CN1161043A - 一种肽、一种支气管扩张剂，和一种血流促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(1)代表的肽：H-His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N (1)。其中A是Ala或Gly；B是Ile或Val；C是Asn或Ser；D是Thr或Ser；E是Leu或Tyr；F、I和J之每一个是Lys或Arg，至少F、I和J是Arg；G是Met，Leu或nLeu；K是Asn或Ala；L是Ser或Ala；M是Ile或Val；和N是-NH2或Asn-NH2，排除以下组合：其中A是Ala，B是Val，C是Asn，D是Thr，E是Leu，K是Asn，L是Ser，M是Ile，和N是Asn-NH2，以及其药物学上可接受的盐，和包含所述肽或其药物学上可接受的盐作为活性成分的支气管扩张剂或血流促进剂。

Description

一种肽、一种支气管扩张剂，和一种血流促进剂
发明领域
本发明涉及一种新肽、一种支气管扩张剂和一种血流促进剂。
发明背景
VIP(血管活性肠肽)是一类称为脑-肠肽的生理活性物质，其活性为促进血流和降低血压。VIP是1970年从猪的小肠提取的，它由28个氨基酸残基构成(S.I.Said，V.Mutt科学(Science)，169，1217(1970))。
PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活多肽)是1989年在一套用作培养的垂体细胞的腺苷酸环化酶激活指标的生物测定系统中从绵羊的下丘脑分离的，它是一种由38个氨基酸残基组成的结构上已确定的肽(A.Miyata，A.Arimura等，生物化学生物物理学研究通讯(BiochemBiophys.Res.Commun)，164，567(1989))。PACAP N末端的27个氨基酸残基具有PACAP活性，并且所述27个氨基酸的氨基酸序列与VIP的具有相当的相似结构。
VIP和PACAP在氨基酸序列上与肠促胰液肽，胰高糖素类似，因而被归类入属于胰高糖素族的肽。依靠它们对血管扩张和血流促进的强烈作用，VIP和PACAP有希望用于治疗溃疡、冻伤、褥疮、阳萎等以及用于头发的恢复和生长。此外，VIP和PACAP对呼吸系统中的支气管平滑肌具有相当强的松弛作用，从而减轻由刺激因子如乙酰胆碱、组胺、血清素等引起的平滑肌收缩。VIP和PACAP的这种松弛作用与通过肾上腺素β2受体引起的松弛作用不同在于普遍支气管扩张，所以VIP和PACAP可望对于β2受体刺激素不能有效起作用的难治性哮喘性痉挛具有治疗效果。
除VIP和PACAP以外，还已知道一种含28至31个氨基酸残基的肽具有支气管扩张作用，降低血压作用和恢复头发作用(见日本专利申请公开出版物(Japanese Patent Application Laid-OpenPublication)第246595/87、83012/89和297498/92号)。
然而，还希望发展一种在支气管扩张作用和血流增加作用的持久性方面优于VIP、PACAP和其它肽的支气管扩张剂和血流促进剂。
                    本发明的内容
本发明的目的是提供一种在支气管扩张的持久性方面优异并且在血流提高作用方面优异的一种新的肽，包含该肽作为活性成分的支气管扩张剂和血流促进剂。
本发明提供由下列通式(I)代表的一种肽：H-His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N(1)其中A是Ala或Gly；B是Ile或Val；C是Asn或Ser；D是Thr或Ser；E是Leu或Tyr；F、I和J之每一个是Lys或Arg，至少F、I和J是Arg；G是Met，Leu或nLeu；K是Asn或Ala；L是Ser或Ala；M是Ile或Val；和N是-NH2或Asn-NH2，排除以下组合：其中A是Ala，B是Val，C是Asn，D是Thr，E是Leu，K是Asn，L是Ser，M是Ile，和N是Asn-NH2，或通式(2)：H-His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-P-Gly-Q-R(2)其中A、B、C、D、E、F、G、I、J、K、L和M具有同上相同定义；至少F、I和J之一是Arg；P是Asn或一个化学键；Q是Lys，Arg，Lys-Arg，Arg-Arg或一个化学键；且R是-OH或-NH2，或其可药用盐。
进一步，本发明提供一种包含所述肽或其药物学上可接受的盐作为活性成分的支气管扩张剂。
另外，本发明还提供一种包含所述肽或其药物学上可接受的盐作为活性成分的血流促进剂。
另外，本发明提供包含所述肽或其药物学上可接受的盐和一种药物学上可接受的载体的药物组合物。
另外，本发明提供一种扩张支气管的方法，它包含在人类中施用有效量的所述肽或其药物学上可接受的盐。
另外，本发明还提供一种促进血流的方法，它包含在人类中施用有效量的所述肽或其药物学上可接受的盐。
另外，本发明提供所述肽或其药物学上可接受的盐在扩张支气管方面的用途。
另外，本发明提供所述肽或其药物学上可接受的盐在促进血流方面的用途。
本发明的肽或其盐在平滑肌的松弛作用所导致的支气管扩张作用的持续性方面是优越的。因此，本发明的肽和其盐可用作支气管扩张剂。
此外，本发明的肽或其盐在血流促进作用和其持久性方面是优越的。因此，本发明的肽或其盐也可用作血流促进剂并且它能在低浓度对血流表现促进作用。
本说明书中氨基酸，肽，保护基团，溶剂等的缩略语依从根据纯理论和应用化学国际联合会(International Union of Pure andApplied Chemistry)(IUPAC)或生物化学国际联合会(InternationalUnion of Biochemistry)(IUB)的缩略语或本领域的常规缩略语。实例显示如下。如果氨基酸等可有光学异构体，则除非特别指出均指左旋异构体。His：组氨酸残基Ser：丝氨酸残基Asp：天冬氨酸残基Ala：丙氨酸残基Val：缬氨酸残基Phe：苯丙氨酸残基Thr：苏氨酸残基Tyr：酪氨酸残基Asn：天冬酰胺残基Leu：亮氨酸残基Arg：精氨酸残基Lys：赖氨酸残基Gln谷氨酰胺残基Met蛋氨酸残基Ile：异亮氨酸残基Gly：甘氨酸残基Nle：正亮氨酸残基Boc：叔-丁基氧羰基         Aoc：t-戊基氧羰基Bzl：苄基基团              z：  苄氧基羰基Tos：对-甲苯磺酰基团       OBut：叔-丁酯OMe：甲酯                  OBz：苄基酯ONP：对-硝基苯酯           Bom：苄氧甲基基团TFA：三氟乙酸              THF：四氢呋喃DCM：二氯甲烷              DMF：二甲基甲酰胺DDC：二环己基碳二亚胺WSC：N-乙基-N′-二甲基氨基丙基-碳化二亚胺OSu：N-羟基琥珀酰亚氨酯HOSu：N-羟基琥珀酰亚氨HOBt：1-羟基苯并三唑DIEA：二异丙基乙胺
上面通式(1)或(2)代表的肽可通过用于合成已知肽的常规方法生产。例如，这些肽可以按如下方法生产，如：叠氮化物方法、酰基氯方法、酸酐方法、混合酸酐方法、DCC方法、活性酯方法(对-硝基苯酯方法，N-羟基琥珀酰亚胺酯方法，氰甲基酯方法等)，一种使用Woodward试剂K的方法，羰基咪唑方法，氧化-还原方法，DCC-加成(HONB，HOBt，HOSu)方法等，按照如下列书中描述的方法：“肽”(The Peptides)Vol.1(1966)〔Schreder和Luhke学术出版社，(Academic Press)，纽约，美国〕或“Peputido Gosei”(肽合成)〔Izumiya等，Maruzen K.K.(1975)，日本〕。这些方法可应用于固相合成和液相合成方法。按照用于合成常规多肽的上述方法，目标肽可以逐步延长方法生产，即所述肽中的每个氨基酸顺次连接于C-末端氨基酸，或以片段缩合方法生产，即先合成所述肽中的部分片段然后再将它们互相连接。
例如，逐步延长方法中的固相合成可采用Merrifield，R.B.的方法(固相肽合成，美国化学会志(Solid Phase Peptide Syntbesis，J.AmerChem.Soc.，)85，2149-2159(1963))如下：目标肽(即，在本发明中，上述通式(1)或(2)的氨基酸序列)的C-末端氨基酸在其氨基基团被保护并随后连接于具有能与羧基基团结合的功能性基团的不溶性树脂。氨基基团随后被去保护，下一个氨基酸在其氨基基团被保护下连接于此游离氨基基团。这些步骤被重复许多次，从而延长氨基酸链直至通式(1)或(2)的1-位的组氨酸残基。然后将如此获得的肽从树脂上裂解下来。
上述方法需要参与氨基酸之间的肽键的氨基基团的保护(即，在氨基基团上连接保护性基团)和去保护(即，从氨基基团释放保护性基团，以及参与氨基酸之间的肽键的羧基基团的激活。如果需要，还将保护性基团连接于氨基酸侧链中的功能基团。
用于保护氨基基团的保护性基团包括常规使用的保护性基团。实例为苄氧基羰基(z)，叔-丁基氧羰基(Boc)，t-戊氧羰基(Aoc)，异冰片基氧羰基，对甲氧苄基氧羰基，2-氯-苄氧基羰基，amadantyloxy carbonyl，三氟乙酰基，邻苯二亚甲基，甲酰基，邻-硝基苯磺苯基，和二苯基硫膦基。
用于保护羧基基团的保护性基团包括常规使用的保护性基团。实例为烷基酯如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和叔丁酯、苄基酯、对-硝基苄基酯、甲基苄基酯、对-氯苄基酯、二苯甲基酯、苄氧基羰基肼、叔-丁基氧羰基肼和三苯甲游基酰肼。
参予肽键合的羧基基团的激活可按上述任何常规已知方法进行，并且，在激活中使用的试剂等可选自公知者。羧基基团的激活涉及用各种试剂与所述羧基基团反应以形成，例如，它们相应的酰基氯，酸酐或混合酸酐，叠氮化物，和活性酯(例如，酯类如五氯苯酚，对-硝基苯酚，N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基苯并三唑，N-羟基-5-降冰片烯-2，3-联羧基酰亚胺等)。
对于在侧链中带有功能性基团的氨基酸优选在形成肽键的反应中该功能性基团被保护。特别地，组氨酸，酪氨酸，苏氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，精氨酸和丝氨酸优选在它们的侧链中的功能性基团被保护。功能性基团的保护是通过以常规方法将保护性基团与其连接实现的。在肽合成完成后，保护性基团被释放。
用于保护组氨酸中亚氨基团的保护性基团包括，例如，苄氧甲基(Bom)，甲苯磺酰基(Tos)，苄基(Bzl)，苄氧基羰基(z)和三苯甲游基。
丝氨酸和苏氨酸中的羟基基团可通过酯化作用或醚化作用被保护，但其保护不是必需的。通过酯化作用引入的保护性基团包括，如，较低的烷酰基基团如乙酰基等，芳酰基基团如苯甲酰基等，如碳酸衍生基团如苯甲酰氧基羰基，乙基氧羰基等。通过醚化作用引入的保护性基团的优选实例为苄基(Bzl)，四氢吡喃基和叔-丁基。
用于保护酪氨酸中羟基基团的保护性基团包括，如苄基(Bzl)，溴苄氧基羰基(Brz)，二氯苄基(Cl2-Bzl)，苄氧基羰基(z)，乙酰基，和甲苯磺酰(Tos)基。
用于赖氨酸中保护氨基基团的保护性基团包括如：苄氧基羰基(z)，氯苄氧基羰基(Cl-z)，二氯苄基(Cl2-Bzl)，叔-丁基氧羰基(Boc)，和甲苯磺酰(Tos)。
用于保护精氨酸中胍基基团的保护性基团包括如：甲苯磺酰(Tos)，硝基，苄氧基羰基(z)，和t-戊基氧羰基(Aoc)。
天冬氨酸中羰基基团的保护是通过酯化实现的，使用如，苯甲醇，甲醇，乙醇或叔-丁醇。
肽键形成的反应完成中有时可有缩合剂存在，如碳化二亚胺试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)，碳二咪唑等，或四乙基焦磷酸酯，苯并三唑-N-羟基三二甲胺鏻六氟磷酸盐(Bop试剂)。
上述固相合成中使用的不溶性树脂可为具有能与羰基基团结合的功能基团的任何树脂。实例为二苯甲基胺树脂(BHA树脂)，氯甲基树脂，氧甲基树脂，氨甲基树脂，对-甲基二苯甲基胺树脂(MBHA树脂)，4-氨基甲基苯氧基甲基树脂，4-羟基甲基苯氧基甲基树脂，4-氧甲基苯乙酰胺(oxymethylphenylacetamidem)乙基树脂(PAM树脂)等。氨基酸向树脂上的连接和合成肽从树脂上的裂解可以任何常规公知方法进行。
上述固相合成中使用的溶剂可为任何已知可用于形成肽键的溶剂，实例为无水的或含水的二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，吡啶，氯仿，二噁烷，二氯甲烷(DCM)，四氢呋喃(THF)，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷酮，和六甲基磷酸酰三胺(HMPA)。这些溶剂可单独或联合使用。
如此制备的肽可按常规方法脱盐和提纯。例如，其脱盐和提纯可通过DEAE-纤维素等上的离子交换色谱法，Sephadex LH-20，Sephadex G-25等上的分离色谱法(Partition Chromatography)，硅胶等上的正相色谱法，ODS-硅凝胶等上的逆相色谱法，或高效液相色谱法(HPLC)等。
上述通式(1)或(2)所代表的肽的药物学上可接受的盐包括如乙酸盐、盐酸盐、磷酸盐等。
本发明的肽及其盐由于它们的支气管扩张作用而可用作支气管扩张剂。因此，含有本发明的肽或其盐作为活性成分的支气管扩张剂可用于抑制和改善哮喘等。
作为支气管扩张剂，本发明的肽或其盐可直接施用，但通常将它以常规方式与各种药物学上可接受的载体混合以形成供口服或胃肠道外施用的液体，凝胶或固体形式的制剂。施用方法包括吸入(例如，与气雾剂一起)，注射，敷贴等。
当用作支气管扩张剂时，本发明的肽或其盐的剂量优选在约1ng/kg至1mg/kg(体重)/日/人范围内。虽然剂量依赖于使用目的，病人的症状，年龄和体重等，施用方法等而确定。
另外，本发明的肽和其盐在血流促进作用方面出色，优越性在于持续时间。因此，包含本发明的肽或其盐的血流促进剂在治疗溃疡、冻疮、褥疮、阳萎等，以及头发的恢复和生长方面有效。
当用作血流促进剂时，本发明的肽或其盐与常规的药物学上可接受的载体混合以形成药物学制剂，优选注射形式。
对于这种注射制剂，所产生的制剂优选被灭菌并与血液等张。任何常规使用的稀释剂可用于注射形式制剂的制造。稀释剂的实例为水、生理盐水等。在这种情况，在注射形式制剂中可含有足够量的食盐或甘油以制备等张溶液。这种制剂可含有常规缓冲液，润滑剂(soothingagent)，防腐剂等，并且，如果需要的话，可含着色剂，防腐剂，增香剂，甜味剂等，以及其它药物。上述供注射目的的活性成分可在使用前溶于蒸馏水。所产生的药物学制剂的施用方法根据制剂形式的不同而不同。例如，注射形式的制剂可单独或在与常规补充物如氨基酸等混合后经静脉施用。
本发明的肽或其盐当用作血流促进剂时优选以每日2至4次在约1ng/lg至1mg/kg(体重)范围内用药，虽然剂量的确定依赖于使用目的，症状等。
                     附图简述图1显示在施用PACAP情况下支气管平滑肌松弛程度随时间的改变。图2显示在施用SEQ ID NO：5的肽5时支气管平滑肌松弛程度随时间的改变。图3显示在施用VIP情况下支气管平滑肌松弛程度随时间的改变。图4显示在施用SEQ ID NO：11的肽11时支气管平滑肌松弛程度随时间的改变。
            实施本发明的最佳实施方案
在下文中，通过参照实施例详细描述本发明，然而这无意于限制本发明的范围。
在下列实施例中，所产生的纯化的肽的鉴定通过高效液相色谱法(HPLC)中保留时间的测定，旋光度的测定，和氨基酸分析进行，如下所示。·高效液相色谱法(HPLC)
为高效液相色谱法测定，使用LC-Module-1(Waters有限公司，日本)。(HPLC中的测定条件)柱：TSK凝胶ODS-120T(4.6×250mm)溶液：0.1％TFA-乙腈(从20％至50％乙腈线性梯度，30分钟)。流速：1ml/分测定波长：220nm。·旋光度
为旋光度的测定，使用DIC-370(Nippon Bunko Kogyo K.K.，Japan)。(旋光度测定条件)光源：钠灯，  589nm。温度：20℃层长度：100mm。浓度：1％(0.1M，于乙酸中)。·氨基酸分析
氨基酸分析通过在含0.1％酚的6N盐酸中在110℃水解20小时并在日立(Hitachi)氨基酸分析仪L-8500(日立有限公司，日本)中分析水解产物而进行。实施例1肽1的生产
固相合成使用肽合成仪9600(Milligen生物研究所)(MilligenBioresearch)。SEQ ID NO：1中显示的C-末端被酰胺化的肽1通过下列固相合成和提纯。
首先，694mg MBHA树脂(0.72mmol/g氨基基团，肽类Kenkynzyo K.K.，日本，制造)被引入肽固相合成反应器并用下列物质以下述次序在氩气流中搅拌处理，这些物质包括8ml DCM(4次，每次1分钟)，8ml含60％ TFA的DCM(20分钟)，4ml DCM(3次，每次15秒)，3mL含1ml DIEA的DMF溶液(2次，每次1分钟)和8ml DMF(6次，每次40秒)。每次处理后，进行滤过。
分开地，将2mmol对应于SEQ ID NO：1中27位氨基酸残基的氨基-基团-保护的氨基酸Boc-亮氨酸-OH溶于4ml DCM。该溶液被导入供氨基酸激活的器皿，随后向其中加入3ml DCC(0.5M，于DCM中)和4ml HOBt(0.5M，于DCM中)并使它们反应30分钟。随后，该反应溶液被滤过并将滤过液转至浓缩器皿。向其中加入3mlDMF，并将DCM在氩气流中蒸馏去除。然后，将3ml DMF加至浓缩物中，并将它转至上述供肽类固相合成的反应器并反应30分钟。然后，将反应物用8ml DCM洗涤(6次，每次20秒)。分开地，将2mmol Boc-亮氨酸-OH溶于4ml DCM中并将溶液导入供氨基酸活化的反应器，并重复上述相同步骤(双偶联double-coupling)和滤过。从而获得Boc-亮氨酸-MBHA树脂。
随后，将Boc-亮氨酸-MHBA树脂用8ml DCM洗涤(4次，每次1分钟)并滤过。该树脂在氩气流中在搅拌下顺次用8ml含60％ TFA的DCM(20分钟)，4ml DCM(3次，每次15秒)，3ml含1ml DIEA的DMF溶液(2次，每次1分钟)，和8ml DMF(6次，每次40秒)处理。在每次处理后，进行滤过。
分开地，将对应于SEQ ID NO：1的26位氨基酸残基的2mmol氨基基团保护的氨基酸Boc-缬氨酸-OH溶于4ml DCM并导入用于氨基酸活化的器皿，随后加入1.5ml DCC(0.5M，于DCM中)，并让它们反应7分钟。随后，将反应溶液滤过并将滤过物转至浓缩器皿。加入3ml DMF并在氩气流中蒸馏去除DCM。随后，将3ml DMF加入浓缩物中，并将它转移至上述供肽类固相合成的反应器并让反应进行30分钟。随后，将反应混合物用8ml DCM洗涤(6次，每次20分钟)并过滤。从而获得Boc-缬氨酸-亮氨酸-MBHA树脂。
随后，将对应于序列ID NO：1的第25至1位的下列氨基被保护的氨基酸分别成功地与之偶联。
  氨基酸    被保护的氨基酸    量
  序号                      (mmol)
  25        Boc-Ala-OH        2
  24        Boc-Ala-OH        2×2
  23        Boc-Leu-OH        2
  22        Boc-Tyr(Bzl)-OH   2
  21        Boc-Arg(Tos)-OH   2×2
  20        Boc-Arg(Tos)-OH   2×2
 氨基酸    被保护的氨基酸     量
  序号                      (mmol)
   19      Boc-Val-OH         2
   18      Boc-Ala-OH         2
   17      Boc-Leu-OH         2
   16      Boc-Gln-OH         2×2
   15      Boc-Arg(Tos)-OH    2×2
   14      Boc-Arg(Tos)-OH    2×2
   13      Boc-Tyr(Bzl)-OH    2
   12      Boc-Arg(Tos)-OH    2×2
   11      Boc-Ser(Bzl)OH     2
   10      Boc-Tyr(Bzl)-OH    2
   9       Boc-Ser(Bzl)-OH    2
   8       Boc-Asp(OBz)-OH    2
   7       Boc-Thr(Bzl)-OH    2
   6       Boc-Phe-OH         2
   5       Boc-Ile-OH         2
   4       Boc-Gly-OH         2
   3       Boc-Asp(OBz)-OH    2
   2       Boc-Ser(Bzl)-OH    2
   1       Boc-His(Bom)-OH    2×2
在上述固相合成中，对于天冬酰胺、精氨酸、谷氨酰胺和组氨酸需进行双偶联。
如此，获得2.76g下述被保护的肽-HBHA树脂：Boc-His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OBz)-Gly-Ile-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OBz)-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Tyr(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Bzl)-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-MBHA树脂。
将5ml茴香醚加至上述被保护的2.76g肽-MBHA树脂，并加入25ml无水氟化氢于其中，将混合物在搅拌中在0℃反应1小时。随后，在减压下将无水氟化氢蒸馏去除。残留物用乙醚洗涤并随后用100ml 0.1M乙酸从它提取肽。
提取物与20ml阴离子交换树脂Amberlite IR-410一起搅拌15分钟并通过滤过将不溶性树脂去除。如此获得的悬液通过0.22μ微孔滤器滤过并将滤过物冷冻干燥。如此获得823mg白色粉末。然后，将此样本上样于CM-纤维素柱(2.5×30cm)并用0.05M至0.5M AcONH4(pH7.0)的线性梯度洗脱，合并级分69-82(10ml/级分)并产生382mg部分纯化形式的所期望的肽。该肽以制备型高效液相色谱法进一步提纯。柱：TSK凝胶ODS-120T(21.5×300mm)。溶剂：0.1％三氟乙酸-乙腈(线性梯度从20％至40％乙腈)。流速：10ml/分。
对应于肽1的峰的洗脱物作为期望的物质被冷冻干燥。从所述高效液相色谱法获得的经提纯形式的肽的量为每100mg部分提纯的肽可得到63mg。经提纯的肽1在HPLC中测定保留时间和旋光度，并测定其氨基酸。结果显示如下：·HPLC中保留时间：27.2分钟。·[α]D：-55.8°·氨基酸分析：
Asp(2)2.17，Thr(1)0.98，Ser(3)2.45，Glu(1)1.09，Gly(1)1.03，Ala(3)3.18，Val(2)2.14，Ile(1)0.96，Leu(3)3.07，Tyr(3)2.73，Phe(1)0.92，His(1)1.12，Arg(5)5.16.实施例2
SEQ ID NO：2中显示的C-末端羧基基团被酰胺化的肽2按照与实施例1中相同的方式以纯化形式获得。这种纯化的肽的产量显示如下。确定了在HPLC中它的保留时间和它的旋光度，并分析了其氨基酸。结果显示如下：·产量：73mg·在HPLC中的保留时间： 27.6分钟。·[α]D：-53.2°·氨基酸分析：
Asp(2)2.10，Thr(1)0.97，Ser(3)2.46，Glu(1)0.97，Gly(2)1.97，Ala(3)3.15，Val(2)2.13，Ile(1)1.00，Leu(3)3.08，Tyr(3)2.75，Phe(1)0.98，His(1)0.99，Arg(5)4.54.实施例3
SEQ ID NO：3中所示C末端羧基基团被酰胺化的肽3按照与实施例1中相同方法以纯化形式获得。这种经纯化的肽的产量如下所示。它在HPLC中的保留时间以及其  旋光度被测定，并且其氨基酸序列被分析。结果显示如下：·产量：88mg·在HPLC中保留时间：27.0分钟。·[α]D：-52.8°·氨基酸分析：
Asp(2)2.11，Thr(1)0.95，Ser(3)2.56，Glu(1)0.97，Gly(2)2.00，Ala(3)3.15，Val(2)2.10，Ile(1)1.00，Leu(3)3.08，Tyr(3)2.75，Phe(1)0.98，His(1)1.03，Arg(5)5.14，Lys(1)1.01.实施例4
SEQ ID NO：4中所示C-末端羧基基团被酰胺化的肽4按照与实施例1中相同方式以纯化形式获得。这种经提纯的肽的产量显示如下。在HPLC中其保留时间和其旋光度被测定，并分析了其氨基酸。结果显示如下：·产量：84mg·在HPLC中的保留时间：25.1分钟。·[α]D：-54.3°·氨基酸分析：
Asp(2)2.09，Thr(1)0.96，Ser(3)2.44，Glu(1)0.97，Gly(2)2.01，Ala(3)3.11，Val(2)2.03，Ile(1)1.02，Leu(3)3.08，Tyr(3)2.74，Phe(1)0.97，His(1)1.05，Arg(6)6.10实施例5
SEQ ID NO：5中所示C-末端羧基基团被酰胺化的肽5按照与实施例1中相同方式以纯化形式获得。该经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和旋光度被测定，其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：76mg·在HPLC中的保留时间：24.4分钟。·[α]D：-52.2°·氨基酸分析：
Asp(2)2.11，Thr(1)0.96，Ser(3)2.47，Glu(1)1.01，Gly(2)2.00，Ala(3)3.03，Val(2)2.03，Ile(1)1.02，Leu(3)3.03，Tyr(3)2.70，Phe(1)0.97，His(1)1.07，Arg(6)6.15，Lys(1)1.02.实施例6
SEQ ID NO：6中所示C-末端羧基基团被酰胺化的肽6按照与权利要求1中相同方式以纯化形式获得。这种经提纯的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：85mg·在HPLC中的保留时间：23.6分钟。·[α]D：-53.7°·氨基酸分析：
Asp(2)2.09，Thr(1)0.94，Ser(3)2.51，Glu(1)1.05，Gly(2)2.00，Ala(3)3.03，Val(2)2.01，Ile(1)1.02，Leu(3)33.03，Tyr(3)2.77，Phe(1)0.97，His(1)1.07，Arg(7)7.11.实施例7
SEQ ID NO：7中显示的肽7按照与实施例1中除下述一点外基本相同的方法以经纯化形式获得。不同处在于：使用704mg Boc-精氨酸(Tos)PAM树脂(0.68mmol/g氨基基团，Peptide kenkyuzyo KK.出品)，即，具有目标肽的C-末端氨基酸残基的一种树脂。该经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：84mg·在HPLC中的保留时间：23.8分钟。·[α]D：-56.7°·氨基酸分析：
Asp(2)2.12，Thr(1)0.96，Ser(3)2.47，Glu(1)1.01，Gly(2)2.00，Ala(3)3.03，Val(2)2.03，Ile(1)1.02，Leu(3)3.03，Tyr(3)2.70，Phe(1)0.97，His(1)1.03，Arg(6)6.10，Lys(1)1.02.实施例8
SEQ ID NO：8中显示的C-末端羧基基团被酰胺化的肽8按照与实施例1中的相同方法以纯化形式获得。这种经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：68mg·在HPLC中的保留时间：26.9分钟。·[α]D：-58.7°·氨基酸分析：
Asp(5)5.11，Thr(2)1.72，Ser(2)1.61，Glu(1)1.10，Ala(2)2.00，Val(2)2.00，Ile(1)1.02，Leu(4)4.15，Tyr(2)1.86，Phe(1)0.99，His(1)0.95，Arg(5)4.75.实施例9
SEQ ID NO：9中显示的C末端羧基基团被酰胺化的肽9按照与实施例1中相同方法以纯化形式获得。该被纯化肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：76mg·在HPLC中的保留时间：25.4分钟。·[α]D：-52.9°·氨基酸分析：
Asp(5)5.11，Thr(2)1.83，Ser(2)1.49，Glu(1)1.09，Gly(1)1.04，Ala(2)2.01，Val(2)2.01，Ile(1)0.96，Leu(4)4.19，Tyr(2)2.03，Phe(1)1.01，His(1)1.07，Arg(6)6.10，Lys(1)1.05.实施例10
SEQ ID NO：10中显示的C-末端羧基基团被酰胺化的肽10按照与实施例1中相同方式以纯化形式获得。该纯化肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：77mg·在HPLC中的保留时间：24.9分钟。·[α]D：-52.5°·氨基酸分析：
Asp(5)5.12，Thr(2)1.83，Ser(2)1.55，Glu(1)1.08，Gly(1)1.03，Ala(2)2.01，Val(2)2.01，Ile(1)0.96，Leu(4)4.17，Tyr(2)2.03，Phe(1)1.01，His(1)1.03，Arg(6)6.15.实施例11
SEQ ID NO：11中显示的C-末端羧基基团被酰胺化的肽11按照与实施例1中相同的方法以纯化形式获得。该经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：87mg·在HPLC中的保留时间：23.5分钟。·[α]D：-55.5°·氨基酸分析：
Asp(5)5.11，Thr(2)1.83，Ser(2)1.49，Glu(1)1.09，Gly(1)1.04，Ala(2)2.01，Val(2)2.01，Ile(1)0.96，Leu(4)4.19，Tyr(2)2.03，Phe(1)1.01，His(1)1.07，Arg(6)6.10，Lys(1)1.05.实施例12
SEQ ID NO：12中显示的C-末端羧基基团被酰胺化的肽12按照与实施例1中相同的方法以纯化形式获得。该经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：78mg·在HPLC中的保留时间：23.0分钟。·[α]D：-56.2°·氨基酸分析：
Asp(5)5.13，Thr(2)1.84，Ser(2)1.49，Glu(1)1.08，Gly(1)1.03，Ala(2)2.01，Val(2)2.01，Ile(1)0.96，Leu(4)4.19，Tyr(2)2.03，Phe(1)1.01，His(1)1.02，Arg(7)7.11.实施例13
SEQ ID NO：13中显示的肽13，除使用704mg Boc-精氨酸(Tos)-PAM树脂即具有目标肽的C-末端氨基酸残基的树脂外，按照与实施例1中相同方法以纯化形式获得。该经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：83mg·在HPLC中的保留时间：22.8分钟。·[α]D：-58.6°·氨基酸分析：
Asp(5)5.15，Thr(2)1.83，Ser(2)1.53，Glu(1)1.09，Gly(1)1.01，Ala(2)2.01，Val(2)2.01，Ile(1)1.02，Leu(4)4.10，Tyr(2)1.86，Phe(1)1.00，His(1)0.95，Arg(6)6.15.实施例14
SEQ ID NO：14中显示的C-末端羧基基团被酰胺化的肽14按照与实施例1中相同的方法以经纯化形式获得。这种经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：64mg·在HPLC中的保留时间：25.1分钟。·[α]D：-52.7°·氨基酸分析：
Asp(2)2.17，Thr(1)0.98，Ser(3)2.55，Glu(1)1.03，Gly(1)1.03，Ala(3)3.18，Met(1)0.96，Val(2)2.14，Ile(1)0.96，Leu(2)2.07，Tyr(3)2.73，Phe(1)1.00，His(1)1.01，Arg(5)5.15.实施例15
序列ID NO：15中显示的C-末端羧基基团被酰胺化的肽15按照与实施例1中相同的方法以纯化形式获得。该经纯化的肽的产量显示如下。其在HPLC中的保留时间和其旋光度被测定，并且其氨基酸被分析。结果显示如下：·产量：62mg·在HPLC中的保留时间：26.2分钟。·[α]D：-52.5°·氨基酸分析：
Asp(2)2.11，Thr(1)0.95，Ser(3)2.45，Glu(1)1.04，Gly(1)1.03，Ala(3)3.18，Val(2)2.14，Ile(1)0.96，Leu(2)2.10，Tyr(3)2.73，Phe(1)0.96，His(1)1.02，Arg(5)5.16，nLeu(1)1.02.实施例16
在实施例1至15中获得的经提纯的肽以下列方式检测它们的支气管扩张作用并与VIP和PACAP的作用相比较。
重450-500g的雄豚鼠在颈静脉处切开，打开胸腔，并立即取出支气管。将它们的气管立即置于Krebs溶液中并切成环，随后通过将软骨部分经一条钢丝互相连接而形成一条链。然后，在平滑肌部分对面的软骨部分被切除，从而使平滑肌部分互相连接。所产生的样本置于约10ml等热器官浴中并垂直悬挂。下部被固定，而上部与负荷1.4g的粗力学换能器(grass force transducer)相连。将足够的94％氧气和6％二氧化碳的气体吹入此样本，同时用含0.1μmol/L羰基胆碱的Krebs溶液以0.33ml/分的速度向其滴入以测定舒张作用。由于舒张反应的发生依赖于测定样本在此滴入溶液中的含量，这可用去比较VIP和PACAP和本发明的肽对支气管平滑肌的舒张作用。
VIA，PACAP和本发明的肽的每一种的溶液以高于终浓度100倍的浓度制备，从而使其在器官浴中的浓度可被调节。滴入含羰基胆碱的Krebs溶液30分钟后，滴入100μl的样本溶液。
假定在无羰基胆碱存在时平滑肌收缩程度为0，而在羰基胆碱存在下为100。在样本存在下最小收缩程度A(即：最大舒张值)被测定，并按如下计算最大舒张程度B：最大舒张程度B(％)＝100-A。
在加入样本后达到最大舒张值的一半所需的时间(以后称为“半值时间T”)被测定。
使用每种肽分别为0.3μM，1μM，和3μM的三个剂量测量支气管平滑肌舒张程度的改变。结果显示于附图中：PACAP于图1中；得自实施例5的肽5，于图2中；VIP于图3中，而得自实施例11的肽11于图4中。对于肽5在剂量为3μM时最大舒张程度B为75％而对于肽11为80％，而在两种情况下半值时间T为360分钟或更长。从这些结果，在具有与VIP和PACAP的相似的舒张效果的同时，本发明的肽表现更优的持久性，即，比VIP和PACAP的作用时间更长。
表1显示对于每种肽在各个剂量下的最大舒张程度B和半值时间T。
                     表1
                0.3μM       1μM          3μM
               B     T      B    T        B     T
             (％)  (分)   (％)  (分)     (％)  (分)PACAP             40    60     90    60       90    100VIP               45    130    80    150      85    240实施例1中的肽1    50    100    80    240      85    ＞360实施例2中的肽2    55    120    80    240      85    ＞360实施例3中的肽3    55    120    80    240      85    ＞360实施例4中的肽4    55    120    80    240      85    ＞360实施例5中的肽5    60    120    80    ＞360    75    ＞360实施例6中的肽6    65    150    80    ＞360    75    ＞360实施例7中的肽7    60    120    80    ＞360    75    ＞360实施例8中的肽8    50    150    80    300      80    ＞360实施例9中的肽9    55    180    80    300      80    ＞360实施例10中的肽10  55    200    80    300      80    ＞360实施例11中的肽11  65    300    85    ＞360    85    ＞360实施例12中的肽12  65    300    90    ＞360    85    ＞360实施例13中的肽13  65    300    90    ＞360    85    ＞360实施例14中的肽14  40    100    80    240      85    ＞360实施例15中的肽15  40    100    80    240      85    ＞360实施例17
在实施例1至15中获得的纯化肽1至15被检测它们的血流增加作用并与VIP和PACAP的作用比较。
将体重220至250g的Wistar雄性大鼠通过腹膜内施用戊巴比妥(25mg/kg)麻醉并在仰卧固定。在颈动脉中插入动脉导管并通过装有含肝素生理盐水(10μ/ml)的doom kit(SCK-512，NipponKoden)与一个血压换能器(DX-300，Nippon Koden，日本)相连，以通过张力血压放大器(AP-601G，Nippon Koden)测定血压。进一步，将一个血流测定探头(FR-030T，Nippon Koden)连接于右股动脉并随后连接于电磁放大血流计(MFV-3200，NipponKoden)以测定血流。每种肽的静脉内剂量为100pmol/kg。
表2显示在给予各种肽的大鼠中血流的增加。
            表2
                      血流(ml/min)
PACAP                 16.04±5.92
VIP                   10.18±3.38
实施例1中的肽1        50.02±42.34
实施例2中的肽2        52.63±39.58
实施例3中的肽3        52.13±37.85
实施例4中的肽4        51.87±37.24
实施例5中的肽5        54.60±41.05
实施例6中的肽6        53.71±46.46
实施例7中的肽7        55.05±46.71
实施例8中的肽8        53.75±37.31
实施例9中的肽9        54.26±35.95
实施例10中的肽11      55.86±34.69
实施例11中的肽11      57.04±38.67
实施例12中的肽12      57.34±41.88
实施例13中的肽13      56.76±36.15
实施例14中的肽14      52.92±32.12
实施例15中的肽15      52.63±31.05
在给予100pmol/kg肽1至15的每一种的大鼠中未观察到明显的血压改变。实施例18急性毒性测定
实施例1至15中获得的肽1至15被溶于生理盐水并以10mg/kg的剂量经静脉施用于小鼠。结果表明每一只小鼠均存活。
                 序列表SEQ ID NO：1：长度：27个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：1：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu
             20                  25SEQ ID NO：2：长度：28个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：2：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly
             20                  25SEQ ID NO：3：长度：29个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：3：His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1               5                  10                  15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lsy
         20                  25SEQ ID NO：4：长度：29个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：4：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg
             20                  25SEQ ID NO：5：长度：30个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：5：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg
             20                  25                  30SEQ ID NO：6：长度：30个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ D NO：6：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg
             20                  25                  30SEQ ID NO：7：长度：30个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：7：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg
             20                  25                  30SEQ ID NO：8：长度：29个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：8：
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly
             20                  25SEQ ID NO：9：长度：30个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：9：
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys
             20                  25                  30SEQ ID NO：10：长度：30个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：10：
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg
             20                  25                  30SEQ ID NO：11：长度：31个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：11：
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys Arg
             20                  25                  30SEQ ID NO：12：长度：31个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：12：
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg Arg
             20                  25                  30SEQ ID NO：13：长度：31个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：13：
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys Arg
             20                  25                  30SEQ ID NO：14：长度：27个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：14：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Met Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu
             20                  25SEQ ID NO：15：长度：27个氨基酸类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：15：
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
  1               5                  10                  15
Nle Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu
             20                  25

Claims (8)

1.一种由通式(1)或通式(2)代表的肽或其药物学上可接受的盐：H-His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N(1)其中A是Ala或Gly；B是Ile或Val；C是Asn或Ser；D是Thr或Ser；E是Leu或Tyr；F、I和J之每一个是Lys或Arg，至少F、I和J是Arg；G是Met，Leu或nLeu；K是Asn或Ala；L是Ser或Ala；M是Ile或Val；和N是-NH2或Asn-NH2，排除以下组合：其中A是Ala，B是Val，C是Asn，D是Thr，E是Leu，K是Asn，L是Ser，M是Ile，和N是Asn-NH2，或通式(2)：H-His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-P-Gly-Q-R(2)其中A、B、C、D、E、F、G、I、J、K、L和M具有同上相同定义；至少F、I和J之一是Arg；P是Asn或一个化学键；Q是Lys，Arg，Lys-Arg，Arg-Arg或一个化学键；且R是-OH或-NH2，或其可药用盐。
2.一种支气管扩张剂，它包含权利要求1的肽或其药物学上可接受的盐作为活性成分。
3.一种血流促进剂，它包含权利要求1的肽或其药物学上可接受的盐作为活性成分。
4.一种药物组合物，它包含权利要求1的肽或其药物学上可接受的盐和一种药物学上可接受的载体。
5.一种扩张支气管的方法，它包含向人类施用有效量的权利要求1的肽或其药物学上可接受的盐。
6.一种促进血流的方法，它包含向人类施用有效量的权利要求1的肽或其药物学上可接受的盐。
7.权利要求1的肽或其药物学上可接受的盐的在扩张支气管中的应用。
8.权利要求1的肽或其药物学上可接受的盐的在促进血流中的应用。
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