RU2477287C2 - Стабилизированные полипептиды инсулиноподобного фактора роста - Google Patents
Стабилизированные полипептиды инсулиноподобного фактора роста Download PDFInfo
- Publication number
- RU2477287C2 RU2477287C2 RU2008151511/10A RU2008151511A RU2477287C2 RU 2477287 C2 RU2477287 C2 RU 2477287C2 RU 2008151511/10 A RU2008151511/10 A RU 2008151511/10A RU 2008151511 A RU2008151511 A RU 2008151511A RU 2477287 C2 RU2477287 C2 RU 2477287C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- igf
- deletion
- polypeptide according
- higf
- peptide
- Prior art date
Links
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 title claims abstract description 137
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 title description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 172
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 130
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 122
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 86
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 86
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 86
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 63
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 19
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 claims description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000017445 musculoskeletal system disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 abstract description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 abstract 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 50
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 46
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 40
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 28
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 20
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 20
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 17
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 17
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 17
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 17
- 241000894007 species Species 0.000 description 17
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 11
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 8
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 7
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 7
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102220472274 Eukaryotic translation initiation factor 4E transporter_R36A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- STJMRWALKKWQGH-UHFFFAOYSA-N clenbuterol Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)C1=CC(Cl)=C(N)C(Cl)=C1 STJMRWALKKWQGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960001117 clenbuterol Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 6
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 6
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 6
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 4
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 4
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 206010028311 Muscle hypertrophy Diseases 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000012042 muscle hypertrophy Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 3
- -1 phospho Chemical class 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 3
- IBSQPLPBRSHTTG-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-methylbenzene Chemical compound CC1=CC=CC=C1Cl IBSQPLPBRSHTTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 208000024806 Brain atrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 101100545204 Danio rerio zdhhc18a gene Proteins 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 2
- 102400000442 Ghrelin-28 Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001044927 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 102100022708 Insulin-like growth factor-binding protein 3 Human genes 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 2
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 101150018368 Pigv gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical group 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000000276 sedentary effect Effects 0.000 description 2
- 239000000849 selective androgen receptor modulator Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003974 3-carbamimidamidopropyl group Chemical group C(N)(=N)NCCC* 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000252355 Acipenser ruthenus Species 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000015374 Central core disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000840566 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100029225 Insulin-like growth factor-binding protein 5 Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100022745 Laminin subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004472 Myostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 1
- 206010061533 Myotonia Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 244000235659 Rubus idaeus Species 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026214 Skeletal muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric Acid Chemical class [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002264 animal mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001088 anti-asthma Effects 0.000 description 1
- 230000000947 anti-immunosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000924 antiasthmatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000000544 articulatio talocruralis Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229940127225 asthma medication Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940064804 betadine Drugs 0.000 description 1
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000476 body water Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 1
- 229960001736 buprenorphine Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000007303 central core myopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 201000006815 congenital muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 201000009338 distal myopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000020937 fasting conditions Nutrition 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 206010021654 increased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006609 metabolic stress Effects 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 206010028320 muscle necrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003365 myofibril Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 229940070020 other anabolic agent in atc Drugs 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 238000000554 physical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009596 postnatal growth Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 229940116540 protein supplement Drugs 0.000 description 1
- 235000005974 protein supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000025185 skeletal muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 150000003385 sodium Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000021510 thyroid gland disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pulmonology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению модифицированных белков IGF-1, и может быть использовано в медицине. Сконструирован полипептид, содержащий человеческий белок-предшественник IGF-1, в котором аминокислоты G1, Р2 и ЕЗ удалены в результате делеции или аминокислота Е3 удалена в результате делеции и в котором аминокислота R37 изменена на аланин и аминокислоты R71 и R72 удалены в результате делеции. При этом отщепление Е-пептида от IGF-1 с помощью протеазы снижено в результате указанных модификаций. Полученный полипептид используют для лечения заболевания костно-мышечной системы, диабета, состояний, ассоциированных с гибелью нейронов, анемии, хронического обструктивного заболевания легких и ожогового поражения. Изобретение позволяет получить стабилизированные полипептиды, содержащие модифицированную последовательность предшественника IGF-1, в которых снижено встречающееся в естественных физиологических условиях отщепление Е-пептида от IGF1. 13 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 82 пр.
Description
Предпосылки создания изобретения
Инсулиноподобные факторы роста (IGF) являются частью комплексной системы, которую клетки используют для связи с их физиологическим окружением. Эта комплексная система (которую часто называют осью инсулиноподобных факторов роста) состоит из двух расположенных на клеточной поверхности рецепторов (IGF-1R и IGF-2R), двух лигандов (IGF-1 и IGF-2), семейства, состоящего из шести обладающих высокой аффинностью к связыванию IGF белков (IGFBP 1-6), и ассоциированных с IGFBP расщепляющих ферментов (протеаз). Эта система важна не только для регуляции нормальной физиологической функции, она участвует также в некоторых патологических состояниях (Glass, Nat Cell Biol 5, 2003, с.87-90).
Установлено, что ось IGF играет роль в усилении клеточной пролиферации и ингибировании клеточной гибели (апоптоз). IGF-1 секретируется главным образом печенью в результате стимуляции человеческим гормоном роста (hGH). IGF-1 оказывает воздействие почти на все клетки в человеческом организме, прежде всего на клетки в мышцах, хрящах, костях, печени, почках, нервах, коже и легких. Помимо инсулиноподобного действия, IGF-1 может регулировать также рост клеток. IGF-1 и IGF-2 регулируются семейством генных продуктов, которые известны как IGF-связывающие белки. Эти белки способствуют модуляции действия IGF сложными путями, которые включают как ингибирование действия IGF в результате предотвращения связывания с IGF-рецепторами, так и усиление действия IGF благодаря «помощи» в переносе к рецепторам и удлинению времени полужизни IGF в кровотоке. Существует по меньшей мере шесть обладающих способностью к связыванию с IGF белков (IGFBP1-6).
В своей зрелой форме человеческий IGF-1 (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa; SEQ ID NO:1), который называют также соматомедином, представляет собой небольшой состоящий из 70 аминокислот белок, который, как установлено, стимулирует рост широкого разнообразия клеток в культуре. Кодирование зрелого белка инициируется тремя известными полученными в результате сплайсинга вариантами мРНК. Открытая рамка считывания каждой мРНК кодирует белок-предшественник, содержащий 70 аминокислот IGF-1 и конкретный Е-пептид на С-конце, в зависимости от конкретной мРНК IGF-1. Эти Е-пептиды, которые обозначены как Еа-пептид (rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO:2), Eb-пептид (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk; SEQ ID NO:3) и Ес-пептид (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; SEQ ID NO:4), состоят из 35-87 аминокислот и содержат общую последовательность на N-конце и вариабельную последовательность на С-конце. Например, открытая рамка считывания дикого типа IGF-1-Ea кодирует состоящий из 105 аминокислот полипептид (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssrrapqtgivde cfrscdirrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO:5). При экспрессии в физиологических условиях Е-пептиды отщепляются от предшественника с помощью эндогенных протеаз с образованием зрелого состоящего из 70 аминокислот IGF-1, который, как известно, обладает биологической активностью. Установлено, что в определенных ситуациях 1-3 N-концевых аминокислот IGF-1 отщепляются в физиологических условиях с образованием активного IGF-1, который состоит из 67-70 аминокислот. Экспрессия и процессинг гена IGF-2 характеризуются сходными особенностями за исключением наличия только одного Е-пептида (rdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggap pemasnrk; SEQ ID NO:6), который был идентифицирован в состоящем из 156 аминокислот предшественнике IGF-2 (ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrscdlalletycatpakserdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk; SEQ ID NO:7). Как IGF-1, так и IGF-2, по-видимому, обладают неудовлетворительными свойствами в качестве лекарственных средств-кандидатов, поскольку эти белки быстро расщепляются эндогенными протеазами в сыворотке пациентов. Одной из возможных стратегий является стабилизация IGF-1 с получением лекарственного средства путем образования комплекса с одним из связывающихся с ним белков.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что белок-предшественник IGF-1 или IGF-2, который содержит практически соответствующий ему Е-пептид, является биологическим активным и стабилизированным в присутствии сыворотки, что приводит к образованию полипептида IGF-1 или IGF-2, который можно применять в качестве фармацевтического средства. В композициях, предлагаемых в изобретении, не происходит имеющее место в естественных условиях (нормальное) отщепление Е-пептида от IGF-1, например, в результате мутации или делеции либо аргинина в положении 1, либо серина в положении 2 Е-пептидов (что соответствует положениям 71 и 72 в предшественнике IGF-1 дикого типа). В IGF-2 отщепление не происходит, например, в результате мутации или делеции или аргинина в положении 1, или аспарагиновой кислоты в положении 2 Е-пептида (что соответствует положениям 68 и 69 в предшественнике IGF-2 дикого типа). Другие модификации в белке-предшественнике IGF могут приводить к аннулированию или снижению указанного расщепления.
Кроме того, дополнительные модификации аминокислотой последовательности предшественника IGF-1 могут придавать дополнительные ценные фармацевтические свойства. Например, полипептиды, предлагаемые в изобретении, могут обладать повышенной аффинностью к рецептору IGF-1 или пониженной способностью к связыванию с ингибирующим IGF-1 или IGF-2 связывающимся белком.
Для ясности и единообразия нумерация аминокислотных остатков в предшественниках или зрелых белках IGF-1 или IGF-2 в контексте настоящего описания и в формуле изобретения основана на нумерации в последовательности белка-предшественника дикого типа без сигнального пептида.
Таким образом, изобретение относится к полипептиду, содержащему человеческий белок-предшественник IGF-1, в котором отщепление Е-пептида от IGF-1 протеазой снижено в результате модификации белка-предшественника. Е-пептид может представлять собой Еа-, Eb- или Ес-пептид. На N-конце предшественника аминокислоты G1, P2 или Е3 белка-предшественника могут быть удалены в результате делеции или изменены в результате мутации, например, могут представлять собой R36 (например, R36A) и R37 (например, R37A).
Белок-предшественник может дополнительно включать консенсусную последовательность N-связанного гликозилирования NXS/T, например, в результате встраивания аминокислот 93-102, характерных для Еа-пептида, между аминокислотами N95 и Т96 Eb-пептида. В целом, белок-предшественник может включать олигосахарид, ковалентно связанный с боковой цепью аминокислоты белка-предшественника, такой как боковая цепь аргинина белка-предшественника.
Кроме того, остатки белка-предшественника можно заменять на не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты (например, на аминокислоты, которые содержат ацетиленовую группу или азидогруппу). Такие не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты могут облегчать связывание поли(этиленгликольного) звена с боковой цепью белка-предшественника, хотя в данной области хорошо известны общепринятые стратегии пэгилирования белков.
Белок-предшественник может включать также один или несколько дополнительных Е-пептидов, сцепленных с С-концом белка-предшественника. Например, полипептид может включать в направлении от N-конца к С-концу (1) белок-предшественник IGF-1, который несет первый Eb-пептид, в котором G1, Р1 и Е1 удалены в результате делеции либо R36, либо R37, либо обе аминокислоты изменены в результате мутации, R71 и S72 удалены в результате делеции и последние семь С-концевых аминокислот первого Eb-пептида удалены в результате делеции; (2) второй Eb-пептид, при этом R71, S72 и последние семь С-концевых аминокислот второго Eb-пептида удалены в результате делеции; (3) третий Eb-пептид, при этом R71, S72 и последние семь С-концевых аминокислот третьего Eb-пептида удалены в результате делеции; и (4) четвертый Eb-пептид, в котором R71 и S72 удалены в результате делеции.
Эффективным путем предупреждения отщепления Е-пептида от IGF-1 является делеция или мутация R71 или S72.
Аналогично этому изобретение относится к человеческому белку-предшественнику IGF-2, в котором отщепление Е-пептида от IGF-2 протеазой снижают путем модификации белка-предшественника. В частности, делеция или мутация R68 или D69 могут представлять собой эффективные пути аннулирования протеазного расщепления белка-предшественника GF-2.
Кроме того, любой Е-пептид IGF-1 можно объединять с IGF-2 и любой Е-пептид IGF-2 можно объединять с IGF-1 с получением указанных в настоящем описании благоприятных действий.
Изобретение относится также к способу лечения заболеваний костно-мышечной системы, диабета, гибели нейронов, заключающемуся в том, что вводят в эффективном количестве полипептид, предлагаемый в изобретении. Изобретение относится также к применению полипептида, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для лечения заболеваний костно-мышечной системы, диабета, гибели нейронов или анемии.
Другим вариантом осуществления изобретения является пэгилированный IGF-1, который не содержит Е-пептид, но в который интродуцирована не встречающаяся в естественных условиях аминокислота в качестве сайта пэгилирования. Под объем изобретения подпадает также любой модифицированный, пэгилированный IGF-1, который содержит не встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, указанную в настоящем описании, без Е-пептида.
В изобретении описаны также применяемые в ветеринарии способы и варианты введения полипептида, предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для получения требуемого действия.
Применение в ветеринарии включает (I) увеличение скорости роста и/или размера животного, (II) повышение эффективности превращения корма в ткани организма, (III) увеличение производства молока у животных на стадии лактации, (IV) лечение животного, имеющего симптомы, связанные с кахексией, травмой или другими ассоциированными с истощением заболеваниями, и (V) лечение находящихся на стадии лактации животных для улучшения здоровья новорожденных.
Все процитированные ссылки или документы включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1А-1В - результаты Вестерн-блоттинга полипептидов, предлагаемых в изобретении, и предшественника IGF-1 дикого типа после отсутствия инкубации (0 ч) или 16-часовой инкубации в присутствии 10% человеческой сыворотки или без нее при 37°С. Экспрессионными векторами, кодирующими различные конструкции IGF-1, трансфектировали клетки линии Cos7 и получали кондиционированную среду. Обозначение «3mut» относится к предшественнику, представляющему собой hIGF-1-Е-пептид, который имеет следующие три набора модификаций: делецию G1, P2 и Е3; мутацию, приводящую к замене Arg 37 на Ala (R37A); и делецию R71 и S72. На фиг.1А показаны результаты Вестерн-блоттинга (с использованием антитела к IGF-1) полипептида дикого типа и 3mut-предшественника, который содержит Еа. На фиг.1Б показаны результаты Вестерн-блоттинга (с использованием антитела к hIGF-1) полипептида дикого типа и 3mut-предшественника, который содержит Eb. На фиг.1В показаны результаты Вестерн-блоттинга (с использованием антитела к hIGF-1) полипептида дикого типа и 3mut-предшественника, который содержит Ее;
на фиг.2А-2Г - линейные графики, демонстрирующие биологическую активность различных полипептидов IGF-1 («лиганды»). Биологическую активность оценивали путем стимуляции миобластов С2С12 полипептидами, экспрессируемыми Cos7-клетками. Затем в стимулированных С2С12-клетках анализировали относительные количества общей АКТ и фосфорилированной АКТ. Long-R3-IGF-1 представляет собой поступающий в продажу реагент (фирма Sigma, продукт №1-1271), который состоит из зрелой человеческой аминокислотой последовательности IGF-1 с мутацией E3R и с добавлением N-концевого состоящего из 13 аминокислот удлиняющего пептида. На фиг.2А показаны данные об активности IGF-1-Ea3mut. На фиг.2Б показаны данные об активности IGF-1-Eb3mut. На фиг.2В приведены данные об активности IGF-1-Eab3mut, представляющего собой несущую 3mut конструкцию, в которой аминокислоты 93-102 Еа встроены между аминокислотами 95 и 96 Eb. На фиг.2Г показаны данные об активности IGF-1-Ec3mut;
на фиг.3А-3Г и 4А-4Г - линейные графики, позволяющий определять сохраняют ли полипептиды-предшественники IGF-1, предлагаемые в изобретении, селективность по отношению к соответствующему рецептору при анализе фосфорилирования рецептора в ответ на связывание с лигандом. На фиг.3А и 3Б представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Ea3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.3А) и инсулиновым рецептором (фиг.3Б). На фиг.3В и 3Г представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Eb3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.3 В) и инсулиновым рецептором (фиг.3Д). На фиг.4А и 4Б представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Ec3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.4А) и инсулиновым рецептором (фиг.4Б). На фиг.4В и 4Г представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Eab3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.4В) и инсулиновым рецептором (фиг.4Д). «IGF1-R3» обозначает описанный выше Long-R3-IGF-1. Полипептид, обозначенный как «IGF1Eab», представляет собой конструкцию, в которой аминокислоты 93-102 Еа встроены между аминокислотами 95 и 96 Eb;
на фиг.5 - результаты Вестерн-блоттинга, демонстрирующие относительное фосфорилирование АКТ после стимуляции мышечных трубочек линии С2С12 (в результате дифференцировки в течение 3-4 дней миоцитов С2С12) различными лигандами. Понятие «мультимеры IGF-1Eb» используют для обозначения конструкции, изображенной схематически на фиг.6А;
на фиг.6А и 6Б - схематические изображения двух полипептидов, предлагаемых в изобретении. На фиг.6А показан полипептид-предшественник IGF-1-Eb с 4 наборами модификаций: делеция G1, P2 и Е3; мутация, приводящая к замене R37 на А; делеция R71 и S72 и делеция последних семи С-концевых аминокислот. Кроме того, полипептид удлинен путем добавления еще двух Eb-пептидов (но без R71 и S72 и без последних семи С-концевых аминокислот) и добавления последнего Eb-пептида (но без R71 и S72) на С-конец полипептида. Эту конструкцию часто обозначают как мультимер IGF-1-Eb. На фиг.6Б показан полипептид-предшественник IGF-1-Eab с 4 наборами модификаций: делеция Gl, P2 и Е3; мутация, приводящая к замене R37 на А; делеция R71 и S72 и инсерция аминокислот 93-102 Еа между аминокислотами 95 и 96 Eb;
на фиг.7А - сравнительный анализ последовательности человеческого IGF-1 (SEQ ID NO:1) и последовательности IGF-1 соответствующего животного. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. G1, P2, Е3 являются консервативными для всех проанализированных видов, кроме стерляди (в последовательности этого вида S2 заменен на P2). R36 и R37 являются консервативными для всех проанализированных видов;
на фиг.7Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого IGF-1 (SEQ ID NO:1). Под филогенетическим деревом изображена шкала, на которой указано количество «аминокислотных замен» на 100 остатков белковых последовательностей. Для расчета величин расстояний используют предназначенную для этой цели формулу Кимура (Kimura), полученную на основе данных о количестве не входящих в брешь ошибочных спариваний и скорректированную с учетом молчащих замен. Полученные с помощью компьютерной обработки величины представляют собой среднее значение различий на сайт и находятся в диапазоне от 0 до 1. Ноль обозначает полную идентичность, а 1 обозначает отсутствие идентичности. На шкале филогенетического дерева эти величины умножены на 100;
на фиг.8А - сравнительный анализ последовательностей человеческого Еа-пептида (SEQ ID NO:2) и Еа-пептидов различных животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R71 и S72 являются консервативными для всех проанализированных видов;
на фиг.8Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Еа-пептида IGF-1 (SEQ ID NO:2);
на фиг.9А - сравнительный анализ последовательностей человеческого Eb-пептида (SEQ ID NO:3) и Eb-пептидов различных животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R71 и S72 являются консервативными для всех проанализированных видов;
на фиг.9Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Eb-пептида IGF-1 (SEQ ID NO:3);
на фиг.10А - сравнительный анализ последовательностей человеческого Ес-пептида (SEQ ID NO:4) и Ес-пептидов различных животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей, R71 и S72 являются консервативными для всех проанализированных видов;
на фиг.10Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Ес-пептида IGF-1 (SEQ ID NO:4);
на фиг.11А - сравнительный анализ последовательности человеческого IGF-2 (SEQ ID NO:7) и соответствующих последовательностей IGF-2 различных видов животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R68 является консервативным для всех проанализированных видов; D69 является консервативным для всех видов, кроме шимпанзе, в последовательности этого вида в этом положении находится остаток гистидина;
на фиг.11Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого IGF-2 (SEQ IDNO:7);
на фиг.12А - сравнительный анализ последовательности человеческого Е-пептида IGF-2 (SEQ ID NO:6) и Е-пептидов IGF-2 различных видов животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R68 является консервативным для всех проанализированных видов; D69 является консервативным для всех видов, кроме шимпанзе, в последовательности этого вида в этом положении находится остаток гистидина;
на фиг.12Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Е-пептида IGF-2 (SEQ ID NO:6).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым полипептидам-предшественникам IGF-1 и IGF-2, которые содержат практически соответствующий им Е-пептид, модифицированный для предупреждения, снижения или аннулирования типичного протеазного расщепления, ответственного за отделение активной формы IGF-1 или IGF-2 от ее Е-пептидов. Возможность применения полипептидов, предлагаемых в изобретении, основана на неожиданно установленном при создании изобретения факте, что такие полипептиды-предшественники обладают биологической активностью, стабильностью и благоприятным действием в качестве фармацевтических средств.
Скрининг полипептидов-предшественников IGF в отношении биологической активности
Возможность применения любого полипептида, предлагаемого в изобретении, можно оценивать с помощью следующих анализов.
Стабильность - Полипептид, предлагаемый в изобретении, должен обладать достаточной стабильностью в присутствии эндогенных протеаз, таких как протеазы, входящие в состав человеческой сыворотки, для того чтобы представлять собой эффективное лекарственное средство. Для оценки стабильности экспрессионным вектором, который кодирует полипептид, можно трансфектировать клетки линии Cos7 (ATCC) в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культуральную среду, содержащую секретируемые полипептиды, можно применять для дополнительных анализов, или в другом варианте экспрссионный вектор может кодировать легко доступные метки, такие как гекса-гистидиновую метку, вместе с полипептидом для облегчения эффективной очистки экспрессируемых полипептидов в культурах Cos7-клеток. Вне зависимости от пути получения образец полипептида инкубируют в сыворотке здорового человека (фирма Sigma) или в ЗФР в течение различных промежутков времени (например, 0, 1, 5, 10 и 16 ч), анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, блоттируют на нитроцеллюлозу и соответствующие белки, визуализируют с помощью первичного антитела к IGF-1 или IGF-2 и вторичного антитела, например, конъюгированного с пероксидазой из хрена. Можно использовать любые многочисленные аналогичные методы блоттинга и обнаружения, в некоторых из которых используются флуоресцентные красители или даже радионуклиды. Интенсивность полосы, соответствующей предшественнику, по сравнению с интенсивностью полосы, соответствующей IGF-1 или IGF-2, должна свидетельствовать о степени расщепления предшественника в различных условиях. Полипептид, предлагаемый в изобретении, обработанный человеческой сывороткой в течение 16 ч при 37°С, может характеризоваться соотношением нерасщепленного предшественника и расщепленного зрелого IGF, составляющим примерно от 1:2 до 1:0,1, например примерно от 1:1 до 1:0,5, в частности соотношением примерно 1:1 или соотношением примерно 1:0,5. Как правило, предшественник должен присутствовать в соотношении, составляющем по меньшей мере 1:1.
Фосфорилирование АКТ - Полипептид, предлагаемый в изобретении, должен сохранять способность передавать сигнал через рецептор IGF-1 (сигналы и IGF-1, и IGF-2 передаются через рецептор IGF-1). Для определения указанной способности осуществлять передачу сигнала можно оценивать фосфорилирование находящейся по ходу передачи сигнала внутриклеточной мишени, т.е. АКТ, в ответ на связывание лиганда на поверхности клетки. Для анализа фосфорилирования АКТ биобласты линии С2С12 выращивают в условиях «голодания» в бессывороточной среде, а затем стимулируют различными лигандами. Клетки лизируют и осветляют центрифугированием. Фосфорилирование АКТ и уровни общей АКТ анализируют с помощью ELISA с использованием набора для двухвалентного (сэндвич) ELISA PathScan phospho АКТ (Ser473) и набора для двухвалентного ELISA PathScan АКТ (фирма Cell Signaling) соответственно.
Специфичность в отношении рецептора IGF-1 - Полипептид, предлагаемый в изобретении, предпочтительно сохраняет специфичность в отношении рецептора IGF-1 и должен связываться с родственным инсулиновым рецептором с низкой аффинностью. Для оценки специфичности в отношении рецептора образцы полипептида добавляют к выращенным в бессывороточной среде NIH3T3-клеткам, сверхэкспрессирующим рецептор IGF-1 или инсулиновый рецептор, и уровни фосфорилирования рецептора IGF-1 или фосфорилирования инсулинового рецептора определяют, лизируя клетки и подвергая лизаты анализу с помощью ELISA с использованием человеческого фосфорилированного IGF-1-рецептора и ELISA-набора для инсулинового рецептора (фирма R&D Systems).
Оценка гипертрофии in vivo на мышиных моделях - Для решения вопроса о том, может ли полипептид, предлагаемый в изобретении, повышать массу скелетных мышц в условиях, которые уже приводят к мышечной гипертрофии, можно подвергать обработанных и необработанных животных физической нагрузке и определять будет ли у обрабатываемых полипептидом животных образовываться больше мышечной массы по сравнению с необработанными животными.
Модели физической нагрузки
Одна из известных в данной области моделей основана на применении вращающегося колеса, движение которого определяется той нагрузкой, которую прикладывает к нему животное без дополнительного принуждения (см., например, Konhilas и др. Am J Physiol Heart Circ Physiol 289, 2005, с.455-465). Находящееся в клетке колесо, которое животное вращает без дополнительного принуждения, позволяет устранять инсульты, связанные с физическим и психологическим состоянием, которые характерны для моделей с принудительной нагрузкой, и поэтому является приемлемой моделью для оценки лекарственных средств-кандидатов, которые можно применять для относительно здоровых особей, для которых повышение мышечной массы является желательным.
Можно применять любую пригодную линию мышей. Например, можно произвольно разделять самцов мышей линии C57B1/6J на экспериментальную (например, получающую полипептид-предшественник IGF) и контрольную группы. Животных помещают по отдельности в клетку с колесом для физических упражнений; ведущих «малоподвижный образ жизни» контрольных животных помещают в идентичные клетки без колеса. Колесо для физических упражнений описано у Allen и др. J Appl Physiol 90, 2001. с.1900-1908. В целом, система состоит их колеса диаметром 11,5 см с поверхностью для пробега шириной 5,0 см (модель 6208, фирма Petsmart, Феникс, шт. Аризона), которая снабжена цифровым магнитным счетчиком (модель ВС 600, фирма Sigma Sport, Олни, шт. Иллинойс), который активируется при вращении колеса. Кроме того, каждое колесо снабжено обеспечивающим сопротивление механизмом, который позволяет регулировать нагрузку. Для этой цели присоединяют леску из нержавеющей стали к верхней части клетки и наматывают проволоку на неподвижный шкив, который закрепляют на находящемся в клетке колесе на оси вращения, так что это не влияет на прилагаемую к колесу нагрузку. Проволоку снова закрепляют в верхней части клетки с помощью пружины и винта. Такая конструкция позволяет осуществлять точную регулировку нагрузки на колесо, которая равномерно распределяется во время вращения колеса. Ежедневно регистрируют продолжительность физической нагрузки и расстояние, которое пробегает каждое животное, находящееся в условиях, позволяющих осуществлять физическую нагрузку, в течение всего периода выдерживания в указанных условиях. Все животные имели свободный доступ к воде и стандартному твердому корму для грызунов. Во всех группах пробег без дополнительного принуждения (нахождение в клетке с колесом) можно начинать с использованием мышей, возраст которых составляет в среднем примерно 12 недель. Каждая группа животных продолжала бегать в условиях различного сопротивления в зависимости от экспериментальной группы в течение 50 дней до достижения животными возраста примерно 19 недель. Нагрузку колеса определяли путем подвешивания на колесо грузов известной массы до тех пор, пока колесо слегка не смещалось. Все группы, находящиеся в условиях физической нагрузки, сначала в течение первой недели имели колесо в клетке без дополнительной нагрузки. Однако условия «без нагрузки» фактически представляли собой нагрузку в 2 г, которую определяли как нагрузку, необходимую для поддержания в колесе силы инерции и трения. Учитывая, что период акклиматизации к колесу составлял 1 неделю, нагрузку колеса можно было изменять с интервалами в одну неделю за исключением более высоких нагрузок, которые можно было изменять через 2 недели. Изменение нагрузок может составлять от 2 г вплоть до 12 г. Находящихся в условиях нагрузки и контрольных ведущих «малоподвижный образ жизни» животных умерщвляли под ингаляционным наркозом путем смещения шеи сразу после окончания конкретного периода нахождения в условиях нагрузки. Определяли вес тела и определенные мышцы быстро вырезали, промывали и замораживали для гистологического или биохимического анализа, которые осуществляли позднее.
Специалистам в данной области известны также альтернативные модели связанной с физической нагрузкой гипертрофии (см., например, модель физической нагрузки с использованием педального вращающегося устройства, которое описано у Lerman и др. J Appl Physiol 92, 2002, с.2245-2255).
Модель, созданная путем инъекции кленбутерола
Кленбутерол представляет собой β2-адренергический агонист, обладающий усиливающими рост свойствами, который, как установлено, вызывает увеличение мышечной массы. Точный механизм действия кленбутерола пока не известен, хотя предполагается снижение расщепления мышечных белков при его применении. В клинических условиях кленбутерол применяют в качестве противоастматического средства, но им, по-видимому, наиболее широко злоупотребляют в качестве структурообразующего агента (агента для бодибилдинга) для повышения мышечной массы как у людей, так и у шоу-животных.
Пяти мышам вводили ежедневно путем инъекции кленбутерол (3 мг/кг, подкожно (s.c.)) в течение 3, 7 или 14 дней для индукции мышечной гипертрофии. Мыши, которым инъецировали ЗФР, служили в качестве отрицательного контроля. Животных обследовали ежедневно (визуальный осмотр) в отношении любых побочных реакций (т.е. неопрятность шерстяного покрова, сонливость) на обработку. Обработка кленбутеролом потенциально может делать мышей более пугливыми или агрессивными, поэтому за мышами, если они помещены в клетки группами, необходимо особенно тщательно следить с позиций из драк друг с другом. Мыши могли свободно двигаться и могли нормально есть и пить. Мышей обследовали ежедневно до их умерщвления в день 3, 7 или 14 и отбирали ткани для дополнительного анализа.
Оценка на моделях мышечной атрофии in vivo - Способность полипептида-предшественника IGF, предлагаемого в изобретении, поддерживать мышечную массу в условиях, которые обычно приводят к снижению мышечной массы, можно оценивать на различных моделях атрофии скелетных мышц. При использовании примеров моделей, описанных ниже, специалист в данной области легко может создавать и осуществлять контролируемые эксперименты, включающие введение и применение полипептидов-предшественников IGF для решения вопроса о том, могут ли указанные полипептиды приводить к увеличению мышечной массы.
Например, самцов мышей линии С57 В16/2 покупали у фирмы The Jackson Laboratories. В начале каждого эксперимента мыши должны были иметь возраст примерно 9 недель. Как правило, мышей помещали в клетки-микроизоляторы с обычным кормом для грызунов. В начале каждого эксперимента мышей взвешивали. В конце каждого эксперимента мышей обычно умерщвляли ингаляционным наркозом с последующим смещением шеи и мышечные ткани собирали для дополнительной обработки. Мышей взвешивали для определения «конечного веса тела». Скелетные мышцы, которые можно получать, представляли собой переднюю большеберцовую мышцу, длинный разгибатель пальцев стопы, камбаловидную мышцу и икроножную мышцу. Произвольно собирали другие ткани, такие как сердце, печень, селезенка, почки, яички и головной мозг. Все мышцы и ткани полностью иссекали и взвешивали на весах, нижний предел которых составлял 0,0001 г. Затем ткани быстро замораживали в жидком азоте для последующей экстракции РНК и белков или быстро замораживали погружением в ОСТ (орто-хлортолуол) на корковом диске. Мышцы, замороженные на корковом диске для последующего получения криосрезов, погружали в изопентан, охлажденный с помощью жидкого азота до образования густой суспензии. Все образцы хранили при -80°С.
Обработка дексаметазоном
Фармакологический метод индукции мышечной кахексии у мышей предусматривает ежедневную внутрибрюшинную инъекцию дексаметазоном в дозе 20 мг/кг. Дексаметазон является синтетическим представителем класса глюкокортикоидных гормонов. Он обладает противовоспалительной и иммуносупрессорной активностью, превышающей по активности гидрокортизон примерно в 40 раз. Дексаметазон применяют для лечения воспаления и аутоиммунных состояний, например ревматоидного артрита. Его дают также страдающим раком пациентам, подвергающимся химиотерапии, для снижения некоторых побочных действий противоопухолевого лечения. Дексаметазон вызывает мышечную атрофию как у мышей, так и у людей.
Мышам инъецировали внутрибрюшинно (ip) дексаметазон в течение 3, 7 или 14 дней. В день окончания опыта животных умерщвляли с помощью CO2 и выделяли мышцы лап. Животных обследовали ежедневно (визуальный осмотр) в отношении любых побочных реакций (т.е. неопрятность шерстяного покрова, сонливость) на обработку. Мыши, как правило, были подвижными и могли нормально есть и пить. Для создания отрицательного контроля мышам инъецировали ЗФР.
Иммобилизация с помощью повязки
Физическое неупотребление различных групп мышц приводит к атрофии этих мышц. Доказано, что фиксация голеностопного сустава («закрепленная пятка» или наложение повязки) является очень эффективным и позволяющим получать воспроизводимые результаты средством индукции физической иммобилизации мускулатуры задних конечностей крыс и мышей.
Для иммобилизации мышей анестезировали изофлуораном. Голеностопный и коленный сустав фиксировали под углом 90° путем наложения повязки из легкого перевязочного материала (VET-LITE) вокруг суставов. Материал замачивали в теплой воде и затем оборачивали конечность, оставляя свободными суставы пальцев стопы и тазобедренный сустав. Суставы поддерживали в положении под углом 90° до высыхания перевязочного материала. Контралатеральные конечности служили в качестве контроля. Мышам давали отойти от наркоза и помещали в обычные клетки-микроизоляторы. Как установлено, перевязка не приводила к повышенному стрессу и животные свободно передвигались в клетке к корму и питью. Однако мышей ежедневно обследовали в отношении побочных действий, которые могут влиять на вес тела, активность и возбудимость.
После наложения на мышей повязки животных ежедневно обследовали для получения гарантий того, что повязка сохраняется на месте, поскольку мыши могут ее изжевывать. Животные могли двигаться, пить и есть после отхода от наркоза, и они не нуждались в специальном ложе, клетках или другой помощи.
Денервация
Как правило, мышей для осуществления денервации анестезировали с помощью газа изофлуорана. С помощью асептических хирургических процедур (три промывки бетадином и конечная промывка этанолом) обнажали правый седалищный нерв в середине бедра и вырезали кусок размером 2-5 мм. Контралатеральная конечность служила в качестве контроля.
Более конкретно, разрез на коже закрывали с помощью кожного зажима и животным инъецировали одну дозу бупренорфина перед тем, как дать им отойти от наркоза. Через 3, 7 или 14 дней после операции животных умерщвляли ингаляционным наркозом с последующим смещением шеи и мышцы (комплекс икроножных мышц, переднюю большеберцовую мышцу, длинный разгибатель пальцев стопы, камбаловидную мышцу) выделяли для гистологических и биохимических анализов.
Поскольку седалищный нерв был рассечен, то соответствующая иннервируемая им конечность становилась неподвижной, индуцируя атрофию скелетных мышц. Несмотря на это, животные могли двигаться, пить и есть после отхода от наркоза, и они не нуждались в специальном ложе, клетках или другой помощи.
Тем не менее, животных обследовали сразу после операции и их отхода от наркоза (1-2 ч). Кроме того, области разреза и общее состояние здоровья животных оценивали в течение 3 дней после операции. Кожный зажим удаляли через 7-10 дней после операции.
Генетические модели
В качестве моделей мышечной атрофии можно использовать также генетически измененных трансгенных мышей. Например, так называемые мини-мыши (Mini Mice) (фирма The Jackson Laboratory, линия №003258) содержат выключающую мутацию («knock out»-мутацию) в гене IGF-1, которая приводит к аномально пониженному постнатальному росту, а также низкому весу тела и росту. Дополнительную информацию можно почерпнуть у Powetl-Braxton и др. Genes Dev 7, 1993, сс.2609-2617. Кроме того, так называемые миди-мыши (Midi Mice) (фирма The Jackson Laboratory, линия №003259) содержат другую мутацию в гене, которая приводит к получению гипоморфного гена, обусловливающего низкий вес взрослых особей и другие сердечно-сосудистые фенотипы. Дополнительную информацию можно почерпнуть у Lembo и др. J Clin Invest 98, 1996, с.2648-2655.
Имеющие решающее значение и необязательные мутации или модификации предшественников IGF
Имеющие решающее значение мутации - Настоящее изобретение основано, в частности, на полученных данных о том, что полипептид-предшественник IGF, который содержит практически соответствующий ему Е-пептид, сохраняет биологическую активность и стабильность в присутствии сыворотки. Для гарантии того, что Е-пептид не отщепляется эндогенными протеазами, мишенью которых является двухосновный протеазный сайт, обычно любую из двух N-концевых двухосновных аминокислот Е-пептида в предшественнике удаляют путем делеции, изменяют путем мутации или маскируют иным образом. В случае MGF-1 эти две аминокислоты представляют собой R71 и S72, а в случае MGF-2 эти первые две аминокислоты представляют собой R68 и D69.
Указанное расщепление могут предупреждать различные модификации:
(1) делеция одного или обоих двухосновных остатков,
(2) мутация одного или обоих двухосновных остатков, приводящая к замене на неосновную аминокислоту, такую как аланин,
(3) инсерция одного или двух неосновных аминокислот между двухосновными остатками,
(4) встраивание сайта гликозилирования около двухосновных остатков, что является достаточным для маскировки протеазного сайта,
(5) сайтнаправленное пэгилирование с применением замены любого из двухосновных остатков или встраивания вблизи или между двухосновными остатками с использованием не встречающейся в естественных условиях аминокислоты, как будет описано ниже.
Кроме того, остатки К68 и К65, вероятно, играют роль в расщеплении IGF-1/Е-пептида; таким образом, мутации или делеции указанных остатков можно применять в сочетании с любой указанной выше тактикой, применяемой в отношении двухосновных аминокислот.
Мутации на N-конце зрелого IGF - В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды-предшественники IGF имеют делеции или мутации нескольких первых N-концевых аминокислот. В случае IGF-1 любые первые три N-концевые аминокислоты можно изымать путем делеции или подвергать мутации, в то время как в случае IGF-2 любые первые шесть N-концевых аминокислот можно изымать путем делеции или подвергать мутации. Было установлено, что определенные N-концевые аминокислоты отщепляются в естественных условиях in vivo, и интродукция указанных мутаций или делеции минимизирует in vivo ассоциации полипептидов, предлагаемых в изобретении, с IGF-связывающими белками (IGFBP). Взаимодействие IGF-1 и IGF-2 с рецептором IGF-1 регулируется IGFBP-белками. Установлено, что все шесть IGFB ингибируют действие IGF (прежде всего IGFBP5), но в некоторых случаях обнаружено стимулирующее действие. По меньшей мере 99% IGF в кровотоке в норме связано с IGFBP. IGFBP, имеющий наиболее высокий уровень в кровотоке в посленатальный период, представляет собой IGFBP3, который может связываться с одинаковой аффинностью и с IGF-1, и с IGF-2. Встречающийся в естественных условиях укороченный IGF-1 (имеющий делецию G1, P2 и Е3) связывается с IGFBP3 в несколько раз с более низкой аффинностью по сравнению с встречающемся в естественных условиях IGF-1. Кроме того, G3 является важным для связывания с IGFBP, a G6 играет аналогичную роль в IGF-2-пептиде.
Таким образом, в случае предшественника hIGF-1 любой из остатков G1, P2 и Е3 можно изымать путем делеции или подвергать мутации либо индивидуально, либо в комбинации. Когда требуется мутация, то можно интродуцировать мутацию, приводящую к замене на аланин. В другом примере в случае предшественника hIGF-2 любой из остатков Р4, S5 и Е6 можно изымать путем делеции или подвергать мутации либо индивидуально, либо в комбинации. Когда требуется мутация, то можно интродуцировать мутацию, приводящую к замене на аланин.
Мутации на остатках 36 и 37 IGF-1 можно расщеплять с помощью сериновых протеаз, присутствующих в человеческой сыворотке. Мутация либо R36, либо R37, приводящая к замене на А, может предупреждать расщепление IGF-1 в этом предсказанном сайте расщепления, находящемся между R36 и R37. В случае hIGF-2 R38 можно подвергать мутации или изымать путем делеции для предупреждения этого оказывающего неблагоприятное воздействие расщепления.
Применение гликозилирования - Время полужизни in vivo полипептидов, предлагаемых в изобретении, можно повышать, добавляя N-связанные сайты гликозилирования либо в IGF, либо во фрагменты Е-пептида-предшественника при экспрессии в клетках млекопитающих или других эукариотических клетках, в которых может проходить N-связанное гликозилирование. Было установлено in vivo, что человеческий IGF-1-Ea является гликозилированным на N92 и N100, поскольку эти фрагменты Еа соответствуют консенсусной последовательности N-связанного сайта гликозилирования N-X-S/T, где Х может обозначать любую аминокислоту, а третья аминокислота триплета представляет собой либо S, либо Т. Известно также, что примыкающий к консенсусу аминокислотный контекст должен оказывать влияние на то, насколько сильно гликозилируется аспарагин. Таким образом, одной из стратегий интродукции сайта гликозилирования в Eb или Ее является встраивание аминокислот Еа вблизи консенсусной последовательности примерно в тот же участок Eb или Ее. Конкретное применение указанной стратегии проиллюстрировано ниже в примерах. В любом случае любую другую консенсусную последовательность N-связанного сайта гликозилирования, включая окружающие контекстные аминокислоты, которая известна специалистам в данной области, можно встраивать в полипептид-предшественник, предлагаемый в изобретении. Кроме того, можно осуществлять O-связанное гликозилирование полипептида, предлагаемого в изобретении, путем выбора конкретного хозяина, применяемого для получения полипептида. Например, применение определенных линий дрожжей для экспрессии IGF-1 приводит к добавлению олигосахаридов к остаткам серина или треонина (см., например, US 5273966).
Добавление поли(этиленгликоля) - Доказано, что конъюгация с поли(этиленгликолем) (ПЭГ; пэгилирование) оказывает благоприятное действие в отношении удлинения времени полужизни терапевтических лекарственных средств. Можно ожидать, что пэгилирование полипептидов-предшественников IGF, предлагаемых в изобретении, может обладать аналогичным преимуществом с позиций фармации. Методы пэгилирования IGF-1 хорошо известны в данной области (см., например, опубликованную заявку на патент США 2006/0154865, в которой описано благоприятное действие конъюгата лизин-монопэгилированный IGF-1). Такое лизин-монопэгилирование можно адаптировать для полипептидов-предшественников IGF, предлагаемых в изобретении. Кроме того, пэгилирование можно осуществлять в любой части полипептида, предлагаемого в изобретении, путем интродукции не встречающихся в естественных условиях аминокислот. Некоторые не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты можно интродуцировать с помощью технологии, описанной у Deiters и др. J Am Chem Soc 125, 2003, с.11782-11783; Wang и Schultz, Science 301, 2003, с.964-967; Wang и др. Science 292, 2001, с.498-500; Zhang и др. Science 303, 2004, с.371-373 или в US 7083970. В целом, для некоторых из указанных систем экспрессии применяли сайтнаправленный мутагенез для интродукции нонсенс-кодона, такого как амбер-кодон TAG, в открытую рамку считывания, которая кодирует полипептид, предлагаемый в изобретении. Такие экспрессионные векторы затем интродуцируют в хозяина, который может использовать тРНК, специфическую для интродуцированного нонсенс-кодона, и «загружают» выбранной не встречающейся в естественных условиях аминокислотой. Конкретные не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты, которые обладают благоприятным действием при их применении в качестве компонентов для конъюгации с полипептидами, предлагаемыми в изобретении, представляют собой аминокислоты с боковыми цепями, которые несут ацетиленовые группы и азидогруппы. Полипептиды-предшественники IGF, которые содержат эти новые аминокислоты, затем можно пэгилировать на указанных выбранный сайтах в белке. Кроме того, такие пэгилированные молекулы IGF, не содержащие Е-пептид, можно применять также в качестве терапевтических агентов.
Мультимеры Е-пептидов - В определенных фармакологических контекстах может требоваться увеличивать размер пептидного или белкового лекарственного средства для гарантии того, что лекарственное средство сохраняется на одной или другой стороне гематоэнцефалического барьера. Поскольку зрелые молекулы IGF представляют собой относительно короткие пептиды, даже в случае, когда в них сохраняется Е-пептид, может оказаться важным увеличивать размер полипептидов, предлагаемых в изобретении. Одним из путей достижения этого является создание мультимеров Е-пептидов на С-конце полипептида-предшественника IGF, что проиллюстрировано в некоторых описанных ниже примерах
С-концевая делеция Е-пептидов - Можно предположить, что наличие свободного цистеина в положении 81 Eb может приводить к гомодимеризации или другим действиям, которые могут приводить к снижению активности полипептидов, предлагаемых в изобретении, в качестве лекарственных средств. Так, делеция или мутация С81 в Eb может оптимизировать активность лекарственного средства. В конкретном варианте благоприятное действие оказывает делеция последних семи аминокислот Eb (т.е. аминокислот 81-87).
Другие мутации или модификации - Дополнительные мутации или модификации IGF, которым можно подвергать полипептиды-предшественники IGF, предлагаемые в изобретении, описаны в US 5077276 и в опубликованных заявках на патент США 2005/0287151, 2006/0211606 и 2006/0166328.
Под объем изобретения подпадают, помимо человеческих IGF-1 и IGF-2, все известные или пока неизвестные последовательности предшественников IGF-1 или IGF-2 животных, кроме человека, которые содержат практически соответствующий им Е-пептид, если имеющее место в естественных условиях отщепление Е-пептида аннулировано или снижено в результате модификаций, предлагаемых в настоящем изобретении.
Предпочтительный для применения тип IGF зависит от видов, подлежащих лечению.
Предпочтительно, чтобы IGF соответствовал виду, для лечения которого его применяют, например, когда лечению подлежат коровы, то предпочтительным типом IGF является бычий IGF.
Хотя, по-видимому, все формы IGF оказывают воздействие на различных индивидуумов благодаря высокой гомологии их последовательностей, в соответствующих видах можно избегать потенциальных нежелательных иммунологических осложнений, которые являются результатом индукции иммунного ответа на IGF из других видов.
Одним из вариантов осуществления изобретения являются модифицированные последовательности предшественников IGF-1 из животных, кроме человека.
Предпочтительными являются последовательности предшественников IGF-1 из позвоночных животных, которые содержат практически соответствующий им Е-пептид, в которых имеющее место в естественных условиях отщепление Е-пептида аннулировано или снижено в результате модификаций, предлагаемых в настоящем изобретении.
Примерами таких последовательностей являются (но, не ограничиваясь только ими) последовательности мышей, крыс, коров, свиней, лошадей, овец, коз, птиц, собак, кошек, рыб и т.п., полученные из любого источника, в том числе естественного, синтетического или рекомбинантного.
Другим вариантом осуществления изобретения являются модифицированные последовательности предшественников IGF-2 из животных, кроме человека.
Предпочтительными являются последовательности предшественников IGF-2 из позвоночных животных, которые содержат практически соответствующий им Е-пептид, в которых имеющее место в естественных условиях отщепление Е-пептида аннулировано или снижено в результате модификаций, предлагаемых в настоящем изобретении.
Примерами таких последовательностей являются (но не ограничиваясь только ими) последовательности мышей, крыс, коров, свиней, лошадей, овец, коз, птиц, собак, кошек, рыб и т.п., полученные из любого источника, в том числе естественного, синтетического или рекомбинантного.
Терапевтическое применение полипептидов-предшественников IGF
Показания - Изобретение относится также к применению полипептида-предшественника IGF, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения заболеваний костно-мышечной системы. Кроме того, изобретение относится также к применению полипептидов-предшественников IGF для повышения мышечной или костной массы у индивидуума вне зависимости от того, имеет или не имеет индивидуум риск развития заболевания костно-мышечной системы или имеет или не имеет заболевание костно-мышечной системы.
В частности, заболевание костно-мышечной системы может представлять собой мышечную атрофию. Известно много типов мышечной атрофии, в том числе являющейся результатом лечения глюкокортикоидами, такими как кортизол, дексаметазон, бетаметазон, преднизон, метилпреднизолон или преднизолон. Мышечная атрофия может являться результатом денервации, вызванной травмой нерва или дегенеративной, метаболической или воспалительной невропатии (например, синдром Гийена-Барре, периферическая невропатия или воздействие находящихся в окружающей среде токсинов или лекарственных средств). Кроме того, мышечная атрофия может быть результатом заболевания моторных нейронов у взрослых, детской атрофии спинных мышц, юношеской атрофии спинных мышц, аутоиммунной моторной невропатии с многоочаговой проводниковой блокадой, паралича, связанного с «ударом» или повреждением спинного мозга, скелетной иммобилизацией из-за травмы, пролонгированного пребывания на постельном режиме, добровольной пониженной активности, принудительной пониженной активности, метаболического стресса или недостаточности питательных веществ, рака, СПИДа, голодания, острого некроза скелетных мышц, заболевания щитовидной железы, диабета, доброкачественной врожденной гипотонии, заболевания центрального ядра, немалиновой (непрогрессирующей врожденной нитеобразной) миопатии, миопатии (центронуклеарной) мышечных трубочек, ожогового повреждения, хронического обструктивного заболевания легких, болезни печени, сепсиса, почечной недостаточности, застойной сердечной недостаточности или старения.
Заболевание костно-мышечной системы может быть связано с синдромом мышечной дистрофии, таким как симптом Дюшенна, симптом Беккера, миотония, плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия, мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса, глазофарингеальная мышечная дистрофия, лопаточно-лицевая мышечная дистрофия, тазово-плечевая мышечная дистрофия, врожденная мышечная дистрофия или приобретенная дистальная миопатия. Заболевание костно-мышечной системы может представлять собой также остеопороз, перелом кости, низкий рост или карликовость.
Предполагается, что IGF-1 можно применять для лечения нечувствительного к инсулину диабета, поскольку IGF-1 может связываться также с гетеродимерами рецептора IGF-1 и инсулинового рецептора. Таким образом, полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения диабета.
IGF-1 обладает нейротрофным действием и удлиняет продолжительность существования нейронов. Было высказано предположение о том, что IGF-1 можно применять для лечения случаев гибели моторных нейронов, что характерно для амиотрофического бокового склероза (ALS), атрофии головного мозга, старения и деменции. Таким образом, полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения состояний, ассоциированных с гибелью нейронов, таких как ALS, атрофия головного мозга или деменция.
IGF-1 повышает популяции как лейкоцитов, так и эритроцитов и обладает аддитивным действием при введении в сочетании с эритропоэтином. Таким образом, полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения анемии.
Поскольку IGF-1 и IGF-2 являются широко распространенными и основными регуляторами деления клеток и роста позвоночных животных, может оказаться целесообразным применять их в различных ветеринарных методах для экзогенного усиления или поддержания роста животных. Примерами такого применения являются (но не ограничиваясь только ими):
(I) увеличение скорости роста и/или размера животного, например ускорение увеличение мышечной ткани у свиней, крупного рогатого скота, домашней птицы и рыбы;
(II) повышение эффективности превращения корма в ткани организма (соотношение тощей массы и жировой массы), например, у свиней, крупного рогатого скота, овец, домашней птицы и рыбы; и
(III) увеличение производства молока у животных на стадии лактации, например молочного крупного рогатого скота, овец, коз.
Другие ветеринарные терапевтические применения включат (но не ограничиваясь только ими):
(IV) лечение животного, имеющего симптомы, связанные с кахексией, травмой или другими связанными с истощением заболеваниями, например животных-компаньонов, таких как собаки, кошки и лошади; и
(V) лечение находящихся на стадии лактации животных для улучшения здоровья новорожденных, например находящихся на стадии лактации свиноматок для улучшения характеристик новорожденных.
Методы введения - Полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно вводить различными путями, включая применение носителей для введения генов. Для введения в терапевтических целях полипептида, предлагаемого в изобретении, можно применять методы, известные в данной области для терапевтического введения таких агентов, как белки или нуклеиновые кислоты, например такие методы, как трансфекция клеток, генная терапия, непосредственное введение в помощью наполнителя, применяемого для введения, или фармацевтически приемлемого носителя, непрямое введение с помощью рекомбинантных клеток, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.
В данной области известны различные системы введения и их можно применять для введения полипептида, предлагаемого в изобретении, такие, например, как капсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, обладающие способностью экспрессировать белок, опосредуемый рецептором эндоцитоз (см., например, Wu и Wu, J Biol Chem 262, 1987, с.4429-4432), конструирование нуклеиновых кислот в качестве части векторов на основе ретровирусов, аденоассоциированных вирусов, аденовирусов, поксивирусов (например, птичьего поксивируса, прежде всего поксивируса домашней птицы) или других векторов и т.д. Методы интродукции могут быть энтеральные или парентеральные и представляют собой (но не ограничиваясь только ими) внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, легочный, интраназальный, внутриглазной, эпидуральный и оральный пути. Полипептиды можно вводить с помощью любого удобного пути, например путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальную или слизисто-кожную выстилку (например, слизистую оболочку рта, ректальную или кишечную слизистую оболочку и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, может оказаться желательным интродуцировать фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, в центральную нервную систему с помощью любого приемлемого пути, включая внутрижелудочковую и подоболочечную инъекцию; внутрижелудочковую инъекцию можно облегчать, используя внутрижелудочковый катетер, например, прикрепленный к резервуару, такому как резервуар Оммайя. Легочное введение можно осуществлять также с помощью, например, ингалятора или распылителя и в виде препаративной формы, содержащей пропеллент.
В конкретном варианте осуществления изобретения может требоваться местное введение фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении, в область, подлежащую лечению; для этой цели можно использовать (но не ограничиваясь только ими) местную инфузию в процессе хирургической операции, местное нанесение, например, путем инъекции, с помощью катетера или с помощью имплантата, имплантат можно изготавливать из пористого, непористого или желеобразного материала, включая мембраны, такие как сиаластические мембраны, волокна или поступающие в продажу заменители кожи.
В другом варианте осуществления изобретения действующее вещество можно вводить в пузырьке, прежде всего в липосоме (см. Langer, Science 249, 1990, с.1527-1533). Еще в одном варианте осуществления изобретения действующее вещество можно вводить с помощью системы с контролируемым высвобождением. В одном из вариантов осуществления изобретения можно использовать насос. В другом варианте осуществления изобретения можно использовать полимерные материалы (см. Howard и др. J Neurosurg 71, 1989, с.105). В другом варианте осуществления изобретения, в котором действующее вещество, предлагаемое в изобретении, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, предлагаемый в изобретении, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для усиления экспрессии кодируемого ею белка, создавая ее в качестве части соответствующего нуклеотидного экспрессионного вектора и вводя его так, чтобы он становился внутриклеточным, например применяя ретровирусный вектор (см., например, US 4980286), или путем непосредственной инъекции, или путем применения бомбардировки микрочастицами (например, с помощью генной пушки; Biolistic, фирма Dupont), или нанося покрытие с использованием липидов, или с помощью находящихся на клеточной поверхности рецепторов, или с помощью трансфектирующих агентов, или путем введения в сочетании с гомеобокс-подобным пептидом, для которого известна способность проникать в ядро (см., например, Joliot и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, c.1864-1868) и т.д. В другом варианте нуклеиновую кислоту можно интродуцировать внутрь клетки и включать в ДНК клетки-хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации.
Трансфекция клеток и генная терапия - Настоящее изобретение относится к применению нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, предлагаемые в изобретении, для трансфекции клеток in vitro и in vivo. Эти нуклеиновые кислоты можно встраивать в любой из хорошо известных векторов для трансфекции клеток- или организмов-мишеней. Нуклеиновыми кислотами также трансфектируют клетки ex vivo и in vivo посредством взаимодействия вектора и клетки-мишени. Композиции вводят (например, путем инъекции в мышцу) индивидууму в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать терапевтический ответ.
Другим объектом изобретения является способ лечения области-мишени, т.е. клетки- или ткани-мишени, у человека или другого животного, заключающийся в том, что трансфектируют клетку нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, предлагаемый в изобретении, где нуклеиновая кислота включает индуцибельный промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, которая кодирует обеспечивающий направленный перенос слитый полипептид. Процедуры генной терапии, которые применяют для лечения или предупреждения болезней человека, см., например, у Van Brunt, Biotechnology 6, 1998, с.1149-1154.
Комбинированные терапии - Согласно нескольким вариантам осуществления изобретения полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в сочетании с одним или несколькими дополнительными соединениями или видами терапии. Например, несколько полипептидов можно вводить в сочетании с одним или несколькими терапевтическими соединениями. Комбинированная терапия может предусматривать одновременное или чередующееся введение. Кроме того, комбинацию можно использовать для острого или постоянного применения. Полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно вводить в сочетании с анаболическими агентами, такими как тестостерон или специфические модуляторы андрогенного рецептора (SARM). К другим анаболическим агентам относятся гормон роста (GH) или молекулы, которые индуцируют высвобождение GH. Грелин представляет собой особенно ценный агент для комбинированной терапии кахексии, поскольку грелин может вызывать усиление аппетита. Аналогично этому полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно объединять с белковыми добавками для усиления анаболизма или объединять с физиотерапией для повышения веса тела. Любая молекула, которая ингибирует миостатин, также является кандидатом для комбинированной терапии.
Фармацевтические композиции - Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, которые содержат белок-предшественник IGF, предлагаемый в изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель. Под понятием «фармацевтически приемлемый» подразумевают разрешенный регулирующим органом федерального или государственного управления или включенный в список Фармакопеи США или другой общепринятой фармакопеи как разрешенный для применения на животных или человеке. Понятие «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым осуществляют введение терапевтического средства. Указанные фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая вазелин, масла животного, растительного происхождения или синтетические масла, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Приемлемыми фармацевтическими эксципиентами являются крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, обезжиренное сухое молоко, глицерин, пропиленгликоль, вода, этанол и т.п. При необходимости композиция может содержать также минорные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-забуферивающих агентов. Такие композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, форм с пролонгированным высвобождением и т.п. Композицию можно приготавливать в форме суппозитория с использованием традиционных связующих веществ и носителей, таких как триглицериды. В состав формы для орального применения могут входить стандартные носители, такие как имеющие фармацевтическую чистоту маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.д. Примеры приемлемых фармацевтических носителей приведены в «Remington's Pharmaceutical Sciences» под ред. Е.W.Martin.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения композицию приготавливают с помощью общепринятых процедур в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения человеку. При необходимости в состав композиции можно включать солюбилизатор и местный анестетик, такой как лидокаин, для ослабления боли в месте инъекции. Если композиция подлежит введению путем инфузии, ее можно приготавливать и выпускать вместе с флаконом для инфузии, содержащим стерильные имеющие фармацевтическую чистоту воду или физиологический раствор. Когда композицию вводят путем инъекции, то можно поставлять ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором так, чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.
Полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно включать в препаративную форму в нейтральном виде или в виде соли. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, образованные со свободными аминогруппами, являющиеся производными соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные со свободными карбоксильными группами, являющиеся производными натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
Количество полипептида, предлагаемого в изобретении, которое должно обладать эффективностью при лечении состояния или заболевания, можно определять стандартными клиническими методиками на основе предписания лечащего врача. Кроме того, необязательно можно проводить анализы in vitro, которые способствуют определению оптимальных диапазонов доз. Точная доза, которую следует вводить в препаративную форму, зависит также от пути введения и серьезности состояния и должна выбираться согласно решению лечащего врача и в зависимости от индивидуального состояния индивидуума. Однако приемлемые диапазоны доз для внутривенного введения составляют, как правило, примерно 20-5000 мкг действующего вещества на кг веса тела. Приемлемые диапазоны доз для интраназального введения составляют, как правило, примерно от 0,01 пг/кг веса тела до 1 мг/кг веса тела. Эффективные дозы можно определять путем экстраполяции из кривых зависимости ответа от дозы, полученных in vitro или с использованием для оценки смоделированных на животных систем. В частности, возможная схема приема лекарственного средства может составлять от 60 до 120 мкг/кг веса тела путем подкожной инъекции дважды в день.
Применение в ветеринарии
Помимо вышеуказанных методов введения людям, можно рассматривать также применение в ветеринарии.
Дозы, которые вводят здоровому животному и страдающему заболеванием животному, могут отличаться. Выбор соответствующей дозы легко могут осуществлять специалисты в данной области на основе анализов, известных в данной области, например на основе описанного ниже анализа пролиферации миобластов (пример 79) или анализа эпителиальной ткани молочной железы (пример 80). Общие анализы для оценки IGF также хорошо известны в данной области, например анализы, описанные в примере 81.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что для некоторых видов животных может быть характерна сезонная фертильность, которая зависит от длины фотопериода. В любых вариантах ветеринарного метода или его применения необязательно можно начинать лечение в конкретный момент репродуктивного цикла животного для того, чтобы достигать требуемого действия. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что репродуктивный статус и цикл легко определять и при необходимости синхронизировать с помощью соответствующего режима.
При применении при ветеринарных показаниях, помимо ранее описанных методов, применяемых на людях, пептид IGF-1 или IGF-2, предлагаемый в настоящем изобретении, можно использовать путем вливания в ротовую полость животного или в виде добавки к оральным или твердым кормам для животных.
Ниже изобретение описано дополнительно с помощью примеров, не ограничивающих его объем.
Примеры
Пример 1
Конструировали экспрессионный ДНК-вектор, который кодирует полипептид-предшественник hIGF-1-Ea, содержащий следующие модификации: делеция G1, делеция Р2 и делеция ЕЗ; мутация, приводящая к замене R37 на А; и делеция R71 и делеция S72. Указанные мутации иногда обозначают как «3mut» в настоящем описании. В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemyeaplkpaksavraqrhtdmpktq kevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:8)
Клетки линии Cos7 (полученные из АТСС) поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, и высевали с плотностью 1×106 клеток на 10-сантиметровый планшет. Эти клеточные культуры трансфектировали 8 мкг экспрессионной плазмиды с помощью Fugene (фирма Roche) согласно инструкциям производителя. Через 24 ч после трансфекции клетки однократно промывали и культивировали в бессывороточной среде в течение 48 ч. Супернатанты собирали и хранили при -80°С.
Для оценки стабильности полипептида в человеческой сыворотке супернатанты, собранные после культивирования клеток линии Cos7, трансфектированных hIGF-1Ea дикого типа (wt) и hIGF-1Ea3mut, инкубировали в течение 16 ч при 37°С либо в присутствии 10% человеческой сыворотки (фирма Sigma), либо без нее. Образцы анализировали с помощью 18% ДСН-ПААГ и осуществляли иммуноблоттинг, используя козье поликлональное антитело к человеческому IGF-1. Результаты, представленные на фиг.1, свидетельствуют о том, что hIGF-1Ea wt в значительной степени расщеплялся после инкубации с сывороткой в течение 16 ч, a hIGF-1Ea3mut оказался стабильным. Денситометрический анализ показал, что отношение нерасщепленного к расщепленному IGF-1 составляло примерно 1:6,2, а в случае hIGF-1Ea3mut указанное отношение составляло примерно 1:0,68, что свидетельствует о том, что указанные мутации привели к получению стабилизированного полипептида.
Для подтверждения того, что hIGF-1Ea3mut обладал способностью передавать сигнал через IGF-1R, оценивали фосфорилирование АКТ в клетках при контакте с полипептидом. Клетки линии С2С12 получали из АТСС и поддерживали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (фирма Invitrogen), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (фирма AMIMED), 100 ед./мл пенициллина(фирма Invitrogen), 100 мкг/мл стрептомицина (фирма Invitrogen) и 2 мМ глутамина (фирма Invitrogen). Для анализа фосфорилирования АКТ клетки линии С2С12 высевали с плотностью 0,15×106 клеток на лунку 6-луночного планшета и культивировали в среде для роста в течение 72 ч. Клетки выдерживали в течение 4 ч в условиях «голодания» в бессывороточной среде и затем стимулировали различными лигандами при 37°С в течение 30 мин. Клетки лизировали с помощью буфера PhosphoSafe (фирма Cell Signaling), содержащего различные ингибиторы протеаз, и осветляли центрифугированием при 14000×g в течение 15 мин при 4°С. Фосфорилирование АКТ и общие уровни АКТ анализировали с помощью ELISA с использованием набора для двухвалентного ELISA PathScan phospho АКТ (Ser473) и набора для двухвалентного ELISA PathScan АКТ (фирма Cell Signaling) соответственно. Данные о фосфорилировании АКТ обобщены на фиг.2А, из которой видно, что hIGF-1Ea3mut обладал способностью активировать клеточный путь IGF-1R аналогично применяемому в качестве положительного контроля реагента long-R3-IGF-1 и рекомбинантному IGF-1. Кроме того, данные, представленные на фиг.5, убедительно свидетельствуют о том, что hIGF-1Ea3mut приводит к фосфорилированию АКТ.
Далее для гарантии того, что рецепторная специфичность hIGF-1Ea3mut в отношении IGF-1R сохранялась, добавляли различные лиганды в культуры NIH3T3-клеток, сверхэкпрессирующих либо IGF-1R, либо инсулиновый рецептор (InsR). Эти клетки культивировали в таких же условиях, что и описанные выше для Со87-клеток. Для анализа фосфорилирования IGF-1R и InsR клетки линий NIH3T3-IGF1R и NIH3T3-InsR высевали с плотностью 0,2×106 клеток на лунку 6-луночного планшета и культивировали в среде для роста в течение 24 ч. Клетки выдерживали в течение 16 ч в условиях «голодания» в бессывороточной среде и затем стимулировали различными лигандами при 37°С в течение 10 мин. Клетки лизировали согласно процедуре, описанной в эксперименте с использованием АКТ, и уровни фосфорилирования IGF-1R и InsR анализировали с помощью ELISA, используя набор DuoSet 1C human phosphor-IGFIR и -InsR ELISA (фирма R&D Systems). Результаты, которые обобщены на фиг.3А и 3Б, свидетельствуют о том, что указанный полипептид-предшественник IGF-1 сохраняет специфичность в отношении рецептора IGF-1 и может связываться с родственным инсулиновым рецептором с более низкой аффинностью.
Пример 2
Конструировали экспрессионный ДНК- вектор, который кодирует полипептид-предшественник hIGF-1-Eb, содержащий следующие мутации: делеция G1, делеция Р2 и делеция ЕЗ; мутация, приводящая к замене R37 на А; и делеция R71 и делеция S72 (т.е. «3mut»). В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:9)
Полипептид анализировали с помощью процедур, описанных выше в примере 1. Данные, представленные на фиг.1Б и полученные с помощью денситометрии, демонстрируют, что отношение нерасщепленного к расщепленному IGF-1 составляло примерно 1:9, в то время как в случае hIGF-1Eb3mut указанное отношение составляло примерно 1:1, что свидетельствует о том, что указанные модификации приводили к получению стабилизированного полипептида. Данные, представленные на фиг.2Б, свидетельствуют о том, что hIGF-1Eb3mut обладал способностью активировать клеточный путь IGF-1R аналогично применяемому в качестве положительного контроля реагенту long-R3-IGF-1 и рекомбинантному IGF-1. Кроме того, данные, представленные на фиг.5, убедительно свидетельствуют о том, что hIGF-1Eb3mut приводил к фосфорилированию АКТ. Результаты, обобщенные на фиг.3В и 3Г, свидетельствуют, что указанный полипептид-предшественник IGF-1 сохраняет специфичность в отношении рецептора IGF-1 и может связываться с родственным инсулиновым рецептором с более низкой аффинностью.
Пример 3
Конструировали экспрессионный ДНК-вектор, который кодирует полипептид-предшественник hIGF-1-Ec, содержащий следующие мутации: делеция G1, делеция Р2 и делеция Е3; мутация, приводящая к замене R37 на А; и делеция R71 и делеция S72 (т.е. «3mut»). В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfcerk (SEQ ID NO:10)
Полипептид анализировали с помощью процедур, описанных выше в примере 1. Данные, представленные на фиг.1В и полученные с помощью денситометрии, демонстрируют, что отношение нерасщепленного к расщепленному IGF-1 составляло примерно 1:5, в то время как в случае hIGF-1Ec3mut указанное отношение составляло примерно 1:0,96, что свидетельствует о том, что указанные модификации приводили к получению стабилизированного полипептида. Данные, представленные на фиг.2Г, свидетельствуют о том, что hIGF-1Ec3mut обладал способностью активировать клеточный путь IGF-1 R аналогично применяемому в качестве положительного контроля реагенту long-R3-IGF-1 и рекомбинантному IGF-1. Кроме того, данные, представленные на фиг.5, убедительно свидетельствуют о том, что hIGF-1Ec3mut приводил к фосфорилированию АКТ. Результаты, обобщенные на фиг.4А и 4Б, свидетельствуют о том, что указанный полипептид-предшественник IGF-1 сохраняет специфичность в отношении рецептора IGF-1 и может связываться с родственным инсулиновым рецептором с более низкой аффинностью.
Пример 4
Конструировали экспрессионный ДНК-вектор, который кодирует полипептид-предшественник hIGF-1-Eab, содержащий следующие мутации: делеция G1, делеция Р2 и делеция Е3; мутация, приводящая к замене R37 на А; и делеция R71 и делеция S72 (т.е. «3mut»); и вставку аминокислот Еа-пептида 93-102 между аминокислотами 95 и 96 Eb-пептида. Вставка создаст возможный N-связанный сигнал гликозилирования N92. В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:11)
Полипептид анализировали с помощью процедур, описанных выше в примере 1. Данные, представленные на фиг.2В, свидетельствуют о том, что hIGF-1Eab3mut обладал способностью активировать клеточный путь IGF-1R аналогично применяемому в качестве положительного контроля реагенту long-R3-IGF-1 и рекомбинантному IGF-1. Результаты, обобщенные на фиг.4В и 4Г, свидетельствуют о том, что указанный полипептид-предшественник IGF-1 сохраняет специфичность в отношении рецептора IGF-1 и не активирует инсулиновый рецептор.
Пример 5
Конструировали экспрессионный ДНК-вектор, который кодирует мультимерный полипептид-предшественник hIGF-1-Eb, содержащий следующие мутации: делеция G1, делеция Р2, делеция Е3, делеция R36, делеция R37, делеция R71, делеция S72, делеция последних семи С-концевых аминокислот Eb и вставка на С-конец указанного предшественника двух дополнительных Eb-пептидов, которые оба не имели R71 и S72 и последних семи С-концевых аминокислот, и четвертого и последнего Eb-пептида, который не имел R71 и S72. На фиг.6А представлено схематическое изображение указанной конструкции. В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:12)
Этот полипептид оценивали с помощью анализа фосфорилирования АКТ, который описан в примере 1. На фиг.5 показано, что указанный мультимер hIGF-1-Eb обладает способностью осуществлять передачу сигнала через IGF-1R-путь.
Пример 6
Можно экспрессировать полипептид-предшественник hIGF-1-Eb, предлагаемый в изобретении, который схематически изображен на фиг.6Б. Эта конструкция содержала следующие модификации: делеция G1, делеция Р2, делеция Е3, делеция R36, делеция R37, делеция R71, делеция S72 и инсерция аминокислот 93-102 Еа между аминокислотами 95 и 96 Eb, что позволяло создавать N-связанный сайт гликозилирования в положении N92 и N100. В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdirrlcmycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:13)
Пример 7
Можно экспрессировать полипептид-предшественник hIGF-2-E, предлагаемый в изобретении, который содержал следующие модификации: делеция Р4, делеция S5 и делеция Е6; мутация, приводящая к замене R38 на А; и делеция R68 и делеция D69. В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: ayrtlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrasrgiveeccfrscdialletycatpaksevstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrirrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk (SEQ ID NO:14)
Пример 8
Можно экспрессировать полипептид-предшественник hIGF-1-Ea, предлагаемый в изобретении, который содержал следующие мутации: делеция G1 и делеция Р2; мутация, приводящая к замене Е3 на X, где Х обозначает не встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, которую пэгилируют; мутация, приводящая к замене R37 на А; и делеция R71 и делеция S72. В результате получали следующую секретируемую белковую последовательность: Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:15)
Примеры 9-78 (Δ = стирание)
9) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔР2, ΔЕ3; R36A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:16).
10) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:17).
10) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:18).
11) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecc&scdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:19).
12) hIGF-1-Ea: AG1, AP2, ΔE3; R37A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:20).
13) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:21).
14) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:22).
15) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; ΔR37; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:23).
16) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQ ID NO:24).
17) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:25).
18) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQ ID NO:26).
19) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:27).
20) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrcigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:28).
21) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔR71
tlcgaelvdatqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:29).
22) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgiyfhkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtcaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:30).
23) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssrapqtgivdecc&scdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggcqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:31).
24) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36Δ; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrsedlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:32).
25) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36Δ; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlcmycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:33).
26) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36Δ; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdecc&scdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:34).
27) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE2; R37Δ; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:35).
28) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37Δ; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:36).
29) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecc&scdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:37).
30) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:38).
31) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:39).
32) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36Δ; ΔR71; инсерция ак 93-102 Еа между ак 95 и 96 Eb (т.е. «Eab»).
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:40)
33) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37Δ; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:41).
34) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:42).
35) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36Δ; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:43).
36) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37Δ; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtglvdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:44).
37) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:45).
38) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36Δ; ΔR71, ΔS72
ttcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:46).
39) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaccrgkkgk (SEQ ID NO:47).
40) hIGF-1-Ea: ΔP2, ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:48).
41) hIGF-1-Eb: ΔP2, ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:49).
42) Мультимер hIGF-1-Eb: (ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37Δ) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, ΔC-конц. 7 ак) - Eb (ΔР71, ΔS72)
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecc&scdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkcgteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtcaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:50)
43) Мультимер hIGF-1-Ebr: (ΔP2, ΔE3; R37Δ) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, АС-конц. 7 ак) - Eb (ΔR71, ΔS72)
gtlcgaclvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrcigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteastqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:51).
44) hIGF-1-Ec: ΔP2, ЛЕЗ; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:52).
45) hIGF-1-Ea: ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:53).
46) hIGF-1-Eb: ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQ ID NO:54).
47) Мультимер hIGF-1-Eb: (ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37Δ) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, ΔC-конц. 7 ак) - Eb (ΔР71, ΔS72)
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:55).
48) Мультимер hIGF-1-Eb: (ΔE3; R37Δ) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, ΔС-конц.7 ак) - Eb (ΔR71, ΔS72)
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk (SEQ ID NO:56).
49) hIGF-1-Ec: ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgtvdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:57).
50) hIGF-1-Ea: ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:58).
51) hIGF-1-Eb: ΔE3; R37Δ; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:59).
52) hIGF-1-Ec: ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:60).
53) hIGF-1-Eab: ΔЕ3; R37A; ΔR71, ΔS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkcqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:61).
54) Мультимер hIGF-1-Eb: (ΔE3; R37A) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, ΔС-конц. 7 ак) - Eb (ΔR71, ΔS72)
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrtemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteastqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsruaecrgkkgk (SEQ ID NO:62).
55) hIGF-1-Ea: E3Δ; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:63).
56) hIGF-1-Eb: E3Δ; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:64).
57) hIGF-1-Ec: E3Δ; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaptkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:65).
58) hIGF-1-Eab: E3Δ; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlegaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdcccfrscdirrlemyeaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggcqkegteaslqirgkkkeqrrcigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:66).
59) Мультимер hIGF-1-Eb: (E3Δ; R37A) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, ΔС-конц. 7 ак) - Eb (ΔR71, ΔS72)
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:67).
60) hIGF-1-Ea: ΔP2, ΔЕ3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:68).
61) hIGF-1-Eb: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecc&scdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk (SEQ ID NO:69).
62) hIGF-1-Ec: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:181).
63) hIGF-1-Eab: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk (SEQ ID NO:70).
64) Мультимер hIGF-1-Eb: (ΔP2, ΔE3; R37A) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, АС-конц. 7 aK) - Eb (ΔR71, ΔS72)
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyRikptgygsssraapqtgivdeccfrscdIrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:71).
65) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2; E3X; R37A; ΔR71, ΔS72
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:72).
66) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2; E3X; R37A; ΔR71, ΔS72
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:73).
67) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2; E3X; R37A; ΔR71, ΔS72
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkcgteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:74).
68) Мультимер hIGF-1-Eb: (ΔG1, ΔP2; E3X; R37A) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, ΔC-конц. 7 ак) - Eb (ΔР71, ΔS72)
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:75).
69) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:76).
70) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:77).
71) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaclvdaIqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdIrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO:78).
72) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrsedlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtcaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:79).
73) Мультимер hIGF-1-Eb: (ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A) - Eb (ΔR71; S72X; ΔC-конц. 7 ак) - 2×Eb (ΔР71, ΔS72, АС-конц. 7 ак) - Eb (ΔР71, ΔS72)
tlcgaelvdatqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdcccfrscdlrrlemycaplkpakXsavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkcgteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:80).
74) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72; N92X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkXasrgsagnknyrm (SEQ ID NO:81).
75) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72; C142X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaeXrgkkgk (SEQ ID NO:82).
76) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72; C151X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaeXrgkkgk (SEQ ID NO:83).
78) Мультимер hIGF-1-Eb (ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A) - 3×Eb (ΔR71, ΔS72, ΔC-конц.7 ак) - Eb (ΔР71, ΔS72; C71X)
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdirrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (SEQ ID NO:84)
Пример 79: Анализ пролиферации миобластов
Анализ пролиферации миобластов представляет собой достоверный индикаторный метод оценки in vitro активности IGF, его применяли в качестве модели для факторов, оказывающих влияние на эмбриональные миобласты и клетки-сателлиты взрослых особей. Факторы, обладающие активностью в этой системе, проявляют свое действие так же, как и в первичных культурах миобластов. Усиление пролиферации миобластов in vitro пептидом, предлагаемым в настоящем изобретении, свидетельствует об активности, повышающей пролиферацию миобластов и вследствие этого повышающей в конце концов количество миофибрилл в матке. Кроме того, аналогичное усиление пролиферации миобластов свидетельствует о том, что пептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для повышения мышечной гипертрофии у взрослых особей, например, путем стимуляции клеточной пролиферации в мышце-сателлите.
Пример 80: Анализ эпителиальной ткани молочной железы
У животного на стадии лактации количество эпителиальной ткани молочной железы является лимитирующим фактором производства молока, поскольку эта ткань содержит клетки, которые продуцируют и секретируют молоко. При использовании в системах in vitro эпителиальные клетки, полученные из молочных желез животных, можно стимулировать модифицированными IGF-1 или IGF-2, предлагаемыми в настоящем изобретении, в отношении пролиферации и производства повышенных количеств компонентов молока. Можно продемонстрировать также, что эпителиальные клетки молочных желез, пролиферация которых стимулирована в одной из таких систем in vitro, можно повторно имплантировать в очищенные скопления жировой ткани молочной железы и стимулировать пролиферацию и/или производство молока у животных на стадии лактации.
Пример 81: Оценка уровней IGF-1 или IGF-2 в крови или других жидкостях организма
Эффективное количество введенного парентерально пептида в дозе можно оценивать с помощью кривых зависимости доза-ответ. Например, уровни модифицированных пептидов IGF, предлагаемых в изобретении, можно определять в крови или в общей воде организма индивидуума, подлежащего лечению, с целью определения дозировки. В другом варианте можно вводить возрастающие количества пептида индивидууму и оценивать уровни модифицированного IGF-1 и IGF-2 в сыворотке индивидуума. Количество пептида, которое следует применять, можно рассчитывать в молях на основе данных об уровнях модифицированного IGF-1 или IGF-2 в сыворотке.
Один из методов определения соответствующей дозировки пептида предусматривает оценку пептида IGF, предлагаемого в изобретении, в биологической жидкости, такой как общая вода организма или плазма крови. Оценку указанных уровней можно осуществлять любыми методиками, включая РИА и ELISA. После определения уровней IGF жидкость приводят в контакт с одной или несколькими дозами пептида. После указанной стадии контакта в жидкости повторно оценивают уровни IGF. Если уровни IGF в жидкости находятся ниже количества, достаточного для достижения требуемой эффективности, с целью получения которой молекулу вводят, то дозу молекулы можно регулировать для достижения максимальной эффективности. Этот метод можно осуществлять in vitro или in vivo. Предпочтительно указанный метод осуществляют in vivo, т.е. после экстракции жидкости из организма индивидуума и оценки уровней IGF пептид вводят млекопитающему в виде одной или нескольких доз (это означает, что путем введения животному достигают стадии контакта) и затем уровни IGF повторно оценивают в экстрагированной жидкости, полученной из животного.
Другой метод определения дозировки предусматривает применение антител к пептиду или представляет собой другой метод определения в LIFA-формате.
Пример 82: Фармакокинетические характеристики hIGF-1-Ec 3mut in vivo
Взрослым самцам мышей (n=3/группу) вводили путем внутривенной (i.v.) болюсной инъекции rhIGF-1 в дозе 1 мг/кг и hIGF-l-Ec3mut (описанный в примере 3) в дозе 1,55 мг/кг. Брали серийные образцы крови через 5, 15, 30 и 60 мин после введения тестируемой субстанции. Концентрации в сыворотке rhIGF-1 и hIGF-1-Ec3mut определяли с помощью ELISA. Этот анализ является специфическим для hIGF-1.
Эквимолярные дозы rhIGF-1 и hIGF-1-Ec3mut вводили мышам i.v. Результаты свидетельствуют о существенно более высоких уровнях белка hIGF-l-Ec3mut по сравнению с rhIGF-1 во все изученные моменты времени, что демонстрирует, что hIGF-1-Ec3mut является более стабильным в отношении метаболизма, чем состоящий из 70 аминокислот IGF-1.
Время (мин) | IGF-1-Ec3mut (нМ) | IGF-1 (нМ) |
5 | 201,4 | 54,7 |
15 | 65,3 | 14,3 |
30 | 12 | 2,4 |
60 | 0,76 | 0,2 |
Claims (21)
1. Полипептид, содержащий человеческий белок-предшественник IGF-1, в котором (i) аминокислоты G1, Р2 и Е3 удалены в результате делеции или аминокислота Е3 удалена в результате делеции и в котором аминокислота R37 изменена на аланин и аминокислоты R71 и R72 удалены в результате делеции; и
(и) отщепление Е-пептида от IGF-1 с помощью протеазы снижено в результате указанных модификаций.
(и) отщепление Е-пептида от IGF-1 с помощью протеазы снижено в результате указанных модификаций.
2. Полипептид по п.1, в котором аминокислоты G1, Р2 и Е3 удалены в результате делеции, аминокислота R37 изменена на аланин и аминокислоты R71 и R72 удалены в результате делеции.
3. Полипептид по п.1, в котором аминокислота Е3 удалена в результате делеции, аминокислота R37 изменена на аланин и аминокислоты R71 и R72 удалены в результате делеции.
4. Полипептид по п.2, включающий SEQ ID NO:8.
5. Полипептид по п.3, включающий SEQ ID NO:53.
6. Полипептид по п.1, в котором белок-предшественник содержит Еa-пептид.
7. Полипептид по п.1, в котором белок-предшественник содержит Еb-пептид.
8. Полипептид по п.1, в котором белок-предшественник содержит Еc-пептид.
9. Полипептид по любому из пп.1-5, дополнительно включающий частицу полиэтиленгликоля, присоединенную к боковой цепи белка-предшественника.
10. Способ лечения заболевания костно-мышечной системы, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид по любому из пп.1-5.
11. Способ лечения диабета, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид по любому из пп.1-5.
12. Способ лечения состояний, ассоциированных с гибелью нейронов, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид по любому из пп.1-5.
13. Способ лечения анемии, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид по любому из пп.1-5.
14. Способ лечения хронического обструктивного заболевания легких, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид по любому из пп.1-5.
15. Способ лечения ожогового поражения, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид по любому из пп.1-5.
16. Применение полипептида по одному из пп.1-5 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания костно-мышечной системы.
17. Применение полипептида по одному из пп.1-5 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения диабета.
18. Применение полипептида по одному из пп.1-5 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения состояний, ассоциированных с гибелью нейронов.
19. Применение полипептида по одному из пп.1-5 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения анемии.
20. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп.1-5.
21. Трансфектирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.20.
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US81234906P | 2006-06-09 | 2006-06-09 | |
US60/812,349 | 2006-06-09 | ||
US86224406P | 2006-10-20 | 2006-10-20 | |
US60/862,244 | 2006-10-20 | ||
US89718707P | 2007-01-24 | 2007-01-24 | |
US60/897,187 | 2007-01-24 | ||
PCT/US2007/070468 WO2007146689A2 (en) | 2006-06-09 | 2007-06-06 | Stabilized insulin-like growth factor polypeptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008151511A RU2008151511A (ru) | 2010-07-20 |
RU2477287C2 true RU2477287C2 (ru) | 2013-03-10 |
Family
ID=38801859
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008151511/10A RU2477287C2 (ru) | 2006-06-09 | 2007-06-06 | Стабилизированные полипептиды инсулиноподобного фактора роста |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US8343918B2 (ru) |
EP (2) | EP2032155B1 (ru) |
JP (2) | JP5290966B2 (ru) |
KR (1) | KR101459789B1 (ru) |
AR (1) | AR061242A1 (ru) |
AU (2) | AU2007257936B2 (ru) |
BR (2) | BRPI0712052A2 (ru) |
CA (2) | CA2653781A1 (ru) |
CL (1) | CL2007001614A1 (ru) |
CR (2) | CR10432A (ru) |
CY (1) | CY1116117T1 (ru) |
DK (2) | DK2032155T3 (ru) |
EC (1) | ECSP088949A (ru) |
ES (1) | ES2529261T3 (ru) |
GT (1) | GT200800273A (ru) |
HK (1) | HK1126429A1 (ru) |
HR (1) | HRP20150326T1 (ru) |
IL (1) | IL195156A (ru) |
JO (1) | JO2968B1 (ru) |
MA (1) | MA30503B1 (ru) |
MX (2) | MX2008015726A (ru) |
MY (1) | MY147856A (ru) |
NO (2) | NO20085183L (ru) |
NZ (2) | NZ572708A (ru) |
PE (1) | PE20080715A1 (ru) |
PL (1) | PL2032155T3 (ru) |
PT (1) | PT2032155E (ru) |
RU (1) | RU2477287C2 (ru) |
SI (1) | SI2032155T1 (ru) |
TN (1) | TNSN08509A1 (ru) |
TW (1) | TWI427084B (ru) |
UA (1) | UA97953C2 (ru) |
WO (2) | WO2007146689A2 (ru) |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090318355A1 (en) * | 2006-02-15 | 2009-12-24 | Chen Thomas T | Compositions and methods for promoting tissue repair and wound healing |
AR061242A1 (es) * | 2006-06-09 | 2008-08-13 | Novartis Ag | Polipeptidos de factor de crecimiento de tipo insulina estabilizada |
EP3778652A1 (en) | 2008-05-07 | 2021-02-17 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Lysosomal targeting peptides and uses thereof |
CA2743072A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-14 | Novartis Ag | Antibodies to modified human igf-1/e peptides |
US8685403B2 (en) * | 2009-01-30 | 2014-04-01 | The Regents Of The University Of California | Insulin-like growth factor signaling and integrin |
CA2758290C (en) | 2009-04-27 | 2018-04-10 | Novartis Ag | Antagonistic activin receptor iib (actriib) antibodies for increasing muscle growth |
BR112012001363A2 (pt) * | 2009-07-22 | 2016-11-08 | Ipsen Pharma Sas | análogo de igf-1, composição farmacêutica,e, método para tratar condições ou doenças mediadas pela ligação do receptor de igf-1 |
WO2011057249A2 (en) * | 2009-11-09 | 2011-05-12 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Treatment of heart disease |
JP2011160696A (ja) * | 2010-02-08 | 2011-08-25 | Novartis Ag | 修飾ヒトigf−1/eペプチドに対する抗体 |
BR112013020969A2 (pt) | 2011-02-23 | 2018-07-10 | Massachusetts Inst Technology | proteínas de membrana solúvel em água e métodos para a sua preparação e uso. |
US20140357558A1 (en) * | 2011-06-24 | 2014-12-04 | Cold Spring Harbor Laboratory | Compositions and methods for treatment of spinal muscular atrophy |
HUE040276T2 (hu) | 2011-07-01 | 2019-02-28 | Novartis Ag | Eljárás metabolikus rendellenességek kezelésére |
WO2014012025A2 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Igf-1 proteins and therapeutic uses thereof |
JP6392245B2 (ja) * | 2012-12-18 | 2018-09-19 | ノバルティス アーゲー | 遺伝子改変哺乳動物細胞における治療用タンパク質の産生 |
CR20200079A (es) * | 2012-12-18 | 2020-03-21 | Novartis Ag | POLIPÉPTIDOS ESTABILIZADOS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO TIPO INSULINA (Divisional 2015-0324) |
AU2014307589A1 (en) | 2013-08-14 | 2016-02-11 | Novartis Ag | Methods of treating sporadic inclusion body myositis |
KR20160091888A (ko) | 2013-10-02 | 2016-08-03 | 노파르티스 아게 | 요법에 사용하기 위한 인슐린-유사 성장 인자 모방체 |
UY35874A (es) * | 2013-12-12 | 2015-07-31 | Novartis Ag | Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas |
WO2015095650A1 (en) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Puretein Bioscience Llc. | Methods for treating an animal |
WO2015111008A2 (en) | 2014-01-27 | 2015-07-30 | Novartis Ag | Biomarkers predictive of muscle atrophy, method and use |
US10373702B2 (en) | 2014-03-27 | 2019-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Water-soluble trans-membrane proteins and methods for the preparation and use thereof |
WO2015149085A2 (en) * | 2014-03-27 | 2015-10-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Warer-soluble trans-membrane proteins and methods for the preparation and use thereof |
TW201622746A (zh) | 2014-04-24 | 2016-07-01 | 諾華公司 | 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法 |
CN107405387A (zh) * | 2015-02-04 | 2017-11-28 | 普雷坦生物科技有限责任公司 | 用于增加后代的性能特性的方法 |
KR101669140B1 (ko) | 2015-04-28 | 2016-10-26 | (주)케어젠 | 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 |
US11534466B2 (en) | 2016-03-09 | 2022-12-27 | Aal Scientifics, Inc. | Pancreatic stem cells and uses thereof |
KR20240014600A (ko) | 2017-03-24 | 2024-02-01 | 노바르티스 아게 | 심장질환 예방 및 치료 방법 |
JP6691503B2 (ja) * | 2017-04-13 | 2020-04-28 | 任天堂株式会社 | ゲームプログラム、ゲーム処理制御方法、およびゲーム装置 |
JOP20190245A1 (ar) | 2017-04-20 | 2019-10-15 | Novartis Ag | أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط |
WO2023145961A1 (ja) * | 2022-01-31 | 2023-08-03 | 国立大学法人信州大学 | IGF1Rを標的とするpre-pro前駆体型キメラ抗原受容体発現細胞 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1141014B1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-08 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variant |
RU2004121029A (ru) * | 2001-12-07 | 2006-01-10 | Астразенека Аб (Se) | Производные пиримидина в качестве модуляторов рецептора инсулинподобного фактора роста 1 (igf-1) |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4980286A (en) * | 1985-07-05 | 1990-12-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells |
WO1987001038A1 (en) | 1985-08-22 | 1987-02-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Or | Peptide analogues of mammalian insulin-like growth factor-1 |
US5164370A (en) | 1987-12-24 | 1992-11-17 | Gropep Pty. Ltd. | Peptide analogues of insulin-like growth factor 1 (igf-1) or factor 2 (igf-2) |
GB8819826D0 (en) * | 1988-08-20 | 1988-09-21 | Kabivitrum Ab | Glycosylated igf-1 |
JPH07508025A (ja) * | 1992-05-08 | 1995-09-07 | トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ | インスリン様増殖因子(igf−1)類似体 |
WO1995013290A1 (en) | 1993-11-12 | 1995-05-18 | North Shore University Hospital Research Corporation | Method of treating muscular dystrophy |
WO1995032003A1 (en) | 1994-05-24 | 1995-11-30 | Amgen Boulder Inc. | Modified insulin-like growth factors |
GB9605124D0 (en) * | 1996-03-11 | 1996-05-08 | Royal Free Hosp School Med | Method of treating muscular disorders |
US7118752B2 (en) | 1998-07-22 | 2006-10-10 | University Of Connecticut | Compositions and methods for inhibiting the proliferation and invasiveness of malignant cells comprising E-domain peptides of IGF-I |
GB9926968D0 (en) * | 1999-11-15 | 2000-01-12 | Univ London | Treatment of neurological disorders |
GB0011278D0 (en) | 2000-05-10 | 2000-06-28 | Univ London | Repair of nerve damage |
JP2005502322A (ja) * | 2001-04-19 | 2005-01-27 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | 非天然アミノ酸のインビボ組込み |
GB0202906D0 (en) | 2002-02-07 | 2002-03-27 | Univ London | Prevention of myocardial damage |
EP1576137A4 (en) | 2002-10-29 | 2010-06-30 | Genentech Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASES RELATED TO THE IMMUNE SYSTEM |
WO2005033134A2 (en) * | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Secreted protein therapeutics and uses thereof |
GB0426154D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | European Molecular Biology Lab Embl | IGF-1 novel peptides |
EP1674113A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol) |
PT2241575E (pt) * | 2005-01-07 | 2015-09-16 | Regeneron Pharma | Polipéptidos de fusão que contêm o igf-1 e utilizações terapêuticas desses polipéptidos |
WO2006097682A1 (en) | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Ucl Business Plc | Mechano growth factor peptides and their use |
WO2006097764A1 (en) | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Ucl Business Plc | Mecano growth factor peptides and their use |
WO2006106689A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Pioneer Corporation | アップグレードモジュール、アプリケーションプログラム、サーバ、及びアップグレードモジュールの配信システム |
AR061242A1 (es) | 2006-06-09 | 2008-08-13 | Novartis Ag | Polipeptidos de factor de crecimiento de tipo insulina estabilizada |
-
2007
- 2007-06-06 AR ARP070102431A patent/AR061242A1/es unknown
- 2007-06-06 ES ES07798148.8T patent/ES2529261T3/es active Active
- 2007-06-06 NZ NZ572708A patent/NZ572708A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-06-06 KR KR1020087029888A patent/KR101459789B1/ko active IP Right Grant
- 2007-06-06 RU RU2008151511/10A patent/RU2477287C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-06-06 UA UAA200814196A patent/UA97953C2/ru unknown
- 2007-06-06 CL CL200701614A patent/CL2007001614A1/es unknown
- 2007-06-06 EP EP07798148.8A patent/EP2032155B1/en active Active
- 2007-06-06 PT PT77981488T patent/PT2032155E/pt unknown
- 2007-06-06 DK DK07798148.8T patent/DK2032155T3/en active
- 2007-06-06 MX MX2008015726A patent/MX2008015726A/es active IP Right Grant
- 2007-06-06 CA CA002653781A patent/CA2653781A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-06 JP JP2009514507A patent/JP5290966B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-06 WO PCT/US2007/070468 patent/WO2007146689A2/en active Application Filing
- 2007-06-06 AU AU2007257936A patent/AU2007257936B2/en not_active Ceased
- 2007-06-06 BR BRPI0712052-4A patent/BRPI0712052A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-06-06 JP JP2009513697A patent/JP2009539805A/ja active Pending
- 2007-06-06 JO JO2007215A patent/JO2968B1/en active
- 2007-06-06 MX MX2008015657A patent/MX2008015657A/es not_active Application Discontinuation
- 2007-06-06 WO PCT/EP2007/055608 patent/WO2007141309A2/en active Application Filing
- 2007-06-06 PL PL07798148T patent/PL2032155T3/pl unknown
- 2007-06-06 NZ NZ572548A patent/NZ572548A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-06-06 MY MYPI20084827A patent/MY147856A/en unknown
- 2007-06-06 EP EP07729975A patent/EP2032154A2/en not_active Withdrawn
- 2007-06-06 TW TW096120340A patent/TWI427084B/zh not_active IP Right Cessation
- 2007-06-06 AU AU2007255419A patent/AU2007255419A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-06 SI SI200731622T patent/SI2032155T1/sl unknown
- 2007-06-06 PE PE2007000699A patent/PE20080715A1/es not_active Application Discontinuation
- 2007-06-06 CA CA2654944A patent/CA2654944C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-06 BR BRPI0712147-4A patent/BRPI0712147A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-06-06 US US12/304,068 patent/US8343918B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-06 US US12/303,623 patent/US20100173839A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-11-06 IL IL195156A patent/IL195156A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-11-10 CR CR10432A patent/CR10432A/es unknown
- 2008-12-04 GT GT200800273A patent/GT200800273A/es unknown
- 2008-12-05 TN TNP2008000509A patent/TNSN08509A1/en unknown
- 2008-12-08 MA MA31459A patent/MA30503B1/fr unknown
- 2008-12-09 EC EC2008008949A patent/ECSP088949A/es unknown
- 2008-12-11 NO NO20085183A patent/NO20085183L/no not_active Application Discontinuation
- 2008-12-11 NO NO20085184A patent/NO20085184L/no not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-01-06 DK DK200900016A patent/DK200900016A/da not_active Application Discontinuation
- 2009-06-17 HK HK09105411.1A patent/HK1126429A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-10-30 US US13/664,055 patent/US8722621B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-01-15 US US14/155,974 patent/US20170066808A9/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-03-13 CY CY20151100260T patent/CY1116117T1/el unknown
- 2015-03-23 HR HRP20150326TT patent/HRP20150326T1/hr unknown
-
2016
- 2016-03-07 CR CR20160115A patent/CR20160115A/es unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1141014B1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-08 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variant |
RU2004121029A (ru) * | 2001-12-07 | 2006-01-10 | Астразенека Аб (Se) | Производные пиримидина в качестве модуляторов рецептора инсулинподобного фактора роста 1 (igf-1) |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
BAGLEY C.J. et al. A key functional role for the insulin-like growth factor 1 N-terminal pentapeptide // Biochem. J. - 1989, v.259, n.3, p.665-671. * |
BALLARD F.J. et al. Des(1-3)IGF-1: a truncated form of insulin-like growth factor-I, Int. // J. Biochem. Cell Biol. - 1996, v.28, n.10, p.1085-1087. * |
BALLARD F.J. et al. Natural and synthetic forms of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and the potent derivative, destripeptide IGF-1: biological activities and receptor binding, Biochem. // Biophys. Res. Commun. - 1987, v.149, n.2, p.398-404. * |
DUGUAY S.J. et al. Mutational analysis of the insulin-like growth factor I prohormone processing site // J. Biol. Chem. - 1995, v.270, n.29, p.17566-17574. * |
DUGUAY S.J. et al. Post-translational processing of the insulin-like growth factor-2 precursor. Analysis of O-glycosylation and endoproteolysis // J. Biol. Chem. - 1998, v.273, n.29, p.18443-18451. * |
DUGUAY S.J. et al. Processing of wild-type and mutant proinsulin-like growth factor-IA by subtilisin-related proprotein convertases // J. Biol. Chem. - 1997, v.272, n.10, p.6663-6670. * |
DUGUAY S.J. et al. Processing of wild-type and mutant proinsulin-like growth factor-IA by subtilisin-related proprotein convertases // J. Biol. Chem. - 1997, v.272, n.10, p.6663-6670. DUGUAY S.J. et al. Mutational analysis of the insulin-like growth factor I prohormone processing site // J. Biol. Chem. - 1995, v.270, n.29, p.17566-17574. DUGUAY S.J. et al. Post-translational processing of the insulin-like growth factor-2 precursor. Analysis of O-glycosylation and endoproteolysis // J. Biol. Chem. - 1998, v.273, n.29, p.18443-18451. BALLARD F.J. et al. Des(1-3)IGF-1: a truncated form of insulin-like growth factor-I, Int. // J. Biochem. Cell Biol. - 1996, v.28, n.10, p.1085-1087. BALLARD F.J. et al. Natural and synthetic forms of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and the potent derivative, destripeptide IGF-1: biological activities and receptor binding, Biochem. // Biophys. Res. Commun. - 1987, v.149, n.2, p.398-404. BAGLEY C.J. et al. A key functional role for the insulin-like growth * |
FRANCIS G.L. et al. Insulin-like growth factor (IGF)-II binding to IGF-binding proteins and IGF receptors is modified by deletion of the N-terminal hexapeptide or substitution of arginine for glutamate-6 in IGF-II // Biochem. J. - 1993, v.293, Pt 3, p.713-719. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2477287C2 (ru) | Стабилизированные полипептиды инсулиноподобного фактора роста | |
PT784093E (pt) | Osteoprotegerina | |
CN101466399B (zh) | 稳定的胰岛素样生长因子多肽 | |
US7534436B2 (en) | Peptide fragments of the harp factor inhibiting angiogenesis | |
US20210275639A1 (en) | Compositions for the treatment of sarcopenia or disuse atrophy | |
US10130687B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of orthopedic disease or injury | |
JP2015514726A (ja) | 肥満及び過体重の処置に用いるSorCS1 | |
JP2002541060A (ja) | ニューロンの再生に関連するタンパク質およびその使用 | |
CN1451752A (zh) | 对lap与lip之比例的控制 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL: 7-2013 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190607 |