JP4562814B2 - インスリン様成長因子アゴニスト分子 - Google Patents
インスリン様成長因子アゴニスト分子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4562814B2 JP4562814B2 JP54289498A JP54289498A JP4562814B2 JP 4562814 B2 JP4562814 B2 JP 4562814B2 JP 54289498 A JP54289498 A JP 54289498A JP 54289498 A JP54289498 A JP 54289498A JP 4562814 B2 JP4562814 B2 JP 4562814B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- igf
- seq
- sequence
- peptide
- igfbp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 title abstract description 349
- 239000000556 agonist Substances 0.000 title abstract description 70
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 title abstract description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 321
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 47
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 39
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 125000000030 D-alanine group Chemical group [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical group CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical group C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims 2
- LLQIKSJTBKCTPV-UHFFFAOYSA-N amino 2-methylpropanoate Chemical group CC(C)C(=O)ON LLQIKSJTBKCTPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 abstract description 342
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 abstract description 313
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 abstract description 312
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 32
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 21
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 abstract description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 5
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 abstract description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 322
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 170
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 170
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 152
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 141
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 128
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 128
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 108
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 102
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 87
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 86
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 83
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 83
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 82
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 82
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 description 82
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 81
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 81
- 102000004374 Insulin-like growth factor binding protein 3 Human genes 0.000 description 78
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 description 78
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 77
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 77
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 76
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 76
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 76
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 72
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 72
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 70
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 102000004375 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Human genes 0.000 description 63
- 108090000957 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Proteins 0.000 description 63
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 58
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 58
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 53
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 44
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 40
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 40
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 40
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 39
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 35
- 230000004044 response Effects 0.000 description 35
- -1 Mac25 (IGFBP-7) Proteins 0.000 description 34
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 31
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 26
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 26
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 24
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 24
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 24
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 24
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 24
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 21
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 21
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 19
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 18
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 17
- 230000009471 action Effects 0.000 description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 16
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 101000599960 Rattus norvegicus Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 14
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 14
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 13
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 13
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 13
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 13
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 13
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 13
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 12
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 12
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 9
- 101100205180 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-6 gene Proteins 0.000 description 9
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 9
- 229940126904 hypoglycaemic agent Drugs 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102400001066 Growth hormone-binding protein Human genes 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 229940123464 Thiazolidinedione Drugs 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- WZHKXNSOCOQYQX-FUAFALNISA-N (2s)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanamide Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CN=CN1 WZHKXNSOCOQYQX-FUAFALNISA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 7
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 7
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 7
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 description 7
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound O=C1CSC(=O)N1 ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 6
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 6
- 101500023492 Lithobates catesbeianus Growth hormone-releasing peptide Proteins 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 6
- ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N glyburide Chemical compound COC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000021332 multicellular organism growth Effects 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 6
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 101710115821 Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 5
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 5
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 5
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 5
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 5
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 5
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 5
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 5
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 5
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 2-{[3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound OCC1OC(CO)(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)C(O)C1O CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 4
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220506264 N-alpha-acetyltransferase 50_Y31A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 4
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000001896 rotating frame Overhauser effect spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 4
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 3
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 3
- 101000840577 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 7 Proteins 0.000 description 3
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 3
- 229940122355 Insulin sensitizer Drugs 0.000 description 3
- 102000004372 Insulin-like growth factor binding protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000964 Insulin-like growth factor binding protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100029228 Insulin-like growth factor-binding protein 7 Human genes 0.000 description 3
- 102000005237 Isophane Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108010081368 Isophane Insulin Proteins 0.000 description 3
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 3
- 206010043087 Tachyphylaxis Diseases 0.000 description 3
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N caninsulin Chemical group [Zn].C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC3N=CN=C3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1C=NC=N1 LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 210000000028 corpus adiposum pararenale Anatomy 0.000 description 3
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 230000001904 diabetogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229960004580 glibenclamide Drugs 0.000 description 3
- ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N glipizide Chemical compound C1=NC(C)=CN=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 3
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 3
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 3
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 3
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 108010033419 somatotropin-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 3
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 238000013293 zucker diabetic fatty rat Methods 0.000 description 3
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 1-(2-azaniumylacetyl)pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 229940123208 Biguanide Drugs 0.000 description 2
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 208000014311 Cushing syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100039256 Growth hormone secretagogue receptor type 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710202385 Growth hormone secretagogue receptor type 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 2
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 2
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010060378 Hyperinsulinaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000038460 IGF Type 2 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010031792 IGF Type 2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004883 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001014 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001034650 Mus musculus Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 description 2
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical group CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N N-methylformamide Chemical compound CNC=O ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 125000005161 aryl oxy carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 150000004283 biguanides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 108700001680 des-(1-3)- insulin-like growth factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000000667 effect on insulin Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 2
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 229960001381 glipizide Drugs 0.000 description 2
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011327 histological measurement Methods 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 230000003451 hyperinsulinaemic effect Effects 0.000 description 2
- 201000008980 hyperinsulinism Diseases 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 2
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 230000021368 organ growth Effects 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- ICFJFFQQTFMIBG-UHFFFAOYSA-N phenformin Chemical compound NC(=N)NC(=N)NCCC1=CC=CC=C1 ICFJFFQQTFMIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003243 phenformin Drugs 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 2
- 238000001472 pulsed field gradient Methods 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 2
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 150000001467 thiazolidinediones Chemical class 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001551 total correlation spectroscopy Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-5-ethoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound CCOC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N (4S,5S)-1,2-dithiane-4,5-diol Chemical compound O[C@@H]1CSSC[C@H]1O YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)=O JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006282 2-chlorobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Cl)=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 2154-56-5 Chemical compound [CH2]C1=CC=CC=C1 SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006281 4-bromobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1Br)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000006283 4-chlorobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1Cl)C([H])([H])* 0.000 description 1
- UHCHLTQBLNUYRT-GFCCVEGCSA-N 5-[5,6-bis(methyloxy)-1h-benzimidazol-1-yl]-3-{[1-(2-chlorophenyl)ethyl]oxy}-2-thiophenecarboxamide Chemical compound C1([C@@H](C)OC=2C=C(SC=2C(N)=O)N2C=NC=3C=C(C(=CC=32)OC)OC)=CC=CC=C1Cl UHCHLTQBLNUYRT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 101150026173 ARG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000819 Adrenocortical Hyperfunction Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100033367 Appetite-regulating hormone Human genes 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100228196 Caenorhabditis elegans gly-4 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000237074 Centris Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005948 Donohue syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 101100165993 Escherichia phage N15 gene 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 240000001238 Gaultheria procumbens Species 0.000 description 1
- 235000007297 Gaultheria procumbens Nutrition 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101800000194 Growth hormone-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710119601 Growth hormone-releasing peptides Proteins 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001081567 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020564 Hyperadrenocorticism Diseases 0.000 description 1
- 206010049645 Hypercatabolism Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010022491 Insulin resistant diabetes Diseases 0.000 description 1
- 102000004371 Insulin-like growth factor binding protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000961 Insulin-like growth factor binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004369 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000969 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000006302 Laron syndrome Diseases 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000021908 Myocardial disease Diseases 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 206010029333 Neurosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000000536 PPAR gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010016731 PPAR gamma Proteins 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000006877 Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010047386 Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 206010037596 Pyelonephritis Diseases 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000078006 Shaka Species 0.000 description 1
- 206010072610 Skeletal dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010057517 Strep-avidin conjugated horseradish peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 201000011032 Werner Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 description 1
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 1
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical compound [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.CC(O)=O WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-M alpha-aminobutyrate Chemical group CCC(N)C([O-])=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSMHTFWPDRJCMN-UHFFFAOYSA-N butan-2-yl carbonochloridate Chemical compound CCC(C)OC(Cl)=O YSMHTFWPDRJCMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003683 cardiac damage Effects 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 125000004803 chlorobenzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 150000003983 crown ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical class BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005170 cycloalkyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940089126 diabeta Drugs 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N diethylstilbestrol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(\CC)C1=CC=C(O)C=C1 RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- 229960000452 diethylstilbestrol Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl azide Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(=O)(N=[N+]=[N-])C1=CC=CC=C1 MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N ethyl chloroformate Chemical compound CCOC(Cl)=O RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 230000001610 euglycemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 206010061989 glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 229940088991 glucotrol Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229940120105 glynase Drugs 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 108010015153 growth hormone releasing hexapeptide Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003581 hormone blood level Effects 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000047065 human IGFBP1 Human genes 0.000 description 1
- GPGMRSSBVJNWRA-UHFFFAOYSA-N hydrochloride hydrofluoride Chemical compound F.Cl GPGMRSSBVJNWRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006362 insulin response pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 201000006334 interstitial nephritis Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001596 intra-abdominal fat Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000009602 intrauterine growth Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 208000018773 low birth weight Diseases 0.000 description 1
- 231100000533 low birth weight Toxicity 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000005980 lung dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000037257 muscle growth Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000022001 negative regulation of insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 208000015238 neurotic disease Diseases 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- 229940063149 nutropin Drugs 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003538 oral antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127209 oral hypoglycaemic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008010 parenteral excipient Substances 0.000 description 1
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHWALFGBDFAJAI-UHFFFAOYSA-N phenyl carbonochloridate Chemical compound ClC(=O)OC1=CC=CC=C1 AHWALFGBDFAJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 201000009395 primary hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000000358 protein NMR Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012439 solid excipient Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011856 somatic therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003890 succinate salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940034199 thyrotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011680 zucker rat Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明はインスリン様成長因子(IGFs)のアゴニストとして有用な分子に関する。より詳細には、これらの分子は、IGFと、1またはそれ以上のそのIGF結合タンパク質との相互作用を抑制する。そのような分子は、例えばIGFsが使用されるいずれかの方法、例えば高血糖症、肥満に関連した、神経学的な、心臓の、腎臓の、免疫学的な及び同化作用の疾患の治療において使用され得る。
背景及び関連技術の説明
IGFs(IGF-I, IGF-II,及びIGF変異体)の作用と活性についての文献の大きな一団がある。ヒトIGF-Iは、成長ホルモン(GH)の作用を調節するインスリン様の及びマイトジェンの生物学的活性を持ったソマトメジンのファミリーに属している8.4のpIを持つ(RinderknechtとHumbel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2365(1976); RinderknechtとHumbel, J. Biol. Chem., 253: 2769(1978))7649-ダルトンのポリペプチドである。Van Wykら、Recent Prog. Horm. Res., 30:259(1974); Binoux, Ann. Endocrinol., 41: 157(1980); ClemmonsとVan Wyk, Handbook Exp. Pharmacol., 57: 161(1981); Baxter, Adv. Clin. Chem., 25: 49(1986);米国特許第4,988,675号;WO 91/03253; WO 93/23071。
GHのような、IGF-Iは、有力な同化作用タンパク質である。Tannerら,Acta Endocrinol., 84: 681-696(1977); Uthneら,J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 548-554(1974)。危篤状態での同化作用剤としてのインスリン、GH、及びIGF-Iの役割を考察するRossら,Intensive Care Med., 19 Suppl. 2: S54-57(1993)も参照。IGF-Iは、インスリンのそれに類似の低血糖作用を有し、ポジティブな窒素バランスをも促進する。Underwoodら,Hormone Res., 24: 166(1986); Gulerら,N. Engl. J. Med., 317: 137(1987)。活性のこの範囲のために、IGF-Iは、創傷治癒、糖尿病の治療、全身異化作用状態の逆転、鬱血性心不全のような心臓条件の治療、及び神経学的疾患の治療のような広い異種の使用のためにヒトにおいて試験されている。Gulerら,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 4889-4893(1988); Duerrら,J. Clin. Invest., 95: 619-627(1995); 及びScience, 264: 772-774(1994)。
米国特許第5,273,961; 5,466,670; 5,126,324; 5,187,151; 5,202,119; 5,374,620; 5,106,832; 4,988,675; 5,106,832; 5,068,224; 5,093,317; 5,569,648;及び4,876,242; WO 92/11865; WO 96/01124; WO 91/03253; WO 93/25219; WO 93/08826;及びWO 94/16722は、IGF-Iを用いる哺乳動物、特にヒトの患者の各種治療方法を開示する。加えて、IGF-Iの臨床的な使用は、例えばBondy, Ann Intern. Med., 120: 593-601(1994)に記載される。
一つの特有な使用において、IGF-Iは、腎臓中で各種の作用を発揮することが見出されている。HammermanとMiller, Am. J. Physiol., 265: F1-F14(1993)。先端巨大症に罹った患者で観測された腎臓のサイズにおける増加が糸球体濾過率の顕著な増加によって達成されることが10年間認識されている。O’SheaとLayish, J. Am. Soc. Nephrol., 3: 157-161(1992)。米国特許第5,273,961号は、急性腎不全の危険のある哺乳動物の予防的治療のための方法を開示する。ヒトにおいてIGF-Iは手術後の腎機能を保護することが示されている。Franklinら,Am. J. Physiol., 272: F257-F259(1997)。通常の腎機能を持つヒトにおける該ペプチドの注入は、糸球体濾過率と腎臓血漿流を増加する。Gulerら,Acta Endocrinol. 121: 101-106(1989); Gulerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872(1989); Hirschbergら,Kidney Int., 43:387-397(1993); 米国特許第5,106,832。さらに、中等度減少腎機能に罹ったヒトは、糸球体濾過率と腎臓血漿流を増加することによって短期間(4日)IGF-I投与に応答する。それ故にIGF-Iは、慢性腎不全を整復する潜在的な治療薬である。O’Sheaら,Am. J. Physiol., 264: F917-F922(1993)。IGF-Iが最終段階の慢性腎不全を経験しているそれらの腎機能を増加できるという事実にもかかわらず、IGF-Iの短期で得られた糸球体濾過率と腎臓血漿流の増加は長期投与の間持続することはなく、副作用の発生は高い。Millerら,Kidney International, 46: 201-207(1994)。
腎臓についてのIGF-Iの作用を完全に再考するために、例えばHammermanとMiller, Am. J. Physiol., 265: F1-F14(1993)及びHammermanとMiller, J. Am. Soc. Nephrol., 5: 1-11(1994)。
IGF-Iのためのアナボリックな指示として、IGF-Iによって連続的に治療したHIV-感染患者において、そのIGF-Iは、同化作用を促進したが、しかしタキフィラキシーは、その患者において急激に発達した。Liebermanら,U.S. Endocrine Meeting, June 1993(Abst. 1664); Liebemanら,J. Clin. Endo. Metab., 78:404-410(1994)。重症の頭部損傷を受けた患者において、深い異化亢進及び窒素損失に関連した条件下に、IGF-Iの注入は一時的な正の窒素バランスのみを誘導した。最初の週において患者は正の窒素バランスを経験したが、第2週の間に負の窒素バランスが発達した。Chenら,U.S. Endocrine Meeting, June 1993(Abst. 1596)。
IGF-Iは、静脈内ボーラス注射により投与した場合、インスリンのそれと類似のヒトにおける低血糖作用を有する。Underwoodら,Hormone Research, 24: 166(1986)。IGF-Iは、正規インスリンと類似して記載された時間の経過と共に、通常者(Gulerら,N. Engl. J. Med., supra)及び糖尿病患者(Schoenleら,Diabetologia, 34: 675-679(1991); Zenobiら,J. Clin. Invest., 90:2234-2241(1992); Sherwinら,Hormone Research, 41(Suppl. 2):97-101(1994); Takanoら,Endocrinol. Japan, 37:309-317(1990); Gulerら,Acta Paediatr. Scand.(Suppl.),367:52-54(1990))の両方においてグルコース低下を発揮することが知られる。組換えヒトIGF-I(rhIGF-I)投与に続く増加した低血糖認識を報告したKerrら,“Effect of Insulin-like Growth Factor 1 on the responses to and recognition of hypoglycemia,”American Diabetes Association(ADA), 52nd Annual Meeting, San Antonio, Texas June 20-23, 1992も参照。加えて、rhIGF-Iの単独投薬が一晩GHレベルとIDDMと共に青年期におけるインスリン要求を減じる。Cheethamら,Clin. Endocrinol., 40:515-555(1994); Cheethamら,Diabetologia, 36: 678-681(1993)。
Schalchら,J. Clin. Metab., 77:1563-1568(1993)で報告されたような、II型糖尿病に対するrhIGF-Iの投与は、血清インスリン同様にCペプチドレベルにおける並行した減少の両方での低下を実証した。これは、IGF-I治療の5日後の膵臓のインスリン分泌における減少を示した。この作用は、Froeschら,Horm. Res., 42:66-71(1994)よって独立に確認されている。通常ラットにおけるインビボ実験でもまた、IGF-I注射が膵臓のインスリン放出を抑制することが示される。Fursinnら,Endocrinology, 135: 2144-2149(1994)。加えて、膵臓の灌流調製において、IGF-Iはまた、インスリン分泌を抑制した。Leahyら,Endocrinology, 126: 1593-1598(1990)。これらはヒト及び哺乳動物におけるインスリン分泌についてのIGF-Iのインビボでの抑制的作用を明確にしたにも関わらず、インビトロ実験ではそのような均一な結果が得られていない。
RhIGF-Iは、インスリン感受性を改善する能力を有する。例えば、rhIGF-I(70μg/kg bid)は、筋緊張性ジストロフィーに罹った皮糖尿病、インスリン耐性患者においてインスリン感受性を改善した。Vlachopapadopoulouら,J. Clin. Endo. Metab., 12: 3715-3723(1995)。Saadら,Diabetologia, 37: Abstract 40(1994)は、肥満症に罹った成人においてインスリン感受性の投薬量依存的改善及びrhIGF-I治療(25μgと100μg/kg bid)の15日の後グルコース耐性が改善されたことを報告した。RhIGF-Iもまた、重症A型インスリン耐性に罹った何名かの患者(Schoenleら,Diabetologia, 34:675-679(1991); Morrowら,Diabetes, 42(Suppl.):269(1993)(abstract); Kuzuyaら,Diabetes, 42: 696-705(1993))及び非-インスリン依存糖尿病においてインスリン感受性と血糖コントロールを改善した。Schalchら,“Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor I(rhIGF-I)in type II diabetes mellitus”, in: Spencer EM, ed., Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors(New York: Elsevier: 1991)pp. 705-715; Zenobiら,J. Clin. Invest., 90: 2234-2241(1993)。
選択した典型被験者におけるIGF-Iの投与のインスリン耐性及び可能性のある効果を生起する幾つかの臨床的表現型の病因学のための一般的なスキームは、幾つかの参考文献中に与えられる。例えば、Elahiら,“Hemodynamic and metabolic responses to human insulin-like growth factor-1(IGF-I)in men,”in: Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors,(Spencer, EM, ed.), Elsevier, New York, pp.219-224(1991); Quinnら,New Engl. J. Med., 323: 1425-1426(1990); Schalchら,“Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor I(rhIGF-I)in type II diabetes mellitus”, in: Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors,(Spencer EM, ed.), Elsevier, New York, pp. 705-714(1991); Schoenleら,Diabetologia, 34: 675-679(1991); Usalaら,N. Eng. J. Med., 327: 853-857(1992); Liebermanら,J. Clin. Endo. Metab., 75:30-36(1992); Zenobiら,J. Clin. Invest., 90: 2234-2241(1992);Zenobiら,J. Clin. Invest., 89: 1908-1913(1992); Kerrら,J. Clin. Invest., 91: 141-147(1993)を参照。IGF-Iが日に二回、120-160μg/kgの投薬量で臨床においてII型糖尿病患者を治療するために使用された場合、その副作用は治療の有効性に勝る。Jabriら,Diabetes, 43: 369-374(1994)。IGF-Iによる患者の治療において観測された副作用に関するWilton, Acta Paediatr., 383: 137-141(1992)も参照。
IGF結合タンパク質(IGFBPs)は、IGFと結合する可能性もある他の関連したタンパク質と共に、少なくとも6のタンパク質のファミリーである(Jones and Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34(1995); Bach and Rechler, Diabetes Reviews, 3:38-61(1995))。IGFBPsは、変化するアフィニティーと特異性によってIGF-IとIGF-IIに結合する。JonesとClemmons, supra; Bach and Rechler, supra。例えば、IGFBP-3は、類似のアフィニティーによってIGF-IとIGF-IIに結合するが、IGFBP-2とIGFBP-6は、それがIGF-Iに結合するよりも、より高いアフィニティーでIGF-IIに結合する。BachとRechler, supra; Ohら,Endocrinology, 132, 1337-1344(1993)。
大部分の成長因子と異なり、循環器系において高濃度で存在するが、しかしIGFsの極少量のフラクションは、タンパク質結合していない。例えば、ヒト又は齧歯動物において、血中IGFsの1%以下が“遊離”で又は未結合形である。Juulら,Clin. Endocrinol., 44: 515-523(1996); Hizukaら,Growth Regulation, 1: 51-55(1991); Hasegawaら,J. Clin. Endocrinol. Metab., 80: 3284-3286(1995)。IGF-I又はIGF-II、IGFBP-3、及び大タンパク質から構成された非共有結合した三重複合体の一部として血液循環中のIGFsの圧倒的大多数は、酸-不安定サブユニット(ALS)と称される。この複合体は、3つの構成要素のそれぞれの等モル量から構成される。IGF、IGFBP-3、及びALSの三重複合体は、ほぼ150,000ダルトンの分子量を有し、且つそれは循環系内でのこの複合体の機能がレザバーとして及び遊離IGF-I又はIGF-IIへの急激な変化を防止する、IGF-IとIGF-IIのためのバッファーとして奉仕するためとされ得ることが示唆されている。
IGF-Iは、ヒト体液、例えば血液及びヒト脳脊髄液において自然に生じる。たとえIGF-Iが多くの組織で生産されるとしても、大部分の循環性IGF-Iは、肝臓において合成されると確信する。IGFBPsは、最初の結合タンパク質がグルコース代謝中に包含されるとして関連させている、IGFBP-1によって(Leeら,Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 204: 4-29(1993))、IGF-Iの生物学的活性を調節すると確信される(JonesとClemmons, supra)。Baxter,“Physiological roles of IGF binding proteins”, in: Spencer(Ed.), Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors(Elsevier, New York, 1991), pp. 371-380。肝臓におけるIGFBP-1生産は、それの生産を直接抑制するインスリンによって、栄養状態によって調節される。Suikkariら,J. Clin. Endocrinol. Metab., 66: 266-272(1988)。
インビボにおけるIGFBP-1の機能は、乏しく理解される。ラットに対する精製したヒトIGFBP-1の投与は、急性の、しかし少量の、血中グルコースの増加を生じることが示されている。Lewittら,Endocrinology, 129: 2254-2256(1991)。IGFBP-1の調節は、幾分良好に理解される。それは、血中グルコースが上昇し且つインスリンが分泌される場合、IGFBP-1は抑制され、グルコース輸送についてインスリン作用をアシストするであろう“遊離”IGF-Iレベルをゆっくりと増加することが提案されている(LewittとBaxter, Mol. Cell Endocrinology, 79: 147-152(1991))。そのようなシナリオは、血中グルコースの直接調節としてIGFBP-1の機能を設定する。
IGF系はIGF-I、IGF-II、及びインスリンのための膜結合レセプターをも構成する。I型IGFレセプターは、そのシグナリング通路の幾つかの構造と形状においてインスリンレセプターに密接に関係付けられる。JonesとClemmons, supra。IGF-IIレセプターは、細胞内のシグナルを移送することがないように見える排除レセプターである。JonesとClemmons, supra。インスリンレセプターに対してよりも、より高い親和力を持ったI型IGF-IレセプターにIGF-IとIGF-IIが結合することから、IGF-IとIGF-IIの大部分の作用がI型レセプターによって仲介されることは、ほぼ間違いない。Ballardら,“Does IGF-I everact through the insulin receptor?”, in Baxterら,(eds.), The Insulin-Like Growth Factors and Their Regulatory Proteins,(Amsterdam: Elsevier, 1994), pp. 131-138。
IGFBPsに結合するIGF-IとIGF-II上のドメインを同定するための多くの研究がなされている。Bayneら,J. Biol. Chem., 265: 15648-15652(1990); 米国特許第5,077,276; 5,164,370; 5,470,828。例えば、それはIGF-IとIGF-IIのN-末端領域がIGFBPsに結合するために臨界であることが発見されている。米国特許第5,077,276; 5,164,370; 5,470,828。かくして、des(1-3)IG-1と定義した自然なIGF-I変異体は、IGFBPsに不完全に結合する。
リサーチの類似の量が、I型IGFレセプターに結合するIGF-IとIGF-II上のドメインを同定するため進展している。Bayneら,supra; Ohら,supra。位置24, 31と60でIGF-I中のチロシン残基は、1型IGFレセプターへのIGF-Iの結合を困難にする。Bayneら,supra。これらのチロシン残基の1又はそれ以上が置換された変異IGF-I分子は、I型IGFレセプターに対して漸次減じられる結合を示した。Bayneら,supra,もまた、IGF-Iのそのような変異体がI型IGFレセプターとIGFBPsとに結合できたことを調査した。彼らはIGF-IとIGF-II上の完全に異なる残基が、I型IGFレセプターに結合するために用いたそれからのIGFBPsに結合するために使用されることを見出した。それは従って、IGFBPsへの減じられた結合を示すが、しかしそれがI型IGFレセプターに良く結合することから、インビトロでの活性測定において維持された活性を示す、IGF変異体を生産する可能性がある。
IGFBPsに結合するが、IGFレセプターにはしない且つそれ故にインビトロでの活性測定における減じられた活性を示すIGF変異体も報告される。Barら,Endocrinology, 127: 3243-3245(1990)。この変異体において(1-27,gly4,38-70)-hIGF-Iと定義したヒトIGF-IのC領域の残基28-37は、4つのグリシンブリッジによって配置される。Barらは、変異IGFに又はIGF自身へのIGFBPs結合の配置に基づいて心臓を経てのIGFBPとの複合体として灌流させた場合の変異IGF-Iの輸送を研究した。IGF変異体とIGFBPの複合体の局在化についてのデータのみが単独で与えられたIGF変異体の局在化についてのBarらによって供給されたデータはなかった。さらにBarらはIGF変異体の投与に応答するいずれかの生物学的な又は有効性についてのデータは提供していない。
端を切り取った他のIGF-I変異体が開示される。例えば、特許文献において、WO 96/33216は、確かなIGF-Iの1-69残基を有する端を切り取った変異体を記載する。EP 742,228は、省略されたCドメインを有する自然に生じる単鎖IGF-Iの誘導体である2-鎖IGF-I超アゴニストを開示する。そのIGF-I類似体は、式:BCn,Aである、
式中、BはIGF-I又はそれの機能的類似体のBドメインであり、CはIGF-I又はそれの機能的類似体のCドメインであり、nはCドメイン中のアミノ酸の数であり且つ約6から約12までである、及びAはIGF-I又はそれの機能的類似体のAドメインである。
さらに、Cascieriら,Biochemistry, 27: 3229-3233(1988)は、IGF-Iの4つの変異体、I型IGFレセプターへの減じられたアフィニティーを有する3つを開示する。これらの変異体は:(Phe23,Phe24,Tyr25)IGF-1(1及び2型IGF及びインスリンレセプターへのそれのアフィニティーにおいてヒトIGF-Iの備品である)、(Leu24)IGF-Iと(Ser24)IGF-I(ヒト胎盤I型IGFレセプター、該胎盤インスリンレセプター、及びラットとマウス細胞のI型IGFレセプターに対するIGF-Iよりもより低いアフィニティーを有する)、及びデスオクタペプチド(Leu24)IGF-I(I型IGFレセプターのための(Leu24)IGF-Iより低いアフィニティーとインスリンレセプターのためのより高いアフィニティーを有する、位置24での芳香性の欠損がhIGF-Iのカルボキシ末端D領域の削除と結合される)である。これらの4つの変異体は、ヒト血清結合タンパク質に対し通常のアフィニティーを有する。
Bayneら,J. Biol. Chem., 263: 6233-6239(1988)は、ヒトIGF-Iの4つの構造類似体を開示する:IGF-Iの最初の16アミノ酸におけるB鎖変異体は、インスリン、(Gln3,Ala4)IGF-I,(Tyr15,Leu16)IGF-I, 及び(Gln3,Ala4,Tyr15,Leu16)IGF-IのB鎖の最初の17アミノ酸と置換される。これらの研究は、血清結合タンパク質とIGF-IIレセプターとの高いアフィニティーを維持することに応答可能であるIGF-Iのドメインの幾つかを同定する。
Bayneら,J. Biol. Chem., 264: 11004-11008(1988)は、IGF-Iの3つの構造類似物を開示する:IGF-Iのカルボキシ末端8アミノ酸D領域を欠いている、(1-62)IGF-I;IGF-IのC領域の残基28-37が4つの残基グリシンブリッジによって置換された(1-27,Gly4,38-70)IGF-I;及びC領域グリシン置換及びD領域削除を伴う、(1-27,Gly4,38-62)IGF-I。Peterkofskyら,Endocrinology, 128: 1769-1779(1991)は、Bayneら,supra(Vol. 264)のGly4変異体を用いるデータを開示する。米国特許第5,714,460号は、IGF-I又は神経ダメージを治療するためのIGF-Iの活性濃度を増加する化合物を使用することに関する。
Cascieriら,J. Biol. Chem., 264: 2199-2202(1989)は、IGF-IのA領域中の特異的残基がインスリンのA鎖における一致する残基によって置換された3つのIGF-I類似体を開示する。その類似体は:(Ile41,Glu45,Gln46,Thr49,Ser50,Ile51,Ser53,Tyr55,Gln56)IGF-I, A鎖変異体、ここで残基41はトレオニンからイソロイシンまで変えられ且つA領域の残基42-56は置換される;(Thr49,Ser50,Ile51)IGF-I;及び(Tyr55,Gln56)IGF-Iである。
Clemmonsら,J. Biol. Chem., 265: 12210-12216(1990)は、IGFBP-1のリガンド特異性と、IGF-Iの生物学的活性を調節することにおけるIGFBP-1の役割を研究するためI型IGFレセプター又は結合タンパク質のいずれか一方のための減じられた結合アフィニティーを有するIGF-I類似物の使用を開示する。
WO 94/04569は、自然のIGFBP以外の特異的結合分子、即ちIGF-Iに結合することができ且つIGF-Iの生物学的活性を増大できる分子を開示する。
米国特許第5,593,844号と5,210,017号は、抗体の使用によって液体サンプル中のGH結合タンパク質又はIGFBPの量を定量化するために使用することができるリガンド介在免疫機能結合タンパク質アッセイを開示し、ここでは複合体形成がこれら結合タンパク質の一つとそれと結合するホルモンリガンドとの間で起こる。
IGF変異体の中のリサーチの方向性は、IGFBPsを結合することはないが、IGFレセプターへの維持された結合を示すIGF変異体を作製することに最も向けられている。そのような分子の研究に隠されたアイデアは、IGFの活性の抑制をすることが企図されるIGFBPsの主要な働きである。これら変異体中の主たるものは、IGFレセプターのためのアフィニティーを未だに維持したIGF結合タンパク質の幾つかのための選択的に減じられたアフィニティーを示す、自然の分子、des(1-3)IGF-Iである。米国特許第5,077,276号;5,164,370号;5,470,828号,supra。
IGFアゴニストとして作用する分子のための、及び高いアフィニティーによってIGF結合タンパク質に結合する分子のための、及び特別な治療又は診断的な目的のための技術の必要性がある。
発明の開示
本発明は、それの作用の一部として、IGFの作用をアゴナイズするためにIGFBP-1への結合によるようなIGFBPへのIGFの結合を抑制する放出因子を提供するための新規な方法に関する。従って、本発明は、(1-27,gly4,38-70)-hIGF-Iを除く、ヒトIGFレセプターに結合することがないIGFBPに対する抗体を除く、及び位置24, 31, 及び/又は60で置換又は削除したチロシン残基を持つヒトIGF-Iの自然の配列を有するペプチドを除く、そのIGFBPsのいずれか1つとIGFとの相互作用を抑制し且つヒトIGFレセプターに結合しない化合物を提供する。
好ましくは、ここでの該化合物はIGFBP、好ましくは血清IGFBPに結合する。また好ましくは、該化合物は、哺乳動物中の血漿インスリン分泌を減じ、血漿GHを減じ、及び/又は血中グルコースレベルを減じる。
他の好適な実施態様において、ここでの化合物は、ペプチド、特に、約10から約25のアミノ酸残基を有する及び/又はそのN末端から位置5, 6, 7, 又は8と番号付けしたシステイン残基を有する又はそのC末端から位置5, 6, 7, 又は8と番号付けしたシステイン残基を、又はそのようなシステイン残基の両方を、又はそのN末端から位置2と番号付けしたシステイン残基を有するペプチドである。
別な実施態様において、本発明は以下のペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列を含んでいるペプチドを提供する:
別な実施態様において、該ペプチドは、配列番号:104であるアミノ酸配列を含む。別な実施態様において、該ペプチドは、配列番号:105、配列番号:106、配列番号:107、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:113、配列番号:114、配列番号:115、又は配列番号:116であるアミノ酸配列を含む。更なる実施態様において、該ペプチドは、配列番号:109、配列番号:117、配列番号:118、配列番号:119、配列番号:120、又は配列番号:121であるアミノ酸配列を含む。更なる実施態様において該ペプチドは、配列番号:122、配列番号:123、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:129、配列番号:130、配列番号:132、又は配列番号:133であるアミノ酸配列を含む。
更に別な実施態様において、該ペプチドは、位置2,3,4,又は6でD-アラニン置換又は位置7,8,9,11,12,13,又は14でアルファ-アミノイソブチラート置換、又は上記のいずれかの組合せを有する配列番号:15のアミノ酸配列を含む。好ましくは、このペプチドは位置2,3,又は6でのD-アラニン置換又は位置7,8,9,11,12,13,又は14でのアルファ-アミノブチラート置換、又は上記のいずれかの組合せを有する。より好ましくは、このペプチドは、位置6でのD-アラニン置換又は位置8,9,又は13でのアルファ-アミノイソブチラート置換を有する。更に好ましくは、ペプチドのこれら後者のセットは、YFGではなくAAである配列番号:15のC末端を有する。
また、製薬的に許容される担体中に、上記化合物又はペプチドの一つを含む組成物をここに提供した。好ましくは、この組成物は無菌である。
これらの化合物及びペプチドの使用は、外因性又は内因性IGFsの少なくとも1の生物学的活性を開放する又は増大する全ての使用を含む。それらは、後述するように、IGF-IのようなIGFが使用される、治療、抑制、又は予防条件において使用され得る。
また、そのIGFBPsのいずれか1つとIGFの相互作用を抑制し且つヒトIGFレセプターと結合しない化合物の有効な量を哺乳動物に投与することを含んでいる哺乳動物における生物学的活性IGFの血清又は組織レベルを増加するための方法をここにさらに提供した。好ましくは、この化合物はまた、哺乳動物中の血漿インスリン分泌、血漿GH分泌、または血中グルコースレベルをも減じ、且ついずれかの種からの内因性GHの分泌又は放出を直接刺激しない。他の好適な実施態様において、この化合物は、IGFBP-1及び/又はIGFBP-3のようなIGFBPに結合し、及び/又はヒトI型IGFレセプターと結合しない。加えて、該哺乳動物は、好ましくはヒトであり、且つ該化合物は、好ましくはペプチド、より好ましくは約10から約25アミノ酸残基を有するそれである。また該化合物を、好ましくは体重増加を生じるために有効な量において、哺乳動物中の同化作用の増加を生じさせるために投与することが好適である。血糖値制御が、該化合物が投与された後の哺乳動物中でもたらされることが更に好適である。
もしそれがペプチドであるなら、該化合物をコードしている単離した核酸も又提供され、インビボで又はエクスビボ遺伝子治療のため使用され得る。
この化合物は、単独で、或いはGH、GH放出ペプチド(GHRP)、GH放出因子(GHRF)、GH放出ホルモン(GHRH)、GH分泌促進剤、IGF、IGFBPとの組み合わせにおいてのIGF、IGFBP、GH結合タンパク質(GHBP)との組合せにおいてのGH、インスリン、又は低血糖剤(以下に定義したチアゾリジンジオンのようなインスリン感作剤を含む)のような別の剤と一緒に投与され得る。
本発明の更に別な態様において、そのIGFBPsのいずれか1つとIGFとの相互作用を抑制する及びヒトIGFレセプターに結合しない化合物の有効な量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物において血糖値制御を生じさせるための方法が提供される。好ましくは、該化合物は、哺乳動物中の血漿インスリン分泌及び血中グルコースレベルをも減じ、且つIGFBPを結合する。また好ましくは、該哺乳動物は、糖尿病のような高血糖症疾患を有する。この方法は、低血糖剤又はインスリンの有効量を該哺乳動物に投与することを補足的に含み得る。
また、哺乳動物における生物学的活性IGFの血清及び組織レベルを増加するための方法及び哺乳動物において同化作用を増加するための方法、又はここでの化合物を含有する有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において血糖値を制御するための方法が提供される。
別な実施態様において:
(a)体液中のIGFのレベルを測定すること;
(b)単一又は複数投薬を用いこの化合物と該液とを接触させること;及び
(c)該液中のIGFのレベルを再測定すること、ここでもし該液のIGFレベルが、該化合物が投与されたために望まれる効力を生じさせるために十分な量によって低下しているならば、該化合物の投薬量が最大限の効力を生じさせるために調節可能であり又は調節される、
を含む、IGFとそのIGFBPsのいずれか1つとの相互作用を抑制し且つヒトIGFレセプターに結合しない、化合物の妥当な投薬量を測定するための方法が提供される。
更に別の実施態様において、該化合物の投薬量が妥当に調節され得るように生物学的液体中の特有のIGFBPの量を又は特有のIGFBPに結合する該化合物の量を測定するための方法が提供される。この方法は:
(a)該液体と、1)固相担体に付着した第1の抗体とを接触させること、該第1の抗体は、抗体の存在中でIGF結合サイトが該化合物に結合するためのIGFBP上に利用可能に残るようにIGFBP上のエピトープのために特異的であり、それによって該第1の抗体とIGFBPとの間の複合体を形成すること;及び2)IGFBP上の全ての利用可能なIGF結合サイトを飽和させるために十分な時間、上記同定した化合物と接触させること、それによって飽和した複合体を形成すること;
(b)該化合物がIGFBPに結合される場合に結合に利用可能である該化合物上のエピトープに特異的である検出可能に標識した第2の抗体と該飽和した複合体とを接触させること;及び
(c)生物学的液体中のIGFBPの指標として、且つそれ故に結合した該化合物の量の指標として、標識した第2の抗体結合の量を定量分析すること、
を含む。
また、ここでの化合物を含む製薬組成物及び該組成物を使用するために使用者向けの指示書を含めた容器を含むキットがここに意図される。このキットは、GH、GHRP、GHRF、GHRH、GH分泌促進剤、IGF、IGFBPとのIGF複合体、IGFBP、GHPBと複合したGH、インスリン、又は低血糖剤を含む容器を任意に更に含み得る。
また、リガンドに結合するポリペプチドと競合するペプチドのリガンドに対する相対アフィニティーを予測するための方法がここに包含され、該ペプチドはファージ-ディスプレーライブラリーから誘導され、該リガンドの存在において該ポリペプチドと、該ペプチドに一致するファージミドクローンをインキュベートすること、該ファージを順次希釈すること、及び該ペプチドによって抑制される該リガンドに対するファージミドクローンの結合に対する度合を測定すること、ここで低いファージ濃度でのみ抑制されるファージミドクローンは、高い及び低いファージ濃度の両方で抑制されるファージミドクローンよりもリガンドへのより高いアフィニティーを有する、を含む方法である。
ここでの別な実施態様において、そのサイトに普及した、又は該サイトから不在のいずれかであるIGFBPに特異的であるここでの化合物の有効な量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物中の特有なサイトの別の方向に、又はその方向のいずれかに内因性IGFを導くための方法である。
更なる実施態様は、IGF結合タンパク質に結合した内因性又は外因性IGFを、又はIGF結合タンパク質に結合し且つIGF結合タンパク質に結合したヒトIGFレセプターに結合しない化合物の量を検出する、又は生物学的液体中の未結合IGFレベルを検出するための方法であり:
(a)該液体と、1)固相担体に付着した化合物を検出するための手段とを接触させること、該手段は、該化合物の存在中でIGF結合サイトがIGF結合タンパク質に結合するための化合物上に利用可能に残るよう該化合物に特異的であり、それによって該手段とIGF結合タンパク質との間の複合体を形成すること;及び2)IGF結合タンパク質上の利用可能なIGF結合サイトの全てを飽和するために十分な時間、該化合物と接触させること、それによって飽和した複合体を形成すること;
(b)該化合物がIGF結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能であるIGF結合タンパク質のために特異的である検出可能に標識した第2の手段と、該飽和した複合体とを接触させること;及び
(c)IGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物とIGF結合タンパク質、結合したIGFとIGF結合タンパク質、又は該液体中に存在する活性IGFの指標として、結合した標識した手段の量を定量分析すること、
を含む。
IGFの作用においてIGFBPsの役割についての多くの論議がある。各種の状況においてIGFsの活性は、抑制され、増大され、又はIGFBPsの存在によって影響されないいずれか一方とされることが示されている。JonesとClemmons, supra; BachとRechler, supra。もしIGFBPsがIGFsの何らかの作用の義務を負わされるなら不明確とされている。何らかの作用のために、IGFBPsに結合されるべきIGFsのために必要とされる、又はもしIGF-Iが完全に活性化されたならば、存在すべきIGFBPsのためにそれが必要とされたことが可能であると思われた。本研究の前に、何がそのIGFBPsのいずれか1つによってIGFの相互作用を抑制する分子を投与することのインビボでの正味の生物学的作用とされるであろうことは不明確であった。
ここでの化合物は、その後者が短い半減期と効果を有すること、それに対してここでの化合物が長い半減期と効果を有していること、及び、もしそれがIGFBPsに結合するならば、この結合が短鎖ペプチドと他の小さな分子に急速に他方を排除するであろう通常の腎臓の濾過を回避することから、des(1-3)IGF-IのようなIGF変異体に勝っている。更に、外因性GH又はGH分泌促進物質と一緒にここでの化合物を投与することは、そのようなGHと分泌促進剤の糖尿病誘発性作用を最上限にする有効性を有するであろう。ここでの化合物の更に別の有効性は、ここでのIGFアゴニスト化合物の作用の上限を決めることである。即ち、それは、もしその最大効力を越える高い濃度で使用したならば、望ましくない副作用を有し得る、IGF-Iとは異なり、搬送IGFsへのIGFBPsの最大許容量よりもより効果的に発揮できない。
【図面の簡単な説明】
図1は、Y24L,Y31A,又は(Leu24,Ala31)hIGF-1,又はIGF-Mとしてここに定義したIGF-I変異体をコードしているDNAの5’末端で接合したlamBシグナルの核酸配列(配列番号:17)と翻訳したアミノ酸配列(配列番号:18)を表し、位置24でTyrがLeuに変わり、位置31でTyrがAlaに変えられる。
図2は、p131TGFのベクターフラグメントからの、pBKIGF-2Bの120-bpと190-bpフラグメントからの、及びDNAの合成片からの、プラスミドpIGFMIの構築を表す。
図3は、pIGFMIの完全ヌクレオチド配列(配列番号:19)を表す。
図4は、IGF-I(四角)又は(Leu24,Ala31)hIGF-1(丸)がKIRAリン酸化アッセイにおいてMCF-7細胞に加えられる場合のレセプターリン酸化のための標準曲線である。
図5は、IGF-I又は(Leu24,Ala31)hIGF-1を用いるマウス3T3細胞中へのチミジン混入を示す。
図6は、IGFBP-1への(Leu24,Ala31)hIGF-1の結合アフィニティーを示す。
図7は、IGFBP-3への(Leu24,Ala31)hIGF-1の結合アフィニティーを示す。
図8Aと8Bは、平均化し且つ100%にセットした前処置血液サンプルでの値のパーセンテージとして表した、(Leu24,Ala31)hIGF-1(黒丸)又はコントロール(PBS)(白四角)によって、第1の実験において処置した通常ラットの血漿グルコース(図8A)と血漿インスリン(図8B)の応答を表す。
図9Aと9Bは、平均化し且つ100%にセットした前処置血液サンプルでの値のパーセンテージとして表した、(Leu24,Ala31)hIGF-1(黒三角)、又はIGF-I(黒丸)、又はコントロール(PBS)(白四角)によって、第2の実験において処置した通常ラットの血漿グルコース(図9A)と血漿インスリン(図9B)の応答を表す。
図10Aと図10Bは、(Leu24,Ala31)hIGF-1、IGF-I、又はコントロールによって処置した糖尿病ラットの基線(100%としてセット)からの血漿インスリン(図10A)及び基線(100%としてセット)からの血漿グルコース(図10B)におけるパーセンテージ変化を示す。
図11Aと図11Bは、(Leu24,Ala31)hIGF-1、IGF-I、又はコントロールによって、第2の実験において処置した糖尿病(ZDF)ラットの基線(100%としてセット)からの血漿インスリン(図11A)及び基線(100%としてセット)からの血漿グルコース(図11B)におけるパーセンテージ変化を示す。
図12は、7日間にわたり、2つの投薬量での(Leu24,Ala31)hIGF-1によって、GHによって、GHと(Leu24,Ala31)hIGF-1の組合せによって、又はコントロールによって、処置したラットの最終体重を示す。
図13Aと13Bは、図12についての上述した実験における脾臓の重量を示し、図13Aは絶対脾臓重量を示し、図13Bは体重のパーセンテージとして表した脾臓重量を示す。
図14Aと14Bは、図12についての上述した実験における胸腺の重量を示し、図14Aは絶対胸腺重量を示し、図14Bは体重のパーセンテージとして表した胸腺重量を示す。
図15Aと15Bは、図12についての上述した実験における心臓の重量を示し、図15Aは絶対心臓重量を示し、図15Bは体重のパーセンテージとして表した心臓重量を示す。
図16は、図12についての上述した実験における5つの処置群からの骨端のプレート幅を示す。
図17Aと17Bは、図12について記載した実験における5つの処置群中のラットIGF-Iの量(図17A)と全IGF-Iの量(図17B)を示す。
図18は、プラシーボ(白四角)、(Leu24,Ala31)hIGF-1(白三角)、IGF-I(白丸)、(Leu24,Ala31)hIGF-1とIGF-Iの組合せ(黒四角)、GH(半白/半黒四角)、及び(Leu24,Ala31)hIGF-1とGHの組合せ(黒四角)で処置したdwarfラットの7日間にわたる最終体重を表す。
図19Aと19Bは、図18についての上述した実験における脾臓の重量を示し、図19Aは絶対脾臓重量を示し、図19Bは体重のパーセンテージとして表した脾臓重量を示す。
図20Aと20Bは、図18についての上述した実験における腎臓の重量を示し、図20Aは絶対脾臓重量を示し、図20Bは体重のパーセンテージとして表した脾臓重量を示す。
図21Aと21Bは、図18について記載した実験における6つの処置群での血液中のラットIGF-Iの量(図21A)と全IGF-Iの量(図21B)を示す。
図22Aと22Bは、賦形剤コントロールで(黒三角)、150μgの(Leu24,Ala31)hIGF-1でtid(一日に三度)(白四角)、50μgの(Leu24,Ala31)hIGF-1でtid(白丸)及び50μgのIGF-Iでtid(黒丸)、処置した糖尿病ラットの長期間にわたる体重増加(図22A)と血中グルコースレベル(図22B)を表す。
図23Aと23Bは、図22について記載した実験における血中グルコースレベルの増加(図23A)とインスリンレベルの変化(図23B)を示す。コントロールは黒バーで、150μgの変異体は暗斜線バーで、50μgの変異体は明斜線バーで、及びIGF-Iは白バーで示した。
図24はファージライブラリーを構築するためのテンプレートとして使ったプラスミドpt4.g8のDNA配列(配列番号:20)を表す。またバクテリオファージM13のg8pに融合した抗体-認識可能(gD-tag)ペプチドのアミノ酸配列(配列番号:20)も示される。
図25は、4つのライブラリープールのそれぞれと、標的IGF-I、IGFBP-1、及びIGFBP-3を用いる選択による遺伝子-8固有ファージライブラリー富化を示す。
図26は、IGFBP-3選択からのg8-ファージペプチドを用いるIGF-I遮断アッセイを示し、ここでファージ滴定は100nM IGF-Iによる。該図中、白丸はペプチド4A3.1であり、白三角はペプチド4B3.4であり、白四角はペプチド4C3.2であり、黒丸はペプチド4D3.3であり、黒三角はペプチド4D3.4であり、黒四角はペプチド4D3.5である。
図27は、IGFBP-3選択からのg8-ファージペプチドを用いるIGF-I遮断アッセイを示し、ここでファージ滴定はIGF-Iなしである。ペプチドのために定義は図26についての上記したそれと同じである。
図28は、IGFBP-1選択からのg8-ファージペプチドを用いるIGF-I遮断アッセイを示し、こでファージ滴定は1μM IGF-Iによる。
図29は、IGFBP-3選択からのg8-ファージペプチドを用いるIGF-I遮断アッセイを示し、ここでペプチド(4C3.2, 4D3.8, 4D3.9, 4D3.11, 及び4D3.12)は、NEUTRAVIDINTM/DTT選択からとする。黒バーは100μM IGF-Iによるもので、白バーはIGF-I無しである。
図30は、IGFBP-3選択からのg8-ファージペプチドを用いるIGF-I遮断アッセイを示し、ここでペプチド(x軸上に示した)は、直接-被覆/HCl選択からとする。黒バーは100μM IGF-Iによるもので、白バーはIGF-I無しである。
図31は、遊離結合タンパク質を測定するためにBIAcoreTM表面プラスモン-共鳴装置を用いIGFBP-3に結合するペプチド(BP3-01と定義した)によるIGFBP-3抑制の競合アッセイを表す。丸はIGF-Iの800応答単位(RU)を示し、四角は固定化したIGF-Iの400RUを示す。
図32は、遊離結合タンパク質を測定するためにBIAcoreTM表面プラスモン-共鳴装置を用いIGFBP-3に結合するペプチド(BP3-02と定義した)によるIGFBP-3抑制の競合アッセイを表す。丸はIGF-Iの800RUを示し、四角は固定化したIGF-Iの400RUを示す。
図33は、IGFBP-1又はIGFBP-3に結合するが、I型IGFレセプターに結合しない3つのペプチドによってプレート上のIGF-Iへのビオチン化IGFBP-1結合の抑制を示す(bp1-01:黒丸、bp1-02:白丸、及びbp3-01-ox:白三角)。
図34は、IGFBP-1に結合するが、I型IGFレセプターに結合しない2つのペプチドによってプレート上のIGF-Iへのビオチン化IGFBP-3結合の抑制を示す(bp1-01(bp3):黒丸、bp1-02(bp3):白丸)。
図35は、IGFBP-3を抑制するため、IGFBP-3に結合するが、I型IGFレセプターに結合しない2つのペプチドの能力の放射能標識IGF-Iプレートアッセイを示す(bp3-01-ox:丸、bp3-02:四角)。
図36は、IGFBP-1を抑制するため、図35について記載した2つのIGFBP-3結合ペプチドの能力の放射能標識IGF-Iプレートアッセイを示す(シンボルは同じ)。
図37は、3つのペプチドを用いるIGF-I活性のKIRAアッセイを表す(bp1-01:四角、bp1-02:丸、及びbp3-ox:三角)。図37Aは、ペプチド単独を表し、図37BはペプチドプラスIGF-IプラスIGFBP-1を表し、図37CはペプチドプラスIGF-Iを表し、図37DはペプチドプラスIGF-IプラスIGFBP-3を表す。
図38は、遊離結合タンパク質を測定するためBIAcoreTM表面プラスモン-共鳴装置を用い、bp3-01-ox(白四角)、BP14(白丸)、BP15(黒丸)、及びBP17(黒四角)で定義した、4つのペプチドによるIGFBP-3抑制のIGF-II競合アッセイを表す。各ペプチドA 20nM IGFBP-3と固定化IGF-IIの約1500RUを用い試験した。
図39は、H2O溶液中30℃でのIGFBP-1(bp1-01)へのペプチド結合の一次元1H NMRスペクトルを表す。
図40Aと40Bは、溶液中のペプチドbp1-01の構造の三次元モデルを開示する。これらはNMRデータから得た制限を用いて計算した構造の総体からのp1-01の表現構造の立体表示である。バックボーン部分はリボンとして表し、側鎖重原子の全てが示され;各非グリシン残基が標識される。二つの視界はほぼ90°相違する。その相対平面疎水性表面(図40A中の左、及び図40B中の視界の方向)は、自己会合が含まれ、IGFBP-1結合も含まれ得る。
図41は、通常のヒトからの血清中に存在する内因性IGFBPsから125I-IGF-Iを移す変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1の能力を実証するクロマトグラムである。データはフラクション(n=1)当たりのcpmとして表した。該図中、丸を伴う実線はインキュベーションの1の時点での変異体であり、丸を伴う長ダッシュ線はインキュベーションの0.5時間の時点での変異体であり、ダイアモンドを伴う短ダッシュ線はインキュベーションの3時間の時点での変異体であり、及び四角を伴う短ドット線はインキュベーションの16時間の時点での変異体である。
図42は、プラシーボ(p)又は一日二度の皮下注射によって12週間、rhIGF-1の10(1)、20(2)、40(4)、又は80(8)μg/kgで処置したII型糖尿病患者の血液中のIGF-Iの濃度を示す。
図43は、図42について記した通りに処置した患者の血液中のIGF-IIの濃度を示す。
図44は、図42について記した通りに処置した患者の血液中のIGFBP-3の濃度を示す。
好適な実施態様の記載
A.定義
ここで用いた通り治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜、及び飼育動物、及び動物園、スポーツ用、又は愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む、哺乳動物として分類されたいずれかの動物に関する。ここでの好ましい哺乳動物はヒトである。用語「非成人」は、周産期から(低誕生重乳児のような)成熟期に達するまでの、その後者は完全な成長可能性にまで達していないそれらである、哺乳動物に関する。
ここで用いた通り「IGF」は、自然インスリン様成長因子-I及び自然インスリン様増殖因子-II、同様に他方ではdes(1-3)IGF-Iとして知られる脳IGFのようなそれの自然変異体に関する。
ここで用いた通り「IGF-I」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヒトを含む何れかの種、好ましくはヒトからの、及びもし外因性投与に関係するならば、自然、合成又は組換えの何れかの1つの、何れかのソースからのインスリン様成長因子-Iに関する。ヒト自然-配列、成熟IGF-I、より好ましくはN末端メチオニンを除いたものが、例えば、1987年8月5日公開のEP 230,869;1984年12月19日公開のEP 128,733;又は1988年10月26日公開のEP 288,451中に記載された方法により調製される。より好ましくは、この自然-配列IGF-Iは、組換え的に生産され且つ臨床的研究のためにはジェネンテック社,South San Francisco, CAから利用可能とされる。
ここで用いた通り「IGF-II」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヒトを含む何れかの種、好ましくはヒトからの、及びもし外因性投与に関係するならば、自然、合成又は組換えの何れかの1つの、何れかのソースからのインスリン様成長因子-IIに関する。それは、例えば上記EP 128,733中に記載した方法によって調製され得る。
「IGFBP」又は「IGF結合タンパク質」は、それが循環性(即ち血清又は組織中)であろうとなかろうと、IGF-I又はIGF-IIと通常は結合する又は結合した又は複合化したタンパク質又はポリペプチドに関する。そのような結合タンパク質は、レセプターを含まない。この定義は、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、Mac25(IGFBP-7)、及びプロスタサイクリン-刺激因子(PSF)又は内皮細胞-特異的分子(ESM-1)、同様にIGFBPsに高い相同性を持つ他のタンパク質を含む。Mac25は、例えば、Swisshelmら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476(1995)とOhら,J. Biol. Chem., 271: 30322-30325(1996)中に記載される。PSFは、Yamauchiら,Biochemical Journal, 303: 591-598(1994)中に記載される。ESM-1は、Lassalleら,J. Biol. Chem., 271: 20458-20464(1996)中に記載される。他に同定されたIGFBPsのため、例えば、1990年6月27日公開のEP 375,438;1990年5月23日公開のEP 369,943;1989年10月5日公開のWO 89/09268;Woodら,Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185(1988);Brinkmanら,The EMBO J., 7: 2417-2423(1988);Leeら,Mol. Endocrinol., 2: 404-411(1988);Brewerら,BBRC, 152: 1289-1297(1988);1988年12月7日公開のEP 294,021;Baxterら,BBRC, 147: 408-415(1987);Leungら,Nature, 330: 537-543(1987);Martinら,J. Biol. Chem., 261: 8754-8760(1986);Baxterら,Comp. Biochem. physiol., 91B: 229-235(1988);1989年9月21日公開のWO 89/08667;1989年10月19日公開のWO 89/09792;及びBinkertら,EMBO J., 8: 2497-2502(1989)を参照。
用語「体液」は、哺乳動物からの、好ましくはヒトからの液の生物学的サンプルに関する。そのような液は、血清、血漿、リンパ液、滑液、小胞液、精液、羊膜液、乳液、全血、尿、脳脊髄液、唾液、涙液、汗、粘液、組織培養培地、組織抽出液、及び細胞の抽出液のような水性流体を含む。
ここで用いた通り「ヒトIGFレセプター」は、ヒトにおいて見出されたIGFのための何れかのレセプターに関し、胎盤1型IGF-Iレセプター等のような、ヒトIGF-IとIGF-IIの両者に結合する、ヒトにおける1型と2型IGFレセプターを含む。
そのIGFBPsの何れか1つとIGFとの相互作用を「抑制する」又は「防止する」化合物は、たとえこの増加が生じるとしても、生物学的に活性なIGFの血清及び組織レベルを増加する分子に関する。例えば、該化合物は、IGFがそれのIGFBPsの1又はそれ以上と結合した複合体から活性なIGFを部分的に又は完全に移し替えができる。この定義の下に該化合物は、IGFBPに結合でき、且つそれによってIGFBPに依然結合した内因性IGFを移し替えるように作用する可能性があり、又はそのIGFBPsの1又はそれ以上とIGFとの相互作用を抑制又は防止するためにレセプター相互作用に含まれたそれから離れたサイトでIGF自身に結合でき、しかしそのレセプターの何れかとIGFとの相互作用は抑制又は防止しない。更に、該化合物がIGFBPsを占めると同時に、その三重複合体における効果は、二重複合体が三重のそれを形成できるかどうかに基づくであろう。ALSと複合体を形成できるIGFアゴニスト化合物は、IGFsと置き換えられるであろうが、しかしIGFBP-3の又は三重複合体の濃度に影響を及ぼさない。ALSと複合体を形成できないIGFアゴニスト化合物は、IGFBP-3を占有するであろうし、ALS/IGFBP-3/IGF複合体の量は減じられるであろう。これは、三重複合体を形成し得る完全長IGF変異体とそれができない小さなペプチドとの間の相違であろう。ここでのペプチドの実例的な一つの構造とIGFBPとそれの相互作用に関しては、後述の実施例9を参照。
「IGF結合タンパク質と結合する」化合物は、高いアフィニティーであろうとなかろうと、少なくともいくらかの度合でIGFBPを結合する化合物に関する。
「ヒトIGFレセプターに結合しない」化合物は、何れかのそのようなレセプターに全てが結合せず、又は約200倍より大きく、そのようなレセプターに結合する野生型ヒトIGF-I(hIGF-I)又は野生型ヒトIGF-II(hIGF-II)より小さいアフィニティーを持つそのようなレセプターに結合する。好ましくは、該化合物は約250倍よりも大きく、同じレセプターに結合する野生型hIGF-I又はhIGF-IIよりも小さいか又は全てに結合しないアフィニティーを持ったそのようなレセプターに結合する。そのような化合物は、ヒトI型IGFレセプターをリン酸化せず、KIRA及び実施例1のマウス3T3アッセイを用いるマウス3T3細胞内のチミジン取込みにより測定した通りのマウスIGF-Iレセプターを刺激しない、即ち該化合物は(Leu24,Ala31)hIGF-1と同様に作用し又はこれらアッセイにおいてこの変異体よりも一様に低くレセプターと結合する、一つとして補足的に定義される。更に、IGF-IIは、IGF-Iアゴニストとして説明され得るし、IGF-IはIGF-IIアゴニストとして説明され得る。しかしながら、IGF-IとIGF-IIの両方はI型IGFレセプターに結合し、且つレセプター活性分子とここで定義した通りの化合物の範囲内ではない両方である。
「疾患」は、制限されること無しに、例えば、肺病、後述するような高血糖疾患、腎疾患、急性及び慢性腎不全のような、最終段階の慢性腎不全、糸球体腎炎、間質性腎炎、腎孟腎炎、糸球体硬化症、例えば、糖尿病患者と腎臓移植後の腎疾患におけるキンメルスティール-ウィルソン病、肥満症、GH-不全、ターナー症候群、ラロン症候群、小人症、肥満症及び体重対身長比の増加のような老化に関連した望ましくない徴候、減少したCD4及び減少した免疫体性又は化学療法で誘発された組織ダメージを含む免疫欠損症のような免疫学的疾患、骨髄移植、心臓機能不全とうっ血性心不全のような心臓構造又は機能の疾患又は不全、ニューロンの、神経学的な、又は神経筋の疾患、例えば周辺神経症、多発性硬化症、筋ジストロフィー、又は筋緊張性ジストロフィー、及び例えば、外傷又は創傷又は細菌又はHIVのようなヒトウイルスによる感染、創傷、皮膚病、復元を要する腸構造と機能、その他を含む何れかの状態によって生じたるいそうに関連した異化作用の状態、を含むIGFによる治療により利益を得るであろう何れかの状態である。治療されるべき疾患は上記の2又はそれ以上の組合せとされ得る。ここでの治療のために標的とされる好適な疾患は、糖尿病と肥満症、心臓機能不全、腎臓疾患、神経学的疾患、全身体成長疾患、及び免疫学的疾患である。
ここで用いた通り用語「高血糖疾患」は、糖尿病及びI型とII型糖尿病のようなインスリン耐性の結果生じる疾患、同様に重症のインスリン耐性、高インスリン血症、及び高脂血症、例えば肥満患者、及びインスリン耐性糖尿病、Mendenhall’s症候群のような、ヴェルナー症候群、妖精症、脂肪組織萎縮性糖尿病、及び他の脂肪組織萎縮症の全ての形態に関する。好ましい高血糖症疾患は、糖尿病、とりわけI型とII型糖尿病である。「糖尿病」それ自身は、インスリンの不十分な生産又は利用を含む炭水化物代謝の発展的疾患に関し及び高血糖症と糖尿によって特徴付けされる。
ここで用いた通り用語「治療」は、治療的な処置と予防又は予防手段の両方に関する。治療が必要なそれらは、既に疾患に罹っているそれら、同様に疾患に罹る傾向にある又は疾患と診断されたそれら又は該疾患を予防するべきそれらを含む。連続した治療又は投与は、1又はそれ以上の日数による治療において中断すること無しに、少なくとも毎日を基本とする治療に関する。間欠的な治療又は投与、又は間欠的形態における治療又は投与は、連続的ではないが、ある程度まで事実上周期的である治療に関する。ここでの治療体制は、連続的又は間欠的の何れか一方とすることができる。
ここで用いた通り用語「低血糖剤」は、グルコース代謝を調節するために有用な、好ましくは経口剤である化合物に関する。ここでヒトに使用するためにより好適には、インスリン及び膵臓によるインスリンの分泌を生じさせる経口低血糖剤のスルホニル尿素クラスである。実例は、グリブリド、グリピジド、及びグリクラジンを含む。加えて、ビグアニド(メトホルミンとフェンホルミンを含む)及びREZULINTM(troglitazone)ブランド インスリン感作剤のようなチアゾリデンジオンのようなインスリン感受性を増加する又はインスリン感作とする剤、及びこの定義の中にある、PPARガンマ核レセプターに結合する他の化合物も好適とされる。
ここで用いた通り、「インスリン」は、何れかの種からのインスリンの何れかの形態、及び天然又は合成又は組換えから得られた何れかに関する。好ましくはそれはNPHインスリンである。
ここで用いた通り、内因性IGFの血清及び組織レベルの変更の状況において「活性」又は「生物学的活性」IGFは、それのレセプターに、又は上記に関する内因性又は外因性IGFのそれの生物学的活性のような、生じる生物学的活性の原因となる他の物に結合するIGFに関する。
それのIGFBPsの何れか一つとIGFの相互作用を抑制し、ヒトIGFレセプターを結合しない「分子」又は「化合物」は、GH分泌促進剤、ここに与えた三次元モデルでモデル化後の有機化学分子、及び後述のペプチドにより実例化される、高い経口生物利用能を持つ分子を含む。そのような化合物はまた、「IGFアゴニスト」又は「IGFアゴニスト化合物」としてここに関連される。
「ペプチド」は、少なくとも2つのアミノ酸を有する分子を含み、且つ少なくとも約50アミノ酸を有するポリペプチドを含む。好ましくは、該ポリペプチドは約10から約25アミノ酸を、より好ましくは約12−25、最も好ましくは15−25アミノ酸を有する。その定義はペプチド誘導体、それの塩、又は光学異性体を含む。
「成長ホルモン放出ペプチド又は因子」(“GHRP”又は“GFRF”)は、分泌促進剤として後述される。「成長ホルモン放出ホルモン」(“GHRH”)は、細胞又は組織からGHを放出する何れかのホルモンとされ得る。「成長ホルモン結合タンパク質と組み合わせた成長ホルモン」(“GH”プラス“GHBP”)は、その結合タンパク質の一つを持つ又は他と結合したGH複合体を意味する。同様に「IGF結合タンパク質と組み合わせたIGF」(“IGF”プラス“IGFBP”)は、それのIGFBPの一つを持つ又は他と結合したIGF複合体に関する。
B.本発明を実施するための態様
この場合本発明は、(1-27,gly4,38-70)-hIGF-Iを除く、IGFBP(に結合する)抗体アゴニストを除く、IGF(に結合する)抗体アゴニストを除く、及び位置24, 31,及び/又は60で置換又は削除したチロシン残基を持つヒトIGF-Iの自然の配列を有するペプチドを除く、そのIGFBPsの1又はそれ以上とIGFとの相互作用を抑制し且つヒトIGFレセプターに結合しない化合物に関する。好ましくは、該化合物はIGFBPに及び/又はIGFに、とりわけIGFBP-1、又はIGFBP-3に、又はIGFBP-1とIGFBP-2の両方に、又はIGF-Iに、又はIGF-IIに、又はIGF-IとIGF-IIの両方に、又はIGFBP-1又は-3とIGF-I又はIGF-IIに結合する。また好ましくは、該化合物はペプチドである。より好ましくは、それはIGFBP、とりわけ血清IGFBPに結合するペプチドである。また、好ましくは、該化合物は哺乳動物中の血漿インスリン分泌を減じ、血漿GHを減じ、又は血中グルコースレベルを減じる。
より好ましくは、該ペプチドは約10から約25アミノ酸残基を有し及び/又はそのN末端から番号付けした位置5,6,7,又は8でシステイン残基を又はそのC末端から番号付けした位置5,6,7,又は8でシステイン残基を、又はそのようなシステイン残基の両方を、又はそのN末端から番号付けした位置2でシステイン残基を有する。好ましくは、上述したペプチドは、12から25、より好ましくは15から25、アミノ酸残基を有する。より好ましくは、該ペプチドはそのN末端から番号付けした位置1,2,3,4,又は5でトリプトファン残基を有する。更に好ましくは、該ペプチドはN末端システイン残基までに補足的にバリン、セリン、又はグルタミンN末端を有する。更に好ましくは、該ペプチドはN末端システインまでの残基N末端がバリン残基である。更に好ましくは、該ペプチドはN末端システインまでの3つの残基C末端である位置で始まる残基のグリシン-プロリン又はバリン-アラニン配列を有する。このペプチドはさらに好ましくは、残基のグリシン-プロリン又はバリン-アラニン配列までに3つの残基C末端の中にトリプトファン残基を有する。このペプチドはより好ましくは、C末端システイン残基までの2つの残基N末端の中にロイシン又はバリン残基を有する。このペプチドは更に好ましくは、そのC末端から番号付けした位置2又は3でトリプトファン残基を有する。
また好適には、配列番号:1−16からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、このペプチドは、配列番号:4、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、及び配列番号:16からなる群から選択される配列を含む。より好ましくは、このペプチドは、配列番号:4、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:15、又は配列番号:16であるアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、このペプチドは配列番号:9、配列番号:10、配列番号:15、又は配列番号:16であるアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、このペプチドは配列番号:10、配列番号:15、又は配列番号:16であるアミノ酸配列を含む。
代替的に、このペプチドは、配列番号:104であるアミノ酸配列を含み、又はこのペプチドは、配列番号:105、配列番号:106、配列番号:107、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:113、配列番号:114、配列番号:115、又は配列番号:116であるアミノ酸配列を含み、又はこのペプチドは、配列番号:109、配列番号:117、配列番号:118、配列番号:119、配列番号:120、又は配列番号:121であるアミノ酸配列を含み、又はこのペプチドは、配列番号:122、配列番号:123、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:129、配列番号:130、配列番号:132、又は配列番号:133であるアミノ酸配列を含む。
別の好適な実施態様において、該ペプチドは、位置2,3,4,又は6でD-アラニン置換を、又は位置7,8,9,11,12,13,又は14でアルファ-アミノイソブチラート置換を、又は上記の何れかの組合せを有する配列番号:15のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、このペプチドは、位置2,3,又は6でD-アラニン置換を、又は位置7,8,9,11,12,13又は14でアルファ-アミノイソブチラート置換を、又は上記の何れかの組合せを有する。更に好ましくは、このペプチドは位置6でD-アラニン置換を、又は位置8,9,又は13でアルファ-アミノイソブチラート置換を有する。後者のペプチドの何れかは好ましくは、YFGではなくAAである配列番号:15のC末端を有する。
該化合物は好ましくは、式:BCn,A、[式中、BはIGF-I又はそれの機能的類似物のBドメインであり、CはIGF-I又はそれの機能的類似物のCドメインであり、nはCドメイン中のアミノ酸の数であり且つ約6から約12までである、及びAはIGF-I又はそれの機能的類似物のAドメインである]の何れかのIGF-I類似物を除く。ここでの化合物は特に(Leu24)IGF-1と(Ser24)IGF-1を除く。該化合物はまた、IGF-Iの最初の16アミノ酸がインスリンのB-鎖の最初の17アミノ酸で置換されたB-鎖ヒトIGF-I変異体;(Gln3,Ala4)IGF-I;(Tyr15,Leu16)IGF-I;(Gln3,Ala4,Tyr15,Leu16)IGF-I;IGF-Iのカルボキシ末端8アミノ酸D領域を欠いた(1-62)IGF-I;C領域グリシン置換及びD領域削除を伴う(1-27,Gly4,38-62)IGF-I;残基41がトレオニンからイソロイシンまで変更され且つA領域の残基42-56が置換されたA鎖変異体、(Ile41,Glu45,Gln46,Thr49,Ser50,Ile51,Ser53,Tyr55,Gln56)IGF-I;(Thr49,Ser50,Ile51)IGF-I;及び(Tyr55,Gln56)IGF-Iをも除く。
ペプチドではないここでの化合物は、高い経口生物利用能を持った非ペプチド分子(GH分泌促進剤のような)及び他の経口的に活性な有機分子を作製するための当該分野における化学合成又は他の適当な方法によって作製され得る。
本発明のペプチドは、化学合成によって又は組換え技術を利用することによって作製され得る。これらの方法は当該分野で周知である。化学合成、特に固相合成は、短鎖(例えば、50残基より小さい)ペプチド又はD-Tyr、オルニチン、アミノアジピン酸、等のような非天然又は例外的なアミノ酸を含むそれが好適である。組換え方法は、長鎖ポリペプチドのために好適である。組換え方法が選択される場合、合成遺伝子は新規に構築することができ又は自然遺伝子が、例えばカセット式変異誘発によって変異させ得る。後述の記載は一般的な組換え方法の典型である。
生成したIGFとそのアミノ酸配列のために、例えばIGFのペプチドの変異体であるIGFアゴニストを用い、組換えDNAを用い実行きれ得る。これらの技術は、簡略化した形式において、ペプチドをコードしている天然の又は合成の何れか一方の遺伝子を得ること;それを適用なベクター内に挿入すること;そのベクターを適当な宿主細胞内に挿入すること;その遺伝子の発現を生じさせるよう該宿主を培養すること;及びそれによって生産したペプチドを回収又は分離することを意図する。好ましくは、回収したペプチドは次いで適当な度合まで精製される。
特に、ペプチドのIGFアゴニストをコードしているDNA配列は、クローン化され、そして好適な宿主中で発現され得るように操作される。親のポリペプチドをコードしているDNAは、ゲノムのライブラリーから、該ペプチドを発現している細胞からのmRNAから誘導したcDNAから、又はDNA配列を合成的に構築することによって(Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboraory Manual(2d ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989)得ることができる。
親のDNAは、次いで宿主細胞を形質転換するために使用される適当なプラスミド又はベクター内に挿入される。一般に、宿主細胞と和合できる種から得られる複製及び制御配列を含んでいるプラスミドベクターが、その宿主と結合して使用される。該ベクターは普通、レプリコンサイト、同様に形質転換した細胞における表現型選択を提供することができるタンパク質又はペプチドをコードする配列を搬送する。
例えば、大腸菌(E. coli)は、大腸菌種から得られたプラスミド、pBR322を用いて形質転換され得る。Mandelら,J. Mol. Biol. 53: 154(1970)。プラスミドpR322は、アンピシリンとテトラサイクリン耐性用の遺伝子を含有し、かくして選択のために容易な手段を提供する。他のベクターは、発現においてしばしば重要な異なるプロモーターのような異なる特徴を含む。例えば、プラスミドpKK223-3、pDR720、及び広く利用可能であるtac, trp, 又はPLプロモーターを持つpPL-ラムダ表現発現ベクター(Pharmacia Biotechnology)。
好適なベクターはpB0475である。このベクターはそれがそのような宿主間を往復されることを許すファージと大腸菌の間の複製の起源を含み、それによって変異誘発と発現の両方を容易にする。Cunninghamら,Science, 243: 1330-1336(1989); 米国特許第5,580,723号。他の好適なベクターは、pR1T5とpR1T2T(Pharmacia Biotechnology)である。これらのベクターは、融合タンパク質として発現されるベクターに挿入した遺伝子を与える、プロテインAのZドメインの後に適当なプロモーターを含む。
他の好適なベクターは、上述したベクターの適切な特徴を結合することによって標準的な技術を用い構築され得る。適切な特徴は、プロモーター、リボソーム結合サイト、デコルシン又はオルナチン遺伝子又は遺伝子融合(プロテインAのZドメインとデコルシン又はオルナチンとそのリンカー)、抗生物質耐性マーカー、及び複製の適切な起源を含む。
宿主細胞は、原核生物又は真核生物とされ得る。原核生物は、親のIGF-Iポリペプチド、セグメント-置換したペプチド、残基-置換したペプチド、及びペプチド変異体を生産するためのDNA配列をクローン化する及び発現するために好適である。例えば、大腸菌K12株294(ATCC No.31446)は、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC No.31537)、及び大腸菌c600とc600hfl、大腸菌W3110(F-,ガンマ-,プロトトロピー/ATCC No. 27325)、Bacillus subtilisのようなバチルス属、及びSalmonella typhimurium又はSerratia marcesans、及び各種のPseudomonas種のような他の腸内細菌科と同様に使用され得る。好ましい原核生物は大腸菌W3110(ATCC 27325)である。原核生物により発現した場合、そのペプチドはN末端メチオニン又はホルミルメチオニンを典型的に含み、且つグリコシル化されていない。融合タンパク質のケースにおいて、N末端メチオニン又はホルミルメチオニンは、該融合タンパク質のアミノ末端上又は融合タンパク質のシグナル配列に存在する。これら実施例は、勿論、制限するものでなく説明することが意図される。
原核生物に加えて、酵母培養、または多細胞生体から得られる細胞のような真核生物が使用され得る。原則として、何れかのそのような細胞培養は、使用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞において興味が最も大きくなっており、培養(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は再生可能な方法になっている。Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors(1973)。そのような使用宿主細胞系の実例は、VERO及びHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、W138、293、BHK、COS-7及びMDCK細胞系である。
上記方法に関するバリエーションは遺伝子融合の使用を意図し、望まれるペプチドをコードしている遺伝子は、ベクター中で別なタンパク質をコードする遺伝子又は別なタンパク質のフラグメントと結合される。これは、別なタンパク質又はペプチドとの融合物として該宿主細胞により生産されている望ましいペプチドの結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドはしばしば、培地から望まれるペプチドを分離し且つ精製することを可能にするよう、及びその望ましいペプチドが細胞の内部に残る場合に生じる宿主細胞の破壊の必要性を省くよう、その細胞によって分泌され得るタンパク質又はペプチドである。代替的に、該融合タンパク質は、細胞内で発現され得る。それは高度に発現される融合タンパク質を使用するために有用である。
必須ではないけれども、遺伝子融合の使用は、大腸菌中の異種ペプチドの発現、同様にそれら遺伝子生産物の次の精製を容易にすることができる。Harris, in Genetic Engineering, Williamson, R., Ed.(Academic Press, London, Vol.4, 1983), p.127; Ljungquistら,Eur. J. Biochem., 186: 557-561(1989)とLjungquistら,Eur. J. Biochem., 186: 563-569(1989)。プロテインA融合は、IgGへのプロテインAの、とりわけプロテインAのZドメインの結合が融合したタンパク質の精製用の「アフィニティーハンドル」を提供するために、しばしば使用される。それはまた、多くが異種タンパク質が大腸菌において直接発現した場合に減成されるが、しかし融合タンパク質として発現する場合安定であることが示されている。Marston, Biochem J., 240: 1(1986)。
融合タンパク質は、メチオニンで切断する臭化シアン、又はAsnとGly残基の間を切断する、ヒドロキシルアミンのような化学薬品を用いて切断され得る。標準的な組換えDNA方法論を用い、これらアミノ酸をコードしているヌクレオチド塩基対は、望まれるペプチドをコードしている遺伝子の5′末端の直前に挿入され得る。
代替的に、それは融合タンパク質のタンパク分解的切断を利用できる。Carter, in Protein Purification: From Molecular Mecanisms to Large-Scale Processes, Ladischら,eds.(American Chemical Society Symposium Series No. 427, 1990), Ch 13, pages 181-193。
因子Xa、トロンビン、及びサブチリシンまたはその変異体、及び多数の他の物のようなプロテアーゼは、融合タンパク質を切断するために首尾良く使用されている。典型的に、使用したプロテアーゼによって切断するために服しやすいペプチドリンカーは、「他の」タンパク質(例えば、プロテインAのZドメイン)と望まれたペプチドの間に挿入される。組換えDNA方法論を用い、該リンカーをコードしているヌクレオチド塩基対は、該他のタンパク質をコードしている遺伝子又は遺伝子フラグメントの間に挿入される。修正リンカーを含む部分的に精製した融合タンパク質の蛋白分解的切断は、自然の融合タンパク質、または減じた又は分解した融合タンパク質のいずれか一方について実行され得る。
該ペプチドは、融合タンパク質として発現する場合に適切に折り重ねでき又はできない。また、切断サイトを含んでいる特異的ペプチドリンカーは、プロテアーゼに接し易くでき又はできない。これらのファクターは、該融合タンパク質が分解され及び再折重されねばならないかどうか、及び、もしそうであれば、これらの方法が切断の前又は後で用いられるかどうかによって決定する。
分解と再折重が必要とされる場合、典型的に該ペプチドは、グアニジン塩酸のようなカオトロープによって処理される。次いで、例えば、該ペプチドがその固有の構造に再折重されるような、適当な割合、pH、及び温度で還元した及び酸化したジチオトレイトール又はグルタチオンを含んでいる還元緩衝液によって処理される。
ペプチドが組み換えDNA技術を用いて調製されない場合、それは、たとえ当該分野で周知の同等の化学合成が利用可能であるとしても、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149(1963)により全般的に記載されたような、固相合成法を用いて好適に調製される。固相合成は、適当な樹脂に保護したα-アミノ酸をカップリングすることによってペプチドのC末端から開始される。そのような出発材料は、クロロメチル化樹脂又はヒドロキシメチル化樹脂へのエステル結合によって、又はBHA樹脂又はMBHA樹脂へのアミド結合によってα-アミノ-保護したアミノ酸を付着することによって調製され得る。該ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bodanskyら,Chem. Ind.(London), 38: 1597-1598(1966)によって記載されている。クロロメチル化樹脂は、BioRad Laboratories, Richmond, CAから、及びLab. Systems社から商業的に利用可能である。そのような樹脂の調製は、Stewartら,“Solid Phase Peptide Synthesis”(Freeman & Co., San Francisco 1969), Chapter 1, pp. 1-6によって記載される。BHAとMBHA樹脂支持体は、商業的に利用可能であり、合成される望まれるペプチドがC末端で非置換アミドを有する場合のみ一般に使用される。
該アミノ酸は、ペプチド結合を形成するための当該分野において周知の技術を用いてペプチド鎖に連結される。一つの方法は、そのカルボキシル基を該ペプチドフラグメントの遊離N末端アミノ基との反応により影響を受け易くするであろう誘導体にそのアミノ酸を転換することを含む。例えば、アミノ酸は、クロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸sec-ブチル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル又は同様の酸塩化物と、保護したアミノ酸の反応によって混合した無水物に変換され得る。代替的に、該アミノ酸は、2,4,5-トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロスクシンアミドエステル、又は1-ヒドロキシベンゾトリアゾールから形成したエステルのような活性エステルに変換され得る。
別なカップリング法は、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はN,N’-ジイソプロピル-カルボジイミドのような適当なカップリング剤の使用を含む。当業者において明らかな他の適当なカップリング剤は、E. Gross & J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology. Vol. I: Major Methods of Peptide Bond Formation(Academic Press, New York, 1979)中に記載される。
該ペプチド合成において用いた核アミノ酸のα-アミノ基が、その活性α-アミノ機能を含む副反応を防止するため該カップリング反応の間保護される必要があることを認識すべきである。また、ある種のアミノ酸が反応性側鎖官能基(例えばスルフィドリル、アミノ、カルボキシル、及びヒドロキシル)を含むこと、及びそのような官能基は、開始と次のカップリング工程の両方の間そのサイトで生じる化学反応を防止するために適当な保護基によって保護される必要があることも認識すべきである。当該分野で周知の、適当な保護基は、GrossとMeienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology. Vol. 3:“Protection of functional Groups in peputide Synthesis”(Academic Press, New York, 1981)中に記載される。
該ペプチドの合成において使用すべき特有の側鎖保護基の選択において、次の一般的なルールが求められる。α-アミノ保護基は、(a)カップリング反応で用いた条件下でα-アミノ機能を不活性にする必要がある、(b)側鎖保護基を取り外すことがないであろう及びペプチドフラグメントの構造を変えることがないであろう条件下でのカップリング反応の後に容易に除去可能とされる必要がある、及び(c)カップリングの直前に活性化によりラセミ化の可能性が排除される必要がある。側鎖保護基は、(a)カップリング反応で用いた条件下でα-アミノ機能を不活性にする必要がある、(b)α-アミノ保護基の除去に用いた条件下で安定である必要がある、及び(c)ペプチド鎖の構造を変化しないであろう反応条件下で、望まれるアミノ酸ペプチドの完成により容易に取り外し可能とされる必要がある。
ペプチド合成用に有用とされる周知の保護基は、それを除去するために用いるその剤との反応性において変更されるであろうことは当業者に明らかであろう。例えば、トリフェニルメチル及び2-(p-ビフェニリル)イソプロピルオキシカルボニルのようなある種の保護基は、非常に適応性があり且つ中度の酸性条件で切断され得る。t-ブチルオキシカルボニル(BOC)、t-アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びp-メトキシベンジルオキシカルボニルのような他の保護基は、適応性に劣っており、それを除去するためにトリフルオロ酢酸塩酸、又は酢酸中の四フッ化ホウ素のような適度な強酸を要求する。ベンジルオキシカルボニル(CBZ又はZ)、ハロベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカルボニルのような更に他の保護基は、一様に適応性に劣っており、それを除去するためにフッ化水素酸、臭化水素酸、またはトリフルオロ酢酸中の四フッ化ホウ素のような強酸を要求する。
有用なアミノ酸保護基のクラスの中では:
(1)α-アミノ基のために、(a)フルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)CBZのような芳香族ウレタンタイプ保護基、及び置換したCBZ、例えばp-クロロベンジルオキシカルボニル、p-6-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル、及びp-メトキシベンジルオキシカルボニル、o-クロロベンジルオキシカルボニル、2,4-ジクロロベンジルオキシカルボニル、2,6-ジクロロベンジルオキシカルボニル、など;(b)BOC、t-アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、2-(p-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、などのような脂肪族ウレタンタイプ保護基;(c)シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロヘキシルオキシカルボニルのようなシクロアルキルウレタンタイプ保護基;及びd)アリールオキシカルボニルを含む。好ましいα-アミノ保護基はBOC又はFMOCである。
(2)Lys中に存在する側鎖アミノ基のために、保護は(1)BOC、p-クロロベンジルオキシカルボニル、等において上述した基の何れかによってなされ得る。
(3)Argのグアニジノ基のために、保護は、ニトロ、トシル、CBZ、アダマンチルオキシカルボニル、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル又は2,3,6-トリメチル-4-メトキシフェニルスルホニル、又はBOCによってなされ得る。
(4)Ser, Thr, 又はTyrの水酸基のために、保護は、例えば、t-ブチルのようなC1-C4アルキル;ベンジル(BZL);p-メトキシベンジル、p-クロロベンジル、o-クロロベンジル、及び2,6-ジクロロベンジルのような置換したBZLによりなされ得る。
(5)Asp又はGluのカルボキシル基のために、保護は、例えばBZL、t-ブチル、シクロヘキシル、シクロペンチル、等のような基を用いるエステル化によりなされ得る。
(6)Hisのイミダゾール窒素のために、トシル部分が好適に利用される。
(7)Tyrのフェノール性水酸基のために、テトラヒドロピラニル、tert-ブチル、トリチル、BLZ、クロロベンジル、4-ブロモベンジル、又は2,6-ジクロロベンジルのような保護基が好適に利用される。好適な保護基は2,6-ジクロロベンジルである。
(8)Asn又はGlnの側鎖アミノ基のためにはキサンチル(Xan)が好適に利用される。
(9)Metについて、該アミノ酸は好ましくは未保護のままとする。
(10)Cysのチオ基のために、p-メトキシベンジルが典型的に利用される。
C末端アミノ酸、例えばLysは、適切に選択した保護基により、Lysの場合においてはBOCにより、N-アミノ位置で保護される。そのBOC-Lys-OHは、Horikiら,Chemistry Letters, 165-168 1978)中に記載された方法に従ってベンジヒドリルアミン又はクロロメチル化樹脂に、又は撹拌しつつ約25℃で二時間、イソプロピルカルボジイミドを用いて最初に連結され得る。樹脂支持体へのBOC-保護したアミノ酸のカップリングの後、塩化メチレン中トリフルオロ酢酸(TFA)又はTFA単独を用いることによって、そのα-アミノ保護基が除去される。その脱保護基は約0℃と室温の間の温度で実行される。ジオキサン中HClのような他の標準的な切断試薬、及び特異的なa-アミノ保護基の除去のための条件は文献中に記載される。
α-アミノ保護基の除去後、残るα-アミノ及び側鎖保護したアミノ酸は望まれる順番の中で段階的に連結される。該合成中で別個に各アミノ酸を加えることの代替として、何れかは固相シンセサイザーに加える前に別の一つに連結され得る。適当なカップリング剤の選択は当業者の理解の範囲内である。カップリング試薬として特に好適なものは、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドである。
それぞれの保護したアミノ酸又はアミノ酸配列は、過剰に固相リアクター内に導入され、カップリングがジメチルホルムアミド(DMF)又はCH2Cl2又はそれの混合物の媒体中で実行される。もし不完全なカップリングが生じるなら、そのカップリングプロセスは次のアミノ酸のカップリングの前にN-アミノ保護基の事前除去を繰り返す。合成の各段階でのカップリング反応の成功がモニターされ得る。その合成のモニタリングの好ましい方法は、Kaiserら,Anal. Biochem. 34: 595(1970)に記載されたニンヒドリン反応によるものである。該カップリング反応は、周知の方法、例えばBIOSEARCH9500TMペプチドシンセサイザーを用い自動的に実行され得る。
望まれるペプチド配列の完成により、その保護したペプチドは樹脂支持体から切断する必要があり、且つ全ての保護基を除去する必要がある。その切断反応と保護基の除去は、好ましくは同時に又は段階的に達成される。その樹脂支持体がクロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、該樹脂に該ペプチドを繋ぎ止めている結合は、C末端残基の遊離カルボキシル基と、樹脂マトリックス上に存在する多くのクロロメチル基の一つとの間に形成されたエステル結合である。その繋ぎ止め結合は、エステル結合を壊すこと及び樹脂マトリックスに貫徹できることが知られる試薬によって切断され得る。
特に便利な方法の一つは、液体無水フッ化水素での処理による。この試薬は該樹脂からの切断のみでなく、全ての保護基を除去するであろう。それ故に、この試薬の使用は、完全に保護を脱したペプチドを直接もたらすであろう。クロロメチル化樹脂が使用される場合フッ化水素処理は、直接遊離ペプチド酸をもたらす結果になる。ベンズヒドリルアミン樹脂が使用される場合、フッ化水素酸処理は直接遊離ペプチドアミンをもたらす結果となる。0℃で1時間、アニソールとジメチルスルフィドの存在中でのフッ化水素との反応は、側鎖保護基が除去されると同時に樹脂から該ペプチドが放出されるであろう。
保護基を除去すること無しに該ペプチドを切断することが望まれる場合、その保護ペプチド-樹脂は、C末端カルボキシル基がメチル化される保護ペプチドが生じるようにメタノリシスを受けることができる。そのメチルエステルは、遊離C末端カルボキシル基を与えるように中度のアルカリ性条件下で加水分解される。次いでペプチド鎖上の保護基は、液体フッ化水素のような強酸での処理によって除去される。メタノリシスのための特に有用な技術は、保護ペプチド-樹脂がクラウンエーテルの存在中メタノールとシアン化カリウムにより処理される、Mooreら,Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. GoodmanとL. Meienhofer, Eds.,(John Wiley, N.Y., 1977), p.518-521のそれである。
クロロメチル化樹脂が使用される場合、該樹脂から保護したペプチドを切断するための別な方法は、アンモノリシスによる又はヒドラジンによる処理によるものである。望むなら、得られるC末端アミン又はヒドラジドは、遊離C末端カルボキシ部分に加水分解でき、且つその保護基は通常的に除去され得る。
N末端のα-アミノ基上に存在する保護基は、該保護基が支持体から切断される前又は後の何れか一方で優先的に除去され得る。
本発明のポリペプチドの精製は、予備HPLC(逆相HPLCを含む)又は他の周知のクロマトグラフィー技術、例えばゲル透過、イオン交換、分配クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー(モノクローナル抗体カラムを含む)又は交流分配のような通常の方法を用い典型的に達成される。
本発明のペプチドは、重合化によって安定化され得る。これは、多価ポリマーを経て、直接的又は間接的の何れか一方で多価架橋剤でのモノマー鎖架橋化により達成され得る。通常、2つの実質的に同一のポリペプチドは、二官能架橋剤を用いてそのC-又はN-末端で架橋される。該剤は、末端アミノ及び/又はカルボキシル基を架橋するように用いられる。一般に、たとえ適切な架橋剤の選択によって、一方のポリペプチドのアルファアミノが他方のポリペプチドの末端カルボキシル基に架橋されるとしても両方の末端カルボキシル基又は両方の末端アミノ基は、互いに架橋される。好ましくは、該ポリペプチドはシステインによってC末端で置換される。当該分野で周知の条件下でジスルフィド結合が末端システイン間に形成され、それによって該ポリペプチド鎖が架橋されている。例えば、ジスルフィドブリッジは遊離システインの金属触媒酸化によって又は適当に修正したシステイン残基の求核的置換によって都合良く形成される。架橋剤の選択は、ポリペプチド中に存在するアミノ鎖の反応性側鎖の同定に基づくであろう。例えば、もしシステインがC末端以外の付加的なサイトでポリペプチド中に存在するならば、ジスルフィド架橋は好ましいとは言えないであろう。メチレンブリッジによって架橋されたペプチドはここでの範囲内である。
ペプチド上の適当な架橋化サイトは、N末端アミノ及びC末端カルボキシル基は別として、リシン残基上に見られるイプシロンアミノ基、同様に該ペプチドの内部残基又はフランキング配列内に導入した残基の側鎖上に配されたアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフィドリル及びヒドロキシル基を含む。外部に加えた架橋剤を通しての架橋は、例えば当業者にとって普通の多数の試薬の何れかを用い、例えばポリペプチドのカルボジイミド処理を経て、好適に達成される。適当な多価(普通二官能)架橋剤の他の実例は文献中に見出される。
本発明のペプチドは、環化によって構造的に安定化され得る。そのペプチドは、2又はそれ以上の繰り返しペプチド配列を含むシクロオリゴマー、各内部ペプチドは実質的に同じ配列を有している、を形成するために本発明の別のペプチドの一致するドメインに一方のペプチドのN-及びC-末端ドメインを共有結合することによって普通に環化される。更に、環化したペプチド(シクロオリゴマー又はシクロモノマーのいずれか)は、その中に含まれた2から6までのペプチドを有する1-3環式構造を形成するように架橋される。該ペプチドは好ましくはα-アミノ及び主鎖カルボキシル基を通して共有結合しないが、しかしある程度はN-及びC-末端ドメインに配された残基の側鎖を経て架橋される。架橋サイトはかくして一般には、該残基の側鎖間とされるであろう。
多くの好適な方法それ自身は、ここに意図したようにモノ-又はポリ-環化ポリペプチドを調製するために周知である。Lys/Asp環化は、Lys/Asp用のFmoc/9-フルオレニルメチル(OFm)側鎖保護によって固相支持体上のN α-Boc-アミノ酸を用い達成されている;該方法は環化に続くピペリジン処理によって完成される。
GluとLys側鎖もまた、環式又は二環式ペプチド調製において架橋されている;該ペプチドは、p-メチルベンズヒドリルアミン樹脂上での固相化学により合成される。そのペプチドは樹脂から切断され且つ脱保護される。環式ペプチドはメチルホルムアミドで希釈したジフェニルホスホリルアジドを用い形成される。代替の方法については、Schillerら,Peptide Protein Res., 25: 171-177(1985)を参照。米国特許第4,547,489号も参照。
ジスルフィド架橋した又は環化したペプチドは通常の方法により生成される。Peltonら,(J. Med. Chem., 29: 2370-2375(1986))の方法は、シクロオリゴマーの大きな比率がシクロモノマーの生産のためのPeltonらによって記載された希釈反応混合物よりも、より濃縮した溶液中で反応を導くことによって製作されることを除いて、好適である。同じ化学薬品はダイマー又はシクロオリゴマー又はシクロモノマーの合成のために有用である。また有用性はチオメチレンブリッジにもある。LeblとHruby, Tetrahedron letters, 25: 2067-2068(1984)。Codyら,J. Med. Chem., 28: 583(1985)も参照。
望まれる環式又はポリマー性ペプチドは、ゲル濾過の後、逆相高圧液体クロマトグラフィー又は他の通常の手法により精製される。ペプチドは無菌濾過され、且つ通常の製薬上許容される賦形剤中で処方される。
ここに記載した方法のために要求される出発材料は、文献において周知であり、且つ周知の方法及び周知の出発材料を用い調製され得る。
もし4つの同一でない置換基に結合した炭素原子が精製されているペプチドにおいて不斉があれば、その化合物はジアステレオマー、エナンチオマー又はその混合物として存在できる。上述した合成は、出発材料又は中間体としてラセミ体、エナンチオマー又はジアステレオマーを使用できる。そのような合成で得られるジアステレオマーの生産物は、クロマトグラフィー又は結晶化法によって分離され得る。さらに、エナンチオマーの生成混合物は同じ技術を用い又は当該分野で周知の方法により分離され得る。存在する場合、それぞれの不斉炭素原子は2つの配置(R又はS)の一つとされ且つ両者は本発明の範囲内である。
本発明において記載した化合物は、遊離の酸又は塩基として分離され又は各種の無機及び有機酸及び塩基の塩に変換され得る。そのような塩の実例は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムとマグネシウムのような金属塩;ジシクロヘキシルアミン、N-メチル-D-グルカミンなどのような有機塩基との塩;及びアルギニン又はリシンのようなアミノ酸との塩を含む。無機及び有機の酸との塩は、さらに例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸などを用いて調製され得る。たとえ他の望ましくない塩が分離と精製のプロセス中で使用できるとしても、無毒性で且つ生理的に和合できる塩が特に有用である。
多くの方法が上述した塩の調製のために有用であり、当業者に周知である。実例は、その塩が不溶性である溶媒又は溶媒混合液中で;又は濃縮、蒸留又は凍結乾燥によりその溶媒を留去した後で水のような溶媒中で、望ましい酸又は塩基の1又はそれ以上のモル当量と共に該ペプチドの遊離酸又は遊離塩基形態との反応を含む。代替的に、その生産物の遊離酸又は塩基形態は、望まれる塩を形成するためイオン交換樹脂を通過させることができ又は生産物の一つの塩形態は同じ一般的プロセスを用い別のものに変換され得る。
ペプチドの化学合成のために適当とされ得るある種の特有なスキームが、参考によりここに併合される開示の、1996年5月23日公開のWO 96/15148中に示される。
本発明の化合物は、その結合タンパク質の1又はそれ以上とIGFとの相互作用を抑制すること、及びそれによってIGF作用をアゴナイズすることが示される。IGFsのための多くの使用があることは当業者に周知である。それ故に、IGF作用をアゴナイズする目的での本発明の化合物の投与は、外因性IGFそれ自身の投与と同じ効果又は使用を有すことができる。IGFのこれらの使用は、先に定義した疾患に追加され得る又は同じである、次のものを含む:通常の及び下垂体機能低下動物における全身、骨、及び筋肉成長率の増加;異化作用状態(断食、窒素制限、高くしたコルチコステロイドレベル、及び/又は糖尿病)の間の体重及び窒素損失の保護;腎臓再生;末梢及び中枢神経系(CNS)変性疾患の治療及びCNSダメージ又は損傷に続く神経保護又は再生の促進;低酸素症の治療;創傷治癒の促進;心臓の再生;癌の悪液質の逆転;新脈管形成の抑制;胃腸管の再生;乳房機能の刺激;代謝ストレス、GH活性における年齢関連減退、及び成人GH欠乏のようなGHのIGF-I依存作用を無効にすること;成人発症型糖尿病の治療;及び/又は特異的IGF-I欠乏の治療。
ここでの化合物が有用である追加された及び特有の疾患は、GH-耐性小人症、GH-不感受性症候群、骨粗しょう症、及び異化状態のような成長疾患;組織又は細胞、例えば末梢神経及び支持細胞、神経及びグリアを含む中枢神経系細胞及び稀突起神経膠細胞、筋肉、皮膚、及び骨のような他の細胞の再生の治療が要求される疾患;心臓疾患、例えば心臓虚血、心筋障害、及びうっ血性心不全;インスリン依存性及び非インスリン依存性糖尿病及び極インスリン耐性のような高血糖性疾患;及び腎不全のような腎臓疾患を含む。これらはまた、初老のヒトにおける同化応答の刺激、グルココルチコイドの異化副作用の防止、骨粗しょう症の治療、免疫系の刺激、肥満症の低減、創傷治癒の促進、骨折結合再生の促進、成長遅延の治療、腎不全又は成長遅延の結果の未成熟の治療、生理学的小人症の治療、成長ホルモン欠乏児を含む、慢性疾患に関連した小人症の治療、肥満症及び肥満症に関連した成長遅延の治療、プラーダー-ヴィリ症候群及びターナー症候群に関連した成長遅延の治療、やけどの患者の入院における回復と軽減の促進、子宮内成長遅延、骨格形成異常、副腎皮質機能亢進症、及びクッシング症候群の治療、拍動性成長ホルモン放出の誘導、ストレス性患者における成長ホルモンの置換、骨軟骨異形成症、Moonans症候群、精神分裂症、うつ病、末梢ニューロパシー、ALS、うつ病、アルツハイマー病、脱髄の疾患、多発性硬化症、及び遅れた創傷治癒の治療、免疫系の刺激、心理堕落の治療、肺の機能不全及び換気依存の治療、大手術の後のタンパク質異化応答の減衰化、癌又はエイズのような慢性病のための悪液質及びタンパク質損失の減少、I型及びII型糖尿病を含む高インスリン血症の治療、排卵誘発のためのアジュバント治療、胸腺発達の刺激及び胸腺機能の年齢関連減退の予防、免疫抑制患者の治療、骨髄移植患者の治療、筋肉強度、可動化筋域機能の疾患、筋ジストロフィーにおける改善、皮膚厚さ、及び代謝恒常性の維持、急性及び慢性腎疾患を含む腎臓の機能と恒常性の増強、骨形成細胞の刺激、骨の再造形、及び軟骨成長、免疫系の刺激、及び家畜における成長促進を含む。各種のIGF-I使用が、例えば、Wo 94/04569; WO 96/33216; 及びBondy, Ann Intern. Med., 120: 593-601(1994)中に見られる。これらの全ては「疾患」の定義中に含まれる。
一つの実施例において、化合物は、成長及び身体組織での飼料のその変換の有効性を促進及びその割合を増加及び進展するために、ブタ、ウシなどのような商業上重要な動物に投与され得る。該化合物はIGF作用を刺激するために成人及び児童にインビボで投与され得る。
本発明の化合物は、経口、非経口(例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下注射又は注入、又はインプラント)、経鼻、吸入、経膣、直腸、舌下、又は投与の局所ルートを含む何れかの適用な技術によって哺乳動物に投与でき、且つ投与の各ルートのために適切な投薬量で処方され得る。投与の特有のルートは、該化合物を用いて何れかの認められた又は予期された副作用を含む、その患者の医学的履歴、投与される化合物のタイプ、及び治療すべき特有の疾患に基づくであろう。とりわけ、その投与は経口又は連続的な注入(例えば除放装置又は浸透ポンプのようなミニポンプ又は皮膚パッチを用いる)、又は注射(例えば静脈内又は皮下手段を用いる)である。その治療に用いられる化合物は、個人の患者の臨床的な状態(特に該化合物による治療の副作用)、輸送のサイト、投与の方法、投与のスケジュール、及び開業医に周知の他のファクターに関して、良好な医療行為と密着した形態において処方され且つ投薬されるであろう。ここで意図される化合物の「有効量」は、かくして、そのような観点で決定され且つ哺乳動物に対する薬剤の生物学的利用能及び望ましい効果が得られる量とされる必要がある。
小さい分子アンタゴニストがIGFアゴニストとして使用されるなら、周期的な効果を有し得るし、効力のために、それの適切な投与の摂生が要求され、血液中のIGFBP-1の可変の濃度は実例とされる。JonesとClemmons, supra。ペプチドのために好適な投与は、IGF-Iの効果を再誘導するため4−8週間、一日約2回の慢性投与である。たとえ注射が好適であろうとも、長期の注入も、連続した皮下(SC)注射のための注入装置を用いて利用され得る。小さいペプチドは経口投与され得る。静脈内バッグ溶液も又利用され得る。糖尿病のための適用な投薬量を選択する上での鍵となるファクターは、血中グルコースが妥当な通常の範囲となるような減少によって、又は開業医によって妥当と思われるような糖尿病の治療を測定するための他の基準による測定として得られた結果である。
一般的な提案として、非経口的な投薬当たり投与されるIGFアゴニスト化合物のトータルの製薬学的有効量は、投薬量応答曲線によって評価され得る範囲内とされるであろう。例えば、IGFBPsに結合した又は血液中のIGF sは投薬量を決定するために処置される哺乳動物の体液中で測定され得る。代替的に、それは患者へのIGFアゴニスト化合物の浄化した量で投与すること及びIGF-I及びIGF-IIの患者の血清レベルをチェックできる。使用されるIGFアゴニストの量はIGF-IとIGF-IIのこれらの血清レベルの基づいてモルベースで計算され得る。ヒト血清中に存在するIGFBPsからIGF-Iトレーサーの置換についての後述の実施例を参照。
特に、化合物の適当な投薬量を決定するための一つの方法は、体液又は血液のような生物学的液体中のIGFレベルを測定することを伴う。そのようなレベルの測定は、RIAとELISAを含む何れかの手段によってなされ得る。IGFレベル測定の後、その液体は単一又は複数投薬量を用いる化合物と接触させる。この接触工程の後、そのIGFレベルは液体中で再測定される。もしその液体IGFレベルが投与されるべきものであるための望ましい効力を生じるために十分な量によって降下しているならば、その分子の投薬量は最大の効力を生じるように調整され得る。この方法は、インビトロ又はインビボで実行され得る。好ましくは、この方法はインビトロで実行され、即ち液体が哺乳動物から抽出され且つIGFレベルが測定された後、ここでの化合物が単一又は複数投薬量を用い投与され(即ち、該接触工程は哺乳動物への投与により達成される)、次いでIGFレベルが哺乳動物から抽出した液体から再測定される。化合物の投薬量が適切に調整できるように生物学的液体中の特別なIGFBPの量又は特別なIGFBPsに結合した化合物の量を測定するための別な方法は:
(a)液体と、1)固相担体に付着した第1の抗体とを接触させること、該第1の抗体は抗体の存在中でそのIGF結合サイトが該化合物への結合のためのIGFBP上に利用可能に残るようにIGFBP上のエピトープのために特異的であり、それによって第1の抗体とIGFBPの間に複合体を形成すること;及び2)IGFBP上の全ての利用可能なIGF結合サイトを飽和するために十分な時間該化合物と接触させること、それによって飽和した複合体を形成すること;
(b)該化合物がIGF結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能であるIGF結合タンパク質のために特異的である検出可能に標識した第2の手段と、該飽和した複合体とを接触させること;及び
(c)IGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物とIGF結合タンパク質、結合したIGFとIGF結合タンパク質、又は該液体中に存在する活性IGFの指標として、結合した標識した手段の量を定量分析すること、
を含む。
リガンド-介在免疫機能化法(LIFA)と称される、抗体を用いる上述した定量分析技術は、米国特許第5,593,844号中にIGFとの接触によりIGFBPの量を測定するために、及び米国特許第5,210,017号中にGHとの接触によってGHBPの量を測定するために記載されているこれら特許の開示は抗体と他の材料及び該アッセイにおいて使用され得る条件に関して参考によりここに併合される。
投薬量を測定するための別の方法は、IGFアゴニストに対する抗体を使用すること及びLIFAフォーマットにおけるIGFアゴニストのための別な検出方法である。これは、IGFBPに結合した内因性又は外因性IGFsの検出及びIGFBPに結合したIGFアゴニストの量を与えるであろう。
投薬量を測定するための別な方法は、血液中の「遊離」又は活性IGFのレベルを測定するものとされるであろう。何れかの使用のために「遊離」IGFのレベルは、効力及び投薬有効性または投薬量の適当なマーカーとされるであろう。
例えば、一つの方法は、IGF結合タンパク質に結合した内因性又は外因性IGFを、又はIGF結合タンパク質に結合するがIGF結合タンパク質に結合したヒトIGFレセプターに結合しない化合物の量を検出すること又は生物学的液体中の未結合IGFのレベルを検出することのために記載される。この方法は:
(a)該液体と、1)該化合物の存在中でIGF結合サイトがIGF結合タンパク質に結合するための化合物上に利用可能に残るよう固相担体に付着した該化合物(該化合物上のエピトープの特異的な第1の抗体のような)に特異的である、化合物を検出するための手段とを接触させること、それによって該手段とIGF結合タンパク質との間の複合体を形成する;及び2)IGF結合タンパク質上の利用可能なIGF結合サイトの全てを飽和するために十分な時間、該化合物と接触させること、それによって飽和した複合体を形成する;
(b)該化合物がIGF結合タンパク質に結合される場合に結合に利用可能であるIGF結合タンパク質(IGFBP上のエピトープに特異的な第2の抗体のような)のために特異的である検出可能に標識した第2の手段と、該飽和した複合体とを接触させること;及び
(c)IGFBPの指標として、且つそれ故に、結合した化合物とIGF結合タンパク質、結合したIGFとIGF結合タンパク質、又は該液体中に存在する活性IGFの指標として、結合した標識した手段の量を定量分析すること、
を含む。
投薬量を測定するための上記方法で与えられ、且つ仮定した投薬量は、全般的に、使用され得るIGFアゴニスト化合物の量が評価され得る、IGF-Iについての実施例11において実証した少なくとも幾つかの特徴を共有する。経口的に活性な小さいIGFアゴニストは、IGF-IとIGF-IIの7500ダルトンに比較して、ほぼ500ダルトンの分子量を有するであろう。IGFアゴニストがIGF-I又はIGF-IIよりもIGFBPsに16倍劣る結合が可能と仮定して、たとえ上述したようにこれが多くの治療的な自由裁量を受けるであろうとしても、患者の体重kgに基づいて、約10μg/kg/日から200μg/kg/日が使用され得たように、IGF-I又はIGF-IIとこれらの分子の等しい重量は等しい有効性を得ることができた。
更なる方法は、LIFAフォーマットを用い、特異的なIGFBP、例えばIGFBP-1又はIGFBP-3についてのIGFsの分配を見積もることが提供される。
その化合物は持続放出性システムにより好ましくは投与される。持続放出性組成物の好適な実施例は、適切な形の物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含む。持続放出性材料は、ポリラクチド(米国特許第3,773,919, EP 58,481)、L-グルタミン酸とガンマ-エチル-L-グルタマートのコポリマー(Sidmanら,Biopolymers, 22, 547-556(1983)、ポリ(メタクリル酸2-ヒドロキシエチル)(Langerら,J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)、及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105(1982)、エチレン酢酸ビニル(Langerら,supra)又はポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸(EP 133,988)を含む。持続放出性組成物はまた、リポソーム性エントラップ化合物を含む。該化合物を含むリポソームは、それ自身周知の方法により調製される:DE 3,218,121; Epsteinら,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692(1985); Hwangら,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034(1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 日本特許出願83-118008; 米国特許第4,485,045と4,544,545号; 及びEP 102,324。普通、該リポソームは、小さな(約200から800オングストロームまで)、脂質含量が約30モルパーセントコレステロールよりも大きい単層ラメラタイプであり、選択した比率は大部分の有効な治療のために調整される。
より長い寿命を有するPEGylatedペプチドもまた、例えば1995年11月30日公開のWO 95/32003中に記載された共役技術に基づいて利用できる。
非経口的投与のために一つの実施態様において、該化合物は、製薬上、又は非経口的に許容される賦形剤、即ち、その投薬量及び使用される濃度で受容者に無毒性であり、且つ製剤の他の成分と和合できるそれと共に、単位投薬量注入可能形態(溶液、懸濁液、又はエマルジョン)中に、複数の望ましい度合でそれぞれを混合することによって処方される。例えばその調剤は、酸化剤及びポリペプチドに害のあることが知られる他の化合物を好ましくは含んでいない。
一般に、その調剤は、液状賦形剤又は微細に分割された固体賦形剤又は両方と該化合物とを均一に且つ親密に接触することによって調製される。次いで、もし必要であれば、その生産物は望ましい調剤に成型される。好ましくはその賦形剤は非経口賦形剤、より好ましくは受容者の血液と等張である溶液である。そのような賦形剤媒体の実例は、水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝化溶液、及びブドウ糖溶液を含む。不揮発性油とオレイン酸エチルのような非水性媒体もここでは有用である。
賦形剤は、等張性及び化学的安定性を増加する物質のような少量の添加剤を好ましくは含む。そのような添加物は、その投薬量及び使用される濃度で受容者に無毒性であり、且つリン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸又はそれの塩のような緩衝剤;アスコルビン酸のような酸化防止剤;低分子量(約10残基以下)ペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、又はアルギニンのようなアミノ酸;単糖類、二糖類、及びセルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、又はデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのようなカウンターイオン;ポリソルベート、ポロキサマー、ポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン性界面活性剤;及び/又は中性塩、例えばNaCl, KCl, MgCl2, CaCl2,などを含む。
該化合物は、約4.5から8までのpHでそのような媒体中で典型的には処方される。前述の賦形剤、賦形剤、又は安定化剤の特定の使用は、該化合物の塩の形成をもたらすであろうことが理解されるであろう。最終的な調製物は安定な液状又は凍結乾燥した固体とされ得る。
製薬組成物としての該ペプチド又は経口分泌促進剤の典型的な製剤が以下に論じられる。遊離の酸又は塩基として又は製薬上許容される塩として、該化合物又は該化合物の混合物の約0.5から500mgは、製薬実施に許容されると称されるような、生理学的に許容される媒体、賦形剤(carrier)、賦形剤(excipient)、バインダー、保存料、安定化剤、フレーバー、などと共に混合される。これら組成物中の活性成分の量は、示された範囲内の適切な投薬量が得られるようになされる。
錠剤、カプセル、などの中に混合され得る典型的な佐剤は、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンのようなバインダー;微晶質セルロースのような賦形剤;コーンスターチ又はアルギン酸のような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムのような滑剤;ショ糖又は乳糖のような甘味剤;ペパーミント、ウィンターグリーン又はチェリーのような香味剤である。投薬形態がカプセルである場合、上記材料に加えて、脂肪油のような液状媒体をも含ませ得る。各種のタイプの他の材料がコーティングとして又は投薬単位の物理的形態の修正剤として使用され得る。シロップ又はエリキシルは、活性化合物、ショ糖のような甘味料、プロピルパラベンのような保存料、着色料及びチェリーのような香味料を含め得る。注射のための滅菌した組成物は、通常の製薬上の慣行に従って製剤され得る。例えば、水又はゴマ油、落花生油、又は綿実油のような天然由来の植物油のような媒体又はオレイン酸エチルのような合成脂質媒体中に活性化合物の溶液又は懸濁液が望まれ得る。緩衝剤、保存料、酸化防止剤、などは許容された製剤上の慣習に従い併合され得る。
治療的な投与のため使用される化合物は、滅菌される必要がある。滅菌は、無菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)を通すことによって容易に達成される。治療組成物は一般に、無菌通路口を有する容器内、例えば静脈輸液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルに配される。
該化合物は普通、単位又は多投薬コンテナー、例えば封止アンプル又はバイアル中に、水性溶液として又は復元のための凍結乾燥製剤として保存されるであろう。凍結乾燥製剤の実例として、10-mLバイアルは、該化合物の滅菌濾過した1%(w/v)水性溶液の5mLで満たされ、生じた混合物が凍結乾燥される。注入溶液は、注入用静菌性水を用い凍結乾燥化合物を復元することによって調製される。
ここでのIGFアゴニスト化合物と、血液中の全IGFを増加する又はIGFアゴニストの効果を増す1又はそれ以上の適切な試薬との組合せ治療は、本発明の一部でもある。これらの試薬は一般に、生成したIGFの放出をここでのIGFアゴニストに与え、且つ成長促進剤を含む。この目的のための成長促進剤は、制限されること無しに、血液中のIGFの濃度を増加するように哺乳動物中の内因性GHの放出を促進するGH分泌促進剤を含む。実例は、TRH、ジエチルスチルベストロール、テオフィリン、エンケファリン、Eシリーズのプロスタグランジン、VIP-セクレチン-グルカゴン-GRFファミリーのペプチド、及び米国特許第4,411,890号中に記載されたようなGHRP-6、GHRP-1のような他のGH分泌促進剤、および米国特許第5,206,235号中に開示されたようなベンゾ-融合化ラクタムを含む。例えば1996年5月23日公開のWO 96/15148も参照。他の成長促進剤は、GHRPs, GHRFs, GH及びそれの類似体を含む。例えば、GHRPsは、1995年6月29日に両方公開のWO 95/17422とWO 95/17423;Bowers, J. Pediatr. Endocrinol., 6: 21-31(1993);及びSchoenら,Annual Reports in Medicinal Chemistry, 28: 177-186(1993)。GHRFsとその類似体は、例えば1996年11月28日公開のWO 96/37514中に記載される。
加えて、GHRH、何れかのIGFBPs、長期作用性GH、GHプラスGHBP、インスリン、又は低血糖剤が、この目的のためにここでのIGFアゴニスト化合物と共に使用され得る。加えて、IGF-I又はIGF-II又はIGFBP-3に複合したIGF-IのようなIGFBPを伴うIGFもまた、ここでのIGFアゴニスト化合物と共に使用され得る。例えば、1994年8月4日公開のWO 94/16723中に記載した通り賦形剤中にIGF-IとIGFBPを含んでいる製薬組成物は該化合物と共に使用され得る。その物はIGFアゴニスト化合物と逐次に又は同時に投与され得る。加えて、食事又はエクスサイズの養生法のようなIGF状態を操作する他の手段も又、本発明の一部として治療に組み合わせるべきと考慮される。
もしインスリンが投与されるなら、それは何れかのインスリンの製剤とすることができるが、しかしNPHインスリンが好適であり、更にNPHインスリンの投薬量は、皮下的に日に二回約5から50単位/注射まで(即ち、約0.2から2mgまで)である。インスリンと該化合物の組合せのために、この製剤中の化合物に対するインスリンの重量比は、一般に約10:1から1:50まで、好ましくは約1:1から1:20まで、より好ましくは約1:1から1:10まで、更により好ましくは約1:1から1:5まで、最も好ましくは1:1から1:3までである。
更に、その製剤は、スルホニル尿素のような低血糖剤の有効量と一緒に好適に投与される。その低血糖剤は、非経口、鼻腔内、経口を含む何れかの適当な技術によって、または何れかの他のルートによって哺乳動物に投与される。最も好ましくは、該投与は経口ルートによりなされる。例えば、1.25, 2.5,及び5mg錠剤濃度においてUpjohnによって販売される。MICRONASETM錠剤(グリブリド)が経口投与のために好適である。この治療に配される、II型糖尿病用の通例維持投与量は、単一投薬として又は適切と思われるようならその日中に分割して投与され得る、一日当たり約1.25から20mgまでの範囲内である。Physician’s Desk Reference, 2563-2565(1995)。処方のために利用可能なグリブリド-ベースの錠剤の他の実例は、GLYNASETMブランド薬(Upjohn)とDIABETATMブランド薬(Hoechst-Roussel)を含む。GLUCOTROLTM(Pratt)は、5-及び10-mgの強さで利用可能なグリピジド(1-シクロヘキシル-3-(p-(2-(5-メチルピラジンカルボキシアミド)エチル)フェニル)スルホニル)尿素)錠剤であり、食事コントロールに続いて低血糖治療が要求されるII型糖尿病に又は他のスルホニル尿素への応答を中止している患者において処方される。Physician’s Desk Reference, 1902-1903(1995)。ビグアニド(例えばメトホルミンとフェンホルミン)又はチアゾリジンジオン(例えばトログリトゾン)、又はインスリン作用に影響を与える他の薬剤のようなスルホニル尿素以外の低血糖剤もまた使用され得る。チアゾリジンジオンが該化合物と共に使用される場合、それは現状で使用されると同じレベルで、又は該化合物単独で又はそのジオンと一緒に見られる効果のために調節され得る、いくらか低いレベルで使用される。それ自身により使用されるトログリタゾン(REZULINTM)の局部投薬量は、一日当たり約100-1000mg、より好ましくは200-800mg/日であり、この範囲がここにおいて適用可能である。例えば、Ghazziら,Diabetes, 46: 433-439(1997)を参照。トログリタゾンよりもより強いインスリン感作剤である他のチアゾリジンジオンがより低い投薬量で用いられるだろう。
本発明の別な態様は、IGFとチアゾリジンジオン、又はIGFの組合せ、チアゾリジンジオン、及び本発明の化合物を含む組成物である。さらに、血糖値の制御をもたらす方法が、それを必要とする哺乳動物に、IGFとチアゾリジンジオンの有効量、又はIGF、チアゾリジンジオン、及び本発明の化合物の有効量を投与することによって提供される。活性剤は、同じ調剤又は共同での何れかで、逐次に又は一緒に哺乳動物に投与され得る。有効量は、上述したように開業医により決定され、且つ一般に当該の状態を治療するために用いられるIGFの量と同じか又は少ない量(例えば、糖尿病用のIGF-Iの約10から約250μg/kg/日まで)及び当該状態を治療するために有効であることが知られるジオンの量、又はその3つが使用されるなら、先に決定したような投薬量を用いる化合物の量を意味する。
加えて、本発明は、もしそれがペプチドであるなら、IGFアゴニスト化合物をコードしている核酸を用い、哺乳動物を治療するための遺伝子治療を用いることを意図する。一般に遺伝子治療は、哺乳動物におけるIGFレベルを増加(又は過剰発現)するために用いられる。IGFアゴニストペプチドをコードする核酸は、この目的のために使用され得る。一度アミノ酸配列が知られれば、それはその遺伝子コードの縮重を用い各種の核酸分子を生成すること、及び遺伝子治療のために使用するように選択できる。遺伝子治療の目的のために患者の細胞の中にその核酸(任意にベクターを含んだ)を受け取らせるための2つの主要なアプローチ:インビボとエクスビボがある。インビボ搬送のため、その核酸は、通例はIGFアゴニスト化合物が要求されるサイトで、患者の中に直接注射される。エクスビボ治療のため、患者の細胞は、取り出され、核酸を分離した細胞内に導入され、その修正した細胞は直接に又は、例えば患者の中に移植される多孔質膜の内部にカプセル内包される、の何れか一方が患者に投与される。例えば、米国特許第4,892,538号と5,283,187号を参照。生存細胞の中に核酸を導入するための利用可能な各種の技術がある。その技法は、意図した宿主の細胞においてインビトロ又はインビボで、培養した細胞内に該核酸が移入されるかどうかに基づいて変更する。インビトロで哺乳動物細胞の核酸の移入のために適当な技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、ミクロインジェクション、細胞融合、DEAE-dextran、リン酸カルシウム沈澱法、などの使用を含む。遺伝子のエクスビボ搬送のために慣習的に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
現在好適なインビボでの核酸移入技術は、ウイルスベクター(アデノウイルス、単純ヘルペスIウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのような)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質介在移入のために有用な脂質は、例えばDOTMA, DOPE及びDC-Cholである)によるトランスフェクションを含む。幾つかの場面において、細胞膜表面タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、該標的細胞上のレセプターのためのリガンドなどのような、標的細胞を標的化する剤と共に該核酸を提供することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスと関連した細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特有の細胞型のためのカプシドタンパク質又はそれのフラグメントトロピック、循環におけるインターナリゼーションを受けるタンパク質のための抗体、及び細胞内局在化を標的化する及び細胞内半減期を増すタンパク質は、標的化及び/又は取込みの促進のために使用され得る。レセプター介在エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら,J. Biol. Chem., 262: 4429-4432(1987);及びWagnerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414(1990)により記載される。現在知られる遺伝子の作製及び遺伝子治療プロトコールの説明は、Andersonら,Science, 256: 808-813(1992)を参照。WO 93/25673及びその中に引用した参考文献も参照。
キットもまた本発明のために意図される。典型的なキットは、容器、好ましくはバイアル、製薬的に許容される緩衝液中にIGFアゴニスト化合物を含むIGFアゴニストのための化合物製剤及び該製薬的製剤を利用するためのユーザーに向けた、挿入文又はラベルのような指示書とを含むであろう。該キットは、GH, GHRP, GHRH, GH分泌促進剤,IGF, IGFBPに複合化したIGF, IGFBP, GHBPと複合化したGH;インスリン、又は低血糖剤のための容器、好ましくはバイアルを任意に含む。
リガンドへの結合のためにポリペプチドと競合するペプチド、該ペプチドはファージ-ディスプレーライブラリーから得られ、のリガンドへの結合のための相対アフィニティーを予測するための方法もまた提供され、該方法は、該リガンドの存在中で該ポリペプチドと共に該ペプチドに一致するファージミドクローンをインキュベートすること、該ファージを連続的に希釈すること、及び該リガンドへの該ファージミドクローンの結合が該ペプチドによって抑制される度合を測定することを含み、ここで低ファージ濃度でのみ抑制されるファージミドクローンは、高い及び低いファージ濃度の両方で抑制されるファージミドクローンよりもリガンドに対するより高いアフィニティーを有する。詳細は後述の実施例7において提供される。好ましくは、該リガンドはIGFBP-1又はIGFBP-3のようなIGFBPであり、該ポリペプチドはIGFである。
ここでの別な実施態様において、そのサイトで、普及又は不在の何れか一方であるIGFBPに特異的であるここでの化合物の有効な量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における特有なサイトから離れた又は向かってのいずれか一方に内因性IGFを導くための方法が提供される。この目的のための「サイト」は、心臓のような、又は脳-特異的IGFBPsを経る脳のような特有の組織又は器官を含む。そのサイトでの普及は、当該のIGFBPが該サイトで局在され及び該サイトでのIGFBPの本質的な又は生物学的に重要な部分を構成することを示す。この示唆は、ここで実証した該化合物のIGFBP-1対IGFBP-3のための特異性に従う。
本発明は、以下の実施例を参考することによりより完全に理解されるであろう。それは、しかしながら、本発明の範囲を制限することとして考慮されるべきでない。ここに記載した全ての文献と特許引用例は、参考により明白に併合される。
実施例
IGFBPsに結合しIGFレセプターにはしない分子の効果を発見するために、Bayneら,J. Biol. Chem., supraにより記載された変異体ヒトIGF-Iを、大腸菌(E. coli)中での組換えDNA技術により生産した。特に、プラスミドpIGFMIを、残基24と31で変わったアミノ酸(Y24L,Y31A)を持ったIGF-I変異体の生産のために設計し、またこれら実施例において(Leu24,Ala31)hIGF-1又はIGF-Mと表示した。該プラスミドは、phGH1の構築のために記載した通りpBR322(Sutcliffe, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 43: 77-90(1978))の基本的バックボーンから構築した。Changら,Gene, 55: 189-196(1987)。その遺伝子の発現のために要求される転写の及び翻訳の配列は、アルカリホスファターゼプロモーターとtrp Shine-Dalgarno配列により提供された。Changら,supra。さらに、ラムダ転写終結配列は、その遺伝子の下流に配される。ScholtissekとGrosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185(1987)。細胞質から細胞周辺腔までのタンパク質の分泌は、lamBシグナル配列によって導かれる。ClementとHofnung, Cell, 27: 507-514(1981)。LamBシグナル配列とIGF-I変異体(Y24L,Y31A)のヌクレオチド及びアミノ酸配列が図1中に示される。
pIGFMIの構築のためのベクターフラグメントは、XbaIとClaIによるp131TGFの消化によって分離した。そのベクターp131TGTは、アルカリホスファターゼプロモーター、アンピシリンとテトラサイクリン耐性マーカー、及びtrp Shine-Dalgarno配列のための配列を含む。IGF-IのLamBシグナル配列とアミノ酸1-15は、XbaIとPstIによるpBKIGF-IIB(米国特許第5,487,980号)の消化により提供した。ほぼ120bpのフラグメントを分離し、Y24LとY31Aの変わった(コドンに下線を付した)アミノ酸をコードしている合成DNAの以下の鎖に予備結紮した:
(それぞれ、配列番号:22と23)
残るIGF-Iコード化配列とラムダ転写終結は、pBKIGF-IIBの適切な190bp BamHIからClaIフラグメントを分離することによって提供した。これらの配列は、図2中に示した通り、pIGFMIを構築するために一緒に結紮した。pIGFMIの完全なヌクレオチド配列は図3中に示される。
Bayneら,J. Biol. Chem., supraは、IGF結合タンパク質への又はIGF又はインスリンレセプターへのそれの結合に関してIGF-I変異体の特性を記載した。この研究はヒトIGF-I上の位置24,31,及び60でチロシン残基が1型IGF-Iレセプターに対する結合のために重要であることを示した。これらチロシン残基の2つが変異した、変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、8.7mMの野生型hIGF-Iのアフィニティーに比べて2,000nMのリガンド結合の半最大抑制を有する。これは、野生型hIGF-Iと比較して約250倍(Leu24,Ala31)hIGF-1による1型IGFレセプターのアフィニティーの相対的減少を示す。
インビトロでの活性に関してIGFにおける変異の機能的な効果は、Bayneら,J. Biol. Chem., supra.によっても研究された。L7ネズミ線維芽細胞内への3Hチミジンの併合を用いたそのアッセイ系は、1型レセプターに結合することのIGF変異体の能力と、DNA合成を刺激することの能力との間に良好な相関関係を示した。これは、このインビトロ活性化アッセイにおいて200倍以上の(Leu24,Ala31)hIGF-1の活性における減少に反映される。しかしながら、ヒト血清IGFBPsへの(Leu24,Ala31)hIGF-1の結合は、野生型IGF-Iで見られるそれに類似する。Bayneら,supra。従って、以下の実施例において、(Leu24,Ala31)hIGF-1は動物において試験されるべく選択した。この分子は、その変異体が2つの変異体のみを含むため、1型IGFレセプター結合が200倍以上減じられるため、及びIGFBPsへの結合が大部分は維持されるために選択した。
実施例1
(Leu24,Ala31)hIGF-1のインビトロでの活性
IGFレセプターについてのIGF-I変異体の直接活性を試験するため、2つの異なるアッセイを利用した。第3のアッセイは、もしその変異体が競合環境においてIGFBPsをIGFに移し替えることができたならば測定するために使用した。
アッセイ1:ヒト1型レセプターのためのKIRA
このアッセイは、ヒト1型レセプター用の直接活性アッセイである。1型IGFレセプターのようなチロシンキナーゼファミリー中のレセプターが活性化される場合、それはチロシン残基上でリン酸化される。このアッセイにおいて、1型IGFレセプターを含んでいる細胞は、インビトロで活性化し、次いで分離し、そして該レセプターに対する抗体が、IGFレセプターを沈殿するために使用される。次に、抗-ホスホチロシン抗体がリン酸化される1型IGFレセプターの量をアッセイするために使用される。もし固定した多数の細胞が使用されるなら、リン酸化されるレセプターの量は、1型IGFレセプター上の分子の活性の直接的な指標である。
ヒト1型IGFレセプター用のKIRAは、ヒトMCF-7細胞を用いて発展した。この細胞系は、ヒト乳ガン腫瘍から最初分離され、ATCCから利用可能である。これら細胞の増殖は、IGF-Iの添加に応答することが知られる。IGF-Iがこれら細胞IGF-I加えられる場合、IGF-Iのリン酸化において投薬量絡みの増加が生じる(図4)。IGF変異体の添加は、レセプターリン酸化においていずれかの変化の原因とならない(図4)。変異体IGFの非常に高い濃度での一様なリン酸化の徴候はなかった。
特に、該アッセイは以下の通り:
細胞
MCF-7、ヒト胸部アデノカルシノーマから分離した癒着細胞系は、American Type Culture Collection(ATCC-HTB22; American Type Culture Collection, Rockville, MD)から入手した。MCF-7細胞は、FACS分析によって表面IGF-IRの測定可能なレベルを発現することが示されている。培養経過のために、該細胞は、150cm2組織培養フラスコ(コーニング社)中、1.5x106/フラスコで4-7日間培養した。アッセイのために、細胞は、PBS/5mM EDTAで組織培養フラスコから分離し、定量化し、さらに平底マイクロタイター板(Falcon 3072, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ)中、ウェル当たり2x105で、5%CO2中37℃で一晩培養した。
媒体
細胞は、ジェネンテック社の媒体施設中で調製したF12/DMEM50:50(特別処方としてGibcoから得た、Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY)中で培養した。該媒体は、10%FBS(HyClone, Logan, Utah), 25mM HEPES(Gibco),及び2mM L-グルタミン(Gibco)を追加した。
KIRA-ELISA
100μl媒体中のMCF7細胞(2x105)は、平底の96-ウェル培養板中の各ウェルに加え、5%CO2中37℃で一晩培養した。翌朝、該ウェルの上清をデカントし、該プレートをペーパータオル上で軽く水気を拭った。次いで実験サンプル又は組換えhIGH-I標準品のいずれか一方を含んでいる刺激媒体(25mM HEPESと2.0%BSAを含むF12/DMEM50:50)を各ウェルに加えた。該細胞を37℃で30分間刺激し、該ウェルの上清をデカントし、該板をペーパータオル上で今一度軽く水気を拭った。細胞を溶解し且つレセプターを可溶化するため、溶解緩衝液の100μlを各ウェルに加えた。溶解緩衝液は、50mM HEPES(Gibco)、0.5%Triton-X 100(Gibco)、0.01%チメロソール、30KIU/mlアプロトニン(ICN Biochemicals, Aurora, OH)、1mM 4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸(AEBSF; ICN Biochemicals), 及び2mMオルトバナジン酸ナトリウムを含む150mM NaClからなる。該板は次いで、60分間室温でプレートシェーカー(Bellco Instruments, Vineland, NJ)上で温和に撹拌した。
該細胞を可溶化している一方、ポリクローナル抗-IGF-IR(ヒト1型IGF-Iレセプターに対する抗体、カタログ3B7, Santa Cruz Biotech, PBS中5.0μg/ml、100μl/ウェル)によって4℃で一晩被覆したELISAマイクロタイター板(Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark)をデカントし、ペーパータオル上で水気をとり、ブロック緩衝液(0.5%BSA(Intergen Company, Purchase, NY)と0.01%チメロソールを含むPBS)によって60分間室温で温和に撹拌することによりブロックした。60分後、抗-IGF-IR被覆プレートを、自動プレートワッシャー(Scan Washer 300, Skatron Instruments, Inc, Sterling, VA)を用いて洗浄緩衝液(0.05%Tween-20と0.01%チメロソールを含むPBS)で6回洗浄した。
細胞培養マイクロタイターウェルからの可溶化したIGF-IRを含む溶解液は、抗-IGF-IR-被覆と-ブロック化ELISAウェルに移し、且つ温和な撹拌とともに室温で2時間インキュベートした。未結合レセプターは、洗浄緩衝液で洗浄することにより取り除き、次いで希釈緩衝液(0.5%BSA、0.05%Tween-20、5mM EDTAと0.01%チメロソールを含むPBS)中に0.1μg/mlに希釈したビオチン化抗体4G10(抗ホスホチロシン)の100μgを各ウェルに加えた。室温で2時間のインキュベーションの後、該板を洗浄し、さらに希釈緩衝液中に1:50,000に希釈したHRP-接合デキストラン-ストレプタビジン(Amdex Laboratories)の100μlを各ウェルに加えた。該プレートは、温和な撹拌とともに室温で30分間インキュベートした。遊離アビジン-接合体を洗い流し、さらに新たに調製した基質溶液(テトラメチルベンジジン;TMB;2-コンポーネント基質キット;Kirkegard and Perry, Gaithersburg, MD)を各ウェルに加えた。反応は10分間継続させた後、着色発生を1.0M H3PO4の100μl/ウェルの添加で停止した。450nmでの吸収は、マッキントッシュCENTRIS 650TMコンピューター(Apple Computers, Cupertino, CA)とSOFTMAXTMソフトウェア(Molecular Devices)によって制御したvmaxプレートリーダー(Molecular Devices, Palo Alto, CA)を用い、650nmの参照波長(Abs450)によって読み取った。
標準曲線(図4)は、300, 100, 33.3, 11.1, 3.7, 1.2, 0.4, 又は参考標準として(ジェネンテック社、lot 1189-2又は均等物)0ng/ml IGF-IによってMCF7細胞を刺激することによって作成した。サンプル濃度は、標準曲線上のそれの吸収の挿入によって得られ、IGF-I ng/ml活性に換算して表した。変異体はこのアッセイにおいてレセプターをリン酸化しない。
アッセイ2:マウス3T3細胞の細胞数の増加
IGF変異体の活性は、DNA合成と細胞複製についてのIGF-Iの活性のためのバイオアッセイにおいても測定した。このアッセイにおいてマウス3T3細胞を培養し、さらにIGF変異体又はIGFを加え、次いで3H-チミジンを滴定した。取り込まれた3H-チミジンの量は、DNAの複製及び従って細胞複製の指標である。IGF-Iは、投薬量絡みの方法においてチミジン取り込みを増加した(図5)。IGF変異体は、非常に高い濃度を加えた場合に一様にこのアッセイにおいて活性なしを示した。
アッセイ3:IGFBPsへの(Leu24,Ala31)hIGF-1のインビトロでの結合
変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、競合結合アッセイにおいてIGFBPsからの放射能標識化rhIGF-Iを移動するその能力を試験した。このアッセイは、一晩96-ウェル板上に、組換えヒト(rh)IGFBP-1又はrhIGFBP-3(160ng/ml)を被覆すること、0.5%BSAで1時間プレートをブロックすること、1時間rhIGF-1(250-0.08ng/ml)又は(Leu24,Ala31)hIGF-1を加えること、次いで125I-IGF-1の20,000cpmを加えること、及び洗浄と計測の前に2時間インキュベートすることを含む。図6は、変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1が野生型hIGF-Iのそれと異なり数倍のみのアフィニティーによって組換えIGFBP-1に結合することを示す。図7は、変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1が野生型hIGF-Iのそれと異なり数倍のみのアフィニティーによって組換えIGFBP-3に結合することを示す。
結論
2つのインビトロアッセイにおいて、変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、1型IGF-レセプターへのわずかな又は無の直接活性を示した。第1に、それはKIRAアッセイにおいて該レセプターのリン酸化によって測定されたようなヒトIGF-Iレセプターを活性化しない。第2に、それは3T3細胞の中に取り込まれたチミジンにより測定されたようなマウスIGF-Iレセプターを直接的に刺激しない。従って、IGFレセプターのその活性の欠落に基づいて、IGF変異体はインビトロで不活性となることも予期されるであろう。しかしながら、変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、インビトロでIGFBP-1とIGFBP-3への顕著な結合を示さない。このインビトロのデータは、インビトロでの変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1を試験するための基礎を提供した。
実施例2
(Leu24,Ala31)hIGF-1のインビトロでの活性
緒言
実施例1で試験した変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1をインビトロで試験した。たとえ該変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1がインビトロで不活性であったとしても、このクラスの分子(レセプター上で直接的には不活性であるが、IGFBPsに結合することができる分子)がインビボで何らかの活性を示すであろうと仮定した。第1の実験において(Leu24,Ala31)hIGF-1は意識のあるラットにIV注射により与えられ且つ血糖値制御の作用を測定した。
方法
7週齢オスWistarラット(240-250g, Charles Rivers Laboratories, Hollister, CA)を、KETAMINE/XYLAZINETM麻酔で意識喪失し、右頸静脈を慢性的血液サンプリング用に開発したシリコーンラバーカニューレによってカニューレ挿入した。Clarkら,J. Endocrinol., 111: 27-35(1986)。2、3日の回復期間の後、2つの基礎の血液サンプルを−10と−5分で採取し、その試験物質をIV注射によりラットに投与し、次いで血液サンプルを、5,10,20,30,45,60,及び120分後に採集し、その血漿を遠心分離によって直ちに分離した。グルコースとインスリン濃度は、Chem 1A血清化学分析装置を用いる結合ヘキソキナーゼ方法又は、後者の場合において、ラットインスリンRIAキット(Linco Research, Inc., St. Charles, MO)によるいずれかで測定した。
統計学的比較は、ダンカンの多重範囲試験によって変数(ANOVA)の分析によって作成した。<0.05のp値は統計学的有意差であると見なした。全てのデータは平均値±SEMとして表した。
結果
実験1
群当たり5匹のラットを持つ2つの処置群は、(Leu24,Ala31)hIGF-1(100μg)又はPBSのいずれか一方をIV投薬した。
該処置に対する血漿グルコースと血漿インスリンの応答は、それぞれ図8Aと8B中に示した。該データは、平均化し且つ100%でセットした前処置血液サンプルにおける値のパーセンテージとして表した。(Leu24,Ala31)hIGF-1のIV注射の一つは、血漿インスリンレベルを即座に(5分後に)、劇的に且つ有意に(10分後、コントロールに対しP<0.001)、コントロール群のそれの25%に減少し、60分間低下を維持した。血漿インスリンにおけるこの落下は、短時間のしかし統計学的に有意な(10分後、コントロールに対しP<0.05)血中グルコースの落下を伴った。
実験2
群当たり4-5匹のラットを持つ3つの処置群中のラットは、(Leu24,Ala31)hIGF-1(100μg)又はrhIGF-1(100μg)のいずれか一方をIV投薬し、コントロール群はPBSを与えた。
図9Aと9Bは、平均化し且つ100%にセットした前処置血液サンプルにおける値のパーセンテージとして表した血漿グルコース(図9A)と血漿インスリン(図9B)の応答を示す。血漿インスリンレベルは有意に減少し(10分後、コントロールに対しp<0.001)、rhIGF-1のIV注射に応答して120分間低下を維持した。加えて、短時間のしかし統計学的に有意な(10分後、コントロールに対しp<0.01)血中グルコースの落下があった。これらはrhIGF-1の注射に対して予期した応答であった。(Leu24,Ala31)hIGF-1が注射された場合、野生型rhIGF-1を与えたラット中のインスリンにおける落下に対して統計学的に有意な(10分後、コントロールに対しp<0.001)の類似の大きさと度合のインスリン濃度における低下があった。(Leu24,Ala31)hIGF-1投与後のインスリンレベルは、実験の終わりまで有意な抑制を維持した(120分後、コントロールに対しp<0.05)。少ないがしかし統計学的に有意な(10分後、コントロールに対しp<0.05)血中グルコースの落下があった。
結論
2つの個別の実験において、高いアフィニティーでIGFBPsに結合するがIGFレセプターには乏しく結合する分子、(Leu24,Ala31)hIGF-1は、通常のラットにおいてIVによって与えた場合、血糖応答変数についてIGF-様の活性を示す。この活性は文献におけるデータから予測することができなかった。該IGF変異体は、野生型rhIGF-Iの作用に類似した程度であったインスリン分泌における抑制作用を示した。この作用のサイズ、及びrhIGF-Iそれ自身の投与の後に見られたその類似性は予期しないものであった。グルコースレベルの落下は、rhIGF-Iの投与の後に見られたと同じく大きくはなかった。応答のこの理法、血中グルコースレベルについてよりもインスリン分泌に関するより大きな作用は、rhIGF-Iに対するこれらの応答の感受性の結果として起こる。インスリン分泌の抑制は、より低い血中グルコースレベルが必要とされるよりもrhIGF-Iのより低い投薬量で見られる。Furnsinnら,Endocrinology, 135: 2144-2149(1994)。
実施例3
糖尿病ラット内への(Leu24,Ala31)hIGF-1の注射
緒言
実施例2において、IGF-I変異体は、通常の非糖尿病ラットにおいてインスリン分泌を減じ且つ血中グルコースを低下した。糖尿病状態において、内因性IGF系を操作することで血糖コントロールの同様の変化に至るであろうことは不明であった。それ故に、II型糖尿病の動物モデルをIGF-I変異体の血糖活性を試験するために選択した。選択した動物、Zuckerラットは、ラットにおける糖尿病に関連した肥満症の良く知られたモデルである。Sternら,Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 139: 66-69(1972)。これらラットの亜系統、Zucker糖尿病肥満系統(ZDF)は、それが進行性b-細胞不全とさらに明らかな糖尿病とともに、早期で肥満とインスリン耐性になることから、II型糖尿病の良好なモデルである。Johnsonら,Science, 250: 546-549(1990)。IGF-I投与がII型糖尿病の開始と重篤度を長期に遅らせ得ることがZDFラットにおいて先に示されている(1996年5月23日公開のWO 96/15148)。従って、ZDFラットは、血糖制御に関してIGFアゴニスト化合物の効果を検査するためのII型糖尿病の適当で敏感な動物モデルを提供する。
本実施例においてIGF変異体の静脈内ボーラス注射を与え、血中グルコース及びインスリン濃度についての効果を実験した。
方法
18匹の7週齢オスZucker糖尿病肥満ラット(250-300g, Genetic Models社)を、KETAMINETM(62.5mg/kg)/ROMPUN XYLAZINETM(12.5mg/kg)麻酔を用い意識喪失した。右頸静脈がシリコーンゴムカテーテルを用いカニューレ挿入され、該ラットを回復させた。
実験1
手術後2日目、該ラット(5−6/群)を3つの処置群に分割し、頸静脈カテーテルを経て、200μlの:
1)PBS賦形剤;
2)IGF変異体(100μg);又は
3)rhIGF-1(100μg)
をIV投与した。
rhIGF-1の投薬量は、血中グルコースレベルと血中インスリンレベルの少ない落下が生起し得る投薬量として選択した。IGF変異体の同じ投薬量が比較のために投与された。
実験2
3日後、同じラットを用い該実験を繰り返した。最初の実験においてIGF-Iを投与した該ラットは繰り返しの実験においてIGF変異体を受けさせ、逆の場合も同じとした。コントロール動物は両方の実験においてPBSを受けさせた。
測定
2つの血液サンプルは、ホルモンをIV投与する前に頸静脈のカニューレを経て各ラットから採集し、次いで血液サンプルを10,30,60,及び120分後に採集した。その血漿は遠心分離によって直ちに分離した。グルコース濃度はChem 1A血清化学分析機を用い結合ヘキソキナーゼ方法により測定した。インスリン濃度は、ラットインスリンRIAキット(Linco Research, inc., St. Charles, MO)を用い測定した。
各時間点での統計学的比較は、Duncan’s多重範囲試験によるANOVAによって作成した。<0.05のp値は、統計学的に有意とされるとして見なした。全てのデータは、処置群当たり5または6動物による平均値±SEMで表した。
結果
実験1の結果を図10Aと10Bに、実験2の結果を図11Aと11Bに示した。各図において上部パネル(A)は基線(100%としてセット)からの血漿インスリンのパーセンテージ変化を、下方パネル(B)は基線(100%としてセット)からの血漿グルコースのパーセンテージ変化を示す。
実験1において、rhIGF-IのIV注射は、直ちに、適度な、且つ統計学的に有意の(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)血中グルコースの低下を生じた(図10B)。反対に、賦形剤処置ラットにあっては、血中グルコースのわずかな増加があった。血中グルコースは次いでコントロール動物におけるレベルに復元した。少量であるが、しかし統計学的に有意な(p<0.05対コントロール、賦形剤処置動物)血中グルコースの低下が、IGF変異体で処置した動物において10分後に見られた。血中グルコースは次いでコントロールレベルに復元した。120分後、血中グルコースはrhIGF-IとIGF変異体の両方で処置した動物において低いレベルを漂った。これは、血中グルコースについてのIGF変異体の長期間の作用の示唆である。
血中グルコースにおけるこれらの変化は、血液中のインスリンの濃度における変化により達成された。コントロールラットの血中インスリンレベルは高く、そのレベルはサンプリングの2時間を通して維持された。rhIGF-Iの注射は、血漿インスリンにおける統計学的に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)、大きな、且つ維持された低下を生じた。IGF変異体の注射もまた、統計学的に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)血中インスリン濃度を抑制した。この群においてインスリンは注射の2時間後にコントロールレベルまでゆっくり戻った。
実験2において(図11Aと11B)、実験1と図10Aと10Bにおいて示したそれら知見と類似の結果が得られた。実験2において、rhIGF-IのIV注射は、直ちに、適度な、且つ統計学的に有意の(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)10分後での血中グルコースの低下を生じた。血中グルコースは30分後にコントロールレベルに復元した。この実験において、類似の且つ統計学的に有意な(p<0.05対コントロール、賦形剤処置動物)血中グルコースの低下が、IGF変異体で処置した動物において10分後に見られた。血中グルコースは次いでコントロールレベルに復元し、次いで低レベルを漂った。再度、これは、血中グルコースについてのIGF変異体の長期間の作用の示唆である。
血中グルコースにおけるこれらの変化は、血液中のインスリンの濃度における変化により達成された。コントロールラットの血中インスリンレベルは高く、そのレベルはサンプリングの2時間を通して維持された。rhIGF-Iの注射は、血漿インスリンにおける統計学的に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)、大きな、且つ維持された低下を生じた。IGF変異体の注射は、同様で且つ統計学的に有意な(p<0.01対コントロール、賦形剤処置動物)血中インスリン濃度の低下を生じた。両方の群において、インスリンはゆっくりとコントロールレベルに戻ったが、しかし2時間後、前注射レベル又はコントロールラットにおけるレベルに完全に戻っているとは思えない。
これらの実験は、IGFアゴニストの急性投与が、1)インスリンレベルを減じ、及び2)血中グルコースレベルを減じることを示す。本実験において、一度だけの注射が与えられ、その輸送は静脈中であった。IGF変異体の一度の注射が血糖値パラメーターに関して効力を示したことから、多数回の注射は、有益な長期間の累積的な効果に至る同様の急性血糖値作用を示すであろうことがほぼ確実であろう。また、皮下で与えた注射がここで用いた静脈内注射と類似の効果を有するが、しかし皮下注射部位からそれの緩やかな吸収のために時間差の原因を示し得ることも予期されるであろう。
ヒトにおいて、rhIGF-Iの注入は、血中グルコースを減じるのに必要とされたそれよりもより低い投薬量でインスリン放出を抑制し(Hartmanら,J. Clin. Invest., 91: 2453-2462(1993))、且つrhIGF-Iのそのような低投薬量オイグリセミック注入はまた、断食-増加拍動GH分泌をも急速に抑制する。それ故に、インスリンの落下は、IGFアゴニストが、増加する内因性活性IGF-Iレベルを生じる、IGF-Iの生物学的利用能を増加すると仮定して、そのIGFBPsの一つとIGFとの相互作用を抑制する分子の投与の後にIGF-Iの放出の感受性マーカーとされることが予期される。
通常の動物と糖尿病動物を用いる、ここに示した実施例において、十分なIGF-Iが血中インスリン及び血中グルコース濃度の有意な低下を誘導することを活性化したことが推定され得る。
実施例4
Hypoxラットへの(Leu24,Ala31)hIGF-1の長期投与
緒言
先の一連の実験は、IGF-Iレセプターに対してではなくIGFBPsに優先的に結合する分子を投与することの急性作用を述べた。これらの分子投与の短期間での効果は、血中グルコースとインスリンレベルの低下により示した通り、IGF様アゴニスト作用を生起することが現に示された。
次に現れる重要な関心事はIGFアゴニストの投与の長期間の効果である。もしこれらの活性のメカニズムがIGFの単純な置換であるなら、時間によって、長期間さらされることによって、継続的にさらされることによって又は高い投薬量にさらされることによって、IGFアゴニストの応答がタキフィラキシーを示すであろう及び急性応答が減少するであろう可能性がある。もし作用のそのメカニズムはIGFの単純な置換以外であるならば、IGFアゴニストの動物における長期間の作用は確実でない。加えて、グルコース調節についての短期間実験は、IGF-Iの長期間の作用、例えば同化作用、分化作用、有糸分裂作用、及び生体機能における作用を示していない。それ故に動物に対するIGFアゴニストの長期間投与は重要であった。
第1のモデルは下垂体切除ラットとした。下垂体切除ラットは、GHとIGF-Iの両方に対して非常に感受性である。Gulerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(1998),supra; Clarkら,Endocrine, 3: 297-304(1995)。しかしながら、内因性IGF-Iレベルは、下垂体切除ラットにおいて非常に低く(恐らく通常の10%のみ)、IGF変異体がそれ自身によって活性を示し得ないと思われた。それ故に、下垂体切除ラットの群は、組換えヒトGHをも与えた。下垂体切除ラットにおけるGH処置は血液中のIGF-Iレベルを引き上げ(Gulerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(1988),supra; Clarkら,Endocrine, supra)、且つこのIGF-Iの増加した血中レベルがIGF変異体の共投与によって活性化され得るとの仮定は合理的であった。
方法
若いメスのSDラットはTaconic実験室で下垂体切除し、数日後に届いた。そのラットは頻繁に体重計測し、下垂体が切除された該実験の後2週と3週の間7グラムの体重増加又は減少した。25匹のラットをそれの体重に基づく5つのグループにランダムにグループ分けし、1ケージ当たりラット4匹でケージにランダムに割り当てた。その動物は食物と水を自由摂取し、温度と光を制御した室内で飼育した。
実験群
1)賦形剤ポンプ、賦形剤注射;
2)(Leu24,Ala31)hIGF-1(10μg/日、SCミニポンプにより)、賦形剤注射;
3)(Leu24,Ala31)hIGF-1(50μg/日、SCミニポンプにより)、賦形剤注射;
4)組換えヒトGH(ジェネンテック社からのNUTROPINTMブランド、20μg/日、SC注射により、各10μg/日で2回注射)、賦形剤ミニポンプ;又は
5)(Leu24,Ala31)hIGF-1(50μg/日、SCミニポンプにより)プラス組換えヒトGH(20μg/日、SC注射により、各10μg/日で2回注射)。
ラットには1週間投薬した。
ホルモン
変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、KETAMINETM/XYLAZINETM麻酔で麻酔した間にそのラットの背部の首部位中の皮下トンネル中に配した浸透性ミニポンプ(ALZET2001TM, Alza, Palo Alto, CA)により投与した。そのポンプは、24μlの溶液が1週間毎日輸送されると仮定し、計算した一日投薬量が50μg又は10μgとなるように溶液で満たした。
組換えヒトGHは、100μl容量中10μgの日に二度のSC注射により一週間投与した。
rhGHの注射を受けない動物は賦形剤の注射を受け、且つIGF-Iを投与しない動物は塩溶液充填ポンプ移植している。
測定
体重は毎朝測定した。投薬の週の終わりに、その動物をCO2を経て麻酔し、心臓穿刺を経て放血した。残りの血液は凝血させ且つ血清を分離し、更なる分析用に保存した。
脾臓、胸腺、心臓、肝臓、腎臓、及び腎周囲脂肪を取り出し、秤量した。その脛骨を取り出し、骨端板の幅を組織学的に測定するために中性緩衝化ホルマリン中で固定した。
血清化学は自動化Chem 1分析機により測定した。血清インスリン濃度は、Linco社によって提供されたRIAキットを用い測定した。IGF-I濃度を測定するため、血清をエタノールを用いて抽出し、その上清を中性状態まで希釈し、RIAによってIGF-Iを測定した。血清抽出液中のラットIGF-Iの濃度は、Diagnostic Systems Laboratories社からのキットを用いるRIAによって測定した。ヒトIGF-I濃度はジェネンテック社でRIAによって測定した。
頸骨は長手方向に分割し、トルエンブルーで染色し、顕微鏡のスライドガラス上に搭載した。その頸骨の骨端板の幅は顕微鏡に接続した接眼マイクロメーターを用いて測定した。
データは1のファクター及び2のファクターANOVAを用いる変数の分析の分析によって統計学的に分析した。
結果と考察
体重:
図12は実験の終了時点での動物の最終体重増を示す。hGH注射の結果として体重の顕著な増加があった。これは、賦形剤で処置した場合、体重増とならないこれらのGH不足下垂体切除ラットにおける予期された応答である。それ自身により、IGFアゴニストは、一日当たり50μgで少量の活性のみを示した。IGFアゴニストの一日当たり10μg群は、コントロール群のそれよりもより少ない平均体重増を有した。しかしながら、IGFアゴニストがhGHと一緒に与えられた場合、IGFアゴニストは全身体の成長についてhGHの活性の増大を示した。これは図12中の最終体重において示される。
器官成長:
器官重量データは、脾臓(図13Aと13B)、胸腺(図14Aと14B)、及び心臓(図15Aと15B)で示される。各図において、絶対器官重量が上部パネル、A中に示され、体重のパーセンテージとして表した器官重量が下部パネル、Bにおいて示される。
絶対脾臓重量(図13A)は、それがhGHのためであるとして、IGF変異体単独の両方の投薬によって増加した。hGHの応答は、IGFアゴニストに対するそれよりもより大きかった。しかしながら、hGHプラスIGFアゴニストの組み合わせは、相乗効果の証拠と共に脾臓サイズを倍増した。脾臓サイズを全身の成長で補正した場合(全体中のパーセンテージとしてのデータで表現することによって)、IGFアゴニストは再度、単独投与の場合に活性化の証拠を示した。しかしながら、現にhGHとIGF変異体の組み合わせの相乗効果は、組み合わせ処置への非常に大きな応答があるとして、より明白であった。
絶対胸腺重量(図14A)は、高投薬量IGFアゴニストによってもまた増加した。hGHに対する及びIGF置換物に対する応答は大体等しかった。hGHプラスIGFアゴニストの組み合わせは胸腺重量をも増加した。胸腺サイズを全身の成長で補正した場合(全体中のパーセンテージとしてのデータで表現することによって)、IGFアゴニストは再度、単独投与の場合に、hGHによって生起されたそれに類似している再度応答によって、活性化の証拠を示した。
本実施例において、10-及び、50-μg投薬量でIGFアゴニストは、心臓の絶対及び相対サイズにおける有意な増加を生じた(図15Aと15B)。一方、hGHによる処置は、絶対心臓重量と相対的な心臓重量をわずかに増加した。hGHとの組み合わせにおいてIGF変異体による処置は、心臓の絶対重量をより大きく増加し、相対心臓重量においてGH誘導化減退を逆転した。
骨の成長:
この実験中の5つの処置群からの骨端板の幅を図16中に示した。コントロール下垂体切除ラットにおける頸骨の幅(約200ミクロン)は、同じラットにおける文献中に報告されたそれと同じだった。Clarkら,Endocrine, 3: 717-725(1995)。それ自身により与えられた場合、50μg/日での(Leu24,Ala31)hIGF-1は、骨の成長において有意の増加を誘導した(P<0.01対コントロール)。低い投薬量の(Leu24,Ala31)hIGF-1は、骨成長が増加しない。一方、rhGHの注射は、周囲400μmまで板の幅が増大する、骨の成長における非常に大きな増加を誘導した。rhGHと(Leu24,Ala31)hIGF-1の組み合わせは骨の成長における更なる増加を生じない。しかしながら、400μmの頸骨板幅は、更なる増加が使用した投薬量で投薬する組み合わせによって生起できたことが起こりそうもないとされる最大値に近い。単独で与えた(Leu24,Ala31)hIGF-1に応答する成長があったことから、hGHの低い投薬量で、単独で与えた各剤よりもその組み合わせの大きな効果が見られるであろうことが予期されるであろう。
血清IGF-Iレベル:
血液中のIGF-Iのレベルは、2つのアッセイで測定した:一方のアッセイでは、血液中のラットIGF-Iの量を、他方は血液中のヒトIGF-Iの量を測定した。図17は、5つの処置群における血液中のラットIGF-Iの量(図17A)及び全IGF-Iの量(図17B)を示す。これらのデータの顕著な側面(図17A)は、レセプター-活性IGF-I(内因性ラットIGF-I)の血中レベルがIGFアゴニストを与えた動物においてより低く、さらにこれらの低い血中IGF-Iレベルは各種の器官及び組織において顕著なIGF様応答と関連したものである。明らかに、それはホルモンの血中レベルが減少される場合にホルモンの増加した活性の証拠を観測することと反対の認識である。
全IGF-I用のアッセイ(図17B)は、ラットとヒトIGF-Iの両方を測定する。このアッセイにおいて、恐らく結合タンパク質へのIGF-Iアゴニストの結合のため及びそれ故に血液中に存在している、IGF-Iアゴニストの50μgを与えたラットにおける全IGF-Iの上昇があった。IGFアゴニストの10μgの低い投薬量で、血液中の全IGFの上昇はなかった。血液中の全IGFは、この処置群において低下する傾向であったラットIGF-Iのレベルに対して、GHとIGFアゴニストの組み合わせを与えたラットにおいて上昇する(p<0.05対hGH単独)。これは、GHがIGF-IとIGFBPsを生み出す場合に、スペアの結合容量があること、及びこの容量はIGFアゴニストによって部分的に満たされていることを示す。
結論
GHとIGF-Iの組み合わせが、ヒトを含む動物に一緒に投与された場合、いずれかの剤単独よりもより大きな活性を示すことは先に示されている(米国特許第5,126,324号;Kupferら,J. Clin. Invest., 91: 391-396(1993))。しかしながら、IGFアゴニストの投与がIGF軸の活性化の結果を生じ且つGH投与の効果を増大するであろうことは不明確であった。本実験は、IGFBPsに緊密に結合するが、IGFレセプターに乏しく結合する化合物の投与が、GHの活性を増大できることを示す。
IGF-Iの投与がGHによって誘導されたそれに対する成長の異なるパターンを誘導することもまた報告されている。特に、IGF-I投与は、脾臓、胸腺、及び腎臓の著しい過剰成長を示す原因となる。Gulerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4889-4893(1988); Skottnerら,Endocrinology, 124: 2519-2526(1989); Clarkら,Endocrine, 3: 297-304(1995)。しかしながら、IGF変異体単独で処置したラットの全身サイズが小さい応答のみ示したことから、処置した動物の器官のサイズにおけるわずかな変化があるであろうことも予期され得る。これはそのケースではない;それは、IGF変異体が、IGF-Iに感受性であることが知られた器官、脾臓及び胸腺のいずれかについて非常に大きな「IGF様」効果を有することがこの実施例中に示される。
この実験における非常に驚くべき知見は、心臓のサイズについての処置の効果であった。下垂体切除又はGH欠乏ラットにおける以前の研究においては、IGF-Iの投与が心臓サイズに関して非常に少ないか効果がないことが示されていた。Gulerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4889-4893(1988);Skottnerら,Endocrinology, 124: 2519-2526(1989);Clarkら,Endocrine, 3: 297-304(1995)。
先に示した通り、IGF-IのアゴニストとしてのIGF変異体の効力に鑑みて、本発明は、血流中のIGF-Iの欠如に関連した、又はそれを特徴とした疾患の大きなグループの治療において適用を有することが予期される。そのような疾患の典型は、糖尿病、肥満症、同化作用疾患、免疫学的疾患、心臓疾患、及び腎臓疾患、同様に他に上述したものである。
実施例5
Dwarfラットへの(Leu24,Ala31)hIGF-1の長期間投与
緒言
先の実施例では、(Leu24,Ala31)hIGF-1に相当するIGF-レセプターよりむしろIGFBPsに優先的に結合する分子を投与することの下垂体切除ラットにおける長期間の効果を述べた。下垂体切除ラットは、それが下垂体ホルモンを欠くために、非常に少ない血清IGF-IレベルとIGFBPsの非常に少ないレベルを有する。Fielderら,Endocrinology, 137: 1913-1920(1996)。しかしながらこれら内因性タンパク質の低いレベルにも関わらず、IGF変異体は顕著な活性を示した。IGF変異体の活性を試験するため選択した次のモデルは、GHとIGF-Iの両方に応答する成長を示す、GH-欠乏dwarf(dw/dw)ラット(Charltonら,J. Endocr., 1198: 51-58(1998))とした。Skottnerら,Endocrinology, 124: 2519-2526(1989); Clarkら,Endocrine 3: 717-727(1995)。dw/dwラットは、下垂体切除ラットであるように全体的なGH-欠乏ではなく、血清IGF-IとIGFBPsのより高いレベルを有する。従って、dw/dwラットに与えたIGF変異体の投薬量は、dw/dwラットの血液がより大きなIGF結合容量とより大きなIGFを含むことが予想されたことから、増加した。
下垂体切除ラット(実施例4)においてGHはIGFとIGFBPのより大きな量を生産するために与えられ、且つ外因性ホルモンの存在において試験した。この実施例において、外因性GHの添加は、これら外因性投与したホルモンの存在においてIGF変異体の活性を発見するために、外因性IGF-Iの添加がされたように繰り返した。該実験の目的は、IGFBPsに良好に結合するがIGFレセプターに乏しく結合する分子を投与することの効果を発見することであった。
方法
動物:
若いメスのdwarfラット(11-12週齢、115-140g)は、ホモ接合のマッチングによって繁殖され(Charles Rivers Laboratories)、ジェネンテック動物舎に搬入し、それらはポリスチレンチップ上の5匹毎のケージに収容し、標準動物餌と水を自由に採取させ、制御した温度と光と共に定常湿度の室内で飼育した。その動物を秤量し、体重の統一性に基づき、37匹の動物を選択し、処置群に任意抽出し、等しい最初の体重(ほぼ120g)の6つの処置群を与えるようにケージ分けした。
実験群:
実験は、群当たり6又は7匹のラットを持つ6つの群からなった。
1)賦形剤コントロール 賦形剤注射
(賦形剤ポンプ)
2)IGF変異体(IGF-M) 賦形剤注射
(ポンプによって120μg/日)
3)IGF-M 賦形剤注射
(ポンプによって120μg/日)
4)IGF-M(120μg/日) 賦形剤注射
プラスIGF-I(120μg/日)
5)賦形剤ポンプ hGH注射(50μg/日)
6)IGF-M hGH注射(50μg/日)
(ポンプによって120μg/日)
ラットは8日間投薬した。
ホルモン:
変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1と固有配列組換えヒトIGF-Iは、KETAMINETM/XYLAZINETM麻酔で麻酔した間にそのラットの背部の首部位中の皮下トンネル中に配した浸透性ミニポンプ(ALZET2001TM, Alza, Palo Alto, CA)により投与した。そのポンプは、製造者の記載の通り(一日当たり24μlの溶液)が輸送されると仮定し、計算した一日投薬量が120μg(1mg/kg/日)となるように溶液で満たした。
組換えヒトGH(50μg/日)は、100μl容量中25μgの日に二度のsc注射により8日間投与した。
rhGHの注射を受けない動物は賦形剤の注射を受け、且つIGF-Mを投与しない動物は塩溶液充填ポンプ移植している。
測定:
体重は毎朝測定した。8日後、その動物をCO2を用いて麻酔し、心臓穿刺を経て放血した。残りの血液は凝血させ且つ血清を分離し、更なる分析用に保存した。
脾臓、胸腺、心臓、肝臓、腎臓、及び腎周囲脂肪を取り出し、秤量した。その脛骨を取り出し、骨端板の幅を組織学的に測定するために中性緩衝化ホルマリン中で固定した。
血清化学はTECHNICON Chem 1 PLUSTM分析機により測定した。血清インスリン濃度は、Linco社によって提供されたRIAキットを用い測定した。IGF-I濃度を測定するため、血清を酸性エタノールを用いて抽出し、その上清を中性状態まで希釈し、RIAによってIGF-Iを測定した。血清抽出液中のラットIGF-Iの濃度は、Diagnostic Systems Laboratories社からのキットを用いるRIAによって測定した。ヒトIGF-I濃度はジェネンテック社でRIAによって測定した。
頸骨は長手方向に分割し、トルエンブルーで染色し、顕微鏡のスライドガラス上に搭載した。その頸骨の骨端板の幅は顕微鏡に接続した接眼マイクロメーターを用いて測定した。
データは1のファクターANOVAを用いる変数の分析、続いてDuncan’s範囲試験によって統計学的に分析した。
結果と考察
体重:
図18は、該実験の8日間にわたる処置の体重増の効果を示す。該実験の7日において、更なる1日間の実験を継続することを決定し、hGHの新たな調製物を作製し且つ注射した。7日と8日の間の大きな体重増は、hGHのこの調製物が0日と7日の間で使用したそれと異なることを示唆する。従って、7日についてのhGH用の体重増データは、8日でのそれよりも全般的な実験を良好に反映する。これらのGH-欠乏dwarfラットにおける予期された応答、IGF-Iの注入又はhGHの注射の結果として体重における顕著な増加があった。それ自身によって、IGFアゴニストは、6日での統計学的に有意なアプローチによってのみの体重増と共に(賦形剤1.3±1.1g対IGF変異体4.2±0.6g、p<0.10)、成長促進活性の少ない量のみを示した。しかしながら、IGF変異体がIGF-Iと一緒に与えられた場合、始めに明瞭な重量増があり(一日目での賦形剤-0.6±0.8g、IGF変異体0.5±0.6g、IGF-I 1.2±0.4g、IGF変異体プラスIGF-I 3.3±0.8g、p<0.05対IGF変異体とIGF-I単独)、しかしこの応答は経時と共に衰えた。一方、hGH単独とhGHプラスIGF変異体の間の相違は経時に伴って増加し、5日で統計学的有意に達した(hGH単独12.4±0.9g対hGHプラスIGF変異体15.5±0.6g、p<0.05)。従って、IGF変異体は全身成長についてhGHの活性を増大した。これらの効果は成長曲線と最終体重において示した(図18)。
器官成長:
器官重量データは、脾臓(図19)と腎臓(図20)を説明する。各図において、絶対器官重量がAで示され(上部パネル)、体重のパーセンテージとして表した器官重量をBで示した(底のパネル)。
絶対脾臓重量(図19A)は、IGF変異体で処置した全ての群で増加する傾向にあった。例えば、賦形剤コントロールラットにおける脾臓重量(308±6mg)は、IGF変異体単独で処置することにより350±14mgに増加した(p<0.10対賦形剤)。IGF-I又はhGH処置のいずれか一方とIGF-Mの組み合わせもまた、より大きな脾臓を与える傾向にあった(図19A)。脾臓重量が体重のパーセンテージとして表される場合、IGF変異体により生じた脾臓サイズにおける類似の増加が見られた(図19B)。
絶対腎臓重量と相対腎臓重量を図20Aと20B中にそれぞれ示した。IGF-I変異体に対する腎臓の応答は、脾臓のそれに似ていた。例えば、相対腎臓重量は、IGF変異体による処置により、特にそれがIGF-Iとの組み合わせにおいて与えられた場合に増加した(IGF-I単独、0.85±0.3%対IGF-IプラスIGF変異体0.92±0.04%、p<0.05)。
腹膜後脂肪蓄積物は、屠殺時にラットから取り出し、秤量した。脂肪組織貯蔵を減じるIGF変異体の傾向があった(プラシーボ0.56±0.09g、IGF変異体0.53±0.10g、IGF-I 0.48±0.06g、及びIGF-IプラスIGF変異体0.43±0.05g)。
血清化学とホルモン:
表Iは、屠殺時に採集した血清の分析から採集したデータを示す。ラットにおいて血中グルコースレベルについて各種の処置のいくらかの効果があったが、インスリンレベルについて非常に顕著な効果があった。GHの糖尿病誘発性作用が、賦形剤処置コントロールに比較してGH処置ラットにおける有意に増加したインスリン濃度(p<0.05)によって示された。もし該ラットがIGF変異体と共-処置されたならば、共-処置群における血清インスリンレベルが賦形剤コントロール群中のインスリンレベルと相違していなかったように、これは血清インスリンを増加する(GHの糖尿病誘発性作用)。
IGF変異体(IGF-M)は腎臓サイズを有意に増加した。腎機能の血清測定の2つの目安、血清クレアチニンと血液尿素窒素(BUN)レベルは、IGF変異体によって減じられた。表Iは、血中のクレアチニン濃度がIGF-IとIGF変異体の両方によってそれらが単独で与えられた場合、減少される傾向を示す;しかしながら、これらの効果は統計学的に有意ではない。しかしながらIGF-IプラスIGF変異体は、腎機能の改善の目安、血清クレアチニンを有意に(p<0.05)減じた。腎機能の第2の目安、血液尿素窒素もまた、IGF-Iによって及びIGF-IプラスIGF変異体によって減じられ、その組み合わせに関して、IGF-I単独のそれよりも有意に大きくなっている(p<0.05)。
IGF-IプラスIGF変異体の組み合わせは、賦形剤コントロールに比べて血液中の酵素AST(アラニンセリントランスフェラーゼ)とCK(クレアチニンキナーゼ)の量を減じた(p<0.05)。ASTは、心臓のダメージと機能の目安であり、CKは骨格筋機能の目安である。これらのデータは、骨格筋と心筋に関してIGF変異体の有益な効果を示すとして解釈され得る。
骨の成長:
頸骨板幅は、賦形剤コントロールと比べ、hGHによって及びIGF-I処置によって有意に(p<0.05)増加した。全てのケースにおいてIGF変異体は個別の処置に比べて平均板幅を増加したが、これらの増加は統計学的有意には達しない。
血清IGF-Iレベル:
血液中のIGF-Iのレベルは、2つのアッセイにおいて測定した(図21Aと21B)。一方のアッセイ(図21A)はラットIGF-Iの量を測定し、他方のアッセイ(図21B)は5つの処置群において血液中のヒト及びラットIGF-I(全IGF-I)の両方を測定した。これらのデータ(図21A)の著しい側面は、レセプター-活性IGF-I(内因性ラットIGF-I)の血液レベルが変異体IGFを与えた動物においてより低く、さらにこれらの低い血液IGF-Iレベルは、各種器官と組織における顕著なIGF様応答と関連した。明らかに、それは、ホルモンの血液レベルが減じた場合、ホルモンの増加した活性の証拠が観測されることと反対の認識である。
全IGF-I用のアッセイ(図21B)はラットとヒトIGF-Iの両方を測定する。このアッセイにおいて、結合タンパク質へのIGF-Iアゴニストの結合とそれ故に血液中に存在していることによると思われる、IGF-Iアゴニストの150μgを与えたラットにおける全IGF-Iの上昇があった。血液中の全IGFレベルは、IGF-I又はGHとIGFアゴニストのいずれか一方の組み合わせを与えたラットにおいて、これら組み合わせ処置群において低下したラットIGF-Iのレベルとは反対に上昇した。(p<0.05対IGF-I単独又はGH単独)。これは、GHがIGFとIGFBPsを生成する場合、スペアの結合容量があり、この容量がIGFアゴニストによって部分的に満たされていることを示す。
結論
GH-欠乏dwarfラットにおけるこれらの長期間データは、下垂体切除ラットにおいて採集した長期間データを確証し拡張する;IGF変異体は同化及び成長促進作用を生産した。加えて、この実験は、IGF変異体がGHと共に投与した場合に成長促進活性を示すことを確証した。さらに、IGF変異体がdwarfラットにIGF-Iと一緒に与えられた場合、そのIGF変異体は投与したIGF-Iの活性を増加できた。それ故、本実験は、IGFBPsと緊密に結合するが、IGFレセプターに乏しく結合する化合物の長期間投与が、内因性IGF-I、外因的に投与したGH、及び外因的に投与したIGF-Iの活性を増大できることを示す。
この実施例においていくつかの重量な知見は、下垂体切除ラットにおいて作られた発見を拡張することをもたらした。
第1に、IGF変異体で処置したラットにおける腎臓の増加したサイズは、血液中のクレアチニン及び血液尿素窒素の濃度における低下によって果たされた。血液代謝におけるこれらの低下は、腎臓の増加した機能の特徴である。心筋と骨格筋に関する機能効果の更なる証拠もまた与えられた。脂肪塊の減少の証拠はIGF変異体を用い得られた。これは、身体組成の制御における、特に肥満症のためのIGFの使用を示す。例えば、肥満症の予防又は治療へのGHとIGF-Iの使用についての米国特許第5,597,797号を参照。
第2に、GHの投与は、インスリンにおいてこの上昇が防止されたIGF変異体の共-投与と同時に、インスリンの血液濃度を有意に増加した。それ故に、GHのこの周知の糖尿病誘発性作用はIGF変異体の共-投与によって逆転できた。
第3に、IGF変異体へのこれらの応答は「活性」ラットIGF-Iの血液濃度における低下の存在において生じた。
それ故、IGF変異体の長期注入は、1)その血液中に検出不可能なGHと非常に低いIGF-I濃度を有する下垂体除去ラット、2)その血液中に低いGHと低いIGF-Iレベルを有するdearfラットにおいて複数の活性を示した。
実施例6
糖尿病ラットへの(Leu24,Ala31)hIGF-1の長期間投与
この実施例において糖尿病の動物モデルは、IGF変異体によって長期間処置された。選択した動物はII型糖尿病ラット(Zucker糖尿病脂肪(ZDF)ラット)とした。このラットは、相対的に通常の脳下垂体機能(GH分泌に関して)と相対的に通常の血清IGF-I濃度を有する。従って、この動物モデルは、GHの完全な欠如(下垂体除去ラット)又はGHの明確な欠乏(dw/dwラット)及びIGF欠乏の両方である先の2つのラットモデルとは異なる。加えて、この実施例において、IGF変異体の投与形態は、注入(先の2つの実施例で用いた)から複数注射まで変えた。さらに、IGF変異体の投薬量は、先に説明した通り、ZDFラットが下垂体切除又はdw/dwラットのようにIGF欠乏でないこと及びそれ故に放出されるべき大量の活性IGFを有するために増加した。先の実施例において効力の目安とするために用いた主要な終点は身体成長の目安であったが、本実施例において主要な終点は、動物の糖尿病段階の測定値、血中グルコースとインスリン濃度とした。
先の実施例において、IGFアゴニストの一つの注射の急速な静脈内投与が、1)インスリンレベルを減じた及び2)グルコースレベルを減じたことを示した。IGFアゴニストの1つの注射が血糖値パラメーターについての効力を示し且つ長期間の注入が効力を示した(成長パラメーターのタキフィラキシーなしに)ことから、複数注射が有益な長期間累積血糖値効果に至る急性血糖値効果をその度毎に示すであろうと仮定した。また、皮下的に与えた注射が効力を示すであろうと仮定した。それ故に、後述した糖尿病ラットにおける長期間実験を開始した。
方法と実験群:
動物:
肥満のオスZucker糖尿病脂肪質(ZDF)ラット(6-7週齢、225-250g、Genetic Models社、indianapolis, IN 46268)は、温度と光を制御した室内でグループ飼育(3/ケージ)し、供給元で推奨した固形化ラット食餌(Purina 5008, 6% fat breeder chow)と飲み口からの水を自由に与えた。3日間の順応化の後、血液サンプルをラット特異的RIA(Linco Research社,St. Charles, MO)によって測定した、血中グルコースとインスリンの測定のため尾の静脈から得た。動物は4つの処置群に任意抽出し均等な最初の血中グルコースレベル、インスリンレベル、及び体重を有するように群のバランスを与えるようにケージに入れた。
該実験は、群毎に7匹のラットを持つ4つの群からなった。
1) 一日3回賦形剤注射、
2) IGF変異体(IGF-M)の注射(一日50μg三度)
3) IGF-Mの注射 (一日150μg三度)
4) rhIGF-Iの注射 (一日150μg三度)
該注射はそれぞれ100μlで一日三度与えた。
ホルモン:
変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1は、一日三回の注射によって二つの濃度を与える(総計450μg/日又は150μg/日)ように、二つの濃度(1.5mg/mlと0.5mg/ml)で調製した。rhIGF-Iは、一日三回の注射によって一つの投薬量(450μg/日)を与えるように一つの濃度(1.5mg/ml)で調製した。ラットの第4の群は賦形剤を与えた。それぞれ100μl容量の注射は、ビバリウム室の昼間の光を制御し混乱させることなしに15日間、午前7時、午後1時、及び午後7時に与えた。体重は毎日午後1時に測定した。
血液サンプリング:
血液サンプルは、投薬する最初の日前の晩に、及び3日、7日と10日に、非断食ラットから採集した。3,7,及び10日の血液サンプルは、昼間の注射の1時間後に尾の静脈から出血することによって採取した。その血液は凝固させ、血清を分離し、分析の前まで保存した。
グルコース耐性試験は、実験の14日目に実行した。ラットはその定例の朝の注射を受けさせ、その食餌を取り上げた。3-5時間後、出血サンプル(400μl)を尾の静脈を経て採取した。次にラットは腹腔内(ip)注射によって2g/kgブドウ糖(50%)を受けさせた。血液サンプル(200μl)を、ブドウ糖投与の10、60、及び120分後に尾の静脈を経て採取した。血液は凝固させ血清を分離し、グルコースとインスリン濃度の測定まで保存した。グルコース耐性試験が完了した後、動物は再度食餌を与えた。
15日目、朝の注射の1時間後、ラットは二酸化炭素によって仮死状態とし心臓穿刺によって放血した。血液は凝固させ、血清を分離し且つ凍結した。脾臓、胸腺、心臓、肝臓、腎臓、及び腎周囲脂肪を取り出し、水気を切り乾燥し、直接秤量した。
統計学的分析:
各時間点の統計学的比較は、Duncan’s多重範囲試験による変数の分析によって行った。<0.05のp値は統計学的有意であると見なした。全てのデータは、処置群当たり7匹の動物による平均±SEMとして表される。
結果
時間に対してプロットした体重増が図22A中に4つの異なる処置群として示される。13日目の体重増は、コントロール(コントロール、93.3±2.9g)に対し、50μgでのIGF変異体(100±2.1g、p<0.05対コントロール)、150μgでのIGF変異体(105.1±2.3g、p<0.01対コントロール)、及びIGF-I(114.5±1.6g、p<0.0001対コントロール)において有意に増加した。IGF変異体の体重についての投薬-関連同化作用は、先の実施例における下垂体除去及びdwaftラットにおけるデータで確証される。
これらの糖尿病動物において、体重増の理由は、その処置が動物の糖尿病状態を改善したために同化作用ではなく間接的な作用ともされ得る。Carlssonら,J. Endocrinol., 122: 661(1989)。データのこの解釈は、これら同じ動物における経時による血中グルコースの変化を示す図22Bにおける説明によって裏付けられる。血中グルコースは、注射を始める前に測定し、その図はこの基本レベルからの変化パーセンテージを示す。図22Bは、10日で基礎の141±21%に達するまで賦形剤の繰り返し注射で処置したラットにおいて血中グルコースは堅実な上昇を示す一方、この時点でIGF-Iの注射(一日150μg三度)は血中グルコースのこの上昇を大きく防止した(25±10%、p<0.001対コントロール)ことを示す。50μgでのIGF変異体の注射(84±20%、p<0.05対コントロール)及び150μgでのIGF変異体の注射(74±22%、p<0.05対コントロール)もまた、10日目でのこれら糖尿病ラットにおける血中グルコースの上昇を遅らせた。より早い時点で、例えば7日目で、高投薬IGF変異体及びIGF-Iは血中グルコースの上昇を抑制することで等しく有効であった。
図23Aと23Bは、血中グルコースについてとインスリン濃度についてこれらの糖尿病ラットにおけるグルコース耐性試験の効果を示す。グルコース耐性試験は、模擬の食事として見なすことができる。そのラットは出血させ、次いで体重の2g/kgでグルコースの腹腔内注射を与え、注射の後に再度出血させた。図23Aは、グルコース負荷試験の後2時間の血中グルコースの変化を示す。賦形剤で処置した糖尿病ラットにおいて、血中グルコースは実質的に上昇した(105±21mg/dl)。IGF-Iによる処置は、血中グルコースのより少ない上昇を生じ(39±12mg/dl, P<0.05対コントロール)、同じくIGF変異体による処置(150μg, tid)もまた、この上昇を弱めた(59±11mg/dl, p<0.1対コントロール)。
IGF-I又はIGF-変異体による処置の有益な効果の可能性のある理由は、図23B中に示したインスリンによって提供される。IGF-Iで処置したラットにおいて、50μgでのIGF変異体(10.2±0.7ng/ml, p<0.05対コントロール)又は150μg(10.6±0.6ng/ml, p<0.05対コントロール)で処理したラットにおいてなされたそれよりも、より多くのインスリン分泌がグルコース負荷試験への応答において生じた(コントロール,81±0.6ng/ml対IGF-I, 12.2±0.7ng/ml、p<0.01)。従って、IGF変異体による長期処置は、グルコース負荷を処理する改善された能力に関係した模擬の食事に応答して多くのインスリン分泌を与えた。
考察
糖尿病ラットへのIGF-変異体を長期間投与するこの実験は、血中グルコースが内因性IGF系を操作することにより制御され得ることを示す。多分、糖尿病動物における改善されたグルコース制御の間接的なマーカー、及びグルコース制御の直接の目安(血中グルコースとインスリン)、体重増は糖尿病状態の改善においてレセプター不活性分子のこのクラスの驚くべき有効性を示す。
本実施例において一日複数回の皮下注射はタキフィラキシーの徴候なしに15日間与えられた。先の実施例においてこの分子の注入は、維持された同化応答を生じた。従ってそれは、輸送の多くのルートとパターンが同様の効力を示すであろうことを合理的に仮定する。例えば、長い半減期を持つ分子の経口処方は、経口又は他のルートによって運ばれた分子の半減期効力がより短くなるであろうような効力となることが予期されるであろう。
実施例7
IGF-Iと結合タンパク質を結合するためのファージ誘導化ペプチド
次の一連の実施例において、通例のα-アミノ酸は、中間体と最終生産物に言及している場合には標準の1又は3文字アミノ酸コードによって記載され得る。普通のα-アミノ酸は、mRNA指令の下でタンパク質に組み入れるそれらアミノ酸を意味する。標準の略字は、The Merck Index, 10th Edition, pp Misc-2-Misc-3中にリストされる。別の定義がない限りは、通例のα-アミノ酸は天然の又はアルファ炭素原子で“L”-立体配置を有する。もしそのコードが“D”によって先行されたなら、これは通例のα-アミノ酸の反対の鏡像異性体を表示する。ノルロイシン(Nle)とオルニチン(Orn)のような修飾した又は例外的なα-アミノ酸は、米国特許庁オフィシャルガゼット1114 TMOG, 1990年5月15日中に記載された通り定義される。
上述したIGF変異体を用いる実験の結果に基づき、IGFBPとIGFの相互作用を抑制し、且つIGF-Iレセプターに全てではなく乏しく結合する、ペプチド又は小さい有機分子のような他の分子が処理されている対象における活性IGFレベルを増加するであろうことが予期される。加えて、別のクラスの分子、特にペプチド又は小さい分子は、IGFBPsとIGF-Iの相互作用を抑制する又は防止するためのそのような手法においてレセプター相互作用を包含したそれから離れたサイトでIGF-Iそれ自身結合し得るが、そのレセプターとIGF-Iの相互作用ではない。
タンパク質のような標的分子に特異的に結合する及び測定可能なアフィニティーを持つペプチドは、バクテリオファージ被覆-タンパク質融合体を用いる結合選択を経て多くの結合及び非結合ペプチドの最初のライブラリーから同定され得る。Smith, Science, 228: 1315(1985); ScottとSmith, Science, 249: 386(1990); Cwirlaら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 309(1990); Devlinら,Science, 249:404(1990); WellsとLowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 2: 597(1992)により再考された; 米国特許第5,223,409号。加えて、ファージを表示したタンパク質とペプチドの両方は、変異誘発、選択及び増殖の繰り返しサイクルを通してアフィニティー-増幅され得る。
特有の残基位置で配列において相違しているペプチドの文献は、合成オリゴヌクレオチドを用い構築され得る。ペプチドは、特有のペプチド変異体をコードしている一重鎖DNAゲノムをそれぞれ含み、ファージ被覆タンパク質(g3p又はg8p)によって融合タンパク質として表示されるアフィニティー精製のサイクルの後、固定化した標的分子を用い、個別のバクテリオファージクローンを分離し、それを表示するペプチドのアミノ酸配列をそれのDNA配列から推定した。
I.ペプチド-ファージライブラリーの構築
IGF-I又はIGF結合タンパク質に結合でき得る能力を有している一連のペプチド分子を同定するために、IGFBP-1又はIGFBP-3のような、18から20残基までの範囲内の長さの、ペプチドのいくつかの多様なファージライブラリーを構築した。このサイズのペプチドは、溶液中で良好に定義された構造を維持できるペプチドの選択に好都合であるため選択した。このサイズの天然-アミノ酸ペプチドが2018-2020(即ち、2.6x1023から1.0x1026)変異体の潜在的な配列多様性を有するために、そのような変異体の全てを構築し且つ試験することは実施できない。その代わり、ある種の残基は、各ペプチドの中の、ジスルフィド結合又はベータ-ターンのようなペプチド構造の安定要因を与える又は促進することが予期され得たものと固定し又は定常化した。
構造的な抑制又はフレームワークは、ファージに関するペプチドライブラリー提示のため及び続いて、変異と選択を通しての結合アフィニティーの首尾の良い増加のために予め使用されている。そのように構成されたフレームワークは、ペプチドセグメントの安定な結合構造に好都合となり得る。類似体により、免疫グロブリンは、異なる抗原に結合できる異なるペプチドループ(CDR’s, 相補決定領域)の多様性の提示のための安定な(及び保存された)構造フレームワークを提供する。
ライブラリー構築用のテンプレートとして用いたのは、バクテリオファージM13のg8pに融合した抗体認識可能(gD-tag)ペプチドを発現するプラスミド、pt4.g8(完全なDNA配列を図24中に示した)とした。このプラスミドはDNA複製の単鎖及び二重鎖基点を含む。phoAプロモーターとSTII分泌-シグナル配列は、「リンカー」ペプチド(下記の二重下線)、及びバクテリオファージM13のg8pの後ろにあるgDペプチド(下記の下線)の上流である:
幾つかのランダム配列ペプチドライブラリー(表II)は、後述したオリゴヌクレオチドと共に、単鎖テンプレート規制変異誘発(Kunkelら,Methods. Enzymol., 204:125(1991))を用い構築した。
A.ベータ-ターン配列モチーフ
周知の三次元構造のペプチドの実施例は、ファージディスプレーによってエリトロポイエチンレセプター(EPO-R)のためのペプチドアゴニストを選択した、Wrightonらによって与えられるWrightonら,Science, 273: 458(1996)。ペプチドGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(配列番号:35)(二つのCys残基を接合しているジスルフィド結合を有している)は、EPO-Rと結晶化した複合体において、二つのベータヘアピンのダイマーを形成する。Livnahら,Science, 273: 464(1996)。たとえ溶液中のこのペプチドの非結合形の構造が報告されていないとしても、EPO-Rとの複合体中のこのペプチドによって形成しされたベータ-ターン構造は、類似の構造が、CX2GPX4C(配列番号:36)型のペプチドによって形成され得たことを示唆した。
構築されたペプチドライブラリーの一つのタイプとして、該gDペプチドは、開始プラスミドのそれから変化していない上流及び下流(「フランキング」)残基をそのままにしてある、モチーフCX2GPX4C(配列番号:36)により置換された。かくして、このライブラリーはファージ粒子上にディスプレーすることで定義され、該ペプチドSGTACX2GPX4CSLAGSP(配列番号:37)(ここでXは20の天然L-アミノ酸の何れかを表す)は、該リンカーと上述したg8pに融合した。このライブラリーはオリゴヌクレオチドHL-300:
(ここでNはヌクレオチドA,G,C,及びTの混合を示し、且つSはヌクレオチドGとCの混合物を表す)を用いて構築した。
補足のライブラリーは、該ペプチド及び/又はフランキング配列もまた任意抽出することによって標的タンパク質との更なる相互作用を許すように構築された。このライブラリーは、オリゴヌクレオチドHL-301:
を用いることによってX4CX2GPX4CX4(配列番号:39)型によって構築した。
B.ジスルフィド-ループモチーフ
多くの補足のペプチド構造が、与えられた標的タンパク質に結合するために生産され得るため、ファージ-ディスプレーしたライブラリー中のペプチド配列モチーフの他のタイプを試験することが望まれた。例えば、小さいペプチドの中の単一ジスルフィド結合は、制限されない構造におけるよりも相対的により高い結合アフィニティーを与える安定構造を支持し得る。Geysenら,Mol. Immunol., 23: 709(1986); Woodら,Science, 232: 633(1986); Oldenburgら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5393(1992); O’Neilら,Proteins, 14: 509(1992); McLaffertyら,Gene, 128: 29(1993); Giebelら,Biochem., 34: 15430(1995)。幾つかのペプチド-ファージライブラリーは、それ故に、XmCXnCKk(配列番号:41)型、式中m=4、n=10、及びk=4、又は式中m=5、n=8-9、及びk=4-5、又はm=6、n=6-7、及びk=5-6、又はm=7、n=4-5、及びk=6-7(配列番号:28から34)を構築した。これらのペプチドにおいて、ジスルフィド結合はペプチド構造のための安定した抑制を形成すると予測される。
これらペプチドライブラリー(表II参照)は、オリゴヌクレオチドHL-303:
を用いて、X7CX4CX7(配列番号:42)、
オリゴヌクレオチドHL-304:
を用いて、X7CX5CX6(配列番号:44)、
オリゴヌクレオチドHL-305:
を用いて、X6CX6CX6(配列番号:46)、
オリゴヌクレオチドHL-306:
を用いて、X6CX7CX5(配列番号:48)、
オリゴヌクレオチドHL-307:
を用いて、X5CX8CX5(配列番号:50)、
オリゴヌクレオチドHL-308:
を用いて、X5CX9CX4(配列番号:52)、
オリゴヌクレオチドHL-309:
を用いて、X4CX10CX4(配列番号:54)、
として構築した。
C.非抑制ペプチド
非抑制ライブラリー(即ち、そのペプチド内に固定した残基を有さない)もまた特異的結合物を生じている。ScottとSmith, Science, supra; Cwirlaら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, supra; Devlinら,Science, supra; Kayら,Gene, 128: 59(1993)。そのようなライブラリーは、非共有的な相互作用が結合及び/又は非結合形における構造をさらに誘導し得ることから、それにもかかわらず、構築したペプチドを生じ得る。X20(配列番号:56)型の、非抑制ペプチドライブラリーは、オリゴヌクレオチドHL-302:
を用いて構築された。
II.多価(g8)ファージ結合選択
ランダム変異誘発反応の生産物は、エレクトロポレーションによってXL1-BLUETM大腸菌細胞(Stratagene)内に形質転換し、M13K07(VieiraとMessing, Methods Enzymol., 153: 3-11(1987))又はVCSM13ヘルパーファージ(Strataene社)と共に15-16時間増殖することによって増幅した。最初の形質転換体の平板培養に基づいて、ライブラリー毎の形質転換体の数はほぼ、ライブラリーHL-300が1.8x108、HL-301が7.9x108、HL-302が5.0x108、HL-303が5.3x108、HL-304が5.6x108、HL-305が5.0x108、HL-306が6.3x108、HL-307が4.5x108、HL-308が1.9x108、及びHL-309が2.1x108であった。
IGFBP-1、IGFBP-3、及びIGF-Iは、製造元の指示を用い、タンパク質に対して、切断可能ビオチン試薬、EZ-LINKTMNHS-SS-Biotin(Pierce)の1.5:1モル比によってビオチン化した。
IGFBP-1、IGFBP-3、及びIGF-Iへの結合のためのペプチドの最初の選択は、ほぼ1010ファージ/ml(100μl全量)のファージプールを用いて実行した。MAXISORPTM 96-ウェルのプラスチック板(Nunc)は、50mM炭酸ナトリウム緩衝液,pH9.6中にNEUTRAVIDINTMブランドのアビジン(Pierce)の2μg/mlの溶液により4℃で一晩被覆した。NEUTRAVIDINTM溶液を取り除き、該板を、50mM炭酸ナトリウム緩衝液中にウシ血清アルブミンの5g/l、又はオボアルブミンの5g/l、又は即席ミルクの5g/lのブロッキング溶液と共に、室温で1-2時間インキュベートした。次いでブロッキング溶液を取り除き、ビオチン化標的タンパク質の溶液を加えた。室温で1-2時間後、その標的溶液を取り除き、その板をPBS/TWEENTM界面活性剤(PBS緩衝液中0.05%のTWEEN-20TM)で十回洗浄した。
上述したライブラリーからのファージは次のようにプールした:プールAはHL-300ファージ、プールBはHL-301ファージ、プールCはHL-302ファージ、及びプールDはHL-303, HL-304, HL-305, HL-306, HL-307, HL-308,及びHL-309ライブラリーからのファージからなる。ファージは、それぞれの標的によって被覆されたウェル、及びNEUTRAVIDINTMにより又はアルブミン、しかし標的をビオチン化していない、により被覆されたコントロールウェルと共に、PBS/TWEENTM/アルブミン/ビオチンの中に加えた。そのファージは室温で5-15時間結合することを許した。そして、その板をPBS/TWEENTM緩衝液で十回洗浄した。
板に結合した残りのファージは、50mM DTTと室温で1-2時間インキュベートすることによって溶離した。溶離したファージは大腸菌の中にトランスフェクトし、該ファージを増幅するために37℃で一晩増殖させた。
結合選択の第2及び第3のサイクルは、ストレプタビジン(0.1mg/mL)をビオチンと一緒にファージカクテルに含めたこと以外は、上記の通り実行した。アリコートをそれぞれの標的被覆した及びそれぞれのライブラリーとインキュベートしたコントロールウェルから採取し、希釈したファージの連続希釈液は標的への特異結合の測定を実行した。その希釈したファージは、大腸菌細胞内にトランスフェクトし、コロニー計測のために平板培養した。
結合選択の第4のラウンドは、それぞれの標的タンパク質の2μg/mlで、又はアルブミンのみで直接被覆したMAXISORPTM板上で実行した。サイクル2-4におけるファージ結合選択の結果を図25に示した。
同じ開始ファージライブラリー(A,B,C,D)はまた、直接被覆したIGFBP-3に対する結合選択のためにも使用した。この場合、MAXISORPTM 96-ウェルプラスチック板(Nunc)は、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中、IGFBP-3の2μg/ml溶液によって4℃で一晩被覆した。その標的溶液を取り除き、さらにその板をウシ血清アルブミンの5g/Lのブロッキング溶液と室温で1-2時間インキュベートした。ファージは上記の通り板とインキュベートし、未結合ファージを洗い流した。結合して残っているファージを20mM HClと室温で10分間インキュベートすることによって溶離した。その後、酸溶離ファージは1Mトリス-HCl,pH8.0の5分の1容量によって中性化した。ファージは上述した通り、コロニー計測のためにトランスフェクトした。
III.多価ファージクローンのスクリーニング(IGF-ブロッキングファージアッセイ)
ペプチド-ファージクローンは、大腸菌細胞とファージプールとを混合すること、及び抗生物質含有培地上で平板培養することによって分離した。クローンを分離し、配列決定のために単鎖DNAを得るためにヘルパーファージ(上記の通り)と培養した。結合IGFBP-3、IGFBP-1、又はIGF-I用に選択したペプチド配列は、ファージミドクローンのDNA配列から推定した。そのようなクローンの数は、それぞれ表III−V中のペプチド配列により表示される。(以下の表中、「SEQ ID NO:」=「配列番号:」)
そのようなペプチドファージクローンは、ブロックリガンド(IGFBPへのIGF-I)結合をするかしないかのいずれかの、又は選択したプールの多数の非結合又は背景要員のいずれかの特異な標的-結合ペプチドを表示できた。これらの可能性の中から識別するため、ファージクローンは、IGF-Iの存在又は不在においてIGFBP-1又はIGFBP-3に結合する能力を試験した。
IGFBP-1又はIGFBP-3は、上記の通りMAXISORPTM板上に直接被覆した。クローンの培養からのファージは、IGF-I(100nMの最終濃度)で混合し、そして固定化IGFBPと室温で1時間インキュベートした。そして、上記の通りその板を十回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼのヤギ抗ウサギ結合体と混合したウサギ抗ファージ抗体の溶液を加えた。室温で一時間のインキュベートの後、その板は、色素の基質、o-フェニレンジアミン(Sigma)によって現像した。その反応は2.5M H2SO4の1/2容量で停止した。490nmでの吸光度を分光プレートリーダー上で測定した。
いくつかのIGFBP-3選択したペプチド-ファージクローンで示された滴定値は、いくつかのファージ濃度でIGFBP-3への結合のためIGF-Iにより全てが抑制された(図26と27)。これらペプチドはかくして、IGFBP-3上のIGF結合エピトープを持つオーバーラッピングサイトを占有するように思われた。IGFBP-1選択したペプチド-ファージクローンの滴定値は、それがいくつかのファージ濃度でIGFBP-1への結合のためIGF-Iにより抑制されたことを示した(図28)。補足のペプチド-ファージクローンは、IGF-Iと共に又はそれなしで、ファージの低い濃度で、同じくスクリーンされた。
図29は、上述した通り、HCl溶離の1ラウンドに続いて、DTT溶離の3ラウンドから得られたいくつかのファージミドクローンのブロッキングアッセイの結果を示す。各ケースにおいて、ファージミドクローンは5mlの培養容量において37℃で一晩、単一のクローンから培養した。そのファージ粒子は、沈殿させ、PBS緩衝液の0.5ml中で再懸濁した。各ファージ溶液の50倍希釈液を、PBS/TWEENTM緩衝液で作製し、該ファージをIGFBP-3被覆したMAXISORPTM板上で100nM IGF-Iとともにまたはそれなしでインキュベートした。図29中に示した通り、大部分のクローンは、たとえクローン4D3.11がこれら条件下でわずか5%抑制したとしても、これらのファージ濃度でIGFBP-3への結合を、>40%抑制した。
図30は上述した通りHCl溶離の3ラウンドから得たいくつかのファージミドクローンのブロッキングアッセイの結果を示す。各ケースにおいて、ファージミドクローンは、5mlの培養容量で37℃で一晩、単一コロニーから培養した。ファージ粒子は上記の通り調製した。このケースにおいて、図30中に示した通り、たとえクローン23A3.3と23A3.5がこれら条件下で約20%抑制したとしても、大部分のクローンは、これらのファージ濃度でIGFBP-3への結合を>80%抑制した。
ファージ希釈の機能として(図26,28)、又はディスプレーしたペプチドの機能として(図29-30)、IGF-Iの一定濃度によってファージ結合が阻止される度合いにおける変化は、いずれか一つの理論に制限されることなしに、それが(1)IGF-IとIGFBP-3上のペプチド結合エピトープの間のオーバーラップの度合、及び/又は(2)IGF-I対IGFBP-3に結合するためのファージディスプレーペプチドの相対アフィニティーを予測し得るために、興味深い。ここで試験した全てのペプチド-ファージクローンがIGF-Iとの抑制の幾らかの度合を示したことから、エリア内にあるそれぞれのIGFBP-3上のペプチド-結合のためのエピトープが結合したIGF-Iによって占有されたと思われる。ペプチドアッセイ(以下を参照)はこの結論を裏付ける(即ち、ケース1)。一方、いずれか1つの理論に制限されることなしに、幾つかのペプチドエピトープは、そのようなペプチドをディスプレーしているファージ粒子が結合したIGF-Iによって立体的に排除されるためにエリアの中とすることができた可能性がある。
ファージ濃度の抑制の依存、及びファージクローンの中の違い(図26)は、ケース2を反映し得る。特に、IGFBP-3被覆した板に結合しているファージクローンは、IGFBP-3被覆した板への結合が高い及び低いファージ濃度での両方で(例えば、ペプチドBP3-23及びBP3-24にそれぞれ一致する4C3.2、4D3.5)抑制したそれらファージクローンが成すよりもIGFBP-3により、より高いアフィニティーペプチド(以下を参照)を生産することが明らかな低いファージ濃度でのみ(例えばペプチドBP3-01-ox及びBP3-02-oxにそれぞれ一致する4D3.3、4B3.4)抑制した。
かくして、ファージ-滴定ブロッキングアッセイのこのタイプは、相対アフィニティー及びファージディスプレーライブラリーから得たペプチドの抑制効力を予期するための手段として、全般的に有用とされ得る。
IV.IGFBP-3結合ペプチドの一価(g3)ディスプレー
ランダム変異誘発、選択、及び増殖の連続したラウンドによってペプチド又はタンパク質配列のアフィニティー成熟は、ディスプレイしたペプチド又はタンパク質のコピー数が制限される場合、能率的に達成され得る。Bassら,Proteins 8: 309(1990)。そのようなアフィニティー成熟プロセスは、hGHのアフィニティー成熟により示される。米国特許第5,534,617号。このケースにおいて、ディスプレーしたhGHのコピー数は、hGHの発現レベルを制限している、且つファージミド包装と増殖のための野生型g3pを与えるためのヘルパーファージを用いている、バクテリオファージ粒子のg8にではなくg3に、ディスプレーしたタンパク質を有効することにより制限された。g8p上のファージディスプレー化ペプチドのプールからより高いアフィニティーのペプチドの選択のために、2ラウンド4g8ライブラリープール、4Bと4DからのペプチドcDNAsは、一価ファージディスプレーのためのg3ベクターに転移させた。結合選択は、結合ファージの酸溶離によって上述した通り、3つのラウンドで実行した。
選択の3ラウンドの後に得られたペプチド配列は表VI中に示される。2つのクローン、4B3.3と4D3.11は、選択したプール、及び初期に見られた、g8ファージ選択を支配した。第3のクローン3Ai.2は、g8と同一でない新規なペプチド配列を表す。ファージ-ELISA競合アッセイにおいて、g3-4B3.3とg3-4D3.11クローンの外形上のアフィニティーは<100nMであり、しかしながら一致するペプチドはより弱い抑制を示した(以下参照)。
アフィニティー改善が、hGHのために記載した通り、反復の変異誘発、選択及びペプチド-ファージライブラリーの増殖によって得ることができると予想される。例えば米国特許第5,534,617号を参照。
V.ペプチドアッセイ
ペプチドは、多数のファージ-誘導した配列に一致させて合成した。2つのCys残基がそのペプチド配列中に見出されたケースにおいて、そのペプチドのジスルフィド(酸化した又は“ox”を付した)モノマー形を調製し且つ精製した。4つのCys残基が見出されたケースにおいて、その{1-4,2-3}ジスルフィド形を調製及び精製した。
IGFBP-1又はIGFBP-3を結合する又はIGF-I結合を阻止することのこれらペプチドの能力は、以下のアッセイの1又はそれ以上で試験した。
A.BIAcoreTM競合アッセイ(IGFBP-3バインダー用)
IGF-Iは、遊離結合タンパク質を測定するために、BIAcoreTM2000表面プラスモン共鳴装置(BIAcore社,Piscataway, NJ)を用いて抑制アッセイ用デキストランチップ上に固定化した。IGF-Iは上述した通りビオチン化し、更に固定化したIGF-Iの400から800 RU(応答単位)を与えるように結合されている(BIAcore社)ストレプタビジンにチップを越えて注入した。そのIGF-Iは、それぞれの時間経過にわたり検出可能な解離を示さなかった。ペプチドの連続希釈は、IGFBP-3の一定濃度(40nM)と混合した。室温で≧1時間インキュベーションの後、20μLのアリコートを、IGF-Iチップを越えて20μL/分の流速で注入した。注入に続いて、応答の読み取りを、IGF-Iに結合したIGFBP-3の相対量を測定することで実行した。
その結果(図31-32)は、チップへのIGFBP-3結合の各ペプチドの抑制についての投薬量-応答曲線を示す。特に、試験したIGFBP-3結合の最も有効なインヒビターは、ペプチドBP3-01-ox(ファージクローン4D3.3に一致)であり、且つこのペプチドの端を切り取った形態、BP15であった(表VII参照)。その表において、ジスルフィド結合は、それぞれの2-Cys含有ペプチドの2つのCys残基の間に形成される。4つのシステインを含有しているペプチドのために、2つのCys*残基はジスルフィドを形成し、且つ残りの2つは第2のジスルフィドを形成する。これらペプチドは、それぞれ2μMと0.75μMのIC50’sを示した。BP3-4D3.11のような他のペプチド(g8ディスプレーからのファージクローン4D3.11とg3ディスプレーからの3Bi.1)は、<10μMのIC50’sを持つ抑制を示した。
IGFBP-1は、この手法において固定化したIGF-Iに対する結合を示していない。
B.平板培養アッセイ
1.ビオチン-BPアッセイ(IGFBP-1バインダー用)
IGFBP-1結合の抑制のため、IGFBP-1を上述した通りビオチン化した。MAXISORPTM板を、2μg/mL IGF-Iを用いて上述した通り被覆し、且つブロック化した。分離板において、ペプチドの連続希釈をビオチン化IGFBP-1の一定濃度(20nM)と予備混合した。20分後、室温で、その混合物をIGF-I板に加えた。次いでそのペプチド/IGFBP混合物を取り出し、0.05% TWEEN-20TM界面活性剤を含むPBS緩衝液で十回洗浄した。結合したビオチン-IGFBP-1は、ストレプタビジン-結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ、及び色素の基質を用いて検出した。
IGFBP-1抑制アッセイの結果(図33と34)は、ペプチドbp1-01とbp1-02(表VIII)が、それぞれ約0.18と0.05μMのIC50’によりIGFBP-1結合を抑制したことを示す。一方、IGFBP-3選択体BP3-01-oxは、IGFBP-1結合の僅かな又は抑制のないことを示した。反対に、bp1-01とbp1-02は、このアッセイにおいてビオチン化IGFBP-3を抑制しないことを示した。Cys残基がセリンに変化したbp1-01変異体は、10μMよりも大きなIC50を示した。
2.放射能標識IGFアッセイ(IGFBP-3バインダー用)
ペプチド活性の補足のアッセイとして、幾つかのペプチドを、実施例1(アッセイ3)中に記載した通り、IGFBP-1結合の抑制を測定するために125-I標識IGF-Iを用いるアッセイにおいて試験した。ペプチドの連続希釈液は、IGFBP-1又はIGFBP-3板に加えた。その後、125-I標識IGF-Iを加え、その板を2時間インキュベートした。次いで、その板を洗浄し、結合したIGF-Iの量を測定するため計測した。
図35は、IGFBP-3板へのIGF-I結合において、二つのIGFBP-3選択ペプチド、bp3-01-oxとbp3-02-oxの抑制を示す。反対に、これらのペプチドはIGFBP-1被覆した板へのIGF-I結合を抑制しない(図36)。
C.インビトロ活性化(KIRA)
IGF-I結合を阻止すること及び機能性IGF-Iを放出することの幾つかの合成ペプチドの能力は、実施例1に記載した通り、IGF-I活性のKIRAアッセイにおいて試験した。細胞は、IGF-I単独、ペプチド単独、ペプチドプラスIGF-I、IGF-Iプラス結合タンパク質(IGFBP-1又はIGFBP-3)、又はIGF-Iプラス結合タンパク質(IGFBP-1又はIGFBP-3)とペプチドにより試験した。
その結果(図37)は、ペプチド単独は活性を有さないことを示す。更に、IGF-Iと混合した場合、そのペプチドはIGF-I活性を顕著に変えない。ペプチドBP-01-oxもまた、IGF-IプラスIGFBP-1又はIGFBP-3と混合した場合にIGF-I活性に付いて顕著な作用は示さない。しかしながら、ペプチドbp1-01とbp1-02の両者は、それぞれ397nMと187nMのIC50’sによって、IGFBP-1によるIGF-I活性の抑制を阻止することを現した。これらペプチドはIGF-IとIGFBP-3による活性は何れも示さない。
加えて、IGFBP-3ペプチドBP15は、KIRAアッセイの活性化をもたらすIGFBP-3:IGF-I(3:1比で)とインキュベートし、IGFBP-3の阻止はBP15用の95μMのIC50と共に生じた。それは、これが1:1比によって30μMまで低下するであろうと確信される。
D.BIAcoreTM競合アッセイ(IGFBP-3バインダー用)
IGF-IIは、遊離結合タンパク質を測定するためにBIAcoreTM2000表面プラスモン共鳴装置(BIAcore社,Piscataway, NJ)を用いる抑制アッセイ用のデキストランチップ上に固定した。IGF-IIは、上述した通りビオチン化し、更に固定化したIGF-IIのほぼ1500 RUを与えるよう結合されているストレプタビジン(BIAcore社)をチップを越えて注入した。そのIGF-IIは、各実験の時間経過にわたり検出可能な解離を示さなかった。ペプチドの連続希釈液は、IGFBP-3の一定濃度(20nM)と混合した。室温で≧一時間のインキュベーションの後、20μlのアリコートを、IGF-IIチップを越えて20μl/分の割合で注入した。その注入に続き、応答の読み取りを、IGF-IIに結合したIGFBP-3の相対量を測定することによって行った。
その結果(例えば、図38を参照)は、IGF-IIへのIGFBP-3結合の各ペプチドの抑制のために投薬量応答曲線を示す。ペプチドbp3-01-ox, BP14, BP15, 及びBP17は、それぞれ0.92μM、1.0μM、0.78μM、及び5.1μMのIC50’sを示した。
実施例8
ペプチドbp1-01のNMRスペクトル
1H MRデータは、6.7ミリモルの濃度で、30℃及びpH5.2でH2O溶液中のペプチドbp1-01について採集した。図39の一次元NMRスペクトルの生成のために、全量5.0mgの生成したペプチドを、スペクトロメーターのフィールド周波数ロック用の7%(v/v)2H2Oを含む440μl H2Oに溶解したそのサンプルのpHは、1N NaOHの3μlの添加によって5.2に調整した。32トランジエントからなるスペクトルが、5-mm三重軸パルス化-フィールド勾配プローブを装備したBRUKER AMX-500TMスペクトロメーター(500.13MHzの1H周波数)で採集された。化学シフトスケールは、4.75p.p.m.での水共鳴に関して百万分の一部である。水共鳴は、励起スカルプティング法によって抑制した。HwangとShaka, J. Magn. Reson., 112A: 275-279(1995)。
図39の一次元スペクトルに加えて、二次元二重量子濾過相関分光法(2QF-COSY)、トータル相関スペクトル(TOCSY)、及び回転フレームOverhauser効果スペクトル(ROESY)を採集した。その実験は、パルス化フィールド勾配を2QF-COSYにおいてコヒーレンス選択用に用いたこと(van Zijlら,J. Magn. Reson., 113A: 265-270(1995))、及び励起スカルプレィングをTOCSY及びROECY実験において水共鳴を抑制するために(HwangとShaka, supra)用いたことを除いて、“Protein NMR Specroscopy, Principles and Practice”(Academic Press, San Diego: ISBN 0-12-164490, 1995)中、Cavanaghらによって記載された通り記録した。2H2O中のペプチドの凍結乾燥と溶解の後、35℃パルス混合(Cavanaghら,supra)によって2-D ROESYスペクトル(Cavanaghら,supra)とCOSYスペクトルを得た。完全1H共鳴割当ては、標準的な方法によりこれらデータから得られた。“NMR of proteins and nucleic acids”中、Wuethrich(John Wiley & Sons, New York: ISBN0-471-82893-9, 1986)。
bp1-01のための定義の明確な三次元構造の証拠は、以下のものから得られた:1)一次元スペクトルにおける共鳴位置(図39)が、非構造ペプチドにおいて置きしたそれとは顕著に相違した。例えば、アミドプロトンは8.73-6.64p.p.m.の範囲に及び(構造未定ペプチドは8.50-8.00p.p.m.の範囲内である);そのメチル基は、次の非構造分子(0.90-0.85p.p.m.)のため低い化学シフトにある(Leu6の0.82p.p.m.、及びLeu9の0.66,0.59p.p.m.)。2)アミドとアルファプロトン間のスカラーカップリング定数(2QF-COSYから得た)は、非構造ペプチドにおいて観測した平均化した値とは異なった。Gln7、Trp8、Cys10、Glu11とPhe14についての5.5Hzより低いその値は、これら残基のヘリックススパンニングの表れである。Leu6、Tyr13、及びPhe14で観測された8.0Hzより大きなその値は、これらの領域において拡張した構造の表れである。スカラーカップリング定数は、COSY-35スペクトル中のアルファとベータプロトン間でも測定された。これらのデータは、Cys1、Gln7、Trp8、Cys10、Tyr13、及びPhe14の側鎖がchi-1角に固定していること、即ち、これらの側鎖が非構造ペプチドに集合されるchi-1回転異性体の範囲の見本を示さないことを示す。3)ROESYスペクトル中のピークは、最初の配列中に近接していない残基間に多くプロトン-プロトン接触(<5Å)のあることを示す。これらは、もしそのペプチドが良く定義された構造の中に折重されるならば、それのみで生じることができる。最初の配列中の位置iとi+3での残基間の接触は、この領域中のヘリックスの存在と一致する、Leu6とTyr13間で優勢である。多数の接触が、そのヘリックスの一面に沿うミニ-疎水性コアの存在を示す、三つの芳香族側鎖(Trp8、Tyr13、及びPhe14)と、ロイシンメチル基(Leu6とLeu9)との間で観測される。
そのNMRデータは、bp1-01構造の三次元モデルを決定するために使用され得た。二面角抑制は、適切なKarplus相関関係を経てアミド-アルファとアルファ-ベータスカラーカップリング定数から得られた。Karplus, J. Phys. Chem., 30: 11-15(1959)。ディスタンス抑制は、ROESYスペクトルにおいて通過-空間相互作用を表したプロトンの間に誘導した;上の界のサイズ、及び上の界への修正は、ピークの重複又は共鳴の縮重が、Skeltonら,Biochemistry, 33: 13581-92(1994)によって記載された通りであることが原因である。これらの抑制は、AMBER全原子力場を用いてプログラムDiscover(MSI, San Diego)によって抑制した分子運動により連続的に精製した、プログラムDGII(Havel, Prog. Biophys. Mol. Biol., 56: 43-78(1991))を用いて構造のファミリーを産生するために用いた。Weinerら,J. Comput. Chem., 7: 230-252(1986)。その得られた構造は、単一グローバル折重に集中した(N, C-アルファ、及び残基4-14のカルボニル炭素の0.37Åの平均構造からの平均二乗根偏差の平均)。最良の25構造(入力抑制の最小の妨害)は非常に良好な入力データに一致し(0.1Åより大きい間隔抑制妨害が無く、更に1.4度より大きい二面角角度妨害のない)、且つプログラムPROCHECKTMによる判定としての幾何図形的配列を良好に共有していた。Laskowskiら,J. Appl. Cryst., 26: 283-291(1993)。
総体の典型的なメンバーは、図40Aと40B中に示した。PROCHECKTMの中のKabschとSander二次構造アルゴリズムに従って、bp1-01はPro5-Leu6(I型)とGln7からLys12間でのアルファヘリックスを中心においた逆ターンを含む;Leu6とTyr13は、主ヘリックスの延長である。残基Cys1、Arg2、Ala3、及びGly15は、NMRによって良好に表されず、残基Gly4からPhe14よりも溶液中でよりフレキシブルとされ得る。図40Aと40Bは、Trp8、Tyr13、及びPhe13の芳香族環が、そのペプチドの一方の面上に、相対的にフラットな疎水性の面を形成するように、Leu6、Leu9、及びLys12の脂肪族部分にパックされる。このパッキングは、そのヘリックスの周期性(Leu6、Leu9、及びTyr13を一緒に持っている)、Trp8のchi-1角(+60度の該chi-1、このアミノ酸に相対的に独特の、Leu9上にパックすることをTrp8に与える)、及びPhe14のペプチドバックボーンの拡張した本質(Leu9への折り返しのためのPhe14の側鎖を与える)によって達成される。
たとえbp1-01が何れかの条件下で自己会合の傾向があるとしても、その三次元構造は、そのような分子間相互作用により安定化されない。ヘリックスの中への疎水性パッキングは、その折重の安定性を疑いなく付与する。Cys1とCys10間のジスルフィド結合はまた、構造と機能のためにも重要である。システイン残基の両方がセリンによって置換されるペプチドは、IGFBP-1へのより減じられたアフィニティーを有し(実施例7を参照)、且つbp1-01によってディスプレーした構造がその機能付与のために重要であることを示唆する、1-又は2-次元NMRスペクトルにおけるヘリカルの又は他の安定な構造の証拠を提示するものでない。何れか一つの理論に制限されること無しに、一つの可能性は、逆ターン(Pro5-Leu6)及びジスルフィド結合が、ヘリックス(Glu11-Phe14)の第二のターン中に残基を含んでいる疎水性側鎖-側鎖接触によって普及される、ヘリックスの第1のターン(Gln7-Cys10)を開始することを助けることである。
図40中に示したbp1-01の構造は、IGFBP-1に結合することができ、それによって活性IGF-Iのレベルを増すペプチドにおけるその手法のための幾つかの可能性を示唆する。1)bp1-01モノマー中のLeu6、Leu9、Trp8、Tyr13、及びPhe14の側鎖により形成したフラットな疎水性表面は、IGFBP-1の露出した疎水性領域上にパックし得る;このケースにおいて、ヘリックスはIGFBP-1によって認識された鍵となる構造特徴である2)BP-1は、該ヘリックスの疎水性表面以外の幾つかの部分、例えば該ヘリックスに先行する5つのN末端残基、又はこれらの残基と、疎水性側鎖から離れたヘリックスの面との組合せ、を認識し得る。このケースにおいて、該ヘリックスは、該ペプチドのどこか他の場所でIGFBP-1-結合のために適切な幾何図形的配置を組み立てるための骨格として、一層重要となされ得る。3)bp1-01は、凝集した形態においてIGFBP-1に結合し得る。ヘリックスの疎水性面(Leu6、Trp8、Leu9、Tyr13、及びPhe14)を経てbp1-01の自己-会合の可能性を与えた、該ペプチドの幾つかの他の領域は、IGFBP-1接触において含まれるであろう。このケースにおいて、そのヘリックスと、それらの間の接触は、IGFBP-1-結合領域を提供するための骨格として作用するであろう。
下記は、図39中に示される典型的な構造のための座標である(標準的なタンパク質データベースフォーマット)。
寸評 BP1-01 IGF-I-結合タンパク質結合ペプチド
寸評 NMR-誘導した抑制によって計算した総体
寸評 からの典型的な構造
実施例9
(Leu24,Ala31)hIGF-1を用いるIGFBPsからのIGF-Iの移動
この実施例は、上記動物実験において使用したIGF変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1が、ヒト血清中に存在するIGFBPsからIGF-Iトレーサーを移動できることを示す。
該IGF-I変異体がヒト血清中に存在する内因性IGFBPsからIGF-Iを移動できるであろうことを測定するために、以下の実験を実行した。放射能標識したrhIGF(125I-IGF-I)は、125I-IGF-I:IGFBP複合体の形成を許すために、4℃で16時間、33ng/mlの濃度で通常のヒト血清サンプルとインキュベートした。複合体形成に続き、IGF変異体(Leu24,Ala31)hIGF-1(40μg/ml)を、0, 0.5, 3, 又は16時間でそのインキュベーションに加えた。そのサンプル(n=3)は、次いで125I-IGF-I:IGFBP複合体の相対的なサイズと量を測定するために、FPLCサイズ-排除クロマトグラフィー(FPLC-SEC)によって分析した。
図41は、通常のヒトからの血清中に存在する内因性IGFBPsから125I-IGF-Iを移動するためのIGF変異体の能力を示すクロマトグラムである。データはフラクション毎のcpm(n=1)として表した。この実験は三回繰り返し、定量化し、そして表IX中に提示した。
125I-IGF-Iと通常のヒト血清との16時間のインキュベーションの後、放射能の3つのピークがFPLC-SECに続いて観測された(図42)。これらのピークは次の125I-IGF-I複合体と一致するように思われる:〜150kDa(125I-IGF-I:IGFBP-3:ALS);〜44kDa(125I-IGF-I:IGFBPs 1-4);〜7kDa(遊離125I-IGF-I)。図42中に見ることができる通り、該血清へのIGF変異体の添加は、125I-IGF-I:IGFBP複合体に結合した125I-IGF-Iの減少と遊離125I-IGF-Iの量の増加の結果を生じた。これらの結果は、上記の表において概要される。その125I-IGF-Iは、〜150kDa 125I-IGF-I:IGFBP複合体よりも〜44kDaから、より容易にディスプレーされ、低分子量IGFBPsに結合したIGF-Iがより生物学的に利用可能な形態であることを示唆する。これらのデータは、IGF変異体が通常のヒト血清中に存在する内因性IGFBPsからIGF-Iをディスプレーする能力を有することを明確に示し、従ってヒトにおいてインビボで活性化とされるものと思われる。
結論において、この証拠は、ラットにおいて示されているヒトにおいて活性を示す変異体の特質の分子を予期するであろう。
実施例10
BP15を用いるIGFBPsからのIGF-Iの移動
この実施例は、ヒト血清中の125I-IGF-Iの結合を阻止するそれの能力について、IGFBP-3-特異的ペプチド、BP15を試験する。ヒト血清は、125I-IGF-I±そのペプチドと共にインキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィーを通してIGFBPsに結合したトレーサーの量を測定した。ペプチドの添加は、150-KD IGF/IGFBP-3/ALS複合体と結合した125I-IGF-Iのほぼ42%の減少及び遊離125I-IGF-Iの量の59%増加の結果を生じた。そのペプチドは44-KD IGFBPsを減少せず(実際、それをわずかに増加した)、該ペプチドがIGFBP-3への結合のためにIGF-Iとのみ競合することを示している。
これらの結果は、その類似物が(0.2mMで)ヒト血清中でIGFBP-3への結合のためにIGF-Iと競合できることを示す。
実施例11
ヒトIGF-Iによるヒトの治療
この実施例は、内因性IGFsを移動するためのIGFBPs作用の1又はそれ以上に結合する化合物をどのように外因的に投与するか、及びヒトにおいて使用するためにIGFアゴニストをどのような投薬量とするかの原理を示す。
この実験において、ヒトII型糖尿病に、12週間、4つの投薬量(10, 20, 40又は80μg/kg)で一日二回の注射によって、組換えヒトIGF-I又はプラシーボを投与した。血液サンプルは、治療の前、2週間毎に、及び治療の12週後(EP)で採血した。IGF-I、IGF-II、及びIGFBP-3の濃度を、IGF-IIがIGF-Iの10μg/日で治療した患者から採取したサンプルにおいて測定していないことを除いて、全てのサンプルで測定した。
図43は、患者の血中IGF-Iの濃度を示す。予期されない知見は、IGF-Iの40と80μgの投与の「プラトー」効果であった;IGF-Iの同じ全血中濃度はこれら2つの投薬量で到達された。
図44は、患者の血中IGF-IIの濃度を示す。IGF-Iの上昇しているレベルに対し、IGF-IIのレベルはIGF-I濃度における上昇に対して大部分がマイナーなイメージパターンで落下した。上昇しているIGF-I濃度のプラトー化のように、落下しているIGF-II濃度もまたプラトーに達した。
図45は、患者の血中IGFBP-3濃度を示す。血中IGF-IとIGF-IIのパターンにおける明瞭な変化に対して、IGFBP-3の濃度は変化の統計学的に有意な又は明確なパターンは示さなかった。
図43と44の精査は、全IGF濃度(IGF-IプラスIGF-II)が治療に伴いほとんど変化無く示されたことを明らかにする。これは、IGF-IIの濃度の落下に密接に適合したIGF-Iの濃度における上昇のためであった。3つの図の全ての精査は、患者の血中IGF-IとIGF-IIの濃度における投薬量関連変化が、減少したIGFBP-3結合タンパク質容量に伴って起こるものではないことを示す(IGFBP-3は血中の主要な結合タンパク質である)。
IGF-IIの濃度における落下、及びIGF-IとIGF-II濃度のプラトー化のための以前の説明は、IGF結合タンパク質容量の限定された量があること、及びこの実験において使用したIGF-Iの投薬量は、結合タンパク質からIGF-IIの投薬量に関連した移動の原因となったことである。
それは、活性IGFのレベルを増すための能力を持ついずれかの分子がこの実施例においてIGF-Iで示されたそれらと類似した活性を示すであろうことを予期するこの実施例中の観測の論理的な拡張である。加えて、使用したIGF-Iの投薬量及び示されたIGFBPとIGF-I及びIGF-IIの濃度から、それは活性の内因性IGFのレベルを増加するためにどのようにIGFアゴニストを与えるべきかを計算するために簡単である。IGF-Iに関するモルサイズ、IGFBPのためのIGFアゴニストのアフィニティー、及びそれの生物学的利用能は、ヒトにおける活性IGFが増加したその投薬量に至ることを考慮して他の可変のものとされるであろう。
実施例12
bp1-01の構造/機能及びアフィニティー成熟
A.IGFBP-1へのbp1-01結合の運動
bp1-01ペプチド変異体の運動は、デキストランチップにEDC/NHS(作製により記載した通り)を経て共有結合したIGFBP-1を用いるBIAcoreTM(Biacore社,Piscataway, NJ)アッセイで検査した。ペプチドbp1-01(配列番号:15)は、あまりに急激なので測定できない解離運動を表示した。しかしながら、bp1-02、19-マー変異体(配列番号:16)は、測定可能な運動を表示した。その会合率定数は2.30x105M-1sec-1であり、解離率定数は5.03x102sec-1であった。その後者は、ほぼ28秒のIGFBP-1からペプチド解離の半減期を含む。その会合率定数は、該ペプチドがIGFBP-1への結合について顕著な構造変化を受けていないとの見解に一致する中度の速さである。
B.bp1-01ペプチドの変異誘発スキャンニング
合成ペプチド変異体の2つのシリーズがbp1-01ペプチドの側鎖がIGFBP-1結合に直接寄与し得たことを測定するために作製された。第1のシリーズにおいて、アラニン-スキャンニングアプローチ(CunninghamとWells, Science, 244: 1081-1085(1989))は、ベータ炭素に属する各側鎖部分を取り除くために使用した。IGFBP-1への該ペプチドの結合の遊離エネルギーに対するこれら原子の寄与は、IGFBP-3のために記載したそれに類似した(実施例7参照)、BIAcoreTM競合アッセイにおいてIGF-I又はIGF-IIへのIGFBP-1の結合を抑制するための該変異体の効果(IC50)を測定することによって評価した。その結果を表X中に示した。
作製したペプチドの第2のシリーズは、アルファ炭素で加えられたメチル基のような他の構造的特徴又はアイソマー(D-アラニン)であろうとなかろうとプローブのための非天然アミノ酸の使用がIGFBP-1へのペプチドの結合に影響を及ぼすことができた。これらのペプチドの有効性は、表XI中に示した結果とともに、ビオチン化IGFBP-1 ELISAアッセイによって測定した。これらの結果は、IGFBP-1へのbp1-01の結合において側鎖L6, L9, W8, 及びY13の重要性を確証する。構造寄与はまた、R2とA3での置換の効果によって示唆された。
一方、G4, Q7, E11, K12, 及びF14でのaib置換のような幾つかの置換は、結合アフィニティーについてわずかしか又は効果がない。これら置換体の1又はそれ以上を含むペプチドは、非天然アミノ酸が、蛋白分解に対して大きな抵抗性のペプチドをしばしば与えるために、それにも関わらず有用となり得る(Schumacherら,Science, 271: 1854(1996)とその中の参考文献を参照)。そのようなペプチドは、天然アミノ酸のみを有するそれよりもより長い血清中の半減期を達成し得る。
表XI中に示した結果に鑑みて、bp1-01の位置2, 3, 又は6で置換されたD-アラニンを持つ又は位置7, 8, 9, 11, 12, 13, 又は14でアルファ-アミノイソブチラート置換を持つペプチドは、インビトロでの細胞培養アッセイにおいてIGF-Iの利用能を増加するであろうことが予期される。
最後に、各種のC末端bp1-01変異体の相対アフィニティーは、表XII中に示した通り、ELISAによって測定された。これらのデータは、該ペプチドのC末端領域が結合のために重要であることを示す。ペプチドbp1-18(配列番号:104)のみは、IGF-I:IGFBP-1結合のための測定可能な抑制的活性を保有した。それは、このペプチドがインビトロでの細胞培養アッセイにおいてIGF-Iの利用能を増加するであろうことを予期させる。
一緒に採取した、その構造-機能データは、より小さな、非ペプチドを含む化合物が、側鎖L6, L9, W8, 及びY13との組み合わせにおけるこのペプチドのC末端の構成要素を含むことによる該bp1-01ペプチドの効果を真似るように設計され得る。
C.bp1-01第二次ライブラリーの多価(g8)選択
NNSコドンは、実施例7中に記載した通りの種々のペプチドライブラリーを作製するために用いた。アフィニティー選択は、親和力効果を最小化するために溶液においてビオチン化IGFBP-1(実施例7で記載した通り調製した)へのファージの溶液結合によって実行した。類似の計画は、Hawkinsら,J. Mol. Biol., 226: 889(1992)による抗体-ファージ選択のために使用した。選択の各ラウンドのために、標的の量は、増加したアフィニティー変異体用の選択で減じられた。典型的に、109-1010の精製したファージを、室温で一時間、MPBST(PBS中5%スキムミルク+0.05% TWEENTM20)によって予備ブロック化し、且つビオチン化標的への結合のため選択した。結合条件は以下の通り。標的に結合したファージは、室温で2-5分間、ストレプタビジン-マグネチックビーズ(Promega社,Madison, WI)と共にインキュベートすることによって捕捉した。結合の後、そのビーズは、0.1M HClによる溶離の前に、PBS-TWEENTM/MPBSTで十回洗浄した。その溶離液は、0.1Mトリス、pH8.0の1/3容量で直接中性化した。溶離したファージは、次の選択サイクル用のXL1に感染することによって増殖した。ラウンド1,2,3は、一時間のインキュベーションによって、それぞれ400nM、200nM、及び20nM標的によって実行した。ラウンド4は、4nM標的によって一晩実行した。全ての結合反応は、室温で実行した。
同定した変異体を表XIII中に示し、さらにELISAプレートアッセイ又はBIAcoreTMによる相対アフィニティーを表XIV中に示した。bp1-10(配列番号:105)、bp1-11(配列番号:106)、bp1-12(配列番号:107)、bp1-13(配列番号:108)、bp1-15(配列番号:110)、bp68(配列番号:112)、bp1027(配列番号:113)、bp1028(配列番号:114)、bp1029(配列番号:115)、及びbp1030(配列番号:116)は、bp1-02とbp1-01に匹敵する又はより高いアフィニティーであり、インビトロ細胞培養アッセイにおいてIGF-Iの利用能を増加することが予期される。
D.bp1-01第二次ライブラリーの1価(g3)選択
bp1-01第二次ライブラリーの1価(g3)選択は、上記のパートC中に記載した通り必須に実行した。テンプレートは、無作為化のために標的化したサイトでのTAA停止コドン又はbp1-01からの完全に関係のない結合配列のいずれかを含む。選択条件は、ブロッキング緩衝液中のBSA置換ミルクと共に以下に記載した通りとした。ファージ標的複合体は、マグネチックストレプタビジンビーズ(Promega社,Madison, WI)により捕捉した。ビオチン化標的は、ラウンド1中で200-500nMから、ラウンド2での50-100nM、ラウンド3での10-50nM、及びラウンド4での1-20nMまでに減じられた標的濃度と共に、各ラウンドにおいて室温で1-3時間ファージと予備インキュベートした。
同定した変異体を表XVに示し、及び選択した幾つかのペプチドのBIAcoreTM競合アッセイによって又はELISAプレートアッセイ(5%アセトニトリルをペプチドの可溶化のために使用したことを除いて、上記の通り実行した)によって測定した相対アフィニティーを表XVI中に示した。bp1-01の13-残基変形体、bp1-16(配列番号:117)は、BP1-01のそれに類似したアフィニティーを有した。N末端又はC末端での置換は、アフィニティー改善を生じた。例えば、bp1-16と比べて、C末端でのSTY配列の添加は、ペプチドbp1-21B(配列番号:121)でのアフィニティーの約3倍の改善を生じた。類似の効果は18-マーの前後において見られた:即ち、3倍の改善がbp1-14(配列番号:109)とbp1-21A(配列番号:120)との間で観測された。N末端SからGモチーフの置換もまた、ペプチドbp1-19(配列番号:118)とbp1-20(配列番号:119)において2倍から3倍アフィニティーが改善された。これらペプチドの全ては、bp1-01とbp1-02との比較として、IGFBP-1のための類似の又は改善された外見上のアフィニティーを有し、且つインビボでの細胞培養アッセイにおけるIGF-Iの利用能を増加させることが予期される。
実施例13
IGFBP-3結合ペプチド変異体の相対アフィニティー
各種のbp3-01-ox変異体の相対アフィニティーは、BIAcoreTM競合アッセイによって測定した。その結果は表XVII中に示した。4d3.3(配列番号:122)、bp3-30(配列番号:123)、bp3-41(配列番号:124)、bp3-40(配列番号:125)、bp3-39(配列番号:126)、bp3-28(配列番号:128)、bp3-27(配列番号:129)、及びbp3-25(配列番号:130)は、bp3-01-oxのそれと類似した又はそれよりもより大きなアフィニティーを有することを見ることができ、そしてインビトロでの細胞培養アッセイにおいてIGF-Iの利用能を増加することが予期される。ペプチドbp3-24(配列番号:131)の測定可能な活性の欠如は、完全なジスルフィドが、ペプチドのこのシリーズのIGFBP-3への結合のために有利なペプチド構造を維持することにおいて演じる重大な役割を示す。
実施例14
IGFBP-3への結合のための補足ライブラリーのスクリーニング
補足の多価(g8)ペプチド-ファージライブラリーは、IGF-IへのIGFBP-3結合を抑制した2つのペプチドを生産したそれに設計及び挿入した。その結果は、表XVIIIに示した通り、bp3-107(配列番号:132)とbp3-108(配列番号:133)がインヒビターであること及びそれがインビトロでの細胞培養アッセイにおいてIGF-Iの利用能を増加することが予期される。
本発明は必要に応じて、ある種の特有の方法と材料に関してここに言及している。本発明の目的を達成するために適切な代替の材料と方法のいずれか又は全てに拡張され、本発明の範囲に関するいずれかの制限を構成するためではないこれら特有の方法と材料の言及であると解される。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:ジェネンテック、インコーポレーテッド
(ii)発明の名称:インスリン様成長因子アゴニスト分子
(iii)配列の数:109
(iv)住所
(A)住所:ジェネンテック、インコーポレーテッド
(B)ストリート:1 ディー・エヌ・エー ウェイ
(C)市:サウス サン フランシスコ
(D)州:カリフォルニア
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:94080
(v)コンピューター読解可能形式:
(A)媒体形式:3.5インチ、1.44Mbフロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC コンパーチブル
(C)オペレーティングシステム: PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:WinPatin(ジェネンテック)
(vi)現出願データ:
(A)出願番号:PCT/US98/06514
(B)出願日:1998年3月31日
(C)分類:
(vii)基礎出願データ:
(A)出願番号:08/825852
(B)出願日:1997年4月4日
(viii)代理人情報:
(A)名称:ハザック・ジャネット・イー
(B)登録番号:28,616
(C)参考/整理番号:P1071P1PCT
(ix)テレコミュニケーション情報:
(A)電話:650/225−1896
(B)テレファックス:650/952−9881
(2)配列番号:1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:1:
(2)配列番号:2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:2:
(2)配列番号:3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:3:
(2)配列番号:4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:4:
(2)配列番号:5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:5:
(2)配列番号:6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:15アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:6:
(2)配列番号:7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:7:
(2)配列番号:8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:8:
(2)配列番号:9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:9:
(2)配列番号:10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:15アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:10:
(2)配列番号:11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:15アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:11:
(2)配列番号:12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:12アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:12:
(2)配列番号:13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:13:
(2)配列番号:14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:14:
(2)配列番号:15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:15アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:15:
(2)配列番号:16の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:16:
(2)配列番号:17の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:400塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:17:
(2)配列番号:18の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:95アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:18:
(2)配列番号:19の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:5115塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:19:
(2)配列番号:20の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:5140塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:20:
(2)配列番号:21の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:77アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:21:
(2)配列番号:22の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:50塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:22:
(2)配列番号:23の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:58塩基対
(B)配列の型:核酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:23:
(2)配列番号:24の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:24:
(2)配列番号:25の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:25:
(2)配列番号:26の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:26:
(2)配列番号:27の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:27:
(2)配列番号:28の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:28:
(2)配列番号:29の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:29:
(2)配列番号:30の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:30:
(2)配列番号:31の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:31:
(2)配列番号:32の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:32:
(2)配列番号:33の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:33:
(2)配列番号:34の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:34:
(2)配列番号:35の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:10アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:35:
(2)配列番号:36の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:70塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:36:
(2)配列番号:37の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:91塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:37:
(2)配列番号:38の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:38:
(2)配列番号:39の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:39:
(2)配列番号:40の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:40:
(2)配列番号:41の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:41:
(2)配列番号:42の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:42:
(2)配列番号:43の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:43:
(2)配列番号:44の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:44:
(2)配列番号:45の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:45:
(2)配列番号:46の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:97塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:46:
(2)配列番号:47の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:47:
(2)配列番号:48の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:48:
(2)配列番号:49の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:49:
(2)配列番号:50の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:50:
(2)配列番号:51の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:51:
(2)配列番号:52の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:52:
(2)配列番号:53の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:53:
(2)配列番号:54の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:54:
(2)配列番号:55の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:55:
(2)配列番号:56の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:56:
(2)配列番号:57の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:57:
(2)配列番号:58の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:58:
(2)配列番号:59の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:59:
(2)配列番号:60の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:60:
(2)配列番号:61の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:61:
(2)配列番号:62の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:62:
(2)配列番号:63の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:63:
(2)配列番号:64の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:64:
(2)配列番号:65の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:65:
(2)配列番号:66の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:66:
(2)配列番号:67の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:67:
(2)配列番号:68の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:68:
(2)配列番号:69の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:69:
(2)配列番号:70の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:70:
(2)配列番号:71の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:71:
(2)配列番号:72の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:72:
(2)配列番号:73の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:73:
(2)配列番号:74の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:74:
(2)配列番号:75の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:75:
(2)配列番号:76の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:76:
(2)配列番号:77の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:77:
(2)配列番号:78の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:78:
(2)配列番号:79の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:79:
(2)配列番号:80の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:80:
(2)配列番号:81の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:11アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:81:
(2)配列番号:82の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:12アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:82:
(2)配列番号:83の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:83:
(2)配列番号:84の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:84:
(2)配列番号:85の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:85:
(2)配列番号:86の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:86:
(2)配列番号:87の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:87:
(2)配列番号:88の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:88:
(2)配列番号:89の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:89:
(2)配列番号:90の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:90:
(2)配列番号:91の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:91:
(2)配列番号:92の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:92:
(2)配列番号:93の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:93:
(2)配列番号:94の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:94:
(2)配列番号:95の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:95:
(2)配列番号:96の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:96:
(2)配列番号:97の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:97:
(2)配列番号:98の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:98:
(2)配列番号:99の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:99:
(2)配列番号:100の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:17アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:100:
(2)配列番号:101の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:101:
(2)配列番号:102の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:16アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:102:
(2)配列番号:103の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:15アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:103:
(2)配列番号:104の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:14アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:104:
(2)配列番号:105の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:13アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:105:
(2)配列番号:106の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:11アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:106:
(2)配列番号:107の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:10アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:107:
(2)配列番号:108の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:12アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:108:
(2)配列番号:109の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:11アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の詳細:配列番号:109:
Claims (16)
- 配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、及び配列番号:16からなる群から選択したアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号:4、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、及び配列番号:16からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる請求項1記載のペプチド。
- 配列番号:4、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:15、又は配列番号:16であるアミノ酸配列からなる請求項1記載のペプチド。
- 配列番号:9、配列番号:10、配列番号:15、又は配列番号:16であるアミノ酸配列からなる請求項1記載のペプチド。
- 配列番号:10、配列番号:15、又は配列番号:16であるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号:104であるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号:105、配列番号:106、配列番号:107、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:113、配列番号:114、配列番号:115、又は配列番号:116であるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号:109、配列番号:117、配列番号:118、配列番号:119、配列番号:120、又は配列番号:121であるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号:122、配列番号:123、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:129、配列番号:130、配列番号:132、又は配列番号:133であるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 位置2,3,4,又は6でD-アラニン置換を、又は位置7,8,9,11,12,13,又は14でアルファ-アミノイソブチラート置換を有する配列番号:15のアミノ酸配列からなるペプチド。
- 位置2,3,又は6でD-アラニン置換を、又は位置7,8,9,11,12,13又は14でアルファ-アミノイソブチラート置換を有する請求項10記載のペプチド。
- 位置6でD-アラニン置換を、又は位置8,9,又は13でアルファ-アミノイソブチラート置換を有する請求項10記載のペプチド。
- YFGではなくAAである配列番号:15のC末端を有する請求項10記載のペプチド。
- YFGではなくAAである配列番号:15のC末端を有する請求項11記載のペプチド。
- YFGではなくAAである配列番号:15のC末端を有する請求項12記載のペプチド。
- 請求項1−15のいずれか1項記載のペプチドをコードしている核酸分子。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/825,852 | 1997-04-04 | ||
US08/825,852 US6121416A (en) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | Insulin-like growth factor agonist molecules |
PCT/US1998/006514 WO1998045427A2 (en) | 1997-04-04 | 1998-03-31 | Insulin-like growth factor agonist peptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002510194A JP2002510194A (ja) | 2002-04-02 |
JP4562814B2 true JP4562814B2 (ja) | 2010-10-13 |
Family
ID=25245064
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP54289498A Expired - Fee Related JP4562814B2 (ja) | 1997-04-04 | 1998-03-31 | インスリン様成長因子アゴニスト分子 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (16) | US6121416A (ja) |
EP (2) | EP1251137A3 (ja) |
JP (1) | JP4562814B2 (ja) |
AT (1) | ATE224951T1 (ja) |
AU (1) | AU732989B2 (ja) |
CA (1) | CA2286264A1 (ja) |
DE (1) | DE69808258T2 (ja) |
DK (1) | DK0972020T3 (ja) |
ES (1) | ES2183344T3 (ja) |
HK (1) | HK1047755A1 (ja) |
IL (1) | IL131925A0 (ja) |
PT (1) | PT972020E (ja) |
WO (1) | WO1998045427A2 (ja) |
Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6420518B1 (en) | 1997-04-04 | 2002-07-16 | Genetech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
US6403764B1 (en) | 1999-01-06 | 2002-06-11 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor-1 protein variants |
AU762047B2 (en) | 1999-01-06 | 2003-06-19 | Genentech Inc. | Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants |
US20030224017A1 (en) * | 2002-03-06 | 2003-12-04 | Samal Siba K. | Recombinant Newcastle disease viruses useful as vaccines or vaccine vectors |
DE60027042D1 (de) * | 1999-10-29 | 2006-05-18 | Univ Oregon Health Sciences | Modulation der neurokrinen differenzierung durch protein 25.1 |
WO2001072323A2 (en) | 2000-03-24 | 2001-10-04 | Genentech, Inc. | Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders |
WO2001087323A2 (en) * | 2000-05-16 | 2001-11-22 | Genentech, Inc. | Method for treating cartilage disorders |
FR2810675B1 (fr) * | 2000-06-22 | 2002-09-27 | Pf Medicament | Construction modifiee en aval du codon d'initiation pour la surexpression de proteines recombinantes |
EP1402266B1 (en) * | 2000-11-28 | 2011-01-12 | Premacure AB | Reducing RISK OF COMPLICATIONS OF PREMATURITY |
US7611711B2 (en) * | 2001-01-17 | 2009-11-03 | Vegenics Limited | VEGFR-3 inhibitor materials and methods |
JP4489352B2 (ja) | 2001-02-09 | 2010-06-23 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Igf−1の結晶化 |
US6555581B1 (en) | 2001-02-15 | 2003-04-29 | Jones Pharma, Inc. | Levothyroxine compositions and methods |
US6790672B2 (en) * | 2001-02-19 | 2004-09-14 | Board Of Regents The University Of Texas System | Encoded molecular sieve particle-based sensors |
WO2002072780A2 (en) | 2001-03-14 | 2002-09-19 | Genentech, Inc. | Igf antagonist peptides |
US6841386B2 (en) | 2001-04-10 | 2005-01-11 | Viacell, Inc. | Modulation of primary stem cell differentiation using an insulin-like growth factor binding protein |
CA2466701C (en) * | 2001-11-13 | 2013-11-12 | Loi Tran | Neuroprotective use of cyclic prolyl glycine |
US20100247483A1 (en) * | 2001-11-13 | 2010-09-30 | Tran Loi H | Therapeutic agent composition and method of use |
US7232798B2 (en) | 2001-11-13 | 2007-06-19 | Tran Loi H | Neuroprotection and neuroegenisis by administering cyclic prolyl glycine |
JP4563171B2 (ja) | 2002-05-24 | 2010-10-13 | シェーリング コーポレイション | 中和ヒト抗igfr抗体 |
JP2005534650A (ja) * | 2002-06-11 | 2005-11-17 | ザ バーナム インスティテュート | エリスロポイエチンおよびインスリン様増殖因子の神経保護的相乗作用 |
US7118877B2 (en) * | 2002-07-08 | 2006-10-10 | Wyeth | Caspase 9 activation and uses therefor |
EP1534314B1 (en) * | 2002-09-04 | 2014-10-22 | DSM IP Assets B.V. | A nutritional and therapeutic composition of an insulin sensitizer and a peptide fraction |
WO2004023647A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson | Composite power amplifier |
US20040121407A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-06-24 | Elixir Pharmaceuticals, Inc. | Regulation of the growth hormone/IGF-1 axis |
CA2496687A1 (en) * | 2002-09-18 | 2004-04-01 | Centre Hospitalier De L'universite De Montreal (Chum) | Ghrh analogues |
EP1560933A4 (en) * | 2002-11-14 | 2007-11-21 | Wyeth Corp | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING NEUROLOGICAL DISORDERS |
US7273788B2 (en) * | 2003-05-21 | 2007-09-25 | Micron Technology, Inc. | Ultra-thin semiconductors bonded on glass substrates |
ATE425463T1 (de) * | 2003-06-06 | 2009-03-15 | Genentech Inc | Modulation der wechselwirkung zwischen hgf-beta- kette und c-met |
US7920906B2 (en) | 2005-03-10 | 2011-04-05 | Dexcom, Inc. | System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration |
DK2274978T3 (en) | 2003-09-12 | 2015-06-15 | Ipsen Biopharmaceuticals Inc | Methods of treating an insulin-like growth factor-I (IGF-I) deficiency |
WO2005033132A2 (en) * | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Genentech, Inc. | Igf binding proteins |
US7326567B2 (en) | 2003-11-12 | 2008-02-05 | Schering Corporation | Plasmid system for multigene expression |
US9247900B2 (en) | 2004-07-13 | 2016-02-02 | Dexcom, Inc. | Analyte sensor |
AR046639A1 (es) | 2003-11-21 | 2005-12-14 | Schering Corp | Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti- igfr1 |
KR101195291B1 (ko) | 2003-12-11 | 2012-10-26 | 제넨테크, 인크. | C-met 이량체화 및 활성화를 억제하는 방법 및조성물 |
US7339031B2 (en) * | 2004-03-19 | 2008-03-04 | Merck Patent Gmbh | Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof |
US20070045902A1 (en) | 2004-07-13 | 2007-03-01 | Brauker James H | Analyte sensor |
US7713574B2 (en) | 2004-07-13 | 2010-05-11 | Dexcom, Inc. | Transcutaneous analyte sensor |
JP2008521907A (ja) | 2004-12-03 | 2008-06-26 | シェーリング コーポレイション | 抗igf1r治療について患者を予め選択するためのバイオマーカー |
US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
BRPI0608777A2 (pt) * | 2005-04-15 | 2010-01-26 | Schering Corp | métodos para tratamento ou prevenção de cáncer, bem como uso de inibidores de igf1r na preparação de composições farmacêuticas |
NZ564098A (en) * | 2005-06-15 | 2010-04-30 | Schering Corp | Anti-IGF1R antibody formulations |
JP5290148B2 (ja) | 2006-04-10 | 2013-09-18 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Disheveled(Dvl)PDZ修飾因子 |
WO2008130315A1 (en) | 2007-04-18 | 2008-10-30 | Premacure Ab | Method and product for treatment and/or prevention of complications of prematurity |
US20090054473A1 (en) | 2007-08-22 | 2009-02-26 | Gilead Colorado, Inc. | Therapy for complications of diabetes |
US8591455B2 (en) | 2008-02-21 | 2013-11-26 | Dexcom, Inc. | Systems and methods for customizing delivery of sensor data |
US8583204B2 (en) | 2008-03-28 | 2013-11-12 | Dexcom, Inc. | Polymer membranes for continuous analyte sensors |
US8682408B2 (en) | 2008-03-28 | 2014-03-25 | Dexcom, Inc. | Polymer membranes for continuous analyte sensors |
US11730407B2 (en) | 2008-03-28 | 2023-08-22 | Dexcom, Inc. | Polymer membranes for continuous analyte sensors |
US9238080B2 (en) | 2010-05-21 | 2016-01-19 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bi-specific fusion proteins |
AU2011317182A1 (en) | 2010-10-20 | 2013-04-11 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for modulating the Wnt pathway |
JP6134725B2 (ja) | 2011-10-14 | 2017-05-24 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Bace1のペプチド阻害剤 |
RU2014118491A (ru) | 2011-10-14 | 2015-11-20 | Дженентек, Инк. | Активаторы зимогенов |
WO2017059231A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. | Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair |
CN111432881A (zh) | 2017-09-11 | 2020-07-17 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 用于治疗慢性肺病的方法和组合物 |
BR112020023252A2 (pt) | 2018-05-15 | 2021-02-23 | Lloyd Hung Loi Tran | composição do agente terapêutico e método de uso para tratamento de deficiência cognitiva leve, depressão e distúrbios psicológicos. |
WO2021005604A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting igf-1 or igf-1 variants and methods of producing same |
GB201913196D0 (en) | 2019-09-12 | 2019-10-30 | Univ Newcastle | Culture method |
EP4228676A1 (en) | 2020-10-19 | 2023-08-23 | Oak Hill Bio Limited | Compositions suitable for use in neonates |
DE102021122096A1 (de) | 2021-08-26 | 2023-03-02 | Forschungsinstitut für Nutztierbiologie | IGF-1, IGFBP-2 und Insulin umfassende Zusammensetzungen und ihre Verwendung |
WO2023139115A1 (en) | 2022-01-19 | 2023-07-27 | Oak Hill Bio Limited | Compositions and methods for reducing oxidation of igf‐1/igfbp |
CN117347626B (zh) * | 2023-12-06 | 2024-03-12 | 安徽惠邦生物工程有限公司 | 人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4411890A (en) * | 1981-04-14 | 1983-10-25 | Beckman Instruments, Inc. | Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity |
US3721252A (en) * | 1971-04-01 | 1973-03-20 | Catheter And Instr Corp | Spring guide washer |
US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
PH23185A (en) | 1983-06-13 | 1989-05-29 | Scheindel Ass Inc | Pressure operated dispensing container |
WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
EP0134094B1 (en) | 1983-08-15 | 1987-05-27 | AMP INCORPORATED (a New Jersey corporation) | An improved compliant section for circuit board contact elements |
JPH0720993B2 (ja) * | 1985-08-22 | 1995-03-08 | グロペップ プロプライエタリー リミテッド | 生長因子 |
SE8505922D0 (sv) * | 1985-12-13 | 1985-12-13 | Kabigen Ab | Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering |
AU627423B2 (en) * | 1987-04-06 | 1992-08-27 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Human somatomedin carrier protein subunits and process for producing them |
AU607209B2 (en) * | 1987-04-23 | 1991-02-28 | Monsanto Technology Llc | Secretion of insulin-like growth factor-i in e. coli |
SE8703625D0 (sv) * | 1987-09-18 | 1987-09-18 | Kabivitrum Ab | New medical use |
US4876242A (en) * | 1987-09-21 | 1989-10-24 | Merck & Co., Inc. | Human insulin-like growth factor analoges with reduced binding to serum carrier proteins and their production in yeast |
EP0346429B1 (en) * | 1987-12-24 | 1994-12-28 | Gropep Pty. Ltd. | Peptide analogues of insulin-like growth factor 1 (igf-1) or factor 2 (igf-2) |
US5470828A (en) * | 1987-12-24 | 1995-11-28 | Gropep Pty. Ltd. | Peptide analogs of insulin-like growth factor II |
US4988675A (en) * | 1988-02-05 | 1991-01-29 | Ciba-Geigy Corporation | Method for preventing secondary effects |
DE68905203T2 (de) * | 1988-02-05 | 1993-07-22 | Ciba Geigy Ag | Verwendung von igf i zur herstellung eines praeparates fuer die behandlung von nierenkrankheiten. |
DK131988A (da) * | 1988-03-11 | 1989-09-12 | Erasmus University | Igf-bindingsprotein, dna-struktur, der koder for igf-bindingsproteinet og vektor indeholdende denne dna-struktur |
US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
EP0418230B1 (en) * | 1988-04-12 | 1995-12-27 | Amgen Boulder Inc. | Method for potentiating and inhibiting insulin-like growth factor activity |
US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5534617A (en) * | 1988-10-28 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1 |
GB8826451D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Sandoz Ltd | Improvements in/relating to organic compounds |
IL92816A0 (en) * | 1988-12-22 | 1990-09-17 | Biogrowth Inc | Recombinant dna molecules,hosts,processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides |
CA2007886A1 (en) * | 1989-01-17 | 1990-07-17 | Marvin L. Bayne | Human insulin-like growth factor analogs with reduced binding to 28 k igf binding proteins and their production in yeast |
US5093317A (en) * | 1989-06-05 | 1992-03-03 | Cephalon, Inc. | Treating disorders by application of insulin-like growth factor |
US5652214A (en) * | 1989-06-05 | 1997-07-29 | Cephalon, Inc. | Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs |
GB8920381D0 (en) * | 1989-09-08 | 1989-10-25 | Greater Glasgow Health Board | Treatment of insulin-resistant diabetes |
US5374620A (en) * | 1990-06-07 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Growth-promoting composition and its use |
US5126324A (en) * | 1990-06-07 | 1992-06-30 | Genentech, Inc. | Method of enhancing growth in patients using combination therapy |
US5593844A (en) * | 1990-11-19 | 1997-01-14 | Genentech, Inc. | Ligand-mediated immunofunctional hormone binding protein assay method |
US5210017A (en) * | 1990-11-19 | 1993-05-11 | Genentech, Inc. | Ligand-mediated immunofunctional hormone binding protein assay method |
SE9100099D0 (sv) * | 1991-01-11 | 1991-01-11 | Kabi Pharmacia Ab | Use of growth factor |
US5187151A (en) * | 1991-02-12 | 1993-02-16 | Genentech, Inc. | Use of binding protein with igf-i as an anabolic growth promoting agent |
EP0575485A1 (en) * | 1991-03-01 | 1993-12-29 | Dyax Corp. | Process for the development of binding mini-proteins |
US5206235A (en) * | 1991-03-20 | 1993-04-27 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams that promote the release of growth hormone |
US5202119A (en) * | 1991-06-28 | 1993-04-13 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response |
ES2101865T3 (es) * | 1991-08-01 | 1997-07-16 | Genentech Inc | Igf-1 para mejorar el estado neural. |
US6310040B1 (en) * | 1991-11-08 | 2001-10-30 | Cephalon, Inc. | Treating retinal neuronal disorders by the application of insulin-like growth factors and analogs |
SE9201573D0 (sv) * | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Kabi Pharmacia Ab | Use of igf-1 |
ATE187889T1 (de) * | 1992-06-12 | 2000-01-15 | Cephalon Inc | Vorbeugung und behandlung der peripheren neuropathie |
NZ255461A (en) * | 1992-08-20 | 1996-12-20 | Biotechnology & Biolog Science | Specific binding molecules for insulin-like-growth-factor-1 (igf-1), antigens capable of generating them and their use in enhancing igf-1 activity |
US5273961A (en) * | 1992-09-22 | 1993-12-28 | Genentech, Inc. | Method of prophylaxis of acute renal failure |
JPH08500123A (ja) * | 1993-01-25 | 1996-01-09 | ザ ベス イスラエル ホスピタル アソシエイション | Igf−i感受性細胞のバリヤー特性の修飾方法,診断方法及びスクリーニング方法 |
AU6093794A (en) * | 1993-01-29 | 1994-08-15 | Synergen, Inc. | Wound healing composition |
US5457109A (en) * | 1993-09-15 | 1995-10-10 | Warner-Lambert Company | Use of thiazolidinedione derivatives and related antihyperglycemic agents in the treatment of disease states at risk for progressing to noninsulin-dependent diabetes mellitus |
DE69427650T2 (de) * | 1993-12-23 | 2001-11-22 | Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd | Verbindungen mit wachstumshormon-freisetzenden eigenschaften |
SK281963B6 (sk) * | 1993-12-23 | 2001-09-11 | Novo Nordisk A/S | Zlúčeniny ovplyvňujúce uvoľňovanie rastového hormónu, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie |
SE9402370D0 (sv) * | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Pharmacia Ab | Use of IGF-I |
US5798337A (en) * | 1994-11-16 | 1998-08-25 | Genentech, Inc. | Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues |
SE9501472D0 (sv) * | 1995-04-21 | 1995-04-21 | Pharmacia Ab | Truncated IGF-I |
US5622932A (en) * | 1995-05-05 | 1997-04-22 | Eli Lilly And Company | IGF-1 superagonists |
BRPI9608799B8 (pt) * | 1995-05-26 | 2019-11-05 | Theratechnologies Inc | análogo pró-grf -corpo graxo quimérico com aumentada potência biológica, e, formulação farmacêutica. |
DE69630708T2 (de) * | 1995-06-07 | 2004-08-05 | Ortho Pharmaceutical Corp. | An den erythropoietin-rezeptor bindende zusammensetzungen und peptide |
EP1961760A3 (en) * | 1995-06-07 | 2008-09-03 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor |
WO1996040189A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
US5958872A (en) * | 1996-04-01 | 1999-09-28 | Apoptosis Technology, Inc. | Active survival domains of IGF-IR and methods of use |
WO1997039032A1 (en) * | 1996-04-17 | 1997-10-23 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Ligand inhibitors of insulin-like growth factor binding proteins and methods of use therefor |
US6402715B2 (en) | 1996-04-25 | 2002-06-11 | Karl Storz Gmbh & Co. Kg | Surgical instrument system |
US6428781B1 (en) | 1996-12-27 | 2002-08-06 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Composition of an endogenous insulin-like growth factor-II derivative |
US6420518B1 (en) * | 1997-04-04 | 2002-07-16 | Genetech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
AU6515499A (en) | 1998-10-16 | 2000-05-08 | Musc Foundation For Research Development | Fragments of insulin-like growth factor binding protein and insulin-like growth factor, and uses thereof |
-
1997
- 1997-04-04 US US08/825,852 patent/US6121416A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-03-31 CA CA002286264A patent/CA2286264A1/en not_active Abandoned
- 1998-03-31 AU AU69470/98A patent/AU732989B2/en not_active Ceased
- 1998-03-31 US US09/052,888 patent/US6251865B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-31 PT PT98915236T patent/PT972020E/pt unknown
- 1998-03-31 EP EP02014880A patent/EP1251137A3/en not_active Withdrawn
- 1998-03-31 JP JP54289498A patent/JP4562814B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-31 AT AT98915236T patent/ATE224951T1/de active
- 1998-03-31 IL IL13192598A patent/IL131925A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-31 DE DE69808258T patent/DE69808258T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-31 EP EP98915236A patent/EP0972020B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-31 WO PCT/US1998/006514 patent/WO1998045427A2/en active IP Right Grant
- 1998-03-31 DK DK98915236T patent/DK0972020T3/da active
- 1998-03-31 ES ES98915236T patent/ES2183344T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-11-28 US US09/723,547 patent/US6632794B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-28 US US09/723,901 patent/US6620789B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/723,912 patent/US6689751B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/723,931 patent/US6645775B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/724,481 patent/US6949349B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/724,157 patent/US6693079B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/723,890 patent/US6608031B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/724,114 patent/US6680298B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/723,873 patent/US6677305B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/724,062 patent/US6713451B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/724,065 patent/US6716586B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/724,127 patent/US6635619B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/723,913 patent/US6683053B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-28 US US09/724,095 patent/US6693078B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-12-30 HK HK02109420.9A patent/HK1047755A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL131925A0 (en) | 2001-03-19 |
CA2286264A1 (en) | 1998-10-15 |
US6716586B1 (en) | 2004-04-06 |
ES2183344T3 (es) | 2003-03-16 |
DE69808258D1 (de) | 2002-10-31 |
US6680298B1 (en) | 2004-01-20 |
AU732989B2 (en) | 2001-05-03 |
WO1998045427A2 (en) | 1998-10-15 |
US6689751B1 (en) | 2004-02-10 |
JP2002510194A (ja) | 2002-04-02 |
US6121416A (en) | 2000-09-19 |
US6645775B1 (en) | 2003-11-11 |
US6251865B1 (en) | 2001-06-26 |
US6608031B1 (en) | 2003-08-19 |
US6677305B1 (en) | 2004-01-13 |
DK0972020T3 (da) | 2003-02-03 |
HK1047755A1 (zh) | 2003-03-07 |
PT972020E (pt) | 2003-02-28 |
US6693078B1 (en) | 2004-02-17 |
EP1251137A3 (en) | 2003-04-16 |
US6620789B1 (en) | 2003-09-16 |
EP0972020B1 (en) | 2002-09-25 |
AU6947098A (en) | 1998-10-30 |
DE69808258T2 (de) | 2003-09-18 |
EP0972020A1 (en) | 2000-01-19 |
ATE224951T1 (de) | 2002-10-15 |
WO1998045427A3 (en) | 1999-01-07 |
US6693079B1 (en) | 2004-02-17 |
US6713451B1 (en) | 2004-03-30 |
US6683053B1 (en) | 2004-01-27 |
US6632794B1 (en) | 2003-10-14 |
US6949349B1 (en) | 2005-09-27 |
EP1251137A2 (en) | 2002-10-23 |
US6635619B1 (en) | 2003-10-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4562814B2 (ja) | インスリン様成長因子アゴニスト分子 | |
US6506874B1 (en) | IGF-I variants | |
EP1141014B1 (en) | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variant | |
US8110548B2 (en) | Method for treating cartilage disorders | |
CA2702760C (en) | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants | |
AU2003236454B2 (en) | Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants | |
EP1506972A1 (en) | Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071218 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080318 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090707 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091001 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091029 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100525 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100610 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100629 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100728 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130806 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |