DE60320573T2

DE60320573T2 - Verfahren zur expression und sekretion von proteinen mittels des nicht-konventionellen hefe zygosaccharomyces bailii

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Publication number: DE60320573T2
Application number: DE60320573T
Authority: DE
Inventors: Danilo Porro; Paola Branduardi; Minoska Valli; Lilia Alberghina
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-06
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2023-11-07
Also published as: EP1558722B1; DE10252245A1; DE60320573D1; WO2004042036A2; US20070065905A1; AU2003283362A1; ATE393210T1; EP1558722A2; WO2004042036A3

Description

Die Massenproduktion von gentechnisch veränderten (rekombinanten, mutagenisierten, ...) Proteinen stellt eine Alternative zur Extraktion von Proteinen aus natürlichen Quellen dar. Natürliche Proteinquellen sind oft begrenzt und die Konzentration des gewünschten Produkts ist im Allgemeinen gering, so dass eine Extraktion gewöhnlich sehr teuer und sogar unmöglich ist. Außerdem könnte eine Extraktion je nach dem natürlichen Ursprung des Proteins die Gefahr einer toxischen oder infektiösen Kontamination mit sich bringen.
Mit dem Aufkommen des molekularen Klonen in der Mitte der 70er Jahre wurde es möglich, Fremdproteine in neuen Wirten herzustellen. Rekombinante DNA(rDNA)-Technologien (gentechnische Manipulationen an Genen, Proteinen und Stoffwechsel) gestatten die Produktion eines breiten Spektrums von Peptiden und Proteinen aus natürlich nicht-produzierenden Zellen. Faktisch waren die ersten mit rDNA auf dem Weltmarkt hergestellten biotechnologischen Produkte pharmazeutische Produkte (z. B. Insulin, Interferone, Erythropoetin, Impfstoff gegen Hepatitis B) sowie industriell eingesetzte Enzyme (welche z. B. für die Behandlung von Nahrungsmitteln, Futter, Detergentien, Papierbrei oder im Gesundheitswesen verwendet werden). Der weltweite Erlös der 20 am meisten verkauften rekombinanten pharmazeutischen Produkte im Jahre 2000 betrug 13 Billionen Euro, währen auf dem Weltmarkt für industriell eingesetzte Enzyme etwa 2,0 erlöst wurden und für das Jahr 2008 ist geplant, dass etwa 8 Billionen Euro erreicht werden.
Mikroorganismen und kultivierte Zellen von höheren Organismen (wie z. B. Säugetieren, Insekten oder Pflanzen) stellen die hauptsächlich zur Verfügung stehenden Wirte für die Produktion von heterologen sowie homologen Proteinen dar.
Es sind einige Verfahren zur Produktion von Proteinen mit Hilfe einer Zellkultur aus Säugerzellen entwickelt worden und es sind viele derart produzierte Proteine auf dem Markt. Unter ihnen befinden sich verschiedene Impfstoffe, monoklonale Antikörper, Interferon, Blutfaktoren, Urokinase und tPA, Hormone und Wachstumsfaktoren.
Der Hauptvorteil eines auf Säugerzellen basierenden Expressionssystems beruht auf der Möglichkeit der Säugerzellen, die Proteine auf geeignete Weise zu prozessieren (richtige Faltung, geeignete Modifikation nach der Translation, richtige Glykosylierung, spezifische proteolytische Aktivitäten, usw.). Ein von einer rekombinanten DNA aus einem Säugetier (Menschen) exprimiertes geklontes Protein wird gewöhnlich richtig prozessiert und gefaltet und wird im Allgemeinen in das Medium ausgeschieden, was eine schnelle Gewinnung und Reinigung gestattet. Andererseits sind in Folge einer gewöhnlich niedrigen Expressionsrate, der Kosten für die Komponenten des Säugermediums, sehr geringer Wachstumsgeschwindigkeiten und der Anforderungen an die Bedingungen der Kultur die Herstellungskosten im Allgemeinen ziemlich hoch. Ferner birgt eine Produktion in Säugerzellen die Gefahr einer toxischen oder infektiösen Kontamination des Produkts.
Mikroorganismen (sowohl prokaryotische als auch eukaryotische) stellen für die Produktion von Proteinen vorteilhafte Wirte dar, weil sie über hohe Wachstumsgeschwindigkeiten verfügen und sich im Allgemeinen leicht genetisch manipulieren lassen. Bakteriellen Wirten fehlt aber insbesondere die Fähigkeit, ein Protein richtig zu prozessieren und heterolog produzierte Proteine bilden in vielen Fällen im Innern der Bakterienzellen Einschlusskörper, wonach die Proteine verloren sind, da ihre enzymatische Aktivität in den meisten Fällen nicht wiederhergestellt werden kann. In Folge ihrer falschen Struktur ist auch jegliche Verwendung derartiger Proteine für die Behandlung von Menschen ausgeschlossen.
Zusammen mit dem Fehlen von Endotoxinen und onkogener oder viraler DNA lassen sich bei Hefewirten die Vorteile von einzelligen Organismen (d. h. leichte genetische Manipulation sowie Wachstum) mit der Fähigkeit eines Proteins zum für eukaryorische Organismen typischen Prozessieren (d. h. Proteinfaltung, Zusammenlagerung und Modifikationen nach der Translation) vereinen. Vom Anfang der frühen 80er Jahre an sind die meisten in Hefe produzierten rekombinanten Proteine mit Hilfe von Saccharomyces cerevisiae exprimiert worden (Hitzeman, R:A. et al., 1981, Nature 293, 717–722). Die Wahl beruhte auf der Vertrautheit der Molekularbiologen mit dieser Hefe zusammen mit dem angehäuften Wissen über dessen Genetik und Physiologie. Ferner ist S. cerevisiae ein Organismus, der im Allgemeinen als sicher angesehen wird (GRAS, generally regarded as safe). Diese Hefe ist jedoch kein optimaler Wirt für die Produktion von Fremdproteinen in großem Maßstab, besonders wegen dessen Eigenschaften in Bezug auf die Bedürfnisse der Fermentation. Insbesondere zeigt das Wachstum von S. cerevisiae einen sehr ausgeprägten Crabtree-Effekt, aus diesem Grund ist eine Fed-Batch-Fermentation angebracht, um hohe Zelldichten zu erreichen (siehe z. B. Porro, D., et al., 1991, Res. Mikrobiol. 142, 535–539). Ferner ist diese Hefe, was die Kulturbedingungen anbelangt, vergleichsweise empfindlich, z. B. in Bezug auf den pH-Wert und die Temperatur. Ihre Kultivierung ist daher kompliziert und erfordert eine sehr anspruchsvolle Ausrüstung. Darüber hinaus sind die von S. cerevisiae produzierten Proteine oft überglykosyliert und es ist häufig eine Retention der Produkte innerhalb des periplasmatischen Raumes zu beobachten (Reiser, J. et al., 1990. Adv. Biochem. Eng./Biophys. 43, 75–102 und Romanos, M. A. et al., 1992, Yeast 8, 423–488). Ferner wird in Folge der teilweisen Retention des Proteins in S. cerevisiae eine Fraktion des Proteins gewöhnlich abgebaut. Diese jeweiligen Abbauprodukte lassen sich im Allgemeinen sehr schwer von dem gewünschten Produkt entfernen. Nachteile wie diese haben eine Suche nach alternativen Wirten ausgelöst, wobei versucht wird, die unter den Hefen bestehende große Biodiversität auszunutzen und mit der Entwicklung von Expressionssystemen bei den so genannten "nicht-konventionellen" Hefen zu beginnen. Herausragende Beispiele sind u. a. Hansenula polymorpha (Buckholz, R. G. et al., 1991, Bio/Technology 9, 1067–1072); Pichia pastoris (Fleer, R., 1992, Curr. Opin. Biotechnol. 9, 486–496); Kluyveromyces lactis (Gellissen, G. et al., 1997, Gene 190, 87–97); Yarrowia lipolytica (Muller, S. et al., 1998, Yeast 14, 1267–1283). Eine andere untersuchte Hefegattung ist die Gattung Zygosaccharomyces. Bisher sind elf Stämme klassifiziert worden, von denen scheint, dass sie in der Evolution ziemlich nahe bei S. cerevisae und nicht so weit von K. lactis angesiedelt sind (James, S. A. et al., 1994, Yeast 10, 871–881, Steels, H. et al., 1999, Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 319–327 und Kurtzman, C. P. et al., 2001, FEMS Yeast research 1, 133–138). Eine ausgezeichnete Widerstandsfähigkeit gegen verschiedene Belastungen macht einige der Zygosaccharomyces-Stämme für industrielle Zwecke potentiell interessant. Von Z. rouxii ist z. B. bekannt, dass sie Salz-tolerant (osmophil) ist und von Z. bailii ist bekannt, dass sie hohe Zucker-Konzentrationen und eine saure Umgebung sowie relativ hohe Temperaturen für das Wachstum aushält (Makdesi, A. K. et al., 1996, Int. J. Food Microbiol. 33, 169–181 und Sousa, M. J. et al., 1996, Appl. Environm. Microbiol. 62, 3152–3157). Die zur Molekularbiologie dieser Hefen verfügbaren Daten sind jedoch sehr spärlich. Während in Z. rouxii die Expression und Sekretion eines heterologen Proteins erreicht werden konnte (Ogawa, Y. et al., 1990, Agric. Biol. Chem. 54, 2521–2529), sind für Z. bailii gerade die ersten molekularen Werkzeuge für eine erfolgreiche Transformation dieser Hefe und für eine Expression von heterologen Proteinen im Innern der Zelle entwickelt worden ( WO 00/41477 ). Da eine Reinigung von intrazellulären Proteinen sehr arbeitsaufwändig ist, bleibt die Verwendung dieses Wirts für industrielle Produktionsverfahren eingeschränkt. Während eine Menge derartiger nicht-konventioneller Hefen spezifische Vorteile hinsichtlich ihrer Kultivierungs-Erfordernisse zeigen, werden diese Vorteile viele Male durch unerwartete negative Eigenschaften oder unlösbare Probleme bei ihrer Handhabung zunichte gemacht. In vielen Fällen sind die Werkzeuge für eine Transformation der Organismen oder für eine Expression heterologer Gene nicht entwickelt oder die Entwicklung schlug wegen ungünstiger natürlicher Eigenschaften des jeweiligen Organismus fehl. Die sekretorischen Fähigkeiten stellen einen für die Herstellung von Proteinen im industriellen Maßstab oft vor weitere Probleme. Falls der Organismus die effiziente Sekretion des gewünschten Proteins nicht gestattet, wird die Isolierung des Produkts deutlich erschwert. Darüber hinaus erwiesen sich sehr interessante Produkte wie z. B. Interleukin 1-β als toxisch für die Zellen, solange sie sich noch im Innern der Zelle befinden (Fleer, R. et al., 1991, Gene 107, 285–295). Eine Produktion derartiger Proteine ist daher nur möglich, wenn der Wirt über ein hoch potentes Ausscheidungssystem verfügt, welches ausgenutzt werden kann. Ein anderes Problem kommt von einer potentiell unterschiedlichen Verwendung oder Häufigkeit der Codons, welche die Expression von heterologen Genen in solchen Organismen entscheidend behindern.
Die von der vorliegenden Erfindung zu lösende Aufgabe bestand in Anbetracht des Standes der Technik darin, ein neues, leichtes und ökonomisches Verfahren zur Herstellung von Proteinen zur Verfügung zu stellen. Außer dass es kostengünstig ist, sollte dieses Verfahren leicht auszuführen sein und die Herstellung hochreiner Proteine in hoher Ausbeute gestatten.
Diese Aufgabe sowie alle weiteren nicht ausdrücklich angeführten Aufgaben, die sich leicht aus den einführenden Betrachtungen ableiten lassen, werden durch die in den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung wiedergegebenen Gegenstände gelöst.
Ein vorteilhaftes Verfahren für die Herstellung eines Proteins wird nach einem in Anspruch 1 angegebenen Verfahren geliefert. Dieses Verfahren umfasst das Kultivieren eines Zygosaccharomyces-Stammes, der einen Vektor enthält, welcher die DNA-Sequenz umfasst, die das Protein codiert, welches funktionell mit einer Signalsequenz verbunden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe Signal-Präsequenz der Alpha-Untereinheit des K1-Killertoxins von Kluyveromyces lactis und der Signalsequenz des Präpro-α-Faktors von Sacchoromyces cerevisiae, und welcher ferner funktionell mit einem Promotor verbunden ist, welcher das Protein exprimiert und sekretiert sowie der Isolierung des Proteins. Dieses Verfahren ist insofern besonders vorteilhaft, als Z. bailii mit hoher Ausbeute in einem chemisch definierten Medium kultiviert werden kann, ohne dass komplexe Inhaltsstoffe zugegeben werden müssen, die von dem hergestellten Protein in mühevoller Arbeit abgetrennt werden müssen. Überraschenderweise ist die sekretorische Fähigkeit dieser Hefe in einem chemisch definierten Medium der sekretorischen Fähigkeit von S. cerevisiae unter identischen Bedingungen deutlich überlegen. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist in der überraschenden Tatsache zu sehen, dass das von Z. bailii produzierte Protein nicht nur leicht sondern auch nahezu vollständig ausgeschieden wird, was bei S. cerevisiae unter identischen Bedingungen nicht der Fall ist. Während der effizienten Sekretion des gewünschten Proteins durch Z. bailii findet auch kein Abbau des Proteins statt. Folglich ist die Reinigung des Produkts deutlich vereinfacht.
Weitere Hauptvorteile von Z. bailii als Wirtsorganismus für eine Proteinproduktion und insbesondere für die Produktion heterologer Proteine bestehen in der günstigen Codon-Verwendung, wie dies aus den hier vorgelegten Beispielen abgeleitet wird, sowie den geringen Anforderungen an die Kulturbedingungen. Dies ist besonders auf die hohe Säure- und Temperaturverträglichkeit sowie einen schwachen Crabtree-Effekt zurückzuführen, was die Kultivierung mit einer hohen Zucker-Konzenmtration von Beginn an (d. h. einem Batch-Betrieb an Stelle einer Fed-Batch-Kultivierung) sowie das Weglassen von extrem ausgeklügelten Regulierungen für Kulturbedingungen wie der Temperatur oder dem pH-Wert gestattet. Dementsprechend gestattet dieses Verfahren eine leichte kosteneffektive Produktion von Proteinen selbst im industriellen Maßstab und führt zu Proteinen von hoher Reinheit.
Der Ausdruck "Expression" eines Proteins durch eine Wirtszelle ist dem Fachmann gut bekannt. Normalerweise umfasst die Expression eines Proteins die Transkription einer DNA-Sequenz in eine mRNA-Sequenz, gefolgt von einer Translation der mRNA-Sequenz zum Protein. Eine genauere Beschreibung des Vorgehens ist z. B. in Knippers, R. et al., 1990, Molekulare Genetik, Kapitel 3, Georg Thieme Verlag, Stuttgart zu finden.
Der im Stand der Technik bekannte Ausdruck "Sekretion" eines Proteins bedeutet die Verlagerung des produzierten Proteins von innerhalb der Zelle nach außerhalb der Zelle, wodurch sich das Protein im Kulturmedium anhäuft. Eine genauere Beschreibung des Vorgangs ist z. B. in Sreyer, L., 1991, Biochemie, Kapitel 31, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg, Berlin, New York zu finden.
Das hergestellte Protein könnte jedes im Stand der Technik bekannte Protein sein, für welches eine industrielle Produktion erwünscht ist. Das Protein könnte z. B. u. a. auf pharmazeutischem Gebiet wie z. B. einer Arzneimittelverabreichung oder einem Impfstoff oder in vorklinischen oder klinischen Versuchen von Nutzen sein (Beispiele sind Wachstumshormone, der Gewebe-Plasminogen-Aktivator, ein Hepatitis B-Impfstoff, Interferone, Erythropoetin). Das hergestellte Protein könnte auch in der Industrie von Nutzen sein, beispielsweise auf dem Gebiet der Nahrungsmittelproduktion (z. B. β-Galactosidase, Chymosin, Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Katalasen usw.). Enzyme sind u. a. als Detergentien (Proteasen, Lipasen und Tenside) von Nutzen und ihre stereospezifischen Eigenschaften lassen sich ferner in einer großen Zahl von biologischen Umwandlungen ausnutzen, was zu einer gewünschten chiralen Verbindung führt. Eine andere viel versprechende Anwendung für rekombinante Enzyme, die sich nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung herstellen lassen, besteht in der Entwicklung von Biosensoren.
Die ausgeschiedenen Proteine können in weitem Umfang in ihrer Größe (Molekulargewicht) variieren. Das hier beschriebene Verfahren funktioniert gut für sehr kleine Proteine (z. B. IL-1β, 17 kDa, siehe 5), aber auch für ziemlich große Proteine (z. B. GAA, 67,5 kDa, siehe 8a). Die ausgeschiedenen Proteine können oder können nicht Konsensus-Stellen für eine Glykosylierung umfassen. Solche Konsensus-Stellen könnten natürlich vorkommen oder sie könnten gentechnisch eingeführt werden. Je nach der beabsichtigten Verwendung des hergestellten Proteins könnte es auch von Vorteil sein, natürlich vorkommende Konsensus-Stellen für eine Glykosylierung gentechnisch zu entfernen, wodurch dann z. B. eine Überglykosylierung des Proteins vermieden wird. Es ist bemerkenswert, dass das hier beschriebene Verfahren zu Proteinen führt, welche ihre gewünschten katalytischen Eigenschaften nach ihrer Sekretion beibehalten (z. B. GAA, siehe 8a).
In der vorliegenden Erfindung wird der Z-bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das Protein codiert, das funktionell an eine zur Sekretion des Proteins führende Signalsequenz gekoppelt ist und ferner funktionell an einen zur Expression des Proteins führenden Promotor gekoppelt ist.
Der Ausdruck "Vektor" bezieht sich auf jedes Mittel wie ein derartiges Plasmid, Cosmid, einen Virus, Phagen, oder ein lineares oder ringförmiges einzelsträngiges oder doppelsträngiges DNA- oder RNA-Molekül, das von jeder Quelle stammt, welche Nucleinsäuresequenzen in eine Wirtszelle transportiert. Vorzugsweise ist ein Vektor für einen Einbau in das Genom oder eine autonome Replikation befähigt. Ein derartiger Vektor ist in der Lage, eine 5'-regulatorische Sequenz oder Promotorregion und eine DNA-Sequenz für ein ausgesuchtes Genprodukt so in eine Zelle einzuführen, dass die DNA-Sequenz in eine funktionelle mRNA transkribiert wird, welche translatiert und daher exprimiert werden kann oder auch nicht. Vorzugsweise ist der Vektor ein extrachromosomales Plasmid. Ein derartiges Plasmid umfasst vorzugsweise eine autonom replizierende Sequenz (ARS) und vorzugsweise zusätzlich eine zentromere Sequenz (CEN). Mehr bevorzugt ist das Plasmid ein 2 μ-artiges episomales Multicopy-Plamid. Noch mehr bevorzugt stammt das Plasmid aus einem endogenen episomalen Plasmid aus einem Z. bailii-Stamm wie z. B. pSB2 (Utatsu, I. et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 5527–5545) und mehr bevorzugt aus pZB₁ oder pZB₅ (siehe 9).
Das Plasmid pZB₅ wurde aus NCYC 1427 extrahiert und teilweise sequenziert. Dementsprechend umfasst das Plasmid vorzugsweise mindestens 35, mehr bevorzugt mindestens 55 und noch mehr bevorzugt mindestens 75 und noch mehr bevorzugt mindestens 100 Basen aus mindestens einer der Sequenzen, die ausgesucht wurden aus der Liste der SEQ ID NO.: 63, SEQ ID NO.: 64, SEQ ID NO.: 65, SEQ ID NO.: 66, SEQ ID NO.: 67, SEQ ID NO.: 68, SEQ ID NO.: 69, SEQ ID NO.: 70 oder SEQ ID NO.: 71.
Hefe-Multicopy-Plasmide (auch als 2 μ- oder 2 μm-artige Plasmide bezeichnet), die aus verschiedenen Hefe-Gattungen oder -Stämmen isoliert wurden, weisen gewöhnlich eine gut konservierte Struktur-Homologie auf, während sie über eine geringe Sequenz-Homologie verfügen. Es wurden einige regulatorische Elemente als notwendig und ausreichend identifiziert, um ein funktionelles Multicopy-Plasmid aufzubauen. Diese sind:
die Rekombinase, welche für die Amplifikation dieser Plasmide sorgt und vom FLP-Gen codiert wird (Blanc, H., et al., 1979, Mol. Gen. Genet. 176, 335–342 und Broach, J. R. et al., 1980, Cell 21, 501–508);
zwei invertierte Repeats (IR-Sequenzen);
ein einziger Replikationsursprung (ARS) an der Verbindungsstelle zwischen einem internen Repeat und einer Unique-Region des Plasmids (Broach, J. R. et al., 1980, Cell 21, 501–508; Brewer, B. J. et al., 1987, Cell 51, 463–471; McNeil, J. B. et al., 1980, Curr. Genet. 2, 17–25) und
die regulatorischen Proteine REP1/REP2 (in Z. bailii als TFB/TFC bezeichnet), welche den Amplifikations-Prozess kontrollieren, indem sie die Rekombinase-Aktivität in der Zelle über eine vermittelte Repression der FLP-Gen-Expression einschränken (Broach, J. R. et al., 1980, Cell 21, 501–508; Jayaram, M. et al., 1983, Cell 34, 95–104).
Im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung stammen diese Schlüsselelemente des 2 μ-Plasmids vorzugsweise von Z. bailii, noch mehr bevorzugt von Z. bailii NCYC 1427 oder ATCC 36947. Besonders bevorzugt entsprechen diese Sequenzen den SEQ ID NO.: 71 (IR-ARS), SEQ ID NO.: 72 (FLP), SEQ ID NO.: 74 (TFB) bzw. SEQ ID NO.: 76 (TFC). Die exprimierte Rekombinase und die exprimierten regulatorischen Proteine weisen vorzugsweise die in den SEQ ID NO.: 73 (FLP), SEQ ID NO.: 75 (TFB) bzw. SEQ ID NO.: 77 (TFC) gezeigten Aminosäuresequenzen auf. Das Plasmid umfasst vorzugsweise zusätzlich die upstream gelegenen Regionen des FLP- und des TFB/TFC-Gens, um eine optimale Kontrolle über den Transkriptionsgrad zu erhalten.
Allgemein gesprochen umfasst das Plasmid vorzugsweise Sequenzen für die Kontrolle der (autonomen) Replikation, Stabilisierung und/oder Kopienzahl des Plasmids, welche von einem Z. bailii-Stamm erhalten werden können.
Das Plasmid ist vorzugsweise pEZ₁ (siehe 9c).
Besonders bevorzugt ist das Plasmid pEZ₂ (siehe 9d). Ein bevorzugter Weg für die Konstruktion von pEZ₂ besteht darin, die IR/ARS-Region und die TFC/FLP-Gene einschließlich deren homologen Promotoren mittels PCR mit den Oligos
zu amplifizieren. und die ARS/CEN-Kassette aus pZ₃ mit diesen amplifizierten Produkten zu substituieren. Ein anderer Weg besteht in der Substitution der 2 μ-ori-Sequenz aus dem Plasmid p195 mit den obigen PCR-Produkten.
Vorteilhafterweise umfasst der Vektor einen selektierbaren Marker. Der Ausdruck "selektierbarer Marker" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, deren Expression zu einem Phänotyp führt, welcher die Identifizierung von die Nucleinsäuresequenz enthaltenden Zellen erleichtert. Selektierbare Marker umfassen solche, die Resistenz gegen toxische Chemikalien (= dominante Marker, z. B. G418, Hygromycin, Formaldehyd, Phleomycin oder Fluoracetat-artige, welche in Van den Berg, M. et al., 1997, Yeast 13, 551–559) zusammengefasst sind) verleihen oder eine Auxotrophie ergänzen (= auxotrophe Marker, z. B. Uracil, Histidin, Leucin, Tryptophan). Auxotrophe Selektions-Marker lassen sich für natürliche auxotrophe Z. bailii-Stämme oder für Stämme einsetzen, welche durch eine genetische Manipulation auxotroph gemacht worden sind, insbesondere durch eine (partielle) Deletion oder Mutagenisierung eines essentiellen Gens, z. B. HIS3 (Branduardi, P., 2002, Yeast 19, 1165–1170). Als ergänzende Markersequenz könnten das homologe Gen aus Z. bailii oder ein heterologes Gen verwendet werden. Auxotophe Marker sind bevorzugt, da dem Medium keine Komponente zugesetzt zu werden braucht, um während der Kultivierung den Selektionsdruck aufrecht zu erhalten.
Der Ausdruck "Promotor" oder "Promotor-Region" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die sich gewöhnlich upstream (5') von einer codierenden Sequenz befindet, welche die Expression der codierenden Sequenz über die Kontrolle der Produktion der Messenger-RNA (mRNA) kontrolliert, indem für die Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase und/oder für andere für den Start der Transkription an der richtigen Stelle notwendige Faktoren gesorgt wird. Der Promotor kann von jedem Organismus stammen. Vorzugsweise stammt der Promotor aus einer Hefe, noch mehr bevorzugt aus Saccharomyces, Kluyveromyces oder Zygosaccharomyces und am meisten bevorzugt aus Z. rouxii oder Z. bailii. Der Promotor kann konstitutiv, induzierbar oder reprimierbar sein. Induzierbare Promotoren können durch Zusatz eines geeigneten Induktormoleküls zum Medium oder durch eine geeignete Veränderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung (wie z. B. der Temperatur oder dem pH-Wert) induziert werden, welche an Hand der Identität des Promotors ermittelt werden. Reprimierbare Promotoren können durch Zusatz eines geeigneten Repressormoleküls zum Medium oder durch eine geeignete Veränderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung (wie z. B. der Temperatur oder dem pH-Wert) reprimiert werden, welche an Hand der Identität des Promotors ermittelt werden. Konstitutive Promotoren sind bevorzugt, da die Verwendung eines geeigneten Repressor- oder Induktormoleküls oder eine geeignete Veränderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung nicht erforderlich sind. Vorzugsweise wird der Promotor ausgewählt aus der Gruppe: Triosephosphatisomerase (TPI), Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH), Alkoholdehydrogenase 1 (ADH1), Phosphoglyceratkinase (PGK), Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP), GAL1, GAL10, saure Phosphatase (PHO5), Cytochrom C-1 (CYC1), Kupfer bindendes Matallothionein (CUP1) oder der Mfa1-Promotor (a-factor matching pheromone precursor) oder die Hybridpromotoren GAL/CYC1, wie z. B. GAL1-10/CYC1, GAP/GAL, PGK/GAL, GAP/ADH2, GAP/PHO5 oder CYC1/GRE entweder aus S. cerevisiae, Z. rouxii oder Z. bailii, aber vorzugsweise aus Z. bauilii. Besonders bevorzugte Promotoren sind die TPI-Promotoren entweder aus S. cerevisiae entsprechend der SEQ ID NO.: 78 oder aus Z. bailii entsprechend der SEQ ID NO.: 79, aber insbesondere bevorzugt ist der TPI-Promotor aus Z. bailii (SEQ ID NO.: 79). Weitere besonders bevorzugte Promotoren sind die GAPDH-Promotoren aus Z. rouxii (SEQ ID NO.: 92 oder Z. bailii.
Ferner umfasst der Vektor hinter der codierenden Sequenz für das gewünschte Protein vorzugsweise eine Terminator-Sequenz für die Transkription für eine effiziente Bildung des mRNA 3-Endes. Eine solche Terminator-Sequenz stammt vorzugsweise aus einer Hefe, mehr bevorzugt aus Saccharomyces oder Zygosaccharomyces, noch mehr bevorzugt aus S. cerevisiae oder Z. bailii und am meisten bevorzugt aus Z. bailii. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Terminatorsequenz umfasst die folgende dreiteilige Konsensus-Sequenz: TAG..(T-reich)..TA(T)GT..(AT-reich)..TTT. Ein anderes bevorzugtes Beispiel umfasst das Sequenzmotiv TTTTTATA.
Ferner umfasst der Vektor eine Signalsequenz (= Leader-Sequenz; nach der Expression in ein Signalpeptid oder eine Leaderpeptid translatierte Sequenz). Derartige Sequenzen führen zu der Richtung der exprimierten Proteine aus dem Cytosol in das Kulturmedium. Mit anderen Worten verursachen die Signalsequenzen die Sekretion der Proteine und ihre Anreicherung im Medium. Signalsequenzen codieren im Allgemeinen einen kontinuierlichen Aminosäureabschnitt, typischerweise in einer Länge von 15 bis 60 (bis zu 150) Aminosäureresten, welcher charakteristischerweise eine oder mehrere positiv geladene Aminosäure(n) enthält (enthalten), gefolgt von einem Abschnitt von etwa 5 bis 10 hydrophoben Aminosäuren, welcher von nicht hydrophoben Resten unterbrochen sein kann oder auch nicht. Vorzugsweise umfasst das Signalpeptid 15 bis 45 Aminosäuren, noch mehr bevorzugt 15 bis 30 Aminosäuren. Obwohl ihre Aminosäuresequenzen in großem Umfang variieren können, sind die Signalpeptide aller Proteine mit der gleichen Bestimmung funktionell austauschbar: die physikalischen Eigenschaften wie z. B. die Hydrophobizität oder das Muster der geladenen Aminosäuren scheinen beim Vorgang der Signalerkennung oft wichtiger zu sein als die genaue Aminosäuresequenz.
Vorzugsweise wird die das Signalpeptid codierende DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 19, SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 23, SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 29, SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 35, SEQ ID NO.: 37, SEQ ID NO.: 39, SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 43, SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 47, SEQ ID NO.: 49, SEQ ID NO.: 51, SEQ ID NO.: 53, SEQ ID NO.: 55, SEQ ID NO.: 57, SEQ ID NO.: 59, SEQ ID NO.: 61. Noch mehr bevorzugt wird die Aminosäutesequenz des Signalpeptids ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 16, SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 24, SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 30, SEQ ID NO.: 32, SEQ ID NO.: 34, SEQ ID NO.: 36, SEQ ID NO.: 38, SEQ ID NO.: 40, SEQ ID NO.: 42, SEQ ID NO.: 44, SEQ ID NO.: 46, SEQ ID NO.: 48, SEQ ID NO.: 50, SEQ ID NO.: 52, SEQ ID NO.: 54, SEQ ID NO.: 56, SEQ ID NO.: 58, SEQ ID NO.: 60, SEQ ID NO.: 62. Besonders bevorzugt wird die das Signalpeptid codierende DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 21 oder SEQ ID NO.: 35. Entsprechen wird die Aminosäuresequenz des Signalpeptids vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 22 oder SEQ ID NO.: 36.
Vorzugsweise wird das Signalpeptid von dem fertigen Protein entfernt. Dies kann über die Aktivität einer spezialisierten Signal-Peptidase erfolgen. Die Signal-Peptidase kann homologen oder heterologen Ursprungs sein. Daher umfasst das Signalpeptid vorzugsweise eine Prozessierungsstelle oder eine Spaltstelle, welche die Erkennung durch eine spezifische Endopeptidase gestatten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Z. bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, welcher die das Protein codierende DNA-Sequenz umfasst, die mit der Signal-Präsequenz (16aa) der Alpha-Untereinheit des K1-Killertoxins von K. lactis funktionell verbunden ist (Stark, M. J. et al., 1986, EMBO J. 5, 1995–2002, SEQ ID NO.: 35 (DNA) und SEQ ID NO.: 36 (Peptid)) und ferner mit dem TPI-Promotor von S. cerevisiae funktionell verbunden ist. Mehr bevorzugt ist der Vektor pZ₃kl (1b). Noch mehr bevorzugt wird der Z. bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, welcher die das Protein codierende DNA-Sequenz umfasst, die mit der Signalsequenz des K1-Killertoxins von K. lactis funktionell verbunden ist und ferner mit dem GAPDH-Promotor von Z. rouxii funktionell verbunden ist. Noch mehr bevorzugt wird der Z. bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, welcher die das Protein codierende DNA-Sequenz umfasst, die mit der Signalsequenz des K1-Killertoxins von K. lactis funktionell verbunden ist und ferner mit dem TPI-Promotor von Z. bailii funktionell verbunden ist. Besonders bevorzugt stammt dieser Vektor von pZ₃bT (4a).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Z. bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, welcher die das Protein codierende DNA-Sequenz umfasst, die mit der Signalsequenz des Präpro-
-Faktors von S. cerevisiae funktionell verbunden ist und ferner an den TPI-Promotor von S. cerevisiae funktionell gekoppelt ist. Vorzugsweise ist der Vektor pZ₃pp
(1c). Noch mehr bevorzugt wird der Z. bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, welcher die das Protein codierende DNA-Sequenz umfasst, die mit der Signalsequenz des Präpro-
-Faktors von S. cerevisiae funktionell verbunden ist und ferner an den GAPDH-Promotor von Z. rouxii funktionell gekoppelt ist. Noch mehr bevorzugt wird der Z. bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, welcher die das Protein codierende DNA-Sequenz umfasst, die mit der Signalsequenz des Präpro-
-Faktors von S. cerevisiae funktionell verbunden ist und ferner an den TPI-Promotor von Z. bailii funktionell gekoppelt ist. Besonders bevorzugt stammt dieser Vektor von pZ₃bT (4a).
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Z. bailii-Stamm mit einem Vektor transformiert, welcher die das Protein codierende DNA-Sequenz umfasst, die mit der Präsequenz des Zygocin-Killertoxins von Z. bailii (SEQ ID NO.: 59) funktionell verbunden ist und ferner an einen in Z. bailii funktionellen Promotor gekoppelt ist. Dieser Promotor ist vorzugsweise der TPI-Promotor aus S, cerevisiae. Noch mehr bevorzugt ist dieser Promotor der TPI-Promotor aus Z. bailii. AQm meisten bevorzugt ist der GAPDH-Promotor aus Z. rouxii.
Die das Protein codierende DNA-Sequenz kann aus Tieren, Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Viren stammen, mehr bevorzugt aus Metazoen, Säugern und Pilzen. Das exprimierte Protein könnte daher zu Z. bailii homolog oder heterolag sein.
Jede zur Spezies Z. bailii gehörende Hefe kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung für die Produktion der Proteine eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Z. bailii-Stamm transformiert. "Transformation" bezieht auf einen Prozess der Einführung einer exogenen Nucleinsäuresequenz (homologen und/oder heterologen Ursprungs, rekombinant oder nicht) in eine Zelle, in der diese exogene Nucleinsäure in ein Chromosom eingebaut wird oder für eine autonome Replikation in der Lage ist. Eine Zelle, die transformiert worden ist oder ein Nachkomme einer solchen Zelle ist, ist "transformiert" oder "rekombinant". Falls die exogene Nucleinsäure eine codierende Region umfasst, welche ein Protein codiert und das Protein in der transformierten Hefe produziert wird, ist eine derartige transformierte Hefe funktionell transformiert. Bevorzugte Verfahren, um Z. bailii zu transformieren sind, wie in [ WO 00/41477 ] beschrieben, die Elektroporation oder das bei Agatep, R. et al., 1998, Technical Tips Online (http//tto.trends.com) beschriebene LiAc/PEG/ssDNA-Verfahren.
Vorzugsweise wird der zu transformierende Z. bailii-Stamm ausgewählt aus der Gruppe: ATTC 36947, ATTC 60483, ATTC 8766, FRR 1292, ISA 1307, NCYC 128, NCYC 563, NCYC 1416, NCYC 1427, NCYC 1766, NRRL Y-2227, NRRL Y-2228, NRRL Y-7239, NRRL Y-7254, NRRL Y-7255, NRRL Y-7256, NRRL Y-7257, NRRL Y-7258, NRRL Y-7259, NRRL Y-7260, NRRL Y-7261, NRRL Y-7264; besonders bevorzugt sind ATTC 36947, ATCC 60483, ATCC 8766 und NCYC 1427.
(ATCC: American Type Culture Collection, Manassas VA, USA; FRR: FRR Culture Collection, North Ryde NSW, Australia; ISA: Sammlung von Kulturen des Instituto Superior de Agronomia, Lissabon; NCYC: National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK; NRRL: Agricultural Research Service Culture Collection, Peoria IL, USA).
Der Z. bailii-Stamm kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur besseren Sekretion einem Selektionsprozess unterzogen werden. Das Screening nach und die Isolierung von einem derartigen "supersektretierenden" Phänotyp vor oder nach der Transformation des jeweiligen Z. bailii-Stamms erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird (werden) das (die) zu GAS1 aus S. cerevisiae homologe(n) Z. bailii-Gen(e) identifiziert und auseinander gerissen. GAS1 ist ein Beispiel für die wenigen Fälle, wo die im faszinierend komplexen sekretorischen Stoffwechselweg eine Rolle spielenden Schlüsselmoleküle identifiziert worden sind. Es war möglich, den ganzen sekretorischen Mechanismus, der das Ausmaß der GAS1-Expression in S. cerevisiae modifiziert, in Folge einer erhaltenen Modifikation der Organisation der Zellwandstruktur zu beeinflussen (Vai, M. et al., 2000, Appl. Environ. Micobiol. 66, 5477–5479), es wurde nämlich gezeigt, dass gasI-Mutanten über einen "supersekretierenden" Phänotyp verfügten (Popolo, L. et al., 1997, J. Bacteriol. 180, 163–166; Ram, A. F. J. et al., 1998, J. Bacteriol. 180, 1418–1424).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfuhr der Z. bailii-Stamm einen oder mehrere Mutagenisierung-/Selektions-Zyklus(-Zyklen), um supersekretierende Mutanten mit einer chemischen oder physikalischen Mutagenese zu erhalten. Vorzugsweise wird die Mutagenisierung durch Orthovanadat verursacht. Orthovanadat ist ein Molekül, von dem bekannt ist, dass es den Glykosylierungsprozess und die Konstruktion der Zellwand in S. cerevisiae beeinflusst (Kanik-Ennulat, C. et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 898–909). Verfahren mit Orthovanadat zur Mutagenisierung, um Zellen mit einer veränderten Zellwand-Konstruktion/veränderten sekretorischen Eigenschaften zu erhalten, werden genauer z. B. für S. cerevisiae (Willsky, G. R. et al., 1985, J. Bacteriol. 164, (611–617) und K. lactis (Uccelletti, D. et al., 1999, Res. Microbiol. 150, 5–12; Uccelletti, D. et al., 2000, Yeast 16, 1161–1171) beschrieben.
Für Hefe geeignete Kultivierungs-Techniken und -Medien sind im Stand der Technik gut bekannt. Typischerweise, jedoch nicht ausschließlich, erfolgt die Kultivierung mittels wässriger Fermentation in einem geeigneten Gefäß. Beispiele für ein typisches Gefäß zur Fermentation von Hefe sind ein Schüttelkolben oder ein Bioreaktor.
Die Kultur wird typischerweise bei einer Temperatur von 20° bis 40°C durchgeführt, vorzugsweise zwischen 25° und 35°C und noch mehr bevorzugt zwischen 28° und 32°C.
Das Medium, in dem der Z. bailii-Stamm kultiviert wird, kann jedes im Stand der Technik bekannte Medium sein, das für diesen Zweck geeignet ist. Das Medium kann komplexe Inhaltsstoffe enthalten oder es kann chemisch definiert sein. Chemisch definierte Medien sind bevorzugt. Das Medium umfasst jede für das Wachstum der Hefe benötigte Komponente. Das Medium umfasst insbesondere eine Kohlenstoffquelle wie z. B. Fructose, Glucose oder andere Kohlenhydrate (wie z. B. u. a. Sucrose, Lactose, D-Galactose oder Hydrolysate aus pflanzlichen Nahrungsmitteln). Typischerweise umfasst das Medium auch ferner eine Stickstoffquelle, entweder organisch oder anorganisch, und wahlweise kann das Medium auch Makro- und/oder Mikronährstoffe wie z. B. Aminosäuren, Purine, Pyrimidine, Korn-Flüssigextrakt, Hefe-Extrakt, Proteinhydrolysate wie z. B. Pepton, Vitamine (wasserlöslich du/oder -unlöslich) wie z. B. Vitamine des B-Komplexes oder anorganische Salze wie u. a. Chloride, Hydrochloride, Phosphate oder Sulfate von Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo oder Zn. Falls nötig kann auch ein Antischaummittel zugesetzt werden. Weitere dem Fachmann bekannte Komponenten, die beim Kultivieren oder Fermentieren von Hefe von Nutzen sind, können ebenfalls enthalten sein. Das Medium kann gepuffert sein oder auch nicht. Ein bevorzugtes Medium umfasst Hefeextrakt, Pepton und Glucose (= YPD). Ein bevorzugteres Medium umfasst Hefeextrakt, Pepton und Fructose (= YPF). Ein noch mehr bevorzugtes Medium umfasst Glucose und Stickstoff-Base von Hefe (YNB, Difco Laboratories, Detroit, MI #919-15). Ein anderes noch mehr bevorzugtes Medium umfasst Fructose und YNB.
Besonders bevorzugt ist ein Medium mit einem High Fructose Cornsyrup als Kohlenstoffquelle (z. B. Isosweet^® 100 42% High Fructose (80% Feststoffe) oder Isosweet^® 5500 55% Fructose von Tate & Lyle PLC oder IsoClear^® 42% High Fructose Corn Syrup oder IsoClear^® 55% High Fructose Corn Syrup von Cargill, Inc.).
Die Zusammensetzungen bevorzugter Medien für eine erfindungsgemäße Batch/Fed-Batch-Kultivierung von Z. bailii sind wie folgt: Das Medium der Batch-Phase umfasst 4% w/v Glucose, 0,5% w/v (NH₄)₂SO₄, 0,05% w/v MgSO₄, 0,3% w/v KH₂PO₄, Vitamine gemäß Verduyn, C. et al., 1992, Yeast 8, 501–517, wobei die Endkonzentration der Vitamine das 3-fache der angegebenen Konzentrationen beträgt, sowie Spurenelemente gemäß Verduyn, C. et al., 1992, Yeast 8, 501–517, wobei die Endkonzentration ebenfalls das 3-fache der angegebenen Konzentrationen beträgt. Die pH-Kontrolle (Wert: pH 5) erfolgt durch Zugabe von 2 M KOH. Das Fed-Batch-Medium umfasst 50% w/v Glucose, 15,708 g/l KH₂PO₄, 5 g/l KCl, 5,831 g/l MgSO₄, 1,2 g/l CaCl₂, 1 g/l Hefeextrakt, 0,447 g/l NaCl, 1 g/l Glutamat, 0,05 g/l ZnSO₄, 0,04 g/l CuSO₄, 0,05 g/l MnCl₂, 0,001 g/l CoCl₂, 0,5 g/l myo-Inosit, 0,1 g/l Thiaminhydrochlorid, 0,02 g/l Pyridoxinhydrochlorid, 0,04 g/l Ca-D(+)-Panthotenat, 0,004 g/l D-Biotin, 0,09 g/l Nicotinsäure. Die pH-Kontrolle (Wert: pH 5) erfolgt durch Zugabe von 2 M NH₄OH.
Im Falle der Selektion nach dem dominanten G418-Marker werden dem jeweiligen Medium 200 mg/l G418 zugesetzt.
Die Verwendung eines definierten Mediums, dessen Komponenten nach den Bedürfnissen des Organismus abgestimmt sind, ist bevorzugt. Die Reinigung des Proteins wird dadurch deutlich vereinfacht.
Vorzugsweise liegt der pH-Wert des Kulturmediums im Bereich zwischen 2 und 9, mehr bevorzugt zwischen 3 und 8 und noch mehr bevorzugt zwischen 4 und 7. Im Verlauf der Fermentation kann der pH-Wert reguliert oder teilweise reguliert oder gar nicht reguliert werden; demgemäß kann der pH-Wert während der Fermentation bei einem bevorzugten pH.Wert konstant gehalten werden oder er kann sich ändern. Ein deutlicher Vorteil von Z. bailii besteht in dessen überraschender Fähigkeit, bei einem niedrigen pH-Wert sowohl zu wachsen als auch Proteine zu exprimieren und auszuscheiden. Daher ist das Bedürfnis dieses Organismus nach einem streng kontrollierten pH-Wert nicht sehr ausgeprägt.
Wie dem Fachmann bekannt, kann die Kultivierung im Batch-, Fed-Batch- und kontinuierlichen Modus erfolgen.
Im Verlauf der Fermentation wird das gewünschte Protein exprimiert, passend prozessiert (d. h. gefaltet, modifiziert, geschnitten usw.) und ausgeschieden (= im Medium angereichert). Während das produzierte Protein teilweise innerhalb der Hefezellen zurückgehalten werden kann, ist bevorzugt, dass eine wesentliche Menge des Proteins ausgeschieden wird. Noch mehr bevorzugt ist, dass das Protein vollständig sekretiert wird.
Nachdem die Kultivierung zur Produktion einer gewünschten Proteinkonzentration in der Hefe und/oder dem Kulturmedium genügend lange fortgeschritten ist, wird das Protein isoliert. Der hier verwendete Begriff "isoliert" in Bezug auf das Protein bedeutet, dass es in einen Zustand größerer Reinheit gebracht wird, indem das Protein von mindestens einer anderen Komponente der Hefe oder des Mediums abgetrennt wird. Vorzugsweise ist das isolierte Protein, bezogen auf sein Gewicht, mindestens etwa 80% rein, mehr bevorzugt, bezogen auf sein Gewicht, mindestens etwa 90% rein und noch mehr bevorzugt, bezogen auf sein Gewicht, mindestens etwa 95% rein. Ein Nachweis über die Reinheit kann mittels SDS-PAGE, 2D-Elektrophorese, IF, HPLC, Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder anderer im Stand der Technik bekannter Verfahren erhalten werden.
"Reinheit" bezieht sich auf die Abwesenheit von Verunreinigungen im gereinigten Endprodukt. Typische, von dem gewünschten Produkt abzutrennende Verunreinigungen sind Proteine, Pyrogene, Nucleinsäuren und mehr.
Das Protein wird aus dem Kulturmedium isoliert, vorzugsweise ohne die Zellen zu lysieren. Eine derartige Isolierung umfasst die Reinigung des Proteins aus dem Medium. Eine Reinigung kann mit im Stand der Technik gut bekannten Techniken wie z. B. u. a. einer Filtration (z. B. Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nonofiltration), Kristallisation oder Fällung, Zentrifugation, Extraktion, Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitätschromatographie, hydrophober Austausch) erreicht werden.
Nach Entfernung der Zellen kann die Kulturbrühe auch direkt ohne weitere Reinigung als Produkt (z. B. Enzym-Lösung) dienen. Die Komponenten des Mediums können vor dem Kultivieren passend eingestellt werden.
Falls das Protein nicht vollständig ausgeschieden wird, kann das Protein auch sowohl aus den Hefezellen als auch aus dem Medium isoliert werden. Verfahren zur Lyse der Hefezellen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen eine chemische oder enzymatische Behandlung, eine Behandlung mit Glaskügelchen, eine Beschallung, ein zyklisches Einfieren und wieder Auftauen oder andere bekannte Techniken. Das Protein lässt sich aus den verschiedenen Fraktionen des Hefelysats mittels geeigneter Techniken wie einer Filtration (z. B. Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nonofiltration), Kristallisation oder Fällung, Zentrifugation, Extraktion, Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitätschromatographie, hydrophober Austausch) reinigen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Z. bailii-Stamm, welcher ein heterologes Protein exprimiert und sekretiert.
Der Z. bailii-Stamm könnte mit einem Vektor transformiert werden, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das heterologe Protein codiert, das funktionell an eine für die Ausscheidung des Proteins sorgende Signalsequenz gekoppelt und funktionell mit einem Promotor verbunden ist.
Beschreibung der Figuren:
1: Expressions- und Sekretion-Vektoren
Schematische Karten der für die Expression der Proteine in Z. bailii konstruierten Plasmide:

a: pZ₃, (intrazelluläre Expression), b: pZ₃kl (Expression und Sekretion) und c: pZ₃ppα (Expression und Sekretion).

a) pZ₃: das Grundgerüst des Plasmids besteht aus dem pYX022-Expressions-Plasmid aus S. cerevisiae (R & D Systems, Inc., Wiesbaden, D; die Expressions-Kassette beruht, wie in der Figur angegeben, auf dem konstitutiven TPI-Promotor aus S. cerevisiae und dem entsprechenden polyA-Signal). Das ARS/CEN-Fragment aus Ycplac33 (Gietz, R. D. et al., 1988, Gene 74, 527–534) stellt die Replikation und Stabilität des Plasmids sicher, während die Kan^R-Kassette, die von pFA6-KanMX4 stammt (Wach et al., 1994, Yeast 10, 1793–1808) eine auf G418 basierende Selektion der Transformanten gestattet.
b) pZ₃kl: ein pZ₃-Expressions-Vektor, welcher die Signalsequenz des K1-Killer-Toxins aus K. lactis (k1) zum Steuern der Sekretion des jeweiligen Proteins umfasst.
c) pZ₃ppα: ein pZ₃-Expressions-Vektor, welcher die Präproleadersequenz des Pheromon-α-Faktors (pre-pro-αF) aus S. cerivisiae zum Steuern der Sekretion des jeweiligen Proteins umfasst.

(Amp = Kassette für Ampicillin-Resistenz; MCS = Multi Cloning Site; colE1 ori = Replikationsursprung von E. coli).

2: Expressions- und Sekretion-Vektoren
Schematische Karten der für die Expression und Sekretion des humanen IL-1β (Auron, E. et al., 1984, PNAS 81, 7907–7911) und des GFP (Heim, R. et al., 1996, Curr. Biol. 6, 178–182) in Z. bailii konstruierten Plasmide.

a) pZ₃klIL-1β: ein pZ₃kl-Vektor, wo die das humane IL-1β kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.
b) pZ₃ppαIL-1β: ein pZ₃ppα-Vektor, wo die das humane IL-1β kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.
c) pZ₃ppαGFP: ein pZ₃ppα-Vektor, wo die GFP kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.

3: Expressions- und Sekretions-Vektoren
Schematische Karten für die Plasmide, welche für die Expression der Arxula adeninivorans-Glucoamylase (GAA, Genbank Akzessions-Nr.; Z46901, Bui Minh, D. et al., 1996, Appl. Mictobiol. Biotechnol. 44, 610–619) und der bakteriellen β-Galactosidase (aus dem Plasmid pSV-β-galactosidase von Promega, Inc.; Genebank Akzessions-Nr.: X65225) in Z. bailii konstruiert wurden.

a) pZ₃GAA: ein pZ₃-Vektor, wo die die Glucoamylase (GAA) kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.
b) pZ3LacZ: ein pZ₃-Vektor, wo die die β-Galactosidase kodierenden Sequenz in die MCS subkloniert wurde.

4: Expressions-Vektoren
Schematische Karten für die Plasmide, die für die auf dem Z. bailii-TPI-Promotor basierende Expression der Proteine in Z. bailii konstruiert wurden.

a) pZ₃bT: ein pZ₃-Vektor, wo der TPI-Promotor aus S. cerevisiae durch den Z. bailii-TPI-Promotor ersetzt wurde.
b) pZ₃bTLacZ: ein pZ₃bT-Vektor, wo die die β-Galactosidase kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.

5: IL-1β-Sekretion

a) Wachstumskinetiken in Minimal-(YNB) und angereichertem (YDP) Medium mit 5% (w/v) Glucose als Kohlenstoffquelle. Das Zellwachstum wurde als optische Dichte (OD 660 nm, Kreise) gemessen und die restliche Glucose ermittelt (g/l, Quadrate). Vergleich zwischen S. cerevisiae (offene Symbole) und Z. bailii (gefüllte Symbole).
b) Western-Blot-Analysen, die an Zellextrakten von S. cerevisiae- und Z. bailii-Zellen erfolgten, welche mit dem Plasmid pZ₃klIL-1β (exprimiert IL-1β, dem die Leadersequenz aus dem K. lactis-Killer-Toxin voranging) und mit dem entsprechenden leeren Plasmid (pZ₃) als negative Kontrolle transformiert worden waren. In der ersten Spur wurde eine positive Kontrolle (humanes rekombiniertes IL-1β (E. coli), Roche Katalog-Nr. 1 457 756) aufgetragen. Die Proben wurden entsprechend den in (a) gezeigten Kinetiken zu den angegebenen Zeiten und aus den angegebenen Medien gesammelt. Die aufgetragenen Volumina wurden für einen entsprechenden OD-Wert von 0,08 korrigiert. Die geblotteten Membranen wurden mit einem polyklonalen α-IL-1β-Antikörper sondiert.
c) wie oben, wobei die aufgetragenen Proben den entsprechenden Überstand repräsentieren.
d) wie oben, wobei die Proben mit einem gleichen Volumen an Medium aufgetragenen wurden.

6: Sekretion von IL-1β und GFP in Folge der Steuerung durch die Präpro-α-Faktor-Signal-Sequenz in Z. bailii

a) Western-Blot-Anylysen, die an Zellextrakten (i) und Überständen (ii) von S. cerevisiae- und Z. bailii-Zellen erfolgten, welche mit dem Plasmid pZ₃ppαIL-1β (und mit dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃) transformiert und auf YPD-Medium (2% w/v Glucose) gezüchtet worden waren Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen. Erste Spur: positive Kontrolle (humanes rekombiniertes IL-1β (E. coli), Roche Katalog-Nr. 1 457 756). Die geblotteten Membranen wurden mit einem polyklonalen α-IL-1β-Antikörper sondiert. Western-Blot-Anylysen, die an Zellextrakten (iii) und Überständen (iv) von Z. bailii- und S. cerevisiae-Zellen erfolgten, welche mit dem Plasmid pZ₃ppαIL-1β (und mit dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃) transformiert und auf YNB-Medium (5% w/v Glucose) gezüchtet worden waren. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen. Erste Spur: positive Kontrolle (humanes rekombiniertes IL-1β (E. coli), Roche Katalog-Nr. 1 457 756). Die geblotteten Membranen wurden mit einem polyklonalen α-IL-1β-Antikörper sondiert.
b) Western-Blot-Anylysen, die an Zellextrakten (cells) und an Überständen (sup) von auf YNB-Medium (2% w/v Glucose) wachsenden Z. bailii-Zellen erfolgten, welche mit dem Kontroll-Plasmid pZ₃ (1. und 2. Spur) und mit dem Plasmid pZ₃ppαGFP (3. und 4. Spur) transformiert worden waren. Die geblottete Membran wurde mit einem polyklonalen α-GFP-Antikörper sondiert. Ein Pfeil zeigt das erwartete positive Signal.

7: Batch-Kultivierungen von das pZ₃klIL-1β-Expressions-Plasmid enthaltenden Z. bailii-Zellen auf einem chemisch definierten Medium in hoher Zucker-Konzentration

a) Kultur-OD (gefüllte Kreise), Trockengewicht (leere Kreise), Glucose-Verbrauch (gefüllte Quadrate) und Ethanol-Produktion (leeres Dreieck).
b) Western-Blot.Analysen, die am Wachstumsmedium (Spuren 2 bis 5) und an den Zellextrakten (Spuren 6 bis 9) von Z. bailii-Zellen erfolgten. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten der Kinetiken gesammelt und ein gleiches Volumen (30 μl für die Überstände bzw. 15 μl für die Zellextrakte) aufgetragen. Die geblotteten Membranen wurden mit einem polyklonalen α-IL-1β-Antikörper sondiert.

Erste Spur: positive Kontrolle (humanes rekombiniertes IL-1β (E. coli), Roche Katalog-Nr. 1457756).

8: Enzymatische Aktivität von in Z. bailii-Zellen exprimierten heterologen Enzymen

a) Bestimmung der Glucoamylase-Aktivität (mE/OD) von A. adeninivorans, welche im Wachstumsmedium (YNB, 2% w/v Glucose) von Z. bailii-Zellen vorkommen, die mit dem Plasmid pZ₃GAA (und dem jeweiligen leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle) transformiert worden waren. Es wurden 3 unabhängige Klone analysiert (Cl. 1, Cl. 3 und Cl. 5).
b) Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität (Miller E/OD) in Zellextrakten von Z. bailii-Zellen, die mit dem Plasmid pZ₃LacZ (zwei unabhängige Klone) und mit dem Plasmid pZ₃bTLacZ (drei unabhängige Klone) und dem jeweiligen leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle transformiert worden waren. Die Zellen wurden in YPD-Medium (2% w/v Glucose) gezüchtet und die Proben zu den angegebenen Zeiten gesammelt.

Auf dem linken Diagramm wurden der Z. bailii-Stamm ATCC 36947 bzw. auf dem rechten Diagramm der Z. bailii-Stamm ATCC 60483 untersucht.
9: Konstruktion eines Multicopy-Plasmids von Z. bailii
Schematische Karten der aus Z-bailii-ATCC 36947 mit dem Namen pZB₁ (a) und aus Z. bailii-NCYC 1427 mit dem Namen pZB₅ (b) isolierten endogenen Plasmide.

c) Multicopy-Expressionsvektor von Z. baili,. welcher die für eine stabile und autonome Replikation mit großer Anzahl von Kopien nötigen und ausreichenden Gene und Sequenzen umfasst. Die Expressionskassette basiert, wie in der Figur gezeigt, auf dem konstitutiven TPI-Promotor von Z. bailii und dem PolyA. Der Marker für die Selektion ist die Kan^R-Kassette.
d) Multicopy-Expressionsvektor von Z. bailii. Die Expressionskassette basiert, wie in der Figur gezeigt, auf dem konstitutiven TPI-Promotor von Z. bailii und dem PolyA. Ferner umfasst der Vektor die IR/ARS-Region und die TFC/FLP-Gene, welche, wie angegeben, ihre homologen Promotoren enthalten.

10: Einfluss des Promotors bzw. der Bestandteile des Plasmids auf die β-Galactosidase-Aktivität.
Gezeigt wird die relative β-Galactosidase-Aktivität in den Zellextrakten der Z. bailii-ATCC 36947-Zellen, die mit den angegebenen Plasmiden transformiert worden waren. Die β-Galactosidase-Aktivität der mit pZ₃LacZ transformierten Zellen wurden gleich 1 gesetzt und die anderen Aktivitäten auf diesen Wert bezogen. Die Zellen wurden in YPD-Medium (2% w/v Glucose) gezüchtet und die Proben gesammelt, sobald die Kulturen einen OD⁶⁶⁰-Wert zwischen 1 und 2 erreichten.

a) Unterschiedliche Promotoren in dem gleichen Plasmid. pZ₃: ScTPI, pZ₃bT: ZbTPI, pZ₃rG: ZrGAPD.
b) Unterschiedliche Bestandteile der Plasmide. pZ₃: Sc ARS/CEN, p195: Sc 2 μm ori-Sequenz, pEZ-IA: Zb 2 μm ori-Sequenz (IR-A), pEZ-IAF: Zb 2 μm ori-Sequenz (IR-A) + FLP, pEZ₂: Zb 2 μm ori-Sequenz (IR-A) + FLP + TFC, pEZ₂-IB: Zb 2 μm ori-Sequenz (IR-A) + FLP + TFC + IR-B. Die Tabelle zeigt die ermittelte Plasmid-Stabilität der jeweilgen Konstrukte.

11: Sekretion von IL-1β in Folge der Steuerung durch die Zygocin-Präsequenz und Vergleich der unterschiedlichen Leader-Sequenzen.

a) Western-Blot-Anylysen, die an Zellextrakten (i) und Überständen (ii) von Z. bailii- und S. cerevisiae-Zellen erfolgten, welche mit dem Plasmid pZ₃kbIL-1β (und mit dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃) transformiert und auf YPD-Medium (2% w/v Glucose) gezüchtet worden waren. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen. Erste Spur: positive Kontrolle (humanes rekombiniertes IL-1β (E. coli), Roche Katalog-Nr. 1 457 756). Die geblotteten Membranen wurden mit einem polyklonalen α-IL-1β-Antikörper sondiert. Western-Blot-Anylysen, die an Zellextrakten (iii) und Überständen (iv) von Z. bailii- und S. cerevisiae-Zellen erfolgten, welche mit dem Plasmid pZ₃kbIL-1β (und mit dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃) transformiert und auf YNB-Medium (5% w/v Glucose) gezüchtet worden waren. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen. Die geblotteten Membranen wurden mit einem polyklonalen α-IL-1β-Antikörper sondiert.
b) Western-Blot-Anylysen, die an Überständen von auf YNB-Medium (2% w/v Glucose) wachsenden Z. bailii-Zellen erfolgten, welche mit den angegebenen Plasmiden transformiert worden waren. Die geblotteten Membranen wurden mit einem polyklonalen α-IL-1β-Antikörper sondiert.

12: Glucoamylase Sta2-Aktivität in transformierten Z. bailii- bzw. S. cerevisiae-Zellen
Bestimmung der Glucoamylase Sta2-Aktivität (E/OD) von S. cerevisiae var. diastaticus im Wachstumsmedium (YNB, 2% w/v Fructose) von mit den Plasmiden pZ₃STA2 und pZ₃klSTA2 und dem jeweiligen (wie angegeben) leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle transformierten Z. bailii- und S. cerevisiae-Zellen. Im ersten Plasmid wird das Plasmid von seiner eigenen Leader-Sequenz zur Sekretion veranlasst, im zweiten Plasmid von der K. lactis-Killertoxin-Präleadersequenz. Die Messungen wurden mehrere Male und mit unabhängigen Klonen wiederholt und das Ausmaß der Variationen mit Fehlerbalken angegeben.
Beispiele:
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Der Fachmann sollte erkennen, dass die in den folgenden Beispielen beschriebenen Techniken solche Techniken darstellen, von denen die Erfinder herausfanden, dass sie bei Ausführung der vorliegenden Erfindung gut funktionieren und somit als bevorzugte Arten ihrer Durchführung angesehen werden können. Der Fachmann sollte jedoch angesichts der vorliegenden Beschreibung erkennen, dass bei den beschriebenen spezifischen Ausführungsformen viele Abänderungen vorgenommen werden können, so dass man immer noch gleichartige oder ähnliche Ergebnisse erhält, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
Beispiel 1: Konstruktion von Z. bailii-Expressions-Plasmiden
Das Grundgerüst des neuen Vektors pZ₃ (1a) bildet das grundlegende Expressionsplasmid YX022 von S. cerevisiae (R & D Systems, Inc., Wiesbaden, D).
Das ARS1-CEN4-Fragment wurde aus Ycplac33 (ATCC 87623, Genbank-Akzessions-Nr. X75456 L26352) entnommen. Es wurde ClaI-blunt/SpeI-geschnitten und in DraIII-blunt/SpeI-geöffnetes pYX022 kloniert (auf diese Weise verlor das Plasmid vollständig das HIS-Gen).
Das erhaltene Plasmid wurde KpnI-blunt-geöffnet und hier wurde die von pFA6-KanMX4 stammende Kan-Kassette (Wach et al., 1994, Yeast 10, 1793–1808) insertiert. Das jeweilige Fragment wurde mittels Schneidens mit SphI/SacI-blunt herausgenommen. Dieses kanMX-Modul enthält das bekannte kan^r-offene Leseraster des an Transkriptions- und Translationssequenzen des TEF-Gens des filamentösen Pilzes Ashbya gossypii (z. B. NRRL Y-1056) fusionierten E. coli-Transposons Tn903. Das beschriebene Hybridmodul gestattet eine effiziente Selektion der gegen Geneticin (G418) resistenten Transformanten.
Die auf dem konstitutiven TPI-Promotor von S. cerevisiae und dem jeweiligen PolyA basierende Expressions-Kassette, die wie in der Figur gezeigt von der MCS (Multi-Cloning Site) unterbrochen ist, stammt von dem ursprünglichen pYX022-Plasmid (siehe Informationen des Lieferanten). Alle anderen in den 1 bis 4 angegebenen Plasmide stammen von pZ₃.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃kl (1b) wurde die Signal-Präsequenz (16aa) der Alpha-Untereinheit des K1-Killertoxins von K. lactis (Stark, M. J. et al., 1986, EMBO J. 5, 1995–2002) funktionell an den TPI-Promotor des pZ₃-Plasmids gekoppelt, um die Selektion des jeweiligen Proteins zu steuern.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃ppα (1c) wurde die Präpro-α-Faktor-Signalsequenz auf ähnliche Weise verwendet und funktionell insertiert. Die Sequenz wurde aus dem Plasmid pPICZαA (Invitrogen BV, Niederlande) entnommen.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃klIL-1β (2a) wurde die kodierende Sequenz für das schon mit der Signalsequenz für das Killertoxin von K. lactis fusionierte Protein entnommen, indem es aus dem Plasmid pCXJ-kan1 (Fleer, R. et al., 1991, Gene 107, 285–295) XbaI/EcoR1-bluntended herausgeschnitten und in das EcoRI-bluntended Plasmid pZ₃ subkloniert und dephosphoryliert wurde.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃ppαGFP (2c) wurde das die α-Faktor-Präproleadersequenz im Leseraster mit der GFP-kodierenden Sequenz enthaltende Fragment aus dem Plasmid pPICAGFP1 HindIII-bluntended/BamH1 herausgeschnitten und in das EcoR1-bluntended/BamH1-geöffnete Plasmid pZ₃ subkloniert und dephosphoryliert. Das Plasmid pPICAGFP1 wurde nach Passolunghi, S. et al. konstruiert, indem eine PCR-amplifizierte GFP-Sequenz im Leseraster in das Plasmid pPICZαA ((Invitrogen BV, Niederlande) eingebaut wurde. Die PCR-Technik ist im Stand der Technik bekannt. Als Beispiel wird auf Gelfand, D. H. et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press und Diefenbach, C. W. et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 Bezug genommen.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃ppαIL-1β (2b) wurde IL-1β aus dem Plasmid pZ₃klIL-1β mittels PCR amplifiziert.
Die Oligos für die Amplifikation sind die folgenden:
Für die Amplifikation wurde das folgende Programm verwendet:
Auf diese Weise wurde eine DrdI-Schnittstelle zum Subklonieren der kodierenden Sequenz des IL-1β-Proteins im Leseraster mit der α-Faktor-Pröproleadersequenz eingeführt. Das Plasmid pZ₃ppαGFP wurde mit EcoEI-bluntended/BamHI geöffnet. Das PCR-Fragment wurde mit DrdI-bluntended/BamHI geschnitten. Eine Kombination führte zu dem Plasmid pZ₃ppαIL-1β.
In dem Plasmid pZ₃kbIL-1β wurde die kodierende Sequenz des Interleukins funktionell an die abgeleitete Präleadersequenz des Z. bailii-Killertoxins Zygocin (Genebank Akzessions-Nr.: AF515592; Weiler, F. et al., 2002, Mol. Microbiol. 46, 1095–1105) gekoppelt. Die Oligonucleotide wurden im Wesentlichen nach der abgeleiteten Präleadersequenz des Z. bailii-Killertoxins Zygocin (SEQ ID NO.: 59) synthetisiert und in das Plasmid pZ₃ kloniert. Sodann wurde, wie zuvor dargestellt, das IL-1β amplifiziert und im Leseraster an die Präsequenz von Zygocin geklont.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃GAA (3a) wurde die kodierende Sequenz der α-Glucoamylase von A. adeninivorans BamHI-bluntended aus dem Plasmid pTS32x-GAA (Bui, D. M. et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 102–106) geschnitten und in das mit EcoRI-bluntended geöffnete Plasmid pZ₃ insertiert und dephosphoryliert. Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃STA2 wurde die codierende Sequenz für die Amylase von S. cerevisiae var. diastaticus (welche ihre eigene Leadersequenz umfasst) aus dem Plasmid pMV35 (Vanoni, M. et al., 1989, Biochim. Biophys. Acta 1008, 168–176) AbaI/AseI-blunt geschnitten und in das EcoRI-blunt-geöffnete Plasmid pZ₃ insertiert. Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃klSTA2 wurde die codierende Sequenz für die gleiche Amylase, die aber funktionell an die Leadersequenz für das K-lactis-Killertoxin gebunden war, aus dem Plasmid pMV57 (Venturini, M. et al., 1997, Mol. Microbio,. 23, 997–1007) XhoI/AseI-blunt-geschnitten und in das EcoRI-blunt-geöffnete Plasmid pZ3 insertiert.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃LacZ (3b) wurde die codierende Sequenz für die bakterielle β-Glucosidase mit HindIII-bluntended/BamHI aus dem Plasmid pSV-β-Galactodidase (Promega, Inc.) herausgeschnitten und in das mit EcoRI.bluntended/BamHI geöffnete Plasmid pZ₃ insertiert und dephosphoryliert.
In dem Plasmid pZ₃bT (4a) wurde der TPI-Promotor von S. cerevisiae durch den endogenen TPI-Promotor aus Z. bailii ersetzt. Die Sequenz aus der genomischen DNA des Z. bailii-Stammes ISA 1307 wurde mittels PCR amplifiziert und die Primer gemäß der Literatur (Merico, A. et al., 2001, Yeast 18, 775–780) benannt. Die Extraktion der genomischen DNA erfolgte nach der von Hoffman, C. S. et al., 1987, Gene 57, 267–272) veröffentlichten Vorschrift.
Die Oligos für die Amplifikation waren die folgenden:
Für die Amplifikation wurde das folgende Programm verwendet:
Das PCR-Fragment wurde in den Vektor pST-Blue1 (Novagen, Perfect Blunt cloning Kit Katalog-Nr. 70191-4) nach der enthaltenen Vorschrift subkloniert. Daraus wurde der Promotor mit SnaBI/SacI herausgeschnitten und in den mit AatII-blundended/SacI geöffneten pZ₃ subkloniert (um so den TPI-Promotor von S. cerevisiae zu entfernen), wodurch das gewünschte Plasmid erhalten wurde.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃bTLacZ (4b) wurde die codierende Sequenz für die bakterielle β-Galactosidase mit HindIII/BamHI bluntended aus dem Plasmid pSV-β-Galactodidase (Promega, Inc.; Genbank Akzessions-Nr.: X65335) herausgeschnitten und in das mit NhI-.bluntended geöffnete Plasmid pZ₃bT insertiert und dephosphoryliert.
In dem Plasmid pZ₃rG wurde der TPI-Promotor von S. cerevisiae durch den GAPDH-Promotor aus Z. rouxii ersetzt. Die Sequenz wurde aus der genomischen DNA des Z. rouxiii-Stammes LST11 mittels PCR amplifiziert und die Primer gemäß der Literatur (Ogawa, Y. et al., 1990, Agric Biol. Chem. 54, 2521–2529) benannt. Die Extraktion der genomischen DNA erfolgte nach der zuvor zitierten Vorschrift. (Ein anderer möglicher Stamm ist Z. rouxii NRRL Y-229).
Die Oligos für die Amplifikation waren die folgenden:
Für die Amplifikation wurde das folgende Programm verwendet:
Das erhaltene PCR-Fragment (708 bp) wurde in den Vektor pST-Blue1 (Novagen, Perfect Blunt cloning Kit Katalog-Nr. 70191-4) nach der enthaltenen Vorschrift subkloniert. Daraus wurde der Promotor mit SnaBI/SacI herausgeschnitten und in den mit AatII-blundended/SacI geöffneten pZ₃ subkloniert (um so den TPI-Promotor von S. cerevisiae zu entfernen), wodurch das gewünschte Plasmid erhalten wurde.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃rGLacZ (4b) wurde die codierende Sequenz für die bakterielle β-Galactosidase mit HindIII/BamHI bluntended aus dem Plasmid pSV-β-Galactodidase (Promega, Inc.; Genbank Akzessions-Nr.: X65335) herausgeschnitten und in das mit XhoI-.bluntended geöffnete Plasmid pZ₃rG insertiert und dephosphoryliert.
Die DNA-Manipulation, die Transformation und die Kultivierung von E. coli (DH5α) wurden nach Standardvorschriften durchgeführt (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Auch die anderen grundlegenden molekularbiologischen Vorschriften wurden, wenn nicht anders angegeben, nach diesem Handbuch durchgeführt. Alle eingesetzten Restriktions- und Modifikations-Enzyme stammten von NEB (New England Biolabs, UK) oder von Roche Diagnostics.
Beispiel 2: Transformation von Z. bailii
Die Transformationen aller Z-bailii- und S. cerevisiae(NRRL Y-30320)-Stämme wurden grundsätzlich nach der LiAc/PEG/ss-DNA-Vorschrift (Agatep, R. et al., 1998, Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol. Technical Tips Online (http://tto.trends.com)) durchgeführt. Nach der Transformation wurden die Z. bailii-Zellen mit einer 16-stündigen Inkubation in YP-Medium, das 2% w/v Fructose als Kohlenstoffquelle (YPF) und 1 M Sorbit enthielt, bei 30°C gewonnen. Die Zellsuspension wurde dann auf selektive YPF-Platten mit 200 mg/l G418 (Gibco BRL. Katalog-Nr. 11811-031) ausplattiert. Nach 2–3 Tagen bei 30°C erschienen einzelne Klone. Von da an wurden die Transformanten entweder in angereichertem Medium oder in Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und 300 mg/l G418 zur Aufrechterhaltung der Selektion angezüchtet. Für die S. cerevisiae-Zellen war der Vorgang der gleiche, mit Ausnahme der Kohlenstoffquelle, die in allen Schritten Glucose blieb, sowie der G418-Konzentration, die für unseren Stamm optimal auf 500 mg/l eingestellt wurde.
Beispiel 3: Expression und Sekretion von Interleukin 1-β in Z. bailii
Um die sekretorische Fähigkeit der Hefe Z. bailii zu untersuchen und um mit dem gut bekannten Wirt S. cerevisiae zu vergleichen, wurden beide Hefen (gemäß Beispiel 2) mit dem Plasmid pZ₃klIL-1β (2a) transformiert. Die unabhängigen Transformanten wurden in einem Schüttelkolben in Minimalmedium (YNB, 1,34% w/v YNB von den Difco Laboratories, Detroit, MI #919-15, 5% w/v Glucose, komplementiert mit Histidin, Uracil und Leucin, 5a, linke Abbildung) oder in angereichertem Medium (YPD, 5% w/v Glucose, 2% w/v Pepton, 1% w/v Hefeextrakt, 5a, rechte Abbildung) kultiviert. In 5a werden die Zelldichte (OD 660 nm) und der Glucose-Verbrauch während der Wachstumskinetiken gezeigt. Der Glucose-Verbrauch wurde mit Hilfe eines im Handel erhältlichen enzymatischen Kits von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland (Katalog-Nr.: 716251) nach den Angaben des Herstellers ermittelt. Während der Kinetiken wurden die Proben zu den angegebenen Zeiten gesammelt (siehe "Stunden" der 5b, c und d). Die Zellen (ein Kulturvolumen entsprechend 10⁸ Zellen) wurden mittels Zentrifugation (10 min bei 10.000 Upm) geerntet. Zu den Überstanden dieser Proben wurde 1 Volumen 2X Laemmli-Puffer (Larmmli, U. K., 1970, Nature 227, 680–685) gegeben, 3–5 Minuten lang gekocht und bei –20°C bis zu ihrer Auftragung aufbewahrt oder sie wurden direkt auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen.
Die Zellpellets dieser Proben wurden in 5 ml 20% TCA resuspendiert, zentrifugiert (10 min bei 3000 Upm) und die erhaltenen Pellets in 150 μl 5% TCA resuspendiert. Die Proben wurden sodann 10 min lang bei 3000 Upm zentrifugiert und das Pellet in Laemmli-Puffer (100 μl) resuspendiert. Um die Proben zu neutralisieren, wurde 1 M Tris-Base (50 μl) zugegeben. Nach 3–5 Minuten bei 99°C sind die Proben bereit, um auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen zu werden (alternativ können sie bei –20°C aufbewahrt werden).
Die Proben wurden auf Standard-Polyacrylamid-Gele (SDS-PAGE, Endkonzentration des Trennungsgels: 15%) aufgetragen; Nach der Auftrennung der Proteine wurden die Gele auf Nitrocellulose-Membranen (Protran BA 85, Schleicher & Schuell) geblottet (1 h, 250 mA). Immundekoration: nach 1 h (RT) Sättigung in TBS 1X (1,2 g/l Tris-Base; 9 g/l NaCl) + 5% NFM (Non Fat Milk), 0,2% Tween-20 wurden die Membranen über Nacht bei 4°C mit dem primären Antikörper gegen Interleukin (polyklonaler Kaninchen-Antikörper IL-1β(H-153) von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Katalog-Nr. sc-7884) inkubiert, der in TBS 1X (1,2 g/l Tris-Base; 9 g/l NaCl) + 5% NFM 1:200 verdünnt worden war. Nach intensiven und wiederholten Waschvorgängen in TBS + 0,2% Tween-20, wurde der sekundäre Antikörper (mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Antikaninchen-IG, Amersham Biosciences, UK, Katalog-Nr. NA934) zugegeben (1:10.000 in TBS 1X + 5% NFM) und 1 h (RT) inkubieren gelassen. Die Proteine wurden mit Hilfe des ECL-Western-Blotting-Systems (Amersham Biosciences, UK) nach den Angaben des Herstellers sichtbar gemacht.
Die mittels Western-Blot erhaltenen Daten, die an dem Überstand genommen wurden, werfen ein Schlaglicht auf die überraschend gute sekretorische Fähigkeit von Z. bailii-Zellen (siehe 5c), sowohl in Minimalmedium als auch in angereichertem Medium. Bemerkenswert ist, dass das dem sekretierten Protein entsprechende Signal signifikant intensiver ist gegenüber dem Signal, das von S. cerevisiae-Zellen erhalten wurde, was mit dem geringeren Signal übereinstimmt, das in rohen Zellextrakten von Z. bailii zu beobachten ist (5b). Darüber hinaus ist der Unterschied zwischen den ausgeschiedenen Mengen an Protein in Minimalmedium noch ausgeprägter als in angereichertem Medium (zum Vergleich: 5c, linke und rechte Abbildung). Diese Schlüsse lassen sich entweder bei Betrachtung der aufgetragenen Proben, wenn man die OD berichtigt (5c) oder bei Betrachtung gleicher Volumina der aufgetragen Proben (5d) ziehen.
Auf ähnliche Weise wurden Z. bailii- und S. cerevisiae-Zellen mit dem Plasmid pZ₃ppαIL-1β transformiert. In diesem Fall wird das gleiche Protein (Interleukin) funktionell mit der Leader-Sequenz des α-Faktor-Pheromons von S. cerevisiae fusioniert. Wie zuvor beschrieben, wurden die Zellen in angereichertem YPD-Medium oder in YNB-Minimalmedium in Schüttelkolben kultiviert, die Proben gesammelt und für eine SDS-PAGE-Proteinauftrennung hergerichtet. Der Western Blot (6a) zeigte einmal mehr die überraschend gute Sekretion bei Z. bailii im Vergleich mit S. cerevisiae: die aus den Rohextrakten erhaltenen Signale (i für das YPD-Medium, iii für das YNB-Medium) sind im letzteren Stamm intensiver, was nahe legt, dass das Produkt eine kürzere Zeit zurückgehalten wird und daher aus Z. bailii-Zellen effizienter ausgeschieden wird. Diese Beobachtung stimmt mit der Tatsache überein, dass die Signale, welche dem in das Medium ausgeschiedenen Produkt entsprechen, bei Z. bailii-Proben intensiver sind als bei solchen von S. cerevisiae (ii für YPD-, iv für YNB-Medium; in diesem Fall liegt ein positives Signal nur bei Z. bailii Proben vor).
Wichtig ist, dass der Prozess der Expression, Sekretion und Anreicherung von heterologen Proteinen im Kulturmedium nicht nur erhalten werden kann, wenn die Leader-Sequenz geändert wird, sondern auch, wenn die gleiche Leader-Sequenz verwendet wird, aber das exprimierte heterologe Protein geändert wird. Die Z. bailii-Zellen wurden mit dem Plasmid pZ₃ppαGFP transformiert, in Schüttelkolben in YNB-Minimalmedium kultiviert, die Proben gesammelt und für eine SDS-PAGE-Proteinauftrennung hergerichtet. Die Western-Blot-Analyse, die mit Ausnahme des eingesetzten Antikörpers (Anti-GFP, Clontech, Inc.) und dessen Konzentration (1:500) wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde, zeigt eine Bande des erwarteten Ausmaßes, welche nur im Überstand der das heterologe GFP-Protein exprimierenden Z. bailii-Zellen auftritt (6b) und nicht bei dem mit einem leeren Plasmid transformierten Kontrollstamm.
Die erhaltenen Daten unterstreichen die Möglichkeit, Z. bailii als Wirt für den Prozess zu verwenden, unterschiedliche heterologe Proteine zu exprimieren und sie auszuscheiden, wobei die Sekretion durch heterologe Leader-Sequenzen gesteuert wird. Bemerkenswert ist, dass das Ausmaß an ausgeschiedenen Proteinen größer ist im Vergleich mit den bei S. cerevisiae erhaltenen Ausmaßen und dass der Unterschied in einem chemisch definierten Kulturmedium noch ausgeprägter ist.
Beispiel 4: Expression und Sekretion von Interleukin 1-β in einer Z. bailii-Bioreaktor-Batch-Kultivierung mit hohen Zucker-Konzentrationen
Z. bailii-Zellen, welche (gemäß Beispiel 2) mit dem Plasmid pZ₃klIL-1β (2a) transformiert und vorher auf ihre Interleukin-1β-Produktion in einer Schüttelkolben-Kultur hin untersucht worden waren (siehe Beispiel 3), wurden batchweise in einem Labor-Bioreaktor von 2 l (Fermentor, Biolafitte & Moritz, Mod. Prelude – Frankreich) in einem chemisch definierten Medium mit hohem Glucose-Gehalt kultiviert (27% w/v Glucose, 4% w/v (NH₄)₂SO₄, 0,4% w/v MgSO₄, 2,4% w/v KH₂PO₄, Vitamine nach Verduyn, C. et al., 1992, Yeast 8, 501–517, wobei die Endkonzentration an Vitaminen so eingestellt wurde, dass sie bezüglich der angegebenen Konzentrationen das 24-fache betrug, sowie Spurenelemente nach Verduyn, C. et al., 1992, Yeast 8, 501–517, wobei auch die Endkonzentration an Spurenelementen so eingestellt wurde, dass sie das 24-fache der angegebenen Konzentrationen betrug. (Je nach der Salz-Toleranz des Produktionsstammes könnte es in diesem Zusammenhang von Nutzen sein, dem Anfangsmedium nur eine Teilmenge der Salze mit der Glucose zuzusetzen und den Rest der Salze zuzugeben, nachdem die Bioreaktion (Fermantation) über eine ausreichende Zeitspanne fortgeschritten ist). Die pH-Kontrolle (pH-Wert: 5) erfolgt durch Zugabe von 2 M KOH. G418 wurde bis zu einer Konzentration von 200 mg/l G418 zugesetzt, wenn nötig wurde ein Antischaummittel zugegeben.). Das Inokulum wurde hergestellt, indem die Hefe in einem Schüttelkolben (Verhältnis Luftraum/Kulturvolumen von 4) in angereichertem YPD-Medium (siehe oben) unter Zugabe von 200 mg/l G418 vorgezüchtet wurde. Die Zellen wurden geerntet, mit entionisiertem Wasser gewaschen und bei einer OD von 1,68 in das Endmedium im Bioreaktor inokuliert. Die Zellkultur wurde mit 90 l/h Luft durchspült und die gelöste Sauerstoff-Konzentration bei einer Luft-Sättigung von 40% gehalten, wobei die Geschwindigkeit des Rührers variiert wurde. In 7a sind die Wachstumskinetiken (Zelldichte, OD 660 nm) zusammen mit dem Glucose-Verbrauch, der Ethanol-Produktion und der produzierten Biomasse (Trockengewicht g/l) wiedergegeben. Der Glucose-Verbrauch und die Ethanol-Produktion wurden mit Hilfe von im Handel erhältlichen enzymatischen Kits von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland (Katalog-Nrn.: 716251 bzw. 0176290) nach den Angaben des Herstellers ermittelt. Die Bestimmung des Zell-Trockengewichts (Biomasse) erfolgte wie früher beschrieben (Rodrigues, F. et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67, 2123–2128). Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten gesammelt und für eine SDS-PAGE-Proteinauftrennung hergerichtet. Die Western-Blot-Analyse (durchgeführt wie in Beispiel 3 beschrieben) zeigt ein sehr starkes und sauberes Signal, das sich im Laufe der Zeit verstärkte und dem ausgeschiedenen Produkt (Spuren 2 bis 5) entspricht und welches die minimale Retention des in den Zellen produzierten heterologen Proteins bestätigt (Spuren 6 bis 9, 7b). Dieses Beispiel zeigt die überraschende und vorteilhafte Eigenschaft von Z. bailii-Zellen, selbst bei sehr hohen Zucker-Konzentrationen sowohl wachsen zu können als auch ein heterologes Protein zu exprimieren und auszuscheiden. Wie berichtet kann S. cerevisiae bei derart hohen Zucker-Konzentrationen nicht oder nur sehr spärlich wachsen (siehe z. B. Porro, D. et al., 1991, Res. Microbiol. 142, 535–539).
Beispiel 5: Expression und Sekretion der Glucoamylase in Z. bailii
Z. bailii-Zellen wurden mit dem Plasmid pZ₃GAA (3) und mit dem leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle transformiert (gemäß Beispiel 2). Unabhängige Transformanten wurden in Schüttelkolben in YNB-Minimalmedium mit 2% w/v Glucose als Kohlenstoffquelle (+0,67% w/v YNB und aa, nach der Vorschrift des Herstellers) bis zur mid-exp-Phase (auch als mid-log-Phase bezeichnet) kultiviert. Die Aktivität der β-Glucoamylase wurde wie folgt bestimmt: Nach Ermittlung der Zelldichte wurden die Zellen geerntet, um den Kulturüberstand zu retten. Es wurden 15 μl/ml NaAc, pH 5,2 und 20 μl/ml 1% w/v Stärke (Fluka 85642 – hohe Löslichkeit) zugesetzt. Sodann wurden die Proben gut gemischt und bei der gewünschten Temperatur (in diesem Versuch: 50°C) inkubiert. Zum Zeitpunkt Null und alle 20 Minuten danach wurde 1 ml des inkubierten Mediums genommen, 2 min lang eisgekühlt, 50 μl Lugols Lösung (Fluka 62650) zugegeben, schnell geschüttelt und bei λ = 580 nm am Spektralphotometer abgelesen. Die Steigung der erhaltenen Werte entspricht der Aktivität der Glucoamylase. In 8 ist die Aktivität der Glucoamylase von drei unabhängigen die GAA und eine negative Kontrolle exprimierenden Klonen wiedergegeben. Die enzymatische Aktivität ist in mE/OD ausgedrückt und sie wird berechnet, indem bedacht wird, dass 1 E der Änderung von 1 OD in 1 min entspricht. Die in der graphischen Darstellung angegebenen Werte wurden vom dem in der Kontrollprobe gemessenen Basiswert für die Aktivität von Z. bailii subtrahiert.
Z. bailii- und S. cerevisiae-Zellen wurden mit den Plasmiden pZ₃STA2 und pZ₃klSTA2 und mit dem leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle transformiert (gemäß Beispiel 2). Unabhängige Transformanten wurden in Schüttelkolben in YNB-Minimalmedium mit 2% w/v Fructose als Kohlenstoffquelle (+0,67% w/v YNB und aa, nach der Vorschrift des Herstellers) bis zur mid-exp-Phase (auch als mid-log-Phase bezeichnet) kultiviert. Die Aktivität der α-Glucoamylase wurde nach der Literatur (Modena et al., 1985, Arch. of Biochem. And Biophys. 248, 138–150) wie folgt bestimmt: Nach Ermittlung der Zelldichte wurden die Zellen geerntet, um den Kulturüberstand zu retten und ein Aliquot dieses Überstandes wurde zur Herstellung des folgenden Reaktionsgemischs verwendet.

Überstand 100 μl

400 mM Maltotriose 6,3 μl

200 mM NaAc pH 4,6 125 μl

H₂O 18,7 μl

insgesamt 250 μl
Das Gemisch wird 1 Stunde lang bei 37°C unter leichtem Rühren inkubiert und nach dieser Zeit ein Aliquot dieses Gemischs dazu verwendet, die Reaktion zu beurteilen. Das Produkts des Abbaus von Maltotriose ist Glucose und dessen Konzentration lässt sich bestimmen, indem ein im Handel erhältliches enzymatisches Kit von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland (Katalog-Nrn.: 716251) verwendet wird. 1 E der Glucoamylase-spezifischen Aktivität ist die Menge an Enzym, die benötigt wird, um unter dieser Bedingung 1 μMol min-1 Glucose freizusetzen.
Beispiel 6: Expression von β-Galactosidase (β-Gal) in Z. bailii
Z. bailii-Zellen wurden mit dem Plasmid pZ₃LacZ (3b), mit dem Plasmid pZ₃bTLacZ (4b), mit dem Plasmid pZ₃GLacZ und mit dem leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle transformiert (gemäß Beispiel 2). Unabhängige Transformanten wurden in Schüttelkolben in YPD-Medium (siehe Beschreibung weiter oben) mit 2% w/v Glucose als Kohlenstoffquelle bis zur mid-exp-Phase kultiviert. Bestimmung der Aktivität der β-Galactosidase: Nach Ermittlung der Zelldichte wird 1 ml der Kultur in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben, 5 min lang zentrifugiert (um ein hartes Pellet zu erhalten), mit einer Pipette abgesaugt (wobei nicht die Vakuumleitung benutzt wird!), in 1 ml Z-Puffer gewaschen [w/o BME – Betamercaptoethanol-; Z-Puffer: 16,1 g/l Na₂HPO₄ × 7H₂O, 5,5 g/l NaH₂PO₄ × H₂O, 0,75 g/l KCl, 0,246 g/l MgSO₄ × 7H₂O], repelletiert, in 150 μl Z-Puffer (mit BME, 27 μl/10 ml) resuspendiert, 50 μl Chloroform zugesetzt und 20 μl 0,1% SDS und 15 Sekunden lang heftig gevortext. Es werden 700 μl vorerwärmtes ONPG (o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid, Sigma, N-1127, 1 mg/ml in Z + BME) zugegeben und die Reaktion bei 30°C (20 Minuten bis 3 Stunden) gestartet, wobei die Zelt kontrolliert wird. Wenn die Suspension ein gelbe Farbe annimmt, wird die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml 1 M Na₂CO₃ angehalten; Nach Zentrifugieren über einen Zeitraum von 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit wird die Probe am Spektralphotometer bei λ = 420 nm abgelesen.
8b zeigt die β-Gal-Aktivität von drei unabhängigen Klonen, welche die β-Gal unter der Kontrolle des TPI-Promotors von Z. bailii exprimieren, von zwei unabhängigen Klonen, welche die β-Gal unter der Kontrolle des TPI-Promotors von S. cerevisiae exprimieren sowie von einer negativen Kontrolle (siehe Legende zu der Figur für die Angaben der jeweiligen Klone). Die enzymatische Aktivität ist als Miller-Einheit/OD ausgedrückt und wird nach der folgenden Formel berechnet:
Wie leicht zu erkennen ist, ist die Expression aus dem endogenen TPI-Promotor viel stärker (4- bis 5-mal) als aus dem jeweiligen Promotor von S. cerevisiae.
Es wurde eine ähnliche Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Effizienz der auf den Sequenzen des endogenen Z. bailii-Plasmids bei der Verbesserung der Expressionsraten von heterogenen Proteinen beruhenden Plasmide zu beurteilen. Es erfolgte eine Transformation (entsprechend Beispiel 2) von Z. bailii-Zellen mit den folgenden Plasmiden: pZ₃LacZ (3b), p195LacZ, pEZ-IALacZ, pEZ-IAFLacZ, pEZ₂LacZ und pEZ₂-IBLacZ. Unabhängige Transformanten wurden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen und, wie zuvor beschrieben, die Aktivität der β-Galctosidase gemessen. Die entsprechenden Daten sind in 10b wiedergegeben.
Beispiel 7: Isolierung eines endogenen Z. bailii-Plasmids
Die Z. bailii-Stämme ATCC 36947 und NCYC 1427 wurden kultiviert und ihr endogenes Plasmid extrahiert, was zu den Plasmiden pZB₁ und pZB₅ führte (siehe 9a und b). Die verwendete Vorschrift war eine Abänderung einer Vorschrift von Lorincz, A., 1985, BRL Focus 6, 11 und in ihr werden zum Aufbrechen der Zellen Glaskügelchen verwendet. Nach Extraktion der DNA wurden die Proben auf ein Agarose-Gel aufgetragen und die dem Plasmid entsprechende Bande wurde eluiert (Qiagen, QIAquick Gel Extraction Kit, Katalog-Nr. 28704).
Das aus NCYC 1427 extrahierte Plasmid wurde mit EcoRI geschnitten und einige der Fragmente wurden sequenziert. Diese Sequenzen entsprechen der SEQ ID NO.: 63, SEQ ID NO.: 64, SEQ ID NO.: 65, SEQ ID NO.: 66, SEQ ID NO.: 67, SEQ ID NO.: 68, SEQ ID NO.: 69 bzw. SEQ ID NO.: 70.
Beispiel 8: Sequenz-Amplifikation der offenen Leseraster und der Struktursequenzen des endogenen Z-bailii-Plasmids
Die aus den Z. bailii-Stämmen ATCC 36947 und NCYC 1427 extrahierten genomischen DNAs wurden als Matrize für die Amplifikation der offenen Leseraster und der Struktursequenzen der endogenen Z. bailii-Plasmide verwendet.
Die Oligos für die Amplifikation sind die folgenden:
Für die Amplifikation wurde das folgende Programm verwendet:
Die in den Vektor pST-Blue1 (Novagen, Perfect Blunt cloning Kit, Kataöog-Nr. 70191-4) subklonierten amplifizierten Fragmente wurden sequenziert und entsprechen den SEQ ID NO.: 71 (IR-ARS), SEQ ID NO.: 72 (FLP), SEQ ID NO.: 74 (TFB) bzw. SEQ ID NO.: 76 (TFC).
Diese codierenden Sequenzen wurden gemäß 9b zur Konstruktion des Expressions-Plasmids pEZ₁ verwendet.
Beispiel 9: Konstruktion von Expressions-Plasmiden, basierend auf der Replikation und die Stabilitätssequenzen aus dem pSB2-Plasmid von Z. bailii
Das Grundgerüst für die neuen Vektoren bildet das wie in Branduardi (2002, Yeast 19, 1165–1170) beschrieben zum Expressions-Plasmid pBR195 modifizierte Multicopy-Plasmid Yeplac 195 von S. cerevisiae (Gietz und Sugino, 1988, Gene 74, 527–534).
Für die Konstruktion des Plasmids p195 wurde das Plasmid pBR195 AatII/ApaI-blunt-geschnitten, um den URA-Marker herauszuschneiden und die aus pFA6-KanMX4 SphI/SacI-blunt herausgeschnittene Kan^R-Kassette (Wach et al., 1994, Yeast 10, 1793–1808) wurde hier insertiert. Aus diesem Plasmid stammt das Plasmid p195LacZ: das LacZ-Gen wurde aus dem SphI/NheI-geschnittenen Plasmid pZ₃LacZ in das mit den gleichen Enzymen geöffnete neue Plasmid p195 subkloniert.
Für die Konstruktion der Plasmide pEZ-IALacZ wurden die Plasmide p195 und p195LacZ NarI/StuI-blunt-geöffnet, um den 2 μm-ori von S. cerevisiae zu entfernen. Das den IR-A- und ARS-Sequenzen aus dem pSB2 entsprechende PCR-Fragment (zur genauen Amplikation siehe voriges Beispiel) wurde aus dem pST-Blue1-Plasmid EcoRI-blunt herausgeschnitten und in die gerade beschriebenen geöffneten Vektoren subkloniert.
Für die Konstruktion des Plasmids pEZ-IAFLacZ wurde das Plasmid pEZ-IALacZ mit SmaI geöffnet und hier das dem FLP entsprechende Fragment und die seinen Promotor enthaltende Sequenz, die von dem Acc1-blunt/SnaBI geöffneten pST-Blue1-Plasmid stammt, subkloniert. Diese Sequenz wurde aus der aus den Z. bailii-Stämmen ATCC 36947 extrahierten genomischen DNA mittels der PCR amplifiziert.
Die Oligos für die Amplifikation sind die folgenden:
Für die Amplifikation wurde das folgende Programm verwendet:
Für die Konstruktion der Plasmide pEZ₂ und pEZ₂LacZ wurden die Plasmide pEZ-IA und pEZ-IALacZ mit SmaI geöffnet und das den Sequenzen für FLP und TFC und die jeweiligen Promotoren entsprechende PCR-Fragment wurde aus dem pST-Blue1-Plasmid Sna1/SaII-blunt herausgeschnitten und in die gerader beschriebenen geöffneten Vektoren subkloniert.
Die Oligos für die Amplifikation sind die folgenden:
Für die Amplifikation wurde das folgende Programm verwendet:
Um zu dem Plasmid pEZ₂ zugelangen, wurde ein zusätzlicher Klonierungsschritt benötigt, um das PolyA wieder zu insertieren: das PolyA wurde aus dem Plasmid pYX022 mit NaeI/NheI-blunt herausgeschnitten und in das transitorische Plasmid BamHI-blunt subkloniert und dephosphoryliert.
Für die Konstruktion des Plasmids pEZ₂-IBLacZ wurde das Plasmid pEZ₂LacZ mit SalI-blunt geöffnet und dephosphoryliert und da hinein das Fragment IR-B subkloniert. Das Fragment war aus pST-Blue1 extrahiertes EcoRI-blunt (siehe voriges Beispiel).
Beispiel 10: Bestimmung der Stabilität von Plasmiden
Die Stabilität der in dem vorigen Beispiel beschriebenen Plasmide wurde wie folgt ermittelt: Z. bailii-Transformanten, welche unterschiedliche Plasmide beherbergten, wurden mit einer Zelldichte von 5 × 10³ Zellen/ml in angereichertes Medium (YPD) bzw. angereichertes Selektivmedium (YPD + G418) inokuliert. Bei T₀ des Inokulums und dann nach 10 und 20 Generationen wurden 500 Zellen aus jeder Kultur 3 Mal auf selektive und nicht-selektive Agarplatten plattiert und sodann bei 30°C inkubiert, bis die Kolonien zu sehen waren. Das Verhältnis zwischen dem Mittelwert der auf Selektivmedium gewachsenen Kolonienzahl und dem Mittelwert der auf nicht-selektivem Medium gewachsenen Kolonienzahl ergibt den Prozentsatz für die mitotische Stabilität.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Proteins, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a. Kultivierung eines Stammes von Zygosaccharomyces bailii, der einen Vektor enthält, welcher die DNA-Sequenz umfasst, welche das Protein codiert, das funktionell an eine Signalsequenz gebunden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe Prä-Signalsequenz der Alpha-Untereinheit des K1-Killertoxins von Kluyveromyces lactis und Signalsequenz des Prä-Pro-α-Faktors von Saccharomyces cerevisiae, und ferner funktionell an einen Promotor gebunden ist, b. Expression und Sekretion des Proteins und c. Isolierung des Proteins.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem der Vektor ein extrachromosomales Plasmid ist.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem das Plasmid von einem endogenen episomalen Plasmid aus dem Z. bailii-Stamm herrührt.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Plasmid Sequenzen für die Replikation, Stabilisierung und/oder Kontrolle der Anzahl der Plasmid-Kopien umfasst, welche aus Z. bailii erhalten werden können.
Verfahren nach Anspruch 3, in welchem das Plasmid mindestens 35 Basen von einer der Sequenzen umfasst, die ausgewählt sind aus der Liste: SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 oder SEQ ID NO: 71.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, in welchem der Promotor ein Triosephosphat-Isomerase-Promotor ist, welcher aus Saccharomyces cerevisiae oder aus Z. bailii, vorzugsweise aus Z. bailii erhalten werden kann.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, in welchem der Promotor ein Glyceraldehyphosphat-Dehydrogenase-Promotor ist, welcher aus Saccharomyces cerevisia, Zygosaccharomyces bailii oder Zygosaccharomyces rouxii, vorzugsweise aus Zygosaccharomyces rouxii erhalten werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem der Vektor das in 1b gezeigte Plasmid pZ₃kl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem der Vektor das in 1c gezeigte Plasmid pZ₃ppα ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, in welchem die das Protein codierende DNA-Sequenz identisch mit der aus Tier-, Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Virus-Quellen ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, in welchem der Z. bailii-Stamm ausgewählt ist aus der Liste: ATCC 36947, ATCC 60483, NCYC 1427 oder ATCC 8766.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem der Z. bailii-Stamm einem Selektionsprozess für eine verbesserte Sekretion unterzogen worden ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem der Z. bailii-Stamm in einem chemisch definierten Medium kultiviert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches ferner die Isolierung des Proteins aus dem Kulturmedium umfasst.
Zygosaccharomyces bailii-Stamm, welcher ein heterologes Protein exprimiert und sekretiert, wobei der Stamm einen Vektor enthält, welcher die DNA-Sequenz umfasst, welche das Protein codiert, das funktionell an eine Signalsequenz gebunden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe Prä-Signalsequenz der Alpha-Untereinheit des K1-Killertoxins von Kluyveromyces lactis und Signalsequenz des Prä-Pro-α-Faktors von Saccharomyces cerevisiae, und ferner funktionell an einen Promotor gebunden ist.