DE60122211T2

DE60122211T2 - Genregulationstherapie mit ferritin

Info

Publication number: DE60122211T2
Application number: DE60122211T
Authority: DE
Inventors: Robert H. Oklahoma City Broyles; Robert A. Oklahoma City Floyd
Original assignee: Broyles Robert H Oklahoma; Floyd Robert A Oklahoma
Current assignee: Broyles Robert H Oklahoma; Floyd Robert A Oklahoma
Priority date: 2000-11-01
Filing date: 2001-11-01
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2021-11-02
Also published as: AU2002217964B2; PT1354032E; WO2002036634A2; DE60122211D1; ATE335811T1; CA2427629A1; ES2269506T3; US20020128183A1; EP1354032A2; US20040186048A1; WO2002036634A3; AU1796402A; EP1354032B1; US7517669B2; JP2005512941A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Genregulationstherapie, welche Ferritin einschließt. Spezifischer betrifft die Erfindung die Verwendung von Ferritin-H und Derivatproteinen davon für die Regulation von Genen, die den Eisenmetabolismus und Regulation betreffen.
1. Grundlagen der Sichelzellenkrankheit
Hämatopoese oder die Bildung von Blutzellen beginnt in dem sich entwickelnden menschlichen Embryo als Anhäufung von Stammzellen, genannt Blutinseln. Diese Zellen erscheinen in dem Dottersack in etwa der dritten Woche der Entwicklung, und sie wandern etwa im dritten Monat zu der sich entwickelnden Leber, welche der Hauptort für die Blutzellenbildung wird. Obwohl die Milz, Lymphknoten und Knochenmark alle kleine Beiträge für die Blutzellenentwicklung bringen, wird das Knochenmark nicht vor dem vierten Monat der Hauptort für Hämatopoese. Bei der Geburt entstehen fast alle Blutzellen aus dem Knochenmark. Obwohl kleine Foci der Blutbildenden Zellen manchmal in der Leber für längere Zeitdauern bestehen bleiben, ist die hepatische Blutzellenbildung auf einen Bruchteil gesunken. Zu diesem Zeitpunkt besteht das gesamte Mark aus aktiv sich bildenden Blutzellen und fährt damit bis nach der Pubertät fort, wenn in einem Alter von etwa 18 Jahren die Hauptorte für die Blutzellenbildung das Mark der Wirbel, der Rippen, des Sternums, des Schädels, des Beckens und die proximalen Epiphysealregionen des Femurs und Humerus werden. Diese Gebiete repräsentieren nur etwa die Hälfte des verfügbaren Marks. Die Höhlen, welche verbleiben, sind mit gelblichen Fett-Geweben gefüllt.
In Erwachsenen schließt die Hämatopoese das Knochenmark, die Lymphknoten und die Milz ein. Diese Organe und assoziierte Gewebe sind traditionell unterteilt in myeloide und lymphoide Gewebetypen. Myeloide Gewebe und aus dem Myeloidgewebe abgeleitete Zellen schließen die Erythrozyten, Blutplättchen, Granulozyten und Monozyten ein. Lymphoide und Lymphoidabgeleitete Gewebe schließen den Thymus, Lymphknoten und die Milz ein. Die myeloide/lymphoide Unterteilung ist ein bisschen künstlich, da von diesen beiden Gewebetypen angenommen wird, dass sie aus einer einzelnen pluri-potenten Stammzelle entstanden sind.
Lymphoide und myeloide Stammzellen, welche aus der Unterteilung der pluri-potenten Zelle gebildet wurden, sind Vorstufen für alle nachfolgenden Zelltypen. Die festgelegten Zelltypen für die lymphoide Stammelle schließen die Pro-T-Zellen ein, welche die reifen T-Zellen bilden, und die Pro-B-Zellen, welche in Plasmazellen differenzieren. Zwischenzelltypen können aufgrund des Zelloberflächenphänomens, wie die Expression schwerer und leichter Kette von Immunglobulin, Ia-Protein und anderen Zelloberflächenmarkern unterschieden werden. Die drei Zelltypen für die Myeloidstammzelle schließen E/Mega-Zellen ein, welche in die Erythrozyt-Ausbruchs-bildende Einheit („erythrocyte-burst forming unit") (BFU-E) differenzieren, gefolgt von den Erythrozyt-Kolonie-bildenden Einheitszellen („erythrocyte-colony forming unit cells") (CFU-E) und Megakaryozyt-CFU-Zellen (CFU-Mega), Granulozyten/Makrophagen-CFU-Zellen (CFU-G/M), welche zu CFU-G- und CFU-M-Zellen differenzieren, und den eosinophilen CFU-Zellen (CFU-Eo), welche letztlich die reifen Eosinophilen bilden. Obwohl diese Zelltypen hauptsächlich im Mark anwesend sind, zirkulieren einige in dem Blutstrom durch den Körper.
Das relative Größenverhältnis der Zelltypen im Knochenmark hat ein Myeloid/Erythroid-Verhältnis von etwa 3:1, wobei etwa 60 % Granulozyten und ihre Vorläufer, etwa 10 % Lymphozyten und ihre Vorläufer, etwa 20 % Erythrozyten und ihre Vorläufer und etwa 10 % nicht-identifzierte Zellen umfasst sind. Die vorhenschenden Myoloidzelltypen in der Markhülle sind die Myelozyten, Metamyelozyten und Granulozyten. Die vorhenschenden Zelltypen in dem Erythroidkompartiment sind die polychromatophilen und orthochromen Normoblasten. Unter Bedingungen des normalen Eisenmetabolismus, enthalten etwa 30 % bis 40 % der Normoblasten verstreute Ferritin-Granulate. Diese Zellen werden als Sideroblasten bezeichnet, und die Eisengranula, die sie enthalten, sind Reservoirs aus denen geschöpft wird, wenn die Zellen Eisen in Protoporphyrin einfügen, um Häm zu bilden. Die Herstellung von Häm und die Herstellung von Globin sind präzise in der Zelle ausgeglichen. Wenn eines von beiden behindert oder unterdrückt wird, aus welchem Grund auch immer, akkumuliert der Überschuss an Ferritin in den Sideroblasten. Diese erhöhte Eisenakkumulation kann in den Mitochondrien sichtbar gemacht werden, den Orten der Hämsynthese.
Die Hauptfunktion von roten Blutzellen ist der Transport von Sauerstoff in Gewebe des Körpers. Neben-Funktionen schließen den Transport von Nährstoffen, interzellulären Botschaften und Zytokinen und die Absorption zellulärer Metabolite ein. Anämie, oder ein Verlust an roten Blutzellen oder roter Blutzellkapazität, kann in grober Weise als eine Reduktion der Fähigkeit des Blutes, Sauerstoff zu transportieren, definiert sein und kann akut oder chronisch sein.
Chronischer Blutverlust kann durch extrinsische rote Blutzellanormalitäten, intrinsische Anormalitäten oder beeinträchtigte Herstellung von roten Blutzellen verursacht werden. Extrinsische oder extrakorpuskuläre Anormalitäten schließen Antikörper-vermittelte Funktionsstörungen, wie Transfusionsreaktionen und Erythroblastosis, mechanisches Trauma bezüglich roter Zellen, wie mikroangiopathische hämolytische Anämien, thrombotische thrombozytopenische Purpura und verstreute intravaskuläre Koagulation ein. Zusätzlich können Infektionen durch Parasiten, wie Plasmodium, chemische Verletzungen durch zum Beispiel Bleivergiftung und Absonderung in dem mononukleären System, wie durch Hypersplenismus, rote Blutzellenfunktionsstörungen bewirken.
Hämoglobin umfasst vier Proteinketten, zwei Alphaketten und zwei Betaketten (α₂ β₂), verflochten miteinander, jedes mit seinem eigenen Eisenmolekül und mit einem kombinierten Molekulargewicht von etwa 68 kD. Das Hämoglobinmakromolekül wird normalerweise glykosyliert und nach Aufnahme von Sauerstoff aus den Lungen in Oxihämoglobin (HbO₂) umgewandelt. Es gibt mindestens sechs eindeutige Formen von Hämoglobin, jede wird zu unterschiedlichen Zeiten während der Entwicklung exprimiert. Im Embryo werden mindestens drei Formen von Hämoglobin gefunden, Hb-Gower 1 (ξ₂ ε₂), Hb-Gower 2 (α₂ ε₂) und Hb-Portand (ξ₂ γ₂). Das Hämoglobin in dem Fötus umfasst nahezu das gesamte HbF (α₂ γ₂), wobei Hämoglobin im Erwachsenen etwa 96 % HbA (α₂ β₂), etwa 3 % HbA₂ (α₂ δ₂) und etwa 1 % fötales HbF (α₂ γ₂) enthält. Die embryonale Umschaltung der Globinexpression von ξ- nach α- und von ε- nach γ- beginnt in dem Dottersack. Jedoch wurden embryonale ξ- und ε- Ketten in der fötalen Leber gefunden, und bis zur späten fötalen Entwicklung tritt kein kompletter Übergang zu der fötalen Form auf. Der fötale Übergang von γ- nach β- beginnt später in der Erythropoese mit der Menge an β-Globin, das während des Reifeprozesses erhöht hergestellt wird. Bei der Geburt macht β-Globin etwa 40 % der nicht-α-Globinkettensynthese aus und nimmt weiterhin rasch zu.
Defekte oder Mutationen in der Globinkettenexpression sind gewöhnlich. Manche dieser genetischen Mutationen stellen keine Beeinträchtigung dar oder nur geringe Konsequenzen für die Person, jedoch verhindern die meisten Mutationen die Bildung eines intakten oder normalen Hämoglobinmoleküls durch eine funktionelle oder strukturelle Unfähigkeit, effektiv Eisen zu binden, eine Unfähigkeit der Ketten oder Kettenpaare, effektiv oder genau zu interagieren, eine Unfähigkeit des Moleküls, Sauerstoff zu absorbieren oder frei zulassen, ein Defekt, um ausreichende Mengen einer oder mehrerer Globinketten zu exprimieren, oder eine Kombination dieser Fehlfunktionen. Zum Beispiel stellen Austausche von Valin durch Glutaminsäure an der 6. Position der β-Kette HbS her, und es wurde gezeigt, dass diese in etwa 30 % der schwarzen Amerikaner auftauchen. In dem HbS-Heterozygoten sind nur etwa 40 % des Gesamthämoglobins HbS, wobei der Rest das normalere HbA ist.
Nach der Deoxygenierung durchlaufen die HbS-Moleküle Aggregation und Polymerisierung, was letztendlich zu einer morphologischen Verformung der roten Zellen führt, welche eine Sichel- oder Stechpalmenblattform erhalten. Die Sichelverformung hat zwei Hauptkonsequenzen, eine chronische hämolytische Anämie und eine Einschließung von kleinen Blutgefäßen, was in einem ischämischen Gewebeschaden resultiert. Zudem formt die Polymerisierung bei einer Exposition gegenüber niedriger Sauerstoffspannungen das HbS-Hämoglobin von einer frei fließenden Flüssigkeit zu einem viskosen Gel um. Somit kann das Ausmaß der Pathologie assoziiert mit der Sichelzellenanämie mit der relativen Menge an HbS im System des Patienten korreliert werden.
Individuen mit schwerer Sichelzellenanämie entwickeln keine Symptome bis etwa fünf bis sechs Monate nach der Geburt. In diesen Kindern wurde bestimmt, dass das fötale Hämoglobin nicht mit HbS interagiert und, solange ausreichende Mengen vorhanden waren, die Auswirkungen der HbS-Krankheit modulieren konnten. Dieser modulierte Effekt von γ-Globin wird auch bei anderen β-Globinfunktionsstörungen, wie HbC und HbD, und anderen Mutationen der β-Kette beobachtet. HbS-Polymerisierung wird auch signifikant durch die Hämoglobinkonzentration der Zelle beeinflusst. Je höher die HbS-Konzentration, desto größer sind die Chancen für einen Kontakt zwischen zwei oder mehreren HbS-Molekülen. Dehydrierung erhöht die Hämoglobinkonzentration und fördert sehr die Sichelverformung.
Teilweise ist die Sichelverformung ein reversibles Phänomen. Bei erhöhten Sauerstoffspannungen depolymerisieren Sichelzellen. Dieser Prozess der Polymerisierung-Depolymerisierung ist sehr schädlich für rote Zellmembranen und führt evtl. zu irreversiblen Sichelzellen (ISC), welche ihre anormale Form sogar bei voller Oxigenierung behalten. Die Durchschnitts ISC überlebt verglichen mit der normalen 120 Tage Lebensspanne für etwa 20 Tage in dem Körper. Individuen mit HbS-Syndromen haben häufig Infektionen, chronische Hämolyse mit einer auffälligen Retikoluzytosis und Hyperbilirubinemie. Der Ablauf der Krankheit ist typischerweise punktiert mit einer Vielzahl von schmerzhaften Krisen, genannt vaso-okklusive Krisen. Diese Krisen repräsentieren Abschnitte von hypoxischer Verletzung und Infarkt in den Organen, Abdomen, Brust, Extremitäten oder Gelenken. Beingeschwüre sind eine zusätzliche Manifestation für die vaso-okklusive Tendenz dieser Krankheit. Die zentrale Nervensystembeteiligung ist normal, wodurch Krämpfe und sogar Schlaganfälle verursacht werden. Aplastische Krisen, welche auch normal sind, repräsentieren eine befristete Einstellung der Knochenmarksaktivität und können durch Infektionen, Folsäuredefizienz oder beides ausgelöst werden. Krisen sind episodisch und reversibel, können aber fatal sein. Der Schaden von Krisenabschnitten tendiert dazu, kumulativ zu sein, und selbst in solchen Individuen mit milderen Formen der Sichelzellenfunktionsstörungen können die Lebensspannen sehr reduziert sein. Bei Abwesenheit eines alternativen Eingriffs sterben die Patienten typischerweise, bevor sie 30 Jahre alt werden.
Für Anti-Gelierverbindungen, schließen klofibrische Säure (ClC₆H₅OC(CH₃)₂COOH), P-Chlorphenoxyessigsäure (ClC₆H_SOCH₂COOH) und Phenoxyessigsäure (C₆H₅OCH₂COOH) ein, ist gezeigt worden, dass sie prophylaktisch Polymerisierung in künstlichen deoxygenierten Blut inhibieren. Es wurde spekuliert, dass diese Verbindungen nützlich in einer begrenzten Hinsicht sein können, um Blutzellensichelverformung in der Sichelzellenkrankheit zu verhindern. Solche Behandlungen können die Frequenz der symptomatischen Abschnitte potenziell senken, welche durch vaso-okklusive Krisen verursacht werden, wenn genug von der Chemikalie verabreicht werden kann, um das gesamte Hämoglobin in dem Körper zu binden.
Die Thalassämiesyndrome sind eine heterogene Gruppe von Funktionsstörungen, welche alle durch ein Fehlen oder eine verringerte Synthese der Globinketten von HbA charakterisiert sind. Defizienzen der β-Globinexpression werden als β-Thalassämien bezeichnet und Defizienzen des α-Globins als α-Thalassämien bezeichnet. Die hämolytischen Konsequenzen der defizienten Globinkettensynthese resultieren aus verringerter Synthese einer Kette und auch einem Überschuss der komplementären Kette. Freie Ketten tendieren zum Ansammeln in unlöslichen Eischluß-Körpern in den Erythrozyten, was die verfrühte Zerstörung der reifenden Erythrozyten und ihrer Vorläufer, ineffektive Retropoese und die Hämolyse von reifen roten Blutzellen verursacht. Die zugrunde liegenden Defekte der Hämoglobinsynthese wurden über die Jahre ermittelt und liegen weitgehend in den Nukleinsäuresequenzen, welche exprimieren oder die Expression des α- oder β-Globinproteins kontrollieren.
Säugetierglobingenexpression wird während der Entwicklung stark reguliert. Die Basisstruktur der α- und β-Globingene sind ähnlich, wie die grundlegenden Schritte in der Synthese des α- und β-Globins. Es gibt mindestens fünf humane α-Globingene, welche auf dem Chromosom 16 lokalisiert sind, welche zwei α-Globingene des Erwachsenen a 141 Aminosäuren einschließen, die für identische Polypeptide kodieren und sich nur in ihren 3'-untranslatierten Bereichen unterscheiden, ein embryonales α-Gen Z(ζ) und mindestens zwei Pseudo-α-Gene, psi zeta (ΨZ) und omega alpha (ωα).
Der humane α-Globingencluster schließt ein embryonales Gen, epsilon (ε), zwei Betaglobingene des Erwachsenen, beta (β) und delta (δ), zwei fötale Betaglobingene G-Gamma (G-γ) und A-Gamma (A-γ.), welche sich nur in einer Aminosäure unterscheiden, und mindestens ein Pseudo-Betagen, psi-beta (Ψβ), ein. Alle werden von einem einzelnen 43 Kilobasensegment auf dem menschlichen Chromosom 11 exprimiert. Fötales β-Typ Globin oder γ-Globin werden in den frühesten Phasen der Säugetierentwicklung exprimiert und dauern bis etwas 32 bis 34 Wochen des Reifeprozesses an. In dieser Phase beginnen die Formen des β-Goobins des Erwachsenen exprimiert zu werden und ersetzen die fötalen Proteine. Studien, die die klinischen hämatologischen Ergebnisse mit den Orten der verschiedenen Mutationen, die dem Wechsel entsprechen, korrelieren, zeigen an, dass ein Bereich, der stromaufwärts des 5'-Endes des δ-Gens lokalisiert ist, in die cis-Unterdrückung der γ-Genexpression in Erwachsenen eingeschlossen sein kann. Die Anregung für diesen Wechsel vom fötalen zum Protein des Erwachsenen ist unbekannt.
Jedes β-Globingen umfasst drei Exons, welche für etwa 146 Aminosäuren kodieren, zwei Introns und einen 5' untranslatierten Bereich, der die Promotorsequenzen enthält und einen 3' untranslatierten Bereich. Die Biosynthese des β-Globins beginnt mit der Transkription des gesamten Gens, gefolgt von der RNA-Prozessierung der Botschaft, Entfernung der Introns durch Splicen, PolyA-Anhang, Versehen mit einer Kappe und posttranskriptionelle Modifikationen. Das reife mRNA-Molekül wird aus dem Nukleus herausgeführt und in β-Golbin translatiert. Für Defekte in jeder dieser Funktionen wurde gezeigt, dass sie spezifisch mit Thalassämien assoziiert sind. Identifizierte Mutationen schließen Einzelnukleotiddeletionen, Insertionen und Austausche, Leserastermutationen, Deletionen von gesamten Segmenten für kodierende oder kontrollierende Bereiche, ungeeignete Terminationssignale, abweichende Splicesignale und vielfache Mutationen ein. β°-Thalassämien werden durch eine komplette Abwesenheit jeglicher β-Globinketten charakterisiert; β⁺-Thalassämien werden durch eine nachweisbare Anwesenheit einer verringerten Menge an β-Ketten charakterisiert.
Es gibt drei prinzipielle Kategorien für β-Thalassämie, Haupt-Thalassämie, Zwischen-Thalassämie und geringe Thalassämie. Patienten mit geringer Thalassämie können komplett asymptomatisch sein und sind genotypisch β⁺/β oder β°/β. Obwohl rote Zellanormalitäten nachgewiesen werden können, sind die Symptome milde. Zwischen-Thalassämiepatienten sind oft genotypisch β⁺/β⁺ oder β°/β und zeigen schwere Symptome, welche durch seltene Bluttransfusionen gemildert werden können. Im Gegensatz dazu sind Haupt-Thalassämiepatienten genotypisch β°/β°, β°/β⁺ oder β⁺/β⁺ und benötigen regelmäßige und häufige Transfusionen. Kinder erleiden schwere Wachstumsverzögerung und sterben in einem frühen Alter aufgrund der tiefgreifender Effekte der Anämie. Solche, die länger überleben, erleiden morphologische Veränderungen. Das Gesicht wird entstellt aufgrund der Ausdehnung des Knochenmarks in den Knochen des Schädels, Hepatusplenomegalie folgt, es gibt eine verspätete Entwicklung der endokrinen Organe, einschließlich der sexuellen Organe, und eine fortschreitenden Eisenüberladung mit sekundärer Hämochromatose.
Es gibt zwei direkte Konsequenzen der β-Thalassämie. Zum ersten gibt es eine inadequate Bildung von HbA und deshalb eine beeinträchtigte Fähigkeit, um Sauerstoff zu transportieren. Es gibt auch vielfache Effekte, die einem Ungleichgewicht zwischen α- und β-Kettensynthese zuschreibbar sind. Überraschenderweise scheinen die pathologischen Konsequenzen des Globinkettenungleichgewichts schwerer zu sein. Freie α-Ketten bilden unstabile Aggregate, die in den roten Vorläufer-Zellformen in der Form von unlöslichen Einschlusskörpern ausfallen. Diese Einschlüsse schaden den Zellmembranen, was in einem Verlust von Kalium resultiert. Der akkumulative Effekt dieser Einschlüsse hinsichtlich der roten Blutzellen ist eine ineffektive Erythropoese. Geschätzte 70 % bis 85 % der Normoblasten in dem Mark sind eventuell zerstört. Solche, die der sofortigen Zerstörung entkommen, besitzen ein erhöhtes Risiko für die Eliminierung durch die Milz, wo Makrophagen anormale Zellen entfernen. Zudem leitet Hämolyse eine erhöhte Expression von Erythropoetin ein, was die Populationen der Erythroidvorläuferformen in dem Knochenmark ausdehnt und zu Skelettanormalitäten führt. Eine andere schwere Komplikation der β-Thalassämie ist, dass Patienten dazu neigen, eine erhöhte Fähigkeit zu haben, Eisen aus der Nahrung zu absorbieren. Da die meisten Behandlungen für Thalassämie vielfache Transfusionen der roten Blutzellen einschließen, haben Patienten oft einen schweren Zustand von Eisenüberladung, was alle Organe und insbesondere die Leber schädigt. Um die Menge des Eisens in ihrem System zu verringern, werden typischerweise Eisenchelatoren verabreicht. Obwohl dies hilfreich ist, erliegen die Patienten in einem Durchschnitt zwischen etwa 17 bis 35 Jahren den akkumulativen Effekten der Krankheit und der Eisenüberladung.
Genotypische Änderungen in gesunden Individuen wurden identifiziert, wobei β-Globin des Erwachsenen nicht gebildet wird, aber schwere Komplikationen vermieden werden. Diese Patienten exprimieren konstitutiv fötales oder γ-Globinprotein in ausreichenden Mengen, um das fehlende β-Globinprotein zu ersetzen. Dieses vererbbare Fortdauern des fötalen Hämoglobins (HPFH) kann eins oder beide der fötalen β-Globingene, A-γ und G-γ, einschließen. Offenbar führt die beständige Herstellung eines der beiden γ-Globinproteine die notwendigen Funktionen des anormalen oder fehlenden β-Globinproteins aus.
Für eine Auswahl von kleinen Molekülen wurde gezeigt, dass sie Hämoglobin oder fötale Globinexpression bewirken. Frühe Experimente zeigten, dass von Acetat (CH₃COOH), Propionat (CH₃CH₂COOH), Butyrat (CH₃CH₂CH₂COOH) und Isobutyrat (CH₃CH(CH₃)COOH) alle Hämoglobinsynthese in kultivierten Friend-Leukämiezellen induzieren. Zusätzliche Studien zeigten, dass polare Verbindungen, wie Säureamide und Fettsäuren die Expression sowohl von fötalen, als auch von Globingenen des Erwachsenen in Mauserythroleukämiezellen stimulieren könnten. Für Hydroxyharnstoff (H₂NCONHOH), einem anderen relativ kleinen Molekül, wurde gezeigt, dass es Globinexpression stimuliert. Jedoch scheint die Stimulation nicht sehr spezifisch für fötales Globin zu sein. Hydroxyharnstoff ist gegenwärtig der einzige Wirkstoff, der für die Behandlung von Sichelzellenkrankheit verwendet wird. Jedoch gibt es eine große Sorge, dass ein antineoplastischer Ribonukleotidreduktaseinhibitor karzinogen ist. Seine karzinogenen Eigenschaften machen seine verbreitete und Langzeitverwendung als ein Pharmazeutikum zu einer fragwürdigen Praktik. Es gibt eine große Notwendigkeit, Verfahren für die Behandlung von Sichelzellenkrankheit zu finden, die nicht einschließen, den Patienten anderen Risiken auszusetzen.
Die Expression von γ-Globingenen wurde erfolgreich in vivo und in vitro unter Verwendung von Wirkstoffen, wie Zytosinarabinosid (AraC), einem zytotoxischen Wirkstoff, der fötale Retikulozytenherstellung induziert, und 5-Azacytidin (AZA), einem gut bekannten DNA-Methylaseinhibitor, manipuliert. Eine kontinuierliche intravenöse Verabreichung von AZA stellt einen 5- bis 7-fachen Anstieg in der γ-Globin mRNA der Knochenmarkzellen her. Zusätzliche Studien haben gezeigt, dass es signifikante Veränderungen in der Population der Stammellen in dem Knochenmark nach der AZA-Behandlung gibt. Diese Experimente zeigen an, dass AZA- Effekte mehr als andere für das Umprogrammieren und Verstärken von Erythroidvorläuferzellen verantwortlich sind, als für jede anderen direkten Effekte auf spezifische Genexpression. Viele dieser Wirkstoffe, die AZA, AraC und Hydroxyharnstoff einschließen, sind myelotoxisch, karzinogen oder teratogen, was Langzeitverwendung unpraktisch macht.
Einer der Hauptdurchbrüche in der Behandlung von Hämoglobinopathien wurde gemacht, als entdeckt wurde, dass Buttersäure (Butnsäure; CH₃CH₂CH₂COOH) genau und spezifisch die Transkription des humane fötalen (γ) Globingen stimuliert. Diese Entdeckungen wurden schnell in vivo bestätigt, wobei gezeigt wurde, dass pharmakologische Dosen von Buttersäure die Expression des fötalen Globins in erwachsenen Hühnern stark erhöhte, welche Anämie durch Injektionen mit Phenylhydrazin erbrachten. Es wurde spekuliert, dass die Histonacetylierung, ein bekannter Effekt von Buttersäure, mindestens teilweise für das Ansteigen der fötalen Genexpression verantwortlich sein kann.
Seitdem wurden über 50 Derivate von Buttersäure gefunden, die in der Stimulierung der fötalen Globinherstellung effektiv sind. Einige von diesen schließen Buttersäuresalze, wie Natrium und Argininbutyrat, α-Amino-N-Buttersäure (Butyramid; CH₃CH₂CH₂CONH₂) und Isobutyramid (CH₃CH(CH₃)CONH₂) ein. Obwohl dies in klinischen Pilot-Studien vielversprechend war, waren behandelte Patienten nicht in der Lage, die angemessenen Niveaus des fötalen Globins in ihrem System beizubehalten. Es wurde später bestimmt, dass viele dieser Formen von Buttersäure eine extrem kurze Halbwertszeit hatten. Oxidation in dem Serum, Beseitigung durch Häpatozyten und Filtrierung durch die Nieren eliminierten diese Wirkstoffe schnell aus dem System des Patienten. Mit anderen, entwickelten Patienten schnell Toleranz oder Metaboliten der Verbindungen, welche den entgegengesetzten Effekt des gewünschten Effekts hatten.
Kürzlich wurde eine Anzahl von aliphatischen Karbonsäuren auf ihre Fähigkeit getestet, spezifisch die fötale Globinexpression im K562 humanen Erythroleukämiezellen zu erhöhen. Obwohl es für längere Ketten erachtet wurde, dass sie toxisch zu Zellen sind, wurde gezeigt, dass Propionat (CH₃CH₂COOH) und Valerat (Pentansäure; CH₃CH₂CH₂CH₂COOH) am effektivsten sind. Butyrat (CH₃(CH₂)₂COOH), Capronat (CH₃(CH₂)₄COOH), Caprylate (CH₃(CH₂)₆COOH), Nonanoat (CH₃(CH₂)₇COOH) und Caprat (CH₃(CH₂)₆COOH) stellten einen viel geringeren Effekt her. Es wurde für Phenylacetat (C6H5CH2COOH) und seiner Vorläuferform 4-Phenylbutyrat (C₆H₅CH₂CH₂CH₂COOH) gezeigt, dass sie die fötale Globinexprimierende Retrikulozytenproliferation senken, aber die relativen Anteile des fötalen Globins pro Zelle in kultivierten Erythroidvorläuferzellen erhöhen. Acetat (CH₃COOH), ein metabolisches Produkt des Butyratkatabolismus, erhöhte sowohl die Erythrozytenvorläuferpopulationen, als auch die fötale Globinsynthese. Jedoch zeigten diese Studien auch, dass positive Effekte nur für sehr kurze Zeitdauern beibehalten werden konnten.
Andere Methoden, um die fötale Globinexpression zu steigern, konzentrierten sich auf die Rekrutierung und Umprogrammierung von Erythroidvorläuferzellen, um fötales Globin zu exprimieren. Wirkstoffe, die in vivo oder in vitro unter Verwendung dieses Ansatzes getestet wurden, schließen hämatopoetische Wachstumsfaktoren, wie Erytropoitin (EPO), Granulozyt/Makrophagenkolonie-Stimulierungsfaktor (GM-CSF) und Interleukin-3 (IL3) ein. Für jeden dieser Faktoren wurde gezeigt, dass er fötale Globinsynthese in Gewebekulturzellen zu steigert.
Andere Wirkstoffe, für die gezeigt wurde, dass sie fötale Globinexpression beeinflussen, schließen Aktivin und Inhibin ein. Inhibin, ein Disulfid-verbundenes Hormon von zwei Untereinheiten, unterdrückt die Sekretion eines Follikel-stimulierenden Hormons aus der Hypophyse. Aktivin, das manchmal als Erythroid-differenzierender Faktor (EDF) oder Follikel-stimulierendes Hormon freisetzendes Protein (FRP) bezeichnet wird, ist auch ein Hormon, und beide dieser Makromoleküle induzierten Hämoglobinakkumulation in kultivierten menschlichen Erythrozyten (S. P. Perrine et al., Blood 74:114a, 1989). Kürzlich haben Studien gezeigt, dass der Steel-Faktor, ein Produkt des Maus-Steellokus, auch fähig ist, die fötale Globinsynthese in erythroiden Vorläufern zu beeinflussen.
Mehrere Studien fokusierten auf dem Mechanismus, wobei Buttersäure und andere kleine organischen Moleküle in der Lage waren, fötale Globinexpression zu stimulieren. Experimente mit kultivierten Zellen haben gezeigt, dass Buttersäure durch Erhöhung des Niveaus von Histonacetylierung durch möglicherweise Senken der Aktivität von einem oder mehreren Histondeacetylasen funktionieren kann. Die resultierende Histonhyperacetylierung kann ungefaltetes Nukleosom herstellen und dabei die Genexpression erhöhen. Andere Studien haben gezeigt, dass Hypomethylierung auf dem Gebiet der DNA um den β-Genkomplex mit einer erhöhten γ-Globin-Genexpression in Thalassämie-Patienten korreliert. Alternativ können Buttersäure und andere kleine Moleküle so funktionieren, dass die spezifische Genexpression durch direktes Einwirken auf Wirkstoffe, die die Transkription regulieren, die sogenannten Transkriptionsfaktoren, erhöhen. Diese Faktoren binden an Sequenz-spezifischen Stellen auf dem Genom an Gebiete, welche die Expression von nahe gelegenen Genen kontrollieren.
Im Gegensatz zu dem menschlichen α-Globingenlokus, wurde der β-Lokus teilweise aufgrund der Identifizierung von vielfachen Mutationen der β-Globingene in HPFH-Patienten sehr im Detail analysiert. Der β-Lokus enthält eine große Sequenz stromaufwärts, die als die Lokuskontrollregion (LCR) bezeichnet wird, die sich 8-16 kbp 5' des Epsilon-Gens erstreckt. Diese Sequenz ist in vier DNase hyperempfindliche Stellen, HSS 1-5, unterteilt, die Enhancersequenzen, Silencersequenzen, Transkriptionsfaktor-Bindestellen und andere cis-wirkende Sequenzen enthalten. Jedes der Gene des β-Globinclusters enthält seinen eigenen Promotor, der in Zusammenarbeit mit Enhancerelementen in dem LCR wirkt. Vielmehr bewirkt die Deletion des LCR in einem Thalassämie-Syndrom mit geringer oder keiner β-Globinexpression. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das β-Globin exprimierte Gen eine kompetitive Wechselwirkung über die LCR einsetzen kann, so dass ihre Enhancerwirkung nur für ein einzelnes Gen zu jedem gegebenen Zeitpunkt der Entwicklung verfügbar ist.
Eine Anzahl von Transkriptionsfaktoren wurde in dem β-Lokus identifiziert, für die erachtet wurde, das Niveau der β-Globingenexpression zu ändern. Für ein Enhancer-Element des LCR wurde gezeigt, dass es ein Bindestellenpaar für den Kernfaktor E2 (NF-E2) enthält, welches mit einem Tandemsatz von Bindestellen für den Transkriptionsfaktor AP-1 überlappt. NF-E2, ein hämatopoetisch-spezifisches basisches Leuzin-Reißverschlussprotein, und AP-1-Bindestellen ermittelt auf einer Auswahl von Globin-genetischen Elementen. Kürzlich wurde für eine konservierte Sequenz (CS), die stromaufwärts der AP-1/NF-E2-Stelle lokalisiert ist, vorgeschlagen, die Enhanceraktivität zu steigern.
Zusatzfaktoren, die an Elemente in den Promotoren des β-Globinclusters binden, wurden identifiziert. Das CAT-Box ersetzende Protein (CDP) bindet an der Sequenz CAAT, die etwa 50 Basenpaare stromaufwärts vieler Genpromotoren lokalisiert ist. Ein anderer ziemlich all gegenwärtiger Transkriptionsfaktor, SP1, bindet an die Positionen-140 und -202 und genauso an mögliche zusätzliche Stellen. Für TAFII110 ist gezeigt worden, dass es an die TATA-Box vieler β-Globinpromotoren bindet. Der Transkriptionsfaktor GATA-1 bindet an die Transkriptionsinitiationsstelle (GATA) und kann durch TFIID unter Bildung eines aktiven Initiationskomplexes ersetzt werden. Ein anderer Erythroid-spezifischer Faktor, YY1, bindet mindestens an 11 Stellen, die auf der Globin-regulierenden Region verteilt sind.
Kürzlich ist ein Faktor identifiziert worden, der in der Regulation der Entwicklungs-Hämoglobinexpression eingeschlossen sein kann. Dieser Faktor, der Phasensortierprotein („stage selector protein") (SSP) genannt wird, bindet an eine Stelle, die etwa 50-60 bp stromaufwärts des Gamma-Globinpromotors lokalisiert ist, der als das Phasensortierelement („stage selector protein") (SSE) bezeichnet wird. Das SSE ist auch die Stelle, an der eine Anzahl an Mutationen in den HPFH-Syndrom-Patienten gefunden worden sind. SSP wurde aus K562-Zellkernextrakten aufgereinigt, und seine relative fötale und erythroide Spezifität ist einem Heterodimerpartnerprotein von 40-45 kD, genannt CP2, zugeordnet worden, welches selektiv die Anordnung des SSP-Komplexes auf den SSE und auch auf Stellen in dem ε-Promotor und eine nachfolgende Interaktion mit der RNA-Polymerase erlaubt.
Die Ermittlung des Mechanismus des Entwicklungs-Hämoglobin (Hb)-Wechsels kann die Rückaktivierung des fötalen Hb in erwachsenen Menschen mit Sichelzellenkrankheit oder β-Thalassämie erlauben, eine Manipulation, die die klinischen Offenbarungen dieser Krankheiten mildern. Die Inaktivierung der mutierten Form des β-Globingens des Erwachsenen, die die Sichelzellenkrankheit verursacht, ist auch von klinischem Wert, da sie in einer kompensatorischen Erhöhung der γ(fötalen)-Globinexpression resultiert.
Es ist klar, dass die Entwicklungsregulation der Globingene vielfache abwickelnde Faktoren einschließt, und der Mechanismus des Wechsels wahrscheinlich eine Chromatinumformung und Interaktionen zwischen Proteinfaktoren, welche an eine Vielzahl von DNA-Regionen gebunden sind, benötigt. Obwohl ein paar der bekannten DNA-Bindeproteine die Entwicklungsspezifität in etwa anzeigen (z.B. Erythroid-Kruppel-ähnlicher Faktor, EKLF, ein positiver Regulator des β-Globingens des Erwachsenen; (Dome, D., Townes, T. M. & Bieker, J. J. (1995) J Biol Chem 270, 1955-9; und FKLF-2, der die γ-Globingene aktiviert, aber auch in einem geringerem Ausmaß die ε- und β-Globingene aktiviert – Asano, H., Li, X.S. & Stamatoyannopoulos, G. (2000) Blood 95, 3578-3584), sind die präzise Kombination der Faktoren, die den Hb-Wechsel vermitteln, und wie sie das exakt machen nicht klar.
Menschliche K562-Zellen behandelt mit Hemin weisen einen Hb-Phänotyp ähnlich zu embryonischen Erythroidzellen auf, welche primär E- und G-Globine, aber kein β-Globin des Erwachsenen exprimieren, d.h. embryonische rote Zellen des Menschen und anderer Vertebraten enthalten auch eine große Menge an Ferritin des spezialisierten Zell(H)-Typs (welcher Eisen für die Verwendung von anderen Zellen hauptsächlich speichert), wobei Erythrozyten von Erwachsenen viel weniger Ferritin des Housekeeping-Typs enthalten, das Eisen für die eigene/intrazelluläre Verwendung speichert.
Nach einer langen Reihe der Experimentierung entdeckten die Erfinder, dass in CV-1-Zellen ein Expressionsklon des menschlichen H-Ferritins die Expression eines EKLF-stimulierten β-Globinpromotor angetriebenen CAT-Reportergens herunterreguliert. Die Erfinder zeigen zudem, dass Ferritin in Kernextrakten der K562-Zellen 5'-β-Globin-DNA zwischen -153 und -148 binden können, und dass eine hochkonservierte Hexanukleotidsequenz CAGTGC für diese Bindung benötigt wird. Diese Sequenz ist essentiell für B-Globinexpression in DMSO-induzierten MEL-Zellen (de Boer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L. & Grosveld, F. (1988) Embo J7, 4203-4212) und ist Teil der Bindestelle eines vemuteten B-Globinrepressors in nicht-induzierten MEL-Zellen (Macleod, K. & Plumb, M. (1991) Mol Cell Biol 11, 4324-32). Wenn dieses CAGTGC-Motiv mutiert ist, ist die in vitro-Bindung etwa um das 20-fache reduziert. Die Fähigkeit von Ferritin-H, in diesem System zu hemmen, ist aufgehoben, aber EKLF-Stimulierung wird beibehalten, wenn die -153/-148-Ferritin-Bindestelle in dem kotransfizierten β-Globin-Reporterplasmid mutiert ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ferritin-H das menschliche β-Globingen des Erwachsenen durch Bindung des Promotors in einer Sequenzspezifischen Weise hemmen kann. Die Biologie dieses Ferritin-Familienproteins und seine Bindestelle, genauso wie seine gezeigte Funktion in transienten Assays, schlagen vor, dass es in K562-Zellen in der Tat als ein β-Globinrepressor funktioniert. Wie oben erwähnt, ist ein solcher Repressor für die Verbesserung der Sichelzellen- und anderer genetischer Krankheiten nützlich.
Studien haben gezeigt, dass Ferritin-H die effizienteste Ferroxidase-Aktivität aufweist, wenn es grob in denselben Niveaus wie Ferritin-L exprimiert wird. Gleiche Expressionsniveaus resultieren in der höchsten Anzahl von Ferritin-H/Ferritin-L-Heteropolymeren. Die Heteropolymerform des 24-mer-Ferritin-Komplexes ist am effizientesten bei der Verarbeitung des Eisen-II-Ions in das Eisen-III-Ion und bei der Absonderung der Eisenionen. Dies schlägt vor, dass der Erhalt gleicher Konzentrationen des Ferritin-H und Ferritin-L höchstwahrscheinlich in einer geeigneten Eisenhandhabung resultiert. Steigende Niveaus von Ferritin-H würden in der Bildung von Ferritin-H-Homopolymeren resultieren. Ferritin-H-Homopolymere weisen niedrige Feroxidase-Aktivität auf. Es würde erwartet werden, dass dies zu höheren Niveaus des schädlicheren Eisen-II-Ions führen würde und nachteilige Beeinflussungen auf diese Zellen haben würde. Jedoch haben die Erfinder entdeckt, dass die Gen-regulatorischen Funktionen des Ferritin-H nur verursachen, dass das Entgegengesetzte auftritt.
Hintergrund von Hautkrebs und anderen Krebsarten: Für ultraviolettes (UV-)Licht ist bekannt, schädlich für die menschliche Haut zu sein, und wurde in die Ätiologie von Hautkrebsarten einbezogen. Kürzliche Studien haben offenbart, dass Ferritin in kultivierten Hautzellen, welche UV-Licht ausgesetzt wurden, erhöht ist, und es wurde postuliert, dass das erhöhte Ferritin das Bestreben der Hautzellen repräsentiert, sich selbst vor Schaden durch freie Radikale durch Bindung und Absonderung von Eisen zu schützen, das wiederum den oxidativen und durch freie Radikale vermittelten Schaden verursachen könnte.
Das Grundprinzip für andere Krebsarten ist ähnlich. Eisen wurde einbezogen als ein ätiologischer oder verschlimmender Wirkstoff für Hautkrebs, Hepatome (Leberkrebs), renale Zellkarzinome (Nierenkrebs), Neuroblastome, Leukämien und Brustkrebs. Die Erfinder bringen ein, dass Ferritin-H schützend gegen karzinogene Ereignisse in Zellen sein wird, welche zu einem Anstieg von all diesen Krebsarten führen. Das vorliegende Grundprinzip der Erfinder ist, dass durch die Behandlung der menschlichen Haut in solcher Weise, dass sie mit einem Ferritin-H-Unterfamilienpeptid oder einem Gen, das das Peptid exprimieren wird, transfiziert werden, kann den Zellen Schutz vor dem UV-induzierten Schaden zur Verfügung gestellt werden. Peptide der Ferritin-H-Unterfamilie sind in dieser Angelegenheit höher gestellt, da sie Eisen absondern können und nicht leicht freisetzen und dies so tun können, ohne normale Aspekte des Eisenmetabolismus und andere Funktionen der Zellen, zu verändern. Auf der anderen Seite können Peptide der Ferritin-L-Unterfamilie voraussichtlich sogar mehr Schaden verursachen, da sie leicht Eisen abgeben, was das Problem durch Erhöhung von freiem Eisen und Radikalerzeugung verschlimmern würde. Deshalb würde die Zufuhr eines Peptids oder eines Gens (Expressionsklons) für das Peptid einer Ferritin-H-Unterfamilie zu den Zielzellen schützend sein und/oder verbessernd für Ereignisse, die zu Krebs führen. Gleichermaßen würden Wirkstoffe, die das endogene Gen oder Gene der Ferritin-H-Unterfamilie aktivieren würden, in derselben Weise nützen.
Es ist realisiert worden, dass alle menschlichen Ferritine, sogar solche, welche stark in Ferritin-L angereichert sind, eine geringe Menge an Ferritin-H und seine verbundene Ferrooxidaseaktivität benötigen, um die Funktionen der Eisenlagerung und -freisetzung auszuüben. Es ist das Gleichgewicht zwischen Ferritinen-L und -H, das kritisch ist. Eine Erhöhung des Gleichgewichts zugunsten von Ferritin-H, sogar zu dem Punkt des großen Überschusses von Ferritin-H, scheint eine Zellrückkehr zu einer gesunden Eisenhandhabung zu vermitteln.
Hintergrund für neurodegenerative Krankheiten:
Die Verteilung von freiem Eisen und Ferritin verändern sich beiden während der Gehirnentwicklung in Menschen und Tieren. Erhöhtes Eisen wurde in den Basalganglien, beginnend früh in dem Krankheitsprozess, gefunden, sowohl in der Parkinson-Krankheit, als auch in der Chorea-Huntington-Krankheit. Ein Anstieg an Eisen in verschiedenen Gebieten des Gehirns bei der Alzheimer-Krankheit, bei anderen Demenzen und im Alterungsprozess; und die Verteilung des Isoferritins in einer Vielzahl von Gehirnregionen ist verschieden und verändert sich in den oben genannten Krankheiten. H-Ferritin, aber nicht L-Ferritin, ist in dem Kern von neuronalen Zellen im Cortex von sich entwickelnden Rattengehirnen vorhanden und kann schützend gegenüber oxidativem Schaden sein, der durch freies Eisen verursacht werden würde. Das Grundprinzip: Ferritin-H sinkt in kritischen Gehirnzellen während des Alterungsprozesses und neurogenerativen Krankheiten, wobei freies Eisen und vom lokalisierten Ferritin-L freigesetztem Eisen in dem oxidativen Schaden in Krankheiten und Demenzen impliziert sind. Ferritin-H oder ein Peptid einer zugehörigen Unterfamilie werden gegenüber einer Auswahl von neurodegenerativen Veränderungen mit dem Alterungsprozess, die mit oben beschriebenen Krankheiten und Demenzen assoziiert sind, schützend sein. Ebenso wird für einen Expressionsklon eines Gens einer Ferritin-H-Unterfamilie und/oder einen Regulator von Genen einer Ferritin-H-Unterfamilie, wenn sie zu dem geeigneten Gehirnbereich und zu spezifischen Zellen zugeführt werden, vorhergesagt, dass sie schützend sind.
Hintergrund der Friedreich-Ataxie und zugehörige neuromuskuläre Funktionsstörungen:
Eine Deletion von YDL120, dem Hefehomolog zum menschlichen Gen, das für die Friedreich-Ataxie verantwortlich ist, löst eine verringerte zelluläre Respiration assoziiert mit einer verringerten Zytochrom-C-Oxidaseaktivität aus und, in bestimmten Kernhintergründen, geht mitochondriale DNA verloren. In den Nullmutanten ist das zelluläre Wachstum hochsensibel für Oxidationsmittel, wie H₂O₂, Eisen und Kupfer; und Eisen (II-Sulfat) löst den Verlust von mitochondrialer DNA aus. Mitochondrien der Nullmutanten enthalten 10-mal mehr Eisen als der Wildtyp. Die Neurodegeneration, welche bei Friedreich-Ataxie beobachtet wurde, kann gut auf der Basis einer mitochondrialen Eisenüberladung, welche für eine erhöhte Herstellung von hochtoxischen freien Radikalen verantwortlich ist, erklärt werden. Das Grundprinzip: Da Eisenakkumulation in die Ätiologie der Friedreich-Ataxie impliziert ist, werden sowohl das anfängliche Auftreten von Symptomen, als auch das Fortschreiten dieser Krankheit durch die Absonderung des freien Eisens verlangsamt oder unterbrochen. Die Transfizierung von Peptiden der Ferritin-H-Unterfamilie oder von Expressionsklonen und/oder Behandlung mit Wirkstoffen, welche die Expression der endogenen Gene der Ferritin-H-Unterfamilie hochregulieren würden, werden verbessernd sein.
Hintergrund der Arteriosklerose:
Ein starker epidemiologischer Hinweis ist erhältlich, dass Eisen (z.B. Eisenüberschuss) ein wichtiger Faktor in dem Prozess der Arteriosklerose ist, und dass Eisenarmut einen kardiovaskulären Nutzen hat und gegen Ischämie-Herzkrankheit schützt. Eisenkatalysierte Erzeugung von freien Radikalen kann zum Gefäßwandschaden, zur Plaquebildung und bei beiden Mechanismen zum Herzgefäßschaden beisteuern. Noch einmal, intrazelluläre Eisenfreisetzung von L-Ferritin ist als eine Quelle des Eisenbeisteuerns für diese Ätiologie impliziert; H-Ferritin kann durch Chelatbildung und Absonderung des freien und freigesetzten Eisens schützend sein. Das Grundprinzip: Transfizierung der geeigneten Zelle mit einem Peptid oder einem Genexpressionsklon einer Ferritin-H-Unterfamilie oder mit einem Genregulator, der das endogene Gen/die endogenen Gene einer Ferritin-H-Unterfamilie in arteriellen Wandzellen aktivierten, oder zelluläre Elemente von Arterioskleroseplaques werden die arterielle Blockade verhindern oder umkehren.
Hintergrund bezüglich möglicher Zufuhrsysteme und Zell-zielende Mechanismen:
Für die Zufuhr von Proteinen oder Peptiden in lebende Zellen ex vivo, gibt es verschiedene Ansätze. Kleine Peptide (etwa 20 kDa oder kleiner) können von Zellen ohne ein spezialisiertes Zufuhrsystem aufgenommen werden. Größere Proteine können eingekapselt in Liposomen, liposomalen Konstrukten oder in einer Membran, wie einem roten Zellgeist („red cell ghost"), geliefert werden, und die Vesikel werden dann gemacht, um mit den rezipienten Zellen durch chemische Mittel zu fusionieren (z.B. Polyethylenglycol [PEG] oder Kalziumionen). Größerer Proteinkomplexe können auch verkapselt durch Fusion der Membranen der Kapsel mit den Plasmamembranen der Zielzelle geliefert werden. Die Erfinder hatten eine große Erfahrung mit diesem Typ der Zufuhr in dem Labor der Erfinder (Literaturangaben sind unten aufgelistet). Für eine in vivo-Zufuhr von Proteinen oder Peptiden, die auf einen spezifischen Zelltyp gerichtet sind, ist das Verfahren der Wahl eher ein liposomaler Typ der Zufuhr mit einem Antikörper oder Liganden, die auf ein spezifisches Zelloberflächenprotein oder -rezeptor gerichtet sind, die in das Liposom eingebaut werden und das Peptid oder Protein in das Liposom eingekapselt werden. Alternativ kann ein Fusionsprotein, das das gewünschte Peptid (z.B. Ferritin-H), das mit einem Proteinliganden, der spezifisch für den Vielzellenrezeptor ist, fusioniert ist, umfasst, direkt injiziert werden. Ein Beispiel für einen Proteinliganden, den man verwenden könnte, um hämatopoetische Stammzellen anzuzielen, ist der Stammzellfaktor (C-Kit-Ligand), welcher an einen Rezeptor (C-Kit) bindet, welcher auf der Oberfläche von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark angereichert ist. Der Fachmann wird erkennen, dass es eine große Anzahl von pharmazeutischen Zufuhrmechanismen gibt, welche für das Einfügen von Proteinen, Proteinfragmenten und genetischem Material in eine Zelle geeignet sind.
Für die Zufuhr von Expressionsklonen von Genen, die (zum Beispiel) für Peptide der Ferritin-H-Unterfamilie kodieren, sind eine Anzahl von Plasmidträgern und Transfektionsreagenzsystemen erhältlich, um Zellen ex vivo zu transfizieren, um für die Rückinfusion in das Wirtstier oder Patienten entweder stabile Transformanten oder vorübergehend transfizierte Zellen zu erzeugen. Gute Expressionsplasmide sind kommerziell als Transfektionreagenzien erhältlich, viele von den letzteren sind kationische Liposomen des einen anderen Typs. Für in vivo- genauso wie für ex vivo-Gentransfer – d.h. Gentherapie – schließen die erhältlichen Vektoren retrovirale Vektoren (nur geeignet für teilende Zellen), adenovirale Vektoren (transfizieren viele Zelltypen, mit sehr geringer Zellspezifität), adeno-assoziierte virale Vektoren, lentivirale Vektoren und Elektroporationssysteme ein. Alle von diesen können in einem ex vivo-Protokoll verwendet werden, wo die Zielzellen als eine pure oder stark angereicherte Population erhalten werden, um nach einem Gentransfer rückinfusioniert zu werden. Für den in vivo-Gentransfer ist die Wahl gegenwärtig limitiert, aufgrund der Schwierigkeit, spezifische Zellen mit ausreichenden Genkopien effizient anzuzielen. Ein angezieltes Liposom, wie in dem vorherigen Absatz beschrieben, ist eine Möglichkeit, wenn ein Ligand für einen mit hoher Affinität, reichlich aber zellspezifischen Rezeptor eingebaut wird.
Hintergrund bezüglich der Induktion der Ferritin-H-Genexpression in menschlichen Zellen:
Ferritin-H gehört zu einer Gruppe von Genen, welche identifiziert worden sind, während der Embryogenese exprimiert zu werden. Die erste Hauptstelle für die Ferritin-H-Expression ist in der embryonischen roten Blutzelle, welche in dem Säugetierdottersack gebildet wird, bevor die Blutzirkulation etabliert ist. Diese zellspezifische Expression von Ferritin-H in der frühen Entwicklung korrespondiert mit der Rolle des roten Blutkörperchens als der Ort für die Eisenlagerung des Embryos. Rote Blutkörperchen des Erwachsenen exprimieren viel weniger Ferritin, und Eisen wird hauptsächlich in der Leber (in Hepatozyoten) in Erwachsenen gelagert, wo das primäre Ferritin, das exprimiert wird, Ferritin-L ist. „Ausknocken" des Ferritin-H-Gens in Mäusen resultiert im Tod innerhalb des Uterus zwischen den Tagen 3,5 und 9,5 der Entwicklung. Deshalb ist Ferritin-H ein Entwicklungs-reguliertes Gen, dessen Expression auch einigermaßen auf bestimmte Zell- und Gewebetypen eingeschränkt ist. Die Erfinder haben entdeckt, dass die Expression von Ferritin-H in differenzierenden Erythroidzellen des Erwachsenen den Entwicklungs-Hämoglobinwechsel umkehren wird, direkt durch die Repression des β-Globingens des Erwachsenen, und entweder direkt oder indirekt eine Aktivierung des fötalen β-Globingens verursachen. Um das endogene Ferritin-H-Gen zu aktivieren, kehrt die Expression in Erythroidzellen des Erwachsenen auch einen Entwicklungsgenwechsel in dieser einen Zelllinie um. Durchführung dieses Wechsels wird wiederum einen anderen Entwicklungswechsel umkehren, den Hämoglobinwechsel, was einen therapeutischen Nutzen für Menschen mit Sichelzellenkrankheit, β-Thalassämie und andere Hämoglobinopathien hat. Aktivierung der Ferritin-H-Expression in anderen Zelltypen mildert und schützt vor Krebsarten, Atherosklerose und neurodegenerative Krankheiten.
Es sollte erwähnt werden, dass obwohl viel über die Regulation der Ferritin-Expression auf der Stufe der Translation durch Eisen, wie durch die IRE-Bindeproteine festgestellt wird (zum Beispiel zytosolische cis-Aconitase, welche das IRP-1-Protein ist [IRE-Bindeprotein-1]), bekannt ist, unterscheidet diese Stufe und dieser Typ der Regulation nicht zwischen den Ferritin-Typen. Um spezifisch Ferritin-H hochzuregulieren, benötigt die Expression die Regulation des spezifischen Gens auf dem Level der Transkription.
BT-20-Brustkrebszellen steigern schnell die Ferritin-H mRNA-Synthese, wenn sie exogen zugefügtem Häm ausgesetzt werden, aber steigern nur etwas die Ferritin-L mRNA. Dieser Wandel ist schützend gegenüber dem Schaden durch freie Radikale der Karzinogenese. In den Caco-2-Zellen des Dickdarmkrebs führt Ferritin-H-Expression zu erhöhter Zelldifferenzierung und einer Abnahme des Krebsphänotyps. Erhöhte Ferritin-H-Expression tritt auch während der Zelldifferenzierung der Erythroleukämie (K562) und Hepatom (HepG2)-Zelllinien in Kultur auf. Obwohl einige der DNA-Elemente in dem Ferritin-H-Genpromotor und Kernproteinen, die an sie binden (zum Beispiel P/CAF-CBP, Bbf und NF-E2) bekannt sind, ist der Mechanismus der Aktivierung der Ferritin-H-Transkription nicht ausreichend verstanden, um klinisch angewendet zu werden.
Unter den exogenen Faktoren, die Zellen zugeführt/auf sie angewandt werden können, um endogene Ferritin-H-Genexpression zu aktivieren, sind Häm, das Phytohormon-Abscisinsäure und Kombinationen von infrarotem- und ultraviolettem Licht, insbesondere angewendet bei menschlichen Keratinozyten und Hautkrebsarten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben entdeckt, dass eine nukleäre Ferritin-H-Unterfamilie von Eisen absondernden Proteinen ein Gen-regulatorisches Protein in menschlichen Zellen ist. Speziell haben sie entdeckt, dass nukleäres Ferritin an eine spezifische DNA-Sequenz bindet, die zentral in dem Promotor des humanen β-Globingens platziert ist, und dass der Effekt der Ferritin-H-Bindung der ist, die Transkription dieses Gens in transfizierten Zellen zu reprimieren. So bietet ein Ferritin-H-Gen oder -Peptid, das auf die richtigen Zellen gezielt ist, eine Heilung für Sichelzellenkrankheit an, bei der das β-Globin-Gen mutiert ist, genauso wie für andere genetische Krankheiten, wo es eine schlechte Handhabung von Eisen gibt. Überexpression von Ferritin-H bis zu 500 x in menschlichen Zellen ist nicht schädlich, verringert den labilen Eisenvorrat, verringert die Proliferation in Krebszelllinien und fördert die Apoptose in Krebszellen.
Basierend auf der obigen Entdeckung sind Verfahren und/oder Zusammensetzungen zur Änderung des Phänotyos einer Zelle aus dem Inneren durch die Herstellung einer Veränderung in der Genexpression, zum Beispiel Genexpressionstherapie, denkbar. Es werden Verfahren beschrieben für die Übertragung eines Gens für Ferritin-H oder anderen Peptiden der Ferritin-H-Familie in eine Zelle, so dass das Ferritin-H-Gen darin exprimiert wird und als ein Ergebnis davon Ferritin-H hergestellt wird. Dies verändert den Phänotyp der Zelle entweder durch das Ferritin selber, das die Expression eines anderen Gens, das mit dem Krankheitsphänotyp assoziiert ist, reguliert (wie in dem von den Erfindern gut untersuchten Beispiel für die Sichelzellenkrankheit) oder durch die Ferritin-Veränderung des Eisengleichgewichts in der Zelle, welches wiederum in einer Änderung in der Genexpression resultiert, die den Phänotyp verändert. Der Phänotyp der betroffenen Zelle kann auch durch die Zufuhr des exprimierten Peptids selber (zum Beispiel Ferritin) oder Teile davon direkt in die erkrankte Zelle oder zu der Zelle, bevor sie den Krankheitsphänotyp aufweist, verändert werden. Induktion der Expression des endogenen Ferritin-H-Gens in den geeigneten Zellen durch Stimulierung seiner Transkription ist ein dritter Ansatz für die Genregulationstherapie; dies wird durch das Anwenden von exogenen Zytokinen oder anderen Wirkstoffen auf die Zellen getan. H-Ferritin ist bekannt, bei der Antwort auf TNFα und IL-1β anzusteigen, wobei L-Ferritin bei einer Antwort auf exogen hingefügtes Eisen selektiv ansteigt. Und ein vierter Ansatz ist der, den Zellphänotyp durch eine Genregulationstherapie durch die Zufuhr eines Antisense-Oligonukleotids zu verändern, das die Expression eines spezifischen Peptids der Ferritin-Familie verhindern würde durch Inhibierung der Translation und/oder Transkription seiner mRNA.
Welche dieser Ansätze für die Genregulationstherapie anwendbar sein werden, wird von der Ätiologie jeder der spezifischen Krankheiten hierin beschrieben abhängen, welche alle die falsche Handhabung von Eisen einschließen. Ferritin-Genexpression kann sie entweder verbessern oder verschlechtern, abhängig der Art des exprimierten Ferritins, von der spezifische Krankheit oder dem Stadium der Krankheit, in welchen der Eingriff initiiert. wird. Der Ansatz der Wahl kann für die Erhöhung des Ferritin-Hs (zum Beispiel durch die zur Verfügungstellung eines Expressionsvektors des Ferritin-H-Gens) sein, oder zur Senkung einer spezifischen Ferritin-Art sein (zum Beispiel durch ein Antisense-Oligonukleotid). Jeder dieser Ansätze wird den gewünschten Effekt erfüllen. Es ist das Gleichgewicht zwischen der Expression des Ferritin-Hs und anderen Ferritinen, das in die zelluläre Veränderung des Phänotyps resultiet. Die Erhöhung der Menge an Ferritin-H in Bezug auf die Konzentrationen der anderen Ferritin-Proteine erfüllt die gewünschte genetische Regulation, die die Effekte der genetischen Krankheit verbessert, die die fehlerhafte Handhabung des Eisens verursacht.
Die Zufuhr von Ferritin-H, eines Ferrtin-H-Gens oder Derivaten davon zu erythroiden Vorläufern oder Stammzellen reprimiert die Expression des mutierten β-Glogin-Gens des Erwachsenen in der Sichelzellenkrankheit und stimulieren begleitend die γ(fötale) Globin-Gen-Expression, um dadurch eine phänotypische Heilung zu bewirken.
In neurodegenerativen Krankheiten und neuromuskulären Funktionsstörungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinsonsche Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Friedreichs Ataxie, ist der Überschuss an Eisen (oder Fehlhandhabung von Eisen) ein ätiologischer oder verschlinmernder Wirkstoff. H-Ferritin wird selektiv in Neuronen exprimiert und ist auch in den neuronalen Kernen lokalisiert. H-Ferritin nimmt im Gehirn mit dem Alter ab und liegt in geringer Menge in Teilbereichen des Gehirns bei AD, PD und HD vor. H-Ferritin allein unter den bekannten Ferritinen besitzt Ferroxidase-Aktivität, und die Gegenwart von Ferritin-H im Gehirn wirkt schützend gegenüber dem überschüssigen oder freien Eisen. Die Erhöhung von H-Ferritin in spezifisch lokalisierten Neuronen dieser Klasse an Patienten verschlimmert die Symptome und das Voranschreiten dieser Krankheiten. Alternativ kann die Zufuhr von spezifischen Ferritin-Antisense-Oligonukleotiden zu Glia und anderen assoziierten ZNS-Zelltypen in spezifischen Gehirnbereichen den bevorzugten Weg der Gen-Regulationstherapie sein, als ein Ansatz, um die Niveaus an gespeicherten Eisen in solchen Zellen zu verringern. Der Fachmann wird verstehen, dass das beste Verfahren zur Erhöhung von intrazellulärem Eisen von Ferritin-H oder eines Derivats davon von einer Vielzahlen von Faktoren abhängen wird, einschließlich, aber nicht limitierend darauf, die Art des Gewebes, das angezielt wird, das gewünschte Niveau des intrazellulären Ferritin-Hs oder des Derivats, die Krankheit, die behandelt wird, und das momentane Niveau des intrazellulären Ferritins in den angezielten Zellen.
In Krebsarten ist es auch klar, dass der Überschuss an Eisen als ein ätiologischer oder verschlimmernder Wirkstoff einbezogen ist. H-Ferritin ist dafür bekannt, intrazellulär in einer Anzahl von Krebsarten erhöht zu sein (zum Beispiel Brustkrebs), wobei L-Ferritin in dem Serum von vielen Krebspatienten erhöht ist (zum Beispiel Neuroblastom). Die Erhöhung in der H-Ferritin-Expression, die in einer Anzahl von Krebsarten gesehen wird, ist das Bestreben der Zelle, sich selber gegenüber freien/überschüssigen Eisen zu schützen; und in so einem Fall, kann die sehr frühe Zufuhr von H-Ferritin, einem H-Ferritin-Gen oder Anregungen zur Erhöhung der endogenen Ferritin-H-Gen-Expression die beste therapeutische Wahl sein. Beim Hautkrebs, wo entweder UV- oder infrarotes Licht endogenes Ferritin-H induzieren, wirkt das Ferritin schützend gegenüber einigen Wegen des oxidativen Schadens.
Der Überschuss an Eisen in Atheroskleroseplaques ist ein ätiologischer oder verschlimmernder Wirkstoff; und Genregulationstherapie zur Erhöhung von Ferritin-H in den Zellen dieser Plaques verlangsamt oder hält den Krankheitsprozess an.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist das Entdecken, dass Ferritin-H das menschliche β-Globingen des Erwachsenen durch eine spezifische Bindung der DNA-Sequenz SEQ ID NR:1, CAGTGC, in dem β-Globin-Promotor reprimiert. Viele andere Gene haben diese Sequenz in ihren Promotoren, einschließlich der menschlichen ε- und γ-Globingene, die durch Ferritin stimuliert werden. Deshalb beeinflusst der Kontext des CAGTGC-Motivs, einschließlich der umgebenen DNA genauso wie die Distanz des Motivs von der Startstelle der Transkription, ob Ferritin reprimiert oder aktiviert. Einige der Gene, die dieses Promotormotiv haben, werden in der Apoptose exprimiert, und andere sind Gene, die im Eisenmetabolismus involviert sind. Die Verwendung von Zytokinen, um Krebszellen in die Apoptose zu drängen, ist eine Weg zur Heilung, und die Stimulierung der Ferritin-H-Expression durch dieses Mittel ist eine wirkungsvolle Therapie.
Das CAGTGC-Motiv, das wir entdeckt haben, zeigt Homologie mit wichtigen, vorher entdeckten Elementen, einschließlich des ARE (antioxidant response element), das die Sequenz RTGACnnnGC hat (wo R ein Pyrimidin ist und n jedes der vier Standardnukleotide sein kann) und eine Sequenz RTGR, dass das bevorzugte Objekt zur Schneidung durch Fe++ vermittelte Fenton-Reaktion ist. Es gibt eine Vielzahl von anderen Genen, die in Gesundheit und Krankheit involviert sind, welche durch Ferritin-Bindung an diese Elemente reguliert werden können.
Die obigen Erwägungen haben eine Bedeutung für Behandlungen aufgrund der wichtigen Entdeckung, dass nukleäres Ferritin (d.h. Ferritin-H und Derivate davon) Genexpression vom menschlichen β-Globin-Genpromotor durch Bindung an das CAGTGC-Motiv reprimieren, das in der Region von -150 Basenpaaren von der Transkriptionsstartstelle lokalisiert ist, wie durch unsere in vitro DNA-Bindungsexperimente und durch unsere Gen-Ko-Transfektionsexperimente in CV-1-Zellen gezeigt wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde entdeckt, dass Ferritin ein Repressor des menschlichen β-Globin-Gens ist, dasselbe Gen, das in der Sichelzellenkrankheit und in einigen Formen der β-Thalassämie mutiert ist. Der Repressor ist eine nukleäre Form von Ferritin (Broyles et al., „A Ferritin-Like Protein Binds to a Highly Conserved CAGTGC Sequence in the β-gobin promoter, in Sickle Cell Disease and Thalassaemias: New Trends in Therapy) der Ferritin-H-Unterfamilie von Ferritin-Peptiden. Kurz gesagt, die Erfinder haben das Folgende entdeckt:

1) Ein Protein der Ferritin-Familie aus Kernextrakten von humanen K562 Erythroleukämiezellen (genauso wie reines humanes Ferritin-H) bindet an den Promotor des humanen β-Globingens (der Promotor, der die mutierte Form des Gens in der Sichelzelle treibt) an der Position -150 Basenpaare von der Transkriptionsstartstelle, in vitro. Die Bindung ist sehr spezifisch für diese DNA-Sequenz.
2) Ein Expressionsklon von Ferritin-H reprimiert diesen β-Globin-Promotor in transienten Ko-Transfektionsexperimenten. Dies ist in Mehrfachen-Experimenten mit zwei verschiedenen Reportergenen sehr reproduzierbar, wobei keine Expression durch die Kontroll/Nullplasmide gesehen wurde.
3) Ferritin-H reprimiert nicht länger, wenn der Promotor eine mutierte Bindestelle enthält. Die Erfinder haben einen perfekten Kontrollplasmid-a β-Globinpromotor, welcher nur in der Ferritin-H-Bindestelle mutiert ist, und zu demselben Reportergen abhängig ist (CAT, in diesem Fall). Dies ist nicht nur die perfekte Kontrolle für die Transfektionen, sondern es verbindet auch sehr schön die in vitro DNA-Bindung mit in vivo-Funktion.

Da eine Verrringerung in der β-Globinexpression durch eine Erhöhung in der Gamma(fötalen)-Globinexpression in humanen Erythroidzellen kompensiert wird, und da eine kleine Menge dieses Wechsels bekannt dafür ist, die Sichelzelle ganz zu verbessern und komplett oder teilweise die β-Thalassämien zu verbessern, macht diese neue Entdeckung Ferritin nützlich für das Heilen des Phänotyps dieser klassischen genetischen Krankheiten.
Berichte in der wissenschaftlichen Literatur deuten an, dass H-Ferritin (schwere Kette von Ferritin) um 50 % in älteren Rattengehirnen gesenkt ist und bei anderen neurodegenerativen Krankheiten, wie Alzheimer-Krankheit, und zeigen, dass Ferritin-H in den neurodegenerativen Krankheiten gefunden wurde, wo Eisen-vermittelter oxidativer Schaden gezeigt wurde, wie bei der Parkinson-Krankheit und möglicherweise der Chorea-Huntington-Krankheit. Es gibt auch Studien, die eine schützende Rolle des Ferritins gegenüber Krebsarten andeuten, wie Leberkrebs- oder Hautkrebsarten. Es wurde berichtet, dass UV-Licht Ferritin-Herstellung in Hautzellen induziert, und dass Ferritin schützend gegenüber UV-Schaden ist. In der Tat kann Ferritin-H verwendet werden, um jene Krankheiten zu behandeln, in welchen zelluläre Verletzung durch Eisen-vermittelten oxidativen Schaden verursacht wird.
Die Zufuhr des Ferritin-H-Peptids oder einer verkürzten Form davon zu erythroiden Vorläuferzellen ist eine effektivere, natürlichere Form der Therapie als teilweise die gegenwärtigen Maßnahmen zur Verwendung zur Behandlung der Sichelzellenkrankheit und β-Thalassämien. Auf ähnliche Weise stellt die Zufuhr von Ferritin-abgeleiteten Peptiden effektive Behandlungen und Schutz bei Alzheimer und anderen neurodegenerativen Krankheiten und Krebsarten zur Verfügung. Das Peptid kann auch als ein Fusionsprotein zugeführt werden, mit Teilen oder dem gesamten Ferritin-H-Peptid, fusioniert an ein anderes Protein, so wie Transferrin oder an einen anderen Liganden, für den spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der Erythroidvorläuferzellen existieren, Neuronen oder andere Zelltypen, für welche Schutz gewünscht wird. Das Herstellen der Fusionsproteine, welche auf spezifische Gewebe gezielt sind, ist dem Fachmann gut bekannt. Alternativ ist ein Expressionsklon, der für Ferritin-H oder einen Teil davon kodiert, geliefert auf erythroide Vorläuferzellen, auf Blut-bildende Stammzellen, auf Neuronen oder auf andere Gewebezellen in einem geeigneten Vektor, entweder ex vivo oder in vivo; und das Protein, das von so einem Vektor exprimiert wird, heilt und schützt auch vor der Krankheit.
Das hier beschriebene Ferritin-H ist von anderen bekannten trans-agierenden Proteinen in seinen physiologischen Eigenschaften und seiner vorgeschlagenen Funktion als ein Repressor, der primär an den β-Globin-Promotor bindet, verschieden. Die H-Ferritin-Unterfamilie wird durch eine größere Anzahl von Genen als der L-Ferritin-Unterfamilie dargestellt und schließt eine Anhäufung von Genen/Pseudogenen auf dem X-Chromosom ein. Eins von diesen, Ferritin-X, scheint für ein Peptid zu kodieren, das in seiner Größe identisch und sehr ähnlich in der vorhergesagten dreidimensionalen Struktur zu Ferritin-H ist.
Die Möglichkeit verbleibt, dass die tatsächliche DNA-Bindung des b-Globin-Promotors des CAGTGC-Motivs an der Position -150 in vivo durch ein Ferritin-assoziiertes Protein vermittelt wird, das durch die Proteinase K und Hitzebehandlung geschützt sein würde und mit dem Anti-Ferritin-Antiserum aufgrund seiner starken Assoziation zu dem Ferritin reagieren würde. Jedoch, wenn dies der Fall sein sollte, ist es ein Protein, das ubiquitär im humanen nukleären Extrakt verteilt ist, und es würde keine Notwendigkeit geben, es hochzuregulieren, und es ist ineffektiv in der Abwesenheit von Ferritin-H. Hochregulation von Ferritin-H ist genug.
Aus den transienten Expressionsassays der Erfinder wird klar, dass Ferritin-H das humane b-Globingen reprimieren kann, und dass diese Repression durch die Bindung von Ferritin-H und/oder eines Ko-Repressors an die -150 Region des Promotors, welcher ein hoch konserviertes CAGTGC-Motiv enthält, vermittelt ist. Diese Bindestelle des Ferritin-Hs ist innerhalb einer wichtigen ARE, welche für die Aktivierung der Transkription des β-Globingens benötigt wird. Deshalb könnte die Bindung dieses Proteins und die Verdrängung von anderen Faktoren wichtig sein in der Repression des humanen β-Globingens, wie anscheinend das Maus-BB1-Protein (welches dieselbe Sequenz erkennt) in der Unterdrückung des Maus-β-Hauptglobingens in uninduzierten MEL-Zellen ist. Eine nachfolgende Interaktion dieser Bindestelle mit den stromaufwärts negativ regulatorischen Regionen erzeugt einen eng gebundenen Komplex, der die Bindung von anderen positiven Faktoren, wie GATA-1, verhindert, genauso wie er die sterische Bildung eines aktiven Transkriptionskomplexes auf dem proximalen Promotor durch DNA-Schleifenbildung behindert.
Das Ferritin-H-Protein kann ein gebundenes Eisenion haben. Die aktive Stelle, welche für die Ferroxidase-Aktivität verantwortlich ist, wurde aufgeklärt. Jedoch wurden die aktive Stelle oder Stellen des Proteins, welche für die Unterdrückung der Transkription verantwortlich sind, noch nicht identifiziert. Genauso wie für alle anderen Genregulationsproteine werden Derivate des Ferritin-Hs die DNA-Transkription genauso gut oder besser als das Ferritin-H selber reprimiren. Diese Derivate schließen Fragmente der Ferritin-Proteine und jeglicher Fusionsproteine ein, in welchen die aktive Stelle oder Stellen des Ferritin-Hs, welche für die Unterdrückung der Transkription verantwortlich sind, gespleißt wurden. Ferritin-H-Derivate können also größere Transkriptions- oder Translationsprodukte eines Proteins der Ferritin-Familie einschließen. Ferritin-H-Derivate schließen zudem jegliche nachahmende Proteine ein, die die Transkription durch eine aktive Stelle, welche im Wesentlichen dieselbe wie die Ferritin-H aktive Stelle ist, welche für die DNA-Bindung und Unterdrückung der Transkription verantwortlich ist, reprimiert. Der Fachmann wird begrüßen, dass die Ferritin aktive Stelle oder Stellen, welche für die Unterdrückung der DNA-Transkription verantwortlich sind, sowohl die DNA-Bindestellen, als auch die Proteinbindestellen einschließen kann. Ferritin-H-Derivate können in Fragmenten von jedem Protein der Ferritin-Familie gefunden werden.
Ferritin-H ist nur ein Mitglied der Familie der Ferritin-Proteine. Ferritin-H und Ferritin-L sind die am besten untersuchten. Es gibt wahrscheinlich Proteine der Ferritin-Familie, welche noch nicht identifiziert worden sind. Proteine der Ferritin-Familie sind im Allgemeinen in dem Eisenmetabolismus involviert. Jetzt, wo die Erfinder die genregulatorische Aktivität von Ferritin-H und seinen Derivaten aufgeklärt haben, ist es wahrscheinlich, dass andere Proteine der Ferritin-Familie auch genregulatorische Funktionen haben.
Die Fähigkeit der Proteine der Ferritin-Familie an die 5'-Promotorregion des β-Globingens zu binden, wurde nur nach übermäßig langem und strengem Experimentieren, wie unten beschrieben wurde, bestimmt. Das erste Beispiel zeigt, dass Ferritin-H an die CAGTGC-Ferritin-Bindestelle bindet, SEQ ID NR:1, die an den Basen -148 bis -153 der 5'-Protomorregion des humanen β-Globingens gefunden werden. Beispiel 2 zeigt, dass zusätzlich zur Bindung an die Ferritin-Bindestelle, Ferritin-H an ein anderes nukleäres Protein bindet, das an die β-Globin 5'-Promotorregion weiter stromaufwärts der Ferritin-Bindestelle bindet. Diese Ergebnisse stellen andauernde Arbeit dar und zeigen, dass nukleäres Ferritin aus der humanen K562-Zelle mit anderen DNA-Bindeproteinen interagiert, besonders um diesen Promotor zu reprimieren, stromaufwärts Silencer-Bindeproteine durch DNA-Schleifenbildung."
BEISPIEL 1
Material und Methoden
Zelllinien. K562 (humane Erythroleukämie)-Zellen wurden in einer Suspension in RPMI 1640 Medium mit 10 % oder 15 % fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika wie beschrieben (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52) wachsen gelassen und bei einer Dichte von 10⁶ Zellen/ml für das Herstellen von nukleären Extrakten geerntet. CV-1 Zellen (Nierenepithelzellen des afrikanischen Grün-Affen) (adhärente Zellen, welche für Transfektionen/transiente Genexpressionsassays verwendet werden) wurden in DMEM mit L-Glutamin, 10 % FBS und Antibiotika wachsen gelassen (Miller, I. J. & Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776-86).
Klone, Transfektionen und Genexpressionsassays. Die stromaufwärts liegende Region (-610/+20) des humanen b-Globin-Gens, das vorher in pSV2CAT kloniert wurde (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52), wurde mittels pGEM und pSELECT zwischenkloniert (nun genannt pALTER) und in pCAT-Basic zurückkloniert (alle Vektoren von Promega). Mutanten der -153/-148-Stelle des b-Globin-Promotors wurden durch Transkription von mutierten Oligonukleotiden, welche der -164/-128-Region entsprechen, unter Verwendung des pSELECT- Systems erzeugt. Transfektionen der CV-1-Zellen wurden mit Hilfe des DMRIE-C-Transfektionsreagenz (GibCoBRL) in OptiMEM serumfreien Medium durchgeführt und wurden unter Verwendung des grünen Fluoreszenzprotein-Plasmids pEGFP-C1 (Clontech), Fluoreszenzmikroskopie und quantitative Fluoreszenz der Zelllysate mit einem Mikrotiter-Plattenleser optimiert. Das Reportergen Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) wurde in Lysaten von transfizierten Zellen unter Verwendung von ELISA (Promega) quantifiziert, welcher mit aufgereinigtes CAT standardisiert wurde. Das EKLF (Erythroid-Krüppel ähnlicher Faktor)-Expressionsplasmid hat das EKLF-Gen in pSG-5 kloniert (Stratagene; (Miller, I. J. & Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776-86) und der Ferritin-H-Expressionsklon ist in dem eukaryotischen Expressionsvektor pcEXV-1 (Wu, Y. J. & Noguchi, C. T. (1991) J Biol Chem 266, 17566-72). Das gesamt zelluläre Protein wurde mit dem BCA Mikrotiterplattenassay (Pierce) unter Verwendung von Rinderserum-Albumin als Standard bestimmt.
Proteine und Antikörper. Ferritine aus der humanen Leber (angereichert in L-Ketten) und aus humanem Herz (angereichert in H-Ketten), humanes Transferrin (gesättigtes Eisen) und Apotransferrin, polyklonales (Kaninchen) Antiserum gegen Ferritin aus der humanen Milz und nicht-immunes Kaninchenserum wurden von Sigma Chemical Company erhalten.
Restriktionsfragmente und Oligonukleotide. Die 5'-Region des humanen b-Globingens (von -610 bis +20), zunächst kloniert in pSV2CAT, wurde in 3 Fragmente durch aufeinander folgende Verdaus mit HindIII und RsaI geschnitten. Die 3 Fragmente, welche aus Agaxose elektroeluiert wurden (Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), waren 416 Basenpaare (-638/-223), 147 Basenpaare (-127/+20), welches die proximale Promotor-Region enthält) und 95 Basenpaare groß (das Rsa-Fragment, -222/-128, das hauptsächlich die distalen Promotorsequenzen enthält). Diese 3 Fragmente wurden PhenoUChloroform-behandelt, dephosphoryliert, und durch 32-P wie beschrieben endmarkiert (Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Kurien, B. T., Scofield, R. H., & Broyles, R. H. (1997) Anal Biochem 245, 123-126). Synthetische Oligonukleotide entsprechend zu -232/-188 und -164/-128 wurden aufgereinigt, und wie vorher beschrieben wurde, erhitzt (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52), und die doppelsträngigen Oligos wurden wie oben endmarkiert und/oder als unmarkierte Kompetitoren in Gel-Mobilitätsshiftassays verwendet.
Zubereitung von nukleären Extrakten. Jede Zubereitung eines nukleären Extraktes wurde aus 2 Litern von K562-Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) unter Verwendung der Vorgehensweise von Dignam, Lebovitz und Roeder gemacht (Dignam, J. D., Lebovitz, R. M. & Roeder, R. G. (1983) Nucleic Acids Res 11, 1475-89). Proteingehalt der Extrakte war in einem Bereich von 3 bis 6 mg/ml. Extrakte angereichert mit 80 bis 90 % von Ferritin-ähnlichem Protein(en) wurden durch Behandlung der Rohextrakte mit Proteinase-K und/oder Erhitzen auf 75 °C zubereitet (Atkinson, B. G., Dean, R. L., Tomlinson, J. & Blaker, T. W. (1989) Biochem Cell Biol 67, 52-7).
Gelmobilitätsshiftassays. Gelretardationsassays (d.h. Gelshift) wurden verwendet, um die DNA-Bindung der Extraktproteine an das Rsa-I (95 bp)-Fragment und synthetische Oligonukleotide zu bestimmen (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52; Fried, M. & Crothers, D. M. (1981) Nucleic Acids Res 9, 6505-25). Jede Reaktion enthielt 0,5 bis 2 ng DNA, 1,0 bis 5,0 μg des Proteinextrakts, 1,0 bis 5,0 μg von Poly dI: Poly dC, 100 mM KCl und Bindungspuffer (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52). Unmarkierte Kompetitor-Oligonukleotide waren in einem Bereich von 15- bis 2000-fachem molarem Überschuss vorhanden und wurden in das Reaktionsgemisch mit der Sonde vor Zugabe des Proteins eingeschlossen. Die Gele, welche für die Retardationsassays verwendet wurden, enthielten 4 %, 5 % oder 6 % Acrylamid und der Laufpuffer war TAE mit niedriger Ionenstärke (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52).
Sequenz-Alignments und Homologie-Suchen. Alle Säugetier-β-Globin-Promotorsequenzen (-200/+1) wurden direkt von der GenBank erhalten und unter Verwendung des PILEUP-Programms, gefolgt von dem LINEUP-Programm des GCG-Packets der Universität von Wisconsin, manipuliert.
ERGEBNISSE
Ferritin-H reprimiert die Expression, welche durch den b-Globin-Promotor in transienten Ko-Transfektionsassays voran getrieben wird. Ein transienter Expressionsassay wurde mit CV-1-Zellen angeordnet, in welchen b-Globin-Promotor gesteuerte Expression eines Reportergens niedrig ist, solange die Zellen nicht mit einem Expressionsklon EKLF kotransfiziert werden, einem Entwicklungs-spezifischen Aktivator der Transkription. Das Expressionsniveau von b-CAT, stimuliert durch EKLF, wurde um über 60 % bei der Ko-Transfektion eines Expressionsklons eines humanen H-Ketten-Ferritins (d.h. Ferritin-H) reprimiert.
Kontrollen schlossen ein positives CAT-Kontrollplasmid (welches CAT konstitutiv exprimierte), ein negatives CAT-Grundplasmid (enthält keinen Promotor) und ein b-CAT ohne EKLF-Stimulation ein. Das Experiment wurde 5 zusätzliche Male mit b-CAT und 3 mal mit einem b-LUC (b-Promotor-Luziferase)-Konstrukt mit sehr ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die Repression ist auch erwiesen (obwohl die Reporteraktivität niedriger ist), wenn EKLF weg gelassen wird (Daten nicht gezeigt). Andere Kontrollen haben Ko-Transfektion von „leeren Trägerplasmiden" für alle der Expressionsklone (kein Effekt auf Reportergenexpression), genauso wie das Konstanthalten der Mikrogramm-Gesamtmenge an transfizierten Zellen eingeschlossen, um die Möglichkeit der nicht-spezifischen Inhibierung der Genexpression aufgrund eines Überschusses der DNA oder von dem Aspekt der Struktur eines Trägerplasmids auszuschließen. Die Ko-Transfektion eines Expressionsklons für Ferritin-L resultiert manchmal in einer gewissen Repression der Reportergenexpression; aber der Effekt wurde als weniger dramatisch und inkonsistent beobachtet.
Bindung von Ferritin an b-Globinpromotor-DNA. Ein Restriktionsfragment, das einen Teil des distalen Promotors des humanen β-Globingens enthält, von -222/-128, wird von humanem Leber- oder humanem Herz abgeleiteten Ferritin gebunden, wie in Gel-Retardationssassays gezeigt. In den Experimenten der Erfinder zeigte Ferritin aus dem humanen Herz (welches in H-Typ (schweren) Untereinheiten angereichert ist) ein höheres Ausmaß an Bindung als das Ferritin der Leber (welches relativ in den L-Typ-Untereinheiten angereichert ist). Ein Restriktionsfragment, welches den proximalen Promotor (-127/+20) enthält, zeigt diese Bindung nicht; und ein anderes Eisenbindungsprotein, Transferrin (bekannt dafür, hauptsächlich extrazellulär vorzuliegen, außer wenn es an seinen Rezeptor gebunden ist) bindet nicht das distale Fragment, das von Ferritin gebunden ist. Die Shiftbanden, welche durch die Bindung des Ferritins der humanen Leber und durch das Ferritin des humanen Herzens hergestellt werden, entsprechen normalerweise den niedrigeren beziehungsweise höheren Shiftbanden, hergestellt durch rohnukleären Extrakten von K562-Zellen. Die Erfinder haben auch entdeckt, dass Ferritin in nukleärem Extrakt beide Shiftbanden herstellen kann, und dass die Bande mit dem höheren Molekulärgewicht die niedrigere Bande hervorbringen wird, wenn sie eluiert und zurückgeshiftet wird. Vielfache Shiftbanden mit Rohextrakten sind das Ergebnis von Aggregaten verschiedener Größen von Ferritin-Untereinheiten oder Oligomeren des DNA-Proteinkomplexes und/oder Komplexen mit anderen Proteinen in den Rohextrakten, da die Erfinder herausgefunden haben, dass mindestens eine der vielfachen Banden GATA-1 enthält.
Anreicherung von Ferritin-ähnlichen Proteinen aus nukleären Extrakten von K562-Zellen. Für polyklonales Antiserum gegen Ferritin aus humaner Milz (welches aus einer Mischung von schweren und leichten Ketten von Ferritin gebildet ist) wurde entdeckt, einen Supershift eines Teils der DNA-Proteinkomplexe zu verursachen, welches von dem rohnukleären Extrakt der K562 Zellen und dem -222/-128-Restriktionsfragment gebildet wird, und die Intensität der Supershiftbande war proportional zu der Menge des zugefügten Antiserums. Für die Supershiftbande mit dem Anti-Ferritin-Antiserum wurde entdeckt, spezifisch für diesen DNA-Proteinkomplex zu sein, dass sehr wenig bis keine DNA in der Abwesenheit von nukleärem Extrakt verändert wurde, dass weder Anti-Transferrin-Antiserum noch nicht-immunes Kaninchenserum (nicht gezeigt) den Komplex shifteten, dass Anti-Kaninchen-IgG den Supershift inhibierte und Proteinkomplexe mit anderen DNAs, wie β-IVS2, nicht durch das Anti-Ferritin-Antiserum geshiftet wurden.
Ferritin im Gegensatz zu den meisten Proteinen ist resistent gegenüber Proteinase K-Verdau und Erhitzen bei 75°C und kann 90 % rein aus Extrakten von embryonalen/larvalen Erythroidzellen unter Verwendung dieser beiden Behandlungen erhalten werden. Wenn diese Vorgehensweise auf K562 nukleären Extrakten angewendet wurde, ergab das verbleibende Protein eine einzelne Shiftbande mit dem -222/-128 Restriktionsfragment. Zudem wurde, wenn das Anti-Ferritin-Antiserum zu dem Reaktionsgemisch nach der Inkubation der DNA und des Bindungsproteins zugegeben wurde, ein größerer Komplex gebildet, welcher in einer Supershiftbande resultierte. Es sollte angemerkt werden, dass die Haupt-Shiftbande mit nukleärem Extrakt behandelt mit Proteinase K sich nicht so sehr shiftete, wie die Gelbanden, welche mit unbehandeltem Extrakt erhalten wurden. Die Erfinder haben dies in einer Serie von zeitlich festgelegten Verdaus untersucht und haben entdeckt, dass Ferritin einem teilweisen Verdau durch Proteinase K unterliegt; was nach einem 10- bis 15-minütigen Verdau verbleibt, scheint ein Proteinase K-resistenter Kern zu sein, welcher immer noch DNA bindet. Zudem ergibt eine Erhöhung der Menge der angereicherten Peptidzubereitung eine erhöhte Intensität der Shiftbande, und die Bande rückt schrittweise auf dem Gel auf, so wie der Komplex sich in Mengen bildet.
Ein einzelne Supershiftbande wurde mit dem 95 bp distalen Promotor erhalten, welche mit Erhöhung des Antiserums in ihrer Intensität erhöht ist. Um zudem die Bindung des Anti-Ferritin-reagierenden Proteins zu lokalisieren, wurde der Supershift auch mit 32 P-markierten doppelsträngigen Oligonukleotiden der -232/-188 und -164/-128 Sequenzen durchgeführt. Das größer als 39 bp Oligonukleotid ergab eine Supershiftbande, wobei das größer als 59 bp Oligonukeotid diese nicht ergab, was anzeigte, dass das Protein, welches durch das Antiserum erkannt wurde, an eine 37 bp Sequenz zwischen -164 und -128 bindet. Das Fehlen eines Supershifts mit dem -232/-188 Oligonukleotid dient auch als eine Kontrolle für die Spezifität des Antikörpers.
Lokalisierung der Bindungsregion mit dem Antikörper-Supershiftassay. Der Antikörper-Gelshift wurde auch mit 32 P-markierten doppelsträngigen Oligonukleotiden verwendet entsprechend zu den 3'- und 5'-Enden des 95 bp Restriktionsfragments und von rohnukleären Extrakten von K562 Zellen, um die Bindung von Ferritin weiter zu lokalisieren. Auf diese Weise ergab nur das 3'-Oligo die Supershiftbande,' das anzeigt, dass das Protein, das durch das Antiserum erkannt wurde, an eine 37 Basenpaar(bp)-Sequenz zwischen -164 und -128 bindet.
Definition der Bindestelle mit Kompetitionsgelshifts. Um die Bindung von Ferritin weiter zu lokalisieren, mutierten die Erfinder das 37 bp Oligonukleotid an unterschiedlichen Orten, wobei 6 Nukleotide jeweils mit allen As, allen Cs oder allen Gs mit komplementären Nukleotidaustauschen in dem Gegenstrang ersetzt wurden. Ein Kompetitionsgelshiftassay wurde mit dem teilweise aufgereinigten Protein aus erhitzten K562 nukleären Extrakt durchgeführt, in welchen sowohl jedes der unmarkierten mutierten Oligos, als auch die native Sequenz mit der 32 P-markierten nativen Sequenz für eine Bindung konkurrierten. Alle Mutanten konkurrierten genauso wie die native Sequenz für eine Bindung, außer solchen, welche in der -153/-148 Region mutiert waren, d.h. in der Sequenz CAGTGC mutiert waren. Die Erfinder schlossen daraus, dass diese 6 Basenpaare die Bindestelle des Ferritin-Hs umfassen. Die Spezifität dieser Bindung wird in Oligo-Kompetitionen titriert, wobei die unmarkierte native Sequenz mit der Sequenz verglichen werden, welche in allen der 6 Nukleotide mutiert ist, welche entdeckt wurden, für die Bindung wichtig zu sein, d.h. die Sequenz CAGTGC (nativ) mit der Mutante Nr. 4 verglichen, und quantifiziert. Während die Bindung zu der markierten nativen Sequenz signifikant mit 50-fachem Überschuss von unmarkierter Eigensequenz konkurriert, benötigte es einen 1000-fachen Überschuss des unmarkierten mutierten Oligos, damit Kompetition um die Bindung mit der native Sequenz eintrat, eine 20-fache Differenz,.
Sequenzvergleiche des Promotors (-162/+1) aus 12 Säugetier β-Globingene des Erwachsenen zeigen, dass das -150 CAGTGC des humanen β-Promotors sehr hoch konserviert ist. In einem phylogenetischen Vergleich von 12 Säugetier β-Globinpromotoren des Erwachsenen von dem Ort der Kappe bis -162 haben die Erfinder entdeckt, dass die CAGTGC-Sequenz in der -150-Region, unter den am höchsten konservierten der cis-agierenden Elemente ist, an zweiter Stelle nur die TATA- und CCAAT-Boxen, in seinem hohen Ausmaß an Konservierung, genauso hoch konserviert wie das proximale CACC-Motiv und höher konserviert als das distale CACC.
DISKUSSION
Die Ergebnisse der Erfinder zeigen, dass in CV-1-Zellen ein Expressionsklon des humanen H-Ferritins die Expression eines EKLF-stimulierten b-Globinpromotor gesteuerten CAT-Reportergens herunterreguliert. Die Erfinder haben ein Protein in den nukleären Extrakten von K562 Zellen identifiziert, welches einzigartige Eigenschaften besitzt, d.h. Stabilität gegenüber Proteinase K und Hitze (75°C) und Reaktivität zu Anti-Ferritin-Antisera. Ferritin-H bindet an eine 5'-Region des β-Globingens, das für die Aktivierung des β-Globingens in K562 und normalen Erythroidzellen benötigt wird, d.h. die Region zwischen -128 und -222 von dem Ort der Kappe aus. Für diese DNA-Region wurde gezeigt, natives humanes Ferritin in Gelshiftexperimenten zu binden. Die Spezifität der Bindung des Ferritin-ähnlichen Proteins wurde unter Verwendung von verschiedenen DNA-Segmenten und Oligonukleotiden in einen Antikörpergelshiftassays bestätigt, und die Oligos und das Anti-Ferritin-Antiserum wurden verwendet, um zu zeigen, dass die Bindestelle zwischen -128 und -165 ist. Kompetitionsgelshiftassays mit mutierten Oligonukleotiden haben gezeigt, dass die Bindung von Ferritin die Nukleotide CAGTGC benötigt, an Positionen -153/-148 des humanen β-Globingens; und wenn dieses CAGTGC-Motiv mutiert ist, ist die in vitro-Bindung etwa um das 20-fache reduziert. Die Fähigkeit von Ferritin-H in diesem System zu reprimieren, wurde aufgehoben, aber EKLF-Stimulation wird beibehalten, wenn die -153/-148-Ferritin-Bindestelle in dem ko-transfizierten b-Globin-Reporterplasmid mutiert ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ferritin-H das humane b-Globingen des Erwachsenen durch Bindung an den Promotor in sequenzspezifischer Art und Weise reprimieren kann. Die Biologie von Ferritin-H und seiner hochkonservierten Bindestelle, genauso wie seine gezeigte Funktion in transienten Assays, geben an, dass es in K562-Zellen in der Tat als ein b-Globin-Repressor funktioniert. So ein Repressor ist nützlich in der Verbesserung der Sichelzelle und anderen genetischen Krankheiten.
Es ist nennenswert, dass für eine RNA-Sequenz CAGUGN vorher entdeckt worden ist, in der Regulation der Translation und Stabilität von mRNAs, welche für Proteine kodieren, welche im Eisenmetabolismus involviert sind, zu funktionieren, zum Beispiel mRNAs für Ferritin-Untereinheiten und für den Transferrin-Rezeptor. In diesem recht unterschiedlichen Kontext ist das Hexa-Nukleotid an der Spitze einer Stammschleifenstruktur, bezeichnet als IRE (Eisenantwortendes Element), eine stabile Sekundärstruktur gebildet in den 5'- oder 3'-untranslatierten Regionen der einzelsträngigen mRNAs. Das regulatorische Protein, welches an das IRE (das IRE-BP) bindet, wurde als die zytosolische Form von Aconitase identifiziert, ein Kuban-Eisen-Sulfur-Cluster-Protein mit einer molekularen Masse nahe bei 97 kDa. Im Gegensatz erkennt das hitzestabile Ferritin-H die CAGTGC-Sequenz auf der DNA und hat offenbar eine molekulare Masse von etwa 20 kDa, oder weniger, wenn es teilweise proteolysiert ist.
Globingen-Regionen sind in CAGTGC/CAGTGN Sequenzen im Vergleich zu der Frequenz angereichert, die man für die Sequenzen bei zufälligem Auftreten erwarten würde. Das menschliche Genom, genauso die 73.326 bp-Sequenz des β-ähnlichen Globingen-Clusters auf Chromosom 11, bestehen etwa aus 40 % G+C. Daher wird die Frequenz des Auftretens von G und C-Nukeotiden jeweils 0,2 sein, und die Frequenz von A und T wird jeweils 0,3 sein. Die zufällige Frequenz des Auftretens der Sequenz CAGTGC wird (0,2) (0,3) (0,2) (0,3) (0,2) (0,2) _ 0,000144 sein. Daher wird für die Sequenz erwartet werden, zufällig 10 bis 11 Mal in den 73.326 bp des β-ähnlichen Clusters aufzutreten. Das tatsächliche Auftreten ist 36 Mal, 3- bis 4-mal häufiger als die Zahl, die durch Zufall erwartet worden ist. Ähnlicherweise tritt das Pentamer CAGTG (in der Sequenz CAGTGN) 205 Mal auf, wieder etwa 4-mal häufiger, als die 52/53-Male des Auftretens, die bei Zufall erwartet worden sind. Die Funktion dieser Sequenz, wie anderer cis-regulatorischer Elemente, ist Kontext-abhängig. Die Sequenz tritt in den 5'- und 3'-Regionen der Epsilon- und Gamma-Globingene auf, aber diese Orte und ihre umgebenden Sequenzen sind merklich verschieden von dem -153-Ort für das β-Globingen. Bindung des Ferritin-H an den Stellen 5' und/oder 3' an die Epsilon- und Gamma-Globingene wird eher einen stimulatorischen als einen inhibitorischen Effekt auf die Transkription haben.
Phylogenetisches Footprinting ist für die Identifizierung wichtiger Bindestellen für regulatorische Proteine nützlich. Diebezüglich ist es interessant, dass die CAGTGC/CAGTGN-Sequenz sehr hoch in der Sequenz und dem Ort in den Säugetier-β-Globingenpromotoren konserviert ist, und sie wurde in den β-Promotoren von Hühnern und Fröschen genauso entdeckt. Die hohe Konservierung dieser Sequenz zeigt, dass diese Bindestelle eine wichtige Funktion hat. Das Xenopus-Haupt-β-Globingen des Erwachsenen hat die CAGTGC-Sequenz an der -45-Position des Ortes der Kappe, und ein Oligonukleotid, welche diese Sequenz enthält, bindet an das humane Ferritin-H aus K562 nukleären Extrakten stärker als an die korrespondierende Region des humanen β-Globinpromotors. Konsistent mit der Endeckung der Erfinder, dass Ferritin-H als ein Repressor des β-Globins des Erwachsenen in humanen K562-Zellen als ein Repressor agiert, ist die Entdeckung der Erfinder, dass die -150-Bindestelle für dieses Protein mit der β-Haupt-160-Stelle aus der Maus konkurriert, für welche bekannt ist, das Repressorprotein BB1 zu binden.
BEISPIEL 2
MATERIALIEN UND METHODEN
Materialien: Basische Phosphatase aus dem Kalbsdarm, T4 Polynukleotidkinase und Sau96I wurden von Promega/Fisher erhalten. 32P-γ-ATP wurde von Dupont/NEN erhalten. Polyklonales (Kaninchen) Antiserum für humanes Ferritin aus der Milz wurde von Sigma Chemical Company erhalten. Alle anderen Reagenzien waren von molekular biologischer Qualität.
Restriktionsfragmente und Oligonukleotide: Die 5'-Region des humanen β-Globingens (von -610 bis +20), welche vorher in pSV0CAT kloniert wurde, wurde aus dem aufgereinigtem Plasmid durch Verdaue mit HindIII und BamHI herausgeschnitten. Das 630 bp-Fragment wurde PhenoUChloroform behandelt, dephosphoryliert und mit 32-P endmarkiert. Synthetische Oligonukleotide korrespondierend zu der Kern/BP-1-Bindestelle von NCR1 (-584/-527), die distaler liegende der beiden 5'-β-Globin-Silencer, und die -164/-128-Region des Promotors wurden aufgereinigt und annealt, und die doppelsträngigen Oligos wurden endmarkiert wie oben beschrieben wurde und/oder als unmarkierte Kompetitoren in Gelmobilitätsshiftassays verwendet.
Zubereitung der Kernextrakte: Nicht-adhärente K562-Zellen wurden in einer Suspension in einem Medium, zusammengesetzt aus RPMI 1640 und 15 %-igen fötalen Rinderserum, wie beschrieben wurde, wachsen gelassen und bei einer Dichte von 106 Zellen/ml geerntet. Für jede Zubereitung wurde nukleärer Extrakt aus zwei Litern der Zellen zubereitet. Der Proteingehalt der Extrakte lag im Bereich von 3 bis 6 mg/ml. Extrakte, bei denen die Proteine auf etwa 80 % angereichert wurden, welche spezifisch an die -150-Promotorregion und die -550-Silencerregion binden, wurden durch Behandlung der Rohextrakte mit Erhitzen auf 80°C zubereitet.
Gelmobilitätsshiftassays: Gelretardationsassays (d.h. Gelshifts) wurden verwendet, um die DNA-Bindung von teilweise aufgereinigten Proteinextrakten zu bestimmen, zunächst für die synthetischen Oligonukleotide korrespondierend zu der -550 Silcencerregion und zu der -150-Region des Promotors, und anschließend zu dem 630 Basenpaarfragment des humanen β-Globingens, das sowohl die Promotor- als auch die stromaufwärts liegenden regulatorischen Sequenzen mit Modifikationen enthält. Gele, welche für die Retardationsassays verwendet wurden, waren 4 %-ige Acrylamidgele und der Laufpuffer war TAE mit niedriger Ionenstärke.
Experimenteller Aufbau: Der DNA-Schleifenassay wurde durch Mischung eines Extraktes durchgeführt, welcher Proteine spezifisch für die regulatorischen Stellen enthält, für welche vorgeschlagen wurde, mit DNA zu interagieren, welche die angrenzenden Orte enthält, welche durch Eingreifen in die DNA getrennt wurden; und die Bindung der Proteine wird durch einen Standard-EMSA nachgewiesen. Wenn Proteine, die an separate Stellen gebunden sind, in einer stabilen Weise miteinander interagieren, wird die eingreifende DNA eine Schleife bilden, welche an einer einzigartigen Restriktionsschnittstelle in der Schleife geschnitten werden kann. Der Test für die Schleifenbildung ist der, dass der DNA-Proteinkomplex seine EMSA-Wanderung als eine einzelne Bande nach dem Schneiden beibehält. Kontrollen schließen Spuren ein mit deproteinisierten Aliquots der Reaktion bevor und nach dem Restriktionsverdau, um zu beweisen, dass die Schleife in der Tat geschnitten worden ist. Die Bedingungen, welche für das Schneiden des Schleifenkomplexes mit Sau 96 I verwendet wurden, sind im Folgenden beschrieben wird. Der in vitro-DNA-Schleifenassay basierte auf der kombinierten Verwendung des elektromotorischen Mobilitätsshiftassays (EMSA) und einem Schneiden an einer einzelnen Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym. Gelshifts (EMSAs) wurden mit einem teilweise aufgereinigtem nukleären Extrakt aus uninduzierten K562-Zellen und der DNA, vor- und nach dem Schneiden mit Sau 96 I durchgeführt. Die gesamte DNA wurde durch das Protein in einem einzelnen, geshifteten Komplex gebunden, welcher seine Wanderung als eine einzelne Bande nach dem Restriktionsschnitt beibehielt. DNA-Proben wurden nach Deproteinisierung der Komplexe zurück gewonnen. Zubereitung von nukleären Extrakten: Nukleäre Extrakte von nicht-adhärenten K562-Zellen wurden durch die Vorgehensweise von Dignam et al., wie vorher beschrieben wurde, zubereitet. Teilweise aufgereinigte Extrakte, in denen die Bindeproteine von Interesse zu 80 % angereichert wurden, wurden durch Erhitzen der nukleären Extrakte auf 80°C zubereitet, zentrifugiert und die Überstandsflüssigkeit aufbewahrt, wie von Atkinson et al. (25) beschrieben wurde. Der angereicherte Extrakt enthielt Proteine, die die -150 (-164/-128)- und die -530 (-584/-527)- Oligonukleotide in dem Standard-EMSA gebunden hatten. Gehnobilitätsshiftassays (EMSAs): Die Vorgehensweise von Fried und Crothers (26) wurde verwendet, wie von Berg et al. (19) beschrieben wurde, außer, dass jede Reaktion (welche 2 ng [9000 cpm] der 630 bp DNA, 2, 5 μg des Proteinextraktes, 1,0 μg von Poly dI: Poly dC, 100 mM KCl und Bindungspuffer enthielt) in einem Volumen von 5 μl (anstelle der gewöhnlichen 25 μl) war. Dem Protein und der DNA wurde erlaubt, bei Raumtemperatur für 20 Minuten zu interagieren, und die Retardationsassays wurden mit 4 %-igen Acrylamidgelen bei hoher Ionenstärke durchgeführt. Aufbau der DNA-Schleifenbildungsexperimente: Um Schleifenbildung, aufgrund der Interaktion von Promotor-gebundenem Protein mit Protein, welches weiter stromaufwärts gebunden ist (ca. -300--600 bp), nachzuweisen, wurde der DNA-Proteinkomplex ging mit Sau 96 I, welches diese DNA bei der Position -210/-209 bp unter Verwendung der Herstellerangaben schneidet, umgesetzt, mit folgender Modifiaktion: 2 μl Enzym und 15 μl des Enzympuffers + BSA wurden in einem Gesamtvolumen von 31 μl verwendet, welches die Bestandteile (5 μl) der Protein-DNA-Bindereaktion bei Raumtemperatur einschloss.
ERGEBNISSE
Wir haben in einer früheren Veröffentlichung berichtet, dass ein Restriktionsfragment, das einen Teil des distalen Promotors des humanen β-Globingens enthält, von -222/-228 bp, durch Ferritin-H-Protein in nukleären Extrakten von K562-Zellen gebunden ist, und spezifisch für die -150-Region ist. Mindestens 2 Proteine, welche spezifisch für Funktionalität, definierte Silencer, sind, welche stromaufwärts des proximalen und distalen Promotors des humanen β-Globingens angeordnet sind, in den Regionen von -300 (-338/-233) und -530 (-610/-490) von der Stelle der Kappe. Mit dem letztendlichen Ziel der Erforschung der Interaktionen zwischen diesen Silencern und dem β-Promotor, haben wir einen experimentellen Ansatz zum Nachweis der DNA-Schleifenbildung entworfen, welche durch Interaktionen zwischen Proteinen, welche an Stellen gebunden waren, welche durch angemessene Längen der eingreifenden DNA getrennt waren, stabilisiert. Wir haben einen teilweise aufgereinigten K562 nukleären Zellextrakt verwendet, der Proteine enthält, welche diese getrennten Regionen bindet.
Der teilweise aufgereinigte Proteinextrakt, welcher für diese Experimente verwendet wurde, hat gezeigt, dass er sowohl das -150 Promotor-Bindeprotein enthält, als auch die Silencer(-530)-Bindungsaktivität aufweist, in separaten Gelshiftassays mit ihren betreffenden Oligonukleotiden (Daten nicht gezeigt).
DNA ist in ihrer Wanderung aufgrund der Bindung der Proteine aus dem teilweise aufgereinigten K562 nukleären Extrakt verzögert. Wenn das Material mit den Restriktionsenzymen Sau 96 I reagierte, nachdem die DNA und Proteine einen Komplex gebildet hatten; die große Mehrheit dieses Materials war in seiner Wanderung verzögert. Es gibt eine einzelne Sau 96 I-Stelle in der 5' β-Globinsequenz, bei -210, welche die DNA zwischen dem Promotor und seinen stromaufwärts liegenden Regionen schneidet. Es wurde gezeigt, dass ein großes Stück der DNA aus einem Komplex zurück gewonnen wurde, wobei die gesamte DNA von einem anderen Komplex geschnitten wurde, wodurch 2 saubere Banden erhalten wurden, welche in ihrer Wanderung zu den Banden identisch waren, welche erhalten wurden, wenn reine DNA mit dem Restriktionsenzym reagierte. Die Längen dieser Fragmente sind 229 bp (+20/-209, welche den Promotor enthalten) und 401 bp (enthält die stromaufwärts liegenden Sequenzen, einschließlich die Silencer-Regionen). Wenn das Gemisch, das diese Fragmente der vorgeschnittenen DNA enthält, mit diesen teilweise aufgereinigten Proteinen reagiert hat, wurden die beiden Fragmente unabhängig geshiftet, aber der große (Schleifen-bildende) Komplex wurde nicht gebildet. Diese beobachtete Tatsache, dass der Komplex zusammenhält, nachdem die DNA komplett durch Sau 96 I herausgeschnitten wurde, zeigt an, dass eine Schleife anfänglich zwischen einer Stelle oder Stellen stromabwärts von -209 und einer Stelle oder Stellen stromaufwärts von -210 gebildet wurde.
Ferritin bindet an die Promotorregion an der Ferritin-Bindestelle. Verschiedene DNA-Bindeproteine binden auch an die β-Globin-Promotorregion. Die Bindeproteine binden alle stromaufwärts der Ferritin-Bindestelle. Reprimierung des β-Globingens durch Ferritin wird durch eine Protein-Protein-Interaktion zwischen Ferritin und mindestens einem der Promotor-Bindeproteine gesteigert. Ein Protein-Protein-DNA-Komplex wird durch Ferritin mit mindestens einem Bindeprotein gebildet. Die Promotorregion hat eine Ferritin-Bindestelle und stromaufwärts davon eine Proteinbindestelle. Ein Bindeprotein heftet sich an die Bindestelle und Ferritin bindet an die Ferritin-Bindestelle. Ferritin und das Bindeprotein binden dann aneinander, wodurch sie eine Schleifenbildung in der DNA erzeugen. Die Promotorregion kann in zwei kleinere Fragmente geschnitten werden: An einer Restriktionsenzymstelle durch Restriktionenzym Sau 96 I. Wegen der Protein-Protein-Interaktion zwischen dem Bindeprotein und Ferritin bleibt der Komplex intakt. Deshalb resultiert die Anwendung eines Restriktionsenzyms nicht in einem Mobilitätsshift auf einem Gelassay. Entfernen von Proteinen von der angeschnittenen DNA-Schleife resultiert in einer intakten Promotorregion. Entfernen der Proteine von der DNA-Schleife, nachdem sie durch ein Restriktionsenzym geschnitten worden ist, resultiert in zwei DNA-Fragmenten. Wenn Promotorfragmente mit einem nukleären Extrakt kombiniert werden, welcher Ferritin und ein Bindeprotein hat, resultiert dies in einem Gelshift. Dies zeigt, dass die DNA-Schleife durch Ferritin-Bindung an die Promotorregion verursacht wird.
Kontrollen: Kontrollen, welche in die Experimente, welche oben beschrieben wurden, eingebaut wurden, schließen Deproteinisierung der Komplexe ein, um zu zeigen, dass die Schleife durch das Retriktionsenzym geschnitten wurde, und um zu zeigen, dass nicht-betroffene DNA-Sequenzen (zum Beispiel P. puptida DNA) keinen Komplex mit diesem Extrakt bilden. Als eine weitere Kontrolle wurde ein Komplex einer einzelnen Bande isoliert, deproteinisiert, und es wurde auch gezeigt, dass er gleiche Mengen der beiden Restriktionsfragmente enthält, welche aus einem Sau 96 I-Verdau resultieren. Die beiden Sau 96 I-Fragmente der β-Globin 5'-Region shiften unabhängig mit diesem Extrakt und bilden nicht den großen Komplex, außer wenn sie verbunden sind; zudem wird eine etwa 8 mal größere Proteinkonzentration benötigt, um zu beginnen, um die seperaten Restriktionsfragmente zu shiften, genauso wird sie benötigt, um die Bildung des Schleifenkomplexes zu initiieren.
DISKUSSION
Interpretationen: Die berichteten Experimente haben gezeigt, dass DNA-Schleifenbildung in vitro durch einen EMSA-Assay nachgewiesen werden kann, welcher mit einem Verdau mit einem spezifischen Restriktionsenzym kombiniert ist. In diesen DNA-Schleifenbildungsexperimenten zeigen die Ergebnisse, dass Sequenzen zwischen -209 und +20 bp des humanen β-Globingens mit stromaufwärts liegenden Sequenzen zwischen -210 und -610 bp interagieren. Die Schleifenbildung wird durch einen teilweise aufgereinigten Extrakt vermittelt, welcher ein -150 Promotor-Bindeprotein und ein β-Globin-Silencer-Bindeprotein enthält, was durch Bindeexperimente mit dem Extrakt und den separaten Bindesequenzen bestätigt wurde. Wenn der einzelne große DNA-Proteinkomplex, welcher durch unsere EMSAs nachgewiesen wurde, mit Sau 96 I geschnitten wurde, wanderte der Komplex immer noch als ein einzelner, großer Komplex hoch in den Gelen. (Es gab einen kleinen Anstieg in der Wanderung des geschnittenen Komplexes, welcher erwartet wird, da ein einzelner, doppelsträngiger Restriktionsschnitt die DNA-Konformation ein bisschen verändern wird.) Es sollte auch festgehalten werden, dass die Bindung der Proteine in diesem Schleifenkomplex sehr eng zu sein scheint; es wird ein hoher Überschuss von unmarkierten -164/-128 und -584/-527 Oligonukleotiden benötigt, um den Komplex aufzubrechen (nicht gezeigt). Zudem zeigte ein Vergleich der Bindungsaffinität der Volllängen 630 bp DNA mit den Bindungsaffinitäten eines Gemisches der Fragmente, welche durch Sau 96 I erzeugt wurden, dass es etwa 8 mal weniger Protein benötigt, um einen geshifteten Komplex mit der großen, intakten (630 bp)-DNA zu bilden, als mit einem Gemisch der separaten Fragmenten, was zeigt, dass die Bindung an die größere 630 bp DNA zusammen wirkend ist und dass eine Schleifenbildung auftritt.
Alle diese Ergebnisse sind mit bekannten Parametern und Kräften konsistent, die die DNA-Schleifenbildung kontrollieren, welche durch zwei oder mehr Proteine vermittelt wird, welche eine zusammen wirkende (und, für gewöhnlich, enge) Bindung zeigen. Diese Ergebnisse dieser Experimente zeigen auch, dass die Repremierung des β-Globingens durch stromaufwärts liegende Silencer-Regionen durch DNA-Schleifenbildung vermittelt werden kann. Dieser Ansatz erlaubt es nicht, die Identität der Proteine zu bestimmen, welche involviert sind, und können in Fällen nicht funktionieren, wo eine DNA-Supercoilstruktur vorliegt, wie bei bestimmten Plasmidkonstrukten in vitro, oder bei schwachen Protein-Protein-Interaktion.
Die Schleife in der Promotorregion, welche durch die Interaktion zwischen Ferritin und einem oder mehrerer stromaufwärts liegender Bindeproteine gebildet wird, steigert die Reprimierung des β-Globingens. Humane Zellen haben im Allgemeinen genügend Mengen von stromaufwärts liegenden Bindeproteinen, so dass die Zugabe von Ferritin allein zu einer humanen Zelle durch die Verfahren, welche hierin beschrieben wurden, im Allgemeinen ausreichen, um Reprimierung des β-Globingens und anderer Gene, welche durch diese Aktivität reguliert werden, zu verursachen. Zusätzlich ist die Bindung von Ferritin an die CAGTGC Ferritin-Bindestelle im Allgemeinen ausreichend, um Transkription des β-Globingens zu reprimieren.
Ein Verfahren zur Erhöhung der Ferritin-H-Expression ist, die Expression von Ferritin-L oder anderen Proteinen der Ferritin-Familie zu reprimieren. Dies kann unter Verwendung von Antisense-DNA Oligonukleotiden ausgeführt werden, welche für die Gene spezifisch sind, welche für Proteine andere als Ferritin-H der Ferritin-Familie kodieren,. Reduktion und Expression dieser Ferritin-Proteine führt zu einer höheren Konzentration und erhöhten Expression von Ferritin-H. Durch Shiften der Verhältnisse zwischen Ferritin-H und anderen Proteinen der Ferritin-Familie, wird β-Globin reprimiert und die schädlichen Effekte von der Sichelzellenanämie werden auf akzeptierbare Niveaus reduziert.
Erhöhte Expression von Ferritin-H heilt auch intrazelluläre Eisenfehlhandhabung, was in niedrige Niveaus von schädlichen Eisen(II)-Ionen resultiert. Während Ferritin-H Ferroxidaseaktivität eine Rolle in der angemessenen Handhabung von intrazellulärem Eisen spielen kann, beeinflussen höhere Konzentrationen von Ferritin-H die Expression einer Anzahl von Genen, welche in den Eisenmetabolismus involviert sind. Diese genetische regulatorische Funktion von Ferritin-H erleichtert eine angemessene Eisenhandhabung in den Zellen, die durch eine große Anzahl von Krankheiten nachteilig beeinflusst wurden. Wie in dem Hintergrund beschrieben wurde, Krebs, neurodegenerative Krankheiten, neuromuskuläre Funktionsstörungen und Atherosklerose führen alle zu einer ungeeigneten Eisenhandhabung in den Körperzellen. Erhöhung der Konzentration von Ferritin-H und das Resultieren genetischer regulatorischer Effekte verbessert die schädlichen Effekte einer ungeeigneten Eisenhandhabung.
Studien haben gezeigt, dass Ferritin-H die effizienteste Ferroxidaseaktivität besitzt, wenn es annähernd auf denselben Niveaus wie Ferritin-L exprimiert wird. Gleiche Expressionsniveaus resultieren in der höchsten Anzahl von Ferritin-H/Ferritin-L Heteropolymeren. Die heteropolymerische Form von dem 24-mer-Ferritin-Komplex ist der effizienteste bei der Formung von Eisen(II)-Ionen nach Eisen(III)-Ionen und bei der Absonderung von Eisenionen. Dies legt nahe, dass die Beibehaltung gleicher Konzentrationen von Ferritin-H und Ferritin-L am wahrscheinlichsten ist, um in eine geeignete Eisenhandhabung zu resultieren. Erhöhte Niveaus von Ferritin-H würden in die Bildung von Ferritin-H Homopolymeren resultieren. Ferritin-H Homopolymere besitzen eine niedrige Ferroxidaseaktivität. Es würde erwartet werden, dass dies zu höheren Niveaus des schädlicheren Eisen(II)-Ions führt und einen nachteiligen Effekt auf die Zellen haben. Jedoch haben die Erfinder entdeckt, dass die Gen-regulatorischen Funktionen von Ferritin-H verursachen, dass genau das Gegenteil auftritt.
Der Fachmann wird realisieren, dass es eine Anzahl von Wegen gibt, um die Niveaus an Ferritin-H in einer Zelle zu erhöhen. Es kann das Einführen des Ferritin-H-Proteins selber durch eine Anzahl von pharmazeutischen verträglichen Mitteln einschließen, welche dem Fachmann gut bekannt sind. Dies kann die Verwendung von liposomalen Konstrukten, welche Ferritin-H-Protein enthalten, einschließen. Diese Konstrukte können oder können nicht Liganden oder Antikörper haben.
Ein alternatives Verfahren für die Erhöhung intrazellulärer Niveaus von Ferritin-H ist, die Expression von Molekülen der Ferritin-Familie zu regulieren. Dies kann auf einer Vielzahl von Wegen getan werden. Antisense-DNA Oligonukleotide, welche andere Gene der Ferritin-Familie als Ferritin-H anzielen, werden in eine verringerte Expression des Zielgens resultieren und größere und höhere Konzentrationen des Ferritin-Hs in der Zelle verursachen. Es ist auch möglich, Proteine oder andere Verbindungen einzuführen, welche die Transkription oder Translation eines endogenen Ferritin-H-Gens oder eines verwandten Gens der Ferritin-Familie erhöhen. Diese aktivierenden Verbindungen können in die Zellen eingeführt werden, durch Verfahren ähnlich zu der Einführung des Ferritin-H-Proteins selber, wie oben diskutiert worden ist.
Noch ein anderes Verfahren ist zur Erhöhung der intrazellulären Niveaus von Ferritin-H, einen Ferritin-H-exprimierenden Vektor in die Zelle einzuführen. Der Fachmann wird begrüßen, dass es eine Anzahl von Verfahren gibt, um Zellen mit einer Anzahl von verschiedenen Vektoren zu transfizieren, einschließlich Plasmide, Phagemide und Kosmide. Die Art des Vektors der verwendet wird, die Promotorregion in dem Vektor und jede Kontrollsequenzen, welche mit dem Vektor verwendet werden, werden variieren, abhängig von einer Vielzahl von Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Faktoren schließen ein, aber sind nicht darauf limitiert, das angezielte Zellgewebe, das Expressionsniveau der Proteine der Ferritin-Familie innerhalb der angezielten Zellen.
Noch ein anderes Verfahren zur Erhöhung der intrazellulären Niveaus von Ferritin-H ist, die Niveaus von Proteinen oder Verbindungen zu erhöhen, welche die Transkription oder Translation der Ferritin-Promotoren erhöhen.
Verfahren zur intrazellulären Erhöhung können Verfahren berücksichtigen, entweder intrazelluläre Induktionsverfahren, wo die Zelle ihr eigenes Ferritin erzeugt, oder extrazelluläre Einführungsverfahren, wo Ferritin zu der Zelle zugegeben wird, zum Beispiel wenn liposomale Konstrukte verwendet werden.
Transfektionen von Zellen mit Vektoren, welche für ein Protein der Ferritin-Familie kodieren, können entweder ex vivo oder in vivo durchgeführt werden. Wenn dies in vivo durchgeführt wird, werden die Vektoren in den Körper des Patienten eingeführt. Wenn dies ex vivo durchgeführt wird, werden die Zellen mit einem Vektor transfiziert und dann in das Körpergewebe des Patienten implantiert. Stammzellen sind besonders gut hierfür geeignet, jedoch können auch andere Zellen verwendet werden.
Literaturverzeichnis
Zitate in der folgenden Liste von Quellenangaben.

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Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung von (i) Ferritin-H, welches befähigt ist, an den Promotor des humanen β-Globin-Gens an der Position -150 bp von der Transkriptionsstartstelle aus zu binden, (ii) Antisense-Oligonukleotiden, die spezifisch sind für das Gen, das für das Protein der Ferritin-Familie mit Ausnahme von Ferritin-H kodiert, und die die Expression dieses Proteins der Ferritin-Familie unterdrücken, oder von (iii)einem Gen, das für Ferritin-H wie oben in (i) definiert kodiert für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Sichelzellen-Erkrankung oder einer β-Thalassämie, wobei das Medikament nicht für eine Gentherapie ist, die die Keimbahn verändert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament für die Einführung von Ferritin-H wie in Anspruch 1 definiert in Globin-produzierende Zellen formuliert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Ferritin-H wie in Anspruch 1 definiert als ein liposomales Konstrukt bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protein aus der Ferritin-Familie mit Ausnahme von Ferritin-H Ferritin-L ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Gen (iii) in Form eines Vektors vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Vektor als ein liposomales Konstrukt mit einem Liganden oder Antikörper auf seiner Oberfläche bereitgestellt wird, und wobei der Ligand oder Antikörper befähigt ist, an einen spezifischen Rezeptor auf der Oberfläche einer Zelle zu binden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Ferritin-H wie in Anspruch 1 definiert in einem Vehikel bereitgestellt wird, wobei das Vehikel hämatopoetische Stammzellen, erythroide Vorläuferzellen oder hämatopoetische Zellen ansteuert.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Sichelzellen-Erkrankung oder einer β-Thalassämie, wobei die Zusammensetzung umfasst: Ferritin-H wie in Anspruch 1 definiert und einen Liganden, der eine Zelle spezifisch ansteuert.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Sichelzellen-Erkrankung oder einer β-Thalassämie, wobei die Zusammensetzung umfasst: ein Gen, das Ferritin-H wie in Anspruch 1 definiert kodiert, und einen geeigneten Vektor für die Transfektion.