JPS5967297A - 新規ベクタ− - Google Patents
新規ベクタ−Info
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- JPS5967297A JPS5967297A JP57177192A JP17719282A JPS5967297A JP S5967297 A JPS5967297 A JP S5967297A JP 57177192 A JP57177192 A JP 57177192A JP 17719282 A JP17719282 A JP 17719282A JP S5967297 A JPS5967297 A JP S5967297A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- translation initiation
- expression vector
- initiation signal
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規プラスミド発現ベクター、その製法およ
び利用に関する。
び利用に関する。
更に詳細には、本発明は転写開始及び翻訳開始に必要な
遺伝−情報と翻訳開始信号（ＡＴＧまたはＧＴＧ ）を
含むベクターであって、かつポリペプチドを７−ドす、
ＬＤＮＡ断片慰ス≦ηトＪ△ 率よく発現させるために好適な発現ベクターおよびその
製法ならびにその利用に関する。
遺伝−情報と翻訳開始信号（ＡＴＧまたはＧＴＧ ）を
含むベクターであって、かつポリペプチドを７−ドす、
ＬＤＮＡ断片慰ス≦ηトＪ△ 率よく発現させるために好適な発現ベクターおよびその
製法ならびにその利用に関する。
近年、遺伝子組換えに関する研究・技術が発達し、その
産業への応用が可能となっており、外来遺伝子をプラス
ミドベクター上にいかにして組込み、どのようにして効
率よく宿主細胞内で外来遺伝子上にコードされたポリペ
プチドを合成させるかは重要な開発牌題である。宿主細
胞、とくに大腸菌において外来遺伝子を効率よく発現さ
せるために、これまで種々の工夫がなされている。
産業への応用が可能となっており、外来遺伝子をプラス
ミドベクター上にいかにして組込み、どのようにして効
率よく宿主細胞内で外来遺伝子上にコードされたポリペ
プチドを合成させるかは重要な開発牌題である。宿主細
胞、とくに大腸菌において外来遺伝子を効率よく発現さ
せるために、これまで種々の工夫がなされている。
まず転写の効率を高めるために、転写開始に必要万遺伝
情報であるプロモーターとしてｊｆａｃ系。
情報であるプロモーターとしてｊｆａｃ系。
ｔｒｐ系などが使用され、また翻訳過程の効率を高める
ために、リポソーム結合部位と翻訳開始信号（主にＡＴ
Ｇ）との距離を調節した組換え体が造成されている。
ために、リポソーム結合部位と翻訳開始信号（主にＡＴ
Ｇ）との距離を調節した組換え体が造成されている。
後者の例では、外来遺伝子をプロモーターの下流に翻訳
開始の遺伝暗号であるＡＴＧを付与して組込むための中
継ぎ役としての特殊な［合成りＮＡＪの使用、ＤＮＡポ
リメラーゼ１１８１ヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１ヌクレ
アーゼなどのＤＮＡ修飾酵素の使用、あるいけ特定の塩
基配列を持つ「合成りＮＡｊの使用などにより、リポソ
ーム結合部位と翻訳開始信号との間の距（５） 離を調節する必要があり不便である。
開始の遺伝暗号であるＡＴＧを付与して組込むための中
継ぎ役としての特殊な［合成りＮＡＪの使用、ＤＮＡポ
リメラーゼ１１８１ヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１ヌクレ
アーゼなどのＤＮＡ修飾酵素の使用、あるいけ特定の塩
基配列を持つ「合成りＮＡｊの使用などにより、リポソ
ーム結合部位と翻訳開始信号との間の距（５） 離を調節する必要があり不便である。
本発明者らは既知のグラスミドベクターが持つかかる難
点を改善するため、プロモーターＳＤの下流（適当な部
位）にＡＴＧを有し、かつ該人ＴＧを残す形で切断可能
なプラスミドベクターを開発し本発明を完成するに至っ
た。
点を改善するため、プロモーターＳＤの下流（適当な部
位）にＡＴＧを有し、かつ該人ＴＧを残す形で切断可能
なプラスミドベクターを開発し本発明を完成するに至っ
た。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明の発現ベクターは転写開始に必要な遺伝情報であ
るプロモーター、翻訳開始に必要な遺伝情報であるリポ
ソーム結合部位−閣園■■シャイン・ダルガーノ配列と
もよばれる、以下ＳＤ配列と略記する）の下流、適切な
距離に位置する翻訳開始信号（ＡＴＧまたはＧＴＧ）を
含み、さらにこの翻訳開始信号に続いて３′−突出末端
（３’−ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ ｅｎｄ）を切断形とし
て残す制限酵素（ＳｐｈＩ＋ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＪ＊
５ａｃ）など）の認識配列が存在する発現ベクターであ
る。
るプロモーター、翻訳開始に必要な遺伝情報であるリポ
ソーム結合部位−閣園■■シャイン・ダルガーノ配列と
もよばれる、以下ＳＤ配列と略記する）の下流、適切な
距離に位置する翻訳開始信号（ＡＴＧまたはＧＴＧ）を
含み、さらにこの翻訳開始信号に続いて３′−突出末端
（３’−ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ ｅｎｄ）を切断形とし
て残す制限酵素（ＳｐｈＩ＋ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＪ＊
５ａｃ）など）の認識配列が存在する発現ベクターであ
る。
本発明発現ベクターのプロモーターとしては（６）
プロモーター活性を有するものであればいずれも用いる
ことができるが、好適にはたとえばラクトースオペロン
のプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモータ
ー、アルカリフォスファターゼオペロンのプロモーター
などが利用できる。翻訳開始信号表してはＡＴＧまたは
ＧＴＧがあげられる。ＳＤ配列と翻訳開始信号の間の距
離が２〜２０塩基（ｂｐ）のときに翻訳が可能である。
ことができるが、好適にはたとえばラクトースオペロン
のプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモータ
ー、アルカリフォスファターゼオペロンのプロモーター
などが利用できる。翻訳開始信号表してはＡＴＧまたは
ＧＴＧがあげられる。ＳＤ配列と翻訳開始信号の間の距
離が２〜２０塩基（ｂｐ）のときに翻訳が可能である。
翻訳開始信号に続いて３１−突出末端を切断形として残
す制限酵素の認識配列とは、たとえば、翻訳開始信号Ａ
ＴＧとｓｐｈ Ｉの認識配列が重複したＡＴＧＣＡＴＧ
Ｃ，ＡＴＧとＥｃｏＲＶの認識配列が重複したＡＴＧＡ
ＴＡＴＣ，ＡＴＧとＫｐｎ Ｉの認識配列が重複したＡ
ＴＧＧＴＡＣＣ，ＡＴＧと３ａｃ Ｉの認識配列が重複
したＡＴＧＡＧＣＴＣなどがあげられる。
す制限酵素の認識配列とは、たとえば、翻訳開始信号Ａ
ＴＧとｓｐｈ Ｉの認識配列が重複したＡＴＧＣＡＴＧ
Ｃ，ＡＴＧとＥｃｏＲＶの認識配列が重複したＡＴＧＡ
ＴＡＴＣ，ＡＴＧとＫｐｎ Ｉの認識配列が重複したＡ
ＴＧＧＴＡＣＣ，ＡＴＧと３ａｃ Ｉの認識配列が重複
したＡＴＧＡＧＣＴＣなどがあげられる。
上述の構造をもつベクターの一例として、翻訳開始信号
ＡＴＧと５ｐｈＩ切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が重複した
ものについて、プロモーターおよびＳＤ配列周辺の構造
を模式化したものを第１図に示し、さらに制限酵素の認
識部位が翻訳開始信号ＡＴＧと重複させることが可能々
上記の制限酵素の切断形をＭｇ図に示す。
ＡＴＧと５ｐｈＩ切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が重複した
ものについて、プロモーターおよびＳＤ配列周辺の構造
を模式化したものを第１図に示し、さらに制限酵素の認
識部位が翻訳開始信号ＡＴＧと重複させることが可能々
上記の制限酵素の切断形をＭｇ図に示す。
以下本発明に述べたようなプラスミドベクターが造成で
きることを、大ｙ１ｋｍのトリプトファン・プロモータ
ーの場合を例にとって詳しく説明する。
きることを、大ｙ１ｋｍのトリプトファン・プロモータ
ーの場合を例にとって詳しく説明する。
本発明に関わる転写開始および翻訳開始に必要な遺伝情
報は原核細胞由来のものに限定されるものでなく、酵母
や高等動物などの真核細胞由来のものにも適用できるも
のであるが、以下の記述はわかりやすくするため、原核
細胞生物のうち転写・翻訳の機構が詳細に解明されてい
る生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｊａ ｃｏｌ
υの場合を中心に述べる。
報は原核細胞由来のものに限定されるものでなく、酵母
や高等動物などの真核細胞由来のものにも適用できるも
のであるが、以下の記述はわかりやすくするため、原核
細胞生物のうち転写・翻訳の機構が詳細に解明されてい
る生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｊａ ｃｏｌ
υの場合を中心に述べる。
ｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡの供給源として、ｔｒ
ｐポータプル・プロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹｐ
１０ （特願昭５６−２１３１９３）から誘導される
ｐＫＹｐ １００を用いる（ＴＩＫＹＰＩＯおよびｐＫ
ＹＰｌｏｏの製造法は参考例１および２を参照）。ｐＫ
ＹＰｌｏｏ ８ （第６図中の番号を示す、以下同じ）
をｔｒｐＬ遺伝子のＳＤ配列のすぐ下流に存在するＣ１
ｍ １部位で切断し、〔第６図参照〕次にｐＫＹＰ １
００ 所）ラサイクリン耐性遺伝子内に存在するｓｐｈ
Ｉ部位で切断した後、大きいプラスミドＤＮＡ断片隻
をアガロース・ゲル電気泳動法によって精製する。一方
、このＤＮＡ断片との連結が容易な構造を有し、しかも
ＳＤ配列の下流、適切な距離を置いて翻訳開始信号（Ａ
ｍまたはＧＴＧ）が存在し、さらにこの翻訳開始信号に
続いて、３′−突出末端を切断形として残す制限酵素の
認識配列が存在するような２種のオリゴヌクレオチド（
両者は互いに再結合しうるよう外相補的な塩基配列を有
する）■を合成し、上で精製したプラスミドＤＮＡ断片
と連結させ、目的の発現ベクター、リーを得る。
ｐポータプル・プロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹｐ
１０ （特願昭５６−２１３１９３）から誘導される
ｐＫＹｐ １００を用いる（ＴＩＫＹＰＩＯおよびｐＫ
ＹＰｌｏｏの製造法は参考例１および２を参照）。ｐＫ
ＹＰｌｏｏ ８ （第６図中の番号を示す、以下同じ）
をｔｒｐＬ遺伝子のＳＤ配列のすぐ下流に存在するＣ１
ｍ １部位で切断し、〔第６図参照〕次にｐＫＹＰ １
００ 所）ラサイクリン耐性遺伝子内に存在するｓｐｈ
Ｉ部位で切断した後、大きいプラスミドＤＮＡ断片隻
をアガロース・ゲル電気泳動法によって精製する。一方
、このＤＮＡ断片との連結が容易な構造を有し、しかも
ＳＤ配列の下流、適切な距離を置いて翻訳開始信号（Ａ
ｍまたはＧＴＧ）が存在し、さらにこの翻訳開始信号に
続いて、３′−突出末端を切断形として残す制限酵素の
認識配列が存在するような２種のオリゴヌクレオチド（
両者は互いに再結合しうるよう外相補的な塩基配列を有
する）■を合成し、上で精製したプラスミドＤＮＡ断片
と連結させ、目的の発現ベクター、リーを得る。
上記組換えプラスミド作成に必要な反応の条件は次のと
おりである。
おりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化は通常０．１〜１００Ｅダ
（９） のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好まし
くはｐＨ７，０〜８．０）、１〜１５０ミリモルのＮａ
Ｃ１，２〜２０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル
）のＭｇＣ１ｚ中で制限酵素ｏ、 ｉ〜３００単位（好
ましくは１μＶのＤＮＡに対し１〜３単位の酵素）を用
い、１８〜４２℃（好ましくは３２〜３８℃）において
、１５分〜２４時間消化反応を行う。反応の停止は通常
５５〜７５℃（好ましくは６３〜７０℃）で５〜３０分
間加熱することによるが、フェノールやジエチルピロカ
ーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法
も用いることができる。合成オリゴヌクレオチドはリン
酸ジエチル法［、）ｔＧ。
（９） のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好まし
くはｐＨ７，０〜８．０）、１〜１５０ミリモルのＮａ
Ｃ１，２〜２０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル
）のＭｇＣ１ｚ中で制限酵素ｏ、 ｉ〜３００単位（好
ましくは１μＶのＤＮＡに対し１〜３単位の酵素）を用
い、１８〜４２℃（好ましくは３２〜３８℃）において
、１５分〜２４時間消化反応を行う。反応の停止は通常
５５〜７５℃（好ましくは６３〜７０℃）で５〜３０分
間加熱することによるが、フェノールやジエチルピロカ
ーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法
も用いることができる。合成オリゴヌクレオチドはリン
酸ジエチル法［、）ｔＧ。
Ｋｈｏｒａｎａ ｅｔ ａ／。： ＪＭｏｌ、ＢｉｏＡ
！、、 ７２巻、２０９頁（１９７２年）〕、リン酸ト
リエステル法［：Ｒ，Ｃｒｅａ ｅｔ ａＡ’、 ：
Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、 Ｕ、Ｓ、入７
５巻、５７６５頁（１９７８年）〕、あるいはホスファ
イト法［［Ｄ、 Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａ４ ：
Ｊ、 Ａｍ。
！、、 ７２巻、２０９頁（１９７２年）〕、リン酸ト
リエステル法［：Ｒ，Ｃｒｅａ ｅｔ ａＡ’、 ：
Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、 Ｕ、Ｓ、入７
５巻、５７６５頁（１９７８年）〕、あるいはホスファ
イト法［［Ｄ、 Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａ４ ：
Ｊ、 Ａｍ。
Ｃｈｅｍ、 ’Ｓｏｃ、１０３巻、３１８５頁（１９８
１年）〕などに（１０） よって合成することができる。
１年）〕などに（１０） よって合成することができる。
合成したオリゴヌクレオチドをリン酸化するには、２〜
２００ミリモル（好ましくは１０〜７０ミリモル）のト
リス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好ましくはｐＨ７，０
〜８．Ｏ）、３〜２０ミリモル（好ましくは４〜１０ミ
リモル）のＭｇＣ１ｘ、１〜１０ミリモルのジチオスレ
イトール中でＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ０．１〜
１００単位を用い、２０〜４０℃（好ましくは３５〜３
８℃）で、５分間から２時間の反応を行う。ＤＮＡ断片
を結合させる場合は２〜２００ ミＩＪモル（好ましく
は１０〜７０ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ６，０〜９
．５、ｐＨ７，０〜８０）、２〜２０ミリモル（好まし
くは５〜１０ミリモル）の’ＭｇＣ１ｔ、０．１〜１０
ミリモル（好ましくは０．５〜２ミリモル）のＡＴＰ、
１〜５０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル）のク
チオスｌ／イトール中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．１〜１
０単位を用いて１〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で
１５分〜７２時間（好ましくけ２〜２０時間）結合反応
を行う。
２００ミリモル（好ましくは１０〜７０ミリモル）のト
リス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好ましくはｐＨ７，０
〜８．Ｏ）、３〜２０ミリモル（好ましくは４〜１０ミ
リモル）のＭｇＣ１ｘ、１〜１０ミリモルのジチオスレ
イトール中でＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ０．１〜
１００単位を用い、２０〜４０℃（好ましくは３５〜３
８℃）で、５分間から２時間の反応を行う。ＤＮＡ断片
を結合させる場合は２〜２００ ミＩＪモル（好ましく
は１０〜７０ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ６，０〜９
．５、ｐＨ７，０〜８０）、２〜２０ミリモル（好まし
くは５〜１０ミリモル）の’ＭｇＣ１ｔ、０．１〜１０
ミリモル（好ましくは０．５〜２ミリモル）のＡＴＰ、
１〜５０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル）のク
チオスｌ／イトール中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．１〜１
０単位を用いて１〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で
１５分〜７２時間（好ましくけ２〜２０時間）結合反応
を行う。
以上のような方法で本発明に述べたようなプラスミド発
現ベクターを製造することができる。
現ベクターを製造することができる。
また、上述の製造法でｐＫＹＰｌｏｏをＣ１ａＩテ切断
する代わりに、Ｃｌａｉ部位のすぐ下流に存在するＨｉ
ｎｄ１部位で切断し、次にｓｐｈ ｌで切断した後、合
成ヌクレオチドを挿入することも可能である。 また、
翻訳開始信号と重複して存在す↓ ５ａｃｌ ： ＧＡＧＣＴＣ）などを用いる場合には、
この認識配列を完全に含むような塩基配列を持つ２種の
オリゴヌクレオチドを合成し、ｐＫＹＰ １００のＣｌ
ａｌ部位あるいはＨｉｎｄ１部位とＢａｍＨＩ部位ある
いはＳｉ２０位の間に挿入すればよい。
する代わりに、Ｃｌａｉ部位のすぐ下流に存在するＨｉ
ｎｄ１部位で切断し、次にｓｐｈ ｌで切断した後、合
成ヌクレオチドを挿入することも可能である。 また、
翻訳開始信号と重複して存在す↓ ５ａｃｌ ： ＧＡＧＣＴＣ）などを用いる場合には、
この認識配列を完全に含むような塩基配列を持つ２種の
オリゴヌクレオチドを合成し、ｐＫＹＰ １００のＣｌ
ａｌ部位あるいはＨｉｎｄ１部位とＢａｍＨＩ部位ある
いはＳｉ２０位の間に挿入すればよい。
ｐＫＹＰ １００はｐＫＹＰ１ｏノ誘導体である。Ｉ）
ＫＹＰＩＯは特願昭５６−２１３１９３に開示されたｔ
ｒｐプロモーター含有プラスミドである。ｐＫＹＰ １
０からｐＫＹＰ １００の造成方法は次のとおり行なう
。
ＫＹＰＩＯは特願昭５６−２１３１９３に開示されたｔ
ｒｐプロモーター含有プラスミドである。ｐＫＹＰ １
０からｐＫＹＰ １００の造成方法は次のとおり行なう
。
第５図に示すようにまず、プラスミドｐｌ（ＹＰＩＯＩ
をＨｈａＩで消化した後、ｔｒｐプロモーターを含むゲ
ル電気泳動法によりｆｌｌ製する。このＤＮＡ断片ヱに
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌ’Ｋｌｅｎｏｗ断片を作用
させて、Ｈｈａｉ消化によって生じだ３−突出末端を削
り、平坦末端に変えた後、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、ｔ
ｒｐプロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片且を
ポリアクリルアミド電気泳動法により精製する。一方、
プラスミドｐＢＲ３２２旦をＥｃ ｏＲＩで消化した後
、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の修復合成反応を利用し
て、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた粘着末端（Ｓｔｉｃ
ｋｙ ｅｎｄ）を平坦末端にする。次にＨ４ｎｄｌで消
化後、大きいプラスミドＤＮＡ断片旦を低融点アガロー
スゲル電気泳動法により精製する。次に、精製したＤＮ
Ａ断片１および互と５′−リン酸化されたＸｈｏ）ＩＪ
ンカー（ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ）土をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結し、プラスミドｐＫＹＰ １００７を得る
。
をＨｈａＩで消化した後、ｔｒｐプロモーターを含むゲ
ル電気泳動法によりｆｌｌ製する。このＤＮＡ断片ヱに
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌ’Ｋｌｅｎｏｗ断片を作用
させて、Ｈｈａｉ消化によって生じだ３−突出末端を削
り、平坦末端に変えた後、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、ｔ
ｒｐプロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片且を
ポリアクリルアミド電気泳動法により精製する。一方、
プラスミドｐＢＲ３２２旦をＥｃ ｏＲＩで消化した後
、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の修復合成反応を利用し
て、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた粘着末端（Ｓｔｉｃ
ｋｙ ｅｎｄ）を平坦末端にする。次にＨ４ｎｄｌで消
化後、大きいプラスミドＤＮＡ断片旦を低融点アガロー
スゲル電気泳動法により精製する。次に、精製したＤＮ
Ａ断片１および互と５′−リン酸化されたＸｈｏ）ＩＪ
ンカー（ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ）土をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結し、プラスミドｐＫＹＰ １００７を得る
。
前記した本発明ベクターの製造法においては、ＳＤ配列
のすぐ下流に存在する制限酵素の切断（１３） 部位を利用したプラスミド発現ベクターの製造法につい
て述べたが、このような切断部位が存在しない場合でも
目的の発現ベクターは製造できる。例えば、プロモータ
ーの上流に存在する制限酵素の切断部位を利用する場合
にはプロモーター、リポソーム結合部位、翻訳開始信号
（ＡＴＧあるいはＧＴＧ）の３者すべての塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドを合成し、ｐＢＲ３２２などのプ
ラスミドベクターにクローン化すればよい。また、転写
開始に必要な要素であるプロモーターとして、大腸菌の
トリプトファン・プロモーターを用いだが、大腸菌のト
リプトファン・プロモーター以外の大腸菌のプロモータ
ーを用いることができる。さらに外来遺伝子を発現させ
るべき細胞が大腸菌以外の生物の細胞の場合は、その細
胞個有のプロモーターを用いることができる。大腸菌以
外の生物のプロモーターを用いる場合、翻訳開始に必要
な情報を含む塩基配列を大腸菌のリポソーム結合部位に
相当する塩基配列と置きかえる必要がある。
のすぐ下流に存在する制限酵素の切断（１３） 部位を利用したプラスミド発現ベクターの製造法につい
て述べたが、このような切断部位が存在しない場合でも
目的の発現ベクターは製造できる。例えば、プロモータ
ーの上流に存在する制限酵素の切断部位を利用する場合
にはプロモーター、リポソーム結合部位、翻訳開始信号
（ＡＴＧあるいはＧＴＧ）の３者すべての塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドを合成し、ｐＢＲ３２２などのプ
ラスミドベクターにクローン化すればよい。また、転写
開始に必要な要素であるプロモーターとして、大腸菌の
トリプトファン・プロモーターを用いだが、大腸菌のト
リプトファン・プロモーター以外の大腸菌のプロモータ
ーを用いることができる。さらに外来遺伝子を発現させ
るべき細胞が大腸菌以外の生物の細胞の場合は、その細
胞個有のプロモーターを用いることができる。大腸菌以
外の生物のプロモーターを用いる場合、翻訳開始に必要
な情報を含む塩基配列を大腸菌のリポソーム結合部位に
相当する塩基配列と置きかえる必要がある。
（１４）
上記のごとくして得られる発現ベクターは制限酵素（ｓ
ｐｈ（、ＥｃｏＲＶ、 Ｋｐｎｌ、 ５ａｃＩ ’＆ど
）で切断後、（１）生じた３′＝突出末端をＤＮＡポリ
メラーゼ）ｌＱｅｎｏｗ断片のもつ３１→５′エキンヌ
クレアーゼ活性を利用して削り、平坦末端にして、これ
に外来遺伝子を組込むか（第３図参照）、（２）生じた
３１−突出末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル
・トランスフェラーゼを用いてホモ・ポリマーグロック
（ポリｄ Ａ ＋ ポリｄＴ。
ｐｈ（、ＥｃｏＲＶ、 Ｋｐｎｌ、 ５ａｃＩ ’＆ど
）で切断後、（１）生じた３′＝突出末端をＤＮＡポリ
メラーゼ）ｌＱｅｎｏｗ断片のもつ３１→５′エキンヌ
クレアーゼ活性を利用して削り、平坦末端にして、これ
に外来遺伝子を組込むか（第３図参照）、（２）生じた
３１−突出末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル
・トランスフェラーゼを用いてホモ・ポリマーグロック
（ポリｄ Ａ ＋ ポリｄＴ。
ポリｄＧ、ボＩＪ ｄ Ｃ）を付加し、これと相補的ガ
ホモ・ポリマー・ブロックを付加した外来遺伝子を組込
む（第４図参照）ことにより翻訳開始信号の直後に外来
遺伝子を連結できる。得られた組換え体を用いて宿主微
生物を培養することにより外来遺伝子を極めて効率よく
発現させるととができる。
ホモ・ポリマー・ブロックを付加した外来遺伝子を組込
む（第４図参照）ことにより翻訳開始信号の直後に外来
遺伝子を連結できる。得られた組換え体を用いて宿主微
生物を培養することにより外来遺伝子を極めて効率よく
発現させるととができる。
前述の説明は分子レベルで最も解明の進んでいる大腸菌
について記述したものであるが本発明は大腸菌に限定さ
れるものでなく、大腸菌以外の他の原核細胞あるいは酵
母や高等動物などの真核細胞などにも適用できるもので
ある。すなわち、翻訳開始信号の下流の構造はそのまま
にし、前述の大腸ｂ１のプロモーターおよび大腸菌のリ
ポソーム結合部位の代わりに、枯草菌がどの他の原核細
胞のものと置き換え、さらにその原核細胞内でプラスミ
ドベクターが複製係持されるのに必要な遺伝情報を付与
すれば他の原核細胞に有効なプラスミド発現ベクターを
構築することが可能である。また、真核細胞の場合、そ
の転写・翻訳の機構は詳細には解明されていないが、犬
腸掘のプロモーターの代わりに転写開始に必要な遺伝情
報と大腸菌のリポソーム結合部位の代わりに、翻訳開始
に必要な遺伝情報と置き換え、さらにその真核細胞内で
プラスミドベクターが保持・複製されるのに必要な遺伝
情報を付与すれは真核細胞に有効なプラスミド発現ベク
ターを構築することが可能である。
について記述したものであるが本発明は大腸菌に限定さ
れるものでなく、大腸菌以外の他の原核細胞あるいは酵
母や高等動物などの真核細胞などにも適用できるもので
ある。すなわち、翻訳開始信号の下流の構造はそのまま
にし、前述の大腸ｂ１のプロモーターおよび大腸菌のリ
ポソーム結合部位の代わりに、枯草菌がどの他の原核細
胞のものと置き換え、さらにその原核細胞内でプラスミ
ドベクターが複製係持されるのに必要な遺伝情報を付与
すれば他の原核細胞に有効なプラスミド発現ベクターを
構築することが可能である。また、真核細胞の場合、そ
の転写・翻訳の機構は詳細には解明されていないが、犬
腸掘のプロモーターの代わりに転写開始に必要な遺伝情
報と大腸菌のリポソーム結合部位の代わりに、翻訳開始
に必要な遺伝情報と置き換え、さらにその真核細胞内で
プラスミドベクターが保持・複製されるのに必要な遺伝
情報を付与すれは真核細胞に有効なプラスミド発現ベク
ターを構築することが可能である。
本発明のベクターの造成法およびその利用法について実
施例をあげて詳細に説明する。
施例をあげて詳細に説明する。
夾友市例 １゜
ｔｒｐプロモーターおよびリポソーム結合部位の下流に
翻訳開始信号ＡＴＧおよびＳｐｈ Ｉ切断部位を有する
プラスミドベクターｐＴｒｓ３の造成：参考例２で造成
されたｐＫＹＰ １００から次のようにしてｐＴｒＳ３
を得る。５μＶのｐＩＱ’Ｐ ］ ００８を１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ／ （ｐＨ７，５）、 ７ｍＭ Ｍｇｃ
ｌｘ 、 ６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む全量
２０μｌの反応液中で、５単位のＣ１ａｎ（ベーリンガ
ー・マンハイム社ｊＲ）を加え、３７℃、２時間反応さ
せた。次いで、６５℃、５分間の熱処理によって反応を
停止させた後、２μｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７，５）、７０ ｍＭ ＭｇＣ１２，１，０Ｍ Ｎ
ａＣ１，６０ｍＭ ２−メルカプトエタノールと１６μ
ｌの蒸留水と７単位の５ｐｈｌ （ベーリンガー・マ
ンノ・イム社製）を加え、３７℃、２時間反応させた。
翻訳開始信号ＡＴＧおよびＳｐｈ Ｉ切断部位を有する
プラスミドベクターｐＴｒｓ３の造成：参考例２で造成
されたｐＫＹＰ １００から次のようにしてｐＴｒＳ３
を得る。５μＶのｐＩＱ’Ｐ ］ ００８を１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ／ （ｐＨ７，５）、 ７ｍＭ Ｍｇｃ
ｌｘ 、 ６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む全量
２０μｌの反応液中で、５単位のＣ１ａｎ（ベーリンガ
ー・マンハイム社ｊＲ）を加え、３７℃、２時間反応さ
せた。次いで、６５℃、５分間の熱処理によって反応を
停止させた後、２μｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７，５）、７０ ｍＭ ＭｇＣ１２，１，０Ｍ Ｎ
ａＣ１，６０ｍＭ ２−メルカプトエタノールと１６μ
ｌの蒸留水と７単位の５ｐｈｌ （ベーリンガー・マ
ンノ・イム社製）を加え、３７℃、２時間反応させた。
６５℃、５分間の熱処理によって反応を停止さメトリー
９８巻３０５頁（１９７９）］により、（１７） 大きいプラスミドＤＮＡ断片１（約３．８２Ｋｂ）を精
製した。次にまず２種Ｉ■■オリゴヌクレオチド５’−
ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧ−３’および５’Ｃ
ＡＴＡＧＣＴＴＡＴ−３’をリン酸トリエステル法によ
って合成した。これら２種の合成オリゴヌクレオチドを
５“−リン酸化した後に、それぞれの濃度が２０μＭと
なるように、ＩＯｍＭＴｒ ｉ ｓ −Ｉ（ｃｌ （ｐ
Ｈ７，５）、１００ｍＭ ＮａＣ／ 、 ｌ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ中で混合し、６５℃に１０分間、３７℃に１２０
分間、ついで室温に１２０分間放置し、両者を対合させ
た。両者を対合させると下図に示すように対合によって
できた２本鎖ＤＮＡのそれぞれの端が Ｃ１ａＩ消化あるいはｓｐｈ ｌ消化によって生じる粘
着末端と連結でき、しかも連結後、Ｃ１ａｌ切断部位あ
るいはＳｐｈ ｒ切断部位が再形成される構造を持つ。
９８巻３０５頁（１９７９）］により、（１７） 大きいプラスミドＤＮＡ断片１（約３．８２Ｋｂ）を精
製した。次にまず２種Ｉ■■オリゴヌクレオチド５’−
ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧ−３’および５’Ｃ
ＡＴＡＧＣＴＴＡＴ−３’をリン酸トリエステル法によ
って合成した。これら２種の合成オリゴヌクレオチドを
５“−リン酸化した後に、それぞれの濃度が２０μＭと
なるように、ＩＯｍＭＴｒ ｉ ｓ −Ｉ（ｃｌ （ｐ
Ｈ７，５）、１００ｍＭ ＮａＣ／ 、 ｌ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ中で混合し、６５℃に１０分間、３７℃に１２０
分間、ついで室温に１２０分間放置し、両者を対合させ
た。両者を対合させると下図に示すように対合によって
できた２本鎖ＤＮＡのそれぞれの端が Ｃ１ａＩ消化あるいはｓｐｈ ｌ消化によって生じる粘
着末端と連結でき、しかも連結後、Ｃ１ａｌ切断部位あ
るいはＳｐｈ ｒ切断部位が再形成される構造を持つ。
この２種の合成オリゴヌクレオチドを対合させたもの塵
に上記の精製したプラスミドＤＮＡ断片９を加え、両者
をＴ ４ ＤＮＡリガー（１８） ゼを用い連結させた。すなわち、２種の合成オリゴヌク
レオチド１．ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧおよび
ｐＣＡＴＡＧＣＴＴＡＴをそれぞれ１ピコモルずつ対合
させ、さらに約０．１５μ７の精製したプラスミドＤＮ
Ａ断片且を加え、２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ（
ｐＨ７，６）、１０ｒｎＭＭｇＣ１＊ ＋ １０ｍＭジ
チオスレイトール、０．５ ｍＭ Ａ Ｔ Ｐを含む全
量２０μｌの反応液中で、０．５単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（全酒造社製）を加え、４℃で１６時間結合反応を
行った。
に上記の精製したプラスミドＤＮＡ断片９を加え、両者
をＴ ４ ＤＮＡリガー（１８） ゼを用い連結させた。すなわち、２種の合成オリゴヌク
レオチド１．ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧおよび
ｐＣＡＴＡＧＣＴＴＡＴをそれぞれ１ピコモルずつ対合
させ、さらに約０．１５μ７の精製したプラスミドＤＮ
Ａ断片且を加え、２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ（
ｐＨ７，６）、１０ｒｎＭＭｇＣ１＊ ＋ １０ｍＭジ
チオスレイトール、０．５ ｍＭ Ａ Ｔ Ｐを含む全
量２０μｌの反応液中で、０．５単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（全酒造社製）を加え、４℃で１６時間結合反応を
行った。
このようにして得られた組換えプラスミドを用△
い、大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、得られるアンピ
シリン耐性、テトラサイクリン感受性（ＡｐＲＴｃＳ）
の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精製した。
シリン耐性、テトラサイクリン感受性（ＡｐＲＴｃＳ）
の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精製した。
これらのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲ（、Ｘｈｏｌ＋
Ｐｓｔｌ （以上全酒造社製）、Ｃ１ａ）、Ｓｐｈ■（
以上ベーリンガー・マンハイム社製）などの制限酵素で
消化することにより、目的のプラスミドベクターｐＴｒ
８３１．１が造成されたことを確認した。さらにｐＴｒ
Ｓ３のＣ１ａ １部位からｓｐｈ １部位までのＤＮＡ
の塩基配列が （１０ ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣであることを
マキサム。
Ｐｓｔｌ （以上全酒造社製）、Ｃ１ａ）、Ｓｐｈ■（
以上ベーリンガー・マンハイム社製）などの制限酵素で
消化することにより、目的のプラスミドベクターｐＴｒ
８３１．１が造成されたことを確認した。さらにｐＴｒ
Ｓ３のＣ１ａ １部位からｓｐｈ １部位までのＤＮＡ
の塩基配列が （１０ ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣであることを
マキサム。
ギルバートの方法（Ａ、 Ｍ、 Ｍａｘａｍら： Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｅｔ第７４巻、５６０頁（１９７７年）〕
を用い確認した。ｐＴｒｓ３を含む大腸菌菌株は工業技
術院微生物工業技術研究所にエッシエリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ） ＩＴｒＳ−３ＦＥ
ＲＭＰ −６７３５として寄託されている。
を用い確認した。ｐＴｒｓ３を含む大腸菌菌株は工業技
術院微生物工業技術研究所にエッシエリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ） ＩＴｒＳ−３ＦＥ
ＲＭＰ −６７３５として寄託されている。
参考例１． ｔｒｐプロモーターを有するプラスミド
ベクター、ＫＹＰＩＯの造成： （ａ）トリプトファン形質導入ファージＩ） Ｎ Ａの
精製 λｐｔｒｐファージであるλ＋４８５７ｔｒｐＥＤ １
０〔以下、λｔｒｐ ＥＤと略すＧ、 Ｆ： Ｍｉａｚ
ｚａｒｉら：Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３３巻、
１４５７頁（＋９７８））を大腸１ｆｉＪＡ１９４株〔
Ｆ−２λ−Ｉ Ａ ｌ ｍ ”’１ ＋△ｔｒｐＥｓ＋
１６ｕ６＋ Ｊ ＣａｒｂｏｎらＲｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓｐ、 ３５５（１９７７）Ｒａ
ｖｅｎＰｒｅｓｓ）に溶原化させることによって得られ
る菌株、ＪＡ１９４（λｔｒｐＥＤ）を４２℃で３０分
培養することによってλｔｒｐＥＤファージを誘発し、
ファージ溶菌液を調製した。
ベクター、ＫＹＰＩＯの造成： （ａ）トリプトファン形質導入ファージＩ） Ｎ Ａの
精製 λｐｔｒｐファージであるλ＋４８５７ｔｒｐＥＤ １
０〔以下、λｔｒｐ ＥＤと略すＧ、 Ｆ： Ｍｉａｚ
ｚａｒｉら：Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３３巻、
１４５７頁（＋９７８））を大腸１ｆｉＪＡ１９４株〔
Ｆ−２λ−Ｉ Ａ ｌ ｍ ”’１ ＋△ｔｒｐＥｓ＋
１６ｕ６＋ Ｊ ＣａｒｂｏｎらＲｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓｐ、 ３５５（１９７７）Ｒａ
ｖｅｎＰｒｅｓｓ）に溶原化させることによって得られ
る菌株、ＪＡ１９４（λｔｒｐＥＤ）を４２℃で３０分
培養することによってλｔｒｐＥＤファージを誘発し、
ファージ溶菌液を調製した。
（２０）
このファージ液より塩化セシウム平衡密度勾配遠心法［
山川ら「核酸の化学Ｉ」東京化学同人社ｐ、５４−６１
．１９７４ ］によってλファージを精製した。
山川ら「核酸の化学Ｉ」東京化学同人社ｐ、５４−６１
．１９７４ ］によってλファージを精製した。
次いでとのλファージより、山川らの方法〔核酸の化学
１１東京化学同人社、１６２−６５．１９７４）に従い
フェノール処理とクロロホルム処理をして精製した。
１１東京化学同人社、１６２−６５．１９７４）に従い
フェノール処理とクロロホルム処理をして精製した。
（ｂ） ｔｒｐプロモーターのプラスミドへのクロー
ニング λｔｒｐＥＤファージＤＮＡからｔｒｐオペロンのクロ
ーン化は以下のごとく行う。す々わち、８μＶのλｔｒ
ｐＥＤＤＮＡを２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）、７５ ｍＭ Ｎａ（Ｊ 、 １０ ｍＭ ＭｇＣｌ
２．５ｍＭジチオスレイトール中で１６単位のＥｃｏＲ
Ｉ（全酒造社製、以下同じ）と１６単位のＨｉｎｄｌ
（全酒造社製、以下同じ）を加えて３７℃、２時間消化
した。一方プラスミドの、ＢＲ３２５ＤＮＡ １μグも
同様に２単位のＥｃ ｏＲ１と２単位のＨｉｎｄｌで消
化した（最終容量３０（２１） Ｓ）。次いで、６５℃、５分間加熱処理して反応を停止
し、それぞれの消化したＤＮＡ溶液１５μｌずつを混合
し、終濃度５００μＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼ５
単位（Ｎ ｅ ｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製→
を加え４℃、１８時間結合反応を行なった。
ニング λｔｒｐＥＤファージＤＮＡからｔｒｐオペロンのクロ
ーン化は以下のごとく行う。す々わち、８μＶのλｔｒ
ｐＥＤＤＮＡを２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）、７５ ｍＭ Ｎａ（Ｊ 、 １０ ｍＭ ＭｇＣｌ
２．５ｍＭジチオスレイトール中で１６単位のＥｃｏＲ
Ｉ（全酒造社製、以下同じ）と１６単位のＨｉｎｄｌ
（全酒造社製、以下同じ）を加えて３７℃、２時間消化
した。一方プラスミドの、ＢＲ３２５ＤＮＡ １μグも
同様に２単位のＥｃ ｏＲ１と２単位のＨｉｎｄｌで消
化した（最終容量３０（２１） Ｓ）。次いで、６５℃、５分間加熱処理して反応を停止
し、それぞれの消化したＤＮＡ溶液１５μｌずつを混合
し、終濃度５００μＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼ５
単位（Ｎ ｅ ｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製→
を加え４℃、１８時間結合反応を行なった。
このようにしてえられるプラスミドの混合物を用い大腸
菌Ｃ６００ＳＦ株〔キヤメロンら：プロシーディングス
・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエン
ス７２巻、３４１６頁（１９７５勺〕を公知の方法［８
，Ｎ。
菌Ｃ６００ＳＦ株〔キヤメロンら：プロシーディングス
・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエン
ス７２巻、３４１６頁（１９７５勺〕を公知の方法［８
，Ｎ。
コーエンラ：プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オプ・サイエンス６９巻、２１１０頁
（１９７２年）〕に従って形質転換し、アンピシリン耐
性（Ａ：）、テトラサイクリン耐性（ＴｃＲ）およびク
ロラムフェニコール感受性（Ｃ□）を有する形質転換株
を得た。このようにして得られる大腸菌の形質転換株よ
りプラスミドＤＮＡを分離し、ｐＫＹＰ−１と命名した
。
ル・アカデミ−・オプ・サイエンス６９巻、２１１０頁
（１９７２年）〕に従って形質転換し、アンピシリン耐
性（Ａ：）、テトラサイクリン耐性（ＴｃＲ）およびク
ロラムフェニコール感受性（Ｃ□）を有する形質転換株
を得た。このようにして得られる大腸菌の形質転換株よ
りプラスミドＤＮＡを分離し、ｐＫＹＰ−１と命名した
。
（２２）
プラスミド、ＫＹＰ−１をＴａｑｉとＥｃｏＲｌで消化
しトリプトファンプロモーターとＳＤ配列を含む２．６
Ｋｂ （キロベース：以下同じ）のＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動法により精製した。この２．６ Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を第７図に示した方法により既知ベク
ターである。ＢＲ３２２にクローン化する。すなわち、
８μ２の、ＢＲ３２２に２単位の’１’ａｑＩ （全酒
造社製→を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐ）
Ｉ ８．４）、６ｍＭＭｇＣ１２，１０１００ｍＭＮａ
Ｃ１１６２−メルカプトエタノールを含む全量１００μ
ｌの反応液中４５℃で６０分、反応させた。Ｔａｑ ｌ
による部分消化後、低融点アガロース・ゲル電気泳動法
〔Ｌウイスランダー（Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ
） ：アナリテイカル・バイオケミストリー ９８巻
３０５頁（１９７９年）〕により４．３６ Ｋ ｂのＤ
ＮＡ断片を精製し、さらにこのＤＮＡ（約１．５ｐ？）
を３単位のＥｃｏＲＩを加えて、３７℃、３時間反応さ
せて完全に消化した後、上と同様に低融点アガロース・
ゲル電気泳動法により、約４．３３Ｋｂ１７）ＤＮＡ断
片（約１０μ２）を得た。
しトリプトファンプロモーターとＳＤ配列を含む２．６
Ｋｂ （キロベース：以下同じ）のＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動法により精製した。この２．６ Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を第７図に示した方法により既知ベク
ターである。ＢＲ３２２にクローン化する。すなわち、
８μ２の、ＢＲ３２２に２単位の’１’ａｑＩ （全酒
造社製→を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐ）
Ｉ ８．４）、６ｍＭＭｇＣ１２，１０１００ｍＭＮａ
Ｃ１１６２−メルカプトエタノールを含む全量１００μ
ｌの反応液中４５℃で６０分、反応させた。Ｔａｑ ｌ
による部分消化後、低融点アガロース・ゲル電気泳動法
〔Ｌウイスランダー（Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ
） ：アナリテイカル・バイオケミストリー ９８巻
３０５頁（１９７９年）〕により４．３６ Ｋ ｂのＤ
ＮＡ断片を精製し、さらにこのＤＮＡ（約１．５ｐ？）
を３単位のＥｃｏＲＩを加えて、３７℃、３時間反応さ
せて完全に消化した後、上と同様に低融点アガロース・
ゲル電気泳動法により、約４．３３Ｋｂ１７）ＤＮＡ断
片（約１０μ２）を得た。
次に１２Ｐ７の、ＫＹＰ−ＩＤＮＡを上と同様に３単位
のＴａｑ ｌを加えて部分消化し、低融点アガロース・
ゲル電気泳動法で８．５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約２μ
Ｌ？）を精製し、さらにこのＤＮＡをＥｃ ｏＲｉで完
全消化することにより、２．６ＫｂのＤＮＡ断片、約０
．５１ｔｆを精製した。
のＴａｑ ｌを加えて部分消化し、低融点アガロース・
ゲル電気泳動法で８．５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約２μ
Ｌ？）を精製し、さらにこのＤＮＡをＥｃ ｏＲｉで完
全消化することにより、２．６ＫｂのＤＮＡ断片、約０
．５１ｔｆを精製した。
このようにして得たｐＢＲ３２２の４．３３ Ｋ ｂＤ
ＮＡ（０，４μＬ？）と、）Ｇ’Ｐ −１の２．６ Ｋ
ｂ ＤＮＡ断片（０，２５μｆりを２０ ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、１０ ｍＭ １１ｇＣ１２
，１０ｍＭジチオスレイトールを含む全量２０μｌの反
応液中で、０．５ ｍＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡＩＪガー
ゼ４単位を加え、４℃で１８時間、結合反応を行なった
。このようにして得られる組みかえプラスミドＤＮＡを
用い、大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、得られる
Ａ♂、Ｔｏ１′の形質転換株がもつプラスミドを分Ｓ精
製した。このプラスミドＤＮＡを６種の制限酵素、Ｅｃ
ｏＲｌ、Ｈｉｎｄｌｌ＋ Ｃ１ａＩ （ベーリンガー・
マンハイム社製）、Ｈｐａｌ（全酒造社製）、Ｈｌｎｅ
ｌ［（全酒造社製）、ＢａｍＨＩ （全酒造社製）によ
って消化して、プラスミドの構造解析を行ない、これを
、ＫＹＰ −５と命名した。
ＮＡ（０，４μＬ？）と、）Ｇ’Ｐ −１の２．６ Ｋ
ｂ ＤＮＡ断片（０，２５μｆりを２０ ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、１０ ｍＭ １１ｇＣ１２
，１０ｍＭジチオスレイトールを含む全量２０μｌの反
応液中で、０．５ ｍＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡＩＪガー
ゼ４単位を加え、４℃で１８時間、結合反応を行なった
。このようにして得られる組みかえプラスミドＤＮＡを
用い、大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、得られる
Ａ♂、Ｔｏ１′の形質転換株がもつプラスミドを分Ｓ精
製した。このプラスミドＤＮＡを６種の制限酵素、Ｅｃ
ｏＲｌ、Ｈｉｎｄｌｌ＋ Ｃ１ａＩ （ベーリンガー・
マンハイム社製）、Ｈｐａｌ（全酒造社製）、Ｈｌｎｅ
ｌ［（全酒造社製）、ＢａｍＨＩ （全酒造社製）によ
って消化して、プラスミドの構造解析を行ない、これを
、ＫＹＰ −５と命名した。
（ｃ） ｔｒｐプロモーターのポータプル化上記のプ
ラスミドベクターｐＫＹＰ −５はＳＤ配列の下流（１
〜２０塩基以内）にＣｌａｉ部位とＨｌｎ（ｌ Ｎ部位
を有するのでＤＮＡ導入ベクターとして充分使用可能で
ある。しかし、ｐＫＹＰ−５ＤＮＡ中に８Ｄ配列の石抜
のＣ１，ａ １部位以外にもう１カ所Ｃ１ａ １部位が
あること、およびｐＫＹＰ−５ＤＮＡからＥｃｏＲｌと
Ｈｌｎａｉで切り出したｔｒｐプロモーターを含む断片
が２．６５Ｋｂとやや大きいのでよ少使いやすいように
するため第８図のようにしてさらに小さいトリプトファ
ンプロモーターを含むＤＮＡ断片を有するプラスミドを
造成する。すなわちｐＫＹＰ−５ＤＮＡをＨｐａｌとＨ
ｌｎｄｌｌ［で消化して約３４０ｂｐ（ベースペアー）
のＤＮＡ断片を精製し、これをＣ１ａ ｌとＨｌｎｄｌ
ｌ［で消化したｐＢＲ３２２に第６図のように挿入し、
ｐＫＹＰ−１０を得た。ｐＫＹＰ−１０の構造は制限酵
素ＥｃｏＲＩ、Ｃ１ａ Ｉ％Ｈ１ｎｄｌ［、Ｈｐａ ｌ
で消化した後、アガロースゲル電気泳動で確認した。
ラスミドベクターｐＫＹＰ −５はＳＤ配列の下流（１
〜２０塩基以内）にＣｌａｉ部位とＨｌｎ（ｌ Ｎ部位
を有するのでＤＮＡ導入ベクターとして充分使用可能で
ある。しかし、ｐＫＹＰ−５ＤＮＡ中に８Ｄ配列の石抜
のＣ１，ａ １部位以外にもう１カ所Ｃ１ａ １部位が
あること、およびｐＫＹＰ−５ＤＮＡからＥｃｏＲｌと
Ｈｌｎａｉで切り出したｔｒｐプロモーターを含む断片
が２．６５Ｋｂとやや大きいのでよ少使いやすいように
するため第８図のようにしてさらに小さいトリプトファ
ンプロモーターを含むＤＮＡ断片を有するプラスミドを
造成する。すなわちｐＫＹＰ−５ＤＮＡをＨｐａｌとＨ
ｌｎｄｌｌ［で消化して約３４０ｂｐ（ベースペアー）
のＤＮＡ断片を精製し、これをＣ１ａ ｌとＨｌｎｄｌ
ｌ［で消化したｐＢＲ３２２に第６図のように挿入し、
ｐＫＹＰ−１０を得た。ｐＫＹＰ−１０の構造は制限酵
素ＥｃｏＲＩ、Ｃ１ａ Ｉ％Ｈ１ｎｄｌ［、Ｈｐａ ｌ
で消化した後、アガロースゲル電気泳動で確認した。
（２５）
参考例２ １１ＫＹＰ１００の造成：
本発明に述べるプラスミドベクターを造成するために、
第５図に示すようにさらに利用しやすい形にしたｐＫＹ
Ｐｌｏｏ ７を造成する。
第５図に示すようにさらに利用しやすい形にしたｐＫＹ
Ｐｌｏｏ ７を造成する。
ｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡの供給源として、ｔｒ
ｐポータプルプロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹＰＩ
Ｏ１（特願昭５６−２１３１９３、第５図参照）を用い
る。
ｐポータプルプロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹＰＩ
Ｏ１（特願昭５６−２１３１９３、第５図参照）を用い
る。
５０μｍの、、ＫＹＰＩＯに５０単位のＨｈａ ｌ （
全酒造社製）を加え、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ’Ａ’（
ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｆＣ１，，６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含む全１ｔｌｏＯμｌの反応液中３７
℃で２時間反応り、ｔｒｐプロモーターを含む約１８０
ｂｐＯ片以外の２つの断片がＰＡＧＥによって良好に
分△ 離できないために一緒に精製される。精製した３つのＤ
ＮＡ断片（計約４μ？）を５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＭＣＩ
（ｐＨ７，６）、７ｍＭＭｆＣｊ、、 １０ｍＭ ２
−メルカプ（２６） トエタノール、０．２５ ｍＭ ｄＡＴＰ、 Ｏ５２５
ｍＭ ｄＣＴＰ。
全酒造社製）を加え、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ’Ａ’（
ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｆＣ１，，６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含む全１ｔｌｏＯμｌの反応液中３７
℃で２時間反応り、ｔｒｐプロモーターを含む約１８０
ｂｐＯ片以外の２つの断片がＰＡＧＥによって良好に
分△ 離できないために一緒に精製される。精製した３つのＤ
ＮＡ断片（計約４μ？）を５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＭＣＩ
（ｐＨ７，６）、７ｍＭＭｆＣｊ、、 １０ｍＭ ２
−メルカプ（２６） トエタノール、０．２５ ｍＭ ｄＡＴＰ、 Ｏ５２５
ｍＭ ｄＣＴＰ。
０．２５ ｍＭｄＧＴＰ、 ０．２５ｍＭｄＴＴＰを含
む全量３０μノの反応液中で、８単位の大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ■・Ｋ１θｎｏｗ断片（ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリ−社製）を加え、１５℃、２時間反応させ
た。この反応によシ、Ｈｈａ Ｉ消化によって生じた３
１−突出末端はＤＮＡポリメラーゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断
片が持つ３Ｉ→５′のエキンヌクレアーゼ活性および５
１→３１の修復合成活性により平坦末端に変えられる。
む全量３０μノの反応液中で、８単位の大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ■・Ｋ１θｎｏｗ断片（ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリ−社製）を加え、１５℃、２時間反応させ
た。この反応によシ、Ｈｈａ Ｉ消化によって生じた３
１−突出末端はＤＮＡポリメラーゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断
片が持つ３Ｉ→５′のエキンヌクレアーゼ活性および５
１→３１の修復合成活性により平坦末端に変えられる。
続いて７２℃、３０分間し、８単位のＨｉｎａｎｌ（全
酒造社製）を加え、３７℃で２時間反応させた。Ｈｌｎ
ｄ Ｉ［［による消化後、ＰＡＧＥによシ、ｔｒｐプロ
モーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製し
た。
酒造社製）を加え、３７℃で２時間反応させた。Ｈｌｎ
ｄ Ｉ［［による消化後、ＰＡＧＥによシ、ｔｒｐプロ
モーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製し
た。
一方、５μ７のプラスミド、、ＢＲ３２２に８単位のＥ
ｃｏＲＩ（全酒造社製）を加え、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ （ｐＨ７，５）、５０ｍＭ Ｎａ（Ｊ、７ ｍＭ
ＭｆＣｌ ２．６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
む全量２０μｌの反応液中、３７℃で２時間反応させた
。反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノ
ール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量２０μｌの５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、７ｍＭＭりｃ１２．６
ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭ ｄＡＴ
Ｐｌｏ、２５１１１Ｍ ｄｃＴＰ。
ｃｏＲＩ（全酒造社製）を加え、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ （ｐＨ７，５）、５０ｍＭ Ｎａ（Ｊ、７ ｍＭ
ＭｆＣｌ ２．６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
む全量２０μｌの反応液中、３７℃で２時間反応させた
。反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノ
ール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量２０μｌの５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、７ｍＭＭりｃ１２．６
ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭ ｄＡＴ
Ｐｌｏ、２５１１１Ｍ ｄｃＴＰ。
０．２５ｍＭ ｄＧＴＰ、 ０．２５ｍＭｄＴＴＰに溶
解し、続いて８単位の大腸菌Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ■
・Ｋ１ｅｎＯＷ断片（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
−社製）を加え、１５℃、２時間反応させた。ＥＯＯＲ
Ｉ消化によって生じた５１−突出末端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩ−１０ｅｎｏｗ断片の修復合成活性により平坦末
端に変えた。７２℃、３０分間の熱処理によって、ＤＮ
Ａポリメラーゼｌ −Ｋｌθｎｏｗ断片を失活させた後
、ＩＭＮａＣｌでＮａＣ１！濃度を５０ｍＭとし、８単
位のＨｌｎｄＩｆｆ （全酒造社製）を加え、３７℃で
２時間反応させた。Ｈｌｎａ ＩＩＩによる消化後、低
融点アガロースゲル電気泳動法によシ大きいプラスミド
ＤＮＡ断片（約ｔａａｋｂ）を精製した。
解し、続いて８単位の大腸菌Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ■
・Ｋ１ｅｎＯＷ断片（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
−社製）を加え、１５℃、２時間反応させた。ＥＯＯＲ
Ｉ消化によって生じた５１−突出末端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩ−１０ｅｎｏｗ断片の修復合成活性により平坦末
端に変えた。７２℃、３０分間の熱処理によって、ＤＮ
Ａポリメラーゼｌ −Ｋｌθｎｏｗ断片を失活させた後
、ＩＭＮａＣｌでＮａＣ１！濃度を５０ｍＭとし、８単
位のＨｌｎｄＩｆｆ （全酒造社製）を加え、３７℃で
２時間反応させた。Ｈｌｎａ ＩＩＩによる消化後、低
融点アガロースゲル電気泳動法によシ大きいプラスミド
ＤＮＡ断片（約ｔａａｋｂ）を精製した。
このようにして得られたｔｒｐプロモーターを含む約１
００ｂｐのＤＮＡ断片ｌ（約５０ｎり）とｐＢＲ３２２
由来の約４゜３３ｋｌ）のＤＮＡ断片６（約０．２μｍ
）に５０ ｎｆの５＋−リン酸されたＸｈｏ （リンカ
−（Ｉｌ、Ｃ’ＣＴＣＧＡＧＧ、コラボレイティプ・リ
サーチ社製）を加え、２０ｍＭＴｒｉＢ−ＨＣｊｌ（、
、Ｈ７，６）、１０ ｍＭ ＭりＣ１，，１０ｍＭジチ
オスレイトール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μｌ
の反応液中で、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（全酒造
社製）を加え、４℃で４０時間、結合反応を行った。こ
のようにして得られる組換えプラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、得られるＡＩ、Ｒｒ
ｒ ｃＲの形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精
製した。これらのプラスミドＤＮＡを８種類の制限酵素
ＥＣＯＲ■、ｘｈＯ■、阻ｎｄｌＩ［、Ｈａｅｌｌｌ（
以上、全酒造社製）、Ｃ１ａ Ｉ（ベーリンガー・マン
ハイム社製）、ＴａｑＩ（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−社製）、Ｒｓａｌにュ・イングランド・バイオラ
ボ社製）で消化することにより、約１００ｂｐのｔｒｐ
プロモーターを含むＤＮＡ断片３とＸｈｏ ｌ リンカ
−４がクローン化された（２９） プラスミドを選び１．ｐＫＹＰｌｏｏ ７ と命名した
。
００ｂｐのＤＮＡ断片ｌ（約５０ｎり）とｐＢＲ３２２
由来の約４゜３３ｋｌ）のＤＮＡ断片６（約０．２μｍ
）に５０ ｎｆの５＋−リン酸されたＸｈｏ （リンカ
−（Ｉｌ、Ｃ’ＣＴＣＧＡＧＧ、コラボレイティプ・リ
サーチ社製）を加え、２０ｍＭＴｒｉＢ−ＨＣｊｌ（、
、Ｈ７，６）、１０ ｍＭ ＭりＣ１，，１０ｍＭジチ
オスレイトール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μｌ
の反応液中で、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（全酒造
社製）を加え、４℃で４０時間、結合反応を行った。こ
のようにして得られる組換えプラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、得られるＡＩ、Ｒｒ
ｒ ｃＲの形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精
製した。これらのプラスミドＤＮＡを８種類の制限酵素
ＥＣＯＲ■、ｘｈＯ■、阻ｎｄｌＩ［、Ｈａｅｌｌｌ（
以上、全酒造社製）、Ｃ１ａ Ｉ（ベーリンガー・マン
ハイム社製）、ＴａｑＩ（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−社製）、Ｒｓａｌにュ・イングランド・バイオラ
ボ社製）で消化することにより、約１００ｂｐのｔｒｐ
プロモーターを含むＤＮＡ断片３とＸｈｏ ｌ リンカ
−４がクローン化された（２９） プラスミドを選び１．ｐＫＹＰｌｏｏ ７ と命名した
。
第１図は、本発明ベクターの一例で、翻訳開始信号ＡＴ
ＧとＳｐｈ ｌ切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が重複したも
のの模式図である。 第２図は、本発明ベクターに利用できる制限酵素の切断
形を示す。 第３図は、本発明ベクターにＤＮＡポリメラーゼｌ −
Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて外来遺伝子を組込む工程を示
す。 第４図は、本発明ベクターにターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて外来遺伝子を組込む工程を示す。 第５図は、プラスミドｐＫＹＰ１００の造成工程を示す
。図中しはプラスミドｐＫＹＰ１０、盃はｔｒｐプロモ
ーターを含む約１８０ ｂｐのＤＮＡ断片、且はｔｒｐ
プロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片、土はＸ
ｈｏ） リンカ−１ｊはプラスミドｐＢＲ３２２、旦は
ｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片、ｌはプラスミドｐＫＹＰ１
００を示す。 （３０） 第６図は、プラスミドｐＴｒｓ ３の造成工程を１００
の約３．８２ ｋｌ）断片、１０は２種の合成オリゴヌ
クレオチドが対合した２本鎖ＤＮＡ、１１はプラスミド
ｐＴｒ１９３ を示す。 第７図は、ｐＫＹＰ−５の造成工程を示す。 第８図は、ｐＫＹＰ−１０の造成工程を示す。 特許出願人 （１０２）協和醗酵工業株式会社財団法人
癌 研 究 会 理事長 安 西 浩 （３１） 第７図 ＨｉｎｃｌＮ 第δ図 第１頁の続き ０発 明 者 伊藤葺荻 相模原市相原２１８−１４ ■出 願 人 財団性人癌研究会 東京都豊島区上池袋−丁目３７番 １号 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１７７１９２号 ２、発明の名称 新規ベクター ３、補正をする考 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の特許請求
の範囲の欄１発明の詳細な説明の欄および図面の簡単な
説明の欄 ５、補正の内容 （１） フェロンーβ（Ｉ ＦＮ−βと略記する）誘導体の発現
： 実施例１で造成した発現ベクターｐ Ｔ ｒ Ｓ −３
を用い、ＩＦＮ−βのＮ末☆ＩＩ）のメチオニンの前に
さらに一個のメチオニンを付与したＩＦＮ−β誘導体を
発現する組換えプラスミドを次のようにして１１た。 １０μｇのｐ Ｔ ｒ Ｓ −３を１０ｍＭＴｒ ｉ
ｓ −ＨＣＩＩ （ｐＨ７，５） 、 ５０ｍＭ
ＮａＣｌ１ 、７ｍＭＭｇＣｊ！２．６ｍＭ２−メルカ
プトエタノールを含む全量４０μｌの反応液中で、１０
単位のＳｐｈ■ （ベーリンガー・マンハイム社製）を
加え、３７℃、２時間反応させた。反応後、フェノール
およびクロロボルム抽出とエタノール沈殿を行った。 沈殿したＤＮＡ断片を全量４０μρの５０ｍＭＴｒ ｉ
５−ＨＣＡ （ｐ Ｈ７，６） 、 ７ｍＭ Ｍ
ｇ（Ｊ！ ２ 。 １０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭｄＡ
ＴＰ、０．２５ｍＭｄ ＣＴＰ、０．２５ｍＭｄ ＧＴ
Ｐ 、 ０．２５ ｍ Ｍ ｄ Ｔ Ｔ Ｐに／８
解し、続いて４単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ −
Ｋｌｅｎｏｗ断片（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
社製）を加え、１５℃、２時間反応させた。反応後、フ
ェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行
った。沈殿したＤＮＡ断片を全量３０μｌの１ ００ｍ
ＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ（１（ｐ Ｈ７，５） 、
５０ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１、７ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
１，２、６ｒｎ Ｍ ２−メルカプトエタノールに溶解
し、続いて１６単位のＥｃｏＲＩ （宝酒造社製）を
加え、３７°Ｃ，２時間反応させた。ＥｃｏＲＩによる
消化後、低融点アガロース・ケル電気泳動法により、小
さいプラスミドＤＮＡ断片（約１３０ｂｐ）を精製した
。 次にＩＦＮ−β遺伝子を有する組換え体プラスミドｐ
Ｌ Ｅ −３の５μｇをｌＯｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（１！
（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ１，２，６ｍＭ２−メル
カプトエタノールを含む全量３０μｌの反応液中で、１
０単位のＣＡａｌ（ベーリンガー・マンハイム社製）を
加え、３７℃、２時間反応させた。 なお、ｐＬＥ−３のＣＡａＩサイＩ・の周辺の構造は次
のとおりである。 Ｃρａ［ ＳＤ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｙｒ反
応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール
沈殿のｆ＆、ＤＮＡ断片を全ｍ ３０ ｔｔβの ５
０ｍＭＴ ｒ ｉ ｓ −ＨＣＩＩ、 ７
ｍＭＭｇＣｌ！ ２゜］００ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール＋０２５ｍＭｄＡＴＰ、０．２５ｍＭｄＴＴＰに
溶解し、続いて１２単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーセＴ
（ＮｅｕＥｎｇＩｎｄ旧ｏｌａｂｓ社製）を加え、
３７°Ｃで３０分間反応させた。 この反応によって、Ｃβａｌ消化によって生じた５′−
突出末端は次に示すとおり、ＤＮＡポリメラーゼＩの持
つ５′→３′エキソヌクレアーセ活性により削られ平坦
末端に変えられる。 ｎａｌ ＴＡ ＴＡ この反応において、ｄＡＴＰ、ｄＴＴｒ’は、 ＤＮ
Ａポリメラーゼ■の持つ３′→５′ユキソヌクレアーゼ
活性によって、ＤＮＡ分子の末端から３′→５′方向に
塩基が削られることを防ぐために添加した。なお、この
反応において」１記のような平坦末端が得られる割合は
数％〜数１０％程度である。 」−記反応後、フェノールおよびクロロポルム抽出とエ
タノール沈殿を行った。沈殿したＤ Ｎ Ａ Ｉｌｉ片
を全ｍ ３０ ｐ Ｒの１００ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
ｆｆ（ｐＨ７，５）、５０ｍＭＮａＣＣ７ｍＭＭｇＣ１
！２゜６ｍＭ２−メルカプトエタノールに溶解し、続い
（４） て、１６単位のＥｃｏＲＴ （宝酒造社製）を加え。 ３７°Ｃ，２時間反応させた。 Ｅｃ ｏＲＩによる消化後、低融点アガロースゲル電気
泳動法により、大きいプラスミドＤ Ｎ Ａ １＋Ｊｉ
片（約５．ＩＫｂ）を精製した。このようにして得られ
たｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコドンを
有する約１３０ｂｐのＤＮＡ断片（約４０ ｎ ｇ＞
とＩＦＮ−β遺伝子を含む約５． ］ Ｋ ｂのＤＮ
Ａ断片（約１５０ｎｇ）を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２
（ｐＨ７，６）、Ｉ ０ｍＭＭｇＣｌ２２．１０ｍＭ
ジチオスレイトール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０
μβの反応液中で、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
、４℃で２０時間結合反応を行った。 このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用い
、常法により大腸菌ＨＢ １０１ （Ｉｌ、Ｒｏｙｅ
ｒら： Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃ、 Ｒｉｏｌｏ、、 ４１４
５９ （１９６９） ）を形質転換した。得られたＡｐ
”Ｔｃ” の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを常法
により分離精製し第９図に示したｐ Ｆ Ｊ −１２３
を得た。 ｐ Ｆ 、１−１２３の構造は制限酵素Ｅｃ ｏＲＩ。 Ｘｈｏ Ｉ、 Ｐｓ ｔ １． Ｂａｍ１４ Ｔ
（以上宝酒造社製）およびＣρａ＋（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）によって消化後、アガロースゲル電気泳
動により確認した。 （５） 組換えプラスミドｐ Ｆ 、Ｊ −１２３を持つ大腸菌
ＨＢ１０１株をＩＰ、１１２３と命名し、インターフェ
ロンの生産性を以下の方法で調べた。 本菌株をＬＧ培地〔トリプトン１０ｇ、１１１母工キス
５ｇ、ＮａＣｊ！５ｇ、 グルコース１ｇを水１ρにと
かし、ＮａＯＨでｐ Ｈを７．２とする〕で３７’Ｃ，
１８時間培養した。この培養液０．２ｍｌを１０ｍ１の
ＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４０，６％、ＫＴ−１２ＰＯ
４０，３％、 ＮａＣ１！ ０．５％ 、
ＮＨ，Ｉ Ｃｅ Ｏ，１％、グルコース０．５％
、カザミノ酸０．５％、Ｍｇ５Ｏａ １ｍＭ、サイア
ミン塩酸塩４１１ ｇ ／ ｍｌ、 ｐｌ＋７．２〕に
接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファン遺
伝子の誘導物質であるインドールアクリル酸（以下ＴＡ
Ａと略記する）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに５〜１２
時間培養を続けた。 培養液を８．００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心して策菌し、
３０ｍＭＮａ Ｃ１！、３０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＡ
（ｐＨ７，５）緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を」−記緩
衡液１慴１に９濁し、２００ｐｇのリゾチーム。 ０．２５ＭＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を
５μｌ加えて、０℃に３０分間放置した後、凍結、融解
を３回繰返して菌体を破砕した。これを１５．００Ｏｒ
ｐｍ、３０分間遠心し、上清を採取した。上清中のイン
ターフェロンの量をアームス１− ロングの方ｌ去（Ｊ
、八、八ｒｍｓｔｒ６ｎｇ ：八ｐｐ１． Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏ＋。 ？１．７２３−７２５ （１９７１） ）に従って定量
した。但し、ウィルスとしてはνｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓ
ｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ。 動物細胞としてはヒ）・羊膜細胞由来のウイソシュ・セ
ル（Ｗｉｓｈ Ｃｅ１１ ）を用いた。 インターフェロン活性の測定の結果１本菌株は３Ｘ１０
９単位／ｐのインターフェロンを生産していた。 ＩＦＪ−１２３株が保持するプラスミド（ｐＦＪ−１２
３）のＳＤ配列とＡＴＧ周辺の塩基配列をマキサム・ギ
ルバートの方法で調べた結果。 ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＣ；ＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＡＴＧＤ であることが判明した。 ｐＦＪ−１２３を含む大腸菌菌株は、工業技術院微生物
工業技術研究所にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＴ
ＦＪ−］２３．ＦＥＲＭ Ｐ−６８８２として寄託さ
れている。 上記したｐＦ、ｌ１２３の造成工程を第９図に図示する
。 実施例３゜ Ｎ末端のアミノ酸を欠失したｒＦＮ−β誘導体の発現： 実施例１で造成した発現ヘクターｐ Ｔｒ Ｓ −３を
用い、ＴＦＮ−βのＮ末端のいくつかのアミノ酸を欠失
したＩＦＮ−β誘導体を発現する組換えプラスミドを次
のようにして得る。 １５μｇのｐＬＥ−，３を１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
Ａ（ｐＨ７，５＞、７ｍＭＭｇＣ７！２．６ｍＭ２−メ
ルカプトエタノールを含む全量１００μβの反応液中で
２０単位のＣｅａＴ＜ベーリンガー・マンハイム社製）
を加え、３７°ｃ、 ２時間反応させた。 反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノー
ル沈殿を行った。沈殿したＤＮＡ断片を全量３０μβの
１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ７！（ｐＨ７，５）−０，
５ｍＭＥＤＴＡに溶解した。続いテ、コのＤＮＡ溶液６
μ＃（Ｄ’ＮＡ量は約３μｇ）と蒸留水１３ｔｔｌｌと
緩衝液（６０ｍＭＣａＣｎ２．６０ｍＭＭｇＣｆｆ ２
，３ＭＮａ Ｃ７！、１００ｍＭＴｒ ｉ ｓ−ＨＣ１
２（ｐＨ８，１） 、、 ５ ｍ Ｍ ＩＦ、 Ｄ
Ｔ Ａ ） ５ ＩＩＩを混合した後、０．５単位のエ
キソヌクレアーセＢＡ Ｌ ３ ］ （Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え。 ３０℃で３分間反応させた。この反応により。 （１１！ａＩ末端から両方向に１〜３０ｂｐＤＮＡ鎖が
削られた。反応をフェノール抽出によって停止させ、続
いてクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行った。沈殿
したＤＮＡ断片を全量２０μρの１００ｍＭＴｒ ｉ
５−ＨＣｊｌ！ （ｐ Ｈ７，５） 、 ５０（８
） ｍＭＮａＣｆｌ、７ｍＭＭｇＣｎ２．６ｍＭ２−メルカ
プトエタノールに溶解し、続いて８単位のＥｃｏＲＴ
（宝酒造社製）を加え、３７℃、２時間反応さゼた。 ＥｃｏＲＩによる消化後、低融点アガロースゲル電気泳
動により、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約５．１Ｋｂ
）を精製した。 このようにして得たＩＦＮ−β遺伝子を含む約５、 Ｉ
Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約１５０ｎｇ）と実施例２で調
製したｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコド
ンを有する約１３０ｂｐのＤＮＡ断片（約４．０ｎｇ）
を、２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩＶ（ｐＨ７，６）、
Ｉ ＱｍＭＭｇ（１！２．１０ｍＭシヂオスレイト−ル
、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μβの反応液中で、
１．ｔｌｔ位の７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加
え、４℃で２０時間結合反応を行った。 このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用い
、大腸菌Ｈ８１０１株を常法により形質転換し、得られ
た八ｐ ＲＴ ＣＳ の形質転換株が持つプラスミドＤ
ＮＡを常法により分離４ｈ製し、第１０図に示したｐＦ
Ｍ−９を得た。 ｐＦＭ−９の構造は制限酵素ＲｃｏＲＩ、Ｘｈ。 １、Ｐ ｓ ｔ １．Ｂａｍ１−（ＩおよびＣ１ａＩに
よって消化後、アガロースゲル電気泳動により確認しく
９） た。 組換えプラスミドｐＦＭ−９を持つ大腸菌８８１０１株
をＩＦＭ−９と命名し、インターフェロン生産性を実施
例２と同様に調べたところ、８×１０７単位／７！のイ
ンターフェロンを生産していた。この菌株は、工業技術
院微生物工業技術研究所に Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｔ ＦＭ −９Ｆ ＢＲＭ Ｐ−６８８
３として寄託されている。この菌株が保持する組換えプ
ラスミドをｐＦＭ−９と呼ぶ。 上記したｐＦＪ１２３の造成工程を第１０図に図示する
。 次に、大腸菌ＩＦＮ−９が保持するプラスミドｐＦ’Ｍ
−９のＳＤ配列とＡＴＧ周辺の塩基配列をマキサム・ギ
ルバートの方法で調べたところ。 ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＩ夏羽ＧＡＴＴＣ
Ｄ という結果を得、ｐＦＭ−９はＮ末端のＭｅｔの次から
５個のアミノ酸（Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ ）を欠失したＩＦＮ−βをコードする遺伝子を含
むことが判明した。」 （２） 明細書第２５頁最下行の後に次の記載を加入
する。 １１ｄｌ ２個以上のｔｒｐプロモーターの連結次に
さらに強いプロモーター活すノ１を有するプラスミドベ
クターの造成を目指して、ｔｒｐプロモーターを２１１
Ｍ連結することを試みた。すなわち、第１１図（Ａ）に
示したように前項ｆｃｌでのべたｔｒｐプロモーターを
含む約３４０ｂｐのＤＮＡ断片をＣｎａＴとＨｉ ｎ
ｄ ＩＩＴで消化したｐＫＹＰ−１０に挿入し、ｐＫＹ
Ｐ−１１を得た。同様の方法でｔｒｐプロモーター３個
を同一方向に連結したｐＫＹＰ−１２（第１１図（Ｂ）
〕 も造成し、ＥｃｏＲＩ、Ｃｊ！ａｌ。 ＨｉｎｄｌｌＴ、Ｈｐａ Ｉで消化し構造を確認した。 」（３） 明１ａ＠第３０頁１行目の後に次の参考例
３を加入する。 「参考例３゜ ｒ＋ＬＢ−３の造成： ｐＴｕｌＦＮβ−５（ΔＴＣＣ３１８７９から常法によ
り分離する）を）（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化後ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ″ＩＬ製）で処理した後結合反応を行い第１２
図に示したｐＴｕ Ｉ ＦＮβ１１−５を得た。ｐ Ｔ
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ Ｉｊ Ｈ−５よりβＩＦＮ遺伝了を
切り出し、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＫ
ＹＰ−１２にクローン化した。すなわち、 ｐ ＫＹ
Ｐ’−１２ＤＮＡ２１１ｇに制限酵素Ｃ７！ａｌを４単
位加え、１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩＶ、（ｐＨ７，
５）、６ｍＭＭｇＣｌ１２゜５ｍＭジチオスレイト−ル
（以下Ｃρａバッファーとよぶ）中（全ｍ３０Ｉ！Ａ）
−（’、３７°ｃ、 ２時間反応さ七た後、ＮａＣβ
を最終１度１００ｍＭになるように加えてさらに３７°
Ｃで２時間反応を続けた。次いで６５°Ｃで５分間加熱
して酵素を失活させ、低融点アガロース・ゲル電気泳動
法で約５ Ｋ ｂのｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断
片を精製し、１．２μｇを得た。次にｐＴｕｌＦＮβ■
１−５ ＤＮＡ１５μｇを上と同様に制限酵素Ｃβａ
ＩとＢ ａ ｍ ＨＩで消化し、低融点アガロース・ケ
ル電気泳動法で精製し、β−■ＦＮ遺伝子を含むＤＮＡ
断片（１，ＩＫｂ）約１μｇを得た。１以上のようにし
て得られる２個のＤＮＡ断片（第１２図の５ Ｋ ｂと
１．ＩＫｂ）を２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１（ｐ
Ｈ７，５）、６ｍＭＭｇＣ＃２．５ｍＭシオチスレイト
−ル、５００．＋ＩＭＡＴＰにとかし、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーセ４単位を加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った
。得られたくみかえ体プラスミドの混合物を用いて、常
法通り、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し Ａ ｐ Ｒの
コロニーを得た。このコロニーの培養液よりプラスミド
を分離し、第１２図に示したｐ Ｌ Ｅ −３を得た。 ｐ Ｉ−Ｅ −３の構造はＣｊ２ａ Ｉ、ＥｃｏＲｌ、
Ｈ４ｎｄｌＴｌ、ＢａｍＨＴで消化後、アガロース・ゲ
ル電気泳動により確認（１２） Ｇ）から開始コドン（ＡＴＧ）までの塩基配列はｒＡＡ
ＧＧＧＴＡＴｃＧＡＴＧＪであることをマキサム・ギル
バートの方法（Ａ８Ｍ、Ｍａｘａｍら：Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ第７４巻、５６０頁 （
１９７７） ）で確認した。 ｐ Ｌ Ｅ −３を含む大腸菌菌株はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃ、ｏｌｉ Ｔ Ｌ Ｅ −３ΔＴＣ
Ｃ３９０１０として寄託されている。」 （４）明細書部３１頁７行目の後に次の記載を加入する
。 ［第９図は、ｐＦＪ−１２３の造成工程を示す。 第１０図は、ｐＦＭ−９の造成工程を示す。 第１１図（Ａ）は、ｐＫＹ−１１の造成工程を示す。 （Ｂ）は、ｐＫＹＰ−１２の構造を示す。 第１２図は、ｐＬＥ−３の造成工程を示す。」（５）明
細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 （６）明細書に第９〜１２図を加入する。 ６、添付書類の目録 図 面 １通 受託証 １通 （１３） 特許請求の範囲 （１） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクター。 （２）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （３）制限酵素が５ｐｈＴ、ＥｃｏＲＶ、Ｋｐｎｌまた
は５ａＣＩであることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の発現ベクター。 （４） プロモーターが原核細胞由来のプロモーター
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発
現ベクター。 （５） プロモーターがｔｒｐ系、ｌａｃ系およびλ
フアージ系の大腸菌プロモーターまたは枯草菌プロモー
ターであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
の発現ベクター。 （６） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （７） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクターを制限酵素で切断ｔＬ 生した３′−突
出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏｗ断片
）またはＴ ４． Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼを用いて平
坦末端に変え、外来遺伝子を該平坦末端に組込んだ組換
え体で宿主微生物を形質転換し、得られる形質転換株を
培養することにより該り１来遺伝子を発現させる方法。 （８） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残ず制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクターを制限酵素で切断後、住した３′−突出
末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランス
フェラーゼを用いてホモ・ポリマー・ブロックを付加し
。 これと相補的なホモ・ポリマー・ブロックを付加した外
来遺伝子を組込んだ組換え体で宿主微生物を形質転換し
、得られる形質転換株を培養することにより該外来遺伝
子を発現させる方法。 （９）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲第７または８項記載の方法。 ００）制限酵素が５ｐｈＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＴまた
は５ａｃｌであることを特徴とする特許請求の範囲第７
または８項記載の方法。 （１１〕 プロモーターが原核細胞由来のプロモータ
ーであることを特徴とする特許請求の範囲第７または８
項記載の方法。 ＯＤ プロモーターがｔｒｐ系、ｐａｃ系およびλフ
アージ系の大腸菌プロモーターであることを特徴とする
特許請求の範囲第１１項記載の方法。 ０３） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第７または８項記載の方法。 ｒ１４） 特許請求の範ＩＩＩ］第１項記載の発現ベ
クターを含む微生物。 〔ＩＳ） エソシエリヒア・コリＩＴｒＳ−３゜（１
６）
ＧとＳｐｈ ｌ切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が重複したも
のの模式図である。 第２図は、本発明ベクターに利用できる制限酵素の切断
形を示す。 第３図は、本発明ベクターにＤＮＡポリメラーゼｌ −
Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて外来遺伝子を組込む工程を示
す。 第４図は、本発明ベクターにターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて外来遺伝子を組込む工程を示す。 第５図は、プラスミドｐＫＹＰ１００の造成工程を示す
。図中しはプラスミドｐＫＹＰ１０、盃はｔｒｐプロモ
ーターを含む約１８０ ｂｐのＤＮＡ断片、且はｔｒｐ
プロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片、土はＸ
ｈｏ） リンカ−１ｊはプラスミドｐＢＲ３２２、旦は
ｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片、ｌはプラスミドｐＫＹＰ１
００を示す。 （３０） 第６図は、プラスミドｐＴｒｓ ３の造成工程を１００
の約３．８２ ｋｌ）断片、１０は２種の合成オリゴヌ
クレオチドが対合した２本鎖ＤＮＡ、１１はプラスミド
ｐＴｒ１９３ を示す。 第７図は、ｐＫＹＰ−５の造成工程を示す。 第８図は、ｐＫＹＰ−１０の造成工程を示す。 特許出願人 （１０２）協和醗酵工業株式会社財団法人
癌 研 究 会 理事長 安 西 浩 （３１） 第７図 ＨｉｎｃｌＮ 第δ図 第１頁の続き ０発 明 者 伊藤葺荻 相模原市相原２１８−１４ ■出 願 人 財団性人癌研究会 東京都豊島区上池袋−丁目３７番 １号 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１７７１９２号 ２、発明の名称 新規ベクター ３、補正をする考 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の特許請求
の範囲の欄１発明の詳細な説明の欄および図面の簡単な
説明の欄 ５、補正の内容 （１） フェロンーβ（Ｉ ＦＮ−βと略記する）誘導体の発現
： 実施例１で造成した発現ベクターｐ Ｔ ｒ Ｓ −３
を用い、ＩＦＮ−βのＮ末☆ＩＩ）のメチオニンの前に
さらに一個のメチオニンを付与したＩＦＮ−β誘導体を
発現する組換えプラスミドを次のようにして１１た。 １０μｇのｐ Ｔ ｒ Ｓ −３を１０ｍＭＴｒ ｉ
ｓ −ＨＣＩＩ （ｐＨ７，５） 、 ５０ｍＭ
ＮａＣｌ１ 、７ｍＭＭｇＣｊ！２．６ｍＭ２−メルカ
プトエタノールを含む全量４０μｌの反応液中で、１０
単位のＳｐｈ■ （ベーリンガー・マンハイム社製）を
加え、３７℃、２時間反応させた。反応後、フェノール
およびクロロボルム抽出とエタノール沈殿を行った。 沈殿したＤＮＡ断片を全量４０μρの５０ｍＭＴｒ ｉ
５−ＨＣＡ （ｐ Ｈ７，６） 、 ７ｍＭ Ｍ
ｇ（Ｊ！ ２ 。 １０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭｄＡ
ＴＰ、０．２５ｍＭｄ ＣＴＰ、０．２５ｍＭｄ ＧＴ
Ｐ 、 ０．２５ ｍ Ｍ ｄ Ｔ Ｔ Ｐに／８
解し、続いて４単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ −
Ｋｌｅｎｏｗ断片（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
社製）を加え、１５℃、２時間反応させた。反応後、フ
ェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行
った。沈殿したＤＮＡ断片を全量３０μｌの１ ００ｍ
ＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ（１（ｐ Ｈ７，５） 、
５０ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１、７ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
１，２、６ｒｎ Ｍ ２−メルカプトエタノールに溶解
し、続いて１６単位のＥｃｏＲＩ （宝酒造社製）を
加え、３７°Ｃ，２時間反応させた。ＥｃｏＲＩによる
消化後、低融点アガロース・ケル電気泳動法により、小
さいプラスミドＤＮＡ断片（約１３０ｂｐ）を精製した
。 次にＩＦＮ−β遺伝子を有する組換え体プラスミドｐ
Ｌ Ｅ −３の５μｇをｌＯｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（１！
（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ１，２，６ｍＭ２−メル
カプトエタノールを含む全量３０μｌの反応液中で、１
０単位のＣＡａｌ（ベーリンガー・マンハイム社製）を
加え、３７℃、２時間反応させた。 なお、ｐＬＥ−３のＣＡａＩサイＩ・の周辺の構造は次
のとおりである。 Ｃρａ［ ＳＤ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｙｒ反
応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール
沈殿のｆ＆、ＤＮＡ断片を全ｍ ３０ ｔｔβの ５
０ｍＭＴ ｒ ｉ ｓ −ＨＣＩＩ、 ７
ｍＭＭｇＣｌ！ ２゜］００ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール＋０２５ｍＭｄＡＴＰ、０．２５ｍＭｄＴＴＰに
溶解し、続いて１２単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーセＴ
（ＮｅｕＥｎｇＩｎｄ旧ｏｌａｂｓ社製）を加え、
３７°Ｃで３０分間反応させた。 この反応によって、Ｃβａｌ消化によって生じた５′−
突出末端は次に示すとおり、ＤＮＡポリメラーゼＩの持
つ５′→３′エキソヌクレアーセ活性により削られ平坦
末端に変えられる。 ｎａｌ ＴＡ ＴＡ この反応において、ｄＡＴＰ、ｄＴＴｒ’は、 ＤＮ
Ａポリメラーゼ■の持つ３′→５′ユキソヌクレアーゼ
活性によって、ＤＮＡ分子の末端から３′→５′方向に
塩基が削られることを防ぐために添加した。なお、この
反応において」１記のような平坦末端が得られる割合は
数％〜数１０％程度である。 」−記反応後、フェノールおよびクロロポルム抽出とエ
タノール沈殿を行った。沈殿したＤ Ｎ Ａ Ｉｌｉ片
を全ｍ ３０ ｐ Ｒの１００ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
ｆｆ（ｐＨ７，５）、５０ｍＭＮａＣＣ７ｍＭＭｇＣ１
！２゜６ｍＭ２−メルカプトエタノールに溶解し、続い
（４） て、１６単位のＥｃｏＲＴ （宝酒造社製）を加え。 ３７°Ｃ，２時間反応させた。 Ｅｃ ｏＲＩによる消化後、低融点アガロースゲル電気
泳動法により、大きいプラスミドＤ Ｎ Ａ １＋Ｊｉ
片（約５．ＩＫｂ）を精製した。このようにして得られ
たｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコドンを
有する約１３０ｂｐのＤＮＡ断片（約４０ ｎ ｇ＞
とＩＦＮ−β遺伝子を含む約５． ］ Ｋ ｂのＤＮ
Ａ断片（約１５０ｎｇ）を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２
（ｐＨ７，６）、Ｉ ０ｍＭＭｇＣｌ２２．１０ｍＭ
ジチオスレイトール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０
μβの反応液中で、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
、４℃で２０時間結合反応を行った。 このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用い
、常法により大腸菌ＨＢ １０１ （Ｉｌ、Ｒｏｙｅ
ｒら： Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃ、 Ｒｉｏｌｏ、、 ４１４
５９ （１９６９） ）を形質転換した。得られたＡｐ
”Ｔｃ” の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを常法
により分離精製し第９図に示したｐ Ｆ Ｊ −１２３
を得た。 ｐ Ｆ 、１−１２３の構造は制限酵素Ｅｃ ｏＲＩ。 Ｘｈｏ Ｉ、 Ｐｓ ｔ １． Ｂａｍ１４ Ｔ
（以上宝酒造社製）およびＣρａ＋（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）によって消化後、アガロースゲル電気泳
動により確認した。 （５） 組換えプラスミドｐ Ｆ 、Ｊ −１２３を持つ大腸菌
ＨＢ１０１株をＩＰ、１１２３と命名し、インターフェ
ロンの生産性を以下の方法で調べた。 本菌株をＬＧ培地〔トリプトン１０ｇ、１１１母工キス
５ｇ、ＮａＣｊ！５ｇ、 グルコース１ｇを水１ρにと
かし、ＮａＯＨでｐ Ｈを７．２とする〕で３７’Ｃ，
１８時間培養した。この培養液０．２ｍｌを１０ｍ１の
ＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４０，６％、ＫＴ−１２ＰＯ
４０，３％、 ＮａＣ１！ ０．５％ 、
ＮＨ，Ｉ Ｃｅ Ｏ，１％、グルコース０．５％
、カザミノ酸０．５％、Ｍｇ５Ｏａ １ｍＭ、サイア
ミン塩酸塩４１１ ｇ ／ ｍｌ、 ｐｌ＋７．２〕に
接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファン遺
伝子の誘導物質であるインドールアクリル酸（以下ＴＡ
Ａと略記する）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに５〜１２
時間培養を続けた。 培養液を８．００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心して策菌し、
３０ｍＭＮａ Ｃ１！、３０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＡ
（ｐＨ７，５）緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を」−記緩
衡液１慴１に９濁し、２００ｐｇのリゾチーム。 ０．２５ＭＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を
５μｌ加えて、０℃に３０分間放置した後、凍結、融解
を３回繰返して菌体を破砕した。これを１５．００Ｏｒ
ｐｍ、３０分間遠心し、上清を採取した。上清中のイン
ターフェロンの量をアームス１− ロングの方ｌ去（Ｊ
、八、八ｒｍｓｔｒ６ｎｇ ：八ｐｐ１． Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏ＋。 ？１．７２３−７２５ （１９７１） ）に従って定量
した。但し、ウィルスとしてはνｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓ
ｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ。 動物細胞としてはヒ）・羊膜細胞由来のウイソシュ・セ
ル（Ｗｉｓｈ Ｃｅ１１ ）を用いた。 インターフェロン活性の測定の結果１本菌株は３Ｘ１０
９単位／ｐのインターフェロンを生産していた。 ＩＦＪ−１２３株が保持するプラスミド（ｐＦＪ−１２
３）のＳＤ配列とＡＴＧ周辺の塩基配列をマキサム・ギ
ルバートの方法で調べた結果。 ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＣ；ＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＡＴＧＤ であることが判明した。 ｐＦＪ−１２３を含む大腸菌菌株は、工業技術院微生物
工業技術研究所にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＴ
ＦＪ−］２３．ＦＥＲＭ Ｐ−６８８２として寄託さ
れている。 上記したｐＦ、ｌ１２３の造成工程を第９図に図示する
。 実施例３゜ Ｎ末端のアミノ酸を欠失したｒＦＮ−β誘導体の発現： 実施例１で造成した発現ヘクターｐ Ｔｒ Ｓ −３を
用い、ＴＦＮ−βのＮ末端のいくつかのアミノ酸を欠失
したＩＦＮ−β誘導体を発現する組換えプラスミドを次
のようにして得る。 １５μｇのｐＬＥ−，３を１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
Ａ（ｐＨ７，５＞、７ｍＭＭｇＣ７！２．６ｍＭ２−メ
ルカプトエタノールを含む全量１００μβの反応液中で
２０単位のＣｅａＴ＜ベーリンガー・マンハイム社製）
を加え、３７°ｃ、 ２時間反応させた。 反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノー
ル沈殿を行った。沈殿したＤＮＡ断片を全量３０μβの
１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ７！（ｐＨ７，５）−０，
５ｍＭＥＤＴＡに溶解した。続いテ、コのＤＮＡ溶液６
μ＃（Ｄ’ＮＡ量は約３μｇ）と蒸留水１３ｔｔｌｌと
緩衝液（６０ｍＭＣａＣｎ２．６０ｍＭＭｇＣｆｆ ２
，３ＭＮａ Ｃ７！、１００ｍＭＴｒ ｉ ｓ−ＨＣ１
２（ｐＨ８，１） 、、 ５ ｍ Ｍ ＩＦ、 Ｄ
Ｔ Ａ ） ５ ＩＩＩを混合した後、０．５単位のエ
キソヌクレアーセＢＡ Ｌ ３ ］ （Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え。 ３０℃で３分間反応させた。この反応により。 （１１！ａＩ末端から両方向に１〜３０ｂｐＤＮＡ鎖が
削られた。反応をフェノール抽出によって停止させ、続
いてクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行った。沈殿
したＤＮＡ断片を全量２０μρの１００ｍＭＴｒ ｉ
５−ＨＣｊｌ！ （ｐ Ｈ７，５） 、 ５０（８
） ｍＭＮａＣｆｌ、７ｍＭＭｇＣｎ２．６ｍＭ２−メルカ
プトエタノールに溶解し、続いて８単位のＥｃｏＲＴ
（宝酒造社製）を加え、３７℃、２時間反応さゼた。 ＥｃｏＲＩによる消化後、低融点アガロースゲル電気泳
動により、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約５．１Ｋｂ
）を精製した。 このようにして得たＩＦＮ−β遺伝子を含む約５、 Ｉ
Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約１５０ｎｇ）と実施例２で調
製したｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコド
ンを有する約１３０ｂｐのＤＮＡ断片（約４．０ｎｇ）
を、２０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩＶ（ｐＨ７，６）、
Ｉ ＱｍＭＭｇ（１！２．１０ｍＭシヂオスレイト−ル
、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μβの反応液中で、
１．ｔｌｔ位の７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加
え、４℃で２０時間結合反応を行った。 このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用い
、大腸菌Ｈ８１０１株を常法により形質転換し、得られ
た八ｐ ＲＴ ＣＳ の形質転換株が持つプラスミドＤ
ＮＡを常法により分離４ｈ製し、第１０図に示したｐＦ
Ｍ−９を得た。 ｐＦＭ−９の構造は制限酵素ＲｃｏＲＩ、Ｘｈ。 １、Ｐ ｓ ｔ １．Ｂａｍ１−（ＩおよびＣ１ａＩに
よって消化後、アガロースゲル電気泳動により確認しく
９） た。 組換えプラスミドｐＦＭ−９を持つ大腸菌８８１０１株
をＩＦＭ−９と命名し、インターフェロン生産性を実施
例２と同様に調べたところ、８×１０７単位／７！のイ
ンターフェロンを生産していた。この菌株は、工業技術
院微生物工業技術研究所に Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｔ ＦＭ −９Ｆ ＢＲＭ Ｐ−６８８
３として寄託されている。この菌株が保持する組換えプ
ラスミドをｐＦＭ−９と呼ぶ。 上記したｐＦＪ１２３の造成工程を第１０図に図示する
。 次に、大腸菌ＩＦＮ−９が保持するプラスミドｐＦ’Ｍ
−９のＳＤ配列とＡＴＧ周辺の塩基配列をマキサム・ギ
ルバートの方法で調べたところ。 ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＩ夏羽ＧＡＴＴＣ
Ｄ という結果を得、ｐＦＭ−９はＮ末端のＭｅｔの次から
５個のアミノ酸（Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ ）を欠失したＩＦＮ−βをコードする遺伝子を含
むことが判明した。」 （２） 明細書第２５頁最下行の後に次の記載を加入
する。 １１ｄｌ ２個以上のｔｒｐプロモーターの連結次に
さらに強いプロモーター活すノ１を有するプラスミドベ
クターの造成を目指して、ｔｒｐプロモーターを２１１
Ｍ連結することを試みた。すなわち、第１１図（Ａ）に
示したように前項ｆｃｌでのべたｔｒｐプロモーターを
含む約３４０ｂｐのＤＮＡ断片をＣｎａＴとＨｉ ｎ
ｄ ＩＩＴで消化したｐＫＹＰ−１０に挿入し、ｐＫＹ
Ｐ−１１を得た。同様の方法でｔｒｐプロモーター３個
を同一方向に連結したｐＫＹＰ−１２（第１１図（Ｂ）
〕 も造成し、ＥｃｏＲＩ、Ｃｊ！ａｌ。 ＨｉｎｄｌｌＴ、Ｈｐａ Ｉで消化し構造を確認した。 」（３） 明１ａ＠第３０頁１行目の後に次の参考例
３を加入する。 「参考例３゜ ｒ＋ＬＢ−３の造成： ｐＴｕｌＦＮβ−５（ΔＴＣＣ３１８７９から常法によ
り分離する）を）（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化後ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ″ＩＬ製）で処理した後結合反応を行い第１２
図に示したｐＴｕ Ｉ ＦＮβ１１−５を得た。ｐ Ｔ
ｕ Ｉ Ｆ Ｎ Ｉｊ Ｈ−５よりβＩＦＮ遺伝了を
切り出し、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＫ
ＹＰ−１２にクローン化した。すなわち、 ｐ ＫＹ
Ｐ’−１２ＤＮＡ２１１ｇに制限酵素Ｃ７！ａｌを４単
位加え、１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩＶ、（ｐＨ７，
５）、６ｍＭＭｇＣｌ１２゜５ｍＭジチオスレイト−ル
（以下Ｃρａバッファーとよぶ）中（全ｍ３０Ｉ！Ａ）
−（’、３７°ｃ、 ２時間反応さ七た後、ＮａＣβ
を最終１度１００ｍＭになるように加えてさらに３７°
Ｃで２時間反応を続けた。次いで６５°Ｃで５分間加熱
して酵素を失活させ、低融点アガロース・ゲル電気泳動
法で約５ Ｋ ｂのｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断
片を精製し、１．２μｇを得た。次にｐＴｕｌＦＮβ■
１−５ ＤＮＡ１５μｇを上と同様に制限酵素Ｃβａ
ＩとＢ ａ ｍ ＨＩで消化し、低融点アガロース・ケ
ル電気泳動法で精製し、β−■ＦＮ遺伝子を含むＤＮＡ
断片（１，ＩＫｂ）約１μｇを得た。１以上のようにし
て得られる２個のＤＮＡ断片（第１２図の５ Ｋ ｂと
１．ＩＫｂ）を２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１（ｐ
Ｈ７，５）、６ｍＭＭｇＣ＃２．５ｍＭシオチスレイト
−ル、５００．＋ＩＭＡＴＰにとかし、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーセ４単位を加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った
。得られたくみかえ体プラスミドの混合物を用いて、常
法通り、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し Ａ ｐ Ｒの
コロニーを得た。このコロニーの培養液よりプラスミド
を分離し、第１２図に示したｐ Ｌ Ｅ −３を得た。 ｐ Ｉ−Ｅ −３の構造はＣｊ２ａ Ｉ、ＥｃｏＲｌ、
Ｈ４ｎｄｌＴｌ、ＢａｍＨＴで消化後、アガロース・ゲ
ル電気泳動により確認（１２） Ｇ）から開始コドン（ＡＴＧ）までの塩基配列はｒＡＡ
ＧＧＧＴＡＴｃＧＡＴＧＪであることをマキサム・ギル
バートの方法（Ａ８Ｍ、Ｍａｘａｍら：Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ第７４巻、５６０頁 （
１９７７） ）で確認した。 ｐ Ｌ Ｅ −３を含む大腸菌菌株はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃ、ｏｌｉ Ｔ Ｌ Ｅ −３ΔＴＣ
Ｃ３９０１０として寄託されている。」 （４）明細書部３１頁７行目の後に次の記載を加入する
。 ［第９図は、ｐＦＪ−１２３の造成工程を示す。 第１０図は、ｐＦＭ−９の造成工程を示す。 第１１図（Ａ）は、ｐＫＹ−１１の造成工程を示す。 （Ｂ）は、ｐＫＹＰ−１２の構造を示す。 第１２図は、ｐＬＥ−３の造成工程を示す。」（５）明
細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 （６）明細書に第９〜１２図を加入する。 ６、添付書類の目録 図 面 １通 受託証 １通 （１３） 特許請求の範囲 （１） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクター。 （２）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （３）制限酵素が５ｐｈＴ、ＥｃｏＲＶ、Ｋｐｎｌまた
は５ａＣＩであることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の発現ベクター。 （４） プロモーターが原核細胞由来のプロモーター
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発
現ベクター。 （５） プロモーターがｔｒｐ系、ｌａｃ系およびλ
フアージ系の大腸菌プロモーターまたは枯草菌プロモー
ターであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
の発現ベクター。 （６） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （７） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクターを制限酵素で切断ｔＬ 生した３′−突
出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏｗ断片
）またはＴ ４． Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼを用いて平
坦末端に変え、外来遺伝子を該平坦末端に組込んだ組換
え体で宿主微生物を形質転換し、得られる形質転換株を
培養することにより該り１来遺伝子を発現させる方法。 （８） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残ず制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクターを制限酵素で切断後、住した３′−突出
末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランス
フェラーゼを用いてホモ・ポリマー・ブロックを付加し
。 これと相補的なホモ・ポリマー・ブロックを付加した外
来遺伝子を組込んだ組換え体で宿主微生物を形質転換し
、得られる形質転換株を培養することにより該外来遺伝
子を発現させる方法。 （９）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲第７または８項記載の方法。 ００）制限酵素が５ｐｈＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＴまた
は５ａｃｌであることを特徴とする特許請求の範囲第７
または８項記載の方法。 （１１〕 プロモーターが原核細胞由来のプロモータ
ーであることを特徴とする特許請求の範囲第７または８
項記載の方法。 ＯＤ プロモーターがｔｒｐ系、ｐａｃ系およびλフ
アージ系の大腸菌プロモーターであることを特徴とする
特許請求の範囲第１１項記載の方法。 ０３） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第７または８項記載の方法。 ｒ１４） 特許請求の範ＩＩＩ］第１項記載の発現ベ
クターを含む微生物。 〔ＩＳ） エソシエリヒア・コリＩＴｒＳ−３゜（１
６）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３１−突出末
端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在する発
現ベクター。 （２）翻訳開始信号がＡＴＧｔたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （３）制限酵素がＳ、ｈＩ、 ＥｅＯＲＶ、 Ｋ、ｎＩ
ｔたはＳａ０■であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の発現ベクター。 （４）プロモーターが原核細胞由来のプロモーターであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発現ベ
クター。 （５）プロモーターがｔｒｐ系、 Ａｉａｃ系およびλ
フアージ系の大腸菌プロモーターまたは枯草菌プロモー
ターであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
の発現ベクター。 （６）プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （７）プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３Ｉ−突出末
端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在する発
現ベクターを制限酵素で切断後、生じた３１−突出末端
をＤＮＡポリメラーゼｌ （Ｋｌｅｎｏｗ断片）または
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平坦末端に変え、外
来遺伝子を該平坦末端に組込んだ組換え体で宿主微生物
を形質転換し、得られる形質転換株を培養することによ
り該外来遺伝子を発現させる方法。 （８）プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３１−突出末
端を切断形として残す制限酵累の認識配列が存在する発
現ベクターを制限酵素で切断彼、生じた３“−突出末端
にターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェ
ラーゼを用いてホモ・ポリマー・ブロックを付加し、こ
れと相補的なホモ・ポリマー・ブロックを付加した外来
遺伝子を組込んだ組換え体で宿主微生物を形質転換し、
得られる形質転換株を培養することにより該外来遺伝子
を発現させる方法。 （９）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲館７または８項記載の方法。 （１０）制限酵素が５ｐｈＩ＋ ＥｃｏＲＶ＋ Ｋｐｎ
Ｉ ！！たはＳ、、Ｉであることを特徴とする特許請求
の範囲第７またけ８項記載の方法。 （１１）プロモーターが原核細胞由来のプロモーターで
あることを特徴とする特許請求の範囲第７′−または８
項記載の方法。 （１２）プロモーターがｔｒｐ系、 ｌａｃ系およびλ
フアージ系の大腸菌プロモーターであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 Ｑ３） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第７または８項記載の方法。 （１４）特許請求の範囲第１項記載の発現ベクターを含
む微生物。 （１５１エッシエリヒア・コリ ＩＴｒＳ−３。
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57177192A JPS5967297A (ja) | 1982-10-08 | 1982-10-08 | 新規ベクタ− |
| AU19421/83A AU575301B2 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
| EP83902695A EP0121569B1 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
| AT83902695T ATE55781T1 (de) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Neuer vektor. |
| DE8383902695T DE3381830D1 (de) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Neuer vektor. |
| DE1983902695 DE121569T1 (de) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Neuer vektor. |
| PCT/JP1983/000276 WO1984001583A1 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
| DE19833336586 DE3336586A1 (de) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Neuer expressionsvektor |
| IL69926A IL69926A (en) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Plasmid expression vector with insertion site for structural gene and processes for the production thereof |
| IT68033/83A IT1160124B (it) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Vettore di espressione di plasmidi relativo procedimento per l'espressione di un gene estraneo e relativi microorganismi |
| ES526324A ES526324A0 (es) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Un procedimiento para la expresion de un gen extrano. |
| DK280084A DK280084D0 (da) | 1982-10-08 | 1984-06-07 | Hidtil ukendt vektor |
| NO842296A NO842296L (no) | 1982-10-08 | 1984-06-07 | Ny vektor |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57177192A JPS5967297A (ja) | 1982-10-08 | 1982-10-08 | 新規ベクタ− |
| PCT/JP1983/000276 WO1984001583A1 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5967297A true JPS5967297A (ja) | 1984-04-16 |
Family
ID=16026782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57177192A Pending JPS5967297A (ja) | 1982-10-08 | 1982-10-08 | 新規ベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5967297A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62502657A (ja) * | 1985-04-03 | 1987-10-15 | ノルデイスク・ゲントフテ・エ−・エス | Ｄｎａ配列体 |
-
1982
- 1982-10-08 JP JP57177192A patent/JPS5967297A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62502657A (ja) * | 1985-04-03 | 1987-10-15 | ノルデイスク・ゲントフテ・エ−・エス | Ｄｎａ配列体 |
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