Rekombinanter Wachstumsfaktor mit der biologischen Aktivität eines G-CSF (Granulocyte Coiony Stimulating Factor)
Die Erfindung betrifft einen Wachstumsfaktor mit Granulozyten Ke'onie- stimulierender Aktivität sowie ein Nukleinsäuremolekül, das eine für diesen Wachs- tumsfaktor kodierende Sequenz umfaßt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Proteine oder Nukleinsäuren umfassen, und ihre therapeutische Verwendung.
Cytokine sind an der Reifung von Blutzellen beteiligt, indem sie die Reifung von Stammzelien zu voll differenzierten Blutzellen stimulieren. Einer dieser Faktoren, der G-CSF (Granulocyte Coiony Stimulating Factor) wird in aktivierten Monozyten, Ma- krophagen und anderen Zellinien synthetisiert. Das Protein tritt in zwei verschiedenen natürlichen Formen mit einer Größe von 177 und 174 Aminosäuren auf (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986). Beide Proteine sind das Resultat der Expression eines einzigen Gens. Das Gen enthält fünf Exons und vier Intronsequenzen. Am 5'- Ende des zweiten Introns befinden sich zwei 9 Bp voneinander entfernte Spleiß- Donorsequenzen, die ein alternatives Spleißen ermöglichen. Die beiden natürlichen Proteinformen werden durch Translation der durch dieses alternative Spleißen des Primärtranskriptes entstandenen mRNAs erzeugt. Die längere Form unterscheidet sich von der kürzeren durch Einschub von 3 Aminosäuren (Val-Ser-Glu) zwischen den Positionen 35 und 36. Beide Formen entstehen aus einer um 30 Aminosäuren längeren Vorstufe. Die relative Masse der kürzeren Form wurde mit 18,671 Da bestimmt (Nagata et al., 1986). Sie wird als Hauptsyntheseprodukt beschrieben, das eine zwanzigfach höhere Aktivität in bestimmten biologischen Tests aufweist als das längere Nebenprodukt (Nagata, 1989).
Das natürliche Protein enthält zwei Disulfidbrücken zwischen den Aminosäurepaaren Cys36 und Cys42 sowie Cys64 und Cys74. Der natürliche G-CSF enthält eine O- Glykosylierung an Thr133. Eine Beeinflussung der biologischen Aktivität durch Veränderung N-terminaler Sequenzen des Cytokins ist nicht bekannt. Nach Kuga et al. behalten N-terminal um bis zu 11 Aminosäurereste verkürzte G-CSF Moleküle die
volle biologische Aktivität, wohingegen z.B. C-terminale Verkürzungen der Grundsequenz die Aktivität herabsetzen bzw. variieren (Kuga et al.,1989).
G-CSF ist in der Lage, die Population neutrophiler Granulozyten in kurzer Zeit in vivo und ex vivo substantiell zu vergrößern. Das Protein ist daher eine Substanz mit vielfältigen therapeutischen Applikationsmöglichkeiten. So kann G-CSF in der Krebsbehandlung eingesetzt werden, wenn die Zellen des Immunsystems z. B. durch eine Chemotherapie zerstört wurden. Darüber hinaus kann G-CSF in der Knochenmarktransplantation, bei schwerwiegenden Verbrennungen, bei Leukämie oder bei opportunistischen Infektionen aufgrund von Immundefizienzen eingesetzt werden (US- Patent 5,399,345). Zudem wird G-CSF zur Mobilisierung von Blutstammzellen aus dem Knochenmark oder einem anderen Stammzellreservoir in das periphere Blut eingesetzt. Mit G-CSF können Zellen der myeloischen Zellreihe zum klinischen Einsatz ex vivo expandiert werden.
Aufgrund der Vielzahl an verschiedenen Anwendungsgebieten für den Wachstumsfaktor G-CSF besteht daher ein Bedürfnis nach Varianten dieses Wachstumsfaktors, die sich durch eine höhere oder geringere biologische Aktivität als der natürliche G- CSF Wachstumsfaktor auszeichnen, so daß je nach angestrebter Verwendung eine Variante des G-CSF Wachstumsfaktors mit geeigneter Aktivität eingesetzt werden kann. Der Terminus „Variante" bzw. „G-CSF-Variante" soll dabei Aminosäure- und Nukleinsäuremoleküle umfassen, die wenigstens eine interne Addition, Substitution, Deletion, Insertion, Inversion und/oder eine C-terminale Deletion gegenüber der jeweiligen ursprünglichen Sequenz, z.B. der Humansequenz, aufweisen, wobei höchstens 5 Aminosäurereste gegenüber der ursprünglichen Sequenz verändert sind. Er umfaßt femer Varianten, die sich von natürlicherweise vorkommenden G-CSF- Molekülen durch ihre Glykosylierung unterscheiden.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, rekombinante Varianten eines Proteins mit der Aktivität des G-CSF Wachstumsfaktors zur Verfügung zu stellen, wobei jede dieser Varianten eine höhere oder geringere biologische Aktivität aufweisen soll als der natürliche G-CSF Wachstumsfaktor.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch einen rekombinanten Wachstumsfaktor gelöst, der ein Säuger-G-CSF oder ein dazu homologes Protein mit der biologischen
Aktivität eines G-CSFs ist, und dem die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren des reifen G-CSF Proteins fehlen.
Unter „homologen Proteinen" sind solche Proteine zu verstehen, die eine Homologie von mindestens 60 % zu einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenzen besitzen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Homologie 70 oder 80 %, besonders bevorzugt 90 oder 95 %. Am stärksten bevorzugt ist eine Homologie von 98 oder 99 %.
Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck „Homologie" Homologie auf Protein-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403- 410) bestimmt werden kann.
Der dem Fachmann bekannte Ausdruck „Homologie" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehr Polypeptiden, der durch die Übereinstimmung z schen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der „Homologie" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksich gung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.
Die Homologie miteinander verwandter Polypeptide kann mit Hilfe bekannter Verfahre bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den besond ren Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das GCG Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST
Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al
Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus ka zur Bestimmung von Homologien verwendet werden.
Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen die nachste den:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48:443-453 (
Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 aus Henikoff und Henikoff, PNAS US
89(1992), 10915-10919
Lücken-Wert (Gap Penalty): 12
Lückenlängen-Wert:
(Gap Length Penalty): 4
Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity): 0
Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default paramete für Aminosäuresequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie-W nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenzsrequenz ka weiterhin notwendig sein, den Erwarungswert auf bis zu 100.000 (expected value) z höhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.
Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschlie der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genann können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei G oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen quenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.
Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 60 % wir
Rahmen dieser Anmeldung als 60 % Homologie bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere Homologiegrade.
Der in der vorliegenden Erfindung beschriebene Wachstumsfaktor weist einen gegenüber dem natürlichen G-CSF-Protein um zwei Aminosäuren verkürzten N- Terminus auf und besitzt vollkommen unerwartet eine deutlich höhere biologische Aktivität als der natürliche G-CSF-Wachstumsfaktor. Der Begriff „biologische Aktivität" des G-CSF Wachstumsfaktors bezieht sich dabei auf die Fähigkeit, die Proliferation von Blutstammzellen zu stimulieren (Kuga et al., 1989). Diese können durch die Stimulation mit G-CSF und anderen Faktoren zu Granulozyten expandiert und differenziert werden. Diese Differenzierung korreliert mit der Synthese des an der Zelloberfläche von myeloischen Vorläuferzellen lokalisierten CD34-Proteins. Daher eignet sich der Nachweis des CD34 Proteins als Maßstab für die Proliferationsfähig- keit der stimulierten Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Wachstumsfaktor ein reifer humaner, um die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren verkürzter Wachstumsfaktor.
Wie oben erwähnt, umfaßt der natürliche humane G-CSF Wachstumsfaktor zwei leicht unterschiedliche Aminosäuresequenzen. Dieser Unterschied ist für die erfindungsgemäße, N-terminal verkürzte Ausführungsform ebenfalls beobachtet worden. Dabei hat die kürzere Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors in ihrer reifen Form 172 Aminosäuren, die längere Form enthält eine Insertion von drei Aminosäuren zwischen den Positionen 33 und 34. Für die Numerierung wird dabei die Aminosäure +3 des reifen Proteins als neue Aminosäure +1 zugrundegelegt. Beide Moleküle, sowohl das 172 als auch das 175 Aminosäuren umfassende Molekül, weisen einen identischen N-Terminus mit der N-terminalen Sequenz Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser auf, im Gegensatz zum N-Terminus der natürlichen Sequenz, die Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser lautet. Die Aminosäuresequenz kann dabei im Vergleich zu den natürlichen Proteinen weiter verändert werden, z.B. ein N- terminales Methionin enthalten; erfindungsgemäß fehlen jedoch stets die beiden Aminosäuren Thr/Pro am N-Terminus.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor ein N-terminales Methionin. Abhängig vom ausgewählten Wirtsorganismus, in dem der Wachstumsfaktor exprimiert wird, können spezifische Proteasen das N-terminale Methionin, welches durch Translation des Initiationskodons entsteht, bei allen oder einem Teil der exprimierten Moleküle abspalten. Durch Einführung eines weiteren für Methionin kodierenden Codons in 3'- Position vom Initiationscodon kann jedoch ein reifes Protein erhalten werden, das auch nach der Prozessierung des N-Terminus ein N-terminales Methionin enthält.
Weiterhin umfaßt der rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungsform die in SEQ ID NR:1 (174 (-2AS) Variante"), SEQ ID NR: 2 („177 (-2AS) Variante"), SEQ ID NR:3 („Met-174 (-2 AS) Variante") oder SEQ ID NR:4 („Met-177 (- 2 AS) Variante") dargestellte Aminosäuresequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz. Die abgeleitete Sequenz unterscheidet sich durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch in einer oder mehreren Positionen von einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 gezeigten Sequenzen. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sich die abgeleitete Sequenz in 1 bis 5 Aminosäureresten von einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR: 4 gezeigten Sequenzen durch eine der erwähnten Mutationen unterscheidet; überaus bevorzugt ist es, wenn sich eine abgeleitete Sequenz in lediglich einem Aminosäurerest von einer der vorstehenden Sequenzen unterscheidet. Zur Modulation der Aktivität wird das Protein bevorzugt am C- Terminus verkürzt.
Die im folgenden verwendete Numerierung der Aminosäuren bezieht sich auf die in SEQ ID NR;1 dargestellte Sequenz und unterscheidet sich folglich um jeweils 2 Aminosäurepositionen von der bekannten natürlichen Sequenz des humanen G-CSFs. Dabei ist jedoch grundsätzlich immer auch die um 3 Aminosäuren längere Spleiß- Variante (siehe SEQ ID Nr. 2) von SEQ ID Nr. 1 von der Erfindung mit umfaßt, ohne daß die Position des jeweiligen Aminosäurerestes oder der jeweiligen Region in der Sequenz für die Spleiß-Variante explizit noch einmal erwähnt wird.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen rekombinanten Wachstumsfaktors sind Wachstumsfaktoren, in denen ein oder mehrere der Histidin-
reste an den Positionen 41 , 77, 154 und 168 durch eine andere natürliche Aminosäure, bevorzugt Glutamin (Gin), ersetzt sind. Des weiteren kann der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein oder mehrere Mutationen im Bereich der Aminosäuren 48 bis 54 tragen. Wie bereits in US-Patent 5,399,345 gezeigt, reduzieren Mutationen in diesen Aminosäureresten die Aktivität des resultierenden Proteins. So führen die Kombinationen der aktivitätssteigemden Mutationen unmittelbar am N- Terminus und der aktivitätsreduzierenden Mutationen in den oben angegebenen Positionen zu zahlreiche Varianten des G-CSF Wachstumsfaktors mit einer Vielzahl an unterschiedlichen biologischen Aktivitäten.
Darüber hinaus ist der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungsform posttranslational modifiziert. Eine solche posttransla- tionale Modifikation umfaßt besonders bevorzugt die Abspaltung eines N-terminalen Methionins und/oder die Glykosylierung des Wachstumsfaktors und weitere möglich andere Modifikationen. Hansenula-spezifische Glykosylierungsmuster sind bevorzugt. Vorzugsweise umfaßt die Hansenula-spezifische Glykosylierung die Übertragung von ein oder zwei Hexose-Resten auf das G-CSF-Polypeptid. Besonders bevorzugt ist die Hexose Mannose.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung mit G-CSF-Aktivität bereit, die beispielsweise erhältlich ist durch rekombinante Expression von G-CSF in einem Hansenula-polymorpha-Stamm und nachfolgende Aufreinigung der G-CSF-Aktivität. Das im nachfolgenden mit G-CSF (ΔO) bezeichnete Protein bedeutet G-CSF, das den natürlicherweise vorkommenden NH2-Terminus aufweist.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt:
a) 10-30 % Mono-Hexose-"177(-2AS)-Variante"
b) 5- 5 % nicht-glykosyliertes G-CSF (Δ0) c) 10-30 % Di-Hexose-"177(-2AS)-Variante"
d) 20-40 % Mono-Hexose-G-CSF (Δ0)
e) 10-30 % Di-Hexose-G-C3F (ΔO).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die G-CSF-Variante eine Glykosylierungs-Variante, der die humane G-CSF-Sequenz zugrundeliegt (Nagata et al., 1986). Weiterhin bevorzugt ist, daß die Hexose Mannose ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Bestandteile der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung in aufgereinigter Form bereit. Die Erfindung stellt somit G-CSF-Varianten zur Verfügung, die ausgewählt sind aus der Mono-Hexose-"177(-2AS)-Variante", Di-Hexose-"177(-2AS)-Variante", Mono- Hexose-G-CSF (Δ0) und Di-Hexose-G-CSF (Δ0) umfassenden Gruppe. Erfindungsgemäß werden weiterhin G-CSF-Varianten zur Verfügung gestellt, die sich von der jeweiligen ursprünglichen Sequenz, z.B. der Sequenz von humanem G-CSF, durch Addition, Substitution, Deletion, Insertion, Inversion und/oder Deletion von mindestens einer und höchstens 15 Aminosäuren unterscheiden. Bevorzugt sind Hansenu- ja-spezifisch glykosylierte G-CSF-Moleküle, die N-terminale Deletionen von einer oder mehreren, maximal 15 Aminosäuren aufweisen.
Die einzelnen G-CSF-Varianten können durch rekombinante Expression in einem H.- polymorpha-Stamm erhalten werden. Weiterhin können die einzelnen Varianten durch chromatographische Trennung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erhalten werden, wobei hier in dem Fachmann bekannter Weise beispielsweise Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von hydrophoben oder Umkehrphasen-Oberflächen durchgeführt werden kann. Weiterhin können zur Trennung der G-CSF-Varianten spezifische Antikörper im Rahmen einer Immunaffinität- schromatographie verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit G-CSF-Aktivität ist erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte:
a) Transformieren eines Hansenula-polymorpha-Stammes mit einem G-CSF- Expressionsvektor;
b) Kultivieren der transformierten Zellen unter zur Expression von G-CSF geeigneten
Bedingungen;
c) Abtrennen des G-CSF-Varianten enthaltenden Kulturüberstandes von den Zellen oder Lysieren der G-CSF-Varianten enthaltenden Zellen; und
d) Aufreinigen der exprimierten G-CSF-Varianten.
Das Abtrennen des G-CSF-Varianten enthaltenden Kulturüberstandes bei Sekretion des Expressionsproduktes in den Überstand kann beispielsweise durch Zentrifugati- on erfolgen. Verbleibt das Expressionsprodukt intrazellulär, so können die exprimierten G-CSF-Varianten durch Zell-Lyse mit Hilfe von ionischen oder nicht-ionischen Detergenzien oder unter Verwendung von Zellzertrümmerungsverfahren, wie French-press oder Zellhomogenisatoren erhalten werden. Das Aufreinigen der im Kulturüberstand bzw. im Zellysat vorhandenen exprimierten G-CSF-Varianten kann durch sämtliche dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, wobei chromatographische Verfahren bevorzugt sind.
Bevorzugt umfaßt das Aufreinigen der exprimierten G-CSF-Varianten die Schritte:
a) Filtration des Kulturüberstandes oder Lysates;
b) Versetzen des Filtrates mit einer zur Fällung von G-CSF-Varianten ausreichenden Menge von Ammoniumsulfat;
c) Resuspendieren des Niederschlages;
d) Abtrennen der G-CSF-Varianten durch Gelfiltrationschromatographie; und
e) Sammeln und gegebenenfalls Vereinigen der die G-CSF-Varianten enthaltenden Fraktionen.
Die Filtration kann mittels kommerziell erhältlicher Filter durchgeführt werden, wobei die Sterilfiltration durch 0,22 μm Filter bevorzugt ist, um ein Verstopfen der Chroma-
tographie-Säulen zu vermeiden. Die zur Fällung von G-CSF-Varianten ausreichende
Menge von Ammoniumsulfat liegt im Bereich von 400 g/l Ammoniumsuifat. Das Ammoniumsulfat wird vorzugsweise bei 4°C unter Rühren hinzugefügt. Der Gelfiltra- tionschromatographieschritt wird vorzugsweise auf einer Sephacryl-S 300 HR.Säule der Firma Amersham Pharmacia Biotech durchgeführt, wobei jedoch sämtliche Gelfü- trationsmaterialien verwendet werden können, sofern sie die gewünschte Trennleistung ergeben. Die Gelfiltration wird vorzugsweise im physiologischen pH-Bereich mit Hilfe von PBS-Puffer durchgeführt.
Die Fraktionen können beispielsweise durch Westem-Blot-Analyse auf ihren Gehalt an G-CSF-Varianten mit Hilfe von G-CSF-spezifischen Antikörpern bestimmt werden. Die notwendigen Versuchsbedingungen sind hierbei Stand der Technik bzw. erfordern allenfalls routinemäßige Anpassungen.
Das Verfahren zur Bereitstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann ferner die Verwendung von Kationenaustauscher-, Hochleistungsflüssigkeitsund/oder Immunaffinitätschromatographie umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die G-CSF-Variante eine humane G-CSF- Variante. Geeignete Vektoren, Wirtszellen und Transformationsverfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail in einem nachstehenden Abschnitt ausgeführt. Vorzugsweise ist der Hansenula-polymorpha-Stamm der Hansenula-polymorpha- Stamm RB11. Der verwendete Expressionvektor ist vorzugsweise der Vektor pFPMTaG-CSF.
Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für einen wie oben beschriebenen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF kodieren. Dabei umfaßt ein solches Nukleinsäuremolekül Nukleinsäuresequenzen, die für ein Protein mit einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:4 dargestellten Aminosäuresequenzen kodieren und schließt insbesondere eine der in SEQ ID NR: 5 bis SEQ ID NR: 8 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ein, sowie Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleinsäureaustausch von einer dieser Nukleinsäuresequenzen ableiten und für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSF kodieren. Des weite-
ren sind ebenfalls Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die mit einer zu den oben aufgezählten Sequenzen komplementären Sequenz hybridisieren können. Diese Varianten der Nukleinsäuremoleküle, die für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodieren, sollen unter Bedingungen moderater Stringenz, bevorzugt aber untar strin- genten Bedingungen (siehe Maniatis et al., 1989) mit einer zu den in SEQ ID NR:5 bis SEQ ID NR:8 dargestellten Sequenzen komplementären Sequenz hybridisieren können. Unter moderater Stringenz ist z.B. eine Hybridisierung bei 42°C in 50% Formamid und anschließenden wenig stringenten Waschschritten zu verstehen, wobei die Waschschritte bei einer Temperatur von weniger als 12°C bis 20°C unter der errechneten Tm des zu untersuchenden Hybridmoleküls durchgeführt werden. Strin- gente Bedingungen bedeuten eine Hybridisierung in 5 x SSC bei 65°C. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin jede zu den vorgenannten Sequenzen komplementäre Sequenz, deren Gegenstrang für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G- CSF's kodiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül weiterhin für eine funktioneile Leader-Sequenz. Sekretorische Proteine werden aus einer Vorstufe prozessiert, die eine N-terminale Leader- Sequenz für den Import eines Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat enthält. Derartige Leader-Sequenzen können aus Prä-Sequenzen oder Prä-ProSequenzen bestehen. Prä-Sequenzen dirigieren ein Translationsprodukt in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) und werden beim Eintritt in das ER proteolytisch entfernt. Bei Prä-Pro-Sequenzen erfolgt eine zweistufige Reifung des Proteins. Nach dem Eintritt in das ER wird wie im ersten Typus die Prä-Sequenz entfernt. Das verbleibende Pro-Protein erfährt im Golgi-Apparat der Zelle eine zusätzliche proteolytische Reifung, bei der die noch vorhandene Pro-Sequenz mit Hilfe einer dibasischen Endopeptidase abgespalten wird. Mit Hilfe von Leader- Sequenzen, die diesen beiden Grundtypen entsprechen, können heterologe Proteine aus Wirtszellen sezemiert werden.
Ein besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung enthält als funktioneile Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des hyperglykämischen Crustaceen- Hormons (CHH) aus Carcinus maenas oder ein Derivat derselben. So konnte von Weydemann und Kollegen bereits gezeigt werden, daß die Fusion dieser Prä-Pro-
Sequenz mit der für Hirudin kodierenden Sequenz zu einer effizienten Sezemierung des reifen Hirudinproteins mir korrekt prozessiertem N-Terminus führt (Weydemann et al., 1995). Die Fusion der für die CHH-Leader-Sequenz kodierenden DNA mit einer der in den SEQ ID NR: 5 bsi 8 dargestellten Nukleinsäuresequenzen wird daher ebenfalls zur korrekten Abspaltung der CHH-Prä-Pro-Sequenz führen.
In einer überaus bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül als Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des Mating Factors a (MFa1 ) aus Hefe. Eine zur Expression in Hefewirtszellen etablierte Konstruktion kodiert für ein Fusionsprotein, welches die Präpro-Sequenz des Pheromons MFa1 enthält (Brake et al., 1984). Aminosäuren in der Umgebung der neu entstandenen Fusionsstelle können dabei die Position der Prozessierungstelle und damit die N- terminale Sequenz des durch Proteolyse entstandenen reifen Proteins beeinflussen. Von Bedeutung ist hierbei insbesondere das Vorhandensein von Pro-Resten (Zurek et al., 1996).
Ein weiteres besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß es die natürliche MFa1 Sequenz in funktioneller Verbindung mit der für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierenden natürlichen Sequenz, einschließlich der Codons für die beiden N-terminalen Aminosäuren von G-CSF, umfaßt. Dabei wird durch Verwendung der natürlichen MF 1 -Sequenz ein primäres Translationsprodukt erzeugt, das aufgrund seiner Aminosäuresequenz im Bereich der Fusionsstelle zwischen MFα-1 Leader-Sequenz und der für den rekombinanten Wachstumsfaktor kodierenden Sequenz von einer Protease zwischen Aminosäure +2 und +3 der nicht verkürzten Aminosäuresequenz des Wachstumsfaktor gespalten wird. Die Prozessierung des Translationsproduktes führt entsprechend zu einer Verkürzung des N-Terminus um zwei Aminosäuren. Der Vorteil der Nutzung eines geeigneten Sekretions-Leaders besteht damit neben der Einschleusung des Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat in der Generierung eines definierten N- Terminus in dem ausgewählten Organismus.
Ein solches bevorzugtes Nukleinsäuremolekül kodiert z.B für die hier in NR:1 oder SEQ ID NR:2 dargestellte Aminosäuresequenz. In weiteren Ausführungsformen umfaßt sie die in SEQ ID NR:9 („natürlicher Leader + 174 x 3 Variante (incl. 6 Nu)")
oder SEQ ID NR:10 („natürlicher Leader + 177 x 3 Variante (incl. 6 Nu)") dargestellte
Aminosäurequenz oder eine sich davon durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch ableitende Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSFs kodiert. Weiterhin kann ein solches Nukleinsäuremolekül eine Sequenz enthalten, die mit einer der zu den oben aufgeführten Nukleinsäuresequenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann bzw. zu einer der oben genannten Sequenzen komplementär ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine in der 3'-Region modifizierte MFa1 Sequenz und weiterhin die für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierende Sequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:5 oder SEQ ID NR:6 oder eine davon abgeleitete Sequenz bevorzugt ist. Um eine proteolytische Spaltung unmittelbar am C-Terminus des MFα-1-Peptids zu erzielen, muß die Aminosäuresequenz des MFa1 Leaders in der Nähe der Prozessierungsstelle verändert werden. Veränderungen dieser Art sind in früheren MFa1/G-CSF Fusionen beschrieben (z.B. U.S. Patent 5,055,555). Dahingegen führt die Verwendung der unveränderten MFa1 Leader Sequenz wie oben beschrieben zur proteolytischen Spaltung zwischen den Aminosäuren +2 und +3 der Sequenz des vollständigen reifen Proteins, d.h. vor Position +1 eines erfindungsgemäßen Proteins.
Außerdem umfaßt die vorliegende Erfindung einen Vektor, der ein wie oben beschriebenes Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon sowie einen damit funktionell verbundenen Promotor und ein mit der Nukleinsäure funktionell verbundenes Terminationssignal umfaßt.
Ein solcher Vektor enthält in einer bevorzugten Ausführungsform einen Promotor und ein Terminationssignal, die jeweils für eine vorgesehene Wirtszelle spezifisch sind. Dabei bedeutet spezifisch, daß der Promotor und das Terminationssignal aus dem für die Expression verwendeten Wirtsorganismus stammen. Ein beispielhafter Expressionsvektor für Hefe, wie der in der vorliegenden Erfindung genutzte, umfaßt eine Expressionskassette mit den folgenden funktionellen Elementen in der angegebenen Reihenfolge : - FMD-Promotor
- heterologe kodierende Sequenz
- MOX-Terminator
Die einzelnen Elemente eines solchen bevorzugten Vektors sind in der Literatur gut beschrieben, z.B. in Gellissen und Melber, 1996; Hollenberg und Gellissen, 1997.
Darüber hinaus enthält ein solcher Vektor Selektionssequenzen und eine HARS (Hansenula autonomously replicating sequence) für eine Propagierung und Selektion in einem geeigneten Hefewirt, einen bakteriellen Replikationsursprung und ein für ein Bakterium geeignetes Selektionsgen für die Vermehrung und Selektion z.B. in einem E.coli Wirt (Gellissen und Hollenberg, 1997; Hollenberg und Gellissen, 1997). Ein Expressionsvektor für die erfindungsgemäße Produktion von G-CSF wurde mit Hilfe von allgemein bekannten Methoden und Verfahren hergestellt, z.B. wie in den laufend aktualisierten Protokollen zur Molekularbiologie beschrieben (Ausübet et al., 1987). Die folgenden Komponenten wurden genutzt: Eine Gensequenz, die für die Aminosäuresequenz des reifen G-CSF kodiert, wurde auf Grundlage der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986) synthetisiert und an ein geeignetes DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für die Prä-ProSequenz des Hefepheromons MFa1 fusioniert. Erfindungsgemäß wurde bewußt ein Element mit unveränderter Aminosäuresequenz eingesetzt (Brake et al., 1984). Die Nutzung eines derartigen Elementes resultiert in einer Prozessierung zwischen Position +2 und +3 und damit in der N-terminalen Verkürzung der G-CSF Sequenz um zwei Aminosäuren (siehe dazu Beispiel 5). Die fusionierte DNA-Sequenz wurde als EcoRI/BamHI Fragment in den Hansenula polvmorpha Expressionsvektor pFPMT121 integriert. In diesem Vektor dient ein FMD-Promotor Element zur Kontrolle der Fremdgenexpression. Der Vektor pFPMT121 und abgeleitete Varianten sind in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben (u.a. Gellissen und Hollenberg, 1997). Die DNA-Sequenzen für die erzeugte MFa1/G-CSF Fusion und der erzeugte Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF in Hansenula polvmorpha sind in den Abbildungen 1 und 2 wiedergegeben (Abb. 1 zeigt die in SEQ ID NR. 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz in Verbindung mit dem Initiationscodon "ATG" sowie die entsprechende Aminosäuresequenz).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der oben beschriebene Vektor ein RNA-Vektor. Auf diese Weise können verschiedene Virus- Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, für die Transfektion von Säugerzellen genutzt werden. DNA-Vektoren sind jedoch ebenfalls umfaßt
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Wirtszellen, die einen der oben beschriebenen Vektoren enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine prokaryotische Wirtszelle. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sie eine Wirtszelle der Gattung Escherichia oder Bacillus ist. Eine solche Wirtszelle ist z.B. E.coli oder B. subtilis.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle. Dabei ist die Wirtszelle bevorzugt eine Säugerzelle, z.B. CHO, HeLa, WISH, COS oder NIH-Zellen, eine Pflanzenzelle, eine Hefezelle oder Pilzzelle. Unter den verschiedenen mikrobiellen Expressionssystemen bieten Hefearten verschiedene Vorteile für industrielle Applikationen. Sie sind in der Lage, rekombinante Produkte effizient zu sezemieren und einem generellen eukaryotischen Muster entsprechend zu prozessieren und modifizieren.
Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, die eine methylothrophe Hefezelle ist. Die methylotrophe Hefe Hansenula polvmorpha wurde als Expressionssystem für heterologe Proteine entwickelt (Roggenkamp et al.,1986; EP 0173378), wobei sich dieser Organismus insbesondere für die Herstellung pharmazeutischer Produkte eignet (Gellissen und Melber, 1996). Die Komponenten des Expressionssystems sind Gegenstand verschiedener Publikationen und Patentanmeldungen. So ist zum Beispiel die Anwendung des FMD-Promotors (Formiatdehydrogenase-Promotor) als Kontrollelement für heterologe Genexpression in EP 0299108 niedergelegt. Ein Plasmid mit einem solchen Kontrollelement dient in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF. Nach Aufnahme einer heterologen DNA wird diese stabil in das Hefegenom integriert. Als fakultativ methylotrophe Hefe ist diese Spezies in der Lage, Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen; andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Glyzerin und Glukose. Bei Zugabe von Methanol oder bei der Zugabe von Glyzerin
oder Glukose in definierten Konzentrationen werden Schlüsselenzyme des Methanolstoffwechsels in hohen Konzentrationen produziert. Die Produktionskontrolle erfolgt auf transkriptioneller Ebene. Um die Sekretion eines heterologen Produktes zu ermöglichen, können unterschiedliche Elemente genutzt werden. So kann z.B, durch Fusion einer vom Hefepheromon MFa1 abgeleiteten Leader-Sequenz und der DNA- Sequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, ein Translationsprodukt erhalten werden, das nach Einschleusen in den sekretorischen Apparat in prozessierter Form ins Zellmedium sezemiert wird (Brake et al, 1984).
Als Wirtszellen bevorzugte methylotrophe Hefezellen sind ausgewählt aus Hansenu- ia, Candida, Pichia und Torulopis. Der Terminus „Hansenula" soll so verstanden werden, daß er alle Spezies einschließt, die die gleiche oder eine ähnliche taxono- mische Einord-nung mit einer methylotrophen Hansenula Hefe teilen. Dies schließt die Organismen Hansenula polvmorpha, Hansenula capsulata, Hansenula saturnus und Hansenula winqei ein, ohne auf sie beschränkt zu sein.
Weitere bevorzugte Wirtszellen, die nicht zu den methylothrophen Hefen gezählt werden, sind aus Saccharomyces cerevisiae, Kluvveromvces lactis, Schizosaccha- romvces pombe, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis und Arxula ade- novorans ausgewählt. Zur Expression besagter G-CSF-Molekülen bestens geeignet sind ferner Insektenzellen. Filamentöse Piizzellen sind ebenfalls bevorzugte Wirtszellen, wobei Asperαillus niqer, Asperqillus oryzae, Neurospora crassa, Acremonium chrvsogenum und Sordaria macrospora besonders bevorzugt sind.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Wirtszelle wie oben beschrieben unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird und der Wachstumsfaktor G-CSF entweder aus dem Medium oder aus der Zelle gewonnen wird. Die dafür geeigneten Verfahren, die dem Zellaufschluß und der Reinigung dienen, sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß der Erfindung wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF zur Mobilisierung von peripheren Blutstammzellen verwendet. Dabei ist unter „Mobilisierung von
peripheren Blutstammzeilen" eine Steigerung des Blutvorläuferzeilspiegels im peri- pherem Blut zu verstehen.
Des weiteren wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF erfindungsgemäß zur Förderung der Proliferation von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen eingesetzt.
Darüber hinaus ist die Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektionen und nach Knochenmarkstransplantationen von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt.
Das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül, das für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodiert bzw. ein oben beschriebener Vektor, der ein solches Nukleinsäuremolekül enthält, wird zur in vitro-Transfektion von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen verwendet.
Ein solches Nukleinsäuremolekül wird gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektionen und nach Knochenmarktransplantationen eingesetzt.
Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF wie oben beschrieben umfaßt und auf eine weitere pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül oder mindestens einen der Vektoren wie oben dargestellt enthält.
Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen dazu dienen, die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung vollständiger zu beschreiben und zu erläutern. Damit wird die Absicht verfolgt, Hansenula polvmorpha als beispielhaften Organismus des Genus Hansenula und anderer methylotropher Hefen darzustellen. Darüber hinaus soll auch die Auswahl der genutzten genetischen Komponenten und DNA- Sequenzen der Erläuterung des Grundprinzips der Erfindung dienen. In diesem Sinne werden die aufgeführten Beispiele als nicht-beschränkend aufgefaßt.
Abbildungen:
Abb. 1 zeigt die Gensequenz für die MFα1 /G-CSF Fusion und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz.
Abb. 2 zeigt den Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF entsprechend der vorliegenden Erfindung.
Abb. 3 zeigt einen Southern Blot der genomischen DNA des rekombinanten Stammes Hansenula polvmorpha 27-1 , der mit dem Vektor pFPMTaG-CSF transformiert worden war. Die DNA wurde mit Xhol/Hindlll geschnitten, in definierten Verdünnungen elektrophoretisch getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einer markierten FMD-Promotor Sonde hybridisiert. Das Hybridisationsmuster besteht aus einem Signal bei 1 ,2 Kb für die genuine Sequenz und einem Signal bei 1 ,88 Kb für die heterologe Fusion. Anhand der Signalstärke läßt sich eine Kopienzahl von 40 Kopien abschätzen.
Spur 1 Größenstandard, Spur 2 Plasmid DNA, Spur 3 nicht-transformierter Ausgangsstamm RB11 , Spuren 4 -7 Stamm 27-1 (Verdünnungen 1 :40; 1 :20, 1 :10 und unverdünnt).
Abb. 4 zeigt die SDS-elektrophoretische Charakterisierung (15 %ige Gele). Die beiden stark gefärbten Banden wurden immunologisch als G-CSF Moleküle identifiziert. Beide Proteine weisen einen identischen N-Terminus auf.
Abb. 5 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Nabelschnurblutzellen nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten.
Abb. 6 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Blutzellen eines an einem Myelom erkrankten Patienten nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten.
Abb. 7 zeigt die massenspektromethsche Analyse der durch rekombinante Expression in H.-polymorpha erhaltenen G-CSF-Varianten. Auf der Ordinate ist die relative Signalintensität und auf der Abszisse das Molekulargewicht in Dalton angegeben.
Beispiel 1
Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors
Konstruktion eines H. polymorpha-Expressionsvektors für die Sekretion von G-CSF: Ein DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für das reife G-CSF wurde entsprechend der publizierten Sequenz synthetisiert (Abb. 1 , Nukleotid 256 ff). Ein EcoRI/Hindlll Fragment mit der kodierenden Sequenz für die MFa1-Leadersequenz wurde zusammen mit dem G-CSF-Fragment in einen mit EcoRI/BamHI geöffneten M13mp18 Vektor ligiert. Das neu enstandene ligierte Fragment enthält eine MFa1- Leader/G-SCF Fusion als EcoRI/BamHI Fragment. Durch Mutagenese wurde die Fusionsstelle zwischen Leader und reifem G-CSF dahingehend verändert, daß die ursprüngliche Leader-Sequenz einschließlich der Lys-Arg-Prozessierungstelle rekonstituiert wurde. An diese Prozessierungsstelle schließt sich die Sequenz des reifen G-CSF ohne N-terminales Methionin an. Die mutagenisierte Fusionssequenz wurde als EcoRI/BamHI-Fragment in den mit diesen Restriktionsenzymen geöffneten Hansenula polymorpha Expressionsvektor pFPMT121 inseriert. Die inserierte Sequenz für MFa1/G-CSF ist in Abb. 1 und der entstandene Expressionsvektor pFPMTaG-CSF ist in der Abb. 2 wiedergegeben.
Beispiel 2
Transformation von Hansenula polvmorpha:
Der oben beschriebene Vektor diente zur Transformation des Hansenula polvmorpha Stammes RB11 , der eine Defizienz in der Orotidin 5'-Phosphat-Dehydrogenase (ura3~) aufweist. Kompetente Zellen dieses Stammes wurden nach etablierten Methoden hergestellt (Dohmen et al., 1991 : Yeast 7:691 ): 10 ml Hefemedium (YPD;
Gemisch aus Hefeextrakt, Pepton und Glucose) wurden mit Zellen inokuliert und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Diese Kultur wurde anschließend zur Beimpfung von 200 ml des beschriebenen Mediums benutzt. Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 0,6 bis 1 bei OD600 kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation sedimen- tiert, bei Raumtemperatur mit 100 ml einer Lösung A gewaschen (1 M Sorbitol, 10 mM Bicine pH 8,35, 3 % (w/v) Ethylenglycol) und in 4 ml dieser Lösung resuspendiert. 11 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde zugegeben und die kompetenten Zellen in 200 μl Aliquots aufgeteilt. Sie wurden entweder sofort genutzt oder bis zur Nutzung bei -70°C gelagert.
Für die Transformation wurden 10 μg der Plasmid DNA (pFPMTaG-CSF) und 100 μl kaltes 0,1 M CaCI2zu gefrorenen Zellaliquots gegeben. Nach schnellem Auftauen wurde 1 ml einer Lösung B zugegeben (40 % (w/v) PEG 3000, 200 mM Bicine pH 8,35) und die Transformationsansätze bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml einer Lösung C (150 mM NaCI in 10 mM Bicine pH 8,35) gewaschen und in 200 μl resuspendiert. Diese Suspension wurde auf Selektivnährböden (Agar in YNB-Glucose (yeast nitrogen base) ausplattiert. Die Ausstriche wurden bei 37 °C für 3 bis 5 Tage inkubiert.
Beispiel 3
Erzeugung mitotisch stabiler Stämme:
Kolonien der Transfomationsausstriche wurden zur Inokulation von 3 ml YNB- Glukose benutzt und bei 37 °C kultiviert. Ein 50 μl Aliquot der ausgewachsenen Kultur wurde zur Inokulation weiterer 3 ml YNB genutzt. Dieser Vorgang wurde für ca. 60 Wachstumsgenerationen wiederholt. Während dieser Passagierung wurde die Plasmid-DNA in das Genom der Hefe integriert. Anschließend wurden 3 ml des nicht-selektiven Mediums (YPD) beimpft und bei 37 °C inkubiert.
Beispiel 4
Herstellung von rekombinanten Stämmen der Art Hansenula polvmorpha mit der Fähigkeit, G-CSF zu sezemieren, und Identifizierung rekombinanter Stämme, die G- CSF sezemieren:
Die Herstellung von rekombinanten, G-CSF produzierenden Hefestämmen der Art Hansenula polvmorpha erfolgte nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode durch
Transformation des Wirtsstammes RB11 mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid pFPMTaG-CSF. Mitotisch stabile Stämme wurden wie beschrieben durch Passagieren in selektivem Medium erzeugt. Die generierten Transformanden wurden im 3 ml Maßstab vergleichend kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in einem Medium, dem Glyzerin in einer Konzentration von 1 ,5 % (w/v) zugesetzt war. Der Verbrauch des Glyzerins durch die wachsende Kultur resultierte in Derepressionsbedingungen für den Promotor. Unter diesen Bedingungen läßt sich die Expression des unter der Kontrolle des FMD-Promotors stehenden Fremdgens nach zwei bis drei Tagen nachweisen. Dabei wurden die Zellen nach zweitägiger Kultur in diesem Medium bei 37 °C abzentrifugiert und der Überstand auf das Vorhandensein von G-CSF untersucht. Der Nachweis erfolgte durch einen direkten ELISA, bei dem ein käuflich erhältliches Anti-G-CSF-Serum aus Ziegenblut verwendet wurde. Der ELISA erfolgte in Polystyrolmikrotiterplatten (F96 Maxisorp, Nunc-Immuno Plate) nach etablierten Methoden. Der Nachweis erfolgte über die an einen biotinylierten Zweitantikörper im Laufe der Nachweisschritte gebundene Peroxidaseaktivität. Das Enzym katalysiert bei Zugabe eines Substrates eine grüne Farbentwicklung, die bei 405 nm photometrisch gemessen werden kann. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich mit kalibrierten G-CSF Mengenstandards. Durch diesen vergleichenden quantitativen Nachweis des G-CSF in den Kulturüberständen konnten Kandidaten mit überdurchschnittlichen Produktionseigenschaften identifiziert werden.
Beispiel 5
Bestimmung der Kopienzahl in ausgewählten Stämmen:
Die Kopienzahl der integrierten heterologen DNA wurde durch Southern Blot Hybridisierung bestimmt. Dazu wurde die genomische DNA ausgesuchter Hefestämme mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol geschnitten, nach elektrophoretischer Trennung auf Nitrozellulosefilter übertragen und mit einer markierten FMD-Promotor Sonde hybridisiert. Die Wahl der Restriktionsenzyme und die Festlegung der Hybri- disierungssonde in der angegebenen Weise resultiert in zwei Hybridisierungssigna- len für das genuine FMD-Gen und die heterologe Fusion. Durch Vergleich der Signalstärken dieser zwei Signale kann die Kopienzahl der rekombinanten DNA festgelegt werden. Die Kopienzahl der beiden als Beispiele dienenden Stämme mit den Seriennummern 12-3 und 27-1 wurde mit jeweils 40 bestimmt (siehe Abb. 3).
Beispiel 6
Kultivierung:
Die Kultivierung der G-CSF-sezemierenden Hansenula-Stämme erfolgte im 21 Ansatzverfahren in einem synthetischen Medium, supplementiert mit Glyzerin als Kohlenstoffquelle. Die Fermentation erfolgte bei pH 5,5 - 3,2.
Beispiel 7
Isolierung des sezemierten G-CSF:
Die Isolierung des sezemierten G-CSF erfolgte mit Hilfe der nachfolgenden Aufreinigungsschritte. Der Fermentationsüberstand wurde durch Zenthfugation der Suspension und anschließende Sterilfiltration gewonnen. Daraufhin erfolgte eine Konzentrierung und Entsalzung durch Querstromfiltration mit Hilfe einer 10 kDa Polyethersul- fonmembran bei 4-8 °C. Das so gewonnene Material wurde 1 :1 mit einem Puffer A verdünnt (20 mM HOAc/KOH pH 5,2, 0,5 mM EDTA, 02 % (w/v) Tween 20), mit KOH auf pH 5,2 eingestellt und auf einen mit diesem Puffer äquilibrierten Kationenaustauscher gegeben (Merck Fractogel EMD-SO3" 650 M; 1 x 7 cm). Die aufgetragene Proteinmenge war 4,5 mg nach Bradford, die Leitfähigkeit 2,1 mS/cm. Die Elution des gebundenen Proteinmaterials erfolgte mit Hilfe eines Salzgradienten mit 10 % bis 100 % Anteil eines Puffers B (Puffer B entspricht Puffer A mit 0,5 M NaCI). Die Produktfraktionen wurden mit Hilfe eines 10 kDa Filters aufkonzentriert und durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Sephadex G 75 Matrix eluiert. Der G-CSF befand sich unter diesen Bedingungen im Ausschlußvolumen.
Das so gewonnene Präparat lag in einer Konzentration von 50 μg/ml vor. Eine elek- trophoretische Analyse mit Hilfe von 15 %igen SDS-PAGE Gelen nach Laemmli belegte das Vorhandensein der zwei bereits beschriebenen G-CSF Moleküle von 18 und 20 kDa.
Beispiel 8
Bestimmung der biologischen Aktivität des rekombinanten G-CSF aus Hansenula polvmorpha
Das rekombinante Produkt wurde in einem CD34-Synthesetest nach Sutherland et al. (Sutherland et al., 1994) durchflußzytometrisch in Vorläuferzellpräparaten auf seine biologische Aktivität im Vergleich mit einem in Bakterien hergestellten G-CSF- Isolat (Filgrastim) getestet. Als Testzellen dienten Zellen aus potentiell zur autolog bzw. allogen zur Knochenmarktransplantation vorgesehenen Vorläuferzellpräparaten. Eingesetzt wurden Nabelschnurblutzellen aus Plazentarestblut bzw. mononu- kleäre Zellen aus autologen Stammzellapheresaten von zytotoxisch mobilisierten Myelompatienten (jeweils drei verschiedene Chargen). Die Zellproben wurden bei unterschiedlichen G-CSF Konzentrationen 30 Minuten inkubiert, mit monoklonalen fluoreszierenden Antikörpern markiert, fixiert und durchflußzytometrisch analysiert. Dabei wurden G-CSF Konzentrationen eingesetzt, die der Serumkonzentration bei der klinischen Anwendung entsprechen (Fischer et al., 1994). Nach Inkubation mit rekombinantem G-CSF aus Hansenula polvmorpha wiesen Zellen aus Nabelschnurblut eine sechsfach höhere Syntheserate an CD34 Protein auf als der Kontroll-G- CSF aus E.coli (Filgrastim, Amgen Corporation, Thousand Oaks, CA). Bei Zellen aus Apheresaten von Myelompatienten wurde eine 8,2-fach höhere Aktivität gegenüber dem E.coli Isolat gefunden. In Vorversuchen wurde demgegenüber kein Unterschied zwischen dem E.coli Isolat und einem rekombinanten glykosylierten Produkt aus Hamsterzellen (Lenograstim, Rhöne-Poulenc Rorer; Frankreich) nachgewiesen.
Beispiel 9
Charakterisierung des sezemierten G-CSF:
Die in Beispiel 3 identifizierten Stämme wurden im 2 I Maßstab nach dem bereits beschriebenen Verfahren fermentiert und das sezernierte Produkt wurde nach verschiedenen Methoden charakterisiert. Die apparente relative Masse wurde durch SDS-PAGE nach Schäger und von Jagow mit 19,5 kDa bestimmt. In der SDS-PAGE nach Laemmli traten zwei monomere Formen von 18 und 20 kDa auf, darüber hinaus multimere Formen (siehe Abb. 4). Die 18 kDa Form bildete in der vergleichenden SDS-PAGE eine Bande auf derselben Höhe wie G-SCF aus E.coli. Die 18 und die
20 kDa Form der SDS-PAGE Auftrennung nach Laemmli und die 19,5 kDa Form der SDS-PAGE nach Schägger und vo Jagow wurden mit Hilfe präparativer Gele aufgetrennt, auf PVDF Membranen transferiert und N-terminal ansequenziert. Für alle Isolate wurde übereinstimmend der folgende N-Terminus bestimmt:
Referenzsequenz
(natürliche Sequenz): TPLGP ASSLP QSFLL KCLEQ VRKIQ GD
Nachgewiesene
Sequenzen: LGP ASSLP QSFLL K?LEQ VRKIQ GD
Das sezernierte Produkt liegt nicht in monomerer, sondern in multimerer Form vor. Durch ausschlußchromatographische Verfahren konnte bestimmt werden, daß die relative Masse des nativen Produktes größer als 75 kDa ist. Das größere Produkt ist nicht N-glykosyliert. Eine O-Glycosylierung konnte durch PAS Färbung (periodic acid Schiff reagent-Färbung) von SDS-Polyacrylamidgelen sowie durch Glycoblotting nicht detektiert werden.
Beispiel 10
Massenspektromethsche Analyse der sezemierten G-CSF-Varianten:
Die in Beispiel 3 identifizierten Stämme wurden nach dem bereits beschriebenen Verfahren im 1 ,5 I Maßstab fermentiert und das sezernierte G-CSF mit Hilfe der nachfolgenden Aufreinigungsschritte isoliert. Der Fermentationsüberstand wurde durch Zentrifugation der Suspension bei 4 °C über 20 Minuten bei 10.000 U/min und anschließender Sterilfiltration mit Hilfe von 0,22 μm Filtern gewonnen. Daraufhin wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat eine fraktionierte Fällung durchgeführt, wobei die relevante Fraktion bei einer Konzentration von 400 g/l Ammoniumsulfat erhalten wurde. Der Ammoniumsulfatniederschlag, der einem Liter Kulturüberstand entsprach, wurde in 50 ml 10 mM Tris-HCI-Puffer; pH-Wert 7,5 resuspendiert. Die hG-CSF enthaltenende Lösung wurde auf eine Gelfiltrationssäule Sephacryl S 300 HR (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen und als Elutionspuffer 0,5 x PBS- Puffer; pH-Wert 7,5 verwendet. Es wurden 16 Fraktionen im Bereich von 2,5 bis 11 ml erhalten. Die Fraktionen 6 bis 9 wurden vereinigt und zeigten bei der Western-
Blot-Analyse ein stark positives Signal. Gemäß Bradford-Bestimmung wies der Pool eine Konzentration von 0,115 mg Protein/ml auf.
50 μl dieses Pools wurden zur massenspektromethschen Untersuchung verwendet. Die Messung wurde an einem LCQ-Massenspektrometer (Finnegan, USA) durchgeführt, wobei die Probe durch Elektro-Sprüh-Ionisierung (Electro Spray) der Untersuchung zugänglich gemacht wurde. Das Ergebnis der Messung ist in Abbildung 7 gezeigt.
Tabelle 1
Legende: Hex = Hexose
NAzHex = N-acetylhexose
- TP = Δ2 (- Thr Pro)
Tabelle 1 zeigt die Zuordnung der gefundenen Molekulargewichte (MG(gef.)) zu den in der Probe vorkommenden G-CSF-Varianten, wobei weiterhin das erwartete Molekulargewicht (MG(soll)) und die Abweichung bzgl. des Molekulargewichtes (Δ Dalton) angegeben sind. Es ergibt sich somit, daß die Probe eine verschiedene G-CSF- Varianten enthaltende Zusammensetzung darstellt, wobei die dominanten Formen: Mono-Hexose-"177(-2AS)-Variante", nicht-glykosyiiertes G-CSF, Di-Hexose-"177(- 2AS)-Variante", Mono-Hexose-G-CSF und Di-Hexose-G-CSF darstellen.
Unter Berücksichtigung der Signalhöhe und -breite läßt sich eine relative Quantifizierung der G-CSF-Varianten in der Probe durchführen. Somit umfaßt die Zusammensetzung (die nachstehend angegebenen Prozentzahlend sind als Massenprozentan- gaben (w/w)):
10-30 % Mono-Hexose-„177(-2AS)Variante" 5-15 % nicht-glykosyliertes G-CSF (Δ0) 10-30 % Di-Hexose-„177(-2AS)Vahante" 20-40 % Mono-Hexose-G-CSF (Δ0) 10-30 % Di-Hexose-G-CSF (Δ0).
Zitierte Literatur:
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