JPS6163699A - ヒト形質転換発育因子 - Google Patents
ヒト形質転換発育因子Info
- Publication number
- JPS6163699A JPS6163699A JP60031380A JP3138085A JPS6163699A JP S6163699 A JPS6163699 A JP S6163699A JP 60031380 A JP60031380 A JP 60031380A JP 3138085 A JP3138085 A JP 3138085A JP S6163699 A JPS6163699 A JP S6163699A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tgf
- item
- fragment
- protein
- species
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野
本発明はヒト組織中に見出されるもの４二対・応する、
ヒト形質転換発育因子−α前駆物質およびそのフラグメ
ント、特に成熟−ヒト形質転換発育因子α（’１’ Ｃ
Ｆ−α）１．１１びにその新規な製剤ね１０組成物、さ
らには、それらを治療および／または診断用に均一な状
態で大量に生産する方法に関する。 本発明は、望ましくないタンパク質を含んだ天然の物質
を、極く少量しか得ることができなかった従来の方法、
即ち、既存の細胞培養中で生産し、抽出する単離法と比
較して、高純度の物質を大量に生産することのできる方
法を堤供するものである。 本明細盲中で言及した文献およびその他の物質は詳細な
説明中に参照例として挿入し、更に、便宜上、記載順に
番号を付し、それぞれ文献目録中にまとめて示した。 発明の技術的背景 Ｆ３’ｌｔ転換発育因子類（ＴＧＦＩｌｌｍ）は、正常
細胞における表現型の（フエノティピカルな）形質転換
を可逆的な方法で支配する因子である。ＴＧＦを投与す
ると、正常細胞のコントロールされていない増殖が刺激
され、また軟寒天中の形質転換細胞の形成状態を測定し
た結果、アンカレッジ・インディベンダンス（ａｎｃｈ
ｏｒａｇｅ １ｌＩｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）が増加する
ことが示された（ｌ−３）。２種類のＴＧＦが識別され
た。ＴＧＦ−αは広範なヒトまたはゲブ歯類起源のＵ瘍
細胞から分泌される（４−７）。ＴＧＦ−αおよび表皮
性発育因子（ＥＧＦ）は同じ受容体を競合しく５．８．
９）、この受容体は、ＴＧＦ−αまたはＥＧＦの結合後
、チロシン残基の位置でリン酸分解される（１０−１１
）。ＴＧＦ−αに特異的−他の受容体の存在を提示する
幾つかの証拠があろ（１２）。ＴＧＦ−αによるアンカ
レッジ・インディベンダンスな増殖はＴＧＦ−βによっ
て著しく補強される（１３．１４）。この後行のＴＧＦ
は多くの正常細胞および腫瘍細胞中に検出されており（
１３〜＋７）、しん腎臓（Ｉ８）、胎盤（Ｉ９）および
血小板（２０）から精製されている。ＴＧＦ−βはＥＧ
Ｆ受容体と結合しないとされており、まｆ二、自身の形
質転換活性またはＮＲＫ細胞活性のｆこめにＥＧＦま几
はＴＧＦ−αを必要とする、と信しられている。 ＴＧＦＩの生物学的な役割は未だ明瞭に解明されていな
い。多くの研究がＴＧＰＩ［が形質転換１こおいて重要
な役割を果たしていることを示唆している。レトロウィ
ルス（２１〜２４）、Ｓ Ｖ ４０ Ｃ２５）またはポ
リオーマウィルス（２６）における細胞形質転換におい
てＴＧＦ−αが分泌されていることが示された。細胞形
質転換におけろＴＧＦ分泌の密接な係り合いはポリオー
マウィルスＤＮＡのトランスフェクション実験で示され
た。即ち、ミドルＴ抗原についてのＤＮＡセグメントの
導入が、形質転換された表現型、およびＴＧＦ分泌の両
番を誘導するのに必要かつ十分な条件であることが示さ
れた（２６）。Ｋ １ｒｓｔｅｎのネズミ肉腫ウィルス
の熱感受性突然変異体を用いた形質転換に関する研究に
おいてら、表現型の形質転換が許容温度で起こった場合
にのみＴＧＦ−αが分泌されることが指示された（２１
）。加えて、最近の研究によると、クローンされたＴ２
４膀胱がん遺伝子の導入でＴＧＦの生産が誘導されるこ
とが示されている（２７）。腫瘍の進行との生物学的な
関連性は、健常人χ・ｉ照との比較にｊｊいて、１１・
［！患との尿中に）ヱＴＧＦ−αの活性てあろ、と同定
される活性が削性することによって６暗示されている（
２８〜３０）。しかしながら、採用された分析法ではＥ
ＧＦの如き池の発育因子の活性を区別し得なかっｆ二か
らしれない。これら、またはその他の観察の結果は、Ｔ
ＧＦ αが自己分泌（ａｕｔｏｓｅｃｒｉｎｅ）機構を
介して腫瘍形成に関与し、そのことによってＴＧＦｆｆ
ｉが形質転換細胞から分泌され、そして同様の細胞集団
においてこれらの形質転換された特性を維持し、刺激す
る、ということを示唆している（３１〜３２）。しかし
ながら、腫瘍細胞がＴＧＦαとβの両者を分泌するとい
うことから示唆される様に、ＴＧＦ−βの増強作用か必
要からしれない（１４）。この様に、ＴＧＦ−αは腫瘍
の形成期間における極めて強力なエフェクター分子であ
り得る。 ＴＧＦ−αのヘテロローガスな（異種の）分子種は、腫
瘍細胞からの抽出物および上澄み（５，１２゜２２．３
３〜３４）並びに尿中（２８〜３０）のらのについて報
告されζいる。約７キしＩクルトノＵノ小さいものか、
ゲ、ｌ歯類（２７，３５）およびヒト（２４゜３５）の
両細胞供給源に関して精製されｆこ。このラットおよび
マウスのＴ Ｇ Ｆ−αについてのアミノ酸配列決定に
よって、これはＥＧＦと幾分かのホモロノー（ｈｏｍｏ
ｌｏｇｙ）を示すことかねかっｊ二（２７゜３５）。報
告されたヒトＴＧＦ−αの部分的なポリペプチド配列は
、ラットおよびネズミ種のそれと強いホモロノー関係に
あることを示している（３５）。 転移性の腎細胞腫患者では進行性の骨の脱仄か起こり、
それが体液性の高カルシウム血症に反映されていること
か観察された（３６）。不純なタンパク質製剤を用いて
行なわれた最近の研究によると、形質転換発育因子（Ｔ
ＱＦ−αを含む）は組織培養系で骨吸収を若起すること
が示唆された（３７）。 ウィルスによる細胞の形質転換では、ＴＧＦ〜αは上記
の治療または診断用薬として用いるには非実用的な、限
られた量しか生産されない。 組換えＤＮＡ技術 ヘテロローガスなタンパク質、即ち、ある細胞か１１゛
常状態ては産生しないタンパク質、は、外来性ＤＮＡに
よって形質転換された細胞によって生成される。これは
通常、外来性ＤＮＡをベクターの形で細胞内に導入する
ことによって達成される。 ベクターの構成要素、即ち、複製起源、１またはそれ以
上の表現型の選択特性、発現プロモーター、ヘテロロー
ガスな遺伝子挿入物およびベクターの残余部分、に関す
るＤＮＡ組換え操作は通常、宿１ミ細胞の外部で行なわ
れる。得られた複製可能な組みえ発現ビヒクル、または
プラスミド、を形質転換によって細胞に導入し、該形質
転換体を増殖さＵ゛て、大量の組換えビヒクルを得るこ
とかできる。遺伝子を、それが暗号化しているＤＮＡメ
ッセーノの転写および翻訳を支配する部分に関して適切
に挿入することによって得られた発現ビヒクルは、挿入
した遺伝子か暗号化しているポリペプチド配列を実際に
生産するのに、また、発現の工程にとって、ａ用でｄ５
ろ。生産物は宿主細胞を溶解して該細胞内から得るか、
または分泌型生産物の場合には培地から得、しかる後適
当な精製法により不純物中から回収゛４′ることがてき
ろ。 魚吸Δ髪性 本発明は、組換えＤＮＡ技術を使用することにより、商
業化にとって必要な作業である動物実験および臨床実験
を開始し、行うのに充分な量の形質転換発育因子−α（
ＴＧＦ−α）前駆体を得ることに成功したという発見に
基づいている。Ｔ Ｇ Ｆ’ −α前駆体およびそのフ
ラグメント（特に成熟ＴＧＦ−αを乙含む）（所望によ
りヒト形質転換発育因子−βを併用する）は、例えばヒ
トにおけろ骨疾徹の治療および損傷の治癒の促進にｆイ
用である。加えて、Ｔ Ｇ Ｆ−αは細胞培養の補助剤
として乙用いることかでき、その様にして培地中の自涜
の必要量を減少しくその結果、精製か何）りとなる）、
細胞培養内での細胞の増殖を刺激し、増大させることか
できる。また、ＴＧＦ−α前駆体およびそのフラグメン
トの大組生産により、新生物その他の疾ｊ、ｌを診断す
るための、体液中のＴＧＦ−α前駆体およびそのフラグ
メントの分計用試薬の製造か可能となる。 ′ｒ Ｇ Ｆ ｎ ＋ｉｉｉ駆体の完全なヌケレオチ
ドおよび対応するアミノ酸配列を第３図に示す。該前駆
体す）様々な主領域を同定するために、便宜上、３個の
ポリペプチド、即ち、成熟ＴＧＦ−α（第３図において
、残基４０から８９までの、枠で囲んだ部分）、残基９
０〜１６０（主要部はＣ１ｎ９１１からＶａ１１６０ま
での６２残基からなるポリペプチド）のＴＧＦ−α末端
ポリペプチドであって、本明細書中てはＴＧＦ−αＣと
弥するもの、並びにＭｅ目ＤりらＡｌａ２２までのＴＧ
Ｆ−αＮ末端ポリペプチド（ＴＧＦ−αＮ）、を定めた
。従って、ＴＧＦ−α１ト１駆体は成熟ＴＧＦ−αを含
むＴＧＦ−α担持ポリペプチドであり、ＴＧ’Ｆ−αと
その正常な非翻訳間ｐＨとの融合によって得られるしの
である。更に、便宜上、本明細書中ではＴＧＦ〜α而駆
体お面びそのフラグメント（成熟ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−
αＣおよびＴＧＦ−αＮを含む）を総括的にＰＲＴＧＦ
−α種（ｓｐｅｃ １ｅｓ）と呼称ｆる。ＴＧＦ−ａと
言うときは成熟ＴＧＦ−αを意味することとする。また
、特に明記しない限り、ＰＲＴＧＦ−α種という語句は
、以１・に、より詳１．＜述へる様に、アミノ酸配列の
突然変異体の様なＰＲＴＧＦ−α種誘導体をも包含する
ものとする。本発明に包含される他のＰＲＴＧＦ−α種
フラグメントはＴＧＦ＝αＣと成熟’ｒ Ｇ Ｆ−αか
ら成るらのである。このポリペプチド（ＴＧＦ−ａｍｃ
と呼称）は、残Ｍ２０〜＋６０の間であって、ＴＧＦ−
αＮ配列は信号としてのみ機能し、内質細網での処理の
間にＴＣＰ−ａｍｃから切離されると思われるので、該
ＴＧＦ−αｍＣは吐乳類細胞内でのＴ Ｇ Ｆ−α前駆
体の発現の初期生産物であると信じられいてる。細胞内
での処理には幾分、変異があるので、これらの主領域は
インビボにおいては、アミノまたはカルボキノ末端と表
現される正確な状態では見出すことができないで李ろう
。 ＰＲＴＧＦ−αフラグメントは通常、（ａ）一般にＰ
ＲＴ Ｇ Ｆ−αと共に何らかの生物学的活性、例えば
抗体交差反応またはアンカレッジ・インディペンダンス
の誘導、を表し、（ｂ）ＰＲＴＧＦ、αと実質的に相同
（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）な領域を存し、そして、（Ｃ）少
なくと６５個、通常は１０〜１３０個のアミノ酸残基の
長さを有する。 本発明は、これまで同定されていなかった、ＴＧＦ−α
Ｎおよび１’ＣＦ−αＣの如きＰＲＴＧＦ−αのポリペ
プチドフラグメノトを分析する方法を提供する乙のであ
り、更に詳しくはこれらの配列の部分を包囲または包含
している他のペプチドの妨害を受けることなく分析を行
う方法を提供するしのでめろ。 本発明により、ＰＲＴ’ＧＦ−α種のアミノ酸配タリを
知ることかできたので、予め決定されたＰＲＴ Ｇ Ｆ
−α唾のアミノ配列に対する抗体を生産さけろことか初
めて可能となったのである。ＰＲＴＧＦ−α種フラグメ
ント（ＴＧＦ−αを除く）を示すアミノ酸配列はタンパ
ク質と免役学的な共役関係で結合し、従って動物に免疫
を付与するのに用いられろ。その様な抗体はｒ’ｎＴＧ
Ｆ−α種に特異的なイムノアッセイや受身免疫療法にお
いて有用でるる。 また本発明は実質上純粋なＰｌで１’ＧＰ−α種であっ
て、１ｆｆｉ常、非組換え細胞雰囲気トては０１（ｊＬ
。 ている不純物等を含まないＰＲＴＧＦ−α種を提供する
ものである。その様な不純物は天然に、正常な状態でＴ
ＧＦ−α七−緒に見出される物質、例えば、細胞内では
細胞滲出物や体液、さらにヒト血清アルブミン、ガンマ
グロブリノ、リポタンパク質、並びに表皮性発育因子（
ＥＧＦ）を含む発育因子等である。ＰＩｔＴＧＦ−αＦ
ＩｉＤＮＡの供給椋から得られる他のタンパク質ら本明
細書中に示すＰＲＴＧＦ−α種の組成物中に存在し得る
ものであり、それらは、例えばＴＧＦ−βおよび血小板
誘導性の発育因子（Ｐ Ｄ Ｇ Ｆ ）であるか、ここ
では、これらは予め定めた量、存在することになろう。 例えば、非ヒト細胞内での組換え細胞培養により、１出
のヒトタンパク質を全く含まないＴＧＦαを牛ｉｒする
ことができるからである。 本発明はまた、Ｐ Ｉｔ １” Ｇ Ｆ ａ性を暗号
化したＤＮＡを発現可能なして有する組換Ｄ Ｎ Ａ発
現ヒヒクル、その槌なりＮＡで形質転換した微生物の株
または細胞倍径、・■びにそれら形質転換された菌株よ
ｌ−は培貢物であ−で１月じｌ’ Ｇ ｌ”−α種を生
産することができろ微生物または細胞培養、を鴇供する
ことを目的とするしのである。さらにまた本発明は、組
換え発酵法により、該微生物および！ｌＩ胞培毘内でＰ
ＲＴＧＦ・α種を製造する方法を提（共することを目的
とする乙のである。 本発明に係るＤＮＡはＰＲＴＧＦ−α種を暗号化してお
り、組換えられた、または形質転換された培養物中で発
現することにより、ＰｒｔＴＧＦ−α種を大量に与える
。Ｐ Ｒ’ｒ Ｇ ｆ’ ａ種合成細胞からの５ＲＮ
Ａの逆転写によって得られるｃＤＮＡはイントロン（介
在配列）を含まず、また、このＤＮＡの供給源にとって
ホモローガスな他のタンパク質を暗号化している如何な
る非翻訳領域をも含んでいないので、上記のＤＮＡは新
規なものといえろ。 ＰＲＴＧＦ−α種を暗号化している染色体ＩＴ）ＮＡは
、ゲノムＤＮＡライブラリーを、ＰＲＴＧＦ−α種を暗
号化しているｃＤＮＡでプローブすることにより得られ
るヵ染色体ＤＮＡは、それ自身の通常な染色体雰囲気を
１杓ない状聾で得られろ。 従って、それは、ヒトＴＧＦ−α前駆体のゲノム暗ぢ配
クリには６個の明瞭なエクソンか含まれている故に、最
初のエクソンの５゛末端より上流の非翻訳領域、あるい
はゲノムＤＮＡの供給源にホモローガスな別のタンパク
質を暗号化している最後のエクソンの３°末端から下流
の非翻訳領域を含まないがイントロンは含むことになる
。その様なりＮＡは本明細書中で述べる様に、哺乳類の
細胞を形質転換し、ＰＲＴＧＦ−αを生産するのに有用
である。 単離したＰＲＴＧＰ−α種のＤＮＡはヌクレオチドの置
換、欠失または挿入（ヌクレオチドの置換の場合には暗
号化されたアミノ酸配列を変化しないことを要すン４こ
よって容易１こ修飾され、その結果、ＰＲＴＧＦ−αを
暗号化している新規なりＮ、Ａ配列または、その配列上
の突然変異体を得ることができる。アミノ酸配列を変え
ずに修飾を施されたＤＮＡ配列は、選択した宿主−ベク
ター系でのＰＲＴＧＦ−ｇ発現を高めるのにａ用である
（ｆｐ４入ば′ヒト コドンをｆｔ′ｔＲの宿主細６〕
ことって好ましル＾コドンに突黙変ｉｌさせた場合）。 これらの新規なりＮＡ配列またはその７ラグメントをラ
ベル（標識化）Ｌ、ＰＲＴＧＰ−α種を暗号化している
遺伝物１ｔ（Ｄ Ｎ Ａまたは＊ＲＮＡ）のへイブリダ
イゼーシプン（雑種分子形成）分析に用いろ。 ＰＲＴＧＦ−ｔｔＭ（ＤＩＪ１ｔｉ方法ハ、ＰｒｔＴＧ
Ｆ４種を暗号化しているＤＮＡをＦＭ製可能（再生産可
能）なベクターにライゲート（結合）し、このベクター
を用いて宿主細ｌａを形質転換し、この宿主細胞を培養
して該培養からＰＲＴＧＦ−αを回収する工程からなる
。この様にして製造することのできるＰＲＴＧＦ’−α
種には、ＴＧＦ−α前駆体およびそのフラグメント（’
ｌ’Ｇｌ？−αＣおよびＴＧＦ−α等）、並びにその誘
導体、これには以下の各物質が含まれろ：（ａ）Ｐ Ｒ
Ｔ Ｇ Ｆ −α種（成熟Ｔ Ｇ Ｉ” ・αを含む）
か、ヘテロローガスなタンパク質またはポリペプチドと
、ＴＧＦ−αのアミノおよび／またはカルボキン末端の
アミノ酸の位置で、ペプチド結合を介して結合してなる
、−合タンパク質、（ｂ） Ｉまたは１以上のアミノｓ
＠ｇの挿入または置換によるＰＲＴＧＦ−α種の突然変
異体および（Ｃ）上記の融合物質、フラグメント類また
は突然変異体等の、メチオニルまたは修飾したメチオニ
ル（ホルミルメチオニルまたはその他の保護メチオニル
）のアミノ末端付加誘導体、が含まれろ。 ヘテロローガスな分泌型リーダー配４１（通常、所望の
宿主微生物にホモローガスなタンパク質から得られる信
号）と機能的に結合している、ＰＲＴＧＦ−α種を暗号
化したＤＮＡを含むベクター類を宿主細胞の形質転換に
用いる。得られたＰＲＴＧＦ−α種融合物で宿主細胞を
処理することによって、アミノ−末端メチオニルまたは
保護メチオニルを含まないＰＲＴＧＦ一種が分泌される
。 アミノ酸配列以外の変異に係るＰｒｔＴＧＰ−α誘導体
ら本発明の範囲に含まれる。その様な誘導体は化学的な
成分との共有または凝集的な会合によって生成されてい
ることが特徴である。この誘導体は通常３クラスに分け
られる。塩類、側鎖ま１＝１未喘’Ａに対・するＪ（イ
１結合的な修飾産物、並びに吸着によるコノブレックス
である。 ｒ’ ＲＴ Ｇ Ｆ−α種か直接、組換え原核生物の培
養物中に蓄積された後（原核生物の信号配列との融合物
以外の形で）、それらを、水不溶性の屈折性の物体とし
ての物理的な形状または、変性に対するかなりの安定性
、のいずれかに基づいて池のタンパク質から分離する。 通常、原核生物培養物から不溶性の物質を回収し、この
不溶性の細胞汚物から屈折性の物体（ＰＲＴＧＦ−α種
を含む）を分離し、次いでこの屈折性物体を可溶化する
。タンパク質の適切なホールディング（再屈折）を増大
させるために、上記の段階の後にグルクチオン処理を適
宜、行ってらよい。組換え真核生物細胞からのＰＲＴＧ
Ｆ−α種は水溶性であるため再溶解を要しない、この場
合は、従来天然起源からＰＲＴＧＦ−α種を単離するの
に用いられていた常法に従って精製する。 組換え細胞の培養物から精製したＰＲＴＧＦ−α種を治
療に使用するために、生理学的に無毒な安定剤および賦
形剤と合わせ、凍結乾燥し−ζ坊ヒノに入れた投与剤形
にＪＡＩ製するか、または好ましくは水性製剤中に貯え
る。後とのことは、ＰＲＴＧＦ−α種が分子中に優勢な
ジサルファイド結合を有しているために熱変性に対して
極めて安定である故に可能となる。別法として、ＰＲＴ
ＧＦ−α種をポリマーマトリックス中に組込んで、埴込
み投与するか、外科的部位の上に取り付け（例えば包帯
中）、そのことによってＰＲ′ｒＧＦ ａ任か局所的に
高い濃度勾配で好期に放出される様にすることかできる
。 ＰＲＴＧＦ−α種−含有組成物は、動物、特に組織の増
殖の促進を必要とする＠青、に治療ａ効量を投与される
。適当な用量は治療に係る技術者にとって自明であろう
。 図面の説明 第１図はヒトＴＧＦ−α前駆体に関するＤＮＡ配列を検
出するためのハイブリダイゼーノジンプローブとして用
いられるオリゴヌクレオチドの配列式を示す模式図であ
る。 第２図はヒトｌ″ＣＦ−αの最初の３３個のアミノ酸を
暗号化しているエクソンを含む、プラスミドｐ′ｒＧＩ
”α１５−１ＣＩ′）１８０ｂｐｓａｕ３Ａフラグメン
トのヌクレオチド配列を示す模式図である。 推定のアミノ酸配列も示されている。大文字で示しに配
列はＴＧＦ−αボリベプヂドの部分であり、小文字でタ
イプしたらのは１１１１駆体中の前記ＴＧＦ−αのアミ
ノ酸配列を示している。矢印はｃＤＮＡ配刈と０比較で
決定した介在配列の受容および供与部位であることを示
している。幾つかの過当な制限部位か指摘されている。 第３図はプラスミドｐＴＣｉＦ Ｃ１中に含まれている
ＣＤＮＡのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列
を示す模式図である。ｃＤＮＡの両側はＧ−ＣテールＱ
ａｉｌ）と接している。ライン上の数字は、単一のメチ
オニンがＮＨ２−末端を構成すると推定した場合のアミ
ノ酸の位置を示している。 ＴＧＦ−αのアミノ酸配列は枠内に囲まれており、その
両側は、Ａｌａ−Ｖａｌに富む配列（オーバーラインで
示した残基）と結合している。幾つかの適切な制限部位
が指摘されている。 第４図はプラスミドｐＴＥ１．２．３．４，５．６゜７
．８の組立て経路を表した模式図である。 第５図はＴＧＦ−α発現プラスミド、ｐＴＥ５およびｐ
ＴＥ６を表す模式図であって、ＴａＦ−α融合タンパク
質のアミノ酸の連結部をも示している。 第６図は発現プラスミドｐＴＥ２、ｐＴＥ３、ｐＴＥ５
またはｐＴＥ６を含む、Ｅ、ｃｏｌｉの全細胞溶解物の
５ＤＳ−１３％ポリアクリルアミドゲル（７９）による
電気泳動の結果を示す状態図である。 矢印はＴＧＦ α融合タンパク質を示す。右側の値はタ
ンパク質マーカーの位置を表す。 第７図は酸−エタノールー法で豊富にした細菌性の短い
ＴＧＦ−α融合タンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上の状態図である。このゲル内で、６８残基のＴ
ＧＦ−α融合タンパク質は幅の広いバンド（矢印）とし
て移動した。右側の値は参考用のタンパク質マーカーの
位置を示している。 第８図はラノオリセプターアッセイにおける細菌ＰＩＴ
Ｇ Ｆ ｔχの短い融合タンパン質と１Ｉ５１−ラヘ
ルＩ＞ ＣＦとの競合状聾を１１−４−グラフであり（
実線）、文献記載（５，１４，２７）の方法に従って行
い、図式的に表しＬものである。ＥＧＦで得られｆコ倹
量線は岐線で示されている。第８Ｂ図はＥＧＦ倹黴線を
示す。縦軸は１１５ （ラヘルＥＧＦと細胞との結合を
示している。 第９図はネズミＥＧＦ、および臭化シアンによる開裂の
＋ｉｉＬ ｉＵにおける細菌性１’ Ｇ Ｆ α融合タ
ンパン質の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフて（’
５る。この分析実験はヒトＴＧＦ−βの存在下、ＮＨＫ
細胞、クローン４９Ｆを用いて文献記載の方法（１４）
に従って行なわれた。縦軸は８５０μｍ２以上のコロニ
ーの数を、横軸はＥＧＦまたは細菌性Ｔ Ｇ Ｆ−αの
濃度であって、ＥＧＦ内で求めた如く、ＥＧＦ当１ｋ（
ｎｙ／ａジ）として、それぞれ表されており、実線は臭
化シアンで処理する前（白丸）または後（黒丸）の細菌
性ＴＧＦ−α融合タン融合タンパ重質結果を示している
。 第１０図はＴＧＦ−αの酵母内での発現のためのプラス
ミド、Ｉ）ｙ ＴＥ ２の役弐図で、ｊうろ１．このプ
ラスミドはＴＧＦ−α配列（斜線）と、それに先１ｊし
、α−因子プ［１モ〜ターの転写コントロール下にある
α−因子（ＭＦ α）プレプロ配列とを有する。 このＴＧＦ’−ｃｉ配列の後方には“Ａｂｌｅ”遺伝子
の３゜非翻訳領域およびポリアデニル化信号（枠で囲ん
だ部分）かある。ＴＲＰ Ｉは酵母内で選択マーカーと
して機能する。酵母内での転写は、２μの転写起源の存
在により確実となる。ＡＰＲ・アンピノリン耐性。α−
因子プレプロ配列とＴＧＦ α配ダ１１との連結（ｊｕ
ｎｃｔｉｏｎ）部分はプラスミド地図の右側に示されて
いる。 詳細な説明 本明細書においては、ＰＲＴＧＦ−α種を、第３図に示
したＴＧＦ−α前駆体のアミノ酸配列に相同（ホモロノ
ー）で、機能的なアミノ酸に係る本質的な領域、または
そのフラグメントを有している、ＥＧＦ以外のポリペプ
チドである、と定義する。候補（ｃａｎｄｉｄａｔｅ）
ポリペプチドは、該侯捕内の残基の内、約３５％以上が
、保存的（コンサーバティブ）なアミノ酸置換またはき
ずの導入を行イつなくとらＰＲＴＧＦ−α種配列内の配
列と対応している場合には、本明細書中で定義したＰＲ
ＴＧＦ−α種と実質上ホモローガスであるとする。 候補ポリペプチドは通常、その様な機能的ホモロノーに
加えて、それ自身が相同である、ＰＲＴＧＦ−α幡と共
通した生物学的活性を表すことができろ。 あるポリペプチドをＰＲＴＧＦ−α種の定義範囲に入れ
るのに必要なアミノ酸配列におけるホモロノーの程度は
、該候補タンパク質とＰＲＴＧＦ−α種との間のホモロ
ノーかＰＲＴＧＦ−α種の生物学的活性に関与している
領域、即ち、（ａ）標的細胞内での形態学上の変化の誘
導、（ｂ）非組換え供給ねで起こりｉする様な、ｒ’
Ｉｔ ’ｒ Ｇ Ｆ−α種に対する抗血ｌ、′？の免疫
学的交差反応、または（Ｃ）細胞表面の受容体との結合
、にとって臨界的な領域内であるか否かによって種々変
化し、定義範囲に含まれるＬめには高度のホモロノーを
示す必要があり、これらの機能の維持と無関係な配列の
場合には、比較的低いホモロノーを示すことになる。加
えて、らし機能的に同様なアミノ酸側鎖を含有する残基
が置換されても、臨界的な領域がこれらの機能のＩまた
はそれ以上を表すならば、本明細書で定義するホモロー
ガスに属することになる。機能的に同様であるというこ
とは、側鎖に優勢な特性（例えば塩基性、中性、疎水性
または酸性）、または立体的な塊（ｂｕｌｋ）の存在ま
たは不存在を指す。 通常、ＰＲＴＧＦ−α種と定義されるポリペプチドは、
図３で示したタンパク質またはそのフラグメントと、少
なくとら約１０ないし２５個のアミノ酸残基からなる連
続した領域にわたって実質的にホモローガスな領域を含
むものである。 あるポリペプチドがＰＲＴＧＦ−α種であることを確実
に同定する上で重要なファクターは、それと対応する非
組換え体と実質上結合し得る抗血清が、問題のポリペプ
チドの活性とし結合し得るということである。しかしな
がら、免疫学的な同一性とそれ以外の生物学的活性に関
する同一性とは、必ずしも同し範囲内であることを必要
と乙ない、とい・〕ごとは理解できるであろっ。例えば
、第３図の成熟Ｔ Ｇ Ｆ αの受容体結合活性に対
する中和抗体は、それが成熟ＴＧＦ αの活性にとって
臨界的な部位に特異的に結合することを目的として生し
たらのでないので、候補タンパク質と結ｆｆｉ Ｌ ’
ｊいかししれない。むしろ、この抗体は無害な領域に結
合し、その中和効果を立体障害によって表しているのか
らしれない。従って、その無害／、Ｌ 領域で突然変異
を生した蚊Ａｌｉタンパク質は中和抗体と結合しないか
、それにらがかわらず、このタンパク質は実質的なＴＧ
Ｆ−αホモロジー、という意味においてＴＧＦ−αの定
義範囲内に含まれることになる。 生物学的な活性に関して“可能な（ｃａｐａｂｌｅ）”
という語句は、酵素的加水分解を受けて、チモーゲン類
似の不活性な状態から、所望の生物学的活性を表すポリ
ペプチドフラグメントに変換され得るポリペプチドであ
ることを意味する。通常、不活性な前駆体は、ＰＲＴＧ
Ｆ−α種タンパク質のいずれか一方の末端にヘテロロー
ガスなタンパク質またはそのフラグメントがペプチド結
合を介して結合している融合タンパク質である。このペ
プチド結合の配列は、インビボ、またはイノビトロでの
製造工程の一部としてのタンパク分解的加水分解に対し
て感受性を有する様、選択する。 ＰＲＴＧＦ−α種は、通常ヒトＰＲＴＧＦ ａ唾を色
味するが、上記のホモローガス領域に関する居準と合致
する限り、ネズミ、ブタ、ウマまたはランの如き供給源
から得られたＰ ＲＴ Ｇ Ｆ α種らＰ Ｉｔ Ｔ
Ｇ Ｆ−α種の定義範囲内に含まれるものである。し
かしながら、あらゆる場合において成熟ＴＧＦ−αはヒ
トＴＧＦ−αを意味する。 ＰＲＴＧＦ−６種因子の誘導体もこの語句の範囲内に含
まれる。誘導体には、アミノ酸配列の突然変異体、グリ
コンル化された変種、並びに他の化学成分との共有結合
または会合による複合物等が含まれろ。共有結合成形誘
ｑ体は、ＰＲＴＧＦα種アミノ酸側鎖に見出される基、
またはＮ６＋）るいはＣ末端と、機能的な成分との結合
によって製造される。これらの誘導体には、例えば以下
、）乙のか３よれろカルボキノ末端またはカルボキン側
鎖を含む残基（例えばａｓｐ３２または４９）の晰肪族
エステルまたはアミド誘導体；ヒドロキノＪＪ−含有残
基（例えば５ｅｒ３１ 、５ｅｒ３．５ｅｒ４２．５ｅ
ｒ１５６または５ｅｒ９４）の０−アシル誘導体；およ
びアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば
リジンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体。 アノル基を、アルキル類（Ｃ３〜ＣＩＯの直鎖アルキル
を含む）の基から選択することにより、アルカノイル種
が生成され、炭素環式または異項環式化合物を選択する
ことにより、アロイル（ａｒｏｙｌ）種ｎ・生成されろ
。反応性の基は、それ自体が反応性の側鎖を介して不溶
性のマトリックスを形成し、ン差結合タンパク質として
用い得る様な二機能性・）化合物であることか好ましい
。 共有結合または会合性の誘導体はイムノアッセ（ｆ：ｊ
ＬＩよアフィニチイ精製法における試薬として自゛用で
ある。例えば、ＰＲＴＧＦ−α種は、自体周′ｆｉ＋の
方法で、臭化ンアンー活性化セファａ〜スに共ａ結合さ
Ｕて不溶化することにより、またはポリオレフィンの表
面に（グルタルアルデヒ！・交差結合の存在または非存
在下で）吸着させることにより、抗−ＰＲＴＧＦ−α種
抗体または細胞表面の受容体を分析または精製するのに
用いることができる。また、ＰＲＴＧＦ−α種を検出可
能な紙でラヘル（例えば、クロラミンＴ法による放射性
ヨウ素化、希」１類キレートとの）（何結合、または池
の蛍光物質との兵役）し、診断的な分析法、特に競合型
イムノアッセイによる生物学的資料中のｌ） ＲＴ Ｇ
Ｆ−α種しベルの診断に用いることができる。 １’ ＣＦ −ａ ＮおよびＴＧＦ−αｃはＴＧＦ α
前駆体の一部に対する抗体を精製さＵｏるので、免疫源
（単独またはへテロローガスなタンパク質との免；ン学
的な複合タンパク質として）として有用である。ＴＧＩ
−α前駆体を成熟ＴＧＦ α、ＴＧＦαＮおよびＴＧＦ
−αＣから識別するための両側サンドウィッチ法による
特異的受容体結合分ＦＬにおいては、分析に先立ち、ま
たはその途中で抗−Ｔ Ｇ Ｆ−αＮ抗体を固定し、肢
検試料を抗体と）１、にｒンギ、１ヘ トし一ζ１記１
１１１駆体をそれと結合させ、次いでこの結合した前駆
体を抗−ＴＧＦ−αＣとイノキュヘート４゛る。この抗
−ＴＧＦ−αＣはインキュベーンコンの前に例えば放射
性ヨウ素でラベルするか、または後に、この抗−ＴＧＦ
−αＣか高められている種のＩｇＧに向けられた標ＪＩ
ｇＧとイノキュヘートする。 予め定められたＰＲＴＧＦ−６種フラグメントに２．＋
、＋゛る抗血清は、そのフラグメントをアオガイのヘ
モンアニノ（ＫＬＨ）または血７１１アルプミノの如き
免疫原性タンパク質と、グルタルアルデヒドや無水コハ
ク酸塩の如き共有結合剤を用いて交差結合させ、マウス
またはウサギ等の適当な動物に通常の賦形剤と一緒に皮
下注射して免疫を付与し、必要ならば追加抗原刺激を行
い、しかる後抗血清を回収することにより、得ることが
できる。モノクローナル抗体は、免疫を得たマウスの牌
細胞から、通常の方法（例えばＥＢウィルスまたは細胞
融合による不死化）によって調製される。 成熟ＴＧＦ−αの妨害を受けずにＴＧＦ−αＣまた（よ
ｉ’ Ｃ，Ｆ αＮを測定するには、Ｔ Ｇ Ｆ
α０支たは゛ｒＧＦ−αＮ分子の相反する末端の、予め
定められたフラグメントに対する抗血清を高め、この様
にして得られた２個の抗血清を用いて’ｒ Ｇ Ｆ −
α１１り躯体に関して記述した如くサンドウィッチ法で
分析する。例えば、ＴＧＦ−αＣの場合ならば、式（Ｃ
ｙｓ）ａＡｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐ
ｒｏ ５ｅｒＡｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｒｇ ＴｈｒΔ１ａ（Ｃｙｓ）ｂ（
式中、ａまたはｂのいずれが一方（両方ではない）はｌ
である）で示されろ配列をＫＬＨとジスルフィド結合を
介して共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させ、この共役結合
物によってウサギを免疫化する。 抗血清をとり、保存する。同様に、ＫＬＨと結合したＴ
ＧＦ−αＣ配列、Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｔｒ
ｐＣｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ａｒｇに対し、ｐＨ６において無水コハク
酸を用いてウサギを免疫化する。これら２つの抗血清は
競合的な、またはサンドウィッチ法に基づくイムノアッ
セイにａ用である。別法として、全ＴＧＦ−αＮまたは
ＴＧＦ−αＣポリペプチドに対してウサギを免疫化し、
３ポリペプチドを分析・４°る丸めの２つの抗血清を、
それらが互いにＴＧＦ−αＮまたはＴＧＦ−αＣとの結
合に際して競合的に阻害し合わない、ということに基づ
いて選択する。競合的に阻害する抗血清は、それに対ず
ろ抗血清が高めらイ１ているフラグメントを囲むタンパ
ク質と、該フラグメントとの識別が容易でない場合に、
このタンパク質を競合的に分析するのにｑ用である。Ｔ
ＧＦ−αｍＣは、尿の如き体液試料を使用し、ＴＧＦ−
αＣ抗体の内の１つと、抗−成熟ＴＧＦ−α抗体とを共
に用いて行う連続的な、あるいは同時の、サンドウィッ
チイムノアッセイにより、最も好都ａに分析し得る。 １） Ｒｉ’ Ｇ Ｆ−α種には、天然の対を遺伝子性
の変異かｑ在し、あるしのから池への変異が起こるとい
うことが理解されよう。この様な変異は１まｆ二はそれ
以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入によって示され
る。池の突然変異体は、ＰＩｔＴＧＦ αｆｉＤＮＡに
おけるサイト指令（配向）性の突然変異により生成され
た、Ｐ ＲＴ Ｇ Ｆ−α種の定められた形での変異体
である。 サイト指令性突然変異の目的は、より改善された特性お
よび活性を表すＰＲＴＧＦ α種の暗号１） Ｎ Ａ
を組立てることにある。突然変異体ＰＲＴＧＦ−α種と
は、それが欠失、置換または挿入のいずれかの原因でＰ
ＲＴ Ｇ Ｆ−α種のアミノ酸配列と異なる配列を有
するという点を除けば、前述のＰＲＴＧＦ−α種とのホ
モロジーに関する定義にあてはまる様なポリペプチドを
指すしのと定義する。例えば、第９６または９７位のり
ノン残基かヒスチジンまたは他のアミノ酸残基に突然変
異的に置き換われば、このタンパク質はもはやこの位置
でタンパク分解的に開裂されろことはない。 同様に、システィン・１７．５５．６０．７１．７３お
よび／または８２はセリンに置換され得るし、Ｐ ＲＴ
Ｇ Ｆ−αのカルボキシまたはアミノ末端は欠失され
得る。突然変異体はＰｆｌＴＧＦ−α種の生物学的特性
の全てをａする必要はないが、ＰＲＴＧＦ・α種の抗体
と交差反応を行い得るエビトビツク部位（抗原決定部位
）を少なくとら１個は保１、’Ｊｌていることを要１１
°１゜ 本発明におけるＰＲＴＧＦ−α種突然変異にお：する突
然変異部位は予め決定されているので、本質的な突然変
異部位を０１１らって定め）てお、ぐ必要はない。例え
ば、４・７１．５．５・、６０．７１．７３まｒ二：：
ｊ、 ｔ ２位での突然変異を適切に実行するために、
ノスティノコドンの位置で無作為な突然変異の誘ｔ’−
Ｘ＠・し、発現したＰＲＴＧＦ’−α穫突然変異体を生
物学的な活性と原核生物！ｒ）槻胞内条件との適合性（
町ち直接発現での溶解性）との鏝適な組合ｈ・せに関し
てスクリーンする。既知の配列を有するＤ Ｎ Ａ内の
予め定めたｔＩ５位に置換的な突然変異を生成させる技
術は良く知られている（ＩＦｌえばＭ１３プライマーの
突然変異生成）か、本発明のサイズの小さいＰＲＴＧＦ
−α種により、予め定めた突然変異をＨする所望のＤＮ
Ａを化学合成することが容易となる。 突然変異の誘発は、通常約１〜ＩＯアミノ酸残基数のア
ミノ酸を挿入、あるいは約１〜３０のアミノ酸残基数の
アミノ酸を欠失させることにより実施される。ｋ３ Ｇ
ち的へ組１λ−ζに１゛ろために、ｐ”ｉ′換、欠失、
挿入あるいは一次的な併用（ｓａｂｃｏｍｈｉｎａＬｉ
ｏｎ）等を組合わＵ・ろことかできる。挿入にはアミノ
またはカルボキン末端での融合（例えば成、′７！ＩＴ
ＧＦ−αのＣ−またはＮ−末端に疎水性の延長部分を付
加する、こと）をも含Ｇ゛。明ら・かに、暗号化された
Ｄ・Ｎ、 Ａ内（で０突然変異′におい・では、配列が
解読フレームの・外部に位置″してはならず、また、ｍ
１１ＮＡの・二次構造を生ぜしめるおそれのある相捕的
な領域をａｌｌ造する乙の・でないことが・好ましい。 ＰＲＴＧＰ−α饅を暗号化しているＤ′ＮＡにおける突
然変異のすべてが最終生ｇ：物を構成するものではない
。例えば、ＤＮＡの挿入＃Ｔ突然変異体の主な種類は、
ヘテロローガスな分泌型リーダー、または信号、がＰＲ
ＴＧＦ−α種のＮ末端に結合した乙のである。別法とし
て、本発明においては、非分泌型へテロローガスポリペ
プチドとのＰＲＴＧＦ−α種のＮ末端における融合を、
例えば臭化シアンまたは酵素を用いてその様なポリペプ
チドをＰＲＴＧＦ−α種から切り離して非メチオニル化
１）１じｒＧＦ α種をｉｒＪろ、という目的の場合
に行っことを考慮している。例えば、原核生物での発現
ベクターを組立てる場合には、Ｅ、ｃｏｌｉアルカリ性
ホスファターゼまたは熱安定性エンテロトキンン■リー
ダーをＰＲＴＧＦ−α種配列の５゛位に、その解読フレ
ーム内において配する。酵母インバーターゼ、アルファ
因子または酸ホスファターゼリーダー類も同様に非メチ
オニル化ＰｒｔＴＧＦ−α種の酵母内での発現に用いる
ことができる。 しかしながら、天然のＴＧＦ−α前駆体の分泌型リーダ
ーはそれ自身の供給源である細胞以外の宿主（より高等
な真核生物の細胞培養において、最らぎり得ることだカ
リによって認識されるかもしれない。分泌型リーダーか
宿主によって“認識”されると、ＰＲＴＧＦ−α種とリ
ーダーから成る融合タンパク質は、通常、ＰＲＴＧＦ−
α種と問題の信号（これはＰＲＴＧＦ−α種を分泌させ
るよう導く）とが結合しているペプチド結合の位置で開
裂される。かくして、突然変異ＰＲＴＧＦ−α種ＤＮＡ
を宿主の１３質転換に使用し、かつ中間体として突然変
異体ｐｒｃｌ’ｌじｌ’Ｇｌｉ’α種（融合物）／Ｊ”
１成されたとしても、得られるＰＲＴＧＦ−α種は融合
物ではないことになる。 本明細書において、形質転換発育因子−β（ＴＧＦ−β
）とは天然に存在するＴＧＦ＝βの表現型（例えば、’
ｒ ｃ ｒｘ−αまたはＥＧＦ（表皮性発育因子）のア
ンカレッノイノディペンダントな増殖効果を増強する）
を有する、β型の形質転換発育因子を指す。 Ｐ ＲＴＧ Ｆ−α種を暗号化しているＤＮＡは、蛍光
性基、放射活性元素または化学発光性基の如き検出可能
な物質により、自体周知の方法で共有結合的にラヘルさ
れる。しかる後、これを通常のハイプリダイゼーノヨン
（雑種分子形成）分析に用いる。この分析法は、実施例
で述へる如＜ＰＲＴＧＦ−α種ベクターおよび形質転換
体の同定、あるいは腫瘍細胞中のＰＲＴＧＦ−α←ｈＲ
Ｎ Ａのディチクトンとして、インビトロでの診断にｆ
り用される。 ０外なことにＰＲＴＧＦ−α種に関するＩｎ［ｔＮＡＱ
・（ｒ白はかなり、３ド１１てＪ′うろ、、その結果、
何を探し出すかを指摘されていないとｃｌ）ＮＡを見落
し弓いことになる。しかしなから、本明細吉中で開示し
た様に、一度その存在か理解され、補助ＤＮＡを完全に
入手することかｉ’＋Ｊ能になれば、ＰＲＴＧ Ｆ
ａ 種ｃＤ Ｎ Ａ／”、！？、ＮＪ ｈｌｉ 的ｒ；
配列ヲＲｔ ルフローブに用いて腫瘍細胞のｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーンすることは、日常的な操作に
すぎない。 Ｐ Ｒ′Ｉ’ Ｇ Ｆ −ａ種はＰＲ’ｌ’ＧＦ ａ種
を暗号中しているＤＮＡを含んでいる発現ベクターによ
って形質転換された宿主細胞により生成される。発現ベ
クターの中には、宿主細胞と一緒になって該ヘタター中
に含まれているＤＮＡ配列（この様な配７１１はそれを
発現させるための他の配列と機能的に結合している）を
発現させることのできる様なベクターら含まれる。それ
らのベクターは宿主微生物内でエピゾームとして、また
は染色体ＤＮＡの組込み部分として、のいずれかの形で
複製され得なければならない。一般に、発現ベクターは
環状１ン二本鎖Ｄ Ｎ Ａループのノ杉のプラスミドで
あり、ベクタ の状態では染色体と結合１−ｌ己１．プ
ラスミドかベクターとして最ら’Ｌ’ｆＩＩｌｉに用い
ら（１ているのて、本明細中では“プラスミドと“ヘタ
ター”とを相互変換的に用いることとする。しかし戸か
ら、本発明はその他の彩の発現ベクター（例えば共形質
転換ベクターやウィルス等、同等の機能を示す乙の）を
も包含するものである。 ＤＮＡ領域はそれらか相互に機能的に関連していれば、
機能的に結合しているしのとするっ例えばプレ配列（ｐ
ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌型リーダーのための
ＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタ
ノパク質として発現されるならば、ポリペプチドのため
のＤＮＡに機能的に結合しており、プロモーターは、そ
れが配列の転写をコントロールするならば暗号配列と機
能的に結合しており：リボゾーム結合部位は、それが翻
訳を行わせる様な位置にあれば暗号配列と機能的に結合
していることになる。−・般に、機能的な結合とは相接
していること、分泌型リーダーの場合には相接しており
、かつ解読相内にあることを、０味する。 ＠Ｉ換え宿゛１゛細胞とは、１記のへタタ で形質転換
された宿主細胞てめろ。既に明らかにした様に、この形
質転換によって、非形質転換宿主では、前記の如く掻く
少量、または、より一般的には検出しｉすない程少量し
か生産されなかっ）＝ ｐ ＲＴ ｃ Ｆ −α←ｌを
大量に生産することができる。その様な細胞によって生
産されたＰＲＴＧＦ αを、組換えＰ ＲＴ Ｇ Ｐ
ａ種と称する。 １ｄ主細胞の培養お上びベクター類 ここに開示するベクター類および方法は広範囲に及ふ原
核性、および真核性の微生物に用いるのに好適でのる。 勿論、原核生物が本発明に（１用なベクター類を４硫で
ろためのＤＮＡ配列のクローニングに好適であるという
ことは当ｆこり前のことである。例えば、Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ Ｋ Ｉ ２菌株２９４（ＡＴＣＣＮｏ。 ３１４４６）は殊にｑ用である。その他の使用しｉ？Ｊ
ろ微生物の菌株には、Ｅ、ｃｏｌｉｒ３およびＥ、ｃｏ
ｌｉＸ Ｉ ７７６（Ａ′ｒＣＣＮｏ、３１５３７）が
含ま−れろ。これらの例は単なる例示に１゛き゛ず、制
限的な乙のでないことは１、うよ°ζ乙ない、。 我々が行った実験では、Ｐ Ｉｔ Ｔ Ｇ Ｆ α種
配列は、通常原核細胞の細胞質に不溶性の屈折性物体と
して析出するか、原核生物らまた発現に用いることがで
きる。これらは容易に回収し、可溶化させることができ
る。上記の菌株、Ｂ、 ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｆ−λ
−１原栄養体、ＡＴＣＣ２７３２５）、並びにＢａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓの如き大腸菌類、その他
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｌｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよた
はＳ ｅｒｒａｋ １ａ１１ａｒｃｅｓｃｅｎｓの如き
腸内菌や様々なＰ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の菌株ら用
い得る。 一般に、宿主細胞に適合し得る←■から誘導されたレプ
リコンおよびコントロール配列を含むプラスミドヘタク
ーを、これらの宿主と一緒に用いる。 普通、ベクターは、複製部位、並びに形質転換細胞内で
表現型に基づく選択性を付与し１すろ標識配列を有する
。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉは一般にＥ、ｃｏｌｉ種から導
かれたプラスミドであるｐＨ１ｔ３２２を用いて形質転
換される（５５）。ｐＨ１ｔ３２２はアンピノリンおよ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を５′η（ｉ’して（・
ろ・）で、杉質転換細胞を？−１１に同定で３る７段を
提供オろらのてめろ。このｐＢｌ（３２２プラスミド、
あるいは他の微生物プラスミドはよｆ−１微生物かそ（
−Ｌ自身のタンパク質を発現さ什るｆ二めに［１１用し
得るプロモーターを含Ｃ丁シ、または、τ白（−ろ株に
食′５前Ｉされていなければならない。客■換ん［）＼
Ａ ））組立てに最ら普通に用いられるプロモーターに
は、β ラクタマーゼ（ベニンリナーゼ）およびラクト
ースプロモーター系（５３，７２，９２）並びにトリプ
トファン（ｔｒｐ）プロモーター系（６７，９３）か含
まれる。これらが最も普通に用いられる乙のでのるか、
その池の微生物プロモーターら発見されて使用されてお
り、それらの詳細なヌタレオヂド配列ら公開され、当業
者はそれらをプラスミトヘタターと機能的にライゲート
する二とかできろ（８０）。 京核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物ら用い
られる。酵母の成熟ＴＧＦ−αの発現および分泌は細菌
よりも低レベルであるが、そのポリペプチドはＥ、ｃｏ
ｌｉからの直接的な発現生産物と５′＋１な−・て弓溶
Ｙ１てど５ろ１．（“Ｅ ＋Ｊｉｔ’ｌ微１１物Ｕ）内
、Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｃｖｉｃｉ
ａｅまたは通祁のパノ酵母か最も一般的に用いられるか
、その池多改の菌株ら言過に用い得る。Ｓ ａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ内で発現させるためには、例えばプラス
ミドＹＲｐ７（８１，８２，８３）か通常用いられろ。 このプラスミドは既にｔｒｐｌ遺伝子を含有しているの
で、トリプトファン中で増殖する能力を持たない、酵母
の突然変５！４１１ｉ（例えばＡＴＣＣＮｏ、４４０７
６またはＰＥＰ ４−１ （８４））に選択マーカーを
与えろ。 酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてＬｒｐｌ障害があると
いうことは、形質転換体をトリブトフ７ノ不在で増ｈα
させることによって形質転換体を検出するのに有効な状
況か与えられることになる。 酵母用へフグ−の好適なプロモーティング配列には、以
下のらのに対するプロモーターか含まれる ３−ホスホ
グリセレート・キナーゼ（８５）まｆ二はエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−ホスホグリセレート・ムター
ゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオースホスフェート・
イソメラーゼ、ホスホ′！ル：Ｉ ス・イツメラ ゼ、
グルコキナ ゼおよびα−ファクター等の他の解糖酵素
類（８６，８７）。 適当な発現プラスミドを組立てるためには、これらの遺
伝子と関連した終止配列を、発現ベクター中に、発現さ
せるべき所望の配列の３゛とライゲートさせて入れ、ｍ
ＲＮ Ａの末端、およびポリアデニル化部位を提供す
る。 その池、増殖条件によって転写がコントロールされろと
いう１１１点をざらにａ４゛るプロモーターとして、ア
ルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１
酸ボスフアタ−ゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記
グリセルアルデヒド−３ホスフェ〜 ト・デヒドロゲナ
ーゼ、並びにマルトースおよびラクトースの利用に与る
酵素類（８７）等に関するプロモーター領域か含まれる
。酵母と適合し得るプロモーター、；に製起源および終
＋Ｌ配列を含ｆ丁するブラスミトヘタターの全てが適す
る。 微生物の外に、多細胞生物から得た細胞の培養物らまｊ
−宿主として用いることかできる。培養がｉＹ Ｈ１ｉ
動物上たはＩ＋＋ｔ ＯＮｕ動物のいずれから得られた
にＵｏよ、Ｉｔｉｆ則的にはその様な細ｆｌａ１１の４
“へてか機能し得る。しかしなから、ａ准動物の細胞に
より大きい関心が寄せられており、最返ては培地（組織
倍径）中でを椎動物細胞を増殖さぜ・ろことは、通常の
操作となっている（７５）。その様なｆ１用な宿主細胞
系（セルライン）にはＶＥＲＯおよびｌ−１ｅＬａ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、並び
にＷ＋３８、ＢＨＫ、ＣＯ５〜７およびＭＤＣＫ！１１
胞系等が含まれる。その様な細胞のための発現ベクター
には、Ｉ！！ｉ當（必要ならば）複製起源および発現さ
れるべきＰＲＴＧＦ−α唾配列の１１ｑ方に位置してい
るプロモーターか、所望のりボゾーム結合部位、ＲＮＡ
スプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配
列等と共に含有されている。 咄乳類細胞内で使用するための発現ヘタター用のコント
ロール機能は、しばしばウィルス性物質によって供給さ
れる。例えば、普通用いられているプロモーターはポリ
オーマ、アデノウィルス２、および最らＶ４繁にはノミ
アンウィルス４０（ＳＶ１（））かり棉かイする。５Ｖ
ｌｌＯウィルスのす刀期および後期のプロモーターは、
いずれら該ウィルスからフラグメントとして容易に得る
ことができ、しからＳＶ４０ウィルスの複製起源を含ａ
しているので特に有用である（８８）。ウィルス性複製
起Ｈ内の、ｌｌ１ｎｄ［［１部位からＢｇ１１部位に向
けて延びる約２５０ｂｐの配列が含まれている限り、大
きいまたは小さいＳＶ４０フラグメントを用いることか
−ζさ／Ｓ、、さらに、正常な状態で所望の遺伝子配“
り４１・を伴っているプロモーターまたはコントロール
配列、を用（する、ことらでき、またしばしば好ましい
といえる。、ただし、その様なコントロール配列か宿主
細胞１系に適合性を有することを条件とする。 複製起源は、外来性の起源、ＳＶ４０その（医のウィル
ス性起源（例えばポリオ−７、アデノ、ＶＳＶ、Ｂ、Ｐ
Ｖ″Ｊ）を含ｔ、−ｔにベクターを組立てるか、みるい
は宿主Ｍｒ＠の染色体性膜製機構によって与えるか、い
ずれかの方法で付与される。もし乙ヘタターか宿主細胞
染色体に組込まれるならば、後置はしばしば充分に働く
。 ウィルス性；（３Ａ起源を含（１するｌ＼クタ を用い
「に、選択可能なマーカーおよびＰ ｒ？ Ｔ Ｇ Ｆ
α種ＤＮＡを用いた共形質転換法によ−て咄乳類細胞
を形質転換することもてきる。適当な選択ｏＪ ｔ＆な
マーカーにはノヒトロ葉酸還ｌ己酵木（Ｉ） ＩＩ Ｉ
” Ｒ）かめる。ＰｆｌＴＧＦ α種とＤ Ｉ−Ｉ
Ｆｌｌの両押をそ 。 れぞれ暗号化しているＤ Ｎ Ａ ＆！刈を含むベクタ
ーでトランスフェクトするのに好適な哺乳Ｍ宿主細胞を
選択するに際しては、用いるＤ ｌ（Ｉ” Ｉｔｌタン
パク質タイプに鎚って宿主を選択するのか適当であ、る
、。野生型・Ｄ）（・ｌタンパク質を用いる場合には、
ＤＨ・ＦＲ欠胤宿主細胞を選択するのか好ましく、かく
してヒボキサンチン、グリッツおよびチミジンを欠く選
択用培地・内で、Ｉシ足のいくトランスフェクンヨンを
選択するマーカーとして［）Ｈ’ ＦＲ暗号配列を用い
ることができる。この場合に好適な宿主細胞はＤ）（Ｆ
Ｒ活、性を欠くチャイニーズハムスターの卵巣（Ｃ，Ｈ
，Ｏ）・細胞系であって、これはＵ ｒｌａａｕｈｊ５
よびＣｋａｔｊｉ（＋ ９８０ 、 Ｐ ｒｏｃ−Ｘａ
ｔｌＡｃａｔ、 ５ｃＥ−（ｔＪ Ｓ Ａ）７７ ：、
４２ Ｌ ６ ）の方ｌ去に上−・てＡ要し、増幅さＵ
・ることかできる。Ａｌｔｌ転質はアメリカ特許第４，
３９９，２１６号に記載されている。この方法をＰＲＴ
ＧＦ−α種の合成のために、上記特許中に用いられてい
るゲノムまた：よβ−グロブリンＤＮＡを、所望により
過当な合成リンカ−類を用いてＰＲＴＧＦ−α種配列を
暗号化しているＤＮＡに置き換えることによって適用す
ることができる。 池方、メトトレキセート（Ｍ’ｒＸ）に対する結合の親
和性の低い、ＤＨＰＲタンパク質の暗号化ＤＮＡをコン
トロール配列に用いる場合には、ＤＨＦ Ｒ耐性細胞を
用いろ必要はない。何故ならば突′！へ変％Ｄ ＨＦ
ＲはＭ Ｔ Ｘ耐性であるので、宕主細ｑａ自身かＭＴ
Ｘ感受性であることを条件として、Ｍ Ｔ Ｘ含角゛培
地を選択の手段として用いることがてさろからてめる。 Ｍｌ”Ｘを吸着することのできる只核細胞の大多数は、
メトトレキセート感受性でめろと思イつれる。その様な
有用な細胞系の１つはＣＨＯ系、ＣＨＯＫｌ（Ａ１’Ｃ
ＣＮｏ、’ＣＧし６１）である。 細胞培養からＰ Ｉｔ ’ｒＧ Ｆ’ ａ樟を回収４
゛ろ方法は、それらが可溶性タンパク質または屈折性の
物体（不溶性の会合体）のいずれの杉で発現されろかと
いうことに依存する。後者は通常、バクテリア（細菌）
性発現の場合であり、大多数の細胞内タノバク質は可溶
性であるために、精製は容易である。 可溶性ＰＲＴＧＦ−α種は、もしそれが分泌型の宿主−
ベクター系で発現されれば（例えば、それが細菌または
酵母の分泌型リーダーと結合しているか、通常の信号配
列を合釘している全ＴＧＦ−α前駆体配列で形質転換さ
れたを椎動物細胞系である様な場合）、その細胞培養か
らの回収はより容易なしのとなる。 可溶性ＰＲＴＧＦ〜α種は、アルキル−セファ０−スク
ロマトグラフイー、ゲル濾過、ケル電気泳動、または、
固定化した抗体、または受容体を用いた受容体−結合ア
フィニティクロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。 Φとに投与するためのＰＲＴＧＦ−α挿合ｑ組成物は、
所望の精？Ｊ度のＰＲＴＧＦ−α種と生理、！的に；ｒ
’？ｉ Ｉ−ｆすろ担体（叩肱採用しｆこ川ｌ＋１お
よび濃度において叫毒な担体）とを混合することにＬ−
）でＪＪｉ製される。これは、通常、Ｐ ｒＦ １’
Ｇ Ｆα種と、緩衝剤、アスコルビン酸の如き抗酸化剤
、低分子量（残基数的ｌθ以下）のポリペプチド、タノ
ペク質、アミノ酸、グルコースよｆ二はデキストリフ等
の炭水化物、Ｅ Ｄ Ｔ Ａの如きキレート剤、並びに
その他の安定剤および賦形剤とを混合することて１１−
＋′ンれろ。 夫ｆこ、動物に投与するための組成物としては、ＰＲＴ
ＧＦ−α種の免疫性の共役化合物、又はＰＲＴＧＦ
α種の兵役化合物とＰＲＴＧＦ−α種に結合し得る抗体
から成るものがあり、前者は、特に診断用キットに用い
るために、抗体を高めることを目的とし、後者は抗−抗
体抗血清を生成させることを目的としている。 その様な組成物の投与経路は既知の方法に従う、例えば
静脈内、腹腔内、筋肉内、または滅菌しｒ二治療用溶液
の病巣内注入または注射、あるいは以下に述べる、時期
調整放出ノステムにより、没１ｊ４′る。 ｒ’ＲＴＧＦ−α種の組成物は植え込みか可能な、放出
時期を調整した（Ｌ ｉｍｅｄ −ｒｅｌｅａｓｅ）物
質から投与することかできる。その様な適当な系には、
例えばし−グルタミン酸とガノマエチル化−グルタミノ
酸の共重合体（Ｕ、 Ｓｉｄｍａｎら、ｌ９８３、”ｂ
ｉｏｐｏｌｙ＋ｎｅｒｓ”２２（１）：５４７〜５５６
）、ポリ（２ヒドロキンエチル−メタクリレートＸＲ，
Ｌ ａｎｇｅｒら、１９８１、”Ｊ 、 Ｂｉｏｓｅｄ
、 Ｍａｋｅｒ １ｊｃｓ、 −１５：１６７〜２７
７並びにＲ，Ｌａｎｇｅｒ、 ｌ ９３２、”Ｃｈｅ
ｗ、 Ｔｅｃｈ、 ” ｌ ２ ：９８〜＋ ０５）
またはエチレンビニルアセテート（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒら
、同上）が含まれる。この物質は、外科的部位または創
傷の上に植え込まれる。別法として、この組成物を注射
のために、半透膜のマイクロカプセルかりボゾーム内に
封入してらよい。 該組成物の投与量は、例えば投与経路、標的である疾患
および患者の状況によって左右される。 病巣内への注射においては、体重を基準とする組成物の
必要量は、静注に比べて少ないであろう。 随・て、ｌ′に師は所望の最適なｌｌＶ性が得られ、か
つ例えば標的組織の生検や診断分析によって測定し得る
様、用量を検定（ｔｉｔｅｒ）Ｌ、投与経路を修正する
必要がある。 ＴＧＦ−αは潜在的な骨吸収剤である。従ってこれはこ
の目的において治療上有用である。このものは、注射、
注入、また放出時期を調整した方法によって投与し、用
量を血漿中のカルンウムイオノ値に従って検定（Ｌｉｔ
ｅｒ）することができる：骨１１ノを収を誘導・１゛る
には高カルシウム血症をもたらず１１１槍について検定
４−る。める１、者にとっては、逆、〕治療が適合する
。その様な患者とは、がんにかかり、ある種の腫瘍の場
合における如く、ｌｌｌ１瘍細抱によるＰＲＴＧＦ−α
種の生成に伴う高カルシウム血症を発現している患者で
ある。この様な患ざは、尿、血清または可能ならば外科
的に切離して得た腫Ｉｕｌｌｌａ中に正常値以上のｉ５
度でＴＧＦ−αｆｆ１ＣまたはＴＧＦ−αｈ仔在してい
ることによって診断される。規定の治療法は、その様な
患ｎ達に抗’Ｉ” ＣＦ−α（またはその抗原−持Ｓｖ
的Ｆａｂ部分）の如きＴＧＦ α中和剤あるいはＥ
Ｇ Ｉ”受容体（またはそのＴＧＦ−α−結合性のアミ
ノ末端細胞外領域）の如きＴＧＦ−α受容体を投与する
ことを含む。その方法・χ、選択されたＴＧＦ−α領域
に対する抗血清の製造に関して前に述べた。欠いて、そ
の様な患者の高カルンウム血症を是正する抗体の能力を
注射、注入または放出時期を調整した投与法に関してス
クリーンする。別法として、ＴＧＦ−αまたは前述の如
く、その選択された領域に対して患とを免役化するごと
により、抗体を自己の内部で生成させることらできる。 ＥＧＦ受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知
である（Ａ 、 Ｕ １ｌｒｉｃｈら、１９８ ・１年
３月、”Ｎａｔｕｒｅ”３０９ ：４ ｌ ８〜４２５
）。更に、ＥＧＦ受容体はＡ４３１表皮がん細胞から得
ることができ、一般に入手できる細胞系はその表面に、
大多数の他の型の細胞の１０〜５０倍らのＥＧＦ受容体
を何する。Ａ４３１細胞はまた、細胞外に結合領域を持
つ、先端に切断された受容体を分泌する（Ａ 、 Ｕ
１ｌｒｉｃｈら、同上）。いずれかのＥＧＦ１゛／ｉ体
を、ＩＩｃ知のノｊ法（Ｍ、 ＷａＬｔ！ｒｆｉｅｌｄ
ら、！９８２”Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、
”２ ｌ Ｏ：ｌ ４９−１６１）、または当栗番周
知の同等手段（例えば、臭化ファンで活性化したセファ
ロース上に結合したＥ Ｇ Ｆに関ずろアフィニティク
ロマトグラフィーノに従−て精製オろ。それらを、滅菌
食塩水の如ご実学的に許容し得る担体中に、Ｌｌｚ入時
に遊離のＴＧＦ−αと結合して血清中のカルシウム値を
下げろＩＩな、治療１イ１°効なｉｅ１隻で含白さＵ゛
ることにより、製剤化する。治療上のａ幼性は、高カル
シウム血症の軽減、または遊離ＴＧＦ−α結合ＴＧＦ−
α比を今日、血漿中の遊離チロキノンの測定に利用され
ているイムノアッセイと類似の方法で測定することによ
り、監視する。ＥＧＦ受容体または１’ Ｇ Ｆ α
受容体（またはそのＴ Ｇ Ｆ−α結合領域）の使用は
、製造か容易でめろ点で抗体の使用より乙好ましい。し
かしながら、抗体は、それらを天？へに生した受容体よ
り乙大きい親和性に基づいて選択し１する、という利点
を存する。 採用した方法 強Ｌ！７１で手ごわい細胞壁障害のない細胞をＭ Ｉｇ
ｉｌ＋胞として用いろ時には、リン酸力ルノウム沈降法
によってトラノスフエクノヨノを行う（８９）。しかし
なから、ＤＮＡを細胞内に導入するための他の方法、例
えば核内注入またはプロトプラスト融合等、し用いるこ
とかできる。 実質的な細胞壁構造を打する原核細胞を用（・る場合の
好ましいトランスフエクノヨノ法は塩化カルシウムを用
い！ニカルシウム処理である（９０）。 所望の暗号配列およびコノトロール配列を含有する適当
なベクターの組立てには、標準的なライゲーノヨン技術
を用いる。単離したプラスミドまｌこはＤ Ｎ Ａフラ
グメントを開裂、修復し、所望のプラスミドにとって望
ましい形に１耳ライケートする。 開裂は、適当な緩衝液中で制限酵素（類）を用いて行う
。一般に、約１μ９のプラスミドまたはＤＮＡフラグメ
ントに対して、約２０μＱの緩衝液中て約１単位の酵素
を用いる。（特定の制限酵素にとって適当な緩衝液およ
び基質のへｌは製造楽音によって明らかにされている。 ）インキュベーノヨンの時間は、３７℃において約１時
間が有効であろう。インキユヘーノヨンした後、フェノ
ールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出し、水性画
分をエタノール沈殿に付して核酸を回収する。 粘着末端を必要とする場合には、調製したらのをポリメ
ラーゼＩ（クレノー）１０単位と共に１５℃で１５分間
処理し、フェノール性クロロホルムで抽出しＬ後、エタ
ノール沈殿に付す。 開裂したフラグメントのサイズ（大きさ）によるで・７
離は、しばしば６％ポリアクリルアミドゲルにｋｉｌ、
行なわれる（Ｇｏｃｄｄｃｌら、６７）。 ラヂケーノヨノに際しては、正確に合致する様に末端を
適当に修復した所望の成分を、ＤＮＡ０５μ９に対して
Ｔ ｌｌ ｌ） ＮΔリガーゼを約ＩＯ単位の割合てＩ
ＩＩＬＩて処理ずろ。（開裂されたベクターを成分とし
て用いる場合には、該開裂ベクターを細菌性のアルカリ
性ホスフγターゼで前処理し、再うイゲーノヨンを防止
しておくことか行用であろう。） プラスミド中に組立てられたｉＥ確な配列を確認するに
は、ライゲーノヨノミゾクスを用いてＥｃｏｌｉ Ｋ
ｌ ２ｌ株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換
し、満足すべき形質転換体をアンピノリンまたはテトラ
サイクリン耐性について適当なところで選択する。形質
転換体からのプラスミドをｉ−ｔ、これを制限酵素法お
よび／または配列決定法により分計する（４５．９１）
。 好ましい＠様の一般的な説明 及敷鯉 以下に示ｉ−実施例は例示をＬノ的としており、本発明
を制限するしのではない。二５う実施例においでは、店
主細胞培養としてＥ、ｃｏｌｉの店主細胞培養を用いた
。しかしながら、本発明方法には池の真核および原核生
物の細胞ら同様に通出性を（＝ｒする。 Ｉ。１１訂府−α特５１ｉｉＩｙＬゲノムＤｉ’ｑ−Ａ
然〔ｌ−）の単線 ＴＧＦ−α遺伝子の！−１！離は合成オリゴヌクレオチ
ドを用いた特ｙ４的ハイブリダイゼーノヨノに基ノと、
二（１らのブ〔ｌ ブは第１［４に示、＋如＜、 ヒト
Ｔ Ｇ Ｆ αの（１定の部分的アミノ酸配列に基つ
いて定められている。 最近、特質的ＤＮＡ配列を、多くの組合わせ上、）誤り
（ミスマツチ）を白°する長い合成オリゴヌクレオチド
を用いて、あまり厳ｒ６てない条件下のハイブリグイゼ
ーノヨノによってｃＤＮＡよたはデフ１ムＤ Ｎ 、Ａ
ライブラリーから単離し得ることか示ｓ Ｘ＝、 ｊ：
、、この方法（よ、アメリカ特許出願番号第５０１．
３５１号、１９８３年６月６日出願（ＥＰＯ出願番号第
８４．３０３７８４７号）に記載の如く、ヒトーインン
ユリン様発育因子ｌの几めの遺伝ｊ−の検出において成
功を収めた方法である。同じ方法を、ヒトＴＧＦ−αを
暗号化しているＤＮＡの単離において試みた。この目的
のために、２藺の長いオリゴヌクレオチドを合成した（
第１図）。 ・１１７−（４１ｆｆ１体）はアミノ酸１２〜２５の暗
号配列に相当し、他方４８７−（４８徹体）はアミノｌ
ｉ！２１〜１６の暗号配列に対して相捕的である。各ア
ミノ酸には数個の異なるコドンか対応し得るのて、この
１リゴヌクし・オチトノｌ ７’Ｈ１Ｖ’＋いメケレ（
子１・は、ヒトｍｌ工ＮＡに幅在して認められているコ
ドンを基に選択した（９４）。なお、複数のＣｐＧノヌ
クレオチトの存在は避けた。４１マーと４８７−の３゛
末端はＩ５残括の長さにわたって相捕的てうろため、こ
れら両オリゴヌクレオチドを准種分子形成し、それらを
鳥類の骨髄性芽球症ウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素で
延長し、二重鎖７４７−を調製゛４゛ることかてきる。 これらの長鎖オリゴヌクレオチドに加えて、２個の１４
７−も合成した。Ｉ４マーの４つの部分（ブール）、即
ら、ＩＡ、ｎ、ＣおよびＤと呼称される部分はアミノ酸
５〜９に関して可能なコドンの全てに一ノいて相捕的で
ある。同様に、１４７−の池の４つの部分（２Ａ−Ｄと
命名）はアミノ酸１５〜１９に対応する。 第１図に示したこれらのオリゴヌクレオチドは、ヒトＴ
ＧＦ−αのためのＤＮＡ配列を検出する目的でハイブリ
ダイゼーション・プローブとして用いた。これらのオリ
ゴヌクレオチドはヒトＴＧＦαのための部分的なアミノ
酸配列（３５）と関連さＵで設計されており、同相トリ
エステル法（３８，３９）を用いて合成された。 ４１マー、４８マーおよびＩ４７−を、反応ミックス（
７（１ｍＭ）リス−）１ｃＩ（叶■７６）、１０−ＭＭ
ｇＣＬおよび５ＩＩＩＭノチオトレイトールを含有）中
、３７℃において３０分間、γ−”Ｐ−ＡＴＰとポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて５゛位で標識化した。また
等モル量の４Ｉマーと４８マーとを、ｚ５μａのミック
ス（１０５ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８３）、ｌ＝１０
ｍＭＫＣＩ、５０ｍＭＭｇｃＬおよび２１０ｍＭβ−メ
ルカプトエタノールを合釘）中において７０°Ｃで５分
間加熱し、その後３０分１川をかけて室温まで徐々に冷
却することにより、７４マーを調製しｆ二。次いで、こ
れらのアニールしたオリゴヌクレオチドに、ｄＴＴｆ）
とｄＧＴＰとを１０ｍＭになるまで、１５０μＣｉづつ
のａ−３２Ｐ−ｄｌ＼′１゛Ｐわよびα〜”Ｐ−ｄＣＴ
Ｐ、更に８０単６γのＡ Ｘ４Ｖ逆転写酵素を加えて全
容外を７０μｅとずろことにより、二重鎖の放射ｌ＆性
−ラヘル７４７にしｆ二。３７℃で３０分間インキュベ
ーノジノした。次いでラベルされていない（ｉΔ１’Ｐ
および（ＩＣＴＰを１０ｍＭになるまで加え、！５分間
反応を進行させた。５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ ５ｕ
ｐｅｒｆｉｎｅとのクロマトグラフィーにより、この〕
１イプリダイゼーションプローブから、取り込まれなか
ったヌクレオチド・トリホスフェートを分離した。 当初は、ヒト黒色腫細胞系Ａ２０５８（５，３４）（こ
れは、ＴＧＦ−αを精製するための供給源として用いら
れていた）からのｍＲＮＡから導かれたＣＤＮＡライブ
リーより、ＴＧＦ−α特異的クローノを単離することに
Ｓｌ一点か合わされていた。１４マー、４１マーおよび
７４７−による広範囲に及ぶスクリーニングによってい
くつかの堆種分子彩成に係るｃＤＮＡを単離することか
てき、これらを配列決定に付したところＴＧＦ αと
無関係でめった。これか不成功であったので、λシャロ
ン４Ａフアーノ（４０）内に含有されているヒト−ゲノ
ムＤＮＡライブラリー中にＴＧＦ−α遺伝子を捜すこと
を決定した。約７．５ＸＩＯ’のファージを、５゛位を
ｔＰでラベルした４Ｉマーとノ＼イブ・１ノ（七 ノー
２）−（ろことによ姦）、スタリーノし、−ら＋−−、
＋５支験で（ｉ、同数Ｊ）イＩＩ換え一ノフーノを、こ
、！−ら組換え人ファー７を二１・［Ｊセルロース−フ
ィルター（９５）にの仕、レプリカＯＨ製）牢板培にし
、孜射活性（票識化７１７ と）＼イブリダイゼノヨノ
ー（る二と、こより、スリリ−）しｆ４ｃ これ、−、
）ス々リーニンクの結果、ｌＩ ｌマーわよび／まｒ二
：よ７４マーとｗ１種分子を形成した３５個の組換Ｋ
Ａ ’ ””／を検出、ｌｊｊｌ １１．、 ３５７−
ｙ−ノ全てＤ・らＤＮＡを煩離しｆこ。６♀１）換えλ
ＤＮＡについて、４１７−１７４７−１・１８７−４し
びに１・１マーのプールｌ Ａ −Ｄおよび２ Ａ −
ｏとのハイブリグイゼーノヨンを“ドツト−プロット”
法（１３）（こより、調・＼ｆ−０こ１ｔらのＥｌｉ離
ファーノＤさ；Ａの内、とれら明確には４８マーまｌ二
はブールＩＡ−Ｄと准種！アナ子を形成し戸かっｒこか
、１４７−プーＪし２＼−Ｄの混合物と：よ、約１／２
のＤ Ｎ Ａか幾′叶１）・、）ハイブリダイセーノヨ
ノを示しｒ二。 １！マー、４８７−および７４マーを、５Ｘ（５１＝：
＋ｓ Ｓ Ｃ（ｌ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ＝ Ｏ、ｌ ５ＭＮ
ａｃｌ、００１′５＼１り」゛／酸−Ｉｊ・リウム）１
．Ｉび）・１月・ｎｈｑｒ；Ｉｔ、′、二、Ｉ＆（ｌ＜
ｌ）ｔ：ｎｈａｒｄｔ溶子シー＋１．１”６１’ｉｃす
ｉｌ、Ｏ１％ポリヒニルビｕ ｊｌ １；／、０１θ５
Ｃ゛１ノ皿ｊｉ７アルフミノ、２０％ホルムアζ１・）
および５０μ７／−ＱＪ）超ご液処理しｆこ鮭精（−Ｄ
Ｎ Ａ中て准唾分子形戎）′こ付しｌ二。 フィルターを・１２°Ｃて２時間、ブレバイブ！１グイ
ズしｆこ後、熱変性さｕ′ｆニブローフを加え、４２°
Ｃて１５〜２０時間ハイブリｙ（七 ／：１）をイＪ几
。フィルターを１ｘｓｓｃおよび０１％５ｌ）Ｓて順次
、広範囲に洗浄しｆ：（３７”Ｃ）。１４７−をプロー
ブに用いた場合には、２時間のプレハイブリダイゼーノ
ヨノおよび１５時間のハイブリダイセーノヨノを、６Ｘ
ＳＳＣ，０，５％ＮＰＩＯ１６ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｉ Ｘ
Ｄｅｎｈａｒｄｋ溶液および５０μｆｆ／′マσ鮭精子
ＤＮＡ中、３７°Ｃて行っｒ為次いて、ＧＸＳＳＣ中で
、室温で敢回洗１１トシた。 、１１７−および１４７−２ＡＤと。）ハイブリグイゼ
ーノ３ノの程度を、ハイブリダイズ５７−ｆ二“トノト
ープロット”ニトロセルロースフィルター’ｉ−，ＩＶ
ｉ次厳シＱ ／Ｊ’ １ｔ１１められろ条ｆ’ｌドで洗
／Ｔ＃４−ることにより評１１ｉ１ｉ Ｌ ｒこ。この
ことは、後続の分（４ｊに適用セへき潜α的な候浦とし
て考慮されるファーツノ）改を、更に制限するためにイ
ｒなわ４を几。この評価に括ついて１２個のファージを
配り１１決定のＬめ（こ８択しｌ二つこれらのファージ
Ｄ Ｎ ＡをＢａｍＨＩ、１−１ ｉｎｄ［Ｉ ′）：
ｆこはこれら両酵素の併用、によって消化し、フラグメ
ントをアガロースゲル上で分離し１１７−または１４マ
ープ〜ル２１＼−りとハイブリダイズしているファージ
Ｄ Ｎ Ａをサザ〜ノ分ｌｒ Ｉ’、 ４４ ）に付す
ことで、いずれかのプローブとハイブリダイズしている
配タリは、同一のＤ Ｎ Ａセグメント１こ局在してい
ることかねかつｆ二。各ファージ［）＼Ａの、ハイブリ
ダイズしたＢａｍＨｌまたは１１ｉｎｄ［ｌＩｌフラグ
メント、次いてプラスミドｐＢＲ：３２２にサブクロー
ノしたつ二カキメラブラスミｒを、エツトヌクレアーゼ
５ａｕ３Ａｌ、１１ｓａ［ま７： ！ ｉ両片、によっ
て順次開裂しｆ二。このフラグメントＪ′）混合物をポ
リアクリルアミドゲルおよびアカ〔ｌ スゲル１で分離
し、二１・（Ｉセル［７スーツイルター１−に序した。 ｌｌ ｌマーとのハイブリダイゼーノヨノにより、１２
［ＡＩのプラスミド全てに関し、２八イブリグイズした
小フラグメノトを同定しｒ為次いて、これらのフラグメ
ントを〜Ｉ１３ｍｐ８またはｍｐ９（４５）にサブクロ
ーノし、それらのヌクレオチド配列をノデオキノヌクレ
オチド鎖末端決定法（４Ｇ）により、決定しｆ二。 ブラスミトノ内、ｐ′ｒＧＦ１５ Ｉと命名５（１）
こプラスミドは、Ｔ Ｇ Ｆ αの最を月の３３個の
アミノ酸の暗弓配列を有（２，１８０塩活村Ｑ’）Ｓａ
ａ３、八（フラグメント内に位置していることか明らつ
・ｉ、＝ ｉｉ ッｆ二（第２図）。ｐＴ Ｇ Ｆ Ｉ
５−１ 、’ｊ＃ｔｌ換ンフ７−ノλ１５から導かれ
たｌｏ、２Ｋｂｐ（キロ塩基χ・ｔ）ＢａｍＨｌフラグ
メントを含（１°している。：３３番ト１のアミノ酸に
関するコトノの次にはさ３止コト／がある。その位置の
ＧＴ−７ヌタレオチトは、介住配刈の供与ａｚｂｌ−て
めろことを示、ｌ′１，１′識てシ５ろ（＝１７）。Ｉ
−’ Ｔ Ｇ ＦＩラ−１の制限的マノビノケ、および
それ以後の配シリ決定法（データーは記載りｉ’ ｉ（
’、 １． ｉ 、 Ｓ：＋１： Ｉ Ａ ｌ
−ノラ ′ｆメ 、１・、ユｉｉ ７ （ｌ ｂ
ｐＳａｃｉ ｆｒａｌｌフラグメノト１−に１ｖ置し
、スプラ（Ｘ供与品位の下流におけるＳ ａｕ ３．Ａ
Ｉ １％ｉ位はＢ２８１酵素の認識耶（１″Ｌでらあ
ることか小された。 ヒトＴＧ Ｆ αの最初の３３１［／ｉのアミノ酸を
暗−ｊ化しているエクソンを含わ゛、プラス（１・ｌｌ
ＴＧＦ１５１ノ） ｌ ８０ｂｐＳａａ３７＼−フラグ
メントのヌクレオチド配列１１、および（１定のアミノ
酸配列をり＋ ２ ｒ＜１に小４゛、Ｋ文′ｉ、′ζ小
しＩこ配り；１は′ｌ″Ｇ１２ αポリペプチドの一部
であり、小文字で示ヒｒ二配列（よ、前駆体においてＴ
ＧＦ αに先行しているアミノ酸配タリてうろ。矢印
は、ｃＤｈＡ配クリとの比較によ−・て決定された介α
配列の受容わよび供与部位を示している。、（下記参照
）。 二、）ヌクレオチド配列を綿密に検討することによ・〕
、１！マーがハイブリダイズし７Ｊ３の残基、よ、得ら
れたＴＧｒ” αＤ Ｎ Ａ配列とホモローガスてめ
ろことかわＤ−ろ。１４個のホモローブメスな塩基か連
続的に伸びている。４８残梧の内３７か十モローカスて
うろにら拘わら１′４８７−か顕著ｆコ’＼（−／ Ｉ
Ｉ ７ （７： ｌ−ｊｉｒ・戸・： ／−ｆ’ｌ！Ｉ
ｌｌ：ｉｌ’ｌｌ 、’＋４−１： ｔ、ｔ： １完全
なホモ〔１） （１１１１同性）を小・１１・１７−′
Ｊ）プールの内の１ってめる２Ｄは、明瞭すか極めて弱
いハイブリダイゼーノヨノを示しｆ二。１４マーの′１
、八−１）とのハイブリダイゼ＝７ヨノの欠如は、成、
訊′Ｉ″Ｇ Ｆ αの７１ケに、最初に−Ｆ ｉ＋＋
１されていｆ二〇ツノでなくアスパラギン酸に関するコ
ト７ノノ・（Ｔ、在していたことに起因しているうこの
相違によって。 １・１７−内に２−）の不適合（ミスマノチノヶ）／ｉ
戊ＪＩＩ５か存在すること（こなっｊ＝。 ｐＴＧＦ１５−１の、単離されｊ二ｌ ８０ｂｐＳａｕ
３１〜１フラグメノトを、引き続き、１１１ｊに単離し
た３５の組換えファージのドツトプロット分析（４３）
におけるハイブリダイゼーノヨンプ〔Ｊ−ブとして用い
た。３５のファージＤＮＡの内５個かこのフラグメント
とハイブリダイズしｒ二。サザー７分析法によってそれ
ら全てか同一の、ハイブリダイズし＋’＝６７０ｂｐＳ
ａｃｌ −Ｂａｌ ｌフラグメントを含有していること
が示されＬｏ ２ 約５０００ヌクレオチド長さのＴＧＦ−αｍＲＮＡ
１−１：己ｙ−： ’６１Ｈｆｕは、ヒト’Ｉ’ Ｇ
Ｆ ＋ｘを！’１′ｌＸＪ化しているケノム配タリか
介龜配クリによって中断されていることを、トシている
。完全な形の暗号配列をｉする７こ０（二、ｉ” Ｇ
Ｆ αエクソンを含むゲノム５ａｃｌ−１（ａｌ１７
ラグメノトを黒色腫細１泡系Ａ ２０５８ ｊ＞＼＜Ｑ
’）ｍｌｔ＼、＼から導り−イーたｃＤＮＡライブラリ
ーのプローブに用いに。これらの試みら不成功てあっ、
ｒコのて、ＴＧＦ αｍＲＮＡの供給源として、他の
細胞系を捜４゛ことか決定されノー。 広範囲に及ぶ種々の腫瘍ａ粗系Ｄ）ら抽出された佳々ｆ
、ｈ ｍ Ｉｔ Ｎ 、＋＼のコレクノヨノを、ホルム
アルデヒＩ−７カロースゲル七の電気、水＋Ｊ＋（、ｌ
ｌ）およびＴＧＦ α特異的Ｓａｃｌ−Ｂｇｌｌフラ
グメントとの゛、ノ ザノ”ハイブリダイゼーノヨノ（
４２）で調べた（デ ターは記載せず）。全ての細胞系
が、弱い、Ｊ、コらく非特異的な雑種分子形成にＪみづ
くバット全、Ｍ にらこれらオリゴｄ′Ｆ−セルロース
選択ｍＲ＼Ａ山にｌｌ：αするリポブームＲＮＡの２８
Ｓの位置７に示しｆ−、′腎細胞腫から導かれた１つの
細胞系、１０７２Ｆ５７：ま、２８８の位置に明瞭で強
いハ（ブリダイゼ ノジノＬｊ’Ｌを小し、約・１８１
１１１〜５０００のヌクレオチド長さの’ｒＧｌαｎｕ
’ｔＮＡか（を在１１゛ろことを示唆した。関連４°ろ
ポリペプチド、ＥＧＦらまた、約−ｔ ！！ ００のヌ
クレオチド長さのｍ ＲＮ Ａによって暗号化されてい
る（・１８．４９）。 このｍＲＮＡの一次の翻訳生産物はＥ Ｇ Ｉ−” ：
’＋：ｉ駆体ポ躯体プチドで２うり、このものは、・；
１き続いて数個のポリペプチドへと処理されろか、そノ
）内の１−ノかＥ Ｇ Ｉ’である。 ＋（、ＴＧＦ αを暗号化しているＣ Ｄ Ｎ Ａの
手並ヒトＴＧＦ αに関する完全戸暗号配クリを含む
Ｃ１１Ｎ Ａを蛸離するｆこめに、上記のａ胞系かり１
１トＡを単離した。ポリアデニル化ｍ ＲＮ Ａ分画を
、オリゴｄＴ−セルロースクロマトグラフィーに吸収さ
せることによって単離しｆこ（５０）。常法通りｃＤＮ
ＡをＡ製しく５ｌ−５３）、ｄＣ−ホモポリマーで修復
しく５４）、更にＰＳＬＩで線状化し、ｄＧ−テール化
（ｄＧ −Ｌａ１１ｅｄ）を行−１ｆ４１１１１３１１
３２２にアニールした（５５）。Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（
５４）における形質転換（５６）を）ｆａｎａｈａｎの
高部−１１１１，法（５８）・工）１０・て行）ことに
、１、Ｃ）、：う１．）４のｃｌ）ＮΔライブラリ を
得た。１つのライブラリーは、Ｌｌ’ｌ’ ｌ ２−１
８をプライマ〜とする（ｄＴ” ｌ ２−１８でプライ
ムされた）ｃＤＮＡを含んでいたか、一方、池の２すの
ライブラリーは合成ｌ６７−ｄＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴ
ＧＴＣＣＴで、特異的にプライムされたｃＤＮＡ合成法
によって、Ｊ＾１製された。このオリゴヌクレオチドは
、ｐＴＧＦ１５−ｌの長い１８０ ｂｐＳａｕ３ Ａ
Ｉ制限フラグメント内に含まれているＴＧＦ−αエクソ
ンから下流の領域（ヌクレオチＦ ｌ ３４〜１４９）
と相捕的である（第２図）。 プラスミドｐＴＧＦ１５〜１から調製した、放射活性−
標識ＴＧＦ−α特異的５ａｃｌ−Ｂａｌｌ制限フラクメ
ノトを用いてＱ性コσニーをスクリーンした（５９）。 特異的にプライムされたｃＤＮＡ合成によって調製され
た９０．０００の組換えＥｃｏｌｉクローンの内、唯１
１１１がこのプローブとハイブリダイズした。このプラ
スミド（ｐＴＧＦ−ＣＩと呼称）を制限酵素分析に付し
たところ、そこには３ＩＬ！］のＰｓｔ［フラグメント
が存在し、その内最短Ｕｌ ６７ ｂｐ−／ラフｌ ／
ｌ−！１、ｐ’ｓ’ Ｇ ｌ冒５１．）１” Ｇ Ｆ
αエクソン中（ご乙１’＋−（ｌ’、 していろご
とか１引らかになった（第２図）。次いて約９００ｂｐ
のｃＤＮＡの挿入を表している３個のＰｓｃｌフラグメ
／１・を、Ｍ ｌ ３ｍｐ８（４５）にサブクローンし
、ノデオキノ鎖末端法（・１６）による配列決定に付し
几。 プラスミドｐＴＧＦ−ＣＩのＣＤＮＡ配？りとその推定
のアミノ酸配列を第３図に示ｔ０ 第３図はプラスミドｐＴＧＦ−ＣＩ中に含まれているＣ
ＤＮＡのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列を
示している。Ｇ−ＣテールがｃＤＮＡの両側に接して存
在する。ヌクレオチドは各ラインの下側に配されている
。ライン上の数字は、＋１１独のメチオニンかＮＨ，−
末端を構成する七推定した場合のアミノ酸の位置を示し
ている。ＴＧＦαのアミノ酸配列は枠で囲まれており、
その両側にはＡｌａ−Ｖａｌに富む配列（オーバーライ
ンで示した残基）か結合している。 ヌクレオチド配列を調べた結果、ＣＤＮＡの合成はプラ
イマー（ＴＧＦ−αエクソンの１３４〜１１！Ｉ’ｌｌ
；°Ｉｈ１°ξ第２図）に特疋されろ１也ＮＡ配列てな
く、乙゛しろ、この特異的なオリゴヌクレオチドに泪当
する位置の下流から開始されていることが分かりた。さ
らに、ｃＤＮＡの３゛末端の直ぐ下流にある遺伝子フラ
グメントを、組換えファージから単離しんところ、特異
的プライマーと似通った配列を有していなかった。従っ
て、このＴＧＦ−αｃＤＮＡは、ラノダム（無作為）な
ｃＤＮＡ合成開始状況下で生成したものであると推＃１
ｌ１１される。ＴＧＦ−αｍＲＮＡの二次構造かオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーノジノ、従って、特
異的なｃＤＮＡの合成開始を防げている可能性かめる。 ＣＤ Ｎ Ａの配列およびｐＴＧＦ１５−１から得たゲ
ノムフラグメノトを直線状に示した図（第３図および第
２図）は、ゲノムＤ Ｎ Ａ内にスプライス受容および
供与率位（４７）が存在することを指摘している。ｌ
８０ｂｐＳａｕＡ Ｉフラグメント内に含ま利ているＴ
ＧＦ αエクソンの長さは、１２１ｂｐでゐる（第２図
）。 認め得るＴＧＦ−αのアミノ酸配列から、ｃＤＮΔ配列
中の解読−ル ノ・か＆１Ｍ ！７さ４１／、＋ 、
ｌｌｉ’７ ’Ｊ配列は、１” ＯＡを終止コドンとし
てヌクレオチド５２７で終わってＪ５す、３゛非翻訳領
域の一部がこれに続いている。オープンリーディングフ
レームはｃＤＮＡの５°末端まて連続している。ｍＲＮ
Ａは約４８００−５０００のヌクレオチド長さを有する
ので、このｃＤＮＡ上には、ＴＧＦ−α１１ｊ駆体の暗
号配列の内、−１か存在していない可能性かある。しか
しながら、単独のメチオニン残基を指すＡＴＧコドコド
対して、Ａか一３位で先行しており、また、その直後に
はＧが続いているという点か重要である。この様な現象
は高等な真核生物の大多数のｍＲＮＡ内の開始コドンの
特徴である（６０）。更に、８位から１８位までの配ク
リは、細胞からのタンパク質分泌に係る信号ペプチドの
疎水性中心（６１）に題めて特徴的な配列である。、他
の信号配列（６１−６２）との比較により、ノブナルペ
プチダーゼによる開裂は、乙しこの配ソリか実際に信号
ペプチドを表しているならば、１９位のＡｌａ、２０位
のＣｙｓまたは２２位の八ｌａの後方て起ご・Ｓことが
小唆された。しかしなから、この単独のメチオニンをＴ
Ｇ Ｆ α前駆体の出発点に帰属することは、ｍＲ
ＮＡの３°非翻訳配列が約４０００ヌクレオチドという
通常でない長さを有する可能性のあることを意味する。 第３図のｃＤＮＡ配列は、前駆体タンパク質のｆこめの
より大きい暗号配列中にはめ込まれているヒトＴＧＦ−
αに関する完全なりＮＡ配列を示している。ラット、マ
ウスおよびヒトのＴＧＦ−αに関する直接的なアミノ酸
分析により（２７，３５）、ＮＨ２−末端にＶａｔ−Ｖ
ａｔ配列のあることが明らかにされた。ポリペプチドの
長さが５０アミノ酸長さであること、並びにラットおよ
びマウスの配列決定されたカルボキン末端に基づき、Ｔ
ＧＦ−αは８８および８９位のＬｅｕ−Ａｌａ残基で終
わっているといえる（第３図）。５０アミノ酸長さのＴ
ＧＦ−αを生成さ仕るためには、アラニンおよびバリン
残基間のタンパク分解的な開裂が、アミノ−およびカル
ホキソー両末端で起こらなければならない。このＮＨ，
−末端におけるＡｌａ−Ｖａｌダイマ は、配列 Ｖ
、ＩＩ Ａｌａ ΔＩ、１ノヘＩ、Ｉ Ｖ３
１Ｖａｌ中に位置しており、これはカルホキノ末端に見
られる配列＋Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ
と非常によく似ている。この顕著な特異性に関連し、Ｔ
ＧＦ−α前駆体のタンパク分解的な処理に関与するプロ
テアーゼは未だ記載されていない。 ここに、腎細胞腫から導かれたｃＤＮ、Ａおよび健常な
胎児の肝臓から導かれたゲノムライブラリーから単離し
た遺伝子フラグメント（４０）において、ＴＧＦ−αに
関する完全な暗号配列が決定された。両配列は同一であ
り、これら両供給源内でのＴＧＦ−α遺伝子間には暗号
の相違が無いことを示唆している。 また、ＴＧＦ−αに関するＤＮＡ暗号配列が確立された
ことにより（第３図径照）、この遺伝子を文献記載（３
８，３９）の常法を用いて合成することが可能である。 ＴＧＦ−α前駆体に関する推定のアミノ酸配列から、５
０アミノ酸から成るＴＧＦ−αのカルホキノ末端から２
０アミノ酸下流を始点とする、非’７：’＋に疎水性の
領域かあることが明らかになった。 これら１０３〜＋２１の残基は、その殆んどがロイノン
、イソロイノンおよびバリンで占められている。１１８
番目のアミノ酸から前駆体ポリペプチドのカルボキノ末
端までの配列は、著しくシスティンに富んでいる。この
４２個のアミノ酸配列中には８個のシスティンが含まれ
ており、その内４個は集まって対になっている。このシ
スティンに富む配列は生物学的に活性なポリペプチドを
構成している可能性がある。今までのところ、どの様に
してこのペプチドが前駆体分子から開裂されるかという
ことは推測にしかすぎない。幾つかのポリペプチドホル
モンはより大きい前駆体として合成され、通常、対にな
った塩基性のアミノ酸で結合されている。９６−９７位
のＬｙｓ−Ｌｙｓ残基は、プレプロエンケファリン（６
１６４）、カルノトニノ前駆Ｋ（６５）およびコルテコ
トロ躯体−β−リポタンパク質前駆体（６６）の場合の
様に、タンパク分解的な開裂の作用部位であるからしれ
ζい。 ゲル濾過分析により、概算の分子量か１０〜２３キロダ
ルトンである大きいＴＧＦ−αが数個存在することか示
された（１．５．２２．２８．２９．３０．３３．３４
）。これらの大きいＴＧＦ−αの本質は未知である。Ｔ
ＧＦ−αを暗号化している数個の関連遺伝子かゲノム内
に存在しているのからしれない。しかしながら、全ヒト
−ゲノムＤＮＡと、ｐＴＧＦＩ５−１のｌ ８０ ｂｐ
Ｓａｕ３ Ａ ｌフラグメント並びに６７０ｂｐＳａｃ
ｌ−Ｂａｌｌフラグメノトとのサザーンハイブリダイゼ
ーノヨノ（４４）によっては、曳数遺伝子の存在は明ら
かにされなかった。あるいは、これら大きいＴ Ｇ Ｆ
の内、幾つかに関してはその本質を、前駆体分子におけ
る翻訳後の処理型が異なることて説明することかできる
からしれない。また、ＴＧＦ−αが他のタンパク質類と
凝集することによって、見かけ上の分子ら１が大きくな
る可能性らある。 ４ 、 Ｅ、 ｃｏｌｉ てのＴＧＦ−ａの ＝−’
ｒ Ｇ Ｆ−αは、多くの腫瘍細胞によって、少量が生
産される。実際、ＴＧＦ−αの“オーバープロ−１”ユ
サ ”て−）ろとさ、！１．ている黒色腫細胞系Ａ２
０５８ ；’）培養物から得ｒコＬＫＪ、、＆ｌ ３６
Ｑから１．５μ９の、小さいＴ Ｇ Ｆ α←ｌか
単離されたにオぎない（３４）。この様に、細胞培養か
らのＴＧＦ’ α人丁釘か極めて低いことか、その生
物学的な確認を妨げている。これらの研究を容易にする
ために、Ｅ、ｃｏｌｉ内でのヒトＴＧＦ αの合成が
追求されて、ニア＝、ＴＧＦ−αを暗号化した配列は前
駆体の中にはｙ）込まれているので、我々は該Ｎ号配列
のｌ１Ｆｉ方に開始コドンを、後方に終止コドンを導入
しＬｏ この開始コドンにはＥｃｏＲ１認識部位が先行
し、終止コドンにはＢｇｌＩ［部位が後続しているので
、ＴＧＦ−α配列はボータプルなＥｃｏＲＩ −ＢｇＩ
Ｉ制限フラグメノトとして利用することか可能となる（
第４図）。 ＴＧＦ αはＥ、ｃｏｌｉ中で、ヒトーソマトスタチ
ノ（７２）、インツユリン（７３）およびデスアセチル
チモノンーα［（７４）と同様な方法で、異なる融合タ
ンペク質の一部として発現された。これら後との場合に
は、成熟タンパク質を臭化ファンを用いて融合タンパク
質から開裂さけろこと更で３た。この化学的処理によっ
て、融合タノバク質し）先端部分と成熟ポリペプチドと
を連結するために導入されたメチオニノ残括の後方で↑
＋ｒ異的な開裂か起きた（７２）。ＴＧＦ−αの暗号配
列およびそれに先行４−ろメヂオニノコトノが、ｔｒｐ
リーダーとＬｒｐＥの融合タンパク質（ｔｒｐ△ＬＥＩ
＝ｌ１３．７６）の先端部分と、ＥｃｏＲＩ部位で連結
されている様な２四のプラスミドか組立てらＡ−ｒこ。 この融合タンパク質の発現は、 ｔｒｐリーダーのりポ
ゾーム結合配列を用いて、ｌｒｐブロモ〜ターのコント
ロール下に置かれている。発現プラスミドｐＴＥ６の場
合には、このＴｒｐΔＬＥ１４１３融合タンＩ・；り質
の最・初の１９０個のアミノ酸配列（数個の７ステイン
残基を含む）かフレーム内でＴＧＦ。 α配りリと連結され、終止コドンか後続している。 プラスミドｐＴＥ５ては、ＴＧＦ αＩ） Ｎ Ａ配
列に対して、このｃｒｐＬＥ融合タンベク質の最初の１
７個のアミノ酸のみについての暗号配列が先行している
。この１７アミノ酸の延長部分にはノステイ７ノノ・１
）よれていないので、このＮ１１．末端が、発現されｆ
ニタンパク質のノスルフイト結合に影響を峻は°ずこと
はおそらくないであろうといえる（第５ａ図）。いずれ
の場合にも、１” ＣＦ−αの暗号配７１１の先端にメ
チオニノット／カイを在しているので、臭化ファンによ
る開裂によって成熟ＴＧＦ αが枚用されるっ 第４図は、ＴＧＦ−α（第３図におけるアミノ酸１ｌＯ
−８９）を、その下流の配列（第３図におけるアミノ酸
９（］−１６０）を伴って、あるいは伴わすに、発現さ
せるための、幾つかのプラスミドの’ｊｌｌ Ｎ７）て
方法を模式的に示す図である。制限的なマノビッグによ
って、ｐＴｃ：ＦＩ５−１内で、ＴＧＦ−αエク′ノン
を有するｌ ８０ｂｐＳａｕ３ Ａ Ｉ −Ｂｇｌｉｌ
フラグメントは、３８０ｂｐＰｖｕｌｌ−５ｍａ１７ラ
グメノト内に含まれていることか明らかになった。 この後晋のフラグメントを単離し、変性した後、γ”Ｐ
−ＡＴＰで５゛標識化をｉｊった合成オリゴヌクレオチ
ドｄ ＣＡ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ ’Ｉ’
ＣＣＣＡＴ Ｔ ’ｒ ＴとＴ４リガーゼのｒ７−α
下て復元させた。 この混合物にＥ、 ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１クレ
ノーフラグメントを加え、ｔｈｉ合成を触媒さｕｆ二（
６７）。このプライマー修復法を用いることにより、Ｃ
ＡＴＧ配列をＴ Ｇ Ｆ αの暗−吃配列の先端に桿
いた。次いでこの反応生成物をｒ３ｇｌｌＴで切断し、
ポリアクリルアミドケル電気泳動によって部分的なＴＧ
Ｆ−α配列を含む１３０ｂｐフラグメントを単離した。 ランＦＦＮ−β２ＤＮＡ配列か短い合成りＮＡフラグメ
ントに置換されている外は発現プラスミドｐｌＦＮ−β
２ （ｐＢｏ Ｉ Ｆ Ｎ β２）と本質的に同一であ
るプラスミドｐＹＧ１２＋を、そのｊ１ｉ’−のＥｃｏ
ｌｊ１部（Ｉγて切り開さ、Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメ
ラーゼｌ（クレノーフラグメノト）でうめ、Ｂｇｌ［ｌ
で切断した。このヘタターに＋３ｏｂｐＴ” Ｇ Ｆ−
αフラグメントをライゲートオることにより、ＥｃｏＲ
ｌ ｆｆｌ！（ｎを回復した。こ１して得らイーたプラ
スシトはｐＴＥｌと呼称された。 最？／Ｉの３３個のアミノ酸を暗号化している配列を含
むｌ ３０ｂｐＥｃｏｆｌｌ−Ｉ３ｇｌｌｌｉｌｌＩ限
７ラクメ：／トをｐ′ｌ’ Ｅ ＋から単離し、テトラ
サイクリン耐性’ｒ Ｉｔ’： ｌ’、ｌ’Ｌ： Ｊｌ
ｉｌｊ １：ｆｌすを＋’； （１’ してし’ ）’
ａ ｐＦ Ｉ Ｆ ｔｒｐ’６９ＬＪ ７ ）、）３５
０ ｂｐＲｇｌ ［１−１３ａＩＩｌｌｌ ｉフラグメ
ント、「、よびｌ−：ｃｏｌｔｌわよびＬ３ａｍｌ−１
ｉで切断しｌ二ｐＩＮＣｖ Ｐへｌ ３−３３の大きい
ヘタタフラグメント（叩Ｚｐｌ ＮＣＶＣ（７８）、プ
ラスミノーゲン活性化ＣＩ）Ｎ、へ挿入体を含在してい
る）にライケートシ、・二。（１＃らイｔｆコブラスミ
ドｐ’ｖＥ２は、１１１ｊ記１ｒｐ几ＬＥ１４１３（７
６）融合タンパク質のＮ Ｈを末端、）Ｉ７アミノ酸を
暗号化している配列と、Ｅｃ。 Ｉｔ Ｉ ｉｍｉ位を介して連結しｆこ、ＴＧＦ α
の最初の３３アミノ酸のｒ二めの配列を含有している。 ＴＧＦ α配列を含有するｌ ３０ｂｐＲＩ−Ｂｇ
ｌ■フラグメノトを、まｆこ、前記ｔｒｐＬＥ融合タン
パク質、７）最初の１９０のアミノ酸のための暗号配列
に連結しｆこ。このプラスミド、ｐＴＥ３は、ｐＴＥｌ
、）ｌ ３０ｂｐＲＩ−Ｂｇｌ［ｌフラグメントをｐＦ
ＩＦｔｒｐｊ６９のＢｇｌ ［１−Ｂａａフラグメント
並びにｐＮＣ〜・１５１）のＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ
ｌで得た大きいフｊのヘタターフラグメントにライゲー
ノジンする二と１こより１組立てられた。 、“１．：ｆ、な”Ｉ’ Ｇ Ｆ α配シリを短し１
融合物として発現、１ろプラスミドを以トの如くにしで
得た。ｐＴＥ２をその弔−のＰ ＳＬ Ｉ Ｊ’；よび
１３ｇ１１１部位で切断し、大きい方のフラグメントを
Ｉｎ離した。ｃＤＮＡプラスミドｐＴＧＦ−ＣＩ’ｒＰ
ｓｔｌ（第３図におけろ２３３位）ｊＪよびＡｖａ［Ｉ
（第３図に才バする３０１位）てｌ／Ｊ ｌ）開き、７
８ｂｐＴＧｌ？ α特異的フラグメントをｉｔ’ｌｌし
た。これら両フラグメノトを部分的に何１ｈｌｉ性を有
ずろオリゴヌクレオチドｄＧＡＣＣＴＣＣＴ Ｇ Ｇ
ＣＣＴ Ａ ＡおよびｄＧＡＴＧＴＴ、ＡＧＧＣＣＡＧ
ＧＡＧの存在下においてライゲートした。これらのオリ
ゴマ〜はＴＧＦ α暗号配列の背後に終止コドンを導
入し、かつ、＼ｗａ１１部位とＢｇ１■部位とを連結す
る乙のである。得られたプラスミドはｐＴＥ５である。 プラスミドｐＴＥ６はｔｒｐＬ［ε融合物の最初の１９
０個のアミノ酸配列に関する完全な暗号配列を有してい
る。これは、ＴＧＦ−ａに特異的な５２０ｂｐ長さのＥ
ｃｏＲｌ −Ｂａｍ１−１１７ラグメノトを１）ＮＣＶ
（５１）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌフラグメントの大き
い方にライゲートす・、ｌとに１．・てＦｊられた。ブ
ラスミＦ’ ｐ ＴＥ ５およびｐＴＥ６からの短い、
または長い、ＴＧＦ−α融合タンパク質の生成、並びに
Ｔｅａ”遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターのコント
ロール下にある。 Ｔ Ｇ ｌ” αのためのＤＮＡ配列を、その下流に１
ｉ１８結している暗号配列と一渚に、直接的に発現させ
るＬめに、プラスミドＸＡＰ−ＰＡ２を単一のＸｂａ口
〕よび８ｇ１１１１位て開裂し、大きい方のヘタターフ
ラグメントを単離した（図４ｄ）。ＸＡＰ−Ｐへ２：よ
、ＩＦＮ βｃＤＮＡ配列り叱ト組織のブラスミノ−ゲ
ノ活性化物質のためのｃＤＮＡ配レリとしｊｊ ｌ’ｉ
ｊ Ｓれでいる外はｐＦ Ｉ Ｆ ｔｒｐ６９ （６７
）と本質的に同様のプラスミドであり、プラスミドｐｔ
ＰＡＬＩｐＩ ２（７０）内の如く修飾されており、
り・−ノ、′ｒｅＬＲＩＲ伝子の下流のＧ −１１ｂｐ
Ａｖａ Ｉ −ｐＶしｎフラグメントを欠失している。 更に、ｐＴＥｌ１ノ）ら、′ｒ Ｇ Ｆ−α配列の始め
の部分を含む７０ｂｐＸｂａｌおよびＢｇｌ［ｌフラグ
メントを、モしてｐＴＧ Ｆ −ＣＩから残りの暗号配
タリを含ｒ丁シている３１５ ｂｐＰｓＬ ｌ −５ａ
ｕ３ Ａ ｌフラグメントをｉｌｉ離した。、３個のフ
ラグメントをライダ １・し）：、 ｉ’ｊ白れたプラ
スミド、ｐＴＥｌは、開始コドンによって先行された暗
号配列を、Ｌｒｐプロモーターのコントロール下にある
、ＥｃｏＲｌ −１３ｇ１ ［１フラグメ／トとして含
ｆ１゛シている。 更に、プラスミドｐＴＩ４で直接的に発現させるために
、この暗号配列をｔｒｐリーダータンパク質のＮＨ，−
末端部分との融合タンパク質として発現さけることを計
画した。そこで、３５０ｂｐ長さの′ｒＧＦ−α特異的
Ｐｓｔｌ−Ｂｇｌ［Ｉ７ラグメノトをｐＴｒシ４からＩ
ｉｉ離し、プラスミドｐｔ”Ｃ２の大きいＰｓＬ−Ｕｇ
ｌｒｌフラグメノトにライダ＝−）Ｌｒこ。 ｉすられたプラスミドをｐＴＥ７と命名した。別法とし
て、ｐＴＥｌのＴＧＦ−α配りリを含￥Ｊ゛４−るＥｃ
。 １ｉ ｌ −ｊ３ａｍＨ［フラグメントをｐｉ” Ｅ
３の大きい１℃ｃｏｌｔ Ｉ −ＢａｍＨｌフラグメン
トにライゲートし、プラスミドｐＴＥ８を得た。プラス
ミドｐＴ Ｅ ７およびｐＴＥ８はＴＧＦ αＤ Ｎ
Ａ配タリを含有しており、しからその下流の暗号配列は
、それぞれ、Ｌ「ｐＬＥ１４１３融合タンパク質（７６
）の最初の１７１１・（口９０個（ハアミノ酸に連結（
結合）（、ζいろ。 これらの配列のライゲーノジノはＥｃｏｆｊ１部位で起
こり、この１Ｅｃｏ＋？１部位の次にはメチオニ）の１
−めのコドン、Ａ Ｔ Ｇが存在している。ＴＧＦ−α
配グ１１の先端にメチオニンが存在するので、この残居
の背後で融合タンパク質を特異的に開裂させることが可
能である。 制限酵素類はＮ ｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄ Ｂ １
ｏｌａｂｓまたは、１１ｔ１ｔｈ
ヒト形質転換発育因子−α前駆物質およびそのフラグメ
ント、特に成熟−ヒト形質転換発育因子α（’１’ Ｃ
Ｆ−α）１．１１びにその新規な製剤ね１０組成物、さ
らには、それらを治療および／または診断用に均一な状
態で大量に生産する方法に関する。 本発明は、望ましくないタンパク質を含んだ天然の物質
を、極く少量しか得ることができなかった従来の方法、
即ち、既存の細胞培養中で生産し、抽出する単離法と比
較して、高純度の物質を大量に生産することのできる方
法を堤供するものである。 本明細盲中で言及した文献およびその他の物質は詳細な
説明中に参照例として挿入し、更に、便宜上、記載順に
番号を付し、それぞれ文献目録中にまとめて示した。 発明の技術的背景 Ｆ３’ｌｔ転換発育因子類（ＴＧＦＩｌｌｍ）は、正常
細胞における表現型の（フエノティピカルな）形質転換
を可逆的な方法で支配する因子である。ＴＧＦを投与す
ると、正常細胞のコントロールされていない増殖が刺激
され、また軟寒天中の形質転換細胞の形成状態を測定し
た結果、アンカレッジ・インディベンダンス（ａｎｃｈ
ｏｒａｇｅ １ｌＩｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）が増加する
ことが示された（ｌ−３）。２種類のＴＧＦが識別され
た。ＴＧＦ−αは広範なヒトまたはゲブ歯類起源のＵ瘍
細胞から分泌される（４−７）。ＴＧＦ−αおよび表皮
性発育因子（ＥＧＦ）は同じ受容体を競合しく５．８．
９）、この受容体は、ＴＧＦ−αまたはＥＧＦの結合後
、チロシン残基の位置でリン酸分解される（１０−１１
）。ＴＧＦ−αに特異的−他の受容体の存在を提示する
幾つかの証拠があろ（１２）。ＴＧＦ−αによるアンカ
レッジ・インディベンダンスな増殖はＴＧＦ−βによっ
て著しく補強される（１３．１４）。この後行のＴＧＦ
は多くの正常細胞および腫瘍細胞中に検出されており（
１３〜＋７）、しん腎臓（Ｉ８）、胎盤（Ｉ９）および
血小板（２０）から精製されている。ＴＧＦ−βはＥＧ
Ｆ受容体と結合しないとされており、まｆ二、自身の形
質転換活性またはＮＲＫ細胞活性のｆこめにＥＧＦま几
はＴＧＦ−αを必要とする、と信しられている。 ＴＧＦＩの生物学的な役割は未だ明瞭に解明されていな
い。多くの研究がＴＧＰＩ［が形質転換１こおいて重要
な役割を果たしていることを示唆している。レトロウィ
ルス（２１〜２４）、Ｓ Ｖ ４０ Ｃ２５）またはポ
リオーマウィルス（２６）における細胞形質転換におい
てＴＧＦ−αが分泌されていることが示された。細胞形
質転換におけろＴＧＦ分泌の密接な係り合いはポリオー
マウィルスＤＮＡのトランスフェクション実験で示され
た。即ち、ミドルＴ抗原についてのＤＮＡセグメントの
導入が、形質転換された表現型、およびＴＧＦ分泌の両
番を誘導するのに必要かつ十分な条件であることが示さ
れた（２６）。Ｋ １ｒｓｔｅｎのネズミ肉腫ウィルス
の熱感受性突然変異体を用いた形質転換に関する研究に
おいてら、表現型の形質転換が許容温度で起こった場合
にのみＴＧＦ−αが分泌されることが指示された（２１
）。加えて、最近の研究によると、クローンされたＴ２
４膀胱がん遺伝子の導入でＴＧＦの生産が誘導されるこ
とが示されている（２７）。腫瘍の進行との生物学的な
関連性は、健常人χ・ｉ照との比較にｊｊいて、１１・
［！患との尿中に）ヱＴＧＦ−αの活性てあろ、と同定
される活性が削性することによって６暗示されている（
２８〜３０）。しかしながら、採用された分析法ではＥ
ＧＦの如き池の発育因子の活性を区別し得なかっｆ二か
らしれない。これら、またはその他の観察の結果は、Ｔ
ＧＦ αが自己分泌（ａｕｔｏｓｅｃｒｉｎｅ）機構を
介して腫瘍形成に関与し、そのことによってＴＧＦｆｆ
ｉが形質転換細胞から分泌され、そして同様の細胞集団
においてこれらの形質転換された特性を維持し、刺激す
る、ということを示唆している（３１〜３２）。しかし
ながら、腫瘍細胞がＴＧＦαとβの両者を分泌するとい
うことから示唆される様に、ＴＧＦ−βの増強作用か必
要からしれない（１４）。この様に、ＴＧＦ−αは腫瘍
の形成期間における極めて強力なエフェクター分子であ
り得る。 ＴＧＦ−αのヘテロローガスな（異種の）分子種は、腫
瘍細胞からの抽出物および上澄み（５，１２゜２２．３
３〜３４）並びに尿中（２８〜３０）のらのについて報
告されζいる。約７キしＩクルトノＵノ小さいものか、
ゲ、ｌ歯類（２７，３５）およびヒト（２４゜３５）の
両細胞供給源に関して精製されｆこ。このラットおよび
マウスのＴ Ｇ Ｆ−αについてのアミノ酸配列決定に
よって、これはＥＧＦと幾分かのホモロノー（ｈｏｍｏ
ｌｏｇｙ）を示すことかねかっｊ二（２７゜３５）。報
告されたヒトＴＧＦ−αの部分的なポリペプチド配列は
、ラットおよびネズミ種のそれと強いホモロノー関係に
あることを示している（３５）。 転移性の腎細胞腫患者では進行性の骨の脱仄か起こり、
それが体液性の高カルシウム血症に反映されていること
か観察された（３６）。不純なタンパク質製剤を用いて
行なわれた最近の研究によると、形質転換発育因子（Ｔ
ＱＦ−αを含む）は組織培養系で骨吸収を若起すること
が示唆された（３７）。 ウィルスによる細胞の形質転換では、ＴＧＦ〜αは上記
の治療または診断用薬として用いるには非実用的な、限
られた量しか生産されない。 組換えＤＮＡ技術 ヘテロローガスなタンパク質、即ち、ある細胞か１１゛
常状態ては産生しないタンパク質、は、外来性ＤＮＡに
よって形質転換された細胞によって生成される。これは
通常、外来性ＤＮＡをベクターの形で細胞内に導入する
ことによって達成される。 ベクターの構成要素、即ち、複製起源、１またはそれ以
上の表現型の選択特性、発現プロモーター、ヘテロロー
ガスな遺伝子挿入物およびベクターの残余部分、に関す
るＤＮＡ組換え操作は通常、宿１ミ細胞の外部で行なわ
れる。得られた複製可能な組みえ発現ビヒクル、または
プラスミド、を形質転換によって細胞に導入し、該形質
転換体を増殖さＵ゛て、大量の組換えビヒクルを得るこ
とかできる。遺伝子を、それが暗号化しているＤＮＡメ
ッセーノの転写および翻訳を支配する部分に関して適切
に挿入することによって得られた発現ビヒクルは、挿入
した遺伝子か暗号化しているポリペプチド配列を実際に
生産するのに、また、発現の工程にとって、ａ用でｄ５
ろ。生産物は宿主細胞を溶解して該細胞内から得るか、
または分泌型生産物の場合には培地から得、しかる後適
当な精製法により不純物中から回収゛４′ることがてき
ろ。 魚吸Δ髪性 本発明は、組換えＤＮＡ技術を使用することにより、商
業化にとって必要な作業である動物実験および臨床実験
を開始し、行うのに充分な量の形質転換発育因子−α（
ＴＧＦ−α）前駆体を得ることに成功したという発見に
基づいている。Ｔ Ｇ Ｆ’ −α前駆体およびそのフ
ラグメント（特に成熟ＴＧＦ−αを乙含む）（所望によ
りヒト形質転換発育因子−βを併用する）は、例えばヒ
トにおけろ骨疾徹の治療および損傷の治癒の促進にｆイ
用である。加えて、Ｔ Ｇ Ｆ−αは細胞培養の補助剤
として乙用いることかでき、その様にして培地中の自涜
の必要量を減少しくその結果、精製か何）りとなる）、
細胞培養内での細胞の増殖を刺激し、増大させることか
できる。また、ＴＧＦ−α前駆体およびそのフラグメン
トの大組生産により、新生物その他の疾ｊ、ｌを診断す
るための、体液中のＴＧＦ−α前駆体およびそのフラグ
メントの分計用試薬の製造か可能となる。 ′ｒ Ｇ Ｆ ｎ ＋ｉｉｉ駆体の完全なヌケレオチ
ドおよび対応するアミノ酸配列を第３図に示す。該前駆
体す）様々な主領域を同定するために、便宜上、３個の
ポリペプチド、即ち、成熟ＴＧＦ−α（第３図において
、残基４０から８９までの、枠で囲んだ部分）、残基９
０〜１６０（主要部はＣ１ｎ９１１からＶａ１１６０ま
での６２残基からなるポリペプチド）のＴＧＦ−α末端
ポリペプチドであって、本明細書中てはＴＧＦ−αＣと
弥するもの、並びにＭｅ目ＤりらＡｌａ２２までのＴＧ
Ｆ−αＮ末端ポリペプチド（ＴＧＦ−αＮ）、を定めた
。従って、ＴＧＦ−α１ト１駆体は成熟ＴＧＦ−αを含
むＴＧＦ−α担持ポリペプチドであり、ＴＧ’Ｆ−αと
その正常な非翻訳間ｐＨとの融合によって得られるしの
である。更に、便宜上、本明細書中ではＴＧＦ〜α而駆
体お面びそのフラグメント（成熟ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−
αＣおよびＴＧＦ−αＮを含む）を総括的にＰＲＴＧＦ
−α種（ｓｐｅｃ １ｅｓ）と呼称ｆる。ＴＧＦ−ａと
言うときは成熟ＴＧＦ−αを意味することとする。また
、特に明記しない限り、ＰＲＴＧＦ−α種という語句は
、以１・に、より詳１．＜述へる様に、アミノ酸配列の
突然変異体の様なＰＲＴＧＦ−α種誘導体をも包含する
ものとする。本発明に包含される他のＰＲＴＧＦ−α種
フラグメントはＴＧＦ＝αＣと成熟’ｒ Ｇ Ｆ−αか
ら成るらのである。このポリペプチド（ＴＧＦ−ａｍｃ
と呼称）は、残Ｍ２０〜＋６０の間であって、ＴＧＦ−
αＮ配列は信号としてのみ機能し、内質細網での処理の
間にＴＣＰ−ａｍｃから切離されると思われるので、該
ＴＧＦ−αｍＣは吐乳類細胞内でのＴ Ｇ Ｆ−α前駆
体の発現の初期生産物であると信じられいてる。細胞内
での処理には幾分、変異があるので、これらの主領域は
インビボにおいては、アミノまたはカルボキノ末端と表
現される正確な状態では見出すことができないで李ろう
。 ＰＲＴＧＦ−αフラグメントは通常、（ａ）一般にＰ
ＲＴ Ｇ Ｆ−αと共に何らかの生物学的活性、例えば
抗体交差反応またはアンカレッジ・インディペンダンス
の誘導、を表し、（ｂ）ＰＲＴＧＦ、αと実質的に相同
（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）な領域を存し、そして、（Ｃ）少
なくと６５個、通常は１０〜１３０個のアミノ酸残基の
長さを有する。 本発明は、これまで同定されていなかった、ＴＧＦ−α
Ｎおよび１’ＣＦ−αＣの如きＰＲＴＧＦ−αのポリペ
プチドフラグメノトを分析する方法を提供する乙のであ
り、更に詳しくはこれらの配列の部分を包囲または包含
している他のペプチドの妨害を受けることなく分析を行
う方法を提供するしのでめろ。 本発明により、ＰＲＴ’ＧＦ−α種のアミノ酸配タリを
知ることかできたので、予め決定されたＰＲＴ Ｇ Ｆ
−α唾のアミノ配列に対する抗体を生産さけろことか初
めて可能となったのである。ＰＲＴＧＦ−α種フラグメ
ント（ＴＧＦ−αを除く）を示すアミノ酸配列はタンパ
ク質と免役学的な共役関係で結合し、従って動物に免疫
を付与するのに用いられろ。その様な抗体はｒ’ｎＴＧ
Ｆ−α種に特異的なイムノアッセイや受身免疫療法にお
いて有用でるる。 また本発明は実質上純粋なＰｌで１’ＧＰ−α種であっ
て、１ｆｆｉ常、非組換え細胞雰囲気トては０１（ｊＬ
。 ている不純物等を含まないＰＲＴＧＦ−α種を提供する
ものである。その様な不純物は天然に、正常な状態でＴ
ＧＦ−α七−緒に見出される物質、例えば、細胞内では
細胞滲出物や体液、さらにヒト血清アルブミン、ガンマ
グロブリノ、リポタンパク質、並びに表皮性発育因子（
ＥＧＦ）を含む発育因子等である。ＰＩｔＴＧＦ−αＦ
ＩｉＤＮＡの供給椋から得られる他のタンパク質ら本明
細書中に示すＰＲＴＧＦ−α種の組成物中に存在し得る
ものであり、それらは、例えばＴＧＦ−βおよび血小板
誘導性の発育因子（Ｐ Ｄ Ｇ Ｆ ）であるか、ここ
では、これらは予め定めた量、存在することになろう。 例えば、非ヒト細胞内での組換え細胞培養により、１出
のヒトタンパク質を全く含まないＴＧＦαを牛ｉｒする
ことができるからである。 本発明はまた、Ｐ Ｉｔ １” Ｇ Ｆ ａ性を暗号
化したＤＮＡを発現可能なして有する組換Ｄ Ｎ Ａ発
現ヒヒクル、その槌なりＮＡで形質転換した微生物の株
または細胞倍径、・■びにそれら形質転換された菌株よ
ｌ−は培貢物であ−で１月じｌ’ Ｇ ｌ”−α種を生
産することができろ微生物または細胞培養、を鴇供する
ことを目的とするしのである。さらにまた本発明は、組
換え発酵法により、該微生物および！ｌＩ胞培毘内でＰ
ＲＴＧＦ・α種を製造する方法を提（共することを目的
とする乙のである。 本発明に係るＤＮＡはＰＲＴＧＦ−α種を暗号化してお
り、組換えられた、または形質転換された培養物中で発
現することにより、ＰｒｔＴＧＦ−α種を大量に与える
。Ｐ Ｒ’ｒ Ｇ ｆ’ ａ種合成細胞からの５ＲＮ
Ａの逆転写によって得られるｃＤＮＡはイントロン（介
在配列）を含まず、また、このＤＮＡの供給源にとって
ホモローガスな他のタンパク質を暗号化している如何な
る非翻訳領域をも含んでいないので、上記のＤＮＡは新
規なものといえろ。 ＰＲＴＧＦ−α種を暗号化している染色体ＩＴ）ＮＡは
、ゲノムＤＮＡライブラリーを、ＰＲＴＧＦ−α種を暗
号化しているｃＤＮＡでプローブすることにより得られ
るヵ染色体ＤＮＡは、それ自身の通常な染色体雰囲気を
１杓ない状聾で得られろ。 従って、それは、ヒトＴＧＦ−α前駆体のゲノム暗ぢ配
クリには６個の明瞭なエクソンか含まれている故に、最
初のエクソンの５゛末端より上流の非翻訳領域、あるい
はゲノムＤＮＡの供給源にホモローガスな別のタンパク
質を暗号化している最後のエクソンの３°末端から下流
の非翻訳領域を含まないがイントロンは含むことになる
。その様なりＮＡは本明細書中で述べる様に、哺乳類の
細胞を形質転換し、ＰＲＴＧＦ−αを生産するのに有用
である。 単離したＰＲＴＧＰ−α種のＤＮＡはヌクレオチドの置
換、欠失または挿入（ヌクレオチドの置換の場合には暗
号化されたアミノ酸配列を変化しないことを要すン４こ
よって容易１こ修飾され、その結果、ＰＲＴＧＦ−αを
暗号化している新規なりＮ、Ａ配列または、その配列上
の突然変異体を得ることができる。アミノ酸配列を変え
ずに修飾を施されたＤＮＡ配列は、選択した宿主−ベク
ター系でのＰＲＴＧＦ−ｇ発現を高めるのにａ用である
（ｆｐ４入ば′ヒト コドンをｆｔ′ｔＲの宿主細６〕
ことって好ましル＾コドンに突黙変ｉｌさせた場合）。 これらの新規なりＮＡ配列またはその７ラグメントをラ
ベル（標識化）Ｌ、ＰＲＴＧＰ−α種を暗号化している
遺伝物１ｔ（Ｄ Ｎ Ａまたは＊ＲＮＡ）のへイブリダ
イゼーシプン（雑種分子形成）分析に用いろ。 ＰＲＴＧＦ−ｔｔＭ（ＤＩＪ１ｔｉ方法ハ、ＰｒｔＴＧ
Ｆ４種を暗号化しているＤＮＡをＦＭ製可能（再生産可
能）なベクターにライゲート（結合）し、このベクター
を用いて宿主細ｌａを形質転換し、この宿主細胞を培養
して該培養からＰＲＴＧＦ−αを回収する工程からなる
。この様にして製造することのできるＰＲＴＧＦ’−α
種には、ＴＧＦ−α前駆体およびそのフラグメント（’
ｌ’Ｇｌ？−αＣおよびＴＧＦ−α等）、並びにその誘
導体、これには以下の各物質が含まれろ：（ａ）Ｐ Ｒ
Ｔ Ｇ Ｆ −α種（成熟Ｔ Ｇ Ｉ” ・αを含む）
か、ヘテロローガスなタンパク質またはポリペプチドと
、ＴＧＦ−αのアミノおよび／またはカルボキン末端の
アミノ酸の位置で、ペプチド結合を介して結合してなる
、−合タンパク質、（ｂ） Ｉまたは１以上のアミノｓ
＠ｇの挿入または置換によるＰＲＴＧＦ−α種の突然変
異体および（Ｃ）上記の融合物質、フラグメント類また
は突然変異体等の、メチオニルまたは修飾したメチオニ
ル（ホルミルメチオニルまたはその他の保護メチオニル
）のアミノ末端付加誘導体、が含まれろ。 ヘテロローガスな分泌型リーダー配４１（通常、所望の
宿主微生物にホモローガスなタンパク質から得られる信
号）と機能的に結合している、ＰＲＴＧＦ−α種を暗号
化したＤＮＡを含むベクター類を宿主細胞の形質転換に
用いる。得られたＰＲＴＧＦ−α種融合物で宿主細胞を
処理することによって、アミノ−末端メチオニルまたは
保護メチオニルを含まないＰＲＴＧＦ一種が分泌される
。 アミノ酸配列以外の変異に係るＰｒｔＴＧＰ−α誘導体
ら本発明の範囲に含まれる。その様な誘導体は化学的な
成分との共有または凝集的な会合によって生成されてい
ることが特徴である。この誘導体は通常３クラスに分け
られる。塩類、側鎖ま１＝１未喘’Ａに対・するＪ（イ
１結合的な修飾産物、並びに吸着によるコノブレックス
である。 ｒ’ ＲＴ Ｇ Ｆ−α種か直接、組換え原核生物の培
養物中に蓄積された後（原核生物の信号配列との融合物
以外の形で）、それらを、水不溶性の屈折性の物体とし
ての物理的な形状または、変性に対するかなりの安定性
、のいずれかに基づいて池のタンパク質から分離する。 通常、原核生物培養物から不溶性の物質を回収し、この
不溶性の細胞汚物から屈折性の物体（ＰＲＴＧＦ−α種
を含む）を分離し、次いでこの屈折性物体を可溶化する
。タンパク質の適切なホールディング（再屈折）を増大
させるために、上記の段階の後にグルクチオン処理を適
宜、行ってらよい。組換え真核生物細胞からのＰＲＴＧ
Ｆ−α種は水溶性であるため再溶解を要しない、この場
合は、従来天然起源からＰＲＴＧＦ−α種を単離するの
に用いられていた常法に従って精製する。 組換え細胞の培養物から精製したＰＲＴＧＦ−α種を治
療に使用するために、生理学的に無毒な安定剤および賦
形剤と合わせ、凍結乾燥し−ζ坊ヒノに入れた投与剤形
にＪＡＩ製するか、または好ましくは水性製剤中に貯え
る。後とのことは、ＰＲＴＧＦ−α種が分子中に優勢な
ジサルファイド結合を有しているために熱変性に対して
極めて安定である故に可能となる。別法として、ＰＲＴ
ＧＦ−α種をポリマーマトリックス中に組込んで、埴込
み投与するか、外科的部位の上に取り付け（例えば包帯
中）、そのことによってＰＲ′ｒＧＦ ａ任か局所的に
高い濃度勾配で好期に放出される様にすることかできる
。 ＰＲＴＧＦ−α種−含有組成物は、動物、特に組織の増
殖の促進を必要とする＠青、に治療ａ効量を投与される
。適当な用量は治療に係る技術者にとって自明であろう
。 図面の説明 第１図はヒトＴＧＦ−α前駆体に関するＤＮＡ配列を検
出するためのハイブリダイゼーノジンプローブとして用
いられるオリゴヌクレオチドの配列式を示す模式図であ
る。 第２図はヒトｌ″ＣＦ−αの最初の３３個のアミノ酸を
暗号化しているエクソンを含む、プラスミドｐ′ｒＧＩ
”α１５−１ＣＩ′）１８０ｂｐｓａｕ３Ａフラグメン
トのヌクレオチド配列を示す模式図である。 推定のアミノ酸配列も示されている。大文字で示しに配
列はＴＧＦ−αボリベプヂドの部分であり、小文字でタ
イプしたらのは１１１１駆体中の前記ＴＧＦ−αのアミ
ノ酸配列を示している。矢印はｃＤＮＡ配刈と０比較で
決定した介在配列の受容および供与部位であることを示
している。幾つかの過当な制限部位か指摘されている。 第３図はプラスミドｐＴＣｉＦ Ｃ１中に含まれている
ＣＤＮＡのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列
を示す模式図である。ｃＤＮＡの両側はＧ−ＣテールＱ
ａｉｌ）と接している。ライン上の数字は、単一のメチ
オニンがＮＨ２−末端を構成すると推定した場合のアミ
ノ酸の位置を示している。 ＴＧＦ−αのアミノ酸配列は枠内に囲まれており、その
両側は、Ａｌａ−Ｖａｌに富む配列（オーバーラインで
示した残基）と結合している。幾つかの適切な制限部位
が指摘されている。 第４図はプラスミドｐＴＥ１．２．３．４，５．６゜７
．８の組立て経路を表した模式図である。 第５図はＴＧＦ−α発現プラスミド、ｐＴＥ５およびｐ
ＴＥ６を表す模式図であって、ＴａＦ−α融合タンパク
質のアミノ酸の連結部をも示している。 第６図は発現プラスミドｐＴＥ２、ｐＴＥ３、ｐＴＥ５
またはｐＴＥ６を含む、Ｅ、ｃｏｌｉの全細胞溶解物の
５ＤＳ−１３％ポリアクリルアミドゲル（７９）による
電気泳動の結果を示す状態図である。 矢印はＴＧＦ α融合タンパク質を示す。右側の値はタ
ンパク質マーカーの位置を表す。 第７図は酸−エタノールー法で豊富にした細菌性の短い
ＴＧＦ−α融合タンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上の状態図である。このゲル内で、６８残基のＴ
ＧＦ−α融合タンパク質は幅の広いバンド（矢印）とし
て移動した。右側の値は参考用のタンパク質マーカーの
位置を示している。 第８図はラノオリセプターアッセイにおける細菌ＰＩＴ
Ｇ Ｆ ｔχの短い融合タンパン質と１Ｉ５１−ラヘ
ルＩ＞ ＣＦとの競合状聾を１１−４−グラフであり（
実線）、文献記載（５，１４，２７）の方法に従って行
い、図式的に表しＬものである。ＥＧＦで得られｆコ倹
量線は岐線で示されている。第８Ｂ図はＥＧＦ倹黴線を
示す。縦軸は１１５ （ラヘルＥＧＦと細胞との結合を
示している。 第９図はネズミＥＧＦ、および臭化シアンによる開裂の
＋ｉｉＬ ｉＵにおける細菌性１’ Ｇ Ｆ α融合タ
ンパン質の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフて（’
５る。この分析実験はヒトＴＧＦ−βの存在下、ＮＨＫ
細胞、クローン４９Ｆを用いて文献記載の方法（１４）
に従って行なわれた。縦軸は８５０μｍ２以上のコロニ
ーの数を、横軸はＥＧＦまたは細菌性Ｔ Ｇ Ｆ−αの
濃度であって、ＥＧＦ内で求めた如く、ＥＧＦ当１ｋ（
ｎｙ／ａジ）として、それぞれ表されており、実線は臭
化シアンで処理する前（白丸）または後（黒丸）の細菌
性ＴＧＦ−α融合タン融合タンパ重質結果を示している
。 第１０図はＴＧＦ−αの酵母内での発現のためのプラス
ミド、Ｉ）ｙ ＴＥ ２の役弐図で、ｊうろ１．このプ
ラスミドはＴＧＦ−α配列（斜線）と、それに先１ｊし
、α−因子プ［１モ〜ターの転写コントロール下にある
α−因子（ＭＦ α）プレプロ配列とを有する。 このＴＧＦ’−ｃｉ配列の後方には“Ａｂｌｅ”遺伝子
の３゜非翻訳領域およびポリアデニル化信号（枠で囲ん
だ部分）かある。ＴＲＰ Ｉは酵母内で選択マーカーと
して機能する。酵母内での転写は、２μの転写起源の存
在により確実となる。ＡＰＲ・アンピノリン耐性。α−
因子プレプロ配列とＴＧＦ α配ダ１１との連結（ｊｕ
ｎｃｔｉｏｎ）部分はプラスミド地図の右側に示されて
いる。 詳細な説明 本明細書においては、ＰＲＴＧＦ−α種を、第３図に示
したＴＧＦ−α前駆体のアミノ酸配列に相同（ホモロノ
ー）で、機能的なアミノ酸に係る本質的な領域、または
そのフラグメントを有している、ＥＧＦ以外のポリペプ
チドである、と定義する。候補（ｃａｎｄｉｄａｔｅ）
ポリペプチドは、該侯捕内の残基の内、約３５％以上が
、保存的（コンサーバティブ）なアミノ酸置換またはき
ずの導入を行イつなくとらＰＲＴＧＦ−α種配列内の配
列と対応している場合には、本明細書中で定義したＰＲ
ＴＧＦ−α種と実質上ホモローガスであるとする。 候補ポリペプチドは通常、その様な機能的ホモロノーに
加えて、それ自身が相同である、ＰＲＴＧＦ−α幡と共
通した生物学的活性を表すことができろ。 あるポリペプチドをＰＲＴＧＦ−α種の定義範囲に入れ
るのに必要なアミノ酸配列におけるホモロノーの程度は
、該候補タンパク質とＰＲＴＧＦ−α種との間のホモロ
ノーかＰＲＴＧＦ−α種の生物学的活性に関与している
領域、即ち、（ａ）標的細胞内での形態学上の変化の誘
導、（ｂ）非組換え供給ねで起こりｉする様な、ｒ’
Ｉｔ ’ｒ Ｇ Ｆ−α種に対する抗血ｌ、′？の免疫
学的交差反応、または（Ｃ）細胞表面の受容体との結合
、にとって臨界的な領域内であるか否かによって種々変
化し、定義範囲に含まれるＬめには高度のホモロノーを
示す必要があり、これらの機能の維持と無関係な配列の
場合には、比較的低いホモロノーを示すことになる。加
えて、らし機能的に同様なアミノ酸側鎖を含有する残基
が置換されても、臨界的な領域がこれらの機能のＩまた
はそれ以上を表すならば、本明細書で定義するホモロー
ガスに属することになる。機能的に同様であるというこ
とは、側鎖に優勢な特性（例えば塩基性、中性、疎水性
または酸性）、または立体的な塊（ｂｕｌｋ）の存在ま
たは不存在を指す。 通常、ＰＲＴＧＦ−α種と定義されるポリペプチドは、
図３で示したタンパク質またはそのフラグメントと、少
なくとら約１０ないし２５個のアミノ酸残基からなる連
続した領域にわたって実質的にホモローガスな領域を含
むものである。 あるポリペプチドがＰＲＴＧＦ−α種であることを確実
に同定する上で重要なファクターは、それと対応する非
組換え体と実質上結合し得る抗血清が、問題のポリペプ
チドの活性とし結合し得るということである。しかしな
がら、免疫学的な同一性とそれ以外の生物学的活性に関
する同一性とは、必ずしも同し範囲内であることを必要
と乙ない、とい・〕ごとは理解できるであろっ。例えば
、第３図の成熟Ｔ Ｇ Ｆ αの受容体結合活性に対
する中和抗体は、それが成熟ＴＧＦ αの活性にとって
臨界的な部位に特異的に結合することを目的として生し
たらのでないので、候補タンパク質と結ｆｆｉ Ｌ ’
ｊいかししれない。むしろ、この抗体は無害な領域に結
合し、その中和効果を立体障害によって表しているのか
らしれない。従って、その無害／、Ｌ 領域で突然変異
を生した蚊Ａｌｉタンパク質は中和抗体と結合しないか
、それにらがかわらず、このタンパク質は実質的なＴＧ
Ｆ−αホモロジー、という意味においてＴＧＦ−αの定
義範囲内に含まれることになる。 生物学的な活性に関して“可能な（ｃａｐａｂｌｅ）”
という語句は、酵素的加水分解を受けて、チモーゲン類
似の不活性な状態から、所望の生物学的活性を表すポリ
ペプチドフラグメントに変換され得るポリペプチドであ
ることを意味する。通常、不活性な前駆体は、ＰＲＴＧ
Ｆ−α種タンパク質のいずれか一方の末端にヘテロロー
ガスなタンパク質またはそのフラグメントがペプチド結
合を介して結合している融合タンパク質である。このペ
プチド結合の配列は、インビボ、またはイノビトロでの
製造工程の一部としてのタンパク分解的加水分解に対し
て感受性を有する様、選択する。 ＰＲＴＧＦ−α種は、通常ヒトＰＲＴＧＦ ａ唾を色
味するが、上記のホモローガス領域に関する居準と合致
する限り、ネズミ、ブタ、ウマまたはランの如き供給源
から得られたＰ ＲＴ Ｇ Ｆ α種らＰ Ｉｔ Ｔ
Ｇ Ｆ−α種の定義範囲内に含まれるものである。し
かしながら、あらゆる場合において成熟ＴＧＦ−αはヒ
トＴＧＦ−αを意味する。 ＰＲＴＧＦ−６種因子の誘導体もこの語句の範囲内に含
まれる。誘導体には、アミノ酸配列の突然変異体、グリ
コンル化された変種、並びに他の化学成分との共有結合
または会合による複合物等が含まれろ。共有結合成形誘
ｑ体は、ＰＲＴＧＦα種アミノ酸側鎖に見出される基、
またはＮ６＋）るいはＣ末端と、機能的な成分との結合
によって製造される。これらの誘導体には、例えば以下
、）乙のか３よれろカルボキノ末端またはカルボキン側
鎖を含む残基（例えばａｓｐ３２または４９）の晰肪族
エステルまたはアミド誘導体；ヒドロキノＪＪ−含有残
基（例えば５ｅｒ３１ 、５ｅｒ３．５ｅｒ４２．５ｅ
ｒ１５６または５ｅｒ９４）の０−アシル誘導体；およ
びアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば
リジンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体。 アノル基を、アルキル類（Ｃ３〜ＣＩＯの直鎖アルキル
を含む）の基から選択することにより、アルカノイル種
が生成され、炭素環式または異項環式化合物を選択する
ことにより、アロイル（ａｒｏｙｌ）種ｎ・生成されろ
。反応性の基は、それ自体が反応性の側鎖を介して不溶
性のマトリックスを形成し、ン差結合タンパク質として
用い得る様な二機能性・）化合物であることか好ましい
。 共有結合または会合性の誘導体はイムノアッセ（ｆ：ｊ
ＬＩよアフィニチイ精製法における試薬として自゛用で
ある。例えば、ＰＲＴＧＦ−α種は、自体周′ｆｉ＋の
方法で、臭化ンアンー活性化セファａ〜スに共ａ結合さ
Ｕて不溶化することにより、またはポリオレフィンの表
面に（グルタルアルデヒ！・交差結合の存在または非存
在下で）吸着させることにより、抗−ＰＲＴＧＦ−α種
抗体または細胞表面の受容体を分析または精製するのに
用いることができる。また、ＰＲＴＧＦ−α種を検出可
能な紙でラヘル（例えば、クロラミンＴ法による放射性
ヨウ素化、希」１類キレートとの）（何結合、または池
の蛍光物質との兵役）し、診断的な分析法、特に競合型
イムノアッセイによる生物学的資料中のｌ） ＲＴ Ｇ
Ｆ−α種しベルの診断に用いることができる。 １’ ＣＦ −ａ ＮおよびＴＧＦ−αｃはＴＧＦ α
前駆体の一部に対する抗体を精製さＵｏるので、免疫源
（単独またはへテロローガスなタンパク質との免；ン学
的な複合タンパク質として）として有用である。ＴＧＩ
−α前駆体を成熟ＴＧＦ α、ＴＧＦαＮおよびＴＧＦ
−αＣから識別するための両側サンドウィッチ法による
特異的受容体結合分ＦＬにおいては、分析に先立ち、ま
たはその途中で抗−Ｔ Ｇ Ｆ−αＮ抗体を固定し、肢
検試料を抗体と）１、にｒンギ、１ヘ トし一ζ１記１
１１１駆体をそれと結合させ、次いでこの結合した前駆
体を抗−ＴＧＦ−αＣとイノキュヘート４゛る。この抗
−ＴＧＦ−αＣはインキュベーンコンの前に例えば放射
性ヨウ素でラベルするか、または後に、この抗−ＴＧＦ
−αＣか高められている種のＩｇＧに向けられた標ＪＩ
ｇＧとイノキュヘートする。 予め定められたＰＲＴＧＦ−６種フラグメントに２．＋
、＋゛る抗血清は、そのフラグメントをアオガイのヘ
モンアニノ（ＫＬＨ）または血７１１アルプミノの如き
免疫原性タンパク質と、グルタルアルデヒドや無水コハ
ク酸塩の如き共有結合剤を用いて交差結合させ、マウス
またはウサギ等の適当な動物に通常の賦形剤と一緒に皮
下注射して免疫を付与し、必要ならば追加抗原刺激を行
い、しかる後抗血清を回収することにより、得ることが
できる。モノクローナル抗体は、免疫を得たマウスの牌
細胞から、通常の方法（例えばＥＢウィルスまたは細胞
融合による不死化）によって調製される。 成熟ＴＧＦ−αの妨害を受けずにＴＧＦ−αＣまた（よ
ｉ’ Ｃ，Ｆ αＮを測定するには、Ｔ Ｇ Ｆ
α０支たは゛ｒＧＦ−αＮ分子の相反する末端の、予め
定められたフラグメントに対する抗血清を高め、この様
にして得られた２個の抗血清を用いて’ｒ Ｇ Ｆ −
α１１り躯体に関して記述した如くサンドウィッチ法で
分析する。例えば、ＴＧＦ−αＣの場合ならば、式（Ｃ
ｙｓ）ａＡｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐ
ｒｏ ５ｅｒＡｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｒｇ ＴｈｒΔ１ａ（Ｃｙｓ）ｂ（
式中、ａまたはｂのいずれが一方（両方ではない）はｌ
である）で示されろ配列をＫＬＨとジスルフィド結合を
介して共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させ、この共役結合
物によってウサギを免疫化する。 抗血清をとり、保存する。同様に、ＫＬＨと結合したＴ
ＧＦ−αＣ配列、Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｔｒ
ｐＣｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ａｒｇに対し、ｐＨ６において無水コハク
酸を用いてウサギを免疫化する。これら２つの抗血清は
競合的な、またはサンドウィッチ法に基づくイムノアッ
セイにａ用である。別法として、全ＴＧＦ−αＮまたは
ＴＧＦ−αＣポリペプチドに対してウサギを免疫化し、
３ポリペプチドを分析・４°る丸めの２つの抗血清を、
それらが互いにＴＧＦ−αＮまたはＴＧＦ−αＣとの結
合に際して競合的に阻害し合わない、ということに基づ
いて選択する。競合的に阻害する抗血清は、それに対ず
ろ抗血清が高めらイ１ているフラグメントを囲むタンパ
ク質と、該フラグメントとの識別が容易でない場合に、
このタンパク質を競合的に分析するのにｑ用である。Ｔ
ＧＦ−αｍＣは、尿の如き体液試料を使用し、ＴＧＦ−
αＣ抗体の内の１つと、抗−成熟ＴＧＦ−α抗体とを共
に用いて行う連続的な、あるいは同時の、サンドウィッ
チイムノアッセイにより、最も好都ａに分析し得る。 １） Ｒｉ’ Ｇ Ｆ−α種には、天然の対を遺伝子性
の変異かｑ在し、あるしのから池への変異が起こるとい
うことが理解されよう。この様な変異は１まｆ二はそれ
以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入によって示され
る。池の突然変異体は、ＰＩｔＴＧＦ αｆｉＤＮＡに
おけるサイト指令（配向）性の突然変異により生成され
た、Ｐ ＲＴ Ｇ Ｆ−α種の定められた形での変異体
である。 サイト指令性突然変異の目的は、より改善された特性お
よび活性を表すＰＲＴＧＦ α種の暗号１） Ｎ Ａ
を組立てることにある。突然変異体ＰＲＴＧＦ−α種と
は、それが欠失、置換または挿入のいずれかの原因でＰ
ＲＴ Ｇ Ｆ−α種のアミノ酸配列と異なる配列を有
するという点を除けば、前述のＰＲＴＧＦ−α種とのホ
モロジーに関する定義にあてはまる様なポリペプチドを
指すしのと定義する。例えば、第９６または９７位のり
ノン残基かヒスチジンまたは他のアミノ酸残基に突然変
異的に置き換われば、このタンパク質はもはやこの位置
でタンパク分解的に開裂されろことはない。 同様に、システィン・１７．５５．６０．７１．７３お
よび／または８２はセリンに置換され得るし、Ｐ ＲＴ
Ｇ Ｆ−αのカルボキシまたはアミノ末端は欠失され
得る。突然変異体はＰｆｌＴＧＦ−α種の生物学的特性
の全てをａする必要はないが、ＰＲＴＧＦ・α種の抗体
と交差反応を行い得るエビトビツク部位（抗原決定部位
）を少なくとら１個は保１、’Ｊｌていることを要１１
°１゜ 本発明におけるＰＲＴＧＦ−α種突然変異にお：する突
然変異部位は予め決定されているので、本質的な突然変
異部位を０１１らって定め）てお、ぐ必要はない。例え
ば、４・７１．５．５・、６０．７１．７３まｒ二：：
ｊ、 ｔ ２位での突然変異を適切に実行するために、
ノスティノコドンの位置で無作為な突然変異の誘ｔ’−
Ｘ＠・し、発現したＰＲＴＧＦ’−α穫突然変異体を生
物学的な活性と原核生物！ｒ）槻胞内条件との適合性（
町ち直接発現での溶解性）との鏝適な組合ｈ・せに関し
てスクリーンする。既知の配列を有するＤ Ｎ Ａ内の
予め定めたｔＩ５位に置換的な突然変異を生成させる技
術は良く知られている（ＩＦｌえばＭ１３プライマーの
突然変異生成）か、本発明のサイズの小さいＰＲＴＧＦ
−α種により、予め定めた突然変異をＨする所望のＤＮ
Ａを化学合成することが容易となる。 突然変異の誘発は、通常約１〜ＩＯアミノ酸残基数のア
ミノ酸を挿入、あるいは約１〜３０のアミノ酸残基数の
アミノ酸を欠失させることにより実施される。ｋ３ Ｇ
ち的へ組１λ−ζに１゛ろために、ｐ”ｉ′換、欠失、
挿入あるいは一次的な併用（ｓａｂｃｏｍｈｉｎａＬｉ
ｏｎ）等を組合わＵ・ろことかできる。挿入にはアミノ
またはカルボキン末端での融合（例えば成、′７！ＩＴ
ＧＦ−αのＣ−またはＮ−末端に疎水性の延長部分を付
加する、こと）をも含Ｇ゛。明ら・かに、暗号化された
Ｄ・Ｎ、 Ａ内（で０突然変異′におい・では、配列が
解読フレームの・外部に位置″してはならず、また、ｍ
１１ＮＡの・二次構造を生ぜしめるおそれのある相捕的
な領域をａｌｌ造する乙の・でないことが・好ましい。 ＰＲＴＧＰ−α饅を暗号化しているＤ′ＮＡにおける突
然変異のすべてが最終生ｇ：物を構成するものではない
。例えば、ＤＮＡの挿入＃Ｔ突然変異体の主な種類は、
ヘテロローガスな分泌型リーダー、または信号、がＰＲ
ＴＧＦ−α種のＮ末端に結合した乙のである。別法とし
て、本発明においては、非分泌型へテロローガスポリペ
プチドとのＰＲＴＧＦ−α種のＮ末端における融合を、
例えば臭化シアンまたは酵素を用いてその様なポリペプ
チドをＰＲＴＧＦ−α種から切り離して非メチオニル化
１）１じｒＧＦ α種をｉｒＪろ、という目的の場合
に行っことを考慮している。例えば、原核生物での発現
ベクターを組立てる場合には、Ｅ、ｃｏｌｉアルカリ性
ホスファターゼまたは熱安定性エンテロトキンン■リー
ダーをＰＲＴＧＦ−α種配列の５゛位に、その解読フレ
ーム内において配する。酵母インバーターゼ、アルファ
因子または酸ホスファターゼリーダー類も同様に非メチ
オニル化ＰｒｔＴＧＦ−α種の酵母内での発現に用いる
ことができる。 しかしながら、天然のＴＧＦ−α前駆体の分泌型リーダ
ーはそれ自身の供給源である細胞以外の宿主（より高等
な真核生物の細胞培養において、最らぎり得ることだカ
リによって認識されるかもしれない。分泌型リーダーか
宿主によって“認識”されると、ＰＲＴＧＦ−α種とリ
ーダーから成る融合タンパク質は、通常、ＰＲＴＧＦ−
α種と問題の信号（これはＰＲＴＧＦ−α種を分泌させ
るよう導く）とが結合しているペプチド結合の位置で開
裂される。かくして、突然変異ＰＲＴＧＦ−α種ＤＮＡ
を宿主の１３質転換に使用し、かつ中間体として突然変
異体ｐｒｃｌ’ｌじｌ’Ｇｌｉ’α種（融合物）／Ｊ”
１成されたとしても、得られるＰＲＴＧＦ−α種は融合
物ではないことになる。 本明細書において、形質転換発育因子−β（ＴＧＦ−β
）とは天然に存在するＴＧＦ＝βの表現型（例えば、’
ｒ ｃ ｒｘ−αまたはＥＧＦ（表皮性発育因子）のア
ンカレッノイノディペンダントな増殖効果を増強する）
を有する、β型の形質転換発育因子を指す。 Ｐ ＲＴＧ Ｆ−α種を暗号化しているＤＮＡは、蛍光
性基、放射活性元素または化学発光性基の如き検出可能
な物質により、自体周知の方法で共有結合的にラヘルさ
れる。しかる後、これを通常のハイプリダイゼーノヨン
（雑種分子形成）分析に用いる。この分析法は、実施例
で述へる如＜ＰＲＴＧＦ−α種ベクターおよび形質転換
体の同定、あるいは腫瘍細胞中のＰＲＴＧＦ−α←ｈＲ
Ｎ Ａのディチクトンとして、インビトロでの診断にｆ
り用される。 ０外なことにＰＲＴＧＦ−α種に関するＩｎ［ｔＮＡＱ
・（ｒ白はかなり、３ド１１てＪ′うろ、、その結果、
何を探し出すかを指摘されていないとｃｌ）ＮＡを見落
し弓いことになる。しかしなから、本明細吉中で開示し
た様に、一度その存在か理解され、補助ＤＮＡを完全に
入手することかｉ’＋Ｊ能になれば、ＰＲＴＧ Ｆ
ａ 種ｃＤ Ｎ Ａ／”、！？、ＮＪ ｈｌｉ 的ｒ；
配列ヲＲｔ ルフローブに用いて腫瘍細胞のｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーンすることは、日常的な操作に
すぎない。 Ｐ Ｒ′Ｉ’ Ｇ Ｆ −ａ種はＰＲ’ｌ’ＧＦ ａ種
を暗号中しているＤＮＡを含んでいる発現ベクターによ
って形質転換された宿主細胞により生成される。発現ベ
クターの中には、宿主細胞と一緒になって該ヘタター中
に含まれているＤＮＡ配列（この様な配７１１はそれを
発現させるための他の配列と機能的に結合している）を
発現させることのできる様なベクターら含まれる。それ
らのベクターは宿主微生物内でエピゾームとして、また
は染色体ＤＮＡの組込み部分として、のいずれかの形で
複製され得なければならない。一般に、発現ベクターは
環状１ン二本鎖Ｄ Ｎ Ａループのノ杉のプラスミドで
あり、ベクタ の状態では染色体と結合１−ｌ己１．プ
ラスミドかベクターとして最ら’Ｌ’ｆＩＩｌｉに用い
ら（１ているのて、本明細中では“プラスミドと“ヘタ
ター”とを相互変換的に用いることとする。しかし戸か
ら、本発明はその他の彩の発現ベクター（例えば共形質
転換ベクターやウィルス等、同等の機能を示す乙の）を
も包含するものである。 ＤＮＡ領域はそれらか相互に機能的に関連していれば、
機能的に結合しているしのとするっ例えばプレ配列（ｐ
ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌型リーダーのための
ＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタ
ノパク質として発現されるならば、ポリペプチドのため
のＤＮＡに機能的に結合しており、プロモーターは、そ
れが配列の転写をコントロールするならば暗号配列と機
能的に結合しており：リボゾーム結合部位は、それが翻
訳を行わせる様な位置にあれば暗号配列と機能的に結合
していることになる。−・般に、機能的な結合とは相接
していること、分泌型リーダーの場合には相接しており
、かつ解読相内にあることを、０味する。 ＠Ｉ換え宿゛１゛細胞とは、１記のへタタ で形質転換
された宿主細胞てめろ。既に明らかにした様に、この形
質転換によって、非形質転換宿主では、前記の如く掻く
少量、または、より一般的には検出しｉすない程少量し
か生産されなかっ）＝ ｐ ＲＴ ｃ Ｆ −α←ｌを
大量に生産することができる。その様な細胞によって生
産されたＰＲＴＧＦ αを、組換えＰ ＲＴ Ｇ Ｐ
ａ種と称する。 １ｄ主細胞の培養お上びベクター類 ここに開示するベクター類および方法は広範囲に及ふ原
核性、および真核性の微生物に用いるのに好適でのる。 勿論、原核生物が本発明に（１用なベクター類を４硫で
ろためのＤＮＡ配列のクローニングに好適であるという
ことは当ｆこり前のことである。例えば、Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ Ｋ Ｉ ２菌株２９４（ＡＴＣＣＮｏ。 ３１４４６）は殊にｑ用である。その他の使用しｉ？Ｊ
ろ微生物の菌株には、Ｅ、ｃｏｌｉｒ３およびＥ、ｃｏ
ｌｉＸ Ｉ ７７６（Ａ′ｒＣＣＮｏ、３１５３７）が
含ま−れろ。これらの例は単なる例示に１゛き゛ず、制
限的な乙のでないことは１、うよ°ζ乙ない、。 我々が行った実験では、Ｐ Ｉｔ Ｔ Ｇ Ｆ α種
配列は、通常原核細胞の細胞質に不溶性の屈折性物体と
して析出するか、原核生物らまた発現に用いることがで
きる。これらは容易に回収し、可溶化させることができ
る。上記の菌株、Ｂ、 ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｆ−λ
−１原栄養体、ＡＴＣＣ２７３２５）、並びにＢａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓの如き大腸菌類、その他
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｌｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよた
はＳ ｅｒｒａｋ １ａ１１ａｒｃｅｓｃｅｎｓの如き
腸内菌や様々なＰ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の菌株ら用
い得る。 一般に、宿主細胞に適合し得る←■から誘導されたレプ
リコンおよびコントロール配列を含むプラスミドヘタク
ーを、これらの宿主と一緒に用いる。 普通、ベクターは、複製部位、並びに形質転換細胞内で
表現型に基づく選択性を付与し１すろ標識配列を有する
。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉは一般にＥ、ｃｏｌｉ種から導
かれたプラスミドであるｐＨ１ｔ３２２を用いて形質転
換される（５５）。ｐＨ１ｔ３２２はアンピノリンおよ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を５′η（ｉ’して（・
ろ・）で、杉質転換細胞を？−１１に同定で３る７段を
提供オろらのてめろ。このｐＢｌ（３２２プラスミド、
あるいは他の微生物プラスミドはよｆ−１微生物かそ（
−Ｌ自身のタンパク質を発現さ什るｆ二めに［１１用し
得るプロモーターを含Ｃ丁シ、または、τ白（−ろ株に
食′５前Ｉされていなければならない。客■換ん［）＼
Ａ ））組立てに最ら普通に用いられるプロモーターに
は、β ラクタマーゼ（ベニンリナーゼ）およびラクト
ースプロモーター系（５３，７２，９２）並びにトリプ
トファン（ｔｒｐ）プロモーター系（６７，９３）か含
まれる。これらが最も普通に用いられる乙のでのるか、
その池の微生物プロモーターら発見されて使用されてお
り、それらの詳細なヌタレオヂド配列ら公開され、当業
者はそれらをプラスミトヘタターと機能的にライゲート
する二とかできろ（８０）。 京核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物ら用い
られる。酵母の成熟ＴＧＦ−αの発現および分泌は細菌
よりも低レベルであるが、そのポリペプチドはＥ、ｃｏ
ｌｉからの直接的な発現生産物と５′＋１な−・て弓溶
Ｙ１てど５ろ１．（“Ｅ ＋Ｊｉｔ’ｌ微１１物Ｕ）内
、Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｃｖｉｃｉ
ａｅまたは通祁のパノ酵母か最も一般的に用いられるか
、その池多改の菌株ら言過に用い得る。Ｓ ａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ内で発現させるためには、例えばプラス
ミドＹＲｐ７（８１，８２，８３）か通常用いられろ。 このプラスミドは既にｔｒｐｌ遺伝子を含有しているの
で、トリプトファン中で増殖する能力を持たない、酵母
の突然変５！４１１ｉ（例えばＡＴＣＣＮｏ、４４０７
６またはＰＥＰ ４−１ （８４））に選択マーカーを
与えろ。 酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてＬｒｐｌ障害があると
いうことは、形質転換体をトリブトフ７ノ不在で増ｈα
させることによって形質転換体を検出するのに有効な状
況か与えられることになる。 酵母用へフグ−の好適なプロモーティング配列には、以
下のらのに対するプロモーターか含まれる ３−ホスホ
グリセレート・キナーゼ（８５）まｆ二はエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−ホスホグリセレート・ムター
ゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオースホスフェート・
イソメラーゼ、ホスホ′！ル：Ｉ ス・イツメラ ゼ、
グルコキナ ゼおよびα−ファクター等の他の解糖酵素
類（８６，８７）。 適当な発現プラスミドを組立てるためには、これらの遺
伝子と関連した終止配列を、発現ベクター中に、発現さ
せるべき所望の配列の３゛とライゲートさせて入れ、ｍ
ＲＮ Ａの末端、およびポリアデニル化部位を提供す
る。 その池、増殖条件によって転写がコントロールされろと
いう１１１点をざらにａ４゛るプロモーターとして、ア
ルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１
酸ボスフアタ−ゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記
グリセルアルデヒド−３ホスフェ〜 ト・デヒドロゲナ
ーゼ、並びにマルトースおよびラクトースの利用に与る
酵素類（８７）等に関するプロモーター領域か含まれる
。酵母と適合し得るプロモーター、；に製起源および終
＋Ｌ配列を含ｆ丁するブラスミトヘタターの全てが適す
る。 微生物の外に、多細胞生物から得た細胞の培養物らまｊ
−宿主として用いることかできる。培養がｉＹ Ｈ１ｉ
動物上たはＩ＋＋ｔ ＯＮｕ動物のいずれから得られた
にＵｏよ、Ｉｔｉｆ則的にはその様な細ｆｌａ１１の４
“へてか機能し得る。しかしなから、ａ准動物の細胞に
より大きい関心が寄せられており、最返ては培地（組織
倍径）中でを椎動物細胞を増殖さぜ・ろことは、通常の
操作となっている（７５）。その様なｆ１用な宿主細胞
系（セルライン）にはＶＥＲＯおよびｌ−１ｅＬａ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、並び
にＷ＋３８、ＢＨＫ、ＣＯ５〜７およびＭＤＣＫ！１１
胞系等が含まれる。その様な細胞のための発現ベクター
には、Ｉ！！ｉ當（必要ならば）複製起源および発現さ
れるべきＰＲＴＧＦ−α唾配列の１１ｑ方に位置してい
るプロモーターか、所望のりボゾーム結合部位、ＲＮＡ
スプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配
列等と共に含有されている。 咄乳類細胞内で使用するための発現ヘタター用のコント
ロール機能は、しばしばウィルス性物質によって供給さ
れる。例えば、普通用いられているプロモーターはポリ
オーマ、アデノウィルス２、および最らＶ４繁にはノミ
アンウィルス４０（ＳＶ１（））かり棉かイする。５Ｖ
ｌｌＯウィルスのす刀期および後期のプロモーターは、
いずれら該ウィルスからフラグメントとして容易に得る
ことができ、しからＳＶ４０ウィルスの複製起源を含ａ
しているので特に有用である（８８）。ウィルス性複製
起Ｈ内の、ｌｌ１ｎｄ［［１部位からＢｇ１１部位に向
けて延びる約２５０ｂｐの配列が含まれている限り、大
きいまたは小さいＳＶ４０フラグメントを用いることか
−ζさ／Ｓ、、さらに、正常な状態で所望の遺伝子配“
り４１・を伴っているプロモーターまたはコントロール
配列、を用（する、ことらでき、またしばしば好ましい
といえる。、ただし、その様なコントロール配列か宿主
細胞１系に適合性を有することを条件とする。 複製起源は、外来性の起源、ＳＶ４０その（医のウィル
ス性起源（例えばポリオ−７、アデノ、ＶＳＶ、Ｂ、Ｐ
Ｖ″Ｊ）を含ｔ、−ｔにベクターを組立てるか、みるい
は宿主Ｍｒ＠の染色体性膜製機構によって与えるか、い
ずれかの方法で付与される。もし乙ヘタターか宿主細胞
染色体に組込まれるならば、後置はしばしば充分に働く
。 ウィルス性；（３Ａ起源を含（１するｌ＼クタ を用い
「に、選択可能なマーカーおよびＰ ｒ？ Ｔ Ｇ Ｆ
α種ＤＮＡを用いた共形質転換法によ−て咄乳類細胞
を形質転換することもてきる。適当な選択ｏＪ ｔ＆な
マーカーにはノヒトロ葉酸還ｌ己酵木（Ｉ） ＩＩ Ｉ
” Ｒ）かめる。ＰｆｌＴＧＦ α種とＤ Ｉ−Ｉ
Ｆｌｌの両押をそ 。 れぞれ暗号化しているＤ Ｎ Ａ ＆！刈を含むベクタ
ーでトランスフェクトするのに好適な哺乳Ｍ宿主細胞を
選択するに際しては、用いるＤ ｌ（Ｉ” Ｉｔｌタン
パク質タイプに鎚って宿主を選択するのか適当であ、る
、。野生型・Ｄ）（・ｌタンパク質を用いる場合には、
ＤＨ・ＦＲ欠胤宿主細胞を選択するのか好ましく、かく
してヒボキサンチン、グリッツおよびチミジンを欠く選
択用培地・内で、Ｉシ足のいくトランスフェクンヨンを
選択するマーカーとして［）Ｈ’ ＦＲ暗号配列を用い
ることができる。この場合に好適な宿主細胞はＤ）（Ｆ
Ｒ活、性を欠くチャイニーズハムスターの卵巣（Ｃ，Ｈ
，Ｏ）・細胞系であって、これはＵ ｒｌａａｕｈｊ５
よびＣｋａｔｊｉ（＋ ９８０ 、 Ｐ ｒｏｃ−Ｘａ
ｔｌＡｃａｔ、 ５ｃＥ−（ｔＪ Ｓ Ａ）７７ ：、
４２ Ｌ ６ ）の方ｌ去に上−・てＡ要し、増幅さＵ
・ることかできる。Ａｌｔｌ転質はアメリカ特許第４，
３９９，２１６号に記載されている。この方法をＰＲＴ
ＧＦ−α種の合成のために、上記特許中に用いられてい
るゲノムまた：よβ−グロブリンＤＮＡを、所望により
過当な合成リンカ−類を用いてＰＲＴＧＦ−α種配列を
暗号化しているＤＮＡに置き換えることによって適用す
ることができる。 池方、メトトレキセート（Ｍ’ｒＸ）に対する結合の親
和性の低い、ＤＨＰＲタンパク質の暗号化ＤＮＡをコン
トロール配列に用いる場合には、ＤＨＦ Ｒ耐性細胞を
用いろ必要はない。何故ならば突′！へ変％Ｄ ＨＦ
ＲはＭ Ｔ Ｘ耐性であるので、宕主細ｑａ自身かＭＴ
Ｘ感受性であることを条件として、Ｍ Ｔ Ｘ含角゛培
地を選択の手段として用いることがてさろからてめる。 Ｍｌ”Ｘを吸着することのできる只核細胞の大多数は、
メトトレキセート感受性でめろと思イつれる。その様な
有用な細胞系の１つはＣＨＯ系、ＣＨＯＫｌ（Ａ１’Ｃ
ＣＮｏ、’ＣＧし６１）である。 細胞培養からＰ Ｉｔ ’ｒＧ Ｆ’ ａ樟を回収４
゛ろ方法は、それらが可溶性タンパク質または屈折性の
物体（不溶性の会合体）のいずれの杉で発現されろかと
いうことに依存する。後者は通常、バクテリア（細菌）
性発現の場合であり、大多数の細胞内タノバク質は可溶
性であるために、精製は容易である。 可溶性ＰＲＴＧＦ−α種は、もしそれが分泌型の宿主−
ベクター系で発現されれば（例えば、それが細菌または
酵母の分泌型リーダーと結合しているか、通常の信号配
列を合釘している全ＴＧＦ−α前駆体配列で形質転換さ
れたを椎動物細胞系である様な場合）、その細胞培養か
らの回収はより容易なしのとなる。 可溶性ＰＲＴＧＦ〜α種は、アルキル−セファ０−スク
ロマトグラフイー、ゲル濾過、ケル電気泳動、または、
固定化した抗体、または受容体を用いた受容体−結合ア
フィニティクロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。 Φとに投与するためのＰＲＴＧＦ−α挿合ｑ組成物は、
所望の精？Ｊ度のＰＲＴＧＦ−α種と生理、！的に；ｒ
’？ｉ Ｉ−ｆすろ担体（叩肱採用しｆこ川ｌ＋１お
よび濃度において叫毒な担体）とを混合することにＬ−
）でＪＪｉ製される。これは、通常、Ｐ ｒＦ １’
Ｇ Ｆα種と、緩衝剤、アスコルビン酸の如き抗酸化剤
、低分子量（残基数的ｌθ以下）のポリペプチド、タノ
ペク質、アミノ酸、グルコースよｆ二はデキストリフ等
の炭水化物、Ｅ Ｄ Ｔ Ａの如きキレート剤、並びに
その他の安定剤および賦形剤とを混合することて１１−
＋′ンれろ。 夫ｆこ、動物に投与するための組成物としては、ＰＲＴ
ＧＦ−α種の免疫性の共役化合物、又はＰＲＴＧＦ
α種の兵役化合物とＰＲＴＧＦ−α種に結合し得る抗体
から成るものがあり、前者は、特に診断用キットに用い
るために、抗体を高めることを目的とし、後者は抗−抗
体抗血清を生成させることを目的としている。 その様な組成物の投与経路は既知の方法に従う、例えば
静脈内、腹腔内、筋肉内、または滅菌しｒ二治療用溶液
の病巣内注入または注射、あるいは以下に述べる、時期
調整放出ノステムにより、没１ｊ４′る。 ｒ’ＲＴＧＦ−α種の組成物は植え込みか可能な、放出
時期を調整した（Ｌ ｉｍｅｄ −ｒｅｌｅａｓｅ）物
質から投与することかできる。その様な適当な系には、
例えばし−グルタミン酸とガノマエチル化−グルタミノ
酸の共重合体（Ｕ、 Ｓｉｄｍａｎら、ｌ９８３、”ｂ
ｉｏｐｏｌｙ＋ｎｅｒｓ”２２（１）：５４７〜５５６
）、ポリ（２ヒドロキンエチル−メタクリレートＸＲ，
Ｌ ａｎｇｅｒら、１９８１、”Ｊ 、 Ｂｉｏｓｅｄ
、 Ｍａｋｅｒ １ｊｃｓ、 −１５：１６７〜２７
７並びにＲ，Ｌａｎｇｅｒ、 ｌ ９３２、”Ｃｈｅ
ｗ、 Ｔｅｃｈ、 ” ｌ ２ ：９８〜＋ ０５）
またはエチレンビニルアセテート（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒら
、同上）が含まれる。この物質は、外科的部位または創
傷の上に植え込まれる。別法として、この組成物を注射
のために、半透膜のマイクロカプセルかりボゾーム内に
封入してらよい。 該組成物の投与量は、例えば投与経路、標的である疾患
および患者の状況によって左右される。 病巣内への注射においては、体重を基準とする組成物の
必要量は、静注に比べて少ないであろう。 随・て、ｌ′に師は所望の最適なｌｌＶ性が得られ、か
つ例えば標的組織の生検や診断分析によって測定し得る
様、用量を検定（ｔｉｔｅｒ）Ｌ、投与経路を修正する
必要がある。 ＴＧＦ−αは潜在的な骨吸収剤である。従ってこれはこ
の目的において治療上有用である。このものは、注射、
注入、また放出時期を調整した方法によって投与し、用
量を血漿中のカルンウムイオノ値に従って検定（Ｌｉｔ
ｅｒ）することができる：骨１１ノを収を誘導・１゛る
には高カルシウム血症をもたらず１１１槍について検定
４−る。める１、者にとっては、逆、〕治療が適合する
。その様な患者とは、がんにかかり、ある種の腫瘍の場
合における如く、ｌｌｌ１瘍細抱によるＰＲＴＧＦ−α
種の生成に伴う高カルシウム血症を発現している患者で
ある。この様な患ざは、尿、血清または可能ならば外科
的に切離して得た腫Ｉｕｌｌｌａ中に正常値以上のｉ５
度でＴＧＦ−αｆｆ１ＣまたはＴＧＦ−αｈ仔在してい
ることによって診断される。規定の治療法は、その様な
患ｎ達に抗’Ｉ” ＣＦ−α（またはその抗原−持Ｓｖ
的Ｆａｂ部分）の如きＴＧＦ α中和剤あるいはＥ
Ｇ Ｉ”受容体（またはそのＴＧＦ−α−結合性のアミ
ノ末端細胞外領域）の如きＴＧＦ−α受容体を投与する
ことを含む。その方法・χ、選択されたＴＧＦ−α領域
に対する抗血清の製造に関して前に述べた。欠いて、そ
の様な患者の高カルンウム血症を是正する抗体の能力を
注射、注入または放出時期を調整した投与法に関してス
クリーンする。別法として、ＴＧＦ−αまたは前述の如
く、その選択された領域に対して患とを免役化するごと
により、抗体を自己の内部で生成させることらできる。 ＥＧＦ受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知
である（Ａ 、 Ｕ １ｌｒｉｃｈら、１９８ ・１年
３月、”Ｎａｔｕｒｅ”３０９ ：４ ｌ ８〜４２５
）。更に、ＥＧＦ受容体はＡ４３１表皮がん細胞から得
ることができ、一般に入手できる細胞系はその表面に、
大多数の他の型の細胞の１０〜５０倍らのＥＧＦ受容体
を何する。Ａ４３１細胞はまた、細胞外に結合領域を持
つ、先端に切断された受容体を分泌する（Ａ 、 Ｕ
１ｌｒｉｃｈら、同上）。いずれかのＥＧＦ１゛／ｉ体
を、ＩＩｃ知のノｊ法（Ｍ、 ＷａＬｔ！ｒｆｉｅｌｄ
ら、！９８２”Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、
”２ ｌ Ｏ：ｌ ４９−１６１）、または当栗番周
知の同等手段（例えば、臭化ファンで活性化したセファ
ロース上に結合したＥ Ｇ Ｆに関ずろアフィニティク
ロマトグラフィーノに従−て精製オろ。それらを、滅菌
食塩水の如ご実学的に許容し得る担体中に、Ｌｌｚ入時
に遊離のＴＧＦ−αと結合して血清中のカルシウム値を
下げろＩＩな、治療１イ１°効なｉｅ１隻で含白さＵ゛
ることにより、製剤化する。治療上のａ幼性は、高カル
シウム血症の軽減、または遊離ＴＧＦ−α結合ＴＧＦ−
α比を今日、血漿中の遊離チロキノンの測定に利用され
ているイムノアッセイと類似の方法で測定することによ
り、監視する。ＥＧＦ受容体または１’ Ｇ Ｆ α
受容体（またはそのＴ Ｇ Ｆ−α結合領域）の使用は
、製造か容易でめろ点で抗体の使用より乙好ましい。し
かしながら、抗体は、それらを天？へに生した受容体よ
り乙大きい親和性に基づいて選択し１する、という利点
を存する。 採用した方法 強Ｌ！７１で手ごわい細胞壁障害のない細胞をＭ Ｉｇ
ｉｌ＋胞として用いろ時には、リン酸力ルノウム沈降法
によってトラノスフエクノヨノを行う（８９）。しかし
なから、ＤＮＡを細胞内に導入するための他の方法、例
えば核内注入またはプロトプラスト融合等、し用いるこ
とかできる。 実質的な細胞壁構造を打する原核細胞を用（・る場合の
好ましいトランスフエクノヨノ法は塩化カルシウムを用
い！ニカルシウム処理である（９０）。 所望の暗号配列およびコノトロール配列を含有する適当
なベクターの組立てには、標準的なライゲーノヨン技術
を用いる。単離したプラスミドまｌこはＤ Ｎ Ａフラ
グメントを開裂、修復し、所望のプラスミドにとって望
ましい形に１耳ライケートする。 開裂は、適当な緩衝液中で制限酵素（類）を用いて行う
。一般に、約１μ９のプラスミドまたはＤＮＡフラグメ
ントに対して、約２０μＱの緩衝液中て約１単位の酵素
を用いる。（特定の制限酵素にとって適当な緩衝液およ
び基質のへｌは製造楽音によって明らかにされている。 ）インキュベーノヨンの時間は、３７℃において約１時
間が有効であろう。インキユヘーノヨンした後、フェノ
ールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出し、水性画
分をエタノール沈殿に付して核酸を回収する。 粘着末端を必要とする場合には、調製したらのをポリメ
ラーゼＩ（クレノー）１０単位と共に１５℃で１５分間
処理し、フェノール性クロロホルムで抽出しＬ後、エタ
ノール沈殿に付す。 開裂したフラグメントのサイズ（大きさ）によるで・７
離は、しばしば６％ポリアクリルアミドゲルにｋｉｌ、
行なわれる（Ｇｏｃｄｄｃｌら、６７）。 ラヂケーノヨノに際しては、正確に合致する様に末端を
適当に修復した所望の成分を、ＤＮＡ０５μ９に対して
Ｔ ｌｌ ｌ） ＮΔリガーゼを約ＩＯ単位の割合てＩ
ＩＩＬＩて処理ずろ。（開裂されたベクターを成分とし
て用いる場合には、該開裂ベクターを細菌性のアルカリ
性ホスフγターゼで前処理し、再うイゲーノヨンを防止
しておくことか行用であろう。） プラスミド中に組立てられたｉＥ確な配列を確認するに
は、ライゲーノヨノミゾクスを用いてＥｃｏｌｉ Ｋ
ｌ ２ｌ株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換
し、満足すべき形質転換体をアンピノリンまたはテトラ
サイクリン耐性について適当なところで選択する。形質
転換体からのプラスミドをｉ−ｔ、これを制限酵素法お
よび／または配列決定法により分計する（４５．９１）
。 好ましい＠様の一般的な説明 及敷鯉 以下に示ｉ−実施例は例示をＬノ的としており、本発明
を制限するしのではない。二５う実施例においでは、店
主細胞培養としてＥ、ｃｏｌｉの店主細胞培養を用いた
。しかしながら、本発明方法には池の真核および原核生
物の細胞ら同様に通出性を（＝ｒする。 Ｉ。１１訂府−α特５１ｉｉＩｙＬゲノムＤｉ’ｑ−Ａ
然〔ｌ−）の単線 ＴＧＦ−α遺伝子の！−１！離は合成オリゴヌクレオチ
ドを用いた特ｙ４的ハイブリダイゼーノヨノに基ノと、
二（１らのブ〔ｌ ブは第１［４に示、＋如＜、 ヒト
Ｔ Ｇ Ｆ αの（１定の部分的アミノ酸配列に基つ
いて定められている。 最近、特質的ＤＮＡ配列を、多くの組合わせ上、）誤り
（ミスマツチ）を白°する長い合成オリゴヌクレオチド
を用いて、あまり厳ｒ６てない条件下のハイブリグイゼ
ーノヨノによってｃＤＮＡよたはデフ１ムＤ Ｎ 、Ａ
ライブラリーから単離し得ることか示ｓ Ｘ＝、 ｊ：
、、この方法（よ、アメリカ特許出願番号第５０１．
３５１号、１９８３年６月６日出願（ＥＰＯ出願番号第
８４．３０３７８４７号）に記載の如く、ヒトーインン
ユリン様発育因子ｌの几めの遺伝ｊ−の検出において成
功を収めた方法である。同じ方法を、ヒトＴＧＦ−αを
暗号化しているＤＮＡの単離において試みた。この目的
のために、２藺の長いオリゴヌクレオチドを合成した（
第１図）。 ・１１７−（４１ｆｆ１体）はアミノ酸１２〜２５の暗
号配列に相当し、他方４８７−（４８徹体）はアミノｌ
ｉ！２１〜１６の暗号配列に対して相捕的である。各ア
ミノ酸には数個の異なるコドンか対応し得るのて、この
１リゴヌクし・オチトノｌ ７’Ｈ１Ｖ’＋いメケレ（
子１・は、ヒトｍｌ工ＮＡに幅在して認められているコ
ドンを基に選択した（９４）。なお、複数のＣｐＧノヌ
クレオチトの存在は避けた。４１マーと４８７−の３゛
末端はＩ５残括の長さにわたって相捕的てうろため、こ
れら両オリゴヌクレオチドを准種分子形成し、それらを
鳥類の骨髄性芽球症ウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素で
延長し、二重鎖７４７−を調製゛４゛ることかてきる。 これらの長鎖オリゴヌクレオチドに加えて、２個の１４
７−も合成した。Ｉ４マーの４つの部分（ブール）、即
ら、ＩＡ、ｎ、ＣおよびＤと呼称される部分はアミノ酸
５〜９に関して可能なコドンの全てに一ノいて相捕的で
ある。同様に、１４７−の池の４つの部分（２Ａ−Ｄと
命名）はアミノ酸１５〜１９に対応する。 第１図に示したこれらのオリゴヌクレオチドは、ヒトＴ
ＧＦ−αのためのＤＮＡ配列を検出する目的でハイブリ
ダイゼーション・プローブとして用いた。これらのオリ
ゴヌクレオチドはヒトＴＧＦαのための部分的なアミノ
酸配列（３５）と関連さＵで設計されており、同相トリ
エステル法（３８，３９）を用いて合成された。 ４１マー、４８マーおよびＩ４７−を、反応ミックス（
７（１ｍＭ）リス−）１ｃＩ（叶■７６）、１０−ＭＭ
ｇＣＬおよび５ＩＩＩＭノチオトレイトールを含有）中
、３７℃において３０分間、γ−”Ｐ−ＡＴＰとポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて５゛位で標識化した。また
等モル量の４Ｉマーと４８マーとを、ｚ５μａのミック
ス（１０５ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８３）、ｌ＝１０
ｍＭＫＣＩ、５０ｍＭＭｇｃＬおよび２１０ｍＭβ−メ
ルカプトエタノールを合釘）中において７０°Ｃで５分
間加熱し、その後３０分１川をかけて室温まで徐々に冷
却することにより、７４マーを調製しｆ二。次いで、こ
れらのアニールしたオリゴヌクレオチドに、ｄＴＴｆ）
とｄＧＴＰとを１０ｍＭになるまで、１５０μＣｉづつ
のａ−３２Ｐ−ｄｌ＼′１゛Ｐわよびα〜”Ｐ−ｄＣＴ
Ｐ、更に８０単６γのＡ Ｘ４Ｖ逆転写酵素を加えて全
容外を７０μｅとずろことにより、二重鎖の放射ｌ＆性
−ラヘル７４７にしｆ二。３７℃で３０分間インキュベ
ーノジノした。次いでラベルされていない（ｉΔ１’Ｐ
および（ＩＣＴＰを１０ｍＭになるまで加え、！５分間
反応を進行させた。５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ ５ｕ
ｐｅｒｆｉｎｅとのクロマトグラフィーにより、この〕
１イプリダイゼーションプローブから、取り込まれなか
ったヌクレオチド・トリホスフェートを分離した。 当初は、ヒト黒色腫細胞系Ａ２０５８（５，３４）（こ
れは、ＴＧＦ−αを精製するための供給源として用いら
れていた）からのｍＲＮＡから導かれたＣＤＮＡライブ
リーより、ＴＧＦ−α特異的クローノを単離することに
Ｓｌ一点か合わされていた。１４マー、４１マーおよび
７４７−による広範囲に及ぶスクリーニングによってい
くつかの堆種分子彩成に係るｃＤＮＡを単離することか
てき、これらを配列決定に付したところＴＧＦ αと
無関係でめった。これか不成功であったので、λシャロ
ン４Ａフアーノ（４０）内に含有されているヒト−ゲノ
ムＤＮＡライブラリー中にＴＧＦ−α遺伝子を捜すこと
を決定した。約７．５ＸＩＯ’のファージを、５゛位を
ｔＰでラベルした４Ｉマーとノ＼イブ・１ノ（七 ノー
２）−（ろことによ姦）、スタリーノし、−ら＋−−、
＋５支験で（ｉ、同数Ｊ）イＩＩ換え一ノフーノを、こ
、！−ら組換え人ファー７を二１・［Ｊセルロース−フ
ィルター（９５）にの仕、レプリカＯＨ製）牢板培にし
、孜射活性（票識化７１７ と）＼イブリダイゼノヨノ
ー（る二と、こより、スリリ−）しｆ４ｃ これ、−、
）ス々リーニンクの結果、ｌＩ ｌマーわよび／まｒ二
：よ７４マーとｗ１種分子を形成した３５個の組換Ｋ
Ａ ’ ””／を検出、ｌｊｊｌ １１．、 ３５７−
ｙ−ノ全てＤ・らＤＮＡを煩離しｆこ。６♀１）換えλ
ＤＮＡについて、４１７−１７４７−１・１８７−４し
びに１・１マーのプールｌ Ａ −Ｄおよび２ Ａ −
ｏとのハイブリグイゼーノヨンを“ドツト−プロット”
法（１３）（こより、調・＼ｆ−０こ１ｔらのＥｌｉ離
ファーノＤさ；Ａの内、とれら明確には４８マーまｌ二
はブールＩＡ−Ｄと准種！アナ子を形成し戸かっｒこか
、１４７−プーＪし２＼−Ｄの混合物と：よ、約１／２
のＤ Ｎ Ａか幾′叶１）・、）ハイブリダイセーノヨ
ノを示しｒ二。 １！マー、４８７−および７４マーを、５Ｘ（５１＝：
＋ｓ Ｓ Ｃ（ｌ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ＝ Ｏ、ｌ ５ＭＮ
ａｃｌ、００１′５＼１り」゛／酸−Ｉｊ・リウム）１
．Ｉび）・１月・ｎｈｑｒ；Ｉｔ、′、二、Ｉ＆（ｌ＜
ｌ）ｔ：ｎｈａｒｄｔ溶子シー＋１．１”６１’ｉｃす
ｉｌ、Ｏ１％ポリヒニルビｕ ｊｌ １；／、０１θ５
Ｃ゛１ノ皿ｊｉ７アルフミノ、２０％ホルムアζ１・）
および５０μ７／−ＱＪ）超ご液処理しｆこ鮭精（−Ｄ
Ｎ Ａ中て准唾分子形戎）′こ付しｌ二。 フィルターを・１２°Ｃて２時間、ブレバイブ！１グイ
ズしｆこ後、熱変性さｕ′ｆニブローフを加え、４２°
Ｃて１５〜２０時間ハイブリｙ（七 ／：１）をイＪ几
。フィルターを１ｘｓｓｃおよび０１％５ｌ）Ｓて順次
、広範囲に洗浄しｆ：（３７”Ｃ）。１４７−をプロー
ブに用いた場合には、２時間のプレハイブリダイゼーノ
ヨノおよび１５時間のハイブリダイセーノヨノを、６Ｘ
ＳＳＣ，０，５％ＮＰＩＯ１６ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｉ Ｘ
Ｄｅｎｈａｒｄｋ溶液および５０μｆｆ／′マσ鮭精子
ＤＮＡ中、３７°Ｃて行っｒ為次いて、ＧＸＳＳＣ中で
、室温で敢回洗１１トシた。 、１１７−および１４７−２ＡＤと。）ハイブリグイゼ
ーノ３ノの程度を、ハイブリダイズ５７−ｆ二“トノト
ープロット”ニトロセルロースフィルター’ｉ−，ＩＶ
ｉ次厳シＱ ／Ｊ’ １ｔ１１められろ条ｆ’ｌドで洗
／Ｔ＃４−ることにより評１１ｉ１ｉ Ｌ ｒこ。この
ことは、後続の分（４ｊに適用セへき潜α的な候浦とし
て考慮されるファーツノ）改を、更に制限するためにイ
ｒなわ４を几。この評価に括ついて１２個のファージを
配り１１決定のＬめ（こ８択しｌ二つこれらのファージ
Ｄ Ｎ ＡをＢａｍＨＩ、１−１ ｉｎｄ［Ｉ ′）：
ｆこはこれら両酵素の併用、によって消化し、フラグメ
ントをアガロースゲル上で分離し１１７−または１４マ
ープ〜ル２１＼−りとハイブリダイズしているファージ
Ｄ Ｎ Ａをサザ〜ノ分ｌｒ Ｉ’、 ４４ ）に付す
ことで、いずれかのプローブとハイブリダイズしている
配タリは、同一のＤ Ｎ Ａセグメント１こ局在してい
ることかねかつｆ二。各ファージ［）＼Ａの、ハイブリ
ダイズしたＢａｍＨｌまたは１１ｉｎｄ［ｌＩｌフラグ
メント、次いてプラスミドｐＢＲ：３２２にサブクロー
ノしたつ二カキメラブラスミｒを、エツトヌクレアーゼ
５ａｕ３Ａｌ、１１ｓａ［ま７： ！ ｉ両片、によっ
て順次開裂しｆ二。このフラグメントＪ′）混合物をポ
リアクリルアミドゲルおよびアカ〔ｌ スゲル１で分離
し、二１・（Ｉセル［７スーツイルター１−に序した。 ｌｌ ｌマーとのハイブリダイゼーノヨノにより、１２
［ＡＩのプラスミド全てに関し、２八イブリグイズした
小フラグメノトを同定しｒ為次いて、これらのフラグメ
ントを〜Ｉ１３ｍｐ８またはｍｐ９（４５）にサブクロ
ーノし、それらのヌクレオチド配列をノデオキノヌクレ
オチド鎖末端決定法（４Ｇ）により、決定しｆ二。 ブラスミトノ内、ｐ′ｒＧＦ１５ Ｉと命名５（１）
こプラスミドは、Ｔ Ｇ Ｆ αの最を月の３３個の
アミノ酸の暗弓配列を有（２，１８０塩活村Ｑ’）Ｓａ
ａ３、八（フラグメント内に位置していることか明らつ
・ｉ、＝ ｉｉ ッｆ二（第２図）。ｐＴ Ｇ Ｆ Ｉ
５−１ 、’ｊ＃ｔｌ換ンフ７−ノλ１５から導かれ
たｌｏ、２Ｋｂｐ（キロ塩基χ・ｔ）ＢａｍＨｌフラグ
メントを含（１°している。：３３番ト１のアミノ酸に
関するコトノの次にはさ３止コト／がある。その位置の
ＧＴ−７ヌタレオチトは、介住配刈の供与ａｚｂｌ−て
めろことを示、ｌ′１，１′識てシ５ろ（＝１７）。Ｉ
−’ Ｔ Ｇ ＦＩラ−１の制限的マノビノケ、および
それ以後の配シリ決定法（データーは記載りｉ’ ｉ（
’、 １． ｉ 、 Ｓ：＋１： Ｉ Ａ ｌ
−ノラ ′ｆメ 、１・、ユｉｉ ７ （ｌ ｂ
ｐＳａｃｉ ｆｒａｌｌフラグメノト１−に１ｖ置し
、スプラ（Ｘ供与品位の下流におけるＳ ａｕ ３．Ａ
Ｉ １％ｉ位はＢ２８１酵素の認識耶（１″Ｌでらあ
ることか小された。 ヒトＴＧ Ｆ αの最初の３３１［／ｉのアミノ酸を
暗−ｊ化しているエクソンを含わ゛、プラス（１・ｌｌ
ＴＧＦ１５１ノ） ｌ ８０ｂｐＳａａ３７＼−フラグ
メントのヌクレオチド配列１１、および（１定のアミノ
酸配列をり＋ ２ ｒ＜１に小４゛、Ｋ文′ｉ、′ζ小
しＩこ配り；１は′ｌ″Ｇ１２ αポリペプチドの一部
であり、小文字で示ヒｒ二配列（よ、前駆体においてＴ
ＧＦ αに先行しているアミノ酸配タリてうろ。矢印
は、ｃＤｈＡ配クリとの比較によ−・て決定された介α
配列の受容わよび供与部位を示している。、（下記参照
）。 二、）ヌクレオチド配列を綿密に検討することによ・〕
、１！マーがハイブリダイズし７Ｊ３の残基、よ、得ら
れたＴＧｒ” αＤ Ｎ Ａ配列とホモローガスてめ
ろことかわＤ−ろ。１４個のホモローブメスな塩基か連
続的に伸びている。４８残梧の内３７か十モローカスて
うろにら拘わら１′４８７−か顕著ｆコ’＼（−／ Ｉ
Ｉ ７ （７： ｌ−ｊｉｒ・戸・： ／−ｆ’ｌ！Ｉ
ｌｌ：ｉｌ’ｌｌ 、’＋４−１： ｔ、ｔ： １完全
なホモ〔１） （１１１１同性）を小・１１・１７−′
Ｊ）プールの内の１ってめる２Ｄは、明瞭すか極めて弱
いハイブリダイゼーノヨノを示しｆ二。１４マーの′１
、八−１）とのハイブリダイゼ＝７ヨノの欠如は、成、
訊′Ｉ″Ｇ Ｆ αの７１ケに、最初に−Ｆ ｉ＋＋
１されていｆ二〇ツノでなくアスパラギン酸に関するコ
ト７ノノ・（Ｔ、在していたことに起因しているうこの
相違によって。 １・１７−内に２−）の不適合（ミスマノチノヶ）／ｉ
戊ＪＩＩ５か存在すること（こなっｊ＝。 ｐＴＧＦ１５−１の、単離されｊ二ｌ ８０ｂｐＳａｕ
３１〜１フラグメノトを、引き続き、１１１ｊに単離し
た３５の組換えファージのドツトプロット分析（４３）
におけるハイブリダイゼーノヨンプ〔Ｊ−ブとして用い
た。３５のファージＤＮＡの内５個かこのフラグメント
とハイブリダイズしｒ二。サザー７分析法によってそれ
ら全てか同一の、ハイブリダイズし＋’＝６７０ｂｐＳ
ａｃｌ −Ｂａｌ ｌフラグメントを含有していること
が示されＬｏ ２ 約５０００ヌクレオチド長さのＴＧＦ−αｍＲＮＡ
１−１：己ｙ−： ’６１Ｈｆｕは、ヒト’Ｉ’ Ｇ
Ｆ ＋ｘを！’１′ｌＸＪ化しているケノム配タリか
介龜配クリによって中断されていることを、トシている
。完全な形の暗号配列をｉする７こ０（二、ｉ” Ｇ
Ｆ αエクソンを含むゲノム５ａｃｌ−１（ａｌ１７
ラグメノトを黒色腫細１泡系Ａ ２０５８ ｊ＞＼＜Ｑ
’）ｍｌｔ＼、＼から導り−イーたｃＤＮＡライブラリ
ーのプローブに用いに。これらの試みら不成功てあっ、
ｒコのて、ＴＧＦ αｍＲＮＡの供給源として、他の
細胞系を捜４゛ことか決定されノー。 広範囲に及ぶ種々の腫瘍ａ粗系Ｄ）ら抽出された佳々ｆ
、ｈ ｍ Ｉｔ Ｎ 、＋＼のコレクノヨノを、ホルム
アルデヒＩ−７カロースゲル七の電気、水＋Ｊ＋（、ｌ
ｌ）およびＴＧＦ α特異的Ｓａｃｌ−Ｂｇｌｌフラ
グメントとの゛、ノ ザノ”ハイブリダイゼーノヨノ（
４２）で調べた（デ ターは記載せず）。全ての細胞系
が、弱い、Ｊ、コらく非特異的な雑種分子形成にＪみづ
くバット全、Ｍ にらこれらオリゴｄ′Ｆ−セルロース
選択ｍＲ＼Ａ山にｌｌ：αするリポブームＲＮＡの２８
Ｓの位置７に示しｆ−、′腎細胞腫から導かれた１つの
細胞系、１０７２Ｆ５７：ま、２８８の位置に明瞭で強
いハ（ブリダイゼ ノジノＬｊ’Ｌを小し、約・１８１
１１１〜５０００のヌクレオチド長さの’ｒＧｌαｎｕ
’ｔＮＡか（を在１１゛ろことを示唆した。関連４°ろ
ポリペプチド、ＥＧＦらまた、約−ｔ ！！ ００のヌ
クレオチド長さのｍ ＲＮ Ａによって暗号化されてい
る（・１８．４９）。 このｍＲＮＡの一次の翻訳生産物はＥ Ｇ Ｉ−” ：
’＋：ｉ駆体ポ躯体プチドで２うり、このものは、・；
１き続いて数個のポリペプチドへと処理されろか、そノ
）内の１−ノかＥ Ｇ Ｉ’である。 ＋（、ＴＧＦ αを暗号化しているＣ Ｄ Ｎ Ａの
手並ヒトＴＧＦ αに関する完全戸暗号配クリを含む
Ｃ１１Ｎ Ａを蛸離するｆこめに、上記のａ胞系かり１
１トＡを単離した。ポリアデニル化ｍ ＲＮ Ａ分画を
、オリゴｄＴ−セルロースクロマトグラフィーに吸収さ
せることによって単離しｆこ（５０）。常法通りｃＤＮ
ＡをＡ製しく５ｌ−５３）、ｄＣ−ホモポリマーで修復
しく５４）、更にＰＳＬＩで線状化し、ｄＧ−テール化
（ｄＧ −Ｌａ１１ｅｄ）を行−１ｆ４１１１１３１１
３２２にアニールした（５５）。Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（
５４）における形質転換（５６）を）ｆａｎａｈａｎの
高部−１１１１，法（５８）・工）１０・て行）ことに
、１、Ｃ）、：う１．）４のｃｌ）ＮΔライブラリ を
得た。１つのライブラリーは、Ｌｌ’ｌ’ ｌ ２−１
８をプライマ〜とする（ｄＴ” ｌ ２−１８でプライ
ムされた）ｃＤＮＡを含んでいたか、一方、池の２すの
ライブラリーは合成ｌ６７−ｄＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴ
ＧＴＣＣＴで、特異的にプライムされたｃＤＮＡ合成法
によって、Ｊ＾１製された。このオリゴヌクレオチドは
、ｐＴＧＦ１５−ｌの長い１８０ ｂｐＳａｕ３ Ａ
Ｉ制限フラグメント内に含まれているＴＧＦ−αエクソ
ンから下流の領域（ヌクレオチＦ ｌ ３４〜１４９）
と相捕的である（第２図）。 プラスミドｐＴＧＦ１５〜１から調製した、放射活性−
標識ＴＧＦ−α特異的５ａｃｌ−Ｂａｌｌ制限フラクメ
ノトを用いてＱ性コσニーをスクリーンした（５９）。 特異的にプライムされたｃＤＮＡ合成によって調製され
た９０．０００の組換えＥｃｏｌｉクローンの内、唯１
１１１がこのプローブとハイブリダイズした。このプラ
スミド（ｐＴＧＦ−ＣＩと呼称）を制限酵素分析に付し
たところ、そこには３ＩＬ！］のＰｓｔ［フラグメント
が存在し、その内最短Ｕｌ ６７ ｂｐ−／ラフｌ ／
ｌ−！１、ｐ’ｓ’ Ｇ ｌ冒５１．）１” Ｇ Ｆ
αエクソン中（ご乙１’＋−（ｌ’、 していろご
とか１引らかになった（第２図）。次いて約９００ｂｐ
のｃＤＮＡの挿入を表している３個のＰｓｃｌフラグメ
／１・を、Ｍ ｌ ３ｍｐ８（４５）にサブクローンし
、ノデオキノ鎖末端法（・１６）による配列決定に付し
几。 プラスミドｐＴＧＦ−ＣＩのＣＤＮＡ配？りとその推定
のアミノ酸配列を第３図に示ｔ０ 第３図はプラスミドｐＴＧＦ−ＣＩ中に含まれているＣ
ＤＮＡのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列を
示している。Ｇ−ＣテールがｃＤＮＡの両側に接して存
在する。ヌクレオチドは各ラインの下側に配されている
。ライン上の数字は、＋１１独のメチオニンかＮＨ，−
末端を構成する七推定した場合のアミノ酸の位置を示し
ている。ＴＧＦαのアミノ酸配列は枠で囲まれており、
その両側にはＡｌａ−Ｖａｌに富む配列（オーバーライ
ンで示した残基）か結合している。 ヌクレオチド配列を調べた結果、ＣＤＮＡの合成はプラ
イマー（ＴＧＦ−αエクソンの１３４〜１１！Ｉ’ｌｌ
；°Ｉｈ１°ξ第２図）に特疋されろ１也ＮＡ配列てな
く、乙゛しろ、この特異的なオリゴヌクレオチドに泪当
する位置の下流から開始されていることが分かりた。さ
らに、ｃＤＮＡの３゛末端の直ぐ下流にある遺伝子フラ
グメントを、組換えファージから単離しんところ、特異
的プライマーと似通った配列を有していなかった。従っ
て、このＴＧＦ−αｃＤＮＡは、ラノダム（無作為）な
ｃＤＮＡ合成開始状況下で生成したものであると推＃１
ｌ１１される。ＴＧＦ−αｍＲＮＡの二次構造かオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーノジノ、従って、特
異的なｃＤＮＡの合成開始を防げている可能性かめる。 ＣＤ Ｎ Ａの配列およびｐＴＧＦ１５−１から得たゲ
ノムフラグメノトを直線状に示した図（第３図および第
２図）は、ゲノムＤ Ｎ Ａ内にスプライス受容および
供与率位（４７）が存在することを指摘している。ｌ
８０ｂｐＳａｕＡ Ｉフラグメント内に含ま利ているＴ
ＧＦ αエクソンの長さは、１２１ｂｐでゐる（第２図
）。 認め得るＴＧＦ−αのアミノ酸配列から、ｃＤＮΔ配列
中の解読−ル ノ・か＆１Ｍ ！７さ４１／、＋ 、
ｌｌｉ’７ ’Ｊ配列は、１” ＯＡを終止コドンとし
てヌクレオチド５２７で終わってＪ５す、３゛非翻訳領
域の一部がこれに続いている。オープンリーディングフ
レームはｃＤＮＡの５°末端まて連続している。ｍＲＮ
Ａは約４８００−５０００のヌクレオチド長さを有する
ので、このｃＤＮＡ上には、ＴＧＦ−α１１ｊ駆体の暗
号配列の内、−１か存在していない可能性かある。しか
しながら、単独のメチオニン残基を指すＡＴＧコドコド
対して、Ａか一３位で先行しており、また、その直後に
はＧが続いているという点か重要である。この様な現象
は高等な真核生物の大多数のｍＲＮＡ内の開始コドンの
特徴である（６０）。更に、８位から１８位までの配ク
リは、細胞からのタンパク質分泌に係る信号ペプチドの
疎水性中心（６１）に題めて特徴的な配列である。、他
の信号配列（６１−６２）との比較により、ノブナルペ
プチダーゼによる開裂は、乙しこの配ソリか実際に信号
ペプチドを表しているならば、１９位のＡｌａ、２０位
のＣｙｓまたは２２位の八ｌａの後方て起ご・Ｓことが
小唆された。しかしなから、この単独のメチオニンをＴ
Ｇ Ｆ α前駆体の出発点に帰属することは、ｍＲ
ＮＡの３°非翻訳配列が約４０００ヌクレオチドという
通常でない長さを有する可能性のあることを意味する。 第３図のｃＤＮＡ配列は、前駆体タンパク質のｆこめの
より大きい暗号配列中にはめ込まれているヒトＴＧＦ−
αに関する完全なりＮＡ配列を示している。ラット、マ
ウスおよびヒトのＴＧＦ−αに関する直接的なアミノ酸
分析により（２７，３５）、ＮＨ２−末端にＶａｔ−Ｖ
ａｔ配列のあることが明らかにされた。ポリペプチドの
長さが５０アミノ酸長さであること、並びにラットおよ
びマウスの配列決定されたカルボキン末端に基づき、Ｔ
ＧＦ−αは８８および８９位のＬｅｕ−Ａｌａ残基で終
わっているといえる（第３図）。５０アミノ酸長さのＴ
ＧＦ−αを生成さ仕るためには、アラニンおよびバリン
残基間のタンパク分解的な開裂が、アミノ−およびカル
ホキソー両末端で起こらなければならない。このＮＨ，
−末端におけるＡｌａ−Ｖａｌダイマ は、配列 Ｖ
、ＩＩ Ａｌａ ΔＩ、１ノヘＩ、Ｉ Ｖ３
１Ｖａｌ中に位置しており、これはカルホキノ末端に見
られる配列＋Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ
と非常によく似ている。この顕著な特異性に関連し、Ｔ
ＧＦ−α前駆体のタンパク分解的な処理に関与するプロ
テアーゼは未だ記載されていない。 ここに、腎細胞腫から導かれたｃＤＮ、Ａおよび健常な
胎児の肝臓から導かれたゲノムライブラリーから単離し
た遺伝子フラグメント（４０）において、ＴＧＦ−αに
関する完全な暗号配列が決定された。両配列は同一であ
り、これら両供給源内でのＴＧＦ−α遺伝子間には暗号
の相違が無いことを示唆している。 また、ＴＧＦ−αに関するＤＮＡ暗号配列が確立された
ことにより（第３図径照）、この遺伝子を文献記載（３
８，３９）の常法を用いて合成することが可能である。 ＴＧＦ−α前駆体に関する推定のアミノ酸配列から、５
０アミノ酸から成るＴＧＦ−αのカルホキノ末端から２
０アミノ酸下流を始点とする、非’７：’＋に疎水性の
領域かあることが明らかになった。 これら１０３〜＋２１の残基は、その殆んどがロイノン
、イソロイノンおよびバリンで占められている。１１８
番目のアミノ酸から前駆体ポリペプチドのカルボキノ末
端までの配列は、著しくシスティンに富んでいる。この
４２個のアミノ酸配列中には８個のシスティンが含まれ
ており、その内４個は集まって対になっている。このシ
スティンに富む配列は生物学的に活性なポリペプチドを
構成している可能性がある。今までのところ、どの様に
してこのペプチドが前駆体分子から開裂されるかという
ことは推測にしかすぎない。幾つかのポリペプチドホル
モンはより大きい前駆体として合成され、通常、対にな
った塩基性のアミノ酸で結合されている。９６−９７位
のＬｙｓ−Ｌｙｓ残基は、プレプロエンケファリン（６
１６４）、カルノトニノ前駆Ｋ（６５）およびコルテコ
トロ躯体−β−リポタンパク質前駆体（６６）の場合の
様に、タンパク分解的な開裂の作用部位であるからしれ
ζい。 ゲル濾過分析により、概算の分子量か１０〜２３キロダ
ルトンである大きいＴＧＦ−αが数個存在することか示
された（１．５．２２．２８．２９．３０．３３．３４
）。これらの大きいＴＧＦ−αの本質は未知である。Ｔ
ＧＦ−αを暗号化している数個の関連遺伝子かゲノム内
に存在しているのからしれない。しかしながら、全ヒト
−ゲノムＤＮＡと、ｐＴＧＦＩ５−１のｌ ８０ ｂｐ
Ｓａｕ３ Ａ ｌフラグメント並びに６７０ｂｐＳａｃ
ｌ−Ｂａｌｌフラグメノトとのサザーンハイブリダイゼ
ーノヨノ（４４）によっては、曳数遺伝子の存在は明ら
かにされなかった。あるいは、これら大きいＴ Ｇ Ｆ
の内、幾つかに関してはその本質を、前駆体分子におけ
る翻訳後の処理型が異なることて説明することかできる
からしれない。また、ＴＧＦ−αが他のタンパク質類と
凝集することによって、見かけ上の分子ら１が大きくな
る可能性らある。 ４ 、 Ｅ、 ｃｏｌｉ てのＴＧＦ−ａの ＝−’
ｒ Ｇ Ｆ−αは、多くの腫瘍細胞によって、少量が生
産される。実際、ＴＧＦ−αの“オーバープロ−１”ユ
サ ”て−）ろとさ、！１．ている黒色腫細胞系Ａ２
０５８ ；’）培養物から得ｒコＬＫＪ、、＆ｌ ３６
Ｑから１．５μ９の、小さいＴ Ｇ Ｆ α←ｌか
単離されたにオぎない（３４）。この様に、細胞培養か
らのＴＧＦ’ α人丁釘か極めて低いことか、その生
物学的な確認を妨げている。これらの研究を容易にする
ために、Ｅ、ｃｏｌｉ内でのヒトＴＧＦ αの合成が
追求されて、ニア＝、ＴＧＦ−αを暗号化した配列は前
駆体の中にはｙ）込まれているので、我々は該Ｎ号配列
のｌ１Ｆｉ方に開始コドンを、後方に終止コドンを導入
しＬｏ この開始コドンにはＥｃｏＲ１認識部位が先行
し、終止コドンにはＢｇｌＩ［部位が後続しているので
、ＴＧＦ−α配列はボータプルなＥｃｏＲＩ −ＢｇＩ
Ｉ制限フラグメノトとして利用することか可能となる（
第４図）。 ＴＧＦ αはＥ、ｃｏｌｉ中で、ヒトーソマトスタチ
ノ（７２）、インツユリン（７３）およびデスアセチル
チモノンーα［（７４）と同様な方法で、異なる融合タ
ンペク質の一部として発現された。これら後との場合に
は、成熟タンパク質を臭化ファンを用いて融合タンパク
質から開裂さけろこと更で３た。この化学的処理によっ
て、融合タノバク質し）先端部分と成熟ポリペプチドと
を連結するために導入されたメチオニノ残括の後方で↑
＋ｒ異的な開裂か起きた（７２）。ＴＧＦ−αの暗号配
列およびそれに先行４−ろメヂオニノコトノが、ｔｒｐ
リーダーとＬｒｐＥの融合タンパク質（ｔｒｐ△ＬＥＩ
＝ｌ１３．７６）の先端部分と、ＥｃｏＲＩ部位で連結
されている様な２四のプラスミドか組立てらＡ−ｒこ。 この融合タンパク質の発現は、 ｔｒｐリーダーのりポ
ゾーム結合配列を用いて、ｌｒｐブロモ〜ターのコント
ロール下に置かれている。発現プラスミドｐＴＥ６の場
合には、このＴｒｐΔＬＥ１４１３融合タンＩ・；り質
の最・初の１９０個のアミノ酸配列（数個の７ステイン
残基を含む）かフレーム内でＴＧＦ。 α配りリと連結され、終止コドンか後続している。 プラスミドｐＴＥ５ては、ＴＧＦ αＩ） Ｎ Ａ配
列に対して、このｃｒｐＬＥ融合タンベク質の最初の１
７個のアミノ酸のみについての暗号配列が先行している
。この１７アミノ酸の延長部分にはノステイ７ノノ・１
）よれていないので、このＮ１１．末端が、発現されｆ
ニタンパク質のノスルフイト結合に影響を峻は°ずこと
はおそらくないであろうといえる（第５ａ図）。いずれ
の場合にも、１” ＣＦ−αの暗号配７１１の先端にメ
チオニノット／カイを在しているので、臭化ファンによ
る開裂によって成熟ＴＧＦ αが枚用されるっ 第４図は、ＴＧＦ−α（第３図におけるアミノ酸１ｌＯ
−８９）を、その下流の配列（第３図におけるアミノ酸
９（］−１６０）を伴って、あるいは伴わすに、発現さ
せるための、幾つかのプラスミドの’ｊｌｌ Ｎ７）て
方法を模式的に示す図である。制限的なマノビッグによ
って、ｐＴｃ：ＦＩ５−１内で、ＴＧＦ−αエク′ノン
を有するｌ ８０ｂｐＳａｕ３ Ａ Ｉ −Ｂｇｌｉｌ
フラグメントは、３８０ｂｐＰｖｕｌｌ−５ｍａ１７ラ
グメノト内に含まれていることか明らかになった。 この後晋のフラグメントを単離し、変性した後、γ”Ｐ
−ＡＴＰで５゛標識化をｉｊった合成オリゴヌクレオチ
ドｄ ＣＡ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ ’Ｉ’
ＣＣＣＡＴ Ｔ ’ｒ ＴとＴ４リガーゼのｒ７−α
下て復元させた。 この混合物にＥ、 ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１クレ
ノーフラグメントを加え、ｔｈｉ合成を触媒さｕｆ二（
６７）。このプライマー修復法を用いることにより、Ｃ
ＡＴＧ配列をＴ Ｇ Ｆ αの暗−吃配列の先端に桿
いた。次いでこの反応生成物をｒ３ｇｌｌＴで切断し、
ポリアクリルアミドケル電気泳動によって部分的なＴＧ
Ｆ−α配列を含む１３０ｂｐフラグメントを単離した。 ランＦＦＮ−β２ＤＮＡ配列か短い合成りＮＡフラグメ
ントに置換されている外は発現プラスミドｐｌＦＮ−β
２ （ｐＢｏ Ｉ Ｆ Ｎ β２）と本質的に同一であ
るプラスミドｐＹＧ１２＋を、そのｊ１ｉ’−のＥｃｏ
ｌｊ１部（Ｉγて切り開さ、Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメ
ラーゼｌ（クレノーフラグメノト）でうめ、Ｂｇｌ［ｌ
で切断した。このヘタターに＋３ｏｂｐＴ” Ｇ Ｆ−
αフラグメントをライゲートオることにより、ＥｃｏＲ
ｌ ｆｆｌ！（ｎを回復した。こ１して得らイーたプラ
スシトはｐＴＥｌと呼称された。 最？／Ｉの３３個のアミノ酸を暗号化している配列を含
むｌ ３０ｂｐＥｃｏｆｌｌ−Ｉ３ｇｌｌｌｉｌｌＩ限
７ラクメ：／トをｐ′ｌ’ Ｅ ＋から単離し、テトラ
サイクリン耐性’ｒ Ｉｔ’： ｌ’、ｌ’Ｌ： Ｊｌ
ｉｌｊ １：ｆｌすを＋’； （１’ してし’ ）’
ａ ｐＦ Ｉ Ｆ ｔｒｐ’６９ＬＪ ７ ）、）３５
０ ｂｐＲｇｌ ［１−１３ａＩＩｌｌｌ ｉフラグメ
ント、「、よびｌ−：ｃｏｌｔｌわよびＬ３ａｍｌ−１
ｉで切断しｌ二ｐＩＮＣｖ Ｐへｌ ３−３３の大きい
ヘタタフラグメント（叩Ｚｐｌ ＮＣＶＣ（７８）、プ
ラスミノーゲン活性化ＣＩ）Ｎ、へ挿入体を含在してい
る）にライケートシ、・二。（１＃らイｔｆコブラスミ
ドｐ’ｖＥ２は、１１１ｊ記１ｒｐ几ＬＥ１４１３（７
６）融合タンパク質のＮ Ｈを末端、）Ｉ７アミノ酸を
暗号化している配列と、Ｅｃ。 Ｉｔ Ｉ ｉｍｉ位を介して連結しｆこ、ＴＧＦ α
の最初の３３アミノ酸のｒ二めの配列を含有している。 ＴＧＦ α配列を含有するｌ ３０ｂｐＲＩ−Ｂｇ
ｌ■フラグメノトを、まｆこ、前記ｔｒｐＬＥ融合タン
パク質、７）最初の１９０のアミノ酸のための暗号配列
に連結しｆこ。このプラスミド、ｐＴＥ３は、ｐＴＥｌ
、）ｌ ３０ｂｐＲＩ−Ｂｇｌ［ｌフラグメントをｐＦ
ＩＦｔｒｐｊ６９のＢｇｌ ［１−Ｂａａフラグメント
並びにｐＮＣ〜・１５１）のＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ
ｌで得た大きいフｊのヘタターフラグメントにライゲー
ノジンする二と１こより１組立てられた。 、“１．：ｆ、な”Ｉ’ Ｇ Ｆ α配シリを短し１
融合物として発現、１ろプラスミドを以トの如くにしで
得た。ｐＴＥ２をその弔−のＰ ＳＬ Ｉ Ｊ’；よび
１３ｇ１１１部位で切断し、大きい方のフラグメントを
Ｉｎ離した。ｃＤＮＡプラスミドｐＴＧＦ−ＣＩ’ｒＰ
ｓｔｌ（第３図におけろ２３３位）ｊＪよびＡｖａ［Ｉ
（第３図に才バする３０１位）てｌ／Ｊ ｌ）開き、７
８ｂｐＴＧｌ？ α特異的フラグメントをｉｔ’ｌｌし
た。これら両フラグメノトを部分的に何１ｈｌｉ性を有
ずろオリゴヌクレオチドｄＧＡＣＣＴＣＣＴ Ｇ Ｇ
ＣＣＴ Ａ ＡおよびｄＧＡＴＧＴＴ、ＡＧＧＣＣＡＧ
ＧＡＧの存在下においてライゲートした。これらのオリ
ゴマ〜はＴＧＦ α暗号配列の背後に終止コドンを導
入し、かつ、＼ｗａ１１部位とＢｇ１■部位とを連結す
る乙のである。得られたプラスミドはｐＴＥ５である。 プラスミドｐＴＥ６はｔｒｐＬ［ε融合物の最初の１９
０個のアミノ酸配列に関する完全な暗号配列を有してい
る。これは、ＴＧＦ−ａに特異的な５２０ｂｐ長さのＥ
ｃｏＲｌ −Ｂａｍ１−１１７ラグメノトを１）ＮＣＶ
（５１）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌフラグメントの大き
い方にライゲートす・、ｌとに１．・てＦｊられた。ブ
ラスミＦ’ ｐ ＴＥ ５およびｐＴＥ６からの短い、
または長い、ＴＧＦ−α融合タンパク質の生成、並びに
Ｔｅａ”遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターのコント
ロール下にある。 Ｔ Ｇ ｌ” αのためのＤＮＡ配列を、その下流に１
ｉ１８結している暗号配列と一渚に、直接的に発現させ
るＬめに、プラスミドＸＡＰ−ＰＡ２を単一のＸｂａ口
〕よび８ｇ１１１１位て開裂し、大きい方のヘタターフ
ラグメントを単離した（図４ｄ）。ＸＡＰ−Ｐへ２：よ
、ＩＦＮ βｃＤＮＡ配列り叱ト組織のブラスミノ−ゲ
ノ活性化物質のためのｃＤＮＡ配レリとしｊｊ ｌ’ｉ
ｊ Ｓれでいる外はｐＦ Ｉ Ｆ ｔｒｐ６９ （６７
）と本質的に同様のプラスミドであり、プラスミドｐｔ
ＰＡＬＩｐＩ ２（７０）内の如く修飾されており、
り・−ノ、′ｒｅＬＲＩＲ伝子の下流のＧ −１１ｂｐ
Ａｖａ Ｉ −ｐＶしｎフラグメントを欠失している。 更に、ｐＴＥｌ１ノ）ら、′ｒ Ｇ Ｆ−α配列の始め
の部分を含む７０ｂｐＸｂａｌおよびＢｇｌ［ｌフラグ
メントを、モしてｐＴＧ Ｆ −ＣＩから残りの暗号配
タリを含ｒ丁シている３１５ ｂｐＰｓＬ ｌ −５ａ
ｕ３ Ａ ｌフラグメントをｉｌｉ離した。、３個のフ
ラグメントをライダ １・し）：、 ｉ’ｊ白れたプラ
スミド、ｐＴＥｌは、開始コドンによって先行された暗
号配列を、Ｌｒｐプロモーターのコントロール下にある
、ＥｃｏＲｌ −１３ｇ１ ［１フラグメ／トとして含
ｆ１゛シている。 更に、プラスミドｐＴＩ４で直接的に発現させるために
、この暗号配列をｔｒｐリーダータンパク質のＮＨ，−
末端部分との融合タンパク質として発現さけることを計
画した。そこで、３５０ｂｐ長さの′ｒＧＦ−α特異的
Ｐｓｔｌ−Ｂｇｌ［Ｉ７ラグメノトをｐＴｒシ４からＩ
ｉｉ離し、プラスミドｐｔ”Ｃ２の大きいＰｓＬ−Ｕｇ
ｌｒｌフラグメノトにライダ＝−）Ｌｒこ。 ｉすられたプラスミドをｐＴＥ７と命名した。別法とし
て、ｐＴＥｌのＴＧＦ−α配りリを含￥Ｊ゛４−るＥｃ
。 １ｉ ｌ −ｊ３ａｍＨ［フラグメントをｐｉ” Ｅ
３の大きい１℃ｃｏｌｔ Ｉ −ＢａｍＨｌフラグメン
トにライゲートし、プラスミドｐＴＥ８を得た。プラス
ミドｐＴ Ｅ ７およびｐＴＥ８はＴＧＦ αＤ Ｎ
Ａ配タリを含有しており、しからその下流の暗号配列は
、それぞれ、Ｌ「ｐＬＥ１４１３融合タンパク質（７６
）の最初の１７１１・（口９０個（ハアミノ酸に連結（
結合）（、ζいろ。 これらの配列のライゲーノジノはＥｃｏｆｊ１部位で起
こり、この１Ｅｃｏ＋？１部位の次にはメチオニ）の１
−めのコドン、Ａ Ｔ Ｇが存在している。ＴＧＦ−α
配グ１１の先端にメチオニンが存在するので、この残居
の背後で融合タンパク質を特異的に開裂させることが可
能である。 制限酵素類はＮ ｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄ Ｂ １
ｏｌａｂｓまたは、１１ｔ１ｔｈ
【！ｓｄａ １ｔｅ
ｓｅａｒｃｈ ＬＸＩｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから人手
した。またＴ４キナーゼはＮｅｖ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＢ ｅｔｈｅｓｄ
ａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
そしてＥ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノ
ーフラグメント）はＮ ｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄＮｕ
ｃｌｅａｒ またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｃｉｍからそれぞれ得た。全ての酵素類は製造者の
指示に実質」−従って用いた。 Ｔ４４キナーゼ応は、７０ＩＩＭトリスーＨＣ１（ｐＨ
７６）、ｌＯａＡＭのＭｇＣＩｔおよび５ｍＭｍナノチ
オトレイトール中った０ライゲーノジンは、２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（＋）Ｈ７、ｓ ）、５０ｍＭのＮαＣｌ
、（ｉｍＭｕ’、’ＭｇｃＬ、Ｉ Ｏｌ１Ｍ ）・Ｐ
’４’ ｌ・シｒｌｌＬによび０．５ｍＭのＡＴＰ中で
行った。制限消化は、６ｍＭｈリスーＨＣＬ ６ ｍＭ
のｌｖｌｇｃｌ、および６ｍＭβ メルカプトエタノー
ル中で行ったが、ＤＮＡ−ポリメラ一ゼ１（クレノーフ
ラグメント）を用いた“；】める（ｒｉ、ｌｌ ｉｎ）
”ための反応は同し緩衝液に４種類のｄＮＴＰ（各々２
０μＭ）を補足しｌ二液中で行った。 第５図はプラスミドｐＴ Ｅ ５およびｐＴＥ６を表４
゛模式図であって、ＴＧＦ−αとそれに先行するｔｒｐ
ＬＥ融合タン融合タンパ色質配列しているアミノ酸配列
を示している。 これらのプラスミドｐＴＥ５およびｐＴＥ６をＥｃｏｌ
ｉ Ｗ３１１０に導入してｔｒｐプロモーターを誘導し
、その結果高レベルでＴＧＦ−α融合タンパク質を生成
させる。プラスミドｐＴＥ６から発現した、長い融合タ
ンパク質は、全細胞溶解物中に圧倒的に多量に含まれろ
主要タンパク質である。 プラスミドｐＴＥ５に暗号化されている短い融合タンパ
ク質は、非常に多量生成されるという訳てはないか、Ｉ
・：、ｃｔ山溶解物中の潰勢なバンドとして検出し得る
（第６図）。 第６図は、発現プラスミドｐＴＥ２、ｐＴＥ３、ｐＴＥ
５またはｐＴＥ６を含んでいるＥ、Ｃ０１ｉの全溶解物
について行ったＳＤＳ Ｉ ３％ポリアクリルアミドゲ
ル（７９）中での電気泳動の結果を表した乙のでめる。 これらのプラスミドで彩質転換したＩＥ、ｃｏｌｉ Ｗ
３１１０を、カサミノ酸およびテトラ４Ｆ（クリ：／
（５ｔｔ ｇ／ｘ（１）を含んだＭ９培地中、３７０Ｃ
でＯＤ、、。＝０１になるまで増殖させた。ｔｒｐプロ
モーターからの発現をインドール酢酸２０μり／、１Ｑ
の添加によって誘導した。まず、誘導面、０Ｄｓｓａ−
０，１の段階で細菌３ｘ（ｌを採り、更に誘導後、ｐ′
ｒＥ２およびｐＴＥ５の場合ハ０Ｄｓｓｏ−１，０゜ｐ
ＴＥ３およびｐＴＥ６の場合はＯＤ ｓ ｓ。−０，７
の段階で同数の細菌を採取した。ベレット化した細菌を
３０７ｚＲの１０ｍＭトリス−ＩＩ ＣＩ（ｐＨ７、５
）、ｌｌ〜（ＥＤＴＡおよび３μＱの１Ｍβメルカプト
エタノール中に再慧劇し、６μｅの１０％ＳＤＳを加え
Ｌｏこの混合物を９５℃で２分間加熱し、３００ ＩＩ
ジの冷アセトノを加えた。アセト）沈殿をベレット化し
、２５μＱのＳＯ８・充填用１衝液（５％メルカプトエ
タノール、４％ＳＤＳ、０．１２５ＭトリスーＨＣＩ（
＋）ｌ−１６，８）および２０％グリセリン）に溶かし
、９５℃で２分間加熱した後、５ＤＳ−１３％ポリアク
リルゲル上に詰めた。このゲルをクームノー・ブリリア
ント・ブルーで染めた。誘導の前後における細菌溶解物
を示す。矢印はＴ Ｇ Ｆ α融合タンパク質を指示
している。 マーカー分子の分子量を、この第６図の右側に示した。 次いで、ｐＴＥ５て杉質転換したＥ、ｃｏｌｉからの短
い融合タンパク質を、その生物学的活性を測定するため
に実質上、豊富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ） シた。 ２トＲの方法（カラムクロマトグラフィーを含まず）に
よって純度を８０〜９０％にした。１つの方法は、この
短い融合タンパク質か池の多くのタンパク質と異なり、
０ 、４ ＭのＮαＣｌと０５％ＮＰ４０の（？、（１
［下で不溶であると思われろ、との観察に基づいている
。次いでこの沈殿を８Ｍの尿素に溶かし、１〜！酢酸に
χ・ｒして込ｔｌｉ’Ｊ°る。ＩＩ工工性性１１Ｉ９分
は大部分の′ｌ″ＧＦ〜α融合タンパク質を含Ｈしてい
る。 別法として、ＨＣＩ酸性の７０％エタノール中で細菌を
超音波処理し、透明な上澄液からエーテル−エタノール
沈殿によってＴ Ｇ ＋”−α融合タンパク質を析出さ
仕、１Ｍ酢酸に溶かｔ’（１８）。ゲル電気泳動分析に
より、これらの両方法で同等の豊富化効果か得られるこ
とが示された。（第７図）。 第７図は、酸−エタノール法でα富化した短い細菌性Ｔ
ＧＦ α融合タンパク質のＳ ｌ） Ｓポリアクリル
アミドケル（７９）中の状態を示している。 ６８アミノ酸長さのＴＧＦ α融合タンパク質は、この
ゲル内で幅の広いバンド（矢印）として多動しｊ為ＮＰ
４０−ＮαＣ１法によってα富化したタンパク質も非常
によく以た状態を示す。 こうして得た細菌性の短いＴＧＦ α融合タンパク質
を２つの異なる方法で試験した。天然のＴＧＦ αは
ＥＧＦと同じ受容体を競合するということが示されてい
る（５．８．９）。このことが、１″ｌ−標識ＥＧＦと
の競合に基づく、ＴＧＦ−αす）迅速か−ノ定’Ｊ的な
カ折法の開発を乙ノこ吻しノー（５，１４，２７）。Ｎ
Ｉｔ Ｋ細胞を用いた結合実験（１５、Ｉ９．２７）
では明らかに、ＴＧＦ’−α融合タンパク質は臭化シア
ンによる開裂で得たＴＧＦ−α（示されていない）と同
様に、ＥＧＦ−受容体と結合ずろことか示された。しか
しながら、結合した短いＴＧＦ−α融合タンパク質は、
この実験条件の下てＴＧＦ−αとＥＧＦとが同じ受容体
に対して量的に同等の結合性を有すると仮定して求めた
予測（／！の０．５〜１％にしかすぎない。この低い値
はヒトＴＧＦ αの結合に対する親和性が低いこと、異
常な立体配置をとっている分子が存在すること、あるい
は、採用した結合条件が細菌性ＴＧＦ−αには不適当な
乙のであったことによるのからしれない。 ラジオリセプターアッセイにおける、細菌性の短いＴＧ
Ｆ−α融合タンパク質と１２５１−標識ＥＧＦとの競合
状況を第８図のＡ面に示す（実線）、、ＥＧＦによる検
量線を破線で示した。Ｂ而は、ＥＧＦ検量線の抜粋であ
る。 ′Ｉ’ Ｇ ｌ・゛ αの生物学的な活性は、Ｎ１ｔＫ
細胞の様な非彩質転換細胞におけるアンカレッジ・イン
ディベンダンスの誘導能力によって測定し得る。 １’ Ｇ Ｆ−αまたはＥ Ｇ ｌ”の存在によってコ
ロニーの形成が誘導される。これらのコロニーの敗およ
び大きさは］’ Ｇ Ｆ−βの存在によって強力に増大
される（１３−１４）。市Ｉ述の如く精製した細菌性の
ｉ” ＣＩ” αのアンカレッジ・インディベンダン
ス誘導能力をＮＨＫ細胞を用いて調べた（１４０）。 第９図は、ネズミＥＧＦと、臭化シアンによる開裂面お
よび後の細菌性ＴＧＦ−α融合タン融合タンパクラとの
軟寒天コロニー形成活性を示ｔグラフでうろ。この分析
は、文献記載の如く、ＴＧＦ−βの１７：在下、ＮＨＫ
細胞、クローン４９ドを用いて行った（Ｉ４）。縦軸は
８５０μが以上のコロニーの数を示し、横軸は、ＥＧＦ
受容体結合分針で求めノ二ＥＧＦ当量（ｎｌ／ｚｃ）と
して表したＥＧＦまたは細菌性ＴＧＦ−αの濃度を示し
ている。破線はＬ： Ｇ ｌ）、実線は細菌性Ｔ Ｇ
Ｆ−α融合タンパク質に関する結果であり、（○）は臭
化シアンで開裂する＋１ｉｊ１（・）は開裂後の値をＩ
ドす。これらの結果は明らかに短いＴ Ｇ Ｆ−α融合
物がＴＧＦ−βの存在の下において、軟寒天中でのコロ
ニー形成の引き金となっていることを示している。これ
らの分析においては、ラジオリセブターアブセイの場合
と比較して、細菌性ＴＧＦ−αがＥＧＦよりら約２０〜
３０倍ら活性であることが注目される。この様なｈｔ的
な相違は、臭化シアンで開裂したＴＧＦ−α融合タンパ
ク質に関してら明白である。ＴＧＦ−βの不存在下で細
菌性Ｔ Ｇ １？−αによって誘導されるコロニーの敗
および大きさははるかに少なく小さいが、この様な分析
条件の下での細菌性ＴＧＩ？−αとＥＧＦとの間の量的
な差異は変わることなく保たれている。 これら２種類の分析の結果は、１７個の−Ｎ［ｈ末端ア
ミノ酸を’ＦＴする細菌性ＴＧＦ−α融合タノパク質、
およびその臭化シアンで開裂されたタンパク質が、ＥＧ
Ｆと競合し、Ｎ Ｉｔ Ｋ細胞のアンカレッジ・インデ
ィベンダンスを誘導し得ることを示している。軟寒天中
における２０ニー形成の誘・ｉ’７１’ｒ ＩＩＩ ＋
Ｊ、−／ ：／ ｉリセ−ｚ ’ｉ −ｒ’ ＝＋
セ（ｉコｌｌ１ｉ−バＰせＩをはるかに上回−・て（・
ろ。老−この場合によ〕いて、１’ Ｇ Ｆ α：よ
軟寒天中では、ラノオリセプターアッセイの場合より乙
２０〜３０倍らＩ’＋’ｉ１い活性を示している（ＥＧ
’Ｆとの比較において）。 ：ｖｌａｓｓａｇａｅら（１２）は、′Ｉ’ＧＦ ば
かＬ’： Ｇ Ｆ受容体、）みζらず６０ｋｄＴＧＦ
α特異抗体と乙結合するということを提示した。後者の
受容体との結１”？ ７戸１，１：公的に′ｌ’ Ｇ
ｌ’ イＩによるＹノ力しノノ−ディベノｙノド性の
誘怪を媒介しているＩｌｌｌ性能ある。らしそうであれ
ば、Ｅ Ｇ Ｆラノオリセブタ−アノセイは軟寒天中で
のコロニー形成を予測する上で絶対的な色味を持たない
といえろ。また、二τ′、らの６受容体に対してＴＧＦ
αの結番性は同一でないからしれない。これに反して
、Ｃａｒｐｅ−ｎｔｅｒら（８）は、最近、ＴＧＦ
αによるアノカレッノインデイベノダノス誘導かＥＧＦ
受容体抗血清７）＃在によって阻止され得ることを示し
、この受容体との結合が軟寒天中てのコロニーの発現に
とって必要であることを指摘した。更に、細菌性ＴＧＩ
″ ｒｒか、ラノ−ｉ ｊｌセブタ −Ｉ′Ｊセ（刀条
１’ｌ＝ １Ｌｌ）ら、軟’１％ Ｊ分を斤の条件ドて
Ｌ ｉｔ （（功に［＞ Ｇ ｌ’ソ８１４と結合しｉ
Ｕる可能性らあり１、ニ５りこと：ま、こり、ら両分針
法において観察されたら１的八差ｖＩ８を説１１月する
乙のといえろ。 ５ 漿朋刈１グエ旦Ｆ−ｍ作多揚 酵母内で′Ｉ″ＧＦ αを発現させ、引き続きそれを
酵母培地中に分泌させることを［１的として１つ・７）
プラスミドを組）′してノラ この１」的の１こめに、
我ＩＪｉ１酵母にわ（ｊろ、接合（交配）因子（）、Ｐ
ｌター）αの１１１用性を追求した。このα因子は、酵
母５ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから分泌され、接合過程で生
理的に重要な役割を果たす因子である。このα−因子に
関する遺伝子は既に単離Ｊれており、大きし１前駆体を
暗号化していることかわかっている。二のプレプロ−α
−因子ポリベプチトは、分泌過程に必要なアミノ末端の
信号ポリペプチドと、４つの同しα因子ペプチド単位か
ら成る。これらα−因子ベプチド類の放出時に′は、前
駆体の二塩基性ｌ、ｙｓ−Ａ「ｇ残基（これらは信号ペ
プチドの下流、α因子単１、°Ｉい先端に位ｊＭｌ 、
Ｊ−ろ）の１１７置におけろタノバク分解的開裂が起こ
ると思われる（ｊ、 Ｋｕｒｊａｎら、１９８２、”Ｃ
ｅ１１”３０：９３３：Ｓｉｍｇｈら、１９８３、“Ｎ
ｕＣｌ、、へＣ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ” ｌ
Ｉ ：４ ０ ４ ９）。 ＴＧＦ−α発現プラス
ミド（ｐｙＴ Ｅ ２ ）は、アミノ酸数５０のＴＧＦ
−αの暗ぢ配列とそれに接する終止コドンとをフレーム
内の、酵８１α−因子のＬｙｓ−Ａ「ｇノペプヂトに関
するコドンの直後に導入する様、組立てた。信号ペプチ
ドを含む、このプレプロ−α因子のアミノ末端部分の配
列はそのまま保持−、イーでいろ、この’Ｉ’ Ｇ ｌ
” α融合ポリペプチドの発現（１α ファクタープ
ロモーターのコントロール下に３うろ。この様な、まノ
ニは同等の場合において適当な出発物質であるプラスミ
ドは、ヨーロッペ持許第１２３．５４４Ａ号に記載され
ている。 発現プラスミドｐｙＴＥ２（第１０図）は、更に、２μ
プラスミド（Ｊ 、 ｌ（ａｒｔ ｌｅｙら、１９８０
、′＼ａｔｕｒｅ”２８６：８６０）から導かれた、酵
母の機能的に複製起源、”Ａｂｌｅ”遺伝子（Ｊ 、
）（ａｒｔｌｅｙら、同上）から導かれた転写ターミネ
ータ−およびボリアデー／ＩＪＴ１１７１、ｌｌｉヒ１
ＱＴ１１＋＋ １選択−ｔ カ（ＧＴ ｓｃｈｕｍ
ｐｅｒら、１９８０、“Ｇｅｎｅ”ｌ Ｏ：ｌ ５７−
１６６）を含灯している。 Ｓ ３ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ菌株２０ｒ３ １１２（Ｅ、、 Ｊｏｎｅｓ、
ｌ ９７ Ｇ、“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ” ８５ ： ２３
）をｐｙＴＩ’：２て形質転換した。形！１転換さイ
また酵Ｕ１の培地をラノオリセプクー分旨と軟寒天コロ
ニー形成法の両者で分析した。（＋−ｄ”れの分析法で
乙、酵母培地中に生物学的に活性なＴＧＦ−αが検出さ
れた。更に実験を重ね、培地ｌπＱから約８ｎ９の′Ｉ
″ＧＦ−αを回収できた。また、酵母内で生成５れた後
、この生物学的に活性なＴＧＦ αの９０％以上か分
泌されろ、ということかわかった、、分泌されたＴＧＩ
−αは、その活性か表れる際にノスルフィド結合の再屈
折（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を必要としないので、適切な
ノスルフｆド枯合に基つく立体配置を存していると思わ
れる。最と、α因子に基づく同様な発現ベクターを用い
て酵母中でヒトＥＧＦを発現、分泌させ得たとの報告か
ある（Ｂｒａｋｅら、１９８４、”Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
１１． ＡＣａｄＳｃｉ ｌＳ、＝ｔ”８ ｌ −
Ｉ ＋ｉ Ｉ ２）、。 ６ＴＧＦ αＣポリペプチドの発現 ｐＴＥ１をＢｇｌｌとＢａｍＨｌてｌ白化し、ＴＧＦα
Ｃ含角゛フラグメントを回収した。Ｅｃｏ［ｔ１部位、
メチオニノコトン、並びに前駆体中で、第１１５番Ｉｆ
７＞ ｌ ｌＩ！から始まるＴＧＦ αＣポリペプチ
ド５）最明の６個の残基、を表して（・る配列。 ＭｅｔｌｌｅｌｌｅＴｈｒＣｙｓＶａｌＬｅｕＧＡＴＣ
Ｇ＊へ６〜ＴＴＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴ
ＧＣＴＧｃｏＲ１ 、）オリゴヌクレオチドプライマーをコＭ製した。こ、
・）プライマーＪ）５゛側におけるＴ Ｇ Ｆ αＣ
含有フラグメ／トは、通常の方法でプライマーを延長さ
せていく間に欠失されん。ＴＧＦ−αＣポリペプチドを
暗号化しているＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびｒ３ｇｌ［
Ｉ７１’を化物のゲル電気泳動によって回収した。 別法として、このＤＮＡは有機合成法で調製して乙よい
。 ｐＴＥｓをＥｃｏＲｌとＢｇｌ［で消化し、大きいベク
ターフラグメントを回収した。回収したｐＴＥ、１−ｔ
−／：ノメ／１・ど１ｊ１１し〉１室階’ｉ：ｉ’Ｊ／
−Ｌ：ｃｎｌし目キ：１１１処理Ｔ Ｇ Ｆ αＣフ
ラグメノトを′ｌ゛１リカーゼてライゲートし、得られ
ｆ二混合物を用いてｉ：、ｃｏｌｉを形質転換し、この
細菌を１記の如く培養しｆ二つ′ｌ″ＧＦ αＣはＥ、
ｃｏｌｉに対してかなりｆＴ ｉ！ｊで（）−１に。Ａ
’ｒＧ開始フトンの代イ）りにＥ ｃｏｌ＋ｓＴ１．
１上ｆこはアルカリ性ホスファターゼ信号を挿入４−ろ
等の方法でオリゴヌクレオチドを修飾するか、ししくは
このＴＧＦ−αＣａ伝子を、哺乳類細胞の形質転換宿主
〜ベクター系で発現さＵ゛れば収率の向上がみられるか
もしれない。 以下に本明細書中に引用した文献を列記する。 象醐址練 Ｉ 、 Ｄｅ Ｌａｒｃｏら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
１１． ５ｃａｄ、 ５ｃｉ（ＵＳＡ）７５（１９７
８） ２ 、 Ｔｏｄａｒｏ、 Ｇ 、 Ｊ ら、Ｊ、 Ｓ
ｕｐｒａｍｏｌｅｃ、 ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ、
１５．２８７（１９８１）。 ３、 ）ｊｏｂｅｒｔｓら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ４２ 。 ２６２１（１９８３）。 ５ｃ−ｉ４見５Ａ）７７．３４９４（１９８０）。 Ｓｃｉ、（：ＵＳＡ）７７．５２５８（１９８０）ｉｉ
Ｉ’Ｊｚａ＋＋ｎｅ、［３ら、Ｊ、Ｃｃｉｌ−１）ｈｙ
ｓｉｏｌ、ＩＯ５゜１６：（（１９８０） ７ Ｍｏｚｅｓ、Ｈ，Ｌ ら、Ｃａｎｃ（！ｒ
ＥＬｅｓ、 ４１．２８・ｉ２（＋９８１） ８ 、 Ｃａｒｐｃｎｔｅｒ、 Ｇ ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａ１１． Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 （ＬＪＳＡ）８０．５６２７（１９８３）９
〜Ｉａｓｓａｇｕｅ、Ｊ 、 、Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、
ＣＩ＋ｅｍ、 ２５８ 。 １０、 Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｆ、 Ｈ，Ｊｒ ら、Ｎ
ａＬｕｒｅ２９２ 。 １１ Ｐｉｋｅ、Ｌ、Ｊ ら、Ｊ、 Ｂｊｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２５７゜１２ ＮＩａｓｓａｇｕｅ、
Ｊ 、 、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
５ｃｉ（Ｌ；Ｓ、、Ａ）７９．６８２２（１９８２
）１３、へｎｚａｎｏ、Ｍ、 Ａ ら、 Ｃａｎｃｅ
ｒ ｌ ｅｓ、４２゜＄７７６（１９ｆ１２）。 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）８０．６２６４（１９８３１１６
、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ａ 、 Ｂ ら、ＮａＬｕｒｅ
２９５．４ ｌ ７（１９８２）。 １７、 、Ａｎｚａｎｏ、Ｍ、Ａ、ら、Ａｎａｌ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｔ ｌ ２５ 。 ２１７（１９８２）。 １８、 Ｒｏｂｅｒｔｓ、、Ａ、 Ｂ、ら、肋に駁畦５
ｔｒｙ、印刷中 １９、 Ｆｒｏｌｉｋ、Ｃ，Ａ、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１
１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 （ＵＳＡ）８０．３６７６（１９８３）。 ２０、 Ａｓ５ｏｉａｎ、ＲＫ ら、Ｊ 、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ２５８ 。 ７ ＋ ５５（＋ ９８３）− ２１、０ｚａｎｎｅ、Ｂ ら、Ｊ、Ｃ：ｅｌｆ、 Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、 ｌ ０５゜１６３（＋９８０）。 Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ６．５ａＬｏ、Ｇ、 Ｉ−１ら
′ｌＸＡ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ［１ａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、 ｌ ｌ ３（１’＋７９） ２３、 ’Ｉ’ｗａｒ＋１ｚｉｋ、Ｉ）、１ｋ ら、
５ｃｉｅｎｃｅ２１６，８９４（＋９８２） ２４、 Ｔｖａｒｄｚｉｋ、Ｄ Ｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙｌ ２４．２０１２５、 Ｋａｌ）ｌａｎ、Ｐ、Ｌ
ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１０８．４８４（１９８＋） ２６、 Ｋａｐｌａｎ、Ｐ、Ｌ ら、Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙｌ ２ ３，３ ２ ７（＋９８０）。 ２７、 Ｍａｓｓａｇｕｅｊ 、、１． Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５８゜＋３６０６（１９８３
）。 ２ｇ、 Ｓ ｈｅｒｖｉｎ、 Ｓ 、 Ａ ら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ４３ 。 ４０３（＋９８３） ２９、 Ｋｉｍｂａｌｌ、Ｅ、 Ｓ ら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 投稿中 ３０、 Ｃｏｃｋｌｅｙ、に、 Ｄ、ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 投稿中 ３１、５ｐｏｒｎ、Ｍ、 Ｂ ら、ＮｅｗＥｎｇｌ、
Ｊ、 Ｍｅｄ３０３．８７８（１９８０）。 ３２、 Ｋａｐｌａｎ、Ｐ、 Ｌ、 ら、 Ｐ ｒｏｅ
、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ。 ３３、 ’ｒｏｄａｒｏ、Ｇ、 Ｊ ら、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｔｅｓ、 ３８ 。 ４１４７（１９７８）。 ３４、 ＭａｒＱｕａｒｄｔ、Ｈら、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｗ、 ２５７ 。 （１９７８）。 ３７、 Ｉｂｂｏｔｓｏｎ、に、Ｊ ら、５ｃｉｅ
ｎｃｅ２２１ 、 ｌ ２９２（＋９８３） ３８、Ｃｒｅａ、 Ｒら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 ８゜３９、 Ｄｅ Ｒｏｏｉｊ、Ｊ、 Ｆ
、 Ｍ、ら、Ｒｅｅｌ、 ＴｒａｖＣｈｉｍ、 Ｒａ
ｙｓ−Ｂａｓ９８．５３７（１９７９）４０、 Ｌａｗ
ｎ、Ｒ，Ｍ、ら、Ｃｅ１１． １５．１１５７（＋９７
８） Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７７．５２０１（１９８０）４３、
ＫａｒＸＩＬｔ＋ｓ、Ｆ、Ｃ，ら、Ｎｕｃｊ、−
−Ａｃｉｄｓ ｒｙｅｓ。 ７．１５４１（１９７９） ＋Ｉ４． ５ｏｕＬｈｅｒｎ、Ｅ、 Ｍ、 、Ｊ 、
Ｍｏ１． Ｂｔｏｌ、 ９８゜５０３（＋９７５） ４５、 Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ ら、 Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓジ、３０９（１９８１） ４６、 Ｓｍ１ｔｈ、Ａ、 Ｊ 、 Ｈ，、ＭｅＬｈ、
Ｅ＋＋ｚｙｉ、 ６５゜５６０（１９８０）。 ４７、１３ｒｃａＬｈｎａｃｈ、ｌＬ、ら、Δｎｎ、
ｒｔｃｖ、 Ｕｉｏｃｈｅｔ５０．３４９（１９８１）
。 ４８、 Ｇｒａｙ、Ａ ら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３ 、
７２２’（１９８３）。 ４９、５ｃｏＬｔ、Ｊ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
１．２３６う０． Ａｖｉｖ、Ｈら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 （ＵＳＡ）６９．１４０８（１９７２）５１、 Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、ら、ＮａＬｕｒｅ２８７．４１１（
１９８０’） ５２、 ＷｉｃｋｅｎｓｏＭ、Ｐ ら、去」υｏ１．
ｃｈｅｍ、 ２５３ 。 ２４８３（＋ ９７８）。 ５３、 Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、 Ｖ、ら、ＮａＬｕｒｅ
２８ ｌ 、 ５４４（１９７９）。 ５４、 Ｃｈａｎｇ、Ａ、Ｃ，Ｙ ら、ＮａＬｕｒｅ
２７５ 、６１７（１９７９）。 ５５、 Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ、ら、Ｇｅｎｅ ２．９
５（１９７７）。 （ＵＳＡ）７３．４１７４（１９７６） −５Ｌ
ｌ１ａｎａｈａｎ、Ｄ、、Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
１６６，５５７（１９８３）。 ５９、 ｌ−１ａｎａｈａｎ、Ｄ ら、Ｇｅｎｅｌ
Ｏ，６３（１９８０）６Ｇ、 Ｋｏｚａｋ、Ｍ、、Ｎ
ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９．５２３３（＋
９８１） ６１、 Ｐｅｒｌｍａｎ、Ｄ、 らｊ 、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ｌ ６ ７ 。 ３９１（＋９８３） ６２、 Ｂ １ｏｂｅｌ 、 Ｇ 、ら、Ｓｏｃ、 Ｅ
ｘｐ、 Ｂｉｏｌ、 Ｓｙｍｐ３３．９（１９７９） ６３、 Ｎｏｄａ、Ｍ、ら、ＮａＬｕｒｅ ２９５，２
０２（１９ｇ２）６４、 Ｇｕｂｌｅｒ、Ｕ、 ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９５，２０６（１９８２）。 ｂ５ ＼ｎａｒａ、Ｓ、 Ｇツ、Ｎａｔｕｒｅ ２
９８．２４０６６ ＼ａｋＸＩｎｉｓｈｉ、Ｓ ら
、Ｎａｔｕｒｅ ２７８．４２３６７、 Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ、Ｄ 、 Ｖ ら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、
１ｉｅｓ。 ８．４０５７（＋ ９８０） ６８、 Ｇｒａｙ、Ｐ、 Ｗ ら、ＮａＬｕｒｅ
２９５．５０３（＋９８２） ６９ 〜ＩｃＧ ｒａＬｈ、 Ｊ 、 ｌ’ ら、Ｎ
ａＬｕｒｅ２９５．４２３（＋９８２） ７０、 Ｐｅｎｎ１ｃａ、Ｄ ら、ＮａｔｕｒｅＡ
」ＬＬ、 ２１４（１９８３）。 ７１、 Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、［−１ら、ＤＮＡ２．３
７（１９８３）７２、 Ｉ ｔａｋｕｒａ、Ｋ ら、
５ｃｉｃｎｃｅ １９８．１０５６７３、 Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ、Ｄ、 Ｖ ら、Ｐ ｒＯｃ、 Ｎａ１１．
Ａｃａｄ（＋９８０）。 ７５ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰ ａＬＬｃｒｓ
ｏｎ、著（＋９７３）７６、 Ｍｉｏｚｚａｒｉ、Ｇ、
Ｆ およびＹ ａｎｏｆｓｋｙ、 Ｃ、。 、１．１３ａｃＬｅｒｉｏ１． ｌ ３３，１−１５
７−１４６６（＋９７７） ７７、ヨーロッパ特許出願公開番号第００８８６２２号
７８、 Ｙ ａｎｓｕｒａ、 Ｄ 、 ら、Ｅｌフ
０ ００６ｇ６９３．３ ａ 章７９、 Ｌａｅａ
ｕｅｌｉ、Ｕ、 Ｋ、 、Ｎａ１ｕｒｅ ２２７
．６８０（ム９７０） ３０、 Ｓ １ｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅ１１２０．
２（ｉ９（１９８０）８１、 Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ
ら、Ｎａ１ｕｒｅ２８２．３９（１９７９）８２、
Ｋｉｎｇｓａａｎら、Ｇｅｎｅ７，１４１（１９７９）
８３、 Ｔ ｓｃｈｕｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅｌ Ｏ，１
５７（１９８０）８４、 Ｊｏｎｅｓ、ＧｅｎｅＬｉｃ
ｓ８５，１２（１９７７）！１５． ＨｉＬｚｅｍａ
ｎら、Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２５５
。 ２０７３（１９８０）。 ＋！６． Ｈｅ５ｓらｊ 、Ａｄｖ、 Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｒｅｇ、 ７ ．１ ４ ９８７、 Ｈ
ｏ１ｌａｎｄら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌ ７
、４９００８ｇ、 Ｆｉｅｒｓら、ＮａＬｕｒｅ２
７３ 、 ｌ ｌ ３（ｌ ９７８）８９、 Ｇ ｒ
ａｈａｍら、Ｖｉｒｎ１ｏｇｙ５２．５４６（１９７８
）９０、 Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
、Ｈｄ、Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）６９．２１ １０（１
９７２） ９１、 Ｍａｘａｍら、ＭｅＬｈｏｄｓ ｉｎ
ｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５ 。 ４４９’（＋９８０） ９２、 Ｃｈａｎｇら、ＮａＬｕｒｅ２７５，６１５
（１９７９）。 ９３ ヨーロッパ特許出願公開番号第００３６７７６
号９４、 Ｇｒａｎｔｈａｉ、Ｒら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ
１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９゜ｒ４３（１９８１）。 ９５、 Ｂｅｎｔｏｎ、Ｗ、 Ｄ およびＤａｖｉｓ
、Ｒ，Ｗ。 ５ｃｉｃｎｃｅ１９６．１８０−１８２（１９７７）
ｓｅａｒｃｈ ＬＸＩｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから人手
した。またＴ４キナーゼはＮｅｖ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＢ ｅｔｈｅｓｄ
ａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
そしてＥ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノ
ーフラグメント）はＮ ｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄＮｕ
ｃｌｅａｒ またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｃｉｍからそれぞれ得た。全ての酵素類は製造者の
指示に実質」−従って用いた。 Ｔ４４キナーゼ応は、７０ＩＩＭトリスーＨＣ１（ｐＨ
７６）、ｌＯａＡＭのＭｇＣＩｔおよび５ｍＭｍナノチ
オトレイトール中った０ライゲーノジンは、２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（＋）Ｈ７、ｓ ）、５０ｍＭのＮαＣｌ
、（ｉｍＭｕ’、’ＭｇｃＬ、Ｉ Ｏｌ１Ｍ ）・Ｐ
’４’ ｌ・シｒｌｌＬによび０．５ｍＭのＡＴＰ中で
行った。制限消化は、６ｍＭｈリスーＨＣＬ ６ ｍＭ
のｌｖｌｇｃｌ、および６ｍＭβ メルカプトエタノー
ル中で行ったが、ＤＮＡ−ポリメラ一ゼ１（クレノーフ
ラグメント）を用いた“；】める（ｒｉ、ｌｌ ｉｎ）
”ための反応は同し緩衝液に４種類のｄＮＴＰ（各々２
０μＭ）を補足しｌ二液中で行った。 第５図はプラスミドｐＴ Ｅ ５およびｐＴＥ６を表４
゛模式図であって、ＴＧＦ−αとそれに先行するｔｒｐ
ＬＥ融合タン融合タンパ色質配列しているアミノ酸配列
を示している。 これらのプラスミドｐＴＥ５およびｐＴＥ６をＥｃｏｌ
ｉ Ｗ３１１０に導入してｔｒｐプロモーターを誘導し
、その結果高レベルでＴＧＦ−α融合タンパク質を生成
させる。プラスミドｐＴＥ６から発現した、長い融合タ
ンパク質は、全細胞溶解物中に圧倒的に多量に含まれろ
主要タンパク質である。 プラスミドｐＴＥ５に暗号化されている短い融合タンパ
ク質は、非常に多量生成されるという訳てはないか、Ｉ
・：、ｃｔ山溶解物中の潰勢なバンドとして検出し得る
（第６図）。 第６図は、発現プラスミドｐＴＥ２、ｐＴＥ３、ｐＴＥ
５またはｐＴＥ６を含んでいるＥ、Ｃ０１ｉの全溶解物
について行ったＳＤＳ Ｉ ３％ポリアクリルアミドゲ
ル（７９）中での電気泳動の結果を表した乙のでめる。 これらのプラスミドで彩質転換したＩＥ、ｃｏｌｉ Ｗ
３１１０を、カサミノ酸およびテトラ４Ｆ（クリ：／
（５ｔｔ ｇ／ｘ（１）を含んだＭ９培地中、３７０Ｃ
でＯＤ、、。＝０１になるまで増殖させた。ｔｒｐプロ
モーターからの発現をインドール酢酸２０μり／、１Ｑ
の添加によって誘導した。まず、誘導面、０Ｄｓｓａ−
０，１の段階で細菌３ｘ（ｌを採り、更に誘導後、ｐ′
ｒＥ２およびｐＴＥ５の場合ハ０Ｄｓｓｏ−１，０゜ｐ
ＴＥ３およびｐＴＥ６の場合はＯＤ ｓ ｓ。−０，７
の段階で同数の細菌を採取した。ベレット化した細菌を
３０７ｚＲの１０ｍＭトリス−ＩＩ ＣＩ（ｐＨ７、５
）、ｌｌ〜（ＥＤＴＡおよび３μＱの１Ｍβメルカプト
エタノール中に再慧劇し、６μｅの１０％ＳＤＳを加え
Ｌｏこの混合物を９５℃で２分間加熱し、３００ ＩＩ
ジの冷アセトノを加えた。アセト）沈殿をベレット化し
、２５μＱのＳＯ８・充填用１衝液（５％メルカプトエ
タノール、４％ＳＤＳ、０．１２５ＭトリスーＨＣＩ（
＋）ｌ−１６，８）および２０％グリセリン）に溶かし
、９５℃で２分間加熱した後、５ＤＳ−１３％ポリアク
リルゲル上に詰めた。このゲルをクームノー・ブリリア
ント・ブルーで染めた。誘導の前後における細菌溶解物
を示す。矢印はＴ Ｇ Ｆ α融合タンパク質を指示
している。 マーカー分子の分子量を、この第６図の右側に示した。 次いで、ｐＴＥ５て杉質転換したＥ、ｃｏｌｉからの短
い融合タンパク質を、その生物学的活性を測定するため
に実質上、豊富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ） シた。 ２トＲの方法（カラムクロマトグラフィーを含まず）に
よって純度を８０〜９０％にした。１つの方法は、この
短い融合タンパク質か池の多くのタンパク質と異なり、
０ 、４ ＭのＮαＣｌと０５％ＮＰ４０の（？、（１
［下で不溶であると思われろ、との観察に基づいている
。次いでこの沈殿を８Ｍの尿素に溶かし、１〜！酢酸に
χ・ｒして込ｔｌｉ’Ｊ°る。ＩＩ工工性性１１Ｉ９分
は大部分の′ｌ″ＧＦ〜α融合タンパク質を含Ｈしてい
る。 別法として、ＨＣＩ酸性の７０％エタノール中で細菌を
超音波処理し、透明な上澄液からエーテル−エタノール
沈殿によってＴ Ｇ ＋”−α融合タンパク質を析出さ
仕、１Ｍ酢酸に溶かｔ’（１８）。ゲル電気泳動分析に
より、これらの両方法で同等の豊富化効果か得られるこ
とが示された。（第７図）。 第７図は、酸−エタノール法でα富化した短い細菌性Ｔ
ＧＦ α融合タンパク質のＳ ｌ） Ｓポリアクリル
アミドケル（７９）中の状態を示している。 ６８アミノ酸長さのＴＧＦ α融合タンパク質は、この
ゲル内で幅の広いバンド（矢印）として多動しｊ為ＮＰ
４０−ＮαＣ１法によってα富化したタンパク質も非常
によく以た状態を示す。 こうして得た細菌性の短いＴＧＦ α融合タンパク質
を２つの異なる方法で試験した。天然のＴＧＦ αは
ＥＧＦと同じ受容体を競合するということが示されてい
る（５．８．９）。このことが、１″ｌ−標識ＥＧＦと
の競合に基づく、ＴＧＦ−αす）迅速か−ノ定’Ｊ的な
カ折法の開発を乙ノこ吻しノー（５，１４，２７）。Ｎ
Ｉｔ Ｋ細胞を用いた結合実験（１５、Ｉ９．２７）
では明らかに、ＴＧＦ’−α融合タンパク質は臭化シア
ンによる開裂で得たＴＧＦ−α（示されていない）と同
様に、ＥＧＦ−受容体と結合ずろことか示された。しか
しながら、結合した短いＴＧＦ−α融合タンパク質は、
この実験条件の下てＴＧＦ−αとＥＧＦとが同じ受容体
に対して量的に同等の結合性を有すると仮定して求めた
予測（／！の０．５〜１％にしかすぎない。この低い値
はヒトＴＧＦ αの結合に対する親和性が低いこと、異
常な立体配置をとっている分子が存在すること、あるい
は、採用した結合条件が細菌性ＴＧＦ−αには不適当な
乙のであったことによるのからしれない。 ラジオリセプターアッセイにおける、細菌性の短いＴＧ
Ｆ−α融合タンパク質と１２５１−標識ＥＧＦとの競合
状況を第８図のＡ面に示す（実線）、、ＥＧＦによる検
量線を破線で示した。Ｂ而は、ＥＧＦ検量線の抜粋であ
る。 ′Ｉ’ Ｇ ｌ・゛ αの生物学的な活性は、Ｎ１ｔＫ
細胞の様な非彩質転換細胞におけるアンカレッジ・イン
ディベンダンスの誘導能力によって測定し得る。 １’ Ｇ Ｆ−αまたはＥ Ｇ ｌ”の存在によってコ
ロニーの形成が誘導される。これらのコロニーの敗およ
び大きさは］’ Ｇ Ｆ−βの存在によって強力に増大
される（１３−１４）。市Ｉ述の如く精製した細菌性の
ｉ” ＣＩ” αのアンカレッジ・インディベンダン
ス誘導能力をＮＨＫ細胞を用いて調べた（１４０）。 第９図は、ネズミＥＧＦと、臭化シアンによる開裂面お
よび後の細菌性ＴＧＦ−α融合タン融合タンパクラとの
軟寒天コロニー形成活性を示ｔグラフでうろ。この分析
は、文献記載の如く、ＴＧＦ−βの１７：在下、ＮＨＫ
細胞、クローン４９ドを用いて行った（Ｉ４）。縦軸は
８５０μが以上のコロニーの数を示し、横軸は、ＥＧＦ
受容体結合分針で求めノ二ＥＧＦ当量（ｎｌ／ｚｃ）と
して表したＥＧＦまたは細菌性ＴＧＦ−αの濃度を示し
ている。破線はＬ： Ｇ ｌ）、実線は細菌性Ｔ Ｇ
Ｆ−α融合タンパク質に関する結果であり、（○）は臭
化シアンで開裂する＋１ｉｊ１（・）は開裂後の値をＩ
ドす。これらの結果は明らかに短いＴ Ｇ Ｆ−α融合
物がＴＧＦ−βの存在の下において、軟寒天中でのコロ
ニー形成の引き金となっていることを示している。これ
らの分析においては、ラジオリセブターアブセイの場合
と比較して、細菌性ＴＧＦ−αがＥＧＦよりら約２０〜
３０倍ら活性であることが注目される。この様なｈｔ的
な相違は、臭化シアンで開裂したＴＧＦ−α融合タンパ
ク質に関してら明白である。ＴＧＦ−βの不存在下で細
菌性Ｔ Ｇ １？−αによって誘導されるコロニーの敗
および大きさははるかに少なく小さいが、この様な分析
条件の下での細菌性ＴＧＩ？−αとＥＧＦとの間の量的
な差異は変わることなく保たれている。 これら２種類の分析の結果は、１７個の−Ｎ［ｈ末端ア
ミノ酸を’ＦＴする細菌性ＴＧＦ−α融合タノパク質、
およびその臭化シアンで開裂されたタンパク質が、ＥＧ
Ｆと競合し、Ｎ Ｉｔ Ｋ細胞のアンカレッジ・インデ
ィベンダンスを誘導し得ることを示している。軟寒天中
における２０ニー形成の誘・ｉ’７１’ｒ ＩＩＩ ＋
Ｊ、−／ ：／ ｉリセ−ｚ ’ｉ −ｒ’ ＝＋
セ（ｉコｌｌ１ｉ−バＰせＩをはるかに上回−・て（・
ろ。老−この場合によ〕いて、１’ Ｇ Ｆ α：よ
軟寒天中では、ラノオリセプターアッセイの場合より乙
２０〜３０倍らＩ’＋’ｉ１い活性を示している（ＥＧ
’Ｆとの比較において）。 ：ｖｌａｓｓａｇａｅら（１２）は、′Ｉ’ＧＦ ば
かＬ’： Ｇ Ｆ受容体、）みζらず６０ｋｄＴＧＦ
α特異抗体と乙結合するということを提示した。後者の
受容体との結１”？ ７戸１，１：公的に′ｌ’ Ｇ
ｌ’ イＩによるＹノ力しノノ−ディベノｙノド性の
誘怪を媒介しているＩｌｌｌ性能ある。らしそうであれ
ば、Ｅ Ｇ Ｆラノオリセブタ−アノセイは軟寒天中で
のコロニー形成を予測する上で絶対的な色味を持たない
といえろ。また、二τ′、らの６受容体に対してＴＧＦ
αの結番性は同一でないからしれない。これに反して
、Ｃａｒｐｅ−ｎｔｅｒら（８）は、最近、ＴＧＦ
αによるアノカレッノインデイベノダノス誘導かＥＧＦ
受容体抗血清７）＃在によって阻止され得ることを示し
、この受容体との結合が軟寒天中てのコロニーの発現に
とって必要であることを指摘した。更に、細菌性ＴＧＩ
″ ｒｒか、ラノ−ｉ ｊｌセブタ −Ｉ′Ｊセ（刀条
１’ｌ＝ １Ｌｌ）ら、軟’１％ Ｊ分を斤の条件ドて
Ｌ ｉｔ （（功に［＞ Ｇ ｌ’ソ８１４と結合しｉ
Ｕる可能性らあり１、ニ５りこと：ま、こり、ら両分針
法において観察されたら１的八差ｖＩ８を説１１月する
乙のといえろ。 ５ 漿朋刈１グエ旦Ｆ−ｍ作多揚 酵母内で′Ｉ″ＧＦ αを発現させ、引き続きそれを
酵母培地中に分泌させることを［１的として１つ・７）
プラスミドを組）′してノラ この１」的の１こめに、
我ＩＪｉ１酵母にわ（ｊろ、接合（交配）因子（）、Ｐ
ｌター）αの１１１用性を追求した。このα因子は、酵
母５ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから分泌され、接合過程で生
理的に重要な役割を果たす因子である。このα−因子に
関する遺伝子は既に単離Ｊれており、大きし１前駆体を
暗号化していることかわかっている。二のプレプロ−α
−因子ポリベプチトは、分泌過程に必要なアミノ末端の
信号ポリペプチドと、４つの同しα因子ペプチド単位か
ら成る。これらα−因子ベプチド類の放出時に′は、前
駆体の二塩基性ｌ、ｙｓ−Ａ「ｇ残基（これらは信号ペ
プチドの下流、α因子単１、°Ｉい先端に位ｊＭｌ 、
Ｊ−ろ）の１１７置におけろタノバク分解的開裂が起こ
ると思われる（ｊ、 Ｋｕｒｊａｎら、１９８２、”Ｃ
ｅ１１”３０：９３３：Ｓｉｍｇｈら、１９８３、“Ｎ
ｕＣｌ、、へＣ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ” ｌ
Ｉ ：４ ０ ４ ９）。 ＴＧＦ−α発現プラス
ミド（ｐｙＴ Ｅ ２ ）は、アミノ酸数５０のＴＧＦ
−αの暗ぢ配列とそれに接する終止コドンとをフレーム
内の、酵８１α−因子のＬｙｓ−Ａ「ｇノペプヂトに関
するコドンの直後に導入する様、組立てた。信号ペプチ
ドを含む、このプレプロ−α因子のアミノ末端部分の配
列はそのまま保持−、イーでいろ、この’Ｉ’ Ｇ ｌ
” α融合ポリペプチドの発現（１α ファクタープ
ロモーターのコントロール下に３うろ。この様な、まノ
ニは同等の場合において適当な出発物質であるプラスミ
ドは、ヨーロッペ持許第１２３．５４４Ａ号に記載され
ている。 発現プラスミドｐｙＴＥ２（第１０図）は、更に、２μ
プラスミド（Ｊ 、 ｌ（ａｒｔ ｌｅｙら、１９８０
、′＼ａｔｕｒｅ”２８６：８６０）から導かれた、酵
母の機能的に複製起源、”Ａｂｌｅ”遺伝子（Ｊ 、
）（ａｒｔｌｅｙら、同上）から導かれた転写ターミネ
ータ−およびボリアデー／ＩＪＴ１１７１、ｌｌｉヒ１
ＱＴ１１＋＋ １選択−ｔ カ（ＧＴ ｓｃｈｕｍ
ｐｅｒら、１９８０、“Ｇｅｎｅ”ｌ Ｏ：ｌ ５７−
１６６）を含灯している。 Ｓ ３ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ菌株２０ｒ３ １１２（Ｅ、、 Ｊｏｎｅｓ、
ｌ ９７ Ｇ、“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ” ８５ ： ２３
）をｐｙＴＩ’：２て形質転換した。形！１転換さイ
また酵Ｕ１の培地をラノオリセプクー分旨と軟寒天コロ
ニー形成法の両者で分析した。（＋−ｄ”れの分析法で
乙、酵母培地中に生物学的に活性なＴＧＦ−αが検出さ
れた。更に実験を重ね、培地ｌπＱから約８ｎ９の′Ｉ
″ＧＦ−αを回収できた。また、酵母内で生成５れた後
、この生物学的に活性なＴＧＦ αの９０％以上か分
泌されろ、ということかわかった、、分泌されたＴＧＩ
−αは、その活性か表れる際にノスルフィド結合の再屈
折（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を必要としないので、適切な
ノスルフｆド枯合に基つく立体配置を存していると思わ
れる。最と、α因子に基づく同様な発現ベクターを用い
て酵母中でヒトＥＧＦを発現、分泌させ得たとの報告か
ある（Ｂｒａｋｅら、１９８４、”Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
１１． ＡＣａｄＳｃｉ ｌＳ、＝ｔ”８ ｌ −
Ｉ ＋ｉ Ｉ ２）、。 ６ＴＧＦ αＣポリペプチドの発現 ｐＴＥ１をＢｇｌｌとＢａｍＨｌてｌ白化し、ＴＧＦα
Ｃ含角゛フラグメントを回収した。Ｅｃｏ［ｔ１部位、
メチオニノコトン、並びに前駆体中で、第１１５番Ｉｆ
７＞ ｌ ｌＩ！から始まるＴＧＦ αＣポリペプチ
ド５）最明の６個の残基、を表して（・る配列。 ＭｅｔｌｌｅｌｌｅＴｈｒＣｙｓＶａｌＬｅｕＧＡＴＣ
Ｇ＊へ６〜ＴＴＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴ
ＧＣＴＧｃｏＲ１ 、）オリゴヌクレオチドプライマーをコＭ製した。こ、
・）プライマーＪ）５゛側におけるＴ Ｇ Ｆ αＣ
含有フラグメ／トは、通常の方法でプライマーを延長さ
せていく間に欠失されん。ＴＧＦ−αＣポリペプチドを
暗号化しているＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびｒ３ｇｌ［
Ｉ７１’を化物のゲル電気泳動によって回収した。 別法として、このＤＮＡは有機合成法で調製して乙よい
。 ｐＴＥｓをＥｃｏＲｌとＢｇｌ［で消化し、大きいベク
ターフラグメントを回収した。回収したｐＴＥ、１−ｔ
−／：ノメ／１・ど１ｊ１１し〉１室階’ｉ：ｉ’Ｊ／
−Ｌ：ｃｎｌし目キ：１１１処理Ｔ Ｇ Ｆ αＣフ
ラグメノトを′ｌ゛１リカーゼてライゲートし、得られ
ｆ二混合物を用いてｉ：、ｃｏｌｉを形質転換し、この
細菌を１記の如く培養しｆ二つ′ｌ″ＧＦ αＣはＥ、
ｃｏｌｉに対してかなりｆＴ ｉ！ｊで（）−１に。Ａ
’ｒＧ開始フトンの代イ）りにＥ ｃｏｌ＋ｓＴ１．
１上ｆこはアルカリ性ホスファターゼ信号を挿入４−ろ
等の方法でオリゴヌクレオチドを修飾するか、ししくは
このＴＧＦ−αＣａ伝子を、哺乳類細胞の形質転換宿主
〜ベクター系で発現さＵ゛れば収率の向上がみられるか
もしれない。 以下に本明細書中に引用した文献を列記する。 象醐址練 Ｉ 、 Ｄｅ Ｌａｒｃｏら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
１１． ５ｃａｄ、 ５ｃｉ（ＵＳＡ）７５（１９７
８） ２ 、 Ｔｏｄａｒｏ、 Ｇ 、 Ｊ ら、Ｊ、 Ｓ
ｕｐｒａｍｏｌｅｃ、 ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ、
１５．２８７（１９８１）。 ３、 ）ｊｏｂｅｒｔｓら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ４２ 。 ２６２１（１９８３）。 ５ｃ−ｉ４見５Ａ）７７．３４９４（１９８０）。 Ｓｃｉ、（：ＵＳＡ）７７．５２５８（１９８０）ｉｉ
Ｉ’Ｊｚａ＋＋ｎｅ、［３ら、Ｊ、Ｃｃｉｌ−１）ｈｙ
ｓｉｏｌ、ＩＯ５゜１６：（（１９８０） ７ Ｍｏｚｅｓ、Ｈ，Ｌ ら、Ｃａｎｃ（！ｒ
ＥＬｅｓ、 ４１．２８・ｉ２（＋９８１） ８ 、 Ｃａｒｐｃｎｔｅｒ、 Ｇ ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａ１１． Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、 （ＬＪＳＡ）８０．５６２７（１９８３）９
〜Ｉａｓｓａｇｕｅ、Ｊ 、 、Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、
ＣＩ＋ｅｍ、 ２５８ 。 １０、 Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｆ、 Ｈ，Ｊｒ ら、Ｎ
ａＬｕｒｅ２９２ 。 １１ Ｐｉｋｅ、Ｌ、Ｊ ら、Ｊ、 Ｂｊｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２５７゜１２ ＮＩａｓｓａｇｕｅ、
Ｊ 、 、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
５ｃｉ（Ｌ；Ｓ、、Ａ）７９．６８２２（１９８２
）１３、へｎｚａｎｏ、Ｍ、 Ａ ら、 Ｃａｎｃｅ
ｒ ｌ ｅｓ、４２゜＄７７６（１９ｆ１２）。 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）８０．６２６４（１９８３１１６
、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ａ 、 Ｂ ら、ＮａＬｕｒｅ
２９５．４ ｌ ７（１９８２）。 １７、 、Ａｎｚａｎｏ、Ｍ、Ａ、ら、Ａｎａｌ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｔ ｌ ２５ 。 ２１７（１９８２）。 １８、 Ｒｏｂｅｒｔｓ、、Ａ、 Ｂ、ら、肋に駁畦５
ｔｒｙ、印刷中 １９、 Ｆｒｏｌｉｋ、Ｃ，Ａ、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１
１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 （ＵＳＡ）８０．３６７６（１９８３）。 ２０、 Ａｓ５ｏｉａｎ、ＲＫ ら、Ｊ 、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ２５８ 。 ７ ＋ ５５（＋ ９８３）− ２１、０ｚａｎｎｅ、Ｂ ら、Ｊ、Ｃ：ｅｌｆ、 Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、 ｌ ０５゜１６３（＋９８０）。 Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ６．５ａＬｏ、Ｇ、 Ｉ−１ら
′ｌＸＡ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ［１ａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、 ｌ ｌ ３（１’＋７９） ２３、 ’Ｉ’ｗａｒ＋１ｚｉｋ、Ｉ）、１ｋ ら、
５ｃｉｅｎｃｅ２１６，８９４（＋９８２） ２４、 Ｔｖａｒｄｚｉｋ、Ｄ Ｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙｌ ２４．２０１２５、 Ｋａｌ）ｌａｎ、Ｐ、Ｌ
ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１０８．４８４（１９８＋） ２６、 Ｋａｐｌａｎ、Ｐ、Ｌ ら、Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙｌ ２ ３，３ ２ ７（＋９８０）。 ２７、 Ｍａｓｓａｇｕｅｊ 、、１． Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５８゜＋３６０６（１９８３
）。 ２ｇ、 Ｓ ｈｅｒｖｉｎ、 Ｓ 、 Ａ ら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ４３ 。 ４０３（＋９８３） ２９、 Ｋｉｍｂａｌｌ、Ｅ、 Ｓ ら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 投稿中 ３０、 Ｃｏｃｋｌｅｙ、に、 Ｄ、ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 投稿中 ３１、５ｐｏｒｎ、Ｍ、 Ｂ ら、ＮｅｗＥｎｇｌ、
Ｊ、 Ｍｅｄ３０３．８７８（１９８０）。 ３２、 Ｋａｐｌａｎ、Ｐ、 Ｌ、 ら、 Ｐ ｒｏｅ
、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ。 ３３、 ’ｒｏｄａｒｏ、Ｇ、 Ｊ ら、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｔｅｓ、 ３８ 。 ４１４７（１９７８）。 ３４、 ＭａｒＱｕａｒｄｔ、Ｈら、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｗ、 ２５７ 。 （１９７８）。 ３７、 Ｉｂｂｏｔｓｏｎ、に、Ｊ ら、５ｃｉｅ
ｎｃｅ２２１ 、 ｌ ２９２（＋９８３） ３８、Ｃｒｅａ、 Ｒら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 ８゜３９、 Ｄｅ Ｒｏｏｉｊ、Ｊ、 Ｆ
、 Ｍ、ら、Ｒｅｅｌ、 ＴｒａｖＣｈｉｍ、 Ｒａ
ｙｓ−Ｂａｓ９８．５３７（１９７９）４０、 Ｌａｗ
ｎ、Ｒ，Ｍ、ら、Ｃｅ１１． １５．１１５７（＋９７
８） Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７７．５２０１（１９８０）４３、
ＫａｒＸＩＬｔ＋ｓ、Ｆ、Ｃ，ら、Ｎｕｃｊ、−
−Ａｃｉｄｓ ｒｙｅｓ。 ７．１５４１（１９７９） ＋Ｉ４． ５ｏｕＬｈｅｒｎ、Ｅ、 Ｍ、 、Ｊ 、
Ｍｏ１． Ｂｔｏｌ、 ９８゜５０３（＋９７５） ４５、 Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ ら、 Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓジ、３０９（１９８１） ４６、 Ｓｍ１ｔｈ、Ａ、 Ｊ 、 Ｈ，、ＭｅＬｈ、
Ｅ＋＋ｚｙｉ、 ６５゜５６０（１９８０）。 ４７、１３ｒｃａＬｈｎａｃｈ、ｌＬ、ら、Δｎｎ、
ｒｔｃｖ、 Ｕｉｏｃｈｅｔ５０．３４９（１９８１）
。 ４８、 Ｇｒａｙ、Ａ ら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３ 、
７２２’（１９８３）。 ４９、５ｃｏＬｔ、Ｊ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２２
１．２３６う０． Ａｖｉｖ、Ｈら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 （ＵＳＡ）６９．１４０８（１９７２）５１、 Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、ら、ＮａＬｕｒｅ２８７．４１１（
１９８０’） ５２、 ＷｉｃｋｅｎｓｏＭ、Ｐ ら、去」υｏ１．
ｃｈｅｍ、 ２５３ 。 ２４８３（＋ ９７８）。 ５３、 Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、 Ｖ、ら、ＮａＬｕｒｅ
２８ ｌ 、 ５４４（１９７９）。 ５４、 Ｃｈａｎｇ、Ａ、Ｃ，Ｙ ら、ＮａＬｕｒｅ
２７５ 、６１７（１９７９）。 ５５、 Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ、ら、Ｇｅｎｅ ２．９
５（１９７７）。 （ＵＳＡ）７３．４１７４（１９７６） −５Ｌ
ｌ１ａｎａｈａｎ、Ｄ、、Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
１６６，５５７（１９８３）。 ５９、 ｌ−１ａｎａｈａｎ、Ｄ ら、Ｇｅｎｅｌ
Ｏ，６３（１９８０）６Ｇ、 Ｋｏｚａｋ、Ｍ、、Ｎ
ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９．５２３３（＋
９８１） ６１、 Ｐｅｒｌｍａｎ、Ｄ、 らｊ 、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ｌ ６ ７ 。 ３９１（＋９８３） ６２、 Ｂ １ｏｂｅｌ 、 Ｇ 、ら、Ｓｏｃ、 Ｅ
ｘｐ、 Ｂｉｏｌ、 Ｓｙｍｐ３３．９（１９７９） ６３、 Ｎｏｄａ、Ｍ、ら、ＮａＬｕｒｅ ２９５，２
０２（１９ｇ２）６４、 Ｇｕｂｌｅｒ、Ｕ、 ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９５，２０６（１９８２）。 ｂ５ ＼ｎａｒａ、Ｓ、 Ｇツ、Ｎａｔｕｒｅ ２
９８．２４０６６ ＼ａｋＸＩｎｉｓｈｉ、Ｓ ら
、Ｎａｔｕｒｅ ２７８．４２３６７、 Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ、Ｄ 、 Ｖ ら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、
１ｉｅｓ。 ８．４０５７（＋ ９８０） ６８、 Ｇｒａｙ、Ｐ、 Ｗ ら、ＮａＬｕｒｅ
２９５．５０３（＋９８２） ６９ 〜ＩｃＧ ｒａＬｈ、 Ｊ 、 ｌ’ ら、Ｎ
ａＬｕｒｅ２９５．４２３（＋９８２） ７０、 Ｐｅｎｎ１ｃａ、Ｄ ら、ＮａｔｕｒｅＡ
」ＬＬ、 ２１４（１９８３）。 ７１、 Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、［−１ら、ＤＮＡ２．３
７（１９８３）７２、 Ｉ ｔａｋｕｒａ、Ｋ ら、
５ｃｉｃｎｃｅ １９８．１０５６７３、 Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ、Ｄ、 Ｖ ら、Ｐ ｒＯｃ、 Ｎａ１１．
Ａｃａｄ（＋９８０）。 ７５ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰ ａＬＬｃｒｓ
ｏｎ、著（＋９７３）７６、 Ｍｉｏｚｚａｒｉ、Ｇ、
Ｆ およびＹ ａｎｏｆｓｋｙ、 Ｃ、。 、１．１３ａｃＬｅｒｉｏ１． ｌ ３３，１−１５
７−１４６６（＋９７７） ７７、ヨーロッパ特許出願公開番号第００８８６２２号
７８、 Ｙ ａｎｓｕｒａ、 Ｄ 、 ら、Ｅｌフ
０ ００６ｇ６９３．３ ａ 章７９、 Ｌａｅａ
ｕｅｌｉ、Ｕ、 Ｋ、 、Ｎａ１ｕｒｅ ２２７
．６８０（ム９７０） ３０、 Ｓ １ｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅ１１２０．
２（ｉ９（１９８０）８１、 Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ
ら、Ｎａ１ｕｒｅ２８２．３９（１９７９）８２、
Ｋｉｎｇｓａａｎら、Ｇｅｎｅ７，１４１（１９７９）
８３、 Ｔ ｓｃｈｕｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅｌ Ｏ，１
５７（１９８０）８４、 Ｊｏｎｅｓ、ＧｅｎｅＬｉｃ
ｓ８５，１２（１９７７）！１５． ＨｉＬｚｅｍａ
ｎら、Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２５５
。 ２０７３（１９８０）。 ＋！６． Ｈｅ５ｓらｊ 、Ａｄｖ、 Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｒｅｇ、 ７ ．１ ４ ９８７、 Ｈ
ｏ１ｌａｎｄら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌ ７
、４９００８ｇ、 Ｆｉｅｒｓら、ＮａＬｕｒｅ２
７３ 、 ｌ ｌ ３（ｌ ９７８）８９、 Ｇ ｒ
ａｈａｍら、Ｖｉｒｎ１ｏｇｙ５２．５４６（１９７８
）９０、 Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
、Ｈｄ、Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）６９．２１ １０（１
９７２） ９１、 Ｍａｘａｍら、ＭｅＬｈｏｄｓ ｉｎ
ｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５ 。 ４４９’（＋９８０） ９２、 Ｃｈａｎｇら、ＮａＬｕｒｅ２７５，６１５
（１９７９）。 ９３ ヨーロッパ特許出願公開番号第００３６７７６
号９４、 Ｇｒａｎｔｈａｉ、Ｒら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ
１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９゜ｒ４３（１９８１）。 ９５、 Ｂｅｎｔｏｎ、Ｗ、 Ｄ およびＤａｖｉｓ
、Ｒ，Ｗ。 ５ｃｉｃｎｃｅ１９６．１８０−１８２（１９７７）
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト′ｒＧＦ αｒＩｆ１駆体のＤ躯体配列
検出のｆ二めにハイブリダイゼーションプローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドの模式図である。第２図
はヒトＴＧＦ−αの最初の３３個のアミノ酸を暗号化し
ているエクソンを含む、プラスミドｐＴＧＦ−α１５−
１のｌ ８０ ｂｐＳ ａｕ３ Ａフラグメントのヌク
レオチド配列、・１１４びに推定のアミノ酸配クリを示
す模式図である。第３図はプラスミＦ’ｐ’ｒ Ｇ Ｆ
ＣＩ中に含まれているＣＤＮＡＵ＞７タレオチド配列
および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。第４図
はプラスミドｐＴＥｌ、２．３．４．５．６．７および
・８の組立て模式図である。第５図はプラスミドｐＴＥ
５およびｐＴＥ６の制限サイト地図であり、ＴＧＦ
α融合タンパク質の連結部分のアミノ酸配列をも示す。 第６図はプラスミドｐＴＥ２、ｐＴＥ３、ｐＴＥ５また
はｐＴＥ６を含むＥ、ｃｏｌｉの全細胞溶解物の５ＤＳ
−１３％ポリアクリルアミドゲル中の電気体動針折の結
果を示す状態図である。第７図は酸−エタノール法で豊
富にした細菌性の、短いＴ Ｇ ｌ） α融合タンパ
ク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
の結果を示す状態図である。第８図はラジオリセプター
アッセイにおける短い細菌性ＴＧＦ α融合タンパク質
と１！５１−標識ＥＧＦとの競合状況を示すグラフであ
る。第９図は不ズミＩεＧ＋）および、臭化シアンによ
る開裂の前後におけろ細菌性ＴＧＦ−α融合タノパク質
の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフである。第１０
図はｌ’ Ｇ ｌ・ｒ−タ酊１月Ｉｌ−ご介ｊＱ Ｑ己
ｒ−、１４、Ｖ）Ｊブー；ンスミト、ｐｙ’ｒ’Ｆ２を
２〈す模式図で５うろっ特１；１゛出願人 ノエ不ノテ
ク、イノコーボレイテット代 理 人 弁理士 前出
保 ４１名唱ハψｐしさゲυ（支）」１フ］ヒ一乙４
８１３本： ５’ ＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴ
ＣＡＡＣＡＡＡＴ（４１童停： ５’ ＡＣＣＡＧ
ＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧ−第１ｖ！Ｊ ｉｃ ＣＣＡ ＧＡＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＣＡＧ ＴＴ
ＣＴＧＣｒＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＧ第
５図 Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−、、、ＴＧ Ｆひ Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−、、、（１８６７ミノ資）０．。 Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、−Ｍｅｔ−ＥｃｏＲ
工
検出のｆ二めにハイブリダイゼーションプローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドの模式図である。第２図
はヒトＴＧＦ−αの最初の３３個のアミノ酸を暗号化し
ているエクソンを含む、プラスミドｐＴＧＦ−α１５−
１のｌ ８０ ｂｐＳ ａｕ３ Ａフラグメントのヌク
レオチド配列、・１１４びに推定のアミノ酸配クリを示
す模式図である。第３図はプラスミＦ’ｐ’ｒ Ｇ Ｆ
ＣＩ中に含まれているＣＤＮＡＵ＞７タレオチド配列
および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。第４図
はプラスミドｐＴＥｌ、２．３．４．５．６．７および
・８の組立て模式図である。第５図はプラスミドｐＴＥ
５およびｐＴＥ６の制限サイト地図であり、ＴＧＦ
α融合タンパク質の連結部分のアミノ酸配列をも示す。 第６図はプラスミドｐＴＥ２、ｐＴＥ３、ｐＴＥ５また
はｐＴＥ６を含むＥ、ｃｏｌｉの全細胞溶解物の５ＤＳ
−１３％ポリアクリルアミドゲル中の電気体動針折の結
果を示す状態図である。第７図は酸−エタノール法で豊
富にした細菌性の、短いＴ Ｇ ｌ） α融合タンパ
ク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
の結果を示す状態図である。第８図はラジオリセプター
アッセイにおける短い細菌性ＴＧＦ α融合タンパク質
と１！５１−標識ＥＧＦとの競合状況を示すグラフであ
る。第９図は不ズミＩεＧ＋）および、臭化シアンによ
る開裂の前後におけろ細菌性ＴＧＦ−α融合タノパク質
の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフである。第１０
図はｌ’ Ｇ ｌ・ｒ−タ酊１月Ｉｌ−ご介ｊＱ Ｑ己
ｒ−、１４、Ｖ）Ｊブー；ンスミト、ｐｙ’ｒ’Ｆ２を
２〈す模式図で５うろっ特１；１゛出願人 ノエ不ノテ
ク、イノコーボレイテット代 理 人 弁理士 前出
保 ４１名唱ハψｐしさゲυ（支）」１フ］ヒ一乙４
８１３本： ５’ ＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴ
ＣＡＡＣＡＡＡＴ（４１童停： ５’ ＡＣＣＡＧ
ＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧ−第１ｖ！Ｊ ｉｃ ＣＣＡ ＧＡＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＣＡＧ ＴＴ
ＣＴＧＣｒＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＧ第
５図 Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−、、、ＴＧ Ｆひ Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−、、、（１８６７ミノ資）０．。 Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、−Ｍｅｔ−ＥｃｏＲ
工
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト成熟ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−αＣ、 ＴＧＦ−α
ＮまたはＴＧＦ−αｍＣを含有し、実質的に他のヒト−
タンパク質を含まない生産物。 ２、第１項に記載の生産物を含浸させた包帯。 ３、アミノ酸残基が挿入、置換または欠失されてなるヒ
トＴＧＦ−αｍＣ、ＴＧＦ−αＣ、ＴＧＦ−αＮまたは
成熟ＴＧＦ−αの突然変異体。 ４、主産物中のシスティン残基がセリンに置換されてな
る第３項に記載の突然変異体。 ５、実質的に他のヒト−タンパク質を含まない、ヒトＴ
ＧＦ−α前駆体。 ６、ヘテロローガスな組換え宿主細胞によって生産され
たＴＧＦ−α前駆体、またはそのフラグメントを含有す
る組成物。 ７、ＴＧＦ−α前駆体またはそのフラグメントが突然変
異体である第６項に記載の組成物。 ８、ＴＧＦ−α前駆体またはそのフラグメントを暗号化
している組換えＤＮＡの供給源である微生物にとってヘ
テロローガスなポリペプチドと結合している第６項に記
載の組成物。 ９、ヘテロローガスなポリペプチドが微生物からのもの
である第８項に記載の組成物。 １０、微生物のポリペプチドが信号配列である第８項に
記載の組成物。 １１、ＴＧＦ−α前駆体またはそのフラグメントが、ヒ
ト起源のものであり、更に予め定められた量のヒトタン
パク質をも含有している第６項に記載の組成物。 １２、検出可能な部分で標識されている第６項に記載の
組成物。 １３、更に、薬学的に許容し得る担体、並びに治療有効
量のＴＧＦ−α前駆体またはそのフラグメントをも含有
している第６項に記載の組成物。 １４、滅菌されており、かつ予め定められた量のＴＧＦ
−βをも含有する第１３項に記載の組成物。 １５、第１３項に記載の組成物を動物に投与することか
らなる方法。 １６、組成物を創傷部位に局所適用することからなる第
１５項に記載の方法。 １７、結合したヘテロローガスなタンパク質に対する免
疫応答性を有する動物を、第８項に記載の組成物で免疫
することからなる方法。 １８、免疫した動物から抗血清を得ることを含む第１７
項に記載の方法。 １９、唯一のヒトＰＲＴＧＦ−αエピトープが、成熟Ｔ
ＧＦ−α以外の、ＴＧＦ−αＣ、ＴＧＦ−αｍＣまたは
これらのフラグメントのエピトープである様なタンパク
質で動物を免疫する方法。 ２０、ＴＧＦ−α前駆体またはそのフラグメントを暗号
化したＤＮＡ配列であって、それが成熟ＴＧＦ−αであ
るときは、ヒトの成熟ＴＧＦ−αである、ＤＮＡ配列。 ２１、フラグメントがＴＧＦ−αｍＣまたはＴＧＦ−α
Ｃである第２０項に記載のＤＮＡ。 ２２、ヘテロローガスなタンパク質を暗号化しているＤ
ＮＡにライゲートしている第２０項に記載のＤＮＡ。 ２３、第２０項に記載のＤＮＡ配列を含有している複製
可能なベクター。 ２４、プラスミドまたはウイルスである第２３項に記載
のベクター。 ２５、第２３項に記載のベクターで形質転換した細胞。 ２６、真核細胞である第２５項に記載の細胞。 ２７、酵母である第２６項に記載の細胞。 ２８、ＴＧＦ−α前駆体またはそのフラグメントを含む
ポリペプチドの製造方法であって： （ａ）宿主細胞と一緒になって、該ポリペプチドを暗号
化しているＤＮＡ配列を発現させる様に作用し得る発現
ベクターを調製し； （ｂ）該宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換して組
換え宿主細胞を得； （ｃ）この組換え宿主細胞を生産物が発現する条件の下
で培養し；次いで、 （ｄ）宿主細胞の培養物中から生産物を回収することか
らなる方法。 ２９、生産物を不溶性の凝集物として回収した後、可溶
化させることを含む第２８項に記載の方法。 ３０、生産物を宿主細胞から分泌させた後、宿主細胞の
培地から回収することを含む第２８項に記載の方法。 ３１、ＴＧＦ−αｍＣまたはＴＧＦ−αｃの存在に関し
て、体組織または体液を分析することからなる診断方法
。 ３２、ＴＧＦ−αｍＣを測定するための診断方法であっ
て： （ａ）体液試料をＴＧＦ−αｍＣのＴＧＦ−αＣ領域と
結合し得る抗体と接触させ； （ｂ）体液試料をＴＧＦ−αｍＣの成熟ＴＧＦ−α領域
と結合し得る抗体と接触させ； （ｃ）（ａ）または（ｂ）における抗体を検出可能な部
分で標識化し； （ｄ）標識化されていない抗体を不溶化し；（ｅ）可溶
性の相と不溶性の相とを分離し、次い（ｆ）両相間にお
ける標識の分布を測定することからなる方法。 ３３、ＰＲＴＧＦ−α種内の予め定められたアミノ酸配
列に対して高められた抗体。 ３４、検出可能な成分で標識された第３３項に記載の抗
体。 ３５、第３３項に記載の抗体を得る方法であって、該ア
ミノ酸配列と、ヘテロローガスなポリペプチドとを結合
させ、そのものにより動物を免疫することを含む方法。 ３６、第３３項に記載の抗体を含有する組成物を動物に
投与することからなる方法。 ３７、ＴＧＦ−α誘発性高カルシウム血症の患者にＴＧ
Ｆ−α結合剤を投与し、細胞表面受容体に対するＴＧＦ
−αの活性化作用を阻害することからなる、該患者の治
療方法。 ３８、該剤がタンパク質である第３７項に記載の方法。 ３９、該タンパク質が、抗ＴＧＦ−αまたは細胞のＴＧ
Ｆ−α受容体のＴＧＦ−α結合領域を含有するものであ
る第３８項に記載の方法。 ４０、タンパク質が、実質的にＴＧＦ−α結合領域から
なるものであり、また受容体がＥＧＦ受容体である第３
９項に記載の方法。 ４１、抗−ＴＧＦ−αの結合領域がＦａｂフラグメント
であり、ＴＧＦ−α受容体の結合領域がＥＧＦ受容体の
細胞外アミノ末端領域である第３９項に記載の方法。 ４２、治療有効量のＴＧＦ−α結合剤と、薬学的に許容
し得る担体からなる、細胞表面の受容体に対するＴＧＦ
−αの活性化作用を阻止するための滅菌した治療用組成
物。 ４３、結合剤が抗ＴＧＦ−αまたは細胞のＴＧＦ−α受
容体のＴＧＦ−α結合領域を含有するタンパク質である
第４２項に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US58174384A | 1984-02-17 | 1984-02-17 | |
| US581743 | 1995-12-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6163699A true JPS6163699A (ja) | 1986-04-01 |
Family
ID=24326395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60031380A Pending JPS6163699A (ja) | 1984-02-17 | 1985-02-18 | ヒト形質転換発育因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6163699A (ja) |
-
1985
- 1985-02-18 JP JP60031380A patent/JPS6163699A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4742003A (en) | Human transforming growth factor | |
| CA2263890C (en) | Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d) | |
| JPH06508031A (ja) | ヘレグリンの構造、生産および用途 | |
| JPH0763378B2 (ja) | ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡ | |
| NZ218631A (en) | Single chain angiogenic factor protein and methods for its production | |
| JP5099943B2 (ja) | ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びその用途 | |
| JPS6163699A (ja) | ヒト形質転換発育因子 | |
| US7544485B2 (en) | Baldness related gene and the polypeptide encoded thereby, and uses | |
| JPH05509320A (ja) | 組織誘導型腫瘍成長抑制物質、その調製及び使用方法 | |
| JP2001503255A (ja) | 胎盤から誘導された前立腺の成長因子 | |
| CN100415299C (zh) | 胚泡着床相关因子及其用途 | |
| JPH03504796A (ja) | ＴＧＦ―β３をコードしている核酸およびその使用 | |
| JPH09182596A (ja) | ヒトインヒビンβ▲Ｂ▼鎖の合成方法 | |
| JPS61501168A (ja) | 生長因子における改良 |