PT1354032E - Terapia reguladora de genes envolvendo ferritina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "TERAPIA REGULADORA DE GENES ENVOLVENDO FERRITINA"

Antecedentes

Campo da invenção A presente descoberta está relacionada com a terapia da regulação de genes envolvendo a ferritina. Mais especificamente, esta descoberta está relacionada com o uso das proteínas derivativas Ferritina-Hand, logo para regulação de genes relacionados com o metabolismo e regulação do ferro.

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Antecedentes da Anemia Falciforme. A hematopoiése, ou a formação das células sanguíneas, começa no embrião humano em desenvolvimento como agrupamentos de células estaminais chamadas ilhas de sangue. Estas células aparecem no saco vitelino cerca da terceira semana de desenvolvimento e, cerca do terceiro mês, migram para o fígado em desenvolvimento que se torna o principal local da formação de células sanguíneas. Embora tanto o baço, como os gânglios linfáticos e a medula óssea façam pequenas contribuições para o desenvolvimento das células sanguíneas, só ao quarto mês a medula óssea se Ί torna ο principal local de hematopoiése„ Ao nascimento, virtualmente todas as células são originárias da medula óssea.. Embora pequenos focos de células hematopoiéticas persistam no fígado por períodos de tempo mais longos, a formação de células hepáticas diminuiu para uma insignificância. Neste ponto, toda a medula forma activamente células sanguíneas e continua a fazê-lo até depois da puberdade quando, cerca dos 18 anos, os principais locais de formação de células sanguíneas tornam-se as medulas das vértebras, costelas, esterno, crânio, pélvis e as epífises proximais do fémur e do úmero. Estas áreas representam cerca de apenas metade da medula disponível. As cavidades restantes são cheias com tecidos adiposos e amarelados.

No adulto, a hematopoiése involve a medula óssea, os gânglios linfáticos e o baço. Estes órgãos e os tecidos associados são tradicionalmente dividos em tecidos do tipo mielóide e do tipo linfóide. Os tecidos mielõides e as células derivadas do tecido mielóide incluem os eritrócítos, plaquetas, granulócitos e monócitos. Os linfóides e os tecidos derivados linfóides incluem o timo, os gânglios linfáticos e o baço. A divisão mielóide/linfõide é de alguma forma artificial visto que se crê que estes dois tipos de tecidos são originários da mesma célula estaminal pluripotente,

As células estaminais linfóides e mielóides, formadas a partir da divisão da célula pluripotente, são precursoras de todos os tipos de células subsequentes. Os tipos de células confinadas a célula estaminal linfóide incluem as 3 células pro-T que formam células T maduras e as células pro-B que se diferenciam em células plasmáticas. Os tipos de células intermediárias podem ser distinguidos com base nos fenómenos da superfície da célula tais como a expressão da cadeia leve e pesa da imunoglobulina, proteína Ia e outros constituintes da superfície da célula. Os três tipos de células confinadas à célula estaminal mielóide incluem células mega/E que se diferenciam em unidades de ruptura da formação de eritrócitos (BFU-E) seguidas pelas células da unidade de formação da colónia de eritrócitos (CFU-E) e as células CFU-megacariócitas (CFU-mega), células CFU-granulócito/macrófago (CFU-G/M) que se diferenciam em células CFU-G e CFU-M, e as células CFU-eosinõfilo (CFU~Eo) que finalmente formam eosinófilos maduros. Embora estes tipos de células confinadas residam maioritariamente na medula, alguns circulam pelo corpo na corrente sanguínea.

As proporções relativas dos tipos de células na medula óssea têm um rãcio mielóide/eritróide de cerca de três para um contendo cerca de 60% de granulócitos e os seus três precursores, cerca de 10% de linfócitos e os seus precursores, cerca de 20% eritrócitos e os seus precursores e cerca de 10% de células não identificadas. Os tipos de células mielóides predominantes na cavidade medular são os mielócitos, metamielõcitos e granulócitos. Os tipos de células predominantes no compartimento eritrõide são os normoblastos policromatofílicos e ortocromãticos. Em condições normais do metabolismo do ferro, cerca de 30% a 40% dos normoblastos contém grânulos de ferritina dispersos. Estas células são referidas como sideroblastos e os grânulos de ferro que contém são reservatórios acumulados à medida que as células introduzem ferro na 4 protoporfirina para formar o heme A produção do heme e a produção de globína são balanceadas com precisão dentro da célula. Se algum deles estiver impedido ou diminuído, por qualquer razão, ferritina em excesso acumula-se nos sideroblastos, A acumulação aumentada de ferro pode ser visualizada na mitocôndria, o local da síntese do heme, A função principal dos glóbulos vermelhos é transportar oxigénio aos tecidos do corpo.

Funções menores incluem o transporte de nutrientes, mensagens inter-celulares e citocinas, e a absorção dos metabolitos celulares. A anemia, ou perda de células vermelhas do sangue ou da capacidade das células hemáticas, pode ser definida sumariamente como a redução da capacidade do sangue para transportar oxigénio e pode ser aguda ou crónica.

Uma perda de sangue crónica pode ser causada por anomalias extrínsecas dos glóbulos vermelhos, anomalias intrínsecas ou produção insuficiente de células sanguíneas.

Anomalias extrínsecas ou extracrepusculares incluem doenças mediadas por anticorpos tais como reacções a transfusões e eritroblastose, traumas mecânicos nas células vermelhas como anemias hemolíticas micro-angiopáticas, púrpura trombocitopénica trombótica e coagulação intravascular disseminada. Adicionalmente, infecção por parasitas como o Plasmodium, lesões químicas de, por exemplo, envenenamento, e sequestro no sistema mononuclear tal como por hiperesplenismo podem provocar desordens nas células vermelhas do sangue. 5 A hemoglobina contém quatro cadeias proteicas, duas cadeias alfa e duas cadeias beta (a2 Q2) , trançadas em conjunto, cada qual com a sua própria molécula de ferro e com um peso molecular combinado de aproximadamente 68 kD. A macromolécula de hemoglobina é normalmente glicosilada e após absorver o oxigénio dos pulmões transforma-o em oxi-hemoglobina (Hb02). Hã pelo menos seis formas distintas de hemoglobina, cada qual expressa em diferentes períodos durante o desenvolvimento, A hemoglobina no embrião é encontrada em pelo menos três formas, Hb-Gower 1 < ξ2 é2), Hb-Gower 2 (cí2 έ2), e Hb-Portland {ξ2 γ2) . A hemoglobina no feto contém quase totalmente HbF (α2 γ2) , enquanto a hemoglobina no adulto contém cerca de 96% HbA {a2 J32) , cerca de 3% (α.2 Õ2) e cerca de 1% HbF fetal (α.2 γ2) . A mudança embrionária da expressão da globina de ξ- para a- e de έ- para γ- começa no saco vitelino.

No entanto, foram encontradas cadeias de ξ- e έ-embrionãrios no fígado fetal e a transição completa para a forma fetal só ocorre num estádio de desenvolvimento tardio. A mudança fetal de γ- para β- começa mais tarde na eritropoiése com a quantidade de β-globina produzida a aumentar durante a gestação. No nascimento, a β-globina contabiliza cerca de 40% da síntese da cadeia não-a-globina e por isso continua a aumentar rapidamente. 6

Os defeitos ou mutações na cadeia da globina são comuns. Algumas destas mutações genéticas não causam adversidades ou apenas consequências menores para a pessoa, no entanto, a maioria das mutações impede a formação de uma molécula Intacta ou normal de hemoglobina através de uma inabilidade estrutural ou funcional para ligar efectivamente o ferro, uma inabilidade das cadeias ou dos pares dessas cadeias para interagirem efectivamente ou correctamente, uma inabilidade da molécula absorver ou libertar oxigénio, falha ao expressar quantidades suficientes de uma ou mais cadeias de globina ou uma combinação destas deformidades. Por exemplo, substituições da valina por ácido glutâmico na posição seis da cadeia β produzem HbS e foi descoberto que ocorria em cerca de 30% dos Americanos negros. No heterozigoto HbS, apenas cerca de 4 0% da hemoglobina total é HbS com a restante sendo a mais normal HbA, A seguir a desoxigenação, as moléculas HbS sofrem agregação e polimerização levando finalmente a uma distorção morfológica das células vermelhas que adquirem uma forma falciforme ou em folha sagrada, A falciformidade tem duas consequências principais, uma anemia hemolítica crónica e uma oclusão dos pequenos vasos sanguíneos que resulta em danos isquémicos para os tecidos. Além disso, quando exposta a baixas tensões de oxigénio, a polimerização converte a hemoglobina HbS de um líquido de circulação livre para um gel viscoso. Consequentemente, o grau da patologia associada com a anemia falciforme pode ser correlacionado com a quantidade relativa de HbS no sistema circulatório do paciente. Indivíduos com anemia 7 falciforme não desenvolvem sintomas até cinco ou seis meses depois do nascimento. Nestas crianças foi determinado que a hemoglobina fetal não interagia com a HbS e, desde que quantidades suficientes estivessem presentes, conseguia modular os efeitos da doença da HbS. Este efeito modulador da γ-globina é também observado em outras desordens da β-globina, tais como HbC e HbD, e outras mutações da cadeia β. A polimerização da HbS também é significativamente afectada pela concentração de hemoglobina da célula. Quanto mais alta for a concentração de HbS, maior são as hipóteses de contacto entre duas ou mais moléculas de HbS. A desidratação aumenta a concentração de hemoglobina e facilita grandemente a falciformidade. Até certo ponto, a falciformidade é um fenómeno reversível. Com tensões de oxigénio aumentadas, as células falciformes despolimerizam. Este processo de polimerização-despolimerização é muito danoso para as membranas das células vermelhas e leva eventualmente a células falciformes irreversíveis (CFI) que mantém a sua forma anormal mesmo quando completamente oxigenadas. As CPI sobrevivem em média 20 dias no corpo, quando comparadas com o ciclo de vida normal de 120 dias. Indivíduos com a síndrome HbS têm infecçÕes frequentes, hemólise crónica com uma reticulocitose fulminante e hiper-bilirrubinemia. O curso desta doença é tipicamente pautado com uma variedade de crises dolorosas chamadas crises vaso-oclusivas. Estas crises representam episódios de lesão hipóxica e enfarte nos órgãos, abdómen, peito, extremidades e articulações. Ulceras nas pernas são manifestações adicionais da tendência vaso-oclusiva desta doença. O envolvimento do sistema nervoso central ê comum, produzindo tonturas e mesmo tromboses. Crises aplásticas, também s comuns, representam uma cessação temporária da actividade da medula óssea e podem ser originadas por infecções, deficiências do ácido fólico ou ambas. As crises são episódicas e reversíveis, mas podem ser fatais. Os danos provenientes das crises tendem a ser acumulados e mesmo naqueles indivíduos com formas moderadas de anemias falciformes, o ciclo de vida pode ser grandemente reduzido. Na ausência de uma intervenção alternativa, os pacientes morrem geralmente antes dos 30 anos.

Compostos anti-gelatinosos incluindo o ácido clofíbrico (CICsH5OC (CH3) 2COOH) , ácido p-clorofenoxiacético (CICeH5OCH2CQOH) , e ácido fenoxiacético {06Η5ΟΟΗ2ΟΟΟΗ) mostraram inibir profilaticamente a polimerização em sangue artificialmente desoxigenado. Especulou-se que estes compostos podem ser úteis num âmbito estreito na prevenção da anemia falei forme. Tais tratamentos podem diminuir potencialmente a frequência de episódios sintomáticos causados por crises vaso-oclusivas se puder ser administrado químico suficiente para ligar toda a hemoglobina no corpo.

As síndromes de talassemia são um grupo heterogéneo de desordens todas caracterizadas pela falta de uma síntese diminuída das cadeias globina da HbA. Deficiências na expressão da β-globina são referidas como β~talassemias e deficiências da a~globína, a-talassemias.

As consequências hemolíticas da síntese deficiente da cadeia globina resultam de sínteses diminuídas de uma das cadeias e também um excesso da cadeia complementar. As 9 cadeias livres tendem a agregar-se em inclusões insolúveis dentro dos eritrócitos δ causando a destruição prematura dos eritrócitos em maturação e dos seus precursores, eritropoiése sem efeito e a hemõlise de hemácias maduras. Os defeitos resultantes da síntese da hemoglobina têm sido elucidados durante estes anos e residem largamente nas sequências de ácido nucleico que expressam ou controlam a expressam da proteína a- ou p-globina. A expressão do gene da globina nos mamíferos é maioritariamente regulada durante o desenvolvimento. A estrutura básica dos genes da a- e p-globina são similares assim como os passos básicos na síntese da a- e p-globina. Existem pelo menos cinco genes α-globina humanos localizados no cromossoma 16 incluindo dois genes adultos α-globina de 141 aminoãcídos que codificam polipeptídeos idênticos e diferem apenas nas suas regiões 3' não traduzidas, num gene α embrionário Z (ζ) e pelo menos em dois genes pseudo-α , psi zeta (ψΖ) e omega alpha (ωα) .0 conjunto de genes da p-globina humana inclui um gene embrionário, epsilon (ε), dois genes beta globina adultos, beta (p) e delta (δ) , dois genes beta globina fetais G-gamma (G-γ) e A-gamma (A-γ) , que diferem apenas por um aminoãcido, e pelo menos um gene pseudo-beta, psi beta (ψ p) . Todos são expressos a partir de um único segmento de 43 kilobases do cromossoma 11 humano. A globina fetal tipo-p, ou globina- y, é expressa nos estádios iniciais do desenvolvimento mamífero e persiste até cerca das 32 a 34 semanas de gestação. Neste ponto, as formas adultas de p-globina começam a ser expressas e substituídas pelas proteínas fetais. Estudos relacionando os resultados 10 clínicos hematológicos com as localizações de várias mutações que correspondem a trocas indicam que uma região localizada no terminal-5' do genes pode estar envolvida na supressão cis da expressão do gene-γ em adultos, O estímulo para esta troca da proteína fetal para a proteína adulta é desconhecido.

Cada gene de β-globina contém três exões que codificam cerca de 146 aminoãcidos, dois intrões e uma região 5' não traduzida contendo as sequências promotoras e uma região 3' não traduzida. A biossíntese da β-globina começa com a transcrição da totalidade do gene seguida do processamento da mensagem pelo ARN, remoção dos intrões através de emendas, adição de poli A, temperamento e modificações pós-transcripcionais. A molécula madura de mARN é exportada do núcleo e traduzida em β-globina. Foram descobertos defeitos em cada uma destas funções associados com talassemias específicas. As mutações identificadas incluem apagamentos, inserções e substituições de nucleótidos simples, mutações da posição estrutural, apagamentos de segmentos inteiros de codificação ou de regiões de controlo, sinais de terminação impróprios, sinais de emendas aberrantes e mutações múltiplas. As β° talassemias são caracterizadas por uma ausência completa de qualquer das cadeias β-globina. As β+-talassemias são caracterizadas por uma presença detectável de uma quantidade reduzida de cadeias β-globina.

Existem três categorias principais de β-talassemia, a talassemia major, talassemia intermédia e a talassemia menor. Os pacientes com talassemia menor podem ser totalmente assintomãticos e são genotipicamente β+/β ou β°/β- Embora as anomalias das células vermelhas possam ser detectadas, os sintomas são medianos. Os pacientes com talassemia intermédia são na maioria das vezes genotipicamente β+/β ou β°/β e apresentam sintomas graves que podem sei" aliviados com transfusões sanguíneas frequentes. Em contraste, os pacientes com talassemia major são na maioria das vezes genotipicamente βΒ/β°, β°/β+ ou β+/β+ e requerem transfusões regulares e frequentes. As crianças sofrem de atrasos graves no crescimento e morrem em tenra idade devido aos efeitos profundos da anemia. Aqueles que sobrevivem mais tempo sofrem mudanças morfológicas. A face fica distorcida devido à expansão da medula dentro dos ossos e do crânio, danos resultantes de hepatoesplenomegalia, hã um desenvolvimento tardio dos órgãos endócrinos incluindo os órgãos sexuais, e uma sobrecarga progressiva de ferro com hemocromatose secundária.

Existem duas consequências directas da p-talassemia. Primeiro, hã uma formação inadequada de HbA e, por isso, uma insuficiente capacidade para transportar oxigénio. Existem também múltiplos efeitos atribuíveis a um desequilíbrio entre as sínteses das cadeias a- e β-. Surpreendentemente, as consequências patológicas do desequilíbrio da cadeia da globina parecem ser as mais graves. As cadeias α livres formam agregados instáveis que precipitam dentro dos precursores das células vermelhas sob a forma de inclusões insolúveis. Estas inclusões danificam as membranas celulares resultando na perda de potássio. O efeito cumulativo destas inclusões nas células vermelhas do sangue é uma eritropoiése ineficaz. 70% a 85% dos 70% 12 normoblastos estimados na medula, são eventualmente destruídos. Aqueles que escapam à destruição imediata estão em risco aumentado de eliminação pelo baço onde os macrófagos removem as células anómalas. Posteriormente, a hemólise despoleta uma expressão aumentada de eritropoetina que expande as populações dos precursores dos eritróides dentro da medula óssea e leva a anomalias esqueléticas.. Outra complicação grave da β-talassemia é que os pacientes tendem a ter uma capacidade aumentada de absorver o ferro da dieta alimentar. Visto que a maioria dos tratamentos da talassemia envolvem múltiplas transfusões de células vermelhas do sangue, os pacientes têm frequentemente um estado severo de sobrecarga de ferro danificando todos os órgãos, particularmente o fígado. Para reduzir a quantidade de ferro nos seus sistemas, quelantes do ferro são geralmente administrados. Embora útil, os pacientes sucumbem com uma idade média entre os 17 a 35 anos de idade aos efeitos cumulativos da doença e à sobrecarga de ferro. Variações genotípicas em indivíduos saudáveis foram identificadas onde a β-globina adulta não está formada, mas complicações graves são evitadas. Estes pacientes expressam constitutivamente proteínas fetais e γ-globinas em quantidades suficientes para substituir a proteína J3-globina em falta. Esta persistência hereditária de hemoglobina fetal (HPFH) pode involver um ou ambos os genes fetais da β-globina, A- γ e G- γ. Aparentemente, uma produção consistente de qualquer proteína γ-globina cumpre as funções necessárias da proteína β-globina em falta ou anómala. 13

Uma variedade de pequenas moléculas têm demonstrado afectar a expressão da hemoglobina ou da globina fetal. Experiências anteriores demonstram que o acetato (CH3COOH), propionato {CH3CH2COOH} , butirato (CH3CH2CH2COOH) e isobutirato (CH3CH (CH3) COOH) todos induziam a síntese da hemoglobina em células Friend leucémicas em cultura. Estudos adicionais mostraram que compostos polares, tais como amidos ácidos, e ácidos gordos podem estimular a expressão de ambos os genes da globina fetais e adultos em células eritroleucémicas da murina. A Hidroxiureia (H2NCONHOH), outra molécula relativamente pequena, estimula a expressão da globina. A estimulação, no entanto, não parece ser muito específica para a globina fetal. A hidroxiureia é presentemente a única droga utilizada para o tratamento da anemia falciforme. No entanto, existe uma grande preocupação que um inibidor da reductase ribonucleotídica antineoplásica seja carcinogénico. As suas propriedades carcinogénicas tornam a sua utilização como fãrmaco de largo espectro e a longo prazo uma prática questionável. Existe uma forte vontade para encontrar métodos de tratamento da anemia falciforme que não incluam a exposição do paciente a outros riscos. A expressão a partir dos genes da γ-globina foi manipulada com sucesso in vivo e in vitro utilizando agentes como a cítosina arabinosido (AraC), um agente citotóxico que induz a produção de retículócítos fetais, e a 5~azacitidina (AZA), um inibidor da ADN metilase bem conhecido. A administração contínua de AZA produziu um aumento de cinco a sete pontos na γ-globina rnRNA das células da medula óssea. Estudos adicionais mostraram que 14 existem alterações significativas na população de células estaminais na medula óssea depois do tratamento com AZA. Estas experiências indicam que os efeitos da AZA podem ser mais atribuíveis à reprogramação e recrutamento das células progenitoras eritróides que a quaisquer efeitos directos na expressão específica dos genes. Muitos destes agentes incluindo AZA, AraC e hidroxiureia são mielotóxicos, carcinogénicos ou teratogénicos tornando a sua utilização a longo prazo impraticável.

Um dos maiores avanços no tratamento das hemoglobinopatias foi feito quando foi descoberto que o ácido butírico (ácido butanõico; (CH3CH2CH2COOH) estimulava precisa e especificamente a transcrição do gene fetal(γ) da globina humana. Estas descobertas foram rapidamente confirmadas in vivo onde foi mostrado que doses farmacológicas de ácido butírico aumentavam grandemente a expressão da globina fetal em galinhas adultas tornadas anémicas através de injecções com fenilhidrazina. Especulou-se que a acetilação histónica, um efeito conhecido do ácido butírico possa ser em parte responsável pela expressão aumentada de genes fetais.

Foi descoberto que mais de 50 derivados do ácido butírico são eficazes na estimulação da produção de globina fetal. Alguns destes incluem sais de ácido butírico tais como o butirato de sódio e butirato de arginina, ácido a-amino-n-butírico (butiramida; {CH3CH2CH2CONH2) / e isobutiramida (CH3CH (CH3) C0NH2) . Embora promissores em ensaios clínicos piloto, os pacientes tratados não foram capazes de manter níveis adequados de globina fetal no seu 15 sistema. Foi posteriormente determinado que muitas destas formas de ácido butírico têm semi-vidas extremamente curtas. A oxidação no soro, o eliminação pelos hepatócitos e a filtração através dos rins eliminam rapidamente estes agentes do sistema do paciente. Com outros, os pacientes desenvolveram rapidamente tolerância ou os metabolitos dos compostos tiveram o oposto do efeito desejado. Recentemente, um número de ácidos carboxílicos alipãticos foi testado pela sua capacidade de aumentar especificamente a expressão da globina fetal em células eritroleucémicas humanas K562. Embora cadeias mais longas fossem consideradas tóxicas para as células, o propionato (CH3CH2 CONH2) e o valerato {ácido pentanóico,-CH3CH2CH2CH2COOH) foram considerados os mais eficazes. Butirato (CH3(CH2) 2COOH) , caproato {CH3 (CH2) 4COOH) , caprilato (CH3 (CH2) 6COOH) , nonanoato (CH3 (CH2) 7COOH) , e caprato (CH3 (CH3) sCOOH) produziram muito menos efeito. Foi descoberto que o fenil acetato (C6H5CH2COOH) e o seu precursor, 4-fenil butirato (C6H5CH2CH2CH2COOH) , diminuíam a proliferação do retículócito que expressa a globina fetal, mas aumentavam as proporções relativas da globina fetal por célula em células progenitoras eritróides de cultura. Acetato (CH3COOH) , um produto metabólico do catabolismo do butirato, aumentou tanto as populações dos precursores dos eritrócitos como a síntese da globina fetal. No entanto, estes estudos também demonstraram que os efeitos positivos só podiam ser mantidos por períodos de tempo muito curtos.

Outras metodologias para aumentar a expressão fetal da globina focaram-se no recrutamento e reprogramação das células eritróides progenitoras para expressar a globina 16 fetal.. Os agentes testados in vivo ou in vitro utilizando esta abordagem incluem factores de crescimento hematopoiético como a eritropoetina (EPO), factor estimulante da colónia granulócito/macrófago {GM-CSF), e interleucina-3 (IL3). Foi descoberto que cada um destes factores aumenta a síntese da globina em cultura de tecidos celulares.

Outros agentes mostraram afectar a expressão da globina fetal incluindo a inibina e activina. A inibina, uma hormona dissulfído ligada de duas sub-unidades, suprime a secreção da hormona folículo-estimulante da glândula pituitária. A activina, algumas vezes referida como factor eritróide diferenciador (FED) da hormona libertadora de proteína folículo-estimulante (FR.P) , é também uma hormona e ambas as macromoléculas induzem a acumulação de hemoglobina em eritrócitos humanos em cultura (S.P Perrine et al., Blood 74:114a, 1989), Recentemente, estudos mostraram que o factor steel, um produto da linha Steel dos ratos, também é capaz de influenciar a síntese da globina fetal em progenitores eritróides.Vários estudos focaram-se no mecanismo através do qual o ácido butírico e outras pequenas moléculas orgânicas foram capazes de estimular a expressão da globina fetal. Experiências com células em cultura indicaram que o ácido butírico pode actuar aumentando o nível de acetilação da histona, possivelmente, ao diminuir a actividade de uma ou mais histonas deacetilase. A hiper-acetilação da histona resultante pode produzir desdobramento dos nucleosomas e por isso uma maior 17 expressão dos genes., Outros estudos indicam que a hiper-metilação da área de ADN à volta do complexo de genes J3 está correlacionada com a expressão aumentada de genes γ-globina em pacientes com talassemia. Alternativamente, o ácido butírico e outras moléculas pequenas podem funcionar aumentando a expressão específica dos genes actuando dírectamente em agentes que regulam a transcrição, os chamados factores de transcrição. Estes factores ligam-se a locais sequência-específicos ao longo do genoma em áreas onde controlam a expressão de genes localizados nas proximidades,

Em contraste com a linha do gene α-globina humano, a linha-β foi analisada em grande detalhe devido, em parte, à identificação de múltiplas mutações dos genes β-globina em pacientes HPFH. A linha-β contém uma grande sequência de produção referida como a região de controlo da linha (LCR), estendendo-se entre os 8-16 Kbs 5' do gene épsilon. Esta sequência está dividida em quatro locais hipersensíveis à DNase, HSS 1-5, que contém sequências de melhoramento, sequências silenciadoras, locais de ligação do factor de transcrição e outras sequências de acção cis. Cada gene do grupo da β-globina contém o seu próprio promotor que age em concertação com os elementos de melhoramento na LCR De facto, o apagamento da LCR resulta numa síndrome talassêmica com pouca a nenhuma expressão de β-globina Estes resultados indicam que o gene β-globina expresso pode uma interacção competitiva sobre a LCR para que os seus efeitos de melhoramento estejam apenas disponíveis para um único gene em qualquer estádio do desenvolvimento. 18

Foi identificado um número de factores de transcrição na linha-β que se pensa alterarem o nível de expressão do gene β-globina. Foi mostrado que um elemento melhorador da LCR contém um par de locais de ligação para o factor nuclear E2 (NF-E2) que se sobrepõe a um conjunto de locais de ligação para o factor de transcrição AP-1.NF-E2, uma proteína básica específíca-hematopoiêtica cora desfiamentos de leucina e locais de ligação AP-1 que foram localizados numa variedade de elementos genéticos da globina. Recentemente, uma sequência conservada (CS) localizada a montante do local AP-1/NF-E2 foi proposta para aumentar a actividade de reforço.

Foram identificados factores adicionais que se ligam dentro dos promotores do conjunto β-globina. A proteína de deslocamento da caixa CAT (CDP) liga à sequência CAAT localizada cerca de 50 BP a montante de muitos promotores de genes. Outro factor de transcrição sempre presente, SP1, liga às posições -140 e -202, e a possíveis locais adicionais também. Foi mostrado que o TAFII110 liga à caixa TATA de muitos promotores β-globina. O factor de transcrição GATA-1 liga-se ao local de início da transcrição (GATA) e pode ser deslocado por TFIID quando forma um complexo activo de iniciação. Outro factor específico-eritróide, ο YY1 liga-se a pelo menos 11 locais distribuídos ao longo da região reguladora da globina.

Recentemente, foi identificado um factor que pode estar envolvido na regulação do desenvolvimento da expressão da hemoglobina. Este factor, nomeado proteína de selecção de estádio (SSP) liga-se a um local a cerca de 50- 19 60 bps a montante do promotor gama da globina referido como elemento selector do estádio (SSE}. O SSE é também o local onde foi descoberto um número de mutações em pacientes com a síndrome HPFH. O SSP tem sido purificado a partir de extractos nucleares de células K562 e a sua relativa especificidade fetal e eritróide tem sido atribuída a uma proteína colaboradora heterodimérica de 40-45 lcD nomeada CP2 que permite selectivamente o encaixe do complexo SSP no SSE, e também em locais dentro do promotor ε, e a subsequente interacção com a ARN polimerase.

Elucidando o mecanismo de troca da hemoglobina de desenvolvimento (Hb) pode permitir a reactivação da Hb fetal em humanos adultos com anemia falciforme ou β-talassemia, uma manipulação que alivia as manifestações clínicas destas doenças. A inactivação da forma mutada do gene adulto da β-globína que causa a anemia falciforme é também de valor clínico, jã que resulta num aumento compensatório na expressão da globina-γ(fetal).

Esta claro que a regulação desenvolvimental do gene da globina envolve factores transaccionais múltiplos, e o mecanismo de troca é provável que necessite de remodelação da cromatina e de interacções entre factores proteicos ligados a uma variedade de regiões de ADN, Embora poucas das proteínas de ligação-ADN mostrem alguma especificidade desenvolvimental (ex, factor eritróide típo-Kruppel, EKLF, um regulador positivo do gene β-globina adulto; (Donse, D., Townes, T. M. , e Bieker, J. J. (1995) J Biol Chem 270, 1955-9; e FKLF-2, que activa os genes da y-globina , mas também, em menor grau activa os genes ε- e β-globina - 20 Âsano, H-, Li-, X. S. e Stamatoyamopoulos, G. (2000) Blood 95, 3578-3584.), ainda não é muito clara a combinação precisa de factores que medeiam as trocas de Hb e exactamente com o fazem. Células humanas K562 tratadas com hemina exibem um fenótipo Hb similar às células eritróides embrionãrias, expressando primariamente e- e g-globinas mas nenhuma β-globina adulta, i.e., células vermelhas embrionãrias de humanos e outros vertebrados também contêm uma grande quantidade de ferritina do tipo (H) de células especializadas (que armazena ferro para ser utilizado principalmente por outras células), onde os eritrócitos dos adultos contêm muito menos ferritina do tipo governanta que guarda ferro para uso prõprio/intracelular.

Após longas séries de experiências, os inventores descobriram que nas células CV-1, um clone de expressão da H-ferritina humana regula por baixo a expressão de um gene indicador CAT EKLF-estimulado dirigido à promoção da β-globina. Os inventores mostram mais adiante que a ferritina nos extractos nucleares de células K562 conseguem ligar ADN 5'"p-globina entre -153 e -148 e que é necessária uma sequência hexanucleótida altamente conservada CAGTGC para ligação. Esta sequência é essencial para a expressão da β-globina em células MEL DMSO-induzidas (deBoer, E. , Antoniou, M., Mignotte, V„ , Wall, L. e Grosveld, F. (1988) Embo Jl, 4203-4212) e é parte do local de ligação de um falso repressor da β-globina em células MEL não induzidas (Macleod, K. e Plumb, M. (1991) Mol Cell Biol 11, 4324-32). Quando este motivo CAGTGC é mutado, a ligação in vitro é 21 reduzida aproximadamente vinte vezes. A capacidade da ferritina-H para se reprimir neste sistema está abolida, mas a estimulação-EKLF é retida, Quando o local de ligação -153/-148 da ferritina é mutado no plasmideo indicador de β-globina co-transferido. Estes resultados mostram que a ferritina H consegue reprimir o gene adulto da β-globina humana ao ligar o promotor de uma forma sequencial específica. A biologia desta proteína da família da ferritina e o seu local de ligação, bem como a sua função demonstrada em ensaios transitórios, sugerem que nas células K562 está a funcionar de facto como um repressor de β-globina. Como descrito em cima, um repressor deste tipo é útil no melhoramento da anemia falciforme e outras doenças genéticas.

Estudos mostraram que a ferritina-H tem uma actividade ferrodixase mais eficiente quando é expressa com os mesmos níveis da ferritina-L. Níveis de expressão iguais resultam num maior número de heteropolimeros ferrítína-H/ferritina-L, A forma heteropolimérica do complexo 24-mer ferritina é a mais eficiente na conversão do ião ferroso no ião férrico e na sequestração de iões ferro. Isto sugere que a manutenção de concentrações iguais de ferritina-H e ferritina-L provavelmente resultará numa gestão adequada do ferro. Aumentar os níveis de ferritina-H resultaria na formação de homopolímeros de ferritina-H. Os homopolímeros de ferritina-H mostram baixa actividade da ferroxidase. Seria de esperar que isto levasse a maoires níveis do mais perigoso ião ferroso e tivesse efeitos adversos nas células. No entanto, os inventores descobriram que as 22 funções reguladoras do gene da ferritina-H provocam o acontecimento exactamente oposto.

Antecedentes para cancro de pele e outros cancros: É sabido que luz ultravioleta (UV) é prejudicial para a pele humana e tem sido implicada na etiologia dos cancros de pele. Estudos recentes revelaram que a ferritina é elevada em células de cultura expostas a radiação UV, e foi postulado que o incremento de ferritina representa a tentativa da pele da célula de se proteger dos danos dos radicais livres ligando-se e sequestrando o ferro que poderia, por sua vez, causar danos oxidatívos e mediados por radicais livres. 0 rationale para outros cancros é similar, 0 ferro tem estado implicado como um agente etiológico ou exacerbante no cancro de pele, hepatomas {cancro do fígado), carcinoma das células renais (cancro do rim), neuroblastomas, leucemias, e cancro da mama. Os inventores propõem que a ferritina-H seja protectiva contra acontecimentos carcinogénicos em células que dão origem a todos estes cancros. 0 rationale actual dos inventores é que tratando a pele humana desta forma, ao transferi -los com um péptido ou gene da sub-família da ferritina-H que expresse o péptido, possa ser fornecida às células protecção dos danos induzidos pela radiação UV. Os péptidos da sub-família da ferritina-H são superiores neste assunto visto que eles conseguem sequestrar o ferro e não o libertar logo, e podem fazê-lo sem alterar os aspectos normais do metabolismo do ferro das células e outras funções. Os péptidos da sub-família da Ferritina-L, por outro lado, podem causar ainda mais danos já que eles desistem rapidamente do ferro o que 23 exacerbaria o problema ao aumentar a geração de ferro e radicais livres, Por isso, enviar um péptido da sub-família da ferritina-H ou um gene (clone de expressão) para o péptido as células-alvo seria protector e/ou corrector de acontecimentos que levam ao cancro. Similarmente, agentes que activariam o gene ou genes endógenos da sub-família da ferritina-H seriam também benéficos, É sabido que todas as ferritinas humanas, mesmo aquelas mais ricas em ferritina-L, requerem uma pequena quantidade de ferritina-H e da sua actividade ferrooxidase associada para executarem as funções de armazenamento e libertação do ferro. É o balanço entre as ferritinas L e H que é crítico. Aumentar o balanço a favor da ferritina-H, mesmo até ao ponto de grande excesso de ferritina-H, parece mediar o regresso das células a uma gestão saudável do ferro,

Antecedentes para as doenças neurodegenerativas: A distribuição de ferro livre e de ferritina muda durante o desenvolvimento do cérebro em animais e humanos. Ferro em quantidade é encontrado nos gânglios basais, entrando cedo no curso da doença, tanto na doença de Parkinson como na doença de Huntington. Existe um aumento do ferro em várias áreas do cérebro na doença de Alzheimer, em outras demências, e no envelhecimento; e a distribuição de isoferritinas em diferentes áreas do cérebro é diferente e muda com as doenças referidas, a H-ferritina, mas não a L-ferritina, está presente no núcleo das células neuronais 24 no córtex do cérebro em desenvolvimento de ratos e pode ser protectiva contra danos oxidativos que seriam causados pelo ferro livre. Rationale: A ferritina-H diminui em células cerebrais críticas durante o envelhecimento e as doenças neurodegenerativas, onde o ferro livre e o ferro libertado da ferritina-L localizada estão implicados em danos oxidativos nas doenças e demência. A ferritina-H ou um péptido relacionado da sub-família, irã ser protectora contra uma variedade de mudanças neurodegenerativas associadas com o envelhecimento, as doenças acima mencionadas e a demência. De igual forma, um clone de expressão de um gene da sub-família da ferritina-H e/ou um regulador dos genes da sub-família da ferritina-H, se entregue na área do cérebro correcta e nas células específicas, prevê-se que seja protector.

Antecedentes para a ataxia de Friedreich e desordens neuromusculares relacionadas: O apagamento da YDL120, levedura homóloga do gene humano responsável pela ataxia de Friedreich, induz uma respiração celular reduzida associada com actividade reduzida da citocromo α oxidase e, em certos contextos nucleares , o ADN mitocondrial é perdido. Nos mutantes nulos, o crescimento celular é altamente sensível aos oxidantes, como H203, ferro e cobre; e o sulfato ferroso induz a perda de ADN mitocondrial. As mitocôndrias dos mutantes nulos contém dez vezes mais ferro do que as do tipo selvagem. A neurodegeneração observada na ataxia de Friedreich pode ser bem explicada na base de uma sobrecarga mitocondrial de ferro responsável por uma produção 25 aumentada de radicais livres altamente tóxicos. Rationale: Uma vez que a acumulação de ferro está implicada na ataxia de Friedreich, tanto o aparecimento inicial dos sintomas como a progressão desta doença serão abrandadas ou paradas sequestrando o ferro livre, A transfectação dos péptídos da sub-família ferritina~H ou clones de expressão e/ou tratamento com agentes que regulariam por cima a expressão dos genes endógenos da sub-família £errítina~H introduzirá melhoras,

Antecedentes para ateroesclerose:

Estão disponíveis fortes evidências epidemiológicas de que o ferro (i.e,, excesso de ferro) é um factor importante no processo da ateroesclerose e que a depleção de ferro tem benefícios cardiovasculares e protege contra a doença cardíaca isquémica. A geração de radicais livres catalizados pelo ferro pode contribuir para danos na parede dos vasos, para a formação de placa, e através de ambos os mecanismos, a danos nos vasos cardíacos. Uma vez mais, a libertação de ferro intracelular a partir da L-ferritina está implicada como forma do ferro contribuir para esta etiologia; a H-ferritina pode ser protectora ao quelar e sequestrar o ferro livre e libertado. Rationale: A transfectação da célula correcta com um péptido da sub-família H-ferritina ou um clone da expressão do gene ou com um regulador do gene que vã activar a sub-família ferrifcina~H de genes endógenos nas células da parede da artéria ou elementos celulares das placas ateroescleróticas irá prevenir ou reverter o bloqueamento da artéria. 26

Antecedentes relativos a possíveis sistemas de entrega e mecanismos de marcação celular:

Para a entrega de proteínas ou péptidos nas células vivas ex vivo existem várias abordagens. Os pequenos péptidos (cerca de 20 kDa ou menores) podem ser agarrados pelas células sem um sistema de entrega especializado. As proteínas maiores podem ser entregues encapsuladas em liposomas, construções lipossomiais, ou dentro de uma membrana tal como um fantasma de célula vermelha e as vesículas são então para se fundirem com as células receptoras através de processos químicos (ex: polietilino glicol [PEG] ou iões cálcio). Os complexos proteicos maiores também podem ser entregues encapsulados, fundindo as membranas da cápsula com as membranas do plasma da célula alvo. Os inventores tinham uma larga experiência com este tipo de entrega no seu laboratório (referências listadas em baixo). Para a entrega in vivo de proteínas ou péptidos dirigidas a um tipo de célula específico, o método escolhido é provável que seja um tipo de entrega lipossomial com um anticorpo ou ligando direccionado a uma proteína específica da superfície da célula ou um receptor incorporado no lipossoma e o péptido ou a proteína encapsulados dentro do lipossoma. Alternativamente, uma proteína de fusão contendo o péptido desejado (ex., ferritina-H) fundida com uma proteína ligando específica para que o receptor da célula alvo possa ser injectado directamente. Como exemplo de uma proteína ligando podemos direccionar células hematopoiéticas estaminais no Factor de Célula Estaminal (c~kit ligando) que tem afinidade com um receptor (c-kit) enriquecido na superfície das células 27 hematopoiéticas estaminais na medula óssea. Os mais categorizados neste assunto vão reconhecer que existe uma grande variedade de mecanismos de entrega farmacêuticos ajustados à introdução de proteínas, fragmentos de proteína e material genético numa célula.

Para entrega de clones de expressão de genes que codificam péptidos da sub-família ferritina-H {por exemplo}, um número de transportadores plasmídeos e sistemas de reagentes de transfecção estão disponíveis para transfectar células ex vivo, para gerar ou transformantes estáveis ou células transientemente transfectadas, para reinfusão no animal hospedeiro ou paciente. Estão disponíveis comercialmente bons plasmídeos de expressão assim como os reagentes de transfecção, sendo muitos deles lipossomas catiónicos de um tipo ou de outro. Para a transferência de genes in vivo bem como para ex vivo -isto é, terapia de genes - os vectores disponíveis incluem vectores retrovirais {bons apenas para dividir células), vectores adenovirais (transfectam muitos tipos de células, com uma especificidade celular muito pequena), vectores virais adeno-associados, vectores lentivirais e sistemas de electroporação. Qualquer um destes pode ser usado num protocolo ex vivo onde as células alvo são obtidas como uma população pura ou altamente enriquecida, apara serem reinfusas após a transferência de genes. Para transferência de genes in vivo, as escolhas estão presentemente limitadas devido à dificuldade em direccionar eficazmente células específicas com cópias de genes suficientes. Um lipossoma direccionado como descrito no parágrafo anterior é uma possibilidade se um ligando para um receptor celular 28 específico, carregado e com grande afinidade estiver incorporado -

Antecedentes relativos à indução da expressão do gene da ferritina-h em células humanas: A ferritina-hH estã entre um grupo de genes que foram identificados como sendo expressados durante a embriogénese, O primeiro grande local de expressão da ferritina-H é na célula vermelha sanguínea embrionãria que é formada no saco vitelino dos mamíferos antes da circulação sanguínea ser estabelecida. A expressão celular específica da ferritina-H no desenvolvimento inicial corresponde ao papel da célula vermelha como local de armazenamento do ferro no embrião. As células vermelhas adultas expressam muito menos ferritina, e o ferro é guardado principalmente no fígado (em hematócitos) em adultos onde a ferritina primária é expressa como ferritina-L. "Deitar abaixo" o gene ferritina-H em ratos resulta em morte intra-uterina entre os dias 3.5 e 9,5 do desenvolvimento. Além disso, a ferritina-H é um gene desenvolvimentalmente regulado, cuja expressão é também de alguma forma restringida a algumas células e tipos de tecidos. Os inventores descobriram que a expressão da ferritina-H em células adultas eritróides em diferenciação vai reverter a da troca da hemoglobina desenvolvimental, reprimindo directamente o gene adulto da β-globina e causando dírecta ou indírectamente uma activação do gene da gama-globina fetal. A expressão do gene da ferritina-H endógena em células eritróides adultas também reverte uma troca do gene desenvolvimental nesta linhagem celular. .29

Completar esta troca irá, por sua vez, reverter outra troca desenvolvimental, a troca da hemoglobina, que tem benefícios terâpeuticos para pessoas com anemia falciforme, β-talassemia e outras hemoglobinopatias. Activar a expressão da ferrítina-H em outros tipos de células alivia e protege contra cancros, ateroesclerose e doenças neurodegenerativas.

Deve-se notar que embora muito se saiba sobre a regulação da expressão da ferritina ao nível da tradução por ferro como sentido pelas proteínas com afinidade com IRE (ex: cis-acotinase citosólica que é uma IRP-1 [proteína -1 com afinidade IRE]), este nível e tipo de regulação não faz distinção entre os tipos de ferritina. Regular especificamente por alto a expressão da ferritina-H requer regulação do gene específico ao nível da transcrição.

As células BT-20 do cancro da mama aumentam rapidamente a síntese de mARN da ferritina-H quando exportadas para heme adicionada exogenamente, mas apenas aumentam ligeiramente o mARN da ferritina-L. Esta mudança é protectora contra danos carcinogénicos dos radicais livres. Nas células Caco-2 do cancro do cólon, a expressão da ferritina-H leva a uma diferenciação celular aumentada e a um declínio no fenótipo do cancro. A expressão aumentada da ferritina-H também ocorre durante a diferenciação celular das linhas celulares da eritroleucemia (K562) e Hepatoma (HepG2) em cultura. Embora alguns dos elementos do ADN no promotor do gene da ferritina-H e das proteínas com a afinidade a eles (ex: P/CAF-CBP, Bbf e NF-E2) sejam conhecidos, o mecanismo de activação da transcrição da 30 ferritina-H não é suficientemente entendido para ser aplicado clinicamente.

Entre os factores exógenos que podem ser entregues/aplicados às células para activar a expressão endógena do gene da ferritina-H estão a heme, a fitohormona ácido abcísico e combinações de luzes infravermelhas e ultra-violetas, especialmente quando aplicadas a queratinõcitos humanos e cancros de pele.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores descobriram que uma sub-família da ferritina-h de proteínas sequestradoras de ferro é uma proteína reguladora de genes nas células humanas.

Especificamente, descobrimos que a ferritina nuclear se liga com uma sequência específica de ADN que está colocada centralmente no promotor do gene da β-globina humana e que o efeito da ligação da ferritina-H é reprimir a transcrição deste gene nas células transf ectadas. Logo, um gene ou peptídeo da ferritina-h direccionado para as células correctas oferece uma cura para a anemia falciforme na qual o gene da β-globina é mutado, bem como para as outras doenaçs genéticas onde existe uma má gestão do ferro. A sobrexpressao da ferritina-H até 500 vezes nas células humanas não tem malefícios, diminui o grupo de ferro instável, diminui a proliferação em linhas celulares cancerosas e promove a apoptose em células cangerígenas. Baseados na descoberta anterior, são concebíveis métodos e/ou composições de alteração do fenótipo de uma célula a partir do interior, através da produção de uma mudança na 31 expressão do gene, i.e. terapia de expressão do gene. Os métodos são os descritos para transferir um gene da ferritina-H ou outros peptídeos da família da ferritina-H para uma célula para que o gene da ferritina-H seja aí expresso, e como resultado disso a ferritina-H seja produzida. Isto altera o fenótipo da célula ou através da regulação pela ferritina de outro gene associado como o fenótipo da doença {como no exemplo bem estudado dos inventores, da anemia falciforme) ou através da ferritina mudar o balanço do ferro dentro da célula o que, por sua vez, resulta numa mudança na expressão do gene que altera o fenótipo. O fenótipo da célula afectada pode também ser alterado entregando o próprio peptídeo expresso {i.e, ferritina), ou parte dele, directamente na célula doente ou na célula antes de exibir o fenótipo da doença. A indução da expressão do gene da ferritina-H endógena nas células apropriadas estimulando a sua transcrição é uma terceira abordagem à terapia da regulação dos genes; isto irã ser feito aplicando às células, citoquinas exógenas ou outros agentes. A ferritina-H é conhecida por aumentar em resposta à TNFa ou à IL-Ιβ, onde a ferritina-L aumenta selectivamente em resposta ao ferro adicionado exogenamente, E uma quarta abordagem é alterar o fenótipo da célula através da terapia de regulação dos genes, entregando um oligonucleotídeo de sentido contrário que prevenisse a expressão de um peptídeo especifico da família da ferritina inibindo a tradução e/ou transcrição do seu mARN, A abordagem à terapia de regulação dos genes que irã ser aplicável, irá depender da etiologia de cada uma das 32 doenças específicas descritas daqui em diante, todas envolvendo a mã gestão do ferro. A expressão do gene da ferritina tanto pode melhorar como exacerbar dependendo do tipo de ferritina expressa, da doença específica ou do estádio da doença no qual a intervenção é iniciada, A abordagem de eleição poderá ser o aumento da ferritina-H (ex„ dando um vector de expressão do gene da ferritina-H) ou a diminuição de um tipo de ferritina específico (ex. por um oligonucleotídeo de sentido contrário). Qualquer destas abordagens irá alcançar o efeito desejado, Ê o balanço entre a expressão da ferritina-H e as outras ferritinas que resulta na mudança celular no fenótipo. Aumentar a quantidade de ferritina-H em relação às concentrações de outras proteínas da ferritina alcança a desejada regulação genética que melhora os efeitos das doenças genéticas que causam a má gestão do ferro.

Entregar a ferritina-H, ou um gene da ferritina-H, ou seus derivados, ao precursor eritróide ou células estaminais reprime a expressão do gene mutado adulto da β-globina na anemia falciforme e concomitantemente estimula a expressão do gene da γ-globina (fetal) efectuando por isso uma cura fenotípica.

Nas doenças neurodegenerativas e doenças neuromusculares tais como a doença de Alzheimer (DA) , doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (DH) e ataxia de Friedreich, o ferro em excesso (ou falha na gestão do ferro) é um agente etiológico ou exacerbante. A ferritina-H é selectivamente expressa nos neurónios e também está localizada nos núcleos neuronais. A ferritina-H 33 declina no cérebro com a idade e é baixa em regiões do cérebro na DA, DP e DH, A ferritina-H sozinha entre as ferritinas conhecidas possui actividade ferroxidase e a presença de ferritina-H no cérebro é protectora contra o excesso de ferro livre. Aumentar a ferritina-H em neurónios especialmente localizados, nesta classe de pacientes, melhora os sintomas e a progressão dessas doenças. Alternativamente, a entrega de oligonucleotídeos de sentido contrário específicos da ferritina da glia e outros tipos de células associados ao SNC em regiões específicas do cérebro podem ser a via preferida da terapia de regulação dos genes, como abordagem â diminuição do armazenamento de ferro nessas células. Os mais experientes na matéria irão entender que o melhor método de aumentar a ferritina-H intracelular ou um derivado do ferro irá depender de uma variedade de factores incluindo, mas não limitados a, o tipo de tecido alvo, o nível desejado de ferritina-H intracelular ou seu derivado, a doença ser tratada e o nível actual d ferritina intracelular nas células alvo.

Nos cancros, está também claro que o excesso de ferro está envolvido como um agente etiológico ou exacerbante. A ferritina-H é conhecida por ser aumentada intracelularmente em alguns cancros (ex: cancro da mama), e onde a ferritina-L está aumentada no soro de muitos pacientes com cancro (ex: neuroblastoma). 0 aumento na expressão da ferritina-H visto em alguns cancros é a tentativa da célula se proteger contra o ferro livre/em excesso; e neste caso, uma entrega muito antecipada da ferritina-H, um gene da ferritina-H, ou um estímulo para aumentar a expressão do gene da ferritina-H endógena pode ser a melhor escolha terapêutica. No cancro 34 de pele, onde tanto a luz UV como a luz infravermelha induzem a ferritina-H, a ferritina é protectora contra algumas vias de danos oxidativos. O excesso de ferro nas placas de ateroesclerose é um agente etiológico ou exacerbante; e a terapia de regulação dos genes para aumentar a ferritina-H nas células destas placas, diminui ou para o processo da doença.

Um aspecto importante da invenção é a descoberta de que a ferritina-H reprime o gene adulto da β-globina humana ao ligar especificamente a sequência de ADN SEQ ID NR:1, CAGTGC, no promotor da J3-globina. Muitos outros genes têm esta sequência nos seus promotores, incluindo os genes da e- e γ-globina humana que são estimulados pela ferritina. Por isso, o contexto do motivo CAGTGC, incluindo o ADN circundante assim como a distância do motivo ao local de inicio da transcrição, afecta a activação ou repressão da ferritina.

Alguns dos genes que têm este motivo promotor são expressos em apoptose, e outros são genes que estão envolvidos no metabolismo do ferro. Usar citoquinas para puxar as células cancerígenas é uma via para a cura, e estimular a expressão de ferritina-H é uma terapia poderosa. O motivo CAGTGC que descobrimos partilha a homologia com elementos importantes anteriormente descobertos incluindo o ARE (Elemento de Resposta Antioxídante) que tem a sequência RTGACnnnGC (onde R é uma pirimidina e n ê qualquer dos quatro nucleotídeos básicos) e uma sequência 35 RTGR que é preferencialmente sujeita a quebra por reacções Fenton mediadas por Fe++. Existem numerosos genes envolvidos na saúde e na doença que podem ser regulados através da ligação da ferritina a esses elementos.

As considerações anteriores têm sentido como tratamentos devido à importante descoberta de que a ferritina nuclear (i. e., ferritina-H e seus derivados) reprime a expressão do gene a partir do promotor do gene da β-globina humana ligando-se ao motivo CAGTGC localizado na região dos pares base -150 do local inicial de transcrição, como mostrado pelas nossas experiências in vítro de ligação do ADN e pelas nossas experiências de co-transfecção de genes em células CV-1,

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Foi descoberto que a ferritina é um repressor do gene da β-globina humana, o mesmo gene que é mutado na anemia falciforme e em algumas formas de β-talassemia. O repressor é uma forma nuclear de ferritina (Broyles et. al.. , "A Ferritin-Like Protein Binds to a Highly Conserved CAGTGC Sequence in the β-globin promoter", In Síckle Cell Disease and Thalassaemias: New Trends in Therapy) da sub-família da ferritina-H dos peptídeos da ferritina. Resumidamente, os inventores descobriram o seguinte: 1) Uma proteína da família das ferritinas dos extractos nucleares das células K562 eritroleucémicas (assim como ferritina-H humana pura) liga-se ao promotor do gene da β-globina humana (o promotor que dirige a forma 36 mutada do gene na anemia falciforme) a -150 bp do início do local de transcrição, in vitro. A ligação é muito especifica a uma sequência de ADN. 2) Um clone de expressão da ferritina-H reprime este promotor da β-globina em experiências de co-transfecção transientes. Isto é muito reproduzível em múltiplas experiências com dois genes informadores diferentes, sem repressão vista pelos plasmídeos de controlo/nulos, 3} A ferritina-H não reprime mais se o promotor contiver um local de ligação mutado. Os inventores têm promotor β-globina plasmídeo- a de controlo perfeito mutado apenas no local de ligação da ferritina-H e enganchado ao mesmo gene informador (CAT, neste caso) . Isto é não só o controlo perfeito para transfecções, mas também conecta a ligação in vitro do ADN com a função ín vitro de uma forma bastante boa. Já que um decréscimo na expressão da β-globina é compensado por um incremento na expressão da gama(fetal)-globina em células eritrõides humanas, e já que uma modesta quantidade desta troca é conhecida por melhorar totalmente a anemia falciforme e melhorar total ou parcialmente as β-talassemias, esta nova descoberta torna a ferritina útil para curar o fenótipo destas doenças genéticas clássicas.

Relatórios na literatura científica indicam que a ferritina H (ferritina de cadeia pesada) é diminuída em 50% em cérebros de ratos envelhecidos e em outras doenças neurodegenerativas como Alzheimer, e mostram que a 37 ferritina-H é encontrada nas doenças neurodegenerativas onde foram demonstrados danos oxidativos mediados por ferro, como na doença de Parkinson e possivelmente na doença de Huntington. Existem também estudos que indicam um papel protector da ferritina contra cancros, como cancros do fígado e da pele. Foi relatado que a luz UV induz a produção de ferritina em células da pele e que a ferritina é protectora contra os danos UV. De facto, a ferritina-H pode ser usada para tratar quaisquer doenças nas quais a lesão celular seja causada por danos oxidativos mediados por ferro.

Entregar o peptídeo da ferritina-H ou uma sua forma trancada âs células eritróides precursoras é uma forma mais eficiente, mais natural de terapia do que as medidas parciais actualmente em uso para o tratamento da anemia falciforme e das β-talassemias. Uma entrega similar de peptídeos derivados da ferritina oferece tratamentos eficientes e protecção no Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas e cancros. 0 peptídeo também pode ser entregue como uma proteína de fusão, com o todo ou partes do peptídeo da ferritina-H fundido a outra proteína como a transferrina ou a outro ligando para o qual existam receptores específicos na superfície das células eritróides precursoras, neurónios, ou outros tipos de células para os quais a protecção seja desejada. A forma de fazer proteínas de fusão dirigidas a tecidos específicos é bem conhecida daqueles mais experientes na matéria. Alternativamente, um clone de expressão que codifique a ferritina-H ou uma sua parte, entregue a células eritróides precursoras, a células estaminais hematopoiéticas, a neurónios ou a outras células 38 de tecidos num vector apropriado, tanto ex vivo como in vivo e a proteína expressada a partir de tal vector também cura e protege contra doenças. A ferritina-H aqui descrita é distinta de outras proteínas trans-actuantes conhecidas nas suas propriedades físicas e na sua função proposta como repressor que liga primariamente ao promotor da β-globina. A sub-família da ferritina-H é representada por um número maior de genes do que a sub-família da ferritina-L e incluem um conjunto de genes/pseudogenes no cromossoma X. Um destes, a ferritina-X, parece codificar um peptídeo idêntico em tamanho e muito semelhante na estrutura tridimensional prevista à ferritina-H.

Permanece a possibilidade de que a ligação de ADN actual do promotor da β-globina -150 motivo CAGTGC seja mediada in vivo por uma proteína associada à ferritina que estaria protegida da proteínase K e de tratamentos de calor, e reaja com antisoro anti-ferritina por causa da sua forte associação com a ferritina. No entanto, se for este o caso, é uma proteína que é ubíqua em extracto nuclear humano e não haveria necessidade de supra-regular e é ineficaz na ausência da ferrítina-H. A supra-regulação da ferritina-H é suficiente. A partir dos ensaios de expressão do transiente, torna-se claro que a ferritina-H consegue reprimir o gene da j3~globina humana e que esta repressão é mediada pela ligação da ferritina H e/ou um co-repressor à região -150 do promotor contendo um motivo CAGTGC altamente conservado. 39 0 local de ligação desta ferritina-H está dentro de um ARE importante necessário para a activação da transcrição do gene da β-globina. Logo, a ligação desta proteína e deslocamento de outros factores poderão ser importantes na repressão do gene da β-globina humana como a proteína de rato BBl (que reconhece a mesma sequência) é na repressão do gene β-major globina do rato em células MEL não induzidas. A interacção subsequente deste local de ligação com as regiões negativas reguladoras a montante cria um complexo muito apertado que previne a ligação de outros factores positivos como o GATA-1 bem como impede estericamente a formação de um complexo actívo de transcrição no promotor proximal, por looping de ADN. A proteína da ferritina-H pode ligar ao ião ferro.. 0 local de ligação responsável pela actividade ferroxidase já foi elucidado. No entanto, o local ou locais activos da proteína responsável pela repressão da transcrição ainda não foram identificados.

Como com todas as outras proteínas de regulação dos genes, os derivados da ferritina-H irão reprimir a transcrição de ADN tão bem ou melhor do que a própria ferritina-H. Estes derivados incluem fragmentos de proteínas de ferritina e quaisquer proteínas de fusão nas quais o local ou locais aactivos de ferritina-H responsável pela repressão da transcrição tenham sido emendados„ Os derivados da ferritina-H também podem incluir produtos de transcrição ou tradução maiores de uma proteína da família das ferritinas. Os derivados da ferritina-H incluem quaisquer proteínas miméticas que reprimam a transcrição de 40 ADN através de um local activo que é substancialmente o mesmo que o local activo da ferritina-H responsável pela ligação de ADN e locais de ligação de proteínas. Aqueles com mais experiência na matéria vão apreciar que o local ou locais activos da ferritina responsáveis pela repressão da transcrição do ADN podem incluir tanto locais de ligação ADN como locais de ligação de proteínas.Os derivados da ferritina-H podem ser encontrados em fragmentos de qualquer uma das proteínas da família das ferritinas. A ferritina-H é o único membro da família das proteínas da ferritina. A ferritina-H e a ferritina-L são as mais estudadas. É provável que existem proteínas da família das ferritinas que ainda não tenham sido identificadas. As proteínas da família das ferritinas estão geralmente envolvidas no metabolismo do ferro. Agora que os inventores elucidaram a activídade regulatória dos genes da Ferritina-H e seus derivados, é provável que outras proteínas da família das ferritinas também tenho funções reguladores dos genes. A capacidade das proteínas da família das ferritinas para se ligarem à região 5! do promotor do gene da beta globina só foi verificada após longas e rigorosas experiências como descrito em baixo. O primeiro exemplo mostra que a ferritina-H se liga ao local de ligação CAGTGC da ferritina, SEQ ID NR:1, encontrado nas bases -148 a -153 da região 5' do promotor mais a montante do local de ligação da ferritina. O exemplo 2 mostra que adicionalmente à ligação ao local de ligação da ferritina, a ferritina-H se liga a outra proteína nuclear que se liga a região 5’ do 41 promotor da beta-globina mais a montante do local de ligação da ferrítina, Estes resultados representam o trabalho em progresso e mostram que a ferrítina nuclear da célula K.562 humana interage com outras proteínas de ligação-ADN para reprimir este promotor, especialmente a montante das proteínas de ligação ao silenciador via looping de ADN. EXEMPLO 1

Materiais e métodos

Linhas celulares. Células K562 (eritroleucemia humana) foram cultivadas em suspensão em meio RPMI 1640 com 10% ou 15% de soro fetal de bovino (SFB) e antibióticos como descrito em (Berg, P. E,, Williams, D. M. , Qian, R. L. , Cohen, R. B., Cão, S. X., Mittelman, M. e Schechter, A. N, {1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52) e colhidas a uma densidade de 106 células/mL para fazer extractos nucleares. As células CV-1 (epiteliaís do rim do macaco verde Africano) (células aderentes usadas para ensaios de transfecção/transiência de expressão dos genes) foram cultivadas em DMEM com L-glutamina, 10% SFB e antibióticos (Miller, I. J. , e Bieker, J, J. (1993) Mol Cell Bíol 13, 2776-86) .

Clones, transfecções e ensaios de expressão dos genes. A região a montante -610/+20) do gene da β-globina humana, previamente clonada em pSV2CAT (Berg, P„ E„, Williams, D, M. , Qian, R. L„, Cohen, R. B., Cão, S. X-, Mittelman, M. e Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52), foi 42 sub-clonada através de pGEM e pSELECT {agora chamado pALTER) e reclonada em pCAT-básico (todos os vectores da Promega) . Os mutantes do local -153/-148 do promotor da {3-globina foram gerados por transcrição a partir de oligonucleotídeos mutantes correspondentes à região -164/-128 utilizando o sistema pSELECT. Transfecções de células CV-1 foram executadas com reagente de transfecção DMRIE-C (GibCo/BRL) em meio OptiMEM sem soro e foram optimizadas usando o plasmídeo de proteína verde fluorescente pEGFP-Cl (Clontech) e fluorescência microscópica e fluorescência quantitativa em lisados de células com um leitor micronizador de lâminas. 0 gene informador cloranfenicol acetil transferase (CAT) foi quantificado em lisados de células transfectadas usando um ELISA (Promega) padronizado com CAT purificado. 0 plasmídeo de expressão EKLF (factor eritróide do tipo Kruppel) tem o gene EKLF clonado no pSG-5 (Stratagene;(Miller, I. J„ e Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776-86) e o clone de expressão da ferrítina-H está no vector eucariõtico de expressão pcEXV-1 (Wu, Y. J. e Noguchi, C. T. (1991) J Biol Chem 266, 17566-72). O total da proteína celular foi determinado com o ensaio BCA de placa de microtitulação (Pierce) usando a albumina do soro de bovino como padrão.

Proteínas e anticorpos. As ferritinas do fígado humano (enriquecidas em cadeias L) e do coração humano (enriquecidas em cadeias H) , a transferrina humana (saturada em ferro) e apotransferrina, antisoro policlonal (coelho) para a ferritina do baço humano e soro de coelho não imune foram obtidos a partir da Sigma Chemical Company. 43

Fragmentos de restrição e oligonucleotídeos. A região 5' do gene da β-globina humana (de -610/ a +20), previamente clonada em pSV2CAT, foi cortada em três segmentos através de digestões sequenciais com HXND XII e Rsa I. Os três fragmentos electrocutados a partir de agarose (Maniatis, T. , Fritsch, E, F. e Sambroo, J. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual {Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), foram o 416 bp, (-635/-223), 147 bp (-127/+20, contendo a região proxímal do promotor) e 95 bp (o fragmento Rsa, -222/-128, contendo principalmente sequências distais do promotor). Os três fragmentos foram tratados com fenol/clorofórmio, defosforilados e etiquetados com 32-P como descrito em (Maniatis, T. , Fritsch, E. F. e Sambroo, J. (1989)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual {Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York;

Kurien, B„T, Scofield, R, H. e Broyles, R. H. (1997) Anal Biochemí 245, 123-126).

Os oligonucleotídeos sintéticos correspodentes a 262/-188 e -164/-128 foram purificados e anelados como anteriormente descrito em (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L, , Cohen, R. B. , Cão, S. X., Mittelman, M, e Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52), e os oligos de cadeia dupla foram etiquetados como em cima e/ou usados como competidores não etiquetados em ensaios de mobilidade "gel shift".

Preparação de extractos nucleares. Cada preparação de extracto nuclear foi feita a partir de dois litros de 44 células K562 (Ix 105 células/mL) usando o procedimento de

Dignam, Lebovitz e Roeder {Dignam, J. D., Lebovitz, R. M, e

Roeder, R. G. (1983) Nucleic Acids Res 11, 1475-89) . 0 conteúdo de proteína dos extractos variou entre 3 a 6 mg/ml. Os extractos enriquecidos 80* -90% em proteínas do tipo ferritina foram preparados tratando os extractos em bruto com proteínase K e/ou calor a 75°C (Atkinson, B. G., Dean, R. L„, Tomlinson, J. e Blaker, T. W. (1989) Biochem Cell Bíol 67, 52-7).

Ensaios de mobilidade "gel shift". Os ensaios de retardação de gel (i„e. Hgel shifts1') foram usados para determinar a ligação do ADN das proteínas do extracto ao fragmento Rsa I (95 bp) e aos oligonucleotldeos sintéticos (Berg, P, E., Williams, D. M. , Qian, R. L., Cohen, R. B.f Cão, S, X., Mittelman, M. e Schechter, A. N. (1989) Nucleíc Acids Res 17, 8833-52; Fried, M. e Crothers, D. M. (1981) Nucleic Acids Res 9, 6505-25). Cada reacção continha 0,5-2 pg de ADN, 1-5 pg de proteína do extracto, 1-5 pg de poli dl: poli dC, lOOmM KCl e um tampão de ligação (Berg, P. E,, Williams, D. M,, Qian, R. L„ , Cohen, R. B., Cão, S. X., Mittelman, M. e Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52) . Os oligonucleotldeos competidores não etiquetados variaram entre 15 a 2000 vezes de excesso molar e foram incluídos na mistura da reacção com a sonda antes da adição da proteína. Os geles utilizados para os ensaios de retardação foram acrilamida a 4%, 5% ou 6% e o tampão de execução foi TAE com baixa força íónica (Berg, P, E., Williams, D. M., Qian, R. L,, Cohen, R. B„, Cão, S. X. , Mittelman, M. e Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52) . 45

Alinhamentos sequenciais e pesquisas de homologia.

Todas as sequências do promotor da (3-globína de mamíferos (-200/+1) foram obtidas directamente a partir da GenBank e manipuladas usando o programa PILEUP seguido pelo programa LINEUP da Uníversity of Wisconsín CCG Package.

RESULTADOS A ferritina-H reprime a expressão conduzida pelo promotor da β-globina em ensaios transientes de co-transfecção. Um ensaio de expressão transiente foi preparado com células CV-1 nas quais onde a expressão da p-globina conduzida por um promotor de um gene informador é baixa a menos que as células sejam co-transfeccionadas com um clone de expressão de EKLF, um activador desenvolvimentalmente específico da transcrição. 0 nível de expressão do b-CAT estimulado pelo EKLF foi reprimido por mais de 60 por cento por co-transf ecção de um clone de expressão da ferritina de cadeia-H humana (i.e. ferritina-H) .

Os controlos incluíam um plasmídeo positivo de controlo CAT (exprime o CAT constitutivamente), um plasmídeo negativo básico CAT (não contém promotor) e um b-cat sem estimulação EKLF. A experiência foi repetida mais cinco vezes com b-CAT e três vezes com uma estrutura b-Luc (promotor b-luciferase) com resultados muito semelhantes. A repressão também é evidente (embora a actividade do informador seja menor) quando o EKLF é omitido (dados não mostrados). Outros controlos incluíram a co-transfecção dos plasmídeos de transporte "vazios" para todos os clones de 46 expressão (sem efeito na expressão do gene informador) bem como a manutenção da quantidade total de microgramas da constante de ADN transfectada para excluir a possibilidade de uma inibição não específica da expressão dos genes, devido ao excesso de ADN ou a algum aspecto da estrutura de um plasmídeo de transporte. A co-transfecção de um clone de expressão para a ferritina-L resultou algumas vezes em alguma repressão da expressão do gene informador, mas o efeito foi menos dramático e observado inconsistentemente.

Ligação da ferritina ao ADN do promotor da b-globina.

Um fragmento de restrição contendo parte do promotor distai do gene da β-globina humana, de -222/-128, é ligado por ferritina derivada do coração ou fígado humano, como mostrado nos ensaios de retardação por gel. Nas experiências dos inventores, a ferritina do coração humano (que é rica em sub-unidades tipo H (pesadas) mostrou um grau de ligação mais alto que a ferritina do fígado (que é relativamente rica em sub-unidades do tipo L). Um fragmento de restrição contendo o promotor proximal (-127/+20) não mostra esta ligação; e outra proteína de ligação ao ferro, a transferrina (conheciada por ser principalmente extracelular excepto quando ligada ao seu receptor) não liga o fragmento distai ligado por ferritina. As bandas de troca produzidas pela ligação da ferritina do fígado humano e pela ferritina do coração humano correspondem geralmente as bandas de troca mais baixas e mais altas produzidas pelos extractos nucleares em bruto da célula K562, respectivamente. Os inventores também descobriram que a ferritina do extracto nuclear pode produzir qualquer das bandas de troca e que a banda com o maior peso molecular 47 vai produzir a banda mais baixa quando eluída e re-trocada. Bandas de troca múltiplas com extractos em bruto são o resultado de agregados de sub-unidades ferritina com diferentes tamanhos ou olígomeros do complexo proteína-ADN e/ou complexos com outras proteínas em extractos em bruto, desde que os inventores descobriram que pelo menos uma das bandas múltiplas contém GATA-1.

Enriquecimento de uma proteína do tipo ferritina a partir de extractos nucleares de célula K562. Foi descoberto que um antisoro policlonal para a ferritina humana do baço (que é composta por uma mistura de cadeias leves e pesadas de ferritina) causa uma super-troca de uma parte dos complexos ADN-proteína formados a partir de extractos nucleares de células K562 e que o fragmento de restrição -222/-128 e a intensidade da banda super-trocada era proporcional à quantidade de antisoro adicionada. Foi descoberto que a super-troca com antisoro anti-ferritina era específica para este complexo ADN-proteína, que muito pouco a nenhum ADN era trocado na ausência de extracto nuclear, que nem o antissoro anti-transferrina nem o soro de coelho não imune (não mostrado) trocavam o complexo, que IgG anti-coelho inibia a super-troca e que complexos proteicos com outros ADNs tais como p-IVS2 não eram trocados pelo anti-soro anti-ferritina. A ferritina, ao contrário da maioria das proteínas, ê resistente â digestão com proteínase K e ao calor a 75°C, e pode ser obtida noventa por cento pura a partir de extractos de células eritróides embrionãrias/larvares usando estes dois tratamentos. Quando este procedimento foi

4S aplicado aos extractos nucleares K.562, a proteína restante originou uma única banda de troca com o fragmento de restrição -222/-128. Além disso, quando o anti-soro antí-ferritina foi adicionado a mistura da reacção após incubação do ADN e da proteína de ligação, um complexo maior foi formado, resultando numa banda de "supershift" Deve notar-se que a banda de troca primária com extracto nuclear tratado com proteínase K não trocou tanto como as bandas de gel obtidas com extracto não tratado. Os inventores investigaram isto numa série de digestões fora de tempo e descobriram que a ferritina é sujeita a uma digestão parcial pela proteínase K; o que resta após uma digestão de 10-15 minutos parece ser um núcleo resistente â proteínase K que ainda liga ao ADN. Além disso, aumentar a quantidade da preparação de peptídeo enriquecida dá um intensidade aumentada à banda de troca, e a banda move-se gradualmente pelo gel à medida que o complexo aumenta em tamanho.

Uma banda "supershift" única foi obtida com o promotor distai 95 bp que aumentou em intensidade com o aumento do anti-soro. Para localização posterior da ligação da proteína reactiva da anti-ferritina, o "supershift1’ também foi efectuado com olígonucleotídeos de cadeia dupla etiquetados com P-32 das sequências -232/-188 e -164/-128. Quanto mais o olígonucleotídeo 39 dava uma banda "supershift", mais o olígonucleotídeo 59 não dava indicando que a proteína reconhecida pelo anti-soro liga a uma sequência 37 bp entre -164 e -128. A falta de um "supershift" com o olígonucleotídeo -232/-128 também serve como controlo para a especificidade do anticorpo. 49

Localização da região de ligação com o ensaio de "supershift" dos anticorpos. 0 "gel shift" dos anticorpos também foi usado com oligonucleotídeos de cadeia dupla 32-P correspondentes às terminações 3' e 5' do fragmento de restrição 95 bp e com extractos nucleares de K.562 em bruto para melhor localizar a ligação da ferritina. Por isso apenas o oligo 31 deu a banda de "supershift" indicando que a proteína reconhecida pelo anti-soro liga a uma sequência base par (bp) 37 entre -164 e -128.

Definição do local de ligação com “gel shifts" em competição. Para melhor localizar a ligação da ferritina, os inventores mutaram os oligonucleotídeos 37 bp em lugares diferentes, substituindo seis nucleotídeos de uma vez com A, C, ou G na totalidade, com substituições complementares de nucleotídeos na cadeia oposta. Um ensaio de competição de "gel shift" foi feito com proteína parcialmente purificada de extracto nuclear de K562 aquecido, no qual cada um dos oligos mutantes não etiquetados, bem como a sequência nativa foram competidas contra a sequência nativa etiquetada com 32-P para ligação. Todos os mutantes competiram para ligação, bem como a sequência nativa excepto aqueles mutados na região -153/-148, ie., mutados na sequência CAGTGC. Os inventores concluíram que estes seis pares base contém o local de ligação da ferritina-H. A especificidade desta ligação é titulada e quantificada em competições de oligo com a sequência nativa não etiquetada comparada com a sequência mutada em todos os seis nucleotídeos que foi descoberto serem importantes para ligação, i. e., a sequência CAGTGC (nativa) comparada com o mutante #4. Onde a ligação a sequência nativa etiquetada é 50 significativamente competida com um excesso de 50 vezes do self não etiquetado, foi preciso um excesso de 1000 vezes do oligo mutante não etiquetado para começar a competir com a ligação à sequência nativa, uma diferença de vinte vezes.

Alinhamentos da sequência dos promotores (-162/+1) de genes de β-globina de doze mamíferos adultos mostram que o CATGTGC -150 do β-promotor humano é conservado em grande parte. Numa comparação filogenética de promotores β-globina de doze mamíferos adultos do local tampão ao -162 os inventores descobriram que a sequência CAGTGC na região -150 está entre as mais conservadas dos elementos de actuação cis, apenas atrás das caixas TATA e CCAAT no seu grau de conservação, tão altamente conservada como o motivo proximal CACC e mais altamente conservada que o CACC distai.

DISCUSSÃO

Os resultados dos inventores mostram que nas células CV-1, um clone de expressão da ferritina-H humana sobre-regula a expressão de um gene da β-globina informador CAT estimulado por EK.LF dirigido por um promotor. Os inventores identifiçaram uma proteína nos extractos nucleares da célula K562 que tem propriedades únicas, i.e., estabilidade à proteínase K e ao calor (75°C) e reactividade com anti-soro anti-ferritina. A ferritina-H liga à região 5' do gene da β-globina que é necessária para a activação do gene da β-globina em células K562 normais e eritróides, i.e, a região entre -128 e -222 do local tampão. Esta região de ADN tem mostrado ligar a ferritina nativa humana em 51 experiências de "gel shift", A especificidade da ligação das proteínas do tipo ferritina tem sido confirmada usando diferentes segmentos de ADN e oligonucleotídeos num ensaio de anticorpos "gel shift", e os oligos e o anti-soro anti-ferrina têm sido usados para mostrar que o local de ligação está entre -128 e -165. Ensaios de competição de "gel shift" como oligonucleotídeos mutados mostraram que a ligação da ferritina requer os nucleotídeos CAGTGC, em -153/-14 8 no gene da {3-globina humana; e quando este motivo CAGTGC é mutado, a ligação in vitro é reduzida aproximadamente vinte vezes. A capacidade da ferritina-H para reprimir neste sistema é abolida, mas a estimulação EKLF é mantida, quando o local de ligação da ferritina -153/-148 ê mutado no plasmídeo repórter co-transfectado da ]3-globina. Estes resultados mostram que a ferritina-H consegue reprimir o gene adulto da β-globina humana ligando o promotor numa forma específica sequencial. A biologia da ferritina-H e o seu local de ligação altamente conservado, bem como a sua função demonstrada em ensaios transientes, significam que em células K562 está de facto a funcionar como um repressor da b-globina. Um repressor deste género é útil no melhoramento da anemia falciforme e outras doenças genéticas. É digno de notar que uma sequência de ARN CAGUGN foi descoberta anteriormente funcionar na regulação da tradução e estabilidade da codificação do ARN para proteínas envolvidas no metabolismo do ferro, por exemplo mARN para as sub-unidades da ferritina e para o receptor da transferrina. Neste contexto bastante diferente, o hexanucleotideo é o "apex" de uma estrutura "stem-loop" 52 referida como um IRE (elemento que responde ao ferro), uma estrutura estável secundária formada nas regiões co-traduzidas 5' ou 31 dos mARNs de cadeia simples. A proteína regulatória que liga ao IRE (a IRE-BP) foi identificada como sendo a forma citosólica de acotinase, uma proteína de "cluster" cubano ferro-sulfur com uma massa molecular próxima de 97 kDa. Em contraste, a ferritina-H, estável ao calor, reconhece a sequência CAGTGC no ADN e aparentemente tem uma massa molecular de cerca de 2 0 kDa, ou menos se parcialmente proteolizada.

As regiões do gene da globina são enriquecidas em sequências CAGTGC/CAGTGN relativamente à frequência com que se esperaria que a sequência aparecesse aleatoriamente. 0 genoma humano, bem como a sequência 73,236 bp do grupo de genes do tipo p-globina no cromossoma 11, é aproximadamente quarenta por cento G+C, Por isso, a frequência de ocorrência dos nucleotídeos G e C será de 0.2 cada, e a frequência de A e T será de 0,3 cada. A frequência aleatória de ocorrência da sequência CAGTGC será (0,2)x(0,3)x(0,2)x(0,3)x(0,2)x(0,2) = 0,000144. Por isso, era esperado que a sequência ocorresse por acaso dez a onze vezes no bp 73,326 do grupo do tipo β-globina. A ocorrência actual é trinta e seis vezes, três a quatro vezes o número esperado por acaso. Similarmente, o pentâmero CAGTG (na sequência CAGTGN) ocorre 205 vezes, novamente cerca de quatro vezes as cinquenta e duas/cinquenta e três ocorrências esperadas por acaso. A função desta sequência, como outros elementos reguladores do cis, é dependente do contexto. A sequência ocorre nas regiões 3' e 5' dos genes ε-globina e ε-globina, mas estas localizações e suas 53 sequências circundantes são marcadamente diferentes do local -153 para o gene da β-globina. A ligação da ferritina-H aos locais 5' e/ou 3' aos genes ε-globina e γ-globina vai ter um efeito estimulador em vez de inibidor na transcrição. A impressão das pegadas filogenéticas é útil para a identificação de locais de ligação importantes para as proteínas regulatórias. Neste contexto, é interessante que a sequência CAGTGC/CAGTGN seja altamente conservada em sequência e localização em promotores do gene da β-globina em mamíferos e seja encontrada nos β-promotores de galinhas e sapos também. A grande conservação desta sequência significa que o local de ligação tem uma função importante. 0 gene principal da β-globina adulta de Xenopus tem a sequência CAGTGC em -4 5 a partir do local tampão, e um oligonucleotídeo contendo esta sequência liga a ferritina-H humana de extractos nucleares de K562 mais fortemente que a região correspondente do promotor da β-globina humana. Em consistência com a descoberta do inventor de que a ferritina-H actua como um repressor da β-globina adulta em células K562 humanas, está a descoberta do inventor que o local de ligação -150 para esta protéina compete com o local principal β -160 do rato conhecido por ligar a proteína repressora BB1. 54 EXEMPLO 2

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais: Fosfatase alcalina de intestino de vitela, quinase T4 polinucleõtida e Sau96 I foram obtidas da Promega/Fisher. 32Ρ-γ-ΆΤΡ foi a partir da Dupont/NEN. Antisoro policlonal (coelho) para a ferritina humano do baço foi obtido da Sigma Chemical Company. Todos os outros reagentes faziam parte da biologia molecular.

Fragmentos de restrição e oligonucleotídeos: A região 5' do gene beta globina humano (de -610 a +20), previamente clonada em pSVOCAT, foi cortada a partir do plasmídeo purificado por digestões com Hind III e Barn Hl. 0 fragmento 630 bp foi tratado com fenol/clorofórmio, defosforilado e marcado no final com 32-P.

Oligonucleotídeos sintéticos correspondentes ao local de ligação núcleo/BP-1 do NCR1 (-584/-527), os mais distais dos dois silenciadores 5'-β-globina, e a região -164/-128 do promotor foram purificados e anelados, e os oligos de dupla cadeia foram marcados no final como descrito em cima e/ou usados como competidores não marcados em ensaios de "gel shift".

Preparação dos extractos nucleares: Células K562 não-aderentes foram cultivadas em suspensão num meio composto por RPMI 1640 e soro fetal de bovino a 15% como descrito em cima e colhidas a uma densidade de 106 células por mL. Para cada preparação, o extracto nuclear foi preparado a partir de dois litros de células. 0 conteúdo de proteína dos 55 extractos variou entre os 3 e os 6 mg/ml. Os extractos enriquecidos com aproximadamente 80% em proteínas com afinidade específica a região promotora -150 e a região silenciadora -550 foram preparados tratando os extractos em bruto com calor a 80°C.

Ensaios de mobilidade "gel shift": Os ensaios de retardação de gel (i.e, "gel shifts"} foram usados para determinar a afinidade do ADN dos extractos de proteínas parcialmente purificados, primeiro com os oligonucleotídeos sintéticos correspondentes ao silenciador -550 e à região -150 do promotor e subsequentemente ao fragmento 630 bp do gene da J3~globina humana contendo tanto o promotor e as sequências reguladoras do fluxo de entrada com modificações. Os geles usados para os ensaios de retardação tinham 4% de acrilamida e o tampão utilizado foi TAE com baixa força iónica.

Design experimental: 0 ensaio de looping do ADN é efectuado misturando um extracto contendo proteínas específicas para locais reguladores que estão propostos para interagir, com ADN contendo os locais contíguos separados por ADN interveniente e a ligação das proteínas é detectada com EMSA padrão. Se as proteínas ligadas a locais separados interagirem umas com as outras de uma maneira estável, o ADN interveniente irá formar um laço que pode ser cortado em apenas um local de restrição no laço. 0 teste para o looping é que o complexo proteína-ADN mantenha a sua migração EMSA como uma tira única depois do corte. Os controlos incluem pistas com alíquotas desproteinizadas da reacção antes e depois da digestão da restrição, para 56 provar que o laço foi efectivamente cortado. As condições para cortar o complexo laçado com Seu 96 I são como descritas na página seguinte. 0 ensaio de looping in vitro do ADN, foi baseado no uso combinado do EMSA (Electromotive Mobility Shift Assay} e uma quebra única de localização com um enzima de restrição apropriado. Foram efectuados "gel shifts" (EMSAs) com um extracto nuclear parcialmente purificado de células KS62 não induzidas e com ADN, antes e depois do corte com SAU 96 I. Todo o ADN teve ligação com a proteína num complexo único trocado que reteve a sua migração, como uma banda única depois do corte de restrição. Foram recolhidas amostras de ADN depois da desproteinização dos complexos. Preparação dos extractos nucleares: Extractos nucleares de células K562 não aderentes foram preparados pelo procedimento de Dignam et al. como anteriormente descrito. Extractos parcíalmente purificados, enriquecidos em 80% por proteínas com afinidade de interesse, foram preparados aquecendo os extractos nucleares a 80°C, centrifugando, e retendo o fluido sobrenadante, como descrito por Atkinson et al. (25). O extracto enriquecido continha proteínas com afinidade com os oligonucleotídeos -150 (-164/-128) e -530 (-584/-527) no EMSA padrão. Ensaios de mobilidade "gel shift" (EMSAs): Foi utilizado o procedimento de Fried e Crothers (26), como descrito por Berg et al. (19), exceptuando que cada reacção (que continham 2 ng [9000 cpm] de ADN 630 bp, 2,5 pg de extracto de proteína, lpg de poli dl: poli dC, lOOmM KCl, e tampão de ligação) estava num volume de 5 μΐ (em vez dos habituas 25 μΐ). A proteína e o ADN foram autorizados a interagir à temperatura ambiente por 20 minutos e os ensaios de retardação foram efectuados 57 com geles de 4% de acrilamida com uma força iónica. Design das experiências de looping de ADN: Para detectar o looping devido à interacção da proteína promotora-afim com a ligação da proteína mais a montante na cadeia {ca. -300 a -600 bp) , o complexo proteína-ADN foi reagido com SAU 96 I, que quebra o ADN em -210/-209 utilizando as instruções do fabricante, modificadas da seguinte forma: 2 μΐ de enzima e 15 μΐ de enzima tampão mais BSA foram utilizados num volume total de 31 μΐ que incluía os conteúdos {5 μΐ) da reacção de ligação proteína-ADN à temperatura ambiente.

RESULTADOS

Anunciámos num artigo preliminar que um fragmento de restrição contendo parte do promotor distai do gene da p-globina humana, de -222/-128 bp, tem afinidade com a proteína da ferritina-H em extractos nucleares da célula K562, e é específico para a região -150. Pelo menos duas proteínas específicas para a funcionalidade, definiram silenciadores com que mapeiam a montante do promotor proximal e distai do gene da p-globina humana, nas regiões de -300 (-338/-233) e -530 (-610/-490) a partir do local tampão. Com o objectivo superior de explorar as interacções entre estes silenciadores e o p-promotor, desenhámos uma abordagem experimental para a detecção de looping estabilizado de ADN por interacções entre proteínas com afinidade a locais separados por distâncias moderadas de ADN interveniente. Usámos um extracto nuclear parcialmente purificado da célula K562 que contém proteínas com ligação com estas regiões separadas. 58

Descobriu-se que o extracto de proteína parcialmente purificado utilizado para estas experiências contém a proteína com ligação ao promotor -150 e actividade com ligação ao silenciador -530 através de ensaios "gel shift" separados com os seus respectivos oligonucleotídeos (dados não mostrados). 0 ADN é retardado na sua migração, devido à ligação das proteínas do extracto nuclear parcialmente purificado da K562. Quando o material reagiu com a enzima de restrição Sau 96 I, depois do ADN e das proteínas terem formado um complexo, a grande maioria deste material foi retardado na sua migração. Existe um único local Sau 96 I na sequência 5' β-globina, que corta o ADN entre o promotor e as regiões a montante) , Foi mostrado que um grande bocado de ADN foi recuperado de um complexo onde todo o ADN de outro complexo foi cortado, dando duas bandas limpas idênticas na sua migração a bandas obtidas quando ADN puro foi reagido com a enzima de restrição. Os comprimentos destes fragmentos são 229 bp (+20/-209 contendo o promotor) e 401 bp (contendo as sequências a montante, incluindo os silenciadores). Quando a mistura contendo estes fragmentos de ADN pré-cortado foi reagida com as proteínas parcialmente purificadas, os dois fragmentos foram trocados independentemente, mas o grande complexo (laçado) não foi formado. O facto observado de que o complexo se mantém junto depois do ADN ser completamente cortado com Sau 96 I indica que um laço foi inicialmente formado entre o local ou locais a jusante de -209 e um local ou locais a montante de -210, 59 A ferritina liga-se à região do promotor no local de ligação da ferritina. Várias proteínas com afinidade de ADN também se ligam à região do promotor da β-globina. As proteínas ganham todas ligação a montante do local de ligação da ferritina. A repressão do gene da β-globina pela ferritina é melhorada pela interacção proteína-proteína entre a ferritina e pelo menos uma das proteínas com ligação ao promotor. Um complexo ADN proteína-proteína é formado pela ferritina com pelo menos uma das proteínas com ligação. A região promotora tem um local de ligação da ferritina e a montante desse local, um local de ligação da proteína. Uma proteína de ligação fixa-se a um local de ligação, e a ferritina liga-se ao local de ligação da ferritina. A ferritina e a proteína de ligação ligam-se então uma â outra, criando dessa forma um laço no ADN. A região promotora pode ser cortada em dois fragmentos mais pequenos num local de restrição enzimãtica pela enzima de restrição Sau 96 I. Devido à interacção proteína-proteína entre a proteína de ligação e a ferritina, o complexo permanece intacto. Logo, a aplicação de uma enzima de restrição não resulta numa troca de mobilidade num ensaio de gel. Remover as proteínas do laço não cortado de ADN resulta numa região promotora intacta. Remover proteínas a partir do laço de ADN depois de ser cortado por uma enzima de restrição resulta em dois fragmentos de ADN.

Quando os fragmentos do promotor são combinados com um extracto nuclear contendo ferritina e ligando a proteína, resulta um "gel shift" . Isto mostra que o "loop" de ADN é causado pela ligação da ferritina à região promotora. 60

Controlos: Os controlos incorporados nas experiências descritas acima, incluíam a desproteínização dos complexos para mostrar que o "loop" foi cortado pela enzima de restrição mostrando que as sequências de ADN não relacionado (ex: ADN P. putida) não formam um complexo com este extracto. Como controlo adicional, um complexo de banda simples foi isolado e desproteinizado e também mostrou conter quantidades iguais dos dois fragmentos de restrição resultantes da digestão por Sau 96 I. Os dois fragmentos de Sau 96 I da região 51 da beta globina trocam independentemente com este extracto e não formam o grande complexo a menos que estejam ligadas; além disso, uma concentração de proteína aproximadamente oito vezes maior é necessária para começar a trocar os fragmentos de restrição separados, do que aquela que é necessária para iniciar a formação do complexo "looped".

DISCUSSÃO

Interpretações; As experiências reportadas mostraram que o " looping" do ADN pode ser detectado in vitro com um ensaio EMSA combinado com digestão com uma enzima de restrição específica. Nestas experiências de "looping" de ADN, os resultados mostram que as sequências entre -209 e + 20 bp do gene da β-globina humana interagem com as sequências a montante entre -210 e -610 bp. 0 "looping" é mediado por um extracto parcialmente purificado contendo uma proteína de ligação promotora -150 e uma proteína β-globina de ligação-silenciador, confirmado por experiências de ligação com o extracto e as sequências de ligação separadas. Quando o grande e simples complexo proteína-ADN 61 detectado pelos nossos EMSAs foi cortado com Sau 96 I, o complexo ainda migrou como um complexo simples e grande acima pelos geles acima, (Houve um pequeno aumento na migração do complexo cortado que é de se esperar visto que um corte de restrição simples de cadeia dupla irã mudar a conformação do ADN ligeiramente.) Deve ser também notado que a ligação da proteína neste complexo "looped" parece ser muito apertada; é preciso um grande excesso de oligonucleotídeos -164/-128 e -584/-527 não etiquetados para quebrar o complexo {não mostrado). Além disso, uma comparação da afinidade da ligação do ADN 630 bp inteiro com as afinidades da ligação de uma mistura dos fragmentos gerados por Sal 96 I, mostrou que é necessário aproximadamente 80 vezes menos proteína para formar um complexo trocado com o ADN grande e intacto (63o bp) do que com uma mistura dos fragmentos separados, mostrando que a ligação ao ADN mais largo 630 bp é cooperativa e que ocorre "looping".

Todos estes resultados são consistentes com parâmetros conhecidos e forças que controlam o "looping" de ADN, que é mediado por duas ou mais proteínas mostrando ligação cooperativa (e geralmente, apertada). Os resultados destas experiências também mostram que a repressão do gene da β-globina por silenciadores a montante pode ser mediada por "looping" de ADN. Esta abordagem não nos permite determinar a identidade das proteínas envolvidas e pode não funcionar em casos onde existir super-enrolamento de ADN, como acontece em certas estruturas plasmídeas in vitro, ou fraca interacção proteína-proteína. 62 0 "loop" na região promotora formado pela interacção entre a ferritina e um ou mais proteínas de ligação a montante aumenta a repressão do gene da β-globina, As células humanas têm geralmente quantidades suficientes de proteínas de ligação a montante de tal forma que a adição de ferritina sozinha a uma célula humana pelos métodos descritos é geralmente suficiente para causar a repressão do gene da β-globina e de outros genes regulados por esta actividade. Adicionalmente, a ligação da ferritina ao local de ligação CAGTGC da ferritina é geralmente suficiente para reprimir a transcrição do gene da β-globina.

Um método para aumentar a expressão da ferritina-H é reprimir a expressão da ferritina-L ou outra proteína da família da ferritina. Isto pode ser acompanhado pela utilização de oligonucleotídeos de sentido contrário de ADN específicos para os genes que codificam as proteínas da família da ferritina, menos a ferritina-H. A redução e a expressão destas proteínas da ferritina levam a uma maior concentração e expressão mais elevada da ferritina-H, Trocando as proporções entre a ferritina-H e outras proteínas da família da ferritina, a β-globina é reprimida e os efeitos destrutivos da anemia falciforme são reduzidos para níveis aceitáveis. A expressão elevada da ferritina-H também cura a falha na gestão do ferro intracelular, resultando em níveis mais baixos de iões de ferro perigosos. Enquanto a actividade ferroxidase da ferritina-H pode desempenhar um papel na gestão adequada do ferro intracelular, maiores concentrações de ferritina-H afectam a expressão de um 63 número de genes envolvidos no metabolismo do ferro. Esta função genética reguladora da ferritina-H facilita a gestão adequada do ferro em celas que foram adversamente afectadas por uma grande variedade de doenças. Como descrito nos antecedentes, o cancro, doenças neurodegenerativas, desordens neuromusculares e ateroesclerose levam a uma gestão imprópria do ferro dentro do corpo das células. Aumentando a concentração de ferrítina-H e os efeitos genéticos reguladores resultantes aliviam os efeitos destrutivos de uma gestão imprópria do ferro.

Os estudos mostraram que a ferritina-H exibe a actividade ferroxidase mais eficaz quando é expressa quase aos mesmos níveis da ferritina-L, Níveis de expressão iguais resultam no maior número de heteropolímeros de ferritina-H/ferritina-L. A forma heteropolimérica do complexo de ferritina 24-mer é a mais eficaz na conversão do ião ferroso em ião férrico e no sequestro de iões ferro,. Isto sugere que a manutenção de concentrações iguais de ferritina-H e ferritina-L provavelmente resultará numa gestão adequada do ferro. Aumentar os níveis de ferritina-H resultaria na formação de homopolímeros de ferritina-H. Os homopolímeros de ferritina-H mostram baixa actividade da ferroxidase. Seria de esperar que isto levasse a maoires níveis do mais perigoso ião ferroso e tivesse efeitos adversos nas células. No entanto, os inventores descobriram que as funções reguladoras do gene da ferrítina-H provocam o acontecimento exactamente oposto.

Aqueles mais experientes na matéria vão perceber que existem várias maneiras de elevar os níveis de ferrítina-H 64 dentro de uma célula. Pode envolver a introdução da própria proteína ferritina-H através de qualquer número de meios farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos daqueles experientes na matéria. Isto pode incluir o uso de estruturas lipossomais que contenham a proteína ferritina-H. Estas estruturas podem ter ou não ligandos ou anticorpos.

Um método alternativo para aumentar os níveis intracelulares de ferritina-H é regular a expressão das moléculas da família da ferritina. Isto pode ser feito de várias maneiras. Oligonucleotídeos ADN de sentido contrário que direccionam os genes da família da ferritina, menos a ferritina-H, vão resultar numa expressão diminuída do gene direccionado e causar maiores concentrações de ferritina-H dentro da célula. Também é possível introduzir proteínas ou outros compostos que aumentam a transcrição ou tradução de um gene endógeno da ferritina-H ou um gene da família da ferritina relacionado. Estes compostos activadores podem ser introduzidos nas células em métodos similares à introdução da própria proteína ferritina-H como discutido em cima.

Ainda outro método de aumentar os níveis intracelulares de ferritina-H é introduzir um vector de expressão da ferritina-H nas células. Os mais experientes na matéria vão apreciar que existem vários métodos de transfectar células com um número de vectores diferentes, incluindo plasmídeos, fagemídeos e cosmídeos. 0 tipo de vector usado, a região promotora dentro do vector e quaisquer sequências de controlo usadas com o vector irão 65 variar dependendo de uma variedade de factores conhecidos daqueles experientes na matéria. Estes factores incluem mas não estão limitados ao tecido celular alvo, ao nível de expressão desejado e ao nível de expressão de proteína da família da ferritina dentro das células alvo.,

Ainda outro método de uamentar os níveis intracelulares de ferritína-Ή é aumentar os níveis de proteínas ou compostos que elevem a transcrição ou tradução dos promotores da ferritina-H.

Os métodos de aumentar os níveis intracelulares podem ser considerados métodos de indução intracelular, onde a célula cria a sua própria ferritina, ou métodos de introdução extracelular, onde a ferritina é adicionada à célula quando as estruturas lipossomais são usadas. A transfecção de células com vectores que codificam uma proteína da família da ferritina pode ser efectuada ex vivo ou in vivo. Quando efectuada in vivo, os vectores são introduzidos dentro do corpo do paciente. Quando efectuada ex vivo, as células são transfectadas com um vector e depois implantadas no tecido celular do paciente. As células estaminais são especialmente adequadas para este procedimento. No entanto, outras células podem também ser usadas. 66

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LISTAGEM SEQUENCIAL

Boyles, Robert H. e Floyd, Robert A. GENE RBGULATION THERAPY INVOLVING FERRITIN OKL010/107-00727Ά Not Yet Assigned Herewith 60/245,003 00-11-01 2

WordPerfect 8.0 (saved in ASCII format) 1 6

DMA

Homo Sapiens 1 cagtgc 6 2 10

DNA

Homo Sapiens

Misc binding 1.,10

Anti Oxidant Response Element 2

Rtgacnnngc 10

Lisboa, 02/11/2006

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. 0 uso da (i) ferritina-H que é capaz de ligar ao promotor do gene da β-globina humana a -150 bp pares de bases do local de início da transcrição, (ii) oligonucleotídeos de sentido contrário específicos para a codificação do gene da proteína da família das ferritinas em vez da ferritina-H e a repressão da expressão da dita família de proteínas da ferritina, ou (íii) uma codificação do gene para a ferritina-H como descrito acima em (i) para o fabrico de um medicamento para o tratamento da anemia falciforme ou da β-talassemia, quando o medicamento não é para terapia de genes por meio de modificação da linha de germes. 2. 0 uso da reivindicação 1, quando o medicamento é formulado para introdução da ferritina-H como definido na reivindicação 1 em células produtoras de globina.

3. O uso da reivindicação 1, quando a ferritina-H como definido na reivindicação 1 é proporcionada como uma construção lipossomial. ferritina-H seja a ferritina-L. 5, 0 uso da reivindicação 1, quando o gene (iii) esteja na forma de vector, 6. 0 uso da reivindicação 1, quando o vector for proporcionado como uma construção lipossomial tendo um ligando ou anticorpo na sua superfície, que o ligando ou anticorpo tenha afinidade com um receptor específico na superfície de uma célula. 70 uso da reivindicação 1, quando a ferritina-H como definido na reivindicação 1 seja fornecida num veículo, o dito veículo direccionando células estaminais hematopoiéticas, células precursoras eritrõides ou células hematopoiéticas.

8. Uma composição farmacêutica para o tratamento da anemia falciforme ou β-talassemia, contendo a composição: ferritina-H como definido na reivindicação 1; e um ligando específico de direccionamento da célula.

9. Uma composição farmacêutica para tratamento da anemia falciforme ou β-talassemia, contendo a composição: um gene que codifica a ferritina-H como definido na reivindicação 1; e um vector de transfecção adequado. Lisboa, 02/11/2006