JP2002510194A - インスリン様成長因子アゴニスト分子 - Google Patents

インスリン様成長因子アゴニスト分子

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Abstract

(57)【要約】 ＩＧＦとその結合タンパク質のいずれか１つとの相互作用を抑制し且つヒトＩＧＦレセプターに結合しない化合物が提供される。ペプチドを含む、これらＩＧＦアコニスト化合物は、哺乳動物中の活性ＩＧＦｓの血清と組織レベルを増加するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 インスリン様成長因子アゴニスト分子 発明の分野 本発明はインスリン様成長因子(IGFs)のアゴニストとして有用な分子に関する 。より詳細には、これらの分子は、ＩＧＦと、１またはそれ以上のそのＩＧＦ結 合タンパク質との相互作用を抑制する。そのような分子は、例えばＩＧＦｓが使 用されるいずれかの方法、例えば高血糖症、肥満に関連した、神経学的な、心臓 の、腎臓の、免疫学的な及び同化作用の疾患の治療において使用され得る。 背景及び関連技術の説明 ＩＧＦｓ(ＩＧＦ-I，ＩＧＦ-II,及びＩＧＦ変異体)の作用と活性についての文 献の大きな一団がある。ヒトＩＧＦ-Iは、成長ホルモン(GH)の作用を調節するイ ンスリン様の及びマイトジェンの生物学的活性を持ったソマトメジンのファミリ ーに属している8.4のp1を持つ(RinderknechtとHumbel，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，73:2365(1976);RinderknechtとHumbel，J．Biol．Chem.，253:2769(1978 ))7649-ダルトンのポリペプチドである。Van Wykら、Recent Prog.Horm.Res.,30 :259(1974);Binoux,Ann.Endocrinol.,41:157(1980);ClemmonsとVan Wyk,Handboo k Exp.Pharmacol.,57:161(1981);Baxter,Adv.Clin.Chem.,25:49(1986);米国特許 第4,988,675号；WO 91/03253;WO 93/23071。 ＧＨのような、ＩＧＦ-Iは、有力な同化作用タンパク質である。Tannerら,Act a Endocrinol.,84:681-696(1977);Uthneら,J.Clin.Endocrinol.Metab.,39:548-5 54(1974)。危篤状態での同化作用剤としてのインスリン、ＧＨ、及びＩＧＦ-Iの 役割を考察するRossら,Intensive Care Med.,19 Suppl.2:S54-57(1993)も参照。 ＩＧＦ-Iは、インスリンのそれに類似の低血糖作用を有し、ポジティブな窒素バ ランスをも促進する。Underwoodら,Hormone Res.,24:166(1986):Gulerら,N.Engl .J.Med.，317:137(1987)。活性のこの範囲のために、ＩＧＦ-Iは、創傷治癒、糖 尿病の治療、全身異化作用状態の逆転、鬱血性心不全のような心臓条件の治療、 及び神経学的疾患の治療のような広い異種の使用のためにヒトにおいて試験され て いる。Gulerら,Proc.Natl.Acad.Sci USA,85:4889-4893(1988);Duerrら,J.Clin.I nvcst.,95:619-627(1995);及びScience,264:772-774(1994)。 米国特許第5,273,961;5,466,670;5,126,324;5,187,151;5,202,119;5,374,620; 5,106,832;4,988,675;5,106,832;5,068,224;5,093,317;5,569,648;及び4,876,24 2;WO 92/11865;WO 96/01124;WO 91/03253;WO 93/25219; WO 93/08826;及びWO 94 /16722は、ＩＧＦ-Iを用いる哺乳動物、特にヒトの患者の各種治療方法を開示す る。加えて、ＩＧＦ-Iの臨床的な使用は、例えばBondy,Ann Intern.Med.,120:59 3-601(1994)に記載される。 一つの特有な使用において、ＩＧＦ-Iは、腎臓中で各種の作用を発揮すること か見出されている。HammermanとMiller,Am.J.Physiol.,265:F1-F14(1993)。先端 巨大症に罹った患者で観測された腎臓のサイズにおける増加が糸球体濾過率の顕 著な増加によって達成されることが１０年間認識されている。O'SheaとLayish,J .Am.Soc.Nephrol.,3:157-161(1992)。米国特許第5,273,961号は、急性腎不全の 危険のある哺乳動物の予防的治療のための方法を開示する。ヒトにおいてＩＧＦ -Iは手術後の腎機能を保護することが示されている。Franklinら，Am.J.Physiol .,272:F257-F259(1997)。通常の腎機能を持つヒトにおける該ペプチドの注入は 、糸球体濾過率と腎臓血漿流を増加する。Gulerら，Acta Endocrinol．121:101- 106(1989);Gulerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:2868-2872(1989);Hirschbergら ，Kidney Int.,43:387-397(1993);米国特許第5,106,832。さらに、中等度減少腎 機能に罹ったヒトは、糸球体濾過率と腎臓血漿流を増加することによって短期間 (４日)ＩＧＦ-I投与に応答する。それ故にＩＧＦ-Iは、慢性腎不全を整復する潜 在的な治療薬である。O'Sheaら,Am.J.Physiol.,264:F917-F922(1993)。ＩＧＦ-I が最終段階の慢性腎不全を経験しているそれらの腎機能を増加できるという事実 にもかかわらず、ＩＧＦ-Iの短期で得られた糸球体濾過率と腎臓血漿流の増加は 長期投与の間持続することはなく、副作用の発生は高い。Millerら，Kidney Int ernational,46:201-207(1994)。 腎臓についてのＩＧＦ-Iの作用を完全に再考するために、例えばHammerman と Miller,Am.J.Physiol.,265:F1-F14(1993)及びHammermanとMiller,J.Am.Soc.Neph rol.,5:1-11(1994)。 ＩＧＦ-Iのためのアナボリックな指示として、ＩＧＦ-Iによって連続的に治療 したＨＩＶ-感染患者において、そのＩＧＦ-Iは、同化作用を促進したが、しか しタキフィラキシーは、その患者において急激に発達した。Licbermanら，U.S.E ndocrine Meeting,June 1993(Abst.1664);Liebemanら,J.Clin.Endo.Metab.,78:4 04-410(1994)。重症の頭部損傷を受けた患者において、深い異化亢進及び窒素損 失に関連した条件下に、ＩＧＦ-Iの注入は一時的な正の窒素バランスのみを誘導 した。最初の週において患者は正の窒素バランスを経験したが、第２週の間に負 の窒素バランスが発達した。Chenら，U.S.Endocrine Meeting,June 1993(Abst.1 596)。 ＩＧＦ-Iは、静脈内ボーラス注射により投与した場合、インスリンのそれと類 似のヒトにおける低血糖作用を有する。Underwoodら,Hormone Research,24:166( 1986)。ＴＧＦ-Iは、正規インスリンと類似して記載された時間の経過と共に、 通常者(Gulerら,N.Engl.J.Med.,supra)及び糖尿病患者(Schoenleら,Diabetologi a,34:675-679(1991);Zenobiら，J.Clin.Invest.,90:2234-2241(1992);Sherwinら ，Hormone Research,41(Suppl.2):97-101(1994);Takanoら，Endocrinol.Japan,3 7:309-317(1990);Gulerら,Acta Paediatr.Scand.(Suppl.),367:52-54(1990))の 両方においてグルコース低下を発揮することが知られる。組換えヒトＩＧＦ-I(r hIGF-I)投与に続く増加した低血糖認識を報告したKerrら，”Effect of Insulin -like Growth Factor 1 on the responses to and recognition of hypoglycemi a,”American Diabetes Association(ADA),52nd Annual Meeting,San Antonio,T exas June 20-23,1992も参照。加えて、rhIGF-Iの単独投薬が一晩ＧＨレベルと ＩＤＤＭと共に青年期におけるインスリン要求を減じる。Cheethamら，Clin．En docrinol.，40:515-555(1994);Cheethamら,Diabetologia,36:678-681(1993)。 Schalchら,J.Clin.Metab.,77:1563-1568(1993)で報告されたような、II型糖尿 病に対するrhIGF-Iの投与は、血清インスリン同様にＣペプチドレベルにおける 並行した減少の両方での低下を実証した。これは、ＩＧＦ-I治療の５日後の膵臓 のインスリン分泌における減少を示した。この作用は、Froeschら，Horm.Res.,4 2:66-71(1994)よって独立に確認されている。通常ラットにおけるインビボ実験 でもまた、ＩＧＦ-I注射が膵臓のインスリン放出を抑制することが示される。Fu rsinn ら，Endocrinology，135:2144-2149(1994)。加えて、膵臓の灌流調製において、 ＩＧＦ-Iはまた、インスリン分泌を抑制した。Leahyら,Endocrinology,126:1593 -1598(1990)。これらはヒト及び哺乳動物におけるインスリン分泌についてのＩ ＧＦ-Iのインビボでの抑制的作用を明確にしたにも関わらず、インビトロ実験で はそのような均一な結果が得られていない。 RhIGF-Iは、インスリン感受性を改善する能力を有する。例えば、rhIGF-I（70 μg/kg bid)は、筋緊張性ジストロフィーに罹った皮糖尿病、インスリン耐性患 者においてインスリン感受性を改善した。Vlachopapadopoulouら，J．Clin．End o.Metab.,12:3715-3723(1995)。Saadら,Diabctologia,37:Abstract 40(1994)は 、肥満症に罹った成人においてインスリン感受性の投薬量依存的改善及びrhIGF- I治療(25μｇと100μg/kg bid)の１５日の後グルコース耐性が改善されたことを 報告した。RhIGF-Iもまた、重症Ａ型インスリン耐性に罹った何名かの患者(Scho enle ら，Diabetologia，34:675-679(1991);Morrowら，Diabetes，42(Suppl.):2 69(1993)(abstract);Kuzuyaら，Diabetes,42:696-705(1993))及び非-インスリン 依存糖尿病においてインスリン感受性と血糖コントロールを改善した。Schalch ら，"Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like grow th factor I(rhIGF-I)in type II diabetes mcllitus",in:Spenecr EM,ed.,Mode rn Concepts of Insulin-like Growth Factors(New York:Elsevier:1991)pp.705 -715;Zenobiら,J.Clin.Invest.,90:2234-2241(1993)。 選択した典型被験者におけるＩＧＦ-Iの投与のインスリン耐性及び可能性のあ る効果を生起する幾つかの臨床的表現型の病因学のための一般的なスキームは、 幾つかの参考文献中に与えられる。例えば、Elahiら,"Hemodynamic and metabol ic responses to human insulin-like growth factor-1(IGF-I)in men,"in:Mode rn Concepts of Insulin-Like Growth Factors,(Spencer,EM,ed.),Elsevier,New York,pp.219-224(1991);Quinnら,New Engl.J.Med.,323:1425-1426(1990);Schal chら,"Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like gro wth factor I(rhIGF-I)in type II diabetes mellitus",in:Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors,(Spencer EM,ed.),Elsevier,New York,pp.705-7 14(1991);Schoenleら,Diabetologia,34:675-679(1991);Usalaら,N.Eng.J.Med.,3 27:853-857(1992);Liebermanら,J.Clin.Endo. Metab.,75:30-36(1992);Zenobiら,J.Clin.Invest.,90:2234-2241(1992);Zenobi ら,J.Clin.Invest.,89:1908-1913(1992);Kerr,J.Clin.Invest.,91:141-147(1993 )を参照。ＩＧＦ-Iが日に二回、120-160μg/kgの投薬量で臨床においてII型糖尿 病患者を治療するために使用された場合、その副作用は治療の有効性に勝る。Ja briら，Diabetes,43:369-374(1994)。ＩＧＦ-Iによる患者の治療において観測さ れた副作用に関するWilton,Acta Paediatr.,383:137-141(1992)も参照。 ＩＧＦ結合タンパク質(IGFBPs)は、ＩＧＦと結合する可能性もある他の関連し たタンパタ質と共に、少なくとも６のタンパク質のファミリーである(Jones and Clemmons,Endocr.Rev.,16:3-34(1995);Bach and Rechler,Diabetes Reviews,3: 38-61(1995))。IGFBPsは、変化するアフィニティーと特異性によってＩＧＦ-Iと ＩＧＦ-IIに結合する。JonesとClemmons,supra;Bach and Reehler,supra。例え ば、IGFBP-3は、類似のアフィニティーによってＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIに結合する が、IGFBP-2とIGFBP-6は、それがＩＧＦ-Iに結合するよりも、より高いアフィニ ティーでＩＧＦ-IIに結合する。BachとRechler,supra;Ohら,Endocrinology,132, 1337-1344(1993)。 大部分の成長因子と異なり、循環器系において高濃度で存在するが、しかしＩ ＧＦｓの極少量のフラクションは、タンパク質結合していない。例えば、ヒト又 は齧歯動物において、血中ＩＧＦｓの１％以下が"遊離"で又は未結合形である。 Juulら,Clin.Endocrinol.,44:515-523(1996);Hizukaら,Growth Regulation,1:51 -55(1991);Hasegawaら,J.Clin.Endocrinol.Metab.,80:3284-3286(1995)。ＩＧＦ -I又はＩＧＦ-II、IGFBP-3、及び大タンパク質から構成された非共有結合した三 重複合体の一部として血液循環中のＩＧＦｓの圧倒的大多数は、酸-不安定サブ ユニット(ALS)と称される。この複合体は、３つの構成要素のそれぞれの等モル 量から構成される。ＩＧＦ、IGFBP-3、及びＡＬＳの三重複合体は、ほぼ150,000 ダルトンの分子量を有し、且つそれは循環系内でのこの複合体の機能がレザバー として及び遊離ＩＧＦ-I又はＩＧＦ-IIへの急激な変化を防止する、ＩＧＦ-Iと ＩＧＦ-IIのためのバッファーとして奉仕するためとされ得ることが示唆されて いる。 ＩＧＦ-Iは、ヒト体液、例えば血液及びヒト脳脊髄液において自然に生じる。 たとえＩＧＦ-Iが多くの組織で生産されるとしても、大部分の循環性ＩＧＦ-Iは 、肝臓において合成されると確信する。IGFBPsは、最初の結合タンパク質がグル コース代謝中に包含されるとして関連させている、IGFBP-1によって(Leeら,Proc .Soc.Exp.Biol.& Med.,204:4-29(1993))、ＩＧＦ-Iの生物学的活性を調節すると 確信される(JonesとClemmons,supra)。Baxter,"Physiological roles of IGF bi nding proteins",in:Spencer(Ed.),Modern Concepts of Insulin-like Growth F actors(Elsevier,New York,1991),pp.371-380。肝臓におけるIGFBP-1生産は、そ れの生産を直接抑制するインスリンによって、栄養状態によって調節される。Su ikkariら,J.Clin.Endocrinol.Metab.,66:266-272(1988)。 インビボにおけるIGFBP-1の機能は、乏しく理解される。ラットに対する精製 したヒトIGFBP-1の投与は、急性の、しかし少量の、血中グルコースの増加を生 じることが示されている。Lewittら，Endocrinology，129:2254-2256(1991)。IG FBP-1の調節は、幾分良好に理解される。それは、血中グルコースが上昇し且つ インスリンが分泌される場合、IGFBP-1は抑制され、グルコース輸送についてイ ンスリン作用をアシストするであろう"遊離"ＩＧＦ-Iレベルをゆっくりと増加す ることが提案されている(LewittとBaxter,Mol.Cell Endocrinology,79:147-152( 1991))。そのようなシナリオは、血中グルコースの直接調節としてIGFBP-1の機 能を設定する。 ＩＴＧＦ系はＩＧＦ-I、ＩＧＦ-II、及びインスリンのための膜結合レセプタ ーをも構成する。Ｉ型ＩＧＦレセプターは、そのシグナリング通路の幾つかの構 造と形状においてインスリンレセプターに密接に関係付けられる。JonesとClemm ons,supra。ＴＧＦ-IIレセプターは、細胞内のシグナルを移送することがないよ うに見える排除レセプターである。JonesとClemmons，supra。インスリンレセプ ターに対してよりも、より高い親和力を持ったＩ型ＩＧＦ-IレセプターにＩＧＦ -IとＩＧＦ-IIが結合することから、ＴＧＦ-IとＩＧＦ-IIの大部分の作用がＩ型 レセプターによって仲介されることは、ほぼ間違いない。Ballardら，"Does IGF -I everact through the insulin receptor?",in Baxterら,(eds.),The Insulin -Like Growth Factors and Their Regulatory Proteins,(Amsterdam:Elsevicr,1 994),pp.131-138。 IGFBPsに結合するＩＧＦ-IとＩＧＦ-II上のドメインを同定するための多くの 研究がなされている。Bayneら,J.Biol.Chem.,265:15648-15652(1990);米国特許 第5,077,276;5,164,370;5,470,828。例えば、それはＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIのＮ- 末端領域がIGFBPsに結合するために臨界であることが発見されている。米国特許 第5,077,276;5,164,370;5,470,828。かくして、dcs(1-3)IG-1と定義した自然な ＩＧＦ-I変異体は、IGFBPsに不完全に結合する。 リサーチの類似の量が、Ｉ型ＴＧＦレセプターに結合するＩＧF-IとＩＧＦ-II 上のドメインを同定するため進展している。Bayneら,supra;Ohら,supra。位置24 ,31と60でＩＧＦ-I中のチロシン残基は、１型ＩＧＦレセプターへのＩＧＦ-Iの 結合を困難にする。Bayneら，supra。これらのチロシン残基の１又はそれ以上が 置換された変異ＩＧＦ-I分子は、Ｉ型ＴＧＦレセプターに対して漸次減じられる 結合を示した。Bayneら，supra,もまた、ＩＧＦ-Iのそのような変異体がＩ型Ｉ ＧＦレセプターとIGFBPsとに結合できたことを調査した。彼らはＩＧＦ-IとＩＧ Ｆ-II上の完全に異なる残基が、Ｉ型ＩＧＦレセプターに結合するために用いた それからのIGFBPsに結合するために使用されることを見出した。それは従って、 IGFBPsへの減じられた結合を示すが、しかしそれがＩ型ＩＧＦレセプターに良く 結合することから、インビトロでの活性測定において維持された活性を示す、Ｔ ＧＦ変異体を生産する可能性がある。 IGFBPsに結合するが、ＩＧＦレセプターにはしない且つそれ故にインビトロで の活性測定における減じられた活性を示すＩＧＦ変異体も報告される。Barら，E ndocrinology,127:3243-3245(1990)。この変異体において(1-27,gly4,38-70)-hI GF-Iと定義したヒトＩＧＦ-IのＣ領域の残基28-37は、４つのグリシンブリッジ によって配置される。Barらは、変異ＩＧＦに又はＩＧＦ自身へのIGFBPs結合の 配置に基づいて心臓を経てのIGFBPとの複合体として灌流させた場合の変異ＩＧ Ｆ-Iの輸送を研究した。ＩＧＦ変異体とIGFBPの複合体の局在化についてのデー タのみが単独で与えられたＩＧＦ変異体の局在化についてのBarらによって供給 されたデータはなかった。さらにBarらはＩＧＦ変異体の投与に応答するいずれ かの生物学的な又は有効性についてのデータは提供していない。 端を切り取った他のＩＧＦ-I変異体が開示される。例えば、特許文献において 、WO 96/33216は、確かなＴＧＦ-Iの1-69残基を有する端を切り取った変異体を 記載する。EP 742,228は、省略されたＣドメインを有する自然に生じる単鎖ＩＧ Ｆ-Iの誘導体である２-鎖ＩＧＦ-I超アゴニストを開示する。そのＩＧＦ-I類似 体は、式：ＢＣn，Ａである、 式中、ＢはＩＧＦ-I又はそれの機能的類似体のＢドメインであり、ＣはＩＧＦ-I 又はそれの機能的類似体のＣドメインであり、ｎはＣドメイン中のアミノ酸の数 であり且つ約６から約１２までである、及びＡはＩＧＦ-I又はそれの機能的類似 体のＡドメインである。 さらに、Cascieriら，Biochemistry,27:3229-3233(1988)は、ＴＧＦ-Iの４つ の変異体、Ｉ型ＩＧＦレセプターへの減じられたアフィニティーを有する３つを 開示する。これらの変異体は：(Phe23,Phe44,Tyr25)IGF-1(１及び２型ＩＧＦ及 びインスリンレセプターへのそれのアフィニティーにおいてヒトＩＧＦ-Iの備品 である)、(Leu24)IGF-Iと(Ser24)IGF-I(ヒト胎盤Ｉ型ＩＧＦレセプター、該胎盤 インスリンレセプター、及びラットとマウス細胞のＩ型ＩＧＦレセプターに対す るＩＧＦ-Iよりもより低いアフィニティーを有する)、及びデスオクタペプチド( Leu24)IGF-I（Ｉ型ＩＧＦレセプターのための(Leu24)IGF-Iより低いアフィニテ ィーとインスリンレセプターのためのより高いアフィニティーを有する、位置２ ４での芳香性の欠損がｈＴＧＦ-Iのカルボキシ末端Ｄ領域の削除と結合される) である。これらの４つの変異体は、ヒト血清結合タンパク質に対し通常のアフィ ニティーを有する。 Bayneら,J.Biol.Chem.,263:6233-6239(1988)は、ヒトＩＧＦ-Iの４つの構造類 似体を開示する：ＩＧＦ-Iの最初の１６アミノ酸におけるＢ鎖変異体は、インス リン、(Gln3,Ala4)IGF-I,(Tyr15,Leu16)IGF-I,及び(Gln3,Ala4,Tyr15,Leu16)IGF -IのＢ鎖の最初の１７アミノ酸と置換される。これらの研究は、血清結合タンパ ク質とＩＧＦ-IIレセプターとの高いアフィニティーを維持することに応答可能 であるＩＧＦ-Iのドメインの幾つかを同定する。 Bayneら,J.Biol.Chem.,264:11004-11008(1988)は、ＩＧＦ-Iの３つの構造類似 物を開示する：ＩＧＦ-Iのカルボキシ末端８アミノ酸Ｄ領域を欠いている、(1-6 2)IGF-I；ＩＧＦ-IのＣ領域の残基28-37が４つの残基グリシンブリッジによって 置換された(1-27,Gly4,38-70)IGF-I;及びＣ領域グリシン置換及びＤ領域削除 を伴う、(1-27,Gly4,38-62)IGF-I。Peterkofskyら,Endocrinology,128:1769-177 9(1991)は、Bayneら，supra(Vol.264)のGly4変異体を用いるデータを開示する。 米国特許第5,714,460号は、ＩＧＦ-I又は神経ダメージを治療するためのＩＧＦ- Iの活性濃度を増加する化合物を使用することに関する。 Cascieriら,J.Biol.Chem.,264:2199-2202(1989)は、ＩＧF-IのＡ領域中の特異 的残基がインスリンのＡ鎖における一致する残基によって置換された３つのＩＧ Ｆ-I類似体を開示する。その類似体は： (Ile41,Glu45,Gln46,Thr49,Scr50,Ile51,Ser53,Tyr55,Gln56)IGF-I，Ａ鎖変異体 、ここで残基41はトレオニンからイソロイシンまで変えられ且つＡ領域の残基42 -56は置換される；(Thr49,Ser50,Ile51)IGF-I;及び(Tyr55,Gln56)IGF-Iである。 Clemmonsら,J.Biol.Chem.,265:12210-12216(1990)は、IGFBP-1のリガンド特異 性と、ＩＧＦ-Iの生物学的活性を調節することにおけるIGFBP-1の役割を研究す るためＩ型ＩＧＦレセプター又は結合タンパク質のいずれか一方のための減じら れた結合アフィニティーを有するＩＧＦ-I類似物の使用を開示する。 WO 94/04569は、自然のIGFBP以外の特異的結合分子、即ちＩＧF-Iに結合する ことができ且つＩＧＦ-Iの生物学的活性を増大できる分子を開示する。 米国特許第5,593,844号と5,210,017号は、抗体の使用によって液体サンプル中 のＧＨ結合タンパク質又はIGFBPの量を定量化するために使用することができる リガンド介在免疫機能結合タンパク質アッセイを開示し、ここでは複合体形成が これら結合タンパク質の一つとそれと結合するホルモンリガンドとの間で起こる 。 ＩＧＦ変異体の中のリサーチの方向性は、IGFBPsを結合することはないが、Ｉ ＧＦレセプターへの維持された結合を示すＩＧＦ変異体を作製することに最も向 けられている。そのような分子の研究に隠されたアイデアは、ＩＧＦの活性の抑 制をすることが企図されるIGFBPsの主要な働きである。これら変異体中の主たる ものは、ＩＧＦレセプターのためのアフィニティーを未だに維持したＩＧＦ結合 タンパク質の幾つかのための選択的に減じられたアフィニティーを示す、自然の 分子、dcs(1-3)IGF-Iである。米国特許第5,077,276号;5,164,370号;5,470,828号 ,supra。 ＩＧＦアゴニストとして作用する分子のための、及び高いアフィニティーによ ってＩＧＦ結合タンパク質に結合する分子のための、及び特別な治療又は診断的 な目的のための技術の必要性がある。 発明の開示 本発明は、それの作用の一部として、ＩＧＦの作用をアゴナイズするためにIG FBP-1への結合によるようなIGFBPへのＩＧＦの結合を抑制する放出因子を提供す るための新規な方法に関する。従って、本発明は、(1-27,gly4,38-70)-hIGF-Iを 除く、ヒトＩＧＦレセプターに結合することがないIGFBPに対する抗体を除く、 及び位置24,31,及び／又は60で置換又は削除したチロシン残基を持つヒトＩＧＦ -Iの自然の配列を有するペプチドを除く、そのIGFBPsのいずれか１つとＩＧＦと の相互作用を抑制し且つヒトＩＧＦレセプターに結合しない化合物を提供する。 好ましくは、ここでの該化合物はIGFBP、好ましくは血清IGFBPに結合する。ま た好ましくは、該化合物は、哺乳動物中の血漿インスリン分泌を減じ、血漿ＧＨ を減じ、及び／又は血中グルコースレベルを減じる。 他の好適な実施態様において、ここでの化合物は、ペプチド、特に、約10から 約25のアミノ酸残基を有する及び／又はそのＮ末端から位置5,6,7,又は8と番号 付けしたシステイン残基を有する又はそのＣ末端から位置5,6,7,又は8と番号付 けしたシステイン残基を、又はそのようなシステイン残基の両方を、又はそのＮ 末端から位置２と番号付けしたシステイン残基を有するペプチドである。 別な実施態様において、本発明は以下のペプチドからなる群から選択されたア ミノ酸配列を含んでいるペプチドを提供する： 別な実施態様において、該ペプチドは、配列番号：１０４であるアミノ酸配列 を含む。別な実施態様において、該ペプチドは、配列番号：１０５、配列番号： １０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号： １１２、配列番号：１１３、配列番号：１１４、配列番号：１１５、又は配列番 号：１１６であるアミノ酸配列を含む。更なる実施態様において、該ペプチドは 、配列番号：１０９、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９ 、配列番号：１２０、又は配列番号：１２１であるアミノ酸配列を含む。更なる 実施態様において該ペプチドは、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番 号：１２４、配列番号：１２５、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番 号：１２９、配列番号：１３０、配列番号：１３２、又は配列番号：１３３であ るアミノ酸配列を含む。 更に別な実施態様において、該ペプチドは、位置２，３，４，又は６でＤ-ア ラニン置換又は位置７，８，９，１１，１２，１３，又は１４でアルファ-アミ ノイソブチラート置換、又は上記のいずれかの組合せを有する配列番号：１５の アミノ酸配列を含む。好ましくは、このペプチドは位置２，３，又は６でのＤ- アラニン置換又は位置７，８，９，１１，１２，１３，又は１４でのアルファ- アミノブチラート置換、又は上記のいずれかの組合せを有する。より好ましくは 、このペプチドは、位置６でのＤ-アラニン置換又は位置８，９，又は１３での アルファ-アミノイソブチラート置換を有する。更に好ましくは、ペプチドのこ れら後者のセットは、ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有す る。 また、製薬的に許容される担体中に、上記化合物又はペプチドの一つを含む組 成物をここに提供した。好ましくは、この組成物は無菌である。 これらの化合物及びペプチドの使用は、外因性又は内因性ＩＧＦｓの少なくと も１の生物学的活性を開放する又は増大する全ての使用を含む。それらは、後述 するように、ＩＧＦ-IのようなＩＧＦが使用される、治療、抑制、又は予防条件 において使用され得る。 また、そのIGFBPsのいずれか１つとＩＧＦの相互作用を抑制し且つヒトＩＧＦ レセプターと結合しない化合物の有効な量を哺乳動物に投与することを含んでい る哺乳動物における生物学的活性ＩＧＦの血清又は組織レベルを増加するための 方法をここにさらに提供した。好ましくは、この化合物はまた、哺乳動物中の血 漿インスリン分泌、血漿ＧＨ分泌、または血中グルコースレベルをも減じ、且つ いずれかの種からの内因性ＧＨの分泌又は放出を直接刺激しない。他の好適な実 施態様において、この化合物は、IGFBP-1及び／又はIGFBP-3のようなＩＧＦＢＰ に結合し、及び／又はヒトＩ型ＩＧＦレセプターと結合しない。加えて、該哺乳 動物は、好ましくはヒトてあり、且つ該化合物は、好ましくはペプチド、より好 ましくは約１０から約２５アミノ酸残基を有するそれである。また該化合物を、 好ましくは体重増加を生じるために有効な量において、哺乳動物中の同化作用の 増加を生じさせるために投与することが好適である。血糖値制御が、該化合物が 投与された後の哺乳動物中でもたらされることが更に好適である。 もしそれがペプチドであるなら、該化合物をコードしている単離した核酸も又 提供され、インビボで又はエクスビボ遺伝子治療のため使用され得る。 この化合物は、単独で、或いはＧＨ、ＧＨ放出ペプチド(GHRP)、ＧＨ放出因子 (GHRF)、ＧＨ放出ホルモン(GHRH)、ＧＨ分泌促進剤、ＩＧＦ、IGFBPとの組み合 わせにおいてのＩＧＦ、IGFBP、ＧＨ結合タンパク質(GHBP)との組合せにおいて のＧＨ、インスリン、又は低血糖剤(以下に定義したチアゾリジンジオンのよう なインスリン感作剤を含む)のような別の剤と一緒に投与され得る。 本発明の更に別な態様において、そのIGFBPsのいずれか１つとＩＧＦとの相互 作用を抑制する及びヒトＩＧＦレセプターに結合しない化合物の有効な量を哺乳 動物に投与することを含む哺乳動物において血糖値制御を生じさせるための方法 が提供される。好ましくは、該化合物は、哺乳動物中の血漿インスリン分泌及 び血中グルコースレベルをも減じ、且つIGFBPを結合する。また好ましくは、該 哺乳動物は、糖尿病のような高血糖症疾患を有する。この方法は、低血糖剤又は インスリンの有効量を該哺乳動物に投与することを補足的に含み得る。 また、哺乳動物における生物学的活性ＩＧＦの血清及び組織レベルを増加する ための方法及び哺乳動物において同化作用を増加するための方法、又はここでの 化合物を含有する有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に おいて血糖値を制御するための方法が提供される。 別な実施態様において： (a)体液中のＩＧＦのレベルを測定すること； (b)単一又は複数投薬を用いこの化合物と該液とを接触させること；及び (c)該液中のＩＧＦのレベルを再測定すること、ここでもし該液のＩＧＦレ ベルが、該化合物が投与されたために望まれる効力を生じさせるために十分な量 によって低下しているならば、該化合物の投薬量が最大限の効力を生じさせるた めに調節可能であり又は調節される、 を含む、ＩＧＦとそのIGFBPsのいずれか１つとの相互作用を抑制し且つヒトＩＧ Ｆレセプターに結合しない、化合物の妥当な投薬量を測定するための方法が提供 される。 更に別の実施態様において、該化合物の投薬量が妥当に調節され得るように生 物学的液体中の特有のIGFBPの量を又は特有のIGFBPに結合する該化合物の量を測 定するための方法が提供される。この方法は： (a)該液体と、１）固相担体に付着した第１の抗体とを接触させること、該 第１の抗体は、抗体の存在中でＩＧＦ結合サイトが該化合物に結合するためのIG FBP上に利用可能に残るようにIGFBP上のエピトープのために特異的であり、それ によって該第１の抗体とIGFBPとの間の複合体を形成すること；及び２）IGFBP上 の全ての利用可能なＩＧＦ結合サイトを飽和させるために十分な時間、上記同定 した化合物と接触させること、それによって飽和した複合体を形成すること； (b)該化合物がIGFBPに結合される場合に結合に利用可能である該化合物上の エピトープに特異的である検出可能に標識した第２の抗体と該飽和した複合体 とを接触させること；及び (c)生物学的液体中のIGFBPの指標として、且つそれ故に結合した該化合物の 量の指標として、標識した第２の抗体結合の量を定量分析すること、 を含む。 また、ここでの化合物を含む製薬組成物及び該組成物を使用するために使用者 向けの指示書を含めた容器を含むキットがここに意図される。このキットは、Ｇ Ｈ、ＧＨＲＰ、ＧＨＲＦ、ＧＨＲＨ、ＧＨ分泌促進剤、ＩＧＦ、IGFBPとのＩＧ Ｆ複合体、IGFBP、ＧＨＰＢと複合したＧＨ、インスリン、又は低血糖剤を含む 容器を任意に更に含み得る。 また、リガンドに結合するポリペプチドと競合するペプチドのリガンドに対す る相対アフィニティーを予測するための方法がここに包含され、該ペプチドはフ ァージ-ディスプレーライブラリーから誘導され、該リガンドの存在において該 ポリペプチドと、該ペプチドに一致するファージミドクローンをインキュベート すること、該ファージを順次希釈すること、及び該ペプチドによって抑制される 該リガンドに対するファージミドクローンの結合に対する度合を測定すること、 ここで低いファージ濃度でのみ抑制されるファージミドクローンは、高い及び低 いファージ濃度の両方で抑制されるファージミドクローンよりもリガンドへのよ り高いアフィニティーを有する、を含む方法である。 ここでの別な実施態様において、そのサイトに普及した、又は該サイトから不 在のいずれかであるIGFBPに特異的であるここでの化合物の有効な量を哺乳動物 に投与することを含む哺乳動物中の特有なサイトの別の方向に、又はその方向の いずれかに内因性ＩＧＦを導くための方法である。 更なる実施態様は、ＩＧＦ結合タンパク質に結合した内因性又は外因性ＩＧＦ を、又はＩＧＦ結合タンパク質に結合し且つＩＧＦ結合タンパク質に結合したヒ トＩＧＦレセプターに結合しない化合物の量を検出する、又は生物学的液体中の 未結合ＩＧＦレベルを検出するための方法であり： (a)該液体と、１）固相担体に付着した化合物を検出するための手段とを接 触させること、該手段は、該化合物の存在中でＩＧＦ結合サイトがＩＧＦ結合タ ンパク質に結合するための化合物上に利用可能に残るよう該化合物に特異的であ り、それによって該手段とＩＧＦ結合タンパク質との間の複合体を形成すること ；及び２）ＩＧＦ結合タンパク質上の利用可能なＩＧＦ結合サイトの全てを飽和 するために十分な時間、該化合物と接触させること、それによって飽和した複合 体を形成すること； (b)該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能で あるＩＧＦ結合タンパク質のために特異的である検出可能に標識した第２の手段 と、該飽和した複合体とを接触させること；及び (c)IGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物とＩＧＦ結合タンパ ク質、結合したＩＧＦとＩＧＦ結合タンパク質、又は該液体中に存在する活性Ｔ ＧＦの指標として、結合した標識した手段の量を定量分析すること、 を含む。 ＩＧＦの作用においてIGFBPsの役割についての多くの論議がある。各種の状況 においてＩＧＦｓの活性は、抑制され、増大され、又はIGFBPsの存在によって影 響されないいずれか一方とされることが示されている。JonesとClemmons,supra; BachとRechler,supra。もしIGFBPsがＩＧＦｓの何らかの作用の義務を負わされ るなら不明確とされている。何らかの作用のために、IGFBPsに結合されるべきＩ ＧＦｓのために必要とされる、又はもしＩＧＦ-Iが完全に活性化されたならば、 存在すべきIGFBPsのためにそれが必要とされたことが可能であると思われた。本 研究の前に、何がそのIGFBPsのいずれか１つによってＩＧＦの相互作用を抑制す る分子を投与することのインビボでの正味の生物学的作用とされるであろうこと は不明確であった。 ここでの化合物は、その後者が短い半減期と効果を有すること、それに対して ここでの化合物が長い半減期と効果を有していること、及び、もしそれがIGFBPs に結合するならば、この結合が短鎖ペプチドと他の小さな分子に急速に他方を排 除するであろう通常の腎臓の濾過を回避することから、des(1-3)IGF-Iのような ＩＧＦ変異体に勝っている。更に、外因性ＧＨ又はＧＨ分泌促進物質と一緒にこ こでの化合物を投与することは、そのようなＧＨと分泌促進剤の糖尿病誘発性作 用を最上限にする有効性を有するであろう。ここでの化合物の更に別の有効性は 、ここでのＩＧＦアゴニスト化合物の作用の上限を決めることである。即ち、そ れ は、もしその最大効力を越える高い濃度で使用したならば、望ましくない副作用 を有し得る、ＩＧＦ-Iとは異なり、搬送ＩＧＦｓへのIGFBPsの最大許容量よりも より効果的に発揮できない。 図面の簡単な説明 図１は、Ｙ２４Ｌ，Ｙ３１Ａ，又は(Leu24,Ala31)hIGF-1，又はＩＧＦ-Mとし てここに定義したＩＧＦ-I変異体をコードしているＤＮＡの５'末端で接合したl amBシグナルの核酸配列(配列番号：１７)と翻訳したアミノ酸配列(配列番号：１ ８)を表し、位置２４でTyrがLeuに変わり、位置３１でTyrがAlaに変えられる。 図２は、p131TGFのベクターフラグメントからの、pBKI6F-2Bの120-bpと190-bp フラグメントからの、及びＤＮＡの合成片からの、プラスミドpIGFMIの構築を表 す。 図３は、pIGFMIの完全ヌクレオチド配列(配列番号：１９)を表す。 図４は、ＩＧＦ-I(四角)又は(Leu24,Ala31)hIGF-1(丸)がKIRAリン酸化アッセ イにおいてＭＣＦ-7細胞に加えられる場合のレセプターリン酸化のための標準曲 線である。 図５は、ＩＧＦ-I又は(Leu24,Ala31)hIGF-1を用いるマウス３Ｔ３細胞中への チミジン混入を示す。 図６は、IGFBP-1への(Leu24,Ala31)hIGF-1の結合アフィニティーを示す。 図７は、IGFBP-3への(Leu24,Ala31)hIGF-1の結合アフィニティーを示す。 図８Ａと８Ｂは、平均化し且つ１００％にセットした前処置血液サンプルでの 値のパーセンテージとして表した、(Leu24,Ala31)hIGF-1(黒丸)又はコントロー ル(PBS)(白四角)によって、第１の実験において処置した通常ラットの血漿グル コース(図８Ａ)と血漿インスリン(図８Ｂ)の応答を表す。 図９Ａと９Ｂは、平均化し且つ１００％にセットした前処置血液サンプルでの 値のパーセンテージとして表した、(Leu24,Ala31)hIGF-1(黒三角)、又はＩＧＦ- I(黒丸)、又はコントロール(pBS)(白四角)によって、第２の実験において処置し た通常ラットの血漿グルコース(図９Ａ)と血漿インスリン(図９Ｂ)の応答を表す 。 図１０Ａと図１０Ｂは、(Leu24,Ala31)hIGF-1、ＩＧＦ-1、又はコントロール によって処置した糖尿病ラットの基線(１００％としてセット)からの血漿インス リン(図１０Ａ)及び基線(１００％としてセット)からの血漿グルコース(図１０ Ｂ)におけるパーセンテージ変化を示す。 図１１Ａと図１１Ｂは、(Leu24,Ala31)hIGF-1、ＩＧＦ-I、又はコントロール によって、第２の実験において処置した糖尿病(ZDF)ラットの基線(１００％とし てセット)からの血漿インスリン(図１１Ａ)及び基線(１００％としてセット)か らの血漿グルコース(図１１Ｂ)におけるパーセンテージ変化を示す。 図１２は、７日間にわたり、２つの投薬量での(Leu24,Ala31)hIGF-1によって 、ＧＨによって、ＧＨと(Leu24,Ala31)hIGF-1の組合せによって、又はコントロ ールによって、処置したラットの最終体重を示す。 図１３Ａと１３Ｂは、図１２についての上述した実験における脾臓の重量を示 し、図１３Ａは絶対脾臓重量を示し、図１３Ｂは体重のパーセンテージとして表 した脾臓重量を示す。 図１４Ａと１４Ｂは、図１２についての上述した実験における胸腺の重量を示 し、図１４Ａは絶対胸腺重量を示し、図１４Ｂは体重のパーセンテージとして表 した胸腺重量を示す。 図１５Ａと１５Ｂは、図１２についての上述した実験における心臓の重量を示 し、図１５Ａは絶対心臓重量を示し、図１５Ｂは体重のパーセンテージとして表 した心臓重量を示す。 図１６は、図１２についての上述した実験における５つの処置群からの骨端の プレート幅を示す。 図１７Ａと１７Ｂは、図１２について記載した実験における５つの処置群中の ラットＩＧＦ-Iの量(図１７Ａ)と全ＩＧＦ-Iの量(図１７Ｂ)を示す。 図１８は、プラシーボ(白四角)、(Leu24,Ala31)hIGF-1(白三角)、ＩＧＦ-I(白 丸)、(Leu24,Ala31)hIGF-1とＩＧＦ-Iの組合せ(黒四角)、ＧＨ(半白／半黒四角) 、及び(Leu24,Ala31)hIGF-1とＧＨの組合せ(黒四角)で処置したdwarfラットの７ 日間にわたる最終体重を表す。 図１９Ａと１９Ｂは、図１８についての上述した実験における脾臓の重量を示 し、図１９Ａは絶対脾臓重量を示し、図１９Ｂは体重のパーセンテージとして表 した脾臓重量を示す。 図２０Ａと２０Ｂは、図１８についての上述した実験における腎臓の重量を示 し、図２０Ａは絶対脾臓重量を示し、図２０Ｂは体重のパーセンテージとして表 した脾臓重量を示す。 図２１Ａと２１Ｂは、図１８について記載した実験における６つの処置群での 血液中のラットＩＧＦ-Iの量(図２１Ａ)と全ＩＧＦ-Iの量(図２１Ｂ)を示す。 図２２Ａと２２Ｂは、賦形剤コントロールで(黒三角)、150μｇの(Leu24,Ala3 1 )hIGF-1でtid(一日に三度)(白四角)、50μｇの(Leu24,Ala31)hIGF-1でtid(白丸 )及び50μｇのＩＧＦ-Iでtid(黒丸)、処置した糖尿病ラットの長期間にわたる体 重増加(図２２Ａ)と血中グルコースレベル(図２２Ｂ)を表す。 図２３Ａと２３Ｂは、図２２について記載した実験における血中グルコースレ ベルの増加(図２３Ａ)とインスリンレベルの変化(図２３Ｂ)を示す。コントロー ルは黒バーで、150μｇの変異体は暗斜線バーで、50μｇの変異体は明斜線バー で、及びＩＧＦ-Iは白バーで示した。 図２４はファージライブラリーを構築するためのテンプレートとして使ったプ ラスミドpt4.g8のＤＮＡ配列(配列番号：２０)を表す。またバクテリオファージ Ｍ１３のg8pに融合した抗体-認識可能(gD-tag)ペプチドのアミノ酸配列(配列番 号：２０)も示される。 図２５は、４つのライブラリープールのそれぞれと、標的ＩＧＦ-I、IGFBP-1 、及びIGFBP-3を用いる選択による遺伝子-８固有ファージライブラリー富化を示 す。 図２６は、IGFBP-３選択からのｇ８-ファージペプチドを用いるＩＧＦ-I遮断 アッセイを示し、ここでファージ滴定は100nM ＩＧＦ-Iによる。該図中、白丸は ペプチド4A3.1であり、白三角はペプチド4B3.4であり、白四角はペプチド4C3.2 であり、黒丸はペプチド4D3.3であり、黒三角はペプチド4D3.4であり、黒四角は ペプチド4D3.5である。 図２７は、IGFBP-３選択からのｇ８-ファージペプチドを用いるＩＧＦ-I遮断 アッセイを示し、ここでファージ滴定はＩＧＦ-Iなしである。ペプチドのために 定義は図２６についての上記したそれと同じである。 図２８は、IGFBP-1選択からのｇ８-ファージペプチドを用いるＩＧＦ-I遮断ア ッセイを示し、こでファージ滴定は１μＭＩＧＦ-Iによる。 図２９は、IGFBP-３選択からのｇ８-ファージペプチドを用いるＩＧＦ-I遮断 アッセイを示し、ここでペプチド(4C3.2,4D3.8,4D3.9,4D3.11,及び4D3.12)は、N EUTRAVIDINTM/DTT選択からとする。黒バーは100μＭ ＩＧＦ-Iによるもので、白 バーはＴＧＦ-I無しである。 図３０は、IGFBP-３選択からのｇ８-ファージペプチドを用いるＴＧＦ-I遮断 アッセイを示し、ここでペプチド(ｘ軸上に示した)は、直接-被覆/HCl選択から とする。黒バーは100μＭ ＩＧＦ-Iによるもので、白バーはＩＧＦ-I無しである 。 図３１は、遊離結合タンパク質を測定するためにBIAcorcTM表面プラスモン-共 鳴装置を用いIGFBP-3に結合するペプチド(BP3-01と定義した)によるIGFBP-3抑制 の競合アッセイを表す。丸はＩＧＦ-Iの800応答単位(RU)を示し、四角は固定化 したＩＧＦ-Iの400RUを示す。 図３２は、遊離結合タンパク質を測定するためにBIAcorcTM表面プラスモン-共 鳴装置を用いIGFBP-3に結合するペプチド(BP3-02と定義した)によるIGFBP-3抑制 の競合アッセイを表す。丸はＩＧＦ-Iの800RUを示し、四角は固定化したＴＧＦ- Iの400RUを示す。 図３３は、IGFBP-1又はIGFBP-3に結合するが、Ｉ型ＩＧＦレセプターに結合し ない３つのペプチドによってプレート上のＩＧＦ-Iへのビオチン化IGFBP-1結合 の抑制を示す(bp1-01:黒丸、bp1-02:白丸、及びbp3-01-ox:白三角)。 図３４は、IGFBP-1に結合するが、Ｉ型ＩＧＦレセプターに結合しない２つの ペプチドによってプレート上のＴＧＦ-Iへのビオチン化IGFBP-3結合の抑制を示 す(bp1-01(bp3):黒丸、bp1-02(bp3):白丸)。 図３５は、IGFBP-3を抑制するため、IGFBP-3に結合するが、Ｉ型ＩＧＦレセプ ターに結合しない２つのペプチドの能力の放射能標識ＩＧＦ-Iプレートアッセイ を示す(bp3-01-ox:丸、bp3-02:四角)。 図３６は、IGFBP-1を抑制するため、図３５について記載した２つのIGFBP-3 結合ペプチドの能力の放射能標識ＩＧＦ-Iプレートアッセイを示す(シンボルは 同じ)。 図３７は、３つのペプチドを用いるＩＧＦ-I活性のKIRAアッセイを表す(bp1-0 1:四角、bp1-02:丸、及びbp3-ox:三角)。図３７Ａは、ペプチド単独を表し、図 ３７ＢはペプチドプラスＩＧＦ-IプラスIGFBP-1を表し、図３７Ｃはペプチドプ ラスＩＧＦ-Iを表し、図３７ＤはペプチドプラスＩＧＦ-IプラスIGFBP-3を表す 。 図３８は、遊離結合タンパク質を測定するためBIAcorcTM表面プラスモン-共鳴 装置を用い、bp3-01-ox(白四角)、BP14(白丸)、BP15(黒丸)、及びBP17(黒四角) で定義した、４つのペプチドによるIGFBP-3抑制のＩＧＦ-II競合アッセイを表す 。各ペプチドＡ20nM IGFBP-3と固定化ＴＧＦ-IIの約1500RUを用い試験した。 図３９は、H2O溶液中３０℃でのIGFBP-1(bpl-01)へのペプチド結合の一次元1 Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す。 図４０Ａと４０Ｂは、溶液中のペプチドbp1-01の構造の三次元モデルを開示す る。これらはＮＭＲデータから得た制限を用いて計算した構造の総体からのp1-0 1の表現構造の立体表示である。バックボーン部分はリボンとして表し、側鎖重 原子の全てが示され；各非グリシン残基が標識される。二つの視界はほぼ９０° 相違する。その相対平面疎水性表面(図４０Ａ中の左、及び図４０Ｂ中の視界の 方向)は、自己会合が含まれ、IGFBP-1結合も含まれ得る。 図４１は、通常のヒトからの血清中に存在する内因性IGFBPsから125Ｉ-ＩＧＦ -Iを移す変異体(Leu24,A1a31)hIGF-1の能力を実証するクロマトグラムである。 データはフラクション(n=1)当たりのｃｐｍとして表した。該図中、丸を伴う実 線はインキュベーションの１の時点での変異体であり、丸を伴う長ダッシュ線は インキュベーションの0.5時間の時点での変異体であり、ダイアモンドを伴う短 ダッシュ線はインキュベーションの３時間の時点での変異体であり、及び四角を 伴う短ドット線はインキュベーションの１６時間の時点での変異体である。 図４２は、プラシーボ(p)又は一日二度の皮下注射によって１２週間、rhIGF-1 の10(1)、20(2)、40(4)、又は80(8)μg/kgで処置したII型糖尿病患者の血液中の ＩＧＦ-Iの濃度を示す。 図４３は、図４２について記した通りに処置した患者の血液中のＩＧＦ-IIの 濃度を示す。 図４４は、図４２について記した通りに処置した患者の血液中のIGFBP-3の濃 度を示す。 好適な実施態様の記載 Ａ．定義 ここで用いた通り治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜、及び飼育 動物、及び動物園、スポーツ用、又は愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒ ツジ、ブタ、ウシなどを含む、哺乳動物として分類されたいずれかの動物に関す る。ここでの好ましい哺乳動物はヒトである。用語「非成人」は、周産期から( 低誕生重乳児のような)成熟期に達するまでの、その後者は完全な成長可能性に まで達していないそれらである、哺乳動物に関する。 ここで用いた通り「ＩＧＦ」は、自然インスリン様成長因子-I及び自然インス リン様増殖因子-II、同様に他方ではdes(1-3)IGF-Iとして知られる脳ＩＧＦのよ うなそれの自然変異体に関する。 ここで用いた通り「ＩＧＦ-I」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヒトを含 む何れかの種、好ましくはヒトからの、及びもし外因性投与に関係するならば、 自然、合成又は組換えの何れかの１つの、何れかのソースからのインスリン様成 長因子-Iに関する。ヒト自然-配列、成熟ＩＧＦ-I、より好ましくはＮ末端メチ オニンを除いたものが、例えば、1987年８月５日公開のEP 230,869；1984年12月 19日公開のEP 128,733；又は1988年10月26日公開のEP 288,451中に記載された方 法により調製される。より好ましくは、この自然-配列ＩＧＦ-Iは、組換え的に 生産され且つ臨床的研究のためにはジェネンテック社，South San Francisco,CA から利用可能とされる。 ここで用いた通り「ＩＧＦ-II」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヒトを 含む何れかの種、好ましくはヒトからの、及びもし外因性投与に関係するならば 、自然、合成又は組換えの何れかの１つの、何れかのソースからのインスリン様 成長因子-IIに関する。それは、例えば上記EP 128,733中に記載した方法によっ て 調製され得る。 「IGFBP」又は「ＩＧＦ結合タンパク質」は、それが循環性(即ち血消又は組織 中)であろうとなかろうと、ＩＧＦ-I又はＩＧＦ-IIと通常は結合する又は結合し た又は複合化したタンパク質又はポリペプチドに関する。そのような結合タンパ ク質は、レセプターを含まない。この定義は、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGF BP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、Mac25(IGFBP-7)、及びプロスタサイクリン-刺激因子( psF)又は内皮細胞-特異的分子(ESM-1)、同様にIGFBPsに高い相同性を持つ他のタ ンパク質を含む。Mac25は、例えば、Swisshelmら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:4 472-4476(1995)とOhら,J.Biol.Chem.,271:30322-30325(1996)中に記載される。P SFは、Yamauchiら,Biochemical Journal,303:591-598(1994)中に記載される。ES M-1は、Lassalleら,J.Biol.Chem.,271:20458-20464(1996)中に記載される。他に 同定されたIGFBPsのため、例えば、1990年６月27日公開のEP 375,438；1990年５ 月23日公開のEP 369,943；1989年10月５日公開のWO 89/09268；Woodら,Molecula r Endocrinology,2:1176-1185(1988)；Brinkmanら,The EMBO J.,7:2417-2423(19 88)；Leeら,Mol.Endocrinol.,2:404-411(1988)；Brewerら,BBRC,152:1289-1297( 1988)；1988年12月７日公開のEP 294,021；Baxtcrら，BBRC,147:408-415(1987) ；Leungら，Nature,330:537-543(1987)；Martinら，J.Biol.Chem.,261:8754-876 0(1986)；Baxterら，Comp.Biochem.physiol.,91B:229-235(1988)；1989年９月21 日公開のWO 89/08667；1989年10月19日公開のWO 89/09792；及びBinkertら,EMB O J.,8:2497-2502(1989)を参照。 用語「体液」は、哺乳動物からの、好ましくはヒトからの液の生物学的サンプ ルに関する。そのような液は、血清、血漿、リンパ液、滑液、小胞液、精液、羊 膜液、乳液、全血、尿、脳脊髄液、唾液、涙液、汗、粘液、組織培養培地、組織 抽出液、及び細胞の抽出液のような水性流体を含む。 ここで用いた通り「ヒトＩＧＦレセプター」は、ヒトにおいて見出されたＩＧ Ｆのための何れかのレセプターに関し、胎盤１型ＩＧＦ-Iレセプター等のような 、ヒトＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIの両者に結合する、ヒトにおける１型と２型ＩＧＦ レセプターを含む。 そのIGFBPsの何れか１つとＩＧＦとの相互作用を「抑制する」又は「防止す る」化合物は、たとえこの増加が生じるとしても、生物学的に活性なＩＧＦの血 清及び組織レベルを増加する分子に関する。例えば、該化合物は、ＩＧＦがそれ のIGFBPsの１又はそれ以上と結合した複合体から活性なＩＧＦを部分的に又は完 全に移し替えができる。この定義の下に該化合物は、IGFBPに結合でき、且つそ れによってIGFBPに依然結合した内因性ＩＧＦを移し替えるように作用する可能 性があり、又はそのIGFBPsの１又はそれ以上とＩＧＦとの相互作用を抑制又は防 止するためにレセプター相互作用に含まれたそれから離れたサイトでＩＧＦ自身 に結合でき、しかしそのレセプターの何れかとＩＧＦとの相互作用は抑制又は防 止しない。更に、該化合物がIGFBPsを占めると同時に、その三重複合体における 効果は、二重複合体が三重のそれを形成できるかどうかに基づくであろう。ＡＬ Ｓと複合体を形成できるＩＧＦアゴニスト化合物は、ＩＧＦｓと置き換えられる であろうが、しかしIGFBP-3の又は三重複合体の濃度に影響を及ぼさない。ＡＬ Ｓと複合体を形成できないＴＧＦアゴニスト化合物は、IGFBP-3を占有するであ ろうし、ALSIGFBP-3/IGF複合体の量は減じられるであろう。これは、三重複合体 を形成し得る完全長ＩＧＦ変異体とそれができない小さなペプチドとの間の相違 であろう。ここでのペプチドの実例的な一つの構造とIGFBPとそれの相互作用に 関しては、後述の実施例９を参照。 「ＩＧＦ結合タンパク質と結合する」化合物は、高いアフィニティーであろう となかろうと、少なくともいくらかの度合でIGFBPを結合する化合物に関する。 「ヒトＩＧＦレセプターに結合しない」化合物は、何れかのそのようなレセプ ターに全てが結合せず、又は約２００倍より大きく、そのようなレセプターに結 合する野生型ヒトＩＧＦ-I(hIGF-I)又は野生型ヒトＩＧＦ-II(hIGF-II)より小さ いアフィニティーを持つそのようなレセプターに結合する。好ましくは、該化合 物は約２５０倍よりも大きく、同じレセプターに結合する野生型hIGF-I又はhIGF -IIよりも小さいか又は全てに結合しないアフィニティーを持ったそのようなレ セプターに結合する。そのような化合物は、ヒトＩ型ＩＧＦレセプターをリン酸 化せす、KIRA及び実施例１のマウス３Ｔ３アッセイを用いるマウス３Ｔ３細胞内 のチミジン取込みにより測定した通りのマウスＩＧＦ-Iレセプターを刺激しない 、即ち該化合物は(Leu24,Ala31)hIGF-1と同様に作用し又はこれらアッセイにお いて この変異体よりも一様に低くレセプターと結合する、一つとして補足的に定義さ れる。更に、ＩＧＦ-IIは、ＩＧＦ-Iアゴニストとして説明され得るし、ＩＧＦ- IはＩＧＦ-IIアゴニストとして説明され得る。しかしながら、ＩＧＦ-IとＩＧＦ -IIの両方はＩ型ＩＧＦレセプターに結合し、且つレセプター活性分子とここで 定義した通りの化合物の範囲内ではない両方である。 「疾患」は、制限されること無しに、例えば、肺病、後述するような高血糖疾 患、腎疾患、急性及び慢性腎不全のような、最終段階の慢性腎不全、糸球体腎炎 、間質性腎炎、腎孟腎炎、糸球体硬化症、例えば、糖尿病患者と腎臓移植後の腎 疾患におけるキンメルスティール‐ウィルソン病、肥満症、ＧＨ-不全、ターナ ー症候群、ラロン症候群、小人症、肥満症及び体重対身長比の増加のような老化 に関連した望ましくない徴候、減少したＣＤ４及び減少した免疫体性又は化学療 法で誘発された組織ダメージを含む免疫欠損症のような免疫学的疾患、骨髄移植 、心臓機能不全とうっ血性心不全のような心臓構造又は機能の疾患又は不全、ニ ューロンの、神経学的な、又は神経筋の疾患、例えば周辺神経症、多発性硬化症 、筋ジストロフィー、又は筋緊張性ジストロフィー、及び例えば、外傷又は創傷 又は細菌又はＨＩＶのようなヒトウイルスによる感染、創傷、皮膚病、復元を要 する腸構造と機能、その他を含む何れかの状態によって生じたるいそうに関連し た異化作用の状態、を含むＩＧＦによる治療により利益を得るであろう何れかの 状態である。治療されるべき疾患は上記の２又はそれ以上の組合せとされ得る。 ここでの治療のために標的とされる好適な疾患は、糖尿病と肥満症、心臓機能不 全、腎臓疾患、神経学的疾患、全身体成長疾患、及び免疫学的疾患である。 ここで用いた通り用語「高血糖疾患」は、糖尿病及びＩ型とII型糖尿病のよう なインスリン耐性の結果生じる疾患、同様に重症のインスリン耐性、高インスリ ン血症、及び高脂血症、例えば肥満患者、及びインスリン耐性糖尿病、Mendenha lls症候群のような、ヴェルナー症候群、妖精症、脂肪組織萎縮性糖尿病、及び 他の脂肪組織萎縮症の全ての形態に関する。好ましい高血糖症疾患は、糖尿病、 とりわけＩ型とII型糖尿病である。「糖尿病」それ自身は、インスリンの不十分 な生産又は利用を含む炭水化物代謝の発展的疾患に関し及び高血糖症と糖尿によ って特徴付けされる。 ここで用いた通り用語「治療」は、治療的な処置と予防又は予防手段の両方に 関する。治療が必要なそれらは、既に疾患に罹っているそれら、同様に疾患に罹 る傾向にある又は疾患と診断されたそれら又は該疾患を予防するべきそれらを含 む。連続した治療又は投与は、１又はそれ以上の日数による治療において中断す ること無しに、少なくとも毎日を基本とする治療に関する。間欠的な治療又は投 与、又は間的形態における治療又は投与は、連続的ではないが、ある程度まで事 実上周期的である治療に関する。ここでの治療体制は、連続的又は間欠的の何れ か一方とすることができる。 ここで用いた通り用語「低血糖剤」は、グルコース代謝を調節するために有用 な、好ましくは経口剤である化合物に関する。ここでヒトに使用するためにより 好適には、インスリン及び膵臓によるインスリンの分泌を生じさせる経口低血糖 剤のスルホニル尿素クラスである。実例は、グリブリド、グリピジド、及びグリ クラジンを含む。加えて、ビグアニド(メトホルミンとフェンホルミンを含む)及 びREZULINTM(troglitazone)ブランドインスリン感作剤のようなチアゾリデンジ オンのようなインスリン感受性を増加する又はインスリン感作とする剤、及びこ の定義の中にある、PPARガンマ核レセプターに結合する他の化合物も好適とされ る。 ここで用いた通り、「インスリン」は、何れかの種からのインスリンの何れか の形態、及び天然又は合成又は組換えから得られた何れかに関する。好ましくは それはＮＰＨインスリンである。 ここで用いた通り、内因性ＩＧＦの血清及び組織レベルの変更の状況において 「活性」又は「生物学的活性」ＩＧＦは、それのレセプターに、又は上記に関す る内因性又は外因性ＩＧＦのそれの生物学的活性のような、生じる生物学的活性 の原因となる他の物に結合するＩＧＦに関する。 それのIGFBPsの何れか一つとＩＧＦの相互作用を抑制し、ヒトＩＧＦレセプタ ーを結合しない「分子」又は「化合物」は、ＧＨ分泌促進剤、ここに与えた三次 元モデルでモデル化後の有機化学分子、及び後述のペプチドにより実例化される 、高い経口生物利用能を持つ分子を含む。そのような化合物はまた、「ＩＧＦア ゴニスト」又は「ＩＧＦアゴニスト化合物」としてここに関連される。 「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸を有する分子を含み、且つ少なく とも約５０アミノ酸を有するポリペプチドを含む。好ましくは、該ポリペプチド は約１０から約２５アミノ酸を、より好ましくは約１２−２５、最も好ましくは １５−２５アミノ酸を有する。その定義はペプチド誘導体、それの塩、又は光学 異性体を含む。 「成長ホルモン放出ペプチド又は因子」("GHRP"又は"GFRF")は、分泌促進剤と して後述される。「成長ホルモン放出ホルモン」("GHRH")は、細胞又は組織から ＧＨを放出する何れかのホルモンとされ得る。「成長ホルモン結合タンパク質と 組み合わせた成長ホルモン」("GH"プラス"GHBP")は、その結合タンパク質の一つ を持つ又は他と結合したＧＨ複合体を意味する。同様に「ＩＧＦ結合タンパク質 と組み合わせたＴＧＦ」("IGFプラス"IGFBP")は、それのIGFBPの一つを持つ又は 他と結合したＩＧＦ複合体に関する。 Ｂ．本発明を実施するための態様 この場合本発明は、(1-27,gly4,38-70)-hIGF-Iを除く、IGFBP(に結合する)抗 体アゴニストを除く、ＴＧＦ(に結合する)抗体アゴニストを除く、及び位置24,3 1,及び／又は60で置換又は削除したチロシン残基を持つヒトＩＧＦ-Iの自然の配 列を有するペプチドを除く、そのIGFBPsの１又はそれ以上とＩＧＦとの相互作用 を抑制し且つヒトＩＧＦレセプターに結合しない化合物に関する。好ましくは、 該化合物はIGFBPに及び／又はＩＧＦに、とりわけIGFBP-1、又はIGFBP-3に、又 はIGFBP-1とIGFBP-2の両方に、又はＩＧＦ-Iに、又はＩＧＦ-IIに、又はＩＧＦ- IとＩＧＦ-IIの両方に、又はIGFBP-1又は-3とＩＧＦ-I又はＩＧＦ-IIに結合する 。また好ましくは、該化合物はペプチドである。より好ましくは、それはIGFBP 、とりわけ血清IGFBPに結合するペプチドである。また、好ましくは、該化合物 は哺乳動物中の血漿インスリン分泌を減じ、血漿ＧＨを減じ、又は血中グルコー スレベルを減じる。 より好ましくは、該ペプチドは約１０から約２５アミノ酸残基を有し及び／又 はそのＮ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８でシステイン残基を又は そのＣ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８でシステイン残基を、又は そのようなシステイン残基の両方を、又はそのＮ末端から番号付けした位置２で システイン残基を有する。好ましくは、上述したペプチドは、１２から２５、よ り好ましくは１５から２５、アミノ酸残基を有する。より好ましくは、該ペプチ ドはそのＮ末端から番号付けした位置１，２，３，４，又は５でトリプトファン 残基を有する。更に好ましくは、該ペプチドはＮ末端システイン残基までに補足 的にバリン、セリン、又はグルタミンＮ末端を有する。更に好ましくは、該ペプ チドはＮ末端システインまでの残基Ｎ末端がバリン残基である。更に好ましくは 、該ペプチドはＮ末端システインまでの３つの残基Ｃ末端である位置で始まる残 基のグリシン-プロリン又はバリン-アラニン配列を有する。このペプチドはさら に好ましくは、残基のグリシン-プロリン又はバリン-アラニン配列までに３つの 残基Ｃ末端の中にトリプトファン残基を有する。このペプチドはより好ましくは 、Ｃ末端システイン残基までの２つの残基Ｎ末端の中にロイシン又はバリン残基 を有する。このペプチドは更に好ましくは、そのＣ末端から番号付けした位置２ 又は３でトリプトファン残基を有する。 また好適には、配列番号：１−１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を 含む。好ましくは、このペプチドは、配列番号：４、配列番号：８、配列番号： ９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列 番号：１４、配列番号：１５、及び配列番号：１６からなる群から選択される配 列を含む。より好ましくは、このペプチドは、配列番号：４、配列番号：９、配 列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１５、又は配列番 号：１６であるアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、このペプチドは配列番 号：９、配列番号：１０、配列番号：１５、又は配列番号：１６であるアミノ酸 配列を含む。最も好ましくは、このペプチドは配列番号：１０、配列番号：１５ 、又は配列番号：１６であるアミノ酸配列を含む。 代替的に、このペプチドは、配列番号：１０４であるアミノ酸配列を含み、又 はこのペプチドは、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、 配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１３、 配列番号：１１４、配列番号：１１５、又は配列番号：１１６であるアミノ酸配 列を含み、又はこのペプチドは、配列番号：１０９、配列番号：１１７、配列番 号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、又は配列番号：１２１であ るアミノ酸配列を含み、又はこのペプチドは、配列番号：１２２、配列番号：１ ２３、配列番号：１２４、配列番号：１２５、配列番号：１２６、配列番号：１ ２８、配列番号：１２９、配列番号：１３０、配列番号：１３２、又は配列番号 ：１３３であるアミノ酸配列を含む。 別の好適な実施態様において、該ペプチドは、位置２，３，４，又は６でＤ- アラニン置換を、又は位置７，８，９，１１，１２，１３，又は１４でアルファ -アミノイソブチラート置換を、又は上記の何れかの組合せを有する配列番号： １５のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、このペプチドは、位置２，３，又 は６でＤ-アラニン置換を、又は位置７，８，９，１１，１２，１３又は１４で アルファ-アミノイソブチラート置換を、又は上記の何れかの組合せを有する。 更に好ましくは、このペプチドは位置６でＤ-アラニン置換を、又は位置８，９ ，又は１３でアルファ-アミノイソブチラート置換を有する。後者のペプチドの 何れかは好ましくは、ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有す る。 該化合物は好ましくは、式：ＢＣn，Ａ、[式中、ＢはＩＧＦ-I又はそれの機能 的類似物のＢドメインであり、ＣはＩＧＦ-I又はそれの機能的類似物のＣドメイ ンであり、ｎはＣドメイン中のアミノ酸の数であり且つ約６から約１２までであ る、及びＡはＩＧＦ-I又はそれの機能的類似物のＡドメインである]の何れかの ＩＧＦ-I類似物を除く。ここでの化合物は特に(Leu24)IGF-1と(Ser24)IGF-1を除 く。該化合物はまた、ＩＧＦ-Iの最初の１６アミノ酸がインスリンのＢ-鎖の最 初の１７アミノ酸で置換されたＢ-鎖ヒトＩＧＦ-I変異体；(Gln3,Ala4)IGF-I；( Tyr15,Leu16)IGF-I；(Gln3,Ala4,Tyr15,Leu16)IGF-I；ＩＧＦ-Iのカルボキシ末 端８アミノ酸Ｄ領域を欠いた(1-62)IGF-I；Ｃ領域グリシン置換及びＤ領域削除 を伴う(1-27,Gly4,38-62)IGF-I；残基41がトレオニンからイソロイシンまで変更 され且つＡ領域の残基42-56が置換されたＡ鎖変異体、(Ile41,Glu45,Gln46,Thr4 9 ,Scr50,Ile51,Ser53,Tyr55,Gln56)IGF-I;(Thr49,Ser50,Ile51)IGF-I；及び(Tyr55 ,Gln56)IGF-Iをも除く。 ペプチドではないここでの化合物は、高い経口生物利用能を持った非ペプチド 分子(ＧＨ分泌促進剤のような)及び他の経口的に活性な有機分子を作製するため の当該分野における化学合成又は他の適当な方法によって作製され得る。 本発明のペプチドは、化学合成によって又は組換え技術を利用することによっ て作製され得る。これらの方法は当該分野で周知である。化学合成、特に固相合 成は、短鎖(例えば、５０残基より小さい)ペプチド又はD-Tyr、オルニチン、ア ミノアジピン酸、等のような非天然又は例外的なアミノ酸を含むそれが好適であ る。組換え方法は、長鎖ポリペプチドのために好適である。組換え方法が選択さ れる場合、合成遺伝子は新規に構築することができ又は自然遺伝子が、例えばカ セット式変異誘発によって変異させ得る。後述の記載は一般的な組換え方法の典 型である。 生成したＩＧＦとそのアミノ酸配列のために、例えばＩＧＦのペプチドの変異 体であるＩＧＦアゴニストを用い、組換えＤＮＡを用い実行され得る。これらの 技術は、簡略化した形式において、ペプチドをコードしている天然の又は合成の 何れか一方の遺伝子を得ること；それを適用なベクター内に挿入すること；その ベクターを適当な宿主細胞内に挿入すること；その遺伝子の発現を生じさせるよ う該宿主を培養すること；及びそれによって生産したペプチドを回収又は分離す ることを意図する。好ましくは、回収したペプチドは次いで適当な度合まで精製 される。 特に、ペプチドのＩＧＦアゴニストをコードしているＤＮＡ配列は、クローン 化され、そして好適な宿主中で発現され得るように操作される。親のポリペプチ ドをコードしているＤＮＡは、ゲノムのライブラリーから、該ペプチドを発現し ている細胞からのmRNAから誘導したｃＤＮＡから、又はＤＮＡ配列を合成的に構 築することによって(Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboraory Manual(2dcd. ),Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.,1989)得ることができる。 親のＤＮＡは、次いで宿主細胞を形質転換するために使用される適当なプラス ミド又はベクター内に挿入される。一般に、宿主細胞と和合できる種から得られ る複製及び制御配列を含んでいるプラスミドベクターが、その宿主と結合して使 用される。該ベクターは普通、レプリコンサイト、同様に形質転換した細胞にお ける表現型選択を提供することができるタンパク質又はペプチドをコードする配 列を搬送する。 例えば、大腸菌(E．coli)は、大腸菌種から得られたプラスミド、pBR322を用 いて形質転換され得る。Mandelら,J.Mol.Biol.53:154(1970)。プラスミドpR322 は、アンピシリンとテトラサイクリン耐性用の遺伝子を含有し、かくして選択の ために容易な手段を提供する。他のベクターは、発現においてしはしば重要な異 なるプロモーターのような異なる特徴を含む。例えば、プラスミドpKK223-3、pD R720、及び広く利用可能であるtac,trp，又はPLプロモーターを持つpPL-ラムダ 表現発現ベクター(Pharmacia Biotechnology)。 好適なベクターはpBO475である。このベクターはそれがそのような宿主間を往 復されることを許すファージと大腸菌の間の複製の起源を含み、それによって変 異誘発と発現の両方を容易にする。Cunninghamら，Science，243:1330-1336(198 9);米国特許第5,580,723号。他の好適なベクターは、pR1T5とpR1T2T(Pharmacia Biotechnology)である。これらのベクターは、融合タンパク質として発現され るベクターに挿入した遺伝子を与える、プロテインＡのＺドメインの後に適当な プロモーターを含む。 他の好適なベクターは、上述したベクターの適切な特徴を結合することによっ て標準的な技術を用い構築され得る。適切な特徴は、プロモーター、リボソーム 結合サイト、デコルシン又はオルナチン遺伝子又は遺伝子融合(プロテインＡの Ｚドメインとデコルシン又はオルナチンとそのリンカー)、抗生物質耐性マーカ ー、及び複製の適切な起源を含む。 宿主細胞は、原核生物又は真核生物とされ得る。原核生物は、親のＩＧＦ-Iポ リペプチド、セグメント-置換したペプチド、残基-置換したペプチド、及びペプ チド変異体を生産するためのＤＮＡ配列をクローン化する及び発現するために好 適である。例えば、大腸菌K12株294(ATCC No.31446)は、大腸菌Ｂ、大腸菌X1776 (ATCC No.31537)、及び大腸菌c600とc600hfl、大腸菌W3110(F-，ガンマー，プロ トトロピー／ATCC No．27325)、Bacillus subtilisのようなバチルス属、及びSa lmonella typhimurium又はSerratia marcesans、及び各種のPseudomonas種のよ うな他の腸内細菌科と同様に使用され得る。好ましい原核生物は大腸菌W3110(AT CC 27325)である。原核生物により発現した場合、そのペプチドはＮ末端メチオ ニン又はホルミルメチオニンを典型的に含み、且つグリコシル化されていな い。融合タンパタ質のケースにおいて、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニ ンは、該融合タンパク質のアミノ末端上又は融合タンパク質のシグナル配列に存 在する。これら実施例は、勿論、制限するものでなく説明することが意図される 。 原核生物に加えて、酵母培養、または多細胞生体から得られる細胞のような真 核生物が使用され得る。原則として、何れかのそのような細胞培養は、使用可能 である。しかしながら、脊椎動物細胞において興味が最も大きくなっており、培 養(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は再生可能な方法になっている。Tiss ue Culture,Academic Press,Kruse and Patterson,Editors(1973)。そのような 使用宿主細胞系の実例は、VERO及びHcLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO )細胞系、Ｗ１３８、２９３、ＢＨＫ、COS-7及びMDCK細胞系である。 上記方法に関するバリエーションは遺伝子融合の使用を意図し、望まれるペプ チドをコードしている遺伝子は、ベクター中で別なタンパク質をコードする遺伝 子又は別なタンパク質のフラグメントと結合される。これは、別なタンパク質又 はペプチドとの融合物として該宿主細胞により生産されている望ましいペプチド の結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドはしばしば、培地から望まれる ペプチドを分離し且つ精製することを可能にするよう、及びその望ましいペプチ ドが細胞の内部に残る場合に生じる宿主細胞の破壊の必要性を省くよう、その細 胞によって分泌され得るタンパク質又はペプチドである。代替的に、該融合タン パク質は、細胞内で発現され得る。それは高度に発現される融合タンパク質を使 用するために有用である。 必須ではないけれども、遺伝子融合の使用は、大腸菌中の異種ペプチドの発現 、同様にそれら遺伝子生産物の次の精製を容易にすることができる。Harris，in Genetic Engineering,Williamson,R.,Ed.(Academic Press,London,Vol.4,1983) ,p.127;Ljungquistら,Eur.J.Biochem.,186:557-561(1989)とLjungquistら,Eur.J .Biochem.,186:563-569(1989)。プロテインＡ融合は、ＩｇＧへのプロテインＡ の、とりわけプロテインＡのＺドメインの結合が融合したタンパク質の精製用の 「アフィニティーハンドル」を提供するために、しばしば使用される。それはま た、多くが異種タンパク質が大腸菌において直接発現した場合に減成されるが、 しかし融合タンパク質として発現する場合安定であることが示されている。Mars ton, Biochem J.,240:1(1986)。 融合タンパク質は、メチオニンで切断する臭化シアン、又はAsnとGly残基の間 を切断する、ヒドロキシルアミンのような化学薬品を用いて切断され得る。標準 的な組換えＤＮＡ方法論を用い、これらアミノ酸をコードしているヌクレオチド 塩基対は、望まれるペプチドをコードしている遺伝子の５’末端の直前に挿人さ れ得る。 代替的に、それは融合タンパク質のタンパク分解的切断を利用できる。Carter ,in Protein Purification:From Molecular Mecanisms to Large-Scale Process es,Ladischら,eds.(American Chemical SocietySymposium Serics No.427,1990) ,Ch 13,pages 181-193。 因子Ｘａ、トロンビン、及びサブチリシンまたはその変異体、及び多数の他の 物のようなプロテアーゼは、融合タンパク質を切断するために首尾良く使用され ている。典型的に、使用したプロテアーゼによって切断するために服しやすいペ プチドリンカーは、「他の」タンパク質(例えば、プロテインＡのＺドメイン)と 望まれたペプチドの間に挿入される。組換えＤＮＡ方法論を用い、該リンカーを コードしているヌクレオチド塩基対は、該他のタンパク質をコードしている遺伝 子又は遺伝子フラグメントの間に挿入される。修正リンカーを含む部分的に精製 した融合タンパク質の蛋白分解的切断は、自然の融合タンパク質、または減じた 又は分解した融合タンパタ質のいずれか一方について実行され得る。 該ペプチドは、融合タンパク質として発現する場合に適切に折り重ねでき又は できない。また、切断サイトを含んでいる特異的ペプチドリンカーは、プロテア ーゼに接し易くでき又はできない。これらのファクターは、該融合タンパク質が 分解され及び再折重されねばならないかどうか、及び、もしそうであれば、これ らの方法が切断の前又は後で用いられるかどうかによって決定する。 分解と再折重が必要とされる場合、典型的に該ペプチドは、グアニジン塩酸の ようなカオトロープによって処理される。次いで、例えば、該ペプチドがその固 有の構造に再折重されるような、適当な割合、ｐＨ、及び温度で還元した及び酸 化したジチオトレイトール又はグルタチオンを含んでいる還元緩衝液によって処 理される。 ペプチドが組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されない場合、それは、たとえ当 該分野で周知の同等の化学合成が利用可能であるとしても、Merrifield,J.Am.Ch em.Soc.,85:2149(1963)により全般的に記載されたような、固相合成法を用いて 好適に調製される。固相合成は、適当な樹脂に保護したα-アミノ酸をカップリ ングすることによってペプチドのＣ末端から開始される。そのような出発材料は 、クロロメチル化樹脂又はヒドロキシメチル化樹脂へのエステル結合によって、 又はＢＨＡ樹脂又はＭＢＨＡ樹脂へのアミド結合によってα-アミノ-保護したア ミノ酸を付着することによって調製され得る。該ヒドロキシメチル樹脂の調製は 、Bodanskyら,Chem.Ind.(London),38:1597-1598(1966)によって記載されている 。クロロメチル化樹脂は、BioRad Laboratories,Richmond,CAから、及びLab.Sys tems社から商業的に利用可能である。そのような樹脂の調製は、Stewartら，"So lid Phasce Pcptide Synthesis"(Freeman & Co.,San Francisco 1969),Chapter 1,pp.1-6によって記載される。ＢＨＡとＭＢＨＡ樹脂支持体は、商業的に利用可 能であり、合成される望まれるペプチドがＣ末端で非置換アミドを有する場合の み一般に使用される。 該アミノ酸は、ペプチド結合を形成するための当該分野において周知の技術を 用いてペプチド鎖に連結される。一つの方法は、そのカルボキシル基を該ペプチ ドフラグメントの遊離Ｎ末端アミノ基との反応により影響を受け易くするであろ う誘導体にそのアミノ酸を転換することを含む。例えば、アミノ酸は、クロロギ 酸エチル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸sec-ブチル、クロロギ酸イソブチル 、塩化ピバロイル又は同様の酸塩化物と、保護したアミノ酸の反応によって混合 した無水物に変換され得る。代替的に、該アミノ酸は、2,4,5-トリクロロフェニ ルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル 、p-ニトロフェニルエステル、Ｎ-ヒドロスクシンアミドエステル、又は１-ヒド ロキシベンゾトリアゾールから形成したエステルのような活性エステルに変換さ れ得る。 別なカップリング法は、N,N'-ジシタロヘキシルカルボジイミド又はN,N'-ジイ ソプロピル-カルボジイミドのような適当なカップリング剤の使用を含む。当業 者において明らかな他の適当なカップリング剤は、E.Gross & J.Meienhofer,The Peptides:Analysis，Structure，Biology．Vol．I:Major Methods of Peptide B ond Formation(Academie Press,New York,1979)中に記載される。 該ペプチド合成において用いた核アミノ酸のα-アミノ基が、その活性α-アミ ノ機能を含む副反応を防止するため該カップリング反応の間保護される必要があ ることを認識すべきである。また、ある種のアミノ酸が反応性側鎖官能基(例え ばスルフィドリル、アミノ、カルボキシル、及びヒドロキシル)を含むこと、及 びそのような官能基は、開始と次のカップリング工程の両方の間そのサイトで生 じる化学反応を防止するために適当な保護基によって保護される必要があること も認識すべきである。当該分野で周知の、適当な保護基は、GrossとMeienhofer, The Peptides:Analysis,Structure,Biology.Vol.3:"Protection of functional Groups in peputide Synthesis"(Academic Press,New York,1981)中に記載され る。 該ペプチドの合成において使用すべき特有の側鎖保護基の選択において、次の 一般的なルールが求められる。α-アミノ保護基は、(a)カップリング反応で用い た条件下でα-アミノ機能を不活性にする必要がある、(b)側鎖保護基を取り外す ことがないであろう及びペプチドフラグメントの構造を変えることかないであろ う条件下でのカップリング反応の後に容易に除去可能とされる必要がある、及び (c)カップリングの直前に活性化によりラセミ化の可能性が排除される必要があ る。側鎖保護基は、(a)カップリング反応で用いた条件下でα-アミノ機能を不活 性にする必要がある、(b)α-アミノ保護基の除去に用いた条件下で安定である必 要がある、及び(c)ペプチド鎖の構造を変化しないであろう反応条件下で、望ま れるアミノ酸ペプチドの完成により容易に取り外し可能とされる必要がある。 ペプチド合成用に有用とされる周知の保護基は、それを除去するために用いる その剤との反応性において変更されるであろうことは当業者に明らかであろう。 例えば、トリフェニルメチル及び２-(p-ビフェニリル)イソプロピルオキシカル ボニルのようなある種の保護基は、非常に適応性があり且つ中度の酸性条件で切 断され得る。t-ブチルオキシカルボニル(ＢＯＣ)、t-アミルオキシカルボニル、 アダマンチルオキシカルボニル、及びp-メトキシベンジルオキシカルボニルのよ うな他の保護基は、適応性に劣っており、それを除去するためにトリフルオロ酢 酸塩酸、又は酢酸中の四フッ化ホウ素のような適度な強酸を要求する。ベンジ ルオキシカルボニル(CBZ又はZ)、ハロベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベン ジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオ キシカルボニルのような更に他の保護基は、一様に適応性に劣っており、それを 除去するためにフッ化水素酸、臭化水素酸、またはトリフルオロ酢酸中の四フッ 化ホウ素のような強酸を要求する。 有用なアミノ酸保護基のクラスの中では： (1)α-アミノ基のために、(a)フルオレニルメチルオキシカルボニル(FM0C)C BZのような芳香族ウレタンタイプ保護基、及び置換したCBZ、例えばp-クロロベ ンジルオキシカルボニル、p-6-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベン ジルオキシカルボニル、及びp-メトキシベンジルオキシカルボニル、o-クロロベ ンジルオキシカルボニル、2,4-ジクロロベンジルオキシカルボニル、2,6-ジクロ ロベンジルオキシカルボニル、など；(b)ＢＯＣ、t-アミルオキシカルボニル、 イソプロピルオキシカルボニル、2-(p-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカル ボニル、アリールオキシカルボニル、などのような脂肪族ウレタンタイプ保護基 ；(c)シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及び シクロヘキシルオキシカルボニルのようなシクロアルキルウレタンタイプ保護基 ；及びｄ）アリールオキシカルボニルを含む。好ましいα-アミノ保護基はＢＯ Ｃ又はＦＭＯＣである。 (2)Lys中に存在する側鎖アミノ基のために、保護は(1)BOC、p-クロロベンジ ルオキシカルボニル、等において上述した基の何れかによってなされ得る。 (3)Argのグアニジノ基のために、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマ ンチルオキシカルボニル、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル又は2 ,3,6-トリメチル-4-メトキシフェニルスルホニル、又はＢＯＣによってなされ得 る。 (4)Scr,Thr,又はTyrの水酸基のために、保護は、例えば、t-ブチルのような C1-C4アルキル；ベンジル(BZL)；p-メトキシベンジル、p-クロロベンジル、o-ク ロロベンジル、及び2,6-ジクロロベンジルのような置換したBZLによりなされ得 る。 (5)Asp又はGluのカルボキシル基のために、保護は、例えばBZL、t-ブチ ル、シクロヘキシル、シクロペンチル、等のような基を用いるエステル化により なされ得る。 (6)Hisのイミダゾール窒素のために、トシル部分が好適に利用される。 (7)Tyrのフェノール性水酸基のために、テトラヒドロピラニル、tert-ブチ ル、トリチル、BLZ、クロロベンジル、4-ブロモベンジル、又は2,6-ジクロロベ ンジルのような保護基が好適に利用される。好適な保護基は2,6-ジクロロベンジ ルである。 (8)Asn又はGlnの側鎖アミノ基のためにはキサンチル(Xan)が好適に利用され る。 (9)Metについて、該アミノ酸は好ましくは未保護のままとする。 (10)Cysのチオ基のために、p-メトキシベンジルが典型的に利用される。 Ｃ末端アミノ酸、例えばLysは、適切に選択した保護基により、Lysの場合にお いてはBOCにより、Ｎ-アミノ位置で保護される。そのBOC-Lys-OHは、Horikiら， Chemistry Letters,165-168 1978)中に記載された方法に従ってベンジヒドリル アミン又はクロロメチル化樹脂に、又は撹拌しつつ約25℃で二時間、イソプロピ ルカルボジイミドを用いて最初に連結され得る。樹脂支持体へのBOC-保護したア ミノ酸のカップリングの後、塩化メチレン中トリフルオロ酢酸(TFA)又はTFA単独 を用いることによって、そのα-アミノ保護基が除去される。その脱保護基は約 ０℃と室温の間の温度で実行される。ジオキサン中ＨＣｌのような他の標準的な 切断試薬、及び特異的なa-アミノ保護基の除去のための条件は文献中に記載され る。 α-アミノ保護基の除去後、残るα-アミノ及び側鎖保護したアミノ酸は望まれ る順番の中で段階的に連結される。該合成中で別個に各アミノ酸を加えることの 代替として、何れかは固相シンセサイザーに加える前に別の一つに連結され得る 。適当なカップリング剤の選択は当業者の理解の範囲内である。カップリング試 薬として特に好適なものは、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソ プロピルカルボジイミドである。 それぞれの保護したアミノ酸又はアミノ酸配列は、過剰に固相リアクター内に 導入され、カップリングがジメチルホルムアミド(DMF)又はCH2Cl2又はそれの 混合物の媒体中で実行される。もし不完全なカップリングが生じるなら、そのカ ップリングプロセスは次のアミノ酸のカップリングの前にＮ-アミノ保護基の事 前除去を繰り返す。合成の各段階でのカップリング反応の成功がモニターされ得 る。その合成のモニタリングの好ましい方法は、Kaiserら,Anal.Biochem.34:595 (1970)に記載されたニンヒドリン反応によるものである。該カップリング反応は 、周知の方法、例えばBIOSEARCH9500TMペプチドシンセサイザーを用い自動的に 実行され得る。 望まれるペプチド配列の完成により、その保護したペプチドは樹脂支持体から 切断する必要があり、且つ全ての保護基を除去する必要がある。その切断反応と 保護基の除去は、好ましくは同時に又は段階的に達成される。その樹脂支持体が クロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、該樹脂に該ペプチドを繋ぎ止めて いる結合は、Ｃ末端残基の遊離カルボキシル基と、樹脂マトリックス上に存在す る多くのクロロメチル基の一つとの間に形成されたエステル結合である。その繋 ぎ止め結合は、エステル結合を壊すこと及び樹脂マトリックスに貫徹できること が知られる試薬によって切断され得る。 特に便利な方法の一つは、液体無水フッ化水素での処理による。この試薬は該 樹脂からの切断のみでなく、全ての保護基を除去するであろう。それ故に、この 試薬の使用は、完全に保護を脱したペプチドを直接もたらすであろう。クロロメ チル化樹脂が使用される場合フッ化水素処理は、直接遊離ペプチド酸をもたらす 結果になる。ベンズヒドリルアミン樹脂が使用される場合、フッ化水素酸処理は 直接遊離ペプチドアミンをもたらす結果となる。０℃で１時間、アニソールとジ メチルスルフィドの存在中でのフッ化水素との反応は、側鎖保護基が除去される と同時に樹脂から該ペプチドが放出されるであろう。 保護基を除去すること無しに該ペプチドを切断することが望まれる場合、その 保護ペプチド-樹脂は、Ｃ末端カルボキシル基がメチル化される保護ペプチドが 生じるようにメタノリシスを受けることができる。そのメチルエステルは、遊離 Ｃ末端カルボキシル基を与えるように中度のアルカリ性条件下で加水分解される 。次いでペプチド鎖上の保護基は、液体フッ化水素のような強酸での処理によっ て除去される。メタノリシスのための特に有用な技術は、保護ペプチド-樹脂 がクラウンエーテルの存在中メタノールとシアン化カリウムにより処理される、 Mooreら,Peptides,Proc.Fifth Amer.Pept.Symp.,M.GoodmanとL.Meicnhofer,Eds. ,(John Wiley,N.Y.,1977),p.518-521のそれである。 クロロメチル化樹脂が使用される場合、該樹脂から保護したペプチドを切断す るための別な方法は、アンモノリシスによる又はヒドラジンによる処理によるも のである。望むなら、得られるＣ末端アミン又はヒドラジドは、遊離Ｃ末端カル ボキシ部分に加水分解でき、且つその保護基は通常的に除去され得る。 Ｎ末端のα-アミノ基上に存在する保護基は、該保護基が支持体から切断され る前又は後の何れか一方で優先的に除去され得る。 本発明のポリペプチドの精製は、予備ＨＰＬＣ(逆相ＨＰＬＣを含む)又は他の 周知のクロマトグラフィー技術、例えばゲル透過、イオン交換、分配クロマトグ ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー(モノクローナル抗体カラムを含 む)又は交流分配のような通常の方法を用い典型的に達成される。 本発明のペプチドは、重合化によって安定化され得る。これは、多価ポリマー を経て、直接的又は間接的の何れか一方で多価架橋剤でのモノマー鎖架橋化によ り達成され得る。通常、２つの実質的に同一のポリペプチドは、二官能架橋剤を 用いてそのＣ-又はＮ-末端で架橋される。該剤は、末端アミノ及び／又はカルボ キシル基を架橋するように用いられる。一般に、たとえ適切な架橋剤の選択によ って、一方のポリペプチドのアルファアミノが他方のポリペプチドの末端カルボ キシル基に架橋されるとしても両方の末端カルボキシル基又は両方の末端アミノ 基は、互いに架橋される。好ましくは、該ポリペプチドはシステインによってＣ 末端で置換される。当該分野で周知の条件下でジスルフィド結合が末端システイ ン間に形成され、それによって該ポリペプチド鎖が架橋されている。例えば、ジ スルフィドブリッジは遊離システインの金属触媒酸化によって又は適当に修正し たシステイン残基の求核的置換によって都合良く形成される。架橋剤の選択は、 ポリペプチド中に存在するアミノ鎖の反応性側鎖の同定に基づくであろう。例え ば、もしシステインがＣ末端以外の付加的なサイトでポリペプチド中に存在する ならば、ジスルフィド架橋は好ましいとは言えないであろう。メチレンブリッジ によって架橋されたペプチドはここでの範囲内である。 ペプチド上の適当な架橋化サイトは、Ｎ末端アミノ及びＣ末端カルボキシル基 は別として、リシン残基上に見られるイプシロンアミノ基、同様に該ペプチドの 内部残基又はフランキング配列内に導入した残基の側鎖上に配されたアミノ、イ ミノ、カルボキシル、スルフィドリル及びヒドロキシル基を含む。外部に加えた 架橋剤を通しての架橋は、例えば当業者にとって普通の多数の試薬の何れかを用 い、例えばポリペプチドのカルボジイミド処理を経て、好適に達成される。適当 な多価(普通二官能)架橋剤の他の実例は文献中に見出される。 本発明のペプチドは、環化によって構造的に安定化され得る。そのペプチドは 、２又はそれ以上の繰り返しペプチド配列を含むシクロオリゴマー、各内部ペプ チドは実質的に同じ配列を有している、を形成するために本発明の別のペプチド の一致するドメインに一方のペプチドのＮ-及びＣ-末端ドメインを共有結合する ことによって普通に環化される。更に、環化したペプチド(シクロオリゴマー又 はシクロモノマーのいずれか)は、その中に含まれた２から６までのペプチドを 有する1-3環式構造を形成するように架橋される。該ペプチドは好ましくはα-ア ミノ及び主鎖カルボキシル基を通して共有結合しないが、しかしある程度はＮ- 及びＣ-末端ドメインに配された残基の側鎖を経て架橋される。架橋サイトはか くして一般には、該残基の側鎖間とされるであろう。 多くの好適な方法それ自身は、ここに意図したようにモノ-又はポリ-環化ポリ ペプチドを調製するために周知である。Lys/Asp環化は、Lys/Asp用のFmoc/9-フ ルオレニルメチル(OFm)側鎖保護によって固相支持体上のＮα-Boc-アミノ酸を用 い達成されている；該方法は環化に続くピペリジン処理によって完成される。 GluとLys側鎖もまた、環式又は二環式ペプチド調製において架橋されている； 該ペプチドは、p-メチルベンズヒドリルアミン樹脂上での固相化学により合成さ れる。そのペプチドは樹脂から切断され且つ脱保護される。環式ペプチドはメチ ルホルムアミドで希釈したジフェニルホスホリルアジドを用い形成される。代替 の方法については、Schillerら,Peptide Protein Res.,25:171-177(1985)を参照 。米国特許第4,547,489号も参照。 ジスルフィド架橋した又は環化したペプチドは通常の方法により生成される。 Peltonら,(J.Med.Chem.,29:2370-2375(1986))の方法は、シクロオリゴマーの大 きな比率がシクロモノマーの生産のためのPeltonらによって記載された希釈反応 混合物よりも、より濃縮した溶液中で反応を導くことによって製作されることを 除いて、好適である。同じ化学薬品はダイマー又はシクロオリゴマー又はシクロ モノマーの合成のために有用である。また有用性はチオメチレンブリッジにもあ る。LeblとHruby,Tetrahedron letters,25:2067-2068(1984)。Codyら，J.Med.Ch cm.,28:583(1985)も参照。 望まれる環式又はポリマー性ペプチドは、ゲル濾過の後、逆相高圧液体クロマ トグラフィー又は他の通常の手法により精製される。ペプチドは無菌濾過され、 且つ通常の製薬上許容される賦形剤中で処方される。 ここに記載した方法のために要求される出発材料は、文献において周知であり 、且つ周知の方法及び周知の出発材料を用い調製され得る。 もし４つの同一でない置換基に結合した炭素原子が精製されているペプチドに おいて不斉があれば、その化合物はジアステレオマー、エナンチオマー又はその 混合物として存在できる。上述した合成は、出発材料又は中間体としてラセミ体 、エナンチオマー又はジアステレオマーを使用できる。そのような合成で得られ るジアステレオマーの生産物は、クロマトグラフィー又は結晶化法によって分離 され得る。さらに、エナンチオマーの生成混合物は同じ技術を用い又は当該分野 で周知の方法により分離され得る。存在する場合、それぞれの不斉炭素原子は２ つの配置(Ｒ又はＳ)の一つとされ且つ両者は本発明の範囲内である。 本発明において記載した化合物は、遊離の酸又は塩基として分離され又は各種 の無機及び有機酸及び塩基の塩に変換され得る。そのような塩の実例は、アンモ ニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムとマグネシウムのような金属塩；ジ シクロヘキシルアミン、Ｎ-メチル-Ｄ-グルカミンなどのような有機塩基との塩 ；及びアルギニン又はリシンのようなアミノ酸との塩を含む。無機及び有機の酸 との塩は、さらに例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、 メタンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸などを用いて調製され得る 。たとえ他の望ましくない塩が分離と精製のプロセス中で使用できるとしても、 無毒性で且つ生理的に和合できる塩が特に有用である。 多くの方法が上述した塩の調製のために有用であり、当業者に周知である。実 例は、その塩が不溶性である溶媒又は溶媒混合液中で；又は濃縮、蒸留又は凍結 乾燥によりその溶媒を留去した後で水のような溶媒中で、望ましい酸又は塩基の １又はそれ以上のモル当量と共に該ペプチドの遊離酸又は遊離塩基形態との反応 を含む。代替的に、その生産物の遊離酸又は塩基形態は、望まれる塩を形成する ためイオン交換樹脂を通過させることができ又は生産物の一つの塩形態は同じ一 般的プロセスを用い別のものに変換され得る。 ペプチドの化学合成のために適当とされ得るある種の特有なスキームが、参考 によりここに併合される開示の、1996年５月23日公開のWO 96/15148中に示され る。 本発明の化合物は、その結合タンパク質の１又はそれ以上とＩＧＦとの相互作 用を抑制すること、及びそれによってＩＧＦ作用をアゴナイズすることが示され る。ＩＧＦｓのための多くの使用があることは当業者に周知である。それ故に、 ＩＧＦ作用をアゴナイズする目的での本発明の化合物の投与は、外因性ＩＧＦそ れ自身の投与と同じ効果又は使用を有すことができる。ＩＧＦのこれらの使用は 、先に定義した疾患に追加され得る又は同じである、次のものを含む：通常の及 び下垂体機能低下動物における全身、骨、及び筋肉成長率の増加；異化作用状態 (断食、窒素制限、高くしたコルチコステロイドレベル、及び／又は糖尿病)の間 の体重及び窒素損失の保護；腎臓再生；末梢及び中枢神経系(CNs)変性疾患の治 療及びＣＮＳダメージ又は損傷に続く神経保護又は再生の促進；低酸素症の治療 ；創傷治癒の促進；心臓の再生；癌の悪液質の逆転；新脈管形成の抑制；胃腸管 の再生；乳房機能の刺激；代謝ストレス、ＧＨ活性における年齢関連減退、及び 成人ＧＨ欠乏のようなＧＨのＩＧＦ-I依存作用を無効にすること；成人発症型糖 尿病の治療；及び／又は特異的ＩＧＦ-I欠乏の治療。 ここでの化合物が有用である追加された及び特有の疾患は、ＧＨ-耐性小人症 、ＧＨ-不感受性症候群、骨粗しょう症、及び異化状態のような成長疾患；組織 又は細胞、例えば末梢神経及び支持細胞、神経及びグリアを含む中枢神経系細胞 及び稀突起神経膠細胞、筋肉、皮膚、及び骨のような他の細胞の再生の治療が要 求される疾患；心臓疾患、例えば心臓虚血、心筋障害、及びうっ血性心不全；イ ンスリン依存性及び非インスリン依存性糖尿病及び極インスリン耐性のような高 血 糖性疾患；及び腎不全のような腎臓疾患を含む。これらはまた、初老のヒトにお ける同化応答の刺激、グルココルチコイドの異化副作用の防止、骨粗しょう症の 治療、免疫系の刺激、肥満症の低減、創傷治癒の促進、骨折結合再生の促進、成 長遅延の治療、腎不全又は成長遅延の結果の未成熟の治療、生理学的小人症の治 療、成長ホルモン欠乏児を含む、慢性疾患に関連した小人症の治療、肥満症及び 肥満症に関連した成長遅延の治療、プラーダー-ヴィリ症候群及びターナー症候 群に関連した成長遅延の治療、やけどの患者の入院における回復と軽減の促進、 子宮内成長遅延、骨格形成異常、副腎皮質機能亢進症、及びクッシング症候群の 治療、拍動性成長ホルモン放出の誘導、ストレス性患者における成長ホルモンの 置換、骨軟骨異形成症、Moonans症候群、精神分裂症、うつ病、末梢ニューロパ シー、ＡＬＳ、うつ病、アルツハイマー病、脱髄の疾患、多発性硬化症、及び遅 れた創傷治癒の治療、免疫系の刺激、心理堕落の治療、肺の機能不全及び換気依 存の治療、大手術の後のタンパク質異化応答の減衰化、癌又はエイズのような慢 性病のための悪液質及びタンパク質損失の減少、Ｉ型及びII型糖尿病を含む高イ ンスリン血症の治療、排卵誘発のためのアジュバント治療、胸腺発達の刺激及び 胸腺機能の年齢関連減退の予防、免疫抑制患者の治療、骨髄移植患者の治療、筋 肉強度、可動化筋域機能の疾患、筋ジストロフィーにおける改善、皮膚厚さ、及 び代謝恒常性の維持、急性及び慢性腎疾患を含む腎臓の機能と恒常性の増強、骨 形成細胞の刺激、骨の再造形、及び軟骨成長、免疫系の刺激、及び家畜における 成長促進を含む。各種のＩＧＦ-I使用が、例えば、Wo 94/04569;WO 96/33216;及 びBondy,Ann Intern.Med.,120:593-601(1994)中に見られる。これらの全ては「 疾患」の定義中に含まれる。 一つの実施例において、化合物は、成長及び身体組織での飼料のその変換の有 効性を促進及びその割合を増加及び進展するために、ブタ、ウシなどのような商 業上重要な動物に投与され得る。該化合物はＩＧＦ作用を刺激するために成人及 び児童にインビボで投与され得る。 本発明の化合物は、経口、非経口(例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮 下注射又は注入、又はインプラント)、経鼻、吸入、経膣、直腸、舌下、又は投 与の局所ルートを含む何れかの適用な技術によって哺乳動物に投与でき、且つ投 与の各ルートのために適切な投薬量で処方され得る。投与の特有のルートは、該 化合物を用いて何れかの認められた又は予期された副作用を含む、その患者の医 学的履歴、投与される化合物のタイプ、及び治療すべき特有の疾患に基づくであ ろう。とりわけ、その投与は経口又は連続的な注入(例えば除放装置又は浸透ポ ンプのようなミニポンプ又は皮膚パッチを用いる)、又は注射(例えば静脈内又は 皮下手段を用いる)である。その治療に用いられる化合物は、個人の患者の臨床 的な状態(特に該化合物による治療の副作用)、輸送のサイト、投与の方法、投与 のスケジュール、及び開業医に周知の他のファクターに関して、良好な医療行為 と密着した形態において処方され且つ投薬されるであろう。ここで意図される化 合物の「有効量」は、かくして、そのような観点で決定され且つ哺乳動物に対す る薬剤の生物学的利用能及び望ましい効果が得られる量とされる必要がある。 小さい分子アンタゴニストがＩＧＦアゴニストとして使用されるなら、周期的 な効果を有し得るし、効力のために、それの適切な投与の摂生が要求され、血液 中のIGFBP-1の可変の濃度は実例とされる。JonesとClemmons,supra。ペプチドの ために好適な投与は、ＩＧＦ-Iの効果を再誘導するため４−８週間、一日約２回 の慢性投与である。たとえ注射が好適であろうとも、長期の注入も、連続した皮 下(SC)注射のための注入装置を用いて利用され得る。小さいペプチドは経口投与 され得る。静脈内バッグ溶液も又利用され得る。糖尿病のための適用な投薬量を 選択する上での鍵となるファクターは、血中グルコースが妥当な通常の範囲とな るような減少によって、又は開業医によって妥当と思われるような糖尿病の治療 を測定するための他の基準による測定として得られた結果である。 一般的な提案として、非経口的な投薬当たり投与されるＩＧＦアゴニスト化合 物のトータルの製薬学的有効量は、投薬量応答曲線によって評価され得る範囲内 とされるであろう。例えば、IGFBPsに結合した又は血液中のＩＧＦｓは投薬量を 決定するために処置される哺乳動物の体液中で測定され得る。代替的に、それは 患者へのＩＧＦアゴニスト化合物の浄化した量で投与すること及びＩＧＦ-I及び ＩＧＦ-IIの患者の血清レベルをチェックできる。使用されるＩＧＦアゴニスト の量はＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIのこれらの血清レベルの基づいてモルベースで計算 され得る。ヒト血清中に存在するIGFBPsからＩＧＦ-Iトレーサーの置換につ いての後述の実施例を参照。 特に、化合物の適当な投薬量を決定するための一つの方法は、体液又は血液の ような生物学的液体中のＩＧＦレベルを測定することを伴う。そのようなレベル の測定は、RIAとELISAを含む何れかの手段によってなされ得る。ＴＧＦレベル測 定の後、その液体は単一又は複数投薬量を用いる化合物と接触させる。この接触 工程の後、そのＩＧＦレベルは液体中で再測定される。もしその液体IＧＦレベ ルが投与されるべきものであるための望ましい効力を生じるために十分な量によ って降下しているならば、その分子の投薬量は最大の効力を生じるように調整さ れ得る。この方法は、インビトロ又はインビボで実行され得る。好ましくは、こ の方法はインビトロで実行され、即ち液体が哺乳動物から抽出され且つＩＧＦレ ベルが測定された後、ここでの化合物が単一又は複数投薬量を用い投与され(即 ち、該接触工程は哺乳動物への投与により達成される)、次いでＩＧＦレベルが 哺乳動物から抽出した液体から再測定される。化合物の投薬量が適切に調整でき るように生物学的液体中の特別なIGFBPの量又は特別なIGFBPsに結合した化合物 の量を測定するための別な方法は： (a)液体と、１）固相担体に付着した第１の抗体とを接触させること、該第 １の抗体は抗体の存在中でそのＩＧＦ結合サイトが該化合物への結合のためのIG FBP上に利用可能に残るようにIGFBP上のエピトープのために特異的であり、それ によって第１の抗体とIGFBPの間に複合体を形成すること；及び２）IGFBP上の全 ての利用可能なＩＧＦ結合サイトを飽和するために十分な時間該化合物と接触さ せること、それによって飽和した複合体を形成すること； (b)該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能で あるＩＧＦ結合タンパク質のために特異的である検出可能に標識した第２の手段 と、該飽和した複合体とを接触させること；及び (c)IGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物とＴＧＦ結合タンパ ク質、結合したＩＧＦとＩＧＦ結合タンパク質、又は該液体中に存在する活性Ｉ ＧＦの指標として、結合した標識した手段の量を定量分析すること、 を含む。 リガンド-介在免疫機能化法(LIFA)と称される、抗体を用いる上述した定量分 析技術は、米国特許第5,593,844号中にＩＧＦとの接触によりIGFBPの量を測定す るために、及び米国特許第5,210,017号中にＧＨとの接触によってGHBPの量を測 定するために記載されているこれら特許の開示は抗体と他の材料及び該アッセイ において使用され得る条件に関して参考によりここに併合される。 投薬量を測定するための別の方法は、ＩＧＦアゴニストに対する抗体を使用す ること及びＬＩＦＡフォーマットにおけるＩＧＦアゴニストのための別な検出方 法である。これは、IGFBPに結合した内因性又は外因性ＩＧＦｓの検出及びIGFBP に結合したＩＧＦアゴニストの量を与えるであろう。 投薬量を測定するための別な方法は、血液中の「遊離」又は活性ＩＧＦのレベ ルを測定するものとされるであろう。何れかの使用のために「遊離」ＴＧＦのレ ベルは、効力及び投薬有効性または投薬量の適当なマーカーとされるであろう。 例えば、一つの方法は、ＩＧＦ結合タンパク質に結合した内因性又は外因性Ｉ ＧＦを、又はＩＧＦ結合タンパク質に結合するがＩＧＦ結合タンパク質に結合し たヒトＩＧＦレセプターに結合しない化合物の量を検出すること又は生物学的液 体中の未結合ＴＧＦのレベルを検出することのために記載される。この方法は： (a)該液体と、１）該化合物の存在中でＩＧＦ結合サイトがＩＧＦ結合タン パク質に結合するための化合物上に利用可能に残るよう固相担体に付着した該化 合物(該化合物上のエピトープの特異的な第１の抗体のような)に特異的である、 化合物を検出するための手段とを接触させること、それによって該手段とＩＧＦ 結合タンパク質との間の複合体を形成する；及び２）ＩＧＦ結合タンパク質上の 利用可能なＩＧＦ結合サイトの全てを飽和するために十分な時間、該化合物と接 触させること、それによって飽和した複合体を形成する； (b)該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能で あるＩＧＦ結合タンパク質(IGFBP上のエピトープに特異的な第２の抗体のような )のために特異的である検出可能に標識した第２の手段と、該飽和した複合体と を接触させること；及び (c)IGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物とＩＧＦ結合タンパ ク質、結合したＩＧＦとＩＧＦ結合タンパク質、又は該液体中に存在する活性Ｉ ＧＦの指標として、結合した標識した手段の量を定量分析すること、 を含む。 投薬量を測定するための上記方法で与えられ、且つ仮定した投薬量は、全般的 に、使用され得るＩＧＦアゴニスト化合物の量が評価され得る、ＩＧＦ-Iについ ての実施例１１において実証した少なくとも幾つかの特徴を共有する。経口的に 活性な小さいＩＧＦアゴニストは、ＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIの7500ダルトンに比較 して、ほぼ500ダルトンの分子量を有するであろう。ＩＧＦアゴニストがＩＧＦ- I又はＩＧＦ-IIよりもIGFBPsに16倍劣る結合が可能と仮定して、たとえ上述した ようにこれが多くの治療的な自由裁量を受けるであろうとしても、患者の体重ｋ ｇに基づいて、約10μg/kg/日から200μg/kg/日が使用され得たように、ＩＧＦ- I又はＩＧＦ-IIとこれらの分子の等しい重量は等しい有効性を得ることができた 。 更なる方法は、ＬＩＦＡフォーマットを用い、特異的なIGFBP、例えばIGFBP-1 又はIGFBP-3についてのＩＧＦｓの分配を見積もることが提供される。 その化合物は持続放出性システムにより好ましくは投与される。持続放出性組 成物の好適な実施例は、適切な形の物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセ ルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含む。持続放出性材料は、ポリラクチ ド(米国特許第3,773,919，EP 58,481)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グ ルタマートのコポリマー(Sidmanら，Biopolymcrs，22，547-556(1983)、ポリ(メ タクリル酸2-ヒドロキシエチル)(Langerら,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(19 81)、及びLanger,Chem.Tech.,12:98-105(1982)、エチレン酢酸ビニル(Langerら, supra)又はポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸(EP 133,988)を含む。持続放出性 組成物はまた、リポソーム性エントラップ化合物を含む。該化合物を含むリポソ ームは、それ自身周知の方法により調製される：DE 3,218,121;Epsteinら,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985);Hwangら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. A.,77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949;EP 142,64 1;日本特許出願83-118008;米国特許第4,485,045と4,544,545号;及びEP 102,324 。普通、該リポソームは、小さな(約200から800オングストロームまで)、脂質含 量が約30モルパーセントコレステロールよりも大きい単層ラメラタイプであり、 選択した比率は大部分の有効な治療のために調整される。 より長い寿命を有するPEGylatcdペプチドもまた、例えば1995年11月30日公開 のWO 95/32003中に記載された共役技術に基づいて利用できる。 非経口的投与のために一つの実施態様において、該化合物は、製薬上、又は非 経口的に許容される賦形剤、即ち、その投薬量及び使用される濃度で受容者に無 毒性であり、且つ製剤の他の成分と和合できるそれと共に、単位投薬量注入可能 形態(溶液、懸濁液、又はエマルジョン)中に、複数の望ましい度合でそれぞれを 混合することによって処方される。例えばその調剤は、酸化剤及びポリペプチド に害のあることが知られる他の化合物を好ましくは含んでいない。 一般に、その調剤は、液状賦形剤又は微細に分割された固体賦形剤又は両方と 該化合物とを均一に且つ親密に接触することによって調製される。次いで、もし 必要であれば、その生産物は望ましい調剤に成型される。好ましくはその賦形剤 は非経口賦形剤、より好ましくは受容者の血液と等張である溶液である。そのよ うな賦形剤媒体の実例は、水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝化溶液、及びブド ウ糖溶液を含む。不揮発性油とオレイン酸エチルのような非水性媒体もここでは 有用である。 賦形剤は、等張性及び化学的安定性を増加する物質のような少量の添加剤を好 ましくは含む。そのような添加物は、その投薬量及び使用される濃度で受容者に 無毒性であり、且つリン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸 又はそれの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような酸化防止剤；低分子量( 約１０残基以下)ペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；血清アル ブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリ ドンのような親水性ポリマー；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、又 はアルキニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、及びセルロース又はその誘導 体、グルコース、マンノース、トレハロース、又はデキストリンを含む他の炭水 化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖 アルコール；ナトリウムのようなカウンターイオン；ポリソルベート、ポロキサ マー、ポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン性界面活性剤；及び／又 は中性塩、例えばNaCl,KCl,MgCl2,CaCl2,などを含む。 該化合物は、約4.5から８までのｐＨでそのような媒体中で典型的には処方さ れる。前述の賦形剤、賦形剤、又は安定化剤の特定の使用は、該化合物の塩の形 成をもたらすであろうことが理解されるであろう。最終的な調製物は安定な液状 又は凍結乾燥した固体とされ得る。 製薬組成物としての該ペプチド又は経口分泌促進剤の典型的な製剤が以下に論 じられる。遊離の酸又は塩基として又は製薬上許容される塩として、該化合物又 は該化合物の混合物の約0.5から500mgは、製薬実施に許容されると称されるよう な、生理学的に許容される媒体、賦形剤(carrier)、賦形剤(excipient)、バイン ダー、保存料、安定化剤、フレーバー、などと共に混合される。これら組成物中 の活性成分の量は、示された範囲内の適切な投薬量が得られるようになされる。 錠剤、カプセル、などの中に混合され得る典型的な佐剤は、アカシア、コーン スターチ又はゼラチンのようなバインダー；微晶質セルロースのような賦形剤； コーンスターチ又はアルギン酸のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのよ うな滑剤；ショ糖又は乳糖のような甘味剤；ペパーミント、ウィンターグリーン 又はチェリーのような香味剤である。投薬形態がカプセルである場合、上記材料 に加えて、脂肪油のような液状媒体をも含ませ得る。各種のタイプの他の材料が コーティングとして又は投薬単位の物理的形態の修正剤として使用され得る。シ ロップ又はエリキシルは、活性化合物、ショ糖のような甘味料、プロピルパラベ ンのような保存料、着色料及びチェリーのような香味料を含め得る。注射のため の滅菌した組成物は、通常の製薬上の慣行に従って製剤され得る。例えば、水又 はゴマ油、落花生油、又は綿実油のような天然由来の植物油のような媒体又はオ レイン酸エチルのような合成脂質媒体中に活性化合物の溶液又は懸濁液が望まれ 得る。緩衝剤、保存料、酸化防止剤、などは許容された製剤上の慣習に従い併合 され得る。 治療的な投与のため使用される化合物は、滅菌される必要がある。滅菌は、無 菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)を通すことによって容易に達成される。治療 組成物は一般に、無菌通路口を有する容器内、例えば静脈輸液バッグ又は皮下注 射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルに配される。 該化合物は普通、単位又は多投薬コンテナー、例えば封止アンプル又はバイア ル中に、水性溶液として又は復元のための凍結乾燥製剤として保存されるであろ う。凍結乾燥製剤の実例として、10-mLバイアルは、該化合物の滅菌濾過した1％ (w/v)水性溶液の5mLで満たされ、生じた混合物が凍結乾燥される。注入溶液は、 注入用静菌性水を用い凍結乾燥化合物を復元することによって調製される。 ここでのＩＧＦアゴニスト化合物と、血液中の全ＩＧＦを増加する又はＩＧＦ アゴニストの効果を増す１又はそれ以上の適切な試薬との組合せ治療は、本発明 の一部でもある。これらの試薬は一般に、生成したＩＧＦの放出をここでのＩＧ Ｆアゴニストに与え、且つ成長促進剤を含む。この目的のための成長促進剤は、 制限されること無しに、血液中のＩＧＦの濃度を増加するように哺乳動物中の内 因性ＧＨの放出を促進するＧＨ分泌促進剤を含む。実例は、ＴＲＨ、ジエチルス チルベストロール、テオフィリン、エンケファリン、Ｅシリーズのプロスタグラ ンジン、VIP-セクレチン-グルカゴン-ＧＲＦファミリーのペプチド、及び米国特 許第4,411,890号中に記載されたようなGHRP-6、GHRP-1のような他のＧＨ分泌促 進剤、および米国特許第5,206,235号中に開示されたようなベンゾ-融合化ラクタ ムを含む。例えば1996年５月23日公開のWO 96/15148も参照。他の成長促進剤は 、GHRPs,GHRFs,GH及びそれの類似体を含む。例えば、GHRPsは、1995年６月29日 に両方公開のWO 95/17422とWO 95/17423；Bowers，J．Pediatr．Endocrinol., 6:21-31(1993)；及びSchoenら,Annual Reports in Medicinal Chemistry,28:177 -186(1993)。GHRFsとその類似体は、例えば1996年11月28日公開のWO 96/37514中 に記載される。 加えて、GHRH、何れかのIGFBPs、長期作用性GH、GHプラスGHBP、インスリン、 又は低血糖剤が、この目的のためにここでのＩＧＦアゴニスト化合物と共に使用 され得る。加えて、ＩＧＦ-I又はＩＧＦ-II又はIGFBP-3に複合したＩＧＦ-Iのよ うなIGFBPを伴うＩＧＦもまた、ここでのＩＧＦアゴニスト化合物と共に使用さ れ得る。例えば、1994年８月４日公開のWO 94/16723中に記載した通り賦形剤中 にＩＧＦ-IとIGFBPを含んでいる製薬組成物は該化合物と共に使用され得る。そ の物はＩＧＦアゴニスト化合物と逐次に又は同時に投与され得る。加えて、食事 又はエクスサイズの養生法のようなＩＧＦ状態を操作する他の手段も又、本発明 の一部として治療に組み合わせるべきと考慮される。 もしインスリンが投与されるなら、それは何れかのインスリンの製剤とするこ とができるが、しかしＮＰＨインスリンが好適であり、更にＮＰＨインスリンの 投薬量は、皮下的に日に二回約５から５０単位／注射まで(即ち、約0.2から2mg まで)である。インスリンと該化合物の組合せのために、この製剤中の化合物に 対するインスリンの重量比は、一般に約10:1から1:50まで、好ましくは約1:1か ら1:20まで、より好ましくは約1:1から1:10まで、更により好ましくは約1:1から 1:5まで、最も好ましくは1:1から1:3までである。 更に、その製剤は、スルホニル尿素のような低血糖剤の有効量と一緒に好適に 投与される。その低血糖剤は、非経口、鼻腔内、経口を含む何れかの適当な技術 によって、または何れかの他のルートによって哺乳動物に投与される。最も好ま しくは、該投与は経口ルートによりなされる。例えば、1.25，2.5,及び5mg錠剤 濃度においてUpjohnによって販売される。MICRONASETM錠剤(グリブリド)が経口 投与のために好適である。この治療に配される、II型糖尿病用の通例維持投与量 は、単一投薬として又は適切と思われるようならその日中に分割して投与され得 る、一日当たり約1.25から20mgまでの範囲内である。Physician's Desk Refcren ce，2563-2565(1995)。処方のために利用可能なグリブリド-ベースの錠剤の他の 実例は、GLYNASETMブランド薬(Upjohn)とDIABETATMブランド薬(Hoechst-Roussel )を含む。GLUCOTROLTM(Pratt)は、5-及び10-mgの強さで利用可能なグリピジド(1 -シクロヘキシル-3-(p-(2-(5-メチルピラジンカルボキシアミド)エチル)フェニ ル)スルホニル)尿素)錠剤であり、食事コントロールに続いて低血糖治療が要求 されるII型糖尿病に又は他のスルホニル尿素への応答を中止している患者におい ても処方される。Physician's Desk Reference,1902-1903(1995)。ビグアニド( 例えばメトホルミンとフェンホルミン)又はチアゾリジンジオン(例えばトログリ トゾン)、又はインスリン作用に影響を与える他の薬剤のようなスルホニル尿素 以外の低血糖剤もまた使用され得る。チアゾリジンジオンが該化合物と共に使用 される場合、それは現状で使用されると同じレベルで、又は該化合物単独で又は そのジオンと一緒に見られる効果のために調節され得る、いくらか低いレベルで 使用される。それ自身により使用されるトログリタゾン(REZULINTM)の局部投薬 量は、一日当たり約100-1000mg、より好ましくは200-800mg/日であり、この範囲 がここにおいて適用可能である。例えば、Ghazziら,Diabetes,46: 433-439(1997)を参照。トログリタゾンよりもより強いインスリン感作剤である 他のチアゾリジンジオンがより低い投薬量で用いられるだろう。 本発明の別な態様は、ＩＧＦとチアゾリジンジオン、又はＩＧＦの組合せ、チ アゾリジンジオン、及び本発明の化合物を含む組成物である。さらに、血糖値の 制御をもたらす方法が、それを必要とする哺乳動物に、ＩＧＦとチアゾリジンジ オンの有効量、又はＩＧＦ、チアゾリジンジオン、及び本発明の化合物の有効量 を投与することによって提供される。活性剤は、同じ調剤又は共同での何れかで 、逐次に又は一緒に哺乳動物に投与され得る。有効量は、上述したように開業医 により決定され、且つ一般に当該の状態を治療するために用いられるＩＧＦの量 と同じか又は少ない量(例えば、糖尿病用のＩＧＦ-Iの約10から約250μg/kg/日 まで)及び当該状態を治療するために有効であることが知られるジオンの量、又 はその３つが使用されるなら、先に決定したような投薬量を用いる化合物の量を 意味する。 加えて、本発明は、もしそれがペプチドであるなら、ＩＧＦアゴニスト化合物 をコードしている核酸を用い、哺乳動物を治療するための遺伝子治療を用いるこ とを意図する。一般に遺伝子治療は、哺乳動物におけるＩＧＦレベルを増加(又 は過剰発現)するために用いられる。ＩＧＦアゴニストペプチドをコードする核 酸は、この目的のために使用され得る。一度アミノ酸配列が知られれば、それは その遺伝子コードの縮重を用い各種の核酸分子を生成すること、及び遺伝子治療 のために使用するように選択できる。遺伝子治療の目的のために患者の細胞の中 にその核酸(任意にベクターを含んだ)を受け取らせるための２つの主要なアプロ ーチ：インビボとエクスビボがある。インビボ搬送のため、その核酸は、通例は ＩＧＦアゴニスト化合物が要求されるサイトで、患者の中に直接注射される。エ クスビボ治療のため、患者の細胞は、取り出され、核酸を分離した細胞内に導入 され、その修正した細胞は直接に又は、例えば患者の中に移植される多孔質膜の 内部にカプセル内包される、の何れか一方が患者に投与される。例えば、米国特 許第4,892,538号と5,283,187号を参照。生存細胞の中に核酸を導入するための利 用可能な各種の技術がある。その技法は、意図した宿主の細胞においてインビト ロ又はインビボで、培養した細胞内に該核酸が移入されるかどうかに基づいて変 更する。インビトロで哺乳動物細胞の核酸の移入のために適当な技術は、リポソ ーム、エレクトロポレーション、ミクロインジェクション、細胞融合、DEAE-dex tran、リン酸カルシウム沈澱法、などの使用を含む。遺伝子のエクスビボ搬送の ために慣習的に使用されるベクターは、レトロウイルスである。 現在好適なインビボでの核酸移入技術は、ウイルスベクター(アデノウイルス 、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのような)及び脂質ベース のシステム(遺伝子の脂質介在移入のために有用な脂質は、例えばDOTMA，DOPE及 びDC-Cholである)によるトランスフェクションを含む。幾つかの場面において、 細胞膜表面タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、該標的細胞上のレセプター のためのリガンドなどのような、標的細胞を標的化する剤と共に該核酸を提供す ることが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスと関連し た細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特有の細胞型のための カプシドタンパク質又はそれのフラグメントトロピック、循環におけるインター ナリゼーションを受けるタンパク質のための抗体、及び細胞内局在化を標的化す る及び細胞内半減期を増すタンパク質は、標的化及び／又は取込みの促進のため に使用され得る。レセプター介在エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら,J .Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)；及びWagnerら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8 7:3410-3414(1990)により記載される。現在知られる遺伝子の作製及び遺伝子治 療プロトコールの説明は、Andersonら,Science,256:808-813(1992)を参照。 WO 93/25673及びその中に引用した参考文献も参照。 キットもまた本発明のために意図される。典型的なキットは、容器、好ましく はバイアル、製薬的に許容される緩衝液中にＩＧＦアゴニスト化合物を含むＩＧ Ｆアゴニストのための化合物製剤及び該製薬的製剤を利用するためのユーザーに 向けた、挿入文又はラベルのような指示書とを含むであろう。該キットは、GH,G HRP,GHRH,GH分泌促進剤,IGF,IGFBPに複合化したIGF,IGFBP,GHBPと複合化したGH ；インスリン、又は低血糖剤のための容器、好ましくはバイアルを任意に含む。 リガンドへの結合のためにポリペプチドと競合するペプチド、該ペプチドはフ アージ-ディスプレーライブラリーから得られ、のリガンドへの結合のための相 対アフィニティーを予測するための方法もまた提供され、該方法は、該リガンド の存在中で該ポリペプチドと共に該ペプチドに一致するファージミドクローンを インキュベートすること、該ファージを連続的に希釈すること、及び該リガンド への該ファージミドクローンの結合が該ペプチドによって抑制される度合を測定 することを含み、ここで低ファージ濃度でのみ抑制されるファージミドクローン は、高い及び低いファージ濃度の両方で抑制されるファージミドクローンよりも リガンドに対するより高いアフィニティーを有する。詳細は後述の実施例７にお いて提供される。好ましくは、該リガンドはIGFBP-1又はIGFBP-3のようなIGFBP であり、該ポリペプチドはＩＧＦである。 ここでの別な実施態様において、そのサイトで、普及又は不在の何れか一方で あるIGFBPに特異的であるここでの化合物の有効な量を哺乳動物に投与すること を含む、哺乳動物における特有なサイトから離れた又は向かってのいずれか一方 に内因性ＩＧＦを導くための方法が提供される。この目的のための「サイト」は 、心臓のような、又は脳-特異的IGFBPsを経る脳のような特有の組織又は器官を 含む。そのサイトでの普及は、当該のIGFBPが該サイトで局在され及び該サイト でのIGFBPの本質的な又は生物学的に重要な部分を構成することを示す。この示 唆は、ここで実証した該化合物のIGFBP-1対IGFBP-3のための特異性に従う。 本発明は、以下の実施例を参考することによりより完全に理解されるであろう 。それは、しかしながら、本発明の範囲を制限することとして考慮されるべきで ない。ここに記載した全ての文献と特許引用例は、参考により明白に併合される 。 実施例 IGFBPsに結合しＩＧＦレセプターにはしない分子の効果を発見するために、Ba yneら,J.Biol.Chem.,supraにより記載された変異体ヒトＩＧＦ-Iを、大腸菌(E.c oli)中での組換えＤＮＡ技術により生産した。特に、プラスミドpIGFMIを、残基 24と31で変わったアミノ酸(Y24L,Y31A)を持ったＩＧＦ-I変異体の生産のために 設計し、またこれら実施例において(Leu24,Ala31)hIGF-1又はＩＧＦ-Mと表示し た。該プラスミドは、phGH1の構築のために記載した通りpBR322(Sutcliffe, Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,43:77-90(1978))の基本的バックボーンか ら構築した。Changら,Gene,55:189-196(1987)。その遺伝子の発現のために要求 される転写の及び翻訳の配列は、アルカリホスファターゼプロモーターとtrpShi ne-Dalgarno配列により提供された。Changら,supra。さらに、ラムダ転写終結配 列は、その遺伝子の下流に配される。ScholtissekとGrosse，Nucleic Acids Res .,15:3185(1987)。細胞質から細胞周辺腔までのタンパク質の分泌は、lamBシグ ナル配列によって導かれる。ClementとHofnung,Cell,27:507-514(1981)。LamBシ グナル配列とＩＧＦ-I変異体(Y24L,Y31A)のヌクレオチド及びアミノ酸配列が図 １中に示される。 pIGFMIの構築のためのベクターフラグメントは、XbaIとClaIによるp131TGFの 消化によって分離した。そのベクターp131TGTは、アルカリホスファターゼプロ モーター、アンピシリンとテトラサイクリン耐性マーカー、及びtrpShine-Dalga rno配列のための配列を含む。ＩＧＦ-IのLamBシグナル配列とアミノ酸1-15は、X baIとPstIによるpBKIGF-IIB(米国特許第5,487,980号)の消化により提供した。ほ ぼ120bpのフラグメントを分離し、Y24LとY31Aの変わった(コドンに下線を付した )アミノ酸をコードしている合成ＤＮＡの以下の鎖に予備結紮した： （それぞれ、配列番号：２２と２３） 残るＩＧＦ-Iコード化配列とラムダ転写終結は、pBKIGF-IIBの適切な190bpBamHI からClaIフラグメントを分離することによって提供した。これらの配列は、図２ 中に示した通り、pIGFMIを構築するために一緒に結紮した。pIGFMIの完全なヌク レオチド配列は図３中に示される。 Bayneら，J.Biol.Chem.,supraは、ＩＧＦ結合タンパク質への又はＩＧＦ又は インスリンレセプターへのそれの結合に関してＩＧＦ-I変異体の特性を記載した 。この研究はヒトＩＧＦ-I上の位置24,31,及び60でチロシン残基が１型ＩＧＦ-I レセプターに対する結合のために重要であることを示した。これらチロシン 残基の２つが変異した、変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、8.7mMの野生型hIGF-Iの アフィニティーに比べて2,000nMのリガンド結合の半最大抑制を有する。これは 、野生型hIGF-Iと比較して約250倍(Leu24,Ala31)hIGF-1による１型ＩＧＦレセプ ターのアフィニティーの相対的減少を示す。 インビトロでの活性に関してＩＧＦにおける変異の機能的な効果は、Bayneら ，J.Biol.Chem.,supra.によっても研究された。Ｌ７ネズミ線維芽細胞内への3Ｈ チミジンの併合を用いたそのアッセイ系は、１型レセプターに結合することのＩ ＧＦ変異体の能力と、ＤＮＡ合成を刺激することの能力との間に良好な相関関係 を示した。これは、このインビトロ活性化アッセイにおいて200倍以上の(Leu24, Ala31)hIGF-1の活性における減少に反映される。しかしながら、ヒト血清IGFBPs への(Leu24,Ala31)hIGF-1の結合は、野生型ＩＧＦ-Iで見られるそれに類似する 。Bayneら，supra。従って、以下の実施例において、(Leu24,Ala31)hIGF-1は動 物において試験されるべく選択した。この分子は、その変異体が２つの変異体の みを含むため、１型ＩＧＦレセプター結合が200倍以上減じられるため、及びIGF BPsへの結合が大部分は維持されるために選択した。 実施例１ (Leu24,Ala31)hIGF-1のインビトロでの活性 ＩＧＦレセプターについてのＩＧＦ-I変異体の直接活性を試験するため、２つ の異なるアッセイを利用した。第３のアッセイは、もしその変異体が競合環境に おいてIGFBPsをＩＧＦに移し替えることができたならば測定するために使用した 。 アッセイ１：ヒト１型レセプターのためのKIRA、 このアッセイは、ヒト１型レセプター用の直接活性アッセイである。１型ＩＧ Ｆレセプターのようなチロシンキナーゼファミリー中のレセプターが活性化され る場合、それはチロシン残基上でリン酸化される。このアッセイにおいて、１型 ＩＧＦレセプターを含んでいる細胞は、インビトロで活性化し、次いで分離し、 そして該レセプターに対する抗体が、ＩＧＦレセプターを沈殿するために使用さ れる。次に、抗-ホスホチロシン抗体がリン酸化される１型ＩＧＦレセプターの 量をアッセイするために使用される。もし固定した多数の細胞が使用されるなら 、リン酸化されるレセプターの量は、１型ＩＧＦレセプター上の分子の活性の直 接的な指標である。 ヒト１型ＩＧＦレセプター用のKIRAは、ヒトMCF-7細胞を用いて発展した。こ の細胞系は、ヒト乳ガン腫瘍から最初分離され、ATCCから利用可能である。これ ら細胞の増殖は、ＩＧＦ-Iの添加に応答することが知られる。ＩＧＦ-Iがこれら 細胞ＩＧＦ-I加えられる場合、ＩＧＦ-Iのリン酸化において投薬量絡みの増加が 生じる(図４)。ＩＧＦ変異体の添加は、レセプターリン酸化においていずれかの 変化の原因とならない(図４)。変異体ＩＧＦの非常に高い濃度での一様なリン酸 化の徴候はなかった。 特に、該アッセイは以下の通り： 細胞 ＭＣＦ-７、ヒト胸部アデノカルシノーマから分離した癒着細胞系は、America n Type Culture Collection(ATCC-HTB22;American Type Culture Collection,Ro ckville,MD)から入手した。ＭＣＦ-７細胞は、ＦＡＣＳ分析によって表面ＩＧＦ -IRの測定可能なレベルを発現することが示されている。培養経過のために、該 細胞は、150cm2組織培養フラスコ(コーニング社)中、1.5x106/フラスコで4-7日 間培養した。アッセイのために、細胞は、PBS/5mM ＥＤＴＡで組織培養フラスコ から分離し、定量化し、さらに平底マイクロタイター板(Falcon 3072,Becton Di ckinson Labware,Lincoln Park,NJ)中、ウェル当たり2x105で、5％ＣＯ2中３７ ℃で一晩培養した。 媒体 細胞は、ジェネンテック社の媒体施設中で調製したF12/DMEM50:50(特別処方と してGibcoから得た、Gibco/BRL,Life Technologies,Grand Island,NY)中で培養 した。該媒体は、10％ＦＢＳ(HyClone，Logan,Utah),25mM ＨＥＰＥＳ(Gibco), 及び2mM Ｌ-グルタミン(Gibco)を追加した。 KIRA-ELISA 100μｌ媒体中のＭＣＦ７細胞(2x105)は、平底の９６-ウェル培養板中の各ウ ェルに加え、5％ＣＯ2中３７℃で一晩培養した。翌朝、該ウェルの上清をデカン トし、該プレートをペーパータオル上で軽く水気を拭った。次いで実験サンプル 又は組換えhIGH-I標準品のいずれか一方を含んでいる刺激媒体(25mM ＨＥＰＥＳ と2.0％ＢＳＡを含むF12/DMEM50:50)を各ウェルに加えた。該細胞を３７℃で３ ０分間刺激し、該ウェルの上清をデカントし、該板をペーパータオル上で今一度 軽く水気を拭った。細胞を溶解し且つレセプターを可溶化するため、溶解緩衝液 の100μlを各ウェルに加えた。溶解緩衝液は、50mM ＨＥＰＥＳ(Gibco)、0.5％T riton-X 100(Gibco)、0.01％チメロソール、30KIU/mlアプロトニン(ICN Biochc micals,Aurora，OH)、1mM４-(２-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド 塩酸(AEBSF;ICN Biochemicals)，及び2mMオルトバナジン酸ナトリウムを含む150 mM ＮａＣｌからなる。該板は次いで、６０分間室温でプレートシェーカー(Bell co Instruments,Vineland,NJ)上で温和に撹拌した。 該細胞を可溶化している一方、ポリクローナル抗-ＩＧＦ-IR(ヒト１型ＩＧＦ- Iレセプターに対する抗体、カタログ3B7,Santa Cruz Biotech,ＰＢＳ中5.0μg/m l、100μl/ウェル)によって４℃で一晩被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイター板( Nunc Maxisorp,Inter Med,Denmark)をデカントし、ペーパータオル上で水気をと り、ブロック緩衝液(0.5％ＢＳＡ(Intergen Company,Purchase,NY)と０.01％チ メロソールを含むＰＢＳ)によって６０分間室温で温和に撹拌することによりブ ロックした。６０分後、抗-ＩＧＦ-IR被覆プレートを、自動プレートワッシャー (Scan Washer 300，Skatron Instruments，Inc，Sterling，VA)を用いて洗浄緩 衝液(0.05％ Tween-20と0.01％チメロソールを含むＰＢＳ)で６回洗浄した。 細胞培養マイクロタイターウェルからの可溶化したＩＧＦ-IRを含む溶解液は 、抗-ＩＧＦ-IR-被覆と-ブロック化ELISAウェルに移し、且つ温和な撹拌ととも に室温で２時間インキュベートした。未結合レセプターは、洗浄緩衝液で洗浄す ることにより取り除き、次いで希釈緩衝液(0.5％ＢＳＡ、0.05％Tween-20、5mM ＥＤＴＡと0.01％チメロソールを含むＰＢＳ)中に0.1μg/mlに希釈したビオチン 化抗体４Ｇ１０(抗-ホスホチロシン)の100μｇを各ウエルに加えた。室温で ２時間のインキュベーションの後、該板を洗浄し、さらに希釈緩衝液中に1:50,0 00に希釈したHRP-接合デキストラン-ストレプタビジン(Amdex Laboratories)の1 00μｌを各ウェルに加えた。該プレートは、温和な撹拌とともに室温で３０分間 インキュベートした。遊離アビジン-接合体を洗い流し、さらに新たに調製した 基質溶液(テトラメチルベンジジン；ＴＭＢ；２-コンポーネント基質キット；Ki rkegard and Perry,Gaithersburg,MD)を各ウェルに加えた。反応は１０分間継続 させた後、着色発生を1.0M Ｈ3ＰＯ4の100μl/ウェルの添加で停止した。450nm での吸収は、マッキントッシュCENTRIS 650TMコンピューター(Apple Computers, Cupertino,CA)とSOFTMAXTMソフトウェア(Molecular Devices)によって制御した ｖｍａｘプレートリーダー(Molecular Devices,Palo Alto,CA)を用い、650nmの 参照波長(Abs450)によって読み取った。 標準曲線(図４)は、300,100,33.3,11.1,3.7,1.2,0.4,又は参考標準として(ジ ェネンテック社、lot 1189-2又は均等物)0ng/ml ＩＧＦ-IによってＭＣＦ７細胞 を刺激することによって作成した。サンプル濃度は、標準曲線上のそれの吸収の 挿入によって得られ、ＴＧＦ-I ng/ml活性に換算して表した。変異体はこのアッ セイにおいてレセプターをリン酸化しない。 アッセイ２：マウス３Ｔ３細胞の細胞数の増加 ＩＧＦ変異体の活性は、ＤＮＡ合成と細胞複製についてのＩＧＦ-Iの活性のた めのバイオアッセイにおいても測定した。このアッセイにおいてマウス３Ｔ３細 胞を培養し、さらにＩＧＦ変異体又はＩＧＦを加え、次いで3Ｈ-チミジンを滴定 した。取り込まれた3Ｈ-チミジンの量は、ＤＮＡの複製及び従って細胞複製の指 標である。ＩＧＦ-Iは、投薬量絡みの方法においてチミジン取り込みを増加した (図５)。ＩＧＦ変異体は、非常に高い濃度を加えた場合に一様にこのアッセイに おいて活性なしを示した。 アッセイ３：IGFBPsへの(Leu24,Ala31)hIGF-1のインビトロでの結合 変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、競合結合アッセイにおいてIGFBPsからの放射 能標識化rhIGF-Iを移動するその能力を試験した。このアッセイは、一晩９６-ウ ェ ル板上に、組換えヒト(rh)IGFBP-1又はrhIGFBP-3(160ng/ml)を被覆すること、0. 5％ＢＳＡで１時間プレートをブロックすること、１時間rhIGF-1(250-0.08ng/ml )又は(Leu24,Ala31)hIGF-1を加えること、次いで125Ｉ-IGF-1の20,000cpmを加え ること、及び洗浄と計測の前に２時間インキュベートすることを含む。図６は、 変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1が野生型hIGF-Iのそれと異なり数倍のみのアフィニ ティーによって組換えIGFBP-1に結合することを示す。図７は、変異体(Leu24,Al a31)hIGF-1が野生型hIGF-Iのそれと異なり数倍のみのアフィニティーによって組 換えIGFBP-3に結合することを示す。 結論 ２つのインビトロアッセイにおいて、変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、１型Ｉ ＧＦ-レセプターへのわずかな又は無の直接活性を示した。第１に、それはKIRA アッセイにおいて該レセプターのリン酸化によって測定されたようなヒトＩＧＦ -Iレセプターを活性化しない。第２に、それは３Ｔ３細胞の中に取り込まれたチ ミジンにより測定されたようなマウスＩＧＦ-Iレセプターを直接的に刺激しない 。従って、ＴＧＦレセプターのその活性の欠落に基づいて、ＩＧＦ変異体はイン ビトロで不活性となることも予期されるであろう。しかしながら、変異体(Leu24 ,Ala31)hIGF-1は、インビトロでIGFBP-1とIGFBP-3への顕著な結合を示さない。 このインビトロのデータは、インビトロでの変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1を試験 するための基礎を提供した。 実施例２ (Leu24,Ala31)hIGF-1のインビトロでの活性 緒言 実施例１で試験した変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1をインビトロで試験した。た とえ該変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1がインビトロで不活性であったとしても、こ のクラスの分子(レセプター上で直接的には不活性であるが、IGFBPsに結合する ことができる分子)がインビボで何らかの活性を示すであろうと仮定した。第１ の実験において(Leu24,Ala31)hIGF-1は意識のあるラットにＩＶ注射により与え られ且 つ血糖値制御の作用を測定した。 方法 ７週齢オスWistarラット(240-250g,Charles Rivers Laboratories,Hollister, CA)を、KETAMINE/XYLAZINETM麻酔で意識喪失し、右頸静脈を慢性的血液サンプリ ング用に開発したシリコーンラバーカニューレによってカニューレ挿入した。Cl arkら，J.Endocrinol.,111:27-35(1986)。２、３日の回復期間の後、２つの基礎 の血液サンプルを−１０と−５分で採取し、その試験物質をＩＶ注射によりラッ トに投与し、次いで血液サンプルを、５，１０，２０，３０，４５，６０，及び １２０分後に採集し、その血漿を遠心分離によって直ちに分離した。グルコース とインスリン濃度は、Chem 1A血清化学分析装置を用いる結合ヘキソキナーゼ方 法又は、後者の場合において、ラットインスリンＲＩＡキット(Linco Research, Inc.,St.Charles,MO)によるいずれかで測定した。 統計学的比較は、ダンカンの多重範囲試験によって変数(ANOVA)の分析によっ て作成した。＜０．０５のｐ値は統計学的有意差であると見なした。全てのデー タは平均値±SEMとして表した。 結果 実験１ 群当たり５匹のラットを持つ２つの処置群は、(Lcu24,Ala31)hIGF-1(100μg) 又はＰＢＳのいずれか一方をＩＶ投薬した。 該処置に対する血漿グルコースと血漿インスリンの応答は、それぞれ図８Ａと ８Ｂ中に示した。該データは、平均化し且つ100％でセットした前処置血液サン プルにおける値のパーセンテージとして表した。(Leu24,Ala31)hIGF-1のＩＶ注 射の一つは、血漿インスリンレベルを即座に(５分後に)、劇的に且つ有意に(１ ０分後、コントロールに対しP<0.001)、コントロール群のそれの２５％に減少し 、６０分間低下を維持した。血漿インスリンにおけるこの落下は、短時間のしか し統計学的に有意な(１０分後、コントロールに対しP<0.05)血中グルコースの落 下を伴った。 実験２ 群当たり４-５匹のラットを持つ３つの処置群中のラットは、(Leu24,Ala31)hI GF-1(100μg)又はrhIGF-1(100μg)のいずれか一方をＩＶ投薬し、コントロール 群はＰＢＳを与えた。 図９Ａと９Ｂは、平均化し且つ１００％にセットした前処置血液サンプルにお ける値のパーセンテージとして表した血漿グルコース(図９Ａ)と血漿インスリン (図９Ｂ)の応答を示す。血漿インスリンレベルは有意に減少し(１０分後、コン トロールに対しp<0.001)、rhIGF-1のＩＶ注射に応答して１２０分間低下を維持 した。加えて、短時間のしかし統計学的に有意な(１０分後、コントロールに対 しp<0.01)血中グルコースの落下があった。これらはrhIGF-1の注射に対して予期 した応答であった。(Leu24,Ala31)hIGF-1が注射された場合、野生型rhIGF-1を与 えたラット中のインスリンにおける落下に対して統計学的に有意な(１０分後、 コントロールに対しp<0.001)の類似の大きさと度合のインスリン濃度における低 下があった。(Leu24,Ala31)hIGF-1投与後のインスリンレベルは、実験の終わり まで有意な抑制を維持した(120分後、コントロールに対しp<0.05)。少ないがし かし統計学的に有意な(１０分後、コントロールに対しp<0.05）血中グルコース の落下があった。 結論 ２つの個別の実験において、高いアフィニティーでIGFBPsに結合するがＩＧＦ レセプターには乏しく結合する分子、(Leu24,Ala31)hIGF-1は、通常のラットに おいてＩＶによって与えた場合、血糖応答変数についてＩＧＦ-様の活性を示す 。この活性は文献におけるデータから予測することができなかった。該ＩＧＦ変 異体は、野生型rhIGF-Iの作用に類似した程度であったインスリン分泌における 抑制作用を示した。この作用のサイズ、及びrhIGF-Iそれ自身の投与の後に見ら れたその類似性は予期しないものであった。グルコースレベルの落下は、rhIGF- Iの投与の後に見られたと同じく大きくはなかった。応答のこの理法、血中グル コースレベルについてよりもインスリン分泌に関するより大きな作用は、rhIGF- I に対するこれらの応答の感受性の結果として起こる。インスリン分泌の抑制は、 より低い血中グルコースレベルが必要とされるよりもrhIGF-Iのより低い投薬量 で見られる。Furnsinnら,Endocrinology,135:2144-2149(1994)。 実施例３ 糖尿病ラット内への(Leu24,Ala31)hIGF-1の注射 緒言 実施例２において、ＩＧＦ-I変異体は、通常の非糖尿病ラットにおいてインス リン分泌を減じ且つ血中グルコースを低下した。糖尿病状態において、内因性Ｉ ＧＦ系を操作することで血糖コントロールの同様の変化に至るであろうことは不 明であった。それ故に、II型糖尿病の動物モデルをＩＧＦ-I変異体の血糖活性を 試験するために選択した。選択した動物、Zuckerラットは、ラットにおける糖尿 病に関連した肥満症の良く知られたモデルである。Sternら，Proc．Soc．Exp.Bi ol．Mcd.，139:66-69(1972)。これらラットの亜系統、Zuckcr糖尿病肥満系統(ZD F)は、それが進行性ｂ-細胞不全とさらに明らかな糖尿病とともに、早期で肥満 とインスリン耐性になることから、II型糖尿病の良好なモデルである。Johnson ら，Science,250:546-549(1990)。ＩＧＦ-I投与がII型糖尿病の開始と重篤度を 長期に遅らせ得ることがＺＤＦラットにおいて先に示されている(1996年５月23 日公開のWO 96/15148)。従って、ＺＤＦラットは、血糖制御に関してＩＧＦアゴ ニスト化合物の効果を検査するためのII型糖尿病の適当で敏感な動物モデルを提 供する。 本実施例においてＩＧＦ変異体の静脈内ボーラス注射を与え、血中グルコース 及びインスリン濃度についての効果を実験した。 方法 １８匹の７週齢オスZucker糖尿病肥満ラット(250-300g,Genetic Models社)を 、KETAMINETM(62.5mg/kg)/ROMPUN XYLAZINETM(12.5mg/kg)麻酔を用い意識喪失し た。右頸静脈がシリコーンゴムカテーテルを用いカニューレ挿入され、該ラット を回復させた。 実験１ 手術後２日目、該ラット(５−６／群)を３つの処置群に分割し、頸静脈カテー テルを経て、２００μｌの： １）ＰＢＳ賦形剤； ２）ＩＧＦ変異体(100μg)；又は 3)rhIGF-1（100μg） をＩＶ投与した。 rhIGF-1の投薬量は、血中グルコースレベルと血中インスリンレベルの少ない 落下が生起し得る投薬量として選択した。ＩＧＦ変異体の同じ投薬量が比較のた めに投与された。 実験２ ３日後、同じラットを用い該実験を繰り返した。最初の実験においてＩＧＦ-I を投与した該ラットは繰り返しの実験においてＩＧＦ変異体を受けさせ、逆の場 合も同じとした。コントロール動物は両方の実験においてＰＢＳを受けさせた。 測定 ２つの血液サンプルは、ホルモンをＩＶ投与する前に頸静脈のカニューレを経 て各ラットから採集し、次いで血液サンプルを１０，３０，６０，及び１２０分 後に採集した。その血漿は遠心分離によって直ちに分離した。グルコース濃度は Chem 1A血清化学分析機を用い結合ヘキソキナーゼ方法により測定した。インス リン濃度は、ラットインスリンＲＩＡキット(Linco Research,inc.,St.Charles, MO)を用い測定した。 各時間点での統計学的比較は、Duncan's多重範囲試験によるANOVAによって作 成した。<0.05のｐ値は、統計学的に有意とされるとして見なした。全てのデー タは、処置群当たり５または６動物による平均値±SEMで表した。 結果 実験１の結果を図１０Ａと１０Ｂに、実験２の結果を図１１Ａと１１Ｂに示し た。各図において上部パネル(Ａ)は基線(１００％としてセット)からの血漿イン スリンのパーセンテージ変化を、下方パネル(Ｂ)は基線(１００％としてセット) からの血漿グルコースのパーセンテージ変化を示す。 実験１において、rhIGF-IのＩＶ注射は、直ちに、適度な、且つ統計学的に有 意の(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)血中グルコースの低下を生じた( 図１０Ｂ)。反対に、賦形剤処置ラットにあっては、血中グルコースのわずかな 増加があった。血中グルコースは次いでコントロール動物におけるレベルに復元 した。少量であるが、しかし統計学的に有意な(p<0.05対コントロール、賦形剤 処置動物)血中グルコースの低下が、ＩＧＦ変異体で処置した動物において１０ 分後に見られた。血中グルコースは次いでコントロールレベルに復元した。１２ ０分後、血中グルコースはrhIGF-IとＩＧＦ変異体の両方で処置した動物におい て低いレベルを漂った。これは、血中グルコースについてのＩＧＦ変異体の長期 間の作用の示唆である。 血中グルコースにおけるこれらの変化は、血液中のインスリンの濃度における 変化により達成された。コントロールラットの血中インスリンレベルは高く、そ のレベルはサンプリングの２時間を通して維持された。rhIGF-Iの注射は、血漿 インスリンにおける統計学的に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物) 、大きな、且つ維持された低下を生じた。ＩＧＦ変異体の注射もまた、統計学的 に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)血中インスリン濃度を抑制し た。この群においてインスリンは注射の２時間後にコントロールレベルまでゆっ くり戻った。 実験２において(図１１Ａと１１Ｂ)、実験１と図１０Ａと１０Ｂにおいて示し たそれら知見と類似の結果が得られた。実験２において、rhIGF-IのＩＶ注射は 、直ちに、適度な、且つ統計学的に有意の(p<0.01対コントロール、賦形剤処置 動物)１０分後での血中グルコースの低下を生じた。血中グルコースは３０分後 にコントロールレベルに復元した。この実験において、類似の且つ統計学的に有 意な(p<0.05対コントロール、賦形剤処置動物)血中グルコースの低下が、ＩＧＦ 変異体で処置した動物において１０分後に見られた。血中グルコースは次いでコ ン トロールレベルに復元し、次いで低レベルを漂った。再度、これは、血中グルコ ースについてのＩＧＦ変異体の長期間の作用の示唆である。 血中グルコースにおけるこれらの変化は、血液中のインスリンの濃度における 変化により達成された。コントロールラットの血中インスリンレベルは高く、そ のレベルはサンプリングの２時間を通して維持された。rhIGF-Iの注射は、血漿 インスリンにおける統計学的に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物) 、大きな、且つ維持された低下を生じた。ＩＧＦ変異体の注射は、同様で且つ統 計学的に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)血中インスリン濃度の 低下を生じた。両方の群において、インスリンはゆっくりとコントロールレベル に戻ったが、しかし２時間後、前注射レベル又はコントロールラットにおけるレ ベルに完全に戻っているとは思えない。 これらの実験は、ＩＧＦアゴニストの急性投与が、１）インスリンレベルを減 じ、及び２）血中グルコースレベルを減じることを示す。本実験において、一度 だけの注射が与えられ、その輸送は静脈中であった。ＴＧＦ変異体の一度の注射 が血糖値パラメーターに関して効力を示したことから、多数回の注射は、有益な 長期間の累積的な効果に至る同様の急性血糖値作用を示すであろうことがほぼ確 実であろう。また、皮下で与えた注射がここで用いた静脈内注射と類似の効果を 有するが、しかし皮下注射部位からそれの緩やかな吸収のために時間差の原因を 示し得ることも予期されるであろう。 ヒトにおいて、rhIGF-Iの注入は、血中グルコースを減じるのに必要とされた それよりもより低い投薬量でインスリン放出を抑制し(Hartmanら,J.Clin.Invest .,91:2453-2462(1993))、且つrhIGF-Iのそのような低投薬量オイグリセミック注 入はまた、断食-増加拍動ＧＨ分泌をも急速に抑制する。それ故に、インスリン の落下は、ＩＧＦアゴニストが、増加する内因性活性ＩＧＦ-Iレベルを生じる、 ＩＧＦ-Iの生物学的利用能を増加すると仮定して、そのIGFBPsの一つとＩＧＦと の相互作用を抑制する分子の投与の後にＩＧＦ-Iの放出の感受性マーカーとされ ることが予期される。 通常の動物と糖尿病動物を用いる、ここに示した実施例において、十分なＩＧ Ｆ-Iが血中インスリン及び血中グルコース濃度の有意な低下を誘導することを活 性化したことが推定され得る。 実施例４ Hypoxラットへの(Leu24,Ala31)hIGF-1の長期投与 緒言 先の一連の実験は、ＩＧＦ-Iレセプターに対してではなくIGFBPsに優先的に結 合する分子を投与することの急性作用を述べた。これらの分子投与の短期間での 効果は、血中グルコースとインスリンレベルの低下により示した通り、ＩＧＦ様 アゴニスト作用を生起することが現に示された。 次に現れる重要な関心事はＩＧＦアゴニストの投与の長期間の効果である。も しこれらの活性のメカニズムがＩＧＦの単純な置換であるなら、時間によって、 長期間さらされることによって、継続的にさらされることによって又は高い投薬 量にさらされることによって、ＩＧＦアゴニストの応答がタキフィラキシーを示 すであろう及び急性応答が減少するであろう可能性がある。もし作用のそのメカ ニスムはＩＧＦの単純な置換以外であるならば、ＩＧＦアゴニストの動物におけ る長期間の作用は確実でない。加えて、グルコース調節についての短期間実験は 、ＩＧＦ-Iの長期間の作用、例えば同化作用、分化作用、有糸分裂作用、及び生 体機能における作用を示していない。それ故に動物に対するＩＧＦアゴニストの 長期間投与は重要であった。 第１のモデルは下垂体切除ラットとした。下垂体切除ラットは、ＧＨとＩＧＦ -Iの両方に対して非常に感受性である。Gulerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1998 ),supra;Clarkら,Endocrine,3:297-304(1995)。しかしながら、内因性ＩＧＦ-I レベルは、下垂体切除ラットにおいて非常に低く(恐らく通常の10％のみ)、ＩＧ Ｆ変異体がそれ自身によって活性を示し得ないと思われた。それ故に、下垂体切 除ラットの群は、組換えヒトＧＨをも与えた。下垂体切除ラットにおけるＧＨ処 置は血液中のＩＧＦ-Iレベルを引き上げ(Gulerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(198 8),supra;Clarkら,Endocrine,supra)、且つこのＩＧＦ-Iの増加した血中レベル がＩＧＦ変異体の共投与によって活性化され得るとの仮定は合理的であった。 方法 若いメスのＳＤラットはTaconic実験室で下垂体切除し、数日後に届いた。そ のラットは頻繁に体重計測し、下垂体が切除された該実験の後２週と３週の間７ グラムの体重増加又は減少した。２５匹のラットをそれの体重に基づく５つのグ ループにランダムにグループ分けし、１ケージ当たりラット４匹でケージにラン ダムに割り当てた。その動物は食物と水を自由摂取し、温度と光を制御した室内 で飼育した。 実験群 １）賦形剤ポンプ、賦形剤注射； ２）(Leu24,Ala31)hIGF-1(10μg/日、ＳＣミニポンプにより)、賦形剤注射； ３）(Leu24,Ala31)hIGF-1(50μg/日、ＳＣミニポンプにより)、賦形剤注射； ４)組換えヒトＧＨ(ジェネンテック社からのNUTROPINTMブランド、20μg/日、Ｓ Ｃ注射により、各10μg/日で２回注射)、賦形剤ミニポンプ；又は ５）(Leu24,Ala31)hIGF-1(50μg/日、ＳＣミニポンプにより)プラス組換えヒト ＧＨ(20μg/日、ＳＣ注射により、各10μg/日で２回注射)。 ラットには１週間投薬した。 ホルモン 変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、KETAMINETM/XYLAZINETM麻酔で麻酔した間にそ のラットの背部の首部位中の皮下トンネル中に配した浸透性ミニポンプ(ALZET20 01TM,Alza,Palo Alto,CA)により投与した。そのポンプは、24μlの溶液が１週間 毎日輸送されると仮定し、計算した一日投薬量が50μｇ又は10μｇとなるように 溶液で満たした。 組換えヒトＧＨは、100μl容量中10μｇの日に二度のＳＣ注射により一週間投 与した。 rhGHの注射を受けない動物は賦形剤の注射を受け、且つＩＧＦ-Iを投与しない 動物は塩溶液充填ポンプ移植している。 測定 体重は毎朝測定した。投薬の週の終わりに、その動物をＣＯ2を経て麻酔し、 心臓穿刺を経て放血した。残りの血液は凝血させ且つ血清を分離し、更なる分析 用に保存した。 脾臓、胸腺、心臓、肝臓、腎臓、及び腎周囲脂肪を取り出し、秤量した。その 脛骨を取り出し、骨端板の幅を組織学的に測定するために中性緩衝化ホルマリン 中で固定した。 血清化学は自動化Chem １分析機により測定した。血清インスリン濃度は、Li nco社によって提供されたＲＩＡキットを用い測定した。ＩＧＦ-I濃度を測定す るため、血清をエタノールを用いて抽出し、その上清を中性状態まで希釈し、Ｒ ＩＡによってＩＧＦ-Iを測定した。血清抽出液中のラットＩＧＦ-Iの濃度は、Di agnostic Systems Laboratorics社からのキットを用いるＲＩＡによって測定し た。ヒトＩＧＦ-I濃度はジェネンテック社でＲＩＡによって測定した。 頸骨は長手方向に分割し、トルエンブルーで染色し、顕微鏡のスライドガラス 上に搭載した。その頸骨の骨端板の幅は顕微鏡に接続した接眼マイクロメーター を用いて測定した。 データは１のファクター及び２のファクターANOVAを用いる変数の分析の分析 によって統計学的に分析した。 結果と考察 体重： 図１２は実験の終了時点での動物の最終体重増を示す。ｈＧＨ注射の結果とし て体重の顕著な増加があった。これは、賦形剤で処置した場合、体重増とならな いこれらのＧＨ不足下垂体切除ラットにおける予期された応答である。それ自身 により、ＩＧＦアゴニストは、一日当たり50μｇで少量の活性のみを示した。Ｉ ＧＦアゴニストの一日当たり10μｇ群は、コントロール群のそれよりもより少な い平均体重増を有した。しかしながら、ＩＧＦアゴニストがｈＧＨと一緒に与え られた場合、ＩＧＦアゴニストは全身体の成長についてｈＧＨの活性の増大を示 した。これは図１２中の最終体重において示される。 器官成長： 器官重量データは、脾臓(図１３Ａと１３Ｂ)、胸腺(図１４Ａと１４Ｂ)、及び 心臓(図１５Ａと１５Ｂ)で示される。各図において、絶対器官重量が上部パネル 、Ａ中に示され、体重のパーセンテージとして表した器官重量が下部パネル、Ｂ において示される。 絶対脾臓重量(図１３Ａ)は、それがｈＧＨのためであるとして、ＩＧＦ変異体 単独の両方の投薬によって増加した。ｈＧＨの応答は、ＩＧＦアゴニストに対す るそれよりもより大きかった。しかしながら、ｈＧＨプラスＩＧＦアゴニストの 組み合わせは、相乗効果の証拠と共に脾臓サイズを倍増した。脾臓サイズを全身 の成長で補正した場合(全体中のパーセンテージとしてのデータで表現すること によって)、ＩＧＦアゴニストは再度、単独投与の場合に活性化の証拠を示した 。しかしながら、現にｈＧＨとＩＧＦ変異体の組み合わせの相乗効果は、組み合 わせ処置への非常に大きな応答があるとして、より明白であった。 絶対胸腺重量(図１４Ａ)は、高投薬量ＩＧＦアゴニストによってもまた増加し た。ｈＧＨに対する及びＩＧＦ置換物に対する応答は大体等しかった。ｈＧＨプ ラスＩＧＦアゴニストの組み合わせは胸腺重量をも増加した。胸腺サイズを全身 の成長で補正した場合(全体中のパーセンテージとしてのデータで表現すること によって)、ＩＧＦアゴニストは再度、単独投与の場合に、ｈＧＨによって生起 されたそれに類似している再度応答によって、活性化の証拠を示した。 本実施例において、10-及び50-μｇ投薬量でＩＧＦアゴニストは、心臓の絶対 及び相対サイズにおける有意な増加を生じた(図１５Ａと１５Ｂ)。一方、ｈＧＨ による処置は、絶対心臓重量と相対的な心臓重量をわずかに増加した。ｈＧＨと の組み合わせにおいてＩＧＦ変異体による処置は、心臓の絶対重量をより大きく 増加し、相対心臓重量においてＧＨ誘導化減退を逆転した。 骨の成長： この実験中の５つの処置群からの骨端板の幅を図１６中に示した。コントロー ル下垂体切除ラットにおける頸骨の幅(約200ミクロン)は、同じラットにおける 文献中に報告されたそれと同じだった。Clarkら,Endocrine,3:717-725(1995)。 それ自身により与えられた場合、50μg/日での(Leu24,Ala31)hIGF-1は、骨の成 長において有意の増加を誘導した(p<0.01対コントロール)。低い投薬量の(Leu24 ,Ala31)hIGF-1は、骨成長が増加しない。一方、rhGHの注射は、周囲400μｍまで 板の幅が増大する、骨の成長における非常に大きな増加を誘導した。rhGHと(Leu24 ,Ala31)hIGF-1の組み合わせは骨の成長における更なる増加を生じない。しか しながら、400μｍの頸骨板幅は、更なる増加が使用した投薬量で投薬する組み 合わせによって生起できたことが起こりそうもないとされる最大値に近い。単独 で与えた(Leu24,Ala31)hIGF-1に応答する成長があったことから、ｈＧＨの低い 投薬量で、単独で与えた各剤よりもその組み合わせの大きな効果が見られるであ ろうことが予期されるであろう。 血清ＩＧＦ-Iレベル： 血液中のＩＧＦ-Iのレベルは、２つのアッセイで測定した：一方のアッセイで は、血液中のラットＩＧＦ-Iの量を、他方は血液中のヒトＩＧＦ-Iの量を測定し た。図１７は、５つの処置群における血液中のラットＩＧＦ-Iの量(図１７Ａ)及 び全ＴＧＦ-Iの量(図１７Ｂ)を示す。これらのデータの顕著な側面(図１７Ａ)は 、レセプター-活性ＩＧＦ-I(内因性ラットＩＧＦ-I)の血中レベルがＩＧＦアゴ ニストを与えた動物においてより低く、さらにこれらの低い血中ＩＧＦ-Iレベル は各種の器官及び組織において顕著なＩＧＦ様応答と関連したものである。明ら かに、それはホルモンの血中レベルが減少される場合にホルモンの増加した活性 の証拠を観測することと反対の認識である。 全ＩＧＦ-I用のアッセイ(図１７Ｂ)は、ラットとヒトＩＧＦ-Iの両方を測定す る。このアッセイにおいて、恐らく結合タンパク質へのＩＧＦ-Iアゴニストの結 合のため及びそれ故に血液中に存在している、ＩＧＦ-Iアゴニストの50μｇを与 えたラットにおける全ＩＧＦ-Iの上昇があった。ＩＧＦアゴニストの10μｇの低 い投薬量で、血液中の全ＩＧＦの上昇はなかった。血液中の全ＩＧＦは、この処 置群において低下する傾向であったラットＩＧＦ-Iのレベルに対して、ＧＨとＩ ＧＦアゴニストの組み合わせを与えたラットにおいて上昇する(p<0.05対 hGH単独)。これは、ＧＨがＩＧＦ-IとIGFBPsを生み出す場合に、スペアの結合容 量があること、及びこの容量はＩＧＦアゴニストによって部分的に満たされてい ることを示す。 結論 ＧＨとＩＧＦ-Iの組み合わせが、ヒトを含む動物に一緒に投与された場合、い ずれかの剤単独よりもより大きな活性を示すことは先に示されている(米国特許 第5,126,324号；Kupferら,J.Clin.Invest.,91:391-396(1993))。しかしながら、 ＩＧＦアゴニストの投与がＩＧＦ軸の活性化の結果を生じ且つＧＨ投与の効果を 増大するであろうことは不明確であった。本実験は、IGFBPsに緊密に結合するが 、ＩＧＦレセプターに乏しく結合する化合物の投与が、ＧＨの活性を増大できる ことを示す。 ＩＧＦ-Iの投与かＧＨによって誘導されたそれに対する成長の異なるパターン を誘導することもまた報告されている。特に、ＩＧＦ-I投与は、脾臓、胸腺、及 び腎臓の著しい過剰成長を示す原因となる。Gulerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8 5:4889-4893(1988);Skottnerら,Endocrinology,124:2519-2526(1989);Clarkら,E ndocrine,3:297-304(1995)。しかしながら、ＩＧＦ変異体単独で処置したラット の全身サイズが小さい応答のみ示したことから、処置した動物の器官のサイズに おけるわずかな変化があるであろうことも予期され得る。これはそのケースでは ない；それは、ＩＧＦ変異体が、ＩＧＦ-Iに感受性であることが知られた器官、 脾臓及び胸腺のいずれかについて非常に大きな「ＩＧＦ様」効果を有することが この実施例中に示される。 この実験における非常に驚くべき知見は、心臓のサイズについての処置の効果 であった。下垂体切除又はＧＨ欠乏ラットにおける以前の研究においては、ＩＧ Ｆ-Iの投与が心臓サイズに関して非常に少ないか効果がないことが示されていた 。Gulerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:4889-4893(1988);Skottnerら，En docrinology,124:2519-2526(1989);Clarkら,Endocrine,3:297-304(1995)。 先に示した通り、ＩＧＦ-IのアゴニストとしてのＩＧＦ変異体の効力に鑑みて 、本発明は、血流中のＩＧＦ-Iの欠如に関連した、又はそれを特徴とした疾患の 大 きなクループの治療において適用を有することが予期される。そのような疾患の 典型は、糖尿病、肥満症、同化作用疾患、免疫学的疾患、心臓疾患、及び腎臓疾 患、同様に他に上述したものである。 実施例５ Dwarfラットへの(Leu24,Ala31)hIGF-1の長期間投与 緒言 先の実施例では、(Leu24,Ala31)hIGF-1に相当するＩＧＦ-レセプターよりむし ろIGFBPsに優先的に結合する分子を投与することの下垂体切除ラットにおける長 期間の効果を述べた。下垂体切除ラットは、それが下垂体ホルモンを欠くために 、非常に少ない血清ＩＧＦ-IレベルとIGFBPsの非常に少ないレベルを有する。Fi clderら，Endocrinology，137:1913-1920(1996)。しかしながらこれら内因性タ ンパク質の低いレベルにも関わらず、ＩＧＦ変異体は顕著な活性を示した。ＩＧ Ｆ変異体の活性を試験するため選択した次のモデルは、ＧＨとＩＧＦ-Iの両方に 応答する成長を示す、ＧＨ-欠乏dwarf(dw/dw)ラット(Charltonら，J．Endoer.， 1198:51-58(1998))とした。Skottncrら，Endocrinology，124:2519-2526(1989); Clarkら，Endocrine 3:717-727(1995)。dw/dwラットは、下垂体切除ラットであ るように全体的なＧＨ-欠乏ではなく、血清ＴＧＦ-IとIGFBPsのより高いレベル を有する。従って、dw/dwラットに与えたＩＧＦ変異体の投薬量は、dw/dwラット の血液がより大きなＩＧＦ結合容量とより大きなＩＧＦを含むことが予想された ことから、増加した。 下垂体切除ラット(実施例４)においてＧＨはＩＧＦとIGFBPのより大きな量を 生産するために与えられ、且つ外因性ホルモンの存在において試験した。この実 施例において、外因性ＧＨの添加は、これら外因性投与したホルモンの存在にお いてＩＧＦ変異体の活性を発見するために、外因性ＩＧＦ-Iの添加がされたよう に繰り返した。該実験の目的は、IGFBPsに良好に結合するがＩＧＦレセプターに 乏しく結合する分子を投与することの効果を発見することであった。 方法 動物： 若いメスのdwarrラット(11-12週齢、115-140g)は、ホモ接合のマッチングによ って繁殖され(Charles Rivers Laboratories)、ジェネンテック動物舎に搬入し 、それらはポリスチレンチップ上の５匹毎のケージに収容し、標準動物餌と水を 自由に採取させ、制御した温度と光と共に定常湿度の室内で飼育した。その動物 を秤量し、体重の統一性に基づき、３７匹の動物を選択し、処置群に任意抽出し 、等しい最初の体重(ほぼ120g)の６つの処置群を与えるようにケージ分けした。 実験群： 実験は、群当たり６又は７匹のラットを持つ６つの群からなった。 １）賦形剤コントロール 賦形剤注射 （賦形剤ポンプ） ２）ＩＧＦ変異体(IGF-M) 賦形剤注射 （ポンプによって120μg/日） ３）ＩＧＦ-Ｍ 賦形剤注射 （ポンプによって120μg/日） ４）ＩＧＦ-M(120μg/日) 賦形剤注射 プラスＩＧＦ-I(12μg/日) ５）賦形剤ポンプ hGH注射(50μg/日) ６）ＩＧＦ-M hGH注射(50μg/日) （ポンプによって120μg/日） ラットは８日間投薬した。 ホルモン： 変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1と固有配列組換えヒトＴＧＦ-Iは、KETAMINETM/XY LAZINETM麻酔で麻酔した間にそのラットの背部の首部位中の皮下トンネル中に配 した浸透性ミニポンプ(ALZET2001TM，A1za，Palo Alto，CA)により投与した。そ のポンプは、製造者の記載の通り(一日当たり24μｌの溶液)が輸送されると仮定 し、計算した一日投薬量が120μg(1mg/kg/日)となるように溶液で満た した。 組換えヒトＧＨ(50μg/日)は、100μl容量中25μｇの日に二度のｓｃ注射によ り８日間投与した。 rhGHの注射を受けない動物は賦形剤の注射を受け、且つＩＧＦ-Ｍを投与しな い動物は塩溶液充填ポンプ移植している。 測定： 体重は毎朝測定した。８日後、その動物をＣＯ2を用いて麻酔し、心臓穿刺を 経て放血した。残りの血液は凝血させ且つ血清を分離し、更なる分析用に保存し た。 脾臓、胸腺、心臓、肝臓、腎臓、及び腎周囲脂肪を取り出し、秤量した。その 脛骨を取り出し、骨端板の幅を組織学的に測定するために中性緩衝化ホルマリン 中で固定した。 血清化学はTECHNICON Chem 1 PLUSTM分析機により測定した。血消インスリン 濃度は、Linco社によって提供されたＲＩＡキットを用い測定した。ＩＧＦ-I濃 度を測定するため、血清を酸性エタノールを用いて抽出し、その上清を中性状態 まで希釈し、ＲＩＡによってＴＧＦ-Iを測定した。血清抽出液中のラットＩＧＦ -Iの濃度は、Diagnostic Systems Laboratories社からのキットを用いるＲＩＡ によって測定した。ヒトＩＧＦ-I濃度はジェネンテック社でＲＩＡによって測定 した。 頸骨は長手方向に分割し、トルエンブルーで染色し、顕微鏡のスライドガラス 上に搭載した。その頸骨の骨端板の幅は顕微鏡に接続した接眼マイクロメーター を用いて測定した。 データは１のファクターANOVAを用いる変数の分析、続いてDuncan's範囲試験 によって統計学的に分析した。 結果と考察 体重： 図１８は、該実験の８日間にわたる処置の体重増の効果を示す。該実験の７日 において、更なる１日間の実験を継続することを決定し、ｈＧＨの新たな調製物 を作製し且つ注射した。７日と８日の間の大きな体重増は、ｈＧＨのこの調製物 が０日と７日の間で使用したそれと異なることを示唆する。従って、７日につい てのｈＧＨ用の体重増テータは、８日でのそれよりも全般的な実験を良好に反映 する。これらのＧＨ-欠乏dwarfラットにおける予期された応答、ＩＧＦ-Iの注入 又はｈＧＨの注射の結果として体重における顕著な増加があった。それ自身によ って、ＩＧＦアゴニストは、６日での統計学的に有意なアプローチによってのみ の体重増と共に(賦形剤1.3±1.1g対ＩＧＦ変異体4.2±0.6g、p<0.10)、成長促進 活性の少ない量のみを示した。しかしながら、ＩＧＦ変異体がＩＧＦ-Iと一緒に 与えられた場合、始めに明瞭な重量増があり(一日目での賦形剤-0.6±0.8g、Ｉ ＧＦ変異体0.5±0.6g、ＩＧＦ-I 1.2±0.4g、ＩＧＦ変異体プラスＩＧＦ-I 3.3 ±0.8g、p<0.05対ＩＧＦ変異体とＩＧＦ-I単独)、しかしこの応答は経時と共に 衰えた。一方、ｈＧＨ単独とｈＧＨプラスＩＧＦ変異体の間の相違は経時に伴っ て増加し、５日で統計学的有意に達した(ｈＧＨ単独12.4±0.9g対ｈＧＨプラス ＩＧＦ変異体15.5±0.6g、p<0.05)。従って、ＩＧＦ変異体は全身成長について ｈＧＨの活性を増大した。これらの効果は成長曲線と最終体重において示した( 図１８)。 器官成長： 器官重量データは、脾臓(図１９)と腎臓(図２０)を説明する。各図において、 絶対器官重量がＡで示され(上部パネル)、体重のパーセンテージとして表した器 官重量をＢで示した(底のパネル)。 絶対脾臓重量(図１９Ａ)は、ＩＧＦ変異体で処置した全ての群で増加する傾向 にあった。例えば、賦形剤コントロールラットにおける脾臓重量(308±6mg)は、 ＩＧＦ変異体単独で処置することにより350±14mgに増加した(p<0.10対賦形剤) 。ＩＧＦ-I又はｈＧＨ処置のいずれか一方とＩＧＦ-Ｍの組み合わせもまた、よ り大きな脾臓を与える傾向にあった(図１９Ａ)。脾臓重量が体重のパーセンテー ジとして表される場合、ＩＧＦ変異体により生じた脾臓サイズにおける類似の増 加が見られた(図１９Ｂ)。 絶対腎臓重量と相対腎臓重量を図２０Ａと２０Ｂ中にそれぞれ示した。ＩＧＦ -I変異体に対する腎臓の応答は、脾臓のそれに似ていた。例えば、相対腎臓重量 は、ＩＧＦ変異体による処置により、特にそれがＩＧＦ-Iとの組み合わせにおい て与えられた場合に増加した(ＩＧＦ-I単独、0.85±0.3％対ＩＧＦ-IプラスＩＧ Ｆ変異体0.92±0.04％、p<0.05)。 腹膜後脂肪蓄積物は、屠殺時にラットから取り出し、秤量した。脂肪組織貯蔵 を減じるＩＧＦ変異体の傾向があった(プラシーボ0.56±0.09g、ＩＧＦ変異体0. 53±0.10g、ＩＧＦ-I 0.48±0.06g、及びＩＧＦ-IプラスＩＧＦ変異体0.43±0. 05g)。 血清化学とホルモン： 表Ｉは、屠殺時に採集した血清の分析から採集したデータを示す。ラットにお いて血中グルコースレベルについて各種の処置のいくらかの効果があったが、イ ンスリンレベルについて非常に顕著な効果があった。ＧＨの糖尿病誘発性作用が 、賦形剤処置コントロールに比較してＧＨ処置ラットにおける有意に増加したイ ンスリン濃度(p<0.05)によって示された。もし該ラットがＩＧＦ変異体と共-処 置されたならば、共-処置群における血清インスリンレベルが賦形剤コントロー ル群中のインスリンレベルと相違していなかったように、これは血清インスリン を増加する(ＧＨの糖尿病誘発性作用)。 表１ Ｄｗａｒｆラットにおける血清測定 データは平均±SEM、*p<0.05対賦形剤コントロール。 ＩＧＦ変異体(ＩＧＦ-Ｍ)は腎臓サイズを有意に増加した。腎機能の血清測定 の２つの目安、血清クレアチニンと血液尿素窒素(BUN)レベルは、ＩＧＦ変異体 によって減じられた。表Ｉは、血中のクレアチニン濃度がＩＧＦ-IとＩＧＦ変異 体の両方によってそれらが単独で与えられた場合、減少される傾向を示す；しか しながら、これらの効果は統計学的に有意ではない。しかしながらＩＧＦ-Iプラ スＩＧＦ変異体は、腎機能の改善の目安、血清クレアチニンを有意に(p<0.05)減 じた。腎機能の第２の目安、血液尿素窒素もまた、ＩＧＦ-Iによって及びＩＧＦ -IプラスＩＧＦ変異体によって減じられ、その組み合わせに関して、ＩＧＦ-I単 独のそれよりも有意に大きくなっている(p<0.05)。 ＩＧＦ-IプラスＩＧＦ変異体の組み合わせは、賦形剤コントロールに比べて血 液中の酵素ＡＳＴ(アラニンセリントランスフェラーゼ)とＣＫ(クレアチニンキ ナーゼ)の量を減じた(p<0.05)。ＡＳＴは、心臓のダメージと機能の目安であり 、ＣＫは骨格筋機能の目安である。これらのデータは、骨格筋と心筋に関してＩ ＧＦ変異体の有益な効果を示すとして解釈され得る。 骨の成長： 頸骨板幅は、賦形剤コントロールと比べ、ｈＧＨによって及びＩＧＦ-I処置に よって有意に(p<0.05)増加した。全てのケースにおいてＩＧＦ変異体は個別の処 置に比べて平均板幅を増加したが、これらの増加は統計学的有意には達しない。 血清ＩＧＦ-Iレベル： 血液中のＩＧＦ-Iのレベルは、２つのアッセイにおいて測定した(図２１Ａと ２１Ｂ)。一方のアッセイ(図２１Ａ)はラットＩＧＦ-Iの量を測定し、他方のア ッセイ(図２１Ｂ)は５つの処置群において血液中のヒト及びラットＩＧＦ-I(全 ＩＧＦ-I)の両方を測定した。これらのデータ(図２１Ａ)の著しい側面は、レセ プター-活性ＩＧＦ-I(内因性ラットＩＧＦ-I)の血液レベルが変異体ＩＧＦを与 えた動物においてより低く、さらにこれらの低い血液ＩＧＦ-Iレベルは、各種器 官と組織における顕著なＴＧＦ様応答と関連した。明らかに、それは、ホルモン の血液レベルが減じた場合、ホルモンの増加した活性の証拠が観測されることと 反対の認識である。 全ＩＧＦ-I用のアッセイ(図２１Ｂ)はラットとヒトＩＧＦ-Iの両方を測定する 。このアッセイにおいて、結合タンパク質へのＩＧＦ-Iアゴニストの結合とそれ 故に血液中に存在していることによると思われる、ＩＧＦ-Iアゴニストの150μ ｇを与えたラットにおける全ＩＧＦ-Iの上昇があった。血液中の全ＩＧＦレベル は、ＴＧＦ-I又はＧＨとＩＧＦアゴニストのいずれか一方の組み合わせを与えた ラットにおいて、これら組み合わせ処置群において低下したラットＩＧＦ-Iのレ ベルとは反対に上昇した。(p<0.05対ＩＧＦ-I単独又はＧＨ単独)。これは、ＧＨ がＩＧＦとIGFBPsを生成する場合、スペアの結合容量があり、この容量がＩＧＦ アゴニストによって部分的に満たされていることを示す。 結論 ＧＨ-欠乏dwarfラットにおけるこれらの長期間データは、下垂体切除ラットに おいて採集した長期間データを確証し拡張する；ＩＧＦ変異体は同化及び成長促 進作用を生産した。加えて、この実験は、ＩＧＦ変異体がＧＨと共に投与した場 合に成長促進活性を示すことを確証した。さらに、ＩＧＦ変異体がdwarfラット にＩＧＦ-Iと一緒に与えられた場合、そのＩＧＦ変異体は投与したＩＧＦ-Iの活 性を増加できた。それ故、本実験は、IGFBPsと緊密に結合するが、ＩＧＦレセプ ターに乏しく結合する化合物の長期間投与が、内因性ＩＧＦ-I、外因的に投与し たＧＨ、及び外因的に投与したＩＧＦ-Iの活性を増大できることを示す。 この実施例においていくつかの重量な知見は、下垂体切除ラットにおいて作ら れた発見を拡張することをもたらした。 第１に、ＩＧＦ変異体で処置したラットにおける腎臓の増加したサイズは、血 液中のクレアチニン及び血液尿素窒素の濃度における低下によって果たされた。 血液代謝におけるこれらの低下は、腎臓の増加した機能の特徴である。心筋と骨 格筋に関する機能効果の更なる証拠もまた与えられた。脂肪塊の減少の証拠はＩ ＧＦ変異体を用い得られた。これは、身体組成の制御における、特に肥満症のた めのＩＧＦの使用を示す。例えば、肥満症の予防又は治療へのＧＨとＩＧＦ-Iの 使用についての米国特許第5,597,797号を参照。 第２に、ＧＨの投与は、インスリンにおいてこの上昇が防止されたＩＧＦ変異 体の共-投与と同時に、インスリンの血液濃度を有意に増加した。それ故に、Ｇ Ｈのこの周知の糖尿病誘発性作用はＩＧＦ変異体の共-投与によって逆転できた 。 第３に、ＩＧＦ変異体へのこれらの応答は「活性」ラットＩＧF-Iの血液濃度 における低下の存在において生じた。 それ故、ＩＧＦ変異体の長期注入は、１）その血液中に検出不可能なＧＨと非 常に低いＩＧＦ-I濃度を有する下垂体除去ラット、２）その血液中に低いＧＨと 低いＩＧＦ-Iレベルを有するdearfラットにおいて複数の活性を示した。 実施例６ 糖尿病ラットへの(Leu24,Ala31)hIGF-1の長期間投与 この実施例において糖尿病の動物モデルは、ＩＧＦ変異体によって長期間処置 された。選択した動物はII型糖尿病ラット(Zucker糖尿病脂肪(ＺＤＦ)ラット)と した。このラットは、相対的に通常の脳下垂体機能(ＧＨ分泌に関して)と相対的 に通常の血清ＩＧＦ-I濃度を有する。従って、この動物モデルは、ＧＨの完全な 欠如(下垂体除去ラット)又はＧＨの明確な欠乏(dw/dwラット)及びＩＧＦ欠乏の 両方である先の２つのラットモデルとは異なる。加えて、この実施例において、 ＩＧＦ変異体の投与形態は、注入(先の２つの実施例で用いた)から複数注射まで 変えた。さらに、ＩＧＦ変異体の投薬量は、先に説明した通り、ZDFラットが下 垂体切除又はdw/dwラットのようにＩＧＦ欠乏でないこと及びそれ故に放出され るべき大量の活性ＩＧＦを有するために増加した。先の実施例において効力の目 安とするために用いた主要な終点は身体成長の目安であったが、本実施例におい て主要な終点は、動物の糖尿病段階の測定値、血中グルコースとインスリン濃度 とした。 先の実施例において、ＴＧＦアゴニストの一つの注射の急速な静脈内投与が、 １)インスリンレベルを減じた及び２）グルコースレベルを減じたことを示した 。ＩＧＦアゴニストの１つの注射が血糖値パラメーターについての効力を示し且 つ長期間の注入が効力を示した(成長パラメーターのタキフィラキシーなしに)こ とから、複数注射が有益な長期間累積血糖値効果に至る急性血糖値効果をその度 毎に示すであろうと仮定した。また、皮下的に与えた注射が効力を示すであろう と仮定した。それ故に、後述した糖尿病ラットにおける長期間実験を開始した。 方法と実験群： 動物： 肥満のオスZucker糖尿病脂肪質(ＺＤＦ)ラット(6-7週齢、225-250g、Genetic Models社、indianapolis,IN 46268)は、温度と光を制御した室内でグループ飼育 (3/ケージ)し、供給元で推奨した固形化ラット食餌(Purina 5008,6％ fat breeder chow)と飲み口からの水を自由に与えた。３日間の順応化の後、血液サンプルを ラット特異的ＲＩＡ(Linco Research社，St.Charles,MO)によって測定した、血 中グルコ ースとインスリンの測定のため尾の静脈から得た。動物は４つの処置群に任意抽 出し均等な最初の血中グルコースレベル、インスリンレベル、及び体重を有する ように群のバランスを与えるようにケージに入れた。 該実験は、群毎に７匹のラットを持つ４つの群からなった。 １） 一日３回賦形剤注射、 ２） ＩＧＦ変異体(ＩＧＦ-M)の注射(一日50μｇ三度) ３） ＩＧＦ-Ｍの注射 （一日150μｇ三度） ４） rhIGF-Iの注射 （一日150μｇ三度） 該注射はそれぞれ100μlで一日三度与えた。 ホルモン： 変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、一日三回の注射によって二つの濃度を与える( 総計450μg/日又は150μg/日)ように、二つの濃度(1.5mg/mlと0.5mg/ml)で調製 した。rhIGF-Iは、一日三回の注射によって一つの投薬量(450μg/日)を与えるよ うに一つの濃度(1.5mg/ml)で調製した。ラットの第４の群は賦形剤を与えた。そ れぞれ100μl容量の注射は、ビバリウム室の昼間の光を制御し混乱させることな しに１５日間、午前７時、午後１時、及び午後７時に与えた。体重は毎日午後１ 時に測定した。 血液サンプリング： 血液サンプルは、投薬する最初の日前の晩に、及び３日、７日と１０日に、非 断食ラットから採集した。３，７，及び１０日の血液サンプルは、昼間の注射の １時間後に尾の静脈から出血することによって採取した。その血液は凝固させ、 血清を分離し、分析の前まで保存した。 グルコース耐性試験は、実験の１４日目に実行した。ラットはその定例の朝の 注射を受けさせ、その食餌を取り上げた。3-5時間後、出血サンプル(400μl)を 尾の静脈を経て採取した。次にラットは腹腔内(ip)注射によって2g/kgブドウ糖( 50％)を受けさせた。血液サンプル(200μl)を、ブドウ糖投与の10、60、及び120 分後に尾の静脈を経て採取した。血液は凝固させ血清を分離し、グルコースとイ ンスリン濫度の測定まで保存した。グルコース耐性試験が完了した後、動物は再 度食餌を与えた。 １５目目、朝の注射の１時間後、ラットは二酸化炭素によって仮死状態とし心 臓穿刺によって放血した。血液は凝固させ、血清を分離し且つ凍結した。脾臓、 胸腺、心臓、肝臓、腎臓、及び腎周囲脂肪を取り出し、水気を切り乾燥し、直接 秤量した。 統計学的分析： 各時間点の統計学的比較は、Duncan's多重範囲試験による変数の分析によって 行った。<0.05のｐ値は統計学的有意であると見なした。全てのデータは、処置 群当たり７匹の動物による平均±SEMとして表される。 結果 時間に対してプロットした体重増が図２２Ａ中に４つの異なる処置群として示 される。１３日目の体重増は、コントロール(コントロール、93.3±2.9g)に対し 、50μｇでのＩＧＦ変異体(100±2.lg、p<0.05対コントロール)、150μｇでのＩ ＧＦ変異体(105.1±2.3g、p<0.01対コントロール)、及びＩＧＦ-I(114.5±1.6g 、p<0.0001対コントロール)において有意に増加した。ＩＧＦ変異体の体重につ いての投薬-関連同化作用は、先の実施例における下垂体除去及びdwaftラットに おけるデータで確証される。 これらの糖尿病動物において、体重増の理由は、その処置が動物の糖尿病状態 を改善したために同化作用ではなく間接的な作用ともされ得る。Carlssonら，J. Endocrinol.,122:661(1989)。データのこの解釈は、これら同じ動物における経 時による血中グルコースの変化を示す図２２Ｂにおける説明によって裏付けられ る。血中グルコースは、注射を始める前に測定し、その図はこの基本レベルから の変化パーセンテージを示す。図２２Ｂは、１０日で基礎の141±21％に達する まで賦形剤の繰り返し注射で処置したラットにおいて血中グルコースは堅実な上 昇を示す一方、この時点でＩＧＦ-Iの注射(一日150μｇ三度)は血中グルコース のこの上昇を大きく防止した(25±10％、p<0.001対コントロール)ことを示す。 50μｇでのＩＧＦ変異体の注射(84±20％、p<0.05対コントロール)及び150μｇ でのＩＧＦ変異体の注射(74±22％、p<0.05対コントロール)もまた、１０日目で のこれら糖尿病ラットにおける血中グルコースの上昇を遅らせた。より早い時点 で、例えば７日目で、高投薬ＩＧＦ変異体及びＩＧＦ-Iは血中グルコースの上昇 を抑制することで等しく有効であった。 図２３Ａと２３Ｂは、血中グルコースについてとインスリン濃度についてこれ らの糖尿病ラットにおけるグルコース耐性試験の効果を示す。グルコース耐性試 験は、模擬の食事として見なすことができる。そのラットは出血させ、次いで体 重の2g/kgでクルコースの腹腔内注射を与え、注射の後に再度出血させた。図２ ３Ａは、グルコース負荷試験の後２時間の血中グルコースの変化を示す。賦形剤 で処置した糖尿病ラットにおいて、血中グルコースは実質的に上昇した(105±21 mg/dl)。ＩＧＦ-Iによる処置は、血中グルコースのより少ない上昇を生じ(39±1 2mg/dl，P<0.05対コントロール)、同じくＩＧＦ変異体による処置(150μg，tid) もまた、この上昇を弱めた(59±11mg/dl,p<0.1対コントロール)。 ＩＧＦ-I又はＩＧＦ-変異体による処置の有益な効果の可能性のある理由は、 図２３Ｂ中に示したインスリンによって提供される。ＩＧＦ-Iで処置したラット において、50μｇでのＩＧＦ変異体(10.2±0.7ng/ml,p<0.05対コントロール)又 は150μg(10.6±0.6ng/ml，p<0.05対コントロール)で処理したラットにおいてな されたそれよりも、より多くのインスリン分泌がグルコース負荷試験への応答に おいて生じた(コントロール，8.1±0.6ng/ml対ＩＧＦ-I，12.2±0.7ng/ml、p<0. 01)。従って、ＩＧＦ変異体による長期処置は、グルコース負荷を処理する改善 された能力に関係した模擬の食事に応答して多くのインスリン分泌を与えた。 考察 糖尿病ラットへのＩＧＦ-変異体を長期間投与するこの実験は、血中グルコー スが内因性ＩＧＦ系を操作することにより制御され得ることを示す。多分、糖尿 病動物における改善されたグルコース制御の間接的なマーカー、及びグルコース 制御の直接の目安(血中グルコースとインスリン)、体重増は糖尿病状態の改善に おいてレセプター不活性分子のこのクラスの驚くべき有効性を示す。 本実施例において一日複数回の皮下注射はタキフィラキシーの徴候なしに１５ 日間与えられた。先の実施例においてこの分子の注入は、維持された同化応答を 生じた。従ってそれは、輸送の多くのルートとパターンが同様の効力を示すであ ろうことを合理的に仮定する。例えば、長い半減期を持つ分子の経口処方は、経 口又は他のルートによって運ばれた分子の半減期効力がより短くなるであろうよ うな効力となることが予期されるであろう。 実施例７ ＩＧＦ-Iと結合タンパク質を結合するためのファージ誘導化ペプチド 次の一連の実施例において、通例のα-アミノ酸は、中間体と最終生産物に言 及している場合には標準の１又は３文字アミノ酸コードによって記載され得る。 普通のα-アミノ酸は、ｍＲＮＡ指令の下でタンパク質に組み入れるそれらアミ ノ酸を意味する。標準の略字は、The Merck Indcx,10th Edition,pp Misc-2-Mis c-3中にリストされる。別の定義がない限りは、通例のα-アミノ酸は天然の又は アルファ炭素原子で"Ｌ"-立体配置を有する。もしそのコードが"Ｄ"によって先 行されたなら、これは通例のα-アミノ酸の反対の鏡像異性体を表示する。ノル ロイシン(Nle)とオルニチン(Orn)のような修飾した又は例外的なα-アミノ酸は 、米国特許庁オフィシャルガゼット1114 TMOG,1990年５月15日中に記載された通 り定義される。 上述したＩＧＦ変異体を用いる実験の結果に基づき、IGFBPとＩＧＦの相互作 用を抑制し、且つＩＧＦ-Iレセプターに全てではなく乏しく結合する、ペプチド 又は小さい有機分子のような他の分子が処理されている対象における活性ＩＧＦ レベルを増加するであろうことが予期される。加えて、別のクラスの分子、特に ペプチド又は小さい分子は、IGFBPsとＩＧＦ-Iの相互作用を抑制する又は防止す るためのそのような手法においてレセプター相互作用を包含したそれから離れた サイトでＩＧＦ-Iそれ自身結合し得るが、そのレセプターとＴＧＦ-Iの相互作用 ではない。 タンパク質のような標的分子に特異的に結合する及び測定可能なアフィニティ ーを持つペプチドは、バクテリオファージ被覆-タンパク質融合体を用いる結合 選択を経て多くの結合及び非結合ペプチドの最初のライブラリーから同定され得 る。Smith,Science,228:1315(1985);ScottとSmith,Science,249:386(1990);Cwir laら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:309(1990):Devlinら,Science,249:404(1990);W ellsとLowman,Curr.Opin.Struct.Biol.,2:597(1992)により再考された;米国特許 第5,223,409号。加えて、ファージを表示したタンパク質とペプチドの両方は、 変異誘発、選択及び増殖の繰り返しサイクルを通してアフィニティー-増幅され 得る。 特有の残基位置で配列において相違しているペプチドの文献は、合成オリゴヌ タレオチドを用い構築され得る。ペプチドは、特有のペプチド変異体をコードし ている一重鎖ＤＮＡゲノムをそれぞれ含み、ファージ被覆タンパク質(g3p又はg8 p)によって融合タンパク質として表示されるアフィニティー精製のサイクルの後 、固定化した標的分子を用い、個別のバクテリオファージクローンを分離し、そ れを表示するペプチドのアミノ酸配列をそれのＤＮＡ配列から推定した。 Ｉ．ペプチド-ファージライブラリーの構築 ＩＧＦ-I又はＩＧＦ結合タンパク質に結合でき得る能力を有している一連のペ プチド分子を同定するために、IGFBP-1又はIGFBP-3のような、18から20残基まで の範囲内の長さの、ペプチドのいくつかの多様なファージライブラリーを構築し た。このサイズのペプチドは、溶液中で良好に定義された構造を維持できるペプ チドの選択に好都合であるため選択した。このサイズの天然-アミノ酸ペプチド が2018-2020(即ち、2.6x1023から1.0x1026)変異体の潜在的な配列多様性を有す るために、そのような変異体の全てを構築し且つ試験することは実施できない。 その代わり、ある種の残基は、各ペプチドの中の、ジスルフィド結合又はベータ -ターンのようなペプチド構造の安定要因を与える又は促進することが予期され 得たものと固定し又は定常化した。 構造的な抑制又はフレームワークは、ファージに関するペプチドライブラリー 提示のため及び続いて、変異と選択を通しての結合アフィニティーの首尾の良い 増加のために予め使用されている。そのように構成されたフレームワークは、ペ プチドセグメントの安定な結合構造に好都合となり得る。類似体により、免疫グ ロブリンは、異なる抗原に結合できる異なるペプチドループ(CDR's，相補決定領 域)の多様性の提示のための安定な(及び保存された)構造フレームワークを提供 する。 ライブラリー構築用のテンプレートとして用いたのは、バクテリオファージＭ １３のg8pに融合した抗体認識可能(gD-tag)ペプチドを発現するプラスミド、pt4 .g8(完全なＤＮＡ配列を図２４中に示した)とした。このプラスミドはＤＮＡ複 製の単鎖及び二重鎖基点を含む。phoAプロモーターとSTII分泌-シグナル配列は 、「リンカー」ペプチド(下記の二重下線)、及びバクテリオファージＭ１３のg8 pの後ろにあるgDペプチド(下記の下線)の上流である： 幾つかのランダム配列ペプチドライブラリー(表ＩＩ)は、後述したオリゴヌク レオチドと共に、単鎖テンプレート規制変異誘発(Kunkelら，Methods．Enzymol. ,204:125(1991))を用い構築した。 表ＩＩ g8ディスプレイのための大きな自然ライブラリー Ａ．ベータ-ターン配列モチーフ 周知の三次元構造のペプチドの実施例は、ファージディスプレーによってエリ トロポイエチンレセプター(EPO-R)のためのペプチドアゴニストを選択した、Wri ghtonらによって与えられるWrightonら，Science,273:458(1996)。ペプチドGGTY SCHFGPLTWVCKPQGG(配列番号：３５)(二つのCys残基を接合しているジスルフィド 結合を有している)は、EPO-Rと結晶化した複合体において、二つのベータヘアピ ンのダイマーを形成する。Livnahら,Science,273:464(1996)。たとえ溶液中のこ のペプチドの非結合形の構造が報告されていないとしても、EPO-Rとの複合体中 のこのペプチドによって形成しされたベータ-ターン構造は、類似の構造が、CX2 GPX4C(配列番号：３６)型のペプチドによって形成され得たことを示唆した。 構築されたペプチドライブラリーの一つのタイプとして、該gDペプチドは、開 始プラスミドのそれから変化していない上流及び下流(「フランキング」)残基を そのままにしてある、モチーフCx2Gpx4C(配列番号：３６)により置換された。か くして、このライブラリーはファージ粒子上にディスプレーすることで定義され 、該ペプチドSGTACX2GPX4CSLAGSP(配列番号：３７)(ここでＸは20の天然L-アミ ノ酸の何れかを表す)は、該リンカーと上述したg8pに融合した。このライブラリ ーはオリゴヌクレオチドHL-300： (ここでＮはヌクレオチドA,G,C,及びＴの混合を示し、且つＳはヌクレオチドＧ とＣの混合物を表す)を用いて構築した。 補足のライブラリーは、該ペプチド及び／又はフランキング配列もまた任意抽 出することによって標的タンパク質との更なる相互作用を許すように構築された 。このライブラリーは、オリゴヌクレオチドHL-301： を用いることによってX4CX2GPX4CX4(配列番号：３９)型によって構築した。 Ｂ．ジスルフィド-ループモチーフ 多くの補足のペプチド構造が、与えられた標的タンパク質に結合するために生 産され得るため、ファージ-ディスプレーしたライブラリー中のペプチド配列モ チーフの他のタイプを試験することが望まれた。例えば、小さいペプチドの中の 単一ジスルフィド結合は、制限されない構造におけるよりも相対的により高い結 合アフィニティーを与える安定構造を支持し得る。Geysenら,Mol.Immunol.,23:7 09(1986):Woodら,Science,232:633(1986);Oldenburgら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,89:5393(1992);O'Neilら,Proteins,14:509(1992);McLaffertyら,Gene,128:29(1 993);Giebelら,Biochem.,34:15430(1995)。幾つかのペプチド-ファージライブラ リーは、それ故に、XmCXnCXk(配列番号：４１)型、式中m=4、n=10、及びk=4、又 は式中m=5、n=8-9、及びk=4-5、又はm=6、n=6-7、及びk=5-6、又はm=7、n=4-5、 及びk=6-7(配列番号：２８から３４)を構築した。これらのペプチドにおいて、 ジスルフィド結合はペプチド構造のための安定した抑制を形成すると予測される 。 これらペプチドライブラリー(表II参照)は、オリゴヌクレオチドHL-303： を用いて、X7CX4Cx7(配列番号：４２)、 オリゴヌクレオチドHL-304： を用いて、X7CX5CX6(配列番号：４４)、 オリゴヌクレオチドHレ305： を用いて、X6CX6CX6(配列番号：４６)、 オリゴヌクレオチドHL-306： を用いて、X6CX7CX5(配列番号：４８)、 オリゴヌクレオチドHL-307： を用いて、X5CX8CX5(配列番号：５０)、 オリゴヌクレオチドHL-308： を用いて、X5CX9CX4(配列番号：５２)、 オリゴヌクレオチドHL-309： を用いて、X4CX10CX4(配列番号：５４)、 として構築した。 Ｃ．非抑制ペプチド 非抑制ライブラリー(即ち、そのペプチド内に固定した残基を有さない)もまた 特異的結合物を生じている。ScottとSmith,Science，supra;Cwirlaら,Proc.Natl .Acad.Sci.USA,supra;Devlinら,Science,supra;Kayら,Gene,128:59(1993)。その ようなライブラリーは、非共有的な相互作用が結合及び／又は非結合形における 構造をさらに誘導し得ることから、それにもかかわらず、構築したペプチドを生 じ得る。X20(配列番号：５６)型の、非抑制ペプチドライブラリーは、オリゴヌ クレオチドHL-302： を用いて構築された。 II．多価(g8)ファージ結合選択 ランダム変異誘発反応の生産物は、エレクトロポレーションによってXL1-BLUETM 大腸菌細胞(Stratagene)内に形質転換し、M13K07(VieiraとMessing,Mcethods Enzymol.,153:3-11(1987))又はVCSM13ヘルパーファージ(Strataene社)と共に15- 16時間増殖することによって増幅した。最初の形質転換体の平板培養に基づいて 、ライブラリー毎の形質転換体の数はほぼ、ライブラリーHL-300が1.8x108、HL- 301が7.9x108、HL-302が5.0x108、HL-303が5.3x108、HL-304が5.6x108、HL-305 が5.0x108、HL-306が6.3x108、HL-307が4.5x108、HL-308が1.9x108、及びHL-309 が2.1x108であった。 IGFBP-1、IGFBP-3、及びＩＧＦ-Iは、製造元の指示を用い、タンパク質に対し て、切断可能ビオチン試薬、EZ-LINKTMNHS-SS-Biotin(Pierce)の1.5:1モル比に よってビオチン化した。 IGFBP-1、IGFBP-3、及びＩＧＦ-Iへの結合のためのペプチドの最初の選択は、 ほぼ1010ファージ/ml(100μｌ全量)のファージプールを用いて実行した。MAXISO RPTM96-ウェルのプラスチック板(Nunc)は、50mM炭酸ナトリウム緩衝液,pH9.6中 にNEUTRAVIDINTMブランドのアビジン(Pierce)の２μg/mlの溶液により４℃で一 晩被覆した。NEUTRAVIDINTM溶液を取り除き、該板を、50mM炭酸ナトリウム緩衝 液中にウシ血清アルブミンの5g/l、又はオボアルブミンの5g/l、又は即席ミルク の5g/lのブロッキング溶液と共に、室温で1-2時間インキュベートした。次いで ブロッキング溶液を取り除き、ビオチン化標的タンパク質の溶液を加えた。室温 で1-2時間後、その標的溶液を取り除き、その板をPBS/TWEENTM界面活性剤(PBS緩 衝液中0.05％のTWEEN-20TM)で十回洗浄した。 上述したライブラリーからのファージは次のようにプールした：プールＡはHL -300ファージ、プールＢはHL-301ファージ、プールＣはHL-302ファージ、 及びプールＤはHL-303,HL-304,HL-305,HL-306,HL-307,HL-308,及びHL-309ライブ ラリーからのファージからなる。ファージは、それぞれの標的によって被覆され たウェル、及びNEUTRAVIDINTMにより又はアルブミン、しかし標的をビオチン化 していない、により被覆されたコントロールウェルと共に、PBS／TWEENTM／アル ブミン／ビオチンの中に加えた。そのファージは室温で5-15時間結合することを 許した。そして、その板をPBS/TWEENTM緩衝液で十回洗浄した。 板に結合した残りのファージは、50mM ＤＴＴと室温で1-2時間インキュベート することによって溶離した。溶離したファージは大腸菌の中にトランスフェクト し、該ファージを増幅するために37℃で一晩増殖させた。 結合選択の第２及び第３のサイクルは、ストレプタビジン(0.1mg/mL)をビオチ ンと一緒にファージカクテルに含めたこと以外は、上記の通り実行した。アリコ ートをそれぞれの標的被覆した及びそれぞれのライブラリーとインキュベートし たコントロールウェルから採取し、希釈したファージの連続希釈液は標的への特 異結合の測定を実行した。その希釈したファージは、大腸菌細胞内にトランスフ ェクトし、コロニー計測のために平板培養した。 結合選択の第４のラウンドは、それぞれの標的タンパク質の２μg/mlで、又は アルブミンのみで直接被覆したMAXISORPTM板上で実行した。サイクル2-4におけ るファージ結合選択の結果を図２５に示した。 同じ開始ファージライブラリー(A,B,C,D)はまた、直接被覆したIGFBP-3に対す る結合選択のためにも使用した。この場合、MAXISORPTM96-ウェルプラスチック 板(Nunc)は、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中、IGFBP-3の２μg/ml溶液によ って４℃で一晩被覆した。その標的溶液を取り除き、さらにその板をウシ血清ア ルブミンの5g/Lのブロッキング溶液と室温で1-2時間インキュベートした。ファ ージは上記の通り板とインキュベートし、未結合ファージを洗い流した。結合し て残っているファージを20mM ＨＣｌと室温で１０分間インキュベートすること によって溶離した。その後、酸溶離ファージは1Mトリス-HCl,pH8.0の５分の１容 量によって中性化した。ファージは上述した通り、コロニー計測のためにトラン スフェクトした。 III．多価ファージクローンのスクリーニング(IGF-ブロッキングファージアッセ イ) ペプチド-ファージクローンは、大腸菌細胞とファージプールとを混合するこ と、及び抗生物質含有培地上で平板培養することによって分離した。クローンを 分離し、配列決定のために単鎖ＤＮＡを得るためにヘルパーファージ(上記の通 り)と培養した。結合IGFBP-3、IGFBP-1、又はＩＧＦ-I用に選択したペプチド配 列は、ファージミドクローンのＤＮＡ配列から推定した。そのようなクローンの 数は、それぞれ表ＩＩＩ−Ｖ中のペプチド配列により表示される。(以下の表中 、「SEQ ID NO:」＝「配列番号：」) 表ＩＩＩ g8ディスプレー、IGFBP-3選択からのペプチド配列 表ＩＶ g8デイスプレー、IGFBP-1選択からのペプチド配列 表Ｖ g8ディスプレー、IGFBP-3選択からのペプチド配列 そのようなペプチドファージクローンは、ブロックリガンド(IGFBPへのＩＧＦ -I)結合をするかしないかのいずれかの、又は選択したプールの多数の非結合又 は背景要貢のいずれかの特異な標的-結合ペプチドを表示できた。これらの可能 性の中から識別するため、ファージクローンは、ＩＧＦ-Iの存在又は不在におい てIGF13P-1又はIGFBP-3に結合する能力を試験した。 IGFBP-1又はIGFBP-3は、上記の通りMAXISORPTM板上に直接被覆した。クローン の培養からのファージは、ＩＧＦ-I(100nMの最終濃度)で混合し、そして固定化I GFBPと室温で１時間インキュベートした。そして、上記の通りその板を十回洗浄 し、ホースラディッシュペルオキシダーゼのヤギ抗ウサギ結合体と混合したウサ ギ抗ファージ抗体の溶液を加えた。室温で一時間のインキュベートの後、その板 は、色素の基質、o-フェニレンジアミン(Sigma)によって現像した。 その反応は2.5M Ｈ2ＳＯ4の1/2容量で停止した。490nmでの吸光度を分光プレー トリーダー上で測定した。 いくつかのIGFBP-3選択したペプチド-ファージクローンで示された滴定値は、 いくつかのファージ濃度でIGFBP-3への結合のためＩＧＦ-Iにより全てが抑制さ れた(図26と27)。これらペプチドはかくして、IGFBP-3上のＩＧＦ結合エピ トープを持つオーバーラッピングサイトを占有するように思われた。IGFBP-1選 択したペプチド-ファージクローンの滴定値は、それがいくつかのファージ濃度 でIGFBP-1への結合のためＩＧＦ-Iにより抑制されたことを示した(図２８)。補 足のペプチド-ファージクローンは、ＩＧＦ-Iと共に又はそれなしで、ファージ の低い濃度で、同じくスクリーンされた。 図２９は、上述した通り、ＨＣｌ溶離の１ラウンドに続いて、ＤＴＴ溶離の３ ラウンドから得られたいくつかのファージミドクローンのブロッキングアッセイ の結果を示す。各ケースにおいて、ファージミドクローンは5mlの培養容量にお いて37℃で一晩、単一のクローンから培養した。そのファージ粒子は、沈殿させ 、ＰＢＳ緩衝液の0.5ml中で再懸濁した。各ファージ溶液の50倍希釈液を、PBS/T WEENTM緩衝液で作製し、該ファージをIGFBP-3被覆したMAXISORPTM板上で100nM ＩＧＦ-Iとともにまたはそれなしでインキュベートした。図２９中に示した通り 、大部分のクローンは、たとえクローン4D3.11がこれら条件下でわずか5％抑制 したとしても、これらのファージ濃度でIGFBP-3への結合を、>40％抑制した。 図３０は上述した通りＨＣｌ溶離の３ラウンドから得たいくつかのファージミ ドクローンのブロッキングアッセイの結果を示す。各ケースにおいて、ファージ ミドクローンは、5mlの培養容量で37℃で一晩、単一コロニーから培養した。フ ァージ粒子は上記の通り調製した。このケースにおいて、図３０中に示した通り 、たとえクローン23A3.3と23A3.5がこれら条件下で約20％抑制したとしても、大 部分のクローンは、これらのファージ濃度でIGFBP-3への結合を>80％抑制した。 ファージ希釈の機能として(図26,28)、又はディスプレーしたペプチドの機能 として(図29-30)、ＩＧＦ-Iの一定濃度によってファージ結合が阻止される度合 いにおける変化は、いずれか一つの理論に制限されることなしに、それが(1)Ｉ ＧＦ-IとIGFBP-3上のペプチド結合エピトープの間のオーバーラップの度合、及 び／又は(2)ＩＧＦ-I対IGFBP-3に結合するためのファージディスプレーペプチド の相対アフィニティーを予測し得るために、興味深い。ここで試験した全てのペ プチド-ファージクローンがＩＧＦ-Iとの抑制の幾らかの度合を示したことか ら、エリア内にあるそれぞれのIGFBP-3上のペプチド-結合のためのエピトープが 結合したＩＧＦ-Iによって占有されたと思われる。ペプチドアッセイ(以下を参 照)はこの結論を裏付ける(即ち、ケース１)。一方、いずれか１つの理論に制限 されることなしに、幾つかのペプチドエピトープは、そのようなペプチドをディ スプレーしているファージ粒子が結合したＩＧＦ-Iによって立体的に排除される ためにエリアの中とすることができた可能性がある。 ファージ濃度の抑制の依存、及びファージクローンの中の違い(図26)は、ケー ス２を反映し得る。特に、IGFBP-3被覆した板に結合しているファージクローン は、IGFBP-3被覆した板への結合が高い及び低いファージ濃度での両方で(例えば 、ペプチドBP3-23及びBP3-24にそれぞれ一致する4C3.2、4D3.5)抑制したそれら ファージクローンが成すよりもIGFBP-3により、より高いアフィニティーペプチ ド(以下を参照)を生産することが明らかな低いファージ濃度でのみ(例えばペプ チドBP3-01-ox及びBP3-02-oxにそれぞれ一致する4D3.3、4B3.4)抑制した。 かくして、ファージ-滴定ブロッキングアッセイのこのタイプは、相対アフィ ニティー及びファージディスプレーライブラリーから得たペプチドの抑制効力を 予期するための手段として、全般的に有用とされ得る。 IV．IGFBP-3結合ペプチドの一価(g3)ディスプレー ランダム変異誘発、選択、及び増殖の連続したラウンドによってペプチド又は タンパク質配列のアフィニティー成熟は、ディスプレイしたペプチド又はタンパ タ質のコピー数が制限される場合、能率的に達成され得る。Bassら,Proteins 8: 309(1990)。そのようなアフィニティー成熟プロセスは、hGHのアフィニティー成 熟により示される。米国特許第5,534,617号。このケースにおいて、ディスプレ ーしたhGHのコピー数は、hGHの発現レベルを制限している、且つファージミド包 装と増殖のための野生型g3pを与えるためのヘルパーファージを用いている、バ クテリオファージ粒子のg8にではなくg3に、ディスプレーしたタンパク質を有効 することにより制限された。g8p上のファージデイスプレー化ペプチドのプール からより高いアフィニティーのペプチドの選択のために、２ラウンド 4g8ライブラリープール、４Ｂと４ＤからのペプチドｃＤＮＡｓは、一価ファー ジディスプレーのためのg3ベクターに転移させた。結合選択は、結合ファージの 酸溶離によって上述した通り、３つのラウンドで実行した。 選択の３ラウンドの後に得られたペプチド配列は表ＶＩ中に示される。２つの クローン、4B3.3と4D3.11は、選択したプール、及び初期に見られた、g8ファー ジ選択を支配した。第３のクローン3Ai.2は、g8と同一でない新規なペプチド配 列を表す。ファージ-ELISA競合アッセイにおいて、g3-4B3.3とg3-4D3.11クロー ンの外形上のアフィニティーは<100nMであり、しかしながら一致するペプチドは より弱い抑制を示した(以下参照)。 表ＶＩ g3ディスプレー、IGFBP-3選択からのペプチド配列 アフィニティー改善が、hGHのために記載した通り、反復の変異誘発、選択及 びペプチド-ファージライブラリーの増殖によって得ることができると予想され る。例えば米国特許第5,534,617号を参照。 Ｖ．ペプチドアッセイ ペプチドは、多数のファージ-誘導した配列に一致させて合成した。２つのCys 残基がそのペプチド配列中に見出されたケースにおいて、そのペプチドのジスル フィド(酸化した又は"ox"を付した)モノマー形を調製し且つ精製した。４つの Cys残基が見出されたケースにおいて、その{1-4,2-3}ジスルフィド形を調製及び 精製した。 IGFBP-1又はIGFBP-3を結合する又はＩＧＦ-I結合を阻止することのこれらペプ チドの能力は、以下のアッセイの１又はそれ以上で試験した。 Ａ．BIAcoreTM競合アッセイ(IGFBP-3バインダー用) ＩＧＦ-Iは、遊離結合タンパク質を測定するために、BIAcorcTM2000表面プラ スモン共鳴装置(BIAcore社，Piscataway，NJ)を用いて抑制アッセイ用デキスト ランチップ上に固定化した。ＩＧＦ-Iは上述した通りビオチン化し、更に固定化 したＩＧＦ-Iの400から800RU(応答単位)を与えるように結合されている(BIAcore 社)ストレプタビジンにチップを越えて注入した。そのＩＧＦ-Iは、それぞれの 時間経過にわたり検出可能な解離を示さなかった。ペプチドの連続希釈は、IGFB P-3の一定濃度(40nM)と混合した。室温で≧１時間インキュベーションの後、20 μＬのアリコートを、ＩＧＦ-Iチップを越えて20μL/分の流速で注入した。注入 に続いて、応答の読み取りを、ＩＧＦ-Iに結合したIGFBP-3の相対量を測定する ことで実行した。 その結果(図31-32)は、チップへのIGFBP-3結合の各ペプチドの抑制についての 投薬量-応答曲線を示す。特に、試験したIGFBP-3結合の最も有効なインヒビター は、ペプチドBP3-01-ox(ファージクローン4D3.3に一致)であり、且つこのペプチ ドの端を切り取った形態、BP15であった(表VII参照)。その表において、ジスル フィド結合は、それぞれの2-Cys含有ペプチドの２つのCys残基の間に形成される 。４つのシステインを含有しているペプチドのために、２つのCys*残基はジスル フィドを形成し、且つ残りの２つは第２のジスルフィドを形成する。これらペプ チドは、それぞれ２μＭと0.75μＭのIC50'sを示した。BP3-4D3.11のような他の ペプチド(g8ディスプレーからのファージクローン4D3.11とg3ディスプレーから の3Bi.1)は、<10μＭのIC50'sを持つ抑制を示した。 IGFBP-1は、この手法において固定化したＩＧＦ-Iに対する結合を示していな い。 表ＶＩＩ 合成ペプチドによるIGFBP-3へのＩＧＦ-I結合の抑制nH2は、そのペプチドがアミドで阻止されていることを意味し、Ｃ*はそのペプチ ド中の別なシステインに結合しているシステインを示す。 Ｂ．平板培養アッセイ １．ビオチン-ＢＰアッセイ(IGFBP-1バインダー用) IGFBP-1結合の抑制のため、IGFBP-1を上述した通りビオチン化した。MAXISORPTM 板を、２μg/mL ＩＧＦ-Iを用いて上述した通り被覆し、且つブロック化した 。分離板において、ペプチドの連続希釈をビオチン化IGFBP-1の一定濃度(20nM) と予備混合した。20分後、室温で、その混合物をＩＧＦ-I板に加えた。次いでそ のペプチド／IGFBP混合物を取り出し、0.05％ TWEEN-20TM界面活性剤を含むＰＢ Ｓ緩衝液で十回洗浄した。結合したビオチン-IGF13P-1は、ストレプタビジン-結 合したホースラディッシュペルオキシダーゼ、及び色素の基質を用いて検出した 。 IGFBP-1抑制アッセイの結果(図３３と３４)は、ペプチドbp1-01とbp1-02(表VI II)が、それぞれ約0.18と0.05μＭのIC50'によりIGFBP-1結合を抑制したことを 示す。一方、IGFBP-3選択体BP3-01-oxは、IGFBP-1結合の僅かな又は抑制のない ことを示した。反対に、bp1-01とbp1-02は、このアッセイにおいてビオチン化IG FBP-3を抑制しないことを示した。Cys残基がセリンに変化したbp1-01変異体は、 10μＭよりも大きなIC50を示した。 表ＶＩＩＩ 合成ペプチドによるIGFBP-1へのＩＧＦ-I結合の抑制 ２．放射能標識ＩＧＦアッセイ(IGFBP-3バインダー用) ペプチド活性の補足のアッセイとして、幾つかのペプチドを、実施例1(アッセ イ３)中に記載した通り、IGFBP-1結合の抑制を測定するために125-Ｉ標識ＩＧＦ -Iを用いるアッセイにおいて試験した。ペプチドの連続希釈液は、IGF13P-1又は IGFBP-3板に加えた。その後、125-I標識ＩＧＦ-Iを加え、その板を２時間インキ ュベートした。次いで、その板を洗浄し、結合したＩＧＦ-Iの量を測定するため 計測した。 図３５は、IGFBP-3板へのＩＧＦ-I結合において、二つのIGFBP-3選択ペプチド 、bp3-01-oxとbp3-02-oxの抑制を示す。反対に、これらのペプチドはIGFBP-1被 覆した板へのＩＧF-I結合を抑制しない(図３６)。 Ｃ．インビトロ活性化(KIRA) ＩＧＦ-I結合を阻止すること及び機能性ＩＧＦ-Iを放出することの幾つかの合 成ペプチドの能力は、実施例１に記載した通り、ＩＧＦ-I活性のKIRAアッセイに おいて試験した。細胞は、ＩＧＦ-I単独、ペプチド単独、ペプチドプラスＩＧＦ -I、ＩＧＦ-Iプラス結合タンパク質(IGFBP-1又はIGFBP-3)、又はＩＧＦ-Iプラス 結合タンパク質(IGFBP-1又はIGFBP-3)とペプチドにより試験した。 その結果(図３７)は、ペプチド単独は活性を有さないことを示す。更に、ＩＧ Ｆ-Iと混合した場合、そのペプチドはＩＧＦ-I活性を顕著に変えない。ペプチド BP-01-oxもまた、ＩＧＦ-IプラスIGFBP-1又はIGFBP-3と混合した場合にＩＧＦ-I 活性に付いて顕著な作用は示さない。しかしながら、ペプチドbp1-01とbp1-02の 両者は、それぞれ397nMと187nMのIC50'sによって、IGFBP-1によるＩＧＦ-I活性 の抑制を阻止することを現した。これらペプチドはＩＧＦ-IとIGFBP-3による活 性は何れも示さない。 加えて、IGFBP-3ペプチドBP15は、KIRAアッセイの活性化をもたらすIGFBP-3: ＩＧＦ-I(3:1比で)とインキュベートし、IGFBP-3の阻止はBP15用の95μＭのIC50 と共に生じた。それは、これが1:1比によって30μＭまで低下するであろうと確 信される。 Ｄ．BIAcoreTM競合アッセイ(IGFBP-3バインダー用) ＩＧＦ-IIは、遊離結合タンパク質を測定するためにBIAcoreTM2000表面プラス モン共鳴装置(BIAcore社，Piscataway，NJ)を用いる抑制アッセイ用のデキスト ランチップ上に固定した。ＩＧＦ-IIは、上述した通りビオチン化し、更に固定 化したＩＧＦ-IIのほぼ1500RUを与えるよう結合されているストレプタビジン(BI Acore社)をチップを越えて注入した。そのＩＧＦ-IIは、各実験の時間経過にわ たり検出可能な解離を示さなかった。ペプチドの連続希釈液は、IGFBP-3の一 定濃度(20nM)と混合した。室温で≧一時間のインキュベーションの後、20μｌの アリコートを、ＩＧＦ-IIチップを越えて20μl/分の割合で注入した。その注入 に続き、応答の読み取りを、ＩＧＦ-IIに結合したIGFBP-3の相対量を測定するこ とによって行った。 その結果(例えば、図３８を参照)は、ＩＧF-IIへのIGFBP-3結合の各ペプチド の抑制のために投薬量応答曲線を示す。ペプチドbp3-01-ox，BP14，BP15，及びB P17は、それぞれ0.92μＭ、1.0μＭ、0.78μＭ、及び5.1μＭのIC50'sを示した 。 実施例８ ペプチドbp1-01のＮＭＲスペクトル 1Ｈ ＭＲデータは、6.7ミリモルの濃度で、30℃及びpH5.2でＨ2Ｏ溶液中のペ プチドbp1-01について採集した。図３９の一次元ＮＭＲスペクトルの生成のため に、全量5.0mgの生成したペプチドを、スペクトロメーターのフィールド周波数 ロック用の7％(v/v)2Ｈ2Ｏを含む440μｌＨ2Ｏに溶解したそのサンプルのｐＨは 、1N ＮａＯＨの３μｌの添加によって５．２に調整した。３２トランジエント からなるスペクトルが、5-mm三重軸パルス化-フィールド勾配プローブを装備し たBRUKER AMX-500TMスペクトロメーター(500.13MHzの1Ｈ周波数)で採集された。 化学シフトスケールは、4.75p.p.m.での水共鳴に関して百万分の一部である。水 共鳴は、励起スカルプティング法によって抑制した。HwangとShaka,J.Magn.Reso n.,112A:275-279(1995)。 図３９の一次元スペクトルに加えて、二次元二重量子濾過相関分光法(2QF-COS Y)、トータル相関スペクトル(TOCSY)、及び回転フレームOverhauser効果スペク トル(ROESY)を採集した。その実験は、パルス化フィールド勾配を2QF-COSYにお いてコヒーレンス選択用に用いたこと(van Zijlら，J．Magn.Reson.,113A:265-2 70(1995))、及び励起スカルプレィングをTOCSY及びROECY実験において水共鳴を 抑制するために(HwangとShaka，supra)用いたことを除いて、"Protein NMR Spec roscopy,Principles and Practice"(Academic Press,San Diego:ISBN 0-12-1644 90,1995)中、Cavanaghらによって記載された通り記録した。2Ｈ2 Ｏ中のペプチドの凍結乾燥と溶解の後、35℃パルス混合(Cavanaghら，supra)に よって2-D ROESYスペクトル(Cavanaghら，supra)とCOSYスペクトルを得た。完全1 Ｈ共鳴割当ては、標準的な方法によりこれらデータから得られた。"NMR of pro teins and nucleic acids"中、Wuethrich(John Wilcy & Sons,New York:ISBN O- 471-82893-9,1986)。 bp1-01のための定義の明確な三次元構造の証拠は、以下のものから得られた： １）一次元スペクトルにおける共鳴位置(図３９)が、非構造ペプチドにおいて置 きしたそれとは顕著に相違した。例えば、アミドプロトンは8.73-6.64p.p.m.の 範囲に及び(構造未定ペプチドは8.50-8.00p.p.m.の範囲内である)；そのメチル 基は、次の非構造分子(0.90-0.85p.p.m.)のため低い化学シフトにある(Leu6の0. 82p.p.m.、及びLeu9の0.66,0.59p.p.m.)。２）アミドとアルファプロトン間のス カラーカップリング定数(2QF-COSYから得た)は、非構造ペプチドにおいて観測し た平均化した値とは異なった。Gln7、Trp8、Cys10、Glu11とPhe14についての5.5 Hzより低いその値は、これら残基のヘリックススパンニングの表れである。Leu6 、Tyr13、及びPhe14で観測された8.0Hzより大きなその値は、これらの領域にお いて拡張した構造の表れである。スカラーカップリング定数は、COSY-35スペク トル中のアルファとベータプロトン間でも測定された。これらのデータは、Cys1 、Gln7、Trp8、Cys10、Tyr13、及びPhe14の側鎖がchi-1角に固定していること、 即ち、これらの側鎖が非構造ペプチドに集合されるchi-1回転異性体の範囲の見 本を示さないことを示す。３）ROESYスペクトル中のピークは、最初の配列中に 近接していない残基間に多くプロトン-プロトン接触(＜５Å)のあることを示す 。これらは、もしそのペプチドが良く定義された構造の中に折重されるならば、 それのみで生じることができる。最初の配列中の位置ｉとi＋3での残基間の接触 は、この領域中のヘリックスの存在と一致する、Leu6とTyr13間で優勢である。 多数の接触が、そのヘリックスの一面に沿うミニ-疎水性コアの存在を示す、三 つの芳香族側鎖(Trp8、Tyr13、及びPhe14)と、ロイシンメチル基(Leu6とLeu9)と の間で観測される。 そのＮＭＲデータは、bp1-01構造の三次元モデルを決定するために使用され得 た。二面角抑制は、適切なKarplus相関関係を経てアミド-アルファとアルファ- ベータスカラーカップリング定数から得られた。Karplus,J.Phys.Chem.,30:11-1 5(1959)。ディスタンス抑制は、ROESYスペクトルにおいて通過-空間相互作用を 表したプロトンの間に誘導した；上の界のサイズ、及び上の界への修正は、ピー クの重複又は共鳴の縮重が、Skeltonら,Biochemistry,33:13581-92(1994)によっ て記載された通りであることが原因である。これらの抑制は、AMBER全原子力場 を用いてプログラムDiscover(MSI，San Dicgo)によって抑制した分子運動により 連続的に精製した、プログラムDGII(Havel,Prog.Biophys.Mol.Biol.,56:43-78(1 991))を用いて構造のファミリーを産生するために用いた。Weinerら，J.Comput. Chem.,7:230-252(1986)。その得られた構造は、単一グローバル折重に集中した( Ｎ，C-アルファ、及び残基4-14のカルボニル炭素の0.37Åの平均構造からの平均 二乗根偏差の平均)。最良の25構造(入力抑制の最小の妨害)は非常に良好な入力 データに一致し(0.1Åより大きい間隔抑制妨害が無く、更に1.4度より大きい二 面角角度妨害のない)、且つプログラムPROCHECKTMによる判定としての幾何図形 的配列を良好に共有していた。Laskowskiら，J．Appl．Cryst.，26:283-291(199 3)。 総体の典型的なメンバーは、図40Aと40B中に示した。PROCHECKTMの中のKabsch とSander二次構造アルゴリズムに従って、bp1-01はPro5-Leu6(Ｉ型)とGln7からL ys12間でのアルファヘリックスを中心においた逆ターンを含む；Leu6とTyr13は 、主ヘリックスの延長である。残基Cys1、Arg2、Ala3、及びGly15は、ＮＭＲに よって良好に表されず、残基Gly4からPhe14よりも溶液中でよりフレキシブルと され得る。図40Aと40Bは、Trp8、Tyr13、及びPhe13の芳香族環が、そのペプチド の一方の面上に、相対的にフラットな疎水性の面を形成するように、Leu6、Leu9 、及びLys12の脂肪族部分にパックされる。このパッキングは、そのヘリックス の周期性(Leu6、Leu9、及びTyr13を一緒に持っている)、Trp8のchi-1角(＋60度 の該chi-1、このアミノ酸に相対的に独特の、Leu9上にパックすることをTrp8に 与える)、及びPhc14のペプチドバックボーンの拡張した本質(Leu9への折り返し のためのPhe14の側鎖を与える)によって達成される。 たとえbp1-01が何れかの条件下で自己会合の傾向があるとしても、その三次元 構造は、そのような分子間相互作用により安定化されない。ヘリックスの中へ の疎水性パッキングは、その折重の安定性を疑いなく付与する。Cys1とCys10間 のジスルフィド結合はまた、構造と機能のためにも重要である。システイン残基 の両方がセリンによって置換されるペプチドは、IGFBP-1へのより減じられたア フィニティーを有し(実施例７を参照)、且つbp1-01によってディスプレーした構 造がその機能付与のために重要であることを示唆する、1-又は２-次元ＮＭＲス ペクトルにおけるヘリカルの又は他の安定な構造の証拠を提示するものでない。 何れか一つの理論に制限されること無しに、一つの可能性は、逆ターン(Pro5-Le u6)及びジスルフィド結合が、ヘリックス(Glu11-Phe14)の第二のターン中に残基 を含んでいる疎水性側鎖-側鎖接触によって普及される、ヘリックスの第１のタ ーン(Gln7-Cys10)を開始することを助けることである。 図４０中に示したbp1-01の構造は、IGFBP-1に結合することができ、それによ って活性ＩＧＦ-Iのレベルを増すペプチドにおけるその手法のための幾つかの可 能性を示唆する。１)bp1-01モノマー中のLcu6、Lcu9、Trp8、Tyr13、及びPhe14 の側鎖により形成したフラットな疎水性表面は、IGFBP-1の露出した疎水性領域 上にパックし得る；このケースにおいて、ヘリックスはIGFBP-1によって認識さ れた鍵となる構造特徴である ２）BP-1は、該ヘリックスの疎水性表面以外の幾 つかの部分、例えば該ヘリックスに先行する５つのＮ末端残基、又はこれらの残 基と、疎水性側鎖から離れたヘリックスの面との組合せ、を認識し得る。このケ ースにおいて、該ヘリックスは、該ペプチドのどこか他の場所でIGFBP-1-結合の ために適切な幾何図形的配置を組み立てるための骨格として、一層重要となされ 得る。３）bp1-01は、凝集した形態においてIGFBP-1に結合し得る。ヘリックス の疎水性面(Leu6、Trp8、Leu9、Tyr13、及びPhe14)を経てbp1-01の自己-会合の 可能性を与えた、該ペプチドの幾つかの他の領域は、IGFBP-1接触において含ま れるであろう。このケースにおいて、そのヘリックスと、それらの間の接触は、 IGF13P-1-結合領域を提供するための骨格として作用するであろう。 下記は、図３９中に示される典型的な構造のための座標である(標準的なタン パク質データベースフォーマット)。 寸評 BP1-01 ＩＧＦ-I-結合タンパク質結合ペプチド 寸評 ＮＭＲ-誘導した抑制によって計算した総体 寸評 からの典型的な構造 実施例９ (Leu24,Ala31)hIGF-1を用いるIGFBPsからのＩＧＦ-Iの移動 この実施例は、上記動物実験において使用したＩＧＦ変異体(Leu24,Ala31)hIG F-1が、ヒト血清中に存在するIGFBPsからＩＧＦ-Iトレーサーを移動できること を示す。 該ＩＧＦ-I変異体がヒト血清中に存在する内因性IGFBPsからＩＧＦ-Iを移動で きるであろうことを測定するために、以下の実験を実行した。放射能標識したrh IGF(125I-IGF-I)は、125I-IGF-I:IGFBP複合体の形成を許すために、４℃で16時 間、33ng/mlの濃度で通常のヒト血清サンプルとインキュベートした。複合体形 成に続き、ＩＧＦ変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1(40μg/ml)を、0,0.5,3,又は16時 間でそのインキュベーションに加えた。そのサンプル(n=3)は、次いで125I-IGF- I:IGFBP複合体の相対的なサイズと量を測定するために、FPLCサイズ-排除クロマ トグラフィー(FPLC-SEC)によって分析した。 図４１は、通常のヒトからの血清中に存在する内因性IGFBPsから125I-IGF-Iを 移動するためのＩＧＦ変異体の能力を示すクロマトグラムである。データはフラ クション毎のｃｐｍ(n=1)として表した。この実験は三回繰り返し、定量化し、 そして表ＩＸ中に提示した。 表ＩＸ 通常のヒト血清中の内因性IGFBPsから125I-IGF-Iを移動するためのＩＧＦ変異体 の能力示すFPLC-SECデータの定量化* * データ(平均±SD，n=3)は、三つの分子量範囲の全てにおける全放射能によっ て、各分子量範囲における放射能の量を割ることによって計算した、全放射能の パーセントとして表される。 125I-IGF-Iと通常のヒト血清との16時間のインキュベーションの後、放射能の ３つのピークがFPLC-SECに続いて観測された(図42)。これらのピークは次の125I -IGF-I複合体と一致するように思われる：〜150kDa(125IGF-I:IGFBP-3:ALS)；〜 44kDa(125I-IGF-I:IGFBPs1-4)；〜７kDa(遊離125I-IGF-I)。図42中に見ることが できる通り、該血清へのＴＧＦ変異体の添加は、125I-IGF-I:IGFBP複合体に結合 した125I-IGF-Iの減少と遊離125I-IGF-Iの量の増加の結果を生じた。これらの結 果は、上記の表において概要される。その125I-IGF-Iは、〜150kDa125I-IGF-I:I GFBP複合体よりも〜44kDaから、より容易にディスプレーされ、低分子量IGFBPs に結合したＩＧＦ-Iがより生物学的に利用可能な形態であることを示唆する。こ れらのデータは、ＩＧＦ変異体が通常のヒト血清中に存在する内因性IGFBPsから ＩＧＦ-Iをディスプレーする能力を有することを明確に示し、従ってヒトにおい てインビボで活性化とされるものと思われる。 結論において、この証拠は、ラットにおいて示されているヒトにおいて活性を 示す変異体の特質の分子を予期するであろう。 実施例１０ BP15を用いるIGFBPsからのＩＧＦ-Iの移動 この実施例は、ヒト血清中の125I-IGF-Iの結合を阻止するそれの能力について 、IGFBP-3-特異的ペプチド、BP15を試験する。ヒト血清は、125I-IGF-I±そのペ プチドと共にインキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィーを通してIGFBPs に結合したトレーサーの量を測定した。ペプチドの添加は、150-KD IGF/IGFBP-3 /ALS複合体と結合した125I-IGF-Iのほぼ42％の減少及び遊離125I-IGF-Iの量の59 ％増加の結果を生じた。そのペプチドは44-KD IGFBPsを減少せず(実際、それを わずかに増加した)、該ペプチドがIGFBP-3への結合のためにＩＧＦ-Iとのみ競合 することを示している。 これらの結果は、その類似物が(0.2mMで)ヒト血清中でIGFBP-3への結合のため にＩＧＦ-Iと競合できることを示す。 実施例１１ ヒトＩＧＦ-Iによるヒトの治療 この実施例は、内因性ＩＧＦｓを移動するためのIGFBPs作用の１又はそれ以上 に結合する化合物をどのように外因的に投与するか、及びヒトにおいて使用する ためにＩＧＦアゴニストをどのような投薬量とするかの原理を示す。 この実験において、ヒトII型糖尿病に、１２週間、４つの投薬量(10,20,40又 は80μg/kg)で一日二回の注射によって、組換えヒトＩＧＦ-I又はプラシーボを 投与した。血液サンプルは、治療の前、２週間毎に、及び治療の１２週後(Ep)で 採血した。ＩＧＦ-I、ＩＧＦ-II、及びIGFBP-3の濃度を、ＩＧＦ-IIがＩＧＦ-I の10μg/日で治療した患者から採取したサンプルにおいて測定していないことを 除いて、全てのサンプルで測定した。 図４３は、患者の血中ＩＧＦ-Iの濃度を示す。予期されない知見は、ＩＧＦ-I の40と80μｇの投与の「プラトー」効果であった；ＩＧＦ-Iの同じ全血中濃度は これら２つの投薬量で到達された。 図４４は、患者の血中ＩＧＦ-IIの濃度を示す。ＩＧＦ-Iの上昇しているレベ ルに対し、ＩＧＦ-IIのレベルはＩＧＦ-I濃度における上昇に対して大部分がマ イナーなイメージパターンで落下した。上昇しているＩＧＦ-I濃度のプラトー化 のように、落下しているＩＧＦ-II濃度もまたプラトーに達した。 図４５は、患者の血中IGFBP-3濃度を示す。血中ＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIのパター ンにおける明瞭な変化に対して、IGFBP-3の濃度は変化の統計学的に有意な又は 明確なパターンは示さなかった。 図４３と４４の精査は、全ＩＧＦ濃度(ＩＧＦ-IプラスＩＧＦ-II)が治療に伴 いほとんど変化無く示されたことを明らかにする。これは、ＩＧＦ-IIの濃度の 落下に密接に適合したＩＧＦ-Iの濃度における上昇のためであった。３つの図の 全ての精査は、患者の血中ＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIの濃度における投薬量関連変化 が、減少したIGFBP-3結合タンパク質容量に伴って起こるものではないことを示 す (IGFBP-3は血中の主要な結合タンパク質である)。 ＩＧＦ-IIの濃度における落下、及びＩＧＦ-IとＩＧＦ-II濃度のプラトー化の ための以前の説明は、ＩＧＦ結合タンパク質容量の限定された量があること、及 びこの実験において使用したＩＧＦ-Iの投薬量は、結合タンパク質からＩＧＦ-I Iの投薬量に関連した移動の原因となったことである。 それは、活性ＩＧＦのレベルを増すための能力を持ついずれかの分子がこの実 施例においてＩＧＦ-Iで示されたそれらと類似した活性を示すであろうことを予 期するこの実施例中の観測の論理的な拡張である。加えて、使用したＩＧＦ-Iの 投薬量及び示されたIGFBPとＩＧＦ-I及びＩＧＦ-IIの濃度から、それは活性の内 因性ＩＧＦのレベルを増加するためにどのようにＩＧＦアゴニストを与えるべき かを計算するために簡単である。ＩＧＦ-Iに関するモルサイズ、IGFBPのための ＩＧＦアゴニストのアフィニティー、及びそれの生物学的利用能は、ヒトにおけ る活性ＩＧＦが増加したその投薬量に至ることを考慮して他の可変のものとされ るであろう。 実施例１２ bp1-01の構造／機能及びアフィニティー成熟 Ａ．IGFBP-1へのbp1-01結合の運動 bp1-01ペプチド変異体の運動は、デキストランチップにEDC/NHS(作製により記 載した通り)を経て共有結合したIGFBP-1を用いるBIAcoreTM(Biacore社，Piscata way，NJ)アッセイで検査した。ペプチドbp1-01(配列番号：１５)は、あまりに急 激なので測定できない解離運動を表示した。しかしながら、bp1-02、19-マー変 異体(配列番号：１６)は、測定可能な運動を表示した。その会合率定数は2.30x1 05M-1sec-1であり、解離率定数は5.03x102sec-1であった。その後者は、ほぼ28 秒のIGFBP-1からペプチド解離の半減期を含む。その会合率定数は、該ペプチド がIGFBP-1への結合について顕著な構造変化を受けていないとの見解に一致する 中度の速さである。 Ｂ．bp1-01ペプチドの変異誘発スキャンニング 合成ペプチド変異体の２つのシリーズがbp1-01ペプチドの側鎖がIGFBP-1結合 に直接寄与し得たことを測定するために作製された。第１のシリーズにおいて、 アラニン-スキャンニングアプローチ(CunninghamとWells，Science，244:1081-1 085(1989))は、ベータ炭素に属する各側鎖部分を取り除くために使用した。IGFB P-1への該ペプチドの結合の遊離エネルギーに対するこれら原子の寄与は、IGFBP -3のために記載したそれに類似した(実施例７参照)、BIAcoreTM競合アッセイに おいてＩＧＦ-I又はＩＧＦ-IIへのIGFBP-1の結合を抑制するための該変異体の効 果(IC50)を測定することによって評価した。その結果を表Ｘ中に示した。 作製したペプチドの第２のシリーズは、アルファ炭素で加えられたメチル基の ような他の構造的特徴又はアイソマー(Ｄ-アラニン)であろうとなかろうとプロ ーブのための非天然アミノ酸の使用がIGFBP-1へのペプチドの結合に影響を及ぼ すことができた。これらのペプチドの有効性は、表ＸＩ中に示した結果とともに 、ビオチン化IGFBP-1 ELISAアッセイによって測定した。これらの結果は、IGFB P-1へのbp1-01の結合において側鎖L6,L9,W8,及びY13の重要性を確証する。構造 寄与はまた、R2とA3での置換の効果によって示唆された。 一方、G4,Q7,E11,K12,及びF14でのaib置換のような幾つかの置換は、結合アフ ィニティーについてわずかしか又は効果がない。これら置換体の１又はそれ以上 を含むペプチドは、非天然アミノ酸が、蛋白分解に対して大きな抵抗性のペプチ ドをしばしば与えるために、それにも関わらず有用となり得る(Schumacherら,Sc ience,271:1854(1996)とその中の参考文献を参照)。そのようなペプチドは、天 然アミノ酸のみを有するそれよりもより長い血清中の半減期を達成し得る。 表ＸＩ中に示した結果に鑑みて、bp1-01の位置2,3,又は６で置換されたＤ-ア ラニンを持つ又は位置7,8,9,11,12,13,又は14でアルファ-アミノイソブチラート 置換を持つペプチドは、インビトロでの細胞培養アッセイにおいてＩＧＦ-Iの利 用能を増加するであろうことが予期される。 最後に、各種のＣ末端bp1-01変異体の相対アフィニティーは、表ＸＩＩ中に示 した通り、ELISAによって測定された。これらのデータは、該ペプチドのＣ末端 領域が結合のために重要であることを示す。ペプチドbp1-18(配列番号：１０４) のみは、IGF-I:IGFBP-1結合のための測定可能な抑制的活性を保有した。そ れは、このペプチドがインビトロでの細胞培養アッセイにおいてＩＧＦ-Iの利用 能を増加するであろうことを予期させる。 一緒に採取した、その構造-機能データは、より小さな、非ペプチドを含む化 合物が、側鎖L6,L9,W8,及びY13との組み合わせにおけるこのペプチドのＣ末端の 構成要素を含むことによる該bp1-01ペプチドの効果を真似るように設計され得る 。 表Ｘ BIAcoereTMによるbp1-01 Ala-スキャン ペプチド変異体の相対アフィニティー 表ＸＩ ELISAによるbp1-01非天然ペプチド変異体の相対アフィニティー 表ＸＩＩ ELISAによるＣ末端bp1-01変異体の相対アフィニティー Ｃ．bp1-01第二次ライブラリーの多価(g8)選択 NNSコドンは、実施例７中に記載した通りの種々のペプチドライブラリーを作 製するために用いた。アフィニティー選択は、親和力効果を最小化するために溶 液においてビオチン化IGFBP-1(実施例７で記載した通り調製した)へのファージ の溶液結合によって実行した。類似の計画は、Hawkinsら,J.Mol.Biol.,226:889( 1992)による抗体-ファージ選択のために使用した。選択の各ラウンドのために、 標的の量は、増加したアフィニティー変異体用の選択で減じられた。典型的に、 109-1010の精製したファージを、室温で一時間、MPBST(PBS中5％スキムミルク＋ 0.05％ TWEENTM20)によって予備ブロック化し、且つビオチン化標的への結合の ため選択した。結合条件は以下の通り。標的に結合したファージは、室温で2-5 分間、ストレプタビジン-マグネチックビーズ(Promega社,Madison,WI)と共にイ ンキュベートすることによって捕捉した。結合の後、そのビーズは、0.1M ＨＣ ｌによる溶離の前に、PBS-TWEENTM/MPBSTで十回洗浄した。その溶離液は、0.1M トリス、pH8.0の1/3容量で直接中性化した。溶離したファージは、次の選択サイ クル用のXL1に感染することによって増殖した。ラウンド１，２，３は、一時間 のインキュベーションによって、それぞれ400nM、200nM、及び20nM標的によって 実行した。ラウンド４は、4nM標的によって一晩実行した。全ての結合反応は、 室温で実行した。 同定した変異体を表ＸＩＩＩ中に示し、さらにＥＬＩＳＡプレートアッセイ又 はBIAcoreTMによる相対アフィニティーを表ＸＩＶ中に示した。bp1-10(配列番号 ：１０５)、bp1-11(配列番号：１０６)、bp1-12(配列番号：１０７)、bp1-13(配 列番号：１０８)、bp1-15(配列番号：１１０)、bp68(配列番号：１１２)、bp102 7(配列番号：１１３)、bp1028(配列番号：１１４)、bp1029(配列番号：１１５) 、及びbp1030(配列番号：１１６)は、bp1-02とbp1-01に匹敵する又はより高いア フィニティーであり、インビトロ細胞培養アッセイにおいてＩＧＦ-Iの利用能を 増加することが予期される。 表ＸＩＩＩ 多価(g8)bp101ライブラリーから同定した変異体と(no.配列) 表ＸＩＶ ELISAプレート又はBIAcoreTM*によるg8 bp1-01変異体の相対アフィニティーＤ．bp1-01第二次ライブラリーの１価(g3)選択 bp1-01第二次ライブラリーの１価(g3)選択は、上記のパートＣ中に記載した通 り必須に実行した。テンプレートは、無作為化のために標的化したサイトでのTA A停止コドン又はbp1-01からの完全に関係のない結合配列のいずれかを含む。選 択条件は、ブロッキング緩衝液中のＢＳＡ置換ミルクと共に以下に記載した通り とした。ファージ標的複合体は、マグネチックストレプタビジンビーズ(Promega 社，Madison，WI)により捕捉した。ビオチン化標的は、ラウンド１中で200-500n Mから、ラウンド２での50-100nM、ラウンド３での10-50nM、及びラウンド４での 1-20nMまでに減じられた標的濃度と共に、各ラウンドにおいて室温で1-3時間フ ァージと予備インキュベートした。 同定した変異体を表ＸＶに示し、及び選択した幾つかのペプチドのBIAcoreTM 競合アッセイによって又はELISAプレートアッセイ(5％アセトニトリルをペプチ ドの可溶化のために使用したことを除いて、上記の通り実行した)によって測定 した相対アフィニティーを表ＸＶＩ中に示した。bp1-01の13-残基変形体、bp1-1 6(配列番号：１１７)は、BP1-01のそれに類似したアフィニティーを有した。Ｎ 末端又はＣ末端での置換は、アフィニティー改善を生じた。例えば、bp1-16と比 べて、Ｃ末端でのSTY配列の添加は、ペプチドbp1-21B(配列番号：１２１)でのア フィニティーの約３倍の改善を生じた。類似の効果は18-マーの前後において見 られた：即ち、３倍の改善がbp1-14(配列番号：１０９)とbp1-21A(配列番号：１ ２０)との間で観測された。Ｎ末端ＳからＧモチーフの置換もまた、ペプチドbp1 -19(配列番号：１１８)とbp1-20(配列番号：１１９)において２倍から３倍アフ ィニティーが改善された。これらペプチドの全ては、bp1-01とbp1-02との比較と して、IGFBP-1のための類似の又は改善された外見上のアフィニティーを有し、 且つインビボでの細胞培養アッセイにおけるＩＧＦ-Iの利用能を増加させること が予期される。 表ＸＶ １価(g3)bp1-01ライブラリーから同定した変異体 表ＸＶＩ BIAcoreTM又はELISAプレートアッセイ*によるg3 bp1-01選択物の相対アフィニテ ィー 実施例１３ IGFBP-3結合ペプチド変異体の相対アフィニティー 各種のbp3-01-ox変異体の相対アフィニティーは、BIAcoreTM競合アッセイによ って測定した。その結果は表ＸＶＩＩ中に示した。4d3.3(配列番号:122)、bp3-3 0(配列番号:123)、bp3-41(配列番号:124)、bp3-40(配列番号:125)、bp3-39(配列 番号:126)、bp3-28(配列番号:128)、bp3-27(配列番号:129)、及びbp3-25(配列番 号:130)は、bp3-01-oxのそれと類似した又はそれよりもより大きなアフィニティ ーを有することを見ることができ、そしてインビトロでの細胞培養アッセイにお いてＩＧＦ-Iの利用能を増加することが予期される。ペプチドbp3-24(配列番号: 131)の測定可能な活性の欠如は、完全なジスルフィドが、ペプチドのこのシリー ズのIGFBP-3への結合のために有利なペプチド構造を維持することにおいて演じ る重大な役割を示す。 表ＸＶＩＩ BIAcoreTM競合アッセイによるbp3-01変異体の相対アフィニティー 実施例１４ IGFBP-3への結合のための補足ライブラリーのスクリーニング 補足の多価(g8)ペプチド-ファージライブラリーは、ＩＧＦ-IへのIGFBP-3結 合を抑制した２つのペプチドを生産したそれに設計及び挿入した。その結果は、 表ＸＶＩＩＩに示した通り、bp3-107(配列番号:132)とbp3-108(配列番号:133)が インヒビターであること及びそれがインビトロでの細胞培養アッセイにおいてＩ ＧＦ-Iの利用能を増加することが予期される。 表ＸＶＩＩＩ BIAcoreTM競合アッセイによるＩＧＦ-IへのIGFBP-3のペプチド抑制 本発明は必要に応じて、ある種の特有の方法と材料に関してここに言及してい る。本発明の目的を達成するために適切な代替の材料と方法のいずれか又は全て に拡張され、本発明の範囲に関するいずれかの制限を構成するためではないこれ ら特有の方法と材料の言及であると解される。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年４月１２日（１９９９．４．１２） 【補正内容】 請求の範囲 １． 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号： ５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１ ０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列 番号：１５、及び配列番号：１６からなる群から選択したアミノ酸配列を含むペ プチド。 ２． 配列番号：４、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号 ：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、 及び配列番号：１６からなる群から選択される配列を含む請求項１記載のペプチ ド。 ３．請求項１，２及び４−１６のいずれか１項記載のペプチドをコードしている 核酸分子。 ４．配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号 ：１３、配列番号：１５、又は配列番号：１６であるアミノ酸配列を含む請求項 １記載のペプチド。 ５． 配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１５、又は配列番号：１６で あるアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。 ６． 配列番号：１０、配列番号：１５、又は配列番号：１６であるアミノ酸配 列を含むペプチド。 ７． 配列番号：１０４であるアミノ酸配列を含むペプチド。 ８． 配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１ ０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１３、配列番号：１ １４、配列番号：１１５、又は配列番号：１１６であるアミノ酸配列を含むペプ チド。 ９． 配列番号：１０９、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１ １９、配列番号：１２０、又は配列番号：１２１であるアミノ酸配列を含むペプ チド。 １０． 配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４、配列番号： １２５、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１２９、配列番号： １３０、配列番号：１３２、又は配列番号：１３３であるアミノ酸配列を含むペ プチド。 １１． 位置２，３，４，又は６でＤ-アラニン置換を、又は位置７，８，９， １１，１２，１３，又は１４でアルファ-アミノイソブチラート置換を、又は上 記の何れかの組合せを有する配列番号：１５のアミノ酸配列を含むペプチド。 １２． 位置２，３，又は６でＤ-アラニン置換を、又は位置７，８，９，１１ ，１２，１３又は１４でアルファ-アミノイソブチラート置換を、又は上記の何 れかの組合せを有する請求項１1記載のペプチド。 １３． 位置６でＤ-アラニン置換を、又は位置８，９，又は１３でアルファ-ア ミノイソブチラート置換を有する請求項１１記載のペプチド。 １４． ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有する請求項１１ 記載のペプチド。 １５． ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有する請求項１２ 記載のペプチド。 １６． ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有する請求項１３ 記載のペプチド。 １７． 製薬上許容される担体中に請求項１，２及び４−１６のいずれか１項記 載のペプチドを含む組成物。 １８． 無菌である請求項１７記載の組成物。 １９． 成長ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン 、成長ホルモン分泌促進剤、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせたＩＧ Ｆ、ＩＧＦ結合タンパク質、成長ホルモン結合タンパク質と組み合わせた成長ホ ルモン、インスリン、又は低血糖剤を更に含む請求項１８記載の組成物。 ２０． ＩＧＦとその結合タンパク質のいずれか１つとの相互作用を抑制し且つ ヒトＩＧＦレセプターに結合しないペプチド又は化合物の有効量を哺乳動物に投 与することを含み、哺乳動物中の生物学的に活性なＩＧＦ-Iの血清と組織レベル を増加するための方法において使用するための、請求項１，２，及び４−１６の いずれか１項記載のペプチド又は請求項１７−１９のいずれか１項記載の組成物 。 ２１． 該ペプチド又は組成物が、哺乳動物において血漿インスリン分泌、血漿 成長ホルモン分泌、又は血中グルコースレベルを減じ、且ついずれかの種からの 内因性成長ホルモンの分泌又は放出を直接刺激しない、請求項２０記載のペプチ ド又は組成物。 ２２． 該ペプチド又は組成物がＩＧＦ結合タンパク質に結合する請求項２０記 載のペプチド又は組成物。 ２３． 該ペプチド又は組成物が、IGFBP-1に、又はIGFBP-3に、又はIGFBP-1 とIGFBP-3の両方に、又はＩＧＦ-Iに、又はＩＧＦ-IIに、又はＩＧＦ-IとＩＧＦ -IIの両方に、又はIGFBP-3又はIGFBP-1とＩＧＦ-I又はＩＧＦ-IIに結合する請求 項２０記載のペプチド又は組成物。 ２４． 哺乳動物に、成長ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、成長ホルモン 放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進剤、成長ホルモン結合タンパク質と組み合 わせた成長ホルモン、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせたＩＧＦ、Ｉ ＧＦ結合タンパク質、インスリン、又は低血糖剤を投与することを更に含む請求 項２０記載のペプチド又は組成物。 ２５． 哺乳動物がヒトである請求項２０記載のペプチド又は組成物。 ２６． 糖尿病、肥満症に関連した、神経学的、心臓、同化作用の、腎臓、又は 免疫学的な疾患からなる群から選択される疾患の治療となる請求項２０記載のペ プチド又は組成物。 ２７． (a)体液中のＴＧＦレベルを測定すること； (b)単一又は複数投薬を用いて化合物と該液とを接触すること； (c)該液中のＩＧＦを再測定すること、もし該液のＩＧＦレベルが、該 化合物が投与されることによる望まれる効力を生じるのに十分な量で低下してい るならば、該化合物の投薬量は、最大の効力を生じるように調整され得る； ここで上記化合物は請求項１，２，又は４−１６のいずれか１項記載のペプチド である、 を含む、ＩＧＦとその結合タンパク質のいずれか１つとの相互作用を抑制し且つ ヒトＩＧＦレセプターと結合しない化合物の適切な投薬量を決定する方法。 ２８． 該液が哺乳動物からのものであり、該液が哺乳動物から抽出され且つそ のＩＧＦレベルが測定された後、該化合物が単一又は複数投薬を用いて哺乳動物 に投与され、そしてそのＩＧＦレベルが哺乳動物から抽出した液で再測定される 請求項２７記載の方法。 ２９． 化合物の投薬量が妥当に調節され得るように生物学的液体中の特有のＩ ＧＦ結合タンパク質の量を又は特有のＩＧＦ結合タンパク質に結合した該化合物 の量を測定するための方法であり、 (a)該液体と、１）固相担体に付着した第１の抗体とを接触させること、該 第１の抗体は、抗体の存在中でＩＧＦ結合サイトが該化合物に結合するためのＩ ＧＦ結合タンパク質上に利用可能に残るようにＩＧＦ結合タンパク質上のエピト ープに特異的であり、それによって該第１の抗体とＩＧＦ結合タンパク質との間 の複合体を形成すること；及び２）ＩＧＦ結合タンパク質上の全ての利用可能な ＩＧＦ結合サイトを飽和させるために十分な時間、該化合物と接触させること、 それによって飽和した複合体を形成すること； (b)該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能で ある該化合物上のエピトープに特異的である検出可能に標識した第２の抗体と該 飽和した複合体とを接触させること；及び (c)生物学的液体中のＩＧＦ結合タンパク質の指標として、且つそれ故に結 合した該化合物の量の指標として、標識した第２の抗体結合の量を定量分析する こと； ここで上記化合物は請求項１，２，又は４−１６のいずれか１項記載のペプチド である、 を含む方法。 ３０． ＩＧＦ結合タンパク質に結合した内因性又は外因性ＩＧＦを、又はＩＧ Ｆ結合タンパク質に結合し且つＩＧＦ結合タンパク質に結合したヒトＩＧＦレセ プターに結合しない化合物の量を検出する、又は生物学的液体中の未結合ＩＧＦ レベルを検出するための方法であり： (a)該液体と、１）固相担体に付着した化合物を検出するための手段とを接 触させること、該手段は、該化合物の存在中でＩＧＦ結合サイトがＩＧＦ結合タ ンパク質に結合するための化合物上に利用可能に残るよう該化合物に特異的であ り、それによって該手段とＩＧＦ結合タンパク質との間の複合体を形成すること ；及び２）ＩＧＦ結合タンパク質上の利用可能なＩＧＦ結合サイトの全てを飽和 するために十分な時間、該化合物と接触させること、それによって飽和した複合 体を形成すること； (b)該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能で あるＩＧＦ結合タンパク質のために特異的である検出可能に標識した第２の手段 と、該飽和した複合体とを接触させること；及び (c)生物学的液体中のIGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物と ＩＧＦ結合タンパク質、結合したＩＧＦとＩＧＦ結合タンパク質、又は該液体中 に存在する活性ＩＧＦの指標として、標識した手段の結合量を定量分析すること ； ここで上記化合物は請求項１，２，又は４−１６のいずれか１項記載のペプチド である、 を含む方法。 ３１． 請求項１７記載の組成物と、該組成物を利用するために使用者に向けら れた指示書とを収容している容器を含むキット。 ３２． 成長ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン 、成長ホルモン分泌促進剤、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質と複合化したＩＧＦ 、ＩＧＦ結合タンパク質、成長ホルモン結合タンパク質と複合化した成長ホルモ ン、インスリン、又は低血糖剤を含む容器を更に含んだ請求項３１記載のキット 。 ３３． ＩＧＦとその結合タンパク質のいずれか１つとの相互作用を抑制する請 求項１，２，及び４−１６のいずれか１項記載のペプチドと、チアゾリジンジオ ンを含む組成物。 ３４． ＩＧＦとその結合タンパク質のいずれか１つとの相互作用を抑制するペ プチド又は組成物と、チアゾリジンジオンの有効量を哺乳動物に投与することを 含む、哺乳動物において血糖値制御をもたらす方法において使用するための請求 項１，２，及び４−１６のいずれか１項記載のペプチド又は請求項１７−１９の いずれか１項記載の組成物。 ３５． そのサイトに普及した又は不在のいずれか一方であるIGFBPに特異的で あるペプチド又は組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に おける特有のサイトから離れた所に、又は向かってのいずれか一方に内因性ＩＧ Ｆを導くための方法において使用するための請求項１，２，及び４−１６のいず れか１項記載のペプチド又は請求項１７−１９のいずれか１項記載の組成物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/27 Ａ６１Ｐ 9/00 38/28 13/12 45/00 25/00 Ａ６１Ｐ 3/04 Ｃ０７Ｋ 7/00 3/10 7/08 9/00 14/00 13/12 16/18 25/00 19/00 Ｃ０７Ｋ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/566 7/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 14/00 Ａ６１Ｋ 37/02 16/18 37/36 19/00 37/24 Ｇ０１Ｎ 33/566 37/26 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ロビンソン，イアン シー エー エフ イギリス国 ハートフォードシャー ＡＬ ４ ０ＥＵ セント アルバンス ウッド ランド ドライヴ 52エー

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． (1-27,gly4,38-70)-hIGF-Iを除く、ヒトＩＧＦレセプターに結合しないＩ ＧＦ結合タンパク質に対する抗体を除く、ＩＧＦに結合する抗体を除く、及び位 置24,31，及び／又は60で置換又は削除したチロシン残基を持つヒトＩＧＦ-Iの 自然の配列を有するペプチドを除く、そのIGFBPsのいずれか１つとＩＧＦとの相 互作用を抑制し且つヒトＩＧＦレセプターに結合しない化合物。 ２． ＴＧＦ結合タンパク質に結合する請求項１記載の化合物。 ３． 血清ＩＧＦ-I結合タンパク質に結合する請求項２記載の化合物。 ４． ペプチドである請求項１記載の化合物。 ５． 約１０から約２５アミノ酸残基を有する請求項４記載の化合物。 ６． 該ペプチドが、そのＮ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８でシ ステイン残基を、又はそのＣ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８でシ ステイン残基を、又はそのようなシステイン残基の両方を、又はそのＮ末端から 番号付けした位置２でシステイン残基を有する請求項４記載の化合物。 ７． 該ペプチドが、そのＮ末端から番号付けした位置１，２，３，４，又は５ でトリプトファン残基を有する請求項５記載の化合物。 ８． 該ペプチドが、そのＮ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８のシ ステイン残基までにバリン、セリン、又はグルタミン残基Ｎ末端を更に有する請 求項６記載の化合物。 ９． そのＮ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８のシステイン残基ま での残基がバリン残基である請求項８記載の化合物。 １０． そのＮ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８のシステイン残基 までの３つの残基Ｃ末端である位置で始まる残基のグリシン-プロリン又はバリ ン-アラニン配列を有する請求項９の化合物。 １１． 残基のグリシン-プロリン又はバリン-アラニン配列までの３つの残基Ｃ 末端の中にトリプトファン残基を有する請求項１０記載の化合物。 １２． そのＣ末端から番号付けした位置５，６，７，又は８のシステイン残基 までの２つのＮ末端の中にロイシン又はバリン残基を有する請求項１１記載の化 合物。 １３． そのＣ末端から番号付けした位置２又は３でトリプトファン残基を有す る請求項１２記載の化合物。 １４． 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号 ：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号： １０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配 列番号：１５、及び配列番号：１６からなる群から選択したアミノ酸配列を含む ペプチド。 １５． 配列番号：４、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番 号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５ 、及び配列番号：１６からなる群から選択される配列を含む請求項１４記載のペ プチド。 １６． 請求項１５記載のペプチドをコードしている核酸分子。 １７． 配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列 番号：１３、配列番号：１５、又は配列番号：１６であるアミノ酸配列を含む請 求項１４記載のペプチド。 １８． 配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１５、又は配列番号：１６ であるアミノ酸配列を含む請求項１４記載のペプチド。 １９． 配列番号：１０、配列番号：１５、又は配列番号：１６であるアミノ酸 配列を含むペプチド。 ２０． 配列番号：１０４であるアミノ酸配列を含むペプチド。 ２１． 配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号： １０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１３、配列番号： １１４、配列番号：１１５、又は配列番号：１１６であるアミノ酸配列を含むペ プチド。 ２２． 配列番号：１０９、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号： １１９、配列番号：１２０、又は配列番号：１２１であるアミノ酸配列を含むペ プチド。 ２３． 配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４、配列番号： １２５、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１２９、配列番号： １３０、配列番号：１３２、又は配列番号：１３３であるアミノ酸配列を含むペ プチド。 ２４． 位置２，３，４，又は６でＤ-アラニン置換を、又は位置７，８，９， １１，１２，１３，又は１４でアルファ-アミノイソブチラート置換を、又は上 記の何れかの組合せを有する配列番号：１５のアミノ酸配列を含むペプチド。 ２５． 位置２，３，又は６でＤ-アラニン置換を、又は位置７，８，９，１１ ，１２，１３又は１４でアルファ-アミノイソブチラート置換を、又は上記の何 れかの組合せを有する請求項２４記載のペプチド。 ２６． 位置６でＤ-アラニン置換を、又は位置８，９，又は１３でアルファ-ア ミノイソブチラート置換を有する請求項２４記載のペプチド。 ２７． ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有する請求項２４ 記載のペプチド。 ２８． ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有する請求項２５ 記載のペプチド。 ２９． ＹＦＧではなくＡＡである配列番号：１５のＣ末端を有する請求項２６ 記載のペプチド。 ３０． 製薬上許容される担体中に請求項１の化合物を含む組成物。 ３１． 無菌である請求項３０記載の組成物。 ３２． 成長ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン 、成長ホルモン分泌促進剤、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせたＩＧ Ｆ、ＩＧＦ結合タンパク質、成長ホルモン結合タンパク質と組み合わせた成長ホ ルモン、インスリン、又は低血糖剤を更に含む請求項３０記載の組成物。 ３３． 製薬上許容される担体中に請求項１４記載のペプチドを含む組成物。 ３４． その結合タンパク質のいずれか１つとＩＧＦとの相互作用を抑制し且つ ヒトＩＧＦレセプターに結合しない化合物の有効量を哺乳動物に投与することを 含む、哺乳動物において生物学的に活性なＩＧＦ-Iの血清と組織レベルを増加す るための方法。 ３５． 該化合物はまた、哺乳動物中の血漿インスリン分泌、血漿成長ホルモン 分泌、又は血中グルコースレベルを減少し、且ついずれかの種からの内因性成長 ホルモンの分泌又は放出を直接刺激しない、請求項３４記載の方法。 ３６． 該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合する請求項３４記載の方法。 ３７． 該化合物が、IGFBP-1に、又はIGFBP-3に、又はIGFBP-1とIGFBP-3の両方 に、又はＩＧＦ-Iに、又はＩＧＦ-IIに、又はＩＧＦ-IとＩＧＦ-IIの両方に、又 はIGFBP-3又はIGFBP-1とＩＧＦ-I又はＩＧＦ-IIに結合する請求項３４記載の方 法。 ３８． 哺乳動物に、成長ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、成長ホルモン 放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進剤、成長ホルモン結合タンパク質と組み合 わせた成長ホルモン、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせたＩＧＦ、Ｉ ＧＦ結合タンパク質、インスリン、又は低血糖剤を投与することを更に含む請求 項３４記載の方法。 ３９． 哺乳動物がヒトである請求項３４記載の方法。 ４０． 該化合物がペプチドである請求項３４記載の方法。 ４１． 糖尿病、肥満症に関連した、神経学的、心臓、同化作用の、腎臓、又は 免疫学的な疾患からなる群から選択される疾患の治療となる請求項３４記載の方 法。 ４２． (a)体液中のＩＧＦレベルを測定すること； (b)単一又は複数投薬を用いて化合物と該液とを接触すること； (c)該液中のＩＧＦを再測定すること、もし該液のＩＧＦレベルが、該 化合物が投与されることによる望まれる効力を生じるのに十分な量で低下してい るならば、該化合物の投薬量は、最大の効力を生じるように調整され得る、 を含む、ＩＧＦとその結合タンパク質のいすれか１つとの相互作用を抑制し且つ ヒトＩＧＦレセプターと結合しない化合物の適切な投薬量を決定する方法。 ４３． 該液が哺乳動物からのものであり、該液が哺乳動物から抽出され且つそ のＩＧＦレベルが測定された後、該化合物が単一又は複数投薬を用いて哺乳動物 に投与され、そしてそのＩＧＦレベルが哺乳動物から抽出した液で再測定される 請求項４２記載の方法。 ４４． 化合物の投薬量が妥当に調節され得るように生物学的液体中の特有のＩ ＧＦ結合タンパク質の量を又は特有のＴＧＦ結合タンパク質に結合する該化合物 の量を測定するための方法であり、 (a)該液体と、１）固相担体に付着した第１の抗体とを接触させること、該 第１の抗体は、抗体の存在中でＩＧＦ結合サイトが該化合物に結合するためのＩ ＧＦ結合タンパク質上に利用可能に残るようにＩＧＦ結合タンパク質上のエピト ープに特異的であり、それによって該第１の抗体とＩＧＦ結合タンパク質との間 の複合体を形成すること；及び２）ＩＧＦ結合タンパク質上の全ての利用可能な ＩＧＦ結合サイトを飽和させるために十分な時間、該化合物と接触させること、 それによって飽和した複合体を形成すること； (b)該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能で ある該化合物上のエピトープに特異的である検出可能に標識した第２の抗体と該 飽和した複合体とを接触させること；及び (c)生物学的液体中のＩＧＦ結合タンパク質の指標として、且つそれ故に結 合した該化合物の量の指標として、標識した第２の抗体結合の量を定量分析する こと、を含む方法。 ４５． ＩＧＦ結合タンパク質に結合した内因性又は外因性ＩＧＦを、又はＩＧ Ｆ結合タンパク質に結合し且つＩＧＦ結合タンパク質に結合したヒトＩＧＦレセ プターに結合しない化合物の量を検出する、又は生物学的液体中の未結合ＩＧＦ レベルを検出するための方法であり： (a)該液体と、１）固相担体に付着した化合物を検出するための手段とを接 触させること、該手段は、該化合物の存在中でＩＧＦ結合サイトがＩＧＦ結合タ ンパク質に結合するための化合物上に利用可能に残るよう該化合物に特異的であ り、それによって該手段とＩＧＦ結合タンパク質との間の複合体を形成すること ；及び２）ＩＧＦ結合タンパク質上の利用可能なＩＧＦ結合サイトの全てを飽和 するために十分な時間、該化合物と接触させること、それによって飽和した複合 体を形成すること； (b)該化合物がＩＧＦ結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能で あるＩＧＦ結合タンパク質のために特異的である検出可能に標識した第２の手段 と、該飽和した複合体とを接触させること；及び (c)生物学的液体中のIGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物と ＩＧＦ結合タンパク質、結合したＩＧＦとＩＧＦ結合タンパク質、又は該液体中 に存在する活性ＩＧＦの指標として、標識した手段の結合量を定量分析すること 、を含む方法。 ４６． 請求項３０記載の組成物と、該組成物を利用するために使用者に向けら れた指示書とを含む容器を含むキット。 ４７． 成長ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン 、成長ホルモン分泌促進剤、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質と複合化したＩＧＦ 、ＴＧＦ結合タンパク質、成長ホルモン結合タンパク質と複合化した成長ホルモ ン、インスリン、又は低血糖剤を含む容器を更に含んだ請求項４６記載のキット 。 ４８． ＩＧＦとその結合タンパク質のいずれか１つとの相互作用を抑制する化 合物と、チアゾリジンジオンを含む組成物。 ４９． 該化合物がペプチドである請求項４８記載の組成物。 ５０． ＩＧＦとその結合タンパク質のいずれか１つとの相互作用を抑制する化 合物と、チアゾリジンジオンの有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動 物において血糖値制御をもたらす方法。 ５１． ＩＧＦとチアゾリジンジオンを含む組成物。 ５２． ＩＧＦがＩＧＦ-Iである請求項５１記載の組成物。 ５３． ＩＧＦ-Iとチアゾリジンジオンの有効量を哺乳動物に投与することを含 む哺乳動物において血糖値の制御をもたらす方法。 ５４． リガンドに結合するポリペプチドと競合するペプチドのリガンドに対す る相対アフィニティーを予測するための方法であり、該ペプチドはファージ-デ ィスプレーライブラリーから得られ、該リガンドの存在において該ポリペプチド と、該ペプチドに一致するファージミドクローンをインキュベートすること、該 ファージを連続希釈すること、及び該ペプチドによって抑制される該リガンドに 対するファージミドクローンの結合に対する度合を測定すること、ここで低いフ ァージ濃度でのみ抑制されるファージミドクローンは、高い及び低いファージ濃 度の両方で抑制されるファージミドクローンよりもリガンドへのより高いアフィ ニティーを有する、を備える方法。 ５５． 該リガンドがＩＧＦ結合タンパク質であり、該ポリペプチドがＩＧＦで ある請求項５４記載の方法。 ５６． そのサイトに普及した又は不在のいずれか一方であるIGFBPに特異的で ある請求項２の化合物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物にお ける特有のサイトから離れた所に、又は向かってのいずれか一方に内因性ＩＧ Ｆを導くための方法。
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