス）の速度の増加をもたらした。実際、高アビディティ結合は、マクロファージのみに限定されず、膵臓β細胞でも観察され、ＴＧＲ５結合は、内因性ＧＬＰ－１分泌（図６Ｊ）およびインスリン産生（図６Ｋ）の増大をもたらし、血糖値に対する効果的な制御を促進する。代謝制御に加えて、結合アビディティの増加はまた、活性化ＣＤ８＋（ＣＤ４４＋ＣＤ８＋）Ｔ細胞応答の抑制と並行して、例えば、Ｍ１からＭ２へのマクロファージ表現型の傾斜（図６Ｏ）、ＩＦＮγ分泌の減少（図３Ｄ）、炎症誘発性ＩＬ－６の減少（図３Ｅ）、ＩＬ－１０およびＣＣＬ１の産生による抗炎症活性の増強（図６Ｎ）、および、制御性Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５）増殖を介した寛容の誘導による複数の免疫調節機構の関与によって、本質的に強力な抗炎症性免疫応答の制御を可能にする（図４Ｆ～図４Ｉ、図６Ｌおよび図６Ｍ）。担体物質自体によるこの多変量自然免疫調節および適応免疫調節は、高血糖に関連する炎症促進性応答の中和に対する相乗的薬物の提供と併せて、膵臓炎症に対する有意な治療的制御を提供する。

ｐＵＤＣＡ効果は、多価ディスプレイの結合価および近接性の増大を介して媒介される
ＵＤＣＡの抗炎症効果は広く研究されており、胆石の溶解および肝臓における慢性移植片対宿主病の予防のために医学的に利用されている。中国語では、「ウルソ」という用語は「クマ」を意味し、ウルソデオキシコール酸は、その抗炎症特性および健康な人々や病気の人々における一般的な利益のおかげで、中国の伝統医療における数十億ドルの産業となっている。さらに、臨床試験は、糖尿病の処置におけるＵＤＣＡの役割に焦点を当てて進行中である。ｐＵＤＣＡは、担体として機能することに加えて、ＴＧＲ５受容体への高アビディティ結合に対するその増強された効果の原因となるＵＤＣＡの多価形態である。

観察された効果の背後にある機序が多価性の増加があることを実証するために、インビトロでの膵臓β細胞からのインスリン分泌におけるｐＵＤＣＡ効果を試験した。膵臓細胞からのインスリン分泌に対する固有の影響を有しない担体であるＰＬＧＡ（図６Ｋ）を、異なる濃度のモノマーＵＤＣＡを用いて、表面がＰＬＧＡ粒子１個当たり約２０００個のＵＤＣＡ分子となる完全な飽和に至るまで修飾した。表面上のＵＤＣＡ濃度の増加は、膵臓細胞を標的とする非ｐＵＤＣＡ担体（すなわちＰＬＧＡ）の結合を増強したが、ｐＵＤＣＡの効果は、モノマーＵＤＣＡで飽和したＰＬＧＡ粒子（ＰＬＧＡ粒子１個当たり最大２０００個のＵＤＣＡ分子）よりも依然として優れていた。このように、この増強効果は、ナノ粒子上のモノマー結合価を増加させることだけでは完全に総括することはできない。さらなる幾何学的または生物物理学的因子が必要であり、それは、多価プラットフォーム上の分子の近接性から、活性化表面上のリガンドの可動性または相対的持続にまで及ぶ可能性がある。多くの場合、親和性の増加のみでは最適な応答を達成するのに十分なパラメーターではないという考えに従えば、多価標的化系の設計にあたって、タンパク質間の間隔を考慮する必要がある。重合リガンドは、固体支持体またはナノ粒子の表面にコンジュゲートまたは吸着されたモノマーと比較して、その組成物が、長さのスケールがより広範なセットにわたるリガンドがランダムに離間して分布したものであるため、本質的にＢＡ受容体を標的化するための長さに及ぶことができる。さらに、薬剤をカプセル化したｐＵＤＣＡは、胆汁酸と放出された薬物との間の比を、応答の改善にあたって両方の部分を増加させるのに必要な期間にわたり一定にすることを可能にする。モノマーで装飾された粒子の表面は、カプセル化された薬剤の放出動態とは異なる動態で分解される。一対の多能性薬物の併用送達が治療に必要とされる場合、併用の時間的な安定性が重要な役割を果たす。時間的な安定性は、潜在的な相乗的活性のための必要条件であり、活性薬物を一定の比率で経時的に供給する系によって最もよく達成されるであろう。これは、担体が２つのエフェクター薬物（胆汁酸およびカプセル化された薬剤）のうちの１つである場合に容易に達成することができる。

この担体の多変量特性を以下の通りまとめる。経口摂取（ｐＨ約７～７．５）後、粒子はアニオン性であり、分散性である。胃（ｐＨ２～３）におけるプロトン化は、水の浸透を制限する。小腸のｐＨ（６～６．５）は、疎水性相互作用を減少させ、粒子内への水の浸透、および腸内腔を通る輸送を可能にし、続いて腸マクロファージによる結合および内在化を可能にする。要約すると、粒子は、十二指腸から総胆管への細胞媒介輸送または粒子輸送単独のいずれかを含むいくつかの機序によって全身を循環し、膵外分泌部への進入が促進される。粒子は、ＧＩ管を通る保護的および局所的な輸送、応答に対する代謝および免疫学的制御を示す。合わせて、これらの特性は、カプセル化された抗炎症または代謝治療薬の効果を増強する手段である。

賦形剤媒介性薬剤送達は、経口送達および機能向上のために多くの様々な革新的な設計によってもたらされてきた。例としては、保護的賦形剤、高分子輸送体、ナノ粒子、ポリマースキャフォールド、および胃壁を通してインスリンを直接送達するミリメートル・マイクロニードル様ピルが挙げられる。しかし、これらのイノベーションにもかかわらず、基礎病理、例えば、１型糖尿病における膵臓代謝の機能不全および局所炎症促進性免疫を処置する戦略と並行して薬剤送達の代謝管理の側面に対処するアプローチは存在しない。したがって、このような開発がなされないと、インスリン投与に生涯依存せざるを得ない。

本実施例は、ポリマーＢＡが、経口摂取可能な治療用ナノ粒子の製剤化を促進するだけでなく、以下の２つの理由によって広範囲の生物活性をも提供することを示す。
１）ナノ粒子は本質的に保護的であり、腸透過を増加させ、ひいては関連する薬剤の全身バイオアベイラビリティを増加させることができる。
２）ナノ粒子は、ＢＡ受容体の結合を介してグルコース代謝および免疫を調節することができ、ひいてはエフェクター治療系として機能することができるシグナル伝達機能を有する。

重合の理論的根拠は以下の考えに基づいていた。１）重合はインスリンを含む広範囲の目的の治療薬のカプセル化および放出のためのストラテジーを促進する。換言すれば、本質的に不安定であるモノマーＢＡミセルとは対照的に、固体の安定な生分解性ポリマー担体。２）そのようにポリマーＮＰを製造することは、ポリマーが水性環境で分解可能である場合に、カプセル化された薬剤の持続放出を可能にする。３）堅牢な担体としてのポリマーＢＡ系は、例えば、別のタイプのポリマーＮＰの表面にハイブリダイズしたＢＡモノマーとは異なる方法で（近接しかつ高密度に）ＢＡを提示する。さらに、ＢＡモノマーが固有の治療効果を有する場合、このエフェクター機能は重合によって増幅され、そのバイオアベイラビリティは、経口摂取後に表面から容易に放出され得る粒子上のＢＡモノマーとは対照的に、より長く持続する。さらに、薬物放出期間にわたるＢＡの持続的な利用可能性は、コンビナトリアルな相乗的活性にとって望ましい要素であり得る。４）低ｐＨでのイオン化ポテンシャルおよびプロトン化に起因するＢＡのｐＨ刺激応答は、その受容体への結合について多価性でＢＡを増強しながら胃の保護を提供する。この多価応答は、イオン化の程度を増幅するだけでなく、粒子が胃から腸内環境に移行する際に、低ｐＨ保護および高ｐＨ脱保護の応答時間を動態学的に増幅する。５）ポリマーの多価性は、ＢＡ受容体に対する高い結合アビディティをもたらし、重合時に弱いＢＡアゴニストをより強い形態に変換する。より強力なアゴニストは、より低い用量でより大きな受容体活性化および治療的シグナル伝達の機能を可能にする。

上記の理由のために、ＢＡモノマーであるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）から形成されたポリマーの使用を提案する。ＵＤＣＡは、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性を低下させるための使用について確立された記録を有するが、この使用は、ドーズデンスである（典型的には、マウスにおいて４０～４５０ｍｇ／ｋｇおよび経口で２～２０週間）。ＵＤＣＡは主にインスリン感受性に影響を及ぼすため、Ｔ１Ｄで試験されることはまれである。ｐＵＤＣＡの機能的影響は、モノマーがそれ自体で達成することができるものを超えるそのエフェクター機能の増幅に加えて、カプセル化された薬剤（インスリンなど）の輸送の改善を超えて広がる。ＵＤＣＡは、細胞外Ｔａｋｅｄａ Ｇタンパク質共役受容体（ＴＧＲ５）に安定に結合し、核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）およびプロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）などのシグナルキナーゼを調節することができる場合、プロテインキナーゼカスケード細胞活性化を誘発し、グルコースおよびエネルギーホメオスタシスを調節することができる。ＴＧＲ５の活性化はまた、脂肪組織におけるエネルギー消費の増加と共に、抗炎症性免疫、抗線維化活性、腸内分泌Ｌ細胞からのＧＬＰ－１の誘導および分泌をもたらす。ｐＵＤＣＡは、そのモノマー対応物であるＵＤＣＡが本質的に弱いＴＧＲ５アゴニストであるため、用量を有意に低下させるだけでなく、ＵＤＣＡ機能の範囲を増幅し得る。

インスリン輸送、生体内分布および薬物動態の改善の観点から、ＢＡは天然乳化剤である。したがって、生分解性ポリマーＢＡは、体内の脂質および脂肪の可溶化においてさらに良好であろう。一般に、ＢＡは、脂質とミセルへの自己集合によって消化助剤として機能する。経口摂取された脂肪物質のより良好な分子生体内分布および血液循環を可能にする。胆汁および膵臓消化液は、十二指腸に分泌することが知られており、胆汁は、具体的には、回腸から門脈循環を通って肝臓に戻り、次いで、摂取された高脂肪食のさらなる消化のために再び腸に戻る。腸から胆管およびその後方へのＢＡのこの循環作用は、「腸肝循環」と呼ばれるプロセスである。ポリマーＢＡ ＮＰの結合が増強されるため、生体内分布が影響を受け、循環寿命が長くなる。薬物をＢＡに共有結合的または非共有結合的に連結する以前の研究は、腸透過および薬物動態の向上に向けてこの循環プロセスを利用してきたが、Ｔ１Ｄの管理、予防および処置のための負荷インスリンと組み合わせた重合ＢＡ、特にｐＵＤＣＡのマルチモーダル処置態様を探究または実証した報告はない。

方法
本実施例で用いた方法は以下の通りである。

試薬および抗体。全ての胆汁酸、パラ－トルエンスルホン酸、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ペプシン、トリアムテレン、リポ多糖（ＬＰＳ）、およびオボアルブミン（ＯＶＡ）は、ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。シクロホスファミド（ＣＹ）、無水塩化メチレン、無水ピリジン、ジイソプロピルカルボジイミド、および無水メタノールは、ＡＣＲＯＳから購入した。Ｄｕｒｅｃｔ製のポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ、固有粘度０．５５～０．７５ｄＬ／ｇ、カルボキシル末端）を対照ポリマーとして使用した。ラパマイシン（ＲＡＰＡ、ＬＣＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウスインスリン（ＩＮＳ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’、３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（ＤＩＲ、Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ）、およびクマリン６（ＡＣＲＯＳ）をＮＰにカプセル化した。Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＦＳ ３０ＤはＥｖｏｎｉｋから入手し、ＣｐＧはＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。ＣＤ８（ＡＰＣ）、ＣＤ４４（ＰＥ）、ＣＤ４（ＡＰＣ）、ＣＤ２５（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ－Ｃｙ７）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７）、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）及びＣＤ２０６（ＦＩＴＣ）に対する抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手した。Ｆｏｘｐ３（ＰＥ）およびＣＤ８６は、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。組換えヒトＧＰＣＲ ＴＧＲ５タンパク質、Ａｔｔｏ５６５コンジュゲートＴＧＲ５抗体、およびブロッキング緩衝液をＡｂｃａｍから入手し、競合結合実験に使用した。

細胞。ヒト結腸腺がんＣａｃｏ－２細胞はＡＴＣＣから購入した。この細胞を、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、抗生物質（１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。頸椎脱臼後のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６またはＲａｇ２／ＯＴＩＩ）から長骨および脾臓を採取した。長骨から骨髄を溶出し、１０％ＦＢＳを補充したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地を使用して脾臓を漬け込んだ。試料中の赤血球（ＲＢＣ）を、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を用いて溶解した。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）培地で培養した。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩに５×１０^５細胞／ｍＬでプレーティングし、５日間培養する従来の増殖プロトコルを使用して生成した。５日目に、非接着性細胞を回収し、ＧＭ－ＣＳＦ培地中でさらに２日間培養した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６の脾細胞集団からＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。全ての細胞を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で培養した。

ＴＧＲ５受容体の活性化によって促進される膵臓β細胞からのインスリン産生を試験するために、マウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６、ＡＴＣＣ）細胞を、３ｍＭのグルコースを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２時間インキュベートし、次いで、２５ｍＭのグルコース及びＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ又はｐＵＤＣＡ ＮＰ（４０μｇ／ｍＬ）を含むＨＢＳＳ中で３０分間インキュベートした。インスリンの濃度を、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＩｎｓｕｌｉｎＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ）を使用して測定した。同じ実験を、ＴＧＲ５アンタゴニスト、対照としてのトリアムテレン（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で行って、ＴＧＲ５活性化のない細胞からの固有のインスリン産生を区別し、結果を正規化するために使用した。ｐＵＤＣＡから放出されたインスリンの生物活性を、インスリン受容体（ＣＨＯ ＩＮＳＲ細胞、ＡＴＣＣ）を発現する遺伝子をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞を用いて測定した。３時間または２４時間でｐＵＤＣＡから放出されたインスリンをＣＨＯ ＩＮＳＲ細胞と１時間インキュベートし、リン酸化プロテインキナーゼＢ（ｐＡｋｔ）のレベルをＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）によって測定した。新鮮なインスリンまたは変性インスリンと共にインキュベートしたＣＨＯ細胞からのｐＡｋｔ産生を比較して、生物活性％を計算した。

動物。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６、６～８週齢、雌）をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｉｎｃ．から入手した。ＮＯＤマウス（ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ、８週齢、雌）およびヌードマウス（無胸腺ヌード、ｎｕ／ｎｕ、７週齢、雌）はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから供給された。マウスを、陽圧封じ込めラックの中に入れられたオートクレーブされたマイクロアイソレータケージに収容した。オサボーバリアー島に由来するオサボーブタ（１７ヶ月齢、４２ｋｇ）を使用した。すべての実験およびメンテナンスは、イェール大学施設内動物管理使用委員会から承認されたプロトコルに従って実施した。

ポリマー合成およびナノ粒子（ＮＰ）製剤。炭素２４基のエステル化によってポリ（胆汁酸）（ｐＢＡ）を合成した（図１Ｆ～図１Ｇ）。ＢＡ（５．４ｍｍｏｌ）、パラトルエンスルホン酸（０．６５２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（０．６５２ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレンと無水ピリジンを５：１で混合した溶媒混合物６０ｍＬに添加し、４０℃で撹拌して透明な溶液を得た。反応混合物に、６．９２ｍｍｏｌのジイソプロピルカルボジイミドを添加し、反応を窒素雰囲気下で２時間進行させた。ポリエステル生成物ｐＢＡを、遠心分離（遠心分離機５８１０Ｒ、エッペンドルフ）によって回収した４００ｍＬの冷無水メタノール中に沈殿させ、乾燥させて白色粉末を保持した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって重合を確認した。ＵＤＣＡおよびポリ（ウルソデオキシコール酸）（ｐＵＤＣＡ）の^１Ｈおよび２Ｄ－（ＣＯＳＹ、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ）ＮＭＲスペクトルデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＮＭＲ分光計（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって、３ｍｍコールドプローブを用いて６００ＭＨｚでまたは４００ＭＨｚで記録し、^１３Ｃ ＮＭＲデータを１００ＭＨｚ磁場で測定した。クロロホルム－ｄ_１（９９．９６％、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、全てのＮＭＲ実験の重水素化ＮＭＲ溶媒および溶媒参照シグナル（δ_Ｈ７．２５、δ_Ｃ７６．９８）として使用した。ｐＢＡ（クロロホルム中１０ｍｇ／ｍＬ）の分子量（ＭＷ）は、モデル１５１５アイソクラティックポンプ、７１７ｐｌｕｓオートサンプラー、およびＷａｔｅｒｓ ＳｔｙｒａｇｅｌカラムＨＴ６ＥおよびＨＴ２を直列に備えた２４１４屈折率（ＲＩ）検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用したＧＰＣによって評価した。クロロホルムを移動相として１ｍＬ／分の流速で利用し、カラムおよびＲＩ検出器の両方を４０℃に維持した。ＭＷ特性は、狭い多分散性ポリスチレン標準（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から作成した較正曲線に対して決定した。Ｅｍｐｏｗｅｒ ＩＩ ＧＰＣソフトウェアを、ＧＰＣ機器の実行およびその後のクロマトグラフィー分析に使用した。色素（ＤＩＲもしくはクマリン６）、薬物（ＲＡＰＡもしくはＩＮＳ）もしくは酸化鉄をカプセル化したｐＢＡもしくはＰＬＧＡまたは混合物（５０／５０、ｗ/ｗ）ＮＰを、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルジョン技術を用いて製剤化した（図１Ｈ～図１Ｊ）。ポリマーまたは混合物（１００ｍｇ）を、ＤＩＲ（１ｍｇ）、クマリン６（１０ｍｇ）、ＲＡＰＡ（１０ｍｇ）または酸化鉄（１ｍｇ）を含有する２ｍＬのクロロホルムに溶解した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１００μＬ）またはＩＮＳ（１０μｇ）を含有するＰＢＳをボルテックスしながらクロロホルムポリマー溶液に滴下して添加し、ＩＫＡ Ｔ２５ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ（ＩＫＡ）を用いてホモジナイズした。次いで、この分散剤相を５％ＰＶＡの連続相に滴下して添加し、ホモジナイズした。次いで、混合物を２００ｍＬの０．２％ＰＶＡに滴下して添加し、２時間撹拌したままにして溶媒を蒸発させた。４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＮＰを回収し、次いで脱イオン水で３回洗浄した。粒子を凍結乾燥し、－２０℃で保存した。ＮＰの流体力学的直径および表面電荷は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒによって測定した。ＮＰの分散物を０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通してキュベットに濾過した後、測定した。動的光散乱は、５３２ｎｍの波長における１７３°の検出角での後方散乱によって測定し、流体力学的半径はストークス－アインシュタイン方程式を使用して計算した。ＮＰの形態は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４８００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＳＥＭ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ）によって観察した。エタノール（２μＬ）中のＮＰの分散物をウェハ基板上に置き、室温で乾燥させた。この試料をアルミニウム製試料ホルダに取り付けた後、金スパッタを行った。ＮＰは、作動距離４ｍｍで１５ｋＶの加速電圧で観察した。ＤＩＲおよびインスリンの放出を胃模倣媒体で測定した。ＮＰを、ペプシン（１０ｍｇ／ｍＬ）の存在下、３７℃で媒体（クエン酸緩衝溶液、ｐＨ２．０）に分散させた。各時点でＮＰを遠心分離し、上清を回収して、プレートリーダー（λ_ｅｘ７５０ｎｍ、λ_ｅｍ７９０ｎｍ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて粒子から放出されたＤＩＲの量を測定した。インスリン放出をＢＣＡアッセイによって定量化した。ＥｕｄｒａｇｉｔでコーティングされたＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ＠Ｅｕｄｒａｇｉｔ）は、ＰＬＧＡを５重量％のＥｕｄｒａｇｉｔ溶液に分散させ、遠心分離することによって調製した。

ヒト腸上皮細胞層を通るＮＰの透過性 Ｃａｃｏ－２細胞を０．４μｍ細孔トランスウェルフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に７×１０^４細胞／ｃｍ^２で播種した。細胞をコンフルエントに達するまで成長させ、３７℃および５％ＣＯ_２で約３０日間成熟させた。透過性試験を行う前に、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、上皮電圧抵抗計（ＥＶＯＭ（商標）上皮電圧／オーム計、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。３００Ω・ｃｍ^２を超えるＴＥＥＲ値を有するコンフルエントな細胞層を透過性試験および細胞傷害試験に使用した。２５ｍＭのグルコースを含有するフェノールを含まないＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１ｍｇ／ｍＬのＤＩＲ負荷ＮＰの分散物または同等濃度の可溶性ＤＩＲを含有する溶液を調製し、トランスウェルフィルターの頂端チャンバーに加えた。基底外側チャンバー中のＨＢＳＳをサンプリングし、各時点で新鮮な培地と交換した。基底外側チャンバーへの累積的なＤＩＲ輸送速度は、フラックス（ｄＱ／ｄｔ）を与えた。見かけの透過性（Ｐ_ａｐｐ）は（１）により算出した。

式中、Ｃ_０は頂端チャンバー内の全ＤＩＲの初期濃度であり、Ａはトランスウェルフィルターの面積である。

ＴＧＲ５結合試験 Ａｔｔｏ５６５コンジュゲートＴＧＲ５抗体で飽和したマクロファージに対するｐＵＤＣＡ、ＵＤＣＡおよびＰＬＧＡ ＮＰの競合的結合を行った。９６ウェルプレート中の細胞（１０^５細胞／ウェル）を、アクセス量（４μｇ／ｍＬ）の蛍光標識ＴＧＲ５抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、続いて異なる濃度のＮＰに曝露した。インキュベーションの２時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、プレートリーダーを使用して細胞上に結合したＡｔｔｏ５６５－ＴＧＲ５抗体の数を測定した。特異的および非特異的ｋ_ｄは、部位飽和全結合方程式Ｙ＝Ｂ_ｍａｘ×Ｘ／（ｋ_ｄ＋Ｘ）＋ＮＳ×Ｘ（式中、Ｂ_ｍａｘは最大特異的結合であり、ｋ_ｄは平衡解離定数であり、ＮＳは非特異的結合の勾配である）を用いた非線形フィッティングによって計算した。膵臓β細胞（１０^６細胞／ウェル）上のＴＧＲ５に対する結合価依存性ＮＰ結合を調べるために、ＵＤＣＡモノマーをビオチン化し、アビジン化ＰＬＧＡ ＮＰ表面にコンジュゲートした。２ｍＬのクロロホルム中のＰＬＧＡ（１００ｍｇ）を、ＰＢＳ中のアビジン－パルミテート（１０ｍｇ／２ｍＬ）と５％ＰＶＡ２ｍＬとの混合物に滴下して添加し、ホモジナイズした。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いてＵＤＣＡをビオチンと結合させた後（１：１モル比）、ビオチン化ＵＤＣＡ（０、５０、２５０、１０００ｎｇ／ｍＬ）をアビジン化ＰＬＧＡ ＮＰ（５ｍｇ／ｍＬ）に固定化した。プレーティングしたＴＧＲ５を調製するために、組換えＴＧＲ５受容体（５μｇ／ｍＬ）をプレート上に一晩コーティングし、非特異的結合部位をタンパク質ブロッキング緩衝液を用いてブロッキングした。プレート上のＴＧＲ５受容体を、アクセス量（４μｇ／ｍＬ）の蛍光標識ＴＧＲ５抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、続いて異なる濃度のＮＰに曝露した。インキュベーションの２時間後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、受容体に結合したＡｔｔｏ５６５－ＴＧＲ５抗体の数をプレートリーダーを用いて測定した。

データを以下の競合阻害式に当てはめ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用）、これにより、標識抗体の５０％が競合して除去されるｐＵＤＣＡ（ＥＣ_５０）およびその親和定数（Ｋ_ｉ）の推定値が得られた。

式中、
Ｆ＝標識ＴＧＲ５抗体との競合による蛍光変化
［ｐＵＤＣＡ］＝ｐＵＤＣＡの濃度
Ｆ_{Ｉｎｉｔｉａｌ}＝蛍光の上のプラトーまたは初期蛍光
Ｆ_{Ｆｉｎａｌ}＝蛍光の下のプラトーまたは最終蛍光
ＥＣ_５０＝全蛍光を５０％低下させるｐＵＤＣＡの濃度
Ｋ_ｉ＝ｐＵＤＣＡ親和性定数
Ｃ_Ａｎｔｉ＝標識抗ＴＧＲ５抗体の濃度
Ｋ_{Ｄ，Ａｎｔｉ}＝ナノモル範囲で推定されたＴＧＲ５受容体に対する標識抗ＴＧＲ５抗体の親和定数

ＵＤＣＡの分子直径と同等の厚さのシェルは、直径３５０ｎｍのｐＵＤＣＡ粒子上に約２０００個のＵＤＣＡモノマーを組み込むことができると推定された。

ＮＰの細胞エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス速度の定量化
ＢＭＭを９６ウェルプレート（１０^５細胞／ウェル）にプレーティングし、ＤＩＲ負荷ｐＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ、およびＰＬＧＡ／ｐＵＤＣＡブレンドＮＰ（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加した。細胞を３７℃で１、３、および６時間インキュベートし、プレートリーダーを使用してＮＰのエンドサイトーシスを測定した。細胞を洗浄し、新しい培地と交換した後、ＢＭＭから培地への放出されたＤＩＲ標識ＮＰを経時的に測定することによって、ＮＰのエキソサイトーシスを３７℃または４℃でモニタリングした。以下の方法は、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスの速度を確認するためにそのような分析が適用される初めての方法である。この方法をより詳細に論じる別の原稿を準備中であるが、端的に言えば、以下の通りである。
平衡エンドサイトーシス－エキソサイトーシス反応は、以下のように単純化することができる。

［式中、［Ｐ］＝培地中の粒子の濃度（粒子数／ｍＬ）
［Ｃ］＝培地中の細胞の濃度（細胞数／ｍＬ）
［ＰＣ］＝細胞に会合した粒子の濃度（粒子－細胞数／ｍＬ）
ｋ_ｅｘｏ＝エキソサイトーシス速度（ｔ^－１）
ｋ_ｅｎｄｏ＝エンドサイトーシス速度（（［Ｐ］・ｔ）^－１）］
次いで、

エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのプロセスを報告するシグナルに関して、これは各プロセス［Ｓ］に関連する蛍光シグナルである。

この微分方程式は、最大取込みに対する取込みなしの２つの極端な限界の間の解を有する。

Ｓ_０＝任意の開始時間ｔ_０における信号

ｋｅｎｄｏおよびｋｅｘｏに関するこの分析およびフィッティングは、２つのプロットを使用して行われる。
エキソサイトーシス相

ここで、Ｓｔは任意の時間（ｔ）における信号であり、
Ｓ０は任意の時間（ｔ_０）の信号である

会合相
会合相は、以下の２つのプロットに関して分析される。
Ｓに対するｄＳ／ｄｔは

を与え、
ｔに対するＬｎ（ｄＳ／ｄｔ）は、

を与える。

仮定：この分析では、エキソサイトーシス後の粒子の再取り込みは考慮されていない。

フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを、ＣＹ誘導マウスに対するＣＹ処置の３日後および５日後に取得した。自然発症Ｔ１Ｄ動物モデルの場合、最後のＮＰ用量後１日目にＴ細胞を採取した。いずれの場合も、膵臓リンパ節を採取し、４０μｍセルストレーナーを用いて処理した。細胞表面マーカーを、４℃で３０分間インキュベートすることによって、ＣＤ８（ＡＰＣ）、ＣＤ４４（ＰＥ）、ＣＤ４（ＡＰＣ）およびＣＤ２５（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）に対する蛍光抗体で確認した。次いで、細胞を固定し、透過処理し、Ｆｏｘｐ３染色キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦｏｘｐ３（ＰＥ）について染色した。最終洗浄後、試料を直ちにＬＳＲ－ＩＩマルチカラーフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して分析した。抗原特異的Ｔ細胞応答を調べるために、ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋細胞をＯＴＩＩ共培養アッセイで使用した。ＢＭＤＣ（２．５×１０^４細胞／ウェル、９６ウェルプレート）をｐＵＤＣＡ ＮＰで２４時間前処理し、洗浄し、次いでＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＯＶＡ（２０μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激し、引き続いてＯＴＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０^４細胞／ウェル、９６ウェルプレート）と３日間共培養した。次いで、細胞増殖およびサイトカイン産生を定量化した。

ＢＭＭ（１０^５細胞／ウェル、９６ウェルプレート）をｐＵＤＣＡ ＮＰ（５０μｇ／ｍＬ）、ＵＤＣＡモノマー（５０μｇ／ｍＬ）、ＰＬＧＡ（５０μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳと共に４時間インキュベートし、ＣｐＧ（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した。２０時間後、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＣＣＬ１の読み取りのために培地上清を回収した。細胞をＦ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７）、ＣＤ８６（ＰＥ）、およびＣＤ２０６（ＦＩＴＣ）について染色した。緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で３回洗浄した後、試料を２％パラホルムアルデヒドで固定し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴマルチカラーフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実行した。ＣＤ１１ｃ－Ｆ４／８０＋ＮＰ＋を、色素負荷粒子を用いたマクロファージのＮＰ追跡に使用した。ＮＰ＋の表示は、負荷された色素の蛍光を介した粒子の読み出しを指す。マウスを４時間絶食させ、経口胃管栄養（５００ｍｇ／ｋｇ、２５０μＬ）によって標識ｐＵＤＣＡ ＮＰで処置した。１日後、膵臓、肝臓、肺および脾臓を採取し、ホモジナイザーを用い、４０μｍセルストレーナーおよびプランジャーを用いて細胞を破片から分離するために穏やかに処理した。細胞表面マーカーを、Ｆ４／８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００）およびＣＤ１１ｃ（ＰＥ－Ｃｙ７）に対する蛍光抗体で染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴマルチカラーフローサイトメーターによって測定した。すべての抗体をフローサイトメトリーのために１：５００に希釈し、サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＩＦＮγ）をＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。

生体内分布および組織学
Ｂ６マウス、ＮＯＤマウスまたはヌードマウスを４時間絶食させ、経口胃管栄養（５０、１００または５００ｍｇ／ｋｇ、２５０μＬ）によって、ＤＩＲまたはクマリン６カプセル化ＮＰで処置した。遊離ＤＩＲまたはクマリン６（１％Ｔｗｅｅｎ２０で可溶化）は対照としての役割をはたした。マウスを胃管栄養後、４、８、１２または２４時間の時点で屠殺し、Ｂｒｕｋｅｒ分子イメージング機器（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．）を使用してエクスビボで臓器をスキャンして蛍光強度を測定した。蛍光データを一成分指数関数的減衰モデル：Ｙ＝Ｙ_ｆ＋（Ｙ_ｏ－ｅ^－ｋｔ）にフィッティングした。ｐＵＤＣＡ、ＰＬＧＡまたは混合物（５０：５０、ｗ/ｗ）によって製剤化されたＤＩＲ負荷ＮＰもまた、それらの生体内分布を遊離色素と比較するために、尾静脈注射によってマウスに静脈内（ＩＶ）投与した（１００ｍｇ／ｋｇ、５０μＬ）。マクロファージ枯渇キット（Ｃｌｏｄｒｏｓｏｍｅ（登録商標）、Ｅｎｃａｐｓｕｌａ Ｎａｎｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ＩＰ）注射）を使用して、Ｂ６マウスのマクロファージを枯渇させた。組織学について、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにプルシアンブルー染色によって組織学的に分析するために、酸化鉄負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰを経口投与したマウス由来の膵臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。染色された切片は、イェール大学病理組織学サービスが調製した。Ｎｉｋｏｎ ＤＳ Ｆｉ１カラーカメラおよびＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェア（バージョン２．３０）を備えたＮｉｋｏｎ ＴＥ－２０００Ｕ顕微鏡で組織をイメージングした。

糖尿病動物モデルを用いた実験。ＮＯＤマウスにＣＹ（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、急性Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を誘導した（図４Ａ～図４Ｉ）。２４時間後、マウスに空のＮＰ、ＲＡＰＡ負荷ＮＰ（５０、１００、および５００ｍｇＮＰ／ｋｇ＝４０ｍｇＲＡＰＡ／ｋｇ）、可溶性ＲＡＰＡ（１％Ｔｗｅｅｎ２０で可溶化した４０ｍｇ／ｋｇ）および食塩水を経口胃管栄養した。ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡを１日目（用量Ｉ）に、または１日目および２日目に２回（用量ＩＩ）経口投与した。血糖値を、血糖モニター（Ｔｒｕｅｒｅｓｕｌｔ（登録商標）メーター、ＨｏｍｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用してモニタリングした。２００ｍｇ／ｄＬより高い２つの測定値（１日間隔）をＴ１Ｄの発症の指標とした。ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡを、このモデルを使用して、インスリン投与の「ゴールドスタンダード」である、インスリンの皮下投与（ＳＱ）または腹腔内投与（ＩＰ）と比較した。インスリンの７回の連続注射または同等のインスリン用量のｐＵＤＣＡ_ＩＮＳの経口胃管栄養の後、血糖を２５日間にわたって測定した。操作受容体枯渇モデルＹ＝Ｂａｓａｌ＋（Ｅｆｆｅｃｔ_ｍａｘＢａｓａｌ）／（１＋ｏｐｅｒａｔｅ）［式中、ｏｐｅｒａｔｅ＝（（（１０^{ｌｏｇｋＡ}）＋（１０^Ｘ）））／（１０^{（ｌｏｇｔａｕ＋Ｘ）}））^ｎであり、Ｅｆｆｅｃｔ_ｍａｘは考えられる系の最大応答であり、Ｂａｓａｌはアゴニストの非存在下での応答であり、ｋＡはアゴニスト－受容体解離定数であり、ｔａｕは最大応答の半分まで低下させる動態である］を使用してデータをフィッティングした。

自然発症Ｔ１Ｄモデルのために、ＮＯＤマウスをおよそ２ヶ月間収容して、Ｔ１Ｄを自然に発達させた。自然発症Ｔ１Ｄモデルの場合、同じ年齢（８週齢）のＮＯＤマウスを、同じ週（１６週齢、２００±１５ｍｇ／ｄＬの２回のランダムな尾静脈血糖測定値の後）に糖尿病になった場合にのみ、試験用に選択した。これらのマウスを、空のＮＰ、ＩＮＳ負荷ＮＰ（１００または５００ｍｇ ＮＰ／ｋｇおよび２８５ｍＩＵ ＩＮＳ／ｋｇ）または遊離ＩＮＳ（２８５ｍＩＵ／ｋｇ）で１週間７回経口処置して、糖尿および体重をモニタリングした。ＧＬＰ－１の濃度を、血漿由来のＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。ブタを水を飲める状態で１２時間超絶食させ、アロキサンをＩＶ投与した（２５０ｍＬ、１５０ｍｇ／ｋｇ）。アロキサン処置から１０日後に、動物（ｎ＝３）にｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ（マウスでの１００ｍｇ／ｋｇに相当する６．４ｍｇ／ｋｇ）を１日７回経口胃管栄養を行い、連続グルコースモニタリングシステムＤｅｘＣｏｍ６（Ｄｅｘｃｏｍ．Ｉｎｃ．）を用いてグルコース読み取り値をモニタリングした。較正は、Ｒｅｌｉｏｎ Ｐｒｉｍｅ ＢＧ Ｍｅｔｅｒ（Ｒｅｌｉｏｎ）を用いてイヤースティックによって行い、さらなる静脈較正は、Ａｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって全血試料から行った。

自然発症Ｔ１Ｄ試験で選択されたＩＮＳ用量の計算 ヒトの血糖値を５０ｍｇ／ｄＬ低下させるためには、１国際単位（ＩＵ）のＩＮＳが必要であることが知られている。高血糖値（４００ｍｇ／ｄＬ超）を高血糖閾値（２００ｍｇ／ｄＬ）未満に低下させるためには、少なくとも４ＩＵのＩＮＳが必要である。それは、以下の式（９）によれば０．０２ＩＵのマウスのＩＮＳである。

［式中、ＨＥＤ＝ヒト等価用量（ｍｇ／ｋｇ）、動物のＮＯＡＥＬ＝動物についての無毒性量（ｍｇ／ｋｇ）、１ＩＵのＩＮＳ＝世界保健機関の換算係数に基づく０．０３６ｍｇ］

ｐＵＤＣＡ ＮＰ中のＩＮＳの負荷は約２０ｎｇ／ｍｇのＮＰであり、これは５．６×１０^４ＩＵ／ｍｇのＮＰである。０．０２ＩＵのＩＮＳを与えるために、一匹のマウスに対して、３５ｍｇのｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ ＮＰを処置すべきである。したがって、糖尿病マウスを３用量の１０ｍｇのＮＰで処置し、グルコースレベルを低く保つためにさらに４用量でマウスを処置し続けた（合計で０．０４ＩＵのＩＮＳおよび７０ｍｇのＮＰ）。

ｐＵＤＣＡおよびＵＤＣＡの毒性学。急性毒性試験を１０週齢の雌Ｂ６マウスで行った。０日目にマウスにｐＵＤＣＡ（１００および５００ｍｇ／ｋｇ）およびＵＤＣＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。Ｔｅｃｏ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃからのキットを、アルカリホスファターゼ、アラニントランスフェラーゼ、総ビリルビンおよび血中尿素窒素濃度の血清濃度の分析のために３、５および７日目に使用した。ＥＤＴＡ抗凝固処理血液をＨｅｍａｖｅｔ血液カウンター（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。

統計。すべての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０１）を使用して行った。ボンフェローニの事後検定または両側スチューデントのｔ検定によるＡＮＯＶＡ分析を使用した複数の群との実験比較を行った。生存データについて、ログランク検定およびχ^２統計分析を行った。０．０５以下のＰ値を統計的に有意とみなした。

実施例２．ｐＵＤＣＡは、担体であり、かつ相加的な代謝／免疫調節薬物以上のものである。
材料および方法
材料および方法は上記の通りである。

ＴＧＲ５受容体の活性化によって促進される膵臓β細胞からのインスリン産生を試験するために、マウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６、ＡＴＣＣ）細胞を、３ｍＭのグルコースを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２時間インキュベートし、次いで、２５ｍＭのグルコース及びＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ又はｐＵＤＣＡ ＮＰ（４０μｇ／ｍＬ）を含むＨＢＳＳ中で３０分間インキュベートした。インスリンの濃度を、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＩｎｓｕｌｉｎＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ）を使用して測定した。

同じ実験を、ＴＧＲ５アンタゴニスト、対照としてのトリアムテレン（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で行って、ＴＧＲ５活性化のない細胞からの固有のインスリン産生を区別し、結果を正規化するために使用した。

ＴＧＲ５受容体の活性化によって促進される膵臓β細胞からのインスリン産生を試験するために、マウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６、ＡＴＣＣ）細胞を、３ｍＭのグルコースを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２時間インキュベートし、次いで、２５ｍＭのグルコース及びＵＤＣＡ、ＰＬＧＡ又はｐＵＤＣＡ ＮＰ（４０μｇ／ｍＬ）を含むＨＢＳＳ中で３０分間インキュベートした。インスリンの濃度を、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＩｎｓｕｌｉｎＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ）を使用して測定した。同じ実験を、ＴＧＲ５アンタゴニスト、対照としてのトリアムテレン（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で行って、ＴＧＲ５活性化のない細胞からの固有のインスリン産生を区別し、結果を正規化するために使用した。

可溶性の抗ＣＤ２８ ５ｕｇ／ｍＬおよび１０ｕｇ／ｍＬでプレーティングした抗ＣＤ３を使用して、ＯＴＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０^４細胞／ウェル、９６ウェルプレート）を３日間刺激した。ＩＦＮγをＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。

結果
ｐＵＤＣＡは薬物担体として機能するが、本質的に治療的でもある。したがって、ｐＵＤＣＡ_ＩＮＳでは、血糖制御は、血液プールへの直接的なインスリン供給ならびにＢＡ受容体の強力なライゲーションの結果としての本質的な治療上の利益の重畳である。インスリンが膵臓および血液プールの両方において材料から生物学的に利用可能にされる程度が、図６Ｈおよび図６Ｉに示される。第１に、経口摂取された色素負荷ｐＵＤＣＡの生体内分布の以前の研究と一致して、ｐＵＤＣＡによって供給されたインスリンは最初に膵臓でより多く現れ、次いで血液プールに自然に流れており、これは、インスリンのｐＵＤＣＡ媒介送達が、膵臓から始まり、次いで血液中で利用可能になる生理学的に適切な態様で起こっているという考えを強調するものである。ｐＵＤＣＡ_ＩＮＳの経口胃管栄養後、４、８、２４時間で、ＰＬＧＡまたは可溶性インスリンの注射による送達と比較して、ｐＵＤＣＡに由来する膵臓および血中インスリンの増加が観察された。

第２に、ｐＵＤＣＡの固有の治療特性は、インスリンをカプセル化しない場合に、それが内因性グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ－１）分泌およびインスリン産生を増加させたという事実によって強調される（図６Ｊおよび図６Ｋ）。インクレチンであるＧＬＰ－１はインスリン分泌活性を有し、内因性インスリン分泌を促進することによって血糖値を低下させることができる。ｐＵＤＣＡ摂取後にインビボでＴＧＲ５受容体を遮断すると腸内分泌Ｌ細胞からのＧＬＰ－１分泌が抑止されるという事実は、ＴＧＲ５への結合およびインスリンのみの送達を超える治療効果の誘導におけるｐＵＤＣＡの役割を強調する。実際、インスリンの代謝制御を超えて、ＴＧＲ５への結合は、ｐＵＤＣＡで処置した動物の膵臓リンパ節におけるＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度の減少およびＴｒｅｇの増加を伴うＴ細胞頻度免疫調節をもたらし（図６Ｌおよび図６Ｍ）、これはＴ１Ｄ予防研究と一致している（図４Ｆ～図４Ｉ）。

ＵＤＣＡ及びｐＵＤＣＡはいずれも、ＰＬＧＡ粒子と比較して、膵臓β細胞からのより多くのインスリン分泌を誘導することができた（図３Ｍ）。

インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の減少はまた、Ｔ細胞のｐＵＤＣＡへの曝露、その後の抗原を提示する樹状細胞の係合の際（図３Ｄ）、または、ＣＤ４＋Ｔ細胞をｐＵＤＣＡで直接処理し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激し（図３Ｎ）、マクロファージの表現型がＭ１からＭ２へ傾斜した際（図６Ｎおよび図６Ｏ、図３Ｅ）に観察された。したがって、ｐＵＤＣＡの抗炎症機能は、自然免疫から獲得免疫に及ぶ複数の免疫学的機序に及んでおり、様々な疾患状態におけるモノマーＵＤＣＡの様々な治療的および免疫調節的な側面を例示する以前の報告と一致している。しかしながら、ｐＵＤＣＡは、ＵＤＣＡの非常に強力なフォーマットであり、したがって、図６Ａ～図６Ｏに示されるように、ＵＤＣＡ単独では不可能な機能の機序およびモダリティを導入する。

実施例３ Ｔ１Ｄの予防：ＲＡＰＡ負荷ｐＵＤＣＡの検証
抗炎症応答の誘導における治療的アゴニスト効果をもたらすｐＵＤＣＡの生体内分布特性および高いアビディティでＴＧＲ５に結合することにおけるｐＵＤＣＡの潜在的な役割を考慮して、Ｔ１Ｄの予防におけるｐＵＤＣＡの役割を調べた。予防研究のためのシクロホスファミド（ＣＹ）を用いた化学的に誘導可能な膵臓炎症（図４Ａ～図４Ｉ）、およびＴ１Ｄの処置のための自然発症マウス非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデル（図６Ａ～図６Ｏ）という２つのＴ１Ｄ動物モデルを利用した。化学的に誘導可能なモデルを利用して、疾患の病態生理に対する初期制御、ひいては予防的介入のための最適時間の選択を達成した。

材料および方法
材料および方法は上記の通りである。

ｐＵＤＣＡおよびそのモノマーＵＤＣＡ、ポリ（リトコール酸）（ｐＬＣＡ）およびポリ（デオキシコール酸）（ｐＤＣＡ）をすべてこの試験で比較した。ＬＣＡおよびＤＣＡは既知の炎症促進性および発がん性作用物質である一方で、これらはＴＧＲ５の強力な天然アゴニストであり、Ｔ１Ｄの予防におけるｐＵＤＣＡおよびそのモノマーＵＤＣＡとの比較に使用した（図４Ａ）。ＣＹ（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）注射して糖尿病動物を誘導し、この動物に１日目および２日目に５００ｍｇ／ｋｇでの２つの用量を投与した。その後、血糖値を３０日間モニタリングした。

ＲＡＰＡは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）５１に対するＴ細胞およびＢ細胞の感受性の低下を伴う免疫抑制効果を有するマクロライドｍＴＯＲ抑制剤である。ＲＡＰＡをカプセル化したｐＵＤＣＡ（ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡ、ＮＰ１ｍｇ当たり０．０８ｍｇ）を、誘導後１日目に１回（用量Ｉ）、または１日目および２日目に２回（用量ＩＩ）投与した（図４Ａ）。

結果
驚くべきことに、ｐＬＣＡ、ｐＤＣＡおよびさらにはＵＤＣＡと比較して、ｐＵＤＣＡ経口摂取は、薬物を一切負荷することなく、最低血糖値および糖尿病状態への最低頻度の変換をもたらした（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＬＣＡおよびＤＣＡは最も強力なＴＧＲ５アゴニストのうちの２つであるにもかかわらず、ｐＵＤＣＡの利益はｐＬＣＡおよびｐＤＣＡよりも大きかった。これは、それらの疎水性の違いおよびｐＵＤＣＡと比較して低いバイオアベイラビリティによって、またはＬＣＡおよびＤＣＡが炎症促進性であるために媒介される可能性がある。ＬＣＡおよびＤＣＡの元の親和性が高いことにより、限られたＢＡ受容体部位に対する競合に起因して、より高い結合価で本来の親和性が低下し得るという普遍的な生物物理学的現象である多価性の結果として、アビディティが低下する可能性もある。一般に、ｐＵＤＣＡはＵＤＣＡの治療効果を増幅し、この増幅された応答の機序およびカプセル化された薬物との相乗効果の可能性を調べた。

薬物誘導マウスの６０％は、誘導後１０日におけるＰＬＧＡ処置により高い血糖値（２００ｍｇ／ｄＬ超）を示したが、グルコースレベルは、ＲＡＰＡ負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰによって用量依存的に３０日間にわたって減衰した（図４Ｄおよび図４Ｅ、図５Ａおよび図５Ｂ）。ＰＬＧＡ_ＲＡＰＡおよびＲＡＰＡ単独では、血糖は同じレベルまで減衰させず、６０％の動物がＴ１Ｄを発症した（図４Ｄおよび図４Ｅ）。生存した動物の膵臓流入領域リンパ節におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の分析（図４Ｆ～４Ｉ）は、処置マウスにおける活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋）の頻度が食塩水と比較して、ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡによって減少したことを示した（５日目に用量ＩおよびＩＩにつきそれぞれ６３％および８８％の減少）。さらに、食塩水と比較して、ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡによって制御性（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度が同時に増加した（用量ＩおよびＩＩにつきそれぞれ２．４倍および９．７倍の増加）。

実施例４ Ｔ１Ｄのマルチモーダル処置：経口投与されたインスリンｐＵＤＣＡの前臨床検証
確立された疾患の処置は、病理の自然発生的性質および疾患症状発現の経時的な不均一性のために、より困難な課題である。インスリンは全身治療薬の「ゴールドスタンダード」であるので、確立された疾患を抑止するインスリン負荷ｐＵＤＣＡ（ｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ）の能力をＮＯＤ Ｔ１Ｄ動物モデルにおいて試験した。これは、マウスのヒト等価糖尿病モデルとして長い確立された歴史を有するモデルであり、処置における可溶性インスリンの効果に関して明確に期待されている。

材料および方法
約２００ｍｇ／ｄＬの血糖値を有するＮＯＤマウスに、２つの異なる用量のｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ（１００または５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ動物１匹当たり２および１０ｍｇのＮＰに相当）を経口胃管栄養した（図６Ａ）。モノマーＵＤＣＡの弱いアゴニスト性のために、より高い用量（５００ｍｇ／ｋｇ）でｐＵＤＣＡとの比較を行った。投与は、血糖値を正常（２００ｍｇ／ｄＬ未満）に回復するために必要なインスリンの予測量の大まかな推定に基づいて確認し、１群当たりのマウス１匹当たり４０ｍＩＵの累積用量は、連続７日間にわたるマウス１匹当たりの１日当たり１０ｍｇの粒子に相当する（図６Ａ～図６Ｅ）。

結果
合計０．０１１ＩＵのインスリンをカプセル化したｐＵＤＣＡの２用量の後、グルコースレベルが低下し、血漿グルコースレベルが糖尿病の閾値２００ｍｇ／ｄＬ以下に低下した（図６Ａ）。ｐＵＤＣＡは、そのモノマー対応物と比較して、７日間にわたって血糖値を低下させる上で有意により有効であった。ヒトでは、１ＩＵのインスリンは、一般に、５０ｍｇ／ｄＬの血糖降下に相当する。この結果は、ほぼ１／１００倍の低い用量でｐＵＤＣＡを用いて、血糖値の再正常化が、ＵＤＣＡよりも強力な形で短期間に達成され得ることを実証している。

実施例５．モデル抗原オボアルブミンを用いたｐＵＤＣＡおよび抗原特異的寛容
材料および方法
材料および方法は上記の通りである。

試験したｐＵＤＣＡ ＮＰは、空であるか、抗原ＯＶＡ（オボアルブミン）のみを含有していたか、またはＯＶＡとＲＡＰＡとの組み合わせであった。

この試験では、ＯＴｉｉ養子移入による有効性を検出するためのＡ群、およびＯＴｉｉマウス（細胞移入なし）における有効性を評価するためのＢ群、という２群のマウスを使用した。実験セットアップを図７Ａおよび図７Ｂに示す。

結果
結果を図７Ｃに示す。
結果を以下の表４にも要約する。

実施例６ Ｔ１Ｄの予防：ＲＡＰＡ負荷ｐＵＤＣＡの検証
抗炎症応答の誘導における治療的アゴニスト効果をもたらすｐＵＤＣＡの生体内分布特性および高いアビディティでＴＧＲ５に結合することにおけるｐＵＤＣＡの潜在的な役割を考慮して、Ｔ１Ｄの予防におけるｐＵＤＣＡの役割を調べた。

確立された疾患の処置は、病理の自然発生的性質および疾患症状発現の経時的な不均一性のために、より困難な課題である。インスリンは全身治療薬の「ゴールドスタンダード」であるので、確立された疾患を抑止するインスリン負荷ｐＵＤＣＡ（ｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ）の能力をＮＯＤ Ｔ１Ｄ動物モデルにおいて試験した。これは、マウスのヒト等価糖尿病モデルとして長い確立された歴史を有するモデルであり、処置における可溶性インスリンの効果に関して明確に期待されている。

材料および方法
材料および方法は上記の通りであった。

予防研究のためのシクロホスファミド（ＣＹ）を用いた化学的に誘導可能な膵臓炎症（図９Ａ～図９Ｂ）、およびＴ１Ｄの処置のための自然発症マウス非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデル（図１１Ａ～図１１Ｏおよび表６）という２つのＴ１Ｄ動物モデルを利用した。化学的に誘導可能なモデルを利用して、疾患の病態生理に対する初期制御、ひいては予防的介入のための最適時間の選択を達成した。

ｐＵＤＣＡおよびそのモノマーＵＤＣＡ、ポリ（リトコール酸）（ｐＬＣＡ）およびポリ（デオキシコール酸）（ｐＤＣＡ）をすべてこの試験で比較した。ＬＣＡおよびＤＣＡは既知の炎症促進性および発がん性作用物質である一方で、これらはＴＧＲ５の強力な天然アゴニストであり、Ｔ１Ｄの予防におけるｐＵＤＣＡおよびそのモノマーＵＤＣＡとの比較に使用した（図９Ａ）。

ＣＹ（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）注射して糖尿病動物を誘導し、この動物に１日目および２日目に５００ｍｇ／ｋｇでの２つの用量を投与した。その後、血糖値を３０日間モニタリングした。

約２００ｍｇ／ｄＬの血糖値を有するＮＯＤマウスに、２つの異なる用量のｐＵＤＣＡ_ＩＮＳ（１００または５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ動物１匹当たり２および１０ｍｇのＮＰに相当）を経口胃管栄養した（図１１Ａ）。モノマーＵＤＣＡの弱いアゴニスト性のために、より高い用量（５００ｍｇ／ｋｇ）でｐＵＤＣＡとの比較を行った。投与は、血糖値を正常（２００ｍｇ／ｄＬ未満、方法を参照されたい）に回復するために必要なインスリンの予測量の大まかな推定に基づいて確認し、１群当たりのマウス１匹当たり４０ｍＩＵの累積用量は、連続７日間にわたるマウス１匹当たりの１日当たり１０ｍｇの粒子に相当する（図１１Ａ～図１１Ｅ）。

ＲＡＰＡは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）５１に対するＴ細胞およびＢ細胞の感受性の低下を伴う免疫抑制効果を有するマクロライドｍＴＯＲ抑制剤である。ＲＡＰＡをカプセル化したｐＵＤＣＡ（ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡ、ＮＰ１ｍｇ当たり０．０８ｍｇ）を、誘導後１日目に１回（用量Ｉ）、または１日目および２日目に２回（用量ＩＩ）投与した（図９Ａ）。

結果
驚くべきことに、ｐＬＣＡ、ｐＤＣＡおよびさらにはＵＤＣＡと比較して、ｐＵＤＣＡ経口摂取は、薬物を一切負荷することなく、最低血糖値および糖尿病状態への最低頻度の変換をもたらした（図９Ｂおよび図９Ｃ）。

図３Ａ～図３Ｅは、インビトロおよびインビボでのポリマー胆汁酸（ｐＢＡ）の分布および取り込みを示すグラフである。ＬＣＡおよびＤＣＡは最も強力なＴＧＲ５アゴニストのうちの２つであるにもかかわらず、ｐＵＤＣＡの利益はｐＬＣＡおよびｐＤＣＡよりも大きかった。これは、それらの疎水性の違いおよびｐＵＤＣＡ（図３Ａ）と比較して低いバイオアベイラビリティによって、またはＬＣＡおよびＤＣＡが炎症促進性であるために媒介される可能性がある。ＬＣＡおよびＤＣＡの元の親和性が高いことにより、限られたＢＡ受容体部位に対する競合に起因して、より高い結合価で本来の親和性が低下し得るという普遍的な生物物理学的現象である多価性の結果として、アビディティが低下する可能性もある。一般に、ｐＵＤＣＡはＵＤＣＡの治療効果を増幅し、この増幅された応答の機序およびカプセル化された薬物による相加的効果を超える可能性を調べた。

薬物誘導マウスの６０％は、誘導後１０日におけるＰＬＧＡ処置により高い血糖値（２００ｍｇ／ｄＬ超）を示したが、グルコースレベルは、ＲＡＰＡ負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰによって用量依存的に３０日間にわたって減衰した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。ＰＬＧＡ_ＲＡＰＡまたはＲＡＰＡ単独では、血糖は同じレベルまで減衰させず、６０％の動物がＴ１Ｄを発症した。生存した動物の膵臓流入領域リンパ節におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の分析は、処置マウスにおける活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４４＋）の頻度が食塩水と比較して、ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡによって減少したことを示した（５日目に用量ＩおよびＩＩにつきそれぞれ６３％および８８％の減少）。

さらに、食塩水と比較して、ｐＵＤＣＡ_ＲＡＰＡによって制御性（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度が同時に増加した（用量ＩおよびＩＩにつきそれぞれ２．４倍および９．７倍の増加）。

ｐＵＤＣＡ／インスリンの経口投与は、自然発症Ｔ１Ｄにおいて、ＢＤＣおよびＲＡＰＡ－ｐＵＤＣＡを投与した場合（図８Ｂ～図８Ｅ）、ＮＯＤマウスにおいて高血糖を短期間で退行させ、長期持続性の治療的免疫調節を誘導する（図８Ａ）。

合計０．０１１ＩＵのインスリンをカプセル化したｐＵＤＣＡの２用量の後、グルコースレベルが低下し、血漿グルコースレベルが糖尿病の閾値２００ｍｇ／ｄＬ以下に低下した。ｐＵＤＣＡは、そのモノマー対応物と比較して、７日間にわたって血糖値を低下させる上で有意により有効であった。ヒトでは、１ＩＵのインスリンは、一般に、５０ｍｇ／ｄＬの血糖降下に相当する。この結果は、ほぼ１／１００倍の低い用量でｐＵＤＣＡを用いて、血糖値の再正常化が、ＵＤＣＡよりも強力な形で短期間に達成され得ることを実証している。

実施例７ インスリン負荷ｐＵＤＣＡ ＮＰは、成体オサボーブタにおけるアロキサン誘発糖尿病を迅速に逆転させた。
材料および方法
材料および方法は上記の通りである。

アロキサン誘発糖尿病では、グルコキナーゼが阻害され（短期から中期）、活性酸素種ＲＯＳ形成（長期）によるベータ細胞の選択的壊死が観察される。動物は１０日後に「安定」であり、糖尿病である（図９Ａおよび図９Ｂ）。

この試験の目的は、起こり得るアロキサン自己回復変動（１０日間で約１０％）を超える治療効果を試験することであった。この試験には、ブタＮｏ．２８６９、Ｎｏ．２８４７およびＮｏ．２８３２の３匹のブタを使用し、アロキサン誘発糖尿病を有していた。これらのブタに、７日間にわたり０．０１％インスリンを含むｐＵＤＣＡの累積１日用量（６．４ｍｇ／ｋｇ用量）を投与した。

結果
図１０Ａの結果は、インスリン含有ｐＵＤＣＡによるアロキサン誘発糖尿病ブタの７日間の処置が、平均血糖値に有意な変化をもたらしたことを示す（図１０Ａおよび表６）。皮下インスリンによる処置と比較した場合、経口ｐＵＤＣＡ－インスリン処置による血糖値に実質的な変化があった（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。図１０Ｃは、ｐＵＤＣＡ－インスリンの単回用量（ＮＤＰ＝２００）がＳＣインスリン注射の繰り返しの必要性を排除するのに十分であったことを示す。図１０Ｅは、ｐＵＤＣＡ ＮＰが、以下の３つの点、すなわち、後期Ｔ１ＤおよびＴ２Ｄを処置するための良好なバイオアベイラビリティを有する経口送達、早期Ｔ１Ｄを処置するための代謝回復、ならびに早期Ｔ１Ｄのための自己免疫反応性の低下、から糖尿病のケアおよび処置を提供することを示す。

実施例８多発性硬化症の動物モデルにおける抗原特異的寛容
材料および方法
材料および方法は上記の通りである。

実験スキームを図１１Ａに示す。免疫化および寛容化抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質３５－５５（ＭＯＧ）であった。治療投薬、すなわち疾患の組織学的かつ物理的証拠。伝統的なスコアリング、尾部下垂から後肢／前肢の麻痺を反映する０～５。

結果
ＰＵＤＣＡ ＮＰの経口投与は、疾患スコアの有意な低下をもたらした。ＰＵＤＣＡ－ＭＯＧが有効であったが、Ｒａｐａの添加が最も有効であった。ＭＯＧを含む可溶性Ｒａｐａは効果がなく、これにより、ＰＵＤＣＡプラットフォーム（送達、細胞保護および抗炎症効果）の影響が実証された（図１１Ｂ）。

実施例９ コラーゲン誘発関節炎の動物モデルにおける抗原特異的寛容
材料および方法
材料および方法は上記の通りである。

実験スキームを図１２Ａに示す。免疫化および寛容化抗原は、関節リウマチの動物モデルを確立するためのコラーゲン（ＣＯＬ）であった。半治療的投薬、すなわち疾患の組織学的証拠を使用した。コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）疾患スコアについて、従来のスコアリング、肢１本当たり０から４、マウス１匹当たり最大でスコア１６を使用した。

処置は、２用量の抗原チャレンジ後、２１日目に開始した。

結果
ＰＵＤＣＡ ＮＰの経口投与は、疾患スコアの低下をもたらした。ＰＵＤＣＡ－ＣＯＬは有効であったが、Ｒａｐａの添加が最も有効であった。ＰＵＤＣＡ－Ｒａｐａは、おそらく相乗的な抗炎症活性を反映して、ある程度の有効性を示した。モデルは、重篤な疾患のために早期に終了した。この結果を図１２Ｂに示す。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物およびそれらが引用される資料は、参照により具体的に組み込まれる。

当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を理解するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (28)

1. 対象の抗原特異的寛容または減少した非特異的炎症を誘導するための製剤であって、約８００～２４０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する胆汁酸エステル化ポリマー、抗原に対する免疫応答を減少させるか、炎症を減少させるか、または制御性Ｔ細胞を増加させる免疫調節剤、および必要に応じて望ましくない免疫応答に関連する抗原を含む有効量のナノ粒子を含む、製剤。
2. 前記胆汁酸エステル化ポリマーが、少なくとも２つの胆汁酸モノマーのポリマーに相当する約８０００～２０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１に記載の製剤。
3. 前記胆汁酸エステル化ポリマーが、ポリマーウルソデオキシコール酸（ｐＵＤＣＡ）、ポリマーリトコール酸（ｐＬＣＡ）、ポリマーデオキシコール酸（ｐＤＣＡ）、ポリマーケノデオキシコール酸（ｐＣＤＣＡ）、およびポリマーコール酸（ｐＣＡ）からなる群より選択される、請求項１に記載の製剤。
4. 前記胆汁酸エステル化ポリマーが、約８００～５０００Ｄａの分子量を有するｐＵＤＣＡである、請求項１に記載の製剤。
5. 前記胆汁酸エステル化ポリマーが、式ＶＩＩ：
   

   

   に示されるｐＵＤＣＡであり、式中、ｎは２～２０の数である、
   請求項４に記載の製剤。
6. 前記胆汁酸エステル化ポリマーが、１００～５０００個の胆汁酸モノマーを含む前記ナノ粒子上に表面を形成し、胆汁酸受容体に対して前記胆汁酸エステル化ポリマーを形成するそれぞれのモノマーよりも少なくとも１．５倍大きい親和性を有する、請求項１に記載の製剤。
7. 前記胆汁酸エステル化ポリマーが、直鎖ポリマーおよび／または分岐ポリマーである、請求項１に記載の製剤。
8. 前記免疫調節剤が、ラパマイシン（シロリムス）およびラパマイシンの類似体からなる群より選択される、請求項１に記載の製剤。
9. 前記免疫調節剤が免疫抑制薬である、請求項１に記載の製剤。
10. 前記免疫調節剤が制御性Ｔ細胞の数を増加させる、請求項１に記載の製剤。
11. 自己抗原、疾患特異的抗原、種特異的抗原、もしくは発現ベクター特異的抗原を含むか、または、自己抗原、疾患特異的抗原、種特異的抗原、もしくは発現ベクター特異的抗原を含むキット中にある、請求項１に記載の製剤。
12. 診断薬を含む、請求項１に記載の製剤。
13. 対象において寛容を誘導するかまたは免疫応答を低下させる方法であって、有効量の請求項１に記載の製剤を前記対象に経口投与することを含む、方法。
14. ナノ粒子が、心臓、腎臓、脾臓、肺、肝臓、または膵臓に特異的な標的化分子の非存在下で、心臓、腎臓、脾臓、肺、肝臓、および膵臓からなる群より選択される内臓に優先的に分布する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記対象が、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、食物アレルギー、環境アレルギー、および抗薬物抗体または抗核酸抗体（ＡＤＡ）を伴う疾患からなる群より選択される自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を有する、請求項１３に記載の方法。
16. 前記有効量の前記製剤が、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇのナノ粒子～１０００ｍｇのナノ粒子を含む、請求項１３に記載の方法。
17. 前記対象が１型糖尿病を有し、血糖を低下させるための免疫抑制薬または寛容誘導剤を含む有効量の前記製剤を、それを必要とする対象に経口投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
18. 前記ナノ粒子がラパマイシンおよびインスリンを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記製剤が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、または少なくとも３週間の期間にわたって投与される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記製剤が１日１回投与される、請求項１７に記載の方法。
21. 前記対象が、請求項１に記載の製剤の投与停止後に、少なくとも約３日間、約５日間、約１週間、約２週間、約１ヶ月間またはそれを超えて健康な血糖を維持する、請求項１７に記載の方法。
22. 前記対象における制御性Ｔ細胞の数を増加させる、請求項１７に記載の方法。
23. 前記対象において寛容原性表現型を誘導する、請求項１７に記載の方法。
24. 前記対象が全身性エリテマトーデスを有し、前記疾患の１またはそれを超える症状を減少させるための有効量の請求項１に記載の製剤を、それを必要とする対象に経口投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
25. 前記対象が関節リウマチを有し、疼痛を軽減するための有効量の請求項１に記載の製剤を、それを必要とする対象に経口投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
26. 前記対象が多発性硬化症を有し、前記疾患の１またはそれを超える症状を減少させるための有効量の請求項１に記載の製剤を、それを必要とする対象に経口投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
27. 前記薬物が、抗薬物抗体を有するか、または抗薬物抗体を発現するリスクを有し、前記薬物に対する寛容を誘導するための有効量の請求項１に記載の製剤を、それを必要とする対象に経口投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
28. 前記対象がアレルギーを有し、アレルギー反応を減少させるための有効量の請求項１に記載の製剤を、それを必要とする対象に経口投与することを含む、請求項１３に記載の方法。