DD207732A5 - Verfahren zur herstellung eines polypeptids, das im wesentlichen aus der aminosaeuresequenz eines tierischen interferonsbesteht - Google Patents

Abstract

ES WIRD EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON ZUSAMMENSETZUNGEN, DIE IM WESENTLICHEN AUS EINEM POLYPEPTID MIT DER AMINOSAEURESEQUENZ EINES TIERISCHEN INTERFERONS, Z.B. RINDER-INTERFERON, BESTEHEN, DURCH REKOMBINANTE DNA-TECHNOLOGIE, EINSCHLIESSLICH DER NUTZUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN, BESCHRIEBEN.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung: . ;

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der rekombinanten DNA-Technik, Mittel und Verfahren zur Anwendung dieser Technik bei der Auffindung einer breiten Klasse von tierischen Interferonen sowie die Herstellung dieser Interferone und verschiedene Produkte dieses Herstellungsverfahrens und die Verwendung dieser Produkte. ,

Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung und Identifizierung von tierische Interferone kodierenden DNA-Sequenzen und den Aufbau von/rekombinanten DNA-Expressionsträgern, die DNA-Sequenzen enthalten, die funktionell mif expressionsbewirkenden Promotorseqüenzen und mit den so aufgebauten Ex- _:i pressionsträgern* verknüpft sind. Ferner'betrifft die Erfindung Wirtskultursysteme, wie verschiedene Mikroorganismen und Wirbeltier-Zellkulturen, die mit diesen Expressionsträgern trans-

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formiert sind und somit auf die Expression, der vorgenannten DNA-Sequenzen'gerichtet sind. Weiter betrifft die Erfindung-Mittel und Verfahren zur Umwandlung der Endprodukte einer derartigen Expression zu Produkten, wie Arzneipräpäraten, die sich zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Tieren eignen.. Ferner werden erfindungsgemäss verschiedene Verfahren, die sich, zur Herstellung der genannten DNA-Sequenzen, Expressionsträger, Wirtskultursysteme und deren Endprodukte eignen, bereitgestellt. ,

Die Erfindung beruht zum Teil auf der Ermittlung der eine Reihe von Rinder-oi-Interferonen kodierenden DNA-Sequenz und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz. Diese DNA-Sequenz schliesst die entsprechenden 3'- und 5'-flankierenden Sequenzen ein, die die in vitro-Verknüpfung in Expressionsträge.rn erleichtert. Diese Befunde ermöglichen wiederum die Entwicklung von Mitteln und Vorrichtungen zur Herstellung von ausreichenden Mengen an tierischen Interferonen mittels recombinanter· DNA-Technik, so dass die Bestimmung von deren biochemischen Eigenschaften und biologischen Aktivitäten möglich wird und diese Produkte grosstechnisch und biologisch verwertet werden können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Druckschriftliche Veröffentlichungen und andere Materialien, die den technischen Hintergrund der Erfindung erläutern und in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind* am Ende der Beschreibung aufgelistet. In der Beschreibung selbst wird auf die Nummern dieser Druckschriftenliste verwiesen.

A. Tierische Interferone . .

Interferonkomponenten wurden aus Geweben verschiedener Spezies gewonnen,"die stammesgeschichtlich niedriger als der Mensch einzuordnen sind (1, 2,. 3). Durch. Aktivitätsuntersuchungen an diesen

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interferonen Hessen sich unterschiedliche Grade an antiviral.er Wirksamkeit beim jeweiligen Wirtstier nachweisen (3, ·4, 5, 6). Es wurde auch nachgewiesen, dass diese Interferone nicht immer speziesspezifisch sind. Beispielsweise weisen Präparate von aus Geweben isolierten Rinderinterferonen¹eine antivirale Wirkung beim Affen und bei menschlichen Zellen auf (7)· In ähnlicher^ Weise haben sich Humaninterferone als aktiv in verschiedenen Zellen von stammesgeschichtlich niedrigeren Spezies erwiesen (7)

Diese Speziesinteraktivität ist zweifellos darauf zurückzuführen, dass unter den Interferonen sowohl in .bezug auf Aminosäurezusammensetzung als auch Aminosäuresequenz ein hohes Mass an homologer Konservierung besteht. Jedoch blieb diese Erklärung bisher rein theoretisch, da Mengen und Reinheitsgrade von zur Verfügung stehenden tierischen Interferonen.,nicht ausreichten, jeden Zweifel ausschliessende Versuche in bezug auf die Charakterisierung und biologischen Eigenschaften der gereinigten Komponenten im Vergleich zu verschiedenen' menschlichen Gegenstücken durchzuführen (8, 9, 10, 11, 12).

Trotz dieser geringen Mengen und Reinheitsgrade würde ein kausaler Zusammenhang zwischen Interferon und der ant.iviralen Aktivität beimerforderlichen Wirtstier festgestellt. Somit' besteht ein Bedarf an der Herstellung von "tierischen Interferonen in hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden, um biologische Tierversuche einzuleiten und erfolgreich durchzuführen, die das Ziel haben, die Behandlung von Tieren gegen virale Infektionen und gegen maligne oder durch eine Immunosuppression oder ein Immunodefizit geprägte Zustände zu ermöglichen. Ferner ist durch die Herstellung von isolierten tierischen Interferonen eine. Charakterisierung der physikalischen und biologischen Eigenschaften dieser Produkte möglich, was eine Grundlage zu ihrer- Einordnung und anschliessende vergleichende Untersuchungen mit den menschlichen Gegenstücken bietet (8 bis 20).

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Die bisher mit' tierischen Interferonen durchgeführten Untersuchungen waren aufgrund der zur Verfügung stehenden, sehr geringen Substanzmengen auf relativ unreine Präparate beschränkt. Jedoch lassen diese Untersuchungen Schlüsse auf wichtige biologische Funktionen zu. Diese Klasse von tierischen interferonen besitzt nicht nur eine starke therapeutische antivirale Wirkung, sondern wirkt vermutlich auch als prophylaktischer Hilfsstoff bei der Verabreichung von Vaccinen und/oder bei antibiotischer Behandlung, wodurch es zu einem vielversprechenden potentiellen Wirkstoff für klinische. Zwecke wird.

Man nahm an, dass die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik einen sehr wirksamen Weg zur Bereitstellung der erforderlichen grösseren Mengen an. tierischen Interferonen' darstellt. Unabhängig davon, ob die. auf .diese Weise hergestellten Materialien die Glycosylierung, d/ie als charakteristisch, für natives Material gilt, umfasst oder nicht, ist anzunehmen, dass diese Materialien biologisch aktiv sind und klinisch bei der Behandlung verschiedenster viraler, neoplastischer und immunosuppressiver Zustände oder Krankheiten eingesetzt- werden· können. . ,,

B. Rekombinante DNA-Technik ·

Die. rekombinante DNA-Technik hat in letzter Zeit eine erhebliche-Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind in der Lage, verschiedene DNA-Sequenzen relativ leicht zu rekombinieren und neue DNA-Einheiten, zu schaffen, die zur Bildung von erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten in transformierten Mikroben, fähig sind. Es stehen allgemeine Mittel und Verfahren zur in vitro-Verknüpfung von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder kohäsiven Enden zur Verfügung, die zur Bildung von leistungsfähigen Expressionsträgern führen, mit denen spezielle Organismen transformiert werden können, so dass deren Syntheseleistung in wirksamer Weise auf das gewünschte exogene Produkt gerichtet wird. Bei einzelnen Produkten ist dieser Weg jedoch

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recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit fortgeschritten, dass regelmässig' Vorhersagen über die Erfolgsausr- sichten gemächt werden können. Versucht man, Erfolge ohne -entsprechende experimentelle Basis vorherzusagen,,so läuft man Gefahr zu scheitern.

Plasmide, d.h. ausserchromosomale Schleifen von doppels_trängiger DNA in Bakterien und anderen Mikroben, die häufig in mehreren Kopien, pro Zelle vorkommen, stellen ein Grundelement¹'der rekombinanten DNA-Technik dar. Die in die Plasmid-DNA einkodierte · Information umfasst die Information, die erforderlich ist, das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren (d.h. Ursprung der - Replication = origin) und im allgemeinen eine oder mehrere phenotypische Selektionseigenschaften, wie im Fall -von Bak-: , terienresistenz gegenüber Antibiotika, die die Erkennung und bevorzugte Züchtung in selektiven Medien von Klonen der das betreffende Plasmid enthaltenden Wirtszelle erlauben. Der^y Wert von Plasmiden liegt darin, dass sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktionsendonuclease oder "Restriktionsenzym", die jeweils unterschiedliche Stellen der Plasmid-DNA erkennen, gespalten wurden können. Anschliessend können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingesetzt werden, indem man eine Endenverbindung an der Spaltungsstelle oder an rekonstruierten Enden nahe der Spaltungsstelle durchführt. Somit werden sogenannte replizierbare Expressionsträger gebildet. Die DNA-Rekombination wird ausserhalb der Zelle durchgeführt, aber der entstandene "rekombinante" replizierbare Expressionsträger oder Plasmid können in die Zellen nach einem'als Trans- , formation bekannten Verfahren eingeführt werden und es lassen sich grosse Mengen des rekombinanten Trägers durch Züchtung . des Transformanten erhalten. Wird¹ferner das Gen in geeigneter Weise in bezug auf die Bereiche des Plasmids eingesetzt, die die -Transkription oder Translation der einkodierten DNA-Botschaft steuern,

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so kann der erhaltene Expressionsträger zur tatsächlichen Bildung der Polypeptidsequenz, die durch das eingesetzte Gen kodiert wird, verwendet werden; ein Vorgang, der als Expression bezeichnet wird.

Die Expression wird in einem als Promotor bekannten Bereich, der durch RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird, initiiert. In der Transkriptionsphase der Expression erfolgt eine Entwindung der DNA, wobei sie eine Schablone für die initiierte Synthese von messenge.r-RNA aus der DNA-Sequenz wird. Die messenger-RNA wird wiederum in ein Polypeptid mit der durch die mRNA kodierten Aminosäuresequenz übersetzt. Jede Aminosäure wird durch ein Nucleotidtriplett oder "codon" kodiert, die zusammen das "Strukturgefi" bilden, d.h. den Teil, der die Aminosäuresequenz des exprimierten Polypeptidprodukts kodiert. Die Translation wird durch ein Startsignal (im allgemeinen ATG, das in der erhaltenen messenger-RNA zu AUG wird) initiiert. Sogenannte Stop-Kodons definieren das Ende der Translation und daher der Bildung von weiteren Aminosäureeinheiten. Das erhaltene Produkt kann gegebenenfalls durch' Lysis der Wirtszelle in mikrobiellen Systemen und Gewinnung des Produkts durch entsprechende Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden. - '

In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA-Technik zur Expression von vollkommen heterologen Polypeptiden sogenannte direkte Expression - oder zur Expression eines heterologen Polypeptide führen, das mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids verschmolzen ist. In den letztgenannten Fällen wird das gewünschte bioaktive Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird (2 1 , 22 ) .

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C. Zellkulturtechnik

Zeil- oder Gewebekulturen sind für kinetische und zellphysiologische Untersuchungen gut eingeführt..Mittel und Methoden zur Erhaltung von permanenten Zellinien, die durch successive Serienübertragungen von isolierten normalen Zellen hergestellt werden, stehen zur Verfügung. Für Forschungszwecke werden derartige Zellinien auf einem festen Träger in einem flüssigen Medium gehalten oder in Suspensionen mit einem Gehalt an unterstützenden Nährstoffen gezüchtet. Eine Vergrösserung des Herstellungsmasstabs zur Herstellung von grossen Präparatemengen scheint nur eine Frage der mechanischen Möglichkeiten zu sein (vgl.'23, 24). . .-·.· ·'

Ziel der Erfindung:·

Aufgäbe der Erfindung ist es, Peptide mit der Aminosäuresequenz von tierischen Interferonen zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass die rekpmbinante DNA-Technik mit Erfolg zur Herstellung von tierischen Interferonen verwendet werden ka-hn, vorzugsweise in direkter Form und in Mengen, die ausreichen, klinische Untersuchungen, die Vorbedingungen für eine Marktzulassung sind, zu initiieren und durchzuführen. Das Produkt eignet sich für alle Formen der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von 'Tieren, insbesondere bei vlralen Infektionen und malignen Zuständen" sowie Zuständen mit Immunosuppression oder Immunodefizit. Seine Formen umfassen verschiedene mögliche oligomere Formen, die assoziierte Glycosylierung einschliessen können, sowie.allele Variationen von 'individuellen Bestandteilen oder Familienein-· hexten. Die Produkte werden durch gentechnisch manipulierte Mikroorganismen oder. Zellkultursysteme gebildet. Somit besteht nun die Möglichkeit, tierische Interferone, wirkungsvoller als bisher herzustellen und zu isolieren. Ein wesentlicher Faktor

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der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung besteht darin, dass es gelungen ist, einen Mikroorganismus oder eine,Zellkultur genetisch so zu dirigieren, dass sie veranlasst werden, tierisches Interferon, insbesondere Rinderinterferon, die von der Wirtszelle in reifer Form ausgeschieden werden, in isolierbaren Mengen zu bilden.

Gegenstand der Erfindung sind die auf diese Weise hergestellten Interferone sowie Mittel und Verfahren zu deren Herstellung. . Gegenstand der Erfindung sind ferner replizierbare DNA-Expressionsträger , -die Gensequenzen beherbergen, welche tierische Interferone in expressionsfähiger Form kodieren. Ein weiterer Gegenstand^der Erfindung sind Mikroorganismenstämme oder Zellkulturen, die mit den vorstehend beschriebenen Expressionsträgern transformiert sind, sowie Fermentationsmedien, die derart transformierte Stämme oder Kulturen, die zur Bildung von tierischen Interf eronen¹ in der Lage sind, enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind ferner verschiedene Verfahren zur Herstellung der genannten Interferongensequenzen, DNA-Expressionsträger, Mikroorganismenstämme und Zellkulturen. Gegenstand der Erfindung ist auch die Herstellung der Fermentationsmedien dieser Mikroorganismen und Zellkulturen. In xbestimmten Wirtssystemen können Vektoren zur Bildung des gewünschten tierischen Interferons, das aus der Wirtszelle in reifer Form sekretiert wird, gebildet werden. Interferon,das die vom 5'-flankierenden Bereich des entsprechende^ Gens abgeleitete Signalsequenz enthält, wird vermutlich zur Zellwand des Wirtsorganismus transportiert, wo zur Unterstützung dieses Transports das Signalprotein während des Sekretionsvorgangs des reifen Interferonprodukts abgespalten wird. Dies ermöglicht die Isolierung und Reinigung des gewünschten reifen Interferons., ohne dass man Verfahren zu Hilfe nehmen muss, die dazu bestimmt sind, Verunreinigungen an intrazellulärem Wirtsprotein oder Z el'lb r/u cn'stucken zu, beseitigen.

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Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von Rinderinterferon, das für die Klasse der hier in Betracht kommenden tierischen Interferone repräsentativ ist. Vorzugsweise wird, dieses Rinderinterferon durch direkte Expression in.reifer Form gebildet. . .. . .

Der hier verwendete Ausdruck "reifes tierisches Interferon" , bezieht sich auf die durch Mikroorganismen oder Zellkulturen bewerkstelligte Herstellung von tierischen Interferonen, die nicht vom,Signalpeptid oder Präsequenzpeptid, das unmittelbar für die.Translation der tierischen Interferon-mRNA sorgt, begleitet ist. Somit wird erfindungsgemäss reifes tierisches Interferon zur Verfügung gestellt, das Methionin als erste Aminosäure (vorhanden aufgrund der Insertion des ATG-S'tartsignalkodons vor dem Strukturgen). oder, wenn das Methionin intra- oder extrazellulär abgespalten ist, ,seine üblicherweise erste Aminosäure aufweist. Demgemäss kann reifes tierisches-Interferon auch zusammen mit einem konjugierten Protein,· das sich 'vom herkömmlichen Signalpolypeptid unterscheidet, hergestellt werden, wobei das Konjugat spezifisch .in einer intra- oder extrazellulären Umgebung abspaltbar ist (2Ί ). Schliesslich kann das reife tierische Interferon durch direkte Expression ohne ^: die Notwendigkeit einer Abspaltung von fremden,, überflüssigen Polypeptiden hergestellt werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn ein bestimmter Wirt ein Signalpeptid nicht oder nicht wirksam genug entfernen kann, sofern der Expressionsträger so gebaut ist, dass er die Expression von reifem Humaninterferon zusammen mit dessen Signalpeptid bewirkt. Das auf diese Weise hergestellte reife Interferon wird gewonnen und so weit gereinigt, dass es als Wirkstoff bei der Behandlung von viralen und malignen Zuständen sowie bei Zuständen mit Immunosuppression oder Immunodefizit geeignet ist.

Abgesehen von der Tatsache, dass tierische Interferone endogene

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-, ίο -

Produkte des tierischen Organismus sind, ist ihre Nomenklatur analog zu Humaninterferonen; man unterscheidet also tierisches H-Interferon (Leukozyteninterferon), ß-Interferon (Fibroblasteninterferon) und /"-Interferon (Immuninterferon). Alle diese 3 Interferonarten sind im Tierversuch identifiziert worden.' Ferner weiss man ausgehend vom Beispiel des- Rinds, dass die tierischen oC-Interf erone wie bei Huma-ninterferon aus einer' Familie von Proteinen zusammengesetzt sind. Die bisher untersuchten Produkte weisen zu den entsprechenden Human-cC-interferonen einen niedrigeren Homologiegrad auf als diese tierischen Interferone untereinander oder die Human-o( -interferone untereinander. Ferner ist die Rinder-ß-Reihe aus einer Proteinfamilie zusammengesetzt, die sich vom menschlichen Produkt unterscheidet. Ferner werd.en erfindungsgemäss Interspezies- und Interfamilien-Hybridinterferone bereitgestellt, wobei man die gemeinsamen Restriktionsstellen innerhalb der Gene von verschiedenen tierischen Tnterferonen ausnützt und die entsprechenden Bereiche nach bekannten Methodenrekombiniert (57).

Auf jeden Fall umfassen_die tierischen Interferone der Erfindung die Interferone,die normalerweise bei Tieren der Familien der Vögel, Rinder, Hunde, Pferde, Katzen, Ziegen, Schafe, Fische und Schweine endogen sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Interferone von Paarhufern, wie Rinder, Schafe und. Ziegen. Die erfindungsgemäss bereitgestellten Interferone: finden Anwendung als Antivirus- and Antitumormittel bei den entsprechenden Wirtstieren. Beispielsweise können Rinderinterferone praktische Anwendung bei „der Behandlung des Atmungskomplexes bei Rindern entweder zusammen mit an sich bekannten Antibiotika als therapeutische Komponente oder zusammen mit Vaccinen als ,prophylaktische Komponente finden.. Die auf die vorstehende Weise demonstrierte Klassenverwertbarkeit erstreckt sich auch auf andere Rinder sowie Ziegen, Schafe, Schweine, Pferde , Hunde, Katzen, Vögel und Fische. ,Bei Pferden, Hunden,

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Katzen und Vögeln lässt sich die Antitumorwirkung'der entsprechenden Interferone vermutlich besonders gut gewerblich ausnutzen. . . ·

Das folgende, anhand von' Rinderinterferon als repräsentativer Klasse beschriebene Grundprinzip kann zur Herstellung der er- · findungsgemässen tierischen Interferone angewandt werden:

.1. Rindergewebe, beispielsweise Rinderpankreasgewebe, wird zu einem gefrorenem Pulver zerkleinert und zur Verdauung von RNA und Proteinmaterialien behandelt. Nach,Fällung.erhält man hochmolekulare Rinder-DNA.

2. Die hochmolekulare DNA wird teilweise verdaut, um sie in bezug auf die "Genstelle willkürlich zu zerschneiden.

3. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden der Grössenfraktionierung unter Bildung von Fragmenten mit 15 bis 20 Kilobasenpaaren (kbp) unterworfen.

4. Die in Stufe 3 erhaltenen Fragmente werden unter Verwen-·' dung^eines -^-"Charon 30-Phagenvektors geklont.

5. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren ^werden in vitro auf infektiöse Phagenteilchen mit einem Gehalt an rDNA unter Bildung einer Phagenbibliothek gepackt. Diese wurde durch Vermehrung auf Bakterienzellen auf das etwa 10 -fache vergrössert. Die Phagen wurden bis zur praktischen Konfluenz auf einem Bakterienra'sen ausgestrichen^l und zur Hybridisierung mit einem radioaktiven Humaninterferon-Marker einem Screening unterworfen.

6. Aus den geeigneten Klonen wurde die entsprechende DNA isoliert. Von dieser wurde eine Restriktionskarte erstellt und eine Analyse durch Southern-Hybridisierung durchgeführt.

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Restriktionsfragmente mit einem Gehalt an Rinderinterferongenen wurden der Subklonierung in Plasmidträger unterworfen und sodann sequenziert. ' ,

7. Die sequenzierte DMA wurde dann in vitro zur Insertion in einen entsprechenden Expressionsträger zugeschnitten, der zur Transformierung einer entsprechenden Wirtszelle verwendet wurde, die wiederum in einer Kultur gezüchtet wurde und die Expression des gewünschten Rinderinterferonprodukts durchführte. .

8. Das auf diese Weise hergestellte Rinderinterferon weist in seiner reifen Form 166 Aminosäuren auf, wobei am Beginn Cystein steht und in der Präsequenz 23 Aminosäuren vorhan-

' den sind. Es weist einen stark hydrophoben Charakter auf. Sein monomeres Molekulargewicht wurde mit etwa 21 40 9 berechnet. Es weist ähnliche Eigenschaften wie Humanleukozyteninterferone (8, 9\ 10, 11) auf. Es wurde festgestellt, dass es zu etwa 60 Prozent homolog mit humanem Leukozyteninterferon ist.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert .· -; ' -..

A. Mikroorganismen/Zellkulturen

1. Bakterienstamme/Promotoren. . . ·.

Die hier wiedergegebenen Versuche bedienen sich unter anderem des Mikroorganismus E.'coli K-12. Stamm 294 (end A, thi~, hsr~, , hsm⁺) (25). Dieser Stamm er hielt bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 31446. Jedoch eignen sich auch verschiedene andere Mikroorganismenstämme, darunter bekannte E. coli-Stämme, wie E. coli B, E.ν coIi X 1776 (ATCC 31 537) E. coli W 3110 (F", Λ~, prototroph) (ATCC 27325) , E, coli DP 50 SuPF (ATCC 39061 ,.- hinterlegt am .5 . März 1982 ) ,

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E. coli JM83 (ATCC'39062 , hinterlegt am 5. .März! Ί982-) , sowie andere Mikroorganismenstämme, von denen viele bei anerkannten Hinterlegungsstellen hinterlegt und dort erhältlich sind, beispielsweise bei der American Type Culture Collection (ATCC); vgl. den ATCC-Katalog und(26, 26a). Beispiele für andere Mikro-Organismen sind Bazillen, wie Bacillus subtilis^und andere, Enterobacteriaceae, von denen zum Beispiel Salmonella typhimurium und Serratia marcescens erwähnt seien, wobei Plasmide verwendet werden, .die die darin enthaltenen heterologen Gensequenzen replizieren und exprimieren, können.

Zum Beispiel wurden ß-Lactamase und Lactose-Promotorsysteme mit Erfolg zur Initiierung und Aufrechterhaltung dermikrobiellen Bildung von heterologen Polypeptiden verwendet. Einzelheiten zum Aufbau- und zur Herstellung "dieser Promotörsysteme gehen aus (27) und (28) hervor.. Kürzlich wurde ein System auf der Basis des Tryptophan-Operons entwickelt, das sogenannte trp-Promotorsystem. Einzelheiten bezüglich·des Aufbaus und der Herstellung dieses Systems wurden von Goeddel et al., (12) und Kleid et al., (29) beschrieben. Es wurden zahlreiche andere mikrobielle Promotoren entdeckt und eingesetzt. Einzelheiten über deren Nucleotidsequenzen, die es dem Fachmann ermöglichen, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen, wurden veröffentlicht (30). .

2. Hefestämme/Hefepromptoren

Das Expressionssystem kann auch das Plasmid YRp7 (3'1> 32, 33) verwenden, welches zur Selektion und implikation sowohl, in E. coli als auch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae fähig ist. Für die Selektion in Hefe erhält das Plasmid das TRP1-Gen (31,j 32, 33), das eine ^Complementation (Ermöglichung des Wachstums in Abwesenheit von Tryptophan) v©n Hefe ermöglicht, die Mutationen in diesem am Chromosom IV der Hefe gefundenen Gen enthält ('3.4K Ein geeigneter Stamm ist der Stamm RH2 18 (35),

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der bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkungen hinterlegt ist (ATCC 44076). Es wird jedoch darauf verwiesen, dass beliebige Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die eine Mutation aufweisen, durch die die Zelle die Eigenschaft trp1 erhält, eine wirksame Umgebung zur 'Expression des das Expressionssystem enthaltenden Plasmids ist. Ein Beispiel für einen weiteren verwendbaren Stamm ist pep4-1 (36). Dieser tryptophan-auxotrophe Stamm weist eine Punktmutation im Gen TRP1 auf.

Wird an der 5'-Stelle eines Nicht-Hefegens die 5'-flankierende DNA-Sequenz (Promotor) aus einem Hefegen (für Alkoholdehydrogenase 1) angebracht, so kann sie die Expression eines fremden Gens in der Hefe, wenn sie in ein Plasmid zur Transformation von Hefe gebracht wird, fördern. Neben einem Promotor ist für die einwandfreie Expression eines Nicht-Hefegens in Hefe eine zweite Hefesequenz am 3'-Ende des Nicht-Hefegens am Plasmid erforderlich, so dass eine einwandfreie Termination der, Transkription und Polyadenylierung i-n der,. Hefe möglich ist. Dieser Promotor kann im Rahmen der Erfindung ebenso wie andere Eromotoren verwendet werden (vgl. unten). Bei bevorzugten Ausführungsf ormen· wird die 5'-flankierende Sequenz des Hefe-3- Phosphoglycerat-kinas'e-Gens (37) aufwärts vom Strukturgen angeordnet, wiederum gefolgt von DNA mit einem Gehalt an Terminations-Polyadenylierungs-Signalen, beispielsweise TRP1- (31? 32, 33) -Gen oder PGK- (37) -Gen.

Da .Hefe-5'-Flankensequenz (in Konjunktion mit 3'-Hefe-Terminations-DNA) (vgl. unten) die Expression, von fremden Genen in ..Hefe fördern kann, scheint es wahrscheinlich, dass die 5'-

... -.

flankierenden Sequenzen von beliebigen hochexprimierten Hefegenen zur Expression von wichtigen Genprodukten verwendet werden können. Da unter diesen Umständen Hefe bis zu 65 Prozent ihres löslichen Proteins als glykolytische Enzyme (38) expri-

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mierte und da dieser hohe Anteil auf die Bildung von hohen Anteilen an individuellen mRNAs zurückzuführen zu sein scheint (39), sollte es möglich sein, die 5'-flankierenden Sequenzen von beliebigen anderen glykolytischen Genen.für derartige Expressionszwecke zu verwenden,, beispielsweise'Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triosephospjiat - isomerase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Beliebige 3'-flankierende Sequenzen dieser Gene können auch'für eine geeignete Termination und mRNA-Polyadenylierung in einem derartigen Expressionssystem verwendet werden; vgl. oben. Beispiele für einige andere hochexprimi-erte Gene sind die für saure Phosphatasen (40) und diejenigen, die aufgrund von Mutationen in den 5'-flankierenden Bereichen (expressionssteigernde Mutanten) - im allgemeinen aufgrund der Awesenheit eines TYltransponierbaren Elements (41) - hohe Produktionsmengen exprimieren.· ~ · " ;

Von sämtlichen vorerwähnten Genen wird angenommen, dass sie durch Hefe-RNA-Polymerase II transkribiert werden (41). Es ist möglich, dass die Promotoren für die RNA-Polymerase I und III , die Gene für ribosomale RNÄ, 5S RNA und tRNA transkribieren (41, 42),auch für derartige Expressionskonstruktionen ' wertvoll sind.. . . .

Schliesslich können viele Hefepromotoren auch eine tränskriptionale Steuerung enthalten, so dass sie bei einer Veränderung der Wachstumsbedingungen ab- oder angestellt, werden können. Beispiele für derartige' Hefepromotoren sind die Gene, die die folgenden Proteine bilden: Alkohol-dehydrogenase II, Isocytochrom-c, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff-Stoffwechsel assoziierte abbauende Enzyme, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase und für die Maltose-und Galactoseyerwertung verantwort-

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Hche Enzyme (3.9). Ein derartiger Sfceu.erungsbereich ist für die Steuerung der Expression von Proteinprodukten, insbesondere wenn ihre Bildung für die Hefe toxisch ist, sehr wertvoll. Es dürfte auch möglich sein, den Steu.erungsbereieh einer 5'-flankierenden Sequenz mit einer 5'-flankierenden Sequenz, die einen Promotor von einem hochexprimierten Gen enthält, zusammenzu- . bringeni Dies würde zu einem Hybridpromotor führen und sollte möglich sein, da es sich beim.Steuerungsbereich und dem Promotor offensichtlich um physikalisch unterschiedliche DNA-Sequenzen handelt. .

3- Zellkultursysterne/Zellkulturvektoren

Die Vermehrung von Wirbeltierzellen;in Kulturen (Gewebekultur) wurde in den letzten Jahren zu einem Routineyerfa.hren (.43)·. 'Die COS-7-Linie von Affennierenfibroblasten kann als Wirt für die Herstellung von tierischen Interferonen verwendet werden (44). Jedoch können die hier geschilderten Experimente in beliebigen Ze.llinien durchgeführt werden, die zur Replikation und Expression eines kompatiblen Vektors fähig sind, zum Beispiel' WI38-, BHK-, 3T3-, CHO-, VERO- und HeLa-Zellinien. Ferner sind für den Expressionsvektor ein Replikationsursprung und ein Promotor, angeordnet vor ,dem zu exprimierenden Gen, zusammen mit allen erforderlichen Ribosomen-Bindungsstellen, RNA-Spleisstellen, Polyadenylierungsstellen und transkriptionalen Terminato.rsequenzen erforderlich. Während im Rahmen dieser Beschreibung diese wesentlichen Elemente von SV40 genutzt werden, ist darauf hinzuweisen, dass .es sich hierbei ' nur um bevorzugte Ausführungsformen, handelt und die Erfindung keineswegs auf diese~Sequenzen beschränkt ist. Beispielsweise können die Replikationsursprungsstellen von anderen viralen (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen) Vektoren, sowie jede zelluläre Ursprungsstelle der DNA-Replikation', die in einem nicht-integrierten Zustand funktioniert, verwendet werden.

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B. Vektorsysteme ' \

1. Direkte Expression von reifem Rinderinterferon in E. coli

Bei dem· Verfahren, das zur direkten Expression von Rinderinterferon in E. coli als reifem Interferon-Polypeptid (minus die Signalsequenz) verwendet wurde, handelte, es sich um eine, Kornbination eines Plasmids mit einem Gehalt an einem Promotorfragment und; einem translationalen Startsignal mit einem zugeschnittenen Fragment von tierischer Genom-DMA, die den kodierenden Bereich für das reife Interferon enthielt. .

2.. Expression in Hefe . ·

Um ein heterologes Gen, wie die DNA für tierisches Interferon in Hefe zu exprimieren, war es notwendig, einen PlasmidVektor mit einem Gehalt an 4 Komponenten aufzubauen. Bei der ersten Komponente handelte es. sich um den Teil, der die Transformation von E._; coli und Hefe ermöglicht und der somit ein selektierbares Gen von.beiden Organismen enthalten muss, beispielsweise das Gen für Ampicillinresistenz aus E. coli und das Gen TRP1 aus Hefe. .Diese Komponente benötigt auch eine Replikationsursprungsstelle von beiden Organismen, die als Plasmid-DNA in. beiden Organismen aufrecht zu erhalten ist. In diesem Fall handelt es sich um die E. coli-Ursprungsstelle aus pBR322 und die ars1-Ursprungsstelle aus dem Chromosom III von Hefe.

Bei der zweiten Komponente 'des Plasmids handelt es sich um eine 5'-flankierende Sequenz eines hochexprimierten Hefegens, um die Transkription eines abwärts plazierten Strukturgens zu fördern. In diesem Fall wird als 5'-flankierende Sequenz die· Sequenz aus dem Hef\e-3-Phosphoglycerat-kinase (PGK)-Gen verwendet - ' ' i '

Bei der dritten Komponente des Systems handelt es sich um ein Strukturgen., das so aufgebaut ist, dass es sowohl ATG-Trans-

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lations-Start- als auch Translations-Stopsignale enthält.. Die Isolierung und der Aufbau eines derartigen Gens ist weiter unten beschrieben. '

Bei der¹ vierten Komponente handelt es sich um eine Hefe-DNA-Sequenz, die die 3'-flankierende Sequenz eines Hefegens enthält, welches die geeigneten Signale zur Beendigung der Transkription und zur Polyadenylierung enthält.

3. Expression in Säugetier-Zellkulturen

Die Strategie zur Synthese von Immuninterferon in Säugetier-. Zellkulturen beruht auf der Entwicklung eines Vektors der sowohl zur autonomen Replikation .als auch Expression eines fremden Gens unter Steuerung einer heterologen Transkriptionseinheit fähig.ist. Die Replikation dieses Vektors in Gewebekultur kann erreicht werden, indem man eine DNA-Replikationsursprungsstelle (abgeleitet vom SV40-Virus) sowie eine Hilfsfunktion (T-Antigen) durch Einführung des Vektors in.'eine Zellinie, die dieses Antigen endogen exprimiert (46, 47), bereitstellt. Der späte .Promotor von SV40-Virus geht dem Strukturgen von Interferon voran und gewährleistet die Transkription des Gens. '

Der zur Erzielung der Expression geeignete Vektor besteht aus pBR322-Sequenzen, die einen selektierbaren Marker für die Selektion in E. coli (Ampicillinresistenz) und eine E. coli-Ursprungsstelle für die DNA-Replikation bereitstellen. Diese-Sequenzen. s,ind aus dem Plasmid pML-1. (46) abgeleitet und umfassen den Bereich, von der EcoRI-Restriktionsstelle bis zur BamHI-Restriktionsstelle. Die SV40-Ursprungsstelle leitet sich von einem 342-Basenpaar-PvuII-Hindlll-Fragment ab, das diesen Bereich umfasste (48, 49) (beide Enden waren in'EcoRI-Enden umgewandelt). Diese Sequenzen kodieren abgesehen davon, dass sie den viralen. Ursprung der DNA-Replikation enthalten, den Promotor

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sowohl für die frühe als auch für die späte Transkriptionseinheit. Die Orientierung des SV4O-Ursprungsbereichs ist so beschaffen, dass sich der Promotor für die späte Transkriptionseinheit proximal zu dem Interferon kodierenden Gen befindet.

Fig. 1.zeigt eine Southern-Hybridisierung von (a) Human-,

(b) Rinder- und (c) Schweinegenom-DNAs, die mit EcoRI verdaut und bei unterschiedlichen Formamidkonzentrationen mit einem 32P-markierteri 570-Basenpaar-EcoRI-Fragment, das den kodierenden Bereich des Humanleukozyteninterferon-A/D-Hybrids enthält, hybridisiert- sind. Die Hybridisierung bei einer Formamidkonzentration von 20 Prozent ergibt das klarste Muster der multigenen Rinder- und Schweineleukozyteninter'f eron-Genfamilien.

Fig. 2 zeigt eine Southern-Hybridisierung von U unterschiedlichen Rindergenom-DNA-Phagenrekombinanten, die mit EcoRI, BamHI

^: ' 32

oder Hindlll verdaut und mit einem P-markiert'en Humanleukozytengenmarker hybridisiert sind. Klon 83 ergibt mit jedem Restriktionsenzym 2 hybridisierende Fragmente. .

Fig. 3A zeigt einen Teil der Nucleotidsequenz aus dem Plasmid Subklon p83BamHI 1,9 kb sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz des darin kodierten Rinderleukozyteninterferons. Das Signalpeptid' wird durch die Aminosäurereste SV bis S23 wiedergegeben . . ' ^s .

Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz für ein zweites Rinderleukozyteninterf eron (a.2) aus dem Plasmidsubklon p67EcoRI 3,2 kb.

Fig. 3C zeigt die vollständige reife Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für ein drittes Rinderleukozyteninterferon (ix3) aus dem Plasmidsubklon p35EcoRI-BamHI 3,5 kb.

24 8612 5

Fig. 3D zeigt die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz eines .vierten Rinderleukozyteninterferons aus dem Pias-, midsubklon p83EcoRI-BamHI 2,9 kb. Das Signal wird durch die Aminosäurereste S1 bis S2 3 wiedergegeben. Das reife Protein umfasst 172 Aminosäurereste.. Es ist festzustellen, dass der letzte Bereich von 6 Aminosäureresten einer Nucleotidbasenänderung in Position 511 zuzuschreiben ist, die 6 zusätzliche .translatierbare Kodons vor dem nächsten Stopsignal · in Phase ermöglicht. . .

Fig. 4 vergleicht die Aminosäuresequenzen von BoIFN-cc 1 , c< 2 , (X_3 und <X4 (Bo = Rind) mit den Sequenzen für 11 bekannte Humanleukozyteninterf erone. Ferner sind die Aminosäuren angegeben, die bei'sämtlichen Humanleukozyteninterferonen konserviert sind. Für Rinderleukozyteninterferon <χ1 und c<4 sind die Positionen angegeben, bei denen Homologie mit dem Grossteil der Humanleukozyteninterferone auftritt.

Fig. 5 ist ein schematisches Diagramm zum Aufbau des Rinderleukozyteninterferon-Expressionsplasmids pBoIFN-aitrp55. Bei den Ausgangsmaterialien handelt es sich um. den trp-Expressionsvektor.pdeltaRIsrc und das BamHI-Fragment des Plasmidsubklons p83BamHI 1,9 kb.

Fig. 6 zeigt eine Southern-Hybridisierung von Rinder-DNA, die mit EcoRI, Hindlll,. BamHI, BgIII und. PvuII verdaut ist, mit, einem radioaktiven Marker, der aus BoIFN-oO- oder BoIFN-o(4-Genfragmenten hergestellt ist. Jedes IFN-Gen hybridisiert bevorzugt mit einer bestimmten Unterfamilie von BoIFN--o!-Gerien.

Fig. 7 zeigt eine Restriktionskarte der Geriomrinder-DNA-Inserts , von 3 Phagenrekombinanten, die. den Humanfibroblasten-Humaninterferongen-Marker hybridisieren. Die Stellung und Orientierung von BoIFN-ß ist jeweils durch ein geschwärztes Rechteck angegeben. Die mit einem Stern gekennzeichneten Restriktionsstellen

24 86 12 5

geben eine partielle Restriktionskarteninformation wieder.

Fig. 8 zeigt eine feiner aufgelöste Restriktionskarte für die 3 in Fig. 7 angegebenen Gene. Der schraffierte Bereich stellt die Signalsequenz und der gepunktete Bereich die. reife Sequenz dar. . .··. '

Die Figuren 9a, 9b und 9c zeigen die Nucleotidsequenzen und abgeleiteten,Aminosäuresequenzen für die Gene BoIFN-ß1 , '2 und 3·

Fig. 10· vergleicht die .Aminosäuresequenzen für die 3 BoIFN-ßs mit HuIFN-ß (Hu = human). ' '

Fig. 11 ist ein Southern-Blot von Fig. 6, rehybridisiert mit einemBoIFN-ßi-Genmarker unter Bedingungen, bei denen im allgemeinen nur ein einziges Hybridi'sierungsf ragment auftritt, wenn ein analoges Experiment mit Humangenom-DNA und dem HuIFN-ß-Gen durchgeführt wird (9). ' . .

Fig. 12 zeigt schematisch die zur Expression, aller 3 BuIFN-ßs unter. Kontrolle des t'rp-Operons, von E. coli angewandte Strategie.

Fig. 13 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von BuIFN-W, HuIFN-^ und Mäuse-IFN-f.

j ' ' . ' ¹^ . ' Nachstehend' folgt eine ausführliche Beschreibung der. Herstellung :vpn verschiedenen tierischen Interferonen mittels rekombinanter DNA-Technik,- wobei- eine allgemein anwendbare Methodik insbesondere zur Herstellung von Rinderleukozyteninterferonen beschrieben wird. Dieses Verfahren wird in bezug auf ein bak-. terielles System beschrieben. . .'

A. Isolierung von Rinder-DNA ' \ /

Zum Aufbau einer Tiergenbibliothek wurde hochmolekulare DNA aus

2.4 86-12 5

tierischem Gewebe nach einem modifizierten Verfahren gemäss Bliri'und'Stafford (50) isoliert, willkürlich in bezug auf den Genort fragmentiert und der Grössenfraktionierung zur Bildung von .15 bis 20 kb-Fragmenten für die Klonierung in einem ^Phagenvektor (51) unterworfen.

Gefrorenes Gewebe, beispielsweise Rinderpankreas, wurde in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen und in 0,25'm EDTA, 1 Prozent Sarkosyl, 0,1 mg/ml Proteinase K (25 ml/ g Gewebe) 3 Stunden bei 5O⁰G in Lösung gebracht. Die erhaltene viskose Lösung wurde durch 3 Phenolextraktionen und eine Chloroformextraktion entproteinisiert, gegen 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 8), 10 millimolar EDTA, 10 millimolar NaCl dralysiert und mit wärmebehandelter pankreatischer Ribonuclease (0,1 mg/ml) 2 Stunden bei37°C verdaut. Nach Extraktion mit / Phenol und Äther würde die DNA mit 2 Volumina Äthanol gefällt, in 95-prozentigem Äthanol gewaschen, lyophilisiert und 'in TE-Puffer (10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert. 7,5, 1 millimolar EDTA) über Nacht bei 4⁰C wieder in Lösung gebracht, wobei die endgültige Konzentration 1 bis 2 mg/ml betrug. Das fertige DNA-Präparat war länger als 100 kb, bestimmt durch Elektrophorese an einem 0,5-prozentigen neutralen Agarosegel.

B. Partielle Endonucleäse-Verdauung und Grössenf raktioni.erung von Rinder-DNA

Aliquotanteile (0,1 mg) von Rinder-DNA wurden mit 1,25, 2,5, 5 und 10 Einheiten an Sau3A-60 Minuten bei 37°C in 1 ml Reaktionsmedium mit 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5) , 10 millimolar MgCIp und 2 millimolar Dithiothreit verdaut. Die Inkubationen wurden durch Zusatz von EDTA in einer Konzentration von 25 millimolar gestoppt. Sodann wurde mit Phenol und Äther extrahiert, mit Natriumacetat auf eine Konzentration von 0,3 m gebracht (pH-Wert 5,2) und mit 3 Volumina Äthanol gefällt. Die DNA wurde in TE-Puffe'r bei 68⁰C wieder in Lösung gebracht

24 86 12 5

und in einem ,10- bis 40 -prozentigen , linearen Saccharosegradienten (51) in einem Beckman SW 27 Rotor 22 Stunden bei 27 QOO U/min und 2O⁰C sedimentiert. Die Fraktionen (0,5 ml), wurden an einem 0 ,5-prozentigen Gel unter Verwendung von EcoRI-verdauter Charon 4A (5La)-DNA als Molekulargewichtsstandard analysiert. Die Fraktionen mit einem Gehalt an 15 bis 20 kb-DNA-Fragmenten wurden vereinigt, mit Äthanol gefällt und wieder in TE-Puffer in Lösung gebracht.

C. Aufbau der Rindergenom-DNA-Bibliothek

Das 15 bis 20 kb-Rinder-DNA-nonlimit-Digestionsprodukt wurde in einem ^-Charon 30 A- Vektor (52) mit. G-A-T-C-kohäsiven · Enden, erzeugt durch Entfernung der beiden internen BamHI-Fragmente der Phage, geklont. Charon 30A wurde in E. coli Stamm DP 50 SupF (ATCC 39061, hinterlegt am 5. März. 1982). in NZYDT-Brühe gezüchtet, durch Fällung mit Polyäthylenglykol konzentriert und durch Zentrifugation im CsCl-Dichtegradienten .(53) gereinigt. Phagen-DNA wurde hergestellt durch 2-malige Extraktion der Phage mit Phenol und 1-malige Extraktion mit Phenol und Äther und Konzentrieren der DNA durch Äthanolfällung.

Zur Herstellung der Endfragmente von Charon 30A wurden 50 ;ug der Phagen DNA 2 Stunden bei 42⁰C in 0,25 ml 50 millimolar Tris-HCl (pH-Weirt 8), 10 millimolar MgCl₂ und 0,15 m NaCl getempert, vollständig mit BamHI verdaut, mit 'Phenol und Äther extrahiert und in einem 10- bis 40-prozentigen Saccharosegradienten -entsprechend den vorstehenden Angaben sedimentiert. Fraktionen mit einem Gehalt an 32 kb getemperten Armen der Phage wurden vereinigt und mit-Äthanol gefällt.

Die gereinigten Charon 30A-Arme (6 ^Ug) wurden wiederum 2 Stunden bei 42⁰C getempert, mit 0,3 ^ug15 bis 20 kb-Rinder-DNA und 400 Einheiten Phagen-T4-Polynucleotid-ligase vereinigt . und über Macht bei· 12 C in 0,.0 75 ml Reaktionsmedium mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 millimolar

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MgCIp , 20 millimolar Dithiothreit und 50 ,ug/ml Rinderserumalbumin inkubiert. Das der Ligation unterworfene DNA-Gemisch wurde sodann in reife λ-Phagenteilchen unter Verwendung eines in vitro- ^-Packungssystems (54) gepackt.

Die Komponenten dieses Systems, d.h. Ultraschallextrakt (SE) Gefrier-Auftau-Lysat (FTL), Protein A und Puffer A und M1, wurden gemäss (54) hergestellt. 3 ',ul-Aliquotanteile des verknüpften DNA-Gemisches wurden 45 Minuten bei 27°C mit 15 jal Puffer A, 2 /Ul Puffer M1 , 10 μΐ SE, und 1 ;ul Protein A inkubiert. Das FTL wurde 45 Minuten auf Eis aufgetaut, mit 0,1 V.olumina Puffer M1 vereinigt und 25 Minuten bei 35 000 U/min und 4°G zentrifugiert. 0 ,075 ml des Überstands wurden zum vorstehenden .Reaktionsgemisch gegeben. Nach weiterer 2-stündiger Inkubation bei 27 C wurde ein kleiner Aliquotanteil der Packung am vorstehenden Stamm DP 50 SupF ^: titriert. Dieses Verfahren ergab insgesamt etwa 1,1 χ 10 unabhängige Rinder-DNA-Rekombinanten. Der Rest des Packungsgemisches wurde gemäss einem Platten-Lysat-Verfahren (52) durch Aus-Streichen der Rekombinanten- auf- DP-50SupF- in einer Dichte- von 10 000 plaquebildenden Einheiten pro 15 cm NZYDT-Agarplatte ver- ., stärkt.

D. Screening der Phagenbibliothek für Rinderinterferongene

Die zur Identifizierung der Phagenrekombinanten, die Rinderinterfe'rongene tragen, angewandte Strategie bestand darin, die Nucleotidhomologie mit radioaktiven Markern, die aus geklonten Humanleukozyten- (8 , 9 ), Humanf ibroblasten- (12) und Humanimmuninterferongenen (55) hergestellt waren, nachzuweisen. Die Hybridisierungsbedingungen wurden mit Southern-Blots (56) von genomischer tierischer DNA festgestellt. Jeweils 5 ug hochmolekulare.DNA. (auf die vorstehend beschriebene. Weise hergestellt aus Humanplazenta, Rinderpankreas und G. submaxillaris vom'Schwein wurden., vollständig mit EcoRI verdaut,

2486 12 5

der Elektrophorese auf 0,5 Prozent Agarosegel unterworfen "und auf Nitrocellulosepapier übertragen (56). Ein P-markierter DNA-Marker.wurde aus einem 570 bp-EcoRI-Fragment, das den proteinkodierenden Bereich für reifes Humanleukozyteninterferon A/D-Hybrid an der BGL II-Restriktionsstelle (57) ent- \ hielt, nach ,üblichen Verfahren (58) hergestellt. Die Nitrocellulosefliter wurden jeweils über Nacht bei 42⁰C in 5xSSC (56), 50, millimolar Natriumphosphat (pH-Wert 6,5), 0,1 mg/ml ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA, 5x-Denhardt-Lös.ung (5·),- 0,1 Prozent Natfiumdodecylsulfat, Ό,1 Prozent Natriumpyrophosphat mit einem Gehalt an entweder 10, 20 oder 30 Prozent Formamid prähybridisiert und sodann mit 100 χ 10 cpm der markierten Probe in der gleichen Lösung mit einem Gehalt an 10 Prozent Natriumdextransulf at (60) hybridisiert. Nach Inkuba-, tion' bei 42⁰C über Nacht wurden die Filter 4 mal in 2xSSC, 0,1 Prozent SDS bei Raumtemperatur und 1 mal in 2xSSC gewaschen und sodann über Nacht Kodak-XR-5-Röntge'nfilm mit Dupont Cronex-Verstärkungsfiltern ausgesetzt. Wie aus Fig. 1 hervorgeht, lässt sich eine Anzahl von hybridisierenden Banden sehr leicht in den Rinder- und Schweine-DNA-Verdäüungsprodukten nachweisen, wenn bei der Hybridisierung 20 Prozent Formamid vorhanden .sind. Dieses Ergebnis beweist eine multigene Familie von Leukozvteninterferongenen bei Rindern und Schweinen analog dem- früher geführten Nachweis beim Menschen (12,

61). Die gleichen Hybridisierungsbedingungeri" wurden daher für das Screening der Interferongene in der Rinder-DNA-Bibliothek angewandt. '. .

500 000 Rekombinantenphagen wurden auf, DP 50- 'SupF in einer Dichte von 10 000 plaquebildenden Einheiten '(pfu)/15 cm-Platte ausgestrichen. Doppelte Nitrocellulosefilter-Replicas wurden von jeder Platte nach dem Verfahren von Benton und Davis (62) hergestellt. Die Filter wurden auf die vorstehend beschriebene

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Weise mit - dem Human-LelF-Genmarker hybridisiert. 96 Duplikathybridisierungsplaques wurden erhalten, die bei wiederholtem Screening starke Signale ergaben.

Die Rinderbibliothek wurde, ferner einem Screening auf Fibro- ^:blasten und Immuninterferongene unterzogen. Marker wurden aus 502 bp Xba T-BgI III-Fragmenten mit einem Gehalt am gesamten reifen Humanfib^oblasteninterferongen (12), einem 318 bp Alu I-Fragment (enthaltend die Aminosäuren 12 bis 116) und einem 190 bp Mbo II-Fragment (enthaltend die Aminosäuren 69 bis 162) aus dem reifen kodierenden Bereich von Humanimmuninterferon-' gen (55) hergestellt. Die Hybridisierung von 1,2 χ 10 rekombinanten Phagen ergab insgesamt 2 6 Rinderfibroblasten- _; und 10 Immuninterf eronklone..,

E. Charakterisierung der Rekombinanteriphaggn .

Phagen-DNA wurde auf _t die vorstehend beschriebene Weise von 12 Rekombinanten, die mit dem Humanleukozyteninterferonmarker hybridisierten, hergestellt. Die DNAs- wurden einzeln und kombiniert mit⁴ EcοRT, BamHI und Hindlll verdaut und der Elektrophorese an einem 0,5-prozentigen Agarosegel unterworfen. Die Position der hybridisierenden Sequenzen wurde nach dem Southern-Verfahren (56) ermittelt. Ein Vergleich von einzeln verdauter DNA der Klone 10, 35, 78 und 83 ist in Fig. 2 gegeben. Für jede Phage sind die Grossen der Restriktionsfragmente' und das entsprechende Hybridisierungsmuster verschieden und nicht-überlappend, was darauf hinweist, dass diese 4 Phagen unterschiedliche Rinderinterferongene tragen. Zusätzlich ergibt'eine Verdauung des Klons 83 mit: jedem der·3 Enzyme· in jedem Fall 2 diskrete hybridisierende-Banden, was anzeigt, dass diese Rekombinante 2 eng verknüpfte Interferongene trägt. '

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F. Subklonierung der Rinderleukozyteninterferongene

Restriktionsfragmente von 3 der rekombinänten Phagen, die mit dem Humanleükozytengehmarker hybridisiert waren, wurden der Subklonierung in die Mehrfachrestriktrionsenzym-Klonierungsstelle des pBR322-Derivats pUC9 unterworfen. Das Plasmid pUC9 war von pBR322 abgeleitet, indem man zunächst das 20,67 bp-EcoRI-PvuII-Fragment mit· einem Gehalt am Tetracyclinresistenzgen entfernte und dann ein 425> bp-Haell-Fragment aus dem Phagen-M13-Derivat mP9 (62a) in die Haell-Stelle des erhaltenen Plasmids in Stellung. 2352 (relativ zur pBR322-Zählung) einsetzte. Das Haell-Fragment von mP9 enthält den N-terminalen kodierenden Bereich des E. coli lacZ-Gens, in das eine Multirestriktionsenzym-Klonierungsstelle der Sequenz CCA AGC TTG GCT GCA GGT. CGA CGG ATC CCC GGG zwischen dem 4. und 5. Aminosäurerest von ß-Galactosidase eingesetzt war. Die Insertion eines fremden DNA-Fragments in diese klonierenden Stellen unterbricht die Kontinuität zwischen dem „lac-Promotor und dem lacZ-Gen, wodurch der Phänotyp des mit dem Plasmid transformierten JM83 von Iac zu Iac" geändert wird. . :

Bei den\vorstehend genannten Fragmenten handelte es sich um folgende: (a) ein 1,9 kb BamHi-Fragment und 3,7 kb EcoRI-Fragment aus dem Klon 83 (entsprechend den nicht-überlappenden Segmenten der gleichen Rekombinante), (b) ein 3,5 kb BamHI-EcoRI-Fragment vom Klon 35 und Cc) ein 3,2 kb EcoRI-Fragment •"•om Klon 67. In jedem Fall wurden 0', 1 ug des^ entsprechend verdauten Vektors mit einem 10-fachen molaren überschuss des gereinigten Fragments verknüpft, transformiert in E.coli JM83 (ATCC 39062-, hinterlegt am 5. März 1982) und auf M9-Platten (63)- ' mit einem Gehalt an 0,04 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid und 0 ,2 mg/ml Ampicillin ausgestrichen.. Weisse Kolonien, die vermutlich einen DNA-Insert an der Restriktionsstelle unter Unterbrechung des kodierenden Bereichs des lacZ-Gens an pUC9 trugen,· wurden in 5 ml LB-Brühe mit. einem Gehalt

2Λ86 12 .5

an 0,02 mg/ml Ampicillin aufgenommen, mehrere Stunden bei 37 C gezüchtet und dem Screening auf das eingesetzte Fragment nach einem Plasmid-DNA-Minipräparationsverfahren (64) unterworfen.

G. DNA-Sequenz von Rinderleukozyteninterferongen.an Klon 83

Die sich von. der BamHI-Stelle von p83BamHI Ί , 9 kb -(der 1,9 kb Fragment-Subklon von Klon 83) erstreckende DNA-Sequenz wurde nach-dem chemischen Verfahren von Maxam-Gilbert (65) bestimmt. Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Der längste offene. Ableseraster kodiert ein Polypeptid mit 189. Aminosäuren mit signifikanter Homologie zu den Humanleukozyteninterferonen (Fig. 4). Analog mit den Humanproteinen besteht Rinderleukozyteninterferon aus einem hydrophoben Slgnalpeptid mit 23 Aminosäuren^ das einem reifen Protein mit I66 Aminosäuren bei identischerSequenz, ser-leu-gly-cys, vorausgeht. 4 Cysteinreste in den Stellen 1, 29, 99 und 139 waren zwischen den Spezies exakt erhalten, Ein paarweiser Homologievergleich ; zwischen den Rinder- und Humaninter.f eronen ist in Tabelle I angegeben. Wie-, zu erwarten, ist das. Rinderprotein in bezug zu den Humanproteinen beträchtlich weniger homolog (etwa 60 Prozent) als die letztgenannten Proteine untereinander (mehr als 80 Prozent).

Für 3 weitere, Rinderleukozyteninterferongene, die an den Plasmidsubklonen p67EcoRI 3,2 kb, p35EcoRi-BamHI 3,5 kb und p83EcoRI 3,7 kb auftreten, sind in den Figuren 3B, 3C und 3D die DNA-S6qüenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz angegeben. - '.

Wie in Tabelle I zusammengestellt, kodieren die BoIFN-<£2 und -3-Gene Peptide mit nur geringen Unterschieden zu BoIFN-o(1 , während das BoIFNa4-Protein sich'von den anderen Rinderpeptiden so stark unterscheidet, wie ein beliebiges Paar von^: Rinderund Humanleukozyteninterferonen.

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Um festzustellen, ob das ei^-Gen/sich wie die anderen BoIFN-ai.s von einer breiten Klasse von zellulären Proteinen ableitet, wurde genomische Rinder-DMA mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen Verdaut und mit radioaktiven DNA-Fragmenten, die die kodierenden Bereiche dercCl- (612 bpAvall-Fragment, Fig. 6) und o{4- (EcoRI-Xmnl-Fragment von pBoIFN-o( 4trp15)- . Gene repräsentieren, unter drastischen Bedingungen (50 Prozent Formamid), die keine Kreuzhybridisierung der beiden Gene erlauben, hybridisiert.. Wie aus Fig. 6 ersichtlich, hybridisiert jedes Gen vorwiegend mit einem bestimmten Satz von Rinder-DNA-Fragmenten. Diese Ergebnisse geben insgesamt einen klaren Hinweis'auf die Existenz von 2 unterschiedlichen Familien an Rinderleukozyteh-IFN-peptiden, von denen die o(1- und <x4-Proteine als repräsentative Mitglieder angesehen werden können. > . ..

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_ 30 _

Tabelle I

Paarweise	Vergleiche von Unterschieden	und Hüman-IFM-c<s	in	den	kodierenden
Sequenzen	von Rinder-
		aA aß aC aD	aF	a H
al	o2 a3 a4	a I aJ ctK

BoIFM-al 94 92 54 -61 62 63 64 61 64 63 61 65

BoIFM-a2 96 91 53 61 61. 64 63 62 63 63 .64 64

BoIFN-a3 100 96 45

BoI.FN-a4 52 4-8 52 . 54. 54 58 55· 56 58 56 54 ^l54

39 .81 81 83 82 83 81 80 86

48 70 81 77 81 83 80 79 81

52 70 65 " 81 89 86 94 92 83

48 '74· 61 65 83 8l·. 80 78 84

- 52 70. 65 100. 65 83 89 86 83

52 74 74 74- 83 74 ' 84 84 84 52 70 65 100 65 100 74 91 81

48 61 57 91 70 91 65 91 80

48 83 70 74 91 74 91 74 6 5

Die Zahlenwerte geben die prozentuale Homologie an.

Die untere linke Hälfte gibt die Präsequenz mit 23 Aminosäuren wieder . ', ..

Die obere rechte Hälfte gibt das reife Protein mit 166 Aminosäuren wieder.

A, B, C und dergleichen" sind Hurnanleukozyteninterf erone A, B, C und dergleichen. ' :

Hu	I	FfJ-a A	56	52
Hu	I	F M-a B	43	39
Hu	I	FN-aC	61	57
Hu	I	F N-a D	52	48
Hu	I	FM-aF	61	57
Hu	I	.FN-a H	56	52
Hu	I	FM-a I	61	57
Hu	I	FN-aJ	56	52
Hu	I	FN-aK	52	48

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H-¹ Direkte Expression von reifem BoIFN- c< 1 in E. coli'

Der Aufbau des direkten Expressiönsplasmids ist in Fig. 5 zusammengestellt. Der Plasmidsubklon p83BamHI 1,9 kb wurde vollständig mit Ava II verdaut. Das 612 bp-Fragment mit einem Gehalt an Rinderleukozyteninterferongen wurde elektrophoretisch an einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel isoliert' und durch Elektroelution gewonnen. Etwa 1,5 jug. dieses Fragments wurden mit Fnu4H verdaut, mit Phenol und Äther extrahiert und mit Äthanol gefällt. Die erhaltenen Fnu4H-kohäsiven Enden, wurden 30 Minuten bei 12⁰C in 2Cr ul. 20millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5.), 10 millimolar MgCl₂, 4 millimolar Dithiothreit und jeweils Ό_ν,1 millimolar dATP, dGTP, dCTP und dTTP mit 6 Einheiten DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zu stumpfen Enden erweitert. Nach Extraktion mit Phenol und Äther wurde die DNA mit Pst I verdaut und der. Elektrophorese an einem 6-prozentigen Gel unterworfen. Das erhaltene 92 bp stumpfendige Pst I-Fragment, das sich vom ers,ten Nucleotid des kodierenden Bereichs für reifes Rinderleukozyteninterferon erstreckt,, wurde aus dem Gel durch Elektroelution gewonnen.,

Der Rest des reifen kodierenden Bereichs· wurde folgendermassen isoliert. 3 )*g des BamHI-Inserts von p83BamHI 1,9 kb wurde partiell 10 Minuten bei 37°Cin 45 ,ul Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 millimolar MgCIp und 2 millimolar Dithiothreit mit' 14 Einheiten Pst I verdaut und mit Phenol und Äther extrahiert. Das gewünschte 1440 bp partielle Pst I-BamHI-Fragment, das sich vom Nucleotid 93 des reifen kodierenden Bereichs erstreckte, wurde von einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel· isoliert. , " . ' -

Das.Piasmid pdeltaRIsrc ist ein Derivat, des Plasmids pSRCexi6 (66), bei dem die EcoRI-Stellen-proximal zum trp-Promotor und distal zum src-Gen durch Reparatur mit DNA-Polymeras.e .I (6'7)

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entfernt sind. Das selbst-komplementäre Oligodesoxynucleotid AATTATGAATTCAT (synthetisiert nach dem Phosphotriesterverfahren (68) wurde in die restliche EcoRI-Stelle unmittelbar neben der Xba !-Stelle eingesetzt. 20 jag pdeltaRIsrc wurden vollständig mit EcoRI verdaut, mit Phenol und Äther extrahiert und mit Äthanol gefällt. Das Plasmid wurde sodann 30 Minuten bei 16⁰C in 25 millimolar'Natriumacetat (pH-Wert 4,6), 1 millimolar ZnCIp und 0,3 m NaCl mit 100 Einheiten Nuclease S1 verdaut, um ein stumpfes Ende mit der Sequenz ATG zu schaffen.. Nach Extraktion mit Phenol und Äther und Äthanolfällung wurde die DNA mit BamHI verdaut und der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel unterworfen. Das grosse (4300 bp) Vektorfragment wurde durch Elektroelution gewonnen.

Das Expressionsplasmid wurde durch Verknüpfen von 0,2 Ug Vektor, 0,02 ug des 92 bp stumpfendigen Pst I-Fragments und 0,25 ,Ug des 1400 bp partiellen Pst I-BamHI-Fragments mit. 400 Einheiten T4 DNA-Ligase zusammengebaut und zur Transformation von E. coli Stamm 2 94 (ATCC 31446) zur Verleihung von Ampicillinresistenz verwendet. Plasmid—DNA wurde aus 96 der Kolonien hergestellt und mit Xba I und Pst I verdaut. 19 dieser' Plasmide enthielten die gewünschten 103 bp-Xba I-Pst I und 1050 bp Pst I-Fragmente. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, dass mehrere dieser Plasmide ein korrekt am Start des Rinderinterferon kodierenden Bereichs, befindliches ATG-Initiationskodon aufwiesen. Eines dieser Plasmide, pBoIFN-'cc 1-trp55 wurde zur weiteren Untersuchung ausgewählt.

I. Direkte Expression einer zweiten Klasse von reifem Rinderleukozyteniriterferon (<x 4) in E. coli

Ein ATG-Initiationskodon wurde durch enzymatische Erweiterung eines synthetischen DNA-Primers, CATGTGTGACTTGTCT, gesetzt. Das Heptadecamer wurde mit T4-Pol·ynucleotid-kinase und ^-32P

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ATP'/phosphoryliert, wie vorstehend beschrieben (12). 250 pMol des Primers wurden mit etwa 1 ^g 319 bp Hindll-Fragment mit einem Gehalt an den Aminosäureresten S20 bis 102 in 30 jßl HpO vereinigt, 5 Minuten gekocht und 3 ,Stunden bei 37⁰C mit 25 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment erweitert. Das Produkt dieser Reaktion- wurde mit HgiAI verdaut. Das erhaltene 181 bp stumpfendige HgiAI-Fragment wurde aus einem β-prozentigeh Polyacrylamidgel isoliert. '.'

Das gesamte Gen für das reife Peptid wurde hinter dem trp-Prpmotor durch enzymatische Verknüpfung des-vorstehenden Fragments mit einem 50 8 bp HgiA-Pstl-Fragment mit einem Gehalt am carboxy-terminalen Bereich des Peptids und dem HuIFN-/"-Expressionsplasmid, pIFN- Jf trp48-13 (.55), das mit EcoRI verdaut, auf glatte Enden mit Klenow-DNA-Polymerase erweitert, mit Pstl verdaut und schliesslich an einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel isoliert war, aufgebaut. Nach Transformation des . erhaltenen Gemisches in E.: coli 294 wurden verschiedene Klone identifiziert, bei denen die EcoRI-Erkennungsstelle zwischen, dem trp-Promotor-Ribosomenbindungsstellenbereich des ursprünglichen Expressionsvektors und der gesamte kodierende Bereich des reifen Rinder-IFN (pBoIFN-o(4trp15) wieder hergestellt war.

J. Subklonierung der Rinderfibroblasteninterferongene ^

6 der Phagen.rekombinanten, die mit dem Human-IFN-ß-DNA-Marker hybridisiert waren, wurden gereinigt. Ihre DNA wurde zur wei-,teren Analyse gemäss den vorstehenden Angaben isoliert. Die' 'Restriktionskarte kombiniert mit Southern Hybridisierungs- analyse zeigte,^; dass die 6 Isolate 3 gesonderte Bereiche des Rindergenoms umfassten,was für eine multigene BoIFN-ß-Familie spricht. Diese Ergebnisse sind anhand der in Fig. 7 gezeigten Restriktionskarten zusammengestellt. Zur Erstellung einer genaueren Restriktionskarte und einer Nucleotidsequenz für die einzelnen Klassen von Rekombinanten, wurden hybridisierende

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Fragmente der Subklonierung in Plasmidvektoren unterzogen. Insbesondere wurden das 5kb Bglll-Fragment der Phage ;\ß1 und das 5 kb BamHI-Fragment der Phage \8>2 einzeln in pBR322 an ' der BamHI-Stelle geklont. Das überlappende 4,5 kb EcoRI-XhoI- und 1,4 kb Pstl-Hpal-Fragment der Phage Xß3 wurden in pUC9 (befreit von EcoRI-Sall-Stellen) bzw. pLeIF87 (10) (befreit von Hpal-Pstl) eingesetzt. . . -

K. DNA-Sequenzen von 3 gesonderten Rinderfibroblasten-IFN-Genen

Fig. 8 zeigt Restriktionskarten für die 3 Typen von Rinder-IFN-ß-Genen, die subkloniert wurden. Diese sind leicht unterscheidbar durch die Anwesenheit von jeweils charakteristischen Spaltungsstellen. Die" peptidkodierenden Bereiche sowie die Sequenzen unmittelbar oberhalb und-unterhalb der jeweiligen Gene wurden nach dem-chemischen Verfahren gemäss Maxam-Gilbert .bestimmt. Sie sind in den Figuren 9a, 9b und 9c wiedergegeben. Die Nucleotidhomologie mit der-für das Humanfibroblasteninterferongen bestimmten Sequenz (12) lässt den korrekten Ableseraster und gesamte Aminosäuresequenz für jedes Rindergenprodukt, das, ein hydrophobes. Signalpep.tid mit..-2 1- Aminosäuren, gefolgt von reifem Protein' mit 185 Aminosäuren einschliesst, vorhersagen. Die Rinderproteine sind untereinander recht unterschiedlich (Tabelle II, Fig. 10), zeigen aber noch grössere Unterschiede (etwa 60 Prozent) zum humanen Peptid.

Die m'ultigene Natur von Rinderfibroblasteninterferon wurde ferner durch Rehybridisierung des in Fig. 11 gezeigten Southern-Blots, mit einem radioaktiven Marker, der aus einem von pBoIFN-ß-trp (Beschreibung weiter unten) abgeleiteten 415 bp EcoRI-Pvul-Fragment hergestellt war, nachgewiesen. Wie aus Fig. 11 ersichtlich, liefert dieser Versuch den. Beweis für die Existenz von weiteren, homologen IFN-ß-Genen. Die weniger hybridisieren-. den Bereiche können tatsächlich weiter entfernte verwandte Gene

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_ 35 _

repräsentieren, die wiederum stärker unterschiedliche. ß-IFNs. kodieren. . ~

	Paarweise	Tabelle	(95)	II	kodierenden	Sequenzen	(51	) -
		Homologievergleiche	(95)	der			(55	)
	von Rinder-IFN-ßs	(76.)	s und Human-IFNrß-	S3	Hub	(52	)
			138 (83)	84
	81	82.	14 6 (88) .	9 2'
el		138 (83)		8 7
32	20		-15 (76)
ß3	20	19 (90)
Hue	i 16	17. (81)

Die Anzahl der identischen 'Aminosäuren in jedem Paar kodierender Sequenzen sind angegeben. Der Vergleich des Signalpeptids mit 2 1 Aminosäuren findet sich in der linken unteren Hälfte und der Vergleich der reifen IFN-ßs' mit 166 Aminosäuren^!fin-· det sich in der rechten oberen Hälfte der Tabelle. Die Gesamtzahl der in jedem Paar identischen Aminosäuren ist zuerst angegeben. In Klammern ist der prozentuale Homologiegrad aufgeführt. ' · '.· -

L. Direkte Expression von 3 Rinder-IFN-ßs in E. coli

Da die 3.Rinder-IFN-ß-Gene^ viele DNA-Sequenzen und Restriktionsstellen gemeinsam haben (vgl. Fig. 8)jist ein allgemeines Schema für die Expression aller 3 Gene denkbar. Da die die ersten 5 Aminosäuren kodierende DNA-Sequenz, die 2 Alul-Stellen enthält, in allen Fällen identisch ist, wurden 2 komplementäre synthetische Oligonucleotide aufgebaut, .die ein ATG-translationales Initiationskodon einverleiben, die Kodons für die

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• - 36 -

ersten 4 Aminosäuren von reifem Rinder-IFN-ß wieder herstellen und ein für die Insertion nach eineV trp-Promotorsequenz kohäsives EcoRI schaffen. Der Aufbau der Expressionsplasmide ist schematisch in Fig. . 12· dargestellt. Eine Ligation der synthetischen Ol.igomeren an das von den BoIFN-ß-Subklonplasmiden abgeleitete 85 bp Alul-Xhol-Fragment, gefolgt von einer Digestion mit EcoRI und Xhol erzeugt ein 10 4 bp-Fragment, flankiert durch EcoRI und Xhol-kohäsive.Enden. Die gesamte Kodierung wurde sodann in den trp-Expressionsvektor eingebaut, indem man das 104 bp-p_ragment zusammen mit dem etwa 700 bp Xhol-Pstl-Fragment, das den Rest der einzelnen BoIFN-ß-Proteine kodiert, und das.Plasmid pIFN- /tr48-13 (55)_?von dem das interne EcoRI-Pstl-Fragment entfernt war, verknüpfte. Die erhaltenen Plasmide, nämlich pBoIFN-ß1trp, pBoIFN-ß2trp und pBoIFN-ß3trp, führen unter der Kontrolle des E. coli trp-Operons sämtlich die exakte Transkription und Translation der IFN-ß-Gene durch.

M. Charakterisierung und Subklonierung von Rinderimmuninter feron (BoIFN- f)-Gen

Die 10 mit "dem Human-IFN- ^-Marker hybridisierten Phagenrekombinanten.wurden gereinigt. DNA.wurde auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt. Alle 10 DNA-Proben ergaben bei der Southern-Blotanalys.e spezifische Hybridisierungsbanden. Die Klone A/5 und ^^-7 wurden für die weitere Analyse ausgewählt, da sie unterschiedliche Hybridisierungsbandenmuster aufweisen. Die Restriktionskarten dieser beiden Klone zeigen, dass sich ihre DNA-Sequenzen überlappen. Der überlappende Bereich enthält die Restriktionsstellen Xbal, EcoRV und Ncol. Die.DNA-Sequenzanalyse dieser.beiden Klone ergibt eine insgesamt ähnliche Genstruktur mit dem Humanimmuninterferongen (70) und zeigt ferner, dass \Π die für das 4. Exon kodierende Sequenz und /iH die für die ersten 3 Exons von Rinder-IFN-Γ-Gen kodierende Sequenz enthält, was auf der DNA-Sequenzhomologie mit dem Human-IFN- r-Gen beruht. Die für BoIFN-/ abge-

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leitete Aminosäuresequenz wird in Fig. 13 mit der von (55) und Mäuse-IFN-j^" verglichen. - ...

Um das gesamte Rinder-IFN-^"-Gen auf einem' kontinuierlichen DMA-Segment zusammenzubauen,, wurden das 3000 bp BamHI-NcoI- Fragment-, das die ersten 3 Exons von Rinder-IFN-/*"-Gen. (abgeleitet von A/4) umspannt, und das 2 500 bp Ncol-Hindlll-Fragmentjdas das letzte Exon (abgeleitet von /1/7) umfasst, iso- liert. Diese beiden DNA-Fragmente wurden sodann in einen BamHI-Hindlll-Vektor, abgeleitet von pBR322, über eine dreiteilige Ligation geklont. .

N. Expression von Rinder-IFN- /"-Gen in Säugetiersystemen ,

Zum Zweck der Herstellung einer intronlosen Version von -BiIFN-/ · um dieses Gen in einem prökaryontischen System, wie E. coli, exprimierbar zumachen, wurde das Gen für einen hohen Expressionsgrad in einem tierischen Zellexpressionssystem geschnitten, um erhebliche Mengen an spezifischer mRNA zu erhalten. Das 5500 bp Bam-HI-HindlTI-Fragment, das. das gesamte Rinder-IFN-^-Gen umspannt, wurde in einen SV40 -Vektor : zur Expression in COS-Zellen (44) eingesetzt. Speziell wurde das BamHI-Hindlll-Rinder-IFN-/'-Genfragment in einen 2800 bp SV40-Plasmidvektor pDLARI ((abgeleitet vom HBV-Antigenexpressionsplasmid. pHBs348-L durch enzymatische Beseitigung der Ec'oRI-Stelle oberhalb des SV40-Replikationsusprungs selektiv zur Richtung „der späten Transkription) . . Das Expressionsplasmid pHBs348-L wurde aufgebaut, indem man das 1986 bp-Fragment, das durch EcoRI- und Bglll-Verdauung von HBV (71) erhalten wurde (das das HBsAg kodierende Gen umspannt) in. das Plasmid pML (72.) an den EcoRIi- und BamHI-Stellen klonte. pML ist ein Derivat von pBR322, bei dem Sequenzen, die die Plasmidreplikation in Affenzellen hemmen, beseitigt worden sind '(72). Das erhaltene Plasmid (pRI-Bgl) wurde sodann mit EcoRI

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linearisiert. Das-3^8 bp-Fr.agment,. das den SV40-Ursprungsbereich repräsentiert, wurde in die EcoRI-Stelle von pRI-Bg1 eingeführt. Das Ursprungsfragment, kann in beiden Orientierungen eingesetzt werden. Da dieses Fragment sowohl den frühen als auch den spaten SV40-Promotor zusätzlich zum Replikationsursprung kodiert, konnten HBV-Gene unter der Kontrolle beider Promotoren je nach dieser Orientierung (pHBs 3^8-L repräsentiert HBs exprimiert unter Kontrolle des spaten Promotors) exprimiert werden zwischen der BamHI-und der SaI I-Stelle über eine dreiteilige Verknüpfung in Gegenwart eines 600 -bp Hindlll-Sal I-Kohverterfragments, das von pBR322 abgeleitet ist, Die Transfektion des erhaltenen Plasmids in COS-Zellen führt zur wirksamen Expression von Rinder-IFN-j'*' unter der Kontrolle des spaten SV40-Promptors. '

Poly A plus m-RNA wurden aus transferierten COS-Zellen hergestellt und wiederum zur Herstellung von cDNA nach üblichen Verfahren (55) verwendet. Mit Rinder-IFN-J^-Genmarker hybridisierende cDNA-Klone wurden isoliert. Der cDNA-Klon mit dem längsten Pstl-Insert wurde zur weiteren Analyse- ausgewählt. Die DNA-Sequenzanalyse dieses cDNA-Klons zeigt, dass sämtliche aus dem Rinder-IFN- I*"-Genomklon vorhergesagten Intronsequenzen korrekt entfernt sind. .

Die cDMA wurde zur Expression in E. coli gemäss dem vorstehend erläuterten Primerreparaturverfahren geschnitten.

0. Herstellung von bakteriellen Extrakten >

Über Nacht in LB-Brühe mit einem" Gehalt an entweder 0,02 mg/ml Ampicillin oder 0 ,005 mg/ml Tetracyclin gezüchtete Kulturen wurden in einer Verdünnung von 1:100.auf 50 ml M9-Medium (63) mit einem Gehalt an 0,2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Casaminsäuren und dem ent'sprechenden Arzneistoff überimpft und unter Schütteln bei 37⁰C bis zu einem A₁-^₀-.Wert von 1,0 gezüchtet. Proben von 10 ml wurden durch' Zentrifugation geerntet und in einem Trockeneis/Äthanol-Bad schnell gefroren. Die 'gefrorenen

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Pellets wurden in 1 ml 7 m Guanidin resuspendiert, 5 Minuten auf Eis inkubiert und zur Bestimmung in PBS verdünnt. Alternativ ,wurden die gefro-renen Pellets durch Zusatz von 0,2 ml' 20 % Saccharose, 100 millimolar Tris-HCl (pH-Wert ,8,0), 20 millimolar EDTA und 5 mg/ml Lysozym der Lysis unterworfen. -Nach 20 Minuten auf Eis wurden 0,8 ml 0,3-prozentiges Triton X-100, 0,15 m Tris-HCl (pH-Wert 8 ,0 ) , 0 ,2 m EDTA und 0,Ί millimolar PMSF zugesetzt. Das Lysat wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 19 000 'U/min geklärt., Im Überstand wurde nach Verdünnung in PBS eine Bestimmung durchgeführt.

P. Interferonb,eStimmungen ·, · . ·

Die Aktivität von Rinderinterferon vurde mittels eines Hemmtests auf der Basis des zytopathischen Effekts (CPE) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen folgendermassen durchgeführt:

1. In jede Vertiefung einer Mikrötiterplatte mit 96 Vertiefungen (8 Reihen mal 12 Spalten) wurden 100 ul.einer Suspension yon Zellen mit einem Gehalt an-10 Prozent fötalem Kälberserum gegeben. Die Konzentration -wurde so eingestellt, dass sich am nächsten Tag eine konfluente'Zellschicht (monolayer)

: ergab. . . - '

^/ , ' " '

2. Die Platten wurden zur gleichmässigen Verteilung der Zellen 10 Minuten auf einer Rüttelplatte gerüttelt.

Nächster Tag: - ,

3. In jede Vertiefung der ersten Spalte wurden 80 ^jI zusätzliches Medium gegeben.

4.. Eine Vertiefung in- der ersten Spalte wurde mit 20 yl einer . Probe, i.n "der die Interferonaktivität bestimmt werden sollte, versetzt. ' ' ' ·

86 12 5

5. Probe und Medium in der Vertiefung wurden vermischt, indem man mit einer 100 ul-Pipette mehrmals 100 μΐ des Inhalts entfernte und wieder einspritzte.

6. 100 ^uI Inhalt einer Vertiefung in der ersten Spalte wurden (horizontal) in eine Vertiefung in der zweiten Spalte übertragen.

7. Es wurde wie in Stufe 3 gemischt. ·

8. Mit der übertragung von 100 μΐ des Inhalts einer Vertiefung einer Spalte auf die folgende Spalte wurde fortgefahren, bis insgesamt 11 Übertragungen durchgeführt waren.

: 9'. '100 ^uI des Inhalts der Vertiefung in der 12. Spalte wurden entfernt und verworfen. Durch dieses Verfahren erhält man Zweifach-Serienverdünnungen. ' '

10.. Die Bestimmungsplatten umfassten entsprechende NIH-Standards.

11. Die Platten wurden 24 Stunden bei·.3'7⁰C unter COp inkubiert.

12. Jede Bestimmungsplatte enthielt Vertiefungen, in die 100 ^uI Zellsuspension und 100^1 Medium als Kontrollen für das Zellwachstum gegeben wurden, sowie Vertiefungen, in die 100 μΐ Zellsuspension, 100 ^uI Medium und 50 JdI Virussuspension als virus-indüzierte zytopathogene Kontrollen gegeben wurden. .

.13· Di-e Vertiefungen mit Ausnahme der Zellkontrollen wurden . mit jeweils 50^1 Virussuspension infiziert. Die verwendete Infektionsmultiplizität war die Virusmenge, die innerhalb von 24 Stunden bei der speziellen Zellinie 100 Prozent

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zytopathischen Effekt hervorrief. -

14. Die Platten wurden 2 4 Stunden bei 37⁰C unter COp reinkubiert

15. Die Flüssigkeit wurde von den .Platten entfernt. Die Zellen wurden mit 0,5 Prozent Kristallviolett gefärbt. Die Färbung wurde 2 bis 5 Minuten durchgeführt,. ⁱ

16. Die Platten wurden in_;Leitungswasser gespült und zum Trocknen aufgestellt. ^;

17. Der Interf erontiter. der Probe ist reziprok zu der Ver-_: dünnung, bei der 50 Prozent lebensfähige Zellen erhalten bleiben^ -.' .

18. Die Aktivität sämtlicher Proben wurde mit Hilfe eines

.. folgendermassen berechneten Umrechnungsfaktors (Reference Units Conversion Factor) normalisiert. ' )

Tatsächlicher Titer des NIH-Standards , Reference Units Beim Test ermittelter Titer ⁼ Conversion Factor

Diesbezüglich wird auf (69) verwiesen. Extrakte aus E. coli Stamm 2 94 (ATCC 31446), die mit pBo IF¹N-c\ 1trp55 transformiert waren, zeigten eine signifikante Aktivität bei mit VS-Virus (Indiana-Stamm) infizierten Rindernieren-Zellinien (MDBK), jedoch nicht bei auf gleiche Weise infizierten Zellinien von Affennieren (VERO), Humanzervikalkarzinom (HeLa), Kaninchennieren (.Rk-.13) oder Mäusen (L929). Kontrollextrakte, -die aus .dem mit pBR322 transformierten Stamm 294 hergestellt waren, zeigten keine', Aktivität gegenüber MDBK-Zellen. In Tabelle III ist die in vitro-antivirale Aktivität von: BoIFN-/? 1 gegenüber verschiedenen infizierten tierischen und. menschlichen ZelUnien zusammengestellt. BoIFN-a. 1 lässt sich- von Humanleukozyten— IFNs leicht aufgrund eines offensichtlichen Mangels an

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viraler Aktivität gegenüber menschlichen Zellen relativ zu seiner Aktivität gegenüber Rinderzellen unter Verwendung von VS-Virus als infizierendem Agens unterscheiden. Tabelle IV zeigt den Grad der Interferonaktivität, die,in Extrakten erhalten wurde, die aus E.coli W3110, das mit den Expressionsplasmiden pBoIFN-crt 4trpi5 , .pBo'IFN-ßi trp, pBoIFN-ß2trp und pBoIFN-fö3trp, hergestellt wurden. Von besonderer Bedeutung ist die Beobachtung, dass Rinderfibroblasteninterferone an Rindernieren-Zellinien etwa.30-fach aktiver sind als an Humanamnion-Zellinien, während sich für Humanfibroblasten. IFN eine umgekehrte Beziehung ergab.. (12)

24 8612

Zellinie

Tabelle III	(Ei	Titer
	VSV	nheiten/ml)
IFN-Präparation	640	MCV
	300 000	NA
LeIF Α-Standard	5 40	NA
Rinderleukozyten-IFN	650	: NA
Kontrollextrakt	<40	. 150°
Le-IF Α-Standard '	<40	< 2 3
Rinderleukozyten-IFN	640	<23
Kontrol!extrakt	,/ <20	1000 '
Mäuse-IFN-Standard	<20	<- 31
Rinderleukozyten-IFN	1000	<31
Kontrollextrakt	<60	NA
Kaninchen-IFN-Standard	<60	NA
Rinderleukozyten-IFN		NA
Kontrollextrakt

MDBK

HeLa

L-92 9'

RK-13'

JERO

LeIF A-Standard.

Rinderleukozyten-IFN Kontrollextrakt

1500

MDBK .= Rindernierenzellen ^r

VERO = Nierenzellen des afrikanischen grünen Affen HeLa = Humanzervikalkarzinomzellen RK-13 = Kaninchennierenzellen , '

NA = nicht anwendbar, da der Virus in den entsprechenden Zellen keine gute Replikation zeigt

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Tabelle IV Interf er.onaktivitat in Extrakten von E. co.li

E. coli 2 94 . . · IFN-ß-Aktivität -IFN-ß-Aktivität

transformiert durch: (Einheiten/Liter (Einheiten/Liter

Kultur) MDBK-VSV Kultur) WISH-VSV

pIFN-Λ 1 - 1 ,0x10⁸ ' : ' N.D.

pIFN-ß1 2 ,2x10⁸ 6,5x-10⁶ .

pIFN-ß2. ' 1 , 1x10⁸ 3,.5x10⁶

pIFN-ß3 . 6,Ox1O⁸ 2,0x10⁷

Bakterielle Extrakte wurden hergestellt und ihre Interferonaktivität bestimmt, wobei man die Bindernieren-MDBK—Zelllinie und die Humanämriion-WISH-Zellinie und VSV zur Infektion gemäss Weck et al., 1981 , verwendete.

Arzneipräparate - · ,

Die Verbindungen der Erfindung können nach üblichen Verfahren zu Arzneipräparaten verarbeitet werden, wobei die tierischen Interferonprodukte mit einem oder mehreren verträglichen Trägerstoffen kombiniert werden. Entsprechende Trägerstoffe und deren Formulierung sind bekannt. Diese Arzneipräparate enthalten eine wirksame Menge Interferonprotein zusammen mit eir ner geeigneten Menge an Träger, so dass pharmakologisch verträgliche Arzneipräparate, die.sich zur Verabreichung an den Wirt auf üblichen Verabreichungswegen, beispielsweise, parenteral, eignen, erhalten werden. :_r

Die erfindungsgemässen tierischen Interferone existieren in natürlichen allelen Variationen. Diese Variationen können sich durch Unterschiede in bezug auf eine oder mehrere Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitu-

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tionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren in dieser Sequenz bemerkbar machen. Sämtliche derartigen allelen Variationen fallen unter den·"' Gegenstand der Erfindung. .

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71. Animal Virus Genetics (Ed. Fields e_t _aj_. ) , Chapter 5, p. 57, Academic Press, N.Y. (1980)..

72.- Lusky and Botchan, Nature 29 3, 79 (1981).

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung eines "Polypeptids, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz eines tierischen Interferons "besteht, gekennzeichnet dadurch, daß eine Expression eines Gens, das tierisches Interferon in reifer Form kodiert, in einem Mikroorganismus oder einer Zellkultur durchgeführt wird. . .

1 QC 1 O K </# AP G 12 H /248 612/5

α ο υ ι α. ϋ r·/ _{62 176 12}

B rfindung sanspruch ,

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine Kultur eines Mikroorganismus oder eine Zellkultur, die mit einem replizierbaren Bxpressionsträger, welcher zur Expression des Polypeptids befähigt ist, transformiert worden sind, zum, Wachstums und.zur.

Bildung des Polypeptids veranlaßt und. das Polypeptid gewinnt. ,

Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Expressionsträger durch Aufbau einer ersten für das Poly— peptid kodierenden DUA«-Sequenz und funktioneile Verknüpfung dieser ersten DHA-Sequenz mit einer zweiten DHA-Sequenz, die zur Expression der ersten DHA-^Sequenz befähigt ist, erhalten wird.

4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man einen transformierten E.coli—Stamm verwendet.

5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus oder eine Zellkultur verwendet, die mit dem Plasmid pBoIFN— -3&1-trp 55 transformiert worden sind. _ -..·'

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid erhalten wird, das nicht von assoziierter

_— ^öC ' . 4P C 121 /248 612/5

86 12 5-^-62 176 12

nativer G-lycosylierung "begleitet ist

7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid erhalten wird, welches in reifer Form vorliegt.

8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid erhalten wird, welches die Aminosäure Methionin enthält, die am n—terminalen Ende der üblicherweise ersten Aminosäure" des Interferons gebunden ist.

9. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid erhalten wird, welches ein ab spaltbares Konjugat oder Signalprotein enthält, das am n—terminalen Ende der üblicherweise ersten Aminosäure des Interferons gebunden ist. ' . ^x

10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß reifes Sinderleukozytenintefferon erhalten wird.

11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß reifes Einderinterferon erhalten wird, das im wesentlichen frei ist. von anderen;, vom Sind abstammenden Proteinen.