JP2005512941A - フェリチンに関連する遺伝子制御療法 - Google Patents

Abstract

鎌状赤血球病、癌、神経変性疾患、フリードライヒ運動失調症およびその他の神経筋障害、およびアテローム性動脈硬化を含む疾患を改善するために、鉄代謝に関連する遺伝子発現を制御するための方法が記載される。このアプローチは、フェリチン-H、つまり細胞核に存在する鉄-結合タンパク質がヒトβ-グロビン遺伝子、つまり鎌状赤血球病にて変異を受ける遺伝子を抑制できることを示す最近の知見により説明される。フェリチン-Hあるいは関連するフェリチン-ファミリーペプチドは、ペプチド自身（あるいはその一部）として、フェリチン-H-サブファミリー遺伝子として、あるいはフェリチン-H-サブファミリー遺伝子自身の発現を増加させる遺伝子レギュレーターを介してのいずれかで効果細胞へ与えられると、上で名前を挙げたものを含む疾患の病因に鉄の有用性の増加が関係している障害における疾患状態の発現を予防あるいは改善する。

Description

【０００１】
発明の属する分野
本発明はフェリチンに関連する遺伝子制御療法に関する。より具体的には、本発明は鉄代謝および制御に関する遺伝子の制御のためにフェリチン-Hおよびその誘導体タンパク質を使用することに関する。
【０００２】
1 ．先行技術
鎌状赤血球病の背景
造血、あるいは血液細胞の形成は、血島と呼ばれる幹細胞のクラスターとして発生中のヒト胚中で始まる。これらの細胞は発生の約3週目に卵黄嚢中に現れ、そして約3ヶ月目に血液細胞形成の主要部位となる発生途中の肝臓へ遊走する。脾臓、リンパ節および骨髄は全て血液細胞形成に対する寄与は小さいが、4ヶ月になって初めて骨髄が造血の主要部位となる。出生時は、事実上全ての血液細胞は骨髄を起源とする。血液形成細胞の小さな増殖巣は長期間肝臓に残るが、肝臓の血液細胞形成は少量へと低下する。同時に、全ての骨髄は活発に血液細胞を形成し、そしてそれは成熟期後、つまり血液細胞形成の主要部位が椎骨、肋骨、胸骨、頭蓋骨、骨盤および大腿骨および上腕骨の近位骨端領域の骨髄になる約18歳まで続く。これらの領域は利用可能な骨髄の約半分を表す。その残存する骨髄腔は黄色脂肪組織で満たされる。
【０００３】
成体では、造血には骨髄、リンパ節および脾臓が関連する。これらの臓器および関連する組織は伝統的に骨髄系およびリンパ系組織-型に分けられる。骨髄系組織および骨髄系組織由来細胞には、赤血球、血小板、顆粒球および単球が含まれる。リンパ系およびリンパ系由来組織には、胸腺、リンパ節および脾臓が含まれる。骨髄系／リンパ系分類は、これらの2つの型の組織は単一の多能性幹細胞を起源とすると信じられているため、いくらか人為的である。
【０００４】
リンパ系および骨髄系幹細胞は、多能性細胞の分類から形成され、全ての一連の細胞型にとっての前駆体である。リンパ系幹細胞にとっての約束された（committed）細胞-型には、成熟T細胞を形成するpro-T細胞およびプラズマ細胞に分化するpro-B細胞が含まれる。中間的な細胞型は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖、Iaタンパク質およびその他の細胞表面マーカーの発現などの細胞-表面現象に基づいて識別することができる。骨髄系幹細胞にとっての3つの約束された細胞-型には、E／メガ細胞、顆粒球／マクロファージ-CFU細胞（CFU-G/M）、および好酸球-CFU細胞（CFU-Eo）が含まれ、E／メガ細胞は赤血球-バースト形成単位（BFU-E）に分化した後、赤血球-コロニー形成単位細胞（CFU-E）および巨核球-CFU細胞（CFU-メガ）に分化し、顆粒球／マクロファージ-CFU細胞（CFU-G/M）はCFU-GおよびCFU-M細胞に分化し、および好酸球-CFU細胞（CFU-Eo）は最終的に成熟好酸球を形成する。これらの約束された細胞型は主に骨髄に存在するが、いくつかは血流内で体中を循環する。
【０００５】
骨髄における細胞型の相対的割合は約3対1の骨髄系／赤血球系比であり、約60%の顆粒球およびそれらの前駆体、約10%のリンパ球およびそれらの前駆体、約20%の赤血球およびそれらの前駆体、および約10%の同定されない細胞が含まれる。髄腔における優勢な骨髄系細胞型は、骨髄球、後骨髄球および顆粒球である。赤血球系コンパートメントにおける優勢な細胞型は、多染性および正染性正赤芽球である。正常な鉄代謝の状態下では、約30%から40%の正赤芽球が散在性のフェリチン顆粒を含有する。これらの細胞はシデロブラストと言われ、そしてそれらが含有する鉄顆粒は、細胞が鉄をプロトポルフィンに挿入してヘムを形成するときに引き出される貯蔵器である。ヘムの産生およびグロビンの産生は細胞内で正確にバランスを取られている。いかなる理由でもいずれかが妨げられたりあるいは低下したりすれば、余剰なフェリチンがシデロブラスト中に蓄積する。この鉄蓄積の増加はヘム合成の部位であるミトコンドリアにおいて視覚化できる。
【０００６】
赤血球の主な機能は、酸素を体の組織に運搬することである。小さい方の機能としては、栄養素、細胞間のメッセージおよびサイトカインの運搬、および細胞性代謝産物の吸収が含まれる。貧血、あるいは赤血球あるいは赤血球容量の損失は、酸素を運搬する血液の能力の減少として大まかに定義することができ、そして急性あるいは慢性的でありうる。慢性的な血液損失は外因的な赤血球異常、赤血球の内因的な異常あるいは欠陥産生により引き起こされうる。外因的あるいは付加的（extra）-血球異常には、輸血反応および赤芽球症などの抗体-媒介性障害、微小-血管障害性溶血性貧血、血栓性血小板減少性紫斑病および播種性血管内凝固などの赤血球への機械的外傷が含まれる。加えて、プラスモジウムなどの寄生虫による感染、例えば、鉛中毒由来化学的傷害、および脾機能亢進症などによる単核系における金属イオン封鎖は、赤血球障害を誘発しうる。
【０００７】
ヘモグロビンは4つのタンパク質鎖、2つのアルファ鎖および2つのベータ鎖（α₂β₂）を含み、一緒に混合され、各々それ自身の鉄分子および約68 kDの結合分子量を有する。ヘモグロビン巨大分子は通常はグリコシル化され、そして肺から酸素を吸収するときに酸化ヘモグロビン（HbO₂）に変換する。少なくとも6つの異なるヘモグロビンの型があり、各々は発生中に様々な時期に発現する。胚におけるヘモグロビンは少なくとも3つの型、Hb-Gower 1（ξ₂ε₂）、Hb-Gower2（α₂ε₂）、およびHb-Portand（ξ₂γ₂）にて見出される。胎児におけるヘモグロビンはほとんど全てHbF（α₂γ₂）を含み、一方、成体におけるヘモグロビンは約96%はHbA（α₂β₂）、約3%はHbA₂（α₂δ₂）および約1%は胎児HbF（α₂γ₂）を含む。ξ-からα-およびε-からγ-のグロビン発現の胚でのスイッチは、卵黄嚢において始まる。しかし、胚ξ-およびε-の鎖は胎児の肝臓に見出されており、そして胎児型への完全な移行は胎児発生の後期まで起こらない。γ-からβ-への胎児スイッチは造血のより後期において始まり、産生されるβ-グロビンの量は妊娠期間にわたり増加する。出生時、β-グロビンは約40%の非-α-グロビン鎖合成から成り、そしてその後急速に増加し続ける。
【０００８】
グロビン鎖発現における欠損あるいは変異はよく起こる。これらの遺伝子変異のいくつかは、個人に対して有害をもたらさないかあるいはほんの小さな結果をもたらすだけであるが、しかし、大半の変異は、機能的あるいは構造的に効果的に鉄を結合できないこと、鎖あるいは鎖の対が効果的にあるいは適正に相互作用できないこと、分子が酸素を吸収あるいは放出できないこと、十分な量の1つあるいはそれ以上のグロビン鎖を発現できないことあるいはこれらの機能不全の組み合わせを通して、インタクトあるいは正常なヘモグロビン分子の機能を阻害する。例えば、β鎖の6番目の位置でのグルタミン酸からバリンへの置換はHbSを産生し、そして約30%のアフリカ系アメリカ人に起こることが見出された。HbSヘテロ接合体では、全ヘモグロビンの約40%のみがHbSであり、残りはより正常なHbAである。
【０００９】
脱酸素のとき、HbS分子は凝集および重合化し、最終的には鎌あるいはヒイラギ葉形状を獲得する赤血球の形態的ゆがみに至る。鎌状化は2つの主な結果、つまり慢性溶血性貧血および組織に対して虚血性損傷をもたらす小血管の閉塞、を有する。さらに、低酸素緊張状態に暴露されるとき、重合化によりHbSヘモグロビンは遊離-浮遊液体から粘性ゲルに変化する。結果として、鎌状赤血球貧血に関する病理の程度は、患者系におけるHbSの相対的な量と一致しうる。
【００１０】
重度の鎌状赤血球貧血を有する個体は、出生後約5から6ヶ月までは症状が発生しない。これらの幼児では、胎児ヘモグロビンはHbSと相互作用せず、十分量が存在する限り、HbS疾患の効力をモジュレートできることが決定された。このγ-グロビンをモジュレートする効果はまた、HbCおよびHbDなどのその他のβ-グロビン障害、およびβ鎖のその他の変異でも観察される。HbS重合化はまた、細胞のヘモグロビン濃度により著しく影響される。HbS濃度が高ければ高いほど、2つあるいはそれ以上のHbS分子間の接触の機会が大きくなる。脱水によりヘモグロビン濃度は増加し、そして大いに鎌状化が容易となる。
【００１１】
ある程度まで、鎌状化は可逆的な現象である。酸素緊張が増加すると、鎌状赤血球は解重合する。この重合-解重合のプロセスは赤血球膜に対して大きな損傷を与え、そして結局、完全に酸素化されるときでさえそれらの異常な形状を保有する不可逆的な鎌状赤血球（ISC）をもたらす。正常の120日の寿命と比較して、平均的なISCは体内で約20日間生存する。HbS症候群を有する個体は、頻繁な感染、著しい網状赤血球増加症を伴う慢性的な溶血および高ビリルビン血症を有する。疾患の経過は典型的には、血管-閉塞危機と呼ばれる様々な痛みをともなう危機で中断される。これらの危機は、器官、腹部、胸部、四肢あるいは関節における低酸素障害および梗塞の症状の発現を示す。足の潰瘍は、この疾患の血管-閉塞傾向の付加的な徴候である。中枢神経系の関与は一般的であり、痙攣および発作でさえ起こす。形成不全危機もまた一般的であり、骨髄活性の一過性の停止を示し、そして感染、葉酸欠乏あるいはその両方により誘発されうる。危機は一時的および可逆的であるが、しかし致死的でもありうる。危機的な症状の発現由来の傷害は蓄積される傾向があり、より穏やかな鎌状赤血球障害の型を有するそれらの個体においてさえ、寿命は大いに短縮しうる。代替的な介入がないと患者は典型的には30歳前に亡くなる。
【００１２】
クロフィブリック酸（clofibric acid）（ClC₆H₅OC(CH₃)₂COOH）、p-クロロフェノキシ酢酸（ClC₆H₅OCH₂COOH）、およびフェノキシ酢酸（C₆H₅OCH₂COOH）を含む抗-ゲル化化合物は、人工的な非酸素化血液において重合を予防的に阻害することが示された。これらの化合物は鎌状赤血球病において血液細胞が鎌状になるのを防ぐために限られた点で有用でありうることが推測された。そのような治療は、体内で全てのヘモグロビンが結合するのに化学的に十分な量を投与することができれば、血管-閉塞危機により引き起こされる症候的な症状の発現の頻度を潜在的に減少させうる。
【００１３】
サラセミア症候群は、HbAのグロビン鎖の欠損あるいは合成の低下により全て特徴づけられる障害の雑多な群である。β-グロビン発現の欠乏はβ-サラセミアとして、およびα-グロビンの欠乏はα-サラセミアとして言及される。不完全なグロビン鎖合成の溶血性の結果は、1つの鎖の合成低下および相補鎖の過剰からも起こる。遊離鎖は赤血球内で不溶性含有物中に凝集する傾向があり、成熟しつつある赤血球およびそれらの前駆体の早期破壊、効果的でない造血、および成熟赤血球の溶血を引き起こす。ヘモグロビン合成の基礎をなす欠陥は数年をかけて解明されており、そしてα-あるいはβ-グロビンタンパク質の発現あるいは発現の調節をする核酸配列中に主として存在する。
【００１４】
哺乳類のグロビン遺伝子発現は、発生中は高度に制御されている。α-およびβ-グロビン遺伝子の基本構造は類似しており、α-およびβ-グロビンの合成の基本ステップも同様に類似している。16番染色体に位置する少なくとも5つのヒトα-グロビン遺伝子があり、同一のポリペプチドをコードしてそしてそれらの3'-非翻訳領域においてのみ異なる141アミノ酸の2つの成体α-グロビン遺伝子、1つの胚α遺伝子Z（ζ）、および少なくとも2つの偽-α遺伝子（pseudo-αgene）、プシーゼータ（ψZ）およびオメガアルファ（ωα）を含む。
【００１５】
ヒトβ-グロビン遺伝子クラスターには、1つの胚遺伝子、イプシロン（ε）、2つの成体ベータグロビン遺伝子、ベータ（β）およびデルタ（δ）、2つの胎児ベータグロビン遺伝子G-ガンマ（G-γ）およびA-ガンマ（A-γ）、これらはただ1つのアミノ酸のみで異なる、および少なくとも1つの偽-ベータ遺伝子、プシーベータ（ψβ）が含まれる。全ては、ヒト11番染色体の単一の43キロ塩基セグメントから発現する。胎児β-型グロビン、あるいはγ-型グロビンは、哺乳類の発生の最も早期のステージにて発現し、そして妊娠の約32から34週まで持続する。このステージで、β-グロビンの成体型が発現および胎児タンパク質から置換し始める。臨床的な血液学的結果とスイッチングに対応する様々な変異の位置とを相関させる研究により、δ-遺伝子の5'-末端の上流に位置する領域は、成体におけるγ-遺伝子発現のシス抑制に関連しているかもしれない、ということが示される。胎児から成体タンパク質へのこのスイッチの刺激物質は未知である。
【００１６】
各々のβ-グロビン遺伝子は、約146アミノ酸をコードする3つのエクソン、2つのイントロンおよびプロモーター配列を含有する5'非翻訳領域および3'非翻訳領域を含む。β-グロビンの生合成は遺伝子全体の転写で始まり、続いてメッセージのRNAプロセッシング、スプライシングによるイントロンの除去、ポリA付加、キャッピングおよび転写後修飾となる。成熟mRNA分子は核から輸送されて、そしてβ-グロビンに翻訳される。各々のこれらの機能の欠損は、特定のサラセミアとの関連が見出された。同定された変異には、単一-ヌクレオチド欠失、挿入および置換、フレームシフト変異、コード領域あるいは調節領域の全セグメントの欠失、不適切な終止シグナル、異常なスプライシングシグナル、および複数の変異が含まれる。β^o-サラセミアは、あらゆるβ-グロビン鎖の完全欠損により特徴付けられる；β⁺-サラセミアは、β鎖の量の検出可能な減少の存在により特徴付けられる。
【００１７】
β-サラセミアの3つの主要なカテゴリー、サラセミアメジャー（thalassemia major）、サラセミアインターメディア（thalassemia intermedia）およびサラセミアマイナー（thalassemia minor）がある。サラセミアマイナーの患者は全体的に無症状であることがあり、遺伝子型はβ⁺/βあるいはβ^o/βである。赤血球異常は検出されるが、症状は穏やかである。サラセミアインターメディアの患者は最もよく見られ、遺伝子型はβ⁺/β⁺あるいはβ^o/βであり、そして習慣的ではない輸血により緩和できる重度の症状を有する。対して、サラセミアメジャーの患者は遺伝子型はβ^o/β^o、β^o/β⁺あるいはβ⁺/β⁺であり、定期的および頻繁な輸血が必要となる。小児は重度の成長遅延を受け、そして貧血の根深い影響により早い年齢で亡くなる。より長く生存した患者は、形態学的な変化を受ける。頭蓋骨内の骨髄の拡張のために顔面は歪み、後に肝脾腫大症が起こり、生殖器官を含む内分泌器官の発達が遅くなり、そして二次的なヘモクロマトーシスを伴う進行性の鉄過負荷が起こる。
【００１８】
β-サラセミアの2つの直接的な結果がある。第1に、HbAの不適切な形成、それゆえの酸素運搬能力の低下がある。α-およびβ-鎖合成の不均衡に帰因する複数の影響もある。驚くべきことに、グロビン鎖不均衡の病理学的な結果は、より重症であるようである。遊離α鎖は、不溶性含有物の形にて赤血球前駆体内に沈澱する不安定な凝集を形成する。これらの含有物は細胞膜に損傷を与え、カリウムの損失を引き起こす。赤血球に対するこれらの含有物の蓄積による影響は、効果的でない造血である。骨髄中の推定70%から85%の正赤芽球は、結局破壊される。即時の破壊を回避したものは、マクロファージが異常細胞を除去する脾臓により除去されるリスクが増加する。さらに、溶血は、骨髄内における赤血球系前駆体の集団を拡大するエリスロポエチンの発現の増加を誘発し、そして骨格異常をもたらす。β-サラセミアのもう一つの重度の合併症は、患者が食餌性鉄を吸収する能力の亢進を有する傾向にあることである。サラセミアの大半の治療は赤血球の複数の輸血を含むため、患者はしばしば全ての器官および特に肝臓に損傷を与える重度の鉄過負荷の状態になる。彼らの系にある鉄の量を減少させるため、一般的に鉄キレーターを投与する。役立つけれども、患者は疾患および鉄過負荷の蓄積する影響のため、平均して約17から35歳の間で死亡する。
【００１９】
成体β-グロビンが形成されないが、しかし重度の合併症が避けられるという健康な個体での遺伝子型の変化が同定された。これらの患者は、失われたβ-グロビンタンパク質を置換するのに十分な量で胎児グロビンあるいはγ-グロビンを構造的に発現する。胎児ヘモグロビン（HPFH）の遺伝的持続性には、胎児β-グロビン遺伝子、A-γおよびG-γ、の1つあるいは両方が含まれるかもしれない。明らかに、どちらかのγ-グロビンタンパク質の一貫性のある産生により、異常あるいは失われたβ-グロビンタンパク質の必要な機能が達成される。
【００２０】
様々な小分子が、ヘモグロビンあるいは胎児グロビン発現をもたらすことが示された。早期の実験により、酢酸（CH₃COOH）、プロピオン酸（CH₃CH₂COOH）、酪酸（CH₃CH₂CH₂COOH）、およびイソ酪酸（CH₃CH(CH₃)COOH）の全ては、培養フレンド白血病細胞においてヘモグロビン合成を誘導することが示された。さらなる研究により、酸アミドなどの極性化合物および脂肪酸は、マウス赤白血病細胞において胎児グロビン遺伝子および成体グロビン遺伝子の両方の発現を刺激できることが示された。もう一つの相対的に小分子であるヒドロキシウレア（H₂NCONHOH）は、グロビン発現を刺激することが見出された。しかし、刺激は胎児グロビンにそれほど特異的ではないようである。ヒドロキシウレアは現在、鎌状赤血球病の治療に使用される唯一の薬剤である。しかし、抗新生物リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤に発癌性があることは大きな懸念である。その発癌性特性のため、それを医薬品として広範および長期的に使用することは、疑わしい慣習となる。その他のリスクに対する患者の暴露を含まない鎌状赤血球病を治療する方法を見出す必要性が強くある。
【００２１】
γ-グロビン遺伝子からの発現は、胎児網状赤血球産生を誘導する細胞障害剤であるシトシンアラビノシド（AraC）、および周知のDNAメチラーゼ阻害剤である5-アザシチジン（AZA）などの薬剤を使用してin vivoおよびin vitroでうまく操作された。AZAの継続的な静脈内投与により、骨髄細胞のγ-グロビンmRNAは5-から7-倍増加する。さらなる研究により、AZA処理後に骨髄中の幹細胞の集団における著しい変化があることが示された。これらの実験により、AZAの効果は特定の遺伝子発現に対するあらゆる直接的な効果より、赤血球系前駆細胞の再プログラム化および補充に帰因することが示される。AZA、AraCおよびヒドロキシウレアを含むこれらの薬剤の多くは、長期使用を非実用的にする骨髄毒性、発癌性および催奇性を有する。
【００２２】
異常ヘモグロビン症の治療における大きな突破口の一つは、酪酸（ブタン酸；CH₃CH₂CH₂COOH）が正確におよび特異的にヒト胎児（γ）グロビン遺伝子の転写を刺激することが発見されたときにつくられた。これらの知見は素早くin vivoで確認され、その中で、酪酸の薬理学的容量はフェニルヒドラジンの注射により貧血にされた成体ニワトリにおいて胎児グロビンの発現を大いに増加することが示された。酪酸の既知の効果であるヒストンのアセチル化が、胎児遺伝子発現の増加の少なくとも一部の原因であることが推測された。
【００２３】
その後、酪酸の50以上の誘導体において、胎児グロビン産生を刺激する効果があることが見出された。これらのいくつかには、ナトリウムおよびアルギニン酪酸などの酪酸塩、α-アミノ-n-酪酸（ブチルアミド；CH₃CH₂CH₂CONH₂）、およびイソブチルアミド（CH₃CH(CH₃)CONH₂）が含まれる。試験的な研究では保証されていたが、治療された患者はかれらの系において胎児グロビンの適正レベルを維持することができなかった。酪酸のこれらの型の多くは極端に寿命が短いことが、後に確定した。血清中での酸素化、肝細胞によるクリアランスおよび腎臓を通しての濾過により、患者の系から急速にこれらの薬剤が除去された。その他では、患者は急速に耐性を発生させたか、あるいは化合物の代謝産物は望ましい効果と逆のものを有していた。
【００２４】
最近、多くの脂肪族カルボン酸が、K562ヒト赤白血病細胞において特異的に胎児グロビン発現を増加するそれらの能力に関してテストされた。より長い鎖は細胞に対して毒性であると考えられたが、プロピオン酸（CH₃CH₂COOH）および吉草酸（ペンタン酸；CH₃CH₂CH₂CH₂COOH）は最も効果的であることが見出された。酪酸（CH₃(CH₂)₂COOH）、カプロン酸（CH₃(CH₂)₄COOH）、カプリル酸（CH₃(CH₂)₆COOH）、ノナン酸（CH₃(CH₂)₇COOH）、カプリン酸（CH₃(CH₂)₆COOH）は、かなり小さな効果しか産生しなかった。フェニル酢酸（C₆H₅CH₂COOH）およびその前駆体である4-フェニル酪酸（C₆H₅CH₂CH₂CH₂COOH）は、胎児グロビン発現網状赤血球の増殖を低下させるが、しかし培養赤血球系前駆細胞において細胞当たりの胎児グロビンの相対的割合を増加させることが見出された。酪酸異化の代謝産物である酢酸（CH₃COOH）は、赤血球前駆体集団およびまた胎児グロビン合成の両方を増加した。しかし、これらの研究はまた、陽性効果は非常に短時間維持され得るのみであることも示した。
【００２５】
胎児グロビン発現を増加するその他の方法論は、胎児グロビンを発現するために赤血球系前駆細胞の補充および再プログラム化に焦点を当てた。このアプローチを使用してin vivoあるいはin vitroでテストされる薬剤には、エリスロポエチン（EPO）、顆粒球／マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、およびインターロイキン-3（IL3）などの造血増殖因子が含まれる。これらの因子の各々は、組織培養細胞にて胎児グロビン合成を増加させることが見出された。
【００２６】
胎児グロビン発現に影響を及ぼすことを示すその他の薬剤には、アクチビンおよびインヒビンが含まれる。インヒビンは、2つのサブユニットがジスルフィド結合したホルモンであり、下垂体からの卵胞刺激ホルモンの分泌を抑制する。アクチビンは、時々赤芽球分化誘導因子（EDF）あるいは卵胞刺激ホルモン放出ホルモン（FRP）として言及され、またホルモンであり、そしてこれらの巨大分子の両方は培養ヒト赤血球においてヘモグロビンの蓄積を誘発した（S. P. Perrine et al., Blood 74:114a, 1989）。最近、研究により、マウスのスチール座（steel locus）の産物であるスチール因子（steel factor）もまた赤血球系前駆体において胎児グロビン合成に影響を与えることができることが示された。
【００２７】
いくつかの研究は、ブチル酸およびその他の小有機分子が胎児グロビン発現を刺激できるという機序に焦点を当てた。培養での細胞を用いた実験により、ブチル酸はおそらく1つあるいはそれ以上のヒストンデアセチラーゼの活性を低下させることによって、ヒストンのアセチル化のレベルを増加させることで作用しうることが示された。結果としてのヒストンの過剰アセチル化（hyperacetylation）により、ヌクレオソームのアンフォールディングが生み出され、そしてそれにより、遺伝子発現が増加されうる。その他の研究により、β遺伝子複合体の周りのDNA領域の低-メチル化は、サラセミア患者においてγ-グロビン遺伝子発現の増加と相関することが示された。あるいは、ブチル酸およびその他の小分子は、転写を制御する薬剤に直接的に作用することにより特異的な遺伝子発現を増加するために機能しうる、いわゆる転写因子である。これらの因子は、近位に位置する遺伝子の発現を調節する領域にあるゲノムに沿った配列-特異部位に結合する。
【００２８】
ヒトα-グロビン遺伝子座に対して、β-座は、部分的には、HPFH患者におけるβ-グロビン遺伝子の複数の変異の同定により非常に詳細に解析された。β-座は、イプシロン遺伝子の5'の8-16 kbpに広がる座調節領域（LCR）として言及される大きな上流配列を含有する。この配列は4つのDNase高感度部位であるHSS1-5に分けられ、エンハンサー配列、サイレンサー配列、転写因子結合部位およびその他のシス作用配列を含有する。β-グロビンクラスターの各々の遺伝子は、LCRにおいてエンハンサーエレメントと協力して作用するそれ自身のプロモーターを含有する。実際に、LCRの欠失により、β-グロビン発現が少なくあるいは無くなるサラセミア症候群となる。これらの結果により、発現するβ-グロビン遺伝子はLCRにわたり競合的な相互作用を働かせ、そのためそのエンハンサー効果はいずれかの所定の発生の時期にて単一遺伝子に対してのみ有用であることが示される。
【００２９】
β-グロビン遺伝子発現のレベルを変えると考えられる多くの転写因子がβ-座にて同定された。LCRのエンハンサーエレメントは、転写因子AP-1の結合部位の直列のセットと重なる核因子E2（NF-E2）のための結合部位の対を含有することが示された。NF-E2は造血-特異的基本ロイシンジッパータンパク質であり、そしてAP-1結合部位は様々なグロビン遺伝エレメント上に位置していた。最近、AP-1/NF-E2部位の上流に位置する保存配列（CS）は、エンハンシング活性を増大させることが提案された。
【００３０】
β-グロビンクラスターのプロモーター内でエレメントと結合するさらなる因子が同定された。CATボックス置換タンパク質（CAT box displacement protein）（CDP）は、多くの遺伝子プロモーターの約50 bp上流に位置するCAAT配列に結合する。もう一つの広く偏在する転写因子であるSP1は、位置-140および-202に、およびおそらく同様にさらなる部位に結合する。TAFII110はβ-グロビンプロモーターの多くのTATAボックスに結合することが示された。転写因子GATA-1は転写開始部位（GATA）に結合し、そして活性開始複合体を形成するときにTFIIDにより置換させられるかもしれない。もう一つの赤血球系-特異的因子であるYY1は、グロビン制御領域中に分布する少なくとも11部位に結合する。
【００３１】
最近、ヘモグロビン発現の発生の制御に関連しうる因子が同定された。この因子はステージセレクタータンパク質（SSP）と名付けられ、ステージセレクターエレメント（SSE）として言及されるガンマグロビンプロモーターの約50-60 bp上流に位置する部位に結合する。SSEはまた、多くの変異がHPFH症候群の患者において見出された部位でもある。SSPはK562細胞核抽出物から精製され、そしてその相対的な胎児および赤血球系特異性は、SSEおよびまたεプロモーター内の部位上でのSSP複合体の組立て、およびそれに続くRNAポリメラーゼとの相互作用を選択的に可能にするCP2と言われる 40-45 kDのヘテロ二量体パートナータンパク質に帰因する。
【００３２】
発生のヘモグロビン（Hb）スイッチングの機序を解明することにより、鎌状赤血球病あるいはβ-サラセミアを有する成体における胎児Hbの再活性化が可能になり、つまりこれらの疾患の臨床的徴候を軽減する操作が可能となる。鎌状赤血球病を引き起こす成体β-グロビン遺伝子の変異型の不活性化はまた、それによりγ（胎児）-グロビン発現の代償的な増加をもたらすため、臨床的な価値がある。
【００３３】
グロビン遺伝子の発生制御には複数のトランス作用性因子（transacting factor）が含まれることが明らかであり、スイッチングの機序はクロマチンリモデリングおよび様々なDNA領域で結合するタンパク質因子間の相互作用が必要であるようだ。少数の既知のDNA-結合タンパク質はいくつかの発生特異性を示すが（例えば、成体β-グロビン遺伝子の陽性レギュレーターである赤血球系クルッペル様因子、ELKF；（Donze, D., Townes, T. M. & Bieker, J. J. (1995) J Biol Chem 270, 1955-9）；およびγグロビン遺伝子を活性化するが、しかしまた、より低い程度でε-およびβ-グロビン遺伝子を活性化するFKLF-2（Asano, H., Li, X. S. & Stamatoyannopoulos, G. (2000) Blood 95, 3578-3584））、Hbスイッチングを媒介する因子の正確な組み合わせおよび正確にそれらがどのように起こるかは明らかではない。
【００３４】
ヘミンで処理されたヒトK562細胞は胚赤血球系細胞と同様なHb表現型を示し、主にe-およびg-グロビンを発現するが、しかし成体β-グロビン発現しない。すなわち、ヒトおよびその他の脊椎動物の胚赤血球はまた、（主に、他の細胞による使用のために鉄を貯蔵する）特殊化-細胞（H）型の多量のフェリチンを含有する、一方で、成体の赤血球は自己／細胞内使用のために鉄を貯蔵するハウスキーピング型（housekeeping type）のもっと少量のフェリチンを含有する。
【００３５】
長い一連の実験の後、発明者はCV-1細胞においてヒトH-フェリチンの発現クローンがEKLF-刺激β-グロビンプロモーター-駆動CATレポーター遺伝子の発現を抑制制御することを発見した。発明者はさらに、K562細胞の核抽出物中のフェリチンが-153および-148の間の5'-β-グロビンDNAに結合できること、および高度に保存されたヘキサヌクレオチド配列CAGTGCがこの結合に必要であることを示す。この配列はDMSO-誘導MEL細胞でのβ-グロビン発現に必須であり（deBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L. & Grosveld, F. (1988) Embo J 7, 4203-4212）、および非誘導MEL細胞においてβ-グロビンリプレッサーと言われている結合部位の一部である（Macleod, K. & Plumb, M. (1991) Mol Cell Biol 11, 4324-32）。このCAGTGCモチーフが変異を受けるとき、in vitroでの結合は約1/20に減少する。-153/-148フェリチン結合部位がコトランスフェクションされたβ-グロビン-レポータープラスミドにおいて変異を受けるとき、フェリチン-Hのこの系における抑制する能力は廃止されるが、しかしEKLF-刺激は保持される。これらの結果は、フェリチンHは配列-特異的様式にてプロモーターと結合することによりヒト成体β-グロビン遺伝子を抑制できることを示す。このフェリチン-ファミリータンパク質およびその結合部位の生物学、ならびに一過性アッセイにおいて証明される機能により、K562細胞においてそれが実際にβ-グロビンリプレッサーとして機能していることが示唆される。上記のように、そのようなリプレッサーは鎌状赤血球およびその他の遺伝性疾患を改善するのに有用である。
【００３６】
研究により、フェリチン-Hはフェリチン-Lとおよそ同レベルで発現されるとき、最も効率的なフェロオキシダーゼ活性を提示することが示される。等しい発現レベルは、最多のフェリチン-H/フェリチン-Lヘテロ重合体をもたらす。24マーのフェリチン複合体のヘテロ重合体型は、最も効率的に第1鉄（鉄（II））イオンから第2鉄（鉄（III））イオンへの変換および鉄イオンの隔離を行う。これは、フェリチン-Hおよびフェリチン-Lの等しい濃度を維持することが、適切な鉄管理となる可能性が最も高いことを示唆する。フェリチン-Hのレベルの増加により、フェリチン-Hホモ重合体の形成がもたらされるであろう。フェリチン-Hホモ重合体は低いフェロオキシダーゼ活性を提示する。これはより高いレベルのより有害な第1鉄（鉄（II））イオンをもたらすこと、および細胞へ悪影響をもたらすことが予測されであろう。しかし、発明者は、フェリチン-Hの遺伝子制御機能がちょうど逆のことが起こるのを引き起こすことを発見した。
【００３７】
皮膚癌およびその他の癌に関する背景：
紫外線（UV）光はヒト皮膚に対して損傷を与えることが知られており、そして皮膚癌の病因に関係していた。最近の研究により、フェリチンはUV光に暴露された培養皮膚細胞にて上昇することが明らかにされ、そしてフェリチンの増加は、鉄を結合することおよび隔離することにより、フリーラジカルの損傷から皮膚細胞自身を保護する皮膚細胞の試みを表し、次に酸化およびフリーラジカル-媒介損傷を引き起こしうるということが仮定された。
【００３８】
その他の癌の原理も同様である。鉄は病因的なあるいは悪化させる薬剤として皮膚癌、ヘパトーマ（肝臓癌）、腎細胞癌（腎臓癌）、神経芽細胞腫、白血病、および乳癌と関係していた。発明者は、フェリチン-Hがこれらの癌の全てを生み出す細胞における発癌性事象に対して保護的であろうことを提案する。発明者の本原理は、フェリチン-H-サブファミリーペプチドあるいはペプチドを発現するであろう遺伝子を用いてそれらをトランスフェクションするためにそのような方法でヒト皮膚を処理することにより、UV-誘導損傷からの保護を細胞に与えることができるというものである。フェリチン-H-サブファミリーペプチドは、それらが鉄を隔離することができることおよびそれを容易に放出できないこと、および細胞の鉄代謝およびその他の機能の正常な性状を変えずにそれを行うことができることから、この点に関して優れている。一方、フェリチン-L-サブファミリーペプチドは、それらが遊離鉄およびラジカル生成を増加させることにより問題を悪化させるであろう鉄を容易に渡すという点で、もっとより害を引き起こすようである。従って、フェリチン-H-サブファミリーペプチドあるいはペプチドのための遺伝子（発現クローン）を標的細胞に送達することは、癌をもたらす事象に対して保護的および／または矯正的であろう。同じように、1つあるいは複数の内因性フェリチン-H-サブファミリー遺伝子を活性化するであろう薬剤は同様に有益であろう。
【００３９】
全てのヒトフェリチン、フェリチン-Lが非常に豊富であるヒトでさえ、鉄の貯蔵および放出の機能を実行するためには少量のフェリチン-Hおよびその関連するフェロオキシダーゼ活性が必要であることが理解される。重要なことは、フェリチンLおよびHの間のバランスである。フェリチン-Hの優勢なバランスの増加は、フェリチン-Hのかなり過剰な程度でさえ、健常な鉄管理へ細胞をもどす媒介をするようである。
【００４０】
神経偏性疾患に関する背景：
遊離鉄およびフェリチンの両方の分布は、動物およびヒトにおいて脳の発達中に変化する。鉄の増加は、パーキンソン病およびハンチントン病の両方において、疾患プロセスの初期に始まり、基底核で見出される。アルツハイマー病、その他の痴呆、および加齢における脳のいくつかの領域において鉄の増加がある；そして、様々な脳領域でのイソフェリチンの分布は、上記の疾患において異なっておりおよび変化する。フェリチン-Lではなく、フェリチン-Hは発育中のラットの脳の皮質中の神経細胞の核に存在し、そして遊離鉄により引き起こされるであろう酸化的損傷に対して保護的でありうる。原理：フェリチン-Hは加齢および神経変性疾患において危機的な脳細胞を減らす、一方で、遊離鉄および配置されるフェリチン-Lから放出される鉄は、疾患および痴呆における酸化的損傷に関連する。フェリチン-Hあるいは関連するサブファミリーペプチドは、加齢、上記疾患および痴呆に関連する様々な神経変性的な変化に対して保護的であろう。同様に、フェリチン-H-サブファミリー遺伝子の発現クローンおよび／またはフェリチン-H-サブファミリー遺伝子のレギュレーターは、もし適切な脳領域および特定の細胞に送達されれば、保護的であることが予想される。
【００４１】
フリードライヒ運動失調症および関連する神経筋障害に関する背景：
フリードライヒ運動失調症の原因であるヒト遺伝子の酵母ホモログであるYDL120の欠失は、シトクロームcオキシダーゼ活性の減少に関連する細胞呼吸の低下を導き、そしてある核の背景では、ミトコンドリアDNAが失われる。ヌル変異体（null mutant）では、細胞成長はH2O2、鉄および銅などのオキシダントに非常に敏感である；そして、硫酸第1鉄（硫酸鉄（II））はミトコンドリアDNAの欠失を導く。ヌル変異体のミトコンドリアは、野生型より10倍の鉄を含有する。フリードライヒ運動失調症で観察される神経変性は、高い毒性のフリーラジカルの産生の増加に寄与するミトコンドリア鉄の過負荷に基づいてよく説明できる。原理：鉄の蓄積はフリードライヒ運動失調症の病因に関係するため、この疾患の症状の最初の出現および進行の両方が遊離鉄の隔離により遅くあるいは停止されるであろう。フェリチン-H-サブファミリーペプチドあるいは発現クローンのトランスフェクションおよび／または内因性フェリチン-H-サブファミリー遺伝子の発現を亢進制御するであろう薬剤による治療は、緩和的なものであろう。
【００４２】
アテローム性動脈硬化に関する背景：
鉄（すなわち、鉄の過剰）はアテローム性動脈硬化のプロセスにおける重要な因子であり、および鉄の涸渇は心血管に有益であり虚血性心疾患を防ぐという強力な疫学的な証拠が入手可能である。フリーラジカルの鉄-触媒生成は、血管壁損傷、プラーク形成および、両方の機序による心臓血管損傷の原因でありうる。今度も、L-フェリチンからの細胞内鉄放出はこの病因の原因となる鉄の供給源として関係している；H-フェリチンは、遊離あるいは放出鉄をキレートおよび隔離することにより保護的でありうる。原理：アテローム性動脈硬化性プラークの動脈壁細胞あるいは細胞エレメントにおいて、フェリチン-H-サブファミリーペプチドあるいは遺伝子発現クローン、あるいは内因性フェリチン-H-サブファミリー遺伝子を活性化するであろう遺伝子レギュレーターを用いて適切な細胞をトランスフェクションすることは、動脈閉塞を防ぐあるいは逆転するであろう。
【００４３】
可能な送達系および細胞 - 標的機序に関する背景：
タンパク質あるいはペプチドのex vivoでの生細胞への送達には、いくつかのアプローチがある。小さいペプチド（約20 kDaあるいはそれ未満）は、特別な送達系を用いずに細胞に取り込まれうる。大きなタンパク質は、リポソーム、リポソーム構築物の中に、あるいは赤血球ゴーストなどの膜内で被包化されて送達されうる、そして小胞は化学的な手段（例えば、ポリエチレングリコール [PEG]あるいはカルシウムイオン）によりレシピエント細胞と融合させられる。大きなタンパク質複合体はまた、被膜の膜を標的細胞の原形質膜へ融合することにより被包化されて、送達されうる。発明者は、発明者の実験室においてこの型の送達を用いた多くの経験を有していた（参考文献は以下にリストした）。特定の細胞型を標的とするタンパク質あるいはペプチドのin vivoでの送達のため、選択される方法は、特定の細胞表面タンパク質を対象とする抗体あるいはリガンドあるいはリポソーム中に組み込まれる受容体、およびリポソーム内に被包化されるペプチドあるいはタンパク質を用いたリポソーム-型の送達であるらしい。あるいは、標的細胞受容体に特異的なタンパク質リガンドを融合する望ましいペプチド（例えば、フェリチン-H）から成る融合タンパク質は、直接的に注入されうる。造血幹細胞を標的とするために使用しうるタンパク質リガンドの例は、骨髄において造血幹細胞の表面上で豊富にされる受容体（c-kit）に結合する幹細胞因子（c-kitリガンド）である。当業者は、細胞にタンパク質、タンパク質フラグメントおよび遺伝物質を導入するのに適した広範な種類の医薬的な送達機序があることを認識するであろう。
【００４４】
フェリチン-H-サブファミリーペプチド（例えば）をコードする遺伝子の発現クローンの送達のために、多くのプラスミドキャリアおよびトランスフェクション試薬系が、宿主動物あるいは患者に再注入するため、ex vivoで細胞をトランスフェクションし、安定した形質転換細胞あるいは一時的にトランスフェクションされた細胞のいずれかの生成をするために入手可能である。良い発現プラスミドはトランスフェクション試薬と同様に商業的に入手可能であり、後者の多くは一つあるいはもう一つの型のカチオンリポソームである。in vivoならびにex vivoでの遺伝子運搬、すなわち遺伝子治療、のための、利用可能なベクターには、レトロウイルスベクター（分裂細胞に関してのみ良い）、アデノウイルスベクター（多くの細胞型にトランスフェクションし、細胞特異性は小さい）、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびエレクトロポレーション系が含まれる。これらのいずれかは、純粋あるいは高度に豊富な集団として標的細胞が得られるex vivoプロトコールにおいて使用され、遺伝子運搬後に再注入されうる。in vivoでの遺伝子運搬のため、選択は、十分な遺伝子コピーを用いた特定細胞を効率的に標的化することの困難さのために、現在は限定されている。先のパラグラフで記載されるような標的とされるリポソームは、高親和性、豊富しかし細胞-特異的受容体のためのリガンドが組み込まれれば可能性がある。
【００４５】
ヒト細胞におけるフェリチン -H 遺伝子発現の誘発に関する背景：
フェリチン-Hは、胚形成中に発現すると同定された遺伝子の群の中にある。フェリチン-H発現の最初の主要な部位は、血液循環が確立する前に哺乳類の卵黄嚢で形成される胚赤血球内にある。発生初期におけるフェリチン-Hのこの細胞-特異的発現は、胚の鉄貯蔵部位としての赤血球の役割と対応している。成体赤血球はフェリチンをかなり少なく発現し、そして鉄は成体では主に肝臓（肝細胞）に貯蔵されており、そこでは発現される主なフェリチンはフェリチン-Lである。マウスにおいてフェリチン-H遺伝子を“ノックアウト”することは、発生3.5から9.5日の間の子宮内死をまねく。このように、フェリチン-Hは発生的に制御される遺伝子であり、その発現はまたある細胞および組織型にいくらか制限される。発明者は、分化している成体赤血球系細胞におけるフェリチン-Hの発現は、直接的に成体β-グロビン遺伝子を抑制することにより、発生ヘモグロビンスイッチングし、そして直接的あるいは間接的のいずれかで胎児ガンマ-グロビン遺伝子の活性化を引き起こして、逆転するであろうことを発見した。成体赤血球系細胞における内因性フェリチン-H遺伝子発現を活性化することはまた、この1つの細胞系統において発生遺伝子スイッチを逆転する。次に、このスイッチを完成することは、鎌状赤血球病、β-サラセミアおよびその他の異常ヘモグロビン症を有するヒトに対して治療的な利益を有する、もう一つの発生スイッチであるヘモグロビンスイッチを逆転するであろう。その他の細胞型においてフェリチン-H発現を活性化することは、癌、アテローム性動脈硬化、および神経変性疾患を緩和および防御する。
【００４６】
IRE-結合タンパク質（例えば、IRP-1 [IRE-結合タンパク質-1]であるサイトゾルシス-アコニターゼ）により感知されるように、鉄による翻訳レベルでのフェリチン発現の制御については多く知られているが、制御のこのレベルおよび型はフェリチン型を区別しない。フェリチン-H発現を具体的に亢進制御するためには、転写レベルでの特定の遺伝子の制御が必要となる。
【００４７】
BT-20乳癌細胞は、外因的に加えられたヘムに暴露されるとき、フェリチン-H mRNA合成を増加させるが、しかしフェリチン-L mRNAはわずかしか増加させない。この変化は発癌のフリーラジカル損傷に対して保護的である。結腸癌Caco-2細胞では、フェリチン-H発現は細胞分化の増加、および癌表現型の低下を導く。フェリチン-H発現の増加はまた、培養における赤白血病細胞株（K562）およびヘパトーマ細胞株（HepG2）の細胞分化中にも起こる。フェリチン-H遺伝子プロモーターにおけるいくつかのDNAエレメント、およびそれらに結合する核内タンパク質（例えば、P/CAF-CBP、Bbf、およびNF-E2）が知られているが、フェリチン-H転写の活性化の機序は、臨床的に適用されるほど十分には理解されていない。
【００４８】
内因性フェリチン-H遺伝子発現を活性化するために細胞に送達／適用されうる外因性因子には、ヘム、植物ホルモン、アブシジン酸、および特にヒトケラチノサイトおよび皮膚癌に適用されるように、赤外線および紫外線光の組み合わせがある。
【００４９】
発明の概要
発明者は、鉄-隔離タンパク質の核内フェリチン-Hサブファミリーがヒト細胞において遺伝子制御タンパク質であることを発見した。具体的に、我々は核内フェリチンがヒトβ-グロビン遺伝子のプロモーターにおいて中央に置かれている特異的なDNA配列に結合すること、およびフェリチン-H結合の効果がトランスフェクションされた細胞においてこの遺伝子の転写を抑制することを見出した。このように、正しい細胞を標的とするフェリチン-H遺伝子あるいはペプチドは、β-グロビン遺伝子が変異を受ける鎌状赤血球病、ならびに鉄の管理不適切が存在するその他の遺伝的疾患の治療を提供する。ヒト細胞において500倍までのフェリチン-Hの過剰発現は有害ではなく、変化しやすい鉄プールを低下させ、癌細胞株における増殖を低下させ、および癌細胞におけるアポトーシスを促進する。
【００５０】
本発明は、遺伝子発現における変化を産生することを介して、内側から細胞の表現型を変える方法および／または組成物、すなわち遺伝子発現療法に関する。細胞内へフェリチン-Hあるいはその他のフェリチン-Hファミリーペプチドの遺伝子を運搬するための方法が記載され、それによりフェリチン-H遺伝子はそこで発現し、そしてこの結果として、フェリチン-Hが産生される。これは、（鎌状赤血球病の発明者のよく研究された例におけるように）フェリチン自身が疾患表現型に関連するもう一つの遺伝子の発現を制御すること、あるいは細胞内における鉄バランスを変化させ、そのことが次に結果として表現型を変える遺伝子発現の変化をもたらすことのいずれかを通して、細胞の表現型を変える。効果を与えられた細胞の表現型はまた、発現されたペプチド自身（すなわち、フェリチン）あるいはその一部を、病的細胞が疾患の表現型を示す前にその細胞内へあるいはその細胞に直接的に送達することにより変えることができる。適した細胞における内因性フェリチン-H遺伝子の発現の誘導は、遺伝子制御療法に対する第3のアプローチである；これは、細胞に外因性サイトカインあるいはその他の薬剤を適用することにより行われるであろう。H-フェリチンはTNFαあるいはIL-1βに応じて増加することが知られている一方で、L-フェリチンは外因的に加えられた鉄に応じて選択的に増加する。そして、第4のアプローチは、特異的なフェリチンファミリーペプチドの発現をそのmRNAの翻訳および／または転写を阻害することにより妨げるアンチセンスヌクレオチドを送達することによる遺伝子制御療法により細胞表現型を変えることである。
【００５１】
遺伝子制御療法に対するこれらのアプローチのどれが適用可能でありうるかは、ここに記載される各々の具体的な疾患の病因に依存し、それらの全ては鉄の管理不適切を伴う。フェリチン遺伝子発現は、発現されるフェリチンの型、具体的な疾患、あるいは介入が開始される時点での疾患のステージに依存して、改善あるいは悪化のいずれかとなりうる。選択のアプローチは、（例えば、フェリチン-H遺伝子の発現ベクターを与えることにより）フェリチン-Hを増加させること、あるいは（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより）特異的なフェリチン型を減少させることでありうる。これらのアプローチのどちらかは、所望する効果を達成するであろう。表現型における細胞変化をもたらすのは、フェリチン-Hおよびその他のフェリチンの発現の間のバランスである。その他のフェリチンタンパク質の濃度に関連してフェリチン-Hの量を増加させることは、鉄の管理不適切を引き起こす遺伝性疾患の影響を改善する所望する遺伝的制御を達成する。
【００５２】
フェリチン-H、フェリチン-H遺伝子あるいはその誘導体を赤血球系前駆細胞あるいは幹細胞へ送達することは、鎌状赤血球病において変異した成体β-グロビン遺伝子の発現を抑制し、そして付随して、γ（胎児）-グロビン遺伝子発現を刺激して、それにより表現型的治癒をもたらす。
【００５３】
アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病（HD）、およびフリードライヒ運動失調症などの神経変性疾患および神経筋障害において、過剰鉄（あるいは鉄の管理不適切）は病因的なあるいは悪化させる因子である。H-フェリチンはニューロンにおいて選択的に発現され、そしてまたニューロンの核内に位置づけられもする。H-フェリチンは年齢にともない脳内で低下し、そしてAD、PD、およびHDにおいて特定の脳領域で低値である。既知のフェリチンの間ではH-フェリチンのみフェロオキシダーゼ活性を有しており、そして脳におけるフェリチン-Hの存在は過剰鉄あるいは遊離鉄に対して保護的である。このクラスの患者の具体的に位置づけられたニューロンにおけるH-フェリチンの増加は、これらの疾患の症状および予後を改善する。あるいは、特異的なフェリチンアンチセンスオリゴヌクレオチドを、特定の脳領域のグリアおよびその他の関連するCNS細胞型に送達することは、そのような細胞において鉄貯蔵のレベルを低下させるアプローチとして、遺伝子制御療法の好ましい経路でありうる。当業者は、細胞内フェリチン-Hあるいはその鉄の誘導体を増加する最良の方法は、標的とされる組織の型、細胞内フェリチン-Hあるいは誘導体の所望するレベル、治療される疾患および標的細胞における細胞内フェリチンの現在のレベルを含むが、これらには限定されない様々な因子に依存しているであろう、ということを理解するであろう。
【００５４】
癌において、過剰鉄は病因的あるいは悪化させる因子として関係することもまた明らかである。H-フェリチンは多くの癌（例えば、乳癌）において細胞内で増加することが知られている一方で、L-フェリチンは多くの癌患者（例えば、神経芽細胞腫）の血清において増加する。多くの癌で見られるH-フェリチン発現の増加は、細胞自身を遊離／過剰鉄から守るための細胞の試みである；およびそのような場合では、H-フェリチン、H-フェリチン遺伝子、あるいは内因性フェリチン-H遺伝子発現を増加する刺激の非常に早期の送達が最良の治療的選択でありうる。UVあるいは赤外線のいずれかが内因性フェリチン-Hを誘導する皮膚癌では、フェリチンは酸化的損傷のいくつかの経路に対して保護的である。
【００５５】
アテローム性動脈硬化性プラークにおける過剰鉄は、病因的あるいは悪化させる因子である：およびこれらのプラークの細胞においてフェリチン-Hを増加する遺伝子制御療法は、疾患プロセスを遅くあるいは停止する。
【００５６】
本発明の重要な観点は、フェリチン-Hがβ-グロビンプロモーターにおいてDNA配列SEQ ID NO:1、CAGTGC、を特異的に結合することにより、ヒト成体β-グロビン遺伝子を抑制するという知見である。フェリチンにより刺激されるヒトε-およびγ-グロビン遺伝子を含む多くの他の遺伝子はそれらのプロモーターにおいてこの配列を有する。このように、CAGTGCモチーフの文脈は、周囲のDNAならびに転写開始部位からのモチーフの距離を含むが、フェリチンが抑制するかあるいは活性化するかどうかに影響する。このプロモーターモチーフを有する遺伝子のいくつかはアポトーシスにおいて発現され、およびその他は鉄代謝に関連する遺伝子である。癌細胞をアポトーシスさせるサイトカインを使用することは、治療への経路であり、そしてこの手段によりフェリチン-H発現を刺激することは強力な治療である。
【００５７】
我々が発見したCAGTGCモチーフは、配列RTGACnnnGC（そこでは、Rはピリミジンおよびnは4つの標準的ヌクレオチドのいずれかである）を有するARE（酸化防止反応エレメント）、およびFe++媒介フェントン反応により好ましく開裂を受ける配列RTGRを含む、重要な以前に発見されたエレメントと相同性を共有する。フェリチンがこれらのエレメントへ結合すること通して制御されうる、健康および疾患に関連する多くのその他の遺伝子がある。
【００５８】
上記の考えは、核内フェリチン（すなわち、フェリチン-Hおよびその誘導体）が、CV-1細胞における我々のin vitro DNA結合実験および我々のコ-トランスフェクション実験により示されるように、転写開始部位から-150塩基対の領域に位置するCAGTGCモチーフに結合することにより、ヒトβ-グロビン遺伝子プロモーターからの遺伝子発現を抑制する、という重要な発見のため、治療としての意味を有する。
【００５９】
発明の詳細な説明
フェリチンはヒトβ-グロビン遺伝子、鎌状赤血球病およびβ-サラセミアのいくつかの型において変異を受ける同じ遺伝子、のリプレッサーであることが見出された。リプレッサーは、フェリチンペプチドのフェリチン-Hサブファミリーのフェリチンの核型である（Broyles et al.,"A Ferritin-Like Protein Binds to a Highly Conserved CAGTGC Sequence in the β-globin promoter, In Sickle Cell Disease and Thalassaemias：New Trends in Therapy）。概略すると、発明者は次のことを見出した：
1）ヒトK562赤白血病細胞核抽出物からのフェリチン-ファミリータンパク質（ならびに純粋ヒトフェリチン-H）は、in vitroにて、転写開始部位から-150 bpでヒトβ-グロビン遺伝子のプロモーター（鎌状赤血球病細胞における遺伝子の変異型を駆動するプロモーター）に結合する。結合はそのDNA配列に非常に特異的である。
【００６０】
2）フェリチン-Hの発現クローンは、一過性コトランスフェクション実験においてこのβ-グロビンプロモーターを抑制する。これは、2つの異なるレポーター遺伝子を用いた複数の実験において非常に再現性があり、対照／ヌル（null）プラスミドにより抑制は見られない。
【００６１】
3）フェリチン-Hは、プロモーターが変異結合部位を含有すれば、もはや抑制しない。発明者は、フェリチン-H結合部位においてのみ変異を受けており、同じレポーター遺伝子（この場合はCAT）へ接続される完全な対照プラスミド-β-グロビンプロモーターを有する。これは、トランスフェクションにとって完全な対照であるだけでなく、in vivoでの非常にすばらしい機能を有するin vitro DNA結合に接続する。
【００６２】
ヒト赤血球系細胞において、β-グロビン発現の低下はガンマ（胎児）-グロビン発現の増加により代償され、そして適度な量のこのスイッチングが鎌状赤血球病を全体的に改善し、およびβ-サラセミアを全体的あるいは部分的に改善することが知られているので、この新しい知見により、フェリチンがこれらの古典的な遺伝性疾患の表現型を治癒するために有用となる。
【００６３】
科学文献での報告は、Hフェリチン（重鎖フェリチン）が高齢なラットの脳およびアルツハイマー病などのその他の神経変性疾患において50%まで低下することを示し、そしてフェリチン-Hがパーキンソン病およびおそらくハンチントン病におけるように、鉄媒介酸化的損傷が説明されている神経変性疾患に見出されることを示す。肝癌および皮膚癌などの癌に対してフェリチンが保護的な役割を示すという研究もある。UV光は皮膚細胞においてフェリチンの産生を誘導すること、およびフェリチンはUV損傷に対して保護的であることが報告された。実際、フェリチン-Hは、細胞傷害が鉄-媒介酸化的損傷により引き起こされるいずれかの疾患を治療するために使用されうる。
【００６４】
フェリチン-Hペプチドあるいはその短縮型（truncated form）を赤血球系前駆細胞に送達することは、鎌状赤血球病およびβ-サラセミアを治療するための使用において、現行の部分的な方策より効果的であり、より自然な形の治療である。フェリチン-誘導ペプチドの同様な送達は、アルツハイマー病およびその他の神経変性疾患および癌において効果的な治療および保護を与える。ペプチドはまた融合タンパク質としても送達されることができ、フェリチン-Hペプチドの一部あるいは全ては、特定のレセプターが赤血球系前駆細胞、ニューロン、あるいはその他の保護が所望される細胞型の表面に存在するトランスフェリンあるいはその他のリガンドなどのもう一つのタンパク質と融合される。特定の組織を標的とする融合タンパク質の作成は、当業者によく知られている。あるいは、フェリチン-Hあるいはその一部をコードする発現クローンは、赤血球系前駆細胞、造血幹細胞、ニューロンあるいはex vivoあるいはin vivoのいずれかでの適したベクターにおけるその他の組織細胞へ送達される；およびそのようなベクターから発現されるタンパク質もまた、疾患を治療および防御する。
【００６５】
ここに記載されるフェリチン-Hは、主にβ-グロビンプロモーターに結合するリプレッサーとして、その物理的な特性およびその提案されている機能においてその他の既知のトランス-活性化タンパク質とは明確に異なる。H-フェリチンサブファミリーは、L-フェリチンサブファミリーより多数の遺伝子により表され、およびX染色体上での遺伝子／偽遺伝子のクラスターを含む。これらの一つ、フェリチン-Xは、フェリチン-Hとサイズが同じであり、予測される3次構造が非常に似ているペプチドをコードするようである。
【００６６】
β-グロビンプロモーター-150 CAGTGCモチーフの実際のDNA-結合は、プロティナーゼKおよび熱処理から保護されるであろう、およびフェリチンとのその強力な関連のため抗-フェリチン抗血清と反応するであろうフェリチン-関連タンパク質によりin vivoにて媒介されるという可能性が残る。しかし、これが事実ならば、ヒト核抽出物に偏在するのはタンパク質であり、そしてそれを亢進制御する必要はないであろうし、それはフェリチン-Hがない場合は効果はない。フェリチン-Hの亢進制御は十分である。
【００６７】
発明者の一過性発現アッセイから、フェリチン-Hはヒトβ-グロビン遺伝子を抑制すること、およびこの抑制は高度に保存されるCAGTGCモチーフを含有するプロモーターの-150領域へのフェリチン-Hおよび／またはコ-リプレッサーの結合により媒介されることは明らかである（図1および6）。このフェリチン-Hの結合部位は、β-グロビン遺伝子の転写の活性化のために必要とされる重要なARE内にある。このように、このタンパク質の結合およびその他の因子の置換は、明らかに（同じ配列を認識する）マウスBB1タンパク質が非誘導MEL細胞においてマウスβ-主要グロビン遺伝子の抑制の状態にあるので、ヒトβ-グロビン遺伝子の抑制に重要でありうる。それに続くこの結合部位と上流負制御（negative regulatory）領域との相互作用は、DNAルーピングにより、GATA-1などのその他の正因子の結合を妨げ、ならびに近位プロモーター上で活性転写複合体の情報を立体的に妨害する緊密な結合複合体をつくる。
【００６８】
図7は、結合鉄イオンを有するフェリチン-Hタンパク質の略図を示す。フェロオキシダーゼ活性に寄与する活性部位が明らかとなった。しかし、転写抑制に寄与するタンパク質の1つあるいは複数の活性部位は、同定されていない。その他の全ての遺伝子制御タンパク質と同様に、フェリチン-H誘導体は、フェリチン-H自身と同じくらいあるいはより良くDNA転写を抑制するであろう。これらの誘導体は、フェリチンタンパク質のフラグメント、および転写抑制に寄与するフェリチン-Hの1つあるいは複数の活性部位がスプライシングされたいずれかの融合タンパク質を含む。フェリチン-H誘導体はまた、フェリチンファミリータンパク質のより大きな転写あるいは翻訳産物を含む。フェリチン-H誘導体はさらに、DNA結合および転写抑制に寄与するフェリチン-H活性部位と実質的に同じである活性部位によってDNA転写を抑制するいずれかの模倣的タンパク質を含む。当業者は、DNA転写の抑制に寄与する1つあるいは複数のフェリチン活性部位は、DNA結合およびタンパク質結合部位の両方を含みうることを評価するであろう。フェリチン-H誘導体は、いずれかのフェリチンファミリータンパク質のフラグメントにおいて見出されうる。
【００６９】
フェリチン-Hは、フェリチンタンパク質のファミリーの唯一の構成員である。フェリチン-Hおよびフェリチン-Lは最も研究されている。まだ同定されていないフェリチンファミリータンパク質があるようである。フェリチンファミリータンパク質は一般的に、鉄代謝に関係する。発明者がフェリチン-Hおよびその誘導体の遺伝子制御活性を明らかにした以上は、その他のフェリチンファミリータンパク質もまた遺伝子制御機能を有するであろうことはあり得る。
【００７０】
β-グロビン遺伝子の5'プロモーター領域へ結合するフェリチンファミリータンパク質の能力は、以下に記載する長期のおよび綿密な実験の後にのみ確認された。最初の実施例は、フェリチン-Hがヒトベータ-グロビン遺伝子の5'プロモーター領域の-148から-153塩基に見出されるCAGTGCフェリチン結合部位、SEQ ID NO:1、に結合することを示す。実施例2は、フェリチン結合部位への結合に加えて、フェリチン-Hがフェリチン結合部位のさらに上流のベータ-グロビン5'プロモーター領域に結合するもう一つの核内タンパク質に結合することを示す。図8から12は、フェリチン-Hがヒトβ-遺伝子を抑制する機序を明らかにすることに関する実験を示す。これらの結果は進行中の作業（work-in-progress）を表し、そしてヒトK562細胞核内フェリチンがこのプロモーターを抑制するためにその他のDNA-結合タンパク質、特にDNA-ルーピングを介した上流サイレンサー-結合タンパク質、と相互作用することを示す。
【００７１】
実施例1
材料と方法
細胞株
K562（ヒト赤白血病）細胞は、記載（Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52）されるように10%あるいは15%の牛胎児血清（FBS）および抗生物質を含むRPMI 1640培地の懸濁液中で増殖させて、そして核抽出物の作製のために10⁶細胞/mlの密度で回収した。CV-1（アフリカミドリザルの腎上皮）細胞（トランスフェクション／一過性遺伝子発現アッセイのために使用される接着細胞）は、L-グルタミン、10% FBSおよび抗生物質を含むDMEMにて増殖させた（Miller, I. J. & Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776-86）。
【００７２】
クローン、トランスフェクション、および遺伝子発現アッセイ
先にpSV2CAT中にクロ-ニングされた（Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) NucleicAcidsRes 17, 8833-52）、ヒトβ-グロビンの上流領域（-610/+20）を、pGEMおよびpSELECT (現在はpALTERと呼ばれる)を介してサブクローニングして、そしてpCAT-基本（全てのベクターはPromega由来）中で再クローニングした。β-グロビンプロモーターの-153/-148部位の変異体は、pSELECT系を使用して-164/-128に対応する変異オリゴヌクレオチドからの転写により生成された。CV-1細胞のトランスフェクションは、OptiMEM血清フリー培地にてDMRIE-Cトランスフェクション試薬（GibCo/BRL）を用いて実行して、そして緑色蛍光タンパク質プラスミドpEGFP-C1（Clontech）、蛍光顕微鏡およびマイクロタイタープレートリーダーを用いた細胞融解物の定量的蛍光を使用して最適化した。リポーター遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）は、精製CATを用いて標準化したELISA（Promega）を使用して、トランスフェクションさせた細胞の融解物において定量化された。EKLF（赤血球系クルッペル様因子）発現プラスミドは、pSG-5（Stratagene;( Miller, I. J. & Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776-86)中でクローニングされたEKLF遺伝子を有しており、フェリチン-H発現クローンは、真核生物発現ベクターpcEXV-1（Wu, Y. J. & Noguchi, C. T. (1991) J Biol Chem 266,17566-72）にある。全細胞タンパク質は、標準として牛胎児血清アルブミンを使用するBCAマイクロタイタープレートアッセイを用いて決定された。
【００７３】
タンパク質および抗体
（Lフェリチンが豊富にある）ヒト肝臓および（Hフェリチンが豊富にある）ヒト心臓からのフェリチン、（鉄飽和の）ヒトトランスフェリンおよびアポトランスフェリン、ヒト脾臓フェリチンに対するポリクローナル（ウサギ）抗血清および非免疫ウサギ血清は、Sigma Chemical Companyから得た。
【００７４】
制限フラグメントおよびオリゴヌクレオチド
先にpSV2CAT中にクローニングされた、ヒトβ-グロビン遺伝子（-610から+20まで）の5'領域は、Hind IIIおよびRsa Iと用いた一連の消化により3つのフラグメントに切断された。アガロースゲルから電気溶出（electroelute）した（Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)、3つのフラグメントは、416 bp（-638/-223）、147 bp（-127/+20、近位プロモーター領域を含有する）、および95 bp（Rsaフラグメント、-222/-128、主に遠位プロモーター配列を含有する）であった。3つのフラグメントは、記載されるように（Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ; Kurien, B. T., Scofield, R. H., & Broyles, R. H. (1997) Anal Biochem 245, 123-126)、フェノール／クロロホルム処理、脱リン酸化、および32-Pで末端標識した。-232/-188および-164/-128に対応する合成オリゴヌクレオチドは、先に記載されるように（Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52）、精製してアニーリングして、そして2本鎖オリゴをゲルモビリティシフトアッセイにおいて、上記のように末端標識して、および／または非標識競合物として使用した。
【００７５】
核抽出物の調製
各々の核抽出調製物は、Dignam、Lebovitz、およびRoederの手順（Dignam, J. D., Lebovitz, R. M. & Roeder, R. G. (1983) Nucleic Acids Res 11, 1475-89）を使用して、2リットルのK562細胞（1×10⁶細胞/ml）から作製した。抽出物のタンパク質含有量は、3から6 mg/mlまでの範囲であった。フェリチン様タンパク質が80-90%で豊富にある抽出物は、プロティナーゼKおよび／または75℃での加熱を用いて粗抽出物を処理することにより調製された（Atkinson, B. G., Dean, R. L., Tomlinson, J. & Blaker, T. W. (1989) Biochem Cell Biol 67,52-7）。
【００７６】
ゲルモビリティシフトアッセイ
ゲル遅延アッセイ（すなわち、ゲルシフト）を使用して、Rsa I（95 bp）フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドへの抽出タンパク質のDNA結合を決定した（Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52; Fried, M. & Crothers, D. M. (1981) Nucleic Acids Res 9,6505-25）。各々の反応は、0.5-2 ngのDNA、1.0-5.0μgの抽出タンパク質、1.0-5.0μgのポリdI:ポリdC、100mM KCl、および結合緩衝液を含有した（Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17,8833-52）。非標識競合物オリゴヌクレオチドは、15-から2000-倍のモル過剰の範囲であり、そしてタンパク質を加える前のプローブをともなう反応混合物に含まれた。遅延アッセイのために使用されるゲルは4%、5%、あるいは6%アクリルアミドであり、そしてランニング緩衝液は低イオン強度TAEであった（Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17,8833-52）。
【００７７】
配列アライメントおよびホモロジー検索
全ての哺乳類β-グロビンプロモーター配列（-200/+1）は直接GenBankから得て、そしてウィスコンシン大学GCGパッケージのPILEUPプログラムとそれに続くLINEUPプログラムを使用して操作した。
【００７８】
結果
フェリチン-Hは一過性コトランスフェクションアッセイにおいてβ-グロビンプロモーターにより駆動される発現を抑制する
一過性発現アッセイは、細胞がEKLF、つまり転写の発生的-特異的アクチベーター、の発現クローンを用いてコトランスフェクションされなければ、レポーター遺伝子のβ-グロビンプロモーター駆動発現が低いCV-1細胞を用いて設定された。β-CATレポータープラスミドを用いた結果は、図1に示される。EKLFにより刺激されるβ-CATの発現レベルは、ヒトH-鎖フェリチン（すなわち、フェリチン-H）の発現クローンのコトランスフェクションにより60%以上まで抑制された。
【００７９】
対照には、陽性CAT-対照プラスミド（構成的にCATを発現する）、陰性CAT-基本プラスミド（プロモーターを含有しない）、およびEKLF刺激のないβ-CATが含まれる。図1に示される実験は、β-CATを用いて5回以上およびβ-Luc（β-プロモータールシフェラーゼ）を用いて3回繰り返して、非常に似た結果を得た。抑制はまた、EKLFが省かれるときに（レポーター活性はより低いが）証拠となる（データは示さない）。その他の対照には、全ての発現クローン（レポーター遺伝子発現には効果を示さない）のための“中身のない”キャリアプラスミドのコトランスフェクション、ならびにトランスフェクションされたDNAの全量マイクログラムを一定に保つことが含まれ（例えば、図6）、過剰DNAあるいはキャリアプラスミドの構造的ないくつかの観点による遺伝子発現の非特異的な阻害の可能性を除去した。フェリチン-Lのための発現クローンのコトランスフェクションは時々、結果的にレポーター遺伝子発現のいくつかの抑制となった；しかし、効果はそれほど劇的でなくおよび一定でもなく観察された。
【００８０】
フェリチンのβ-グロビンプロモーターDNAへの結合
ヒトβ-グロビン遺伝子の-222/-128由来の遠位プロモーターの部分、を含有する制限フラグメントは、ゲル遅延アッセイに示されるように、ヒト肝臓-あるいはヒト心臓-由来フェリチンにより結合される（図2a、左側、レーン3および4）。発明者の実験では、（H-型（重）サブユニットが豊富な）ヒト心臓由来のフェリチンは、レーン3（左）のより暗いバンドにより示されるように、（相対的にL-型サブユニットが豊富な）肝臓フェリチンより高い結合の程度を示した。近位プロモーター（-127/+20）を含有する制限フラグメントはこの結合を示さない（図2a、右側、レーン2-5）；およびもう一つの鉄-結合タンパク質であるトランスフェリン（それがレセプターに結合するとき以外は、主に細胞外に存在することが知られている）は、フェリチンにより結合される遠位フラグメントに結合しない（図2a、左側、レーン5および6）。ヒト肝臓フェリチンおよびヒト心臓フェリチンの結合により産生されたシフトバンドは通常、各々K562細胞粗核抽出物により産生されたより下方のおよびより上方のシフトバンドに対応する（図2a、左側、レーン2-4）。発明者はまた、核抽出フェリチンはどちらかのシフトバンドを産生できること、およびより高分子量のバンドは溶出および再シフトされたときにより下方のバンドを産するであろうことを見出した。粗抽出物を用いた複数のシフトバンド（例えば、図3）は、粗抽出物におけるその他のタンパク質を伴う1つおよび／または複数のDNA-タンパク質複合体のフェリチンサブユニットあるいはオリゴマーが、様々なサイズで凝集した結果である。というのも、発明者は複数のバンドの少なくとも1つはGATA-1を含有することを見出したからである。
【００８１】
K562細胞核抽出物由来のフェリチン様タンパク質の濃縮
（フェリチンの重鎖および軽鎖の混合物から成る）ヒト脾臓フェリチンに対するポリクローナル抗血清は、粗K562核抽出物から形成されるDNA-タンパク質複合体および-222/-128制限フラグメントの部分のスーパーシフトを引き起こすことが見出されて、そしてスーパーシフトバンドの強度は加えられた抗血清の量に比例した（図2b）。抗-フェリチン抗血清でのスーパーシフトは、このDNA-タンパク質複合体に特異的であることが見出され、非常に少ないDNAないしDNAなしは核抽出物の非存在下でシフトされ、抗-トランスフェリン抗血清および非免疫ウサギ血清（示されていない）のいずれも複合体をシフトさせず、抗-ウサギIgGはスーパーシフトを阻害し、そしてβ-IVS2などのその他のDNAとのタンパク質複合体は抗-フェリチン抗血清によりシフトされなかった（図2C）。
【００８２】
フェリチンは、大半のタンパク質とは異なり、プロティナーゼK消化および75℃での加熱に抵抗性であり、そしてこれらの2つの処理を使用して胚／幼生赤血球系細胞の抽出物から90%純粋を得ることができる。この手順をK562核抽出物に適用したとき、残りのタンパク質は-222/-128制限フラグメントを伴う単一のシフトバンドを与えた（図2b、左から3番目のレーン）。さらに、DNAおよび結合タンパク質のインキュベーションの後に抗-フェリチン抗血清を反応混合物に加えたとき、より大きな複合体が形成されて、結果としてスーパーシフトバンドとなった（図2b、第4レーン）。プロティナーゼKで処理した核抽出物を用いた主要なシフトバンドは、処理された抽出物を用いて得られたゲルバンドの範囲まではシフトしなかったことは注目すべきである。発明者は、一連の時間消化においてこれを調査して、そしてフェリチンはプロティナーゼKによる部分的な消化を受けることが見出された；10-15分の消化の後に残るものは（図2c、第3レーン）、まだDNAに結合するプロティナーゼK-耐性コアである可能性がある。さらに、濃縮ペプチド調製物の量の増加はシフトバンドに強度の増加を与え、そして複合体が量を組み込むにしたがって、バンドは徐々にゲルの上方へ動く。
【００８３】
図3Bに示されるように、レーンの左のシリーズである単一スーパーシフトバンドは、抗血清の増加に伴って強度が増加する95-bp遠位プロモーターを用いて得られた（矢印）。さらに抗-フェリチン反応性タンパク質の結合を限局するために、-232/-188および-164/-128配列の32P-標識2本鎖オリゴヌクレオチドを用いてスーパーシフトも行った。さらに39オリゴヌクレオチドはスーパーシフトバンドを与え、一方さらに59オリゴヌクレオチドは与えず（図3B）、抗血清によって認識されるタンパク質は-164および-128の間の37-bp配列に結合することを示した。-232/-188オリゴヌクレオチドを用いたスーパーシフトの欠乏はまた、抗体の特異性のための対照として働く。
【００８４】
抗体スーパーシフトアッセイを用いた結合領域の局限
抗体ゲルシフトアッセイを、95 bp制限フラグメント（図3A）の3'および5'末端に対応する32P-標識2本鎖オリゴヌクレオチド、および粗K562核抽出物とともに使用して、さらにフェリチンの結合を限局もした。このように、3'オリゴのみがスーパーシフトバンドを与え（図3B）、抗血清により認識されるタンパク質は-164および-128の間の37塩基対（bp）配列に結合することを示した。
【００８５】
競合ゲルシフトを用いた結合部位の定義
さらにフェリチンの結合を限局するため、発明者は様々な場所において37 bpオリゴヌクレオチドを変異させて、反対鎖における相補的ヌクレオチド置換を用いて、全てのA、全てのC、あるいは全てのGで6ヌクレオチドを同時に置換した（図4A）。競合ゲルシフトアッセイは、加熱K562核抽出物由来の部分的に精製したタンパク質を用いて行われ、そこでは各々の非標識変異オリゴならびに天然配列は、結合について32-P-標識天然配列に対して競合させた。全ての変異体、ならびに-153/-148領域で変異された、すなわち配列CAGTGCにおいて変異されたものを除いた天然配列は結合について競合した（例えば、図4D）。発明者は、これらの6塩基対はフェリチン-Hの結合部位を含むと結論する。図4Cにおいて、この結合の特異性を、結合にとって重要であることが見出された6ヌクレオチドの全てにおいて変異を受ける配列と比較される非標識天然配列、すなわち変異体#4と比較した配列CAGTCG（天然）、とのオリゴ競合において滴定および定量した（図4A）。標識天然配列への結合は50倍過剰の非標識自身と顕著に競合するのに対して、天然配列に対する結合との競合を始めるためには、1,000倍過剰の、つまり20倍異なる、非標識変異オリゴが必要であった。
【００８６】
12の哺乳類成体β-グロビン遺伝子由来のプロモーター（-162/+1）の配列アライメントはヒトβ-プロモーターの-150 CAGTGCが非常に高度に保存されていることを示す
キャップ部位から-162までの12の哺乳類成体β-グロビンプロモーターの系統発生的比較では（図5）、発明者は、-150領域におけるCAGTGC配列が最も保存されているシス-作用エレメントの間にあり、その高度な保存性においてはTATAおよびCCAATボックスに続くのみであり、近位CACCモチーフと同じくらい高度に、および遠位CACCよりも高度に保存されていることを見出した。
【００８７】
検討
発明者の結果は、CV-1細胞において、ヒトH-フェリチンの発現クローンはEKLF-刺激β-グロビンプロモーター-駆動CATレポーター遺伝子の発現を抑制制御することを示す（図1）。発明者は、独特な特性、すわなち、プロティナーゼKおよび熱（75℃）に対する安定性および抗-フェリチン抗血清との反応性、を有するK562細胞核抽出物にあるタンパク質を同定した。フェリチン-Hは、K562および正常赤血球系細胞においてβ-グロビン遺伝子の活性化のために必要とされるβ-グロビン遺伝子の5'領域、すわなち、キャップ部位から-128および-222の間の領域、に結合する（図3）。このDNA領域は、ゲルシフト実験において天然ヒトフェリチンを結合することを示した（図2）。フェリチン様タンパク質の結合の特異性は、抗体ゲルシフトアッセイにおいて様々なDNAセグメントおよびオリゴヌクレオチドを使用して確認して、そしてオリゴおよび抗フェリチン抗血清は、結合部位が-128および-165の間にあることを示すために使用された（図3）。変異オリゴヌクレオチドを用いた競合ゲルシフトアッセイは、フェチリンの結合がヒトβ-グロビン遺伝子の-153/-148にあるヌクレオチドCAGTGCを必要とすること；このCAGTGCモチーフが変異を受けるとき、in vitroでの結合は約1/20に減少することを示した（図4）。-153/-148フェリチン結合部位がコトランスフェクションされたβ-グロビン-レポータープラスミドにて変異を受けるとき、この系を抑制するフェリチン-Hの能力は撤廃されるが、しかしEKLF-刺激は保持される（図6）。これらの結果は、フェリチン-Hが配列-特異的様式にてプロモーターを結合することにより、ヒト成体β-グロビン遺伝子を抑制できることを示す。フェリチン-Hおよびその高度に保存された結合部位（図5）の生物学、ならびに一過性アッセイにて証明された機能は、K562細胞において、それが実際にβ-グロビンリプレッサーとして機能していることを意味する。そのようなリプレッサーは、鎌状赤血球病およびその他の遺伝性疾患を改善する際において有用である。
【００８８】
RNA配列CAGUGNは、鉄代謝に関連するタンパク質をコードするmRNA、例えばフェリチンサブユニットおよびトランスフェリン受容体のmRNA、の翻訳および安定性の制御において機能することが以前に見出されていたことは特筆すべきである。この非常に異なる文脈において、ヘキサヌクレオチドはIRE（鉄-反応エレメント）として言及されるステム-ループ（stem-loop）構造、つまり1本鎖mRNAの5'あるいは3'非翻訳領域に形成される安定な二次構造、の先端にある。IREに結合する制御タンパク質（IRE-BP）は、97 kDaに近い分子マスを有するクバン硫酸鉄クラスタータンパク質である、アコニターゼのサイトゾル型として同定された。対して、熱安定性なフェリチン-HはDNAにおけるCAGTGC配列を認識して、そして一見すると約20 kDaの、あるいは部分的にタンパク質分解を受けていればより小さい分子マスを有する。
【００８９】
グロビン遺伝子領域は、配列がランダムに発生することを期待しうる頻度に関連して、CAGTGC/CAGTGN配列を豊富に有する。ヒトゲノム、ならびに11番染色体上のβ様グロビン遺伝子クラスターの73,326 bp配列、は約40% G+Cである。従って、GおよびCの発生する頻度は各々0.2であろうし、そしてAおよびTの頻度は各々0.3であろう。配列CAGTGCの発生するランダム頻度は、（0.2）（0.3）（0.2）（0.3）（0.2）（0.2）= 0.000144である。従って、配列は、β様クラスターの73,326 bpにおいて10から11倍偶然に発生することが期待されうる。実際の発生は36倍であり、偶然に期待されうる数は3から4倍である。同様に、（配列CAGTGNにおける）五量体は205回発生し、再び偶然に期待されうる52/53発生の約4倍である。この配列の機能は、他のシス-制御エレメントと同様に、文脈依存性である。配列は、イプシロン-およびガンマ-グロビン遺伝子の5'および3'領域にて発生するが、しかしこれらの位置およびそれらの周囲の配列は、β-グロビン遺伝子についての-153位置とは著しく異なる。イプシロン-およびガンマ-グロビン遺伝子に対する部位5'および／または3'へのフェリチン-Hの結合は、転写に対して阻害効果より刺激効果を有するであろう。
【００９０】
系統発生的フットプリントは、制御タンパク質のための重要な結合部位を同定するために有用である。この点において、CAGTGC/CAGTGN配列は哺乳類β-グロビン遺伝子プロモーター内の配列および位置にて非常に高度に保存されており（図5）、そしてニワトリおよびカエルのプロモーターにおいても同様に見出される。この配列の高い保存性は、この結合部位が重要な機能を有していることを意味する。アフリカツメガエル（Xenopus）成体主要β-グロビン遺伝子は、キャップ部位から-45にてCAGTGC配列を有し、そしてこの配列を含有するオリゴヌクレオチドは、ヒトβ-グロビンプロモーターの対応する領域よりも強力にK562核抽出物由来ヒトフェリチン-Hを結合する。フェリチン-HがヒトK562細胞にて成体β-グロビンのリプレッサーとして作用するという発明者の発見と一致するのは、このタンパク質ための-150結合部位がリプレッサータンパク質BB1を結合することが知られているマウスβ-主要-160部位と競合するという発見者の知見である。
【００９１】
実施例2
材料と方法
材料：子牛腸アルカリホスファターゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、およびSau 96 Iは、Promega/Fisherから得た。32P-γ-ATPはDupont/NENから得た。ヒト脾臓フェリチンに対するポリクローナル（ウサギ）抗血清は、Sigma Chemical Companyから得た。全てのその他の試薬は分子生物学的グレードであった。
【００９２】
制限フラグメントおよびオリゴヌクレオチド：先にpSV0CATにおいてクローニングされた、ヒトベータグロビン遺伝子（-610から+20まで）の5'領域は、Hind IIIおよびBam HIで消化することにより精製プラスミドから切り出された。630 bpフラグメントをフェノール／クロロホルム処理、脱リン酸化、および32-Pで末端標識した。NCR1（-584/-527）のコア／BP-1結合部位に対応する合成オリゴヌクレオチド、2つの5'-β-グロビンサイレンサーのさらに遠位、およびプロモーターの-164/-128領域を精製およびアニーリングして、そして2本鎖オリゴを、ゲルモビリティシフトアッセイにおいて上のように末端標識しておよび／または非標識競合物として使用した。
【００９３】
核抽出物の調製：非接着K562細胞は、記述したように、RPMI 1640および15%牛胎児血清からなる培地中の懸濁液において増殖させて、そしてmlあたり10⁶細胞の密度で回収した。各々の調製のため、核抽出物は細胞の2リットルから調製した。抽出物のタンパク質含有量は、3から6 mg/mlの範囲であった。特異的に-150プロモーター領域および-550サイレンサー領域特異的にに結合するタンパク質において約80%に濃縮された抽出物は、80℃での加熱で粗抽出物を処理することにより調製された。
【００９４】
ゲルモビリティシフトアッセイ：ゲル遅延アッセイ（すなわち、ゲルシフト）は、図11の説明に記載される修飾を用いて、部分的に精製された抽出タンパク質が、はじめにプロモーターの-550サイレンサーおよび -150領域に対応する合成ヌクレオチドに、続いてプロモーターおよび上流制御配列の両方を含有するヒトβ-グロビン遺伝子の630 bpフラグメントにDNA結合することを決定するために使用された。遅延アッセイのために使用されたゲルは4%アクリルアミド、およびランニング緩衝液は低イオン強度TAEであった。
【００９５】
実験の設計：DNAルーピングアッセイは、介入DNAにより分離された隣接部位を含有するDNAと、相互作用することが提案される制御部位に特異的なタンパク質を含有する抽出物を混合することにより行われる；そして、タンパク質の結合は標準EMSAを用いて検出される。もし分離部位に結合するタンパク質が、安定した方法でお互いに相互作用するなら、介入DNAはループを形成して、ループ内の唯一の制限部位で切断することができる。ルーピングのためのテストは、DNA-タンパク質複合体が切断後の単一バンドとしてそのEMSA移動を保持することである。対照は、制限消化の前および後の反応の脱タンパク質化されたアリコートを有するレーンを含み、ループが実際に切断されたことを証明する。Sau 96 Iを用いてループ化複合体を切断するために使用される条件は、図11に対する説明中に与えられる。
【００９６】
結果
我々は、-222/-128 bp由来のヒトβ-グロビン遺伝子の遠位プロモーターの部分を含有する制限タンパク質が、K562細胞核抽出物中のフェリチン-Hタンパク質により結合されて、そして-150領域に特異的であることを、予備論文にて報告した。少なくとも2つのタンパク質は、キャップ部位から-300（-338/-233）および-530（-610/-490）の領域において、ヒトβ-グロビン遺伝子の近位および遠位プロモーターの上流に分布する機能的に定義されたサイレンサーに特異的である。これらのサイレンサーおよびβ-プロモーターの間の相互作用を検索する最終目的をもって、我々は介入DNAの適度な長さにより分離される部位に結合するタンパク質間の相互作用により安定化するDNAルーピングを検出するための実験的アプローチを設計した。我々は、これらの別々の領域を結合するタンパク質を含有する部分的に精製されたK562細胞核抽出物を使用した。
【００９７】
図8は、これらの実験においてプローブとして使用されるβ-グロビン遺伝子5'領域の図式である。図11および10は、ルーピングを証明するためにこの630 bpプローブ（-610/+20）を制限消化と組み合わせて使用するEMSAを示し、そして図9は結果の図的解釈を与える。これらの実験のために使用される部分的に精製されたタンパク質抽出物は、-150プロモーター-結合タンパク質およびサイレンサー（-530）-結合活性の両方を含有することが、それらの反応オリゴヌクレオチドを用いた別々のゲルシフトアッセイにより見出された。
【００９８】
図 10 、レーン 1 、および図 11 、レーン 1は、単一バンドを与えるDNAのみの移動を示す。図10および11のレーン 2では、全てのDNAは部分的に精製されたK562核抽出物由来のタンパク質の結合のため、その移動において遅延する。図10および11のレーン 3では、DNAおよびタンパク質が複合体を形成した後、物質は制限酵素Sau 96 Iと反応された；この物質の大半は、レーン2のそれと同様にその移動において遅延した。（図8に示すように、プロモーターおよび上流領域の間でDNAを切断する5'β-グロビン配列における単一のSau 96 I部位、-210、が存在する。）図10および11のレーン 4 および 5では、各々レーン2および3での複合体が脱タンパク質化されて、純粋DNAとして泳動されて、DNAの1つの大きな断片がレーン2における複合体から回収され、一方、レーン3における複合体からの全てのDNAは切断されて、純粋DNAが制限酵素と反応したとき（レーン 6、図10）に得られるバンドに対するその移動と同じ2つの明瞭なバンド（レーン5）を与えることを示した。これらのフラグメントの長さは、229 bp（+22/-209、プロモーターを含有する）および401 bp（サイレンサーを含む、上流配列を含有する）。切断前DNAのこれらのフラグメントを含有する混合物が、部分的に精製されたタンパク質と反応させられるとき、2つのフラグメントは独立してシフトされたが、しかし大きな（ループ化した）複合体は形成されなかった（レーン 7、図10）。両方の図のレーン2において検出される複合体は、DNAがSau 96 Iで完全に切断された後に結合するという観察事実は、ループが-209から下流の1つあるいは複数の部位および-210から上流の1つあるいは複数の部位の間で最初に形成されたことを示す。
【００９９】
これらの結果の解釈図は、図 9に示され、そして説明は図のどの部分が図10のどのゲルレーンに対応するかを示す。図9は、β-グロビン遺伝子5'領域30およびそれに結合するタンパク質を解明するために使用される実験の説明図を示す。フェリチン34は、フェリチン結合部位44にてプロモーター領域30に結合する。いくつかのDNA結合タンパク質50もまた、β-グロビンプロモーター領域に結合する。結合タンパク質50は全て、フェリチン結合部位44の上流に結合する。フェリチンによるβ-グロビン遺伝子の抑制は、フェリチンおよび少なくとも1つのプロモーター結合タンパク質50の間のタンパク質-タンパク質相互作用により亢進される。図9は、少なくとも1つの結合タンパク質32を有するタンパク質-タンパク質-DNA複合体フェリチン34形式を説明する。プロモーター領域30はフェリチン結合部位44を有しており、その上流はタンパク質結合部位46を有する。結合タンパク質32は結合部位46に付着し、およびフェリチン34はフェリチン結合部位44に結合する。そして、フェリチン34および結合タンパク質32は互いに結合して、それによりDNA中でループをつくる。プロモーター領域30は、制限酵素Sau 96 Iによって制限酵素部位36で2つのより小さなフラグメント40および42に切断されうる。結合タンパク質32およびフェリチン34の間のタンパク質-タンパク質相互作用のため、複合体はインタクトな（intact）ままである。このように、制限酵素の適用は、結果としてゲルアッセイ上でのモビリティシフトにはならない。これは図10および図11の両方のレーン2および3において認めることができる。非切断DNAループからタンパク質を除去することは、結果として図10のレーン4および図11のレーン4で説明されるインタクトプロモーター領域30をもたらす。制限酵素により切断された後に、DNAループからタンパク質を除去することは、結果として2つのDNAフラグメント40および42をもたらす。これらのフラグメントは、図10のレーン5および図11のレーン5において認められうる。図10のレーン7は、フラグメント40および42に核抽出物を加えた結果を示す。レーン3に見出される同じ複合体は、DNAフラグメント40および42に核抽出物を加えることにより形成されうる。
【０１００】
プロモーターフラグメント40および42が、フェリチン34および結合タンパク質32を有する核抽出物と組み合わされるとき、ゲルシフトが生じる。これは図10のレーン7に示される。これは、DNAループがフェリチンがプロモーター領域に結合することにより引き起こされることを示す。
【０１０１】
対照：図10および11に描かれるように、上記した実験に組み込まれる対照は、複合体を脱タンパク質化することを含み、ループが制限酵素により切断されたことを示し、そして非関連DNA配列（例えば、P. putida DNA）がこの抽出物と複合体を形成しないことを示す。さらなる対照として、図11におけるものと同じゲルからのレーン3における単一-バンド複合体は単離され、脱タンパク質化され、そしてまたSau 96 I消化の結果として生じた等量の2つの制限フラグメントを含有することを示す。図10、レーン6および7に示されるように、ベータグロビン5'領域の2つのSau 96 Iフラグメントは、この抽出物を用いて独立してシフトし、そしてそれらが連結されないならば、大きな複合体は形成しない；さらに、分離された制限フラグメントをシフトし始めるためには、ループ化した複合体の形成を開始するために必要とされるより、約8倍の大きなタンパク質濃度が必要とされる。
【０１０２】
検討
解釈：報告された実験では、DNAルーピングは特異的な制限酵素を用いた消化と組み合わせたEMSAアッセイを用いてin vitroで検出できることが示された。これらのDNAルーピング実験では、結果から、ヒトβ-グロビン遺伝子の-209および+20 bpの間の配列は-210および-610 bpの間の上流配列と相互作用することが示される。ルーピングは、-150プロモーター-結合タンパク質およびβ-グロビンサイレンサー-結合タンパク質を含有する、部分的に精製された抽出物により媒介されて、抽出物および別々の結合配列を用いた結合実験により確認される。我々のEMSAにより検出される単一、巨大DNA-タンパク質複合体がSau 96 Iで切断されたとき、複合体はまだゲル上の高い位置に、単一、巨大複合体として移動した。（単一、2本鎖制限切断はDNA構造をわずかに変化させるので、期待されるべき切断複合体の移動の小さな増加があった。）このループ化複合体におけるタンパク質の結合は、非常に堅固であるようであることもまた注目すべきである；複合体を壊すためには、高度に過剰な非標識-164/-128および-584/-527オリゴヌクレオチドを必要とする（データは示されない）。さらに、完全な630 bp DNAの結合親和性とSau 96 Iにより生成されるフラグメントの混合物の結合親和性との比較は、巨大、インタクト（630 bp）DNAを用いてシフトされる複合体を形成する方が、分離フラグメントの混合物を用いるより、約8倍少ないタンパク質を必要とすることが示され、巨大630 bp DNAへの結合は協調的であり、そしてルーピングは起こっていることを示す。
【０１０３】
これらの結果の全ては、協調的な（および、通常は堅固な）結合を示す2つあるいはそれ以上のタンパク質により媒介される、DNAルーピングを調節する既知のパラメーターおよび力と一致する。これらの実験の結果はまた、上流サイレンサーによるβ-グロビン遺伝子の抑制がDNAルーピングにより媒介されうることも示す。このアプローチは関連するタンパク質の同定を決定することはできず、そして、in vitroでのあるプラスミド収縮と同様に、DNAスーパーコイルあるいは弱いタンパク質-タンパク質相互作用が存在する場合は働かないであろう。
【０１０４】
フェリチンおよび1つあるいはそれ以上の上流結合タンパク質の間の相互作用により形成されるプロモーター領域中のループは、β-グロビン遺伝子の抑制を亢進する。ヒト細胞は一般的に十分量の上流結合タンパク質を有しているので、ここに記載される方法によってヒト細胞にフェリチンのみを加えることは一般的に、β-グロビン遺伝子およびこの活性により制御されるその他の遺伝子の抑制を引き起こすのに十分である。加えて、CAGTGCフェリチン結合部位へのフェリチンの結合は一般的に、β-グロビン遺伝子の転写を抑制するのに十分である。
【０１０５】
フェリチン-H発現を増加させる1つの方法は、フェリチン-Lあるいはその他のフェリチンファミリータンパク質の発現を抑制することである。これは、フェリチン-H以外のフェリチンファミリータンパク質をコードする遺伝子に特異的なアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドを使用することにより達成されうる。これらのフェリチンタンパク質の減少および発現は、フェリチン-Hのより高い濃度および高められた発現を導く。フェリチン-Hおよびその他のフェリチンファミリータンパク質の間の割合をシフトすることにより、β-グロビンは抑制され、そして鎌状赤血球性貧血の悪影響は受容できるレベルまで減少される。
【０１０６】
フェリチン-Hの高められた発現はまた、細胞内鉄管理不適切を回復させて、結果として有害な第1鉄（鉄（II））イオンのレベルをより低下させる。フェリチン-Hフェロオキシダーゼ活性が細胞内鉄の適切な管理に影響を与える一方で、フェリチン-Hのより高い濃度は、鉄代謝に関連する多くの遺伝子の発現に影響する。フェリチン-Hのこの遺伝的制御機能は、広く様々な疾患により悪影響を受けた細胞において適した鉄管理を容易にする。背景に記載されるように、癌、神経変性疾患、神経筋障害およびアテローム性動脈硬化の全ては、身体の細胞内において不適切な鉄管理を導く。フェリチン-Hの濃度の増加および結果としての遺伝的制御効果は、不適切な鉄管理の悪影響を改善する。
【０１０７】
研究により、フェリチン-Hはおおまかにフェリチン-Lと同レベルで発現されるとき、最も効果的なフェロオキシダーゼ活性を示すことが示された。等しい発現レベルは、結果として最も多くのフェリチン-H／フェリチン-Lヘテロ重合体をもたらす。24マーのフェリチン複合体のヘテロ重合体形式は、第1鉄（鉄（II））イオンから第2鉄（鉄（III））イオンへの変換および鉄イオンの隔離に関して最も効率的である。これは、フェリチン-Hおよびフェリチン-Lの等しい濃度を維持することは、結果として適切な鉄管理を最も生じそうであることを示唆する。フェリチン-Hのレベルの増加は、結果としてフェリチン-Hホモ重合体の形成を生じるであろう。フェリチン-Hホモ重合体は、低いフェロオキシダーゼ活性を示す。これはより高いレベルのより有害な第1鉄（鉄（II））をもたらし、そして細胞に悪影響を有するであろうことが予想されるであろう。しかし、発明者は、フェリチン-Hの遺伝制御機能はまさに反対のことを引き起こすことを発見した。
【０１０８】
当業者は、細胞内でフェリチン-Hのレベルを高めるための多くの方法があることを理解するであろう。それは、当業者には周知のいずれかの数の医薬的に許容可能である手段によるフェリチン-Hタンパク質自身の導入も含みうる。これは、フェリチン-Hタンパク質を含有するリポソーム構築物を使用することを含みうる。これらの構築物は、リガンドあるいは抗体を有しているかもしれないし、そうでないかもしれない。
【０１０９】
フェリチン-Hの細胞内レベルを増加させるための代わりの方法は、フェリチンファミリー分子の発現を制御することである。これは多くの方法で行われうる。フェリチン-H以外のフェリチンファミリー遺伝子を標的とするアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドは、結果的に標的遺伝子の発現の減少を生じ、および細胞内のより高い濃度のフェリチン-Hを引き起こすであろう。内因性フェリチン-H遺伝子あるいは関連するフェリチンファミリー遺伝子の転写あるいは翻訳を増加させる、タンパク質あるいはその他の化合物を導入することも可能である。これらの活性化化合物は、上で検討されるようにフェリチン-Hタンパク質自身の導入と同様な方法で細胞に導入されうる。
【０１１０】
フェリチン-Hの細胞内レベルを増加させるさらなるもう一つの方法は、細胞内へフェリチン-H発現ベクターを導入することである。当業者は、プラスミド、ファージミド（phagemid）、およびコスミドを含む、多くの異なるベクターを用いて細胞をトランスフェクションする多くの方法があることを評価するであろう。使用されるベクターの型、ベクター内のプロモーター領域およびベクターを用いて使用されるいずれかの対照配列は、当業者に知られる様々な因子に依存して変わるであろう。これらの因子は、標的とされる細胞組織、標的細胞内での所望される発現のレベルおよびフェリチンファミリータンパク質発現のレベルを含むが、それらには限定されない。
【０１１１】
フェリチン-Hの細胞内レベルを増加させるさらなるもう一つの方法は、フェリチン-Hプロモーターの転写あるいは翻訳を高めるタンパク質あるいは化合物のレベルを増加させることである。
【０１１２】
細胞内の方法を増加させる方法は、細胞がそれ自身のフェリチンをつくる細胞内誘導方法、あるいはフェリチンがリポソーム構築物を使用するときに細胞に加えられる細胞外誘導方法のいずれかが考えられうる。
【０１１３】
フェリチンファミリータンパク質をコードするベクターを用いた細胞のトランスフェクションは、ex vivoあるいはin vivoのいずれかで行われうる。in vivoで行われるとき、ベクターは患者の体内に導入される。ex vivoで行われるとき、細胞はベクターを用いてトランスフェクションされ、そして患者の体の組織に移植される。幹細胞はこれにとって特によく適しているが、しかしその他の細胞も使用されうる。
【０１１４】
本発明はここに付される図に関して記載されたが、ここで示されるあるいは示唆されるもの以外に、その他のおよびさらなる修飾は、本発明の意図および範囲内で行われうることを理解されるべきである。
【０１１５】
【表１】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図1はコトランスフェクションされたCV-1細胞におけるβ-グロビンプロモーターのフェリチン-H抑制を示す。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードするレポーター遺伝子の一過性の発現は、以下の材料と方法に記載されるようにELISAにより測定されるng CAT／mg細胞タンパク質として表され、次のCATプラスミド（左から右へ）を用いてトランスフェクトされるCV-1細胞について示される：活性化SV40プロモーターにより駆動されるCAT（pCAT-対照ベクター）、プロモーターを伴わないCATプラスミド（pCAT-基本ベクター）、非刺激ヒトβ-グロビンプロモーター（B-CAT）、コトランスフェクションされたEKLFエフェクタープラスミドにより刺激されるβ-グロビンプロモーター（B-CAT、EKLF）、およびフェリチン-H発現プラスミドを用いてコトランスフェクションされたEKLF-刺激β-グロビンプロモーター（B-CAT、EKFL、FH）。レポーター遺伝子発現は、コトランスフェクションされたフェリチン-H発現ベクターの存在により62%抑制された。
【図２】 図2Aはヒトβ-グロビン遺伝子の遠位プロモーターへのフェリチン鎖の結合を示す。5'β-グロビン遠位プロモーター（-222/-128）（レーン1から6の左側のセット）、あるいは近位プロモーター（-127/+20）（レーン1から5の右側のセット）、の制限フラグメントは³²Pを用いて末端標識（end-label）され、そして、以下の材料と方法に記載されるように、K562核抽出物（左レーン2）、精製ヒト肝臓フェリチン（F_L、レーン3 [左]および2、3、および4 [右]）、ヒト心臓フェリチン（F_H、レーン4 [左]および5 [右]）、ヒトトランスフェリン（T、レーン5 [左]）およびアポトランスフェリン（aT、レーン6 [左]）と共に、ゲルモビリティシフトアッセイ（gel mobility shift assay）においてプローブとして使用された。レーン1 [左および右]は、DNAのみ（タンパク質なし）を含有する。
図2Bは-222/-128β-グロビン領域へのK562細胞核抽出物由来フェリチン様タンパク質の結合を示す。ーK消化に続く75℃での熱処理を使用する、胚赤血球から90%純粋フェリチンを得るための手順（36）は、K562細胞核抽出物に適用された；遠心分離の後に得られた透明な上清液は、抗フェリチンポリクローナル抗血清（最後のレーン）を伴う“スーパーシフト”を与える単一シフトバンド（左から3番目のレーン）を与え、フェリチンの3つの特性（プロティナーゼK-耐性、熱安定性、および抗フェリチン-特異的抗血清との反応性）を有する核抽出物内のタンパク質が存在することを示した。
図2Cは抗-フェリチンスーパーシフトアッセイ（supershift assay）の特異性を示す対照実験を示す。左のレーンのセット（a）：抗-F（抗-フェリチン）はスーパーシフト（矢印）を与える；抗-T（抗-トランスフェリン）は与えない。中央のレーンのセット（b）：抗-Fスーパーシフトは抗-ウサギ-IgGにより阻害される。右のレーンのセット（c）：プローブとしてのヒトβ-グロビン遺伝子の2番目のイントロン（IVS-2）由来の正常あるいは変異配列を使用すると、K562核抽出物を用いた主要なシフトバンドが得られた；しかし、抗-Fにより認識されるものはなかった（すなわち、スーパーシフトバンドを得られなかった）。
【図３】 図3A-3Bは抗体スーパーシフトアッセイを使用して、β-グロビンプロモーターの-164/-128領域への核内フェリチンの結合領域の位置を示す。
図3Aは、各々末端標識されて結合のための基質として使用されて、抗体スーパー-シフトアッセイおよび粗K562細胞核抽出物を使用する、95 bp Rsaフラグメント（-222/-128）およびこの同じ領域を重複する2つのds-オリゴを示す（-164/-128および-232/-188）。
図3Bは、モビリティシフトアッセイを示す。スーパー-シフトバンド（矢印）は、Rsaフラグメントおよび-164/-128オリゴを伴うが、-232/-188オリゴは伴わないで観察され、核内フェリチンのための結合部位がβ-グロビンプロモーターの-164および-128の間にあることを示した。
【図４】 図4A-4D オリゴヌクレオチド競合アッセイを使用する、核内フェリチンの結合部位の定義。
図4Aは、図3Aにおいてマッピングされる5'結合領域に対応するwtおよび変異オリゴヌクレオチドの配列を示す。変異ヌクレオチドおよび本来のCAGTGC配列には下線が引かれる。これらのオリゴは、図4B、4C、および4Dにて競合的ゲルシフトにおいて使用されており、2本鎖である；上部の鎖のみ示される。
図4Bは、K562核由来の部分的に精製されたフェリチン-タンパク質を用いて、末端標識wt配列対非標識wtあるいは変異体no.4オリゴヌクレオチドを使用する競合的ゲル-シフトアッセイを示す。示される過剰倍率0（fold excess）における非標識オリゴヌクレオチドは、結合が開始された時に標識wt配列と共に存在した。wt配列は50倍過剰の時にそれ自身と著しく競合するが、CAGTGC配列にて変異を受けたオリゴヌクレオチドは、同レベルの競合を与えるために1,000倍過剰を必要とする。ラベル：p, プローブ；sb, シフトバンド；w, ウェル。
図4Cは、図4Bにおけるゲルについて、プロットされるシフトバンド対競合物のモル過剰の相対的光学濃度を示す。
図4D wtおよび変異オリゴヌクレオチドのモル過剰は、標識プローブの結合の50%阻害を産生するために必要とされた。各々の変異オリゴヌクレオチドは、 同程度の競合のために20倍より高い濃度を必要とする変異体no. 4（2153/2148 CAGTGC配列にて変異を受ける）以外で、50%阻害を産生するためにwt配列とほとんど同じモル過剰を必要とし、CAGTGCがDNA-タンパク質相互作用にとって重要であることを示した。
【図５】 図5は哺乳類β-グロビンプロモーターの多重配列アライメントを示し、CAGTGCモチーフの保存の程度の高さを示す。哺乳類β-グロビンプロモーターの多重配列アライメントは、CAGTGCモチーフの保存の程度の高さを示す。プロモーター配列（ヒトβ-グロビン遺伝子の-162/+1に対応する）は、12の哺乳類種について並べられた。配列についてのGenBank寄託番号は、（上から下へ）V01317、X61109、X05665、X00376、M15387、X14727、M61740、J04429、Y00347、M11818、X15009、およびX14061である。アライメントは、プログラムPILEUPおよびLINEUPを使用して生成した。
【図６】 図6は、もしβ-グロビンプロモーターが変異を受けたフェリチン結合部位を含有する場合、フェリチン-Hがその抑制する能力を失うことを証明するコトランスフェクション実験を示す。コトランスフェクション実験は、フェリチン結合部位（CAGTGC）が変異される時、β-グロビンプロモーターのフェリチン-H抑制および抑制する能力の消失を証明する。CV-1細胞のトランスフェクションは、2 3 10 6 CV-1細胞に加えられる8 mlのDMRIE-Cと混合される一定量（6 mg）の全プラスミドDNAを用いて行われ、そして各々のトランスフェクションは2 mgのβ-CATプラスミド（W 5 wt、あるいはM 5変異体）、61 mgのEKLF、63 mgのFH（フェリチン-H発現プラスミド）を有しており、違いはpEGFPを伴う6 mgでつくられた。リポーター遺伝子活性は、（ELISAにより測定される）細胞タンパク質のmgあたりのCATのngとして表され、天然（W）あるいは変異（M）β-CATプラスミドのいずれかとの次の組み合わせについて示される：非刺激ヒトβ-グロビンプロモーター（白抜きバー）；コトランスフェクションされるEKLFエフェクタープラスミドにより刺激されるβ-グロビンプロモーター（斜線バー）；およびフェリチン-H発現プラスミドを用いてコトランスフェクションされるEKLF-刺激β-グロビンプロモーター（黒色バー）。（データセットあたりn 5 3トランスフェクション；バー5 SEM）。（ヒストグラム上で図で示される）レポータープラスミドの構造は以下に記載される。
【図７】 図7は、フェロオキシダーゼ活性部位（中央）に結合する鉄イオンを有するフェリチン-Hタンパク質単量体の略図を示す。周囲にある2つの暗い／ベタな円はカルシウムイオンを表す。
【図８】 図8は、ヒトベータグロビン遺伝子の5'のタンパク質-結合部位を示す。一般的な因子は長方形の中に示され、赤血球系-特異的因子は楕円（elipse）の中に示され、そしてフェリチンタンパク質は円として示される。
【図９】 図9は、実施例2におけるDNAルーピング（looping）実験の図式的解釈を示す。5'プロモーター領域30は図10におけるレーン1および4に、タンパク質／DNA複合体50は（Sau 96 Iで切断する前の）レーン2に、タンパク質／DNA複合体52は（切断した後の）レーン3に、脱タンパク質化フラグメント40および42はレーン5および6に、およびタンパク質／DNA混合物54はレーン7に対応する。この説明において、プロモーターに結合する1つあるいは複数のタンパク質は、黒い円として描かれ（例えば、-150部位で結合されるタンパク質）、-210制限部位の上流に結合される1つあるいは複数のタンパク質（例えば、2つの先に記載されたサイレンサー-結合タンパク質の1つあるいは両方）（白抜き円で描かれる）と相互作用し、結果的に、ゲルシフトアッセイにおいて単一バンドとして複合体あるいはそのモビリティを妨げることなしに制限酵素で切断されうる介在DNAのルーピングとなる。
【図１０】 図10 -610/+20β-グロビンDNAおよびK562核抽出物から部分的に精製されたタンパク質を用いたin vitroでのDNAルーピング。
制限酵素Sau 96 Iを用いてループを切断する前および後のDNAルーピングのゲルシフト検出。実線矢印は始点を示す。レーン 1-純粋630 bp（-610/+20）DNAの移動。レーン 2-DNAプラス加熱K562核抽出物、すなわちシフトされたDNA（DNA + タンパク質）。レーン 3-DNAプラス加熱抽出物、Sau 96 Iで切断。レーン 4-レーン2の試料、電気泳動の前に脱タンパク質化される。レーン 5-レーン3の試料、切断の後だが電気泳動の前に脱タンパク質化される。レーン 6-DNAのみ、Sau 96 Iでプレカットされる。レーン 7-Sau 96 I でプレカットされ、そして抽出タンパク質と反応させたDNA。（注：反応条件および濃度はレーン1-5と同じであったが、レーン6および7については多くの物質の半分をゲルにロードした。）
【図１１】 図11 電動モビリティシフトアッセイ（EMSA）および適した制限酵素を用いた単一部位開裂の組み合わせの使用に基づく、in vitro DNAルーピングアッセイ。レーン 1：5' β-グロビンDNAのみの630 bpの移動（矢印は始点に印を付ける）。レーン 2 および 3：ゲルシフト（EMSA）は、Sau 96 Iでの切断の前（レーン2）および後（レーン3）に、非誘導K562細胞およびそのDNA由来の部分的に精製された核抽出物を用いて行われた。全てのDNAは、制限酵素切断の後（レーン3）の単一バンドとしてその移動を保持する単一のシフトされた複合体（レーン2）におけるタンパク質により結合された。レーン 4 および 5：DNA試料は、各々レーン2および3において複合体の脱タンパク質化の後に回収された。核抽出物の調製：非接着K562細胞の核抽出物は、先に記載されるように、Dignamらの手順により調製した。部分的に精製された抽出物は、関心のある結合タンパク質において80%濃縮され、Atkinsonら（25）により記載されるように、80℃で核抽出物を加熱し、遠心分離して、そして上清液を保持することで調製した。濃縮抽出物は、標準EMSAにおける-150（-164/-128）および-530（-584/-527）オリゴヌクレオチドを結合するタンパク質を含有した。ゲルモビリティシフトアッセイ：FriedおよびCrothers（26）の手順は、（2 ng [9,000 cpm]の630 bp DNA、2.5μgの抽出タンパク質、1.0μgのポリdI：ポリdC、100 mM KCI、および結合緩衝液を含有する）各々の反応が（通常の25μlに代わり）5μlの容量におけるものであるということ以外は、Bergら（19）により記載されるように使用された。タンパク質およびDNAは、20分間室温で相互作用を可能にされ、そして遅延（retardation）アッセイはイオン強度で4パーセントアクリルアミドゲルを用いて行われた。DNA ルーピング実験の設計：さらに上流（約-300から-600 bp）に結合するタンパク質とプロモーター-結合タンパク質の相互作用によりルーピングを検するために、DNA-タンパク質複合体を、図1に示されるようにこのDNAを-210/-209 bpで開裂するSau 96 Iを用いて、次のように修飾した製造業者の説明を使用して反応させた：2μlの酵素および15μlの酵素緩衝液プラスBSAを、タンパク質-DNA結合反応の内容物（5μl）を含む全量31μlの中で、室温で使用した。
【図１２】 図12は、核抽出物がフェリチン-H結合部位の上流で結合する、およびまたフェリチンにも結合するDNA結合タンパク質を含有することを示す、ゲルモビリティアッセイを示す。レーン1は、ベータ-グロビン5'プロモーター領域のシフトされていない（unshifted）630 bpセグメントを示す。レーン2は、加えられた核抽出物を伴う630 bpフラグメントを含有する。上流結合タンパク質およびフェリチン-Hの両方が存在するので、DNAはループ化されて、そしてバンドはシフトした。レーン3は、630 bpフラグメントおよびフェリチン-Hが除去された核抽出物を含有する。上流結合タンパク質のみが存在するので、バンドシフトはより少ない。しかし、より少ないシフトがあるという事実は、タンパク質が結合されていること、およびフェリチン-Hがないために複合体はそれほど大きくないことを示す。レーン4および5は、レーン2と同じ試料であり、加えられた抗-フェリチン抗血清を伴う。630 bpフラグメントは次に抗血清に結合するフェリチンに結合されるので、結果的にスーパーシフト（supershift）となる。
【配列表】

Claims (23)

1. 少なくとも1つのフェリチン-Hあるいはその誘導体の細胞内での量を効果的なレベルまで増加させることを含む、細胞内鉄管理不適切の効果により引き起こされるあるいは亢進される疾患を抑えるための方法。
2. 外因性フェリチン-Hあるいはその誘導体がグロビン-産生細胞に導入される、請求項1の疾患を抑えるための方法。
3. グロビン-産生細胞がフェリチン-Hあるいはその誘導体を含有するリポソーム構築物と融合される、請求項1の疾患を抑えるための方法。
4. フェリチン-Hあるいはその誘導体がグロビン-産生細胞の内因性フェリチン遺伝子の発現を誘導することにより産生される、請求項1の疾患を抑えるための方法。
5. フェリチン-Hあるいはその誘導体の細胞内濃度がフェリチン-Lあるいはその誘導体の発現を抑制することにより高められる、請求項1の疾患を抑えるための方法。
6. フェリチン-Lあるいはその誘導体の発現が、フェリチン-Lあるいはその誘導体に特異的なアンチセンスDNAの細胞への導入により抑制される、請求項1の疾患を抑えるための方法。
7. フェリチン-Hあるいはその誘導体が、フェリチン-Hあるいはその誘導体をコードするベクターを用いて少なくとも1つの細胞をトランスフェクションした後に産生される、請求項1の疾患を抑えるための方法。
8. トランスフェクションがin vivoで起こる、請求項7の疾患を抑えるための方法。
9. トランスフェクションがex vivoで起こる、請求項7の疾患を抑えるための方法。
10. トランスフェクションが、表面上にリガンドあるいは抗体を有するリポソーム構築物であって、細胞表面上の特異的な受容体と結合できるものの中にベクターを挿入することを含む、請求項7の疾患を抑えるための方法。
11. フェリチン-Hあるいはその誘導体を用いてグロビン-産生細胞における成体β-グロビン遺伝子の発現を抑えることを含む、鎌状赤血球病を治療するための方法。
12. 外因性フェリチン-Hあるいはその誘導体が、グロビン-産生細胞に導入される、請求項11の鎌状赤血球病を治療するための方法。
13. グロビン-産生細胞がフェリチン-Hあるいはその誘導体を含有するリポソーム構築物と融合される、請求項12の鎌状赤血球病を治療するための方法。
14. フェリチン-Hあるいはその誘導体が、グロビン-産生細胞の内因性フェリチン遺伝子の発現を誘導することにより産生される、請求項11の鎌状赤血球病を治療するための方法。
15. フェリチン-Hあるいはその誘導体の細胞内濃度が、フェリチン-Lあるいはその誘導体の発現を抑制することにより高められる、請求項11の鎌状赤血球病を治療するための方法。
16. フェリチン-Lあるいはその誘導体の発現が、フェリチン-Lあるいはその誘導体に特異的なアンチセンスDNAの細胞への導入により抑制される、請求項15の鎌状赤血球病を治療するための方法。
17. フェリチン-Hあるいはその誘導体が、フェリチン-Hあるいはその誘導体をコードするベクターを用いて少なくとも1つの細胞をトランスフェクションした後に産生される、請求項11の鎌状赤血球病を治療するための方法。
18. トランスフェクションが、表面上にリガンドあるいは抗体を有するリポソーム構築物であって、細胞表面上の特異的な受容体と結合できるものの中にベクターを挿入することを含む、請求項17の鎌状赤血球病を治療するための方法。
19. フェリチン-Hあるいはその誘導体が、β-グロビン遺伝子のプロモーター領域に結合する、請求項11の鎌状赤血球病を治療するための方法。
20. 医薬的に許容可能なキャリア中においてフェリチン-含有ビヒクルを患者に投与することであって、前記ビヒクルが造血幹細胞、赤血球系前駆細胞、あるいは造血細胞を標的とすることを含む、鎌状赤血球病を治療するための方法。
21. 過剰な細胞内鉄により引き起こされるあるいは亢進される神経学的障害を治療するための方法であって：影響される神経細胞において効果的なレベルまでフェリチン-Hあるいはその誘導体の細胞内量を増加させることを含む、前記の方法。
22. フェリチン-Hあるいはその誘導体；および細胞特異的標的リガンドを含む医薬的組成物。
23. フェリチン-Hあるいはその誘導体をコードする遺伝子；および適したトランスフェクションベクターを含む医薬的組成物。