DE69229613T2

DE69229613T2 - Neurotrophen-Peptidderivat

Info

Publication number: DE69229613T2
Application number: DE69229613T
Authority: DE
Inventors: Hideo Agui; Nobuyuki Fukushima; Tsunemasa Irie; Shin-Ichi Kojima; Toshio Nishihara; Kosei Ojika; Keiichi Ono; Naoki Tohdoh; Shin-Ichiro Tojo; Yasuyuki Ueki
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1991-04-27
Filing date: 1992-04-27
Publication date: 2000-04-13
Anticipated expiration: 2012-04-28
Also published as: KR920019928A; CA2067039A1; EP0511816A3; EP0511816A2; ATE182361T1; JPH05268966A; DE69229613D1; EP0511816B1

Description

NEUROTROPHES PEPTID-DERIVAT

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die mit einem neurotrophen Faktor in Zusammenhang sehen, und Gene davon, insbesondere neurotrophe Peptide und Gene davon. Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft neurotrophe Peptide (ein sogenanntes neurostimulierendes Peptid), die vom Menschen stammen und die als Arzneistoffe eingesetzt werden können, vom Menschen und von Ratten stammende Vorläufer-Polypeptide, Gene, die diese codieren, und Transformanten, die rekombinante Expressionsvektoren enthalten, welche diese Gene umfassen. Die Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, die diese neurotrophen Peptide als Wirkstoffe umfassen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue neurotrophe Peptide, nämlich vom Menschen stammende neurotrophe Peptide mit der Aktivität eines neurotrophen Faktors, die den aus Ratten-Hippocampus stammenden neurotrophen Peptiden mit der Aktivität eines neurotrophen Faktors entsprechen, oder Derivate eines neurotrophen Peptids, die einen Teil von dessen Aminosäuresequenz enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vorläufer-Polypeptide, die neurotrophe Peptide enthalten, die aus Ratten-Hippocampus oder vom Menschen stammen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Gene, welche die aus Ratten- Hippocampus oder vom Menschen stammenden neurotrophen Peptide, Vorläufer- Polypeptide davon oder Peptide codieren, die einen Teil davon umfassen; und Bakterien-, Hefe- oder Säugerzellen, die mit rekombinanten Expressionsvektoren transformiert sind, in welche diese Gene eingebaut sind. Die Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, die als Wirkstoffe die neurotrophen Peptide der vorliegenden Erfindung, Derivate davon oder Vorläufer-Polypeptide davon umfassen.

Stand der Technik

Bisher sind verschiedene Berichte über neurotrophe Faktoren erschienen. Z. B. werden in EP-A-0 390 602 ein neurotrophes Peptide der Sequenz Ala Ala Asp Ile Ser Gln Trp Ala Gly Pro Leu und ein Derivat davon beschrieben. Das cholingerge neurotrophe Peptid aus dem Hippocampus (HCNP) ist ein aus 11 Aminosäureresten zusammengesetztes neurotrophes Peptid, das von Ojika et al. aus dem Hippocampus-Gewebe neugeborener Ratten isoliert wurde. Dieses Peptid steigert die Produktion von Acetylcholin für acetylcholinerge Neuronen des "medial septum nuclei" in Ratten (Referenz 1). Ojika et al. beschreiben außerdem HCNP-Derivate mit einem niedrigeren Molekulargewicht (Referenz 2). Proteinartige Faktoren, die bereits isoliert wurden und deren Primärstrukturen bekannt sind, sind der Nervenwachstumsfaktor (NGF; Referenz 3), der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF; Referenz 4) und der ziliare neurotrophe Faktor (CNTF; Referenz 5). Kürzlich wurde ein Neurotrophin-3 (NT-3) genannter Faktor cloniert, der eine große Ähnlichkeit mit NGF und BDNF aufweist (Referenzen 6, 7, 8). NGF, BDNF und CNTF sind proteinartige Faktoren mit Molekulargewichten von 13 259, 13 511 bzw. 22 660; das clonierte NT-3 (NGF-2) ist auch ein Protein, das insgesamt 119 Aminosäuren aufweist. Deshalb ist mit erheblichen Problemen bezüglich Bioverfügbarkeit, industrieller Herstellung usw. zu rechnen, wenn diese Faktoren als Mittel zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden. In dieser Hinsicht ist das aus Ratten erhaltene HCNP ein Peptidfaktor von Interesse, denn es besteht aus nur 11 Aminosäureresten und seine Derivate weisen ein niedrigeres Molekulargewicht auf, wie vorstehend beschrieben. Damit können diese Probleme gelöst werden.
Das nach dem Stand der Technik erhaltene HCNP ist ein Faktor, der aus dem Gehirn von Ratten stammt, wenn das HCNP jedoch zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen bei höheren Säugern, z. B. beim Menschen, eingesetzt werden soll, ist es wünschenswert, einen Faktor einzusetzen, der aus der entsprechenden Tierart stammt. Somit ist es sehr wünschenswert, insbesondere ein vom Menschen stammendes HCNP und Derivate davon, die eine dem HCNP entsprechende pharmakologische Aktivität besitzen, zu entwickeln. Bisher wurden jedoch noch keine zufriedenstellenden Verbindungen erhalten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst die vorstehenden Probleme des Stands der Technik.
Das heißt, eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer neurotropher Peptide (nachstehend manchmal mit "HCNP" abgekürzt), die auf acetylcholinerge Neuronen eine neurotrophe Aktivität ausüben.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Genen, die die vorstehenden neurotrophen Peptide codieren.
Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Transformanten, die Expressionsvektoren enthalten, welche die vorstehend beschriebenen Gene umfassen.
Eine vierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Zusammensetzungen für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.
Um die vorstehenden Probleme lösen zu können, führten die Erfinder die Clonierung des Gens durch, das das Vorläufer-Protein codiert, welches das aus Rattengehirn stammende HCNP enthält, sie vorfolgten damit das Ziel, die Aminosäuresequenz des vom Menschen stammenden HCNP zu bestimmen, das dem aus Rattengehirn stammenden HCNP entspricht.
Denn es wird als sehr wichtig angesehen, den Mechanismus der Expression des vorstehenden HCNP-enthaltenden Vorläufer-Proteins und der Prozessierung des auf diese Weise erzeugten Proteins aufzuklären, auch deswegen war die Clonierung des Gens erforderlich, welches das Vorläufer-Protein codiert.
Insbesondere erfolgte die Bestimmung des Vorläufer-Protein-codierenden Gens anhand einer cDNA-Genbank, die unter Verwendung einer aus Ratten- Hypocampus-Gewebe erhaltenen mRNA hergestellt wurde, wobei polyclonale Antikörper gegen das vorstehend beschriebene, aus 11 Aminosäuren zusammengesetzte Ratten-HCNP eingesetzt wurden.
Als Ergebnis wurde das Vorläufer-Gen, enthaltend Ratten-HCNP, aus den gesamten Genen erfolgreich isoliert, die im Hippocampus-Gewebe der neugeborenen Ratte auf Zellen wirken. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung erhalten.
Ferner wurde auch das Gen, welches das menschliche Vorläufer-Polypeptid codiert, erfolgreich aus dem das Ratten-Vorläufer-Polypeptid codierenden Gen isoliert. Außerdem wurde die Aktivität eines neurotrophen Faktors in einem aus 11 Aminosäuren zusammengesetzten menschlichen Peptid festgestellt, das dem neurotrophen Peptid der Ratte entsprach. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft
(1) ein Gen, das ein neurotrophes Peptid mit der Sequenz Nr. 15 codiert;
(2) ein Gen, das ein Polypeptid mit der Sequenz Nr. 14 codiert;
(3) ein neurotrophes Peptid mit einer Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 15;
(4) ein Vorläufer-Polypeptid mit der Sequenz Nr. 14;
(5) Bakterien-, Hefe- oder Säugerzellen, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert sind, der das Gen enthält; und
(6) eine Zusammensetzung, die als Wirkstoff die vorstehenden neurotrophen Peptide umfaßt.
Fig. 1 zeigt die Sequenz einer Oligonucleotid-Sonde, die zum Absuchen des Clons verwendet wurde.
Von den Nucleotidsequenzen, die von der Aminosäuresequenz des aus Ratten-Hippocampus stammenden neurotrophen Peptids hergeleitet wurden, ist der verwendete Sonden-Bereich dargestellt.
1) Sonden in 72 verschiedenen Ausführungen wurden synthetisiert, wobei die Sonden im Mittelteil der Nucleotidsequenz vorlagen. Im vorliegenden Fall wurden für die im Mittelteil liegenden Sonden drei verschiedene Gruppen von Sonden, die aus 17 Nucelotiden zusammengesetzt waren, jeweils in 24 verschiedenen Kombinationen synthetisiert, wie zur Erläuterung dargestellt, und die äquimolaren Mengen gemischt, um die Sonde herzustellen.
2) Die Sonde am C-Terminus ist ein Sondengemisch aus 16 Nucleotiden in 256 verschiedenen Kombinationen.
Fig. 2 zeigt die Restriktionsenzymkarte des Vorläufer-Gens des neurotrophen Peptids aus Ratten-Hippocampus und die Vorgehensweise zur Bestimmung der Nucleotidsequenz.
In der Figur ist das Spaltungsmuster des Vorläufer-Genclons (A61-cDNA) mit Restriktionsenzymen dargestellt. In der A61-cDNA (Fragment von etwa 1 kb mit EcoRI) liegen Spaltstellen für HincII, Sacll, Pstl und Smal vor. Unter Verwendung dieser Spaltstellen wurde der Clon einer Subclonierung unterworfen und die Nucleotidsequenz in dem durch Wellenlinien bezeichneten Bereich bestimmt. Die fette Linie in der A61-cDNA zeigt das offene Leseraster, das bei der Bestimmung der Nucleotidsequenz als Ergebnis erhalten wurde.
Fig. 3 zeigt, zusammen mit Fig. 4, die gesamte Nucleotidsequenz des Clons A61-cDNA, die das Gen des neurotrophen Peptid-Vorläufers aus Ratten- Hippocampus enthält.
Außerdem ist die aus der Nucleotidsequenz hergeleitete Aminosäuresequenz dargestellt. Vom N-Terminus des offenen Leserasters aus wurde eine Sequenz mit 11 Aminosäuren erhalten, die die Aktivität eines neurotrophen Faktors aufwies. Die Zahl der Aminosäuren, die das offene Leseraster darstellten, betrug 186. In der Figur bezeichnet der unterstrichene Bereich ein Poly-(A)-Additions- Signal. Die ATG-Sequenz, die ein Translations-Initiationscodon darstellt, ist nicht im offenen Leseraster enthalten.
Fig. 4 zeigt, zusammen mit Fig. 3, die gesamte Nucleotidsequenz des Clons A61-cDNA, die das Vorläufer-Gen des neurotrophen Peptids aus Ratten- Hippocampus enthält.
Fig. 5 zeigt die Aminosäuresequenz, die aus der in den Fig. 3 und 4 dargestellten Nucleotidsequenz hergeleitet ist. Das Translations-Initiationscodon ist in dieser Aminosäuresequenz nicht enthalten.
Fig. 6 zeigt die Schritte der Insertion des aus Ratten und Menschen stammenden Vorläufer-Gens des neurotrophen Peptids in einen Abkömmling des E. coli-Expressionsvektors pKK233-2.
Die EcoRI-Termini des Vorläufer-Gens des neurotrophen Peptids aus Ratten-Hippocampus (AO10-12-cDNA) wurden durch die DNA-Polymerase I (Klenow- Fragment) mit glatten Enden versehen, um sie in den E. coli-Expressionsvektor pKK233-2 übertragen zu können. Der E. coli-Expressionsvektor pKK233-2 wurde mit glatten Enden versehen, indem er mit Ncol gespalten und anschließend mit Mungobohnen-Nuclease behandelt wurde, auf diese Weise wurde der Smal-Linker eingefügt. Der so konstruierte Vektor wurde mit Smal gespalten und sodann mit Phosphatase behandelt, um das vorstehend beschriebene Vorläufer-Gen übertragen zu können. Die clonierten rekombinanten Vektoren wurden mit pKK233-2- AO10-12 und pKK233-2-p13 bezeichnet.
Fig. 7 zeigt die Schritte der Übertragung der Vorläufer-Gene des neurotrophen Peptids aus Ratten- und Mensch-Hippocampus in einen eukaryotischen Expressionsvektor.
Der Expressionsvektor mit den übertragenen Genen wurde durch die folgenden Verfahren konstruiert. Nachdem die MMTV-LTR-enthaltende pMDSG-DNA mit HindIII gespalten worden war, wurde ein MMTV-LTR-enthaltendes 1,4-kb-großes DNA-Fragment mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) behandelt, um es mit glatten Enden zu versehen. Der Xbal-Linker wurde zugefügt und in die Xbal-Stelle von pBluescript II eingefügt. Ferner wurde nach der Spaltung einer SV40-DNA mit Bcll-EcoRI ein 1-kb-großes DNA-Fragment, welches das Poly-(A)-Additions-Signal umfaßte, genauso mit glatten Enden versehen. Der XhoI-Linker wurde zugefügt und anschließend pBluescript II in die XhoI-Stelle eingefügt. Sodann wurde ein 2,6-kb- BamHI-Fragment von pMAM-neo, welches das Neomycin-Resistenz-Gen enthielt, in die BamHI-Stelle von pUC19 eingefügt, wobei vorher der Kpnl-Linker in die Smal-Stelle eingefügt worden war. 2,6-kb der Kpnl-Spaltprodukte wurden in die Kpnl-Stelle des konstruierten Expressionsvektors eingefügt. Die AO10-12- und pl-3- Gene wurden in die EcoRI-Stelle des auf diese Weise konstruierten Vektors eingefügt und die clonierten rekombinanten Vektoren mit pMMTV-LTR-AO10-12 und pMMTV-LTR-p13 bezeichnet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das Gen, welches das Ratten-Vorläufer-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird erhalten, indem die mRNA aus dem Hippocampus-Gewebe von neugeborenen Ratten im Alter von 12 Tagen nach der Geburt präpariert wird, in welchen das Vorliegen des aus Ratten-Hippocampus stammenden neurotrophen Peptids festgestellt wurde, indem sie in herkömmlicher Art und Weise in doppelsträngige cDNA umgewandelt wird, ein durch die cDNA codiertes Protein in E. coli synthetisiert wird und die Clone isoliert werden, die eine Reaktivität mit einem Antikörper gegen das aus Ratten-Hippocampus stammende neurotrophe Peptid zeigen.
Die Gesamt-RNA aus dem Hippocampus-Gewebe von neugeborenen Ratten, wie vorstehend beschrieben, kann nach einem herkömmlichen Verfahren präpariert werden, das bereits zur Clonierung verschiedener physiologisch aktiver Proteine eingesetzt wurde. Z. B. gibt es ein Verfahren, bei dem die Gesamt-RNA aus den Zellen in Gegenwart von grenzflächenaktiven Mitteln, wie z. B. SDS, NP-40, Triton-X100 usw., oder in Gegenwart von Phenol extrahiert wird (Referenzen 10, 11). In diesem Fall ist die Zugabe von RNase-Inhibitoren erwünscht, wie z. B. Vanadium-Komplexen, Heparin, Bentonit, Diethylpyrocarbonat usw., um die Spaltung von RNA durch RNase zu verhindern. Die Gesamt-RNA kann auch erhalten werden, indem die Zellen durch physikalische Verfahren unter Verwendung eines Homogenisators usw. homogenisiert werden, die Zellen mit Guanidinthiocyanat behandelt und anschließend die Gesamt-RNA durch Cäsiumchlorid-Dichtegradienten- Zentrifugation gefällt wird (Referenzen 10, 12, 13). Als nächstes wird die polyadenylierte mRNA aus der Gesamt-RNA gereinigt, die durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Für die Reinigung kann eine Affinitätssäule verwendet werden, die gepackt ist mit Oligo-(dT)-Cellulose, Poly-U- Sepharose, die durch Bindung von Poly-U erhalten wird, usw. (Referenzen 14, 15). In einer anderen Ausführungsform, wenn die Größe der mRNA bereits bekannt ist oder eine Fraktionierung aufgrund der Größe der mRNA erwünscht ist, kann eine Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation (Referenz 16), Agarose-Gel-Elektrophorese, Gelfiltration unter Verwendung einer Säule usw. eingesetzt werden. Die auf diese Weise erhaltenen Poly-(A)-mRNA wird daraufhin untersucht, ob sie das gewünschte Protein codiert. Für die Untersuchtung werden einige der folgenden Verfahren angewendet.
1) Die präparierte mRNA wird direkt in ein Protein translatiert, und die physiologischen Eigenschaften des auf diese Weise produzierten Proteins werden untersucht. In diesem Fall kann die mRNA entweder in eine Eizelle von Xenopus laevis eingeführt werden (Referenz 17, 18), oder ein Protein kann in vitro unter Ver wendung von Kaninchen-Reticulocyten oder Weizenkeimextrakt synthetisiert werden (Referenz 16).
2) Einzelsträngige cDNA wird synthetisiert, indem die mRNA als Matrize eingesetzt wird, und anschließend wird doppelsträngige cDNA synthetisiert. Die doppelsträngige cDNA wird in einen geeigneten Vektor eingebaut, dessen Rekombination mit einem Wirt erfolgt, z. B. mit E. coli oder mit einem eukaryotischen Wirt usw., wodurch der Expressionsvektor eingeführt wird. Wenn ein Expressionsvektor als Vektor verwendet wird, wird die Expression in dem Wirt bewirkt, in welchen die Protein-codierende cDNA transduziert wurde, und der gewünschte Clon kann selektiert werden, indem ein gegen das gewünschte Protein gerichteter Antikörper eingesetzt wird. Außerdem kann eine partielle Aminosäuresequenz des vorher hergestellten Proteins bestimmt, ein Oligonucleotid synthetisiert und der gewünschte Clon selektiert werden, indem das Oligonucleotid als Sonde eingesetzt wird.
Als erstes wird unter Verwendung der mRNA als Matrize eine zu der mRNA komplementäre, einzelsträngige cDNA durch reverse Transkriptase (die vom Vogel- Myeloblastose-Virus (AMV) oder vom murinen Leukämie-Virus (Mo-MLV) stammt) in Gegenwart von dATP, dGTP, dCTP und dTTP unter Verwendung eines Oligo- (dT)-Primers (Referenzen 19, 20) oder eines aus sechs Basen bestehenden Zufallsprimers (Referenzen 21, 22) synthetisiert. Anschließend wird, nachdem die mRNA durch eine Alkalibehandlung gespalten wurde, eine doppelsträngige cDNA durch reverse Transkriptase oder DNA-Polymerase unter Verwendung der einzelsträngigen cDNA als Matrize synthetisiert. Die doppelsträngige cDNA kann auch durch direkte Wirkung von RNase-H und E. coli-DNA-Polymerase I synthetisiert werden (Referenz 19). Danach werden die beiden Enden der synthetisierten doppelsträngigen cDNA in jedem Fall in glatte Enden umgewandelt, wobei ein Enzym wie S1-Nuclease, T4-DNA-Polymerase und E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow- Fragment) usw. eingesetzt wird. Damit die auf diese Weise synthetisierte doppelsträngige cDNA mit den glatten Enden in einen geeigneten Vektor eingefügt werden kann, wird sie an den Enden modifiziert, indem eine chemisch synthetisierte DNA angefügt wird, wie z. B. ein Linker oder ein Adaptor (Referenzen 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29), oder indem eine dG- oder dC-Kette durch terminale Desoxynucleotidyl- Transferase angefügt wird (Referenzen 30, 31).
Die auf diese Weise erhaltene doppelsträngige cDNA wird in einen Vektor eingebaut, wobei als ein solcher Vektor häufig Plasmidvektoren vom Typ EK1, wie z. B. pBR322, pUC19, pSC101, ColE1, Honjo-Vektor usw., oder λ-Phagenvektoren, wie z. B. λgt10, λgt11, λgtWES, λzap usw., eingesetzt werden. Wenn die doppelsträngige cDNA in diese Vektoren eingebaut werden soll, kann sie mit den Vektoren durch die Wirkung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP ligiert werden.
Nachdem die doppelsträngige cDNA in den geeigneten Vektor eingebaut wurde, wie vorstehend beschrieben, wird E. coli (Stamm AG-1, HB101, JM109, DH5, C600, Y1090, LE392 usw.) transformiert, wodurch DNA einer Gruppe von Transformanten erhalten wird (die nachstehend als cDNA-Genbank bezeichnet wird).
Wenn die doppelsträngige cDNA in einen Plasmidvektor eingebaut und dieser zur Transformation von E. coli eingesetzt werden soll, werden kompetente Zellen, die diese DNA einbauen können, in der exponentiellen Wachstumsphase gewonnen und durch das Verfahren transformiert, das von Hanahan ausführlich beschrieben wird, das in Gegenwart von CaCl&sub2;, MgCl&sub2; oder RbCl erfolgt (Referenzen 32, 33). Wenn ferner die doppelsträngige cDNA in einen Phagenvektor eingebaut und dieser zur Transformation von E. coli eingesetzt werden soll, wird die durch die T4-DNA-Ligase ligierte DNA in Phagenpartikel durch in vitro-Verpackung eingeführt und E. coli damit infiziert, wodurch die Transformation bewirkt wird (Referenz 10).
E. coli, welches das Vorläufer-Gen enthält, welches das aus Ratten- Hippocampus stammende neurotrophe Peptid codiert, kann transformiert und selektiert werden, wobei eines der folgenden zwei Verfahren eingesetzt werden kann.
1) Eine Nucleotidsequenz wird aus der Aminosäuresequenz von Sequenz Nr. 17 hergeleitet und chemisch synthetisiert. Die Nucleotidsequenz wird als Sonde eingesetzt. In diesem Fall entspricht jedoch nicht immer ein einziges Godon einer bestimmten Aminosäure (Wobble-Hypothese), und deshalb ist es wünschenswert, einen Bereich als Oligonucleotid-Sonde zu verwenden, der die kleinste Anzahl von Kombinationen in der Nuceotidsequenz aufweist. Außerdem ist es wünschenswert, daß als Oligonucleotid-Sonde eine Vielzahl von Bereichen eingesetzt wird. Die Transformanten können durch Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung usw. selektiert werden (Referenzen 10, 23, 24).
2) Aufgrund der Aminosäuresequenz von Sequenz Nr. 17 wird ein Oligopeptid chemisch synthetisiert; das synthetisierte Oligopeptid wird an ein Protein gebunden, wie z. B. Rinderserumalbumin usw.. Ein Antikörper gegen den auf diese Weise hergestellten Proteinkomplex wird aus Kaninchen erhalten.
Wenn die doppeltsträngige cDNA in einen Vektor eingebaut wird und sie dabei in ein Gen eingefügt wird, das ein Protein, wie z. B. β-Galactosidase, codiert, wird das durch die cDNA codierte Protein in einer solchen Form exprimiert, daß das Protein mit dem anderen Protein, z. B. β-Galactosidase usw., fusioniert ist. Deshalb wird der rekombinante Expressionsvektor mit der eingebauten cDNA in den Wirt E. coli transfiziert, so daß Transformanten erhalten werden, und ein in den Transformanten produziertes Protein wird durch Western-Blotting an ein Membranfilter usw. fixiert, auf diese Weise kann ein Transformant isoliert werden, der das gewünschte Gen enthält (Referenzen 23, 25, 26, 27, 28, 29). Der gewünschte Transformant kann einfach bestimmt werden, indem der Kaninchen-Antikörper nachgewiesen wird, der an das an dem Membranfilter fixierte Protein gebunden ist. Zum Nachweis des Kaninchen-Antikörpers können die Verfahren verwendet werden, die nachstehend beschrieben werden.
1) Ein biotinylierter Anti-Kaninchen-Ig-Antikörper wird mit dem an das Protein gebundenen Kaninchen-Antikörper umgesetzt. Anschließend wird Avidin oder Streptavidin mit einer hohen Bindungsaffinität für Biotin an das Reaktionsprodukt gebunden. Wenn vorher ein Enzym, wie z. B. Peroxidase usw., an Avidin und Streptavidin gebunden wurde, kann die gewünschte Transformante durch eine Enzymreaktion nachgewiesen werden (Referenzen 34, 35).
2) Ein Protein-A-Molekül, das eine hohe Bindungsaffinität für den Ig-Antikörper hat, wird mit dem Kaninchen-Antikörper umgesetzt, der an das gewünschte Protein gebunden ist. In diesem Fall kann die gewünschte Transformante durch ein Autoradiogramm nachgewiesen werden, indem das Protein A vorher mit einem Isotop markiert wird (Referenz 23).
3) Wenn der Anti-Kaninchen-Ig-Antikörper, der an ein Enzym, wie z. B. Peroxidase usw., gebunden ist, mit dem Kaninchen Antikörper umgesetzt wird, der an das gewünschte Protein gebunden ist, kann die gewünschte Transformante durch die Enzymreaktion nachgewiesen werden (Referenzen 36, 37, 38).
Die gewünschte Transformante kann durch alle diese Verfahren nachgewiesen werden, wobei jedoch Verfahren 1) aufgrund des geringsten Hintergrunds und der höchsten Empfindlichkeit besonders bevorzugt ist.
Das Ratten-Vorläufer-Gen, enthaltend das neurotrophe Peptid des Ratten- Hippocampus der vorliegenden Erfindung, kann wie vorstehend beschrieben cloniert werden, wodurch ein Gen erhalten wird, das die durch Sequenz Nr. 3 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. In der durch Sequenz Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 134 ein Glu, wobei an dieser Position jedoch auch ein Lys stehen kann. Ein solches Gen ist durch die Nucleotidsequenz von Sequenz Nr. 2 dargestellt. Die Sequenz Nr. 3 wurde auch von D. K. Grandy et al. beschrieben (Mol End. 9 (1990), 1370-1376). Das Protein, das dem auf diese Weise erhaltenen Vorläufer-Gen entsprach, zeigte eine extrem hohe Homologie (84,4%) zu dem bovinen Phosphatidylethanolamin-bindenden Protein (Referenz 9). Das neurotrophe Peptid aus Ratten-Hippocampus lag am N-Terminus des Vorläufer-Proteins vor.
Die Strukturen des neurotrophen Peptids des Ratten-Hippocampus und seiner Derivate mit einem niedrigeren Molekulargewicht wurden bereits durch die Referenzen 1 und 2 ermittelt, wie vorstehend beschrieben, jedoch wurde nichts über deren Gene veröffentlicht. Die Erfinder haben die in Sequenz Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz als ein Gen identifiziert, das die Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 17) des neurotrophen Peptids des Ratten-Hippocampus codiert, indem sie das Vorläufer-Gen aufgeklärt haben, wie vorstehend beschrieben.
Wenn man die auf diese Weise erhaltene cDNA des Ratten-Vorläufer-Gens, enthaltend das neurotrophe Peptid aus Ratten-Hippocampus, als Sonde einsetzt, kann man die Clonierung des menschlichen cDNA-Gens, das dem Ratten-Gen entspricht, durchführen.
Für die Gewinnung des menschlichen cDNA-Gens ist es erforderlich, eine cDNA-Genbank herzustellen, die aus verschiedenen Organen hergeleitet sein kann, z. B. aus menschlichem embryonalem Gehirn, erwachsenem Gehirn, Plazenta und dergleichen. Es ist schwierig, diese menschlichen Gewebe zu erhalten, inzwischen sind jedoch cDNA-Genbanken lieferbar.
In den meisten Fällen werden diese cDNA-Genbanken als Phagenpartikel angeboten, bei denen die cDNA in einen λ-Phagenvektor, wie z. B. λgt10, λgt11, λzap usw., eingebaut wurde. Diese Phagen-Genbanken können geeignete E. coli- Stämme (C600, Y1088, Y1090, XL1-Blue usw.) infizieren, so daß E. coli transformiert wird. E. coli, das das menschliche cDNA-Gen enthält, das dem Vorläufer-Gen entspricht, welches das das neurotrophe Peptid des Ratten-Hippocampus codierende Gen enthält, kann auf einfache Weise durch Plaque-Hybridisierung selektiert werden, indem als Sonde ein Isotopen-markiertes cDNA-Fragment des Ratten- Vorläufer-Gens eingesetzt wird. Die Sonde wird hergestellt, indem das cDNA- Fragment, welches das Ratten-Vorläufer-Gen enthält, gereinigt und mittels Nick- Translation oder Zufallsprimer-Markierung (random prime labeling) mit ³²P markiert wird.
Durch Vergleich der Homologie der auf diese Weise erhaltenen Sequenz des menschlichen cDNA-Gens und des Ratten-Vorläufer-cDNA-Gens kann die Sequenz des menschlichen neurotrophen Peptids bestimmt werden, die dem Bereich entspricht, in welchem die Sequenz des neurotrophen Ratten-Peptids vorliegt.
Die Erfinder haben erfolgreich das menschliche Vorläufer-Gen aus dem Ratten-Vorläufer-Gen isoliert und seine Struktur bestimmt. Das menschliche Vorläufer-Gen der vorliegenden Erfindung codiert die in Sequenz Nr. 14 dargestellte Aminosäuresequenz, und ein Beispiel eines solchen Gens umfaßt das in Sequenz Nr. 13 dargestellte Gen. Aufgrund des Vergleichs der Homologie des Ratten- Vorläufer-Gens und des menschlichen Vorläufer-Gens wurde vermutet, daß das menschliche HCNP die folgende Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 15) aufweist und daß es ein Peptid ist, das vom HCNP der Ratte ziemlich verschieden ist. Ein Beispiel des Gens, das ein solches menschliches HCNP codiert, umfaßt das in Sequenz Nr. 16 dargestellte Gen.
H-Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH
[Nachstehend wird dieses vom Menschen stammende Peptid HCNP manchmal als hHCNP (vom Menschen stammendes cholinerges neurotrophes Hippocampus- Peptid) bezeichnet.]
Tatsächlich wurde in diesem Peptid eine neurotrophe Aktivität festgestellt, die ähnlich war wie beim Ratten-HCNP, und auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Die neurotrophe Aktivität (auch Aktivität des neurotrophen Faktors genannt) bezieht sich z. B. auf eine Wirkung, die die Differenzierung und Reifung von neuronalen Zellen reguliert, d. h. eine Wirkung, welche die Acetylcholin-Synthese im Gewebe des "medial septum nuclei" beschleunigt, das reich an cholinergen Neuronen ist.
Die DNA-Fragmente, die die Gene enthalten, welche das auf diese Weise clonierte Vorläufer-Polypeptid codieren, welches das aus Ratten-Hippocampus oder vom Menschen stammende neurotrophe Peptid enthält, werden in geeignete Vektoren eingebaut, mit denen ein Prokaryot, z. B. E. coli oder B. subtilis usw., transformiert werden kann. Der Vektor, in den das gewünschte Gen eingebaut wird, ist im allgemeinen vorzugsweise ein Plasmidvektor, der ein Replicon und eine Regulatorsequenz aufweist, die aus einer mit der Wirtszelle kompatiblen Art erhalten wird. Der Plasmidvektor enthält im allgemeinen einen Replikationsursprung (Ori) und ein Markergen, z. B. ein Gen für eine chemische Resistenz, wodurch eine Phänotyp- Selektion der Transformante ermöglicht wird.
Z. B. können die vom E. coli-Stamm K12 stammenden Stämme wie HB101, JM109 usw. mit pBR322 transformiert werden, das aus dem aus E. coli erhaltenen R-Faktor oder Derivaten davon konstruiert wurde. pBR322 enthält ein Gen, das eine Resistenz gegen Ampicillin und Tetracyclin vermittelt, und damit kann eine Transformante, die diese chemische Resistenz aufweist, einfach nachgewiesen werden (Referenz 39).
Ferner kann durch den Einbau eines geeigneten Promotors und einer an der Genexpression beteiligten Sequenz in diese rekombinanten Vektoren das durch das rekombinante DNA-Fragment codierte Vorläufer-Polypeptid in Wirtszellen, wie z. B. Bakterien-, Hefe-, Säugerzellen usw., exprimiert werden.
Als Promotor, der für die Expression eines Gens in Bakterien-Wirtszellen eingesetzt wird, eignen sich Promotoren für das β-Lactamase-, Lactose-, Tryptophan-Gen von E. coli usw. (Referenzen 27, 40, 41, 42, 43). Für die Expression des Vorläufer-Proteins der vorliegenden Erfindung, das das aus Ratten-Hippocampus oder vom Menschen stammende neurotrophe Peptid enthält, kann jeder der Promotoren dieser Gene eingesetzt werden.
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie z. B. Hefen, als Wirtszellen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae ist ein eukaryotischer Mikroorganismus, der bevorzugt eingesetzt wird. Jedoch können auch andere eukaryotische Mikroorganismen als Wirtszellen verwendet werden.
Zur Genexpression in Hefe wird am besten das Plasmid YRp7 verwendet (Referenzen 44, 47). Dieses Plasmid enthält das trp1-Gen, das eine Phänotyp- Selektion und die Identifizierung einer Transformante ermöglicht, z. B. wenn die Hefemutante PEP4-1 usw. verwendet wird, welche die Fähigkeit zur Vermehrung in Gegenwart von Tryptophan verloren hat.
Ein mit Hefe kompatibler Promotor, der für die Genexpression in Hefe erforderlich ist, ist der von 3-Phosphoglyceratkinase (Referenz 46), außerdem eignen sich Promotoren vieler anderer Gene, z. B. Gene für Enzyme des Glykolyse- Abbauwegs (Referenzen 47, 48). Ferner wird bei Eukaryoten mit wenigen Ausnahmen eine Poly-(A)-Sequenz am 3'-Ende der von einem Gen transkribierten mRNA angefügt. Die Transkription wird beendet, indem am 3'-Ende des exprimierten Gens ein DNA-Fragment eingeführt wird, welches das Signal für das Anfügen dieser Poly- (A)-Sequenz beinhaltet (Referenz 49).
Wenn ein Gen in Zellen exprimiert wird, die von eukaryotischen Organismen stammen, können als Wirtszellen auch Zellen verwendet werden, die von Vertebraten wie Säugern, Invertebraten wie Insekten oder von Pflanzen stammen. Für die Genexpression in Säugern, wie in der vorliegenden Erfindung, ist es jedoch bevorzugt, als Wirtszellen Zellen zu verwenden, die von Vertebraten stammen. Die von Vertebraten stammenden Zellen, die zur Genexpression verwendet werden, können entweder primäre Zellkulturen sein, die aus einem tierischen Gewebe erhalten werden, oder es können etablierte Zellkulturen sein, wobei jedoch die letzteren Zellen aufgrund der einfachen Handhabung das stärker bevorzugte Expressionssystem darstellen.
Beispiele von Wirtszellinien, die zur Zeit häufig für eine Vielzahl von Experimenten zur Expression von Genen eingesetzt werden, sind Namalwa-Zellen, hergeleitet vom menschlichen Burkitt-Lymphom, Vero-Zellen und GV-1-Zellen, die von Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze stammen, COS-1- und COS-7- Zellen von SV40-Transformanten, die von Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze stammen, von den Ovarzellen des Chinesischen Hamsters hergeleitete CHO-Zellen, BHK-Zellen von Nierenzellen neugeborener Syrischer Hamster, von Nierenzellen des Hundes stammende MDCK (NBL-2)-Zellen, NIH/3T3- und Balb/3T3-Zellen, hergeleitet von fetalen Mäuse-Fibroblasten, 3Y1-Zellen, hergeleitet von fetalen Ratten-Fibroblasten usw.. Im Grunde kann jede beliebige Zellinie eingesetzt werden, so lange der Promotor für die Expression des Gens mit der Wirtszelle kompatibel ist.
Wie vorstehend beschrieben, enthält der Vektor für die Expression eines Gens in einer Vielzahl von gezüchteten Zellinien einen Promotor für die Transkription im 5'-Stromaufwärts-Bereich eines exprimierten Gens und eine Poly-(A)- Additions-Signalsequenz. Sofern es erforderlich und erwünscht ist, enthält der Vektor einen Replikationsursprung, der zur autonomen Proliferation in Eukaryoten fähig ist, und die Enhancer-Region, die eine trans-Aktivierungsfaktor-Bindungsstelle für die Transkription darstellt.
Wenn ein Gen in einer Säugerzelle exprimiert wird, werden als Promotor für den Expressionvektor ein von einem Virus stammender Promotor und ein von einem bestimmten chromosomalen Gen hergeleiteter Promotor eingesetzt, die mit der Zelle kompatibel sind, in welche das Gen transduziert wird. Beispiele des Viruspromotors umfassen SV40 aus Affen, Herpes simplex-Virus, Polyomavirus und Adenovirus. Außerdem kann eine lange terminale Sequenzwiederholung ("long terminal repeat", LTR) verwendet werden, die einen Promotor darstellt, der aus einem Retrovirus stammt (aus einem Rous-Sarkom-Virus, RSV; murinen Leukämie- Virus, MLV; murinen Mammatumor-Virus, MMTV, usw.).
Kürzlich wurde ein Verfahren beschrieben, wobei Viruspartikel, bei denen das gewünschte Gen in ein Retrovirusvektorderivat übertragen wurde, in Gegenwart des als Helfer wirkenden Retrovirus hergestellt werden. Die Wirtszellen mit dem Virus werden mit dem transduzierten Virus infiziert, wodurch das Gen in das Wirtschromosom eingebaut und das gewünschte Gen exprimiert wird (Referenz 50).
Als Replikationsursprung werden exogene Ursprünge eingesetzt, die von Viren wie SV40-, Polyoma-, Adeno-, bovinem Papillomavirus usw. stammen, diese werden zur transienten Expression des Gens eingesetzt, so daß das Gen nicht in das Chromosom der Wirtszelle eingebaut wird. Wenn eine rekombinante DNA ohne einen exogenen Ursprung in einen Eukaryoten transduziert wird, kann im allgemeinen keine autonome Replikation der rekombinanten DNA erfolgen, sie wird jedoch in das Wirtschromosom eingebaut. Der Replikationsmechanismus der rekombinanten DNA wird durch den des Wirtschromosoms bestimmt.
Die mit dem gewünschten Gen transformierte Zelle kann anhand eines bestimmten Kennzeichens, das die Transformanten erworben haben, mittels Phänotyp-Selektion identifiziert werden, z. B. anhand einer chemischen Resistenz und der Lebensfähigkeit in einem Selektivmedium. Das Gen, das der Marker hierfür ist, ist entweder im Expressionsvektor, in den das gewünschte Gen übertragen wurde, oder in einem anderen Vektor enthalten, der das Markergen alleine enthält. Im letzteren Fall wird das Markergen zusammen mit dem Expressionsvektor, der das gewünschte Gen enthält, in eine Wirtszelle co-transfiziert.
Als Resistenz-Gen, das als Marker für die Phänotyp-Selektion dienen kann, wird häufig ein Neomycin-Resistenz-Gen eingesetzt, wobei eine Zelle mit Resistenz gegen Neomycin (Geneticin: G418) als Transformante identifiziert werden kann (Referenz 51). Eine Phänotyp-Selektion in einem Selektivmedium erfolgt, indem das HPRT-Gen (Referenzen 52, 53) oder das TK-Gen (Referenzen 54, 55) als Marker in eine gezüchtete Mutanten-Zelllinie eingeführt wird, die Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyl-Transferase (HPRT)- oder Thymidinkinase (TK)- defizient ist. Als Selektivmedium wird HAT-Medium verwendet (das Hypoxanthin, Aminopterin oder Amethopterin (auch Methotrexat genannt) und Thymidin enthält). Da Aminopterin die Biosynthese von Purin oder Pyrimidin hemmt, kann sich eine defiziente Mutantenzelle in HAT-Medium nicht vermehren, wenn jedoch das HPRT- oder TK- enthaltende Chromosom wiederhergestellt ist, können sich die Stämme in HAT- Medium vermehren. Außerdem kann die Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (Eco-gpt) als Markergen eingesetzt werden (Referenz 53). Micophenolsäure hemmt die Synthese von GMP in tierischen Zellen, wodurch die Zellen abgetötet werden. Durch Eco-gpt wird GMP aus dem im Medium vorliegenden Xanthin synthetisiert, wobei jedoch tierische Zellen Xanthin nicht verwerten können. Aus diesem Grund kann sich nur eine Transformante, bei der das Eco-gpt-Gen eingeführt wurde, auch nach einer Behandlung mit Micophenolsäure selektiv vermehren.
Für die Transfektion eines Gens in Säugerzellen können im allgemeinen verschiedene Verfahren verwendet werden, z. B. die DNA-Calciumphosphat-Co- Präzipitation (Referenzen 54, 56), die Protoplasten-Fusion unter Verwendung von Polyethylenglykol (Referenz 57) und dergleichen. Ferner kann ein Verfahren zur elektrischen Transfektion eines Gens in eine Wirtszelle unter Einsatz eines elektrischen Impulses (Referenzen 58, 59) oder ein Verfahren zur physikalischen Transfektion eines Gens direkt in eine Zelle unter Verwendung eines Mikromanipulators (Referenz 60) eingesetzt werden.
Das vom Menschen stammende neurotrophe Peptid der vorliegenden Erfindung besitzt die in der nachstehenden Formel I dargestellte Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 15).
Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu (I)
Ein Derivat der Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 15) wird von F. Schoentgen et al., beschrieben (Eur. J. Biochem. 166 (1987), 333-338).
Die vom Menschen stammenden neurotrophen Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf peptidartige Derivate, bei denen die in Formel (I) dargestellte Struktur des menschlichen neurotrophen Peptids modifiziert oder umgewandelt wurde, mittels Derivatisierung wie Spaltung und N-terminale Modifikation und/oder C-terminale Modifikation, jeweils einzeln oder in Kombination.
Genauer gesagt beziehen sich die Derivate des vom Menschen stammenden neurotrophen Peptids der vorliegenden Erfindung auf unverzweigtkettige peptidartige Derivate der nachstehenden allgemeinen Formel (II).
X-Z-Y (II)
In der Formel bedeutet X ein Wasserstoffatom, verschiedene Acylreste, verschiedene Sulfonylreste oder verschiedene Reste, die zusammen mit der Aminogruppe in den Aminosäureresten, an die X gebunden ist, zur Vervollständigung eines Harnstoff- oder Urethangerüsts dienen.
Spezifische Beispiele von X sind ein Wasserstoffatom oder ein Rest der chemischen Formel 1:
[wobei R1a ein Wasserstoffatom, einen unsubstituierten oder substituierten Alkyl-, Hydroxy-, -COOH, Aryl-, C&sub1;-C&sub4; Alkoxyrest, ein Halogenatom, einen Rest der Formel -CONR²R³, wobei R² und R³ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;-C&sub4; Alkylrest darstellen, oder einen heterocyclischen Rest bedeutet; R1b ein Wasserstoffatom, einen unsubstituierten oder substituierten Alkylrest oder ein Halogenatom bedeutet; und R1c ein Wasserstoffatom, einen C&sub1;-C&sub4; Alkylrest oder ein Halogenatom darstellt]; ein Rest der chemischen Formel 2:
[wobei R4a ein Wasserstoffatom, einen C&sub1;-C&sub4; Alkyl- oder einen Arylrest bedeutet; und R4b ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;-C&sub4; Alkylrest darstellt]; ein Rest der folgenden Formel:
R&sup5;-O-CO-
[wobei R&sup5; einen unsubstituierten oder substituierten Alkyl- oder einen Arylrest bedeutet]; ein Rest der folgenden Formel:
R&sup6;-CO-
[wobei R&sup6; ein Wasserstoffatom, einen Aryl- oder einen heterocyclischen Rest bedeutet]; ein Rest der folgenden Formel:
R&sup7;-SO&sub2;-
[wobei R&sup7; einen unsubstituierten oder substituierten Alkyl- oder einen Arylrest bedeutet]; usw..
Y stellt eine OH-Gruppe oder verschiedene Reste dar, die zusammen mit der Carbonylgruppe in den Aminosäureresten, an die Y gebunden wird, eine Amido- oder Estergruppe bilden.
Spezifische und repräsentative Beispiele von Y umfassen einen Rest, der durch die chemische Formel 3 dargestellt wird:
[wobei R8a ein Wasserstoffatom, einen unsubstituierten oder substituierten Alkyl-, Hydroxy-, einen Aryl- oder einen heterocyclischen Rest bedeutet; und R8b ein Wasserstoffatom oder einen unsubstituierten oder substituierten Alkylrest darstellt]; oder einen Rest der folgenden Formel:
-O-R&sup9;
[wobei R&sup9; ein Wasserstoffatom, einen unsubstituierten oder substituierten Alkyl-, einen Aryl- oder einen heterocyclischen Rest bedeutet]; oder einen Rest der chemischen Formel 4:
[wobei R10a und R10b zusammen mit N einen Stickstoff-enthaltenden gesättigten heterocyclischen Ring bilden]; usw..
Z stellt eine partielle Aminosäuresequenz von hHCNP dar, die mindestens die -Lys-Trp-Sequenz umfaßt und die durch eines der folgenden Verfahren erhalten wird: durch eine Spaltung mittels Reduktion von Aminosäureresten vom N- Terminus der Aminosäuresequenz von hHCNP aus, eine Spaltung mittels Reduktion von Aminosäureresten vom C-Terminus aus und eine Spaltung mittels Reduktion von Aminosäureresten sowohl vom N-Terminus als auch vom C-Terminus aus, oder es stellt die gesamte Aminosäuresequenz von hHCNP dar. Genauer gesagt bedeutet Z eine Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel:
Z¹-Lys-Trp-Z²
[wobei Z¹ Pro-Val-Asp-Leu-Ser, Val-Asp-Leu-Ser, Asp-Leu-Ser, Leu-Ser, Ser oder eine einzelne Bindung darstellt und Z² Ser-Gly-Pro-Leu, Ser-Gly-Pro, Ser-Gly, Ser oder eine einzelne Bindung bedeutet]. Die am stärksten bevorzugten Beispiele von Z umfassen die folgenden:
Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu;
Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp;
Leu-Ser-Lys-Trp-Ser;
Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu;
Lys-Trp.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Alkylrest" bezieht sich auf einen verzweigten oder unverzweigten gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit einer spezifischen Anzahl von Kohlenstoffatomen. Z. B, bedeutet ein C&sub1;-C&sub4; Alkylrest eine Methyl-, Ethyl-, Propyl- Butyl-, Isopropyl-, Isobutyl-, t- Butylgruppe usw..
Der Begriff "Alkoxyrest" bezeichnet einen Alkylrest mit einer spezifischen Anzahl von Kohlenstoffatomen, der über ein Sauerstoffatom gebunden ist. Z. B. bedeutet ein C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyrest eine Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy- Butoxygruppe usw..
Der Begriff "Halogenatom" steht für ein Fluor-, Chlor-, Brom- und Iodatom.
Der Begriff "Arylrest" soll eine Phenyl-, Naphthyl- oder Anthrylgruppe usw. bedeuten, die gegebenenfalls mit 1 bis 3 Resten substituiert sein kann, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: C&sub1;-C&sub8;-Alkyl-, Amino-, Mono- oder Di-C&sub1;- C&sub4;-alkylamino-, Amino-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, Mono- oder Di-C&sub1;-C&sub4;-alkylamino-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, Guanidino-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylguanidino-, Guanidino-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylguanidino-C&sub1;- C&sub8;-alkyl-, Hydroxy-, Hydroxy-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, -CO&sub2;H, Carboxy-C&sub1;-C&sub8;- alkylrest, Halogenatom, NO&sub2;, CF&sub3; und -CONR²R³ [wobei R² und R³ die gleiche Bedeutung haben wie vorstehend beschrieben] und dergleichen. Der Begriff "C&sub1;-C&sub4;- Alkylguanidinorest" bedeutet eine Guanidinogruppe, bei der das Guanidino- Stickstoffatom mit einem oder zwei C&sub1;-C&sub4;-Alkylresten alkyliert ist.
Der Begriff "heterocyclischer Rest" soll einen gesättigten oder ungesättigten 3- bis 8-gliedrigen monocyclischen oder einen 9- bis 10-gliedrigen fusionierten heterocyclischen Rest darstellen. Der heterocyclische Rest besteht aus Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, die ausgewählt sind aus N, O und S. Die Stickstoff- und Schwefel-Heteroatome können gegebenenfalls oxidiert sein; oder das Stickstoff-Heteroatom kann gegebenenfalls quaternisiert sein. Die Bindungsstelle liegt an einem beliebigen Kohlenstoffatom, wird jedoch bezogen auf R1a, im Fall eines Heterorings, der mindestens ein Stickstoffatom enthält, kann das Stickstoffatom die Bindungsstelle darstellen.
Beispiele solcher gesättigen heterocyclischen Reste umfassen eine Pyrrolidinyl-, Piperidyl-, Piperidino-, Homopiperidyl-, Heptamethyleniminyl-, Piperazinyl-, Homopiperazinyl-, Morpholinyl-, Morpholino-, Thioranyl-, Thiomorpholinyl-, Thiomorpholinylsulfoxid-, Thiomorpholinylsulfon-, Tetrahydrofurylgruppe usw.. Solche gesättigten heterocyclischen Reste können gegebenenfalls auch mit einem oder zwei Resten substituiert sein, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: Hydroxy-, Carboxyl-, Carboxyl-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, Aryl-, Aryl-C&sub1;-C&sub4;-alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, Amino-, Mono- oder Di-C&sub1;-C&sub4;-alkylamino-, Amino-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, Mono- oder Di-C&sub1;-C&sub4;- alkylamino-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, Hydroxy-C&sub1;-C&sub4;-alkyl-, Guanidino-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylguanidino-, Guanidino-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylguanidino-C&sub1;-C&sub8;-alkyl-, N(R¹¹)&sub3;A [wobei R¹¹ einen C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest darstellt und A ein Gegenion bedeutet, das aus einwertigen Anionen ausgewählt ist], N(R¹¹)&sub3;A-substituierter C&sub1;-C&sub8;-Alkylrest [wobei R¹¹ und A die gleiche Bedeutung haben, wie vorstehend beschrieben] und dergleichen.
Beispiele solcher ungesättigen heterocyclischen Reste umfassen eine Pyrrolyl-, Pyridyl-, Pyrazinyl-, lmidazolyl-, Pyrazolyl-, Furyl-, Oxazolyl-, Thienyl-, Thiazolyl-, Indolyl-, Chinolyl-, Isochinolylgruppe usw.. Ein solcher ungesätttigte heterocyclische Rest kann gegebenenfalls mit einem der folgenden Reste substituiert sein: einem CF³-, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyrest, einem Halogenatom usw..
Der Begriff "Gegenion" bedeutet ein einwertiges Anion, wie z. B. ein Chlorid-, Bromid-, Acetat-, Perchlorat-, Benzoat-, Maleat-, Benzolsulfonat-, Tartrat-, Hemitartration usw..
Der Begriff "Stickstoff-enthaltender gesättigter heterocyclischer Rest" steht für einen gesättigten 3- bis 8-gliedrigen monocyclischen Stickstoff-enthaltenden heterocyclischen Rest, der aus mindestens einem Stickstoffatom, Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls einem Heteroatom von O und S zusammengesetzt ist und dessen Bindungsstelle am Stickstoffatom liegt. Die Stickstoff- und Schwefel- Heteroatome können gegebenenfalls oxidiert sein, oder das Stickstoffatom kann auch quaternisiert sein.
Beispiele solcher Stickstoff-enthaltenden gesättigten heterocyclischen Reste umfassen eine Pyrrolidinyl-, Piperidino-, Homopiperidino-, Heptamethyleniminyl-, Piperazinyl-, Homopiperazinyl-, Morpholino-, Thiomorpholino-, Thiomorpholinosulfoxid-, Thiomorpholinosulfongruppe usw..
Das Vorläufer-Polypeptid des neurotrophen Peptids der vorliegenden Erfindung umfaßt das vom Menschen stammende Vorläufer-Polypeptid, das die in Sequenz Nr. 14 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
In der Beschreibung werden die Aminosäuren, Schutzgruppen, aktiven Gruppen, Lösungsmittel und dergleichen manchmal mit ihren Abkürzungen gemäß den IUPAC-Regeln oder mit ihren üblicherweise verwendeten Abkürzungen bezeichnet.
Die Abkürzungen für die Aminosäurereste oder Aminosäurederivate sind nachstehend angegeben.

Abkürzungen Name

Asp Asparaginsäure
Gly Glycin
Lys Lysin
Leu Leucin
Pro Prolin
Ser Serin
Val Valin
Trp Tryptophan
Asx Asparagin oder Asparaginsäure
Glx Glutamin oder Glutaminsäure
Sofern nicht anders angegeben, entsprechen die in der Beschreibung ohne vorangestelltes "L-" angegebenen Aminosäurereste der in der Natur vorkommenden absoluten Konfiguration L-.
Nachstehend sind noch weitere Abkürzungen angegeben.

Abkürzungen Name

Boc t-Butyloxycarbonyl
OcHex Cyclohexylester
Bzl Benzyl
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DMF Dimethylformamid
TFA Trifluoressigsäüre
TEA Triethylamin
HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
PTC Phenylthiocarbamyl
Die pharmazeutisch verträglichen Salze des vom Menschen stammenden neurotrophen Peptids der vorliegenden Erfindung umfassen herkömmliche nichttoxische Salze dieser Peptide und quaternäre Salze davon. Diese Salze können aus anorganischen oder organischen Säuren oder Basen hergestellt werden. Beispiele solcher Säureadditionssalze sind Salze der Essigsäure, Buttersäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure. Salze von Basen sind Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, wie z. B. Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie z. B. Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit Aminosäure, wie z. B. Arginin, Lysin usw.. Solche Salze können durch bekannte Verfahren einfach hergestellt werden. Im Fall von Acetaten können die Acetate z. B. hergestellt werden, indem die neurotrophen Peptid-Derivate oder Derivate davon in Wasser gelöst werden und eine erforderliche Menge Essigsäure zu der Lösung zugefügt wird.

< Verfahren zur Herstellung >

Die neurotrophen Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren hergestellt werden, wie sie üblicherweise in der Peptid-Chemie verwendet werden. Solche Verfahren werden in den Referenzen 61, 62, 63, 64, 65 usw. beschrieben. Das heißt, das Peptid kann synthetisiert werden, indem, abhängig von der Struktur des C-Terminus, ein Flüssigphasen- und Festphasenverfahren ausgewählt wird. Genauer gesagt können die Peptide, wenn sie am C-Terminus eine partielle Struktur von -COOH oder -CONH&sub2; enthalten, durch ein beliebiges Flüssigphasen- oder Festphasenverfahren erhalten werden, in anderen Fällen jedoch ist eher das Flüssigphasenverfahren bevorzugt.
Wenn z. B. das Peptid-Derivat durch das Festphasenverfahren synthetisiert wird, wird die C-terminale Aminosäure (Aminosäure mit geschützter Aminogruppe) oder der C-terminale Substituent (der Substituent weist eine Carboxylgruppe auf; sofern eine Aminogruppe enthalten ist, ist die Aminogruppe geschützt) über die Carboxylgruppe an einen unlöslichen Träger gebunden. Sofern es erforderlich und erwünscht ist, werden die an der Aminogruppe geschützten Aminosäuren oder die Aminosäure-Derivate (sofern eine freie Aminogruppe vorliegt, ist die Aminogruppe geschützt) nacheinander gemäß der Aminosäuresequenz des gewünschten Peptids nach der Abspaltung der Amino-Schutzgruppe durch Kondensation der reaktiven Carboxylgruppen mit den reaktiven Aminogruppen oder mit den reaktiven Hydroxygruppen verknüpft. Die Synthese erfolgt schrittweise. Nach der Synthese der vollständigen Sequenz wird gegebenenfalls der N-terminale Substituent angefügt. Anschließend wird das Peptid von dem unlöslichen Träger abgespalten und gleichzeitig die Schutzgruppe entfernt. Ferner wird gegebenen- und gewünschtenfalls der N- terminale Substituent oder der C-terminale Substituent angehängt und die Schutzgruppe entfernt, wodurch das gewünschte Peptid erhalten wird.
Wenn die Synthese durch das Flüssigphasenverfahren erfolgt, wird die C- terminale Aminosäure, die am Ende eine freie Aminogruppe aufweist (eine an der Carboxylgruppe geschützte Aminosäure), oder der C-terminale Substituent (ein Substituent, der eine freie Amino- oder Hydroxygruppe besitzt; sofern eine Carboxylgruppe vorliegt, ist sie geschützt) mit der an der Aminogruppe geschützten Aminosäure gemäß der Aminosäuresequenz des gewünschten Peptids erfolgreich verknüpft, indem eine Kondensation der reaktiven Aminogruppen oder der reaktiven Hydroxygruppen mit den reaktiven Carboxylgruppen erfolgt. Gegebenenfalls wird zuletzt der N-terminale Substituent damit verknüpft. Auf diese Weise kann die gesamte Sequenz synthetisiert werden. Die gesamte Sequenz kann auch synthetisiert werden, indem eine ähnliche Synthese erfolgt, die ausgewählten Schutzgruppen entfernt werden und die resultierenden Peptidfragmente aneinander gebunden werden. Die Schutzgruppe wird entfernt und gegebenenfalls der N-terminale Substituent oder der C-terminale Substituent angehängt, und die Schutzgruppe wird entfernt, wodurch das gewünschte Peptid erhalten wird.
In den vorstehend beschriebenen Verfahren werden die reaktiven funktionellen Gruppen vorzugsweise geschützt.
Beispiele der Schutzgruppe für die Aminogruppe umfassen eine Benzyloxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Toluolsulfonyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Formyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 3-Nitro-2-pyridinsulfenyl-, Diphenylphosphinothioylgruppe usw..
Beispiele der Schutzgruppe für die Carboxylgruppe umfassen Alkylester (Ester mit C&sub1;-C&sub4;-Resten, wie z. B. Methyl-, Ethyl-, t-Butylester usw.), Benzylester, p- Nitrobenzylester, p-Methylbenzylester, Cyclohexylester, Cyclopentylester usw..
Die Hydroxygruppe in Ser, Tyr usw. muß nicht unbedingt geschützt werden, gegebenenfalls kann sie jedoch mit einer Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl-, t-Butyl-, Benzyloxycarbonyl-, Acetylgruppe usw. geschützt werden. Die Indolylgruppe in Trp usw. kann gegebenenfalls mit einer Formyl-, Benzyloxycarbonyl-, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonylgruppe usw. geschützt werden. Die Guanidinogruppe kann auch in ei nem mit Salzsäure usw. protonierten Stadium als geschützt wirken, jedoch kann sie gegebenenfalls auch mit einer p-Toluolsulfonyl-, Nitro-, Benzyloxycarbonyl-, p- Methoxybenzolsulfonyl-, Mesitylen-2-sulfonylgruppe usw. geschützt werden.
In den vorstehend beschriebenen Verfahren können die Peptidbindungen durch bekannte Verfahren geknüpft werden, z. B. durch das Verfahren, bei dem Kondensationsmittel des Carbodiimid-Typs eingesetzt werden, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid usw.; durch das symmetrische Säureanhydrid-Verfahren, das gemischte Säureanhydrid-Verfahren, das Azid-Verfahren, das aktivierte Ester-Verfahren, das Oxidations-Reduktions- Verfahren, das Diphenylphosphorylazid-Verfahren, das Verfahren, bei dem Kondensationsmittel vom Carbodiimid-Typ und Zusatzstoffe (1-Hydroxybenzotriazal, N- Hydroxysuccinimid usw.) eingesetzt werden.
Zur Entfernung der Schutzgruppe kennt man z. B. das Trifluoressigsäure- Verfahren, das Methansulfonsäure-Verfahren, das Trifluormethansulfonsäure-Verfahren, das Hydrogenfluorid-Verfahren, das wäßr.-Ammoniaklösung-Natrium-Verfahren, das katalytische Reduktions-Verfahren, das Alkali-Verseifungs-Verfahren usw..
Die durch die vorliegende Erfindung erzeugten Peptide können durch bekannte Verfahren gereinigt werden, die üblicherweise nach dem Stand der Technik in der Peptid-Chemie eingesetzt werden und die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, z. B. Ionenaustausch-Chromatographie, Verteilungs-Chromatographie, Gel-Chromatographie, Reverse Phase-Flüssig-Chromatographie usw..

< Pharmakologische Aktivitäten >

Das vom Menschen stammende neurotrophe Peptid oder seine Derivate der vorliegenden Erfindung können die Differenzierung und Reifung neuronaler Zellen regulieren. Das heißt, das neurotrophe Peptid und die Derivate davon beschleunigen die Acetylcholin-Synthese im Gewebe des "medial septum nuclei". Die biologische Aktivität kann durch das Verfahren von Ojika, K., et al. (Referenz 66) bestimmt werden.

< Verwendung als Arzneimittel >

Das vom Menschen stammende neurotrophe Peptid oder seine Derivate der vorliegenden Erfindung können für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Demenz verwendet werden. Eine neurodegenerative Erkrankung ist ein Leiden, das durch Degeneration/Denervierung von cholinergen Neuronen verursacht wird, wobei Beispiele hierfür das Alzheimer-Syndrom, die Alzheimer- Demenz, die amyotrophische Lateralsklerose, das Parkinson-Syndrom usw. sind.
Eine Demenz kann eine Alzheimer-Demenz, Parkinson-Demenz oder cerebrovaskuläre Demenz sein.
Tiere, an die die neurotrophen Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung verabreicht werden können, sind nicht eingeschränkt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können sowohl an Menschen als auch an andere verschiedene Säugerarten verabreicht werden, wie Maus, Ratte, Hund, Kalb, Pferd, Ziege, Schaf, Kaninchen, Schwein usw..
Das neurotrophe Peptid oder seine Derivate der vorliegenden Erfindung können an diese Tiere und an Menschen über eine herkömmliche Route verabreicht werden, z. B. oral, intramuskulär, intravenös, subkutan, intraperitoneal, pernasal und intracerebral. Die Dosis und der Zeitpunkt der Verabreichung können je nach Tierart, Verabreichungsroute, Krankheitszustand, Körpergewicht usw. verschieden sein. Beim Menschen können die Peptide oder ihre Derivate an einen Erwachsenen mit einer täglichen Dosis von etwa 1 ug bis 1 g als Einmalgabe oder in mehreren Portionen verabreicht werden. Beispiele von Arzneimitteln umfassen Pulver, Granulate, Granula, Tabletten, Kapseln, Suppositorien, Injektionen, nasale Präparate usw.. Die Arzneimittel können in herkömmlicher Art und Weise unter Verwendung üblicher Träger hergestellt werden. Das heißt, wenn orale Präparate hergestellt werden, werden zum Wirkstoff Excipienten oder Träger zugegeben, außerdem werden gegebenenfalls Bindemittel, Zerfallhilfsmittel, Gleitmittel und Farbstoffe zugefügt und anschließend die Tabletten, Granula, Pulver, Kapseln usw. durch bekannte Verfahren hergestellt. Bei der Zubereitung von Injektionen werden gegebenenfalls pH- Regulatoren, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel usw. zugegeben und die Injektionspräparate in herkömmlicher Art und Weise hergestellt.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand der Beispiele genauer beschrieben, wobei die Beispiele jedoch in keiner Weise die Erfindung einschränken sollen.

Beispiel 1

Herstellung von polyclonalen Kaninchen-Antikörpern gegen das neurotrophe Peptid des Ratten-Hippocampus

Polyclonale Kaninchen-Antikörper gegen das Ratten-HCNP mit der in Sequenz Nr. 17 dargestellten Aminosäuresequenz wurden hergestellt. Die Verfahren werden nachstehend beschrieben (Referenz 67).
In 2 ml 0,1 M Ammoniumacetat (pH 7,0) wurden 3 mg eines synthetischen Oligopeptids mit der in Sequenz Nr. 17 dargestellten Aminosäuresequenz gelöst und die Lösung sodann mit 10 mg Rinderserumalbumin und 1,3 ml 0,02 M Glutaraldehyd versetzt. Die Lösung wurde fünf Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Nach der Dialyse gegen H&sub2;O über Nacht wurde die Lösung lyophilisiert, wobei etwa 10 mg komplexes Protein gewonnen wurde.
Anschließend wurden 1,5 mg des komplexen Proteins in 1,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und die Lösung mit 1,5 ml komplettem Freundschem Adjuvans versetzt, so daß eine Emulsion erhalten wurde.
Drei Kaninchen wurden mit einem Adjuvans geboostert, das 0,25 bis 0,5 mg des komplexen Proteins pro Kaninchen enthielt. Die Sensibilisierung erfolgte, indem das Adjuvans an etwa 50 Punkten pro Hautbereich (10 cm · 10 cm) unter die Rückenhaut verteilt wurde und die Boosterung alle zwei Wochen wiederholt wurde. Zehn Tage nach der insgesamt fünften Boosterung wurde Blut aus der Karotis entnommen und über Nacht bei 4ºC stehengelassen, so daß das geronnene Blut ausfiel. Durch Zentrifugation bei 3000 UpM wurde der Überstand gewonnen und auf diese Weise die Antikörperlösung hergestellt. Die aus den drei Kaninchen erhaltenen Antikörper wurden mit Ab-1, Ab-2 bzw. Ab-3 bezeichnet. Die Antikörper wiesen alle ähnliche Titer auf (vgl. Beispiel 3).

Beispiel 2

Herstellung von Sonden

Basierend auf der Sequenz der sechs dargestellten Aminosäuren, Asp-Ile- Ser-Gln-Trp-Ala, im Mittelteil der Aminosäuresequenz des aus 11 Aminosäuren bestehenden Ratten-HCNP wurden Oligonucleotide aus 17 fortlaufenden Nucleotiden synthetisiert (Fig. 1). Die Synthese erfolgte so, daß anhand der Ser-Stelle eine Einteilung in drei verschiedene Sondengruppen erfolgte und in jeder Gruppe 24 Kombinationen erhalten wurden. In den in Fig. 1 dargestellten Sequenzen besteht das Nucleotid an Position 6 vom 5'-Ende der Sonde her aus einem äquimolaren Gemisch aus dT und dC.
Als nächstes wurde die Sonde am C-Terminus der Aminosäuresequenz des Ratten-HCNP, wie vorstehend beschrieben, synthetisiert, indem Oligonucleotide aus 16 fortlaufenden Nucleotiden hergestellt wurden, die auf der Sequenz der sechs Aminosäuren am C-Terminus basierten, die durch Gln-Trp-Ala-Gly-Pro-Leu dargestellt ist. Die Sonde am C-Terminus lag in 256 verschiedenen Kombinationen vor (Fig. 1).
Die Nucleotidsequenzen der in Fig. 1 dargestellten Sonde weisen reverse Sequenzen der aus der Aminosäuresequenz hergeleiteten Nucleotidsequenz auf. Die Oligonucleotide wurden in einem von Applied Biosystems Co. hergestellten DNA-Synthesizer (Modell 381) synthetisiert. Die synthetisierten DNAs wurden unter Verwendung einer OPC-Cartridge (hergestellt von Applied Biosystems Co.) gereinigt.
Die Markierung der Oligonucleotide mit ³²P erfolgte folgendermaßen: Zu 10 ul eines Reaktiongemisches aus 67 mM Tris-HCl (pH 8,0), 17 mM β-Mercaptoethanol und 10 mM MgCl&sub2; wurden 1 ug des synthetischen Oligonucleotids, 50 uCi [γ-³²P]-ATP (hergestellt von Amersham Co., PB10218, 10 mCi/ml, 5000 Ci/mMol) und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase zugegeben, anschließend folgte eine Inkubation von 30 Minuten bei 37ºC. Danach wurde das Ganze zehn Minuten auf 65ºC erhitzt, um die Reaktion zu beenden. Zur Entfernung der überschüssigen Nucleotide wurde eine Gelfiltration durchgeführt, wobei eine PD-10-Säule von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., verwendet wurde, die mit TE-Lösung (10 mM Tris- HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) äquilibriert worden war. Die spezifische Aktivität der Sonde betrug etwa 2 · 10&sup7; cpm/ug.

Beispiel 3

Reinigung und Nachweis des Vorläufer-Proteins des Ratten-HCNP

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden drei Antikörper gegen das aus 11 Aminosäuren zusammengesetzte Ratten-HCNP hergestellt. Die Proteine, die mit diesen Antikörpern reagierten, wurden durch Western Blotting nachgewiesen.
Rattengehirn wurde mit eisgekühlter PBS-Lösung (pH 7,2) versetzt und homogenisiert. Nach einer dreißigminütigen Zentrifugation bei 10 000 · g wurde der Überstand gewonnen und einer 14 bis 16% SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen (Referenz 68). Das bei der Elektrophorese erhaltene Protein wurde elektrisch auf ein Immobilon PVDF-Filter (hergestellt von Millipore Co., Ltd.) übertragen (Referenz 69). Die Übertragung erfolgte unter den folgenden Bedingungen, hierbei wurden vier Stunden 70 V angelegt und für das Blotten eine Pufferlösung verwendet, die aus 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM Glycin, 0,02% SDS/Methanol (80/20) bestand. Das Filter wurde mit TBS (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl) gewaschen und eine Stunde bei Raumtemperatur in 3% Gelatine-TBS-Lösung inkubiert, wodurch mit der Gelatine die Membranoberfläche blockiert wurde, an die kein Protein adsorbiert war. Nach Schütteln und Waschen mit TBS wurde der mit 1% Gelatine-TBS verdünnte primäre Antikörper (500-fache Verdünnung) mit dem an das Filter adsorbierten Protein vier Stunden umgesetzt, worauf ein dreimaliges Schütteln für fünf Minuten in T-TBS (0,05% Tween 20, TBS) folgte.
Das Filter wurde in eine 1% Gelatine-TBS-Lösung gelegt, die den Peroxidase-markierten sekundären Antikörper (hergestellt von Amersham Co.) in 2000- facher Verdünnung enthielt, und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Filter wurde dreimal zehn Minuten mit T-TBS gewaschen. Schließlich wurden 60 mg 4-Chlor-1-naphthol in 20 ml Methanol gelöst und die resultierende Lösung mit 100 ml TBS-Lösung gemischt. Die Membran wurde in eine Lösung eingetaucht, mit er Peroxidase eine Farbe erzeugen kann, hierzu wurde H&sub2;O&sub2; in einer Konzentration von 0,01% zugegeben, so daß eine Farbe erhalten wurde (Referenz 70). Als Ergebnis wurde gezeigt, daß das im Rattengehirn vorliegende Protein mit einem Molekulargewicht von 23 Kilodalton mit dem Antikörper gegen das Ratten-HCNP reagierte.
Mit den drei in Beispiel 1 beschriebenen, polyclonalen Antikörpern konnte das Protein in allen Fällen mit einer ähnlichen Verdünnung nachgewiesen werden.
Um die Aminosäuresequenz des Proteins zu bestimmen, wurde eisgekühlte PBS (pH 7,2) zu den aus 20 Ratten entnommenen Gehirnen zugegeben. Nach der Homogenisierung wurden 20 ml von 33 ml Überstand einer Gelfiltration unterworfen, wobei 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,2) und eine Säule mit Sephadex G-150 "Fine Column" (Durchmesser von 6 · 84 cm) verwendet wurden. Durch Western- Blotting nach einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde eine Fraktion von 50 ml gewonnen, die mit dem Antikörper reagierte. 10 ml der Fraktion wurden auf eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie aufgetragen, um das Protein zu reinigen. Unter Verwendung einer von BioRad Co. hergestellten Säule RP-304 (Durchmesser von 4,6 · 250 mm) wurde eine Chromatographie mit einem Lösungsmittelsystem aus 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) Acetonitril durchgeführt, wodurch das gewünschte Protein in einer Acetonitril-Konzentration von etwa 38 bis 40% eluiert wurde.

Beispiel 4

Konstruktion einer Ratten-Hippocampus-cDNA-Genbank

I) Herstellung der mRNA

Die mRNA wurde aus dem aus neugeborenen Ratten gewonnenen Hippocampus-Gewebe in herkömmlicher Art und Weise isoliert (Ratten-Hippocampus wurde aus 30 Ratten gewonnen; Naßgewicht etwa 2 g). Unter Verwendung eines Homogenisators wurden 2 mg des gefrorenen Gewebes bei Raumtemperatur in Gegenwart von 4 M Guanidinlösung (4 M Gunaidinthiocyanat, 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1% β-Mercaptoethanol) sofort homogenisiert. Die hochmolekulare chromosomale DNA wurde sodann physikalisch zerstört, indem sie zehnmal mit einer mit 18-G-Nadel ausgestatteten Spritze eingesaugt und wieder ausgedrückt wurde. Zu der auf diese Weise behandelten Suspension wurde eine 10% Natriumsarcosylsulfatlösung in einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben. Nach der Zentrifugation bei Raumtemperatur und 2000 UpM für fünf Minuten wurde der Überstand gewonnen und die Zelltrümmer entfernt. Auf 1 ml 5,7 M Cäsiumchlorid und 4 mM ED- TA in einem Polyallomer-Röhrchen wurden vorsichtig 3 ml der vorstehend beschriebenen Guanidinlösung geschichtet. Nach der Zentrifugation bei 45 000 UpM für 11 Stunden bei 20ºC wurde der Niederschlag in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA und 1% SDS gelöst. Nachdem das 1/10 Volumen an 3 M Natriumacetat zu der RNA-Lösung zugegeben worden war, wurde zur Fällung der Gesamt-RNA das 2,2-fache Volumen an Ethanol bei -20ºC zugefügt. Durch mehrmalige Ethanolfällung wurden etwa 2 mg Gesamt-RNA erhalten.
Die Poly-(A)-mRNA wurde folgendermaßen aus der Gesamt-RNA gereinigt, wobei eine Oligo-(dT)-Cellulose-Säule verwendet wurde. 1,5 mg der wie vorstehend beschrieben durch Ethanolfällung gereinigten Gesamt-RNA wurden in 2 ml TE- Lösung gelöst. Nach fünfminütigem Erhitzen auf 70ºC wurde die Lösung abgeschreckt und mit 1/5 Volumen an 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA und 3 M NaCl versetzt. Das Gemisch wurde auf eine Oligo-(dT)-Cellulose-Säule (5 ml; hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.; Oligo-(dT)-Cellulose Typ 7) aufgetragen. Die Poly-(A)-mRNA-Moleküle wurden an der Cellulose-Säule gewonnen, indem eine Probe unter der spezifischen Schwerkraft auf die Säule aufgetragen wurde, wobei die mRNA, die einen Poly-(A)-Schwanz enthält, an das Oligo-(dT) gebunden wird. Die Lösung, die die Säule passierte wurde wieder erhitzt, abgeschreckt und auf dieselbe Säule aufgetragen. Nachdem die Säule mit dem 10- fachen Volumen an 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA und 0,5 M NaCl gewaschen worden war, wurde sie weiter mit dem 6-fachen Volumen an 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA und 0,1 M NaCl gewaschen. Sodann wurde die Poly-(A)- mRNA mit einer bei 70ºC gehaltenen TE-Lösung eluiert. Das Eluat wurde erneut zehn Minuten bei 70ºC erhitzt und einer zweiten Chromatographie unterworfen, wobei eine Oligo-(dT)-Cellulose-Säule (2 ml) auf ähnliche Weise eingesetzt wurde. Die Menge der erhaltenen Poly-(A)-mRNA betrug 103 ug.

(II) Herstellung der aus Ratten-Hippocampus-Gewebe stammenden cDNA- Genbank

Zur Herstellung von cDNA aus der auf diese Weise gereinigten Poly-(A)- mRNA wurde die cDNA unter Verwendung eines Oligo-(dT)-Primers und unter Verwendung eines Zufallprimers synthetisiert. Zwischen den jeweiligen Verfahren für die Synthese von einzelsträngiger cDNA mit den zwei Arten von Primern wurden einige Unterschiede festgestellt. Deshalb werden die jeweiligen Verfahren genauer beschrieben.

(1) Synthese der einzelsträngigen cDNA unter Verwendung eines Oligo-dT- Primers

Die Synthese von cDNA unter Verwendung eines Oligo-(dT)-Primers erfolgte durch die folgenden Verfahren. 8 ug der auf diese Weise hergestellten, aus Ratten- Hippocampus stammenden Poly-(A)-mRNA wurden in 20 ul H&sub2;O gelöst, wobei die RNase durch Behandlung mit Diethylpyrocarbonat inaktiviert wurde. Nach zehnminütigem Erhitzen bei 70ºC wurde die Lösung auf Eis abgekühlt.
Anschließend wurden 10 ul von 5 · RT-Puffer (250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 375 mM KCl, 15 mM MgCl&sub2;) zur Lösung zugegeben. Außerdem wurde das Gemisch mit 4 ul Ribonuclease-Inhibitor aus menschlicher Plazenta (20 Einheiten/ul, hergestellt von Amersham, Co.), 1,5 ul Nucleotidlösung (Lösung, die jeweils 10 mM von dATP, dGTP, dTTP und dCTP enthielt), 50 uCi (5 ul) von [α³²P]-dCTP (hergestellt von Amersham Co., PB10205, 10 mCi/ml, 3000 Ci/mMol) und 1 ul 250 mM Dithiothreitol versetzt und das Volumen schließlich mit H&sub2;O auf 49 ul gebracht. Schließlich wurde 1 ul reverse Transkriptase (erhalten vom Mo-MLV, 200 Einheiten/ul, hergestellt von Besesda Research Laboratories) zum Reaktionsgemisch zugegeben. Nach einstündigem Erwärmen bei 37ºC wurde das Reaktionsröhrchen wieder auf Eis gestellt, wodurch die Synthese der einzelsträngigen cDNA vervollständigt wurde.

(2) Synthese der einzelsträngigen cDNA unter Verwendung eines Zufallprimers

Nachdem eine Lösung von 8 ug Poly-(A)-mRNA, gelöst in 8 ul H&sub2;O, Hitzebehandelt worden war, wie im vorstehend beschriebenen Verfahren bei Verwendung des Oligo-(dT)-Primers, wurden 16 ul von 5 · "First Strand Buffer" (250 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM MgCl&sub2;, 50 mM Dithiothreitol), 4 ul einer 80 mM Natriumpyrophosphatlösung, 4 ul Ribonuclease-Inhibitor aus menschlicher Plazenta (20 Einheiten/ul, hergestellt von Amersham, Co.), 5 ul Lösung eines Desoxynucleotidtriphosphat-Gemisches, das jeweils 10 mM von dATP, dGTP, dTTP und dCTP enthielt, 4 ul Hexanucleotid-Zufallprimer von 0,02 OD/ul und 50 uCi (5 ul) von [α-³²P]- dCTP (hergestellt von Amersham Co., PB10205, 10 mCi/ml, 3000 Ci/mMol) zu der Hitze-behandelten Lösung zugegeben. Das Volumen wurde schließlich mit H&sub2;O auf 72 ul gebracht. Zuletzt wurden 8 ul reverse Transkriptase (die vom AMV stammt, 20 Einheiten/ml, hergestellt von Amersham Co.) zum Reaktionsgemisch zugefügt. Nach einstündigem Erhitzen bei 42ºC wurde das Reaktionsröhrchen wieder auf Eis gestellt, wodurch die Synthese der einzelsträngigen cDNA vervollständigt wurde.

(3) Synthese der doppelsträngigen cDNA

Zu der auf diese Weise synthetisierten einzelsträngigen cDNA wurden eine Pufferlösung und Enzyme in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 100 mM KCl, 0,15 mM β-NAD, 50 mM BSA, 40 uM dNTP, 8,5 Einheiten/ml E. coli-Ribonuclease H und 230 Einheiten/ml E. coli-DNA-Polymerase I zugefügt. Das Gemisch wurde zuerst 60 Minuten bei 12ºC und anschließend 60 Minuten bei 22ºC umgesetzt. Um die zugegebenen Enzyme zu inaktivieren, wurde das Reaktionsgemisch anschließend zehn Minuten bei 70ºC erhitzt und sodann wieder auf Eis gestellt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 2 Einheiten E. coli-DNA- Polymerase I, Klenow-Fragment, versetzt. Nach 30-minütigem Umsetzen bei 37ºC wurden 16 Einheiten T4-DNA-Polymerase zu dem Gemisch zugefügt. Durch 15 Minuten Umsetzen bei 37ºC wurden die beiden Termini der doppelsträngigen cDNA in glatte Enden überführt. Die Reaktion wurde beendet, indem 4 ul 0,25 M EDTA (pH 7,5) pro 100 ul Reaktionslösung zugefügt wurden. Die Syntheserate der doppelsträngigen cDNA, die aus der eingesetzten mRNA synthetisiert wurde, betrug bei Verwendung des Oligo-(dT)-Primers bzw. des Zufallprimers 30 bzw. 65%. Als nächstes wurde die synthetisierte cDNA unter Verwendung einer Qiagen-Säule, hergestellt von DIAGEN Co., gereinigt.
Die Reinigung der DNA unter Verwendung einer Qiagen-Säule erfolgte folgendermaßen. Die cDNA-Lösung, die vorher auf eine Konzentration von 0,5 M NaCl und 50 mM MOPS (pH 7,0) eingestellt worden war, wurde auf eine mit 0,5 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0) und 15% Ethanol äquilibrierte Qiagen-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 1,0 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0) und 15% Ethanol gewaschen, wobei ein Volumen von mehr als einem 10-fachen Überschuß gegenüber dem Säulenvolumen eingesetzt wurde, und anschließend folgte die Elution mit 1,5 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,5) und 15% Ethanol. Um das Eluat vollständig aus dem gepackten Harz zu entfernen, erfolgten eine Behandlung mit Phenol- Chloroform und eine Behandlung mit Chloroform. Sodann wurde das 0,8-fache Volumen an Isopropanol zum System zugegeben. Nach 15 Minuten Stehenlassen in Eiswasser erfolgte eine Zentrifugation bei 15 000 UpM für 30 Minuten. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde in 0,3 M Natriumacetatlösung gelöst und die Lösung anschließend mit dem 2,5-fachen Volumen an Ethanol versetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei -80ºC stehengelassen. Sodann wurde das Gemisch zehn Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die DNA gewonnen wurde.
Ein Überschuß des EcoRI-Adaptors (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., und Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde mit der gereinigten doppelsträngigen, mit glatten Enden versehenen cDNA in 100 ul einer Reaktionslösung ligiert, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,7 mM Dithiothreitol, 6,7 mM MgCl&sub2;, 1 mM ATP und 500 Einheiten/ml T4-DNA-Ligase enthielt. Sodann erfolgte zur Entfernung des überschüssigen EcoRI-Adaptors eine Reinigung, wobei wieder eine Qiagen-Säule eingesetzt wurde, hierauf folgte die Phosphorylierung des EcoRI-Adaptors am 5'-Ende mit 67 mM Tris-HCl (pH 8,0), 17 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM ATP und 200 Einheiten/ml T4-DNA-Polynucleotidkinase.
Um von der auf diese Weise erhaltenen DNA das überschüssige ATP und außerdem die kurze synthetische cDNA zu entfernen, wurde wieder eine Qiagen- Säule eingesetzt. Das Verfahren erfolgte genauso wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Säule mit 1,3 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0) und 15% Ethanol gewaschen wurde. Unter diesen Waschbedingungen können das über schüssige ATP und die cDNA mit einer Größe von weniger als etwa 700 bp Länge entfernt werden.
Die auf diese Weise gereinigte cDNA wurde durch Phenol-Chloroform- Behandlung und Ethanolfällung weiter gereinigt und eingeengt, so daß die endgültige cDNA-Genbank erhalten wurde. Die cDNA-Mengen, die unter Verwendung des Oligo-(dT)-Primers bzw. des Zufallprimers erhalten wurden, betrugen schließlich 2 bzw. 1,3 ug.

Beispiel 5

Absuchverfahren

I) Ligierung der doppelsträngigen cDNA und der λpt11-Vektor-DNA

Die doppelsträngige cDNA, an die der EcoRI-Adaptor wie vorstehend beschrieben angehängt worden war, wurde in die EcoRI-Spaltstelle von Xgt11 eingefügt, indem die Ligierung mit T4-DNA-Ligase erfolgte. Die Ligierung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Nach der vorherigen Spaltung mit EcoRI wurde die Phosphatgruppe am 5'- Ende der λgt11-Vektor-DNA mit alkalischer Phosphatase von E. coli entfernt. Die λgt11-Vektor-DNA (2 ug; 66 fMol) wurde mit der doppelsträngigen cDNA (160 ng; etwa 100 fMol) gemischt. Das Gemisch wurde bei 12ºC über Nacht mit einer Reaktionszusammensetzung (Endvolumen: 10 ul) umgesetzt, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,7 mM MgCl&sub2;, 6,7 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP und 5 Einheiten T4-DNA- Ligase enthielt.

II) In-vitro-Verpackung

1/3 der wie vorstehend beschrieben erhaltenen rekombinanten DNA wurde verpackt, wobei das von Stratagene Co. hergestellte In Vitro Packaging Kit (GIGA- PACK II GOLD) verwendet wurde, so daß Phagenpartikel erhalten wurden. Die Zahl der unter Verwendung dieser Phagenpartikel erhaltenen Transformanten betrug 8,8 x 10&sup7; Plaque-bildende Einheiten (pfu) bzw. 2,5 · 10&sup7; pfu pro 1 ug cDNA, die unter Verwendung des Oligo-(dT)-Primers bzw. des Zufallprimers synthetisiert worden war.

III) Absuchen der λgt11-Phagen-Genbank durch einen polyclonalen Antikörper gegen das Ratten-HCNP

Mit der Phagen-Genbank, welche die vorstehend beschriebene cDNA enthielt, wurde E. coli Y1090 als Wirt infiziert, und die cDNA-Clone, die unter Verwendung des Oligo-(dT)-Primers bzw. des Zufallprimers synthetisiert worden waren, wurden auf 10 Platten mit Agarmedium mit einem Durchmesser von 150 mm geimpft, so daß 1 · 10&sup6; Plaques erhalten wurden. Jede Platte wurde zwei Stunden bei 42ºC und anschließend 1,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Sodann wurde ein Nitrocellulose-Membranfilter (BA85; hergestellt von Schleicher & Schuell Co., Ltd.), das vorher mit 20 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid behandelt worden war, auf das mit den Transformanten beimpfte Agarmedium gelegt und weitere 3,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Filter wurde vorsichtig vom Agarmedium abgeschält und fünfmal fünf Minuten mit T-TBS-Lösung (60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) gewaschen. Sodann wurde das Filter in eine TBS-1%- BSA-Lösung (60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Rinderserumalbumin) überführt und drei Stunden bei Raumtemperatur leicht geschüttelt, wodurch das Rinderserumalbumin an das Filter angelagert wurde und auf diese Weise bei der Umsetzung mit dem Antikörper die Hintergrunddichte reduziert werden konnte.
Anschließend wurde das Filter in TBS-1%-BSA-Lösung gelegt, die den polyclonalen Antikörper (Ab-1) gegen das Ratten-HCNP (Sequenz Nr. 17) in 500-facher Verdünnung enthielt, es folgte ein leichtes Schütteln bei Raumtemperatur über Nacht, wodurch der primäre Antikörper mit dem am Filter immobilisierten Protein umgesetzt wurde. Das Filter wurde dreimal fünf Minuten gewaschen und in eine TBS-1%-BSA-Lösung gelegt, die einen 200-fach verdünnten biotinylierten Anti- Kaninchen-Ig-Esel-Antikörper (hergestellt von Amersham Co.) enthielt. Der sekundäre Antikörper wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur mit dem primären Antikörper umgesetzt, der an das am Filter immobilisierte Protein gebunden war. Nach dreimaligem Waschen mit T-TBS für fünf Minuten wurde das Filter in eine TBS-1%- BSA-Lösung gelegt, die einen 200-fach verdünnten Komplex aus Streptavidin und biotinylierter Peroxidase (hergestellt von Amersham Co.) enthielt, die Reaktion erfolgte eine Stunde bei Raumtemperatur. Der an den sekundären Antikörper gebundene Peroxidase-Komplex wurde nachgewiesen, indem das Filter bei Raumtemperatur 30 Minuten in 200 ml TBS-Lösung (60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl) eingetaucht wurde, zu der 40 ml 3 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol, 1 ml H&sub2;O&sub2; und 1 ml 1 M Imidazol zugefügt wurden, wodurch eine Farbe erzeugt wurde. Als Ergebnis des Absuchverfahrens unter Verwendung des Antikörpers wurden aus den cDNA- Genbanken, die anhand des Oligo-(dT)-Primers bzw. des Zufallprimers synthetisiert worden waren, 12 bzw. 1 positive Klone erhalten.
Jeder Clon wurde vereinzelt, wobei der gleiche primäre Antikörper (Ab-1), wie vorstehend beschrieben, gemäß dem gleichen Nachweisverfahren eingesetzt wurde. Um die Reaktivität mit den drei in Beispiel 1 beschriebenen polyclonalen Antikörpern zu untersuchen, wurde jeder der monoclonierten Clone entsprechend verdünnt, daß mehrere zehn Plaques pro ul erhalten wurden, und 1 ul der Verdünnung jedes Clons auf drei Platten getüpfelt. Die Reaktivität des durch jeden der Clone produzierten Proteins mit den drei Antikörpern wurde untersucht, wobei das Nachweissystem eingesetzt wurde, das vorstehend beschrieben wird. Als Ergebnis wurde gezeigt, daß die aus den drei Clonen stammenden Proteine mit den drei An tikörpern signifikant reagierten. Unter diesen Clonen waren zwei (A61, A62) bzw. einer (R4), die aus der cDNA-Genbank erhalten worden waren, die anhand des Oligo-(dT)-Primers bzw. des Zufallprimers synthetisiert worden war.

IV) Absuchen der λgt11-Phagen-Genbank durch eine Oligonucleotid-Sonde, die aus der Nucleotidsequenz hergestellt wurde, welche aus der Aminosäuresequenz des Ratten-HCNP hergeleitet worden war

Um festzustellen, ob die aus dem Ratten-HCNP hergeleitete Nucleotidsequenz der Sequenz Nr. 17 in der eingefügten cDNA-Sequenz in jedem der vorstehend beschriebenen Monoclone enthalten war, erfolgte eine Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde (Referenz 10). Die zwei in Fig. 1 dargestellten Oligonucleotid-Sonden wurden durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren mit ³²P markiert. Die markierten Sonden wurden mit einer Hybridisierungslösung verdünnt, die 20 ml 6 · SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat), 5 · Denhardt (0,1% Ficol, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Rinderserumalbumin) und 0,1% SDS enthielt, so daß 1 · 10&sup6; cpm/ml Sondenlösung erhalten wurden.
Unter Verwendung von E. coli Y1088 als Wirt wurde von jedem von insgesamt 13 Clonen, die unter Verwendung des Antikörpers (Ab-1), wie vorstehend in Abschnitt III beschrieben, ausgewählt wurden, 1 ul der Phagenverdünnung aufgetüpfelt, so daß mehrere zehn Plaques erhalten wurden, anschließend folgte eine zweistündige Inkubation bei 42ºC und danach eine vierstündige Inkubation bei 37ºC. Sodann wurden die Phagen auf ein Nitrocellulose-Membranfilter übertragen. Das Filter wurde zur Denaturierung der DNA fünf Minuten mit 0,5 N NaOH und 1,5 M NaCl-Lösung behandelt und anschließend zehn Minuten mit 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 3 M NaCl versetzt, um die DNA an das Filter zu immobilisieren. Nach Wachen mit 2 · SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat) für fünf Minuten wurde das Filter zwei Stunden bei 80ºC gebacken.
Das Filter wurde wieder mit 2 · SSC angefeuchtet und eine Prähybridisierung mit einer Sondenfreien Hybridisierungslösung sechs Stunden bei 34ºC durchgeführt. Anschließend wurde die Hybridisierung über Nacht bei 34ºC mit der vorstehend beschriebenen Sondenlösung fortgesetzt.
Das Filter wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 · SSC und 0,1% SDS gewaschen und anschließend viermal 30 Minuten bei 42ºC mit 2 · SSC und 0,1% SDS gewaschen. Danach wurden die Clone, die eine Homologie zu den zwei Sonden aufwiesen, mittels Autoradiographie nachgewiesen.
Die Ergebnisse zeigen, daß lediglich die drei Clone (A61, A62, R4), welche die gleiche Reaktivität mit den drei polyclonalen Antikörpern zeigten, wie in Abschnitt III beschrieben, den Bereich enthielten, der eine Homologie zu den zwei Oligonucleotid-Sonden aufwies.

Beispiel 6

Bestimmung der Nucleotidsequenz des Gens welches das Ratten-HCNP- enthaltende Vorläufer-Protein codiert

Die Phagen-DNA wurde aus den drei Clonen (A61, A62, R4) hergestellt, die fähig sind, das Vorläufer-Protein des Ratten-HCNP zu codieren, wie im vorstehend beschriebenen Beispiel 5 erhalten. Das eingefügte DNA-Fragment wurde sodann subcloniert und die Nucleotidsequenz bestimmt.
Die Phagen-DNA wurde nach den folgenden Verfahren hergestellt. Der vereinigte Phagenclon wurde so angeimpft, daß er auf der gesamten Oberfläche der Platte vorlag. Nach der Züchtung über Nacht bei 37ºC wurden 5 ml eines Lambda- Diluens (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM EDTA) auf das Agarmedium gegossen, um die Lyse der Platte zu bewirken, wodurch die Phagenpartikel amplifiziert wurden. Unter Einsatz der auf diese Weise erhaltenen Phagenpartikel wurde der Phage in großen Mengen durch Flüssigkultur hergestellt. Nachdem 2 ml E. coli Y1088-Vorkultur und die Phagenpartikel zu 100 ml flüssigem Medium mit einer Infektionsmultiplizität (moi) von 0,05 zugegeben worden waren, wurde der Erlenmeyer-Kolben so lange kräftig geschüttelt, bis E. coli lysiert war. Nach der Lyse wurde 1 ml Chloroform zugefügt, wodurch E. coli vollständig lysiert wurde. Die erhaltene Phagenlösung wurde zehn Minuten bei 9000 UpM zentrifugiert. Nach Entfernung der Zelltrümmer von E. coli wurde der Überstand mit DNase I und RNase A mit 10 ug/ml versetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC gehalten. Anschließend wurde die 1/5-fache Menge einer Lösung von 30% Polyethylenglykol und 3 M NaCl zugegeben und eine Stunde in Eis gekühlt. Nach einer zehnminütigen Zentrifugation bei 9000 UpM wurde der resultierende Niederschlag in 3 ml 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl und 25 mM EDTA suspendiert und die Suspension mit 3 ml 4% SDS versetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 70ºC erhitzt. Anschließend wurden 3 ml 2,55 M Kaliumacetat (pH 4,8) zu der Suspension zugegeben. Nach Rühren erfolgte eine Zentrifugation 30 Minuten bei 17 000 UpM und 4ºC, sodann wurde der Überstand durch ein Glasfilter passiert, um Verunreinigungen zu entfernen. Das Filtrat wurde aufgetragen auf Qiagen-pack 100 (hergestellt von DIAGEN Co.), äquilibriert mit 750 mM NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0) und 15% Ethanol. Anschließend wurde die Säule mit 4 ml 1,0 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0) und 15% Ethanol gewaschen, die Elution der DNA erfolgte mit 4 ml 1,2 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 8,0) und 15% Ethanol. Nach Zugabe des 0,8-fachen Volumens an Isopropanol zu dem Eluat wurde das Gemisch 15 Minuten auf Eis stehengelassen, anschließend folgte eine dreißigminütige Zentrifugation bei 17 000 UpM. Der Niederschlag wurde in 0,3 M Natriumacetat (pH 4,5) gelöst und das 2,5- fache Volumen an Ethanol zu der Lösung zugefügt. Nach 15 Minuten Abkühlen bei -80ºC erfolgte eine Zentrifugation, wodurch die DNA gewonnen wurde.
Das cDNA-Insertions-Fragment, das durch Spaltung der Phagenclon-DNA (1 ug) mit einem geeigneten Restriktionsenzym und Reinigung hergestellt wurde, wurde in einen gespaltenen und dephosphorylierten M13mp19- oder M13mp18-Phagenvektor eingefügt. Die Restriktionskarte der DNA des Clons A61, welcher die längste cDNA-Insertion unter den Clonen A61, A62 und R4 enthielt, und die Vorgehensweise zur Bestimmung der Nucleotidsequenz sind in Fig. 2 dargestellt. Die Nucleotidsequenz wurde bestimmt, indem aus der Transformante mit dem cDNA- Insertions-Fragment des Clons A61 eine einzelsträngige Phagen-DNA hergestellt wurde, hierfür wurde das DNA Sequencing Kit eingesetzt (hergestellt von United States Biochemicals Co., Sequenase Version 2.0).
Die auf diese Weise bestimmte Nucleotidsequenz des Clons A61 wies ein großes offenes Leseraster auf. Das in dieser cDNA-Insertion enthaltene offene Leseraster bestand aus 186 Aminosäuren vom 5'-Ende der cDNA aus, während die ATG-Sequenz fehlte, die bei Eukaryoten als Translations-Initiationssequenz wirkt. Die am 3'-Ende der mRNA vorliegende Poly-(A)-Sequenz wurde am 3'-Ende dieser cDNA gefunden, und die Sequenz AATAAA, ein Poly-(A)-Additions-Signal aus 6 Nucleotiden, das im allgemeinen in den meisten mRNAs von Eukaroten gefunden wird, wurde stromaufwärts lokalisiert. Die auf diese Weise bestimmte DNA- Sequenz der cDNA-Insertion und das offene Leseraster sind in den Fig. 3 bzw. 4 dargestellt.
Die Aminosäuresequenz, die durch diese cDNA codiert wird, kann wie in Fig. 5 dargestellt hergeleitet werden. Das Polypeptid besteht aus 186 Aminosäuren und sein Molekulargewicht wurde auf 20 669,1 Dalton bestimmt. Bei der Ratte ist das Ratten-HCNP der Sequenz Nr. 17, das eine neurotrophe Aktivität aufweist, im Bereich vom ersten bis zum elften Aminosäurerest am N-Terminus des in Fig. 5 dargestelltem Polypeptids lokalisiert. Die Nucleotidsequenz, die dem Aminosäurebereich entspricht, ist durch Sequenz Nr. 1 dargestellt. Die cDNA-Insertion von Clon A62 enthielt den Stromabwärts-Bereich ab dem zweiten Aminosäurerest der in Fig. 5 dargestellten Aminosäuresequenz. Andererseits wurde in Clon R4 der gleiche Aminosäureterminus nachgewiesen wie in A61.

Beispiel 7

Selektion eines Clons, der die cDNA in voller Länge aufwies und Bestimmung der Nucletoidsequenz des DNA-Insertions-Fragments

Die vorstehend beschriebene cDNA des Clons A61 erstreckte sich nicht bis zum Translations-Initiationscodon, so daß der zum Polypeptid gehörende N- Terminus nicht analysiert werden konnte. Deshalb wurde das HincII-HincII- Fragment mit etwa 190 bp, das in der Restriktionsenzymkarte von Fig. 2 dargestellt ist, durch das Random Prime Labeling Kit (hergestellt von Amersham Co.) mit ³²P markiert. Indem das so markierte Fragment als Sonde verwendet wurde, wurden cDNA-Clone selektiert, die sich bis zum 5'-Stromaufwärts-Bereich des Translations- Initiationscodons erstreckten, und die Nucleotidsequenzen wurden bestimmt.
E. coli Y1088 wurde als Wirt verwendet und die λgt11-Phagen-Genbank, in welche die anhand des Oligo-(dT)-Primers synthetisierte cDNA eingebaut war, auf 10 Platten plattiert (150 000 pfu pro Agarmedium mit einem Durchmesser von 150 mm). Die Phagen-DNA wurde genauso an ein Nitrocellulose-Membranfilter immobilisiert, wie in Beispiel 5 beschrieben, und eine Prähybridisierung sechs Stunden bei 42ºC mit einer Hybridisierungslösung durchgeführt, die die folgende Zusammensetzung aufwies: 50% Formamid, 6 · SSC, 5 · Denhardt-Lösung und 0,1% SDS. Anschließend wurde die Hybridisierung über Nacht bei 42ºC mit einer Hybridisierungslösung (1 · 10&sup6; cpm) fortgesetzt, die das vorstehend beschriebene, markierte HincII-HincII-Fragment enthielt.
Das Filter wurde mit 2 · SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur 15 Minuten und anschließend dreimal 30 Minuten gewaschen. Danach wurden die Clone durch Autoradiographie selektiert. Die resultierenden neun Clone wurden durch ein zweites und drittes Absuchverfahren isoliert, wodurch eine Phagenlösung erhalten wurde.
Um aus den ausgewählten Clonen cDNA-Clone zu selektieren, die sich bis zum 5'-Ende der mRNA erstreckten, erfolgte ein erneutes Absuchverfahren, wobei als Sonde ein DNA-Fragment mit etwa 90 bp von der EcoRI-Adaptor-Sequenz zur HincII-Spaltstelle verwendet wurde, wie in der Restriktionsenzymkarte der cDNA des Clons A61 in Fig. 2 dargestellt.
Die Phagenlösung wurde so auf das Agarmedium getüpfelt, daß mehrere zehn Plaques pro Clon erscheinen würden, und die Hybridisierung erfolgte gemäß den vorstehend beschriebenen Absuchverfahren. Die Ergebnisse zeigen, daß sechs der neun Clone solche Clone sind, die eine cDNA enthalten, welche sich zumindest bis zu der stromaufwärts des 5'-Endes liegenden HincII-Spaltstelle erstreckt, wie in der Restriktionsenzymkarte von Fig. 2 dargestellt. Die DNA dieser sechs λ-Phagenclone wurde durch eine Flüssigkultur hergestellt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Nach der Spaltung mit EcoRI wurde die eingebaute DNA in die EcoRI- Stelle eines vorher mit alkalischer Phosphatase behandelten M13mp19 subcloniert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Als Ergebnis wurde erhalten, wie in Sequenz Nr. 2 gezeigt, daß die ATG-Sequenz, die das Translations-Initiationscodon darstellt, in der Nucleotidsequenz der im Clon AO10-12 enthaltenen cDNA-Insertion vorlag, und zwar direkt vor der Sequenz des Ratten-HCNP, welches die Aktivität des vom Ratten-Hippocampus stammenden neurotrophen Faktors aufwies. Die Ergebnisse, die bei der Herleitung der Aminosäuresequenz erhalten wurden, die in der cDNA des Clons AO10-12 codiert ist, sind in Sequenz Nr. 3 dargestellt. Die in Sequenz Nr. 3 beschriebene Aminosäuresequenz enthält nicht die ATG-Sequenz, welche das Translations-Initiationscodon darstellt.
Das Scannen einer Datenbank mit der cDNA zeigt, daß die Aminosäuresequenz des bovinen Phosphatidylethanolamin-bindenden Proteins zu der durch die DNA codierten Aminosäuresequenz eine Homologie von 84,4% aufwies (Referenz 9).
In AO1-1, einem der Clone, die sich bis zu der stromaufwärts des 5'-Endes liegenden HincII-Spaltstelle erstreckt, wie in der Restriktionsenzymkarte in Fig. 2 gezeigt, war der Aminosäurerest 135, gezählt vom Methioninrest aus, der als Translations-Initiationscodon vermutet wird, ein Lysinrest (in den Clonen A61, R4 und AO10-12 ein Glutaminsäurerest). Die Sequenz GAG (Glu) in den Clonen A61, R&sup4; und AO10-12 ist in AO1-1 in die Sequenz AAG (Lys) umgewandelt.

Beispiel 8

Spaltung des Vorläufer-Proteins, welches das Ratten-HCNP enthält, durch Lysyl- Endopeptidase und Aminosäuresequenz des entstehenden Peptids

Um die Aminosäuresequenz des Proteins mit einem Molekulargewicht von 23 Kilodalton zu bestimmen, das im Hippocampus des Rattengehirns vorliegt und eine Reaktivität mit dem gegen das Ratten-HCNP gerichteten Antikörper zeigt, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde das Oligopeptid gereinigt, das durch die Spaltung durch Lysyl-Endopeptidase erhalten wurde.
Das durch die Spaltung des Proteins mit einem Molekulargewicht von 23 Kilodalton durch Lysyl-Endopeptidase erzeugte Oligopeptid wurde einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie unterworfen, um die entsprechenden Fragmente zu isolieren und zu reinigen. Das Oligopeptid wurde fraktioniert, wobei die Säule RP- 304 (Durchmesser von 4,6 · 250 mm; hergestellt von Biorad Co.) und das Lösungsmittelsystem 0,1% Trifluoressigsäure Acetonitril verwendet wurden. Neun eluierte Fraktionen (jeweils 500 ul) wurden auf den Sequenzer 477A (hergestellt von Applied Biochemicals Co.) aufgetragen, um die Aminosäuresequenz des Peptid- Bestandteils mittels serieller Sequenzierung zu analysieren. Als Ergebnis wurden die Aminosäuresequenzen der in acht Fraktionen eluierten Polypeptide bestimmt. Die Ergebnisse, die bei der Bestimmung der Aminosäuresequenz des jeweiligen Fragments erhalten wurden, sind in den Sequenzen Nr. 5 bis 12 dargestellt. Das Oligopeptid, dessen Struktur nicht bestimmt wurde, liegt aufgrund seines blockierten N-Terminus vermutlich am N-Terminus der 23 Kilodalton. Die Aminosäuresequenzen der Peptid-Bestandteile, deren Strukturen bestimmt wurden, konnten alle auf der in Sequenz Nr. 3 hergeleiteten Aminosäuresequenz lokalisiert werden. Die Ergebnisse liefern deutliche Hinweise darauf, daß das Protein mit einem Molekulargewicht von 23 Kilodalton mit dem Protein übereinstimmt, das durch das in den Beispielen 6 und 7 bestimmte Gen codiert wird.

Beispiel 9

Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz des Vorläufer-Proteins, welche durch die Spaltung durch Lysyl-Endopeptidase erhalten wurde

Um das Lysyl-Endopeptidase-Fragment mit 38 Aminosäureresten zu bestimmen, das am N-Terminus blockiert war, wie in Beispiel 8 beschrieben, wurde dieser Peptid-Bestandteil weiter einer Spaltung mit Trypsin unterworfen und sodann die Aminosäuresequenz der Reste 26 bis 38 am C-Terminus bestimmt. Anschließend wurde das restliche N-terminale Fragment durch Chymotrypsin gespalten, um die Aminosäuresequenz des Peptids der Reste 8 bis 25 am C-Terminus bestimmen zu können. Danach wurde das N-terminale Peptid durch ein Acylaminosäurefreisetzendes Enzym gespalten, wodurch die Sequenz der Aminosäurereste 2 bis 6 bestimmt wurde. Als Ergebnis wurden alle Aminosäuresequenzen der blockierten N-terminalen Lysyl-Endoeptidase-Fragmente bestimmt, mit Ausnahme des acylierten N-terminalen Aminosäurerestes und des siebenten Aminosäurerestes. Die auf diese Weise bestimmte Aminosäuresequenz ist in Sequenz Nr. 4 dargestellt. Die in Sequenz Nr. 4 gezeigte Sequenz, die von der Nucleotidsequenz hergeleitet ist, enthält den N-terminalen und den siebenten Aminosäurerest. Das Ergebnis der Analyse der auf diese Weise erhaltenen Aminosäuresequenz zeigt, daß das vorstehend beschriebene Fragment in dem Bereich liegt, welcher die Oligopeptidsequenz mit der Aktivität des neurotrophen Faktors enthält, die im N-Terminus der Aminosäuresequenz vorlag, die durch das Vorläufer-Gen codiert wird, welches durch die Bestimmung der Nucleotidsequenz in den Beispielen 6 und 7 ermittelt wurde.
Bei Untersuchungen in den letzten Jahren wurde festgestellt, daß die N- Termini von Ratten-HCNP meist acyliert waren. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß der N-Terminus bereits im Stadium des Vorläufer-Polypeptids acyliert war.
Wie in Beispiel 3 ausführlich beschrieben, wurde das Molekulargewicht des Vorläufer-Proteins, dessen Expression im Rattengehirn nachgewiesen wurde, auf 23 Kilodalton geschätzt, wobei diese Schätzung aufgrund der Ergebnisse des Western-Blotting erfolgte, dieser Wert unterschied sich jedoch von dem Molekulargewicht (21 Kilodalton), das aus der Aminosäuresequenz berechnet wurde, die aus der Nucleotidsequenz des bestimmten Gens hergeleitet wurde. Dieser Unterschied im Molekulargewicht wurde auch im Fall des bovinen Phosphatidylethanolaminbindenden Proteins festgestellt (Referenz 9) und beruht vermutlich darauf, daß die Mobilität des Proteins in der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese aufgrund der sterischen Struktur des Proteins usw. beeinflußt wird.

Beispiel 10

Absuchen nach dem menschlichen cDNA-Gen, das dem Ratten-HCNP- enthaltenden Vorläufer-Gen entsprach

Um den menschlichen cDNA-Clon zu isolieren, wurden eine menschliche fetales-Gehirn-cDNA-Genbank und eine menschliche Plazenta-cDNA-Genbank (beide hergestellt von Clontech Co.) abgesucht, wobei ein cDNA-Clon des Ratten- HCNP-Voräufers als Sonde verwendet wurde. Mit den Phagen, die jeweils eine der vorstehend beschriebenen, von menschlichem Gewebe stammenden cDNA- Genbanken enthielten, wurde E. coli Y1090 infiziert und jeweils 1 · 10&sup6; pfu der Phagen auf 10 Platten geimpft. Die Phagenpartikel wurden auf ein Nitrocellulose- Filter (hergestellt von Schleicher & Schuell Co.) überführt. Nach zweimaliger Behandlung in Denaturierungslösung (0,1 N NaOH, 1 M NaCl) für fünf Minuten und anschließender zweimaliger Behandlung in Neutralisationslösung (3 M NaCl, 1 M Tris-HCl (pH 7,5)) für fünf Minuten wurde das Filter in 2 · SSC-Lösung (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat) eingetaucht, getrocknet und drei Stunden bei 80ºC gebacken.
Das EcoRI-Fragment von etwa 1 kb, das im Ratten-HCNP-Vorläufer-cDNA- Clon enthalten war (R4) (beschrieben in Beispiel 6), wurde durch das Random Prime Labeling Kit (hergestellt von Amersham Co.) mit ³²P markiert, zehn Minuten bei 95ºC erhitzt und denaturiert, sodann wurde es als Sonde eingesetzt. Das Nitrocellulose-Filter, an welches die Phagen immobilisiert worden waren, wurde vier Stunden bei 37ºC in einer Lösung prähybridisiert, die 50% Formamid, 5 · SSC, % SDS, 0,2% Ficol, 0,2% Polyvinylpyrrolidon und 0,2% Rinderserumalbumin enthielt. Anschließend wurde die Hybridisierung durchgeführt, indem das Filter über Nacht in der gleichen Lösung wie vorstehend geschüttelt wurde, in der jetzt jedoch die vorstehend beschriebene Sonde enthalten war.
Das Filter wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur in 2 · SSC und sodann weitere zwei Stunden bei 50ºC in 2 · SSC und 1% SDS gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Filter einer Autoradiographie unterworfen. Als Ergebnis wurden etwa 10 positive Plaques pro 1 · 10&sup5; pfu erhalten. Jeder Clon wurde isoliert, indem drei Zyklen dieser Verfahren wiederholt wurden. Von diesen positiven Plaques wurden 15 Clone (fb-1 bis fb-15) bzw. 4 Clone (pl-1, 3, 4 und 5) aus der cDNA- Genbank des menschlichen fetalen Gehirns bzw. aus der cDNA-Genbank der menschlichen Plazenta selektiert, welche besonders starke Signale aufwiesen. Die DNA, die aus diesen insgesamt 19 Phagenclonen nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wurde mit EcoRI gespalten, um die Größe der cDNA-Insertion zu bestimmen. Das EcoRI-Fragment des Clons (pl-3) mit der läng sten cDNA-Insertion (1,4 kb) wurde in die EcoRI-Stelle des Vektors pBluescript II (hergestellt von Stratagene Co.) subcloniert.

Beispiel 11

Bestimmung der Nucleotidsequenz des menschlichen cDNA-Gens, das dem Ratten-HCNP-enthaltenden Vorläufer-Gen entsprach

Die Nucleotidsequenz der cDNA, die in den Vektor pBluescript II subcloniert wurde, wie im vorstehenden Beispiel 10 beschrieben, wurde durch die Verfahren von Beispiel 6 bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß pl-3 das offene Leseraster enthielt, das mit ATG als Initiationscodon der Eukaryoten begann, daß es jedoch weder die Sequenz, die mit der Sequenz AATAAA übereinstimmt, die ein Poly-(A)- Additions-Signal darstellt, noch die Poly-(A)-Sequenz enthielt. Die Nucleotidsequenz der cDNA, die das offene Leseraster enthält, ist in Sequenz Nr. 13 dargestellt. Außerdem ist die aus der in Sequenz Nr. 13 dargestellten Nucleotidsequenz hergeleitete Aminosäuresequenz in Sequenz Nr. 14 angegeben. Die beschriebene Aminosäuresequenz enthält kein durch das Initiationscodon ATG codiertes Methionin. Die Aminosäuresequenz, die hergeleitet werden kann, besteht aus 186 Aminosäuren. Hiervon entspricht das Oligopeptid, das in Sequenz Nr. 15 dargestellt ist, dem Bereich von der ersten Aminosäure (Prolin) bis zur elften Aminosäure (Leucin) des Polypeptids, das in Sequenz Nr. 14 dargestellt ist. Außerdem ist die Nucleotidsequenz, die das vom Menschen stammende neurotrophe Peptid codiert, in der Sequenz Nr. 16 dargestellt.

Beispiel 12

Synthese von hHCNP(1-11) (Sequenz Nr. 15)

Ein chlormethyliertes Polystyrol-Vinylbenzol-Harz (1% Divinylbenzol mit einem anfänglichen Chloridzusatz von 0,64 mMol/g Harz) mit einem Partikeldurchmesser von 100 bis 200 Mesh wurde eingesetzt. Bei der Synthese des Polypeptids wurden 4,79 g Boc-Leu-OH in einem Gemisch aus 45 ml Ethylalkohol und 15 ml Wässer gelöst und der pH-Wert mit einer 20% Cäsiumcarbonatlösung auf 7 eingestellt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und getrocknet. Der Rückstand wurde mit 220 ml DMF und außerdem mit 20 g des chlormethylierten Harzes versetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 50ºC gerührt, wobei die Veresterung erfolgte. Das resultierende Boc-Leu-O-Harz wurde filtriert und nacheinander mit 90% DMF, DMF und Ethylalkohol gewaschen und sodann getrocknet. Die Ausbeute betrug 21,8 g.
6 g dieses Boc-Leu-O-Harzes wurden in einen Festphasen-Synthesereaktor gefüllt. Entsprechend dem nachstehenden Schema 1 wurden nacheinander Boc- Pro-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Trp-OH, Boc-Lys(CIZ)-OH, Boc- Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Val-OH und Boc-Pro-OH an das Harz gebunden. Als Ergebnis wurden 11,9 g des hHCNP(1-11)-Peptid-Harzes erhalten.
6,00 g dieses hHCNP(1-11)-Peptid-Harzes wurden mit 9 ml Anisol, 1,5 ml Ethylmethylsulfid und 60 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff versetzt. Das Gemisch wurde 60 Minuten bei -20ºC und anschließend 60 Minuten bei 0ºC umgesetzt. Nach Einengen des Reaktionsgemisches im Vakuum wurden 200 ml Diethylether zum Rückstand zugefügt. Die Aufschlämmung wurde 30 Minuten gerührt, filtriert und mit 100 ml Diethylether gewaschen. Der Rückstand wurde mit 200 ml einer 5% wäßrigen Essigsäurelösung versetzt. Nach 30 Minuten Rühren wurde das Harz abfiltriert und mit 100 ml einer 5% wäßrigen Essigsäurelösung gewaschen. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wodurch ein Rohpeptid erhalten wurde, das in 100 ml einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung gelöst wurde. Die Lösung wurde auf eine Reverse Phase YMC-A363 (S-5) ODS-Säule ( 30 · 250 mm) aufgetragen, die vorher mit einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung wurde das Peptid mit einem Gradienten von 0 bis 26% Acetonitril in 480 Minuten mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 6,0 ml/Min. eluiert. Das Eluat wurde bei A280 nm überwacht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wodurch 471,1 mg hHCNP(1-11) erhalten wurden.
Das auf diese Weise erhaltene hHCNP(1-11) wurde bei einer Retentionszeit von 31,0 Minuten mit einem linearen Dichtegradienten von 10 bis 50% wäßrigem Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, durch eine Reverse Phase YMC-AM303 (S-5) ODS-Säule ( 4,6 · 250 mm) eluiert. Die Aminosäureanalyse des Peptids stimmte mit den errechneten Werten überein.

Aminosäureanalyse

Hydrolyse: 4 N Methansulfonsäure, 2% Tryptamin, 24 Stunden bei 110ºC
Analysenverfahren: PICO-TAG (Reverse Phase PTC-Aminosäure)-Verfahren
Ergebnis: Asx: 1,12 (1)
Ser: 2,24 (2)
Gly: 1,19 (1)
Pro: 2,11 (2)
Val: 1,07 (1)
*Leu: 2,00 (2)
Trp: 0,97 (1)
Lys:0,82 (1)
*Leu wurde als Standardaminsäure eingesetzt. Die Werte in Klammern geben die errechneten Werte an.

Schema 1

Schritte Zeit (Min.) x Behandlungszyklen

1. Waschen mit Methylenchlorid, 60 ml 2 · 3
2. Abspaltung der Schutzgruppe mit 50% TFA, 5% 3 · 1
Ethandiol, 45% Methylenchlorid (Vol./Vol.), 60 ml 20 · 1
3. Waschen mit Methylenchlorid, 60 ml 2 · 2
4. Waschen mit Methanol, 60 ml 2 · 2
5. Neutralisation mit 10% Triethylamin, 90% 1 · 1
Methylenchlorid (Vol./Vol.), 60 ml
6. Waschen mit Methanol, 60 ml 2 · 1
7. Neutralisation mit 10% Triethylamin, 90% 1 · 1
Methylenchlorid (Vol./Vol.), 60 ml
8. Waschen mit Methanol, 60 ml 2 · 2
9. Waschen mit Methylenchlorid, 60 ml 2 · 3
10. Verknüpfung durch Verwendung von verschiedenen, 5 · 1 Amino-geschützten Aminosäuren (6 mMol), Additiv (HOBt oder HONp) 50% DMF-50% Methylenchlorid (Vol./Vol.), 30 ml Lösung von DCC (6 mMol) in Methylenchlorid, 12 ml 120 · 1
11. Waschen mit 50% DMF, 50% Methylenchlorid 2 · 2 (Vol./Vol.), 60 ml
12. Waschen mit Methanol, 60 ml 2 · 1
13. Neutralisation mit 10% Triethylamin, 90% Methylen-chlorid (Vol./Vol.), 60 ml 1 · 1
14. Waschen mit Methanol, 60 ml 2 · 2
15. Waschen mit Methylenchlorid, 60 ml 2 · 2
16. Acetylierung mit 25% Essigsäureanhydrid, 75% 15 · 1
Methylenchlorid (Vol./Vol), 60 ml
17. Waschen mit Methylenchlorid, 60 ml 2 · 2
18. Waschen mit Methanol, 60 ml 2 · 2
Nach der Verknüpfungsreaktion in Schritt 10 wurde eine kleine Menge des Harzes einem Ninhydrin-Test unterworfen, und wenn dabei eine positive blaue Färbung die Unvollständigkeit der Verknüpfungsreaktion anzeigte, wurde die Verknüpfungsreaktion mit einer Aminosäure wiederholt, die auf gleiche Weise geschützt war. Sofern die Verknüpfung nach zweimaligem Auftreten erfolgte, wurde DMF oder 1-Methyl-2-pyrrolidinon anstelle von 50% DMF-50% Methylenchlorid (Vol./Vol.) eingesetzt und die Verknüpfungsreaktion maximal 12 Stunden durchgeführt.

Beispiel 13

Synthese von hHCNP(2-7) (Sequenz Nr. 18)

Ein chlormethyliertes Polystyrol-Vinylbenzol-Harz (1% Divinylbenzol mit einem anfänglichen Chloridzusatz von 0,66 mMol/g Harz) mit einem Partikeldurchmesser von 100 bis 200 Mesh wurde eingesetzt. Bei der Synthese des Polypeptids wurden 9,64 g Boc-Trp-OH in einem Gemisch aus 100 ml Ethylalkohol und 34 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit einer 20% Cäsiumcarbonatlösung auf 7 eingestellt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und getrocknet. Der Rückstand wurde mit 240 ml DMF und außerdem mit 40,16 g des chlormethylierten Harzes versetzt. Das Gemisch wurde 14 Stunden bei 50ºC und weitere 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Veresterung erfolgte. Das resultierende Boc- Trp-O-Harz wurde filtriert und nacheinander mit 90% DMF, DMF und Ethylalkohol gewaschen und sodann getrocknet. Die Ausbeute betrug 46,8 g.
6 g dieses Boc-Trp-O-Harzes wurden in einen Festphasen-Synthesereaktor gefüllt. Entsprechend dem vorstehend beschriebenen Schema 1 wurden nacheinander Boc-Lys(CIZ)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH und Boc-Val-OH an das Harz gebunden. Als Ergebnis wurden 8,83 g des hHCNP(2-7)- Peptid-Harzes erhalten.
8,83 g dieses hHCNP(2-7)-Peptid-Harzes wurden mit 14 ml Anisol, 2,2 ml Ethylmethylsulfid und 100 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff versetzt. Das Gemisch wurde 90 Minuten bei -20ºC und anschließend 70 Minuten bei 0ºC umgesetzt. Nach Einengen des Reaktionsgemisches im Vakuum wurden 100 ml Diethylether zum Rückstand zugefügt. Die Aufschlämmung wurde 30 Minuten gerührt, filtriert und mit 300 ml Diethylether und 300 ml Chloroform gewaschen. Der Rückstand wurde mit 100 ml einer 1 N wäßrigen Essigsäurelösung versetzt. Nach 30 Minuten Rühren wurde das Harz abfiltriert und mit 40 ml einer 1 N wäßrigen Essigsäurelösung gewaschen. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wodurch 2,38 g eines Rohpeptids erhalten wurden.
Das resultierende Rohpeptid wurde in 250 ml Wasser gelöst. Die Läsung wurde auf eine Reverse Phase YMC-R355-15/30 ODS-Säule ( 50 · 500 mm) aufgetragen, die vorher mit einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung wurde das Peptid mit einem Gradienten von 0 bis 15% Acetonitril in 180 Minuten mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 ml/Min. eluiert. Das Eluat wurde bei A220 nm über wacht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wodurch 2,054 g hHCNP(2-7) erhalten wurden.
Das auf diese Weise erhaltene hHCNP(2-7) wurde bei einer Retentionszeit von 13,2 Minuten mit einem linearen Dichtegradienten von 20 bis 50% wäßrigem Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, durch eine Reverse Phase YMC-AM303 (S-5) ODS-Säule ( 4,6 · 250 mm) eluiert. Die Aminosäureanalyse des Peptids stimmte mit den errechneten Werten überein.

Aminosäureanalyse

Hydrolyse: 4 N Methansulfonsäure, 2% Tryptamin, 24 Stunden bei 110ºC
Analysenverfahren: PICO-TAG (Reverse Phase PTC-Aminosäure)-Verfahren
Ergebnis: Asx: 1,13 (1)
Ser: 2,05 (1)
Val: 1,07 (1)
Leu: 1,00 (1)
Trp: 0,80 (1)
Lys: 0,94 (1)
*Leu wurde als Standardaminsäure eingesetzt. Die Werte in Klammern geben die errechneten Werte an.

Beispiel 14

Synthese von hHCNP(6-11) (Sequenz Nr. 19)

6 g dieses Boc-Leu-O-Harzes, wie in Beispiel 12 beschrieben, wurden in einen Festphasen-Synthesereaktor eingefüllt. Entsprechend dem in Beispiel 12 beschriebenen Schema 1 wurden nacheinander Boc-Pro-OH, Boc-Gly-OH, Boc- Ser(Bzl)-OH, Boc-Trp-OH und Boc-Lys(CIZ)-OH an das Harz gebunden. Als Ergebnis wurden 9,46 g des hHCNP(6-11)-Peptid-Harzes erhalten.
9,46 g dieses hHCNP(6-11)-Peptid-Harzes wurden mit 15 ml Anisol, 2,4 ml Ethylmethylsulfid und 100 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff versetzt. Das Gemisch wurde 60 Minuten bei -20ºC und anschließend 70 Minuten bei 0ºC umgesetzt. Nach Einengen des Reaktionsgemisches im Vakuum wurden 100 ml Diethylether zum Rückstand zugefügt. Die Aufschlämmung wurde 30 Minuten gerührt, filtriert und mit 150 ml Diethylether und 150 ml Chloroform gewaschen. Der Rückstand wurde mit 100 ml einer 1 N wäßrigen Essigsäurelösung versetzt. Nach 30 Minuten Rühren wurde das Harz abfiltriert und mit 50 ml einer 1 N wäßrigen Essigsäurelösung gewaschen. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wodurch 2,82 g eines Rohpeptids erhalten wurden.
Das resultierende Rohpeptid wurde in 200 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf eine Reverse Phase YMC-R355-15/30 ODS-Säule ( 50 · 500 mm) aufgetragen, die vorher mit einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit einer wäßrigen 0,1% TFÄ-Lösung wurde das Peptid mit einem Gradienten von 0 bis 7% Acetonitril in 180 Minuten und sodann bis 15% Acetonitril in 300 Minuten mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 ml/Min. eluiert. Das Eluat wurde bei A220 nm überwacht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wodurch 1,194 g hHCNP(6-11) erhalten wurden.
Das auf diese Weise erhaltene hHCNP(6-11) wurde bei einer Retentionszeit von 14,0 Minuten mit einem linearen Dichtegradienten von 20 bis 35% wäßrigem Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, durch eine Reverse Phase YMC-AM303 (S-5) ODS-Säule ( 4,6 · 250 mm) eluiert. Die Aminosäureanalyse des Peptids stimmte mit den errechneten Werten überein.

Aminosäureanalyse

Hydrolyse: 4 N Methansulfonsäure, 2% Tryptamin, 24 Stunden bei 110ºC
Analysenverfahren: PICO-TAG (Reverse Phase PTC-Aminosäure)-Verfahren
Ergebnis: Ser: 1,11 (1)
Gly: 1,25 (1)
Pro: 1,06 (1)
*Leu: 1,00 (1)
Trp: 0,76 (1)
Lys: 0,97 (1)
*Leu wurde als Standardaminsäure eingesetzt. Die Werte in Klammern geben die errechneten Werte an.

Beispiel 15

Synthese von hHCNP(4-8)NH&sub2;

Ein MBHA-Harz (1% Divinylbenzol mit einem anfänglichen Aminogruppen- Anteil von 0,76 mMol/g Harz) mit einem Partikeldurchmesser von 100 bis 200 Mesh wurde eingesetzt. Dieses Harz, 3,95 g, wurde in einen Festphasen-Synthesereaktor gefüllt. Entsprechend dem in Beispiel 12 beschriebenen Schema 1 wurde die Synthese von Schritt 3 aus begonnen und nacheinander Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Trp-OH, Boc-Lys(CIZ)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH und Boc-Leu-OH an das Harz gebunden. Als Ergebnis wurden 6,36 g des hHCNP(4-8)NH&sub2;-Peptid-Harzes erhalten.
6,36 g dieses hHCNP(4-8)NH&sub2;-Peptid-Harzes wurden mit 10 ml Anisol, 1,6 ml Ethylmethylsulfid und 80 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff versetzt. Das Ge misch wurde 60 Minuten bei -20ºC und anschließend 70 Minuten bei 0ºC umgesetzt. Nach Einengen des Reaktionsgemisches im Vakuum wurden 100 ml Diethylether zum Rückstand zugefügt. Die Aufschlämmung wurde 30 Minuten gerührt, filtriert und mit 150 ml Diethylether und 150 ml Chloroform gewaschen. Der Rückstand wurde mit 100 ml einer 1 N wäßrigen Essigsäurelösung versetzt. Nach 30 Minuten Rühren wurde das Harz abfiltriert und mit 50 ml einer 1 N wäßrigen Essigsäurelösung gewaschen. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wodurch 1,98 g eines Rohpeptids erhalten wurden.
Das resultierende Rohpeptid wurde in 200 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf eine Reverse Phase YMC-R355-15/30 ODS-Säule ( 50 · 500 mm) aufgetragen, die vorher mit einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit einer wäßrigen 0,1% TFA-Lösung wurde das Peptid mit einem Gradienten von 0 bis 11% Acetonitril in 180 Minuten und sodann bis zu 30% Acetonitril in 360 Minuten mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 ml/Min. eluiert. Das Eluat wurde bei A220 nm überwacht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wodurch 0,715 g hHCNP(4-8)NH&sub2; erhalten wurden.
Das auf diese Weise erhaltene hHCNP(4-8)NH&sub2; wurde bei einer Retentionszeit von 18,8 Minuten mit einem linearen Dichtegradienten von 10 bis 25% wäßrigem Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, durch eine Reverse Phase YMC-AM303 (S- 5) ODS-Säule ( 4,6 · 250 mm) eluiert. Die Aminosäureanalyse des Peptids stimmte mit den errechneten Werten überein.

Aminosäureanalyse

Hydrolyse: 4 N Methansulfonsäure, 2% Tryptamin, 24 Stunden bei 110ºC
Analysenverfahren: PICO-TAG (Reverse Phase PTC-Aminosäure)-Verfahren
Ergebnis: Ser: 2,09 (2)
*Leu: 1,00 (1)
Trp: 0,52 (1)
Lys: 1,05 (1)
*Leu wurde als Standardaminsäure eingesetzt. Die Werte in Klammern geben die errechneten Werte an.

Beispiel 16

I) Konstruktion eines rekombinanten Vektors, der in E. coli exprimiert wird

Um das durch das Vorläufer-Gen codierte Protein zu exprimieren, welches das aus dem Ratten-Hippocarnus stammende und das vom Menschen stammende neurotrophe Peptid enthält, wurde das cDNA-Gen in den Expressionsvektor pKK233-2 (hergestellt von Clontech Co.) übertragen, der einen starken trc-Promotor enthält, hergeleitet vom fusionierten Promotor von trp-lac (Referenz 71, 72). Dieser Expressionsvektor besitzt die ATG-Sequenz, die ein Translations-Initiationscodon darstellt, in der einmaligen Ncol-Restriktionsenzymstelle (CCATGG) und weist außerdem stromaufwärts eine Ribosomenbindungsstelle der Prokaryoten auf. Der Expressionsvektor besitzt auch einen T1T2-Terminator, welcher ein starkes Transkriptions-Terminations-Signal der Prokaryoten darstellt. Die Übertragung der cDNA auf diesen Expressionsvektor und die Konstruktion des Expressionsvektors erfolgten durch die in Fig. 6 dargestellten Verfahren. Zuerst wurden die Clone AO10-12- und pl-3-cDNA mit EcoRI gespalten und die Termini mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I in glatte Enden überführt. Die Reaktion erfolgte, indem 100 ul 67 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6,7 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 1 mM von dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 0,5 ug DNA und 0,25 Einheiten des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I gemischt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert wurden. Nach einer Phenol-Chloroform-Behandlung wurde die Probe gereinigt und durch Ethanolfällung eingeengt.
Die cDNA wurde auf die DNA des Expressionsvektors pKK233-2 übertragen, in welche eine Smal-Stelle neu eingefügt worden war, wobei vorher eine Spaltung mit Ncol und eine Behandlung mit Mungobohnen-Nuclease zur Herstellung von glatten Enden erfolgte. Der Expressionsvektor wurde folgendermaßen konstruiert.
Die Reaktionslösung (50 ul), die die Zusammensetzung von 30 mM Natriumacetat (pH 4,6), 50 mM NaCl, 1 mM Zinkacetat, 5% Glycerin und 5 Einheiten/ul Mungobohnen-Nuclease aufwies und 1 ug pKK233-2-DNA enthielt, die vorher mit Ncol gespalten worden war, wurde 30 Minuten bei 37ºC gehalten, um glatte Enden bereitzustellen. Anschließend wurde ein am 5'-Ende phosphorylierter Smal-Linker (hergestellt von Toyobo Co.) zugefügt. Die Bedingungen für die Linker-Additionsreaktion sahen folgendermaßen aus. 100 ul Reaktionslösung (20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,7 mM MgCl&sub2;, 6,7 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 100 pMol Smal-Linker und 500 Einheiten T4-DNA-Ligase) wurden über Nacht bei 12ºC inkubiert und sodann die Reaktionslösung zehn Minuten bei 65ºC erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Danach wurde der wie vorstehend behandelte Expressionsvektor in E. coli JM109 transduziert, wodurch Transformanten erhalten wurden. Die Transformanten, welche die Expressionsvektor-DNA mit der neu eingefügten Smal-Stelle enthielten, wurden selektiert. Aus der gewünschten Transformante wurde die Plasmid-DNA gewonnen. Nach der Spaltung mit Smal folgte eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase von E. coli.
Die aus dem Ratten-Hippocampus und vom Menschen stammenden Vorläufer-Gene, die mit glatten Enden versehen worden waren, wurden in den Expres sionsvektor eingefügt, der wie vorstehend beschrieben behandelt worden war, wodurch ein rekombinanter Vektor erhalten wurde. Der rekombinante Vektor wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen konstruiert.
Die Reaktionslösung (10 ul), die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,7 mM MgCl&sub2; 6,7 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 0,1 ug Vektor-DNA, 0,5 ug cDNA und 5 Einheiten T4- DNA-Ligase enthielt, wurde über Nacht bei 12ºC inkubiert. Unter Verwendung von 4 ul der Reaktionslösung wurde die DNA auf kompetente E. coli JM109-Zellen (hergestellt von Toyobo Co.) transduziert. Der Expressionsvektor enthält das Ampicillin- Resistenz-Gen. Deshalb konnten die Transformanten erhalten werden, indem die kompetenten Zellen auf einem Agarmedium plattiert wurden, das 50 ug Ampicillin enthielt. Die erschienenen Clone wurden eins-zu-eins auf das Gitter eines Nitrocellulose-Membranfilters mit Gitternetz überimpft. Die Inkubation erfolgte über Nacht in einem mit Ampicillin versetzten Agarmedium, so daß wieder Kolonien entstanden. Die Plasmid-DNA wurde an das Filter fixiert, wie das bei dem in Beispiel 7 verwendeten Phagen-Absuchverfahren der Fall war. Unter Verwendung von R4-cDNA als Sonde wurden die gewünschten Clone (pKK233-2-A01012, pKK233-2-p13) durch Koloniehybridisierung erhalten (vgl. Fig. 6).

II) Konstruktion eines rekombinanten Vektors, der in einer gezüchteten Säuger- Zellinie exprimiert wird

Um das Vorläufer-Protein, welches das aus dem Ratten-Hippocampus und vom Menschen stammende neurotrophe Peptid enthält, in einer von einem Säuger stammenden Zellkultur zu exprimieren, wurden der Ratten-cDNA-Clon AO10-12 mit der in Beispiel 7 erhaltenen Nucleotidsequenz, die in Sequenz Nr. 2 dargestellt ist, und der menschliche cDNA-Clon pl-3 mit der in Sequenz Nr. 13 dargestellten Nucleotidsequenz, die in Beispiel 11 erhalten wurde, in einen Expressionsvektor zum Erhalt von E. coli-Transformanten eingebaut. Der verwendete Expressionsvektor wurde folgendermaßen konstruiert. Die Termini des 1,4 kb-großen HindIII- Fragments, das die von MMTV hergeleitete LTR-Sequenz aufwies und das in pMDSG enthalten war, wurden durch eine Modifizierung des im vorstehenden Abschnitt I) beschriebenene Verfahrens behandelt, so daß das Fragment an der Xbal- Spaltstelle von pBluescript II (hergestellt von Stratagene Co.) eingefügt werden konnte. Anschließend wurde das Bcll-EcoRI-Fragment (1 kb), das das Poly-(A)- Additions-Signal von SV40-T-Antigen enthielt, auf den vorstehenden rekombinanten Vektor in die Xho-Spaltstelle eingebaut. Ein BamHI-Fragment (2,6 kb), welches Neomycin-Resistenz-Gene von pMAM-neo enthielt (hergestellt von Clontech Co.), wurde an die BamHI-Stelle von pUC19 übertragen, wobei vorher ein Kpnl-Linker in die Smal-Stelle eingefügt worden war. Sodann wurde das Neomycin-Resistenz-Gen mit Kpnl ausgeschnitten und auf den rekombinanten Vektor, enthaltend einen Pro motor und eine Poly-(A)-Additions-Sequenz, an der Kpnl-Stelle eingeführt, wodurch ein Expressionsvektor hergestellt wurde (Fig. 7).
Die EcoRI-cDNA-Fragmente der Clone AO10-12 und pl-3 wurden in den auf diese Weise konstruierten Expressionsvektor an der EcoRI-Spaltstelle eingeführt und eine Koloniehybridisierung in ähnlicher Weise wie in Abschnitt I) durchgeführt, wobei R4-cDNA als Sonde eingesetzt wurde, wodurch die gewünschten Clone erhalten wurden.
Die auf diese Weise erhaltenen Clone wurden mit pMMTV-LTR-AO10-12 und pMMTV-LTR-p13 bezeichnet (Fig. 7).

Beispiel 17

Herstellung, Inkubation und Expression von Transformanten

I) Expression des Vorläufer-Proteins in E. coli

Die erhaltenen Transformanten, die einen rekombinanten Vektor enthielten wurden in 3 ml Flüssigmedium gezüchtet, das mit 2 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) angereichert war, bis sie die späte exponentielle Phase erreicht hatten. Sodann wurden die transformierten E. coli abzentrifugiert. Die E. coli-Zellen wurden in 60 ul eines SDS-enthaltenden Probenpuffers (50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 100 mM Dithiothreitol, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau (BPB), 10% Glycerin) suspendiert. Die Suspension wurde vier Minuten bei 100ºC erhitzt, um das Protein zu solubilisieren. Sodann wurden 20 ul, die einem Drittel der Probe entsprachen, einer 12% Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, enthaltend 1% SDS, unterworfen (Referenz 68). Anschließend wurden die Proteine auf eine Immobilon PVDF Transfer Membran (hergestellt von Millipore Co.) überführt (Referenz 68) und die gewünschten Proteine, die durch die Transformanten erzeugt wurden, welche die Ratten- und die menschlichen cDNA-Gene trugen, nachgewiesen, wobei eine Modifikation des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens zum Nachweis des Vorläufer- Proteins unter Einsatz des polyclonalen Antikörpers gegen das Ratten-HCNP verwendet Wurde (Referenz 70). Als Ergebnis wurden die Ratten- und Mensch- Vorläufer-Proteine nachgewiesen, dies bestätigte, daß der rekombinante Vektor die Expression bewirkte, wie zu erwarten war.

II) Expression des Vorläufer-Proteins in einer Säugerzellkultur

30 ug der rekombinanten DNA, die aus einer den rekombinanten Vektor enthaltenden E, coli-Transformante hergestellt wurde, wurden durch das DNA Transfection Kit (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) transfiziert. Hierfür wurden von fetalen Mäusefibroblasten stammende NIH/3T3-Zellen verwendet. Pro Schals mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 1 · 10&sup6; Zellen verteilt und die Gene durch eine DNA-Caliumphosphat-Co-Präziptiation transfiziert. Für die Transfektion der Gene wurde eine Modifikation der Verfahren eingesetzt, die von Phar macia Fine Chemicals empfohlen werden. Die Transformante, welche die Expression einer selektierbaren Neomycin-Resistenz zeigte, wurde erhalten, indem die Inkubation in 10% Rinderserum-enthaltendem DMEM-Medium fortgesetzt wurde, das mit 400 ug/ml Neomycin (Genteticin: G418) angereichert war. Die an einer der Platten haftenden Zellen wurden mit 0,25% Trypsinlösung abgelöst und erneut auf sieben Platten geimpft. Die Inkubation wurde weitere zwei Wochen fortgesetzt, wodurch Monoclone erhalten wurden. Jeder Monoclon wurde weiter gezüchtet und die chromosomale DNA aus den Neomycin-resistenten Zellen hergestellt.
Die erhaltene chromosomale DNA wurde mit EcoRI gespalten. Das Spaltprodukt wurde durch eine 0,7% Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert und einer Hybridisierung mit R4-cDNA als Sonde unterworfen (Referenz 10). Als Ergebnis wurde bestätigt, daß transformierte NIH/3T3-Zellen erhalten wurden, welche die gewünschten Ratten- und Mensch-Vorläufer-Proteine enthielten.
Die auf diese Weise erhaltenen Transformanten wurden drei Tage in einem Medium gezüchtet, das mit 1 uM Glukocorticoid (Dexamethason) angereichert war, um die Transkription von dem in der LTR-Sequenz in MMTV vorliegenden Promotor aus zu fördern. Anschließend wurden die Zellen gewonnen und daraufhin untersucht, ob die Vorläufer-Proteine exprimiert wurden. Wie im vorstehenden Abschnitt I) beschrieben, wurden die Proteine in den Transformanten solubilisiert und einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen; die Proteine wurden durch Western-Blotting an ein Immobilon PVDF-Filter adsorbiert und die gewünschten Proteine durch einen polyclonalen Antikörper gegen das Ratten-HCNP nachgewiesen.
Als Ergebnis wurden die gewünschten Ratten- und Mensch-Vorläufer-Proteine aus den von Säugerzellkulturen stammenden Transformanten nachgewiesen, dies zeigt, daß der Expressionsvektor normal funktionierte.

Referenzen

1) Japanische Patentanmeldung KOKAI (offengelegt) Nr. 3-72499;
2) EP-A-0390602;
3) Angeletti und Bradshow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68 (1971), 2417;
4) J. Leiblock et al., Nature 341 (1989), 149;
5) F. Collins et al., Science 246 (1989), 1023;
6) A. Hohn et al., Nature 344 (1990), 339;
7) P. C. Maisonpierre et al., Science 247 (1990), 1446;
8) Y. Kaisho et al., FEBS Letters 266 (1990), 187;
9) F. Schoentgen et al., Eur. J. Biochem. 166 (1987), 333;
10) J. Sambrook et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Lab., New York, 1989;
11) J. Favaloro et al., Methods in Enzymol. 65 (1980), 718;
12) V. Glisin et al., Biochem. 13 (1974), 2633;
13) A. Ullrich et al., Science 196 (1977), 1313;
14) M. Edmonds et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68 (1971), 1336;
15) H. Aviv und P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 1408;
16) R. F. Schleif und P. C. Wensink, "Practical Methods in Molecular Biology", Springer-Verlag, New York, 1981;
17) J. B. Gurdon et al., Nature 233 (1972), 177;
18) J. B. Gurdon, "The Control of Gene Expression in Animal Development", Oxford University Press, 1974;
19) U. Gubler und B. J. Hoffman, Gene 25 (1983), 263;
20) C. Schneider et al., Nature 311 (1984), 675;
21) H. Heymerle et al., Nucl. Acid. Res. 14 (1986), 8615;
22) S. Koike et al., Nucl. Acid. Res. 15 (1987), 2499;
23) T. V. Huynh et al., "DNA Cloning - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1985;
24) G. Schere et al., Devel. Biol. 86 (1981), 438;
25) R. A. Young und R. W. Davis, Science 222 (1983), 778;
26) R. A. Young und R. W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 1194;
27) K. Itakura et al., Science 198 (1977), 1056;
28) J. H. Miller und W. S. Peznikoff, "The Operon", Cold Spring Horbor Lab., New York, 1978;
29) D. W. Mount, Ann. Rev. Genet. 14 (1980), 279;
30) A. Efstratiadis und L. Villa-Komaroff, "Genetic Engineering", Plenum Press, New York, 1979;
31) C. Chen und H. Okayama, Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 2745;
32) D. Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983), 557;
33) D: Hanahan, "DNA Cloning - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1985;
34) J. L. Guesden et al., J. Histochem. Cytochem. 27 (1979), 1131;
35) C. Bonnard et al., "Immunolabelling for Electon Microscopy", Elseiver Scientific Publishers, Amsterdam, 1984;
36) J. J. Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 4045;
37) D. M. Helfman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 31;
38) M. S. Blake et al., Anal. Biochem. 136 (1984), 176;
39) F. Boliver et al., Gene 2 (1977), 95;
40) D. V. Goeddel et al., Nature 281 (1979), 544;
41) D. V. Goeddel et al., Nucl. Acid. Res. 8 (1980), 4057;
42) D. V. Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 106;
43) D. V. Goeddel et al., Nature 287 (1980), 411;
44) J. Yochem und B. Byers, J. Mol. Biol. 195 (1987), 233;
45) M. Karin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 337;
46) R. A. Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 2073;
47) V. M. Williamson et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 20;
48) M. J. Holland et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 1385;
49) N. J. Ptoudfoot und C. G. Brownlee, Nature 263 (1976), 211;
50) R. G. Hawley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2406;
51) G. Brady et al., The EMBO J. 4 (1985), 2583;
52) F. Lee et al., Nature 294 (1981), 228;
53) G. Ringold et al., J. Mol. Applied Genet. 1 (1981), 165;
54) M. Wigler et al., Cell 14 (1978), 725;
55) C. M. Corsano und M. L. Pearson, Somat. Cell Genet. 7 (1981), 603;
56) F. L. Graham und A. J. von der Eb, Virology 52 (1973), 456;
57) M. Rassoulzadegon, Nature 295 (1982), 257;
58) H. Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7161;
59) G. Chu et al., Nucl. Acid. Res. 15 (1987), 1311;
60) K. Thomas, "Transgenic Animals", Butterworth-Heinemann Co., 1991, Kapitel 4, S. 45-54;
61) M. Bodansky und M. A. Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966;
62) F. M. Finn und K. Hofmann, "The Proteins", Bd. 2, American Press Inc., New York, 1976;
63) N. Izumiya et al., "Peptide Synthesis", Maruzen Co., Ltd., 1975;
64) N. Izumiya et al., "Basis and Experiment of Peptide Synthesis", Maruzen Co., Ltd., 1985;
65) H. Yajima, "Lecture Series an Biochemical Experiment: Chemistry of Protein IV" Hrsg. Japanese Biochemical Association, 1977;
66) K. Ojika et al., "Drug, Spirit, Action" 7 (1985), 447;
67) K. Ogawa et al., "Technology of Histrocytology: Hormone and Neurotransmittant Substance", Asakura Shoten Publishing Co., 1986;
68) U. K. Laemmli, Nature 227 (1970), 680;
69) T. Manabe et al., Anal. Biochem. 143 (1984), 39;
70) I. Sakurabayashi et al., "Gene, Protein: Experimental Manual, Blotting", Soft Science Co., 1987;
71) E. Amann und J. Broslus, Gene 40 (1985), 183;
72) D. Straus und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 2914.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZ NR: 1
LÄNGE DER SEQUENZ: 33
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: cDNA zu mRNA
HYPOTHETISCHE SEQUENZ: nein
ANTISENSE: nein
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
UNMITTELBARE HERKUNFT:
Name des Clons: AO10-12
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: CDS
Lage: 1..33
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
GCCGCCGACA TCAGCCAGTG GGCCGGGCCG CTG
SEQUENZ NR: 2
LÄNGE DER SEQUENZ: 1047
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: cDNA zu mRNA
HYPOTHETISCHE SEQUENZ: nein
ANTISENSE: nein
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
UNMITTELBARE HERKUNFT:
Name des Clons: AO10-12
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: CDS
Lage: 1..1047
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: 5'-UTR
Lage: 1..25
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 26..586
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: 3'-UTR
Lage: 587..1047
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Poly-A-Signal
Lage: 987..992
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: S
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Poly-A-Stelle
Lage: 1008..1047
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: S
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 3
LÄNGE DER SEQUENZ: 186
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..186
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 4
LÄNGE DER SEQUENZ: 38
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: N-terminales Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..38
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 5
LÄNGE DER SEQUENZ: 23
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..23
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 6
LÄNGE DER SEQUENZ: 15
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..15
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 7
LÄNGE DER SEQUENZ: 13
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..13
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 8
LÄNGE DER SEQUENZ: 20
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..20
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 9
LÄNGE DER SEQUENZ: 28
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..28
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 10
LÄNGE DER SEQUENZ: 6
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..6
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 11
LÄNGE DER SEQUENZ: 22
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..22
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 12
LÄNGE DER SEQUENZ: 8
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..8
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 13
LÄNGE DER SEQUENZ: 1447
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: cDNA zu mRNA
HYPOTHETISCHE SEQUENZ: nein
ANTISENSE: nein
HERKUNFT:
Art: Mensch (Homo sapiens)
Art des Gewebes: Plazenta-Gewebe
UNMITTELBARE HERKUNFT:
Name des Clons: pl-3
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: CDS
Lage: 1..1447
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: 5'-UTR
Lage: 1..119
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 120..680
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: 3'-UTR
Lage: 681..1447
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 14
LÄNGE DER SEQUENZ: 186
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
HERKUNFT:
Art: Mensch (Homo sapiens)
Art des Gewebes: Plazenta-Gewebe
ERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..186
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 15
LÄNGE DER SEQUENZ: 11
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
HERKUNFT:
Art: Mensch (Homo sapiens)
Art des Gewebes: Plazenta-Gewebe
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Lage: 1..11
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: P
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 16
LÄNGE DER SEQUENZ: 33
ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: cDNA zu mRNA
HYPOTHETISCHE SEQUENZ: nein
ANTISENSE: nein
HERKUNFT:
Art: Mensch (Homo sapiens)
Art des Gewebes:. Plazenta-Gewebe
UNMITTELBARE HERKUNFT:
Name des Clons: pl-3
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: CDS
Lage: 1..33
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
CCGGTGGACC TCAGCAAGTG GTCCGGGCCC TTG
SEQUENZ NR: 17
LÄNGE DER SEQUENZ: 11
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
HERKUNFT:
Art: Ratte (Rattus norvegicus)
Stamm: Wistar
Art des Gewebes: Hippocampus-Gewebe des Gehirns
MERKMALE DER SEQUENZ:
Charakteristische Bezeichnung: Peptid
Verfahren zur Bestimmung der Merkmale: E
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 18
LÄNGE DER SEQUENZ: 6
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
SEQUENZ:
SEQUENZ NR: 19
LÄNGE DER SEQUENZ: 6
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
SEQUENZART: Peptid
SEQUENZ:

Claims

1. Gen, das ein neurotrophes Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 15) codiert:

Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu

2. Gen, das ein Polypeptdid mit der folgenden Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 14) codiert:

3. Neurotrophes Peptid mit der Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 15).

4. Vorläufer-Polypeptid des neurotrophen Peptids mit der Aminosäuresequenz Nr. 14.

5. Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert ist, der ein Gen nach Anspruch 1 enthält.

6. Arzneimittel für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, umfassend als Wirkstoff ein neurotrophes Peptid nach Anspruch 3 zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder einem Träger dafür.

7. Gen nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung in einem chirurgischen, therapeutischen oder diagnostischen Verfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wird.

8. Verwendung eines Gens nach einem der Ansprüche 1 oder 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Demenz.

9. Peptid nach Anspruch 3 oder 4 zur Verwendung in einem chirurgischen, therapeutischen oder diagnostischen Verfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wird.

10. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 3 oder 4 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Demenz.