WO2000040727A2 - Rekombinanter wachstumsfaktor mit der biologischen aktivität eines g-csf (granulocyte colony stimulating factor) - Google Patents

Rekombinanter wachstumsfaktor mit der biologischen aktivität eines g-csf (granulocyte colony stimulating factor) Download PDF

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WO2000040727A2
WO2000040727A2 PCT/EP1999/010466 EP9910466W WO0040727A2 WO 2000040727 A2 WO2000040727 A2 WO 2000040727A2 EP 9910466 W EP9910466 W EP 9910466W WO 0040727 A2 WO0040727 A2 WO 0040727A2
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nucleic acid
sequence
variant
growth factor
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Johannes Fischer
Peter Wernet
Gerd Gellissen
Volker Jenzelewski
Michael Piontek
Alexander W. Strasser
Ulrike Weydemann
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Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF

Definitions

  • G-CSF Gramulocyte Coiony Stimulating Factor
  • the invention relates to a growth factor with granulocyte-stimulating activity and a nucleic acid molecule which comprises a sequence coding for this growth factor. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the growth factor according to the invention, pharmaceutical compositions comprising the proteins or nucleic acids according to the invention, and their therapeutic use.
  • Cytokines are involved in the maturation of blood cells by stimulating the maturation of stem cells into fully differentiated blood cells.
  • G-CSF Gramulocyte Coiony Stimulating Factor
  • the protein occurs in two different natural forms with a size of 177 and 174 amino acids (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986). Both proteins are the result of expression of a single gene.
  • the gene contains five exons and four intron sequences. At the 5 'end of the second intron there are two splice donor sequences 9 bp apart that allow alternative splicing.
  • the two natural forms of protein are produced by translation of the mRNAs resulting from this alternative splicing of the primary transcript.
  • the longer form differs from the shorter one by inserting 3 amino acids (Val-Ser-Glu) between positions 35 and 36. Both forms result from a precursor that is 30 amino acids longer.
  • the relative mass of the shorter form was determined to be 18.671 Da (Nagata et al., 1986). It is described as the main synthetic product, which is 20 times more active in certain biological tests than the longer by-product (Nagata, 1989).
  • the natural protein contains two disulfide bridges between the amino acid pairs Cys36 and Cys42 as well as Cys64 and Cys74.
  • the natural G-CSF contains an O-glycosylation at Thr133. It is not known that biological activity is influenced by altering N-terminal sequences of the cytokine. According to Kuga et al. retain G-CSF molecules truncated by up to 11 amino acid residues full biological activity, whereas, for example, C-terminal shortenings of the basic sequence reduce or vary the activity (Kuga et al., 1989).
  • G-CSF is able to substantially increase the population of neutrophil granulocytes in a short time in vivo and ex vivo.
  • the protein is therefore a substance with a wide range of therapeutic application options. So G-CSF can be used in cancer treatment if the cells of the immune system z. B. have been destroyed by chemotherapy.
  • G-CSF can be used in bone marrow transplantation, for severe burns, for leukemia or for opportunistic infections due to immune deficiencies (US Pat. No. 5,399,345).
  • G-CSF is also used to mobilize blood stem cells from the bone marrow or other stem cell reservoir into the peripheral blood. With G-CSF, cells of the myeloid cell series can be expanded ex vivo for clinical use.
  • variants of this growth factor which are characterized by a higher or lower biological activity than the natural G-CSF growth factor, so that, depending on the intended use, a variant of the G- CSF growth factor with appropriate activity can be used.
  • the term "variant" or "G-CSF variant” is intended to include amino acid and nucleic acid molecules which have at least one internal addition, substitution, deletion, insertion, inversion and / or a C-terminal deletion with respect to the respective original sequence, e.g. of the human sequence, with a maximum of 5 amino acid residues being changed compared to the original sequence. It also includes variants that differ from naturally occurring G-CSF molecules in their glycosylation.
  • each of these variants should have a higher or lower biological activity than the natural G-CSF growth factor.
  • this object is achieved by a recombinant growth factor which combines a mammalian G-CSF or a homologous protein with the biological one
  • homologous proteins are understood to mean those proteins which have a homology of at least 60% to one of the amino acid sequences shown in SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4. In preferred embodiments, the homology is 70 or 80%, particularly preferred 90 or 95%, most preferred is 98 or 99% homology.
  • homology means homology at the protein level which, according to known methods, for example computer-aided sequence comparisons (Basic local alignment search tool, SF Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) can be determined.
  • homoology known to those skilled in the art refers to the degree of relationship between two or more polypeptides, which is determined by the agreement between the sequences. The percentage of “homology” results from the percentage of identical regions in two or more sequences taking into account gaps or other sequence peculiarities.
  • the homology of related polypeptides can be determined using known methods. As a rule, special computer programs with algorithms that take account of the special requirements are used.
  • GCG program package including GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)).
  • the BLASTX program can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and from other sources (BLAST Handbook, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al
  • Preferred parameters for amino acid sequence comparison include the following:
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the above parameters are the error parameters (default parameters for amino acid sequence comparisons, gaps at the ends not reducing the homology W. In the case of very short sequences compared to the reference sequence, it may still be necessary to reduce the expected value to 100,000 (expected value ) z and if necessary reduce the word length to up to 2.
  • gap opening penalties can be used. The selection will depend on the comparison to be carried out and also on whether the comparison is carried out between sequence pairs, G or Best Fit being preferred, or between a sequence and an extensive sequence database, with FASTA or BLAST being preferred. A 60% match determined with the above algorithm is us
  • the growth factor described in the present invention has an N-terminus shortened by two amino acids compared to the natural G-CSF protein and, completely unexpectedly, has a significantly higher biological activity than the natural G-CSF growth factor.
  • biological activity refers to the ability to stimulate the proliferation of blood stem cells (Kuga et al., 1989). These can be expanded and differentiated into granulocytes by stimulation with G-CSF and other factors This differentiation correlates with the synthesis of the CD34 protein located on the cell surface of myeloid progenitor cells, which is why the detection of the CD34 protein is suitable as a measure of the ability of the stimulated cells to proliferate.
  • the growth factor according to the invention is a mature human growth factor shortened by the first two N-terminal amino acids.
  • the natural human G-CSF growth factor comprises two slightly different amino acid sequences. This difference has also been observed for the N-terminal shortened embodiment according to the invention.
  • the shorter amino acid sequence of the growth factor according to the invention has 172 amino acids in its mature form, the longer form contains an insertion of three amino acids between positions 33 and 34. The numbering is based on the amino acid +3 of the mature protein as the new amino acid +1.
  • Both molecules, both the 172 and the 175 amino acid molecule have an identical N-terminus with the N-terminal sequence Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser, in contrast to the N-terminus of the natural sequence, the Is Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser.
  • the amino acid sequence can be changed further compared to the natural proteins, for example contain an N-terminal methionine; According to the invention, however, the two amino acids Thr / Pro are always missing at the N-terminus.
  • the recombinant growth factor according to the invention contains an N-terminal methionine.
  • specific proteases can split off the N-terminal methionine, which is produced by translation of the initiation codon, in all or part of the expressed molecules.
  • a mature protein can be obtained which contains an N-terminal methionine even after the N-terminus has been processed.
  • the recombinant growth factor comprises the SEQ ID NO: 1 (174 (-2AS) variant "), SEQ ID NO: 2 (" 177 (-2AS) variant "), SEQ ID NO: 3 (" Met -174 (-2 AS) variant ") or SEQ ID NO: 4 (" Met-177 (- 2 AS) variant ") amino acid sequence shown or a sequence derived therefrom.
  • the derived sequence differs from one of the sequences shown in SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4 by deletion, insertion, addition and / or amino acid exchange in one or more positions.
  • the derived sequence differs in 1 to 5 amino acid residues from one of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 by one of the mutations mentioned; It is extremely preferred if a derived sequence differs from one of the above sequences in only one amino acid residue.
  • the protein is preferably shortened at the C terminus.
  • the numbering of the amino acids used in the following refers to the sequence shown in SEQ ID NO; 1 and consequently differs by 2 amino acid positions from the known natural sequence of the human G-CSF.
  • the splice variant (see SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 1, which is longer by 3 amino acids, is always included in the invention without the position of the respective amino acid residue or region in the sequence for the Splice variant is explicitly mentioned again.
  • the recombinant growth factor according to the invention are growth factors in which one or more of the histidine residues at positions 41, 77, 154 and 168 are replaced by another natural amino acid, preferably glutamine (gin).
  • the recombinant growth factor according to the invention can likewise carry one or more mutations in the region of amino acids 48 to 54. As already shown in US Patent 5,399,345, mutations in these amino acid residues reduce the activity of the resulting protein.
  • the combinations of the activity-increasing mutations directly at the N-terminus and the activity-reducing mutations in the positions indicated above lead to numerous variants of the G-CSF growth factor with a large number of different biological activities.
  • the recombinant growth factor according to the invention is modified post-translationally.
  • a post-translational modification particularly preferably comprises the elimination of an N-terminal methionine and / or the glycosylation of the growth factor and other possible other modifications.
  • Hansenula-specific glycosylation patterns are preferred.
  • Hansenula-specific glycosylation involves the transfer of one or two hexose residues to the G-CSF polypeptide. The hexose mannose is particularly preferred.
  • the invention provides a composition with G-CSF activity, which can be obtained, for example, by recombinant expression of G-CSF in a Hansenula polymorpha strain and subsequent purification of the G-CSF activity.
  • G-CSF The protein referred to below as G-CSF ( ⁇ O) means G-CSF, which has the naturally occurring NH 2 terminus.
  • composition according to the invention comprises:
  • the G-CSF variant is a glycosylation variant on which the human G-CSF sequence is based (Nagata et al., 1986). It is further preferred that the hexose is mannose.
  • the invention provides the components of the composition described above in a purified form.
  • the invention thus provides G-CSF variants which are selected from the mono-hexose "177 (-2AS) variant", di-hexose "177 (-2AS) variant", mono-hexose-G -CSF ( ⁇ 0) and di-hexose-G-CSF ( ⁇ 0) comprehensive group.
  • G-CSF variants are also made available which differ from the respective original sequence, e.g. distinguish the sequence of human G-CSF, by addition, substitution, deletion, insertion, inversion and / or deletion of at least one and at most 15 amino acids. Hansenuja-specific glycosylated G-CSF molecules are preferred which have N-terminal deletions of one or more, at most 15 amino acids.
  • the individual G-CSF variants can be obtained by recombinant expression in an H. polymorpha strain. Furthermore, the individual variants can be obtained by chromatographic separation of the composition according to the invention, it being possible, for example, to carry out high-performance liquid chromatography using hydrophobic or reverse-phase surfaces in a manner known to those skilled in the art. Furthermore, specific antibodies can be used for immunoaffinity chromatography to separate the G-CSF variants.
  • composition of the invention with G-CSF activity can be obtained by a process comprising the following steps:
  • the culture supernatant containing G-CSF variants can be separated off when the expression product is secreted into the supernatant, for example by centrifugation. If the expression product remains intracellular, the expressed G-CSF variants can be obtained by cell lysis with the aid of ionic or non-ionic detergents or using cell disruption methods such as French press or cell homogenizers.
  • the expressed G-CSF variants present in the culture supernatant or in the cell lysate can be purified by all methods known to the person skilled in the art, with chromatographic methods being preferred.
  • the purification of the expressed G-CSF variants preferably comprises the steps:
  • the filtration can be carried out using commercially available filters, with sterile filtration through 0.22 ⁇ m filters being preferred in order to avoid clogging of the chromium to avoid topography columns. Sufficient to precipitate G-CSF variants
  • the amount of ammonium sulfate is in the range of 400 g / l ammonium sulfate.
  • the ammonium sulfate is preferably added at 4 ° C with stirring.
  • the gel filtration chromatography step is preferably carried out on a Sephacryl-S 300 HR column from Amersham Pharmacia Biotech, although all gel filtration materials can be used, provided they give the desired separation performance. Gel filtration is preferably carried out in the physiological pH range using PBS buffer.
  • fractions can be determined, for example, by Western blot analysis for their content of G-CSF variants with the aid of G-CSF-specific antibodies.
  • the necessary test conditions are state of the art or may require routine adjustments.
  • the method of providing the composition of the invention may further comprise using cation exchange, high performance liquid and / or immunoaffinity chromatography.
  • the G-CSF variant is a human G-CSF variant.
  • Suitable vectors, host cells and transformation methods are known to the person skilled in the art and are described in detail in a section below.
  • the Hansenula polymorpha strain is preferably the Hansenula polymorpha strain RB11.
  • the expression vector used is preferably the vector pFPMTaG-CSF.
  • the present invention further encompasses nucleic acid molecules which code for a recombinant growth factor G-CSF as described above.
  • a nucleic acid molecule comprises nucleic acid sequences which code for a protein with one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 and in particular includes one of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, and nucleic acid sequences which are derived from one of these nucleic acid sequences by degeneration of the genetic code, by deletion, insertion, addition and / or nucleic acid exchange and which code for a protein with the biological activity of a G-CSF.
  • nucleic acid sequences are included, which can hybridize with a sequence complementary to the sequences listed above.
  • These variants of the nucleic acid molecules which code for a growth factor according to the invention are said to be under conditions of moderate stringency, but preferably in non-stringent conditions (see Maniatis et al., 1989) with one of those in SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8 sequences can complementary sequence hybridize.
  • Moderate stringency means, for example, hybridization at 42 ° C in 50% formamide and subsequent less stringent washing steps, the washing steps being carried out at a temperature of less than 12 ° C to 20 ° C below the calculated T m of the hybrid molecule to be investigated .
  • Strict conditions mean hybridization in 5 x SSC at 65 ° C.
  • the invention furthermore relates to any sequence which is complementary to the abovementioned sequences and whose opposite strand codes for a protein with the biological activity of a G-CSF.
  • the nucleic acid molecule described above also codes for a functional leader sequence.
  • Secretory proteins are processed from a precursor which contains an N-terminal leader sequence for the import of a translation product into the secretory apparatus.
  • leader sequences can consist of pre-sequences or pre-pro sequences.
  • Pre-sequences direct a translation product into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) and are proteolytically removed when entering the ER.
  • ER endoplasmic reticulum
  • the protein is matured in two stages. After entering the ER, the pre-sequence is removed as in the first type.
  • the remaining pro protein undergoes an additional proteolytic maturation in the cell's Golgi apparatus, in which the remaining pro sequence is cleaved using a dibasic endopeptidase. With the help of leader sequences that correspond to these two basic types, heterologous proteins can be secreted from host cells.
  • a particularly preferred nucleic acid molecule of this invention contains, as a functional leader sequence, the leader sequence of the hyperglycemic crustacean hormone (CHH) from Carcinus maenas or a derivative thereof.
  • CHH hyperglycemic crustacean hormone
  • the nucleic acid molecule according to the invention contains the leader sequence of the yeast mating factor a (MFa1) as the leader sequence.
  • MFa1 yeast mating factor a
  • a construction established for expression in yeast host cells codes for a fusion protein which contains the prepro sequence of the pheromone MFa1 (Brake et al., 1984). Amino acids in the vicinity of the newly created fusion site can influence the position of the processing site and thus the N-terminal sequence of the mature protein produced by proteolysis. Of particular importance here is the presence of pro residues (Zurek et al., 1996).
  • Another particularly preferred nucleic acid molecule of this invention is characterized in that it comprises the natural MFa1 sequence in functional connection with the natural sequence coding for the growth factor G-CSF, including the codons for the two N-terminal amino acids of G-CSF.
  • the use of the natural MF 1 sequence produces a primary translation product which, due to its amino acid sequence in the region of the fusion site between the MF ⁇ -1 leader sequence and the sequence coding for the recombinant growth factor, does not contain a protease between amino acid +2 and +3 shortened amino acid sequence of the growth factor is cleaved.
  • the processing of the translation product accordingly leads to a shortening of the N-terminus by two amino acids.
  • the advantage of using a suitable secretion leader in addition to introducing the translation product into the secretory apparatus, is to generate a defined N-terminus in the selected organism.
  • Such a preferred nucleic acid molecule codes, for example, for the amino acid sequence shown here in NR: 1 or SEQ ID NO: 2. In further embodiments, it comprises the one in SEQ ID NO: 9 ("natural leader + 174 x 3 variant (incl. 6 nu)") or SEQ ID NO: 10 ("natural leader + 177 x 3 variant (incl. 6 nu)”)
  • Such a nucleic acid molecule can furthermore contain a sequence which can hybridize with a sequence which is complementary to the nucleic acid sequences listed above or which is complementary to one of the sequences mentioned above.
  • the nucleic acid molecule according to the invention contains an MFa1 sequence modified in the 3 ′ region and furthermore the sequence coding for the growth factor G-CSF, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 or a sequence derived therefrom is preferred.
  • the amino acid sequence of the MFa1 leader in the vicinity of the processing site must be changed. Changes of this kind are described in previous MFa1 / G-CSF fusions (e.g. U.S. Patent 5,055,555).
  • the use of the unchanged MFa1 leader sequence as described above leads to proteolytic cleavage between amino acids +2 and +3 of the sequence of the fully mature protein, i.e. before position +1 of a protein according to the invention.
  • the present invention comprises a vector which comprises a nucleic acid molecule or a fragment thereof as described above and a promoter functionally linked thereto and a termination signal functionally linked to the nucleic acid.
  • such a vector contains a promoter and a termination signal, each of which is specific for an intended host cell. Specifically, this means that the promoter and the termination signal originate from the host organism used for the expression.
  • An exemplary expression vector for yeast such as that used in the present invention, comprises an expression cassette with the following functional elements in the order given: FMD promoter - heterologous coding sequence
  • such a vector contains selection sequences and a HARS (Hansenula autonomously replicating sequence) for propagation and selection in a suitable yeast host, a bacterial origin of replication and a selection gene suitable for a bacterium for propagation and selection, for example in an E. coli host (Gellissen and Hollenberg, 1997; Hollenberg and Gellissen, 1997).
  • HARS Hazanula autonomously replicating sequence
  • An expression vector for the production of G-CSF according to the invention was produced using generally known methods and processes, for example as described in the continuously updated protocols on molecular biology (Ausübet et al., 1987).
  • a gene sequence coding for the amino acid sequence of the mature G-CSF was synthesized on the basis of the published cDNA sequence (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986) and linked to a suitable DNA Fragment fused with the coding sequence for the pre-pro sequence of the yeast pheromone MFa1.
  • an element with an unchanged amino acid sequence was deliberately used (Brake et al., 1984). The use of such an element results in a processing between position +2 and +3 and thus in the N-terminal shortening of the G-CSF sequence by two amino acids (see example 5).
  • the fused DNA sequence was integrated as an EcoRI / BamHI fragment in the Hansenula polvmorpha expression vector pFPMT121.
  • an FMD promoter element is used to control foreign gene expression.
  • the vector pFPMT121 and derived variants have been described in various publications (including Gellissen and Hollenberg, 1997).
  • the DNA sequences for the generated MFa1 / G-CSF fusion and the generated expression vector for the production of G-CSF in Hansenula polvmorpha are shown in Figures 1 and 2 (Fig. 1 shows the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO. 9 in FIG Connection with the initiation codon "ATG" and the corresponding amino acid sequence).
  • the vector described above is an RNA vector. In this way, different virus vectors containing a nucleic acid according to the invention can be used for the transfection of mammalian cells. However, DNA vectors are also included
  • the present invention further encompasses host cells containing one of the vectors described above.
  • the host cell is a prokaryotic host cell. It is particularly preferred that it is a host cell of the genus Escherichia or Bacillus. Such a host cell is e.g. E.coli or B. subtilis.
  • the host cell is a eukaryotic host cell.
  • the host cell is preferably a mammalian cell, e.g. CHO, HeLa, WISH, COS or NIH cells, a plant cell, a yeast cell or fungal cell.
  • yeast types offer various advantages for industrial applications. They are able to efficiently secrete recombinant products and to process and modify them in accordance with a general eukaryotic pattern.
  • a host cell which is a methylothrophic yeast cell is particularly preferred.
  • the methylotrophic yeast Hansenula polvmorpha was developed as an expression system for heterologous proteins (Roggenkamp et al., 1986; EP 0173378), whereby this organism is particularly suitable for the manufacture of pharmaceutical products (Gellissen and Melber, 1996).
  • the components of the expression system are the subject of various publications and patent applications.
  • the use of the FMD promoter (formate dehydrogenase promoter) as a control element for heterologous gene expression is laid down in EP 0299108.
  • a plasmid with such a control element serves as an expression vector for the production of G-CSF.
  • this species is able to use methanol as the only source of energy and carbon; other possible carbon sources are glycerin and glucose.
  • methanol is added to the yeast genome.
  • glycerin is a source of energy and carbon
  • glucose is a possible carbon source.
  • key enzymes of the methanol metabolism are produced in high concentrations. Production control takes place at the transcriptional level. Different elements can be used to enable the secretion of a heterologous product.
  • a translation product can be obtained which, after being introduced into the secretory apparatus, is secreted in a processed form into the cell medium (Brake et al, 1984).
  • Methylotrophic yeast cells preferred as host cells are selected from Hansenuia, Candida, Pichia and Torulopis.
  • the term "Hansenula” should be understood to include all species that share the same or a similar taxonomic classification with a methylotrophic Hansenula yeast. This includes the organisms Hansenula polvmorpha, Hansenula capsulata, Hansenula saturnus and Hansenula winqei one without being limited to them.
  • Further preferred host cells that are not counted among the methylothrophic yeasts are selected from Saccharomyces cerevisiae, Kluvveromvces lactis, Schizosaccharomvces pombe, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis and Arxula ade novorans. Insect cells are also best suited for the expression of said G-CSF molecules. Filamentous Piiz cells are also preferred host cells, with Asper ⁇ illus niqer, Asperqillus oryzae, Neurospora crassa, Acremonium chrvsogenum and Sordaria macrospora being particularly preferred.
  • the invention further relates to a method for producing a recombinant growth factor G-CSF, which is characterized in that a host cell according to the invention is cultivated as described above under suitable conditions and the growth factor G-CSF is obtained either from the medium or from the cell .
  • a host cell according to the invention is cultivated as described above under suitable conditions and the growth factor G-CSF is obtained either from the medium or from the cell .
  • the person skilled in the art is familiar with the methods suitable for this purpose, which serve for cell disruption and purification.
  • the recombinant growth factor G-CSF is used to mobilize peripheral blood stem cells. Under “Mobilization of peripheral blood stem lines "to understand an increase in the blood precursor line level in the peripheral blood.
  • the recombinant growth factor G-CSF is used according to the invention to promote the proliferation of blood stem cells and / or progenitor cells.
  • the use of the recombinant growth factor G-CSF for treating cancer, leukemia, severe burns, opportunistic infections and after bone marrow transplantation is included in the present invention.
  • the nucleic acid molecule described above which codes for a growth factor according to the invention or a vector described above, which contains such a nucleic acid molecule, is used for in vitro transfection of blood stem cells and / or progenitor cells.
  • such a nucleic acid molecule is also used to treat cancer, leukemia, severe burns, opportunistic infections and after bone marrow transplants.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which comprises at least one recombinant growth factor G-CSF as described above and to a further pharmaceutical composition which contains at least one nucleic acid molecule or at least one of the vectors as described above.
  • Fig. 1 shows the gene sequence for the MF ⁇ 1 / G-CSF fusion and the amino acid sequence derived therefrom.
  • Figure 2 shows the expression vector for the production of G-CSF according to the present invention.
  • Fig. 3 shows a Southern blot of the genomic DNA of the recombinant strain Hansenula polvmorpha 27-1, which had been transformed with the vector pFPMTaG-CSF.
  • the DNA was cut with Xhol / HindIII, electrophoretically separated in defined dilutions, transferred to nitrocellulose and hybridized with a labeled FMD promoter probe.
  • the hybridization pattern consists of a signal at 1.2 Kb for the genuine sequence and a signal at 1.88 Kb for the heterologous fusion. Based on the signal strength, a copy number of 40 copies can be estimated.
  • Lane 1 size standard, lane 2 plasmid DNA, lane 3 non-transformed starting strain RB11, lanes 4-7 strain 27-1 (dilutions 1:40; 1:20, 1:10 and undiluted).
  • Fig. 4 shows the SDS electrophoretic characterization (15% gels). The two strongly stained bands were identified immunologically as G-CSF molecules. Both proteins have an identical N-terminus.
  • Fig. 5 shows the expression of CD34 on the surface of umbilical cord blood cells after stimulation with different G-CSF isolates.
  • Fig. 6 shows the expression of CD34 on the surface of blood cells of a myeloma patient after stimulation with different G-CSF isolates.
  • Fig. 7 shows the mass spectrometric analysis of the G-CSF variants obtained by recombinant expression in H. polymorpha. The relative signal intensity is shown on the ordinate and the molecular weight in daltons on the abscissa.
  • an H. polymorpha expression vector for the secretion of G-CSF A DNA fragment with the coding sequence for the mature G-CSF was synthesized in accordance with the published sequence (Fig. 1, nucleotide 256 ff). An EcoRI / HindIII fragment with the coding sequence for the MFa1 leader sequence was ligated together with the G-CSF fragment into an M13mp18 vector opened with EcoRI / BamHI. The newly created ligated fragment contains an MFa1 leader / G-SCF fusion as an EcoRI / BamHI fragment. The fusion site between leader and mature G-CSF was changed by mutagenesis in such a way that the original leader sequence including the Lys-Arg processing site was reconstituted.
  • the sequence of the mature G-CSF without N-terminal methionine follows this processing site.
  • the mutagenized fusion sequence was inserted as an EcoRI / BamHI fragment in the Hansenula polymorpha expression vector pFPMT121 opened with these restriction enzymes.
  • the inserted sequence for MFa1 / G-CSF is shown in Fig. 1 and the resulting expression vector pFPMTaG-CSF is shown in Fig. 2.
  • Competent cells of this strain were produced according to established methods (Dohmen et al., 1991 : Yeast 7: 691): 10 ml yeast medium (YPD; Mixture of yeast extract, peptone and glucose) were inoculated with cells and cultivated overnight at 37 ° C. This culture was then used to inoculate 200 ml of the medium described. The cells were cultivated to a cell density of 0.6 to 1 at OD 600 .
  • the cells were sedimented by centrifugation, washed at room temperature with 100 ml of solution A (1 M sorbitol, 10 mM bicine pH 8.35, 3% (w / v) ethylene glycol) and resuspended in 4 ml of this solution. 11 ul dimethyl sulfoxide (DMSO) was added and the competent cells were divided into 200 ul aliquots. They were either used immediately or stored at -70 ° C until use.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Colonies from the transformation smears were used to inoculate 3 ml of YNB glucose and cultured at 37 ° C. A 50 ⁇ l aliquot of the adult culture was used to inoculate another 3 ml of YNB. This process was repeated for about 60 growth generations. During this passage, the plasmid DNA was integrated into the yeast genome. Then 3 ml of the non-selective medium (YPD) were inoculated and incubated at 37 ° C.
  • YPD non-selective medium
  • Recombinant, G-CSF-producing yeast strains of the Hansenula polvmorpha type were produced by the method described in Example 2 Transformation of the host strain RB11 with the plasmid pFPMTaG-CSF described in Example 1. Mitotically stable strains were generated as described by passengers in a selective medium. The transformants generated were cultivated on a 3 ml scale for comparison. The cultivation was carried out in a medium to which glycerol had been added in a concentration of 1.5% (w / v). The consumption of the glycerin by the growing culture resulted in conditions of derepression for the promoter. Under these conditions, the expression of the foreign gene under the control of the FMD promoter can be detected after two to three days.
  • the cells were centrifuged in this medium at 37 ° C. and the supernatant was examined for the presence of G-CSF.
  • the detection was carried out by a direct ELISA using a commercially available anti-G-CSF serum from goat blood.
  • the ELISA was carried out in polystyrene microtiter plates (F96 Maxisorp, Nunc-Immuno Plate) using established methods.
  • the detection was carried out via the peroxidase activity bound to a biotinylated second antibody in the course of the detection steps.
  • the enzyme catalyzes a green color development, which can be measured photometrically at 405 nm.
  • the quantification was carried out by comparison with calibrated G-CSF quantity standards. This comparative quantitative detection of the G-CSF in the culture supernatants enabled candidates with above-average production properties to be identified.
  • the copy number of the integrated heterologous DNA was determined by Southern blot hybridization.
  • the genomic DNA of selected yeast strains was cut with the restriction enzymes BamHI and Xhol, transferred to nitrocellulose filters after electrophoretic separation and hybridized with a labeled FMD promoter probe.
  • the selection of the restriction enzymes and the determination of the hybridization probe in the stated manner results in two hybridization signals for the genuine FMD gene and the heterologous fusion.
  • the copy number of the recombinant DNA can be determined by comparing the signal strengths of these two signals.
  • the number of copies of the two exemplary strains with serial numbers 12-3 and 27-1 was determined to be 40 in each case (see Fig. 3).
  • the G-CSF-secreting Hansenula strains were cultivated using the 21 batch method in a synthetic medium, supplemented with glycerol as a carbon source. The fermentation took place at pH 5.5-3.2.
  • the secreted G-CSF was isolated using the following purification steps.
  • the fermentation supernatant was obtained by centrifugation of the suspension and subsequent sterile filtration. This was followed by concentration and desalting by cross-flow filtration using a 10 kDa polyethersulfone membrane at 4-8 ° C.
  • the material thus obtained was diluted 1: 1 with a buffer A (20 mM HOAc / KOH pH 5.2, 0.5 mM EDTA, 02% (w / v) Tween 20), adjusted to pH 5.2 with KOH and placed on a cation exchanger equilibrated with this buffer (Merck Fractogel EMD-SO 3 " 650 M; 1 x 7 cm).
  • the amount of protein applied was 4.5 mg according to Bradford, the conductivity was 2.1 mS / cm.
  • the elution of the bound protein material was carried out using a salt gradient with a 10% to 100% proportion of a buffer B (buffer B corresponds to buffer A with 0.5 M NaCl)
  • Buffer B corresponds to buffer A with 0.5 M NaCl
  • the product fractions were concentrated using a 10 kDa filter and eluted by gel filtration chromatography on a Sephadex G 75 matrix.
  • the G-CSF was in the exclusion volume under these conditions.
  • the recombinant product was in a CD34 synthesis test according to Sutherland et al. (Sutherland et al., 1994) were tested for their biological activity by flow cytometry in precursor cell preparations in comparison with a G-CSF isolate (filgrastim) produced in bacteria.
  • Cells from progenitor cell preparations potentially intended for autologous or allogeneic bone marrow transplantation served as test cells.
  • Example 3 The strains identified in Example 3 were fermented on a 2 liter scale using the method already described and the secreted product was characterized using various methods.
  • the apparent relative mass was determined by SDS-PAGE according to Shuger and Jagow to be 19.5 kDa.
  • SDS-PAGE according to Laemmli two monomeric forms of 18 and 20 kDa appeared, as well as multimeric forms (see Fig. 4).
  • the 18 kDa form formed a band at the same level as G-SCF from E. coli.
  • the secreted product is not in monomeric, but in multimeric form. It was possible to determine by exclusion chromatography that the relative mass of the native product is greater than 75 kDa. The larger product is not N-glycosylated. O-glycosylation could not be detected by PAS staining (periodic acid Schiff reagent staining) of SDS polyacrylamide gels or by glycoblotting.
  • Example 3 The strains identified in Example 3 were fermented on a 1.5 liter scale using the process already described and the secreted G-CSF was isolated using the subsequent purification steps.
  • the fermentation supernatant was obtained by centrifuging the suspension at 4 ° C. for 20 minutes at 10,000 rpm and subsequent sterile filtration using 0.22 ⁇ m filters.
  • a fractional precipitation was then carried out by adding ammonium sulfate, the relevant fraction being obtained at a concentration of 400 g / l ammonium sulfate.
  • the ammonium sulfate precipitate which corresponded to one liter of culture supernatant, was dissolved in 50 ml of 10 mM Tris-HCl buffer; pH 7.5 resuspended.
  • the solution containing hG-CSF was applied to a gel filtration column Sephacryl S 300 HR (Amersham Pharmacia Biotech) and 0.5 ⁇ PBS buffer as elution buffer; pH 7.5 used. 16 fractions in the range from 2.5 to 11 ml were obtained. Fractions 6 to 9 were pooled and showed in the Western Blot analysis sends a strong positive signal. According to the Bradford determination, the pool had a concentration of 0.115 mg protein / ml.
  • Table 1 shows the assignment of the molecular weights found (MG (found)) to the G-CSF variants occurring in the sample, the expected molecular weight (MG (target)) and the deviation with respect to the molecular weight ( ⁇ Dalton) being also given are.
  • the sample represents a composition containing different G-CSF variants, the dominant forms: mono-hexose "177 (-2AS) variant", non-glycosylated G-CSF, di-hexose " 177 (- 2AS) variant ", mono-hexose-G-CSF and di-hexose-G-CSF.
  • the composition (the percentages given below are mass percentages (w / w)):

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Abstract

Die Erfindung stellt Wachstumsfaktoren mit Granulozyten Kolonie-stimulierender Aktivität sowie Nukleinsäuremoleküle, die eine für diesen Wachstumsfaktor kodierende Sequenz umfassen, zur Verfügung. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemässen Wachstumsfaktors, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemässen Proteine oder Nukleinsäuren umfassen, und ihre therapeutische Verwendung. Die Wachstumsfaktoren besitzen Cytokinwirkung in unterschiedlicher Ausprägung und sind in der Lage, die Reifung von Blutzellen zu stimulieren. Daher ist vorgesehen, die erfindungsgemässen Moleküle insbesondere zum Behandeln von Krankheiten und Verletzungen einzusetzen, die mit einem Mangel an Blutzellen in Zusammenhang stehen, wie z.B. Krebs, Leukämie, schwere Verbrennungen, opportunistische Infektionen und nach Knochenmarktransplantationen.

Description

Rekombinanter Wachstumsfaktor mit der biologischen Aktivität eines G-CSF (Granulocyte Coiony Stimulating Factor)
Die Erfindung betrifft einen Wachstumsfaktor mit Granulozyten Ke'onie- stimulierender Aktivität sowie ein Nukleinsäuremolekül, das eine für diesen Wachs- tumsfaktor kodierende Sequenz umfaßt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Proteine oder Nukleinsäuren umfassen, und ihre therapeutische Verwendung.
Cytokine sind an der Reifung von Blutzellen beteiligt, indem sie die Reifung von Stammzelien zu voll differenzierten Blutzellen stimulieren. Einer dieser Faktoren, der G-CSF (Granulocyte Coiony Stimulating Factor) wird in aktivierten Monozyten, Ma- krophagen und anderen Zellinien synthetisiert. Das Protein tritt in zwei verschiedenen natürlichen Formen mit einer Größe von 177 und 174 Aminosäuren auf (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986). Beide Proteine sind das Resultat der Expression eines einzigen Gens. Das Gen enthält fünf Exons und vier Intronsequenzen. Am 5'- Ende des zweiten Introns befinden sich zwei 9 Bp voneinander entfernte Spleiß- Donorsequenzen, die ein alternatives Spleißen ermöglichen. Die beiden natürlichen Proteinformen werden durch Translation der durch dieses alternative Spleißen des Primärtranskriptes entstandenen mRNAs erzeugt. Die längere Form unterscheidet sich von der kürzeren durch Einschub von 3 Aminosäuren (Val-Ser-Glu) zwischen den Positionen 35 und 36. Beide Formen entstehen aus einer um 30 Aminosäuren längeren Vorstufe. Die relative Masse der kürzeren Form wurde mit 18,671 Da bestimmt (Nagata et al., 1986). Sie wird als Hauptsyntheseprodukt beschrieben, das eine zwanzigfach höhere Aktivität in bestimmten biologischen Tests aufweist als das längere Nebenprodukt (Nagata, 1989).
Das natürliche Protein enthält zwei Disulfidbrücken zwischen den Aminosäurepaaren Cys36 und Cys42 sowie Cys64 und Cys74. Der natürliche G-CSF enthält eine O- Glykosylierung an Thr133. Eine Beeinflussung der biologischen Aktivität durch Veränderung N-terminaler Sequenzen des Cytokins ist nicht bekannt. Nach Kuga et al. behalten N-terminal um bis zu 11 Aminosäurereste verkürzte G-CSF Moleküle die volle biologische Aktivität, wohingegen z.B. C-terminale Verkürzungen der Grundsequenz die Aktivität herabsetzen bzw. variieren (Kuga et al.,1989).
G-CSF ist in der Lage, die Population neutrophiler Granulozyten in kurzer Zeit in vivo und ex vivo substantiell zu vergrößern. Das Protein ist daher eine Substanz mit vielfältigen therapeutischen Applikationsmöglichkeiten. So kann G-CSF in der Krebsbehandlung eingesetzt werden, wenn die Zellen des Immunsystems z. B. durch eine Chemotherapie zerstört wurden. Darüber hinaus kann G-CSF in der Knochenmarktransplantation, bei schwerwiegenden Verbrennungen, bei Leukämie oder bei opportunistischen Infektionen aufgrund von Immundefizienzen eingesetzt werden (US- Patent 5,399,345). Zudem wird G-CSF zur Mobilisierung von Blutstammzellen aus dem Knochenmark oder einem anderen Stammzellreservoir in das periphere Blut eingesetzt. Mit G-CSF können Zellen der myeloischen Zellreihe zum klinischen Einsatz ex vivo expandiert werden.
Aufgrund der Vielzahl an verschiedenen Anwendungsgebieten für den Wachstumsfaktor G-CSF besteht daher ein Bedürfnis nach Varianten dieses Wachstumsfaktors, die sich durch eine höhere oder geringere biologische Aktivität als der natürliche G- CSF Wachstumsfaktor auszeichnen, so daß je nach angestrebter Verwendung eine Variante des G-CSF Wachstumsfaktors mit geeigneter Aktivität eingesetzt werden kann. Der Terminus „Variante" bzw. „G-CSF-Variante" soll dabei Aminosäure- und Nukleinsäuremoleküle umfassen, die wenigstens eine interne Addition, Substitution, Deletion, Insertion, Inversion und/oder eine C-terminale Deletion gegenüber der jeweiligen ursprünglichen Sequenz, z.B. der Humansequenz, aufweisen, wobei höchstens 5 Aminosäurereste gegenüber der ursprünglichen Sequenz verändert sind. Er umfaßt femer Varianten, die sich von natürlicherweise vorkommenden G-CSF- Molekülen durch ihre Glykosylierung unterscheiden.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, rekombinante Varianten eines Proteins mit der Aktivität des G-CSF Wachstumsfaktors zur Verfügung zu stellen, wobei jede dieser Varianten eine höhere oder geringere biologische Aktivität aufweisen soll als der natürliche G-CSF Wachstumsfaktor. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch einen rekombinanten Wachstumsfaktor gelöst, der ein Säuger-G-CSF oder ein dazu homologes Protein mit der biologischen
Aktivität eines G-CSFs ist, und dem die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren des reifen G-CSF Proteins fehlen.
Unter „homologen Proteinen" sind solche Proteine zu verstehen, die eine Homologie von mindestens 60 % zu einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenzen besitzen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Homologie 70 oder 80 %, besonders bevorzugt 90 oder 95 %. Am stärksten bevorzugt ist eine Homologie von 98 oder 99 %.
Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck „Homologie" Homologie auf Protein-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403- 410) bestimmt werden kann.
Der dem Fachmann bekannte Ausdruck „Homologie" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehr Polypeptiden, der durch die Übereinstimmung z schen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der „Homologie" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksich gung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.
Die Homologie miteinander verwandter Polypeptide kann mit Hilfe bekannter Verfahre bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den besond ren Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das GCG Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al
Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus ka zur Bestimmung von Homologien verwendet werden.
Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen die nachste den:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48:443-453 (
Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 aus Henikoff und Henikoff, PNAS US
89(1992), 10915-10919
Lücken-Wert (Gap Penalty): 12
Lückenlängen-Wert:
(Gap Length Penalty): 4
Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity): 0
Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default paramete für Aminosäuresequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie-W nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenzsrequenz ka weiterhin notwendig sein, den Erwarungswert auf bis zu 100.000 (expected value) z höhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.
Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschlie der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genann können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei G oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen quenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird. Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 60 % wir
Rahmen dieser Anmeldung als 60 % Homologie bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere Homologiegrade.
Der in der vorliegenden Erfindung beschriebene Wachstumsfaktor weist einen gegenüber dem natürlichen G-CSF-Protein um zwei Aminosäuren verkürzten N- Terminus auf und besitzt vollkommen unerwartet eine deutlich höhere biologische Aktivität als der natürliche G-CSF-Wachstumsfaktor. Der Begriff „biologische Aktivität" des G-CSF Wachstumsfaktors bezieht sich dabei auf die Fähigkeit, die Proliferation von Blutstammzellen zu stimulieren (Kuga et al., 1989). Diese können durch die Stimulation mit G-CSF und anderen Faktoren zu Granulozyten expandiert und differenziert werden. Diese Differenzierung korreliert mit der Synthese des an der Zelloberfläche von myeloischen Vorläuferzellen lokalisierten CD34-Proteins. Daher eignet sich der Nachweis des CD34 Proteins als Maßstab für die Proliferationsfähig- keit der stimulierten Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Wachstumsfaktor ein reifer humaner, um die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren verkürzter Wachstumsfaktor.
Wie oben erwähnt, umfaßt der natürliche humane G-CSF Wachstumsfaktor zwei leicht unterschiedliche Aminosäuresequenzen. Dieser Unterschied ist für die erfindungsgemäße, N-terminal verkürzte Ausführungsform ebenfalls beobachtet worden. Dabei hat die kürzere Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors in ihrer reifen Form 172 Aminosäuren, die längere Form enthält eine Insertion von drei Aminosäuren zwischen den Positionen 33 und 34. Für die Numerierung wird dabei die Aminosäure +3 des reifen Proteins als neue Aminosäure +1 zugrundegelegt. Beide Moleküle, sowohl das 172 als auch das 175 Aminosäuren umfassende Molekül, weisen einen identischen N-Terminus mit der N-terminalen Sequenz Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser auf, im Gegensatz zum N-Terminus der natürlichen Sequenz, die Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser lautet. Die Aminosäuresequenz kann dabei im Vergleich zu den natürlichen Proteinen weiter verändert werden, z.B. ein N- terminales Methionin enthalten; erfindungsgemäß fehlen jedoch stets die beiden Aminosäuren Thr/Pro am N-Terminus. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor ein N-terminales Methionin. Abhängig vom ausgewählten Wirtsorganismus, in dem der Wachstumsfaktor exprimiert wird, können spezifische Proteasen das N-terminale Methionin, welches durch Translation des Initiationskodons entsteht, bei allen oder einem Teil der exprimierten Moleküle abspalten. Durch Einführung eines weiteren für Methionin kodierenden Codons in 3'- Position vom Initiationscodon kann jedoch ein reifes Protein erhalten werden, das auch nach der Prozessierung des N-Terminus ein N-terminales Methionin enthält.
Weiterhin umfaßt der rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungsform die in SEQ ID NR:1 (174 (-2AS) Variante"), SEQ ID NR: 2 („177 (-2AS) Variante"), SEQ ID NR:3 („Met-174 (-2 AS) Variante") oder SEQ ID NR:4 („Met-177 (- 2 AS) Variante") dargestellte Aminosäuresequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz. Die abgeleitete Sequenz unterscheidet sich durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch in einer oder mehreren Positionen von einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 gezeigten Sequenzen. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sich die abgeleitete Sequenz in 1 bis 5 Aminosäureresten von einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR: 4 gezeigten Sequenzen durch eine der erwähnten Mutationen unterscheidet; überaus bevorzugt ist es, wenn sich eine abgeleitete Sequenz in lediglich einem Aminosäurerest von einer der vorstehenden Sequenzen unterscheidet. Zur Modulation der Aktivität wird das Protein bevorzugt am C- Terminus verkürzt.
Die im folgenden verwendete Numerierung der Aminosäuren bezieht sich auf die in SEQ ID NR;1 dargestellte Sequenz und unterscheidet sich folglich um jeweils 2 Aminosäurepositionen von der bekannten natürlichen Sequenz des humanen G-CSFs. Dabei ist jedoch grundsätzlich immer auch die um 3 Aminosäuren längere Spleiß- Variante (siehe SEQ ID Nr. 2) von SEQ ID Nr. 1 von der Erfindung mit umfaßt, ohne daß die Position des jeweiligen Aminosäurerestes oder der jeweiligen Region in der Sequenz für die Spleiß-Variante explizit noch einmal erwähnt wird.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen rekombinanten Wachstumsfaktors sind Wachstumsfaktoren, in denen ein oder mehrere der Histidin- reste an den Positionen 41 , 77, 154 und 168 durch eine andere natürliche Aminosäure, bevorzugt Glutamin (Gin), ersetzt sind. Des weiteren kann der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein oder mehrere Mutationen im Bereich der Aminosäuren 48 bis 54 tragen. Wie bereits in US-Patent 5,399,345 gezeigt, reduzieren Mutationen in diesen Aminosäureresten die Aktivität des resultierenden Proteins. So führen die Kombinationen der aktivitätssteigemden Mutationen unmittelbar am N- Terminus und der aktivitätsreduzierenden Mutationen in den oben angegebenen Positionen zu zahlreiche Varianten des G-CSF Wachstumsfaktors mit einer Vielzahl an unterschiedlichen biologischen Aktivitäten.
Darüber hinaus ist der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungsform posttranslational modifiziert. Eine solche posttransla- tionale Modifikation umfaßt besonders bevorzugt die Abspaltung eines N-terminalen Methionins und/oder die Glykosylierung des Wachstumsfaktors und weitere möglich andere Modifikationen. Hansenula-spezifische Glykosylierungsmuster sind bevorzugt. Vorzugsweise umfaßt die Hansenula-spezifische Glykosylierung die Übertragung von ein oder zwei Hexose-Resten auf das G-CSF-Polypeptid. Besonders bevorzugt ist die Hexose Mannose.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung mit G-CSF-Aktivität bereit, die beispielsweise erhältlich ist durch rekombinante Expression von G-CSF in einem Hansenula-polymorpha-Stamm und nachfolgende Aufreinigung der G-CSF-Aktivität. Das im nachfolgenden mit G-CSF (ΔO) bezeichnete Protein bedeutet G-CSF, das den natürlicherweise vorkommenden NH2-Terminus aufweist.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt:
a) 10-30 % Mono-Hexose-"177(-2AS)-Variante"
b) 5- 5 % nicht-glykosyliertes G-CSF (Δ0) c) 10-30 % Di-Hexose-"177(-2AS)-Variante"
d) 20-40 % Mono-Hexose-G-CSF (Δ0) e) 10-30 % Di-Hexose-G-C3F (ΔO).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die G-CSF-Variante eine Glykosylierungs-Variante, der die humane G-CSF-Sequenz zugrundeliegt (Nagata et al., 1986). Weiterhin bevorzugt ist, daß die Hexose Mannose ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Bestandteile der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung in aufgereinigter Form bereit. Die Erfindung stellt somit G-CSF-Varianten zur Verfügung, die ausgewählt sind aus der Mono-Hexose-"177(-2AS)-Variante", Di-Hexose-"177(-2AS)-Variante", Mono- Hexose-G-CSF (Δ0) und Di-Hexose-G-CSF (Δ0) umfassenden Gruppe. Erfindungsgemäß werden weiterhin G-CSF-Varianten zur Verfügung gestellt, die sich von der jeweiligen ursprünglichen Sequenz, z.B. der Sequenz von humanem G-CSF, durch Addition, Substitution, Deletion, Insertion, Inversion und/oder Deletion von mindestens einer und höchstens 15 Aminosäuren unterscheiden. Bevorzugt sind Hansenu- ja-spezifisch glykosylierte G-CSF-Moleküle, die N-terminale Deletionen von einer oder mehreren, maximal 15 Aminosäuren aufweisen.
Die einzelnen G-CSF-Varianten können durch rekombinante Expression in einem H.- polymorpha-Stamm erhalten werden. Weiterhin können die einzelnen Varianten durch chromatographische Trennung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erhalten werden, wobei hier in dem Fachmann bekannter Weise beispielsweise Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von hydrophoben oder Umkehrphasen-Oberflächen durchgeführt werden kann. Weiterhin können zur Trennung der G-CSF-Varianten spezifische Antikörper im Rahmen einer Immunaffinität- schromatographie verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit G-CSF-Aktivität ist erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte:
a) Transformieren eines Hansenula-polymorpha-Stammes mit einem G-CSF- Expressionsvektor; b) Kultivieren der transformierten Zellen unter zur Expression von G-CSF geeigneten
Bedingungen;
c) Abtrennen des G-CSF-Varianten enthaltenden Kulturüberstandes von den Zellen oder Lysieren der G-CSF-Varianten enthaltenden Zellen; und
d) Aufreinigen der exprimierten G-CSF-Varianten.
Das Abtrennen des G-CSF-Varianten enthaltenden Kulturüberstandes bei Sekretion des Expressionsproduktes in den Überstand kann beispielsweise durch Zentrifugati- on erfolgen. Verbleibt das Expressionsprodukt intrazellulär, so können die exprimierten G-CSF-Varianten durch Zell-Lyse mit Hilfe von ionischen oder nicht-ionischen Detergenzien oder unter Verwendung von Zellzertrümmerungsverfahren, wie French-press oder Zellhomogenisatoren erhalten werden. Das Aufreinigen der im Kulturüberstand bzw. im Zellysat vorhandenen exprimierten G-CSF-Varianten kann durch sämtliche dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, wobei chromatographische Verfahren bevorzugt sind.
Bevorzugt umfaßt das Aufreinigen der exprimierten G-CSF-Varianten die Schritte:
a) Filtration des Kulturüberstandes oder Lysates;
b) Versetzen des Filtrates mit einer zur Fällung von G-CSF-Varianten ausreichenden Menge von Ammoniumsulfat;
c) Resuspendieren des Niederschlages;
d) Abtrennen der G-CSF-Varianten durch Gelfiltrationschromatographie; und
e) Sammeln und gegebenenfalls Vereinigen der die G-CSF-Varianten enthaltenden Fraktionen.
Die Filtration kann mittels kommerziell erhältlicher Filter durchgeführt werden, wobei die Sterilfiltration durch 0,22 μm Filter bevorzugt ist, um ein Verstopfen der Chroma- tographie-Säulen zu vermeiden. Die zur Fällung von G-CSF-Varianten ausreichende
Menge von Ammoniumsulfat liegt im Bereich von 400 g/l Ammoniumsuifat. Das Ammoniumsulfat wird vorzugsweise bei 4°C unter Rühren hinzugefügt. Der Gelfiltra- tionschromatographieschritt wird vorzugsweise auf einer Sephacryl-S 300 HR.Säule der Firma Amersham Pharmacia Biotech durchgeführt, wobei jedoch sämtliche Gelfü- trationsmaterialien verwendet werden können, sofern sie die gewünschte Trennleistung ergeben. Die Gelfiltration wird vorzugsweise im physiologischen pH-Bereich mit Hilfe von PBS-Puffer durchgeführt.
Die Fraktionen können beispielsweise durch Westem-Blot-Analyse auf ihren Gehalt an G-CSF-Varianten mit Hilfe von G-CSF-spezifischen Antikörpern bestimmt werden. Die notwendigen Versuchsbedingungen sind hierbei Stand der Technik bzw. erfordern allenfalls routinemäßige Anpassungen.
Das Verfahren zur Bereitstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann ferner die Verwendung von Kationenaustauscher-, Hochleistungsflüssigkeitsund/oder Immunaffinitätschromatographie umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die G-CSF-Variante eine humane G-CSF- Variante. Geeignete Vektoren, Wirtszellen und Transformationsverfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail in einem nachstehenden Abschnitt ausgeführt. Vorzugsweise ist der Hansenula-polymorpha-Stamm der Hansenula-polymorpha- Stamm RB11. Der verwendete Expressionvektor ist vorzugsweise der Vektor pFPMTaG-CSF.
Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für einen wie oben beschriebenen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF kodieren. Dabei umfaßt ein solches Nukleinsäuremolekül Nukleinsäuresequenzen, die für ein Protein mit einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:4 dargestellten Aminosäuresequenzen kodieren und schließt insbesondere eine der in SEQ ID NR: 5 bis SEQ ID NR: 8 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ein, sowie Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleinsäureaustausch von einer dieser Nukleinsäuresequenzen ableiten und für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSF kodieren. Des weite- ren sind ebenfalls Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die mit einer zu den oben aufgezählten Sequenzen komplementären Sequenz hybridisieren können. Diese Varianten der Nukleinsäuremoleküle, die für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodieren, sollen unter Bedingungen moderater Stringenz, bevorzugt aber untar strin- genten Bedingungen (siehe Maniatis et al., 1989) mit einer zu den in SEQ ID NR:5 bis SEQ ID NR:8 dargestellten Sequenzen komplementären Sequenz hybridisieren können. Unter moderater Stringenz ist z.B. eine Hybridisierung bei 42°C in 50% Formamid und anschließenden wenig stringenten Waschschritten zu verstehen, wobei die Waschschritte bei einer Temperatur von weniger als 12°C bis 20°C unter der errechneten Tm des zu untersuchenden Hybridmoleküls durchgeführt werden. Strin- gente Bedingungen bedeuten eine Hybridisierung in 5 x SSC bei 65°C. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin jede zu den vorgenannten Sequenzen komplementäre Sequenz, deren Gegenstrang für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G- CSF's kodiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül weiterhin für eine funktioneile Leader-Sequenz. Sekretorische Proteine werden aus einer Vorstufe prozessiert, die eine N-terminale Leader- Sequenz für den Import eines Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat enthält. Derartige Leader-Sequenzen können aus Prä-Sequenzen oder Prä-ProSequenzen bestehen. Prä-Sequenzen dirigieren ein Translationsprodukt in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) und werden beim Eintritt in das ER proteolytisch entfernt. Bei Prä-Pro-Sequenzen erfolgt eine zweistufige Reifung des Proteins. Nach dem Eintritt in das ER wird wie im ersten Typus die Prä-Sequenz entfernt. Das verbleibende Pro-Protein erfährt im Golgi-Apparat der Zelle eine zusätzliche proteolytische Reifung, bei der die noch vorhandene Pro-Sequenz mit Hilfe einer dibasischen Endopeptidase abgespalten wird. Mit Hilfe von Leader- Sequenzen, die diesen beiden Grundtypen entsprechen, können heterologe Proteine aus Wirtszellen sezemiert werden.
Ein besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung enthält als funktioneile Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des hyperglykämischen Crustaceen- Hormons (CHH) aus Carcinus maenas oder ein Derivat derselben. So konnte von Weydemann und Kollegen bereits gezeigt werden, daß die Fusion dieser Prä-Pro- Sequenz mit der für Hirudin kodierenden Sequenz zu einer effizienten Sezemierung des reifen Hirudinproteins mir korrekt prozessiertem N-Terminus führt (Weydemann et al., 1995). Die Fusion der für die CHH-Leader-Sequenz kodierenden DNA mit einer der in den SEQ ID NR: 5 bsi 8 dargestellten Nukleinsäuresequenzen wird daher ebenfalls zur korrekten Abspaltung der CHH-Prä-Pro-Sequenz führen.
In einer überaus bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül als Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des Mating Factors a (MFa1 ) aus Hefe. Eine zur Expression in Hefewirtszellen etablierte Konstruktion kodiert für ein Fusionsprotein, welches die Präpro-Sequenz des Pheromons MFa1 enthält (Brake et al., 1984). Aminosäuren in der Umgebung der neu entstandenen Fusionsstelle können dabei die Position der Prozessierungstelle und damit die N- terminale Sequenz des durch Proteolyse entstandenen reifen Proteins beeinflussen. Von Bedeutung ist hierbei insbesondere das Vorhandensein von Pro-Resten (Zurek et al., 1996).
Ein weiteres besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß es die natürliche MFa1 Sequenz in funktioneller Verbindung mit der für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierenden natürlichen Sequenz, einschließlich der Codons für die beiden N-terminalen Aminosäuren von G-CSF, umfaßt. Dabei wird durch Verwendung der natürlichen MF 1 -Sequenz ein primäres Translationsprodukt erzeugt, das aufgrund seiner Aminosäuresequenz im Bereich der Fusionsstelle zwischen MFα-1 Leader-Sequenz und der für den rekombinanten Wachstumsfaktor kodierenden Sequenz von einer Protease zwischen Aminosäure +2 und +3 der nicht verkürzten Aminosäuresequenz des Wachstumsfaktor gespalten wird. Die Prozessierung des Translationsproduktes führt entsprechend zu einer Verkürzung des N-Terminus um zwei Aminosäuren. Der Vorteil der Nutzung eines geeigneten Sekretions-Leaders besteht damit neben der Einschleusung des Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat in der Generierung eines definierten N- Terminus in dem ausgewählten Organismus.
Ein solches bevorzugtes Nukleinsäuremolekül kodiert z.B für die hier in NR:1 oder SEQ ID NR:2 dargestellte Aminosäuresequenz. In weiteren Ausführungsformen umfaßt sie die in SEQ ID NR:9 („natürlicher Leader + 174 x 3 Variante (incl. 6 Nu)") oder SEQ ID NR:10 („natürlicher Leader + 177 x 3 Variante (incl. 6 Nu)") dargestellte
Aminosäurequenz oder eine sich davon durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch ableitende Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSFs kodiert. Weiterhin kann ein solches Nukleinsäuremolekül eine Sequenz enthalten, die mit einer der zu den oben aufgeführten Nukleinsäuresequenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann bzw. zu einer der oben genannten Sequenzen komplementär ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine in der 3'-Region modifizierte MFa1 Sequenz und weiterhin die für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierende Sequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:5 oder SEQ ID NR:6 oder eine davon abgeleitete Sequenz bevorzugt ist. Um eine proteolytische Spaltung unmittelbar am C-Terminus des MFα-1-Peptids zu erzielen, muß die Aminosäuresequenz des MFa1 Leaders in der Nähe der Prozessierungsstelle verändert werden. Veränderungen dieser Art sind in früheren MFa1/G-CSF Fusionen beschrieben (z.B. U.S. Patent 5,055,555). Dahingegen führt die Verwendung der unveränderten MFa1 Leader Sequenz wie oben beschrieben zur proteolytischen Spaltung zwischen den Aminosäuren +2 und +3 der Sequenz des vollständigen reifen Proteins, d.h. vor Position +1 eines erfindungsgemäßen Proteins.
Außerdem umfaßt die vorliegende Erfindung einen Vektor, der ein wie oben beschriebenes Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon sowie einen damit funktionell verbundenen Promotor und ein mit der Nukleinsäure funktionell verbundenes Terminationssignal umfaßt.
Ein solcher Vektor enthält in einer bevorzugten Ausführungsform einen Promotor und ein Terminationssignal, die jeweils für eine vorgesehene Wirtszelle spezifisch sind. Dabei bedeutet spezifisch, daß der Promotor und das Terminationssignal aus dem für die Expression verwendeten Wirtsorganismus stammen. Ein beispielhafter Expressionsvektor für Hefe, wie der in der vorliegenden Erfindung genutzte, umfaßt eine Expressionskassette mit den folgenden funktionellen Elementen in der angegebenen Reihenfolge : - FMD-Promotor - heterologe kodierende Sequenz
- MOX-Terminator
Die einzelnen Elemente eines solchen bevorzugten Vektors sind in der Literatur gut beschrieben, z.B. in Gellissen und Melber, 1996; Hollenberg und Gellissen, 1997.
Darüber hinaus enthält ein solcher Vektor Selektionssequenzen und eine HARS (Hansenula autonomously replicating sequence) für eine Propagierung und Selektion in einem geeigneten Hefewirt, einen bakteriellen Replikationsursprung und ein für ein Bakterium geeignetes Selektionsgen für die Vermehrung und Selektion z.B. in einem E.coli Wirt (Gellissen und Hollenberg, 1997; Hollenberg und Gellissen, 1997). Ein Expressionsvektor für die erfindungsgemäße Produktion von G-CSF wurde mit Hilfe von allgemein bekannten Methoden und Verfahren hergestellt, z.B. wie in den laufend aktualisierten Protokollen zur Molekularbiologie beschrieben (Ausübet et al., 1987). Die folgenden Komponenten wurden genutzt: Eine Gensequenz, die für die Aminosäuresequenz des reifen G-CSF kodiert, wurde auf Grundlage der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986) synthetisiert und an ein geeignetes DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für die Prä-ProSequenz des Hefepheromons MFa1 fusioniert. Erfindungsgemäß wurde bewußt ein Element mit unveränderter Aminosäuresequenz eingesetzt (Brake et al., 1984). Die Nutzung eines derartigen Elementes resultiert in einer Prozessierung zwischen Position +2 und +3 und damit in der N-terminalen Verkürzung der G-CSF Sequenz um zwei Aminosäuren (siehe dazu Beispiel 5). Die fusionierte DNA-Sequenz wurde als EcoRI/BamHI Fragment in den Hansenula polvmorpha Expressionsvektor pFPMT121 integriert. In diesem Vektor dient ein FMD-Promotor Element zur Kontrolle der Fremdgenexpression. Der Vektor pFPMT121 und abgeleitete Varianten sind in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben (u.a. Gellissen und Hollenberg, 1997). Die DNA-Sequenzen für die erzeugte MFa1/G-CSF Fusion und der erzeugte Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF in Hansenula polvmorpha sind in den Abbildungen 1 und 2 wiedergegeben (Abb. 1 zeigt die in SEQ ID NR. 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz in Verbindung mit dem Initiationscodon "ATG" sowie die entsprechende Aminosäuresequenz). In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der oben beschriebene Vektor ein RNA-Vektor. Auf diese Weise können verschiedene Virus- Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, für die Transfektion von Säugerzellen genutzt werden. DNA-Vektoren sind jedoch ebenfalls umfaßt
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Wirtszellen, die einen der oben beschriebenen Vektoren enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine prokaryotische Wirtszelle. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sie eine Wirtszelle der Gattung Escherichia oder Bacillus ist. Eine solche Wirtszelle ist z.B. E.coli oder B. subtilis.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle. Dabei ist die Wirtszelle bevorzugt eine Säugerzelle, z.B. CHO, HeLa, WISH, COS oder NIH-Zellen, eine Pflanzenzelle, eine Hefezelle oder Pilzzelle. Unter den verschiedenen mikrobiellen Expressionssystemen bieten Hefearten verschiedene Vorteile für industrielle Applikationen. Sie sind in der Lage, rekombinante Produkte effizient zu sezemieren und einem generellen eukaryotischen Muster entsprechend zu prozessieren und modifizieren.
Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, die eine methylothrophe Hefezelle ist. Die methylotrophe Hefe Hansenula polvmorpha wurde als Expressionssystem für heterologe Proteine entwickelt (Roggenkamp et al.,1986; EP 0173378), wobei sich dieser Organismus insbesondere für die Herstellung pharmazeutischer Produkte eignet (Gellissen und Melber, 1996). Die Komponenten des Expressionssystems sind Gegenstand verschiedener Publikationen und Patentanmeldungen. So ist zum Beispiel die Anwendung des FMD-Promotors (Formiatdehydrogenase-Promotor) als Kontrollelement für heterologe Genexpression in EP 0299108 niedergelegt. Ein Plasmid mit einem solchen Kontrollelement dient in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF. Nach Aufnahme einer heterologen DNA wird diese stabil in das Hefegenom integriert. Als fakultativ methylotrophe Hefe ist diese Spezies in der Lage, Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen; andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Glyzerin und Glukose. Bei Zugabe von Methanol oder bei der Zugabe von Glyzerin oder Glukose in definierten Konzentrationen werden Schlüsselenzyme des Methanolstoffwechsels in hohen Konzentrationen produziert. Die Produktionskontrolle erfolgt auf transkriptioneller Ebene. Um die Sekretion eines heterologen Produktes zu ermöglichen, können unterschiedliche Elemente genutzt werden. So kann z.B, durch Fusion einer vom Hefepheromon MFa1 abgeleiteten Leader-Sequenz und der DNA- Sequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, ein Translationsprodukt erhalten werden, das nach Einschleusen in den sekretorischen Apparat in prozessierter Form ins Zellmedium sezemiert wird (Brake et al, 1984).
Als Wirtszellen bevorzugte methylotrophe Hefezellen sind ausgewählt aus Hansenu- ia, Candida, Pichia und Torulopis. Der Terminus „Hansenula" soll so verstanden werden, daß er alle Spezies einschließt, die die gleiche oder eine ähnliche taxono- mische Einord-nung mit einer methylotrophen Hansenula Hefe teilen. Dies schließt die Organismen Hansenula polvmorpha, Hansenula capsulata, Hansenula saturnus und Hansenula winqei ein, ohne auf sie beschränkt zu sein.
Weitere bevorzugte Wirtszellen, die nicht zu den methylothrophen Hefen gezählt werden, sind aus Saccharomyces cerevisiae, Kluvveromvces lactis, Schizosaccha- romvces pombe, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis und Arxula ade- novorans ausgewählt. Zur Expression besagter G-CSF-Molekülen bestens geeignet sind ferner Insektenzellen. Filamentöse Piizzellen sind ebenfalls bevorzugte Wirtszellen, wobei Asperαillus niqer, Asperqillus oryzae, Neurospora crassa, Acremonium chrvsogenum und Sordaria macrospora besonders bevorzugt sind.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Wirtszelle wie oben beschrieben unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird und der Wachstumsfaktor G-CSF entweder aus dem Medium oder aus der Zelle gewonnen wird. Die dafür geeigneten Verfahren, die dem Zellaufschluß und der Reinigung dienen, sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß der Erfindung wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF zur Mobilisierung von peripheren Blutstammzellen verwendet. Dabei ist unter „Mobilisierung von peripheren Blutstammzeilen" eine Steigerung des Blutvorläuferzeilspiegels im peri- pherem Blut zu verstehen.
Des weiteren wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF erfindungsgemäß zur Förderung der Proliferation von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen eingesetzt.
Darüber hinaus ist die Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektionen und nach Knochenmarkstransplantationen von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt.
Das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül, das für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodiert bzw. ein oben beschriebener Vektor, der ein solches Nukleinsäuremolekül enthält, wird zur in vitro-Transfektion von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen verwendet.
Ein solches Nukleinsäuremolekül wird gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektionen und nach Knochenmarktransplantationen eingesetzt.
Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF wie oben beschrieben umfaßt und auf eine weitere pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül oder mindestens einen der Vektoren wie oben dargestellt enthält.
Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen dazu dienen, die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung vollständiger zu beschreiben und zu erläutern. Damit wird die Absicht verfolgt, Hansenula polvmorpha als beispielhaften Organismus des Genus Hansenula und anderer methylotropher Hefen darzustellen. Darüber hinaus soll auch die Auswahl der genutzten genetischen Komponenten und DNA- Sequenzen der Erläuterung des Grundprinzips der Erfindung dienen. In diesem Sinne werden die aufgeführten Beispiele als nicht-beschränkend aufgefaßt.
Abbildungen:
Abb. 1 zeigt die Gensequenz für die MFα1 /G-CSF Fusion und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz.
Abb. 2 zeigt den Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF entsprechend der vorliegenden Erfindung.
Abb. 3 zeigt einen Southern Blot der genomischen DNA des rekombinanten Stammes Hansenula polvmorpha 27-1 , der mit dem Vektor pFPMTaG-CSF transformiert worden war. Die DNA wurde mit Xhol/Hindlll geschnitten, in definierten Verdünnungen elektrophoretisch getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einer markierten FMD-Promotor Sonde hybridisiert. Das Hybridisationsmuster besteht aus einem Signal bei 1 ,2 Kb für die genuine Sequenz und einem Signal bei 1 ,88 Kb für die heterologe Fusion. Anhand der Signalstärke läßt sich eine Kopienzahl von 40 Kopien abschätzen.
Spur 1 Größenstandard, Spur 2 Plasmid DNA, Spur 3 nicht-transformierter Ausgangsstamm RB11 , Spuren 4 -7 Stamm 27-1 (Verdünnungen 1 :40; 1 :20, 1 :10 und unverdünnt).
Abb. 4 zeigt die SDS-elektrophoretische Charakterisierung (15 %ige Gele). Die beiden stark gefärbten Banden wurden immunologisch als G-CSF Moleküle identifiziert. Beide Proteine weisen einen identischen N-Terminus auf.
Abb. 5 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Nabelschnurblutzellen nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten. Abb. 6 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Blutzellen eines an einem Myelom erkrankten Patienten nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten.
Abb. 7 zeigt die massenspektromethsche Analyse der durch rekombinante Expression in H.-polymorpha erhaltenen G-CSF-Varianten. Auf der Ordinate ist die relative Signalintensität und auf der Abszisse das Molekulargewicht in Dalton angegeben.
Beispiel 1
Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors
Konstruktion eines H. polymorpha-Expressionsvektors für die Sekretion von G-CSF: Ein DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für das reife G-CSF wurde entsprechend der publizierten Sequenz synthetisiert (Abb. 1 , Nukleotid 256 ff). Ein EcoRI/Hindlll Fragment mit der kodierenden Sequenz für die MFa1-Leadersequenz wurde zusammen mit dem G-CSF-Fragment in einen mit EcoRI/BamHI geöffneten M13mp18 Vektor ligiert. Das neu enstandene ligierte Fragment enthält eine MFa1- Leader/G-SCF Fusion als EcoRI/BamHI Fragment. Durch Mutagenese wurde die Fusionsstelle zwischen Leader und reifem G-CSF dahingehend verändert, daß die ursprüngliche Leader-Sequenz einschließlich der Lys-Arg-Prozessierungstelle rekonstituiert wurde. An diese Prozessierungsstelle schließt sich die Sequenz des reifen G-CSF ohne N-terminales Methionin an. Die mutagenisierte Fusionssequenz wurde als EcoRI/BamHI-Fragment in den mit diesen Restriktionsenzymen geöffneten Hansenula polymorpha Expressionsvektor pFPMT121 inseriert. Die inserierte Sequenz für MFa1/G-CSF ist in Abb. 1 und der entstandene Expressionsvektor pFPMTaG-CSF ist in der Abb. 2 wiedergegeben.
Beispiel 2
Transformation von Hansenula polvmorpha:
Der oben beschriebene Vektor diente zur Transformation des Hansenula polvmorpha Stammes RB11 , der eine Defizienz in der Orotidin 5'-Phosphat-Dehydrogenase (ura3~) aufweist. Kompetente Zellen dieses Stammes wurden nach etablierten Methoden hergestellt (Dohmen et al., 1991 : Yeast 7:691 ): 10 ml Hefemedium (YPD; Gemisch aus Hefeextrakt, Pepton und Glucose) wurden mit Zellen inokuliert und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Diese Kultur wurde anschließend zur Beimpfung von 200 ml des beschriebenen Mediums benutzt. Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 0,6 bis 1 bei OD600 kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation sedimen- tiert, bei Raumtemperatur mit 100 ml einer Lösung A gewaschen (1 M Sorbitol, 10 mM Bicine pH 8,35, 3 % (w/v) Ethylenglycol) und in 4 ml dieser Lösung resuspendiert. 11 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde zugegeben und die kompetenten Zellen in 200 μl Aliquots aufgeteilt. Sie wurden entweder sofort genutzt oder bis zur Nutzung bei -70°C gelagert.
Für die Transformation wurden 10 μg der Plasmid DNA (pFPMTaG-CSF) und 100 μl kaltes 0,1 M CaCI2zu gefrorenen Zellaliquots gegeben. Nach schnellem Auftauen wurde 1 ml einer Lösung B zugegeben (40 % (w/v) PEG 3000, 200 mM Bicine pH 8,35) und die Transformationsansätze bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml einer Lösung C (150 mM NaCI in 10 mM Bicine pH 8,35) gewaschen und in 200 μl resuspendiert. Diese Suspension wurde auf Selektivnährböden (Agar in YNB-Glucose (yeast nitrogen base) ausplattiert. Die Ausstriche wurden bei 37 °C für 3 bis 5 Tage inkubiert.
Beispiel 3
Erzeugung mitotisch stabiler Stämme:
Kolonien der Transfomationsausstriche wurden zur Inokulation von 3 ml YNB- Glukose benutzt und bei 37 °C kultiviert. Ein 50 μl Aliquot der ausgewachsenen Kultur wurde zur Inokulation weiterer 3 ml YNB genutzt. Dieser Vorgang wurde für ca. 60 Wachstumsgenerationen wiederholt. Während dieser Passagierung wurde die Plasmid-DNA in das Genom der Hefe integriert. Anschließend wurden 3 ml des nicht-selektiven Mediums (YPD) beimpft und bei 37 °C inkubiert.
Beispiel 4
Herstellung von rekombinanten Stämmen der Art Hansenula polvmorpha mit der Fähigkeit, G-CSF zu sezemieren, und Identifizierung rekombinanter Stämme, die G- CSF sezemieren:
Die Herstellung von rekombinanten, G-CSF produzierenden Hefestämmen der Art Hansenula polvmorpha erfolgte nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode durch Transformation des Wirtsstammes RB11 mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid pFPMTaG-CSF. Mitotisch stabile Stämme wurden wie beschrieben durch Passagieren in selektivem Medium erzeugt. Die generierten Transformanden wurden im 3 ml Maßstab vergleichend kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in einem Medium, dem Glyzerin in einer Konzentration von 1 ,5 % (w/v) zugesetzt war. Der Verbrauch des Glyzerins durch die wachsende Kultur resultierte in Derepressionsbedingungen für den Promotor. Unter diesen Bedingungen läßt sich die Expression des unter der Kontrolle des FMD-Promotors stehenden Fremdgens nach zwei bis drei Tagen nachweisen. Dabei wurden die Zellen nach zweitägiger Kultur in diesem Medium bei 37 °C abzentrifugiert und der Überstand auf das Vorhandensein von G-CSF untersucht. Der Nachweis erfolgte durch einen direkten ELISA, bei dem ein käuflich erhältliches Anti-G-CSF-Serum aus Ziegenblut verwendet wurde. Der ELISA erfolgte in Polystyrolmikrotiterplatten (F96 Maxisorp, Nunc-Immuno Plate) nach etablierten Methoden. Der Nachweis erfolgte über die an einen biotinylierten Zweitantikörper im Laufe der Nachweisschritte gebundene Peroxidaseaktivität. Das Enzym katalysiert bei Zugabe eines Substrates eine grüne Farbentwicklung, die bei 405 nm photometrisch gemessen werden kann. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich mit kalibrierten G-CSF Mengenstandards. Durch diesen vergleichenden quantitativen Nachweis des G-CSF in den Kulturüberständen konnten Kandidaten mit überdurchschnittlichen Produktionseigenschaften identifiziert werden.
Beispiel 5
Bestimmung der Kopienzahl in ausgewählten Stämmen:
Die Kopienzahl der integrierten heterologen DNA wurde durch Southern Blot Hybridisierung bestimmt. Dazu wurde die genomische DNA ausgesuchter Hefestämme mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol geschnitten, nach elektrophoretischer Trennung auf Nitrozellulosefilter übertragen und mit einer markierten FMD-Promotor Sonde hybridisiert. Die Wahl der Restriktionsenzyme und die Festlegung der Hybri- disierungssonde in der angegebenen Weise resultiert in zwei Hybridisierungssigna- len für das genuine FMD-Gen und die heterologe Fusion. Durch Vergleich der Signalstärken dieser zwei Signale kann die Kopienzahl der rekombinanten DNA festgelegt werden. Die Kopienzahl der beiden als Beispiele dienenden Stämme mit den Seriennummern 12-3 und 27-1 wurde mit jeweils 40 bestimmt (siehe Abb. 3). Beispiel 6
Kultivierung:
Die Kultivierung der G-CSF-sezemierenden Hansenula-Stämme erfolgte im 21 Ansatzverfahren in einem synthetischen Medium, supplementiert mit Glyzerin als Kohlenstoffquelle. Die Fermentation erfolgte bei pH 5,5 - 3,2.
Beispiel 7
Isolierung des sezemierten G-CSF:
Die Isolierung des sezemierten G-CSF erfolgte mit Hilfe der nachfolgenden Aufreinigungsschritte. Der Fermentationsüberstand wurde durch Zenthfugation der Suspension und anschließende Sterilfiltration gewonnen. Daraufhin erfolgte eine Konzentrierung und Entsalzung durch Querstromfiltration mit Hilfe einer 10 kDa Polyethersul- fonmembran bei 4-8 °C. Das so gewonnene Material wurde 1 :1 mit einem Puffer A verdünnt (20 mM HOAc/KOH pH 5,2, 0,5 mM EDTA, 02 % (w/v) Tween 20), mit KOH auf pH 5,2 eingestellt und auf einen mit diesem Puffer äquilibrierten Kationenaustauscher gegeben (Merck Fractogel EMD-SO3" 650 M; 1 x 7 cm). Die aufgetragene Proteinmenge war 4,5 mg nach Bradford, die Leitfähigkeit 2,1 mS/cm. Die Elution des gebundenen Proteinmaterials erfolgte mit Hilfe eines Salzgradienten mit 10 % bis 100 % Anteil eines Puffers B (Puffer B entspricht Puffer A mit 0,5 M NaCI). Die Produktfraktionen wurden mit Hilfe eines 10 kDa Filters aufkonzentriert und durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Sephadex G 75 Matrix eluiert. Der G-CSF befand sich unter diesen Bedingungen im Ausschlußvolumen.
Das so gewonnene Präparat lag in einer Konzentration von 50 μg/ml vor. Eine elek- trophoretische Analyse mit Hilfe von 15 %igen SDS-PAGE Gelen nach Laemmli belegte das Vorhandensein der zwei bereits beschriebenen G-CSF Moleküle von 18 und 20 kDa. Beispiel 8
Bestimmung der biologischen Aktivität des rekombinanten G-CSF aus Hansenula polvmorpha
Das rekombinante Produkt wurde in einem CD34-Synthesetest nach Sutherland et al. (Sutherland et al., 1994) durchflußzytometrisch in Vorläuferzellpräparaten auf seine biologische Aktivität im Vergleich mit einem in Bakterien hergestellten G-CSF- Isolat (Filgrastim) getestet. Als Testzellen dienten Zellen aus potentiell zur autolog bzw. allogen zur Knochenmarktransplantation vorgesehenen Vorläuferzellpräparaten. Eingesetzt wurden Nabelschnurblutzellen aus Plazentarestblut bzw. mononu- kleäre Zellen aus autologen Stammzellapheresaten von zytotoxisch mobilisierten Myelompatienten (jeweils drei verschiedene Chargen). Die Zellproben wurden bei unterschiedlichen G-CSF Konzentrationen 30 Minuten inkubiert, mit monoklonalen fluoreszierenden Antikörpern markiert, fixiert und durchflußzytometrisch analysiert. Dabei wurden G-CSF Konzentrationen eingesetzt, die der Serumkonzentration bei der klinischen Anwendung entsprechen (Fischer et al., 1994). Nach Inkubation mit rekombinantem G-CSF aus Hansenula polvmorpha wiesen Zellen aus Nabelschnurblut eine sechsfach höhere Syntheserate an CD34 Protein auf als der Kontroll-G- CSF aus E.coli (Filgrastim, Amgen Corporation, Thousand Oaks, CA). Bei Zellen aus Apheresaten von Myelompatienten wurde eine 8,2-fach höhere Aktivität gegenüber dem E.coli Isolat gefunden. In Vorversuchen wurde demgegenüber kein Unterschied zwischen dem E.coli Isolat und einem rekombinanten glykosylierten Produkt aus Hamsterzellen (Lenograstim, Rhöne-Poulenc Rorer; Frankreich) nachgewiesen.
Beispiel 9
Charakterisierung des sezemierten G-CSF:
Die in Beispiel 3 identifizierten Stämme wurden im 2 I Maßstab nach dem bereits beschriebenen Verfahren fermentiert und das sezernierte Produkt wurde nach verschiedenen Methoden charakterisiert. Die apparente relative Masse wurde durch SDS-PAGE nach Schäger und von Jagow mit 19,5 kDa bestimmt. In der SDS-PAGE nach Laemmli traten zwei monomere Formen von 18 und 20 kDa auf, darüber hinaus multimere Formen (siehe Abb. 4). Die 18 kDa Form bildete in der vergleichenden SDS-PAGE eine Bande auf derselben Höhe wie G-SCF aus E.coli. Die 18 und die 20 kDa Form der SDS-PAGE Auftrennung nach Laemmli und die 19,5 kDa Form der SDS-PAGE nach Schägger und vo Jagow wurden mit Hilfe präparativer Gele aufgetrennt, auf PVDF Membranen transferiert und N-terminal ansequenziert. Für alle Isolate wurde übereinstimmend der folgende N-Terminus bestimmt:
Referenzsequenz
(natürliche Sequenz): TPLGP ASSLP QSFLL KCLEQ VRKIQ GD
Nachgewiesene
Sequenzen: LGP ASSLP QSFLL K?LEQ VRKIQ GD
Das sezernierte Produkt liegt nicht in monomerer, sondern in multimerer Form vor. Durch ausschlußchromatographische Verfahren konnte bestimmt werden, daß die relative Masse des nativen Produktes größer als 75 kDa ist. Das größere Produkt ist nicht N-glykosyliert. Eine O-Glycosylierung konnte durch PAS Färbung (periodic acid Schiff reagent-Färbung) von SDS-Polyacrylamidgelen sowie durch Glycoblotting nicht detektiert werden.
Beispiel 10
Massenspektromethsche Analyse der sezemierten G-CSF-Varianten:
Die in Beispiel 3 identifizierten Stämme wurden nach dem bereits beschriebenen Verfahren im 1 ,5 I Maßstab fermentiert und das sezernierte G-CSF mit Hilfe der nachfolgenden Aufreinigungsschritte isoliert. Der Fermentationsüberstand wurde durch Zentrifugation der Suspension bei 4 °C über 20 Minuten bei 10.000 U/min und anschließender Sterilfiltration mit Hilfe von 0,22 μm Filtern gewonnen. Daraufhin wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat eine fraktionierte Fällung durchgeführt, wobei die relevante Fraktion bei einer Konzentration von 400 g/l Ammoniumsulfat erhalten wurde. Der Ammoniumsulfatniederschlag, der einem Liter Kulturüberstand entsprach, wurde in 50 ml 10 mM Tris-HCI-Puffer; pH-Wert 7,5 resuspendiert. Die hG-CSF enthaltenende Lösung wurde auf eine Gelfiltrationssäule Sephacryl S 300 HR (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen und als Elutionspuffer 0,5 x PBS- Puffer; pH-Wert 7,5 verwendet. Es wurden 16 Fraktionen im Bereich von 2,5 bis 11 ml erhalten. Die Fraktionen 6 bis 9 wurden vereinigt und zeigten bei der Western- Blot-Analyse ein stark positives Signal. Gemäß Bradford-Bestimmung wies der Pool eine Konzentration von 0,115 mg Protein/ml auf.
50 μl dieses Pools wurden zur massenspektromethschen Untersuchung verwendet. Die Messung wurde an einem LCQ-Massenspektrometer (Finnegan, USA) durchgeführt, wobei die Probe durch Elektro-Sprüh-Ionisierung (Electro Spray) der Untersuchung zugänglich gemacht wurde. Das Ergebnis der Messung ist in Abbildung 7 gezeigt.
Tabelle 1
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Legende: Hex = Hexose
NAzHex = N-acetylhexose
- TP = Δ2 (- Thr Pro)
Tabelle 1 zeigt die Zuordnung der gefundenen Molekulargewichte (MG(gef.)) zu den in der Probe vorkommenden G-CSF-Varianten, wobei weiterhin das erwartete Molekulargewicht (MG(soll)) und die Abweichung bzgl. des Molekulargewichtes (Δ Dalton) angegeben sind. Es ergibt sich somit, daß die Probe eine verschiedene G-CSF- Varianten enthaltende Zusammensetzung darstellt, wobei die dominanten Formen: Mono-Hexose-"177(-2AS)-Variante", nicht-glykosyiiertes G-CSF, Di-Hexose-"177(- 2AS)-Variante", Mono-Hexose-G-CSF und Di-Hexose-G-CSF darstellen. Unter Berücksichtigung der Signalhöhe und -breite läßt sich eine relative Quantifizierung der G-CSF-Varianten in der Probe durchführen. Somit umfaßt die Zusammensetzung (die nachstehend angegebenen Prozentzahlend sind als Massenprozentan- gaben (w/w)):
10-30 % Mono-Hexose-„177(-2AS)Variante" 5-15 % nicht-glykosyliertes G-CSF (Δ0) 10-30 % Di-Hexose-„177(-2AS)Vahante" 20-40 % Mono-Hexose-G-CSF (Δ0) 10-30 % Di-Hexose-G-CSF (Δ0).
Zitierte Literatur:
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Claims

Patentansprüche
1. Rekombinanter Wachstumsfaktor, der ein Säuger-G-CSF (Granulozyten Kolo- nie-stimulierender Wachstumsfaktor) oder ein dazu homologes Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSF ist, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren des reifen G-CSF Proteins fehlen.
2. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß er ein humaner Wachstumsfaktor ist.
3. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er ein N-terminales Methionin enthält.
4. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
i) SEQ ID NR:1 („174 (-2 AS) Variante"), ii) SEQ ID NR:2 („177 (-2 AS) Variante"), iii) SEQ ID NR:3 („Met-174 (-2 AS) Variante"), und iv) SEQ ID NR:4 („Met-177 (-2 AS) Variante"),
oder eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist.
5. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich die abgeleitete Sequenz durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch einer oder mehrerer Aminosäuren von der in SEQ ID Nr. 1 , SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 angegebenen Sequenz unterscheidet.
6. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 4 und/oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere der Histidinreste an den Positionen 41 , 77, 154 und 168 durch eine andere natürliche Aminosäure ersetzt sind.
7. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere der Histidinreste an den Positionen 41 , 77, 154 und 168 durch Glutamin ersetzt sind.
8. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis
7, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Aminosäurereste im Bereich der Aminosäuren 48 bis 54 ausgetauscht sind.
9. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
8, dadurch gekennzeichnet, daß er posttranslational modifiziert ist.
10. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die posttranslationale Modifikation die Abspaltung eines N-terminalen Methionins und/oder die Glycosylierung des Wachstumsfaktors umfaßt.
11. Zusammensetzung umfassend:
a) 10-30 % Mono-Hexose-„177(-2AS)Variante" b) 5-15 % nicht-glykosyliertes G-CSF (Δ0) c) 10-30 % Di-Hexose-„177(-2AS)Variante" d) 20-40 % Mono-Hexose-G-CSF (Δ0) e) 10-30 % Di-Hexose-G-CSF (Δ0).
12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß, die G-CSF-Variante eine humane G-CSF-Variante ist.
13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Hexose Mannose ist.
14. G-CSF-Variante, ausgewählt aus: Mono-Hexose-„177(-2AS)Variante", Di- Hexose-„177(-2AS)Variante", Mono-Hexose-G-CSF (Δ0) und Di-Hexose-G- CSF (Δ0).
15. G-CSF-Variante gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die G-
CSF-Variante eine humane G-CSF-Variante ist.
16. G-CSF-Variante gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Hexose Mannose ist.
17. Zusammensetzung mit G-CSF-Aktivität, erhältlich durch:
a) Transformieren eines Hansenula polyrnorpha-Stammes mit einem G-CSF Expressionsvektor;
b) Kultivieren der transformierten Zellen unter zur Expression von G-CSF geeigneten Bedingungen;
c) Abtrennen des G-CSF-Varianten enthaltenden Kulturüberstandes von den Zellen oder Lysieren der G-CSF-Varianten enthaltenden Zellen; und
d) Aufreinigen der exprimierten G-CSF-Varianten.
18. Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufreinigen nach d) die Schritte umfaßt:
a) Filtration des Kulturüberstandes oder Lysates;
b) Versetzen des Filtrates mit einer zur Fällung von G-CSF-Varianten ausreichenden Menge von Ammoniumsulfat;
c) Resuspendieren des Niederschlages;
d) Abtrennen der G-CSF-Varianten durch Gelfiltrationschromatographie; und e) Sammeln und gegebenfalls Vereinigen der G-CSF-Varianten enthaltenden Fraktionen.
19. Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ferner das Trennen der Proteine durch Kationenaustauscher-, Hochleistungsflüssigkeits- und/oder Immunaffinitätschromatographie umfaßt.
20. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das G-CSF humanes G-CSF ist.
21. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Hansenula polymorpha-Stamm RB11 ist.
22. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21 , d.d.g., daß der Expressionsvektor pFPMTaG-CSF ist.
23. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine für einen rekombinanten Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einer G-CSF-Variante nach einem der Ansprüche 14 bis 16 kodierende Sequenz umfaßt und ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:1 dargestellten Sequenz kodiert,
b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:2 dargestellten Sequenz kodiert,
c) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:3 dargestellten Sequenz kodiert,
d) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:4 dargestellten Sequenz kodiert, e) der in SEQ ID NR:5 („174 x 3 (-6 Nu) Variante ") dargestellten Nukleinsäuresequenz,
f) der in SEQ ID NR:6 („177 x 3 (-6 Nu) Variante ") dargestellten Nukleinsäuresequenz,
g) der in SEQ ID NR:7 („AUG-174 x 3 (-6 Nu) Variante ") dargestellten Nukleinsäuresequenz,
h) der in SEQ ID NR:8 („AUG-177 x 3 (-6 Nu) Variante ") dargestellten Nukleinsäuresequenz,
i) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleotidaustausch von einer der in a) bis h) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen abgeleiteten Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSFs kodiert,
k) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer zu den in a) bis i) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann,
sowie einer zu einer der unter a) bis k) genannten Sequenzen komplementären Sequenz.
24. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin für eine funktioneile Leader-Sequenz kodiert.
25. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des hyperglykämischen Crustaceen- Hormons (CHH) aus Carcinus maenas oder ein Derivat derselben ist.
26. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des Mating Factors α (MFα1 ) aus Hefe oder ein Derivat derselben ist.
27. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es die
MFα1 Leader-Sequenz mit der natürlichen MFα1 Sequenz in funktioneller Verbindung mit einer für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierenden Sequenz einschließlich der Codons für die beiden N-terminalen Aminosäuresequenzen von G-CSF umfaßt.
28. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein gemäß SEQ ID NR:1 oder SEQ ID NR:2 und für eine damit funktionell verbundene MFα1 Leader- Sequenz kodiert,
ii) SEQ ID NR:9 („natürlicher Leader + 174 x 3 Variante (incl. 6 Nu)"),
iii) SEQ ID NR:10 („natürlicher Leader + 177 x 3 Variante (incl. 6 Nu)"),
iv) einer durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleotidaustausch von einer der in (i), (ii) oder (iii) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen abgeleiteten Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G- CSFs kodiert,
v) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer zu den in (i) bis (iv) beanspruchten komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann,
sowie ein zu einer der in (i) bis (v) genannten Sequenzen komplementären Sequenz.
29. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat der MF 1 Leader-Sequenz eine in der 3'-Region modifizierte MFα1 Sequenz ist und die für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierende Sequenz die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:5 oder SEQ ID NR:6 oder eine davon abgeleitete Sequenz ist.
30. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Nukleinsäuremolekül nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 29 oder ein Fragment davon, einen damit funktionell verbundenen Promotor sowie ein mit der Nukleinsäure funktionell verbundenes Terminationssignal umfaßt.
31. Vektor nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor und das Terminationssignal ein für eine vorgesehene Wirtszelle spezifischer Promotor und spezifisches Terminationssignal sind.
32. Vektor nach Anspruch 30 und/oder 31 , dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Vektor oder ein RNA-Vektor ist.
33. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Vektor nach mindestens einem der Ansprüche 30 bis 32 enthält.
34. Wirtszelle nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine pro- karyotische Wirtszelle ist.
35. Wirtszelle nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Wirtszelle der Gattung E 3cjτejjcjτia oder BaciHus ist.
36. Wirtszelle nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle E.coli oder B. subtilis ist.
37. Wirtszelle nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine eu- karyotische Wirtszelle ist.
38. Wirtszelle nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugerzelle, eine Pflanzenzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Pilzzelle ist.
39. Wirtszelle nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine methylotrophe Hefezelle ist.
40. Wirtszelle nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Hansenula, Candida. Pichia und Torulopis.
41. Wirtszelle nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Hansenula polvmorpha, Hansenula capsulata, Hansenula saturnus und Hansenula wingei.
42. Wirtszelle nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Saccharomvces cerevisiae, Kluvveromvces lactis und Schi- zosaccharomvces pombe, Yarrowia lipolytica. Schwanniomyces occidentalis und Arxula adenovorans.
43. Wirtszelle nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine filamen- töse Pilzzelle ist.
44. Wirtszelle nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Acremonium chrvsogenum und Sordaria macrospora.
45. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF oder einer G-CSF-Variante, dadurch gekennzeichnet, daß eine Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 33 bis 44 unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird und der Wachstumsfaktor G-CSF oder die G-CSF-Variante entweder aus dem Medium oder aus der Zelle gewonnen wird.
46. Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer G-CSF-Variante nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Mobilisieren von peripheren Blutstammzellen.
47. Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer G-CSF-Variante nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Fördern der Proliferation von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen.
48. Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer G-CSF-Variante nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektionen und nach Knochenmarkstransplantationen.
49. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 29 oder eines Vektors nach mindestens einem der Ansprüche 30 bis 32 zur in vitro-Transfektion von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen.
50. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 29 oder eines Vektors nach mindestens einem der Ansprüche 30 bis 32 zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektionen und nach Knochenmarktransplantationen.
51. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens einen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder eine G-CSF-Variante nach einem der Ansprüche 14 bis 16.
52. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 23 bis 29 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 30 bis 32.
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