DK171790B1 - Fremgangsmåde til identificering af DNA, som koder for et ikke-humant dyreinterferon, og DNA, som kan identificeres ved fremgangsmåden, fremgangsmåde til fremstilling af DNA, som koder for et hybridt interferon, og DNA, som kan opnås ved fremgangsmåden, fremgangsmåde til fremstilling af et ikke-humant dyreinterferon eller hybridt interferon, DNA-isolat, som koder for et sådant interferon, - Google Patents

Description

DK 171790 B1 i

Denne opfindelsen angår en fremgangsmåde til identificering af DNA, som koder for et ikke-humant dyreinterferon, og DNA som kan identificeres ved fremgangsmåden, samt en fremgangsmåde til fremstilling af DNA, som koder for et 5 hybridt interferon, og DNA, som kan opnås ved fremgangsmåden. Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et ikke-humant dyreinterferon eller hybridt interferon, et DNA-isolat, som koder for et sådant interferon, en ekspressionsvektor indeholdende en DNA-10 sekvens, som koder for et sådant interferon, og en celle transformeret med ekspressionsvektoren.

Nærmere bestemt angår opfindelsen isoleringen og identifikationen af DNA-sekvenser, der koder for dyreinterfero-15 ner, og konstruktionen af rekombinante DNA-ekspressions-vektorer indeholdende sådanne DNA-sekvenser operabelt forbundet med ekspressionsfrembringende promotorsekvenser samt således konstruerede ekspressionsvektorer. I en anden henseende angår opfindelsen værtskultursystemer, så-20 som forskellige mikroorganismer og hvirveldyrcellekulturer transformeret med sådanne ekspressionsvektorer og således dirigeret til ekspression af de ovennævnte DNA-sekvenser. I endnu andre henseender angår opfindelsen midlerne og fremgangsmåderne til at omdanne de hidtil 25 ukendte slutprodukter af en sådan ekspression til enheder, såsom farmaceutiske præparater, der er nyttige til profylaktisk eller terapeutisk behandling af dyr. Desuden angår opfindelsen forskellige fremgangsmåder, som er nyttige til fremstilling af de nævnte DNA-sekvenser, eks-30 pressionsvektorer, værtskultursystemer og slutprodukter og enheder deraf samt specifikke dermed forbundne udførelsesformer .

Opfindelsen bygger delvis på opdagelsen af de DNA-35 sekvenser, som koder for en række okse-a-interferoner, 2 DK 171790 B1 inklusive de 3'- og 5'-flankerende sekvenser deraf, som letter deres in vitro tilknytning til ekspressionsvektorer, og de deraf afledte aminosyresekvenser. Disse opdagelser muliggør på sin side udviklingen af midler og 5 fremgangsmåder til via rekombinant-DNA-teknologi at producere tilstrækkelige mængder dyreinterferoner, hvilket igen muliggør bestemmelsen af deres biokemiske egenskaber og bioaktivitet og åbner for deres effektive produktion til kommerciel/biologisk udnyttelse.

10

De publikationer, som der henvises til i denne ansøgning for at belyse opfindelsens baggrund og, i særlige tilfælde, give yderligere detaljer med hensyn til dens udøvelse, er af nemhedsgrunde samlet i den vedføjede bibliogra-15 fi, til hvis numre der henvises i den følgende tekst.

Opfindelsens baggrund A. Dyreinterferoner 20

Interferonkomponenter er blevet isoleret fra væv af forskellige lavere phylogenetiske arter end menneskets (1, 2, 3). Aktivitetsundersøgelser gennemført med disse in terferoner har påvist forskellige grader af antivirale 25 virkninger hos det pågældende værtsdyr (3, 4, 5, 6). Det er også blevet påvist, at disse interferoner ikke altid er artsspecifikke. F.eks. havde præparater af okseinterferoner isoleret fra væv antiviral aktivitet på abe- og menneskeceller (7). Ligeledes har humane interferoner 30 vist sig aktive i forskellige celler af phylogenetisk lavere arter (se 7).

Denne aktivitet hos forskellige arter skyldes uden tvivl en høj grad af homolog bevarelse, både med hensyn til 35 aminosyresammensætning og -sekvens, blandt interferoner- DK 171790 B1 3 ne. Imidlertid er denne forklaring hidtil forblevet teoretisk , fordi de mængder og renheder af dyreinterferoner, som har kunnet opnås, var utilstrækkelige til at udføre entydige forsøg med hensyn til karakteriseringen og de 5 biologiske egenskaber af de rensede komponenter i forhold til flere af deres humane modparter (8, 9, 10, 11, 12).

I hvert fald er der, trods disse lave mængder og renheder, blevet fastslået en kausal forbindelse mellem inter-10 feron og antiviral aktivitet hos den pågældende dyrevært. Således ville fremstillingen af dyreinterferoner i høje udbytter og renheder være meget ønskelig for at påbegynde og med held gennemføre dyreforsøg, som kunne føre til kommerciel udnyttelse til behandling af dyr for virusin-15 fektioner og maligne og immunoundertrykte eller immunode-ficiente tilstande. Desuden ville produktionen af isolerede dyreinterferonarter muliggøre deres karakterisering, både fysisk og bioaktiv, og således danne basis for kategorisering og deraf følgende sammenligningsundersøgelser 20 med tilsvarende humane interferonarter (se 8 - 20).

De undersøgelser, som hidtil er blevet foretaget med dyreinterferoner, og som på grund af deres meget lave tilgængelighed har været begrænset til anvendelsen af temme-25 lig rå præparater, antyder ikke desto mindre meget vigtige biologiske funktioner. Ikke blot har klassen af dyreinterferoner en kraftig tilknyttet terapeutisk antiviral aktivitet, men også mulighed som profylaktisk tilsætning til vaccine og/eller antibiotisk behandling, hvilket 30 klart peger på meget lovende kliniske og kommercielle kandidater.

Det blev indset, at anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi ville være en meget effektiv måde at tilveje-35 bringe de nødvendige større mængder af dyreinterferoner, 4 DK 171790 B1 som var nødvendige til at opnå klinisk og kommerciel udnyttelse. Hvad enten de således producerede materialer ville inkludere glycosylering, der betragtes som karakteristisk for nativt afledt materiale, eller ej, ville de 5 sandsynligvis udvise bioaktivitet, som tillod deres anvendelse klinisk til behandling af et bredt område af vi-rale, neoplastiske og immunoundertrykte tilstande eller sygdomme hos dyr.

10 B. Rekombinant-DNA-teknologi

Rekombinant-DNA-teknologien har allerede nået en vis finpudsning. Molekylærbiologer er i stand til at rekombinere forskellige DNA-sekvenser med nogen lethed og skabe hid-15 til ukendte DNA-enheder, som er i stand til at producere rigelige mængder af exogent proteinprodukt i transformerede mikroorganismer. Man råder over de almene midler og fremgangsmåder til in vitro ligering af forskellige stump-endede eller kohærent-endede fragmenter af DNA til 20 frembringelse af kraftige ekspressionsmedier, som er nyttige til transformering af bestemte organismer og således dirigerer deres effektive syntese af et ønsket exogent produkt. Imidlertid er vejen for et individuelt produkt stadig noget indviklet, og videnskaben er ikke nået frem 25 til et stade, hvor der regulært kan forudsiges held. Faktisk løber de, som påberåber sig heldige resultater uden det nødvendige forsøgsgrundlag, en betydelig risiko for, at det ikke virker.

30 Plasmidet, en ekstrakromosomal løkke af dobbeltstrenget DNA, som findes hos bakterier og andre mikroorganismer, ofte i flere kopier pr. celle, forbliver et grundelement i rekombinant-DNA-teknologien. Inkluderet i den information, som er indkodet i plasmid-DNA'en, er den der kræves 35 til at reproducere plasmidet i datterceller (dvs. et re- DK 171790 B1 5 plikationsorigin) og almindeligvis en eller flere fænoty-piske selektionsegenskaber, såsom i tilfælde af bakterier, resistens over for antibiotica, hvilket gør det muligt at genkende kloner af værtscellen indeholdende det 5 ønskede plasmid og dyrke dem med fortrin i selektive medier. Anvendeligheden af plasmider ligger i, at de kan spaltes specifikt af en eller anden restriktionsendonu-clease eller "restriktionsenzym", en type enzymer, som hver genkender et forskelligt sted på plasmid-DNA'en.

10

Derefter kan heterologe gener eller genfragmenter indsættes i plasmidet ved ende-mod-ende-sammenføjning ved spaltningsstedet eller ved rekonstruerede ender op til spaltningsstedet. Således dannes såkaldte replikerbare 15 ekspressionsmedier. DNA-rekombination gennemføres uden for cellen, men det resulterende "rekombinante" replikerbare ekspressionsmedium, dvs. det rekombinante plasmid, kan indføres i celler ved en proces, der kendes som transformation, og store mængder af det rekombinante me-20 dium kan opnås ved dyrkning af transformanten. Hvor endvidere genet er rigtigt indsat med hensyn til dele af plasmidet, som styrer transkriptionen og translationen af det indkodede DNA-budskab, kan det resulterende ekspressionsmedium anvendes til faktisk at producere den poly-25 peptidsekvens, for hvilken det indsatte gen koder, en proces, der betegnes som ekspression.

Ekspressionen startes i et område, der kendes som promotoren, og som genkendes og bindes af RNA-polymerase. I 30 transkriptionsfasen af ekspressionen vikles DNA'en op og blottes som skabelon for startet syntese af budbringer-RNA (mRNA) ud fra DNA-sekvensen. MRNA'en translateres på sin side til et polypeptid med den aminosyresekvens, som er indkodet af mRNA'en. Hver aminosyre er indkodet af en 35 nucleotidtriplet eller "codon", og samlingen af disse ud- 6 DK 171790 B1 gør "strukturgenet", dvs. den del, som koder for aminosy-resekvensen af det udtrykte polypeptidprodukt. Translation startes ved et startsignal (almindeligvis ATG, som i den resulterende mRNA bliver AUG). Såkaldte stop-codoner 5 definerer afslutningen af translationen og dermed produktionen af yderligere aminosyreenheder. Det resulterende produkt kan i mikrobielle systemer, om nødvendigt, opnås ved lysering af værtscellen og udvinding af produktet ved passende rensning fra andre proteiner.

10 I praksis kan anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi udtrykke helt heterologe polypeptider, såkaldt direkte ekspression, eller kan alternativt udtrykke et heterologt polypeptid fusioneret med en del af aminosyresekvensen af 15 et homologt polypeptid. I det sidstnævnte tilfælde gøres det ønskede bioaktive produkt sommetider bioinaktivt i det fusionerede, homologt/heterologe polypeptid, indtil det spaltes i et ekstracellulært miljø (21, 22).

20 C. Cellekulturteknologi

Teknikken med celle- eller vævskulturer til undersøgelse af genetik og cellefysiologi er veletableret. Der rådes over midler og fremgangsmåder til bevarelse af permanente 25 cellelinier, fremstillet ved successive overførsler fra isolerede normalceller. Til brug ved forskning holdes sådanne cellelinier på en fast bærer i flydende medium eller dyrkes i suspension indeholdende nødvendige næringsstoffer. Opskalering til præparationer i stor målestok 30 synes kun at frembyde mekaniske problemer (se alment 23, 24).

35 DK 171790 B1 7

Sammenfatning af opfindelsen

Opfindelsen er baseret på den erkendelse, at rekombinant-DNA-teknologi kan anvendes til med held at producere dy-5 reinterferoner og hvert af dem fortrinsvis i direkte form og i tilstrækkelige mængder til at starte og gennemføre klinisk afprøvning som forudsætning for markedsføring. Produktet er egnet til brug i alle dets former ved profylaktisk eller terapeutisk behandling af dyr, især for vi-10 rusinfektioner og maligne og immunoundertrykte eller im-munodeficiente tilstande. Dets former inkluderer forskellige mulige oligomere former, som kan inkludere tilknyttet glycosylering såvel som allele variationer af individuelle medlemmer eller familieenheder. Produkterne produ-15 ceres af genetisk manipulerede mikroorganismer eller cellekultursystemer. Således foreligger der nu mulighed for at fremstille og isolere dyreinterferoner på en mere effektiv måde end det hidtil har været muligt. En væsentlig faktor ved den foreliggende opfindelse i dens mest fore-20 trukne udførelsesform er gennemførelsen af genetisk dirigering af en mikroorganisme eller cellekultur til at producere et repræsentativt dyreinterferon, okseinterferon, i isolerbare mængder, produceret af værtscellen i moden form. Opfindelsen omfatter således producerede dyreinter-25 feroner og midlerne og fremgangsmåderne til deres fremstilling. Opfindelsen er yderligere rettet mod repliker-bare DNA-ekspressionsmedier indeholdende gensekvenser, der koder for dyreinterferoner i udtrykkelig form. Endvidere er opfindelsen rettet mod mikroorganismestammer el-30 ler cellekulturer transformeret med de ovenfor beskrevne ekspressionsmedier og mod gæringsmedier omfattende således transformerede stammer eller kulturer, som er i stand til at producere dyreinterferoner.

8 DK 171790 B1 I endnu andre henseender er opfindelsen rettet mod forskellige fremgangsmåder til fremstilling af de nævnte inter ferongensekvenser, DNA-ekspressionsmedier, mikroorga-nismestammer og cellekulturer og mod specifikke udførel-5 sesformer deraf. Endvidere er opfindelsen rettet mod fremstillingen af gæringskulturer af de nævnte mikroorganismer og cellekulturer. Endvidere kan der i visse værts-systemer udformes vektorer til at producere det ønskede dyreinterferon secerneret fra værtscellen i moden form.

10 Interferonet indeholdende signalsekvensen afledt fra det 5'-flankerende område til selve genet antages at blive transporteret til værtsorganismens cellevæg, hvor signalportionen, der har hjulpet med til denne transport, fraspaltes under sekretionsprocessen for det modne inter-15 feronprodukt. Denne udførelsesform muliggør isoleringen og rensningen af det ønskede modne interferon, uden at man behøver at gribe til indviklede procedurer udformet til at fjerne forureninger af intracellulært værtsprotein eller cellerester.

20

Desuden er opfindelsen specifikt rettet mod fremstillingen af et okseinterferon, som er repræsentativt for den heri omhandlede klasse af dyreinterferoner, frembragt ved direkte ekspression i moden form.

25 I denne beskrivelse skal udtrykket "modent dyreinterferon" betegne funktionen i en mikroorganisme eller cellekultur af dyreinterferon uden ledsagelse af det signalpeptid eller præsekvenspeptid, som umiddelbart ledsager 30 translationen af dyreinterferon-mRNA'en. Der tilvejebringes således ifølge opfindelsen modent dyreinterferon med methionin som dets første aminosyre (til stede på grund af ATG-startsignal-codon-indsætningen foran strukturgenet) eller, hvor methioninet fraspaltes intra- eller ex-35 tracellulært, med dets normalt første aminosyre. Modent DK 171790 B1 9 dyreinterferon kan ifølge opfindelsen også fremstilles med et andet konjugeret protein end det konventionelle signalpolypeptid, således at konjugatet er specifikt spalteligt i et intra- eller extracellulært miljø (se 5 21). Endelig kan det modne dyreinterferon produceres ved direkte ekspression uden behov for fraspaltning af noget fremmed, overflødigt polypeptid. Dette er særlig vigtigt, hvor en given vært ikke eller ikke effektivt nok kan fjerne et signalpeptid, hvor ekspressionsmediet er udfor-10 met til at udtrykke det modne interferon sammen med dets signalpeptid. Det således producerede modne interferon udvindes og renses til et niveau, som gør det egnet til anvendelse ved behandling af virale, maligne og immunoun-dertrykte eller immunodeficiente tilstande.

15

Dyreinterferoner i opfindelsens forstand er dem, som i øvrigt er endogene for dyreorganismen, herunder i analog nomenclatur til humane interferoner, dyre-a- (leukocyt-), -β- (fibroblast-) og -γ- (immun-)interferoner. Alle tre 20 rækker er blevet identificeret i en dyremodel. Endvidere er dyre-a-rækken, baseret på okse-eksemplet, sammensat af en familie af proteiner ligesom i det humane tilfælde; de som er undersøgt har en lavere grad af homologi til de tilsvarende humane α-interferoner end såvel de pågældende 25 dyreinterferoner indbyrdes som de humane a-interferoner indbyrdes. Desuden er okse-P-rækken sammensat af en familie af proteiner, der klart adskiller sig fra det humane tilfælde. Endvidere tilvejebringer den foreliggende opfindelse interarts- og intrafamilie-hybridinterferoner 30 ved at drage fordel af fælles restriktionssteder i generne af de forskellige omhandlede dyreinterferoner og re-kombinere tilsvarende dele ifølge kendte metoder (se 57).

I hvert fald inkluderer de her omhandlede dyreinterfero- 35 ner dem, som normalt er endogene for dyr af fugle-, ok- 10 DK 171790 B1 se-, hunde-, heste-, katte-, gede-, fåre-, fiske- og svi-nefamilierne. Især tilvejebringer opfindelsen interferoner af klovbærende dyr, såsom kvæg, får og geder. De ifølge opfindelsen fremstillede interferoner finder an-5 vendelse som antivirale og antitumor-midler hos det respektive værtsdyr. F.eks. vil okseinterferoner finde praktisk anvendelse til behandling af respiratorisk kom-plex hos kvæg, enten i forbindelse med (i sig selv) kendte antibiotica som terapeutisk komponent eller med vacci-10 ner som profylaktisk komponent. Klasseanvendeligheden, påvist som beskrevet ovenfor, vil kunne udstrækkes til andre oksearter og til geder, får, svin, heste, hunde, katte, fugle og fisk. Hos heste, hunde, katte og fugle vil antitumor-virkningen af de tilsvarende interferoner 15 kunne forventes at være særlig vigtig kommercielt.

Det følgende grundskema, beskrevet med henvisning til okseinterferon som repræsentant for klassen, kan anvendes til fremstilling af de omhandlede dyreinterferoner i 20 overensstemmelse med opfindelsen: 1. Oksevæv, f.eks. oksepancreasvæv, blev reduceret til et frosset pulver og behandlet for at nedbryde RNA og proteinmaterialer og ved udfældning tilvejebringe højmo- 25 lekylær okse-DNA.

2. Den højmolekylære DNA blev delvis nedbrudt til tilfældig overklipning med hensyn til genlocus.

30 3. De resulterende DNA-fragmenter blev størrelsesfrak tioneret, hvorved der blev opnået fragmenter på 15 - 20 kilobasepar.

4. De resulterende fragmenter fra trin 3 blev klonet 35 under anvendelse af en λ Charon 30 fag-vektor.

DK 171790 B1 11 5. De således fremstillede vektorer blev pakket in vitro til infektiøse fagpartikler indeholdende rDNA til opnåelse af et fagbibliotek. Dette blev forøget ved formering på bakterieceller til omkring 10® gange. Fagen 5 blev udsået til faktisk sammenflydning på et tæppe af bakterier og screenet for hybridisering med en radioaktiv human-interferon-sonde.

6. Fra de passende kloner blev den tilsvarende DNA 10 isoleret og restriktionskortlagt og analyseret ved

Southern-hybridisering. Restriktionsfragmenter indeholdende okseinterferongener blev subklonet i plasmidmedier og derpå sekvensbestemt.

15 7. Den sekvensbestemte DNA blev derpå tilpasset in vitro til indsætning i et passende ekspressionsmedium, som blev anvendt til at transformere en passende værtscelle, som på sin side fik lov at vokse i en kultur og udtrykke det ønskede okseinterferonprodukt.

20 8. Således fremstillet okseinterferon har 166 aminosyrer i dets modne form, begyndende med cystein, og 23 i præsekvensen, og er meget hydrofobt af karakter. Dets monomere molekylvægt er blevet beregnet til omkring 21409.

25 Det udviser egenskaber, der minder om humane leukocytinterferoner (8, 9, 10, 11) og har vist sig at være omkring 60 % homologt med et humant leukocytinterferon.

Beskrivelse af foretrukne udførelsesformer 30 A. Mikroorganismer/cellekulturer 1. Bakteriestammer/promotorer 12 DK 171790 B1

Det heri beskrevne arbejde blev gennemført under anvendelse af blandt andet mikroorganismen E. coli K-12 stamme 294 (end A, thi”, hsr“, jchsm+) (25). Denne stamme er blevet deponeret i the American Type Culture Collection, 5 ATCC accessionsnr. 31446. Imidlertid er forskellige andre mikroorganimestammer nyttige, herunder kendte E. coli stammer, såsom E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC nr. 31537) og E. coli W 3110 (F_, λ”, prototroph) (ATCC nr. 27325), E. coli DP 50 SuPF (ATCC nr. 39061, deponeret 5. marts 10 1982), E. coli JM83 (ATCC nr. 39062, deponeret 5. marts 1982), eller andre mikroorganismestammer, hvoraf mange er deponeret i og (potentielt) tilgængelige fra anerkendte mikroorganismedeponeringsinstitutioner, såsom the American Type Culture Collection (ATCC), jfr. ATCC-kataloget 15 (se også 26, 26a). Disse andre mikroorganismer inkluderer f.eks. baciller, såsom Bacillus subtilis, og andre Ente-robacteriaceae, blandt hvilke der som eksempler kan nævnes Salmonella typhimurium og Serratia marcescens, under udnyttelse af plasmider, som kan replikere og udtrykke 20 heterologe gensekvenser deri.

Som eksempler er β-lactamase- og lactosepromotorsystemer med fordel blevet anvendt til at starte og opretholde mikrobiel produktion af heterologe polypeptider. Detaljer 25 med hensyn til sammensætningen og konstruktionen af disse promotorsystemer kan fås fra referencerne (27) og (28).

For nylig er der blevet udviklet et system baseret på tryptophan-operonet, det såkaldte trp-promotorsystem. Detaljer med hensyn til sammensætningen og konstruktionen 30 af dette system er blevet offentliggjort af Goeddel et al. (12) og Kleid et al. (29). Talrige andre mikrobielle promotorer er blevet opdaget og udnyttet, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser, der gør det muligt for en fagmand at ligere dem funktionelt i plasmidvekto-35 rer, er blevet offentliggjort (se 30).

DK 171790 B1 13 2. Gærstammer/gærpromotorer

Det omhandlede ekspressionssystem kan også anvende plas-midet YRp7 (31, 32, 33), som er i stand til selektion og 5 replikation i både E. coli og gæren Saccharomyces cerevi-siae. Til selektion i gær indeholder plasmidet TRPl-genet (31, 32, 33), som kompletterer (tillader vækst i fravær af tryptophan) gær indeholdende mutationer i dette gen, som findes på gærens kromosom IV (34). En nyttig stamme 10 er stamme RH218 (35) deponeret i the American Type Culture Collection uden begrænsning (ATCC nr. 44076). Imidlertid vil det forstås, at enhver Saccharomyces cerevisiae stamme indeholdende en mutation, som gør cellen trpl, skulle være et effektivt miljø for ekspression af plasmi-15 det indeholdende ekspressionssystemet. Et eksempel på en anden stamme, som kunne anvendes, er pep4-l (36). Denne tryptophan-auxotrophe stamme har også en punktmutation i TRPl-genet.

20 Når den anbringes på 5'-siden af et ikke-gær-gen, kan den 5'-flankerende DNA-sekvens (promotoren) fra et gærgen (for alkoholdehydrogenase 1) promotere ekspressionen af et fremmed gen i gær, når den anbringes i et plasmid, der anvendes til at transformere gæren. Foruden en promotor 25 kræver rigtig ekspression af et ikke-gær-gen i gær en anden gærsekvens anbragt ved 3'-enden af ikke-gær-genet på plasmidet for at muliggøre rigtig transcriptionsafslutning og polyadenylering i gær. Denne promotor såvel som andre (se nedenfor) kan passende anvendes ifølge den 30 foreliggende opfindelse. I de foretrukne udførelsesformer anbringes den 5'-flankerende sekvens af gær-3-phosphoglyceratkinase-genet (37) ovenfor strukturgenet efterfulgt igen af DNA indeholdende afslutnings-polyade-nylerings-signaler, f.eks. TRPl-genet (31, 32, 33) eller 35 PGK-genet (37).

14 DK 171790 B1

Eftersom gær-5'-flankerende sekvens (i forbindelse med 3'-gær-afslutnings-DNA, se nedenfor) kan promotere ekspression af fremmede gener i gær, forekommer det sandsyn-5 ligt, at de 5'-flankerende sekvenser af ethvert kraftigt udtrykt gærgen vil kunne anvendes til ekspression af vigtige genprodukter. Da gær under nogle omstændigheder udtrykte op til 65 % af dens opløselige protein som glyco-lytiske enzymer (38), og da dette høje niveau synes at 10 skyldes produktionen af høje niveauer af de individuelle mRNA'er (39), skulle det være muligt at anvende de 5'-flankerende sekvenser af hvilke som helst andre glycoly-tiske gener til sådanne ekspressionsformål, f. eks. eno-lase, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, 15 pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose 6-phosphat-isomerase, 3-phosphoglycerat-mutase, pyruvatki-nase, triosephosphat-isomerase, phosphoglucose-isomerase og glucokinase. Enhver af de 3'- flankerende sekvenser af disse gener kunne også anvendes til rigtig afslutning og 20 mRNA-polyadenylering i et sådant ekspressionssystem, jfr. ovenfor. Nogle andre kraftigt udtrykte gener er dem for de sure phosphataser (40) og dem, der udtrykker høje niveauer af produktion på grund af mutationer i de 5'-flankerende områder (mutanter, der forøger ekspression), 25 sædvanligvis på grund af tilstedeværelsen af et Tyloverførbart element (41).

Alle de ovennævnte gener antages at transcriberes af gær-RNA-polymerase II (41). Det er muligt, at promotorerne 30 for RNA-polymerase I og III, som transcriberer gener for ribosomal RNA, 5S RNA og tRNA'er (41, 42), også kan være nyttige til sådanne ekspressionskonstruktioner.

Endelig indeholder mange gærpromotorer også transcripti-35 ons ontrol, således at de kan slås fra eller til ved va- DK 171790 B1 15 riation i vækstbetingelserne. Nogle eksempler på sådanne gærpromotorer er de gener, der producerer de følgende proteiner: Alkoholdehydrogenase II, isocytochrom-c, sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogen-5 metabolismen, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase og enzymer, der er ansvarlige for maltose- og galactoseud-nyttelse (39). Et sådant kontrolområde ville være meget nyttigt til at styre ekspressionen af proteinprodukter, især når deres produktion er toxisk for gær. Det skulle 10 også være muligt at sætte kontrolområdet af én 5'-flankerende sekvens sammen med en 5'-flankerende sekvens indeholdende en promotor fra et kraftigt udtrykt gen. Dette ville resultere i en hybrid promotor og skulle være muligt, da kontrolområdet og promotoren synes at være fy-15 sisk adskilte DNA-sekvenser.

3. Cellekultursystemer/cellekulturvektorer

Formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er 20 blevet en rutineprocedure i de seneste år (se 43). COS-7 linien af abenyrefibroblaster kan anvendes som vært for produktionen af dyreinterferoner (44). Imidlertid kunne de her beskrevne forsøg gennemføres i enhver cellelinie, som er i stand til at replikere og udtrykke en kompatibel 25 vektor, f.eks. WI38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VERO og HeLa cellelinier.

Hvad der kræves af ekspressionsvektoren, er et replikati-onsorigin og en promotor lokaliseret foran genet, som 30 skal udtrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindingssteder, RNA-aplejsningssteder, polyadenylerings-sted og transcriptionsterminatorsekvenser. Selv om disse nødvendige elementer af SV40 er blevet udnyttet i denne beskrivelse, vil det forstås, at opfindelsen ikke er be-35 grænset til disse sekvenser. F.eks. kunne der anvendes 16 DK 171790 B1 replikationsoriginet af andre virale (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV osv.) vektorer såvel som cellulære origi-ner for DNA-replikation, som kunne fungere i en ikke-integreret tilstand.

5 B. Vektorsystemer 1. Direkte ekspression af modent okseinterferon i E. coli 10

Den procedure, der anvendtes til at opnå direkte ekspression af okseinterferon i E. coli som et modent inter-feronpolypeptid (minus aignalsekvens) involverede kombinationen af et plasmid indeholdende et promotorfragment 15 og et translationsstartsignal med et tilpasset fragment af dyregenomisk DNA, der indeholdt kodeområdet for det modne interferon.

2. Ekspression i gær 20

For at udtrykke et heterologt gen, såsom DNA for dyrein-terferon, i gær, er det nødvendigt at konstruere en plas-midvektor indeholdende dyrekomponenter. Den første komponent er den del, som muliggør transformation af både E.

25 coli og gær og således må indeholde et selekterbart gen fra hver organisme, såsom genet for ampicillinresistens fra E. coli og genet TRP1 fra gær. Denne komponent kræver også et replikationsorigin fra begge organismer for at opretholdes som plasmid-DNA i begge organismer, såsom E.

30 coli originet fra pBR322 og arsl-originet fra gærens kromosom III.

Den anden komponent af plasmidet er en 5'-flankerende sekvens fra et kraftigt udtrykt gærgen til at promotere 35 transcription af et nedenfor anbragt strukturgen, såsom DK 171790 B1 17 den 5'-flankerende sekvens fra gær-3-phosphoglycerat-kinase (PGK)-genet.

Den tredje komponent af systemet er et strukturgen kon-5 strueret på en sådan måde, at det indeholder både et ATG-translationsstartsignal og translationsstopsignaler. Isoleringen og konstruktionen af et sådant gen er beskrevet nedenfor.

10 Den fjerde komponent er en gaer-DNA-sekvens indeholdende den 3'-flankerende skvens af et gærgen, som indeholder de rigtige signaler for transcriptionsafslutning og polyade-nylering.

15 3. Ekspression i pattedyrcellekultur

Strategien for syntesen af immuninterferon i pattedyrcellekultur hviler på udviklingen af en vektor, som er i stand til både autonom replikation og ekspression af et 20 fremmed gen under styring af en heterolog transcriptions-enhed. Replikationen af denne vektor i vævskultur kan opnås ved at tilvejebringe et DNA-replikationsorigin (afledt fra SV40 virus) og tilvejebringe hjælperfunktion (T-antigen) ved indførelse af vektoren i en cellelinie, 25 der endogent udtrykker dette antigen (46, 47). Den sene promotor fra SV40 virus kom foran strukturgenet for interferon og sikrede transcription af genet.

En nyttig vektor til opnåelse af ekspression består af 30 pBR322-sekvenser som tilvejebringer en selekterbar markør til selektion i E. coli (ampicillinresistens) såvel som et E. coli origin for DNA-replikation. Disse sekvenser afledes fra plasmidet pML-1 (46) og omfatter det område, der spænder over EcoRI- og BamHI-restriktionsstederne.

35 SV40 originet afledea fra et 342 basepar PvuII-Hindlll- 18 DK 171790 B1 fragment, der indeslutter dette område (48, 49) (idet begge ender omdannes til EcoRI-ender). Foruden at omfatte det virale origin for DNA-replikation har disse sekvenser indkodet promotoren for både den tidlige og den sene 5 transcriptionsenhed. Orienteringen af SV40-origin-området er sådan, at promotoren for den sene transcriptionsenhed er anbragt proximalt til genet, der koder for interferon.

Kort beskrivelse af tegningerne 10

Fig. 1 viser en Southern-hybridisering af (a) menneske-, (b) okse- og (c) svine-genomisk DNA nedbrudt med EcoRI og hybridiseret ved forskellige formamidkoncentrationer med et P-mærket EcoRI-fgragment på 570 basepar indeholdende 15 kodeområdet for den humane leukocyt-interferon-A/D-hybrid. Hybridiseringen ved 20 % formamid giver det klareste mønster af de multigene okse- og svine-leukocytin-terferon-genfamilier.

20 Fig. 2 viser en Southern-hybridisering af fire forskellige okse-genomiske DNA/fag-rekombinanter nedbrudt med Eco- •jo RI, BamHI eller Hindlll og hybridiseret med en P-mærket human leukocytgensonde. Klon 83 giver to hybridiserende fragmenter med hvert restriktionsenzym.

25

Fig. 3A viser en del af nucleotidsekvensen fra plasmids-ubklonen p83BamHI på 1,9 kb såvel som den afledte amino-syresekvens for okse-leukocytinterferon indikodet deri. Signalpeptidet repræsenteres af aminosyreresterne 30 SI - S23.

Fig. 3B viser nucleotidsekvensen og den afledte aminosy-resekvens for et andet okse-leukocytinterferon (a2) fra plasmidsubklonen p67EcoRI på 3,2 kb.

35 DK 171790 B1 19

Fig. 3C viser den komplette modne nucleotidsekvens og afledte aminosyresekvens for et tredje okse-leukocytinter-feron (a3) fra plasmidsubklonen p35EcoRI-BamHI på 3,5 kb.

5 Fig. 3D viser nucleotidsekvensen og den afledte aminosyresekvens for et fjerde okse-leukocytinterferon fra plasmidsubklonen p83EcoRI-BamHI på 2,9 kb. Signalpeptidet repræsenteres af aminosyreresterne Si - S23. Det modne protein omfatter 172 aminosyrerester. Det bemærkes, at den 10 sidste strækning på seks aminosyrerester tilskrives en nucleotidbaseændring ved position 501, som tillader seks yderligere translaterbare codoner før det næste i-fase stopsignal.

15 Fig. 4 sammenligner aminosyresekvenserne af BoIFN-al, a2, a3 og a4 med sekvenserne for 11 kendte humane leukocytinterferoner. Der er også anført de aminosyrer, som er bevaret blandt alle humane leukocytinterferoner, alle okse-leukocytinterferoner og med hensyn til okse-al og -a4 de 20 positioner, hvor der forekommer homologi med hovedparten af humane leukocytinterferoner.

Fig. 5 er et skematisk diagram af konstruktionen af det okse-leukocytinterferon-udtrykkende plasmid pBoIFN-25 altrp55. Udgangsmaterialerne er trp-ekspressionsvektoren pdelaRIsrc og BamHI-fragmentet fra plasmidsubklonen p83BamHI 1,9 kb.

Fig. 6 viser en Southern-hybridisering af okse-DNA ned-30 brudt med enten EcoRI, Hindlll, BamHI, Bglll og PvuII med en radioaktiv sonde fremstillet ud fra BoIFN-al eller BoIFN-a4-genfragmenter. Hvert IFN-gen hybridiserer fortrinsvis med en afgrænset underfamilie af BoIFN-a-gener.

20 DK 171790 B1

Fig. 7 viser et restriktionskort over de genomiske okse-DNA-indsaetninger fra tre fag-rekombinanter, som hybridi-serer den humane interferongen-sonde fra humane fibrobla-ster. Lokaliseringen og orienteringen af hvert BoIFN-β er 5 angivet ved en sort kasse. Restriktionssteder markeret med en stjerne repræsenterer delvis restriktionskortlægningsinformation .

Fig. 8 viser et restriktionskort med finere opløsning for 10 de tre gener omhandlet i fig. 7. Skravering repræsenterer signalsekvensen, gråtoning den modne sekvens.

Fig. 9a, 9b og 9c viser nucleotidsekvensen og den afledte aminosyresekvens for BoIFN-βΙ, -2 og -3-generne.

15

Fig. 10 sammenligner aminosyresekvenserne for de tre BoIFN^-gener med HuIFN^-genet.

Fig. 11 er en Southern-afdupning af fig. 6 rehybridiseret 20 med en BoIFN^l-gen-sonde under betingelser, hvorved i almindelighed kun et enkelt hybridiseringsfragment ville blive synligt ved gennemførelse af et analogt forsøg med human genomisk DNA og HuIFN^-genet (9).

25 Fig. 12 viser skematisk den strategi, som anvendes til at udtrykke alle tre ΒοΙΡΝ-β-gener under styring af trp-operonet fra E. coli.

Fig. 13 giver sammenligningen af de afledte aminosyrese-30 kvenser af BoIFN-γ, HuIFN-γ, og muse-IFN-γ.

Detailbeskrivelse

Den følgende detaljerede beskrivelse belyser opfindelsen 35 med hensyn til fremstillingen via rekombinant-DNA-tek- DK 171790 B1 21 nologi af de forskellige omhandlede dyreinterferoner og angiver alment anvendelig metodologi for fremstillingen af bestemte okse-leukocytinterferoner. Fremgangsmåden er beskrevet med hensyn til et bakterielt system.

5

A. Isolering af okse-DNA

Med det formål at konstruere et dyregenbibliotek blev højmolekylær DNA isoleret fra dyrevæv ved en modifikation 10 af den procedure, som er beskrevet af Blin og Stafford (50), fragmenteret tilfældigt med hensyn til genlocus og størrelsesfraktioneret til opnåelse af 15 - 20 kilobase fragmenter til kloning i en λ fag-vektor (51).

15 Frosset væv, f.eks. oksepancreas, blev formalet til et fint pulver i flydende nitrogen og solubiliseret i 0,25 M EDTA, 1 % Sarkosyl, 0,1 mg/ml Proteinase K (25 ml/g væv) ved 50 °C i tre timer. Den opnåede viskose opløsning blev deproteineret ved tre phenolfældninger og en chloroform-20 fældning, dialyseret over for 50 mM "Tris"-HCl (pH 8), 10 mM EDTA, 10 mM NaCl og nedbrudt med varmebehandlet pan-creatisk ribonuclease (0,1 mg/ml) i 2 timer ved 37 °C. Efter phenol- og etherekstraktion blev DNA'en udfældet med to volumener ethanol, vasket i 95 % ethanol, lyophi-25 liseret og genopløst i TE-puffer (10 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) natten over ved 4 °C i en slutkoncentration på 1 - 2 mg/ml. Det endelige DNA-præparat var på mere end 100 kilobaser i længde som 30 bestemt ved elektroforese på en 0,5 % neutral agarosegel.

B. Delvis endonuclease-nedbrydning og størrelsesfraktionering af okse-DNA

22 DK 171790 B1

Aliquoter (0,1 mg) af okse-DNA blev nedbrudt med 1,25,

2,5, 5 og 10 enheder Sau3A ved 37 °C i 60 minutter i en reaktionsblanding (1 ml) indeholdende 10 mM "Tris"HCl (pH

7,5), 10 mM MgCl2^ 2 mM dithiothreitol. Inkubationer blev 5 stoppet ved tilsætning af EDTA til 25 mM, og blandingerne blev phenol- og etherekstraheret, gjort 0,3 M med hensyn til natriumacetat (pH 5,2) og udfældet med tre volumener ethanol. DNA'en blev genopløst i TE-puffer ved 68 °C og sedimenteret igennem en 10-40 % lineær saccharosegradient 10 (51) i en Beckman SW 27 rotor ved 27 000 omdr./min i 22 timer ved 20 °C. Fraktioner (0,5 ml) blev analyseret på en 0,5 % gel under anvendelse af EcoRI-nedbrudt Charon 4A (51a) DNA som molekylvægtstandard. De fraktioner, der indeholdt 15-20 kilobase DNA-fragmenter, blev kombineret, 15 fældet med ethanol og genopløst i TE-puffer.

C. Konstruktion af det genomiske okse-DNA-bibliotek 15 - 20 kb okse-DNA-blandingen fra den ubegrænsede ned-2 0 brydning blev klonet ind i en λ Charon 30 A vektor (52) med G-A-T-C-kohæsive ender skabt ved fjernelse af de to indre BamHI-fragmenter i fagen. Charon 30 A blev dyrket i E. coli stamme DP 50 SupF (ATCC nr. 39061, deponeret 5. marts 1982) i NZYDT væske, koncentreret ved polyethy-25 lenglycolfældning og renset ved CsCl-densitetsgradient-centrifugering (53). Fag-DNA blev fremstillet ved ekstra-hering af den rensede fag to gange med phenol, en gang med phenol og ether og koncentrering af DNA'en ved etha-nolfældning.

30

Til fremstilling af endefragmenterne af Charon 30 A blev 50 pg fag-DNA behandlet i 2 timer ved 42 °C i 0,25 ml 50 mM "Tris"-HCl (pH 8), 10 mM MgCl2 og 0,15 M NaCl, nedbrudt fuldstændigt med BamHI, ekstraheret med phenol og 35 ether og sedimenteret igennem en 10 - 40 % saccharosegra- DK 171790 B1 23 dient som beskrevet ovenfor. Fraktioner indeholdende fagens sammensmeltede arme på 32 kb blev kombineret og et-hanolfældet.

5 De rensede Charon 30 A arme (6 pg) blev behandlet igen ved 42 °C i 2 timer, kombineret med 0,3 pg 15 - 20 kb ok-se-DNA og 400 enheder fag-T4~polynucleotidligase og inkuberet natten over ved 12 °C i en 0,075 ml reaktionsblanding indeholdende 50 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 20 mM dithiothreitol og 50 pg/ml okseserumalbumin. Den ligerede DNA-blanding blev derpå pakket til modne λ fagpartikler under anvendelse af et in vitro pakningssystem (54).

15 Komponenterne i dette system: sonisk ekstrakt (SE), fry-se-optøning-lysat (FTL), protein A og puffere A og Ml, blev fremstillet som beskrevet i (54). 3 μΐ aliquoter af den ligerede DNA-blanding blev inkuberet med 15 μΐ puffer A, 2 μΐ puffer Ml, 10 μΐ SE og 1 μΐ protein A i 45 minut-20 ter ved 27 °C. Fryse-optøningslysatet blev optøet på is i 45 minutter, kombineret med 0,1 volumen puffer Ml, centrifugeret ved 35 000 omdr./min ved 4 °C i 25 minutter, og 0,075 ml aliquoter af supernatanten tilsattes til den ovenstående reaktionsblanding. Efter yderligere 2 timers 25 inkubation ved 27 °C blev en lille aliquot af pakningsreaktionsblandingen filtreret på den ovennævnte stamme DP 50 SupF. Denne procedure gav i alt ca. 1,1 x 10® uafhængige okse-DNA-rekombinanter. Resten af pakningsblandingen blev forstærket ved en plade-lysat-metode (52) ved udså-30 ning af rekombinanterne på DP 50 SupF i en tæthed på 10 000 plakdannende enheder pr. 15 cm NZYDT-agarplade.

D. Screening af fagsamlingen for okse-interferon-gener 24 DK 171790 B1

Den strategi, der anvendtes til at identificere fagrekom-binanter bærende okseinterferongener bestod i at detektere nucleotidhomologi med radioaktive sonder fremstillet ud fra klonede humane leukocyt- (8, 9), fibroblast- (12) 5 og immun- (55) interferongener. Hybridiseringsbetingel-serne blev fastslået med Southern-afdupninger (56) af genomisk dyre-DNA. 5 ug hver af højmolekylære DNA'er (fremstillet som beskrevet ovenfor) fra human placenta, oksepancreas og svineunderkæbekirtel blev nedbrudt fuld-10 stændigt med EcoRI, underkastet elektroforese på en 0,5 % agarosegel og overført til nitrocellulosepapir (56). En 32 P-mærket DNA-sonde blev fremstillet ud fra et 570 basepar EcoRI-fragment indeholdende proteinkodeområdet af den modne humane leukocytinterferon-A/D-hybrid ved Bglll-15 restriktionsstedet (57) ved standardprocedurer (58). Hvert nitrocellulosefilter blev forhybridiseret ved 42 °C natten over i 5xSSC (56), 50 mM natriumphosphat (pH 6,5), 0,1 mg/ml ultralydbehandlet lakse-sperm-DNA, 5x Den-hardt's opløsning (59), 0,1 % natriumdodecylsulfat 0,1 % 20 natriumpyrophosphat, der indeholdt 10 %, 20 % eller 30 % formamid, og derpå hybridiseret med 100 x 10® tællinger pr. minut af den mærkede sonde i den samme opløsning indeholdende 10 % natriumdextransulfat (60). Efter inkubation natten over ved 42 °C blev filtrene vasket fire gan-25 ge i 2xSSC, 0,1 % SDS ved stuetemperatur, én gang i 2xSSC og derpå eksponeret på Kodak XR-5 røntgenfilm med Dupont Cronex intensiveringsskærme natten over. Som det ses i fig. 1, spores let et antal hybridiseringsbånd i okse- og svine-DNA-nedbrydningerne, når der er 20 % formamid til 30 stede ved hybridiseringen. Dette resultat giver bevis for en multigenfamilie af leukocytinterferon-gener i okse og svin analoge til den, der tidligere er påvist hos mennesker (12, 61). De samme hybridiseringsbetingelser blev derfor anvendt til at screene for interferongener i okse-35 DNA-biblioteket.

DK 171790 B1 25 500 000 rekombinant-fager blev udsået på DP 50 SupF i en tæthed på 10 000 plakdannende enheder pr. 15 cm plade, og der blev fremstillet kopier i nitrocellulosefilteraftryk for hver plade ved den metode, som er beskrevet af Benton 5 and Davis (62). Filtrene blev hybridiseret med human-LelF-gen-sonden som beskrevet ovenfor. Der blev opnået 96 hybridiserende plakkopier, som gav stærke signaler ved gentagen screening.

10 Okse-DNA-biblioteket blev yderligere screenet for fibroblast- og immun-interferon-gener. Sonder blev fremstillet ud fra et 502 bp Xbal-BgllIl-fragment indeholdende hele det modne humane fibroblastinterferon-gen (12) og et 318 bp Alul-fragment (indeholdende aminosyrerne 12-116) og et 15 190 bp MbolI-fragment (indeholdende aminosyrerne 99-162) fra det modne kodeområde for det humane immuninterferon-gen (55). Hybridisering af 1,2 x 10® rekombinant-fager gav i alt 26 okse-fibroblast- og 10 okse-immuninterferon-kloner.

20 E Karakterisering af rekombinant-fagen

Fag-DNA blev fremstillet (som beskrevet ovenfor) ud fra 12 rekombinanter, som hybridiserede med human leukocytin-25 terferon-sonden. Hver DNA blev nedbrudt enkeltvis og i kombination med Eco RI, Barn HI og Hind III, underkastet elektroforese på en 0,5 % agarosegel, og lokaliseringen af den hybridiserende sekvens kortlagt ved Southern-metoden (56). En sammenligning af enkeltvis nedbrudt DNA 30 fra klonerne 10, 35, 78 og 83 er vist i fig. 2. For hver fag er størrelserne af de iagttagne restriktionsfragmenter såvel som det tilsvarende hybridiseringsmønster klart og ikke-overlappende, hvilket tyder på, at hver af disse fire fager bærer et forskelligt okse-interferon-gen. Des-35 uden giver nedbrydning af klon 83 med hvert af de tre en- 26 DK 171790 B1 zymer i hvert tilfælde to adskilte hybridiseringsbånd, hvilket viser, at denne rekombinant kan bære to tæt sammenknyttede interferongener.

5 F. Subkloning af okse-leukocytinterferon-gener

Restriktionsfragmenter fra tre af rekombinant-fagerne, som hybridiserede med den humane leukocytinterferon-gen-sonde blev subklonet ind i det multiple restriktionsen-10 zym-kloningssted af pBR322-derivatet, pUC9. Plasmidet pUC9 blev afledt fra pBR322 ved først at fjerne 2 067 bp EcoRI-PvuII-fragmentet indeholdende tetracyclinresistens-genet, derpå indsætte et 425 bp HaeII-fragment fra fag Ml3-derivatet mP9 (62a) ind i Haell-stedet af det resul-15 terende plasmid ved position 2352 (i forhold til pBR322-notationen). Haell-fragmentet fra mP9 indeholder det N-terminale kodeområde af E. coli lacZ-genet, hvori der er blevet indsat et multi-restriktionsenzym-kloningssted med sekvensen CCA AGC TTG GCT GCA GGT CGA CGG ATC CCC GGG 20 mellem den fjerde og femte aminosyrerest i β-galactosi-dase. Indsætning af et fremmed DNA-fragment i disse kloningssteder afbryder kontinuiteten mellem lac-promotoren og lacZ-genet og ændrer således fænotypen af en JM83 transformeret med plasmidet fra lac+ til lac" 25

De fragmenter, der blev henvist til ovenfor, var: (a) et 1,9 kb BamHI-fragment og 3,7 kb EcoRI-fragment fra klon 83 (som svarer til ikke-overlappende segmenter af den samme rekombinant), (b) et 3,5 kb BamHI-EcoRI-fragment 30 fra klon 35 og (c) et 3,2 kb EcoRI-fragment fra klon 67.

I hvert tilfælde blev 0,1 ^ig af den passende nedbrudte vektor ligeret med et ti gange molært overskud af det rensede fragment, transformeret ind i E. coli stamme JM83 (ATCC nr. 39062, deponeret 5. marts 1982) og udsået på 35 M9-plader (63) indeholdende 0,04 mg/ml 5-brom-4-chlor-3- DK 171790 B1 27 indolyl-P-D-galactosid og 0,2 mg/ml ampicillin. Hvide kolonier, som antageligvis bærer en DNA-indsætning ved et restriktionssted, som afbryder kodeområdet af lacZ-genet på pUC9, blev opsamlet i 5 ml LB-væske plus 0,02 mg/ml 5 ampicillin, dyrket i flere timer ved 37 °C og screenet for det indsatte fragment ved en plasmid-DNA-minipræpara-tionsprocedure (64).

G. DNA-sekvens af et okse-leukocytinterferon-gen på 10 klon 83 DNA-sekvensen, der strækker sig fra BamHI-stedet i p83BamHI 1,9 kb (1,9 kb fragment-subklonen af klon 83) blev bestemt ved Maxam-Gilbert's kemiske procedure (65) 15 og er vist i fig. 3. Den længste åbne læseramme koder for et polypeptid på 189 aminosyrer med væsentlig homologi til de humane leukocytinterferoner (fig. 4). Ved analogi med de humane proteiner består okse-leukocytinterferonet af et hydrofobt signalpeptid på 23 aminosyrer, som kommer 2 0 forud for et modent protein på 166 aminosyrer med en identisk sekvens, ser-leu-gly-cys. Fire cysteinrester i positionerne 1, 29, 99 og 139 er nøjagtigt bevaret mellem arterne. En parvis homologisammenligning mellem okse- og menneske-interferonerne er vist i tabel 1. Som det kunne 25 forventes, er okseproteinet væsentligt mindre homologt (ca. 60%) med hvert af de humane proteiner end de sidstnævnte er indbyrdes (mere end 80 %).

DNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens for de tre 30 yderligere okse-leukocytinterferon-gener, der forekommer på plasmidsubklonerne p67EcoRI 3,2 kb, p35EcoRI-BamHI 3,5 kb og p83EcoRI 3,7 kb, er vist i henholdsvis fig. 3B, 3C og 3D.

28 DK 171790 B1

Det ses af sammenfatningen i tabel 1, at medens BoIFN-a2 og -a3 generne koder for peptider med kun små synlige forskelle fra BoIFN-al, er BoIFN-a4-proteinet lige så forskelligt fra de andre oksepeptider som ethvert af ok-5 se-leukocytinterferonerne er fra ethvert af de humane leukocytinterferoner.

For at fastslå om a4-genet afledes fra en lige så bred klasse af celleproteiner som de andre BoIFN-a-gener, blev 10 genomisk okse-DNA nedbrudt med flere restriktionsendonu-cleaser og hybridiseret med radioaktive DNA-fragmenter repræsenterende proteinkodeområderne af al-(612 bp AvalI-fragment, fig. 6) og a4-(EcoRI-XmnI-fragmentet af pBoIFN-a4trpl5) generne under betingelser med høj stringens (50 15 % formamid), som ikke tillader krydshybridisering af de to gener. Som det ses i fig. 6 hybridiserer hvert gen fortrinsvis til et klart adskilt sæt af okse-DNA-fragmenter. Disse resultater viser tilsammen klart forekomsten af to forskellige familier af okse-leukocyt-IFN-20 peptider, hvoraf al- og a4- proteinerne kan anses for at være repræsentative medlemmer.

DK 171790 B1 29 TABEL 1

Parvise sammenligninger af forskelle i kodesekvenser af okse- og menneske-IFN-a-gener 5___________

al a2 a 3 a4 aA aB aC aD aF uH al aJ aK

94 92 54 61 62 63 64 61 64~ 63 61 65

BoIFN-al _______ 91 53 61 61 64 63 62 63 63 64 64

BoIFH-a2 96______________ 96 45

BoIFN-a3 100 ________ 52 48 52 54 54 58 55 56 58 56 54 54

BoIFN-a4______________ 56 52 39 81 81 83 82 83 81 80 86

HuIFN-aA______________ 43 39 48 70 81 77 81 83 80 79 81

HuIFH-aB______________ 61 57 52 70 65 81 89 86 94 92 83

HuIFH-aC______________ 52 48 48 74 61 65 83 81 80 78 84

HuIFH-aD______________ 61 57 52 70 65 100 65 83 89 86 83

HuIFN-aF______________ 56 52 52 74 74 74 83 74 84 84 84

HuIFH-aH______________ 61 57 52 70 65 100 65 100 74 91 81 HUIFH-al______________ 56 52 48 61 57 91 70 91 65 91 80

HuIFN-aJ______________

52 48 48 83 70 74 91 74 91 74 65 I

HuIFN-aK i i i i 1 || II I I I I I

Tallene repræsenterer % homologi

Den nederste venstre halvdel repræsenterer præsekvensen på 23 aminosyrerester 10 Den øverste halvdel repræsenterer det modne protein på 166 aminosyrerester A,B,C osv. er de humane leukocytinterferoner A,B,C osv.

15 H. Direkte ekspression af modent BoIFN-al i E. coli

Konstruktionen af det direkte ekspressionsplasmid er sammenfattet i fig. 5. Plasmidsubklonen p83BamHIl,9kb blev nedbrudt fuldstændigt med Ava II, og 612 bp fragmentet 20 indeholdende okse-leukocytinterferon-genet blev isoleret ved elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel og elektro-elueret. Omkring 1,5 ug af dette fragment blev nedbrudt med Fnu4H, ekstraheret med phenol og ether og ethanol fæl- 30 DK 171790 B1 det De resulterende Fnu4H-kohæsive ender blev udstrakt til stumpe ender med 6 enheder DNA-polymerase I (Klenow-fragment) ved 12 °C i 30 minutter i 2 0 μΐ reaktionsblanding indeholdende 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2r 5 4 mM dithiothreitol og 0,1 mM hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP. Efter ekstraktion med phenol og ether blev DNA'en nedbrudt med PstI og underkastet elektroforese på en 6 % gel. Det resulterende 92 bp stump-endede PstI-fragment, som strækker sig fra det første nucleotid af kodeområdet 10 for det modne okse-leukocytinterferon, blev elektroelue-ret fra gelen.

Resten af det modne kodeområde blev isoleret som følger: 3 pg af BamHI-indsætningen i p83BamHI1,9kb blev delvis 15 nedbrudt med 14 enheder Pst I i 10 minutter ved 37 °C i en 45 μΐ reaktionsblanding indeholdende 10 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 2 mM dithiotreitol og ekstraheret med phenol og ether. Det ønskede 1440 bp delvise Pstl-BamHI-fragment, der strækker sig fra nucleotid 93 i 2 0 det modne kodeområde, blev isoleret fra en 6 % polyacry-lamidgel.

Plasmidet pARIsrc er et derivat af plasmidet pSRCexl6 (66), hvori EcoRI-stederne proximalt til trp-promotoren 25 og distalt til src-genet er blevet fjernet ved reparation med DNA-polymerase I (67), og det selvkomplementerende oligodeoxynucleotid AATTATGAATTCAT (syntetiseret ved phosphotriestermetoden (68)) var indsat i det resterende EcoRI-sted umiddelbart op til Xbal-stedet. 20 pg pARIsrc 30 blev nedbrudt fuldstændigt med EcoRI, ekstraheret med phenol og ether og ethanolfældet. Plasmidet blev derpå nedbrudt med 100 enheder nuclease SI ved 16 °C i 30 minutter i 25 mM natriumacetat (pH 4,6), 1 mM ZnCl2 og 0,3 M NaCl til skabelse af en stump ende med sekvensen ATG.

35 Efter phenol- og ether-ekstraktion og ethanol fældning DK 171790 B1 31 blev DNA'en nedbrudt med BamHI, underkastet elektroforese på en 6 % polyacrylamidgel, og det store (4300 bp) vektorfragment udvundet ved elektroeluering.

5 Ekspressionsplasmidet blev samlet ved ligering sammen af 0. 2 ^ig vektor, 0,02 ug af det stump-endede Pstl-fragment på 92 bp og 0,25 pg af det delvise Pstl-BamHI-fragment på 1400 bp med 400 enheder T4~DNA-ligase natten over ved 12 °C og anvendt til at transformere E. coli stamme 294 10 (ATCC nr. 31446) til ampicillinresistens. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra 96 af kolonierne og nedbrudt med Xbal og Pstl. 19 af disse plasmider indeholdt de ønskede 103 bp Xbal-PstI- og 1050 bp Pstl-fragmenter. DNA-sekvensanalyse bekræftede, at flere af disse plasmider 15 havde en ATG-startcodon korrekt placeret ved starten af okse-interferon-kodeområdet. Et af disse plasmider, pBoIFN-altrp55 blev valgt til yderligere undersøgelse.

1. Direkte ekspression af en anden klasse af modent 20 okse-leukocytinterferon (a4) i E. coli.

En ATG-startcodon blev anbragt foran det modne kodeområde ved enzymatisk forlængelse af en syntetisk DNA-primer, CATGTGTGACTTGTCT. Heptadecameren blev phosphoryleret med 25 T/j-polynucleotidkinase og γ-32ρ_ΑΤΡ som tidligere beskrevet (12). 250 pmol af primeren blev kombineret med om kring 1 pg af et 319 bp HincII-fragment indeholdende ami-nosyreresterne 520 - 102 i 30 μΐ vand, kogt i 5 minutter og forlænget med 25 enheder E. coli DNA-polymerase I 30 (Klenow-fragment) ved 37 °C i 3 timer. Produktet af denne reaktion blev nedbrudt med HgiAI, og det resulterende stump-endede HgiAI-fragment på 181 bp blev isoleret fra en 6 % polyacrylamidgel. Hele genet for det modne peptid blev samlet bag trp-promotoren ved enzymatisk ligering af 35 det ovenstående fragment med et 508 bp HgiAI-Pstl-frag- 32 DK 171790 B1 ment indeholdende den carboxylterminale del af peptidet og HuIFN-y-ekspressionsplasmidet, pIFN-y-trp48-13 (55), som var blevet nedbrudt med EcoRI, forlænget til overensstemmende ender med Klenow-DNA-polymerase, nebrudt med 5 PstI og endelig isoleret på en 6 % polyacrylamidgel. Efter transformation af den resulterende blanding i E. coli 294, blev der identificeret flere kloner, som havde genoprettet EcoRI-genkendelsesstedet mellem trp-promotor-ribosombindingssteds-området af udgangs-ekspressionsvek-10 toren og det komplette kodeområde af det modne okseinterferon (pBoIFN-a4trpl5) .

J. Subkloning af okse-fibroblast-interferon-gener 15 Seks af de fag-rekombinanter, som hybridiserede med den humane IFN-P-DNA-sonde, blev renset, og deres DNA isoleret som beskrevet ovenfor til yderligere analyse. Restriktionskortlægning kombineret med Southern-hybridise-ringsanalyse viste, at de seks isolater bestod af tre ad-20 skilte områder af oksegenomet, hvilket tyder på en multi-gen BoIFN-p-familie. Disse resultater er sammenfattet i de restriktionskort, som er vist i fig. 7. For at opnå et mere detaljeret restriktionskort og nucleotidsekvensen for hver adskilt rekombinantklasse, blev hybridiserende 25 fragmenter subklonet ind i plasmidvektorer. Specifikt blev 5 kb Bgl 11-fragmentet af fag λβΐ og 5 kb BamHI-fragmentet af fag λβ2 individuelt klonet ind i pBR322 ved BamHI-stedet, det overlappende 4,5 kb EcoRI-Xhol- og 1,4 kb Pstl-Hpal-fragment af fag λβ3 blev indsat i henholds-30 vis pUC9 (deleteret fra EcoRI- til Sall-stedet) og pLeIF87 (10) (deleteret fra Hpal- til Pstl-stedet).

K. DNA-sekvenser af tre adskilte okse-fibroblastinter-feron-gener 35 DK 171790 B1 33

Fig. 8 viser restriktionskort for hver af tre typer af okse-IFN-P-gener, som blev subklonet. Disse skelnes let ved tilstedeværelsen af spaltningssteder, som findes alene i hvert af dem. Peptid-kodeområderne såvel som sekven-5 ser umiddelbart ovenfor og nedenfor hvert gen blev bestemt ved Maxam-Gilbert's kemiske procedure og er vist i fig. 9a, 9b og 9c. Nucleotidhomologi med den sekvens, der er bestemt for det humane fibroblastinterferon-gen (12) forudsiger den korrekte læseramme og hele aminosyrese-10 kvensen for hvert oksegenprodukt, som inkluderer et hydrofobt signalpeptid på 21 aminosyrer efterfulgt af et modent protein på 185 aminosyrerester. Okseproteinerne er klart forskellige fra hverandre (tabel 2, fig. 10), men viser en endnu større forskel (omkring 60 %) fra det hu-15 mane peptid.

Den multigene natur af okse-fibroblastinterferon blev yderligere påvist ved rehybridisering af den i fig. 11 viste Southern-afdupning med en radioaktiv sonde frem-20 stillet ud fra et 415 bp EcoRI-Pvul-fragment afledt fra pBoIFN-pitrp (beskrevet nedenfor). Som det ses i fig. 11 giver dette forsøg bevis for eksistensen af yderligere homologe IFN-P-gener. De mindre hybridiserende bånd kan i virkeligheden repræsentere mere fjernt beslægtede gener, 25 som på deres side ville kode for mere distinkte β-interferoner.

34 DK 171790 B1 TABEL. 2

Parvise sammenligninger af homologi i kodesekvenser af okse-IFN-P-gener og det humane IFN-P-gen 5 __ PI P2 p3 Hup __ 138 (83) 138 (83) 84 (51) ~ 20 (95) 146 (88) 92 (55) — 20 (95) 19 (90) 87 (52) |Hup 16 (76) 17 (81) 16 (76)

Antallet af identiske aminosyrer i hvert par kodesekvenser er vist. Signalpeptidet på 21 aminosyrer sammenlignes i den nedre venstre del og de modne IFN-P-gener på 166 10 aminosyrer sammenlignes i den øvre højre del af tabellen.

Det totale antal identiske aminosyrer i hvert par er anført først, efterfulgt af homologiprocenten.

L. Direkte ekspression af tre okse-IFN-P-gener i 15 E.coli

Da de tre okse-IFN-P-gener har mange fælles DNA-sekvenser og restriktionssteder (se fig. 8), er det muligt at opstille et fælles skema for ekspressionen af alle tre ge-20 ner. Da den DNA-sekvens, der koder for de første fem aminosyrer, og som indeholder to Alul-steder, var identisk i hvert tilfælde, blev der udformet to komplementære syntetiske oligonucleotider, som inkorporerer en ATG-transla-tionsstart-codon, genopretter codonerne for de første 4 25 aminosyrer af modent okse-IFN-P og skaber en EcoRI-kohæsiv ende til indsætning efter en trp-promotor-sekvens. Konstruktionen af ekspressionsplasmiderne er skematiseret i fig. 12. Ligering af de syntetiske oligo-mere til 85 bp AluI-Xhol-f ragmentet afledt fra et af 30 BoIFN-P-subklon-plasmiderne, efterfulgt af nedbrydning med EcoRI og Xhol skaber et 104 bp fragment flankeret af EcoRI- og Xhol-kohæsive ender. Hele kodesekvensen blev derpå samlet i trp-ekspressionsvektoren ved ligering af DK 171790 B1 35 104 bp fragmentet sammen med Xhol-Pstl-fragmentet på omkring 700 bp, der koder for resten af hvert BoIFN-β-protein, og plasmidet pIFN-ytrp48-13 (55), hvorfra det indre EcoRI-Pstl-fragment var blevet fjernet. De resulte-5 rende plasmider pBoIFN-pitrp, pBoIFN~P2trp og pBoIFN-p3trp, placerer alle den rigtige transcription og translation af IFN-P-generne under styring af E. coli-trp-operonet.

10 M. Karakterisering og subkloning af okse-immuninter- feron-(BolFN-γ)-genet

De ti fag-rekombinanter, der hybridiserede med den humane IFN-y-sonde, blev renset, og DNA blev præpareret som be-15 skrevet ovenfor. Alle ti DNA-prøver giver specifikke hy-bridiseringsbånd ved Southern-afdupningsanalyse. Klonerne λγ4 og λγ7 blev valgt til yderligere analyse, da de har klart adskilte hybridiseringsbåndmønstre. Restriktionskortlægning af disse to kloner viser, at deres DNA-20 sekvenser overlapper hinanden. Det overlappende område indeholder restriktionsstederne Xbal, EcoRV og Ncol. DNA-sekvensanalyse af disse to kloner viser en samlet lignende genstruktur som det humane immuninterferon-gen (70), og at λγ7 indeholder den sekvens, der koder for den fjer-25 de exon, og λγ4 indeholder sekvenser, der koder for de første tre exoner af okse-IFN-y-gen baseret på DNA-sekvenshomologi med det humane IFN-y-gen. Den aminosyre-sekvens, der afledes for BoIFN-y, sammenlignes med den, der afledes for HuIFN-y (55) og muse-IFN-y, i fig. 13.

30

For at samle hele okse-IFN-y-genet på et kontinuert segment af DNA isoleredes 3000 bp BamHI-Ncol-fragmentet, som spænder over de første tre exoner af okse-IFN-y-gen, afledt fra λγ4, og 2500 bp NcoI-Hindlll-fragmentet, som 35 spænder over den sidste exon, afledt fra λγ7. Disse to DK 171790 Bl 36 DNA-fragmenter blev derpå klonet ind i en BamHI-Hindlll-vektor afledt fra pBR322 via en tre-parts-ligering.

N. Ekspression af okse-IFN-y-gen i pattedyrsystem 5

Med det formål at opnå en intronløs version af BoIFN-y for at dette gen kan være udtrykkeligt i et prokaryotisk system, såsom E. coli, blev genet skræddersyet til høj ekspression i et dyrecelle-ekspressionssystem for at opnå 10 væsentlige mængder specifik mRNA. 5500 bp BamHI-HindiIlfragmentet, som spænder over hele okse-IFN-y-genet, blev indsat i en SV40-vektor til ekspression i COS-celler (44). Specifikt blev BamHI-HindlII okse-IFN-y-gen-frag-mentet klonet ind i en 2800 bp SV40-plasmidvektor, pDLARl 15 [afledt fra HBV-antigenekspressionsplasmidet pHBs348-L ved enzymatisk fjernelse af EcoRI-stedet ovenfor SV40-replikationsoriginet selektivt for retningen af sen transcription. Ekspressionsplasmidet pHBs348-L blev konstrueret ved kloning af 1986 bp fragmentet stammende fra 20 EcoRI- og BglII-nedbrydning af HBV (71) (som spænder over genet, der koder for HBsAg) ind i plasmidet pML (72) ved EcoRI- og BamHI-stederne. (pML er et derivat af pBR322, som har en deletion, der eliminerer sekvenser, som er in-hiberende for plasmidreplikation i abeceller (72)). Det 25 resulterende plasmid (pRI-Bgl) blev derpå lineariseret med EcoRI, og 348 bp fragmentet repræsenterende SV40-origin-området blev indført i EcoRI-stedet af pRI-Bgl. Originfragmentet kan indsættes i den ene eller den anden orientering. Da dette fragment koder for både den tidlige 30 og den sene SV40-promotor foruden replikationsoriginet, vil HBV-gener kunne udtrykkes under styring af enhver af promotorerne afhængigt af denne orientering (pHBs348-L repræsenterer HB'er udtrykt under styring af den sene promotor)] mellem BamHI- og Sall-stedet via en treparts-35 ligering i nærvær af et 600 bp Hindlll-Sall-konverter- DK 171790 B1 37 fragment afledt fra pBR322. Transfektion af det resulterende plasmid ind i COS-celler fører til effektiv ekspression af okse-IFN-γ under styring af den sene SV40-promotor.

5

Poly-A+-mRNA blev fremstillet ud fra transficerede COS-celler og anvendt på sin side til at fremstille cDNA ved standardprocedurer (55). cDNA-kloner, der hybridiserede med okse-IFN-y-gen-sonden, blev isoleret. cDNA-klonen med 10 den laveste Pstl-indsætning blev valgt til yderligere analyse. DNA-sekvensanalyse af denne cDNA-klon viser, at alle intronsekvenserne, som er forudsagt ud fra den okse-IFN-y-genomiske klon, er korrekt fjernet.

15 cDNA'en blev tilpasset til ekspression i E. coli ved den ovenfor beskrevne primerreparationsmetode.

0. Fremstilling af bakterieekstrakter 20 Kulturer dyrket natten over i LB-væske indeholdende enten 0,02 mg/ml ampicillin eller 0,005 mg/ml tetracyclin blev podet i en fortynding på 1:100 i 50 ml M9-medium (63) indeholdende 0,2 % glucose, 0,5 % casaminosyrer og det passende lægemiddel og dyrket ved 37 °C med rystning til en 25 A550 på 1,0. Prøver på 10 ml blev høstet ved centrifuge ring og øjeblikkeligt lynfrosset i et tøris/ethanolbad.

De frosne piller blev gensuspenderet i 1 ml 7M guanidin, inkuberet på is i 5 minutter og fortyndet i PBS til prøvning. Alternativt blev de frosne piller lyseret ved til-30 sætning af 0,2 ml 20 % saccharose, 100 mM "Tris"-HCl (pH

8,0), 20 mM EDTA og 5 mg/ml lysozym. Efter 20 minutter på is tilsattes 0,8 ml 0,3 % "Triton X-100", 0,15 M "Tris"-HC1 (pH 8,0), 0,2 M EDTA og 0,1 mM PMSF. Lysatet blev klaret ved centrifugering ved 19 000 omdr./min i 15 mi- DK 171790 B1 38 nutter, og supernatanten blev prøvet efter fortynding i PBS.

P. Interferonprøvninger 5

Okseinterferonaktivitet blev prøvet ved en prøvning for inhibering af cytopatisk effekt (CPE) gennemført i 96 hullers mikrotiterplader som følger: 10 1. Til hvert hul i en 96 hullers mikrotiterplade (8 ræk ker x 12 søjler) sættes 100 μΐ af en suspension af celler i medier indeholdende 10 % fetalt kalveserum. Cellekoncentrationen indstilles til at give konfluent monolag den næste dag.

15 2. Pladerne rokkes forsigtigt på en rokkeplatform i 10 minutter for at fordele cellerne jævnt.

Næste dag: 20 3. Hvert hul i den første søjle tilsættes 80 μΐ yderligere medier.

4. Hvert hul i den første søjle tilsættes 20 μΐ af en 25 prøve, som skal prøves for interferon-aktivitet.

5. Prøven og mediet i hullet blandes ved udtrækning og indsprøjtning af 100 μΐ af hullets indhold flere gange med en 100 μ.Ι pipette.

30 6. 100 μΐ af indholdet af et hul i den første søjle overføres horisontalt til et hul i den anden søjle.

7. Der blandes som i trin 3.

35 39 DK 171790 B1 8. Der fortsættes med at overføre 100 μΐ af indholdet i et hul fra søjle til efterfølgende søjle, indtil der er gennemført ialt 11 overførsler.

5 9. 100 μΐ af indholdet af hullet i den 12. søjle udtages og smides væk. Denne procedure frembringer en række sæt af dobbeltfortyndinger.

10. Hver prøveplade inkluderer passende NIH-standarder.

10 11. Pladerne inkuberes i en C02~inkubator ved 37 °C i 24 timer.

12. Hver prøveplade indeholder huller, som modtager 100 15 μΐ cellesuspension og 100 μΐ medium, der tjener som cellevækstkontroller, og huller, som modtager 100 μΐ cellesuspension, 100 μΐ medium og 50 μΐ virussuspension, der tjener som virusinducerede cytopatogene kontroller.

20 13. Alle huller undtagen cellekontrollerne udfordres med 50 μΐ af en virussuspension. Den anvendte multiplicitet af infektion er den mængde virus, som frembringer 100 % cytopatisk effekt på den bestemte cellelinie inden for 24 timer.

25 14. Pladerne inkuberes igen i 24 timer ved 37 °C i CO2-inkubator.

15. Væsken fjernes fra pladerne, og cellerne farves med 30 0,5 % krystalviolet. Cellerne får lov at farves i 2-5 minutter .

16. Pladerne skylles godt i ledningsvand og får lov at tørre.

35 40 DK 171790 B1 17. Prøvens interferontiter er den reciprokke værdi af den fortynding, hvorved der forbliver 50 % levedygtige celler.

5 18. Aktiviteten af alle prøver normaliseres med referen ceenhedsomregningsfaktoren, der beregnes ud fra:

Faktisk titer af NIH-standard

Referenceenhedsomregningsfaktoren = - 10 Iagttaget titer ved prøvning (se 69).

Ekstrakter fremstillet ud fra E. coli stamme 294 (ATCC 15 nr. 31446} transformeret med pBoIFN-altrp55 viste signifikant aktivitet på en oksenyrecellelinie (MDBK) udfor-dret med VS-virus (Indiana-stamme), men ikke på abenyre-(VERO), human-cervical-carcinoma-(HeLa), kaninnyre-(Rk- 13) eller muse-(L929) cellelinier udfordret på lignende 20 måde. Kontrolekstrakter fremstillet ud fra stamme 294 transformeret med pBR322 udviste ikke aktivitet på MDBK-celler. Tabel 3 sammenfatter den antivirale aktivitet af BoIFN-al in vitro på forskellige udfordrede dyre- og humane cellelinier. BoIFN-al skelnes let fra de humane leu-25 kocytinterferoner ved en tilsyneladende mangel på antiviral aktivitet i humane celler i forhold til dets aktivitet i okseceller ved anvendelse af VS-virus som udfordring. Tabel 4 viser det niveau af interferonaktivitet, der opnås i ekstrakter fremstillet ud fra E. coli W3110, 30 der er blevet transformeret med ekspressionsplasmiderne pBoIFN-a4trpl5, pBoIFN-pltrp, pBoIFN-p2trp og pBoIFN-P3trp. Særlig signifikant er den iagttagelse, at oksefi-broblast-interferonerne er omkring 30 gange mere aktive på en oksenyrecellelinie end på en human amnioncelleli-35 nie, medens det omvendte forhold findes for humant fibroblast-interferon (12).

DK 171790 B1 41 IAggfr l

Titer (enh./ml)

Cellelinie_IFN-praparat_VSV_EMCV

LeIF A-standard 640 NA

MDBK okse-leukocyt-IFN 300 000 NA

kontrolekstrakt <40 NA

LeIF A-standard 650 1500

HeLa okse-leukocyt-IFN <40 <23 kontrolekstrakt <40 <23

Muse-IFN-standard 640 1000 L-929 okse-leukocyt-IFN <20 <31 kontrolekstrakt <20 <31

kanin-IFN-standard 1000 NA

RK-13 okse-leukocyt-IFN <60 NA

kontrolekstrakt <60 NA

LeIF A-standard 1500 VERO okse-leukocyt-IFN <12 kontrolekstrakt <12 MDBK = oksenyreceller 5 VERO = abenyreceller fra afrikansk grønabe HeLa = human-cervical-carcinoma-celler RK-13= kaninnyreceller NA = ikke anvendelig som virus, replikerer ikke godt i den respektive celle.

10 TABEL 4

Interferon-aktivitet i ekstrakter af E. coli ——^ —T——1 1 - - ''I·™»··"»"·—i— E. coli 294 IFN-P-aktivitet IFN-P-aktivitet transformeret (enh./l kultur) (enh./l kultur) med;__MDBK-VSV__WISH-VSV_ pIFN-al__1,0 x 108__ikke bestemt_ pIFN-Pl__2,2 x 108__6,5 x 106_ pIFN-p2__1,1 x 108__3,5 x 106_ pIFN-P3 6,0 x 108 2,0 x 107 15

Bakterieekstrakter blev fremstillet og prøvet for interferonaktivitet under anvendelse af oksenyre (MDBK) cellelinien og humanamnion (WISH) cellelinien og VS virus som udfordring ifølge en publiceret procedure (Week et al., 20 1981).

42 DK 171790 B1

Farmaceutiske præparater

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan sammensættes ifølge kendte metoder til fremstilling af far-5 maceutisk nyttige præparater, hvorved de omhandlede dyre-interferonprodukter kombineres i blanding med et eller flere acceptable bæremedier. Egnede medier og deres sammensætning er tidligere beskrevet. Sådanne præparater vil indeholde en effektiv mængde af det omhandlede inter-10 feronprotein sammen med en egnet mængde bæremedium til at fremstille acceptable præparater, der er egnede til effektiv indgivelse til værten ad kendte veje, f.eks. pa-renteralt.

15 Det vil forstås, at de her omhandlede dyreinterferoner forekommer med naturlige alleliske variationer. Disse variationer kan påvises ved en eller flere aminosyrefor-skelle i den samlede sekvens eller ved deletioner, udskiftninger, indsætninger, ombytninger eller tilføjelser 20 af en eller flere aminosyrer i sekvensen. Alle sådanne alleliske variationer er omfattet af denne opfindelse.

BIBLIOGRAFI

25 1. Rinaldo et al., Infection and Immunity JJ., 660 (1976).

2. Fulton and Rosenquist, Am. J. Vet. Res. £7, 1497 (1976).

3. Babrick and Rouse, Infection and Immunity ϋ, 1567 30 (1976).

4. Todd et al., Infection and Immunity 5., 699 (1972).

5. Ahl and Rump, Infection and Immunity JJl, 603 ( 1976).

6. Babrick and Rouse, Interviroloqy £, 250 (1977).

7. Tovey et al., J. Gen. Virol. ££, 341 (1977).

35 8. Goeddel et al., Nature 287. 411 (1980).

DK 171790 B1 43 9. Goeddel et al., Nature 290. 20 (1981).

10. Yelverton et al., Nucleic Acids Research £., 731 (1981).

11. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 22., 399 5 (1980).

12. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 2, 4057 (1980) .

13. Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 22./ 1601 (1981) .

10 14. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78.

3469 (1981).

15. Bloom, Nature 289. 593 (1980).

16. Sonnenfeld et al., Cellular Immunol. 4£., 285 (1978).

17. Fleishmann et al., Infection and Immunity 22, 248 15 (1979).

18. Blalock et al., Cellular Immunoloqy 22/ 390 (1980).

19. Rudin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 22/ 5928 (1980).

20. Crane et al., J. Natl. Cancer Inst. £2/ 871 (1978).

20 21. GB offentliggørelsesskrift nr. 2007676A.

22. Wetzel, American Scientist £2/ 664 (1980).

23. Microbioloqy, 2nd Edition, Harper and Row Pub lishers, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), især side 1122 og videre.

25 24. Scientific American 245. 66 og videre (1981).

25. GB offentliggørelsesskrift nr. 2055382A.

26. DE offentliggørelsesskrift nr. 2644432.

26a. Leder et al., Science 196. 175 (1977).

27. Chang et al., Nature 275. 617 (1978).

30 28. Itakura et al., Science 193. 1056 (1977).

29. EP offentliggørelsesskrift nr. 0036776.

30. Siebenlist et al., Cell 2SLt 269 (1980).

31. Stinchcomb et al., Nature 282. 39 (1979).

32. Kingsman et al., Gene T_, 141 (1979).

35 33. Tschumper et al., Gene JJl, 157 ( 1980).

44 DK 171790 B1 34. Mortimer et al.. Microbiological Reviews 44.» 519 (193).

35. Miozzari et al.. Journal of Bacteriology 134. 43 (1978) .

5 36. Jones, Genetics £5, 23 (1977).

37. Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255. 12073 (1980).

38. Hess et al., J. Adv. Enzyme Requl. X, 149 (1968).

39. Holland et al.. Biochemistry IX, 4900 (1978).

40. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77.

10 4504 (1980).

41. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981),

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

New York.

42. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry 14., 613 ( 1975).

15 43. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, eds. (1973).

44. Gluzman, Cell 21, 175 (1981).

45. Goeddel et al., Nature 281. 544 (1979).

46. Lusky et al., Nature 293. 79 (1981).

20 47. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bi ol. Μ, 293 ( 1980) .

48. Fiers et al., Nature 273. 113 (1978).

49. Reddy et al., Science 200. 494 (1978).

50. Blin and Stafford, Nucleic Acids Research £, 2303 25 (1976).

51. Maniatis et al., Cell .15, 687 (1978).

51a. Blattner et al., Science 196. 161 (1977).

52. Rimm et al., Gene 12., 361 (1980).

53. Blattner et al. (1978), Procedures for Use of Charon 30 Phages in Recombinant DNA Research, Research Resour ces Branch, National Institute af Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland.

54. Blattner et al., Science 202. 1279 (1978).

55. Gray et al., Nature 295. 503 (1982).

35 56. Southern, J. Mol. Biol. ££, 503 (1975).

DK 171790 B1 45 57. Week et al., Nucleic Acids Research 2.» 6153.

58. Taylor et al., Biochem. Biophys. Acta 442. 324 (1976) .

59. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 2Ar 641 5 (1966).

60. Wahl et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 2L·, 3683 (1979).

61. Nagata et al., Nature 287. 401 (1980).

62. Benton and Davis, Science 196. 180 (1977).

62a. Messing et al., Nucleic Acids Research 3., 309 10 (1981).

63. Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

New York.

64. Birnboim et al. , Nucleic Acids Research 7., 1513 15 (1979).

65. Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. 74., 560 (1977) .

66. McGrath and Levinson, Nature 295. 423 (1982).

67. Itakura et al., Science 198. 1056, (1977).

20 68. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72., 5765 (1978).

69. Stewart (1979), The Interferon System, Springer-Verlag, New York, pp. 17 et seq.

70. Gray and Goeddel, Nature 298. 859 (1982).

71. Animal Virus Genetics (Ed. Fields et al.), Chapter 25 5, p. 57, Academic Press, N.Y. (1980).

72. Lusky and Botchan, Nature 293. 79 (1981).

Claims (20)

1. Fremgangsmåde til identificering af DNA, som koder for et interferon fra en ikke-human dyreart, kendetegnet ved, at der fremstilles et bibliotek af 5 klonet DNA fra den nævnte art, og det sonderes med en hy-bridiseringssonde af interferon-DNA fra en derfra forskellig art, hvorpå positive kloner analyseres for interferonkodende sekvenser.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at DNA fra den nævnte ikke-humane dyreart først adskilles ved elektroforese og hybridiseres til den nævnte interferon-DNA fra en derfra forskellig art under varierende hybridiseringsbetingelser for at bestemme passende hybridiseringsbetingelser for sondering af biblioteket.

3. DNA, som koder for ikke-humant dyreinterferon, kendetegnet ved, at den kan identificeres ved fremgangsmåden ifølge krav 1 eller krav 2.

4. DNA ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den koder for et fugle-, okse-, hunde-, heste-, katte-, 20 gede-, fåre-, fiske- eller svine-interferon.

5. DNA ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den koder for et ikke-humant dyreinterferon valgt blandt okse-leukocyt-, -fibroblast- og -immun-interferon.

6. DNA ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 25 den koder for okse-leukocyt-interferon.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af DNA, som koder for et hybridt interferon, kendetegnet ved, at et fragment af DNA ifølge et hvilket som helst af kravene 3-6, hvilket fragment ikke koder for et helt interferon- 30 polypeptid, ligeres med et eller flere DNA-fragmenter, som koder for en komplementær del eller flere komplemen- DK 171790 B1 tære dele af et interferon fra et andet medlem af den samme familie og af den samme dyreart og/eller af den samme eller et andet medlem af den samme familie, men af en anden art.

8. DNA, som koder for et hybridt interferon, ken detegnet ved, at den kan opnås ved fremgangsmåden ifølge krav 7.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et ikke-humant dyre-interferon med en aminosyresekvens indkodet af DNA ifølge 10 et hvilket som helst af kravene 3-6, eller et hybridt interferon indkodet af DNA ifølge krav 8, kendetegnet ved ekspression i en rekombinant værtscelle af DNA, som koder for det nævnte interferon.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvorved der fremstilles 15 et okse-leukocyt-interferon omfattende en aminosyresekvens fra den, der er afbildet i en hvilken som helst af Figurerne 3a-d heri.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvorved der fremstilles et okse-fibroblast-interferon omfattende en aminosyrese- 20 kvens fra den, der er afbildet i en hvilken som helst af Figurerne 9a-c heri.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvorved der fremstilles et okse-immun-interferon omfattende en aminosyresekvens fra den, der er afbildet for dette i Figur 13 heri.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12, hvorved der fremstilles et okseinterferon, som mangler alle aminosyrer før den N-terminale aminosyre i den modne sekvens.

14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 30 10-12, hvorved der fremstilles et okseinterferon med me- DK 171790 B1 thionyl-aminosyreresten før den N-terminale aminosyre i den modne sekvens.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12, hvorved der fremstilles et okseinterferon med kon- 5 jugeret protein før den N-terminale aminosyre i den modne sekvens.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12, hvorved der fremstilles et okseinterferon med specifikt fraspalteligt konjugeret protein før den N- 10 terminale aminosyre i den modne sekvens.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvorved der fremstilles et interarts- eller intrafamiliært hybridinterferon indeholdende en portion af mindst et af de okse-leukocyt-interferoner, der er afbildet i Figurerne 3a-d heri, el- 15 ler en portion af mindst et af de okse-fibroblast-interferoner, der er afbildet i Figurerne 9a-c heri, eller en portion af det okse-immun-interferon, der er afbildet i Figur 13 heri, med en komplementær del eller komplementære dele af et interferon fra et andet medlem 20 af den samme familie og af den samme dyreart og/eller af den samme eller et andet medlem af den samme familie, men af en forskellig art.

18. DNA-isolat, kendetegnet ved, at det omfatter en sekvens, som koder for et interferon som defi- 25 neret i et hvilket som helst af kravene 10-17.

19. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den operabelt indeholder en DNA-sekvens, som koder for et interferon som defineret i et hvilket som helst af kravene 10-17.

20. Celle transformeret med en ekspressionsvektor ifølge krav 19.