JPS59140883A - 新規ベクタ− - Google Patents
新規ベクタ−Info
- Publication number
- JPS59140883A JPS59140883A JP58012282A JP1228283A JPS59140883A JP S59140883 A JPS59140883 A JP S59140883A JP 58012282 A JP58012282 A JP 58012282A JP 1228283 A JP1228283 A JP 1228283A JP S59140883 A JPS59140883 A JP S59140883A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- translation initiation
- initiation signal
- expression vector
- restriction enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規プラスミド発現ベクター、その製法およ
び利用に関する。
び利用に関する。
更に詳細には、本発明は転写開始及び翻訳開始に必要な
遺伝情報と翻訳開始信号（ＡＴ、、（）また、はＧ、Ｔ
Ｇ）を含むベクターであって、かつポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ断片を絹み込み、該ポリペプチドを効率よ
く発現させるために好適な発現ベクターおよびその製法
ならびにその利用に関する。
遺伝情報と翻訳開始信号（ＡＴ、、（）また、はＧ、Ｔ
Ｇ）を含むベクターであって、かつポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ断片を絹み込み、該ポリペプチドを効率よ
く発現させるために好適な発現ベクターおよびその製法
ならびにその利用に関する。
近年、遺伝子組換えに関する研究・技術が発達し、その
産業への応用が可能となっており、外来遺伝子を 以下余白 プラスミドベクター上にいかにして組込み、どのように
して効率よく宿主細胞内で外来遺伝子上にコードされた
ポリペプチドを合成させるかは重要な開発課題である。
産業への応用が可能となっており、外来遺伝子を 以下余白 プラスミドベクター上にいかにして組込み、どのように
して効率よく宿主細胞内で外来遺伝子上にコードされた
ポリペプチドを合成させるかは重要な開発課題である。
宿主細胞、とくに大＠菌において外来遺伝子を効率よく
発現させるために、□これまで種々の工夫がなされてい
る。
発現させるために、□これまで種々の工夫がなされてい
る。
まず転写の効率□を尻めるために、転写開始に必要な遺
伝情報であるプロモーターとしてＪａｃ系。
伝情報であるプロモーターとしてＪａｃ系。
ｔｒｐ系などが使用され、また翻訳過程の効率を高返る
賃めに、リポソーム結合部位と翻訳開始信号（主にＡＴ
Ｇ）との距離を調節した組換え体が造成されている。
賃めに、リポソーム結合部位と翻訳開始信号（主にＡＴ
Ｇ）との距離を調節した組換え体が造成されている。
後者の例では、外来遺伝子をプロモーターの下流に翻訳
開始の遺伝暗号であるＡＴＧを付与して組込むための中
継ぎ役としての特殊な「合成りＮＡＪの使用、ＤＮＡポ
リメラーゼｉ、Ｓｌヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１ヌクレ
アーゼなどのＤＮＡ修飾酵素の使用、あるいは特定の塩
基配列をｉつ［合成りＮＡｊの使用などにより、リポソ
ーム結合部位と翻訳開始信号と）間の距離を調節する必
要があり不便である。
開始の遺伝暗号であるＡＴＧを付与して組込むための中
継ぎ役としての特殊な「合成りＮＡＪの使用、ＤＮＡポ
リメラーゼｉ、Ｓｌヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１ヌクレ
アーゼなどのＤＮＡ修飾酵素の使用、あるいは特定の塩
基配列をｉつ［合成りＮＡｊの使用などにより、リポソ
ーム結合部位と翻訳開始信号と）間の距離を調節する必
要があり不便である。
本発明者らは既知のプラスミドベクターが持つかかる難
点を改善するため、プロモーターＳＤの下流（適当な部
位）にＡＴＧを有し、かつ該ＡＴＧを残す形で切断可能
なプラスミドベクターを開発し本発明を完成するに至っ
た。
点を改善するため、プロモーターＳＤの下流（適当な部
位）にＡＴＧを有し、かつ該ＡＴＧを残す形で切断可能
なプラスミドベクターを開発し本発明を完成するに至っ
た。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明の発現ベクターは転写開始に必要な遺伝情報であ
るプロモーター、翻訳開始に必要な遺伝情報であるリポ
ソーム結合部位■■■−−シャイン・ダルガーノ配列と
もよばれる、以下ＳＤ配列と略記する）の下流、適切な
距離に位置する翻訳開始信号（ＡＴＧまたはＧＴＧ）を
含み、さらにこの翻訳開始信号に続いて３“−突出末端
（３”−ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ ｅｎｄ）を切断形とし
て残す制限酵素（８ｐｈｌ ＋ ＥｃｏＲ’／ｙ Ｋｐ
ｎＩ Ｉ Ｓａｃ Ｉなど）の認識配列が存在する発現
ベクターである。
るプロモーター、翻訳開始に必要な遺伝情報であるリポ
ソーム結合部位■■■−−シャイン・ダルガーノ配列と
もよばれる、以下ＳＤ配列と略記する）の下流、適切な
距離に位置する翻訳開始信号（ＡＴＧまたはＧＴＧ）を
含み、さらにこの翻訳開始信号に続いて３“−突出末端
（３”−ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ ｅｎｄ）を切断形とし
て残す制限酵素（８ｐｈｌ ＋ ＥｃｏＲ’／ｙ Ｋｐ
ｎＩ Ｉ Ｓａｃ Ｉなど）の認識配列が存在する発現
ベクターである。
本発明発現ベクターのプロモーターとしてはプロモータ
ー活性を有するものであればいずれも用いることができ
るが、好適にはたとえば２クトースオベロンのプロモー
ター、トＩ７７’）ファンオペロンのプロモーター、ア
ルカリフォスファターゼオペロンのプロモーターなどが
利用できる。翻訳開始信号としてはＡＴＧまたはＧＴＧ
があげられる。ＳＤ配列と翻訳開始信号の間の距離が２
〜２０塩基（ｂｐ）のときに翻訳が可能である。
ー活性を有するものであればいずれも用いることができ
るが、好適にはたとえば２クトースオベロンのプロモー
ター、トＩ７７’）ファンオペロンのプロモーター、ア
ルカリフォスファターゼオペロンのプロモーターなどが
利用できる。翻訳開始信号としてはＡＴＧまたはＧＴＧ
があげられる。ＳＤ配列と翻訳開始信号の間の距離が２
〜２０塩基（ｂｐ）のときに翻訳が可能である。
翻訳開始信号に続いて３′−突出末端を切断形として残
す制限酵素の認識配列とは、たとえば、翻訳開始信号Ａ
ＴＧとｓｐｈ Ｉの認識配列が重複したＡＴＧＣＡＴＧ
Ｃ，ＡＴＧとＥｃｏＲＶの認識配列が重複したＡＴＧＡ
ＴＡＴＣ，ＡＴＧとＫｐｎＩの認識配列が重複したＡＴ
ＧＧＴＡＣＣ，ＡＴＧとＢａｃＩの認識配列が重複した
ＡＴＧＡＧＣ’ｒＣなどがあげられる。
す制限酵素の認識配列とは、たとえば、翻訳開始信号Ａ
ＴＧとｓｐｈ Ｉの認識配列が重複したＡＴＧＣＡＴＧ
Ｃ，ＡＴＧとＥｃｏＲＶの認識配列が重複したＡＴＧＡ
ＴＡＴＣ，ＡＴＧとＫｐｎＩの認識配列が重複したＡＴ
ＧＧＴＡＣＣ，ＡＴＧとＢａｃＩの認識配列が重複した
ＡＴＧＡＧＣ’ｒＣなどがあげられる。
上述の構、造をもつベクターの一例として、翻訳開始信
号Ａ、Ｔ Ｇと５ｐｈＩ切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が重
複したものについて、プロモーターおよびＳＤ配列周辺
の構造を模式化したものを第１図に示し、さらに制限酵
素の認識部位が翻訳開始信号ＡＴＧと重複させることが
可能な上記の制限酵素の切断形を第２岬に示す。
号Ａ、Ｔ Ｇと５ｐｈＩ切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が重
複したものについて、プロモーターおよびＳＤ配列周辺
の構造を模式化したものを第１図に示し、さらに制限酵
素の認識部位が翻訳開始信号ＡＴＧと重複させることが
可能な上記の制限酵素の切断形を第２岬に示す。
以下本発明に述べたようなプラスミドベクターが造成で
きることを、大腸菌のトリプトファン・プロモーターの
場合を例にとって詳しく説明する。
きることを、大腸菌のトリプトファン・プロモーターの
場合を例にとって詳しく説明する。
本発明に関わる転写開始および翻訳開始に必要な遺伝情
報は原核細胞白米のものに限定されるものでなく、酵母
や高等動物などの真核細胞由来のものにも適用できるも
のであるが、以下の記述はわかりやすくするため、原核
細胞生物のうち転写・翻訳の機構が詳細に解明されてい
る生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ：ｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ）の場合を中心に述べる。
報は原核細胞白米のものに限定されるものでなく、酵母
や高等動物などの真核細胞由来のものにも適用できるも
のであるが、以下の記述はわかりやすくするため、原核
細胞生物のうち転写・翻訳の機構が詳細に解明されてい
る生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ：ｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ）の場合を中心に述べる。
ｔｒｐプロモーターを含むＩ）ＮＡの供給源として、ｔ
ｒｐポータプル・プロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹ
Ｐ １０ （特願昭５ａ−２１３１９３）から訪導され
るｐＫＹＰ １００を用いる（ｐＫＹＰＩＯおよび、Ｋ
ＹＰｌｏｏの製造法は参考例１および２を参照）。 Ｋ
ＹＰ１００８（第６図中の番号を示す、以下同じ）をｔ
ｒｐＬ遺伝子のＳＤ配列のすぐ下流に存在するＣ１ａ（
部位で切断し、〔第６図参照〕次にｐＫＹＰ１００ω２
トラサイクリン耐性遺伝子内に□存在するｓｐｈ １部
位士切断した後、大きいシラスミドＤＮＡ断片１をアガ
ロース・ゲル電気泳動法によって精製する。一方、この
ＤＮＡ断片との連結が容易な構造を有し、しかもＳＤ配
列の下流、□適切な距離を置いて翻訳開始信号（ＡＴＧ
またはＧＴＧ）が存在し、さらにこの翻訳開始信号に続
いて、３′−突出末端を切断形として残す制限酵素の認
識配列が存在するような２種のオリゴヌクレオチド（両
者は互いに再結合しうるような相補的な塩基配列を有す
る）赳を合成し、上で精製したプラスミドＤＮＡ断片と
連結させ、目的の発現ベクタ一旦を得る。
ｒｐポータプル・プロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹ
Ｐ １０ （特願昭５ａ−２１３１９３）から訪導され
るｐＫＹＰ １００を用いる（ｐＫＹＰＩＯおよび、Ｋ
ＹＰｌｏｏの製造法は参考例１および２を参照）。 Ｋ
ＹＰ１００８（第６図中の番号を示す、以下同じ）をｔ
ｒｐＬ遺伝子のＳＤ配列のすぐ下流に存在するＣ１ａ（
部位で切断し、〔第６図参照〕次にｐＫＹＰ１００ω２
トラサイクリン耐性遺伝子内に□存在するｓｐｈ １部
位士切断した後、大きいシラスミドＤＮＡ断片１をアガ
ロース・ゲル電気泳動法によって精製する。一方、この
ＤＮＡ断片との連結が容易な構造を有し、しかもＳＤ配
列の下流、□適切な距離を置いて翻訳開始信号（ＡＴＧ
またはＧＴＧ）が存在し、さらにこの翻訳開始信号に続
いて、３′−突出末端を切断形として残す制限酵素の認
識配列が存在するような２種のオリゴヌクレオチド（両
者は互いに再結合しうるような相補的な塩基配列を有す
る）赳を合成し、上で精製したプラスミドＤＮＡ断片と
連結させ、目的の発現ベクタ一旦を得る。
上記組換えプラ□スミド作成に必要な反応の条件は次の
とおりである。
とおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化は通常０．１〜１００μ２
のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好まし
くはｐＨ７，０〜８．０）、１〜１５０ミリモルのＮａ
Ｃ１，２〜２０ミリモル（好ましくは５〜ｌＯミリそル
）のＭｇＣ１ｘ中で制限酵素０．１〜３００単位（好ま
しくは１・μＶのＤＮＡに対し１〜３単位の酵素）を用
い、１８〜４２℃（好ましくは３２〜３８℃）において
、１５分〜２４時間消化反応を行う。反応の停止は通常
５５〜７５℃（好ましくは６３〜７０℃）で５〜３０分
間加熱することによるが、フェノールやジエチルピロカ
ーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法
も用いることができる。合成オリゴヌクレオチドはリン
酸ジエチル法［Ｈ，Ｇ。
のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好まし
くはｐＨ７，０〜８．０）、１〜１５０ミリモルのＮａ
Ｃ１，２〜２０ミリモル（好ましくは５〜ｌＯミリそル
）のＭｇＣ１ｘ中で制限酵素０．１〜３００単位（好ま
しくは１・μＶのＤＮＡに対し１〜３単位の酵素）を用
い、１８〜４２℃（好ましくは３２〜３８℃）において
、１５分〜２４時間消化反応を行う。反応の停止は通常
５５〜７５℃（好ましくは６３〜７０℃）で５〜３０分
間加熱することによるが、フェノールやジエチルピロカ
ーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法
も用いることができる。合成オリゴヌクレオチドはリン
酸ジエチル法［Ｈ，Ｇ。
Ｋｈｏｒａｎａ ｅｔ ａ／、 ： Ｊ Ｍｏ４ Ｂｉ
ｏ私７２巻、２０９頁（１９７２年）〕、リン酸トリエ
ステル法（Ｒ，Ｃｒｅａ ｅｔ ＠亙： Ｐｒｏ、 Ｎ
ａｔＪ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 Ｑ Ｓ、へ′７５巻
＊５７６−５頁（１９７８年）〕、あるいはホスファイ
ト法［ｇ Ｑ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｇ３ ＆！、：
’Ｊ、 Ａｍ。
ｏ私７２巻、２０９頁（１９７２年）〕、リン酸トリエ
ステル法（Ｒ，Ｃｒｅａ ｅｔ ＠亙： Ｐｒｏ、 Ｎ
ａｔＪ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 Ｑ Ｓ、へ′７５巻
＊５７６−５頁（１９７８年）〕、あるいはホスファイ
ト法［ｇ Ｑ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｇ３ ＆！、：
’Ｊ、 Ａｍ。
’ Ｃｈｅｍ、 ８ｏｃ、 １０３巻、３讐８５頁（１
９８１年）〕などによって合成することができる。
９８１年）〕などによって合成することができる。
合成したオリゴヌクレオチドをリン酸化するには、２〜
２００ミリモル（好ましくは１０〜７０ミリモル）のト
リス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好ましくはｐＨ７，０
〜８．０）、３〜２０ミリモル（好１ Ｌ＜ｕ４〜ｌ
Ｏミリモル）のに／ｉｇｃｌ ｚ −１〜ｌＯミリモル
のジチオスレイトール中でＴ４ポリヌクレオチド・キナ
ーゼ０．１〜１００単位を用い、２０〜４０℃（好まし
くは３５〜３８℃）で、゛５分間から２時間の反応を行
う。ＤＮＡ断片を結合させる場合は２〜２００ミリモル
（好ましくは１０〜７′０オリモル）のトリス塩酸（ｐ
Ｈ６，０〜９．５、ｐＨ７，０〜８．０）、２〜２０ミ
リモル（好ましくは５〜ｌＯミリモル）のＭｇＣ１ｚ、
０．１〜ｌＯミリモル（好ましくはα５〜２ミリモル）
のＡＴＰ、１〜５０ミリモル（好ましくは５〜ｌＯミリ
モル）のジチオスレイトール中でＴ４ Ｄ Ｎ Ａリガ
ーゼ０．１〜１０単位を用いて１〜３７℃（好ましくは
３〜２０℃）で１５分〜７２時間（好ましくは２〜２０
時間）結合反応を行う。 。
２００ミリモル（好ましくは１０〜７０ミリモル）のト
リス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、好ましくはｐＨ７，０
〜８．０）、３〜２０ミリモル（好１ Ｌ＜ｕ４〜ｌ
Ｏミリモル）のに／ｉｇｃｌ ｚ −１〜ｌＯミリモル
のジチオスレイトール中でＴ４ポリヌクレオチド・キナ
ーゼ０．１〜１００単位を用い、２０〜４０℃（好まし
くは３５〜３８℃）で、゛５分間から２時間の反応を行
う。ＤＮＡ断片を結合させる場合は２〜２００ミリモル
（好ましくは１０〜７′０オリモル）のトリス塩酸（ｐ
Ｈ６，０〜９．５、ｐＨ７，０〜８．０）、２〜２０ミ
リモル（好ましくは５〜ｌＯミリモル）のＭｇＣ１ｚ、
０．１〜ｌＯミリモル（好ましくはα５〜２ミリモル）
のＡＴＰ、１〜５０ミリモル（好ましくは５〜ｌＯミリ
モル）のジチオスレイトール中でＴ４ Ｄ Ｎ Ａリガ
ーゼ０．１〜１０単位を用いて１〜３７℃（好ましくは
３〜２０℃）で１５分〜７２時間（好ましくは２〜２０
時間）結合反応を行う。 。
以上のような方法で±発明に述べたようなプラスミー゛
発現ベクターｔ−ａｌＩ造するこ、とができ、、る・ま
た、上述の製造法でｐＩｉＱ’Ｐ１００をＣ１ａ、（で
切断する代わりに、Ｃ１ｍ１部位のすぐ下流に存、在す
るＨｉ ｎｄ １部倍で切断し、・次にＳｐｈ Ｉで切
断した後、合成ヌクレオチドを挿入することも可能であ
る。 また、翻訳開始信号と重複して存在す５ａｃｌ
： ＧＡＧＣＴＣ）などを用いる場合には、この認識配
列を完全に含むような塩基配列を持つ２種のオリゴヌク
レオチドを合成し、ｐＫＹＰｌｏｏのＣｌａｉ部位ある
いはＨｉｎｄ１部位とＢ ａｍｐ： １部位あるいはＳ
ａＪｍ位の間に挿入すればよい。
発現ベクターｔ−ａｌＩ造するこ、とができ、、る・ま
た、上述の製造法でｐＩｉＱ’Ｐ１００をＣ１ａ、（で
切断する代わりに、Ｃ１ｍ１部位のすぐ下流に存、在す
るＨｉ ｎｄ １部倍で切断し、・次にＳｐｈ Ｉで切
断した後、合成ヌクレオチドを挿入することも可能であ
る。 また、翻訳開始信号と重複して存在す５ａｃｌ
： ＧＡＧＣＴＣ）などを用いる場合には、この認識配
列を完全に含むような塩基配列を持つ２種のオリゴヌク
レオチドを合成し、ｐＫＹＰｌｏｏのＣｌａｉ部位ある
いはＨｉｎｄ１部位とＢ ａｍｐ： １部位あるいはＳ
ａＪｍ位の間に挿入すればよい。
ｐＫＹＰ １００ ＦｉｐｌＱ’Ｐ １０の誘導体であ
る。ＰＫＹＰ ｎは特願昭５６−２１３１９３に開示さ
れたｔｒｐプ四モーター含有プラスミドである。ＰＫＹ
Ｐ ｉ 。
る。ＰＫＹＰ ｎは特願昭５６−２１３１９３に開示さ
れたｔｒｐプ四モーター含有プラスミドである。ＰＫＹ
Ｐ ｉ 。
からｐＫＹＰ １００の造成方法は次のとおり行々う。
第５図に示すようにまず、プラスミドｐＫＹＰＩＯ１１
Ｈｈａｉで消化゛した後、ｔｒｐプロモーターを含むゲ
ル電気泳動法により精製する。このＤＮＡ断片遣に大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ”Ｋｌｅｎｏｗ断片を作用させ
て、ＨｈａＩ消化によって生じた３−突出末端を削り、
平坦末端に変えた後、Ｈｌｎｄｌで消化し、ｔｒｐプロ
モーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片且をポリアク
リルアミド電気泳動法によりｔ＃製する。一方、プラス
ミドｐＢＲ３２２旦をＥｃ ｏＲＩで消化した後、大腸
菌゛ＤＮＡポリメラーゼＩの修復合成反応を利用して、
ＥｃｏＲＩ消化によって生じた粘着末端（Ｓｔｉｃｋｙ
ｅｎｄ）を平坦末端にする。次にＨｉｎｄｌで消化後
、大きいプラスミドＤＮＡ断片６′ｔ−低融点アガロー
スゲル電気泳動法により精製する。次に、精製したＤＮ
Ａ断片断片上び互と５！−リン酸化され九Ｘｈｏ ｌ
ＩＪ ｙカー（ｐｃｃＴｃＧＡＧＧ）４をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＩＱ’Ｐ １００
７を得る。
Ｈｈａｉで消化゛した後、ｔｒｐプロモーターを含むゲ
ル電気泳動法により精製する。このＤＮＡ断片遣に大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ”Ｋｌｅｎｏｗ断片を作用させ
て、ＨｈａＩ消化によって生じた３−突出末端を削り、
平坦末端に変えた後、Ｈｌｎｄｌで消化し、ｔｒｐプロ
モーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片且をポリアク
リルアミド電気泳動法によりｔ＃製する。一方、プラス
ミドｐＢＲ３２２旦をＥｃ ｏＲＩで消化した後、大腸
菌゛ＤＮＡポリメラーゼＩの修復合成反応を利用して、
ＥｃｏＲＩ消化によって生じた粘着末端（Ｓｔｉｃｋｙ
ｅｎｄ）を平坦末端にする。次にＨｉｎｄｌで消化後
、大きいプラスミドＤＮＡ断片６′ｔ−低融点アガロー
スゲル電気泳動法により精製する。次に、精製したＤＮ
Ａ断片断片上び互と５！−リン酸化され九Ｘｈｏ ｌ
ＩＪ ｙカー（ｐｃｃＴｃＧＡＧＧ）４をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＩＱ’Ｐ １００
７を得る。
前記した本発明ベクターの製造法にお゛いては、ＳＤ配
列のすぐ下流に存在する制限酵素の切断部位を利用した
プラスミド発現ベクターの製造法について述べたが、こ
のような切断部位が存在しない場合で本目的の発現ベク
ターは製造できる。例えば、プロモーターの上流に存在
する制限酵素の切断部位を利用する場合にはプロモータ
ー、リポソーム結合部位、翻訳開始信号（ＡＴＧあるい
はＧＴＧ）の３者すべての塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドを合成し、ｐＢＲ３２２などのプラスミドベクタ
ーにクローン化すればよい。また、転写開始に必要な要
素であるプロモーターとして、大腸菌のトリプトファン
・プロモーターを用いたが、大腸菌のトリプトファン・
プロモーター以外の犬Ｈｊ狛のプロモーターを用いるこ
とができる。さらに外来遺伝子を発現させるべき細胞が
大腸菌以外の生物の細胞の場合は、その細胞個有のプロ
モーターを用いることができる。大腸菌以外の生物のプ
ロモーターを用いる場合、翻訳開始に必要な情報を含む
塩基配列を大腸菌のリポソーム結合部位に相当する塩基
配列と置きかえる必要がある。
列のすぐ下流に存在する制限酵素の切断部位を利用した
プラスミド発現ベクターの製造法について述べたが、こ
のような切断部位が存在しない場合で本目的の発現ベク
ターは製造できる。例えば、プロモーターの上流に存在
する制限酵素の切断部位を利用する場合にはプロモータ
ー、リポソーム結合部位、翻訳開始信号（ＡＴＧあるい
はＧＴＧ）の３者すべての塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドを合成し、ｐＢＲ３２２などのプラスミドベクタ
ーにクローン化すればよい。また、転写開始に必要な要
素であるプロモーターとして、大腸菌のトリプトファン
・プロモーターを用いたが、大腸菌のトリプトファン・
プロモーター以外の犬Ｈｊ狛のプロモーターを用いるこ
とができる。さらに外来遺伝子を発現させるべき細胞が
大腸菌以外の生物の細胞の場合は、その細胞個有のプロ
モーターを用いることができる。大腸菌以外の生物のプ
ロモーターを用いる場合、翻訳開始に必要な情報を含む
塩基配列を大腸菌のリポソーム結合部位に相当する塩基
配列と置きかえる必要がある。
上記のごとくして得られる発現ベクターは制限酵素（ｓ
ｐｈｌ ＊ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ、 Ｓａｃ Ｉなど
）で切断後、（１）生じた３°−突出末端をＤＮＡポリ
メ２−ゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断片のもつ３→５エキソヌク
レアーゼ活性を利用して削り、平坦末端にして、これに
外来遺伝子を組込むか（第３図参照）、（２）生じた３
１−突出末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル・
トランスフェラーゼを用いてホモ・ポリマーグロック（
ポリｄＡ、ポリｄＴ。
ｐｈｌ ＊ ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ、 Ｓａｃ Ｉなど
）で切断後、（１）生じた３°−突出末端をＤＮＡポリ
メ２−ゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断片のもつ３→５エキソヌク
レアーゼ活性を利用して削り、平坦末端にして、これに
外来遺伝子を組込むか（第３図参照）、（２）生じた３
１−突出末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル・
トランスフェラーゼを用いてホモ・ポリマーグロック（
ポリｄＡ、ポリｄＴ。
ボＩＪｄＧ、ボＩｊ ｄ Ｃ）を付加し、これと相補的
なホモ・ポリマーグロックを付加した外来遺伝子を組込
む（第４図参照）ことにより翻訳開始信号の直後に外来
遺伝子を連結できる。得られた組換え体を用いて宿↓微
生物を培養することにより外来遺伝子を極めて効率よく
発現させることができる。
なホモ・ポリマーグロックを付加した外来遺伝子を組込
む（第４図参照）ことにより翻訳開始信号の直後に外来
遺伝子を連結できる。得られた組換え体を用いて宿↓微
生物を培養することにより外来遺伝子を極めて効率よく
発現させることができる。
前述の説明は分子レベルで最も解明の進んでりる大腸菌
について記述したものであるが本発明は大腸菌に限定さ
れるものでなく、大腸菌以外の他の原核細胞あるいは酵
母や高等動物などの真核細胞などにも適用できるもので
ある。すなわち、翻訳開始信号の下流の構造はそのまま
にし、前述の大腸菌のプロモーターおよび大腸菌のリポ
ソーム結合部位の代わりに、枯草菌などの他の原核細胞
のものと置き換え、さらにその原核細胞内でプラスミド
ベクターが複製保持されるのに必要な遺伝情報を付与す
れば他の原核細胞に有効なプラスミド発現ベクターを構
築することが可能である。また、真核細胞の場合、その
転写・翻訳の機構は詳細には解明されていないが、大腸
伽のプロモーターの代わりに転写開始に必要な遺伝情報
と大腸菌のリポソーム結合部位の代わりに、翻訳開始に
必要な遺伝情報と置き換え、さらにその真核細胞内でグ
ラスミドベクターが保持・複製されるのに必要な遺伝情
報を付与すれば真核細胞に有効なプラスミド発現ベクタ
ーを構築することが可能である。
について記述したものであるが本発明は大腸菌に限定さ
れるものでなく、大腸菌以外の他の原核細胞あるいは酵
母や高等動物などの真核細胞などにも適用できるもので
ある。すなわち、翻訳開始信号の下流の構造はそのまま
にし、前述の大腸菌のプロモーターおよび大腸菌のリポ
ソーム結合部位の代わりに、枯草菌などの他の原核細胞
のものと置き換え、さらにその原核細胞内でプラスミド
ベクターが複製保持されるのに必要な遺伝情報を付与す
れば他の原核細胞に有効なプラスミド発現ベクターを構
築することが可能である。また、真核細胞の場合、その
転写・翻訳の機構は詳細には解明されていないが、大腸
伽のプロモーターの代わりに転写開始に必要な遺伝情報
と大腸菌のリポソーム結合部位の代わりに、翻訳開始に
必要な遺伝情報と置き換え、さらにその真核細胞内でグ
ラスミドベクターが保持・複製されるのに必要な遺伝情
報を付与すれば真核細胞に有効なプラスミド発現ベクタ
ーを構築することが可能である。
本発明のベクターの造成法およびその利用法について実
施例をあげて詳細に説明する。
施例をあげて詳細に説明する。
実施例１゜
ｔｒｐプロモーターおよびリポソーム結合部位の下流に
翻訳開始信号ＡＴＧおよび５ｐｈｌ切断部位を有するグ
ラスミドベクターｐＴｒｓ３の造成：参考例２で造成さ
れたｐＫＹＰ １００から次のようにしてｐＴｒｓａを
得る。５μ？のｐＫＹＰ１００８を１０ ｍＭＴｒｉ
５−１１１Ｊ （ｐＨ７，５）、 ７ｍＭ ｈ’１ｚｃ
ｌｘ 、 ６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む全量
２０μｌの反応液中で、５単位のＣ１ａｎ（ベーリンガ
ー・マ／ハイム社製→を加え、３７℃、２時間反応させ
た。次いで、６５℃、５分間の熱処理によって反応を停
止させた後、２μｌの１００ｍＭＴｒｉａ−ＨＣＪ （
ｐＨ７゜５）、７０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１．０Ｍ Ｎ
ａＣｌ、６０ｍＭ 、２−メルカプトエタノールと１６
μｌの蒸留水と７単位の５ｐｈｌ （ベーリンガー・
マンハイム社製）を加え、３７℃、２時間反応させた。
翻訳開始信号ＡＴＧおよび５ｐｈｌ切断部位を有するグ
ラスミドベクターｐＴｒｓ３の造成：参考例２で造成さ
れたｐＫＹＰ １００から次のようにしてｐＴｒｓａを
得る。５μ？のｐＫＹＰ１００８を１０ ｍＭＴｒｉ
５−１１１Ｊ （ｐＨ７，５）、 ７ｍＭ ｈ’１ｚｃ
ｌｘ 、 ６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む全量
２０μｌの反応液中で、５単位のＣ１ａｎ（ベーリンガ
ー・マ／ハイム社製→を加え、３７℃、２時間反応させ
た。次いで、６５℃、５分間の熱処理によって反応を停
止させた後、２μｌの１００ｍＭＴｒｉａ−ＨＣＪ （
ｐＨ７゜５）、７０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１．０Ｍ Ｎ
ａＣｌ、６０ｍＭ 、２−メルカプトエタノールと１６
μｌの蒸留水と７単位の５ｐｈｌ （ベーリンガー・
マンハイム社製）を加え、３７℃、２時間反応させた。
６５℃、５分間の熱処理によって反応を停止さメトリー
９８巻３０５頁（１９７９））により、大きいプラスミ
ドＤＮＡ断片上（約ａ、５２Ｋｂ）を精製した。次にま
ず２＠の１１けりゴヌクレオチド５’−ＣＧＡＴＡＡＧ
ＣＴＡＴＧＣＡＴＧ−３’および５’−ＣＡＴＡＧＣＴ
ＴＡＴ−３’をリン酸トリエステル法によって合成した
。これら；２種の合成オリゴヌクレオチドを５゛−リン
酸化した後に、それぞれの濃度が２０７’Ｍとなるよう
に、１０ ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）、１００ｍＭ Ｎａ（Ｖ 、 １ ｍｈｌ ＥＤＴＡ
中で混合し、６５℃に１０分間、３７℃に１２０分間、
ついで室温に１２０分間放置し、両者を対合させた。両
者を対合させると下図に示すように対合によってできた
２本鎖Ｄ Ｎ Ａのそれぞれの端が Ｃ１ａ ｌ消化あるいはｓｐｈ ｌ消化ｒよって生じる
粘着末端と連結でき、しかも連結後、Ｃ１ａ［切断部位
あるいは５ｐｈｌ切断部位が再形成される構造を持つ。
９８巻３０５頁（１９７９））により、大きいプラスミ
ドＤＮＡ断片上（約ａ、５２Ｋｂ）を精製した。次にま
ず２＠の１１けりゴヌクレオチド５’−ＣＧＡＴＡＡＧ
ＣＴＡＴＧＣＡＴＧ−３’および５’−ＣＡＴＡＧＣＴ
ＴＡＴ−３’をリン酸トリエステル法によって合成した
。これら；２種の合成オリゴヌクレオチドを５゛−リン
酸化した後に、それぞれの濃度が２０７’Ｍとなるよう
に、１０ ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）、１００ｍＭ Ｎａ（Ｖ 、 １ ｍｈｌ ＥＤＴＡ
中で混合し、６５℃に１０分間、３７℃に１２０分間、
ついで室温に１２０分間放置し、両者を対合させた。両
者を対合させると下図に示すように対合によってできた
２本鎖Ｄ Ｎ Ａのそれぞれの端が Ｃ１ａ ｌ消化あるいはｓｐｈ ｌ消化ｒよって生じる
粘着末端と連結でき、しかも連結後、Ｃ１ａ［切断部位
あるいは５ｐｈｌ切断部位が再形成される構造を持つ。
この２種の合成オリゴヌクレオチドを対合させたもの旦
に上記の精製したプラスミドＤＮＡ断片上を加え、両者
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い連結させた。すなわち、２
種の合成オリゴヌクレオチド、ｐＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡ
ＴＧＣＡＴＧおよびｐＣＡＴＡＧＣＴＴＡＴをそれぞれ
１ピコモルずつ対合させ、さらに約０．１５μ）の精製
したプラスミドＤＮＡ断片且を加え、２０ ｍＭ Ｔｒ
ｉ ｓ −ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇＣ１
２，１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ ｍＭ Ａ
Ｔ Ｐを含む全量２０μｌの反応液中で、０．５単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社い、大腸菌ＨＢＩＯＩ株
を形質転換し、得られるアンピシリン耐性、テトラサイ
クリン感受性（ＡｐＲＴｃ ｓ）の形質転換株が持つプ
ラスミドＤＮＡを分離精製した。これらのプラスミドＤ
ＮＡをＥｃｏＲ１＋ Ｘｈｏ（＋ Ｐｓｔｌ （以上全
酒造社製）、Ｃ１ａｌ、５ｐｈｌ （以上ベーリンガー
・マンハイム社製）などの制限酵素で消化することによ
り、目的のプラスミドベクターｐＴｒｓ３１１が造成さ
れたことを確認した。さらにｐＴｒＳ３のＣ１ａ １部
位からｓｐｈ １部位までのＤＮＡの塩基配列が ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣであることを
マキサム・ギルバートの方法（Ａ、 Ｍ、 Ｍａｘａｍ
ら： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
に上記の精製したプラスミドＤＮＡ断片上を加え、両者
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い連結させた。すなわち、２
種の合成オリゴヌクレオチド、ｐＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡ
ＴＧＣＡＴＧおよびｐＣＡＴＡＧＣＴＴＡＴをそれぞれ
１ピコモルずつ対合させ、さらに約０．１５μ）の精製
したプラスミドＤＮＡ断片且を加え、２０ ｍＭ Ｔｒ
ｉ ｓ −ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇＣ１
２，１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ ｍＭ Ａ
Ｔ Ｐを含む全量２０μｌの反応液中で、０．５単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社い、大腸菌ＨＢＩＯＩ株
を形質転換し、得られるアンピシリン耐性、テトラサイ
クリン感受性（ＡｐＲＴｃ ｓ）の形質転換株が持つプ
ラスミドＤＮＡを分離精製した。これらのプラスミドＤ
ＮＡをＥｃｏＲ１＋ Ｘｈｏ（＋ Ｐｓｔｌ （以上全
酒造社製）、Ｃ１ａｌ、５ｐｈｌ （以上ベーリンガー
・マンハイム社製）などの制限酵素で消化することによ
り、目的のプラスミドベクターｐＴｒｓ３１１が造成さ
れたことを確認した。さらにｐＴｒＳ３のＣ１ａ １部
位からｓｐｈ １部位までのＤＮＡの塩基配列が ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣであることを
マキサム・ギルバートの方法（Ａ、 Ｍ、 Ｍａｘａｍ
ら： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ第７４巻、５６０頁（１９，７７年
）〕を用い確認した。ｐＴｒＳ３を含む大腸菌菌株は工
業技術院微生物工業技術研究所にエツシエリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、 ｃｏ’ｌｉ ） ＩＴｒ
Ｓ−３ＦＥＲＭＰ−６７３５として寄託されている。
）〕を用い確認した。ｐＴｒＳ３を含む大腸菌菌株は工
業技術院微生物工業技術研究所にエツシエリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、 ｃｏ’ｌｉ ） ＩＴｒ
Ｓ−３ＦＥＲＭＰ−６７３５として寄託されている。
以下余白
実施例２゜
Ｎ末端に余分にメチオニンを付与したインターフェロン
−β（Ｉ ＦＮ−１？と略記する）誘導体の発現： 実施例】で造成した発現ベクターｐＴｒＳ−３を用い、
ＩＦＮ〜βのＮ末端のメチオニンの前にさらに一個のメ
チオニンを付与した１ＦＮ−β誘導体を発現する組換え
プラスミドを次のようにして得ノこ。
−β（Ｉ ＦＮ−１？と略記する）誘導体の発現： 実施例】で造成した発現ベクターｐＴｒＳ−３を用い、
ＩＦＮ〜βのＮ末端のメチオニンの前にさらに一個のメ
チオニンを付与した１ＦＮ−β誘導体を発現する組換え
プラスミドを次のようにして得ノこ。
ｌＯμｇのｐ ′ｒｒ Ｓ −３をｌ ＯｍＭ’「ｒ
ｉ ｓ −ＨＣｆｆ”’Ｃ’ｐ’ｌ１７．５）、５０ｍ
Ｍ ＮａＣ＃ 、７ｍＭＭｇ（１！ン、６ｒＸＩＭ２
−メルカプトエタノール含む全け４０μｌの反応液中で
．１０単位のＳｐｂｌ ＜−、−リンカ−・マンハイ
ム社製）を加え．３７°（：、２時間反応させた。反応
後，フェノールおよびりｌｌｌ ｌ：ｌ十ルム抽出とエ
タノール沈殿を行った。
ｉ ｓ −ＨＣｆｆ”’Ｃ’ｐ’ｌ１７．５）、５０ｍ
Ｍ ＮａＣ＃ 、７ｍＭＭｇ（１！ン、６ｒＸＩＭ２
−メルカプトエタノール含む全け４０μｌの反応液中で
．１０単位のＳｐｂｌ ＜−、−リンカ−・マンハイ
ム社製）を加え．３７°（：、２時間反応させた。反応
後，フェノールおよびりｌｌｌ ｌ：ｌ十ルム抽出とエ
タノール沈殿を行った。
沈殿した１）Ｎ入断片を全量４０μｐの５ ０ ｍ Ｍ
Ｔｒ ｉ’ｓ−ＩｉＣ！ （ｐＨ７、６） 、 ７ｍ
Ｍ ＭｇＣｆｆ２ 。
Ｔｒ ｉ’ｓ−ＩｉＣ！ （ｐＨ７、６） 、 ７ｍ
Ｍ ＭｇＣｆｆ２ 。
１０ｍＭ２：−メＪＬｔカブｌ−ｘタノール，０．２５
ｍＭｄΔＴｒ’．０．ｊ ５ｍＭｄＣＴＩ）、０．２
５ｒｒｔＭｄＧＴＰ．、０．２ ５ｍＭｄＴ’ｒＰに溶
解し，続いて４単位の大腸菌ＤＮＡ，Ｉでリメラーセト
Ｋｌｅｎｏｗ断片（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
社製）を加え，１５℃．２時間反応させた。反応後．フ
エノ−ルおよびクロロボルム抽出とエタノール沈殿を行
った。沈殿したＤＮＡ断片を全Ｍ３０ｔｔｌｌの１００
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）、５０ｍＭＮａ
Ｃｊ！、７ｍＭＭｇＣ７！２．６ｍＭ２−メルカプトエ
タノールに溶解し、続いて１６単位のＥｃｏＲＩ （
宝酒造社製）を加え、３７℃、２時間反応させた。Ｅｃ
ｏＲＩによる消化後、低融点アガロース・ゲル電気泳動
法により、小さいプラスミドＤＮＡ断片（約１３０ｂｐ
）を精製した。
ｍＭｄΔＴｒ’．０．ｊ ５ｍＭｄＣＴＩ）、０．２
５ｒｒｔＭｄＧＴＰ．、０．２ ５ｍＭｄＴ’ｒＰに溶
解し，続いて４単位の大腸菌ＤＮＡ，Ｉでリメラーセト
Ｋｌｅｎｏｗ断片（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
社製）を加え，１５℃．２時間反応させた。反応後．フ
エノ−ルおよびクロロボルム抽出とエタノール沈殿を行
った。沈殿したＤＮＡ断片を全Ｍ３０ｔｔｌｌの１００
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）、５０ｍＭＮａ
Ｃｊ！、７ｍＭＭｇＣ７！２．６ｍＭ２−メルカプトエ
タノールに溶解し、続いて１６単位のＥｃｏＲＩ （
宝酒造社製）を加え、３７℃、２時間反応させた。Ｅｃ
ｏＲＩによる消化後、低融点アガロース・ゲル電気泳動
法により、小さいプラスミドＤＮＡ断片（約１３０ｂｐ
）を精製した。
次にＩＦＮ−β遺伝子を有する組換え体プラスミドｐＬ
Ｅ−３の５％ｇを１０ｍＭ′Ｆｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ
（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣＡ’７．５ｍｐ４２−メ
ルカプトエタノールを含む全量３０μρの反応液中で、
１０単位のＣβａ＋（ヘーリンヵー・マンハイム社製）
を加え、３７℃、２時間反応させた。
Ｅ−３の５％ｇを１０ｍＭ′Ｆｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ
（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣＡ’７．５ｍｐ４２−メ
ルカプトエタノールを含む全量３０μρの反応液中で、
１０単位のＣβａ＋（ヘーリンヵー・マンハイム社製）
を加え、３７℃、２時間反応させた。
なお、ｐＬＥ−３のＣ１ａ ＋サイトの周辺の構造は次
のとおりである。
のとおりである。
Ｃｊ！ａｌ
ＳＤ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｙｒ反
応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール
沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量３０μｌの５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＣ７ｍＭＭｇＣｎ２゜１０ｍＭ２−メルカプト
エタノール、０．２５ｍＭｄＡ’ｒｒ’、０．２５ｍＭ
ｄ’ＴＴＰに溶解し、続いて１２単位の大腸菌ＤＮＡポ
リメラーセｌ （ＮｅｗＥｎｇｌｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓｕｉＭ）を加え、３７°Ｃて３０分間反応させた。
応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール
沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量３０μｌの５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＣ７ｍＭＭｇＣｎ２゜１０ｍＭ２−メルカプト
エタノール、０．２５ｍＭｄＡ’ｒｒ’、０．２５ｍＭ
ｄ’ＴＴＰに溶解し、続いて１２単位の大腸菌ＤＮＡポ
リメラーセｌ （ＮｅｗＥｎｇｌｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓｕｉＭ）を加え、３７°Ｃて３０分間反応させた。
この反応によって、Ｃｎａｌ消化によって生じた５′−
突出末端は吹に示すとおり、ＤＮＡポリメラーセｌの持
つ５′→３′エキソヌクレアーセ活性により削られ平坦
末端に変えられる。
突出末端は吹に示すとおり、ＤＮＡポリメラーセｌの持
つ５′→３′エキソヌクレアーセ活性により削られ平坦
末端に変えられる。
Ｃ７！ａｌ
′Ｉ゛△ ′１゛Δ
コノ反応ニＡｗ イテ、 ｄ Ａ ′ｒＰ 、 ｄ
Ｔ ”「Ｐは、 ＤＮＡボリメラ−セＩの持つ３′
→５′エキソヌクレアーセ活性によって、１）ＮＡ分子
の末端から３′・５′力向に塩基が削られることを防ぐ
ために添加した。な４？、この反応において上記のよう
な平坦末端が得られる割合は数％〜数１０％程度である
。
Ｔ ”「Ｐは、 ＤＮＡボリメラ−セＩの持つ３′
→５′エキソヌクレアーセ活性によって、１）ＮＡ分子
の末端から３′・５′力向に塩基が削られることを防ぐ
ために添加した。な４？、この反応において上記のよう
な平坦末端が得られる割合は数％〜数１０％程度である
。
上記反応後、フェノールおよびクロロポルム抽出とエタ
ノール沈殿を行った。沈殿したＤＮＡ断片を全Ｗ３０ｐ
（ｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−（４Ｃ１（ｐＨ７，５）、
５０ｍＭＮ、ｉｃｊ！、 ７ｍＭＭｇＣｊ！２゜
６＋’ｎＭ２−メルカプトエタノールに溶解し、続いて
、１６単位のＥｃｏＲＩ （宝酒造社製）を加え。
ノール沈殿を行った。沈殿したＤＮＡ断片を全Ｗ３０ｐ
（ｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−（４Ｃ１（ｐＨ７，５）、
５０ｍＭＮ、ｉｃｊ！、 ７ｍＭＭｇＣｊ！２゜
６＋’ｎＭ２−メルカプトエタノールに溶解し、続いて
、１６単位のＥｃｏＲＩ （宝酒造社製）を加え。
３７℃、２時間反応させた。
１ＥｃｏＲＩによる消化後、低融点アガロースケル電気
泳動法により、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約５．Ｉ
Ｋｂ）を精製した。このようにして得られたｔｒｐプロ
モーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコドンを有する約１３
０ｂｐのＤＮＡ断片（約４０ｎｇ）とＩＦＮ−β遺伝子
を含む約５．、ｌＫｂのＤＮＡ断片（約１５０ｎｇ）を
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１）Ｈ７，６） 、１０ｍ
ＭＭｇＣ７！２，１０ｍＭジチオスレイトール、 ０
．５ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐを含む全量２０μｌの反応液
中で、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で２０
時間結合反応を行った。
泳動法により、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約５．Ｉ
Ｋｂ）を精製した。このようにして得られたｔｒｐプロ
モーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコドンを有する約１３
０ｂｐのＤＮＡ断片（約４０ｎｇ）とＩＦＮ−β遺伝子
を含む約５．、ｌＫｂのＤＮＡ断片（約１５０ｎｇ）を
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１）Ｈ７，６） 、１０ｍ
ＭＭｇＣ７！２，１０ｍＭジチオスレイトール、 ０
．５ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐを含む全量２０μｌの反応液
中で、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で２０
時間結合反応を行った。
このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用い
、常法により大腸菌ＨＢ １０１ （Ｉｌ、Ｂｏｙｅ
ｒら： Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃ、 Ｂｉｏｌｏ、、旧４５９
（１９６９） ）を形質転換した。得られたＡＩ）”
ｊｃ’ の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを常法
により分１１Ｉｌｌ精製し第９図に示したｐＦＪ−１２
３を得た。
、常法により大腸菌ＨＢ １０１ （Ｉｌ、Ｂｏｙｅ
ｒら： Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃ、 Ｂｉｏｌｏ、、旧４５９
（１９６９） ）を形質転換した。得られたＡＩ）”
ｊｃ’ の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを常法
により分１１Ｉｌｌ精製し第９図に示したｐＦＪ−１２
３を得た。
ｐＦＪ−１２３の構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ。
Ｘｈｏ Ｉ、Ｐｓ ｔ Ｉ、ＢａｍＨＩ （以上宝酒
造社製）オよびＣ／ａｌ（ベーリンガー・マンハイム社
Ｍ）によって消化後、アガロースケル電気泳動によりＴ
ｆｖ認した。
造社製）オよびＣ／ａｌ（ベーリンガー・マンハイム社
Ｍ）によって消化後、アガロースケル電気泳動によりＴ
ｆｖ認した。
組換えプラスミドｐＦＪ−１２３を持つ大腸菌ＨＢ Ｉ
−０１株をＩＦ、Ｊ−、，１２３と命名し、インター
フェロンの生産性を以下の方法で調べた。
−０１株をＩＦ、Ｊ−、，１２３と命名し、インター
フェロンの生産性を以下の方法で調べた。
本菌株を１、Ｇ培地〔トリプトンｌｏｇ、酵母エキス５
ｇ、ｊＪ’ａｃｆｆ５ｇ、’グルコースＩｇを水１ｐに
とかし、ＮａＯＨでｐ Ｈを７，２とする〕で３７’Ｃ
，１’８時間培養した。この培養液０．２ｍｌを１０ｍ
１のＭＣ（″Ｊ培地（Ｎａ２ＩＩＰ０４ ０．６％、Ｋ
Ｉ１２Ｐ（）、＋ ０．３％、 ＮａＣＲＯ，５％、
ＮＨａ ｃｘ ｏ、ｔ％、グルコース０．５％、カ
ザミノ酸０．５％、Ｍｇ５Ｏ／ｌ ＩｒｎＭ、サイアミ
ン塩酸塩４１１ ｇ ／ ｍｌ、 ｐＨ７，２〕に接
種し、３０℃で４〜８時間培養後、トップ１フアン遺伝
子の誘導物質であるインド〜ルーｒクリフレ酸（以下１
八Δと略記する）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに５〜１
２時間培養を続けた。
ｇ、ｊＪ’ａｃｆｆ５ｇ、’グルコースＩｇを水１ｐに
とかし、ＮａＯＨでｐ Ｈを７，２とする〕で３７’Ｃ
，１’８時間培養した。この培養液０．２ｍｌを１０ｍ
１のＭＣ（″Ｊ培地（Ｎａ２ＩＩＰ０４ ０．６％、Ｋ
Ｉ１２Ｐ（）、＋ ０．３％、 ＮａＣＲＯ，５％、
ＮＨａ ｃｘ ｏ、ｔ％、グルコース０．５％、カ
ザミノ酸０．５％、Ｍｇ５Ｏ／ｌ ＩｒｎＭ、サイアミ
ン塩酸塩４１１ ｇ ／ ｍｌ、 ｐＨ７，２〕に接
種し、３０℃で４〜８時間培養後、トップ１フアン遺伝
子の誘導物質であるインド〜ルーｒクリフレ酸（以下１
八Δと略記する）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに５〜１
２時間培養を続けた。
培ｆＳ：液を８．０００ ｒ ｐｒｎ、 １０分間遠
心して某閑し、、ｉ’ＯｍＭＮａＣ（！、３０ｍＭＴ
ｒ ｉ ５−ＨＣＡ！（ｐＨ７、，５）緩衝液で洗浄す
る。洗浄菌体を」二記緩１＃ｉ液１ｍｌに懸濁し、２０
０μｇのリゾチーム。
心して某閑し、、ｉ’ＯｍＭＮａＣ（！、３０ｍＭＴ
ｒ ｉ ５−ＨＣＡ！（ｐＨ７、，５）緩衝液で洗浄す
る。洗浄菌体を」二記緩１＃ｉ液１ｍｌに懸濁し、２０
０μｇのリゾチーム。
０、２５．、Ｍ、’ＥＤＴ Ａ 、 （エチレンシアミ
ンチＩ・う酢酸）を５μｌ加えて、０℃に３０分間放置
した後、凍結、融解走３回繰返して菌体を破砕した。こ
れを１５、ＯＯＯｒｐｍ、３０分間遠心し、上Ｉｎを採
取した。上滑中のインターフェロンの量をアームストロ
ングの方法（Ｊ、八、＾ｒｍｓｔｒｏｎｇ ：＾ｐｐ１
． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋。
ンチＩ・う酢酸）を５μｌ加えて、０℃に３０分間放置
した後、凍結、融解走３回繰返して菌体を破砕した。こ
れを１５、ＯＯＯｒｐｍ、３０分間遠心し、上Ｉｎを採
取した。上滑中のインターフェロンの量をアームストロ
ングの方法（Ｊ、八、＾ｒｍｓｔｒｏｎｇ ：＾ｐｐ１
． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋。
２１、７２３−７２５ （１９７１） ）に従って定量
した。但し、ウィルスとしてはＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓ
ｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ。
した。但し、ウィルスとしてはＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓ
ｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ。
動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来のウイノシュ・セル
（Ｗｉｓｈ Ｃｅ１ｌ ）を用いた。
（Ｗｉｓｈ Ｃｅ１ｌ ）を用いた。
インターフェロン活性の測定の結果１本面株は３ｘｌ
０９単位／βのインターフェロンを生産していた。
０９単位／βのインターフェロンを生産していた。
ＩＦＪ−１２３株が保持するプラスミド（ｐＦＪ−１２
３）のＳＤ配列とＡＴＧ周辺の塩基配列をマキサム・ギ
ルバートの方法で調べた結果。
３）のＳＤ配列とＡＴＧ周辺の塩基配列をマキサム・ギ
ルバートの方法で調べた結果。
八Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ ＣＧ Ａ Ｔ Ａ Ａ
Ｇ ＣＴ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ ＧＤ であることが判明した。
Ｇ ＣＴ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ ＧＤ であることが判明した。
ｐ Ｆ Ｊ −’１２３を含む大腸菌菌株は、工業技術
院微生物工業技術研究所に［１ｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＩＦＪ−１２３，ＦＥＲＭ Ｐ７６８８２と
して寄託されている。
院微生物工業技術研究所に［１ｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＩＦＪ−１２３，ＦＥＲＭ Ｐ７６８８２と
して寄託されている。
上記したｐＦ；Ｊ−１２３の造成工程を第９図番こ図示
する。
する。
実施例３、
Ｎ末端のアミノ酸を欠失したＩＦＮ−β誘導体の発現：
実施例１で造成した発現ベクターｐＴｒＳ−３を用い、
ＩＦＮ−βのＮ末端のいくつかのアミノ酸を欠失したＩ
ＦＮ−β誘導体を発現する組換えプラスミドを次のよう
にして得る。
ＩＦＮ−βのＮ末端のいくつかのアミノ酸を欠失したＩ
ＦＮ−β誘導体を発現する組換えプラスミドを次のよう
にして得る。
１５μｇのｐＬＥ−３を１０ｍＭＴ ｒ ｉ ５−ＨＣ
（１（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ６２，６ｍＭ２−メ
ルカプトエタノールを含む全量１００μβの反応液中で
２０単位の０７！ａ＋（ベーリンガー・マンハイム社製
）を加え、３７℃、２時間反応させた。
（１（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ６２，６ｍＭ２−メ
ルカプトエタノールを含む全量１００μβの反応液中で
２０単位の０７！ａ＋（ベーリンガー・マンハイム社製
）を加え、３７℃、２時間反応させた。
反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノー
ル沈殿を行った。沈殿したＤＮＡ断片を全ｍ３０ｐｌの
１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩ！ （ｐＨ７，５）−０
，５ｍＭＥＤＴ八に溶解した。続いて、このＤＮＡ溶液
６μｆ （ＤＮＡ量は約３μｇ）と蒸留水１３、ｃｕｆ
ｆと緩衝液（６０ｍＭＣａ Ｃ１２、６０ｍＭＭｇＣ１
２’、３ＭＮａ Ｃｅ、１００ｍＭ”Ｆｒ ｉ ５−Ｈ
Ｃ７！ （ｓ＞８８．１）、５ｍＭＥＤ′ｒＡ）５μ
ｆｆを混合した後、０．５単位のエキソヌクレアーゼＢ
ΔＬ ３ Ｌ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ社ｍ＞を加え。
ル沈殿を行った。沈殿したＤＮＡ断片を全ｍ３０ｐｌの
１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣＩ！ （ｐＨ７，５）−０
，５ｍＭＥＤＴ八に溶解した。続いて、このＤＮＡ溶液
６μｆ （ＤＮＡ量は約３μｇ）と蒸留水１３、ｃｕｆ
ｆと緩衝液（６０ｍＭＣａ Ｃ１２、６０ｍＭＭｇＣ１
２’、３ＭＮａ Ｃｅ、１００ｍＭ”Ｆｒ ｉ ５−Ｈ
Ｃ７！ （ｓ＞８８．１）、５ｍＭＥＤ′ｒＡ）５μ
ｆｆを混合した後、０．５単位のエキソヌクレアーゼＢ
ΔＬ ３ Ｌ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ社ｍ＞を加え。
３０℃で３分間反応させた。この反応により。
Ｃｊ！ａ＋末端から両方向に１〜３０ｂｐＤＮＡ鎖が削
られた。反応をフェノール抽出によって停止させ、続い
てクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行った。沈殿し
たＤＮＡ断片を全量２０μｌの１００ｍＭＴ ｒ ｉ
５−ＨＣ＃ （ｐＨ７，５） 、 ’５０ｍＭＮａｃｊ
！、７ｍＭＭ、ｇＣｎ２，６ｍＭ２−メルカプトエタノ
ールに溶解し、続いて８単位のＥＣ０ＲＩ （宝酒造
社製）・を加え、３７℃、２時間反応させた。ＥＣ０Ｒ
Ｉによる消化後、低融点アガロースゲル電気泳動により
、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約５．１Ｋｂ）を精製
した。
られた。反応をフェノール抽出によって停止させ、続い
てクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行った。沈殿し
たＤＮＡ断片を全量２０μｌの１００ｍＭＴ ｒ ｉ
５−ＨＣ＃ （ｐＨ７，５） 、 ’５０ｍＭＮａｃｊ
！、７ｍＭＭ、ｇＣｎ２，６ｍＭ２−メルカプトエタノ
ールに溶解し、続いて８単位のＥＣ０ＲＩ （宝酒造
社製）・を加え、３７℃、２時間反応させた。ＥＣ０Ｒ
Ｉによる消化後、低融点アガロースゲル電気泳動により
、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約５．１Ｋｂ）を精製
した。
このようにして得たＩＦＮ−β遺伝子を含む約５、 Ｉ
Ｋ ｂのＤＮＡ断片□（約１５０ｎｇ）と実施例２で
調製したｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコ
ドンを有する約１３０ｂｐのＤＮＡ断片（約４０ｎｇ）
を、 ２０ｍＭＴ ｒ ｉ ５−ＨＣｊ！（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭＭｇＣＡ ２．ｌ０ｍＭジチオスレイト
ール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μｌの反応液中
で、１単位の７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え
、４℃で２０時間結合反応を行った。
Ｋ ｂのＤＮＡ断片□（約１５０ｎｇ）と実施例２で
調製したｔｒｐプロモーター、ＳＤ配列およびＡＴＧコ
ドンを有する約１３０ｂｐのＤＮＡ断片（約４０ｎｇ）
を、 ２０ｍＭＴ ｒ ｉ ５−ＨＣｊ！（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭＭｇＣＡ ２．ｌ０ｍＭジチオスレイト
ール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μｌの反応液中
で、１単位の７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え
、４℃で２０時間結合反応を行った。
このようにして得られた組換えプラスミドＤ’ＮＡを用
い、大腸菌ＨＢＩＯＩ株を常法により形質転換し、得ら
れたＡｐ”Ｔｃ５の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡ
を常法により分離精製し、第１θ図に示したｐＦＭ−９
を得た。
い、大腸菌ＨＢＩＯＩ株を常法により形質転換し、得ら
れたＡｐ”Ｔｃ５の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡ
を常法により分離精製し、第１θ図に示したｐＦＭ−９
を得た。
ｐＦＭ−９の構造は制限酵素ＥｃｏＲＴ、Ｘｈ。
１、’ Ｐｓ ｔ Ｉ、ＢａｍＨＩおよびＣｊｌａ＋に
よりて消化後、アガロースゲル電気泳動により確認した
。
よりて消化後、アガロースゲル電気泳動により確認した
。
組換えプラスミドｐＦＭ”９を持つ大腸菌ＨＢ・１０１
株をｉＦＭ−９と命名し、インターフェロン生産性を実
施例２と同様に調べたところ、８×１０７単位／ ｅの
インターフェロンを生産していた。この菌株は、工業技
術院微生物工業技４４・ｉ研究所に Ｅ’Ａｃｔｉｅｒ
ｉｃｈｉａ’ｃｏｌ’ｉ Ｉ Ｆ Ｍ −９Ｆ Ｅ
ＲＭ Ｐ−６８８３として寄託□されている。この菌
株が保持する組換□えプラスミドをｐ ＦＭ−９と呼ぶ
。
株をｉＦＭ−９と命名し、インターフェロン生産性を実
施例２と同様に調べたところ、８×１０７単位／ ｅの
インターフェロンを生産していた。この菌株は、工業技
術院微生物工業技４４・ｉ研究所に Ｅ’Ａｃｔｉｅｒ
ｉｃｈｉａ’ｃｏｌ’ｉ Ｉ Ｆ Ｍ −９Ｆ Ｅ
ＲＭ Ｐ−６８８３として寄託□されている。この菌
株が保持する組換□えプラスミドをｐ ＦＭ−９と呼ぶ
。
上記したｐＦＪ−１２３の造成工程を第１０回に図示す
る。
る。
次に、大腸菌ＩＦＮ−９が保持するプラスミド、） Ｆ
Ｍ−９のＳＤ配列とへＴＧ周辺の塩基配列をマキサム
・ギルバートの方法で調べたところ。
Ｍ−９のＳＤ配列とへＴＧ周辺の塩基配列をマキサム
・ギルバートの方法で調べたところ。
Ａ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ ′Ｉ” Ａ Ｔ ＣＧ Ａ Ｔ
Ａ Ａ Ｇ ＣＴ Ｅ可ＩＧ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ３Ｉ） という結果を得、 ｐＰＭ−９はＮ末端のＭｅｔの次
から５ ｎｘ＋のアミノＩ’ｍ （Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ）を欠失したＩＦＮ−βをコー
ドする遺伝子を含むことが判明した。
Ａ Ａ Ｇ ＣＴ Ｅ可ＩＧ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ３Ｉ） という結果を得、 ｐＰＭ−９はＮ末端のＭｅｔの次
から５ ｎｘ＋のアミノＩ’ｍ （Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ）を欠失したＩＦＮ−βをコー
ドする遺伝子を含むことが判明した。
参考例１゜
ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドベクターｐＫＹ
Ｐ １０の造成： （ａ）トリプトファン形質導入ファージＤＮＡの精製 〜 λｐｔｒｐファージであるλｃ １８５７ｔｒｐＥ
Ｄ１０〔以下、ＡｔｒｐＥＤと略すＧ、 Ｆ、 Ｍｉａ
ｚｚａｒｉら：Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３３巻
、１４５７頁（１９７８））を大腸菌Ｊ入１９４株〔Ｆ
−２λ−、ｒｘ、 ｍｉ、 ΔｔｒｐＥｓ。
Ｐ １０の造成： （ａ）トリプトファン形質導入ファージＤＮＡの精製 〜 λｐｔｒｐファージであるλｃ １８５７ｔｒｐＥ
Ｄ１０〔以下、ＡｔｒｐＥＤと略すＧ、 Ｆ、 Ｍｉａ
ｚｚａｒｉら：Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３３巻
、１４５７頁（１９７８））を大腸菌Ｊ入１９４株〔Ｆ
−２λ−、ｒｘ、 ｍｉ、 ΔｔｒｐＥｓ。
１ｅｕ６． Ｊ、 Ｃａｒｂｏｎ Ｇ） Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓｐ、 ３５５（１９７
７）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）に溶原化させることによ
って得られる菌株、ＪＡ１９４（ＡｔｒｐＥＤ）を４２
℃で３０分培養することによってλｔｒｐＥＤファージ
を誘発し、ファージ溶菌液を調製した。
ｉｎａｎｔ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓｐ、 ３５５（１９７
７）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）に溶原化させることによ
って得られる菌株、ＪＡ１９４（ＡｔｒｐＥＤ）を４２
℃で３０分培養することによってλｔｒｐＥＤファージ
を誘発し、ファージ溶菌液を調製した。
以下余白
配遠心法〔山川ら「核酸の化学１」東京化学同人社ｐ、
５４−６１．１９７４ ）によってλファージをイー＃
製した。
５４−６１．１９７４ ）によってλファージをイー＃
製した。
次いでとのλファージより、山川らの方法〔核酸の化学
１１東京化学同人社、１１６２−６５二１９７４〕に従
“７ ｘ ／ −／ｌ／処ゝと′ロロホルム処理をして
精製した。
１１東京化学同人社、１１６２−６５二１９７４〕に従
“７ ｘ ／ −／ｌ／処ゝと′ロロホルム処理をして
精製した。
（ｂ） ｔ、ｒｐプロモーターのプラスミドへのクロ
ーニング λｔｒｐ ＥＤファージＤＮＡがらｔｒｐオペロンのク
ローン化は以下のごとく行う。すなわち、８μ２のλｔ
ｒｐ ｇＤ Ｄ Ｎ Ａを２０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐ
Ｈ７，５）、７５ ｍＭ Ｎａ（Ｖ 、 １０ ｍＭ
ＭｇＣ１２，５ｍＭジチオスレイトール中で１６単位ρ
ＥｃｏＲ１（全酒造社製、以下同じ）と１６単位のＨｉ
ｎｄｌ （全酒造社製、以下同じ）を加えて３７℃５１
．２吟間消化じた。°一方プラスミドのｐＢＲｊ！５
ＤＮＡ １μ２も同様に２単位のＥｃ ｏＲ１と２単位
のａｔ ｎｄｌで消化した（最終容量３゜Ｓ）。次いで
、６５℃、５分間加熱処理して反応を停止し、それぞれ
の消化したＤＮＡ溶液１５μｌずつを混合し、終濃度５
００μＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼ５単位（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）、・を加え４℃、
１８時間結合反応を行なった。
ーニング λｔｒｐ ＥＤファージＤＮＡがらｔｒｐオペロンのク
ローン化は以下のごとく行う。すなわち、８μ２のλｔ
ｒｐ ｇＤ Ｄ Ｎ Ａを２０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐ
Ｈ７，５）、７５ ｍＭ Ｎａ（Ｖ 、 １０ ｍＭ
ＭｇＣ１２，５ｍＭジチオスレイトール中で１６単位ρ
ＥｃｏＲ１（全酒造社製、以下同じ）と１６単位のＨｉ
ｎｄｌ （全酒造社製、以下同じ）を加えて３７℃５１
．２吟間消化じた。°一方プラスミドのｐＢＲｊ！５
ＤＮＡ １μ２も同様に２単位のＥｃ ｏＲ１と２単位
のａｔ ｎｄｌで消化した（最終容量３゜Ｓ）。次いで
、６５℃、５分間加熱処理して反応を停止し、それぞれ
の消化したＤＮＡ溶液１５μｌずつを混合し、終濃度５
００μＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼ５単位（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）、・を加え４℃、
１８時間結合反応を行なった。
このようにしてえられるプラスミドの混合物を用い犬Ｗ
ｈＶｉＣ６００ＳＦ株〔キヤメロンら：プロシーディ／
ゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイ
エンス７２巻、３４１６頁（１９７５的〕を公知の方法
〔Ｓ、Ｎ。
ｈＶｉＣ６００ＳＦ株〔キヤメロンら：プロシーディ／
ゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイ
エンス７２巻、３４１６頁（１９７５的〕を公知の方法
〔Ｓ、Ｎ。
コーエンラ：プロシーディングスーオプ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス６９巻、２１１０頁
（１９Ｍ年）〕に従って形質転換し、アンピシリン耐性
（Ａ：）、テトラサイクリン耐性（ＴｅＲ）およびクロ
シムフェニコール感受性Ｑ♂）を有する形質転換株を得
た。このようにして得られるズ腸菌の形質転換株よりプ
ラスミド・ＤＮＡを分離し、ｐＫＹＰ−１と命名した。
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス６９巻、２１１０頁
（１９Ｍ年）〕に従って形質転換し、アンピシリン耐性
（Ａ：）、テトラサイクリン耐性（ＴｅＲ）およびクロ
シムフェニコール感受性Ｑ♂）を有する形質転換株を得
た。このようにして得られるズ腸菌の形質転換株よりプ
ラスミド・ＤＮＡを分離し、ｐＫＹＰ−１と命名した。
プラスミドｐＫＹＰ １をＴａｑＩとＥｃｏＲＩで消
化しトリプトファンプロモーターとＳＤ配列を含む２．
ａ ｉｃｂ （キロベース二以下同じ）のＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動法により精製した。この２．
６ＫｂのＤＮＡ断片を第７図に示した方法により既知ベ
クターであるｐＢＲ３２２にクローン化する。すなわち
、８μＶのｐＢＲ３２２に２単位のＴａｑｌ （全酒造
社製）を加え、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ （ｐ
Ｈ８４）、６ｍＭＭｇＣ１ｚ二１００ｍＭＮａＣ／、
６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む全量１００μ
ｌの反応液中４５℃で６０分、反応させた。Ｔａｑ ｌ
による部分消化後、低融点アガロース・ゲル電気泳動法
〔ムウイスランダー（Ｌａｒｓ Ｗｉｅｇｌａｎｄｅｒ
） ：アナリテイカル・バイオケミストリー ９８巻３
０５頁（１９７９年）〕により４．３６ Ｋ 、ｂのＤ
Ｎ Ａ断片をＨＥＩＨし、′さらにこのＤＮＡ（約１
．５７Ｑ）を３単位（ｉ’） Ｅｃ ｏＲＩを加えて、
３７℃、３時間反応させて完全に消化した後、上と同様
に低融点アガロース・ゲル電気泳動法により、約４．３
３ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約１．０μＶ）を得た。
化しトリプトファンプロモーターとＳＤ配列を含む２．
ａ ｉｃｂ （キロベース二以下同じ）のＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動法により精製した。この２．
６ＫｂのＤＮＡ断片を第７図に示した方法により既知ベ
クターであるｐＢＲ３２２にクローン化する。すなわち
、８μＶのｐＢＲ３２２に２単位のＴａｑｌ （全酒造
社製）を加え、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ （ｐ
Ｈ８４）、６ｍＭＭｇＣ１ｚ二１００ｍＭＮａＣ／、
６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む全量１００μ
ｌの反応液中４５℃で６０分、反応させた。Ｔａｑ ｌ
による部分消化後、低融点アガロース・ゲル電気泳動法
〔ムウイスランダー（Ｌａｒｓ Ｗｉｅｇｌａｎｄｅｒ
） ：アナリテイカル・バイオケミストリー ９８巻３
０５頁（１９７９年）〕により４．３６ Ｋ 、ｂのＤ
Ｎ Ａ断片をＨＥＩＨし、′さらにこのＤＮＡ（約１
．５７Ｑ）を３単位（ｉ’） Ｅｃ ｏＲＩを加えて、
３７℃、３時間反応させて完全に消化した後、上と同様
に低融点アガロース・ゲル電気泳動法により、約４．３
３ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約１．０μＶ）を得た。
次に１２μ２の、ＫＹＰ−ＩＤＮＡを上と同様に３単位
のＴａｑｌを加えて部分消化し、低融点アガロース・ゲ
ル電気泳′１ＪＪＪ法で８．５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（
約２Ｉｔｇ″）を精製し、さらにこのＤ Ｎ Ａ ｆ
ＥｃｏＲｌで完全消化することにより、２、６ Ｋｂの
ＤＮＡ断片、約０．５μｍを精製した。
のＴａｑｌを加えて部分消化し、低融点アガロース・ゲ
ル電気泳′１ＪＪＪ法で８．５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（
約２Ｉｔｇ″）を精製し、さらにこのＤ Ｎ Ａ ｆ
ＥｃｏＲｌで完全消化することにより、２、６ Ｋｂの
ＤＮＡ断片、約０．５μｍを精製した。
このようにして得たｐＢＲ３２２の４．３３ Ｋ ｂＤ
ＮＡ（０，４μり）とｐＫＹＰ−１の２．６ＫｂＤＮＡ
断片（０，２５μＶ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡｔ
（ｐＨ７，６）、１０ ｍＭ ＭｇＣ１ｘ 、 １０ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む全量２０μノの反応液中で
、０．５ ｍＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ４単位
を加え、４℃で１８時間、結合反応を行なった。このよ
うにして得られる組みかえプラスミドＤＮＡを用い、大
腸１ｌｃ６００８Ｆ８株を形質転換し、得られるＡ、Ｒ
ｌＴ、Ｈの形質転換株がもつプラスミドを分離精製した
。このプラスミドＤＮＡを６種の制限酵素、ＥｃｏＲ（
、Ｈｉｎｄｌ＋ Ｃ１ａｌ （ベーリンガー・マンハイ
ム社製）、Ｈｐａｌ（宝酒造社製）、Ｈｉｎｃｌ（宝酒
造社製）、ＢａｍＨｌ （宝酒造社製）によって消化し
て、プラスミドの構造解析を行ない、これをｐＫＹＰ
５と命名した。
ＮＡ（０，４μり）とｐＫＹＰ−１の２．６ＫｂＤＮＡ
断片（０，２５μＶ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡｔ
（ｐＨ７，６）、１０ ｍＭ ＭｇＣ１ｘ 、 １０ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む全量２０μノの反応液中で
、０．５ ｍＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ４単位
を加え、４℃で１８時間、結合反応を行なった。このよ
うにして得られる組みかえプラスミドＤＮＡを用い、大
腸１ｌｃ６００８Ｆ８株を形質転換し、得られるＡ、Ｒ
ｌＴ、Ｈの形質転換株がもつプラスミドを分離精製した
。このプラスミドＤＮＡを６種の制限酵素、ＥｃｏＲ（
、Ｈｉｎｄｌ＋ Ｃ１ａｌ （ベーリンガー・マンハイ
ム社製）、Ｈｐａｌ（宝酒造社製）、Ｈｉｎｃｌ（宝酒
造社製）、ＢａｍＨｌ （宝酒造社製）によって消化し
て、プラスミドの構造解析を行ない、これをｐＫＹＰ
５と命名した。
（ｃ） ｔｒｐプロモーターのポータプル化上記のプ
ラスミドベクターｐＫＹＰ −５はＳＤ配列の下流（１
〜２０塩基以内）にＣｏａ１部位とＩ■１ｎｄＩ部位を
有するのでＤＮＡ導入ベクターとして充分使用可能であ
る。しかし、ｐＫＹＰ−５ＤＮＡ中にＢＤ配列の直後の
Ｃ１ａ １部位以外にもう１カ所Ｃ１ａ １部位がある
こと、およびｐＫＹＰ−５ＤＮＡからＥｃｏＲｌとＨｌ
ｎｄ ｌで切り出したｔｒｐプロモーターを含む断片が
２，６５Ｋｂとやや大きいのでよシ使いやすいようにす
るため第８図のようにしてさらに小さいトリプトファン
プロモーターを含むＤＮＡ断片を有するグラスミドを造
成する。すなわちｐＫＹＰ−５ＤＮＡをＨｐａ ｌとＨ
ｌｎｄｌで消化して約３４０１）ｐ（ペースベアー）の
ＤＮＡ断片を精製し、これをＣ１ａ ｌとＨｔｎａｌで
消化したｐＢＲ３２２に第６図のように挿入し、ｐＫＹ
Ｐ−１０を得た。ｐＫＹＰ−１０の構造は制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ、Ｃ１ａ ｌ、Ｈ１ｎｄ１％Ｈｐａ ｌで消化し
た後、アガロースゲル電気泳動で確認した。
ラスミドベクターｐＫＹＰ −５はＳＤ配列の下流（１
〜２０塩基以内）にＣｏａ１部位とＩ■１ｎｄＩ部位を
有するのでＤＮＡ導入ベクターとして充分使用可能であ
る。しかし、ｐＫＹＰ−５ＤＮＡ中にＢＤ配列の直後の
Ｃ１ａ １部位以外にもう１カ所Ｃ１ａ １部位がある
こと、およびｐＫＹＰ−５ＤＮＡからＥｃｏＲｌとＨｌ
ｎｄ ｌで切り出したｔｒｐプロモーターを含む断片が
２，６５Ｋｂとやや大きいのでよシ使いやすいようにす
るため第８図のようにしてさらに小さいトリプトファン
プロモーターを含むＤＮＡ断片を有するグラスミドを造
成する。すなわちｐＫＹＰ−５ＤＮＡをＨｐａ ｌとＨ
ｌｎｄｌで消化して約３４０１）ｐ（ペースベアー）の
ＤＮＡ断片を精製し、これをＣ１ａ ｌとＨｔｎａｌで
消化したｐＢＲ３２２に第６図のように挿入し、ｐＫＹ
Ｐ−１０を得た。ｐＫＹＰ−１０の構造は制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ、Ｃ１ａ ｌ、Ｈ１ｎｄ１％Ｈｐａ ｌで消化し
た後、アガロースゲル電気泳動で確認した。
（ｄ）２個以上のｔｒｐプロモーターの連結法にさらに
強いプロモーター活性を有するプラスミドベクターの造
成を目指して、ｔｒｐプロモーターを２個連結すること
を試みた。すなわち、第１１図（Ａ）に示したように前
項（Ｃ１でのべたｔｒｐプロモーターをコむ約３４０ｂ
ｐのＤＮＡ断片をＣ１２ａ、 ＩとＨｉｎｄｌ［ｌで消
化したｐＫＹＰ−１０に挿入し、ｐＫＹＰ−１，１を得
た。同様の方法でｔｒｐプロモーター３個を同一方向に
連結したｐＫＹＰ−１２Ｃ第１１図（Ｂ）〕 も造成し
、ＥｃｏＲｌ、Ｃｎａｌ。
強いプロモーター活性を有するプラスミドベクターの造
成を目指して、ｔｒｐプロモーターを２個連結すること
を試みた。すなわち、第１１図（Ａ）に示したように前
項（Ｃ１でのべたｔｒｐプロモーターをコむ約３４０ｂ
ｐのＤＮＡ断片をＣ１２ａ、 ＩとＨｉｎｄｌ［ｌで消
化したｐＫＹＰ−１０に挿入し、ｐＫＹＰ−１，１を得
た。同様の方法でｔｒｐプロモーター３個を同一方向に
連結したｐＫＹＰ−１２Ｃ第１１図（Ｂ）〕 も造成し
、ＥｃｏＲｌ、Ｃｎａｌ。
Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｈｐａｌで消化し構造を確認した。
以下余白
参考例２ ｐＫＹＰｌｏｏの造成：
本発明に述べるプラスミドベクターを造成するために、
第５図に示すようにさらに利用しやすい形にしたｐＫＹ
Ｐ１００ヱを造成する。
第５図に示すようにさらに利用しやすい形にしたｐＫＹ
Ｐ１００ヱを造成する。
ｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡの供給源として、ｔｒ
ｐポータプルプロモーターを運ぶプラスミド１）ＫＹＰ
１０１ （特願昭５６−２１３１９３、第５図参照）
を用いる。
ｐポータプルプロモーターを運ぶプラスミド１）ＫＹＰ
１０１ （特願昭５６−２１３１９３、第５図参照）
を用いる。
５ｏｐｙのｐＫＹＰｌｏに５ａ単位のａｈａ １ （宝
酒造社製）を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＡｔ（
ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｆＣＩ ２．６ｍＭ ２−メル
カプトエタノールを含む全ｆｔ１００μノの反応液中３
７℃で２時間反応９、ｔｒｐプロモーターを含む約１８
０ｂｐの離できないために一緒に精製される。精製した
３つのＤＮＡ断片（計約４μｆ）を５０ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＪ （’ｐＨ７，６）、７ｍＭ Ｍｔｃ１２．１
０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ ｍＭ （
ＩＡＴＰ、 ０．２５ ｍＭ ｄｃＴＰ。
酒造社製）を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＡｔ（
ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｆＣＩ ２．６ｍＭ ２−メル
カプトエタノールを含む全ｆｔ１００μノの反応液中３
７℃で２時間反応９、ｔｒｐプロモーターを含む約１８
０ｂｐの離できないために一緒に精製される。精製した
３つのＤＮＡ断片（計約４μｆ）を５０ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＪ （’ｐＨ７，６）、７ｍＭ Ｍｔｃ１２．１
０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ ｍＭ （
ＩＡＴＰ、 ０．２５ ｍＭ ｄｃＴＰ。
０．２５ ｍＭｄＧＴＰ、 ０．２５ｍＭｄＴＴＰを含
む全１１３０μｌの反応液中で、８単位の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼｌ−ＫｌｅｎｏｗＭ片（ペセスダ・リサー
チ・ラボラトリ−社ＳＳ＞を加え、１５℃、２時間反応
させた。この反応によシ、Ｈｈａ ｌ消化によって生じ
た３′−突出末端はＤＮＡポリメラーゼＩ・ＩＱｅｎｏ
ｗ断片が持つ３１→５１のエキソヌクレアーゼ活性およ
び５１→３°の修復合成活性により平坦末端に変えられ
る。続いて７２℃、３０分間の熱処理によってＤＮＡポ
リメラーゼｌ −ＫｌｅｎｏｗでＮａＣＡ’ 断片を失活させた後、ＩＭＮａＣ１ｉ度を５０ｍＭとし
、８単位のａｔｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）を加え、３７
℃で２時間反応させた。Ｈｌｎｄｌ［ｌによる消化後、
ＰＡＧＥによシ、ｔｒｐプロモーターを含む約１００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
む全１１３０μｌの反応液中で、８単位の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼｌ−ＫｌｅｎｏｗＭ片（ペセスダ・リサー
チ・ラボラトリ−社ＳＳ＞を加え、１５℃、２時間反応
させた。この反応によシ、Ｈｈａ ｌ消化によって生じ
た３′−突出末端はＤＮＡポリメラーゼＩ・ＩＱｅｎｏ
ｗ断片が持つ３１→５１のエキソヌクレアーゼ活性およ
び５１→３°の修復合成活性により平坦末端に変えられ
る。続いて７２℃、３０分間の熱処理によってＤＮＡポ
リメラーゼｌ −ＫｌｅｎｏｗでＮａＣＡ’ 断片を失活させた後、ＩＭＮａＣ１ｉ度を５０ｍＭとし
、８単位のａｔｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）を加え、３７
℃で２時間反応させた。Ｈｌｎｄｌ［ｌによる消化後、
ＰＡＧＥによシ、ｔｒｐプロモーターを含む約１００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を分離精製した。
一方、５μＶのプラスミドｐＢＲ３２２に８単位のｇｃ
ｏＲｌ（宝酒造社製）を加え、ｌＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｊ （ｐＨ７，５）、５０ｍＭ ＮａＣＪ、 ７ ｍＭ
ＭｆＣＩ 、、６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
む全量２０μｌの反応液中、３７℃で２時間反応させた
。反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノ
ール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量２０μｌの５０ｍＭＴ
ｒｉｅ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、７ｍＭＭｆＣＡ’、、
６ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭ ｄＡ
ＴＰ、 ０．２５１１１Ｍ ｄｃＴＰ。
ｏＲｌ（宝酒造社製）を加え、ｌＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｊ （ｐＨ７，５）、５０ｍＭ ＮａＣＪ、 ７ ｍＭ
ＭｆＣＩ 、、６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
む全量２０μｌの反応液中、３７℃で２時間反応させた
。反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノ
ール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量２０μｌの５０ｍＭＴ
ｒｉｅ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、７ｍＭＭｆＣＡ’、、
６ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭ ｄＡ
ＴＰ、 ０．２５１１１Ｍ ｄｃＴＰ。
０．２５ｍＭ ｄＧＴＰ、 ０．２５１ｎＭｄＴＴＰに
溶解し、続いて８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１−
Ｋｌθｎｏｗ断片（ペセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
社Ｍ）を加え、１５℃、２時間反応さすた。ＥｃｏＲｌ
消化によって生じた５１−突出末端をＤ Ｎ Ａポリメ
ラーゼ１−Ｋｌθｎｏｗ断片の修復合成活性により平坦
末端に変えた。７２℃、３０分間の熱処理によって、Ｄ
ＮＡポリメラーゼｌ −Ｋｌθｎｏｗ断片を失活させた
後、Ｉ ＭＮａＣＪでＮａＣＡ！ 濃度を５０ｍＭとし
、８単位のＨｌｎｄ ｉ［（宝酒造社製）を加え、３７
℃で２時間反応させた。Ｈｌｎｄ ［１による消化後、
低融点アガロースゲル電気泳動法によシ大きいグラスミ
ドＤＮＡ断片（約４．３３ｋｂ）を精製した。
溶解し、続いて８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１−
Ｋｌθｎｏｗ断片（ペセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
社Ｍ）を加え、１５℃、２時間反応さすた。ＥｃｏＲｌ
消化によって生じた５１−突出末端をＤ Ｎ Ａポリメ
ラーゼ１−Ｋｌθｎｏｗ断片の修復合成活性により平坦
末端に変えた。７２℃、３０分間の熱処理によって、Ｄ
ＮＡポリメラーゼｌ −Ｋｌθｎｏｗ断片を失活させた
後、Ｉ ＭＮａＣＪでＮａＣＡ！ 濃度を５０ｍＭとし
、８単位のＨｌｎｄ ｉ［（宝酒造社製）を加え、３７
℃で２時間反応させた。Ｈｌｎｄ ［１による消化後、
低融点アガロースゲル電気泳動法によシ大きいグラスミ
ドＤＮＡ断片（約４．３３ｋｂ）を精製した。
このようにして得られたｔｒｐプ四モーターを含む約１
００ｂｐのＤＮＡ断片王（約ｓ ｏ ｎｆ） とｐＢ
Ｒ３２２由来の約４，３３ｋｂのＤＮＡ断片１（約０．
２μｔ）に５０ｎｆの５１−リン酸されたＸｈＯＩリン
カ−（ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ、コラボレイティブ・リサー
チ社製）を加え、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＡｔ（ｐＨ７
，６）、１０ｍＭＭｆＣＪ、、１０ｍＭジチオスレイト
ール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μノの反応液中
で、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加
え、４℃で４０時間、結合反応を行った。このようにし
て得られる組換えプラスミドＤＮＡを用い、大腸菌ＨＢ
ＩＯＩ株を形質転換し、得られるＡｐＲＴｃＲの形質転
換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精製した。これらの
プラスミドＤＮＡを８種類の制限酵素ＥｃｏＲｌ 、
Ｘｈｏ Ｉ％Ｈ１ｎｄ Ｉｆ！、Ｈａｅｌｌｌ （以上
、宝酒造社製）Ｃ１ａｌ（ペーリンガー・マンハイム社
製）、Ｔａｑｌ（ペセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社
製）、Ｒｓａｌにュ・イングランド・バイオラボ社製）
で消化することにより、約１００ｂｐのｔｒｐプロモー
ターを含むＤＮＡ断プラプラスミドび、ｐＫＹＰｌｏｏ
７と命名した。
００ｂｐのＤＮＡ断片王（約ｓ ｏ ｎｆ） とｐＢ
Ｒ３２２由来の約４，３３ｋｂのＤＮＡ断片１（約０．
２μｔ）に５０ｎｆの５１−リン酸されたＸｈＯＩリン
カ−（ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ、コラボレイティブ・リサー
チ社製）を加え、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＡｔ（ｐＨ７
，６）、１０ｍＭＭｆＣＪ、、１０ｍＭジチオスレイト
ール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２０μノの反応液中
で、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加
え、４℃で４０時間、結合反応を行った。このようにし
て得られる組換えプラスミドＤＮＡを用い、大腸菌ＨＢ
ＩＯＩ株を形質転換し、得られるＡｐＲＴｃＲの形質転
換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精製した。これらの
プラスミドＤＮＡを８種類の制限酵素ＥｃｏＲｌ 、
Ｘｈｏ Ｉ％Ｈ１ｎｄ Ｉｆ！、Ｈａｅｌｌｌ （以上
、宝酒造社製）Ｃ１ａｌ（ペーリンガー・マンハイム社
製）、Ｔａｑｌ（ペセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社
製）、Ｒｓａｌにュ・イングランド・バイオラボ社製）
で消化することにより、約１００ｂｐのｔｒｐプロモー
ターを含むＤＮＡ断プラプラスミドび、ｐＫＹＰｌｏｏ
７と命名した。
参考例３゜
ｐ Ｌ Ｅ −３の造成：
ｐＴｕｌＦＮβ−５（ＡＴＣＣ３１Ｂ ７９から常法に
より分離する）を）ｌ ｉ ｎｄｌｌＩで消化＃＆Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ社製）で処理した後結合反応を行い第１２
図に示したｐ Ｔ ｕ 、、ｌ 、、Ｆ 、Ｎβ■］−
５を得た。ｐＴｕｌＦＮβＨ−５よりβＩＦＮ遺伝子を
切り出し、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＫ
ＹＰ−１２にクローン化し□た□。すなわち、ｐＫＹＰ
−１２ＤＮＡ２μｇに制限酵素Ｃｏａｌを４単位加え、
１０ｍＭＴｒ ｉ ５−１１ＣＩｌ（ｐＨ７，５）、６
ｍＭＭｇＣｊ！２゜５ｍＭジチオスレイトール（以下Ｃ
ｌａバッファーとよぶ）中（全量３０μｌ）で、３７°
Ｃ，２時間反応させた後、ＮａＣｊ＋を最終濃度１００
ｍＭになるように加えてさらに３７℃で２時間反応を続
けた。次いで６５℃で５分間加熱して酵素を失活させ、
低融点アガロース・ケル電気泳動法で約５ Ｋ ｂ １
７） ｔ ｒ ｐプロモーターを含むＤＮＡ断片を相製
し、１．２／ｊｇを得た。次にｐＴｕｌＦＮβＨ−５Ｄ
ＮＡ断片１ｇを上と同様に制限酵素Ｃｌａ■と１３ａｍ
ＨＩで消化し、低融点アガロース・ゲル電気泳動法でｔ
ｉ製し、β−ＩＦＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１，ＩＫ
ｂ）約ｌμｇを得た。以上のようにして得られる２個の
ＤＮＡ断片（第１２図の５Ｋｂと１．ＩＫｂ）を２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、６ｍＭＭｇ
Ｃｎ、２．５ｍＭジオチスレイトール、５００μＭＡＴ
’Ｐにとかし、１゛４ＤＮＡリガ一ゼ４単位を加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。得られたぐみかえ体プ
ラスミドの混合物を用□いて、常法通り、大腸菌ＨＢＩ
ＯＩを形質転換し Ａ Ｉ） Ｒのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第１２図
に示したｐｔ、Ｅ−３を得た。ｐＬＥ−３の構造はＣＲ
ａ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨＩで消
化後、アガロース・ゲル電気泳動により確認した。プラ
スミドｐＬＥ−３のＳＤ配列（ＡＡＣＧ）から開始コド
ン（ＡＴＧ）までの塩基配列はｒＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧ
ＡＴ、ＧＪであることをマキサム・ギルバートの方法〔
＾、Ｍ、Ｍａｘａｍら：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ第７４巻、５６０頁（１９７７） ）で
確認した。
より分離する）を）ｌ ｉ ｎｄｌｌＩで消化＃＆Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ社製）で処理した後結合反応を行い第１２
図に示したｐ Ｔ ｕ 、、ｌ 、、Ｆ 、Ｎβ■］−
５を得た。ｐＴｕｌＦＮβＨ−５よりβＩＦＮ遺伝子を
切り出し、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＫ
ＹＰ−１２にクローン化し□た□。すなわち、ｐＫＹＰ
−１２ＤＮＡ２μｇに制限酵素Ｃｏａｌを４単位加え、
１０ｍＭＴｒ ｉ ５−１１ＣＩｌ（ｐＨ７，５）、６
ｍＭＭｇＣｊ！２゜５ｍＭジチオスレイトール（以下Ｃ
ｌａバッファーとよぶ）中（全量３０μｌ）で、３７°
Ｃ，２時間反応させた後、ＮａＣｊ＋を最終濃度１００
ｍＭになるように加えてさらに３７℃で２時間反応を続
けた。次いで６５℃で５分間加熱して酵素を失活させ、
低融点アガロース・ケル電気泳動法で約５ Ｋ ｂ １
７） ｔ ｒ ｐプロモーターを含むＤＮＡ断片を相製
し、１．２／ｊｇを得た。次にｐＴｕｌＦＮβＨ−５Ｄ
ＮＡ断片１ｇを上と同様に制限酵素Ｃｌａ■と１３ａｍ
ＨＩで消化し、低融点アガロース・ゲル電気泳動法でｔ
ｉ製し、β−ＩＦＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１，ＩＫ
ｂ）約ｌμｇを得た。以上のようにして得られる２個の
ＤＮＡ断片（第１２図の５Ｋｂと１．ＩＫｂ）を２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、６ｍＭＭｇ
Ｃｎ、２．５ｍＭジオチスレイトール、５００μＭＡＴ
’Ｐにとかし、１゛４ＤＮＡリガ一ゼ４単位を加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。得られたぐみかえ体プ
ラスミドの混合物を用□いて、常法通り、大腸菌ＨＢＩ
ＯＩを形質転換し Ａ Ｉ） Ｒのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第１２図
に示したｐｔ、Ｅ−３を得た。ｐＬＥ−３の構造はＣＲ
ａ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨＩで消
化後、アガロース・ゲル電気泳動により確認した。プラ
スミドｐＬＥ−３のＳＤ配列（ＡＡＣＧ）から開始コド
ン（ＡＴＧ）までの塩基配列はｒＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧ
ＡＴ、ＧＪであることをマキサム・ギルバートの方法〔
＾、Ｍ、Ｍａｘａｍら：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ第７４巻、５６０頁（１９７７） ）で
確認した。
ｐＬＥ−３を含む大腸菌菌株はアメリカン・タイ少・カ
ルチャ゛−・コレクシ３ン（ＡＴＣＣ＞にＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｌ Ｌ Ｅ −３ＡＴＣＣ３
９０１０として寄託されている。
ルチャ゛−・コレクシ３ン（ＡＴＣＣ＞にＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｌ Ｌ Ｅ −３ＡＴＣＣ３
９０１０として寄託されている。
第１図は、本発明ベクターの一例で、翻訳開始信号ＡＴ
ＧとＳｐｈ を切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が１複したも
のの模式図である。 第２図は、本発明ベクターに利用できる制限酵素の切断
形を示す。 第３図は、本発明ベクターにＤＮＡポリメラーゼ！・Ｋ
１ｅｎＯＷ断片を用いて外来遺伝子を組込む工程を示す
。 第４図は、本発明ベクターにターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて外来遺伝子を絹込む工程を示す。 第５図は、プラスミドｐＫＹＰ １００の造成工程ｔｒ
ｐプロモーターを含む約１８０ ｂｐのＤＮＡ断片、３
はｔｒｐプロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片
、４はＸｈｏ ｌリンカ−１５はプラスミドｐＢＲ３２
２，６はｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片、７はプラ・スミド
ｐＫＹＰ１００を示す。 菓６図れ、プラスミドｐＴｒｓ３の造成工程を示す。図
中旦はプラスミドｐＫＹＰ １００、遣はｐＫＹＰｌｏ
ｏの約３．８２ｋｂ断片、りは２４ｍの合成メリゴメク
レオチドが対合した２本船ＤＮＡ、１１はプラスミドｐ
ＴｒＳ ３を示す。 □第７図は、ｐＫＹＰ
−５の造成工程を示す。 第８図は、ｐＫＹＰ−１０の造成工程を示す。 第９図は、ｐＦＪ−１２３，の層成工程を示す。 第１０図は、ｐＦＭ−９の造成工程を示す。 第１１図（Ａ）は、ｐＫＹＰ−１１の造成工程を示す。 、（Ｂ）は、ｐＫＹＰ−１２の構造を示す。 第１２図は、ｐＬＥ−３の造成工程を示す。 財団法人 癌 研 究 会 理事長安西 浩 −４・ 第６図 ↓Ｃ１ａｌ ↓５ｐｈｌ ↓ＬＧＴ−ＡＧＥ 第７図 １（ｉｎｄｌｌＩ 第８図 第９図 （ ５ＱｍＭｌ 第１０図 第１１図 ｒＡ＋ （Ｂ） １−続＋４１ｉ正居 昭和５８年８月ＩＩ日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１２２８２号 ２、発明の名称 新規ベクター ３、補正をする者 事（’ｌとの関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁口６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置 ：’０３−
２０１−７２１１内線２７５１）５、補正の内容 別紙のとおり 特許請求の範囲 （１） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクター。 （２）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲Ｎ５１項記載の発現ブクター
。 （３）制限酵素がＳ ｐ ｋｌＩ 、 Ｅ ｃ ｏ
ＲＶ 、 Ｋ ｐ ｎ １または５ａｃｌであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター
。 （４） プロモーターか原核細胞由来のプロモーター
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発
現ベクター。 （５） プロモーターかｔｒｐ系、１４ａｃ系および
λフアージ系の大腸菌プロモーターまたは枯草菌プロモ
ーターであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記
載の発現ベクター。 （６） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （７） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出床α１を切断形として残す制御板酵素の認識配列が存
在する発現ベクターを制限酵素で切断後。 生じた３′−突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅ
ｎ咋断片）またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平坦
末端に変え、外来遺伝子を該平坦末端に組込んだ組換え
体で宿主微生物を形質転換し。 得られる形質転換株を培養することにより該外来遺伝子
を発現させる方法。 （８） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクターを制限酵素で切断後。 生じた３′−突出末端にターミナル・デオキシヌクレオ
チジル・トランスフェラーゼを用いてホモホ０リマー・
ブロックを付加し、これと相補的なホモ・ポリマー・ブ
ロックを付加した外来遺伝子を組込んだ組換え体で宿主
微生物を形質転換し、得られる形質転換株を培養するこ
とにより該外来遺伝子を発現させる方法。 （９）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧ’ＴＧであること
を特徴とする特許請求の範囲第７または８項記載の方法
。 α０） 制限酵素が５ｐｈｌ、ＥｃｏＲＶ、Ｋｐｎｒま
たは３ａｃｌであることを特徴とする特許請求の範囲第
７または８項記載の方法。 （６） プロモーターが原核細胞由来のプロモーターで
あることを特徴とする特許請求の範囲第７または８項記
載の方法。 ■ プロモーターがｔｒｐ系、ｌａｃ系およびλフアー
ジ系の大腸菌プロモーターであることを特徴とする特許
請求の範囲第１１項記載の方法。 ａの プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とする特
許請求の範囲第７または８項記載の方法。 ■ 特許請求の範囲第１項記載の発現ベクターを含む微
生物。 （ト） エソシエリヒア・コリＩＴｒＳ−３゜（１Ｇ）
外来遺伝子がインターフェロンの遺伝子り亙ぶｉΔ版専
鉢であることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
方法。 （１７） 宿主微生物が大腸菌に属することを特徴と
する特許請求の範囲第７項記載の方法。
ＧとＳｐｈ を切断部位（ＧＣＡＴＧＣ）が１複したも
のの模式図である。 第２図は、本発明ベクターに利用できる制限酵素の切断
形を示す。 第３図は、本発明ベクターにＤＮＡポリメラーゼ！・Ｋ
１ｅｎＯＷ断片を用いて外来遺伝子を組込む工程を示す
。 第４図は、本発明ベクターにターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて外来遺伝子を絹込む工程を示す。 第５図は、プラスミドｐＫＹＰ １００の造成工程ｔｒ
ｐプロモーターを含む約１８０ ｂｐのＤＮＡ断片、３
はｔｒｐプロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片
、４はＸｈｏ ｌリンカ−１５はプラスミドｐＢＲ３２
２，６はｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片、７はプラ・スミド
ｐＫＹＰ１００を示す。 菓６図れ、プラスミドｐＴｒｓ３の造成工程を示す。図
中旦はプラスミドｐＫＹＰ １００、遣はｐＫＹＰｌｏ
ｏの約３．８２ｋｂ断片、りは２４ｍの合成メリゴメク
レオチドが対合した２本船ＤＮＡ、１１はプラスミドｐ
ＴｒＳ ３を示す。 □第７図は、ｐＫＹＰ
−５の造成工程を示す。 第８図は、ｐＫＹＰ−１０の造成工程を示す。 第９図は、ｐＦＪ−１２３，の層成工程を示す。 第１０図は、ｐＦＭ−９の造成工程を示す。 第１１図（Ａ）は、ｐＫＹＰ−１１の造成工程を示す。 、（Ｂ）は、ｐＫＹＰ−１２の構造を示す。 第１２図は、ｐＬＥ−３の造成工程を示す。 財団法人 癌 研 究 会 理事長安西 浩 −４・ 第６図 ↓Ｃ１ａｌ ↓５ｐｈｌ ↓ＬＧＴ−ＡＧＥ 第７図 １（ｉｎｄｌｌＩ 第８図 第９図 （ ５ＱｍＭｌ 第１０図 第１１図 ｒＡ＋ （Ｂ） １−続＋４１ｉ正居 昭和５８年８月ＩＩ日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１２２８２号 ２、発明の名称 新規ベクター ３、補正をする者 事（’ｌとの関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁口６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置 ：’０３−
２０１−７２１１内線２７５１）５、補正の内容 別紙のとおり 特許請求の範囲 （１） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクター。 （２）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲Ｎ５１項記載の発現ブクター
。 （３）制限酵素がＳ ｐ ｋｌＩ 、 Ｅ ｃ ｏ
ＲＶ 、 Ｋ ｐ ｎ １または５ａｃｌであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター
。 （４） プロモーターか原核細胞由来のプロモーター
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発
現ベクター。 （５） プロモーターかｔｒｐ系、１４ａｃ系および
λフアージ系の大腸菌プロモーターまたは枯草菌プロモ
ーターであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記
載の発現ベクター。 （６） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 （７） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出床α１を切断形として残す制御板酵素の認識配列が存
在する発現ベクターを制限酵素で切断後。 生じた３′−突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅ
ｎ咋断片）またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平坦
末端に変え、外来遺伝子を該平坦末端に組込んだ組換え
体で宿主微生物を形質転換し。 得られる形質転換株を培養することにより該外来遺伝子
を発現させる方法。 （８） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３′−突
出末端を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在す
る発現ベクターを制限酵素で切断後。 生じた３′−突出末端にターミナル・デオキシヌクレオ
チジル・トランスフェラーゼを用いてホモホ０リマー・
ブロックを付加し、これと相補的なホモ・ポリマー・ブ
ロックを付加した外来遺伝子を組込んだ組換え体で宿主
微生物を形質転換し、得られる形質転換株を培養するこ
とにより該外来遺伝子を発現させる方法。 （９）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧ’ＴＧであること
を特徴とする特許請求の範囲第７または８項記載の方法
。 α０） 制限酵素が５ｐｈｌ、ＥｃｏＲＶ、Ｋｐｎｒま
たは３ａｃｌであることを特徴とする特許請求の範囲第
７または８項記載の方法。 （６） プロモーターが原核細胞由来のプロモーターで
あることを特徴とする特許請求の範囲第７または８項記
載の方法。 ■ プロモーターがｔｒｐ系、ｌａｃ系およびλフアー
ジ系の大腸菌プロモーターであることを特徴とする特許
請求の範囲第１１項記載の方法。 ａの プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とする特
許請求の範囲第７または８項記載の方法。 ■ 特許請求の範囲第１項記載の発現ベクターを含む微
生物。 （ト） エソシエリヒア・コリＩＴｒＳ−３゜（１Ｇ）
外来遺伝子がインターフェロンの遺伝子り亙ぶｉΔ版専
鉢であることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
方法。 （１７） 宿主微生物が大腸菌に属することを特徴と
する特許請求の範囲第７項記載の方法。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） プロモーター、リポソーム結合部位および翻
訳開始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３１−突
出末端を切断形として讐す制、！素の認識配列が存在す
る発現、ベクタ、＝。 （２）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧである５゜こ
とを特徴とする特許請求、の範囲第１項記弊。 の発現ベクター。 （３）制限酵素が８ｐｈＬ Ｅｃ ｏＲＶｔ 、 Ｋｐ
ｎＩ マたは５ａｅＩであること、を特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の発現ベクター。 。 （４）プロモーターが原核細胞由来のプロモーターであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の発現ベ
クター。 、１（５）プロモーターがｔｒ
ｐ系ａ Ｉ＆ｃ系セよびλフアージ系の大腸菌プロモー
ターまたは枯草菌プロモーターであることを特徴とする
特許請求の範囲第４項記載の発現ベクター。 （６）プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号が真核細胞由来のものであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の発現べ□フタ−。 ゛ （７）プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３１−突出末
端を切断形として残す制限酵素の認識配列が゛存在する
発現ベクターを制限酵素で切断後、生じた３１−突出末
端をＤＮＡ ゛ポリメラーゼｌ （Ｋｌｅｎｏｗ断片
）またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平坦末端に変
え、外来遺伝子を該早坦末端に組込んだ組換え体で宿主
微生物を形質転換し、得られる形質転換株を培養するこ
とにより該外来遺伝子を発現させる方法。 （８）グロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開
始信号を有し、かつ翻訳開始信号に続いて３−突出末端
を切断形として残す制限酵素の認識配列が存在する発現
ベクターを制限酵素で切断後、生じた３′−突出末端に
ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラ
ーゼを用いてホモ・ポリマー・ブロックを付加し、これ
と相補的なホモ・ポリマー・プ日ツクを付加した外来遺
伝子を組込んだ組換え体で宿主微生物を一形質転換し、
得られる形質転換株を培養することにより該外来遺伝子
を発現させる方法。 （９）翻訳開始信号がＡＴＧまたはＧＴＧであることを
特徴とする特許請求の範囲第７または８項記載の方法。 （１０） 制限酵素が５ｐｈｌ、 ＥｃｏＲＶｔ Ｋ
ｐｎＩまたは５ａｃＩであることを特徴とする特許請求
の範囲第７または８項記載の方法。 αυ プロモーターが原核細胞由来のプロモーターであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第７または８項記載
の方法。 ０．２１ プロモーターがｔ、ｙｐ系、 １ｔｈ６系
およびλフアージ系の大腸菌プロモーターであることを
特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。 餞 プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳開始
信号が真核細胞由来のものであることを特徴とする特許
請求の範囲第７″！、たは８項記載の方法。 （１４） 特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター
を含む微生物。 Ｑ５） エッシエリヒア・コリ エ’Ｉ’ｒＳ−３゜
α６）外来遺伝子がインターフェロンの遺伝子であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 （１７） 宿主微生物が大腸菌に属することを特徴と
する特許請求の範囲第７項記載の方法。 （１８）エッシエリヒア・コリ ＩＦＪ−１２３゜（１
９）エッシエリヒア・コリ ＩＦＭ −９゜
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58012282A JPS59140883A (ja) | 1983-01-28 | 1983-01-28 | 新規ベクタ− |
| AT83902695T ATE55781T1 (de) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Neuer vektor. |
| DE1983902695 DE121569T1 (de) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Neuer vektor. |
| PCT/JP1983/000276 WO1984001583A1 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
| EP83902695A EP0121569B1 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
| AU19421/83A AU575301B2 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
| ES526324A ES526324A0 (es) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Un procedimiento para la expresion de un gen extrano. |
| IT68033/83A IT1160124B (it) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Vettore di espressione di plasmidi relativo procedimento per l'espressione di un gene estraneo e relativi microorganismi |
| DE19833336586 DE3336586A1 (de) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Neuer expressionsvektor |
| IL69926A IL69926A (en) | 1982-10-08 | 1983-10-07 | Plasmid expression vector with insertion site for structural gene and processes for the production thereof |
| DK280084A DK280084A (da) | 1982-10-08 | 1984-06-07 | Hidtil ukendt vektor |
| NO842296A NO842296L (no) | 1982-10-08 | 1984-06-07 | Ny vektor |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58012282A JPS59140883A (ja) | 1983-01-28 | 1983-01-28 | 新規ベクタ− |
| PCT/JP1983/000276 WO1984001583A1 (en) | 1982-10-08 | 1983-08-24 | Novel vector |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59140883A true JPS59140883A (ja) | 1984-08-13 |
Family
ID=11801001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58012282A Pending JPS59140883A (ja) | 1982-10-08 | 1983-01-28 | 新規ベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59140883A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57177192A (en) * | 1981-04-24 | 1982-10-30 | Citizen Watch Co Ltd | Drive circuit for electrochromic display element |
-
1983
- 1983-01-28 JP JP58012282A patent/JPS59140883A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57177192A (en) * | 1981-04-24 | 1982-10-30 | Citizen Watch Co Ltd | Drive circuit for electrochromic display element |
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