JPH06315385A - 動物インターフェロンをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 広範な種類の動物インターフェロンを見い出
すためのこの種の技術を利用する手段および方法、この
産生の各種の産物およびその使用に係る。 【構成】 本発明はヒト以外の動物インターフェロンを
コードするＤＮＡ分子、それを含有する発現ビヒクル、
およびその発現ビヒクルを含有する形質転換体に関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、一般に組換ＤＮＡ技術、広範な
種類の動物インターフェロンを見出すためのこの種の技
術を利用する手段および方法、その産生並びにこの産生
の各種の産物およびその使用に係る。

【０００２】より詳細には、本発明は、動物インターフ
ェロンをコードするＤＮＡ配列の単離および同定、発現
を行なうプロモーター配列に作動可能に(正しく読みと
られるように)結合されたこの種のＤＮＡ配列を含有す
る組換ＤＮＡ発現ビヒクルの構築並びにこのように構築
された発現ビヒクルに係る。他の面において、本発明
は、この種の発現ビヒクルにより形質転換されしたがっ
て上記ＤＮＡ配列を発現し得る宿主培養系、たとえば各
種微生物および脊椎動物細胞培養(セルカルチャー)に係
る。

【０００３】さらに他の面において、本発明は、この種
の発現の新規な最終産物を、動物の予防もしくは治療処
置に有用な完全体、たとえば薬剤組成物に転換する手段
および方法に係る。さらに、本発明は、前記ＤＮＡ配
列、発現ビヒクル、宿主培養系並びに最終産物及びその
完全体の製造に有用な各種の方法に係り、さらにその特
定具体例および関連具体例に係る。

【０００４】本発明は、一連のウシα−インターフェロ
ンをコードしており且つ発現ビヒクル中へのそのin vit
ro(試験管内)結合を容易にする３'−および５'−フラン
キング(flanking)配列を含むＤＮＡ配列、並びにそれか
ら推定されるアミノ酸配列の知見に一部基づくものであ
る。さらに、これらの知見は、組換ＤＮＡ技術によっ
て、充分量の動物インターフェロンを製造する手段およ
び方法の開発を可能にし、その結果、その生化学的性質
および生物活性の測定を可能にし、従って、その産業上
／生物学上の開発に対して有効な生産を可能ならしめ
る。

【０００５】本発明の背景を説明し、特別な場合には、
その実施に関し詳細を補足するために、刊行物およびそ
の他の資料をここに参考のため引用するが、これらは便
宜上本明細書中発明の詳細な説明の最後尾に掲げた番号
を付して引用する。

【０００６】Ａ．動物インターフェロン インターフェロン成分は、ヒトより下等な種々の系統学
的種の組織から単離されている(１、２、３)。これらイ
ンターフェロンを用いて行なわれた活性試験は、必須の
宿主動物(requisite host animal)において種々の程度
の抗ウイルス効果を示している(３、４、５、６)。さら
に、これらインターフェロンは必ずしも種特異性でない
ことが示されている。たとえば、組織から単離されたウ
シインターフェロンの調製物は、サルおよびヒトの細胞
に対し抗ウイルス活性を示した(７)。同様に、ヒトイン
ターフェロンは、系統学的により下等な種の様々な細胞
において活性であることが判明している(７)。

【０００７】この種間相互活性は、インターフェロン間
におけるアミノ酸組成と配列との両者における高度の相
同性保存により疑いがない。しかしながら、今日まで、
この説明は理論上の説明に留まっている。何故なら、こ
れまで入手し得た動物インターフェロンの量および純度
は不充分であったため、精製された成分の特性化および
生物学的性質を幾種かのヒトの対応する部分に関して比
較する明確な実験を行なうことができなかったからであ
る(８、９、１０、１１、１２)。

【０００８】いずれにせよ、これらの少ない量および低
純度にも拘らず、必須の動物宿主におけるインターフェ
ロンと抗ウイルス活性との間の因果関係が確立されてい
る。たとえば、高収率および高純度で動物インターフェ
ロンを生産することは、動物バイオアッセイ実験を開始
しかつ成功裡に行なって、ウイルス感染症ならびに悪性
腫瘍状態および免疫抑制状態もしくは免疫欠如状態に対
する動物の治療における産業上の利用性をもたらすため
に、極めて望ましいものである。さらに、単離される動
物インターフェロン類の生産は、物理的にも生物活性的
にもその特性化を可能にし、したがって対応するヒトイ
ンターフェロン類に関し分類およびそれによる比較研究
の基礎を与える(８〜２０)。

【０００９】動物インターフェロンを用いて本発明に至
るまで行なわれた研究は、その入手が極めて困難なため
粗調製物を使用せざるを得なかったが、極めて重要な生
物学的機能を示唆している。この種の動物インターフェ
ロンは関連した治療上有力な抗ウイルス活性を示すだけ
でなく、ワクチンおよび／または抗生物質による治療と
ともに付加的予防薬としても有効であり、極めて有望な
臨床上かつ商業上の候補物質として挙げられることは明
らかである。

【００１０】組換ＤＮＡ技術の使用は、臨床的かつ産業
的開発を達成するのに必要な必須量の動物インターフェ
ロンを提供する最も有効な方法であると思われた。この
ようにして生産される物質が天然に生ずる物質に特徴的
と思われるグリコシレーションを含むかどうかに関係な
く、これらは恐らく動物における広範囲のウイルス性、
新生(腫瘍)のおよび免疫抑制状態もしくは病気の治療に
おいて臨床的にその使用を可能にする生物活性を示すで
あろう。

【００１１】Ｂ．組換ＤＮＡ技術 組換ＤＮＡ技術は、或る種の高度な知識の時代に達して
いる。分子生物学者は、各種のＤＮＡ配列をかなり容易
に組換えることにより、著量の外因性(外来)蛋白質産物
を形質転換微生物中で産生しうる新規なＤＮＡ完全体を
創生することができる。一般的手段および方法は、ＤＮ
Ａの種々の平滑末端又は「付着」末端を有する断片のin v
itro結合を行なって、特定生物を形質転換させるのに有
用な強力な発現ビヒクルを製造し、かくして所望の外因
性産物の効率的合成に使用することを可能にする。しか
しながら、個々の産物に関してはその製造経路は若干面
倒であって、かかる分野の科学は常に一定の成功の予想
がなされるような段階までは進歩していない。事実、基
礎的実験に基づかずに成功を予告する者がいても、その
予告には実施不能であるという著しい危険が伴なう。

【００１２】しばしば１細胞当り複数のコピーとして細
菌およびその他微生物に見られるプラスミド、すなわち
二重鎖ＤＮＡの非染色体ループは、組換ＤＮＡ技術の基
本的要素である。プラスミドＤＮＡにコードされている
情報には、娘細胞においてプラスミドを再生するのに必
要な情報(すなわち複製のオリジン)および通常１種もし
くはそれ以上の表現型選択特性、たとえば細菌の場合、
抗生物質に対する耐性が包含され、これらは目的とする
プラスミドを含有する宿主細胞のクローンを識別しかつ
優先的にこれを選択培地中で増殖させることを可能にす
る。プラスミドの有用性は、それぞれプラスミドＤＮＡ
上の異なる部位を識別する１種もしくはその他の制限エ
ンドヌクレアーゼすなわち「制限酵素」によって特異的に
開裂しうるという事実にある。その後、異種遺伝子もし
くは遺伝子断片を、開裂部位またはこの開裂部位に隣接
する再編成末端において末端結合することにより、プラ
スミド中に挿入することができる。このようにして、い
わゆる複製可能な発現ビヒクルが形成される。ＤＮＡ組
織は細胞の外部で行なわれるが、生成する「組換体」であ
る複製可能な発現ビヒクルすなわちプラスミドは形質転
換として知られる方法により細胞中へ導入することがで
き、多量の組換ビヒクルが形質転換体の増殖によって得
られる。さらに、コード化ＤＮＡメッセージの転写およ
び翻訳を支配するプラスミドの部分に関し遺伝子を適切
に挿入すれば、得られる発現ビヒクルを使用して挿入遺
伝子がコードするポリペプチド配列を実際に産生するこ
とができ、この過程は発現と呼ばれる。

【００１３】発現は、ＲＮＡポリメラーゼにより識別さ
れかつ結合されるプロモーターとして知られた領域にお
いて開始される。発現の転写期において、ＤＮＡは巻戻
されて、ＤＮＡ配列からメッセンジャＲＮＡの合成を開
始するための鋳型としてこれを露呈させる。次いで、メ
ッセンジャＲＮＡは、このmＲＮＡによりコードされる
アミノ酸配列を有するポリペプチドに翻訳される。各ア
ミノ酸はヌクレオチドトリプレットすなわち「コドン」に
よってコードされ、このコドンは集合して「構造遺伝子」
を構成し、すなわち発現ポリペプチド産物のアミノ酸配
列をコードするような部分を構成する。翻訳は「開始」信
号において開始される(通常ＡＴＧであって、これは生
ずるメッセンジャＲＮＡにおいてＡＵＧになる)。いわ
ゆる停止コドンは翻訳の終末を規定し、したがってその
後のアミノ酸単位の生成の終末を規定する。生ずる生産
物は、必要に応じ微生物系において宿主細胞を溶菌し、
かつ適当な精製法により他の蛋白質からこの生産物を回
収することにより得ることができる。

【００１４】実際上、組換ＤＮＡ技術の使用は全く異種
のポリペプチドを発現することができ(いわゆる直接的
発現)、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部
に融合された異種ポリペプチドを発現することもでき
る。後者の場合、目的とする生物活性生産物は、しばし
ば菌体外環境において開裂されるまで、融合された同種
／異種ポリペプチド内において生物不活性にされている
(２１、２２)。

【００１５】Ｃ．細胞培養技術 遺伝学および細胞生理学を研究するための細胞培養(セ
ルカルチャー)および組織培養の技術は充分に確立され
ている。単離された正常細胞から連続トランスファ処理
により永久細胞系を得これを維持する手段および方法も
既に知られている。研究用途のため、この種の細胞系を
液体培地中で固体支持体上に維持し、或いは増殖により
栄養支持体を含む懸濁液中で増殖させる。大規模製造の
ための規模拡大は、機械的問題のみを課すると思われる
(一般に２３、２４)。

【００１６】発明の概要 本発明は、組換ＤＮＡ技術を使用して、動物インターフ
ェロンを成功裡に生産し、しかもそのそれぞれを好まし
くは直接的な形態でかつ市場で認可されるために必要と
される臨床試験を開始しかつ実施するのに充分な量で生
産しうるという知見に基づいている。この生産物はその
全ての形態において、特にウイルス感染症ならびに悪性
腫瘍状態および免疫抑制された、もしくは免疫欠如の状
態に対し動物の予防的もしくは治療的処置に使用するの
に適している。その形態は種々可能なオリゴマー形態を
包含し、関連するグリコシレーションならびに個々の要
素もしくは種単位のアレル変異(allelic variation)を
包含することができる。これら生産物は、微生物もしく
は細胞培養系を遺伝子工学的に処理することにより生産
される。すなわち、現在では従来可能であったよりも効
率的な方法で動物インターフェロンを製造しかつ単離す
る能力が存在する。本発明の最も好適な具体例におけ
る、本発明の１つの顕著な因子は、微生物もしくはセル
カルチャーを、この宿主細胞により成熟形態で産生され
る代表的な動物インターフェロン、すなわちウシインタ
ーフェロンを単離可能な量で産生するように遺伝子工学
的に処理することを達成するにある。

【００１７】本発明は、このように生産される動物イン
ターフェロンならびにその製造手段および方法を含む。
さらに本発明は動物インターフェロンをコードする遺伝
子配列を発現可能な形態で有する複製可能なＤＮＡ発現
ビヒクルに向けられる。さらに、本発明は上記の発現ビ
ヒクルにより形質転換された微生物菌株またはセルカル
チャーに向けられ、さらに動物インターフェロンを生産
しうるこのように形質転換された菌株もしくはカルチャ
ー(培養物)からなる発酵培地に関するものである。

【００１８】さらに、他の面において、本発明は前記イ
ンターフェロン遺伝子配列、ＤＮＡ発現ビヒクル、微生
物菌株およびセルカルチャー(細胞培養物)を製造するの
に有用な種々の方法、ならびにその特定具体例に向けら
れる。さらに、本発明は、前記微生物もしくは細胞培養
物の発酵培地の調製に向けられる。さらに、或る種の宿
主系において、この宿主細胞から成熟形態で分泌される
所望の動物インターフェロンを産生すべくベクターを案
出することができる。遺伝子本来の５'−フランキング
領域から得られるシグナル配列を含有するインターフェ
ロンは、宿主生物の細胞壁部に移動され、シグナル配列
はこの移動を促進する役割を果たし、この細胞壁では成
熟インターフェロン産物の分泌過程にてシグナル部分が
開裂されると信じられる。この具体例は、細胞内宿主蛋
白質もしくは細胞残骸の夾雑物を除去するよう設計され
た関連過程に頼ることなく、目的とする成熟インターフ
ェロンの単離および精製を可能にする。

【００１９】さらに、本発明は、直接的発現により成熟
形態で産生される本発明に包含される動物インターフェ
ロンの代表的種類であるウシインターフェロンの製造に
特に向けられる。

【００２０】本明細書において「成熟動物インターフェ
ロン」という表現は、動物インターフェロンmＲＮＡの翻
訳に際して直ちに行なわれる、シグナルペプチドもしく
はプレ配列ペプチドを伴なわない動物インターフェロン
の微生物的もしくは細胞培養による生産を包含する。し
たがって、本発明によれば、第１アミノ酸としてのメチ
オニン(構造遺伝子の前方にＡＴＧ開始信号コドンを挿
入することにより提供される)を有する、或いはメチオ
ニンが細胞内もしくは細胞外で開裂される場合はその正
常な第１アミノ酸を有する成熟動物インターフェロンが
提供される。さらに、本発明によれば、通常のシグナル
ポリペプチド以外の共役蛋白質と共に成熟動物インター
フェロンを産生することもでき、ここで共役蛋白質は細
胞内もしくは細胞外環境において特異的に開裂可能であ
る(２１)。最後に、成熟動物インターフェロンは、外因
性の余分なポリペプチドを開裂除去する必要なしに、直
接的発現により生産することができる。このことは、成
熟インターフェロンをそのシグナルペプチドと共に発現
すべく発現ビヒクルを設定するような場合、或る種の宿
主がシグナルペプチドを除去しないまたは効率的に除去
しない場合、特に重要である。このように産生された成
熟インターフェロンは、ウイルス感染症、悪性腫瘍状態
および免疫抑制もしくは免疫欠如状態の治療に使用する
のに適するレベルにまで回収かつ精製される。

【００２１】動物インターフェロンは、動物生体に対し
内生的なものであり、ヒトインターフェロンに類似した
命名法において動物α(白血球)、β(繊維芽球)およびγ
(免疫)−インターフェロンを包含する。これら３種の系
統は全て動物モデルにおいて同定されている。さらに、
ウシの例に基づけば、動物α系列はヒトの場合と同様に
一群の蛋白質から構成され、検討された動物α系列は対
応するヒトα−インターフェロンに対する相同性(homol
ogy)の程度が、これらの動物インターフェロン自体間も
しくはヒトα−インターフェロン自体間のいずれよりも
低いものである。さらに、ウシのβ系列はヒトの場合と
は異なる一群の蛋白質から構成される。さらに、本発明
は種間および族内(intrafamily)ハイブリッドインター
フェロンをも提供し、その際各種動物インターフェロン
の遺伝子内の共通制限部位を利用しかつ公知方法で対応
部分を再結合(組換)させる(５７参照)。

【００２２】いずれにせよ、本発明に包含される動物イ
ンターフェロンは鳥類、牛、犬、馬、猫、山羊、羊、魚
類および豚科の動物に対し通常内生的(内因性)なものを
包含する。特に、本発明はたとえば牛、羊および山羊の
ような偶蹄類動物のインターフェロンを提供する。本発
明により提供されるインターフェロンは、夫々の宿主動
物における抗ウイルスおよび抗腫瘍剤としての用途があ
る。たとえば、ウシインターフェロンはウシにおける呼
吸器併発症を処置する際、治療剤成分としての(それ自
体公知の)抗生物質と組合せて、或いは予防薬成分とし
てのワクチンと組合せて実際に使用されるであろう。上
記に例示した種類の用途は他の牛ならびに羊、山羊、
豚、馬、犬、猫、鳥および魚類に拡張することができ
る。馬、犬、猫および鳥の場合、対応するインターフェ
ロンの抗腫瘍効果は産業上特に重要であると予想され
る。

【００２３】この種類の代表としてのウシインターフェ
ロンに関し記載された下記の原理を、本発明により動物
インターフェロンを得るために使用することができる: １．ウシの組織、たとえばウシ膵臓組織を凍結粉末に
し、これを処理してＲＮＡおよび蛋白質物を消化し、そ
して沈澱させることにより高分子量のウシＤＮＡを得
た。 ２．この高分子量ＤＮＡを部分消化し、遺伝子部位に関
しランダムに切断した。 ３．得られたＤＮＡ断片をサイズ分画し、１５〜２０キ
ロ塩基対の断片を得た。 ４．工程３で得られた断片を、λシャロン(Ｃharon)３
０ファージベクターを使用してクローン化させた。 ５．このように調製されたベクターを、rＤＮＡを含有
する感染性フアージ粒子 にin vitroパッケージングし
て、フアージライブラリーを得た。これを、約１０⁶倍
まで細菌細胞上で増殖させた。このフアージを細菌の芝
上に実質上全面成長するまで(virtual confluence)プレ
ートし、そして放射活性のヒトインターフェロンプロー
ブとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングし
た。

【００２４】６．適当なクローンから対応するＤＮＡを
単離し、制限マップを作成しそしてサザーンハイブリダ
イゼーションによって分析した。ウシインターフェロン
遺伝子を含有する制限断片をプラスミドビヒクル中にサ
ブクローン化し、次いで配列決定した。 ７．次に、配列決定したＤＮＡを適当な発現ビヒクル中
へ挿入するようにin vitroで処理し、このビヒクルを使
用して適当な宿主細胞を形質転換させ、次いでこの宿主
細胞を培地中で増殖させ所望のウシインターフェロン産
物を発現させた。 ８．かく生産されたウシインターフェロンはシステイン
で始まる１６６個のアミノ酸をその成熟形態で有すると
共に、プレシーケンス中に２３個のアミノ酸を有し、性
質としては極めて疎水性である。そのモノマー分子量は
約２１,４０９と計算された。これはヒト白血球インタ
ーフェロンと同様な特性を示し(８、９、１０、１１)、
かつヒト白血球インターフェロンに対し約６０％の相同
部分を有することが判明した。

【００２５】Ａ．微生物／セルカルチャー １．細菌菌株／プロモータ 本明細書中に記載した実験は、特に微生物Ｅ. coli Ｋ
−１２菌株２９４(末端(end)Ａ,thi^-,hsr^-,khsm⁺)(２
５)を用いて行なった。この菌株はアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託して、ＡＴＣＣ受託
番号第３１４４６号を受けている。しかしながら、その
他種々の微生物菌株を使用することもでき、公知のＥ.
coli菌株、たとえばＥ. coli Ｂ,Ｅ. coli Ｘ１７７６
(ＡＴＣＣＮo．３１５３７)およびＥ. coli Ｗ３１１０
(Ｆ^-,λ^-,原始栄養株protrophic)(ＡＴＣＣ Ｎo．２７
３２５)、Ｅ. coli ＤＰ５０ ＳuＰＦ(ＡＴＣＣ Ｎo．
３９０６１,１９８２年３月５日付で寄託)、Ｅ. coli
ＪＭ８３(ＡＴＣＣ Ｎo．３９０６２,１９８２年３月
５日付で寄託)を包含し、或いはその他多くの微生物菌
株を包含し、それらの多くは寄託されて承認されかつ微
生物寄託機関、たとえばアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(ＡＴＣＣ)から入手しうる(可能性が
ある)(ＡＴＣＣカタログリスト参照,２６,２６a参照)。
これらその他の微生物は、たとえば枯草菌(Ｂacillus s
ubtilis)の如きＢacilliおよびその他の腸内菌を包含
し、それらのうち、たとえばサルモネラ・チフイムリウ
ム(Ｓalmonella typhimurium)およびセラチヤ・マルセ
サンス(Ｓerratia marcesans)を挙げることができ、こ
の場合、これらの菌体内で異種遺伝子配列を複製しかつ
発現しうるプラスミドを利用する。

【００２６】例として、異種ポリペプチドの微生物産生
を開始させ、かつ持続させるには、β−ラクタマーゼお
よび乳糖プロモータ系が有利に使用されている。これら
プロモータ系の構成および構造に関する詳細は参考文献
(２７)および(２８)により得ることができる。最近、ト
リプトフアンオペロンに基づく系、いわゆるtrpプロモ
ータ系が開発された。この系の構成および構造に関する
詳細はゲデル等(１２)およびクライド等(２９)により公
表されている。その他多くの微生物プロモータが発見さ
れかつ利用されており、それらのヌクレオチド配列に関
する詳細は当業者がこれらを機能的にプラスミドベクタ
ー中に結合させることを可能とし、これらについては既
に発表されている(３０参照)。

【００２７】２．酵母菌株／酵母プロモータ 本発明の発現系は、さらにプラスミドＹＲp７(３１,３
２,３３)を使用することもでき、これはＥ. coliおよび
酵母サッカロミセス・セレビシイアエ(Ｓaccharomyces
cerevisiae)の両者において選択かつ複製することがで
きる。酵母において選択するには、プラスミドはＴＲＰ
１遺伝子(３１,３２,３３)を含有し、これは酵母の染色
体ＩＶに見られるこの遺伝子に突然変異を含む酵母(３
４)を補完する(トリプトフアンの不存在下において成長
を可能にする)。１種の有用な菌株は、制限なしにアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され
た菌株ＲＨ２１８(３５)である(ＡＴＣＣ Ｎo．４４０
７６)。しかしながら、細胞をtrp１にする突然変異を含
む任意のＳaccharomyces cerevisiae菌株が、発現系を
含むプラスミドの発現に対し有効な環境であることが了
解されるであろう。使用しうる他の菌株の例は、pep４
−１である(３６)。このトリプトフアン栄養要求菌株
も、ＴＲＰ１遺伝子に点突然変異を有する。

【００２８】非酵母菌遺伝子の５'−側に配置すると、
酵母菌遺伝子(アルコール・デヒドロゲナーゼ１に対す
る)からの５'−フランキングＤＮＡ配列(プロモータ)
は、酵母を形質転換させるべく使用したプラスミドに入
れた場合、酵母内で外因性遺伝子の発現を促進(プロモ
ート)することができる。プロモータの他、酵母におけ
る非酵母遺伝子の適切な発現は、酵母における適切な転
写終了とポリアデニル化とを可能にするよう、プラスミ
ド上の非酵母遺伝子の３'−末端に配置した第２の酵母
配列を必要とする。このプロモータも他のものと同様に
本発明において適当に使用することができる(下記参
照)。好適具体例において、酵母３−ホスホグリセレー
トキナーゼ遺伝子(３７)の５'−フランキング配列は構
造遺伝子の上流に位置し、次いで終了−ポリアデニル化
信号を有するＤＮＡ、たとえばＴＲＰ１(３１,３２,３
３)遺伝子またはＰＧＫ(３７)遺伝子が存在する。

【００２９】酵母５'−フランキング配列(３'−酵母終
了ＤＮＡと共に、下記参照)は酵母における外来遺伝子
の発現を促進するよう機能しうるので、高度に発現され
た任意の酵母遺伝子の５'−フランキング配列は重要な
遺伝子生産物を発現するのに使用することができると思
われる。或る環境下において酵母はその可溶性蛋白質の
６５％までを糖分解酵素として発現したので(３８)、か
つこの高レベルは個々のmＲＮＡの高レベルの生産から
生ずると思われるので(３９)、任意のその他の糖分解遺
伝子の５'−フランキング配列をこの種の発現目的に使
用することができ、たとえばエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルク
トキナーゼ、グルコース−６−ホスフエートイソメラー
ゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、トリオースホスフエートイソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼが挙げられ
る。これら遺伝子の３'−フランキング配列のいずれを
も、この種の発現系において適切な終了およびmＲＮＡ
ポリアデニル化のために使用することができる(上記参
照)。或る種の他の高度に発現された遺伝子は、酸性ホ
スフアターゼに対するもの(４０)および５'−フランキ
ング領域における突然変異により、通常ＴＹ１転移可能
要素(transposable element)の存在により高レベルの生
産を発現するもの(発現を増大する突然変異体)(４１)で
ある。

【００３０】上記遺伝子の全ては、酵母ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩによって転写されると思われる(４１)。リボゾ
ームＲＮＡ、５ＳＲＮＡおよびtＲＮＡに対する遺伝子
を転写するＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩＩ用のプロ
モータ(４１,４２)はこの種の発現構成において有用で
ある。

【００３１】最後に、多くの酵母プロモータはさらに転
写制御作用を有するので、増殖条件における変化により
これらを切換ることができる。この種の酵母プロモータ
の幾つかの例は、次の蛋白質を生産する遺伝子である:
アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ、イソチトクローム
−c、酸性ホスフアターゼ、窒素代謝に関連する分解酵
素、グリセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒドロゲ
ナーゼならびにマルトースおよびガラクトース利用に関
係する酵素(３９)。この種の制御領域は、特にそれらの
生産が酵母に対し毒性である場合、蛋白質生産物の発現
を調節するのに極めて有用である。さらに、１種の５'
−フランキング配列の制御領域に、高度に発現された遺
伝子由来のプロモータを含有する５'−フランキング配
列を入れることもできるであろう。これはハイブリッド
プロモータをもたらし、制御領域とプロモータとは物理
的に異なるＤＮＡ配列であると思われるため可能であろ
う。

【００３２】３．細胞培養系／細胞培養ベクター: 培
養(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は近年日常の
方法となった(４３参照)。サルの腎繊維芽細胞のＣＯＳ
−７系を動物インターフェロンの生産用宿主として使用
することができる(４４)。しかしながら、ここに詳述す
る実験は、適合性ベクターの複製および発現を可能にす
る任意の細胞系、たとえばＷＩ３８、ＢＨＫ、３Ｔ３、
ＣＨＯ、ＶＥＲＯおよびＨela細胞系において行なうこ
ともできる。さらに、発現ベクターにつき必要とされる
ものは、複製のオリジンおよび発現すべき遺伝子の前方
に位置するプロモータならびに任意の必要とされるリボ
ゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル
化部位および転写終了配列である。ＳＶ４０のこれらの
本質的要素を本発明で使用したが、本発明は好適具体例
としてここに記載するこれら配列のみに限定されると理
解すべきでない。たとえば、他のウイルスベクターの複
製のオリジン(たとえばポリオーマ(polyoma)、アデノ
(Ａdeno)、ＶＳＶ、ＢＰＶなど)を使用することもで
き、また非一体的状態で機能しうるＤＮＡ複製の細胞性
オリジンも使用することができる。

【００３３】Ｂ．ベクター系 １．Ｅ. coliにおける成熟ウシインターフェロンの直接
的発現 成熟インターフェロンポリペプチド(マイナスシグナル
配列)としてＥ. coliにおいてウシインターフェロンを
直接的に発現させるため使用する手順は、プロモータ断
片および翻訳開始信号を含有するプラスミドと、成熟イ
ンターフェロンのコード領域を含む動物ゲノムＤＮＡの
処理断片との組合せを含む。

【００３４】２．酵母における発現 たとえば動物インターフェロン用のＤＮＡのような異種
遺伝子を酵母中で発現するには、４種の成分を含むプラ
スミドベクターを作成する必要がある。第１の成分は、
Ｅ. coliおよび酵母の両者の形質転換を可能にし、した
がってどちらの生物からも選択しうる遺伝子、たとえば
Ｅ. coliからのアンピシリン耐性遺伝子および酵母から
の遺伝子ＴＲＰ１を含有せねばならない部分である。こ
の成分は、さらに両生物においてプラスミドＤＮＡとし
て維持すべき両生物からの複製のオリジンを必要とし、
たとえばpＢＲ３２２からのＥ. coliオリジンおよび酵
母の染色体ＩＩＩ由来のars１オリジンを必要とする。

【００３５】プラスミドの第２の成分は、下流に位置す
る構造遺伝子の転写を促進する高度に発現された酵母遺
伝子からの５'−フランキング配列であり、たとえば使
用する５'−フランキング配列は酵母３−ホスホグリセ
レートキナーゼ(ＰＧＫ)遺伝子からのものである。この
系の第３の成分は、ＡＴＧ翻訳開始信号と翻訳停止信号
との両者を含有するように作成された構造遺伝子であ
る。この種の遺伝子の単離および構造は後述する。第４
の成分は酵母遺伝子の３'−フランキング配列を含有す
る酵母ＤＮＡ配列であり、転写終了およびポリアデニル
化のための適切な信号を含んでいる。

【００３６】３．哺乳類セルカルチャーにおける発現 哺乳動物のセルカルチャーにおける免疫インターフェロ
ンの合成方法は、異種転写単位の制御下に外来遺伝子の
自律的複製と発現との両者を行ないうるベクターの開発
に依存する。組織培養におけるこのベクターの複製は、
ＤＮＡ複製オリジン(ＳＶ４０ウイルス由来)を提供しか
つＴ抗原を内生的に発現する細胞系中へのベクターの導
入によりヘルパー機能(Ｔ抗原)を与えることによって達
成される(４６、４７)。ＳＶ４０ウイルスのレートプロ
モータ(late promoter)はインターフェロンの構造遺伝
子に先行して存在し遺伝子の転写を確保する。

【００３７】発現を得るための有用なベクターはpＢＲ
３２２配列よりなり、これはイー・コリ(Ｅ. coli)にお
ける選択のための選択性標識(アンピシリン耐性)ならび
にＤＮＡ複製のイー・コリオリジンを与える。これらの
配列はプラスミドpＭＬ−１(４６)から得られ、ＥcoＲ
Ｉ制限部位とＢamＨＩ制限部位とに及ぶ領域を包含す
る。ＳＶ４０オリジンは、この領域を含む３４２個の塩
基対のＰvuＩＩ−ＨindＩＩＩ断片から得られる(４８、
４９)(両末端はＥcoＲＩ末端に転換される)。これらの
配列は、ＤＮＡ複製のウイルス性オリジンを含むだけで
なく、初期および後期転写単位の両者のためのプロモー
タを暗号化(コード)する。ＳＶ４０オリジン領域の方向
性は、後期転写単位用のプロモータがインターフェロン
を暗号化する遺伝子に対し近くに存在するようなもので
ある。

【００３８】以下記載する詳細な説明は、組換ＤＮＡ技
術を介し種々の動物インターフェロンを製造するための
本発明の例示であり、特に牛白血球インターフェロンの
製造につき一般的に使用しうる方法を包含しかつ示して
いる。この方法を細菌系に関して説明する。

【００３９】Ａ．牛ＤＮＡの単離 動物遺伝子保存物(ライブラリ)を作成する目的で、高分
子量ＤＮＡをＢlinおよびＳtafford法(５０)の変法によ
り動物組織から単離し、遺伝子部位に関してランダムに
断片化させ、かつサイズ分画してλフアージベクター中
へクローン化させるための１５−２０キロ塩基断片を得
た(５１)。

【００４０】凍結組織、たとえば牛の膵臓を液体窒素中
で微粉末まで磨砕し、０．２５ＭのＥＤＴＡと１％のザ
ルコシル(Ｓarkosyl)と０．１mg／mlのプロテイナーゼ
Ｋ(２５ml／g組織)とに５０℃にて３時間可溶化させ
た。得られた粘性溶液をフエノールで３回およびクロロ
ホルムで１回抽出して除蛋白し、５０mＭのトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ８)と１０mＭのＥＤＴＡと１０mＭのＮaＣlとに
対し透析し、そして熱処理されたパンクレアチンリボヌ
クレアーゼ(０．１mg／ml)にて３７℃で２時間消化させ
た。フエノールとエーテルとで抽出した後、ＤＮＡを２
倍容量のエタノールで沈澱させ、９５％エタノール中で
洗浄し、凍結乾燥させそしてＴＥ緩衝液(１０mＭのトリ
ス−ＨＣl(pＨ７．５)と１mＭのＥＤＴＡ)とに最終濃度
１−２mg／mlにて４℃で１晩再溶解させた。最終のＤＮ
Ａ調製物は、０．５％中性アガロースゲル電気泳動で測
定すると、長さにおいて１００キロ塩基より大であっ
た。

【００４１】Ｂ．牛ＤＮＡの部分エンドヌクレアーゼ消
化およびサイズ分画 牛ＤＮＡの１部(０．１mg)を１．２５、２．５、５およ
び１０単位のＳau３Ａにて、１０mＭのトリス−ＨＣl(p
Ｈ７．５)と１０mＭのＭgＣl₂と２mＭのジチオスレイト
ールとを有する反応液(１ml)中で３７℃にて６０分間消
化した。ＥＤＴＡを２５mＭまで添加してインキュベー
ションを停止させ、フエノールおよびエーテルで抽出
し、酢酸ナトリウム０．３Ｍとなし(pＨ５．２)、そし
て３倍容量のエタノールで沈澱させた。このＤＮＡをＴ
Ｅ緩衝液中に６８℃で再溶解させ、ベックマンＳＷ２７
型ロータにて２７,０００rpmで１０−４０％の線状蔗糖
勾配(５１)を用いて２０℃にて２２時間沈降させた。こ
れらフラクション(０．５ml)を、分子量標準としてＥco
ＲＩ消化されたシャロン４Ａ(５１a)ＤＮＡを用いて
０．５％ゲル上にて分析した。１５−２０キロ塩基のＤ
ＮＡ断片を含有するフラクションを混合し、エタノール
で沈澱させ、そしてＴＥ緩衝液中に再溶解させた。

【００４２】Ｃ．牛ゲノムＤＮＡ保存物の作成 １５〜２０kbの牛ＤＮＡ非限定消化物を、フアージの２
個の内部ＢamＨＩ断片の除去により生じたＧ−Ａ−Ｔ−
Ｃ付着性末端を有するλシャロン３０Ａベクター(５２)
中へクローン化させた。シャロン３０Ａをイーコリ菌株
ＤＰ５０ＳupＦ(ＡＴＴＣ Ｎo．３９０６１、１９８２
年３月５日寄託)においてＮＺＹＤＴブロス中で増殖さ
せ、ポリエチレングリコール沈澱によって濃縮し、そし
てＣsＣl濃度勾配遠心分離によって精製した(５３)。こ
の精製されたフアージをフエノールで２回、フエノール
とエーテルとで１回抽出し、かつＤＮＡをエタノール沈
澱により濃縮して、フアージＤＮＡを調製した。

【００４３】シャロン３０Ａの末端断片を調製するた
め、５０μgのフアージＤＮＡを５０mＭのトリス−ＨＣ
l(pＨ８)と１０mＭのＭgＣl₂と０．１５ＭのＮaＣlとの
０．２５ml中で４２℃にて２時間アニールし、ＢamＨＩ
にて完全に消化させ、フエノールおよびエーテルで抽出
し、そして上記と同様に１０−４０％蔗糖勾配にて沈降
させた。フアージの３２kbのアニールされたアームを有
するフラクションを集め、エタノール沈澱させた。精製
されたシャロン３０Ａアーム(６μg)を４２℃にて２時
間再アニールし、０．３μgの１５−２０kb牛ＤＮＡお
よび４００単位のフアージＴ４ポリヌクレオチドリガー
ゼと混合し、そして５０mＭのトリス−ＨＣl(pＨ７．
５)と１０mＭのＭgＣl₂と２０mＭのジチオスレイトール
と５０μg／mlの牛血清アルブミンとを含有する反応液
０．０７５ml中で１２℃にて１晩インキュベートした。
次いで、この結合したＤＮＡ混合物を、試験管内λ包封
系を用いて成熟λフアージ粒子中へ包封した(５４)。

【００４４】この系の成分、すなわち音波抽出物(Ｓ
Ｅ)、凍結−解凍溶菌物(ＦＴＬ)、蛋白質Ａおよび緩衝
液ＡおよびＭ１とを文献に記載されたように調製した
(５４)。結合したＤＮＡ混合物の３μlを１５μlの緩衝
液Ａ、２μlの緩衝液Ｍ１、１０μlのＳＥおよび１μl
の蛋白質Ａと共に２７℃にて４５分間インキュベートし
た。ＦＴＬを氷上で４５分間解凍させ、０．１容量の緩
衝液Ｍ１と混合し、３５,０００rpmにて４℃で２５分間
遠心分離し、そして０．０７５mlの上澄液を上記反応液
へ加えた。２７℃にてさらに２時間インキュベーション
した後、少量の包封反応物を菌株ＤＰ５０ＳupＦ(上記)
上で滴定した。この手順は、全部で約１．１×１０⁶の
個々の牛ＤＰ組換体を生成した。残部の包封混合物をプ
レート−溶菌物法(５２)により増幅させ、その際組換体
をＤＰ５０ＳupＦ上に１５cmのＮＺＹＤＴ寒天板１枚当
り１０,０００プラーク形成単位の密度で接種した。

【００４５】Ｄ．牛インターフェロン遺伝子に対するフ
アージライブラリのスクリーニング 牛インターフェロン遺伝子を有するフアージ組換体を同
定するために使用した方法は、クローン化されたヒト白
血球(８,９)、繊維芽細胞(１２)および免疫(５５)イン
ターフェロン遺伝子から調製された放射能活性プローブ
によりヌクレオチド相同性を検出することからなってい
る。ハイブリダイゼーション条件は、ゲノム動物ＤＮＡ
のサウザンブロット(５６)によって確立させた。ヒト胎
盤、牛膵臓および豚の顎下腺からの高分子量ＤＮＡ(上
記と同様に調製)のそれぞれ５μgをＥcoＲＩで完全に消
化させ、０．５％アガロースゲル上で電気泳動させ、そ
してニトロセルロース紙へ移した(５６)。Ｐ³²−標識し
たＤＮＡプローブを、ＢglＩＩ制限部位(５７)に成熟ヒ
ト白血球インターフェロンＡ／Ｄハイブリッドの蛋白質
暗号化領域を有する５７０塩基対のＥcoＲＩ断片から標
準法(５８)によって調製した。各ニトロセルロース濾紙
を、５×ＳＳＣ(５６)と５０mＭの燐酸ナトリウム(pＨ
６．５)と０．１mg／mlの超音波処理した鮭精子ＤＮＡ
と５×デンハルト溶液(Ｄenhardt's solution)(５９)と
０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと１０％、２０％も
しくは３０％のいずれかのホルムアミドを含有する０．
１％のピロ燐酸ナトリウムとにおいて４２℃で１晩予備
ハイブリダイズさせ、次いで１０％のデキストラン硫酸
ナトリウムを含有する同じ溶液中で１分間当り１００×
１０⁶カウントの標識プローブでハイブリダイズさせた
(６０)。４２℃にて１晩インキュベーションした後、濾
紙を２×ＳＳＣと０．１％のＳＤＳとにおいて室温で４
回洗浄し、２×ＳＳＣにて１回洗浄し、次いでデュポン
・クロネックス(Ｄupont Ｃronex)強化スクリーンを有
するコダックＸＲ−５Ｘ線フイルムに１晩露出させた。
図１に見られるように、多数のハイブリダイズ帯は、２
０％のホルムアミドをハイブリダイゼーションの際に存
在させた場合、牛および豚のＤＮＡ消化物において最も
容易に検出された。この結果は、ヒトにおいて上記に例
示したものと類似した牛および豚における白血球インタ
ーフェロン遺伝子のマルチジエン(multigene)類に対す
る証明を与える(１２、６１)。したがって、同じハイブ
リダイゼーション条件を使用して、牛ＤＮＡライブラリ
においてインターフェロン遺伝子をスクリーニングし
た。

【００４６】５００,０００個の組換体フアージをＤＰ
５０ＳupＦ上に１０,０００pfu／１５cmプレートの密度
で接種し、二重のニトロセルロース濾紙レプリカ(dupli
catenitrocellulose filter replicas)をベントンおよ
びデービスの方法(６２)により各プレートにつき調製し
た。これらフイルタを上記のようにヒトＬeＩＦ遺伝子
プローブとハイブリダイズさせた。反復スクリーニング
の際強力な信号を与える９６個の複製ハイブリダイズプ
ラーク(duplicate hybridizing plaques)が得られた。

【００４７】牛ライブラリをさらに繊維芽細胞および免
疫インターフェロン遺伝子につきスクリーニングした。
これらプローブは、全成熟ヒト繊維芽細胞インターフェ
ロン遺伝子を含有する５０２塩基対のＸbaＩ−ＢglＩＩ
Ｉ断片(１２)および３１８塩基対のＡluＩ断片(アミノ
酸１２−１１６を含有する)および１９０塩基対のＭbo
ＩＩ断片(アミノ酸９９−１６２を含有)から作成し、こ
れらはヒト免疫インターフェロン遺伝子の成熟暗号化領
域から得られたものである(５５)。１．２×１０⁶個の
組換体フアージのハイブリダイゼーションは、全部で２
６種の牛繊維芽細胞インターフェロンクローンと１０種
の牛免疫インターフェロンクローンとを生成した。

【００４８】Ｅ．組換体フアージの特性化 フアージＤＮＡを、ヒト白血球インターフェロンプロー
ブとハイブリダイズした１２種の組換体から上記と同様
に調製した。各ＤＮＡをＥcoＲＩ、ＢamＨＩおよびＨin
dＩＩＩのいずれか１つにより並びにその組合せによっ
て消化し、０．５％アガロースゲル上で電気泳動させ、
ハイブリダイズ配列の位置をサウザン法(５６)によって
地図化した。クローン１０、３５、７８および８３から
の単一消化したＤＮＡの比較を図２に示す。各フアージ
につき、観察された制限断片の寸法ならびに対応するハ
イブリダイゼーションパターンは相違しかつ重複してお
らず、このことはこれら４種のフアージのそれぞれが異
なる牛インターフェロン遺伝子を有することを示唆して
いる。さらに、３種の酵素のそれぞれによるクローン８
３の消化はそれぞれの場合２種の異なるハイブリダイズ
帯をもたらし、これはこの組換体が２種の近接して結合
したインターフェロン遺伝子を有することを示してい
る。

【００４９】Ｆ．牛白血球インターフェロン遺伝子のサ
ブクローン化 ヒト白血球遺伝子プローブとハイブリダイズした組換体
フアージの３種からの制限断片を、pＢＲ３２２誘導体
すなわちpＵＣ９の多重制限酵素クローン化部位(multip
le restriction enzyme cloning site)にサブクローン
化させた。このプラスミドpＵＣ９はpＢＲ３２２から、
先ずテトラサイクリン耐性遺伝子を有する２０６７塩基
対のＥcoＲＩ−ＰvuＩＩ断片を除去し、次いでフアージ
Ｍ１３誘導体mＰ９(６２a)からの４２５塩基対のＨaeＩ
Ｉ断片を得られたプラスミドのＨaeＩＩ部位中に位置２
３５２(pＢＲ３２２表記に関し)で挿入することにより
誘導した。mＰ９からのＨaeＩＩ断片はイー・コリlacＺ
遺伝子のＮ−末端暗号化領域を含有し、ここで配列の多
重−制限酵素クローン化部位 ＣＣＡＡＧＣ ＴＴＧ
ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＧＴ ＣＧＡ ＣＧＧ ＡＴＣ Ｃ
ＣＣＧＧＧは、β−ガクトシラーゼの第４番目と第５番
目のアミノ酸残基の間に挿入されている。これらクロー
ン化部位への外来ＤＮＡ断片の挿入は、lacプロモータ
とlacＺ遺伝子との間の連続性を中断し、したがってlac
⁺からlac^-にプラスミドにより形質転換されたＪＭ８３
の表現系を変化させる。

【００５０】上記の断片は次の通りであった;(a)クロー
ン８３からの１．９kbのＢamＨＩ断片および３．７kbの
ＥcoＲＩ断片(これは同じ組換体の非重複セグメントに
相当する)、(b)クローン３５からの３．５kbのＢamＨＩ
−ＥcoＲＩ断片および、(c)クローン６７からの３．２k
bのＥcoＲＩ断片。それぞれの場合、適当に消化された
ベクターの０．１μgを１０倍モル過剰の精製断片と結
合させ、イー・コリ菌株ＪＭ８３(ＡＴＣＣ Ｎo．３９
０６２、１９８２年３月５日付で寄託)に形質転換さ
せ、０．０４mg／mlの５−ブロム−４−クロル−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトシドと０．２mg／mlのアン
ピシリンとを含有するＭ９(６３)プレート上へ接種し
た。pＵＣ９上のlacＺ遺伝子の暗号化領域を中断する制
限部位にＤＮＡ挿入物を有すると思われる白色のコロニ
ーを、ＬＢブロス＋０．０２mg／mlのアンピシリンの５
ml中へ釣上げ、３７℃にて数時間増殖させ、そして挿入
断片をプラスミドＤＮＡのミニ調製法(６４)によってス
クリーニングした。

【００５１】Ｇ．クローン８３に関する牛白血球インタ
ーフェロン遺伝子のＤＮＡ配列 p８３ＢamＨＩ１．９kb(クローン８３の１．９kb断片の
サブクローン)のＢamＨＩ部位から伸びるＤＮＡ配列を
マキサム−ギルバート化学法(６５)によって決定し、こ
れを図３、図４、図５、および図６に示す。最も長いオ
ープン解読枠は、ヒト白血球インターフェロンに顕著な
相同性を有する１８９個のアミノ酸からなるポリペプチ
ドを暗号化する(図７、図８、および図９)。ヒト蛋白質
との相同性により、牛白血球インターフェロンは疎水性
の２３個のアミノ酸シグナルペプチドよりなり、これは
同一配列すなわちser−leu−gly−cysにより１６６個の
アミノ酸成熟蛋白質に先行する。位置１,２９,９９およ
び１３９における４個のシステイン残基は、種間におい
て正確に保持されている。牛インターフェロンとヒトイ
ンターフェロンとの間の対としての相同性比較を表１に
示す。予想通り、牛蛋白質はヒト蛋白質のそれぞれに対
し、後者(８０％より大)よりも著しく相同性が低い(約
６０％)。

【００５２】プラスミドサブクローンp６７ＥcoＲＩ
３．２kb、p３５ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ３．５kbおよびp８
３ＥcoＲＩ３．７kbについて生ずる３種の追加の牛白血
球インターフェロン遺伝子に対するＤＮＡ配列および推
定アミノ酸配列を図４、図５および図６にそれぞれ示
す。表１に要約したように、ＢoＩＦＮ−α２および３
遺伝子はＢoＩＦＮ−α１とは極く僅かに異なったペプ
チドを暗号化するのに対し、ＢoＩＦＮ−α４蛋白質は
他の牛ペプチドとは相違しており、後者は任意の２種の
牛およびヒト白血球インターフェロンが相違しているの
と同様である。

【００５３】α４遺伝子が他のＢoＩＦＮ−αと同程度
に幅広い種類の細胞蛋白質から誘導されるかどうかを確
認するため、ゲノム牛ＤＮＡを数種の制限エンドヌクレ
アーゼで消化し、これをα１(６１２bpのＡvaＩＩ断
片、図１１)およびα４(pＢoＩＦＮ−α４trp１５のＥc
oＲＩ−ＸmnＩ断片)遺伝子の蛋白質暗号化領域を示す放
射能活性ＤＮＡ断片と、これら２種の遺伝子の交差ハイ
ブリダイゼーションを許容しない高度の厳格な条件下
(５０％ホルムアミド)にてハイブリダイズさせた。図１
１に見られるように各遺伝子は優先的に牛ＤＮＡ断片の
異なった組合せにハイブリダイズする。これらの結果
は、総合的に２種の異なる牛白血球ＩＦＮペプチドの種
類の存在を明らかに示し、それらのうちα１およびα４
蛋白質は代表的なものと考えられる。

【００５４】

【表１】 牛およびヒトＩＦＮ−αの暗号化配列における相違の対比較 α1 α2 α3 α4 αA αB αC αD αF αH αI αJ αK BoIFN-α1 94 92 54 61 62 63 64 61 64 63 61 65 BoIFN-α2 96 91 53 61 61 64 63 62 63 63 64 64 BoIFN-α3 100 96 45 BoIFN-α4 52 48 52 54 54 58 55 56 58 56 54 54 HuIFN-αA 56 52 39 81 81 83 82 83 81 80 86 HuIFN-αB 43 39 48 70 81 77 81 83 80 79 81 HuIFN-αC 61 57 52 70 65 81 89 86 94 92 83 HuIFN-αD 52 48 48 74 61 65 83 81 80 78 84 HuIFN-αF 61 57 52 70 65 100 65 83 89 86 83 HuIFN-αH 56 52 52 74 74 74 83 74 84 84 84 HuIFN-αI 61 57 52 70 65 100 65 100 74 91 81 HuIFN-αJ 56 52 48 61 57 91 70 91 65 91 80 HuIFN-αK 52 48 48 83 70 74 91 74 91 74 65

【００５５】表１において、数値は相同性％を示し、左
側下半分は２３個のアミノ酸プレシーケンスを示し、上
部右半分は１６６個のアミノ酸成熟蛋白質を示し、Ａ,
Ｂ,Ｃなどはヒト白血球インターフェロンＡ,Ｂ,Ｃなど
である。

【００５６】Ｈ．イー・コリにおける成熟ＢoＩＦＮ−
α１の直接的発現 直接発現プラスミドの作成を図１０に要約する。プラス
ミドサブクローンp８３ＢamＨＩ１．９kbをＡvaＩＩに
よって完全に消化させ、牛白血球インターフェロン遺伝
子を含有する６１２塩基対の断片を６％ポリアクリルア
ミドゲル上での電気泳動により単離し、そして電気溶出
させた。約１．５μgのこの断片をＦnu４Ｈにより消化
し、フエノールおよびエーテルで抽出し、そしてエタノ
ール沈澱させた。得られたＦnu４Ｈ付着末端を６単位の
ＤＮＡポリメラーゼＩ(クレノー断片)により２０mＭの
トリス−ＨＣl(pＨ７．５)と１０mＭのＭgＣl₂と４mＭ
ジチオスレイトールと０．１mＭのそれぞれdＡＴＰ,dＧ
ＴＰ,dＣＴＰおよびdＴＴＰとを含有する２０μl中にお
いて１２℃で３０分間平滑末端部まで伸長させた。フエ
ノールおよびエーテルで抽出した後、このＤＮＡをＰst
Ｉによって消化し、そして６％ゲル上で電気泳動にかけ
た。得られた９２塩基対の平滑末端ＰstＩ断片は、成熟
牛白血球インターフェロンの暗号化領域の第１ヌクレオ
チドから伸びるものであり、これをゲルから電気溶出さ
せた。

【００５７】残部の成熟暗号化領域を次のように単離し
た。p８３ＢamＨＩ１．９kbのＢamＨＩ挿入物３μgを１
４単位のＰstＩにより、１０mＭのトリス−ＨＣl(pＨ
７．５)と１０mＭのＭgＣl₂と２mＭのジチオスレイトー
ルとを含有する４５μlの反応液中で３７℃にて１０分
間部分消化させ、そしてフエノールおよびエタノールで
抽出した。成熟暗号化領域のヌクレオチド９３から伸び
る所望の１４４０塩基対の部分ＰstＩ−ＢamＨＩ断片を
６％ポリアクリルアミドゲルから単離した。

【００５８】プラスミドpdeltaＲＩsrcはプラスミドpＳ
ＲＣex１６(６６)の誘導体であり、ここでtrpプロモー
タに近接しかつsrc遺伝子から離れているＥcoＲＩ部位
はＤＮＡポリメラーゼ１での修復により除去されており
(６７)、自己補完的なオリゴデオキシヌクレオチドＡＡ
ＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴ(ホスホトリエステル法(６
８)によって合成)をＸbaＩ部位にすぐ隣接する残余のＥ
coＲＩ部位中へ挿入した。２０μgのpdeltaＲＩsrcをＥ
coＲＩによって完全に消化し、フエノールおよびエーテ
ルで抽出し、そしてエタノール沈澱させた。次いで、こ
のプラスミドを１００単位のヌクレアーゼＳ１により２
５mＭの酢酸ナトリウム(pＨ４．６)と１mＭのＺnＣl₂と
０．３ＭのＮaＣlとにおいて１６℃にて３０分間消化さ
せ、配列ＡＴＧを有する平滑末端部を生成させた。フエ
ノールおよびエーテル抽出ならびにエタノール沈澱の
後、ＤＮＡをＢamＨＩで消化し、６％ポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動させ、そして大型(４３００bp)のベ
クター断片を電気溶出により回収した。

【００５９】０．２μgのベクターと０．０２μgの９２
bpの平滑末端−ＰstＩ断片と０．２５μgの１４００bp
の部分ＰstＩ−ＢamＨＩ断片とを４００単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより１２℃で１晩結合させて発現プラスミ
ドを組立てた後、これを使用してイー・コリ菌株２９４
(ＡＴＣＣ Ｎo．３１４４６)をアンピシリン耐性に形
質転換させた。プラスミドＤＮＡを９６個のコロニーか
ら調製し、これをＸbaＩおよびＰstＩによって消化し
た。これらプラスミドの１９種は所望の１０３塩基対の
ＸbaＩ−ＰstＩおよび１０５０塩基対のＰstＩ断片を含
有した。ＤＮＡ配列の分析は、これらプラスミドの数種
が牛インターフェロン暗号化領域の開始部に正確に位置
するＡＴＧ開始コドンを有することを証明した。これら
プラスミドの１種、すなわちpＢoＩＦＮ−α１trp５５
をさらに検討するため選択した。

【００６０】Ｉ．イー・コリにおける成熟牛白血球イン
ターフェロン(α−４)の第２の種類の直接的発現 ＡＴＧ開始コドンを、合成ＤＮＡプライマーＣＡＴＧＴ
ＧＴＧＡＣＴＴＧＴＣＴの酵素的伸長により、成熟暗号
化領域の前面に入れた。ヘプタデカマーをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼとγ−³²Ｐ ＡＴＰとにより前記と同
様に燐酸化した(１２)。２５０ピコモルのプライマー
を、３０μlのＨ₂Ｏ中にアミノ酸残基Ｓ２０〜１０２を
含有する約１μgの３１９bpＨincＩＩ断片と組合せ、５
分間煮沸し、そして２５単位のイー・コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩクレノー断片により３７℃にて３時間伸長させ
た。この反応の生成物をＨgiＡＩにより消化し、そして
得られた１８１bpの平滑末端−ＨgiＡＩ断片を６％ポリ
アクリルアミドゲルから単離した。

【００６１】成熟ペプチド用の全遺伝子を、ペプチドの
カルボキシ末端部分およびＥcoＲＩにより予め消化した
ＨuＩＦＮ−γ発現プラスミドすなわちpＩＦＮ−γtrp
４８−１３(５５)を含有する５０８bpのＨgiＡ−ＰstＩ
断片と上記の断片とを酵素的に結合することにより、tr
pプロモータの背後に組込み、伸長させて末端部(flush
end)をクレノーＤＮＡポリメラーゼと整列させ、Ｐst
Ｉにより消化し、そして最後に６％ポリアクリルアミド
ゲルで単離した。得られた混合物をイー・コリ２９４に
形質転換させる際、数種のクローンが同定され、これら
は親発現ベクターのtrpプロモーターリボソーム結合部
位領域と成熟牛ＩＦＮ(pＢoＩＦＮ−α４trp１５)の完
全暗号化領域との間にＥcoＲＩ識別部位を備えた。

【００６２】Ｊ．牛繊維芽細胞インターフェロン遺伝子
のサブクローン化 ヒトＩＦＮ−βＤＮＡプローブとハイブリダイズしたフ
アージ組換体の６種を精製し、そしてそれらのＤＮＡを
上記したように次の分析用として単離した。サウザンハ
イブリダイゼーション分析と組合せた制限地図化が示す
ところによれば、６種の単離物は牛ゲノムの３種の異な
る領域からなり、したがって多重遺伝子(multigene)Ｂo
ＩＦＮ−β類(family)を意味する。これらの結果を、図
１２に示した制限地図により要約する。それぞれ異なる
種類の組換体に対する一層詳細な制限地図およびヌクレ
オチド配列を得るため、ハイブリダイズ断片をプラスミ
ドベクター中へサブクローン化させた。特に、フアージ
λβ１の５kbＢglＩＩ断片とフアージλβ２の５kbＢam
ＨＩ断片とを個々にＢamＨＩ部位にてpＢＲ３２２中へ
クローン化し、フアージλβ３の重複する４．５kbＥco
ＲＩ−ＸhoＩおよび１．４kbＰstＩ−ＨpaＩ断片をそれ
ぞれpＵＣ９(ＥcoＲＩ−ＳalＩ部位から削除したもの)
とpＬeＩＦ８７(１０)(ＨpaＩ−ＰstＩから削除したも
の)中へ挿入した。

【００６３】Ｋ．３種の異なる牛繊維芽細胞ＩＦＮ遺伝
子のＤＮＡ配列 図１３は、サブクローン化した３種の牛ＩＦＮ−β遺伝
子のそれぞれに対する制限地図を示している。これら
は、それぞれに独特な開裂部位の存在により容易に区別
される。各遺伝子に対するペプチド暗号化領域ならびに
そのすぐ上流および下流の配列をマキサム−ギルバート
化学法により決定し、これらを図１４、図１５および図
１６に示す。ヒト繊維芽インターフェロン遺伝子につき
決定された配列とのヌクレオチド相同性(１２)は、各牛
遺伝子生成物に対する正確な解読枠と全アミノ酸配列と
を予想させ、これは２１個のアミノ酸よりなる疎水性シ
グナルペプチドとそれに続く１８５個の残基の成熟蛋白
質とを含む。牛蛋白質は互いに全く異なるが(表２、図
１７)、ヒトペプチドに対しずっと大きな差(約６０％)
を示す。

【００６４】牛繊維芽細胞インターフェロンのマルチジ
エン特性を、さらに図１８に示されたサウザンブロット
をpＢoＩＦＮ−β１trpから誘導された４１５bpのＥco
ＲＩ−ＰvuＩ断片から調製された放射能活性プローブと
再ハイブリダイズすることにより示した(下記)。図１８
に示すように、この実験は追加の同族ＩＦＮ−β遺伝子
の存在に対する証明を与えた。より少ないハイブリダイ
ズ帯は実際に一層明確に関連する遺伝子を示し、これら
遺伝子はより明確なβ−ＩＦＮを暗号化する。

【００６５】

【表２】 牛ＩＦＮ−βおよびヒトＩＦＮ−βの暗号化配列における相同性の対比較 β１ β２ β３ Ｈuβ β１ １３８(８３) １３８(８３) ８４(５１) β２ ２０(９５) １４６(８８) ９２(５５) β３ ２０(９５) １９(９０) ８７(５２) Ｈuβ １６(７６) １７(８１) １６(７６)

【００６６】各対の暗号化配列における同一アミノ酸の
数を示す。２１個のアミノ酸シグナルペプチドを下方左
側部分で比較し、１６６個のアミノ酸成熟ＩＦＮ−βを
表の上方右側部分で比較する。各対における同一アミノ
酸の総数を最初に示し、次いで相同性％を示す。

【００６７】Ｌ．イー・コリにおける３種の牛ＩＦＮ−
βの直接的発現 ３種の牛ＩＦＮ−β遺伝子は多くの共通のＤＮＡ配列と
制限部位とを共有するので(図１３参照)、３種の全ての
遺伝子の発現につき一般的図式が可能である。２個のＡ
luＩ部位を含有する最初の５個のアミノ酸を暗号化する
ＤＮＡ配列はそれぞれの場合同一であったので、２種の
補完的合成オリゴヌクレオチドを設計し、これらはＡＴ
Ｇ翻訳開始コドンを組込み、成熟牛ＩＦＮ−βの最初の
４個のアミノ酸に対するコドンを復帰し、かつtrpプロ
モータ配列の後に挿入するための付着性のＥcoＲＩを生
成する。発現プラスミドの作成を図１９に図示する。Ｂ
oＩＦＮ−βサブクローンプラスミドから生ずる８５bp
ＡluＩ−ＸhoＩ断片に対する合成オリゴマーの結合、お
よびそれに続くＥcoＲＩおよびＸhoＩによる消化は、Ｅ
coＲＩおよびＸhoＩ付着末端によりフランキングした１
０４bp断片を生成する。次いで、全暗号化を、１０４bp
の断片を各ＢoＩＦＮ−β蛋白質の残部を暗号化する約
７００bpのＸhoＩ−Ｐst断片および予め内部ＥcoＲＩ−
ＰstＩ断片が除去されているプラスミドpＩＦＮ−γtrp
４８−１３(５５)と結合することにより、trp発現ベク
ター中へ組込んだ。得られたプラスミド、すなわちpＢo
ＩＦＮ−β１trp、pＢoＩＦＮ−β２trpおよびpＢoＩＦ
Ｎ−β３trpは全て、ＩＦＮ−β遺伝子の適切な転写お
よび翻訳がイー・コリtrpオペロンの制御下で行なわれ
るように構成されていた。

【００６８】Ｍ．牛免疫インターフェロン(ＢoＩＦＮ−
γ)遺伝子の特性化およびサブクローン化 ヒトＩＦＮ−γプローブとハイブリダイズした１０種の
フアージ組換体を精製し、そしてＤＮＡを上記と同様に
調製した。１０種のＤＮＡ試料は全て、サウザンブロッ
ト分析により特定のハイブリダイズ帯を与えた。クロー
ンλγ４およびλγ７を、それらが異なるハイブリダイ
ズ帯パターンを有するので、その後の分析のために選択
した。これら２種のクローンの制限地図は、互いに重複
するＤＮＡ配列を示す。重複領域は制限部位ＸbaＩ,Ｅc
oＲＶおよびＮcoＩを含有する。これら２種のクローン
のＤＮＡ配列分析は、ヒト免疫インターフェロン遺伝子
(７０)に全体的に類似の遺伝子構造を示し、かつλγ７
が４番目のエキソンを暗号化する配列を含みかつλγ４
がヒトＩＦＮ−γ遺伝子とのＤＮＡ配列相同性に基づく
牛ＩＦＮ−γ遺伝子の最初の３つのエキソンを暗号化す
る配列を含有することを示す。ＢoＩＦＮ−γを示唆す
るアミノ酸配列を、図２０において、ＨuＩＦＮ−γ(５
５)およびねずみＩＦＮ−γのそれと比較する。

【００６９】ＤＮＡの連続セグメントに対する全牛ＩＦ
Ｎ−γ遺伝子を組立てるため、λγ４から生ずる牛ＩＦ
Ｎ−γ遺伝子の最初の３つのエキソンを離間する３００
０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＮcoＩ断片と、λγ７から生ずる
最後のエキソンを離間する２５００bpのＮcoＩ−Ｈind
ＩＩＩ断片とを単離した。これら２つのＤＡＮ断片を、
次いで３つの部分結合を介してpＢＲ３２２から生ずる
ＢamＨＩ−ＨindＩＩＩベクター中へクローン化させ
た。

【００７０】Ｎ．哺乳類系における牛ＩＦＮ−γ遺伝子
の発現 たとえばイー・コリのような原子核系においてこの遺伝
子を発現しうるようＢoＩＦＮ−γのイントロンのない
ものを得る目的で、遺伝子を動物細胞発現系において高
レベルの発現を得るよう処理し、著量の特定mＲＮＡを
得た。全牛ＩＦＮ−γ遺伝子を離間する５５００bpのＢ
amＨＩ−ＨindＩＩＩ断片を、ＣＯＳ細胞における発現
のためＳＶ４０ベクター中へ挿入した(４４)。特に、Ｂ
amＨＩ−ＨindＩＩＩ牛ＩＦＮ−γ遺伝子断片を２８０
０bpのＳＶ４０プラスミドベクターpＤＬ△Ｒ１にクロ
ーン化させた[(後期転写の方向に選択的な複製のＳＶ４
０オリジンから上流のＥcoＲＩ部位を酵素的に削除する
ことにより、ＨＢＶ抗原発現プラスミドpＨＢs３４８−
Ｌから生ずる。発現プラスミドpＨＢs３４８−Ｌは、Ｈ
ＢＶ(７１)(これはＨＢsＡgを暗号化する遺伝子を離間
する)のＥcoＲＩおよびＢglＩＩ消化物から生ずる１９
８６塩基対の断片をプラスミドpＭＬ(７２)中へＥcoＲ
ＩおよびＢamＨＩ部位においてクローン化させることに
より作成した(pＭＬは猿細胞におけるプラスミド複製に
抑制的な配列を除去する削除部を有するpＢＲ３２２の
誘導体である(７２)]。次いで、生じたプラスミド(pＲ
Ｉ−Ｂgl)をＥcoＲＩにより線状化し、そしてＳＶ４０
オリジン領域を示す３４８塩基対の断片をpＲＩ−Ｂgl
のＥcoＲＩ部位に導入した。オリジン断片はいずれの方
向でも挿入することができる。この断片は複製のオリジ
ンの他に初期および後期のＳＶ４０プロモータの両者を
暗号化するので、この方向性によっていずれかのプロモ
ータの制御下に(pＨＢs３４８−Ｌは後期プロモータの
制御下において発現されるＨＢsを示す)ＢamＨＩおよび
ＳalＩ部位との間に、pＢＲ３２２から生じた６００bp
のＨindＩＩＩ−ＳalＩ変換断片の存在下で３種の部分
結合を介してＨＢＶ遺伝子を発現することができるであ
ろう。ＣＯＳ細胞中への得られたプラスミドのトランス
フエクションは、ＳＶ４０後期プロモータの制御下に牛
ＩＦＮ−γの効率的発現をもたらす。

【００７１】ポリＡ⁺mＲＮＡをトランスフエクションさ
れたＣＯＳ細胞から調製し、次いで標準法(５５)により
cＤＮＡを調製するために使用した。牛ＩＦＮ−γ遺伝
子プローブとハイブリダイズするcＤＮＡクローンを単
離した。最も長いＰstＩ挿入物を有するcＤＮＡクロー
ンをその後の分析のために選択した。このcＤＮＡクロ
ーンのＤＮＡ配列の分析は、牛ＩＦＮ−γゲノムクロー
ンから予想される全てのイントロン配列が正確に除去さ
れたことを示している。cＤＮＡを上記のプライマ修復
法によりイー・コリ中で発現させるために処理した。

【００７２】Ｏ．細菌抽出物の調製 ０．０２mg／mlのアンピシリンまたは０．００５mg／ml
のテトラサイクリンを含有するＬＢブロスで増殖させた
１晩培養物を、１:１００の希釈率にて０．２％のグル
コースと０．５％のカザミノ酸と適当な薬剤とを含有す
る５０mlのＭ９培地(６３)中に接種し、そして振とうし
ながら３７℃にてＡ５５０＝１．０となるまで増殖させ
た。１０mlの試料を遠心分離により収穫し、そして直ち
にドライアイス−エタノール浴中で迅速に凍結させた。
凍結したペレットを１mlの７Ｍグアニジン中に再懸濁さ
せ、氷上で５分間インキュベートし、そしてＰＢＳ中に
希釈して分析した。或いは、凍結ペレットを、０．２ml
の２０％蔗糖と１００mＭのトリス−ＨＣl(pＨ８．０)
と２０mＭのＥＤＴＡと５mg／mlのリゾチームとの添加
により溶菌させた。氷上にて２０分間後、０．８mlの
０．３％トリトンＸ−１００と０．１５Ｍのトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ８．０)と０．２ＭのＥＤＴＡと０．１mＭのＰ
ＭＳＦとを添加した。１９,０００rpmにて１５分間遠心
分離することにより溶菌物を清澄させ、そして上澄液を
ＰＢＳ中に希釈した後に分析した。

【００７３】Ｐ．インターフェロン分析 牛インターフェロン活性を９６ウエルマイクロ測定板で
行なわれる細胞病理的効果(ＣＰＥ)抑制分析により次の
ように分析した： １．９６ウエルマイクロ測定板のそれぞれのウエルに
（８横列×１２縦列)、１０％の胎児牛血清を含有する
培地中の細胞の懸濁物１００μlを加える。細胞濃度を
調整して、翌日に融合単一層を与える。 ２．固定プラットフォーム上へプレートを緩和に１０分
間固定して、一様に細胞を分配させる。翌日: ３．第１の縦列の各ウエルに８０μlの追加培地を加え
る。 ４．第１の縦列のウエルに、インターフェロン活性につ
き分析すべき試料の２０μlを加える。 ５．１００μlピペットによりウエルの内容物１００μl
を数回抜取りかつ注入することにより、ウエルにおける
試料および培地を混合する。

【００７４】６．第１の縦列におけるウエルの内容物１
００μlを水平に第２の縦列のウエルへ移行させる。 ７．工程３におけると同様に混合する。 ８．全部で１１回の移行が行なわれるまで縦列から次の
縦列までウエルの内容物１００μlの移動を続ける。 ９．第１２番目の縦列におけるウエルの内容物１００μ
lを取出して捨てる。この過程は順次の２倍希釈をもた
らす。 １０．各分析プレートは適当なＮＩＨ標準を含有する。

【００７５】１１．ＣＯ₂インキュベーションにおいて
プレートを３７℃にて２４時間インキュベートする。 １２．各分析プレートは１００μlの細胞懸濁物と１０
０μlの培地とを収容して細胞増殖比較として役立つウ
エルと、１００μlの細胞懸濁物と１００μlの培地と５
０μlのウイルス懸濁物とを収容してウイルス誘発性細
胞病原性比較として役立つウイルスとを含む。 １３．５０μlのウイルス懸濁物を含む細胞比較を除
き、全てのウエルを攻撃する。使用した感染の倍数は、
２４時間以内における特定の細胞系に対する１００％の
細胞病理的効果をもたらすウイルスの量である。 １４．ＣＯ₂インキュベーションで３７℃にて２４時間
プレートを再インキュベートする。 １５．プレートから液体を取出し、細胞を０．５％クリ
スタルヴアイオレットで染色する。細胞を２〜５分間染
色させる。

【００７６】１６．プレートウエルを水道水にて洗浄
し、乾燥させる。 １７．試料に関するインターフェロンのタイター（力
価）は、５０％の生存細胞が残存する希釈率の逆数であ
る。 １８．全ての試料の活性を、次の式から計算される比較
単位変換ファクタにより規格化する:

【００７７】

【数１】ＮＩＨ標準の実際のタイター／分析における観
測タイター＝比較単位変換ファクタ (６９参照)。pＢoＩＦＮ−α１trp５５で形質転換させ
たイー・コリ菌株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo．３１４４６)
から調製された抽出物は、ＶＳウイルス(インジアナ菌
株)で攻撃される牛腎臓細胞系(ＭＤＢＫ)に対し顕著な
活性を示すが、猿腎臓(ＶＥＲＯ)、ヒト頸部癌(ＨeＬ
a)、うさぎ腎臓(ＲＫ−１３)またはねずみ(Ｌ９２９)細
胞系(同様にして攻撃される)に対し顕著な活性を示さな
かった。pＢＲ３２２により形質転換された菌株２９４
から調製された比較抽出物は、ＭＤＢＫ細胞に対し活性
を示さなかった。表３は、種々の攻撃された動物および
ヒト細胞系に対する試験管内の抗ウイルス活性ＢoＩＦ
Ｎ−α１を要約している。ＢoＩＦＮ−α１は、攻撃と
してＶＳウイルスを使用する牛細胞に対する活性に関
し、ヒト細胞に対する抗ウイルス活性を明らかに欠如す
ることによりヒト白血球ＩＦＮとは容易に区別される。
表４は、発現プラスミドpＢoＩＦＮ−α４trp１５、pＢ
oＩＦＮ−β１trp、pＢoＩＦＮ−β２trpおよびpＢoＩ
ＦＮ−β３trpにより形質転換されたイー・コリＷ３１
１０から調製される抽出物で得られるインターフェロン
活性のレベルを示している。特に顕著なことは、牛繊維
芽細胞インターフェロンは牛腎臓細胞系に対しヒト羊膜
細胞系よりも約３０倍活性であるのに対し、逆比関係が
ヒト繊維芽ＩＦＮにつき見出された(１２)。

【００７８】

【表３】 細胞系 ＩＦＮ調製物 タイター(単位／ml) ＶＳＶ ＥＭＣＶ ＭＤＢＫ ＬeＩＦＡ標準 ６４０ ＮＡ 牛白血球ＩＦＮ ３００,０００ ＮＡ 比較抽出物 ＜４０ ＮＡ ＨeＬa ＬeＩＦＡ標準 ６５０ １５００ 牛白血球ＩＦＮ ＜４０ ＜２３ 比較抽出物 ＜４０ ＜２３ Ｌ−９２９ ねずみＩＦＮ標準 ６４０ １０００ 牛白血球ＩＦＮ ＜２０ ＜３１ 比較抽出物 ＜２０ ＜３１ ＲＫ−１３ うさぎＩＦＮ標準 １０００ ＮＡ 牛白血球ＩＦＮ ＜６０ ＮＡ 比較抽出物 ＜６０ ＮＡ ＶＥＲＯ ＬeＩＦＡ標準 １５００ 牛白血球ＩＦＮ ＜１２ 比較抽出物 ＜１２ ＭＤＢＫ＝牛腎臓細胞 ＶＥＲＯ＝アフリカミドリザル腎臓細胞 ＨeＬa＝ヒト頸部癌細胞 ＲＫ−１３＝うさぎ腎臓細胞 ＮＡ＝ウイルスは各細胞において充分に複製できないの
で利用できない。

【００７９】

【表４】 イー・コリの抽出物におけるインターフェロン活性 下記により形質転換 ＩＦＮ−β活性 ＩＦＮ−β活性 されたイー・コリ294 (単位／Ｌ培養物) (単位／Ｌ培養物) ＭＤＢＫ−ＶＳＶ ＷＩＳＨ−ＶＳＶ pＩＦＮ−α１ １．０×１０⁸ Ｎ．Ｄ． pＩＦＮ−β１ ２．２×１０⁸ ６．５×１０⁶ pＩＦＮ−β２ １．１×１０⁸ ３．５×１０⁶ pＩＦＮ−β３ ６．０×１０⁸ ２．０×１０⁷ 細胞抽出物を調製し、公表された方法に従がい攻撃物と
して牛腎臓ＭＤＢＫ細胞系およびヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞
系およびＶＳＶを用いてインターフェロン活性につき分
析した(ウエック等、１９８１)。

【００８０】医薬組成物 本発明の化合物を公知の方法により調合して医薬上有用
な組成物を調製することができ、この場合動物インター
フェロン生成物を許容しうるキャリヤビヒクルと組合せ
ることができる。適するビヒクルおよびその調合物は記
載されている。この種の組成物は有効量のインターフェ
ロン蛋白質を適当量のビヒクルと共に含有して、公知の
ルートたとえば非経口的に宿主に有効投与するのに適し
た許容しうる組成物を調製する。

【００８１】本発明に包含される動物インターフェロン
は天然の対立遺伝子(allelic variation)と共に存在す
ることが了解されよう。これらは全配列におけるアミノ
酸の相違、或いは削除、置換、挿入、逆転、または前記
配列におけるアミノ酸の添加によって示すことができ
る。これら全ての対立遺伝子は本発明の範囲内に包含さ
れる。以上特定の好適具体例につき記載したが、本発明
はこれのみに限定されないことが了解されよう。

【００８２】文 献 １．リナルド(Ｒinaldo)他、インフエクション アンド
イミユニテイ(Ｉnfection and Ｉmmunity)、１４巻、
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オブ イースト(Ｔhe ＭolecularＢiology of Ｙeast)
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グハーバー ラボラトリイ(Ｃold Ｓpring Ｈarbor
Ｌaboratory)、コールドスプリング ハーバー(Ｃold
Ｓpring Ｈarbor)、ニューヨーク ４２．チャムボン(Ｃhambon)、アン．レブ．バイオケミ
ストリイ(Ａnn．Ｒev．Ｂiochemistry)、４４巻、６１
３頁、１９７５年 ４３．テイッシュ カルチャー(Ｔissue Ｃulture)、ア
ガデミック プレス(Ａcademic Ｐress)、クルス(Ｋru
se)及びパターソン(Ｐatterson)編、１９７３年 ４４．グルツマン(Ｇluzman)、セル(Ｃell)、２３巻、
１７５頁、１９８１年 ４５．ゲデル(Ｇoeddel)他、ネイチャー(Ｎature)、２
８１巻、５４４頁、１９７９年

【００９１】４６．ラスキイ(Ｌusky)他、ネイチャー
(Ｎature)、２９３巻、７９頁、１９８１年 ４７．グルツマン(Ｇluzman)他、コールド スプリング
ハーバー シンプ．クオント．バイオル．(Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor Ｓymp．Ｑuant．Ｂiol．)、４４巻、
２９３頁、１９８０年 ４８．フアイアス(Ｆiers)他、ネイチャー(Ｎature)、
２７３巻、１１３頁、１９７８年 ４９．レデイ(Ｒeddy)他、サイエンス(Ｓcience)、２０
０巻、４９４頁、１９７８年 ５０．ブリン(Ｂlin)及びスタフオード(Ｓtafford)、ヌ
クレイック アシッズリサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒese
arch)、３巻、２３０３頁、１９７６年

【００９２】５１．マニアテイス(Ｍaniatis)他、セル
(Ｃell)、１５巻、６８７頁、１９７８年 ５１a．ブラトナー(Ｂlattner)他、サイエンス(Ｓcienc
e)、１９６巻、１６１頁 、１９７７年 ５２．リム(Ｒimm)他、ジエン(Ｇene)、１２巻、３０１
頁、１９８０年 ５３．ブラトナー(Ｂlattner)他、１９７８年、プロセ
デユレス フオー ユウス オブ チャロン フアージ
ス イン レコンビナント デイーエヌエーリサーチ,
リサーチ リソウセス ブランチ(Ｐrocedures for
Ｕse of Ｃharon Ｐhages in Ｒecombinant ＤＮＡ Ｒ
esearch，Ｒesearch Ｒesources Ｂranch)、ナショナル
インスチチユウト オブ アレルギイ アンド イン
フエクシヨウス デジイズ(Ｎational Ｉnstitute of
Ａllergy and Ｉnfectious Ｄiseases)、ベセスダ(Ｂet
hesda)、メリイランド(Ｍaryland) ５４．ブラトナー(Ｂlattner)他、サイエンス(Ｓcienc
e)、２０２巻、１２７９頁 、１９７８年 ５５．グレイ(Ｇray)他、ネイチャー(Ｎature)、２９５
巻、５０３頁、１９８２年

【００９３】５６．サウセルン(Ｓouthern)、ジエイ．
モル．バイオル．(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)、９８巻、５０
３頁、１９７５年 ５７．ウエック(Ｗeck)他、ヌクレイック アシッズ
リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch)、９巻、６１５
３頁 ５８．テイラー(Ｔaylor)他、バイオケム．バイオフイ
ジ．アクタ(Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta)、４４２巻、
３２４頁、１９７６年 ５９．デンハート(Ｄenhardt)、バイオケム．バイオフ
イジ．レス．コム．(Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃom
m．)、２３巻、６４１頁、１９６６年 ６０．ワール(Ｗahl)他、プロク．ナト．アカデ．サ
イ．(Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.)、７６巻、３６８３頁、
１９７９年

【００９４】６１．ナガタ(Ｎagata)他、ネイチャー(Ｎ
ature)、２８７巻、４０１頁、１９８０年 ６２．ベントン(Ｂenton)及びデイビス(Ｄavis)、サイ
エンス(Ｓcience)、１９６ 巻、１８０頁、１９７７年 ６２a．メシング(Ｍessing)他、ヌクレイック アシッ
ズ リサーチ(ＮucleicＡcids Ｒesearch)、９巻、３０
９頁、１９８１年 ６３．ミラー(Ｍiller)１９７２年、エクスペリメンツ
イン モレキュラージ エネテイックス(Ｅxperiments
in Ｍolecular Ｇenetics)、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリイ(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌ
aboratory)、コールド スプリング ハーバー(Ｃold
Ｓpring Ｈarbor)、ニューヨーク ６４．ビルンボイム(Ｂirnboim)他、ヌクレイック ア
シッズ リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch)、７
巻、１５１３頁、１９７９年 ６５．マキサム(Ｍaxam)及びギルベルト(Ｇilbert)、プ
ロク．ナト．アカデ．サイ．(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓc
i．)、７４巻、５６０頁、１９７７年

【００９５】６６．マクグラス(ＭcＧrath)及びレビン
ソン(Ｌevinson)、ネイチャー(Ｎature) 、２９５巻、
４２３頁、１９８２年 ６７．イタクラ(Ｉtakura)他、サイエンス(Ｓcience)、
１９８巻、１０５６頁、１９７７年 ６８．クレア(Ｃrea)他、プロク．ナトル．アカデ．サ
イ．(Ｐroc．Ｎatl.Ａcad．Ｓci．)、７５巻、５７６５
頁、１９７８年 ６９．ステワルト(Ｓtewart)１９７９年、ザ インター
フェロン システム(Ｔhe Ｉnterferon Ｓystem)、スプ
リンガー−フエルラグ(Ｓpringer−Ｖerlag)、ニューヨ
ーク、１７頁参照 ７０．グレイ(Ｇray)及びゲデル(Ｇoeddel)、ネイチャ
ー(Ｎature)、２９８巻、８５９頁、１９８２年

【００９６】７１．アニマル ウイルス ジエネテイク
ス(Ａnimal Ｖirus Ｇenetics)、(フイ ールズ(Ｆield
s)他編)、５章５７頁、アカデミック プレス(Ａcademi
c Press)、エヌ．ワイ．(Ｎ．Ｙ．)、１９８０年 ７２．ラスキイ(Ｌusky)及びボッチャン(Ｂotchan)、ネ
イチャー(Ｎature)、２９３巻、７９頁、１９８１年

【００９７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＥcoＲＩにより消化しかつ種々異なるホルム
アミド濃度にてヒト白血球インターフェロンＡ／Ｄハイ
ブリッドの暗号化領域を含む³²Ｐ−標識５７０塩基対Ｅ
coＲＩ断片でハイブリダイズされた(a)ヒト、(b)牛およ
び(c)豚のゲノムＤＮＡのサウザンハイブリダイゼーシ
ョンを示している。２０％ホルムアミドにおけるハイブ
リダイゼーションは、マルチジエン牛および豚白血球イ
ンターフェロン遺伝子類の最も明瞭なパターンを示して
いる。

【図２】 ＥcoＲＩ,ＢamＨＩまたはＨindＩＩＩにより
消化されかつ³²Ｐ−標識したヒト白血球遺伝子プローブ
でハイブリダイズさせた４種の異なる牛ゲノムＤＮＡフ
アージ組換体のサウザンハイブリダイゼーションを示し
ている。クローン８３は、各制限酵素により２種のハイ
ブリダイズ断片を与える。

【図３】 プラスミドサブクローンp８３ＢamＨＩ１．
９kbからのヌクレオチド配列の一部ならびにそこに暗号
化された牛白血球インターフェロンのための推定アミノ
酸配列を示している。シグナルペプチドはアミノ酸残基
Ｓ１〜Ｓ２３によって示される。

【図４】 プラスミドサブクローンp６７ＥcoＲＩ３．
２kbからの第２の牛白血球インターフェロン(α２)のた
めのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示して
いる。

【図５】 プラスミドサブクローンp３５ＥcoＲＩ−Ｂa
mＨＩ３．５kbからの第３の牛白血球インターフェロン
(α３)に対する完全成熟ヌクレオチド配列および推定ア
ミノ酸配列を示している。

【図６】 プラスミドサブクローンp８３ＥcoＲＩ−Ｂa
mＨＩ２．９kbからの第４の牛白血球インターフェロン
に対するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示
している。シグナルペプチドはアミノ酸残基Ｓ１〜Ｓ２
３によって示される。成熟蛋白質は１７２個のアミノ酸
残基からなっている。６個のアミノ酸残基よりなる最終
の長さは位置５１１におけるヌクレオチド塩基変化に基
因し、次の同位相停止信号の前に６個の追加翻訳コドン
を許容する。

【図７】 ＢoＩＦＮ−α１,α２,α３およびα４のア
ミノ酸配列と、１１種の公知のヒト白血球インターフェ
ロンに対する配列との比較を示している。さらに、全て
のヒト白血球インターフェロンと全ての牛白血球インタ
ーフェロンで保持されているアミノ酸、並びに牛α１お
よびα４については大多数のヒト白血球インターフェロ
ンとの相同性が生ずる位置が示されている。

【図８】 ＢoＩＦＮ−α１,α２,α３およびα４のア
ミノ酸配列と、１１種の公知のヒト白血球インターフェ
ロンに対する配列との比較を示している。さらに、全て
のヒト白血球インターフェロンと全ての牛白血球インタ
ーフェロンで保持されているアミノ酸、並びに牛α１お
よびα４については大多数のヒト白血球インターフェロ
ンとの相同性が生ずる位置が示されている。

【図９】 ＢoＩＦＮ−α１,α２,α３およびα４のア
ミノ酸配列と、１１種の公知のヒト白血球インターフェ
ロンに対する配列との比較を示している。さらに、全て
のヒト白血球インターフェロンと全ての牛白血球インタ
ーフェロンで保持されているアミノ酸、並びに牛α１お
よびα４については大多数のヒト白血球インターフェロ
ンとの相同性が生ずる位置が示されている。

【図１０】 牛白血球インターフェロン発現プラスミド
pＢoＩＦＮ−α１trp５５の作成を示す略図である。出
発材料はtrp発現ベクターpdeltaＲＩsrcおよびプラスミ
ドサブクローンp８３ＢamＨＩ１．９kbからのＢamＨＩ
断片である。

【図１１】 ＥcoＲＩ,ＨindＩＩＩ,ＢamＨＩ,ＢglＩＩ
およびＰvuＩＩのいずれかで消化された牛ＤＮＡと、Ｂ
oＩＦＮ−α１またはＢoＩＦＮ−α４遺伝子断片から調
製された放射能活性プローブとのサウザンハイブリダイ
ゼーションを示している。各ＩＦＮ遺伝子は、ＢoＩＦ
Ｎ−α遺伝子の異なるサブフアミリ(Ｓubfamily)と優先
的にハイブリダイズする。

【図１２】 ヒト繊維芽細胞ヒトインターフェロン遺伝
子プローブをハイブリダイズする３種のフアージ組換体
からのゲノム牛ＤＮＡ挿入物の制限地図を示している。
各ＢoＩＦＮ−βの位置および配向は黒四角形によって
示されている。星印により示された制限部位は、部分制
限地図化情報を示している。

【図１３】 図１２に示した３種の遺伝子に対する一層
詳細な分解制限地図を示している。ハッチングはシグナ
ル配列を示し、成熟配列を陰影化している。

【図１４】 ＢｏＩＦＮ−β１,２および３遺伝子に対
するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示して
いる。

【図１５】 ＢoＩＦＮ−β１,２および３遺伝子に対す
るヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示してい
る。

【図１６】 ＢoＩＦＮ−β１,２および３遺伝子に対す
るヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示してい
る。

【図１７】 ３種のＢoＩＦＮ−βに対するアミノ酸配
列とＨuＩＦＮ−βとの比較を示している。

【図１８】 ヒトゲノムＤＮＡとＨuＩＦＮ−β遺伝子
(９)とを用いて同様な実験を行なった際、単一のハイブ
リダイズ断片のみが一般に明らかとなるような条件下で
ＢoＩＦＮ−β１遺伝子プローブで再ハイブリダイズさ
せた図１１のサウザンブロットである。

【図１９】 イー・コリのtrpオペロンの制御下で３種
の全てのＢoＩＦＮ−βを発現するため使用した方法の
略図である。

【図２０】 ＢoＩＦＮ−γ,ＨuＩＦＮ−γおよびねず
みＩＦＮ−γの推定アミノ酸配列の比較を示している。

【手続補正書】

【提出日】平成６年６月１３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】 ＥcoＲＩにより消化しかつ種々異なるホルム
アミド濃度にてヒト白血球インターフェロンＡ／Ｄハイ
ブリッドの暗号化領域を含む³²Ｐ−標識５７０塩基対Ｅ
coＲＩ断片でハイブリダイズされた(a)ヒト、(b)牛およ
び(c)豚のゲノムＤＮＡのサウザンハイブリダイゼーシ
ョンの電気泳動を示す図面に代わる写真である。２０％
ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーションは、マル
チジエン牛および豚白血球インターフェロン遺伝子類の
最も明瞭なパターンを示している。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】 ＥcoＲＩ,ＢamＨＩまたはＨindＩＩＩにより
消化されかつ³²Ｐ−標識したヒト白血球遺伝子プローブ
でハイブリダイズさせた４種の異なる牛ゲノムＤＮＡフ
アージ組換体のサウザンハイブリダイゼーションの電気
泳動を示す図面に代わる写真である。クローン８３は、
各制限酵素により２種のハイブリダイズ断片を与える。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１１】 ＥcoＲＩ,ＨindＩＩＩ,ＢamＨＩ,ＢglＩＩ
およびＰvuＩＩのいずれかで消化された牛ＤＮＡと、Ｂ
oＩＦＮ−α１またはＢoＩＦＮ−α４遺伝子断片から調
製された放射能活性プローブとのサウザンハイブリダイ
ゼーションの電気泳動を示す図面に代わる写真である。
各ＩＦＮ遺伝子は、ＢoＩＦＮ−α遺伝子の異なるサブ
フアミリ(Ｓubfamily)と優先的にハイブリダイズする。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１８】 ヒトゲノムＤＮＡとＨuＩＦＮ−β遺伝子
(９)とを用いて同様な実験を行なった際、単一のハイブ
リダイズ断片のみが一般に明らかとなるような条件下で
ＢoＩＦＮ−β１遺伝子プローブで再ハイブリダイズさ
せた図１１のサウザンブロットの電気泳動を示す図面に
代わる写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図３に示される２−１６６アミノ酸、 図４に示される２−１６６アミノ酸、 図５に示される２−１６６アミノ酸、 図６に示される２−１７２アミノ酸、 図１４に示される２−１６５アミノ酸、 図１５に示される２−１６５アミノ酸、 図１６に示される２−１６５アミノ酸、及び図２０に示
   されるboＩＦＮ−γ配列の２−１４６アミノ酸のいずれ
   かのアミノ酸配列、又はこれらの配列の天然のアレル変
   異体を含有するヒト以外の動物インターフェロンをコー
   ドしている単離されたＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 図３に示される２−１６５アミノ酸、 図４に示される２−１６６アミノ酸、 図５に示される２−１６６アミノ酸、 図６に示される２−１７２アミノ酸のいずれかのアミノ
   酸配列、又はこれらの配列の天然のアレル変異体を含有
   するウシ白血球インターフェロンをコードしている請求
   項１に記載のＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 図１４に示される２−１６５アミノ酸、 図１５に示される２−１６５アミノ酸、 図１６に示される２−１６５アミノ酸のいずれかのアミ
   ノ酸配列、又はこれらの配列の天然のアレル変異体を含
   有するウシ線維芽細胞インターフェロンをコードしてい
   る請求項１に記載のＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 図２０に示されるboＩＦＮ−γ配列の２
   −１４６アミノ酸のアミノ酸配列、又はその天然のアレ
   ル変異体を含有するウシ免疫インターフェロンをコード
   している請求項１に記載のＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 請求項１−請求項４のいずれかに記載の
   ＤＮＡ配列を適当な形質転換宿主細胞にて発現すること
   のできる複製可能な発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現ベクターによって
   形質転換されている組換え宿主細胞。
7. 【請求項７】 大腸菌細胞である請求項６に記載の宿主
   細胞。