DE102021122096A1

DE102021122096A1 - IGF-1, IGFBP-2 und Insulin umfassende Zusammensetzungen und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE102021122096A1
Application number: DE102021122096.3A
Authority: DE
Inventors: Andreas Höflich
Original assignee: Forschungsinstitut Fuer Nutztierbiologie
Current assignee: Forschungsinstitut Fuer Nutztierbiologie
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2023-03-02
Also published as: WO2023025914A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Kits zur gezielten Beeinflussung des Energiestoffwechsels in Muskel- und Fettgewebe. Im Detail lehrt die Erfindung eine Zusammensetzung oder ein Kit, die bzw. das die drei Komponenten Insulin, IGF-1 und IGFBP-2 bereitstellt. Die drei Komponenten können in der Zusammensetzung oder dem Kit als Protein vorliegen oder durch mindestens eine in der Zusammensetzung oder dem Kit enthaltene Nukleinsäure kodiert werden, wobei es sich bei der Nukleinsäure bevorzugt um RNA handelt. Ferner offenbart die Erfindung die Verwendung der Zusammensetzung oder des Kits in einem Verfahren zur Erhöhung des intramuskulären Fettgehalts in Fleisch von Nutztieren oder in in vitro-Kultur. Bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder dem Kit kann es sich zudem um eine pharmazeutische Zusammensetzung bzw. um ein pharmazeutisches Kit handeln, die/das bei der Behandlung von Insulinresistenz, Muskeldystrophie, der Erhaltung und Regeneration neuronaler Funktionen und der Behandlung und/oder Prävention einer Neuropathie Verwendung finden kann. Schließlich offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und des pharmazeutischen Kits zur Behandlung einer Verletzung eines Muskels, Bandes und/oder einer Sehne in einem Subjekt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Kits zur gezielten Beeinflussung des Energiestoffwechsels in Muskel- und Fettgewebe. Im Detail lehrt die Erfindung eine Zusammensetzung oder ein Kit, die bzw. das die drei Komponenten Insulin, IGF-1 und IGFBP-2 bereitstellt. Die drei Komponenten können in der Zusammensetzung oder dem Kit als Protein vorliegen oder durch mindestens eine in der Zusammensetzung oder dem Kit enthaltene Nukleinsäure kodiert werden, wobei es sich bei der Nukleinsäure bevorzugt um RNA handelt. Ferner offenbart die Erfindung die Verwendung der Zusammensetzung oder des Kits in einem Verfahren zur Erhöhung des intramuskulären Fettgehalts in Fleisch von Nutztieren oder in in vitro-Kultur. Bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder dem Kit kann es sich zudem um eine pharmazeutische Zusammensetzung bzw. um ein pharmazeutisches Kit handeln, die/das bei der Behandlung von Insulinresistenz, Muskeldystrophie, der Erhaltung und Regeneration neuronaler Funktionen und der Behandlung und/oder Prävention einer Neuropathie Verwendung finden kann. Schließlich offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und des pharmazeutischen Kits zur Behandlung einer Verletzung eines Muskels, Bandes und/oder einer Sehne in einem Subjekt.
In Deutschland lag der jährliche Fleischverbrauch im Jahr 2020 bei knapp 60 kg pro Kopf, wobei der größte Teil des Fleischkonsums auf Schweinefleisch entfällt. Obwohl der Fleischkonsum in den letzten Jahren stetig zurückging, ist seit 2005 eine kontinuierlich steigende Nachfrage nach Rindfleisch festzustellen (https://www.landwirtschaft.de/landwirtschaft-verstehen/haetten-sies-gewusst/infografiken). Diese Entwicklung geht mit wachsenden Ansprüchen an die Qualität von Nahrungsmitteln einher. So legen immer mehr Konsumenten einen gesteigerten Wert auf eine hohe Fleischqualität, die sich durch eine besonders zarte Fleischkonsistenz und einen ansprechenden Geschmack auszeichnet.
Insbesondere das Fleisch des japanischen Kobe-Rinds (auch als Wagyu-Rind bekannt) ist für seine außergewöhnlich hohe Fleischqualität weltberühmt. Das Wagyu-Fleisch zeichnet sich durch eine besonders mürbe Struktur und ein außergewöhnlichen hohen intramuskulären Fettgehalt aus, der als feine Marmorierung des Fleisches wahrgenommen wird. Die ausgezeichnete Qualität des Wagyu-Fleischs erfordert allerdings eine außergewöhnlich kosten- und zeitaufwändige Aufzucht der Rinder. So erhalten die Tiere in ihren ersten Lebensmonaten einen speziellen Futtermix aus ausgewählten Zutaten und dürfen sich anschließend frei in kleinen Herden auf Wiesen und Weiden aufhalten. Darüber hinaus leben Wagyu-Rinder bis zur Schlachtreife deutlich länger als konventionelle Fleischrinder und sind bei ihrer Schlachtung in der Regel kleiner und leichter. Der Aufwand, der für die Aufzucht der Wagyu-Rinder betrieben wird, um Fleisch von allerhöchster Güte und Qualität zu erhalten, äußert sich dementsprechend im Preis: Das Fleisch des Wagyu-Rinds gilt als das teuerste Fleisch der Welt.
Es liegt auf der Hand, dass eine derartige ressourcenintensive Aufzucht von Nutztieren zur Fleischproduktion für den deutschen Massenmarkt nicht in Frage kommt. In Deutschland dominiert bei der Rindern die Laufstallhaltung. Lediglich ein Drittel erhält regelmäßigen Weidezugang, wobei dieser Anteil in den letzten Jahren kontinuierlich gesunken ist (https://www.landwirtschaft.de/landwirtschaft-verstehen/haetten-sies-gewusst/infografiken). Konventionelle Mastverfahren zielen zudem auf eine möglichst große Gewichts- und Größenzunahme der Schlachttiere in möglichst kurzer Zeit ab. In Zeiten von Massentierhaltung wird es somit zunehmend schwer, die Qualitätsansprüche vieler deutscher Fleischkonsumenten zufriedenzustellen
Nichtdestotrotz gilt auch in Deutschland bei der Rindermast die Maßgabe, dass ein hoher intramuskulärer Fettgehalt der Nutztiere wünschenswert ist. Ein erhöhter Fettansatz in Nutztieren dient nicht nur einer hohen Qualität des produzierten Fleisches, sondern kann auch die Futtereffizienz der Tiere erheblich steigern. Die selektive Kontrolle des Fett- und Muskelansatzes hat somit auch das Potential, die Zucht und Haltung von Nutztieren kostengünstiger zu gestalten.
Es besteht somit ein Bedarf an neuartigen Verfahren und Ansätzen, die eine selektive gewebsspezifische Regulation des Energiestoffwechsels erlauben, um eine gezielte Kontrolle und Förderung des Fett- und Muskelansatzes, etwa eine Steigerung der intramuskulären Fetteinlagerung, zu ermöglichen.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung, insbesondere der Ansprüche.
Die Erfindung offenbart eine Zusammensetzung oder ein Kit, welche(s) IGF-1, Insulin und IGFBP-2 bereitstellt, wobei

(a) das IGF-1, Insulin und/oder IGFBP-2 als Protein vorliegt, oder
(b) mindestens eine Nukleinsäure vorliegt, welche für IGF-1, Insulin und/oder IGFBP-2 kodiert.

Insulin ist ein Hormon, das gemeinsam mit Glucagon die Konzentration von Glucose im Blut reguliert. Während Glucagon eine Erhöhung der Glucosekonzentration im Blut bewirkt, fördert Insulin die Aufnahme der Glucose durch Muskel- und Fettzellen, was zu einer Senkung des Blutzuckerspiegels führt. Hierzu muss Insulin an einen spezifischen Insulinrezeptor andocken, der als Transmembranprotein exprimiert wird. Durch die Interaktion des Insulins mit dessen Rezeptor wird eine Kaskade von Phosphorylierungsreaktionen ausgelöst, die letztlich zur Aktivierung spezifischer Glucose-Transporterproteine führt, und somit den Eintritt der Glucose in die Zellen ermöglicht. Vollständig gereiftes Insulin besteht aus einer A-Kette und einer B-Kette und wird normalerweise in den β-Zellen innerhalb der Langerhans-Inseln der Bauspeicheldrüse gebildet. Es wird erst als Reaktion auf die Aufnahme kohlenhydratreicher Nahrung in das Blut ausgeschüttet.
Der insulinähnliche Wachstumsfaktor 1 (englisch insulin-like growth factor 1) ist ein Wachstumsfaktor mit hoher Sequenzhomologie zu Insulin, der hauptsächlich unter Mitwirkung des Wachstumshormons Somatotropin in der Leber gebildet wird. Die IGF-1 Produktion erfolgt ein Leben lang, erreicht jedoch ihr Maximum während des Wachstumsschubes in der Pubertät. IGF-1 ist in der Lage, das Wachstum nahezu jeder Zellart des Körpers anzuregen, u.a. indem es u.a. den AKT-Kinasesignalweg stimuliert. Gleichzeitig ist IGF-1 ein wirksamer Inhibitor des programmierten Zelltods. Aufgrund seiner wachstumsfördernden und Apoptose-hemmenden Funktion wird eine Überexpression von IGF-1 jedoch auch mit der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs in Verbindung gebracht.
Die anabolen Funktionen des IGF-1 werden unter anderem durch die Familie der Insulin-like Growth Factor Binding Proteins (IGFBP) reguliert. IGFBP-2 ist das zweithäufigste IGFBP und wird in verschiedenen Geweben exprimiert, wo es beispielsweise die Bindung von IGF-1 an dessen spezifischen Rezeptor unterdrücken kann und somit die IGF-1 Aktivität inhibiert.
In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass IGFBP-2 neben seiner inhibitorischen Funktion auch gemeinsam mit IGF-1 eine Aktivierung des AKT-Kinasesignalwegs auslösen und folglich die Migration und Vermehrung von vaskulären glatten Muskelzellen bewirken kann (Shen et al. 2012). IGFBP-2 scheint hierzu die Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase β (RPTPβ) zu stimulieren, was zu einer Dephosphorylierung und somit Inaktivierung der Lipidphosphatase PTEN führt. Gleichzeitig bindet das IGF-1 an dessen spezifischen Rezeptor, und aktiviert dadurch Vimentin. Vimentin bindet im Anschluss ebenfalls an RPTPβ. Die koordinierte Stimulation von RPTPβ durch IGFBP-2 und Vimentin und die damit einhergehende Inaktivierung von PTEN verhindert die Dephosphorylierung von Phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphat (PIP3) und ermöglicht infolgedessen die Aktivierung der wachstumsfördernden AKT-Kinase (Shen et al., 2012, Shen et al., 2015).
Weitere Studien konnten zeigen, dass eine supprimierte PTEN-Aktivität und eine Aktivierung von AKT nicht nur das Zellwachstum fördert, sondern auch gegen Hyperglykämie und Insulinresistenz schützt und eine erhöhte Insulinsensitivität bewirkt (z.B. Li et al., 2017).
Die Erfindung macht sich diese Erkenntnisse zu Nutze und stellt einen neuartigen Ansatz zur Verfügung, wonach eine Kombination von IGF-1 und IGFBP-2 verwendet werden kann, um Muskelwachstum und/oder Fetteinlagerung durch die Aktivierung der AKT-Signalisierung und der Förderung einer erhöhten Insulinwirksamkeit gezielt anzuregen. Tatsächlich wurde eine Relevanz einer kombinierten Aktivität von IGF-1 und IGFBP-2 für die Wirksamkeit von Insulin bislang noch nicht beschrieben. Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung bzw. ein Kit zur Verfügung, die/das Insulin gemeinsam mit IGF-1 und IGFBP-2 als Komponenten bereitstellt und beispielsweise einem Subjekt oder einer in vitro Kultur verabreicht werden kann, um die Wirkung des bereitgestellten Insulins innerhalb des Subjekts oder der Kultur zu potenzieren. Aufgrund der Bereitstellung von IGF-1 in Form einer Zusammensetzung oder eines Kits mit IGFBP-2 als weitere, wachstumsfördernde Komponente kann zudem die Dosis des bereitgestellten IGF-1 im Vergleich zu reinen IGF-1 Präparaten herabgesetzt werden, um ein unkontrolliertes Zellwachstum und die Entstehung maligner Erkrankungen vorzubeugen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung bzw. das erfindungsgemäße Kit kann weitere Inhaltstoffe umfassen oder bereitstellen. Im Kontext der Erfindung bezieht sich der Begriff „Komponenten“ jedoch lediglich auf Insulin, IGF-1 und IGFBP-2.
Das Kit kann ein einziges Kompartiment umfassen, in dem die drei verschiedenen Komponenten als Proteine und/oder die mindestens eine Nukleinsäure, die für eine oder mehrere der Komponenten kodiert, gemeinsam vorliegen. Alternativ können die Komponenten bzw. die mindestens eine Nukleinsäure in unterschiedliche Kompartimente des Kits aufgeteilt vorliegen und, optional, erst vor oder während der Verwendung des Kits mit einander in Kontakt gebracht werden. Das Kit oder die Zusammensetzung kann bei einer Temperatur von 2-6°C für mehrere Tage bis mehrere Wochen gelagert werden, z.B. 1 Tag bis 4 Wochen, 1 Tag bis 3 Wochen, 1 Tag bis 2 Wochen oder 1 Tag bis 7 Tage. Bevorzugt kann das Kit oder die Zusammensetzung bei 2-6°C für weniger als 2 Wochen gelagert werden. Für eine langfristige Lagerung kann das Kit oder die Zusammensetzung bei -80°C für einen Zeitraum von mehreren Wochen bis zu mehreren Monaten vor der Verwendung gelagert werden, z. B. von 4 Wochen bis zu 24 Monaten, von 2 Monaten bis zu 20 Monaten, von 4 Monaten bis zu 16 Monaten, von 8 Monaten bis zu 14 Monaten oder für etwa 12 Monate. In einigen Ausführungsformen kann das Kit oder die Zusammensetzung bei -80°C für noch längere Zeiträume vor der Verwendung gelagert werden, z. B. für 3 Jahre, für 4 Jahre, für 5 Jahre, für 6 Jahre, für 7 Jahre, für 8 Jahre, für 9 Jahre oder sogar für bis zu 10 Jahre. Auch eine Lyophilisierung von Komponenten und eine Resuspendierung vor Verabreichung sind möglich.
Wie oben bereits erwähnt, liegt in einer ersten Ausführungsform der Erfindung mindestens eine der drei Komponenten, d.h. Insulin, IGF-1 oder IGFBP-2, als Protein in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder dem erfindungsgemäßen Kit vor. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit zwei oder auch alle drei Komponenten als Proteine.
Die drei Komponenten können in diesem Fall zu gleich Teilen in der Zusammensetzung oder dem Kit vorliegen, d.h. ungefähr in einem äquimolaren Verhältnis. Da eine Bereitstellung des Wachstumshormons IGF-1 jedoch mit einem erhöhten Krebsrisiko einhergehen könnte, kann es im Sinne der Erfindung vorteilhaft sein, wenn das IGF-1 Protein zu einem geringeren Anteil in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder dem erfindungsgemäßen Kit vorliegt als die beiden übrigen Komponenten. Durch Verringerung des relativen IGF-1 Anteils in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. dem Kit kann dessen anaboles, d.h. wachstumsförderndes Potential eingeschränkt werden. Auf der anderen Seite verstärkt ein größerer relativer IGF-1-Anteil in der Zusammensetzung oder dem Kit den Aufbau und die Regeneration von körpereigenem Gewebe, was je nach Verwendung der Zusammensetzung oder des Kits wünschenswert sein kann. Das Verhältnis zwischen Insulin, IGF-1 und IGFBP-2 kann von dem Verhältnis 1:1:1 abweichen. So kann das Verhältnis der drei Komponenten in der Zusammensetzung oder dem Kit zueinander bei 0,1-10:0,1-10:0,1-10 liegen. Die physiologisch wirksamen Dosen für IGF-1, IGFBP-2 bzw. Insulin liegen bei 10-1000 ng/mL, 30-2000 ng/mL, bzw. bei 10-1000 ng/mL Serum oder Kultur-Medium. Durch weitere Konzentrationserhöhungen sind zusätzliche Effekte möglich, zum Beispiel dadurch, dass Insulin bei höheren Konzentrationen auch an den IGF-1 Rezeptor binden kann.
Im Kontext der Erfindung bedeutet „als Protein vorliegen“, dass die Komponenten als vollständig translatierte und korrekt gefaltete Polypeptide in der Zusammensetzung oder dem Kit bereitgestellt werden. Bevorzugt sind die als Protein vorliegenden Komponenten zudem vollständig prozessiert. So wird das Insulin beispielsweise bevorzugt ohne das 31 Aminosäuren umfassende C-Peptid oder die 24 Aminosäure umfassende Signalsequenz bereitgestellt, liegt somit weder als Präproinsulin (Signalpeptid - B-Kette - C-Peptid - A-Kette) oder als Proinsulin (B-Kette - C-Peptid - A-Kette), sondern als vollständig gereiftes Insulin (B-Kette - A-Kette) in der Zusammensetzung oder dem Kit vor. In anderen Ausführungsformen werden die Komponenten in nicht vollständig prozessierter Form bereitgestellt. So kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit beispielsweise auch anstatt Insulin lediglich Präproinsulin oder Proinsulin, aber auch eine beliebige Mischung aus Präproinsulin, Proinsulin und/oder gereiftem Insulin, umfassen. Entsprechendes gilt für die übrigen Komponenten der Zusammensetzung oder des Kits.
In einer weiteren Ausführungsform werden nicht alle Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits als Protein bereitgestellt. Beispielsweise können lediglich eine oder zwei der drei Komponenten als Protein bereitgestellt werden. Die übrigen Komponenten werden dagegen mittels mindestens einer Nukleinsäure bereitgestellt, die für diese Komponenten kodiert. Entsprechend werden die durch die mindestens eine Nukleinsäure kodierten Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits erst nach deren Verwendung in einer Zelle des Zielgewebes hergestellt.
Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit in einer Ausführungsform mindestens eine Nukleinsäure umfasst, welche für IGF-1, Insulin und/oder IGFBP-2 kodiert. Die mindestens eine Nukleinsäure kodiert somit für mindestens eine Komponente der Zusammensetzung bzw. des Kits, während die übrigen Komponenten als Protein, wie hierin beschrieben, bereitgestellt werden. Die mindestens eine Nukleinsäure kann auch für mehr als eine Komponente der Zusammensetzung bzw. des Kits kodieren, z.B. für zwei oder alle drei der Komponenten. Beispielsweise kann die mindestens eine Nukleinsäure für Insulin und IGF-1 kodieren, während IGFBP-2 als Protein bereitgestellt wird. Bevorzugt werden alle drei Komponenten, also IGF-1, Insulin und IGFB-2, durch mindestens eine Nukleinsäure kodiert. In einer Ausführungsform der Erfindung werden eine, zwei oder alle drei Komponenten in der Zusammensetzung oder dem Kit sowohl als Protein, als auch in Form mindestens einer Nukleinsäure bereitgestellt, die für mindestens eine der Komponenten kodiert.
In einer Ausführungsform werden die jeweiligen Komponenten des erfindungsgemäßen Kits oder der erfindungsgemäßen Zusammensetzung durch separate Nukleinsäuren kodiert. So kodiert eine erste Nukleinsäure für Insulin, eine zweite Nukleinsäure für IGF-1 und eine dritte Nukleinsäure für IGFBP-2. Alternativ kann ein und dieselbe Nukleinsäure auch für mehrere Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits kodieren. Beispielsweise kann eine erste Nukleinsäure sowohl für Insulin und IGF-1 kodieren, während eine zweite Nukleinsäure für IGFBP-2 kodiert. In einer weiteren Ausführungsform kodiert eine einzige Nukleinsäure für alle drei Komponenten, also sowohl für Insulin als auch für IGF-1 und IGFBP-2.
Bei der mindestens einen Nukleinsäure des erfindungsgemäßen Kits oder der erfindungsgemäßen Zusammensetzung handelt es sich in einer ersten Ausführungsform um DNA. Bei der DNA kann es sich beispielsweise um einen DNA-Vektor handeln, z.B. um ein aus Bakterien oder Backhefe abgeleitetes Plasmid, einen DNA-Vektor viralen Ursprungs oder einen Minicircle, welcher mindestens ein Transgen umfasst, das für mindestens eine der Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen Kits kodiert. Der Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, einen geeigneten DNA-Vektor für die Bereitstellung des mindestens einen Transgens auszuwählen.
Bei dem mindestens einen Transgen kann es sich um das jeweilige Gen für Insulin, IGF-1 oder IGFBP-2 handeln, welches endogen in dem mit dem erfindungsgemäßen Kit oder der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zu behandelnden Organismus vorkommt, oder aus dem gleichen Organismus stammt, aus dem eine zu behandelnde in vitro Kultur abgeleitet wurde. Sofern die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit beispielsweise für die Anwendung in einem menschlichen Subjekt vorgesehen ist, handelt es sich bei dem mindestens einen Transgen bevorzugt um das menschliche Gen für Insulin, IGF-1 und/oder IGFBP-2. Sofern die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit beispielsweise für die Anwendung in einem Rind vorgesehen ist, handelt es sich bei dem mindestens einen Transgen bevorzugt um das Rinder-Gen für Insulin, IGF-1 und/oder IGFBP-2. Das Transgen kann sämtliche endogenen Kontrollelemente (z.B. Promotor) und/oder Introns umfassen. Alternativ kann das Transgen auch operabel mit einem heterologen Promoter verbunden sein und/oder frei von Introns sein. Es kann auch lediglich einige ausgewählte Introns umfassen oder künstliche bzw. artfremde Introns, die normalerweise nicht in einem der genannten Gene vorkommen.
Der heterologe Promoter kann ein konstitutiver Promoter sein, der eine konstante und fortwährende Expression des Transgens gewährleistet. Alternativ kann die Expression des Transgens auch durch einen gewebsspezifischen Promoter kontrolliert werden, sodass das Transgen lediglich in einem konkreten Zielgewebe exprimiert wird, z.B. in Muskelzellen oder in Nervenzellen, bevorzugt in Muskelzellen. Auf diese Weise lassen sich gegebenenfalls unerwünschte Nebenwirkungen umgehen, die mit einer systemischen Anwendung des erfindungsgemäßen Kits oder der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in einem Subjekt auftreten können. Eine kontrollierte, ausschließlich gewebsspezifische Expression von IGF-1 kann beispielsweise das mit der systemischen Überexpression von IGF-1 verbundene Risiko eines unspezifischen Zellwachstums in anderen, unerwünschten Geweben reduzieren. Alternativ kann der heterologe Promoter auch ein induzierbarer Promoter, z.B. ein Tet-induzierbarer Promoter sein, welcher die Expression des Transgens nur in Gegenwart eines entsprechenden chemischen oder physikalischen Stimulus initiiert. Die Verwendung eines induzierbaren Promoters zur Expression der mindestens einen Komponente des erfindungsgemäßen Kits oder der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann beispielsweise dann besonders sinnvoll sein, wenn die Zusammensetzung oder das Kit für die Anwendung in einer in vitro Kultur vorgesehen ist.
Sofern die gleiche DNA für mehrere Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits kodiert, kann eine einzelne DNA, z.B. das Plasmid, mehrere Transgene umfassen, deren Expression jeweils durch einen eigenen Promoter reguliert wird. Folglich ermöglicht eine einzige DNA die Expression dreier separater mRNA Moleküle, die getrennt voneinander in die drei durch die Zusammensetzung oder das Kit bereitzustellenden Komponenten translatiert werden können. Dieser Ansatz, genau wie die oben beschriebene Alternative, wonach die drei Komponenten jeweils von separaten Nukleinsäuren, d.h. drei unterschiedlichen DNA-Vektoren, exprimiert werden, hat den Vorteil, dass die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits durch die gezielte Auswahl unterschiedlich starker Promotoren in unterschiedlichen Mengen innerhalb des Zielgewebes exprimiert werden können. So kann z.B. ein erhöhtes Krebsrisiko dadurch beschränkt werden, dass die IGF-1 Expression lediglich mittels eines schwachen und/oder induzierbaren Promoters angetrieben wird, während die Expression der übrigen Komponenten durch die Auswahl starker und/oder konstitutiver Promotoren gesteuert werden kann. Umgekehrt kann ein erwünschtes Zellwachstums durch eine gezielte gewebsspezifische Überexpression von IGF-1 gefördert werden.
Die für die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen Kits kodierenden Transgene können alternativ auch zu einem einzelnen Operon zusammengefasst werden, welches unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promoters steht. In einer solchen Ausführungsform würde die Transkription des Operons entsprechend zur Herstellung eines einzelnen polyzistronischen mRNA-Moleküls führen, das anschließend beispielsweise mittels gezielter RNA-Spleißung in drei separate mRNAs aufgeteilt und separat translatiert werden kann. Alternativ können die Gene für Insulin, IGF-1 und IGFBP-2 hintereinander innerhalb eines Operons auf den DNA Vektor kloniert werden und jeweils durch eine interne ribosomale Eintritsstelle (IRES) voneinander getrennt werden. Hierdurch kann die Translation der entsprechend hergestellten polyzystronischen mRNA an mehreren Positionen, d.h. unabhängig von der Gegenwart einer 5'Cap-Endstruktur, gleichzeitig initiiert werden, sodass die drei Komponenten simultan mit derselben mRNA als Vorlage synthetisiert werden können. Da sich die Expressionseffizienz in der Regel aufgrund der eingeführten IRES-Sequenzen für jedes weitere nachfolgende Gen verringert, kann es vorteilhaft sein, wenn das IGF-1-Gen an letzter Position innerhalb des Operons eingefügt wird. Somit fielen die Expressionslevel für IGF-1 geringer aus als für die beiden übrigen Komponenten, was ein erhöhtes Krebsrisiko verringern kann. Eine Expression mehrerer Komponenten von einem einzelnen Operon kann alternativ durch den Einsatz von zwischengelagerten 2A-Peptid-Sequenzen erzielt werden. In einer solchen Ausführungsform wird die transkribierte mRNA in ein einzelnes langes Polypeptid translatiert, welches anschließend aufgrund der zwischengelagerten 2A-Peptide in mehrere Proteine zerfällt. Einem Fachmann sind solche und ähnliche Vektordesign-Strategien zur gleichzeitigen Expression mehrerer Proteine aus dem Stand der Technik bekannt.
Bevorzugt handelt es sich bei der mindestens einen Nukleinsäure der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits um eine RNA. Die RNA kann beispielsweise ein RNA-Vektor viralen Ursprungs sein, z.B. ein lentiviraler Vektor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine Nukleinsäure jedoch eine mRNA, die für mindestens eine der Komponenten Insulin, IGF-1 oder IGFBP-2 kodiert. Wie hierin ausgeführt, kann jede Komponente durch eine separate mRNA kodiert werden. Optional kodiert die mindestens eine erfindungsgemäße mRNA jedoch für mehrere Komponenten, z.B. zwei oder alle drei Komponenten die durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit bereitgestellt werden sollen. Die Expression mehrerer unterschiedlicher Komponenten von einer einzelnen mRNA kann beispielsweise mittels gezielt zwischengeschalteter IRES- oder 2A-Peptidsequenzen erreicht werden, wie hierin beschrieben.
Die mRNA kann eine natürliche mRNA sein, d.h., eine mRNA, die durch eine Zelle exprimiert und anschließend isoliert wurde. Derartige natürliche mRNAs haben jedoch den Nachteil, dass sie eine geringe Stabilität aufweisen und bei Verabreichung in ein Subjekt oder eine in vitro Kultur eine unerwünschte Immunreaktion auslösen können. Daher wird die erfindungsgemäße mRNA in einer bevorzugten Ausführungsform als chemisch modifizierte mRNA synthetisch hergestellt. Zum Beispiel kann es sich bei der mindestens einen mRNA um eine Nukleosid-modifizierte mRNA handeln, bei der einzelne Nukleoside durch andere natürliche modifizierte Nukleoside oder durch synthetische Nukleosid-Analoga ersetzt wurden. So können in der mindestens einen mRNA ein oder mehrere Uridin-Nukleoside durch Pseudouridin oder N¹-Methylpseudouridin ersetzt werden. Alternativ oder zusätzlich kann Cytosin innerhalb der mindestens einen mRNA durch 5-Methyl-Cytosin ersetzt werden. Der Einsatz derartiger Nukleosid-Analoga beeinflusst die Sekundärstruktur der modifizierten mRNA, sodass diese schlechter oder nicht mehr durch das Immunsystem erkannt und bekämpft werden kann. Die Stabilität der mindestens einen modifizierten mRNA kann ferner durch die gezielte Auswahl geeigneter untranslatierter Regionen (UTR) am 3`- und 5'-Ende der mRNA sowie den Einsatz weiterer Nukleosidanaloga, wie beispielsweise N⁶-methyladenosine, N⁶,2'-O-dimethyladenosine, 8-oxo-7,8-dihydroguanosine oder N⁴-acetylcytidine erhöht werden. Dem Fachmann sind unterschiedliche Verfahren und Werkzeuge zur synthetischen Herstellung einer erfindungsgemäßen mRNA aus dem Stand der Technik bekannt.
Für die Applikation wird die mindestens eine mRNA des erfindungsgemäßen Kits oder der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bevorzugt in einen geeigneten, physiologisch unbedenklichen Carrier eingebracht. Geeignete Carrier umfassen beispielsweise Lipidnanopartikel, die u.a. auch bei mRNA-basierten Vakzinen zum Einsatz kommen. Weitere geeignete Carrier für das Einbringen der mindestens einen mRNA in eine Zielzelle sind dem Fachmann ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt und können beispielsweise Minizellen, RNA basierte Nanopartikel oder Dendromere umfassen. In einigen Ausführungsformen können die Carrier mit spezifischen Targeting-Molekülen ausgestattet sein, die einen zielgerichteten Transport der mindestens einen mRNA zu einem gewünschten Gewebe innerhalb des mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder dem erfindungsgemäßen Kit behandelten Subjekts ermöglicht, z.B. zu Muskelzellen und/oder Nervenzellen. Alternativ kann die mindestens eine mRNA innerhalb der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits jedoch auch ohne Carrier verabreicht werden.
Unabhängig davon, ob die mindestens eine in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. dem erfindungsgemäßen Kit vorliegende Nukleinsäure eine DNA oder RNA ist, ist die Nukleinsäure bevorzugt für die Expression in dem Zielorganismus und/oder dem Zielgewebe Codon-optimiert. Hierbei werden vereinzelte Triplettcodons der Nukleotidsequenz im Zuge einer in vitro Mutagenese durch synonyme Codons ersetzt, um die Expressionsrate der einzelnen Komponenten an die bevorzugte Codonverwendung des Zielorganismus oder des Zielgewebes anzupassen.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits zur Erhöhung des intramuskulären Fettgehalts in Fleisch, bevorzugt von Nutztieren, optional von Bovinen, oder in in vitro-Kultur.
Im Kontext der Erfindung bedeutet „eine Erhöhung des intramuskulären Fettgehalts in Fleisch“, dass das Fleisch in Reaktion auf die hierin offenbarte Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des Kits quantitativ einen erhöhten Anteil von Fettgewebe innerhalb des Muskelgewebes aufweist. Zudem kann das Fettgewebe bevorzugt besonders gleichmäßig innerhalb des Fleisches verteilt sein. Der Fachmann spricht in diesem Kontext von einer besonders feinen und gleichmäßigen Marmorierung des Fleisches.
Das Fleisch des Kobe-Rinds (auch als Wagyu-Rind bekannt) ist insbesondere durch seine besonders mürbe Struktur und eben eine solche feine Marmorierung mit Fettäderchen bekannt. Aufgrund seines hohen intramuskulären Fettgehalts ist das Fleisch aus Wagyu-Rindern besonders zart und schmackhaft und wird daher weltweit als Delikatesse angesehen. Eine Studie von Connolly et al., 2020 offenbarte erst kürzlich einen möglichen Zusammenhang zwischen der feinen Marmorierung des Wagyu-Fleisches und einem erhöhten Zuckergehalt in dem Serum der Rinder. Eine besonders effiziente Versorgung der Muskeln des Wagyu-Rinds mit Kohlenhydraten kann somit den ungewöhnlich hohen intramuskulären Fettgehalt des Fleisches begünstigen.
Lebewesen verfügen über einen komplexen Energiestoffwechsel, um ausreichend Energie für ihr Überleben bereitzustellen. Die gewonnene Energie wird für die Aufrechterhaltung der normalen Körperfunktionen und den Aufbau von Körperbestandteilen benötigt. Es ist daher wichtig, dass Lebewesen bei Bedarf jederzeit auf körpereigene Energiespeicher zurückgreifen können, um die notwendige Energie bereitstellen zu können.
Der natürlich vorkommende Einfachzucker Glucose ist eine wichtiger Energieträger. Glucose kann durch Zellen im Zuge der Glykolyse metabolisiert werden, um Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) zu gewinnen. Der Abbau von Glucose liefert zudem auch die Bausteine für die Biosynthese vieler weiterer überlebenswichtiger Verbindungen. Beispielsweise entsteht bei der Glycolyse von Glucose Pyruvat, welches als Ausgangsstoff u.a. für die Herstellung von Fettsäuren benötigt wird. Fettsäuren dienen Zellen wiederum als Ausgangsstoff für die Biosynthese von Lipiden bzw. Fetten. Lipide sind sehr energiereiche Verbindungen, die durch den Körper in Form von Speicher- oder Depotfett in die Zellen des Fettgewebes, den sogenannten Adipozyten, eingelagert werden. Die Fettreserven dienen als Langzeitenergiespeicher und können z.B. einen gesunden Menschen über Wochen mit Energie versorgen. Adipozyten können über die Ernährung bereitgestellte Glucose aus dem Blut aufnehmen und somit die Fettreserven auffüllen oder vergrößern.
Im Gegensatz zu Adipozyten speichern Muskelzellen aus dem Blut aufgenommene Glucose in Form von Glykogen, einem aus Glucose-Monomeren aufgebauten Polysaccharid. Im Gegensatz zu Fett, welches der langfristigen Energiespeicherung dient und den Körper über mehrere Wochen mit Energie versorgen kann, stellt Glykogen eher einen kurz- bis mittelfristiger Energiespeicher dar, der den Muskeln je nach Belastungsintensität lediglich für einige Stunden Energie liefert.
Gewebe nutzen unterschiedliche Mechanismen zur Aufnahme von Glukose. Vor allem in Zellen des zentralen Nervensystems, Hepatozyten, der Darmmukosa, und den Epithelzellen der Niere erfolgt die Glucoseaufnahme mittels insulinunabhängiger Glucosetransporter. Im Gegensatz dazu findet sich im Muskel- und im Fettgewebe mit dem Glucosetransporter Glut4 ein insulinabhängiger Kanal, der den Transport von Glucose aus der Zirkulation in die Fett- und Muskelzellen ermöglicht. Der Mechanismus der Insulin-Wirkung wird hierbei über den Insulin-Rezeptor und den AKT-Kinasesignalweg vermittelt.
Die vorliegende Erfindung offenbart, dass durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits an ein Subjekt dessen Insulinsensitivität erhöht und somit die Aufnahme von Glucose in Muskel-und Fettzellen gezielt gefördert werden kann. Von einer „Erhöhung“ der Insulinsensitivität kann gesprochen werden, wenn die Insulinwirksamkeit, also die Fähigkeit des Insulins, die Aufnahme von Glucose aus dem Blut in die Muskel- und Fettzellen zu fördern, nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits stärker ausfällt als davor. Die vorliegende Erfindung erlaubt folglich eine gewebsspezifische Beeinflussung des Energiestoffwechsels insbesondere in Muskel- und Fettgewebe und ermöglicht dadurch eine selektive hormonelle Kontrolle des Muskel- und Fettansatzes.
In einer wichtigen Ausführungsform der Erfindung ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung bzw. das erfindungsgemäße Kit für die Verwendung in Nutztieren vorgesehen. Unter dem Begriff „Nutztier“ werden im Allgemeinen Tiere zusammengefasst, die aufgrund bestimmter Fähigkeiten oder aus ästhetischen Gründen vom Menschen wirtschaftlich genutzt werden (https://de.wikipedia.org/wiki/Nutztier). Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich das Wort „Nutztier“ jedoch insbesondere auf Tiere, die als Nahrungslieferanten, insbesondere als Fleischlieferanten genutzt werden. Nutztiere im Sinne der Erfindung sind somit vornehmlich Schlachttiere, wie beispielsweise Mitglieder der Familie der Bovinae, Schweine, Schafe, Ziegen, Pferde, Zebras, Kamele, Lamas, Alpakas, Geflügel, Hasen oder Kaninchen.
Durch die Bereitstellung der drei Komponenten Insulin, IGF-1 und IGFBP-2 mit Hilfe des erfindungsgemäßen Kits bzw. der erfindungsgemäßen Zusammensetzung lässt sich, wie oben beschrieben, die Glucoseaufnahme aus dem Blut in das Muskel- und Fettgewebe dieser Tiere selektiv erhöhen. Entsprechend kann der intramuskuläre Fettgehalt der Tiere gesteigert werden, was sich positiv auf die Qualität und Zartheit des produzierten Fleisches dieser Nutztiere auswirkt.
Bevorzugt handelt es sich bei den Nutztieren um Mitglieder der Familie der Bovinae. Diese Unterfamilie der Hornträger umfasst z.B. Rinder, Bisons, Büffel und sämtliche Antilopenarten. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Nutztieren um Rinder, am meisten bevorzugt um einheimische Rinderrassen wie dem Angler-Rind, dem Ansbach-Triesdorfer-Rind, dem Braunvieh, dem Angus, z.B. dem deutschen Angus, dem deutschen Holstein Rotbunt/Schwarzbunt, dem deutschen schwarzbunten Niederungsrind, dem deutschen Shorthorn, dem Fleckvieh, dem Gelbvieh, dem Glanrind, dem Hinterwälder oder dem Limpurger. Durch die gezielte Erhöhung des Fettgehalts in den Muskeln dieser Rinderrassen mit Hilfe der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits können diese Tiere Fleisch von einer Qualität und Zartheit bereitstellen, das dem Fleisch aus den exklusiven japanischen Wagyu-Rindern ähnelt oder gar entspricht.
Die hierin beschriebene hormonelle gewebsspezifische Beeinflussung des Energiestoffwechsels und selektive Kontrolle des Muskel- und Fettansatzes kann sich ebenfalls positiv auf die Fleischqualität weiterer, hierin aufgeführter Schlachttierarten auswirken. So kann unter Umständen das Fleisch von Tieren, das von einigen Konsumenten aufgrund seiner hohen Festigkeit und Trockenheit grundsätzlich eher gemieden wird, durch eine erhöhte Fetteinlagerungen zarter und somit geschmacklich anregender gestaltet werden.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen Kits in Nutztieren wirkt sich jedoch nicht lediglich auf die Qualität des erzeugten Fleisches aus. In einer weiteren Ausführungsform trägt die Verwendung der Zusammensetzung oder des Kits auch zur Verbesserung der Futtereffizienz bei Nutztieren bei. So verringert ein hormonell gesteuerter, erhöhter Fettansatz in der Muskulatur von Schweinen beispielsweise Energieverluste während der Aufzucht, was eine kostengünstigere Haltung erlaubt. Daher ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen Kits auch in solchen Nutztieren von Interesse, die nicht zwangsläufig als Fleischlieferanten dienen. So optimiert eine erhöhte Futtereffizienz auch die Haltung beispielsweise von Milchkühen oder Schafen als Wolllieferanten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung bzw. das erfindungsgemäße Kit für die Verwendung in einer in vitro Kultur vorgesehen. Die gezielte in vitro Züchtung von Gewebe mit der Maßgabe, Fleisch zum menschlichen Verzehr im industriellen Maßstab synthetisch herzustellen, hat in den letzten Jahren rasante Fortschritte gemacht. Die Erzeugung von in vitro-Fleisch basiert auf den Methoden der Zellkultur, insbesondere auf den Methoden der Gewebezüchtung wie die 3D-Zellkultur und das Tissue Engineering (https://de.wikipedia.org/wiki/ln-vitro-Fleisch). Die Herstellung von derartigem „Laborfleisch“ besitzt das Potential, eine Vielzahl ethischer und ökologischer Probleme, die mit der Massentierhaltung in der Fleischindustrie verbunden sind, zu überwinden. Eine wichtige Herausforderung auf dem Gebiet der in vitro-Fleischzucht besteht darin, synthetisches Fleisch mit hohem ernährungsphysiologischem Wert herzustellen, das zudem geschmacklich überzeugen kann. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen Kits in der in vitro-Kultur kann sich daher auch positiv auf die Qualität und die Zartheit des synthetisch hergestellten Fleischs auswirken.
Die vorliegende Erfindung stellt somit auch ein Verfahren zur Erhöhung des intramuskulären Fettgehalts in Fleisch bereit, bevorzugt von Nutztieren oder von in vitrogezüchtetem Fleisch, Das Verfahren umfasst einen Schritt, bei dem man die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit an das Nutztier oder der Kultur verabreicht.
In einer Ausführungsform wird die Zusammensetzung oder das Kit bzw. mindestens eine der Komponenten des Kits dem Tier systemisch verabreicht, also etwa in die Blutzirkulation injiziert. Bevorzugt ist eine lokale Applikation der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder mindestens einer Komponente des Kits in das Muskel- und/oder Fettgewebe des Tieres.
Optional kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder mindestens eine Komponente davon, etwa Insulin und/oder IGFBP-2, für eine orale Aufnahme durch das Tier in einen geeigneten Träger, beispielsweise einer Kapsel eingearbeitet und dem Tier gemeinsam mit der üblichen Nahrung verabreicht werden. Eine derartige Kapsel ist mit einem magensaftresistenten Überzug, d. h. einer geeigneten Polymerbarriere zur Verhinderung der Auflösung im Magenmilieu, beschichtet. Die magensaftresistente Beschichtung sollte so gewählt werden, dass sie bei niedrigem pH-Wert der Magensäure stabil bleibt, sich aber auflöst, sobald sie in die alkalischere Umgebung des Dünndarms gelangt. Geeignete Überzüge sind z. B. in der Fachwelt bekannt. Die orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits über eine magensaftresistente Kapsel ermöglicht somit eine gezielte Aufnahme der Komponenten in die Blutzirkulation über die Darmwand und kann unnötigen Stress für die Tiere vermeiden. Auch eine intranasale Verabreichung mindestens einer der Komponenten des Kits oder der Zusammensetzung ist möglich.
Die Administration der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Kits kann durch medizinisches Fachpersonal erfolgen. Bevorzugt kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit jedoch durch den Nutztierhalter selbst, d.h. auch in Abwesenheit eines medizinisch geschulten Fachmanns bzw. einer medizinisch geschulten Fachfrau dem Nutztier verabreicht werden.
Für den Fall, dass die Zusammensetzung oder das Kit im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens einer in vitro Kultur verabreicht werden soll, hängt die Art und Weise der Verabreichung von der bereitgestellten Form der einzelne Komponenten ab. Die Verabreichung kann mittels direkter Injektion in die Zellkultur erfolgen, etwa in bereits in vitro generiertes Fleisch. Alternativ kann die Zusammensetzung oder das Kit in das Zellmedium eingebracht werden, um durch die Zelle z.B. mittels Endozytose aufgenommen zu werden. Nukleinsäuren, die für eine oder mehrere Komponenten kodieren, können auch mittels Transfektion in die Zellen eingeschleust werden. Hierzu bieten sich sowohl chemische Transfektionsverfahren wie Lipofektion oder Calcium-Phosphat-Präzipitation oder physikalische Verfahren mit Hilfe von Mikroinjektion oder Elektroporation an. Verfahren zur Einbringungen exogener Proteine oder Nukleinsäuren in Zell- und Gewebskulturen sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. In diesem Fall ist es hilfreich, die Zellen vor oder am Anfang der in vitro-Kultur zu transfizieren, so dass alle Abkömmlinge der transfizierten Zellen die vorteilhaften Nukleinsäuren tragen. Gegenstand der Erfindung ist damit auch eine Zelle, etwa eine Muskel- oder Fettzelle oder eine Vorläuferzelle, etwa eine mesenchymale Stammzelle, die die Nukleinsäure(n) des erfindungsgemäßen Kits umfasst, wobei die Nukleinsäuren in nicht einer Form vorliegen, die in Wildtyp-Zellen dieses Zelltyps vorliegt.
Die Zusammensetzung oder das Kit kann dem Nutztier und/oder der in vitro-Kultur einmalig verbreicht werden. Die Verabreichung kann jedoch auch mehrmals wiederholt werden, z.B. ein Form einer längerfristigen Hormonkur. So kann die Zusammensetzung oder das Kit beispielsweise für eine sich monatlich, wöchentlich oder sogar täglich wiederholende Verabreichung vorgesehen sein.
Die hierin offenbarte Zusammensetzung bzw. das Kit kann auch zu therapeutischen Zwecken in einem Subjekt eingesetzt werden. Folglich kann es sich bei der erfindungsgemäße Zusammensetzung oder dem erfindungsgemäße Kit auch um eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein pharmazeutisches Kit handeln, die bzw. das einem Subjekt zu Therapiezwecken oder zur Prävention einer Erkrankung verabreicht werden kann. Eine derartige erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung oder ein pharmazeutisches Kit kann zusätzlich mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff umfassen.
Im Kontext der Erfindung ist ein Subjekt, das mit der pharmazeutischen Zusammensetzung oder dem pharmazeutischen Kit behandeln werden soll, bevorzugt ein Tier. Das Subjekt kann ein Nutztier sein, wie hierin beschrieben, oder ein Tier, das in Rennen oder für körperliche Arbeit eingesetzt wird, etwa ein Pferd, Kamel, Hund, Rind, Büffel oder Elefant, oder ein Haustier, etwa eine Katze, ein Hund oder ein Kaninchen. Am meisten bevorzugt ist das Subjekt, das mit der pharmazeutischen Zusammensetzung oder dem pharmazeutischen Kit behandelt werden soll, ein Mensch.
In einer Ausführungsform kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße pharmazeutische Kit zur Verwendung bei der Behandlung von Insulinresistenz, bevorzugt schwerer Insulinresistenz vorgesehen sein.
Von einer Insulinresistenz wird gesprochen, wenn insbesondere die Muskulatur, das Fettgewebe und/oder die Leber eines Organismus, z.B. eines Menschen, lediglich vermindert auf das Hormon Insulin anspricht. Dies kann geschehen, wenn der insulinabhängige Glut4 Glucosetransporter in Gegenwart von Insulin nur einen unzureichenden Glucosetransport in das Muskel- und Fettgewebe vermittelt.
In einem gesunden Menschen liegt die physiologische Insulinproduktion, die benötigt wird, um normale Blutzuckerwerte aufrechtzuerhalten, bei ungefähr 20-40 Internationalen Einheiten (I.E.) Insulin pro Tag. Liegt die benötigte Insulinproduktion über mehrere Tage über diesen Werten, so lässt sich von einer Insulinresistenz sprechen. Eine „schwere Insulinresistenz“ wird im Allgemeinen bei einer längerfristigen Ausschüttung von über 200 I.E. Insulin pro Tag angenommen. Eine Insulinresistenz ist mit zahlreichen Erkrankungen verbunden, und deutet auf eine sich entwickelnde Typ-2-Diabetes-mellitus-Erkrankung hin.
Wie beschrieben, bewirkt die simultane Bereitstellung der Komponenten Insulin, IGF-1 und IGFBP-2 durch die hierin offenbarte Zusammensetzung bzw. das Kit eine erhöhte Wirksamkeit des Insulins. Die so verbesserte Insulinwirksamkeit kann ausreichen, um eine Insulinresistenz in einem Subjekt zu überwinden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Kit kann, ähnlich wie bei eine Insulintherapie, mit Hilfe eines Pens, einer Spritze oder einer Insulinpumpe subkutan in das Unterhaut-Fettgewebe, aber auch intramuskulär oder intravenös verabreicht werden.
Bevorzugt kann die Verabreichung durch einen unter Insulinresistenz leidenden Patienten selbst vorgenommen werden. Alternativ kann die Verabreichung jedoch auch durch geschultes Fachpersonal oder einen Arzt erfolgen. Da die Zusammensetzung bzw. das Kit, wie hierin beschrieben, die Aktivität des AKT-Kinasesignalwegs verstärkt, kann deren/dessen Verwendung das Risiko einer malignen Erkrankung erhöhen. Aus diesem Grund sollte die regelmäßige Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Kits zur Behandlung von Insulinresistenz bevorzugt nur bei Vorliegen einer besonders schweren Insulinresistenz erfolgen, also wenn die erforderliche Insulinproduktion dauerhaft, zumindest jedoch kontinuierlich über mehrere Tage hinweg bei über 200 I.E. Insulin pro Tag liegt. Unter Umständen kann die Gefahr von AKT-induzierter Tumorbildung verringert werden, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung bzw. das erfindungsgemäße pharmazeutische Kit ferner einen mTOR-Inhibitor wie Metformin umfasst. Metformin steigert zudem selbst die Insulinsensitivität und kann die Glucose-Neubildung der Leber hemmen. Insbesondere in Kombination mit derartigen geeigneten mTOR-Inhibitoren kann eine Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Kits bei der Behandlung auch von weniger schwerwiegenden Formen von Insulinresistenz vorteilhaft sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist damit auch ein Verabreichungsmittel, wie ein Pen, eine Spritze oder eine Insulinpumpe, welches die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit umfasst. Insbesondere Im Falle eines Kits kann auch eine Mehrkammernspritze verwendet werden. Dies kann auch sinnvoll sein, wenn die Zusammensetzung lyophilisiert ist, wobei eine weitere Kammer dann üblicherweise Wasser zur Injektion (optional auch einen Puffer) umfasst.
Da die pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Kit in erhöhtem Maße die Glucoseaufnahme durch Muskel- und Fettzellen anregt und die anabole Aktivität des AKT-Kinasesignalwegs stimuliert, eignet sie sich auch zur Verwendung bei der Behandlung von Muskelschwäche, insbesondere bei Muskeldystrophie.
Muskeldystrophie bezeichnet eine besondere Gruppe erblicher Muskelerkrankungen, die mit einer Muskelschwäche und/oder Muskelschwund verbunden sind. Alle Muskeldystrophien sind durch fortschreitende (progressive) Degeneration der Muskulatur, einhergehend mit Umbauprozessen, gekennzeichnet. Die einzelnen Muskeldystrophien unterscheiden sich hinsichtlich der Art des Erbgangs, der hauptsächlich betroffenen Körperregionen, des Erkrankungsalters und des Verlaufs. Eine Auswahl der Muskeldystrophien, die mit Hilfe der hierin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. des pharmazeutischen Kits behandeln werden können, umfasst Muskeldystrophie Duchenne, Muskeldystrophie Becker-Kiener, Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie Typ 1-5, Skapuloperoneale Muskeldystrophie, Reducing body myopathy (RBM), LGMD1A-E, LGMD2A-Q, Kongenitaler Merosinmangel, Kongenitale Myopathie mit Integrin-alpha-7-Mangel, Kongenitale Muskeldystrophie 1C, Kongenitale Muskeldystrophie Typ Fukuyama, Walker-Warburg-Syndrom, Muskel-Auge-Gehirn-Krankheit, Rigid-Spine-Syndrom, Ullrich-Myopathie, Bethlem-Myopathie, Bethlem-Myopathie, Distale Muskeldystrophien, Myofibrilläre Myopathie Typ 1-6, Myotone Dystrophie Typ 1/2, Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie und Skapuloperoneale Muskeldystrophie oder andere degenerative Erkrankungen wie die amyotrophe Lateralsklerose.
Die aktuelle Entwicklung beispielsweise von RNA-basierten Hormon-Therapie-Ansätzen bei Muskelschwäche und/oder -verletzungen sieht aktuell lediglich die Verabreichung von IGF-1 vor. Durch die hierin beschriebene Kombination des IGF-1 mit IGFBP-2 und Insulin kann die zelluläre Antwort erheblich gesteigert werden. Aufgrund der höheren Wirkung können niedrigere IGF-1 Dosen verwendet werden als bei den reinen IGF-1-Präparaten, wodurch die Gefahr einer Malignität (z.B. durch systemische Effekte des IGF-1) minimiert wird.
Aufgrund der wachstumsfördernden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des Kits ist auch deren/dessen Verwendung zur Therapie von Wachstumsstörungen, d.h., eine von der Norm abweichende Körperlänge bei Kindern und Jugendlichen denkbar. So kann durch eine regelmäßige Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen Kits in betroffenen Subjekten einer Hyposomie (Kleinwuchs) entgegengewirkt werden.
Zudem eignet sich die hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Kit zur Verwendung bei der Behandlung einer Verletzung eines Muskels, Bandes und/oder einer Sehne eines Subjekts, bevorzugt eines Muskels.
Wie oben beschrieben, ist das Subjekt bevorzugt ein Tier. Das Subjekt kann z.B. ein Mensch sein, z.B. ein professioneller Sportler oder ambitionierter Amateursportler, für den eine möglichst kurze Regenerationszeit nach einer Muskel-, Bänder-, oder Sehnenverletzung vorteilhaft ist. Gleichsam kann das Subjekt auch ein Pferd, ein Kamel, ein Hund oder ein Raubvogel sein, also ein Tier, dass beispielsweise bei sportlichen Wettkämpfen eingesetzt wird und einem erhöhten Risiko unterliegt, eine Verletzung der Muskeln, Bänder oder Sehnen zu erleiden. Die Verletzung kann akut sein, d.h. eine plötzlich und heftige Verletzung, die das betroffene Subjekt in seiner Leistungsfähigkeit einschränkt. Bei der Verletzung kann es sich alternativ auch um eine chronische Verletzung handeln, also eine Verletzung, deren Ursprung beispielsweise längere Zeit zurückliegt und die nie vollständig ausgeheilt ist, oder deren Zustand sich zunehmend verschlechtert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verletzung eine akute Verletzung. Die Muskelverletzung kann beispielsweise eine Muskelzerrung, ein Muskelfaserriss, ein Muskelriss, eine Prellung oder eine Schnittwunde sein. Eine Bänder- bzw. Sehnenverletzung umfasst einen Sehnen- oder Bänderriss oder eine Dehnung. Bevorzugt ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Kit für die Verwendung bei der Behandlung einer Muskelverletzung vorgesehen.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung die hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Kit auch zur Verwendung bei der Erhaltung und Regeneration von neuronalen Funktionen bereit. Bei den neuronalen Funktionen kann es sich sowohl um Funktionen zentraler als auch peripherer Nervenzellen handeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung oder das erfindungsgemäße Kit auch zur Behandlung und/ oder Prävention einer Neuropathie verwendet werden. So deuten wissenschaftliche Studien darauf hin, dass eine Insulinresistenz zur Pathophysiologie und den klinischen Symptomen diverser neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer (Watson et al., 2003) oder Parkinson (Hong et al., 2020) beitragen kann. Die Zusammensetzung bzw. das Kit der Erfindung kann zudem zur Prävention von Nervenschädigungen beitragen, die auf hohe Blutzuckerwerte zurückzuführen sind, wie dies z.B. bei einer diabetischen Neuropathie der Fall ist.
Unabhängig von der konkreten medizinischen Indikation kann die hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung oder das pharmazeutische Kit einem Subjekt entweder systemisch oder lokal verabreicht werden. Eine systemische Applikation kann beispielsweise bei der Behandlung eine Insulinresistenz sinnvoll sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung oder das pharmazeutische Kit jedoch bei der Behandlung und/oder Prävention der hierin beschriebenen Erkrankungen und/oder Verletzungen lokal appliziert. Sofern die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder das Kit zur Behandlung einer Muskelverletzung verwendet werden soll, ist eine lokale Applikation der Zusammensetzung oder des Kits direkt in den verletzten Muskeln vorteilhaft. Auch bei der Behandlung einer Muskeldystrophie, einer neuronalen Funktionsstörung oder Neuropathie ist eine lokale Applikation der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des Kits bevorzugt, um das Risiko der Entstehung maligner Erkrankungen zu minimieren.
Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des pharmazeutischen Kits zur Behandlung eines der hierin beschriebenen medizinischen Zustände kann einmalig erfolgen. In alternativen Ausführungsformen kann eine mehrmalige Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des pharmazeutischen Kits notwendig sein, um eine Verbesserung des zu behandelnden medizinischen Zustands zu erwirken. So kann es erforderlich sein, dass die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Kit dem Subjekt mindestens 2 Mal, mindestens 3 Mal, mindestens 4 Mal, mindestens 5 Mal, mindestens 10 Mal, mindestens 50 Mal oder mindestens 100 Mal verabreicht werden muss, bevor eine Verbesserung seines Zustands eintritt. In manchen Ausführungsformen muss die Verabreichung regelmäßig erfolgen, solange der Zustand des Subjektes vorliegt, unter Umständen auch ein Leben lang. Die Behandlung des Subjekts mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. dem pharmazeutischen Kit kann ferner begleitend mit anderen Therapieansätzen verbunden werden oder, insbesondere im Fall von Verletzungen an Muskeln oder dem Halteapparat, zur Unterstützung verschiedenster Rehabilitationsmaßnahmen eingesetzt werden.
Zusammenfassend lehrt die vorliegende Erfindung einen vollkommen neuartigen Ansatz zur gezielten Beeinflussung des Energiestoffwechsels in Muskel- und Fettgewebe von Tieren und Menschen. Die hierin offenbarten Zusammensetzungen und Kits stellen eine Kombination aus Insulin, IGF-1 und IGFBP-2 bereit, mit Hilfe derer die Insulinwirksamkeit und somit die Glucoseaufnahme gewebespezifisch gesteuert werden kann. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Kits ermöglicht somit eine Steigerung des intramuskulären Fettgehalts. Der gezielte Fettansatz kann die Qualität von Fleisch und die Futtereffizienz von Nutztieren erhöhen. Zudem wird eine vergrößerte Energiespeicherkapazität des Muskelgewebes erreicht, die das Regenerationspotential der Muskulatur erhöht. Die durch die Zusammensetzungen und Kits vermittelte Aktivierung des AKT-Signalwegs fördert ferner das Zellwachstum.
Im Rahmen der Erfindung ist der Begriff „ungefähr“ im Sinne von „+/- 10 %“ zu verstehen. Bezieht sich der Begriff „ungefähr“ auf einen Bereich, so bezieht er sich sowohl auf die untere als auch auf die obere Grenze des Bereichs. „Ein“ bedeutet „ein oder mehrere“, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben. Sämtliche hier zitierte Literatur wird hiermit vollständig einbezogen.
Literatur

Li et al. (2017) PTEN, Insulin Resistance and Cancer. Curr Pharm Des. 23(25), 3667-3676. Watson et al. (2003) The role of insulin resistance in the pathogenesis of Alzheimer's disease: implications for treatment. CNS Drugs 17(1), 27-45.
Hong et al. (2020) Insulin Resistance Promotes Parkinson's Disease through Aberrant Expression of α-Synuclein, Mitochondrial Dysfunction, and Deregulation of the Polo-Like Kinase 2 Signaling. Cells 9(3).
https://www. landwi rtschaft. de/landwi rtschaft-verstehen/haetten-si es-gewusst/i nfog rafi ken Shen et al. (2012) Insulin-like growth factor (IGF) binding protein 2 functions coordinately with receptor protein tyrosine phosphatase β and the IGF-I receptor to regulate IGF-I-stimulated signaling. Mol. Cell. Biol. 32, 4116-4130.
Shen et al. (2015) The Coordinate Cellular Response to Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I) and Insulin-like Growth Factor-binding Protein-2 (IGFBP-2) Is Regulated through Vimentin Binding to Receptor Tyrosine Phosphatase β (RPTPβ). J Biol Chem. 290, 11578-11590.
Connolly et al. (2020) Changes in the blood metabolome of Wagyu crossbred steers with time in the feedlot and relationships with marbling. Scientific reports 10, 18987.
https://de.wikipedia.org/wiki/Nutztier
https://de.wikipedia.org/wiki/ln-vitro-Fleisch

Claims

Eine Zusammensetzung oder ein Kit, welches IGF-1, Insulin und IGFBP-2 bereitstellt, wobei (a) das IGF1, Insulin und/oder IGFBP-2 als Protein vorliegt, oder (b) mindestens eine Nukleinsäure vorliegt, welche für IGF-1, Insulin und/oder IGFBP-2 kodiert.
Zusammensetzung oder Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein pharmazeutisches Kit handelt.
Zusammensetzung oder Kit nach einem der Ansprüche 1-2, wobei mindestens eine Komponente als Protein vorliegt, wobei bevorzugt IGF-1, Insulin und IGFBP-2 als Protein vorliegen.
Zusammensetzung oder Kit nach einem der Ansprüche 1-3, wobei mindestens eine Nukleinsäure vorliegt, welche für IGF-1, Insulin und/oder IGFBP-2 kodiert, wobei bevorzugt IGF-1, Insulin und IGFB-2 durch mindestens eine Nukleinsäure kodiert werden.
Zusammensetzung oder Kit nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Nukleinsäure RNA ist.
Verwendung der Zusammensetzung oder des Kits nach einem der Ansprüche 1-5 zur Erhöhung des intramuskulären Fettgehalts in Fleisch, bevorzugt von Nutztieren, optional von Bovinen, oder in in vitro-Kultur.
Verwendung der Zusammensetzung oder des Kits nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verbesserung der Futtereffizienz bei Nutztieren.
Verfahren zur Erhöhung des intramuskulären Fettgehalts in Fleisch, bevorzugt von Nutztieren oder in vitro, einen Schritt umfassend, bei dem man die Zusammensetzung oder das Kit nach einem der Ansprüche 1-5 dem Nutztier oder der in vitro-Kultur verabreicht.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder pharmazeutisches Kit nach einem der Ansprüche 2-5 zur Verwendung bei der Behandlung von Insulinresistenz, bevorzugt schwerer Insulinresistenz.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder pharmazeutisches Kit nach einem der Ansprüche 2-5 zur Verwendung bei der Behandlung einer Muskelschwäche, bevorzugt einer Muskeldystrophie ausgewählt aus der Gruppe umfassend Muskeldystrophie Duchenne, Muskeldystrophie Becker-Kiener, Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie Typ 1-5, Skapuloperoneale Muskeldystrophie, Reducing body myopathy (RBM), LGMD1A-E, LGMD2A-Q, Kongenitaler Merosinmangel, Kongenitale Myopathie mit Integrin-alpha-7-Mangel, Kongenitale Muskeldystrophie 1C, Kongenitale Muskeldystrophie Typ Fukuyama, Walker-Warburg-Syndrom, Muskel-Auge-Gehirn-Krankheit, Rigid-Spine-Syndrom, Ullrich-Myopathie, Bethlem-Myopathie, Distale Muskeldystrophien, Myofibrilläre Myopathie Typ 1-6, Myotone Dystrophie Typ 1/2, Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie und Skapuloperoneale Muskeldystro-phie oder andere degenerative Erkrankungen wie die amyotrophe Lateralsklerose.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder pharmazeutisches Kit nach einem der Ansprüche 2-5 zur Verwendung bei der Erhaltung und Regeneration von neuronalen Funktionen, bevorzugt zur Behandlung und/oder Prävention einer Neuropathie, optional einer diabetischen Neuropathie.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder pharmazeutisches Kit nach einem der Ansprüche 2-5 zur Verwendung bei der Behandlung einer Verletzung eines Muskels, Bandes und/oder einer Sehne eines Subjekts, bevorzugt eines Muskels.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder pharmazeutisches Kit nach einem der Ansprüche 2-5 zur lokalen Verabreichung, optional zur Verwendung nach einem der Ansprüche 10-12.