JP2009539383A - 安定化されたインスリン様増殖因子ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２配列およびＥ−ペプチド配列を有し、ＩＧＦからのＥ−ペプチドの生理学的自然開裂が阻止されている、安定化されたポリペプチドに関するものである。

Description

発明の背景
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）は、細胞がその生理学的環境との間で情報伝達を行う際に使用する複雑な系の一部である。この複雑な系（インスリン様増殖因子軸と称されることが多い）は、２種の細胞表面受容体（ＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２Ｒ）、２種のリガンド（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、６種の高親和力ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）のファミリー、および関連ＩＧＦＢＰ分解酵素（プロテアーゼ）により構成される。この系は、正常な生理機能の調節だけでなく多くの病的状態にとっても重要である（Glass、Nat Cell Biol ５：８７−９０、２００３）。

ＩＧＦ軸は、細胞増殖の促進および細胞死（アポトーシス）の阻害において幾つかの役割を果たすことが示されている。ＩＧＦ−１は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果、主として肝臓により分泌される。人体におけるほとんど全ての細胞、特に筋肉、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚および肺における細胞は、ＩＧＦ−１による影響を被る。インスリン様効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた、細胞の成長を調節し得る。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、ＩＧＦ結合タンパク質として知られる一群の遺伝子産物により調節される。これらのタンパク質は、ＩＧＦ受容体への結合阻止によるＩＧＦ作用の阻害および受容体への送達の促進および血流中のＩＧＦ半減期の増加を通じたＩＧＦ作用の促進の両方を含む複雑な方法でＩＧＦ作用の調節を助ける。少なくとも６種の特性確認された結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）が存在する。

ソマトメジンとも呼ばれる、ヒトＩＧＦ−１（gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa；配列番号１）は、その成熟形態では、培養中の広範囲の細胞の成長を刺激することが示された７０アミノ酸から成る小さなタンパク質である。成熟タンパク質は、最初に３つの既知スプライス変異型ｍＲＮＡによりコード化される。各ｍＲＮＡの読み枠は、７０アミノ酸ＩＧＦ−１および特定ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡに依存するＣ−末端の特定Ｅ−ペプチドを含む前駆体タンパク質をコード化する。これらのＥ−ペプチドは、Ｅａ（rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm；配列番号２）、Ｅｂ（rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk；配列番号３）およびＥｃ（rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk；配列番号４）ペプチドと呼ばれるもので、長さ３５〜８７アミノ酸の範囲であり、Ｎ−末端にある共通配列領域およびＣ−末端にある可変配列領域を包含する。例えば、ＩＧＦ−１−Ｅａについての野生型読み枠は、１０５アミノ酸（gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm；配列番号５）のポリペプチドをコード化する。生理学的表現では、Ｅ−ペプチドは、内在性プロテアーゼにより前駆体から開裂され、生物活性であることが知られている成熟７０アミノ酸ＩＧＦ−１が生成される。ある種の状況において、ＩＧＦ−１のＮ−末端アミノ酸の１〜３個は、生理学的条件下で開裂されることにより、６７〜７０個のアミノ酸を有する活性ＩＧＦ−１を生じることが知られている。ヒトＩＧＦ−２についての唯一のＥ−ペプチド（rdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk；配列番号６）が１５６アミノ酸前駆体（ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrscdlalletycatpakserdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk；配列番号７）について同定されたことを除き、ＩＧＦ−２遺伝子発現およびプロセッシングは、類似特性を特徴としている。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は患者の血清中で内在性プロテアーゼにより迅速に分解されるため、これらのタンパク質は両方とも薬剤候補としては不十分であると思われる。考えられる一戦略は、ＩＧＦ−１をその結合タンパク質の一つとの複合体を形成させることにより薬剤として安定化することである。

発明の要旨
本発明は、実質的にそのＥ−ペプチドを含む前駆体ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２タンパク質が生物活性を呈し、血清の存在下では安定化されることから、医薬として有用なＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２ポリペプチドが得られるという発見に基づいている。本発明組成物では、ＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの正常な開裂が、例えばＥ−ペプチドの１位のアルギニンまたは２位のセリン（野生型前駆体ＩＧＦ−１の７１および７２位に相当）の突然変異または欠失により回避される。ＩＧＦ−２では、例えばＥ−ペプチドの１位のアルギニンまたは２位のアスパラギン酸（野生型前駆体ＩＧＦ−２の６８および６９位に相当）の突然変異または欠失により開裂が回避される。ＩＧＦ前駆体タンパク質の他の修飾もこの開裂を回避または減少させ得る。

さらに、ＩＧＦ−１前駆体アミノ酸配列にさらなる修飾を加えることにより、医薬上の利点が追加され得る。例えば、本発明ポリペプチドは、ＩＧＦ−１受容体に関する親和力の増加または阻害性ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２結合タンパク質への結合能の減少を呈し得る。

明確さおよび一貫性を保つため、請求の範囲を含む本明細書全体を通してＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２前駆体または成熟タンパク質におけるアミノ酸残基の番号付は、シグナルペプチドを伴わない野生型前駆体タンパク質配列の番号付に基づくものとする。

したがって、本発明は、ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含み、プロテアーゼによるＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの開裂を前駆体タンパク質の修飾により低減化させたポリペプチドを含む。Ｅ−ペプチドは、Ｅａ、ＥｂまたはＥｃペプチドであり得る。前駆体のＮ−末端では、前駆体タンパク質のアミノ酸Ｇ１、Ｐ２またはＥ３は、Ｒ３６（例、Ｒ３６Ａ）およびＲ３７（例、Ｒ３７Ａ）で見られるように欠失または突然変異が導入され得る。

さらに前駆体タンパク質は、例えばＥｂのアミノ酸Ｎ９５およびＴ９６間におけるＥａのアミノ酸９３〜１０２の挿入により、Ｎ−結合グリコシル化共通配列ＮＸＳ／Ｔを含み得る。一般に、前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸側鎖、例えば前駆体タンパク質のアルギニン側鎖に共有結合したオリゴ糖を含み得る。

さらに、前駆体タンパク質の残基は、非天然アミノ酸（例、アセチレンまたはアジド基を含むもの）により置換され得る。典型的なタンパク質ペギル化戦略は当業界ではよく知られているが、上記の非天然アミノ酸は、前駆体タンパク質の側鎖へのポリ（エチレングリコール）部分の結合を促進し得る。

さらに前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のＣ−末端に結合された１個またはそれ以上の追加的Ｅ−ペプチドを含み得る。例えば、ポリペプチドは、Ｎ−末端からＣ−末端まで、（１）第１Ｅｂペプチドを有するＩＧＦ−１前駆体タンパク質（ただし、Ｇ１、Ｐ１およびＥ１は欠失しており、Ｒ３６またはＲ３７またはその両方は突然変異しており、Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、第１Ｅｂペプチドの最後の７個のＣ−末端アミノ酸は欠失している）、（２）第２Ｅｂペプチド（ただし、Ｒ７１、Ｓ７２および第２Ｅｂペプチドの最後の７個のＣ−末端アミノ酸は欠失している）、（３）第３Ｅｂペプチド（ただし、Ｒ７１、Ｓ７２および第３Ｅｂペプチドの最後の７個のＣ−末端アミノ酸は欠失している）、および（４）第４Ｅｂペプチド（ただし、Ｒ７１およびＳ７２は欠失している）を含み得る。

ＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの開裂を阻止する有効な手段は、Ｒ７１またはＳ７２の欠失または突然変異である。

同様に、本発明は、プロテアーゼによるＩＧＦ−２からのＥ−ペプチドの開裂を前駆体タンパク質の修飾により低減化させるヒトＩＧＦ−２前駆体タンパク質を包含する。特に、Ｒ６８またはＤ６９の欠失または突然変異は、ＩＧＦ−２前駆体タンパク質のプロテアーゼ消化を回避する有効な手段であり得る。

さらに、ＩＧＦ−１のいずれかのＥ−ペプチドをＩＧＦ−２と組み合わせ、ＩＧＦ−２のいずれかのＥ−ペプチドをＩＧＦ−１と組み合わせることも可能であり、それによって本明細書記載の利点が得られる。

さらに本発明は、治療有効量の本発明ポリペプチドの投与による筋骨格疾患、糖尿病、神経細胞死の処置方法を含む。同様に、本発明は、筋骨格疾患、糖尿病、神経細胞死、または貧血を処置する医薬の製造を目的とする本発明ポリペプチドの使用を包含する。

別の実施態様において、本発明は、Ｅ−ペプチドを伴わないが、ペギル化部位として非天然アミノ酸がそこに導入されているペギル化ＩＧＦ−１を包含する。Ｅ−ペプチドを伴わず、本明細書に開示している非天然アミノ酸を含む修飾ペギル化ＩＧＦ−１もまた、いずれも本発明に包含される。

本発明はまた、所望の効果を得るために有効量の本発明ポリペプチドを投与する獣医学的方法および使用を包含する。

獣医学的使用は、（ｉ）動物における成長速度および／または範囲を向上させ、（ii）身体組織への飼料の変換効率を向上させ、（iii）泌乳動物において乳生産を向上させ、（iv）悪液質、外傷または他の消耗性疾患に伴う動物の消耗的症状を処置し、（ｖ）新生児の健康状態を改善するために泌乳動物を処置することを含む。

本明細書で引用した参考文献または文書は全て出典明示により援用する。

図１Ａ〜１Ｃは、３７℃で１０％ヒト血清の存在または非存在下での０または１６時間インキュベーション後における本発明および野生型ＩＧＦ−１前駆体のポリペプチドのウエスタンブロットである。様々なＩＧＦ−１構築物をコード化する発現ベクターを、Ｃｏｓ７細胞にトランスフェクションし、条件培養培地を得た。「３ｍｕｔ」は、以下３セットの修飾を有するｈＩＧＦ−１−Ｅ−ペプチド前駆体をいう：Ｇ１、Ｐ２およびＥ３の欠失；Ａｒｇ３７からＡｌａへの突然変異（Ｒ３７Ａ）；およびＲ７１およびＳ７２の欠失。図１Ａは、Ｅａを含む野生型および３ｍｕｔ前駆体についてのウエスタンブロット結果（ＩＧＦ−１に対する抗体を用いる）を示す。図１Ｂは、Ｅｂを含む野生型および３ｍｕｔ前駆体に関するウエスタンブロット結果（ｈＩＧＦ−１に対する抗体を用いる）を示す。図１Ｃは、Ｅｃを含む野生型および３ｍｕｔ前駆体に関するウエスタンブロット結果（ｈＩＧＦ−１に対する抗体を用いる）を示す。

図２Ａ〜２Ｄは、様々なＩＧＦ−１ポリペプチド（「リガンド」）の生物活性を示す線グラフである。Ｃｏｓ７−発現ポリペプチドでＣ２Ｃ１２筋芽細胞を刺激することにより、生物活性を測定した。次いで、刺激を加えたＣ２Ｃ１２細胞を、全ＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴの相対量について検定した。Long−Ｒ３−ＩＧＦ−１は、Ｅ３Ｒ突然変異およびさらなる１３アミノ酸Ｎ−末端伸長ペプチドを伴う成熟ヒトＩＧＦ−１アミノ酸配列から成る市販試薬（Sigma製品番号Ｉ−１２７１）である。図２Ａは、ＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの活性を示す。図２Ｂは、ＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの活性を示す。図２Ｃは、Ｅａアミノ酸９３〜１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６の間に挿入された３ｍｕｔ構築物である、ＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔの活性を示す。図２Ｄは、ＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの活性を示す。

図３Ａ〜３Ｄは、リガンド結合に応答した受容体リン酸化について検定することによる、本発明のＩＧＦ−１前駆体ポリペプチドが適切な受容体に対する選択性を維持しているか否かを示す線グラフである。図３Ａおよび３Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ａ）およびインスリン受容体（図３Ｂ）に対するＩＧＦ−１−Ｅａ３ｍｕｔの受容体選択性の試験結果である。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図３Ｃ）およびインスリン受容体（図３Ｄ）に対するＩＧＦ−１−Ｅｂ３ｍｕｔの受容体選択性の試験結果である。「ＩＧＦ１−Ｒ３」は、上記のLong−Ｒ３−ＩＧＦ−１をいう。「ＩＧＦ１Ｅａｂ」として列挙したポリペプチドは、Ｅａアミノ酸９３〜１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６の間に挿入された構築物をいう。

４Ａ〜４Ｄは、リガンド結合に応答した受容体リン酸化について検定することによる、本発明のＩＧＦ−１前駆体ポリペプチドが適切な受容体に対する選択性を維持しているか否かを示す線グラフである。図４Ａおよび４Ｂは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ａ）およびインスリン受容体（図４Ｂ）に対するＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔの受容体選択性の試験結果である。図４Ｃおよび４Ｄは、ＩＧＦ−１受容体（図４Ｃ）およびインスリン受容体（図４Ｄ）に対するＩＧＦ−１−Ｅａｂ３ｍｕｔの受容体選択性の試験結果である。「ＩＧＦ１−Ｒ３」は、上記のLong−Ｒ３−ＩＧＦ−１をいう。「ＩＧＦ１Ｅａｂ」として列挙したポリペプチドは、Ｅａアミノ酸９３〜１０２がＥｂのアミノ酸９５と９６の間に挿入された構築物をいう。

図５は、種々のリガンドによるＣ２Ｃ１２筋管（Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の３〜４日間の分化の結果として）の刺激時における相対的ＡＫＴリン酸化を示すウエスタンブロットである。ＩＧＦ−１Ｅｂマルチマーは、図６Ａで図示した構築物を指す。

図６Ａおよび６Ｂは、本発明ポリペプチドの２種を表す図である。図６Ａは、４セットの修飾を伴うＩＧＦ−１−Ｅｂ前駆体ポリペプチドを示す：Ｇ１、Ｐ２およびＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの突然変異；Ｒ７１およびＳ７２の欠失；および最後の７個のＣ−末端アミノ酸の欠失。さらに、２つのさらなるＥｂペプチド（ただし、Ｒ７１およびＳ７２を伴わず、最後の７個のＣ−末端アミノ酸を伴わない）を付加し、ポリペプチドのＣ−末端に最終Ｅｂペプチド（ただし、Ｒ７１およびＳ７２を伴わない）を付加することにより、ポリペプチドを伸長させる。この構築物は、ＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマーと称されることが多い。図６Ｂは、４セットの修飾を伴うＩＧＦ−１−Ｅａｂ前駆体ポリペプチドを示す：Ｇ１、Ｐ２およびＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの突然変異；Ｒ７１およびＳ７２の欠失；およびＥｂのアミノ酸９５および９６間におけるＥａアミノ酸９３〜１０２の挿入。

図７Ａは、対応する動物ＩＧＦ−１とのヒトＩＧＦ−１（配列番号１）の配列アラインメントである。分析した全動物種および配列に関するそれらの対応する GenBank 受入番号を示す。Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３は、Sterlet（カワリチョウザメ）（Ｓ２がＰ２と置き換わっている）を除き、分析した全種において保存されている。Ｒ３６およびＲ３７は、分析した全種において保存されている。

図７Ｂは、ヒトＩＧＦ−１（配列番号１）と比較した解析アミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。樹形図の下にあるのは、タンパク質配列に関する１００残基あたりの「アミノ酸置換」の数を示す目盛である。Kimura距離式を用いることにより、無ギャップミスマッチの数から誘導し、サイレント置換について補正した距離値を計算する。コンピューター処理値は、１部位あたりの差異の平均数であり、ゼロと１の間に含まれる。ゼロは完全な同一性を表し、１は同一性無しを表す。系統発生樹形図の目盛りは、これらの値を１００倍したものを使用する。

図８Ａは、様々な動物ＥａペプチドとのヒトＥａペプチド（配列番号２）の配列アラインメントである。分析した全動物種および配列に関するそれらの対応するGenBank受入番号を示す。Ｒ７１およびＳ７２は、分析した全種において保存されている。

図８Ｂは、ヒトＩＧＦ−１ Ｅａペプチド（配列番号２）と比較した解析アミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。

図９Ａは、様々な動物ＥｂペプチドとのヒトＥｂペプチド（配列番号３）の配列アラインメントである。分析した全動物種および配列に関するそれらの対応するGenBank受入番号を示す。Ｒ７１およびＳ７２は、分析した全種において保存されている。

図９Ｂは、ヒトＩＧＦ−１ Ｅｂペプチド（配列番号３）と比較した解析アミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。

図１０Ａは、様々な動物ＥｃペプチドとのヒトＥｃペプチド（配列番号４）の配列アラインメントである。分析した全動物種および配列に関するそれらの対応する GenBank 受入番号を示す。Ｒ７１およびＳ７２は、分析した全種において保存されている。

図１０Ｂは、ヒトＩＧＦ−１ Ｅｃペプチド（配列番号４）と比較した解析アミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。

図１１Ａは、対応する動物ＩＧＦ−２とのヒトＩＧＦ−２（配列番号７）の配列アラインメントである。分析した全動物種および配列に関するそれらの対応する GenBank 受入番号を示す。Ｒ６８は、分析した全種において保存されている。Ｄ６９は、その位置にヒスチジン残基があるチンパンジーを除き保存されている。

図１１Ｂは、ヒトＩＧＦ−２（配列番号７）と比較した解析アミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。

図１２Ａは、様々な動物ＩＧＦ−２ Ｅ−ペプチドとのヒトＩＧＦ−２ Ｅ−ペプチド（配列番号６）の配列アラインメントである。分析した全動物種および配列に関するそれらの対応する GenBank 受入番号を示す。Ｒ６８は、分析した全種において保存されている。Ｄ６９は、その位置にヒスチジン残基があるチンパンジーを除き保存されている。

図１２Ｂは、ヒトＩＧＦ−２ Ｅペプチド（配列番号６）と比較した解析アミノ酸配列の系統発生を示すグラフである。

発明の詳細な記載
本発明は、Ｅ−ペプチドからの活性ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の放出の誘因である典型的なプロテアーゼ開裂を阻止、低減化または回避するように実質的に修飾が加えられたＥ−ペプチドを含む新規ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２前駆体ポリペプチドに関するものである。本発明ポリペプチドの有用性は、前駆体ポリペプチドが生物活性を呈し、安定し、かつ医薬として有益であるという驚くべき発見に基づいている。

活性ＩＧＦ前駆体ポリペプチドについてのスクリーニング
本発明ポリペプチドの有用性は、以下の検定法を用いて評価され得る。
安定性 本発明ポリペプチドが有効な薬剤であるためには、内在性プロテアーゼの存在下、例えばヒト血清中において十分な安定性を有すべきである。安定性を評価するため、ポリペプチドをコード化する発現ベクターは、１０％胎児ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中のＣｏｓ７細胞（ＡＴＣＣ）へトランスフェクションされ得る。分泌されたポリペプチドを含む培養培地は、さらなる分析に適用され得るか、または別法として、発現ベクターがポリペプチドにおいて容易に利用可能な標識、例えばヘキサ−ヒスチジン標識をコード化することにより、Ｃｏｓ７培地中で発現されたポリペプチドの有効な精製を容易に行うことができる。しかしながら、調製したポリペプチド試料を、様々な期間（例、０、１、５、１０および１６時間）正常ヒト血清（Sigma）またはＰＢＳ中でインキュベーションし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースにブロッティングし、関連性のあるタンパク質を、ヒトＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に対する一次抗体および例えばホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した二次抗体を用いて視覚化する。場合によっては蛍光染料または放射性核種を用い、かなり多数の類似したブロッティングおよび検出技術が使用され得る。前駆体バンドの強度対ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２バンドの強度は、前駆体ポリペプチドが様々な条件下で開裂される場合の程度を示すことになる。３７℃で１６時間ヒト血清に暴露された本発明ポリペプチドは、約１：２〜１：０.１、例えば約１：１〜１：０.５の未開裂前駆体対開裂成熟ＩＧＦの比、特に約１：１の比率または約１：０.５の比率を呈し得る。典型的には、前駆体は少なくとも１：１の比を呈する。

ＡＫＴリン酸化 本発明ポリペプチドは、ＩＧＦ−１受容体を通したシグナリング能力を維持している（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は両方ともＩＧＦ−１受容体を通してシグナリングする）。このシグナリング能力を測定するため、下流細胞内標的、ＡＫＴが、細胞表面でのリガンド結合に応答してリン酸化されているか否かが評価され得る。ＡＫＴリン酸化の分析については、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を血清不含有培地中で飢餓させ、次いで種々のリガンドにより刺激を加える。細胞を溶解し、遠心分離により澄明にする。ＡＫＴリン酸化および全ＡＫＴレベルは、それぞれPathScanホスホＡＫＴ（Ser４７３）サンドイッチＥＬＩＳＡキットおよび PathScan ＡＫＴサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Cell Signaling）を用いるＥＬＩＳＡにより分析される。

ＩＧＦ−１受容体特異性 本発明ポリペプチドは、好ましくはＩＧＦ−１受容体についての特異性を維持しており、低親和力で関連インスリン受容体に結合する。受容体特異性を評価するため、ポリペプチド試料を、ＩＧＦ−１受容体またはインスリン受容体を過剰発現する血清飢餓ＮＩＨ３Ｔ３細胞に加え、細胞を溶解し、DuoSet IC ヒトリン光体−ＩＧＦ−１受容体およびインスリン受容体ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いるＥＬＩＳＡにライゼートをかけることにより、ＩＧＦ−１受容体リン酸化またはインスリン受容体リン酸化のレベルを測定する。

マウス肥厚モデルにおけるインビボ試験 本発明ポリペプチドが、既に筋肉肥厚に向かっている状況下で骨格筋量を増加させるように作用し得るか否かを測定するため、処置および未処置動物を運動させることにより、ポリペプチドを与えられた動物が未処置動物よりも多量の筋肉を生じたか否かが測定され得る。

運動モデル
当業界で公知の一モデルは、ユーザー可変負荷による自発走用ランニングホイールの使用に基づいている（例、Konhilas et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol ２８９：Ｈ４５５−Ｈ４６５、２００５参照）。自発走用ケージホイールは、運動強制モデルに共通する肉体的および心理的傷害を排除するため、筋肉量の増加が望まれる比較的健康な個体で使用される候補薬剤を評価するのにより適している。

適切なマウス系統であればいずれも使用可能である。例えば、雄Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、実験（例、ＩＧＦ前駆体ポリペプチドを与える）および対照群に無作為に割り当てる。運動用ホイールを設置したケージに動物を個々に収容する。運動させない対照動物については、ホイールの無い同一ケージに収容する。運動用ホイールは、Allen et al., J Appl Physiol ９０：１９００−１９０８（２００１）に記載されている。簡単に述べると、このシステムは、ホイールの回転により作動するデジタル式磁気カウンター（モデルＢＣ６００、Sigma Sport、オルネイ、イリノイ）を備えつけた５.０ｃｍ幅のランニング表面をもつ１１.５ｃｍ直径のホイール（モデル６２０８、Petsmart、フェニックス、アリゾナ）から成る。さらに、各ホイールに、負荷の調節を行う抵抗機械装置を備えつける。これは、ステンレス鋼釣り糸をケージ上部に取り付け、ホイール負荷に負担をかけないように回転軸のところでケージホイールに確保された固定滑車にワイヤーを巻きつけることにより達成される。再びワイヤーを、ばねとねじでケージ上部に固定する。この設計により、ホイール負荷の微調整が可能となり、ホイールの回転中終始均等に配分される。走行時間および距離に関する毎日の運動値を、運動持続時間全体を通して各動物について記録する。全動物に水およびげっ歯類用標準固形飼料を無制限に与える。自発走（ケージホイール露出）は、全群について平均約１２週齢で始まり得る。動物が約１９週齢になるまで、各群は、５０日間実験群によって抵抗を変えながら走行を続けさせる。ホイールが僅かに移動するまで、ホイールに既知重量のおもりを掛けることにより、ホイールの負荷を測定する。全運動群は、最初の週についてはケージホイールでの負荷無し状態から始める。しかしながら、「負荷無し」条件は実際には２ｇであり、これはホイール慣性および摩擦的負荷を維持するのに必要な負荷として測定される。１週間のホイール順化期間を考慮すると、ホイール負荷は、高い負荷以外１週間隔で変えられ得ることから、２週間後に変更され得る。負荷は、概して２ｇから１２ｇまでの範囲であり得る。特定運動期間の終了直後吸入麻酔下での頸部脱臼により、運動および非運動対照動物を安楽死させる。体格を測定し、特定筋肉を迅速に摘出し、洗浄し、将来的に組織学または生化学検定法に使用するため冷凍する。

代替的運動肥厚モデルもまた、当業者にとっては利用可能である。例えば、Lerman et al., J Appl Physiol ９２：２２４５−２２５５（２００２）に記載されたトレッドミル運動モデル参照。

クレンブテロール注射モデル
クレンブテロールは、筋量の増加誘発が立証された成長促進特性をもつβ_２−アドレナリン作用性アゴニストである。クレンブテロールの正確な作用機序は依然として不明瞭であるが、筋肉タンパク質分解の低減化が提案されている。臨床では、クレンブテロールは抗喘息薬として使用されるが、たいていはヒトおよび展示動物の両方で筋量を増加させる筋肉増強剤として誤用されていると思われる。

５匹のマウスに３、７または１４日間毎日クレンブテロールを注射（３ｍｇ／ｋｇ、皮下（s.c.））することにより、筋肉肥厚を誘導する。ＰＢＳを注射したマウスを陰性対照として使用する。処置に対する有害な反応（すなわち、粗毛、嗜眠状態）について動物を毎日監視（視診）する。クレンブテロール処置は、マウスを怯えさせるか、または攻撃的にする可能性があるため、マウスを群で収容する場合、争いについて特に監視するべきである。マウスは、順応性があるため、通常通り飲食し得る。マウスを３、７または１４日目に安楽死させ、さらなる分析用に組織を採取するまで、毎日それらを監視する。

筋委縮モデルにおけるインビボ試験 様々な骨格筋委縮モデルにおいて、一般に筋量を低下させる条件下での筋量の維持能力について本発明のＩＧＦ前駆体ポリペプチドが試験され得る。下記実施例のモデルにより、当業者であれば、ＩＧＦ前駆体ポリペプチドを投与および使用することにより上記ポリペプチドが筋量を増加させ得るか否かを測定する対照実験を容易に設計および実行できるはずである。

例えば、Ｃ５７Ｂ１６／２雄マウスを、The Jackson Laboratoriesから購入する。各実験開始時に約９週齢となるようにマウスを購入する。一般的には、通常のげっ歯類用飼料を入れたマイクロアイソレーターケージにマウスを収容する。各実験開始時、マウスを秤量する。各実験終了時、一般的にはマウスをＣＯ_２吸入、次いで頸部脱臼により安楽死させ、さらなる調製用に筋組織を採取する。マウスを秤量して、「最終体重」を得る。採取され得る骨格筋は、前頸骨筋、長趾伸筋、ヒラメ筋および腓腹筋である。採取される他の組織は、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、精巣および脳の場合もある。筋肉および組織を全て完全に解剖し、０.０００１ｇまで測定できる天秤で秤量する。次いで、後のＲＮＡおよびタンパク質抽出用に組織を液体窒素中で急速冷凍するか、またはコルクディスクにおいてＯＣＴ中に埋封させて急速冷凍する。後の冷凍切断用にコルクディスクにおいて冷凍した筋肉を、液体窒素により濃厚スラッシュに冷却したイソペンタンに浸す。全試料を−８０℃で貯蔵する。

デキサメタゾン処置
マウスにおける薬理学的筋肉消耗誘導方法では、２０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンによる腹腔内注射を毎日行う。デキサメタゾンは、グルココルチコイド類のホルモンの合成構成員である。それは、抗炎症および免疫抑制剤として作用し、ヒドロコルチゾンの約４０倍の効力をもつ。デキサメタゾンを用いて、多くの炎症および自己免疫状態、例えば慢性関節リウマチを処置する。また、それは、化学療法を受けている癌患者にも投与され、抗癌治療のある種の副作用を打ち消す。デキサメタゾンは、マウスおよびヒト患者の両方において筋委縮を誘発する。

マウスに３、７または１４日間デキサメタゾンの腹腔内（ip）注射を行う。最終日に対象をＣＯ_２により安楽死させ、足の筋肉を採取する。処置に対する有害な反応（すなわち、粗毛、嗜眠状態）について動物を毎日監視（視診）する。マウスは普通順応性があるため、通常通り飲食し得る。ＰＢＳを注射したマウスは陰性対照である。

ギプス固定化
様々な筋肉群を物理的に使わないと、それらの筋肉は萎縮する。足根関節固定（「踵固定」またはギプス固定）は、ラットおよびマウスの後脚筋系の物理的固定を誘導する非常に有用かつ再現性のある方法であることがわかった。

固定するためイソフルオランでマウスに麻酔をかける。関節周囲に軽量ギプス材（ＶＥＴ−ＬＩＴＥ）を巻いて足根および膝関節を９０度で固定する。ギプス材を温水に浸し、次いで、足指と股関節を自由に動かせる状態にして足に巻きつける。ギプス材が乾いてしまうまで関節を９０度の位置に維持する。反対側の足を対照として使用する。次いで、マウスを麻酔から回復させ、通常のマイクロアイソレーターケージに収容する。ギプス固定による過度のストレスの誘発は観察されず、動物はケージ付近を自由に動き回って飼料を食べ、水を飲んでいる。しかしながら、体重、活動性および過敏性に影響を及ぼす有害な事象についてマウスを毎日監視する。

一旦ギプスをマウスに適用すると、動物を毎日監視することにより、咀嚼が行われ得る際にギプスが定位置に留まっていることを確認する。動物は、麻酔から回復後、動きまわって、飲食し得るため、特殊な寝床、収容装置または他の補助を必要としない。

除神経
一般には、除神経するためイソフルオランガスでマウスに麻酔をかける。無菌手術手順（ベタジンで３回洗浄、最後にエタノール洗浄）を用いて、右坐骨神経を大腿中間部で分離し、２〜５ｍｍ片を切り取る。反対側の足を対照として用いる。

さらに具体的には、皮膚切開部を縫合クリップで閉じ、動物に単用量のブプレノルフィンの注射をした後、麻酔から回復させる。術後３、７または１４日目に、ＣＯ_２吸入、次いで頸部脱臼により動物を安楽死させ、組織学的および生化学的分析用に筋肉（腓腹筋複合体、前頸骨筋、長趾伸筋、ヒラメ筋）を取り出す。

坐骨神経を横に切開すれば、その足は動けない状態になるため、関与する筋肉の骨格筋委縮が誘導される。麻酔から回復後、普通なら動物は動き回って、飲食し得るため、特殊な寝床、収容装置または他の補助を必要としない。それにもかかわらず、動物を手術直後および回復期（１〜２時間）を通して監視する。さらに、切開部位および全般的な動物の健康状態を術後３日間監視する。縫合クリップを術後７〜１０日で除去する。

遺伝モデル
遺伝子操作を加えたトランスジェニックマウスは、筋委縮モデルとしても使用され得る。例えば、いわゆるミニマウス（The Jackson Laboratory、ストック番号００３２５８）は、ＩＧＦ−１遺伝子に生後の成長の異常な低下並びに低体重および体格をもたらすノックアウト突然変異を含む。追加的情報については、Powell-Braxton et al., Genes Dev ７：２６０９−２６１７（１９９３）参照。さらに、いわゆるミディマウス（The Jackson Laboratory、ストック番号００３２５９）は、低成体体重を呈する矮小体型および他の心臓血管表現型をもたらす異なる突然変異をＩＧＦ−１遺伝子に含む。追加的情報については、Lembo et al., J Clin Invest ９８：２６４８−２６５５（１９９６）参照。

ＩＧＦ前駆体における決定的および所望による突然変異または修飾
「決定的突然変異」 本発明は、一つには実質的にそのＥ−ペプチドを含むＩＧＦ前駆体ポリペプチドが血清の存在下では生物活性および安定性を残しているという観察に基づいている。Ｅ−ペプチドが、二塩基性プロテアーゼ部位をターゲッティングする内在性プロテアーゼにより開裂されないことを確認するため、一般には前駆体におけるＥ−ペプチドの２個のＮ−末端二塩基性アミノ酸のいずれか一方が欠失、突然変異導入または他の方法で遮蔽され得る。ｈＩＧＦ−１の場合、これら２個のアミノ酸はＲ７１およびＳ７２であり、ｈＩＧＦ−２の場合、初めのこれら２個のアミノ酸はＲ６８およびＤ６９である。

様々な修飾を加えることにより、この開裂が阻止され得る：
（１）一方または両方の二塩基性残基の欠失
（２）一または両二塩基性残基の非塩基性アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異
（３）二塩基性残基間における１個またはそれ以上の非塩基性アミノ酸の挿入
（４）プロテアーゼ部位の遮蔽に十分な形で二塩基性残基付近にグリコシル化部位を配置
（５）下記要領による、いずれかの二塩基性残基の置換、または二塩基性残基の付近またはその間における非天然アミノ酸挿入を用いる位置指定ペギル化。

さらに、残基Ｋ６８およびＫ６５は、ＩＧＦ−１／Ｅ−ペプチド開裂においてある一定の役割を果たすと思われる。したがって、これらの残基の突然変異または欠失は、上記の通り二塩基性アミノ酸に向けられた戦略に組み込まれ得る。

成熟ＩＧＦのＮ−末端における突然変異 本発明のある実施態様において、ＩＧＦ前駆体ポリペプチドは、最初の数個のＮ−末端アミノ酸の欠失または突然変異を有する。ＩＧＦ−１の場合、最初の３個のＮ−末端アミノ酸のいずれかを欠失または突然変異させ得、ＩＧＦ−２の場合、最初の６個のＮ−末端アミノ酸のいずれかを欠失または突然変異させ得る。ある種のＮ−末端アミノ酸はインビボで自然開裂されることが観察されており、これらの突然変異または欠失の導入により、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）と本発明ポリペプチドのインビボ会合は最小限度に抑えられる。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２とＩＧＦ−１受容体の相互作用は、ＩＧＦＢＰにより調節される。６種のＩＧＦＢＰは全て、ＩＧＦ作用を阻害することが示されたが（特にＩＧＦＢＰ５）、場合によっては、刺激作用が観察されることもあった。血行中のＩＧＦの少なくとも９９％は、通常ＩＧＦＢＰに結合している。新生児期間後の血行中における最も豊富なＩＧＦＢＰは、似た親和力でＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方と結合し得るＩＧＦＢＰ３である。天然に存する先端切除ＩＧＦ−１（Ｇ１、Ｐ２およびＥ３の欠失をもつ）は、天然ＩＧＦ−１の数分の１の親和力でＩＧＦＢＰ３に結合する。さらに、Ｇ３は、ＩＧＦＢＰ結合に重要であり、Ｇ６はＩＧＦ−２ペプチドにおいて似た役割を果たす。

したがって、ｈＩＧＦ−１前駆体の場合、Ｇ１、Ｐ２またはＥ３のいずれかを単独または組合わせて欠失または突然変異させ得る。突然変異導入が望ましいとき、アラニンへの突然変異が導入され得る。別の例では、ｈＩＧＦ−２前駆体の場合、Ｐ４、Ｓ５およびＥ６のいずれかを単独または組合わせて欠失または突然変異させ得る。突然変異導入が望ましいとき、アラニンへの突然変異が導入され得る。

残基３６および３７での突然変異 ＩＧＦ−１は、ヒト血清に存在するセリンプロテアーゼにより開裂され得る。ＡへのＲ３６またはＲ３７の突然変異は、Ｒ３６およびＲ３７間のこの予測される開裂部位でのＩＧＦ−１の開裂を阻止し得る。ｈＩＧＦ−２の場合、Ｒ３８を突然変異または欠失させることによりこの有害な開裂を阻止し得る。

グリコシル化の使用 Ｎ−結合グリコシル化が可能な哺乳類または他の真核生物細胞で発現されるとき、本発明ポリペプチドのインビボ半減期は、ＩＧＦまたは前駆体のＥ−ペプチド部分にＮ−結合グリコシル化部位を付加することにより改善され得る。ヒトＩＧＦ−１ ＥａのＮ９２およびＮ１００はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘは任意のアミノ酸であり得、トリプレットの３番目のアミノ酸はＳまたはＴである）の共通Ｎ−結合グリコシル化配列と適合するため、上記Ｅａはこれらの部分でグリコシル化されていることがインビトロで示された。また、共通配列の隣接アミノ酸関係が、いかに強くアスパラギンがグリコシル化されるかに影響することも知られている。したがって、グリコシル化部位をＥｂまたはＥｃへ導入する一戦略は、共通配列の周囲のＥａアミノ酸をＥｂまたはＥｃのほぼ同じ部分に挿入することである。この戦略の特定実施態様を下記実施例に示す。いずれにしても、当業者に公知である、周囲の関係アミノ酸を含む他の共通Ｎ−結合グリコシル化部位も、本発明の前駆体ポリペプチドに挿入され得る。さらに、本発明ポリペプチドのＯ−結合グリコシル化は、ポリペプチドの生成に使用される特定宿主を選択することにより達成され得る。例えば、ＩＧＦ−１発現用のある種の酵母株の使用により、セリンまたはトレオニンにおいてオリゴ糖が付加される。例えば、米国特許第５２７３９６６号参照。

ポリ（エチレングリコール）の付加 ポリ（エチレングリコール）への結合(コンジュゲーション)（ＰＥＧ；ペギル化）は、治療用タンパク質薬剤の半減期を延長するのに有益であることがわかった。本発明のＩＧＦ前駆体ポリペプチドのペギル化は、類似した医薬上の利益をもたらし得ると期待される。ＩＧＦ−１のペギル化方法は当業界では公知である。例えば、リシン−モノペギル化ＩＧＦ−１の有益な特性について報告している米国特許出願公開２００６／０１５４８６５号参照。上記リシン−モノペギル化は、本発明の前駆体ＩＧＦポリペプチドに適合され得る。さらに、ペギル化は、非天然アミノ酸の導入により本発明ポリペプチドのいずれの部分でも達成され得る。ある種の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc １２５：１１７８２−１１７８３、２００３；Wangおよび Schultz、Science ３０１：９６４−９６７（２００３）；Wang et al.、Science ２９２：４９８−５００、２００１；Zhang et al., Science ３０３：３７１−３７３、２００４または米国特許第７０８３９７０号に記載された技術により導入され得る。簡単に述べると、これらの発現系の中には、位置指定突然変異導入により、ナンセンスコドン、例えばアンバーＴＡＧを、本発明ポリペプチドをコード化する読み枠へ導入するものもある。次いで、上記発現ベクターを、選択された非天然アミノ酸を加えた、導入されるナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用し得る宿主に導入する。本発明ポリペプチドへ一部分を結合させる目的に有利である特定非天然アミノ酸には、アセチレンおよびアジド側鎖を伴うものがある。次いで、これらの新規アミノ酸を含むＩＧＦ前駆体ポリペプチドは、タンパク質におけるこれらの選択された位置でペギル化され得る。さらに、Ｅ−ペプチドを伴わない上記ペギル化ＩＧＦ分子でも治療薬として有用である。

Ｅ−ペプチドのマルチマー ある種の薬理学的状況では、血液−脳関門のいずれか一方側における薬剤の残存を確実にするため、ペプチドまたはタンパク質薬剤の大きさを増大させるのが有利である。成熟ＩＧＦ分子は比較的短いペプチドであるため、Ｅ−ペプチドが結合されたままの場合でさえ、本発明ポリペプチドの大きさを増大させることは有益であり得る。それを為す一手段は、下記実施例で説明している通り、ＩＧＦ前駆体ポリペプチドのＣ−末端にＥ−ペプチドのマルチマーを付加することである。

Ｅ−ペプチドのＣ−末端欠失 Ｅｂの８１位にある遊離システインは、本発明ポリペプチドに存在するとき、活性の劣る薬剤を生じさせ得るホモ二量体化または他の作用をもたらし得ることが疑われている。すなわち、ＥｂにおけるＣ８１の欠失または突然変異は、薬剤活性を最適化させ得る。ある特定例では、Ｅｂの最後の７個のアミノ酸（すなわち、アミノ酸８１〜８７）の欠失が有益である。

他の突然変異または修飾 本発明のＩＧＦ前駆体ポリペプチドに組み込まれ得るＩＧＦのさらなる突然変異または修飾については、米国特許第５０７７２７６号および米国特許出願公開第２００５／０２８７１５１号、同第２００６／０２１１６０６号および同第２００６／０１６６３２８号に記載されている。

本発明は、ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に加えて、実質的にそのＥ−ペプチドを含む既知および未知のヒト以外の動物前駆体ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２配列を全て包含し、Ｅ−ペプチドの通常の開裂は本発明の修飾によって回避または低減化されるものとする。

使用するのに好ましいＩＧＦのタイプは、処置されている対象の種に依存する。ＩＧＦは種適合性であるのが好ましく、例えばウシが処置されているとき、ＩＧＦの好ましいタイプはウシＩＧＦである。

ＩＧＦの全形態は、高い配列相同性故に異なる対象でもある一定の作用を有すると思われるが、種と適合させることにより、異なる種からのＩＧＦに対する免疫応答の誘導から生じる可能性のある有害な免疫学的合併症が回避される。

本発明の一実施態様では、修飾されたヒト以外の動物の前駆体ＩＧＦ−１配列が提供される。

好ましいのは、実質的にそのＥ−ペプチドを含む前駆体ＩＧＦ−１配列であり、Ｅ−ペプチドの通常の開裂は、脊椎動物からの本発明の修飾により回避または低減化される。

例えば、上記配列は、限定されるわけではないが、天然、合成または組換え体のいずれの供給源からにせよ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、イヌ、ネコ、魚類などからの配列を含む。

本発明の別の態様では、修飾を加えたヒト以外の動物の前駆体ＩＧＦ−２配列が提供される。

好ましいのは、実質的にそのＥ−ペプチドを含む前駆体ＩＧＦ−２配列であり、Ｅ−ペプチドの通常の開裂は、脊椎動物からの本発明の修飾により回避または低減化される。

例えば、上記配列は、限定されるわけではないが、天然、合成または組換え体のいずれの供給源からにせよ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、イヌ、ネコ、魚類などからの配列を含む。

ＩＧＦ前駆体ポリペプチドの治療的使用
適応症 本発明はまた、筋骨格疾患の処置または予防用の医薬の製造における本発明ＩＧＦ前駆体ポリペプチドの使用を含む。さらに、本発明は、個体が筋骨格疾患の危険に直面しているかまたはそれに罹患している場合であれ、そうでない場合であれ、上記個体において筋肉または骨量を増加させるためのＩＧＦ前駆体ポリペプチドの使用を包含するものである。

特に、筋骨格疾患は筋委縮であり得る。グルココルチコイド、例えばコルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、またはプレドニゾロンによる処置の結果を含め、筋委縮には多くの原因がある。筋委縮はまた、神経損傷による除神経の結果または変性、代謝性または炎症性ニューロパシー（例、ギヤン−バレー症候群、末梢神経障害、または環境毒素または薬剤への暴露）の結果であり得る。さらに、筋委縮は、成人運動ニューロン疾患、乳児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症、多巣性伝導ブロックを伴う自己免疫運動ニューロパシー、卒中または脊椎損傷による麻痺、外傷による骨格非可動化、長期床上安静、自発的休止、非自発的休止、代謝性ストレスまたは栄養失調、癌、エイズ、絶食、横紋筋融解症、甲状腺疾患、糖尿病、良性先天性低血圧、セントラルコア病、ネマリンミオパシー、筋細管（中心核）ミオパシー、火傷、慢性閉塞性肺疾患、肝臓病、敗血症、腎不全、うっ血性心不全または加齢の結果であり得る。

筋骨格疾患はまた、筋ジストロフィー症候群、例えばデュシェーヌ、ベッカー、筋緊張性、顔面肩甲上腕、エメリー−ドライフス(Deifuss)、眼咽頭、肩甲上腕骨、肢帯、先天性筋ジストロフィー、または遺伝性遠位性ミオパシーであり得る。筋骨格疾患はまた、オステオポローシス、骨折、低身長または小人症でもあり得る。

ＩＧＦ−１はまたＩＧＦ−１受容体およびインスリン受容体のヘテロ二量体と結合し得るため、ＩＧＦ−１はインスリン非感受性糖尿病に関する治療薬として提案されている。したがって、本発明ポリペプチドは、糖尿病の処置に使用され得る。

ＩＧＦ−１は、神経栄養性であり、ニューロンの生存を強化する。ＩＧＦ−１は、例えば筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳萎縮、加齢および認知症で見られる運動ニューロン死の症例を処置するのに使用され得ることが提案されている。したがって、本発明ポリペプチドは、ニューロン死、例えばＡＬＳ、脳萎縮または認知症に随伴する状態の処置に使用され得る。

ＩＧＦ−１は、白血球および赤血球数の両方を増加させ、エリスロポイエチンの投与に対して付加的効果を有する。したがって、本発明ポリペプチドは、貧血の処置に使用され得る。

ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、偏在しており、細胞分裂および脊椎動物成長の不可欠な調節因子であるため、それらは様々な獣医学的方法で有利に使用され、動物の成長を外因的に促進または維持し得る。以下に若干の例を挙げるが、これらに限定されるわけではない：
（ｉ）動物における成長の速度および／または範囲の向上、例えばブタ、ウシ、家禽および魚類における筋肉成長の促進；
（ii）例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、家禽および魚類における体組織への飼料の変換効率（赤身肉対脂肉比）の向上；および
（iii）泌乳動物、例えば乳牛、ヒツジ、ヤギにおける乳生産の向上。
他の獣医学的治療適用例には、以下のものがあるが、これらに限定されるわけではない：
（iv）例えばイヌ、ネコおよびウマといった伴侶動物における、悪液質、外傷または他の消耗性疾患に伴う動物の消耗的症状の処置、および
（ｖ）新生児の健康状態を改善するための泌乳動物の処置、例えば新生児の能力を改善するための泌乳雌豚の処置。

投与方法 本発明ポリペプチドは、遺伝子送達媒体の使用を含む様々な方法で送達され得る。例えばタンパク質または核酸といった作用物質の治療的送達について当業界で公知の方法であれば、本発明ポリペプチドの治療的送達に使用され得、例えば細胞トランスフェクション、遺伝子治療、送達媒体または医薬上許容される担体による直接投与、ポリペプチドをコード化する核酸を含む組換え細胞の提供による間接的送達法がある。

様々な送達系が知られており、本発明ポリペプチドの投与に使用され得、例えばリポソーム封入、微粒子、マイクロカプセル、タンパク質を発現し得る組換え細胞、受容体伝達エンドサイトーシス（例、Wu and Wu, J Biol Chem ２６２：４４２９−４４３２、１９８７参照）、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス（例、禽痘ウイルス、特に鶏痘ウイルス）または他のベクターの一部としての核酸の構築がある。導入方法は、経腸または非経口であり得、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経肺、鼻腔内、眼内、硬膜外および経口経路があるが、これらに限定されるわけではない。ポリペプチドは、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通した吸収による好都合な経路により投与され得、他の生物活性作用物質と一緒に投与され得る。投与は全身的または局所的であり得る。さらに、心室内および鞘内注射を含む、任意の適切な経路により本発明医薬組成物を中枢神経系に導入することが望ましい場合もあり得る。心室内注射は、例えばレザバー、例えばオマヤレザバーに心室内カテーテルを結合することにより容易に行われ得る。また、例えば吸入器または噴霧器、およびエーロゾル化剤を含む処方物の使用による、経肺投与も使用され得る。

一実施態様では、処置を必要とする領域に本発明医薬組成物を局所投与するのが望ましい場合もあり得る。これは、例えば、限定するわけではないが、手術中の局所注入、局所適用により、例えば注射、カテーテル手段により、またはインプラント手段により達成され得、上記インプラントは、膜、例えばシラスティック（sialastic）メンブラン、ファイバーまたは市販の皮膚代用物を含む、多孔質、非多孔質またはゼラチン状材料でできている。

別の実施態様では、活性物質は小胞、特にリポソームで送達され得る（Langer, Science ２４９：１５２７−１５３３、１９９０参照）。さらに別の実施態様では、活性物質は、放出制御系で送達され得る。一実施態様では、ポンプが使用され得る。別の実施態様では、ポリマー材料が使用され得る（Howard et al., J Neurosurg ７１：１０５、１９８９参照）。本発明の活性物質が本発明ポリペプチドをコード化する核酸であるさらに別の実施態様では、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えばレトロウイルスベクターを使用（例えば、米国特許第４９８０２８６号参照）して、それを投与することにより細胞内のものとするか、または直接注射により、またはパーティクル・ガン（例、遺伝子銃；Biolistic、Dupont）、または脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクション剤でのコーティングの使用により、または核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結した形でそれを投与すること（例、Joliot et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８：１８６４−１８６８、１９９１参照）等により、生体内投与し、そのコード化タンパク質の発現を促進させ得る。別法として、核酸は、相同的組換えにより、細胞内導入され、発現用の宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。

細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療 本発明は、インビトロおよびインビボでの細胞のトランスフェクションを目的とする本発明ポリペプチドをコード化する核酸の使用を包含する。これらの核酸は、標的細胞および生物体のトランスフェクションを目的とする若干の公知ベクターのいずれかに挿入され得る。核酸は、ベクターと標的細胞の相互作用を通してエクスビボおよびインビボで細胞にトランスフェクションされる。組成物を十分な量で対象に（例えば筋肉への注射により）投与することにより、治療的応答を誘導する。

別の態様において、本発明は、ヒトまたは他の動物における標的部位、すなわち標的細胞または組織の処置方法であって、本発明ポリペプチドをコード化する核酸で細胞をトランスフェクションすることを含み、その核酸が標的融合ポリペプチドをコード化する核酸に機能し得るように結合された誘導性プロモーターを含むものである方法を提供する。ヒトの疾患の処置または予防における遺伝子治療法については、例えばVan Brunt Biotechnology ６：１１４９−１１５４、１９９８参照。

併用療法 多くの実施態様において、本発明ポリペプチドは、１種またはそれ以上の追加的化合物または治療薬と組み合わせて投与され得る。例えば、多数のポリペプチドは、１種またはそれ以上の治療用化合物と連係的に併用投与され得る。併用療法は、同時または交互投与を包含し得る。さらに、この組合わせは短期または長期投与を包含し得る。本発明ポリペプチドは、同化促進剤、例えばテストステロンまたは特異的アンドロゲン受容体モジュレーター（ＳＡＲＭ）と組み合わせて投与され得る。さらなる同化促進剤には、成長ホルモン（ＧＨ）またはＧＨ放出を誘導する分子がある。グレリンは食欲を増進させ得るため、悪液質に関する併用療法において特に有用である。同様の特質で、本発明ポリペプチドをタンパク質補給剤と併用することにより、同化作用を増加させるか、または物理療法または運動と組み合わせることにより、体重を増加させ得る。また、ミオスタチンを阻害する分子であれば、併用療法に関する候補といえる。

医薬組成物 本発明はまた、本発明ＩＧＦ前駆体タンパク質および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。「医薬上許容される」の語は、連邦の規制機関または州政府により認可されているか、または米国薬局方または動物またはヒトでの使用について一般的に認められている他の薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」の語は、治療薬を投与する際に用いる希釈剤、補助薬、補形薬または賦形剤をいう。上記医薬用担体は、滅菌液、例えば水および油類であり得、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。適切な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノールなどがある。所望ならば、組成物はまた、少量の湿潤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、持効性製剤などの形態をとり得る。組成物は、慣用的結合剤および担体、例えばトリグリセリドにより、坐薬として処方され得る。経口処方物は、標準担体、例えば医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。適切な医薬用担体の例は、E.W.Martin による Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。

場合によっては、組成物は、人体への静脈内投与用に適合化させた医薬組成物として常用手順に従って処方されることもある。必要な場合、組成物に可溶化剤および局部麻酔薬、例えばリドカインを含ませることにより、注射部位の痛みを緩和させ得る。組成物を注入により投与する場合、それは、滅菌医薬用水または食塩水を含む注入ビンにより投薬され得る。組成物を注射により投与する場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを供給することにより、成分が投与前に混合され得る。

本発明ポリペプチドは、中性または塩形態として処方され得る。医薬上許容される塩類には、遊離アミノ基により形成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもの、および遊離カルボキシル基により形成されるもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものがある。

ある状態または疾患の処置における本発明ポリペプチドの有効量は、本記載に基づいた標準的臨床技術により決定され得る。さらに、所望によりインビトロ検定法を用いてもよく、最適な用量範囲を確認する助けとなり得る。また、処方物で使用される正確な用量は、投与経路、状態の重症度に依存するため、担当医の判断および各対象の環境に従って決定されるべきである。しかしながら、静脈内投与に適切な用量範囲は、一般に体重１キログラム当たり約２０〜５０００マイクログラムの活性化合物である。鼻腔内投与に最適な用量範囲は、一般に体重に基づき約０.０１ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿され得る。特に、可能な用量範囲は、１日２回皮下注射で体重に基づき約６０〜１２０μｇ／ｋｇであり得る。

獣医学的使用
前記のヒトにおける投与方法に加えて、さらに獣医学的投与についても考察を進める。

健康な動物と病気に罹患している動物に対して投与する場合、用量は異なり得る。適切な用量の評価は、当業界で公知の検定法、例えば下記の筋芽細胞増殖検定法（実施例７９）または乳房上皮組織検定法（実施例８０）を用いて当業者により容易に行われ得る。ＩＧＦを測定する一般的検定法もまた当業界では公知であり、例えば実施例８１記載のものがある。

当業者であれば、動物の種によっては光周期の長さの影響を受けて季節による生殖能力の変動を呈する場合もあることを認めるはずである。獣医学的方法または使用の実施態様の中には、所望により動物の生殖周期内の特定時点で処置法を開始することにより、所望の効果を達成し得る場合もある。当業者であれば、適切なプログラムの使用により生殖状態および周期を容易に決定し、所望ならば、同時性をもたせ得ることは認識しているはずである。

ヒトに対する使用に関する前記方法に加えて、獣医学的適応症に使用するとき、本発明のＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２ペプチドはまた、経口水薬として、または動物用の経口または固体飼料への補給剤として使用され得る。
以下、実施例により本発明についてさらに説明するが、限定するものではない。

実施例１
以下の修飾を含むｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドをコード化するＤＮＡ発現ベクターを構築した：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失、およびＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの突然変異；およびＲ７１の欠失およびＳ７２の欠失。これらの突然変異は、本開示全体を通して「３ｍｕｔ」と称される場合もある。この結果、以下の分泌タンパク質配列がもたらされる：
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm（配列番号８）

１０％胎児ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中でＣｏｓ７細胞（ＡＴＣＣから入手可能）を維持し、１０ｃｍプレート１枚当たり１×１０^６細胞の密度で平板培養した。これらの細胞培養物を、製造業者の使用説明書に従って、Fugene（Roche）を用いて発現プラスミド８μｇによりトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１回洗浄し、血清不含有培地で４８時間培養した。上清を集め、−８０℃で貯蔵した。

ヒト血清中におけるポリペプチド安定性を評価するため、野生型（ｗｔ）ｈＩＧＦ−１ＥａおよびｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔでトランスフェクションしたＣｏｓ７細胞から集めた上清を、３７℃で１６時間、１０％ヒト血清（Sigma）の非存在または存在下でインキュベーションした。試料を１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ヒトＩＧＦ−１に対するヤギポリクローナル抗体を用いて免疫ブロッティングを実施した。図１Ａの結果は、ｗｔ ｈＩＧＦ−１Ｅａが１６時間の血清とのインキュベーション後には実質的に分解されており、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔは安定していたことを示す。濃度計が、未開裂対開裂ＩＧＦ−１の比は約１：６.２であり、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔについての比は約１：０.６８であることを示していたことから、これらの突然変異は安定したポリペプチドをもたらすことがわかる。

ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔがＩＧＦ−１Ｒを通してシグナリングし得ることを確認するため、ポリペプチドと接触させた細胞のＡＫＴリン酸化を測定した。Ｃ２Ｃ１２をＡＴＣＣから購入し、１０％胎児ウシ血清（ＡＭＩＭＥＤ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Invitrogen）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）および２ｍＭグルタミン（Invitrogen）を含む高グルコース含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Invitrogen）中で維持した。ＡＫＴリン酸化を分析するため、Ｃ２Ｃ１２細胞を６ウェルプレートの１ウェル当たり０.１５×１０^６細胞の密度で平板培養し、７２時間成長培地で培養した。細胞を４時間血清不含有培地中で飢餓させ、次いで３７℃で３０分間種々のリガンドで刺激を加えた。様々なプロテアーゼ阻害剤を含む PhosphoSafe 緩衝液（Cell Signaling）により細胞を溶解し、４℃で１５分間、１４０００×ｇでの遠心分離により澄明にした。ＡＫＴリン酸化および全ＡＫＴレベルを、PathScan ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）サンドイッチＥＬＩＳＡキットおよび PathScan ＡＫＴサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Cell Signaling）を用いるＥＬＩＳＡによりそれぞれ分析した。ＡＫＴリン酸化結果を図２Ａに要約しており、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔが、long−Ｒ３−ＩＧＦ−１陽性対照試薬および組換えＩＧＦ−１と同様の程度までＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化し得たことがわかる。さらに、図５のデータは、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔがＡＫＴリン酸化に至ったことを直接示している。

次に、ｈＩＧＦ−１Ｅａ３ｍｕｔの受容体特異性がＩＧＦ−１Ｒにより残存していることを確認するため、様々なリガンドを、ＩＧＦ−１Ｒまたはインスリン受容体（ＩｎｓＲ）を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３の培養物に加えた。これらの細胞を、Ｃｏｓ７細胞に関する上記と同じ条件下で培養した。ＩＧＦ−１ＲおよびＩｎｓＲリン酸化を分析するため、ＮＩＨ３Ｔ３−ＩＧＦ１ＲおよびＮＩＨ３Ｔ３−ＩｎｓＲ細胞を、６ウェルプレートの１ウェル当たり０.２×１０^６細胞の密度で平板培養し、２４時間成長培地で培養した。細胞を１８時間血清不含有培地中で飢餓させ、次いで３７℃で１０分間種々のリガンドで刺激を加えた。ＡＫＴ実験に関する上記要領で細胞を溶解し、DuoSet IC ヒトリン光体−ＩＧＦ１Ｒおよび−ＩｎｓＲ ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いるＥＬＩＳＡによりＩＧＦ−１ＲおよびＩｎｓＲリン酸化レベルを分析した。図３Ａおよび３Ｂに要約した結果は、このＩＧＦ−１前駆体ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に関する特異性を保持しており、当然低親和力で関連インスリン受容体に結合することを示している。

実施例２
以下の突然変異を含むｈＩＧＦ−１−Ｅｂ前駆体ポリペプチドをコード化するＤＮＡ発現ベクターを構築した：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失、およびＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの突然変異；およびＲ７１の欠失およびＳ７２の欠失（すなわち、「３ｍｕｔ」）。この結果、以下の分泌タンパク質配列がもたらされる：
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk（配列番号９）

上記実施例１記載の手順にしたがってポリペプチドを検定した。図１Ｂおよび濃度計の使用により、未開裂対開裂ＩＧＦ−１の比が約１：９であり、ｈＩＧＦ−１Ｅｂ３ｍｕｔに関する比が約１：１であることがわかり、これらの修飾により安定したポリペプチドが得られることを示している。図２Ｂは、ｈＩＧＦ−１Ｅｂ３ｍｕｔが、long−Ｒ３−ＩＧＦ−１陽性対照試薬および組換えＩＧＦ−１と同様の程度までＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化し得たことを示す。さらに、図５のデータは、ｈＩＧＦ−１Ｅｂ３ｍｕｔがＡＫＴリン酸化に至ったことを直接示している。図３Ｃおよび３Ｄに要約した結果は、このＩＧＦ−１前駆体ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に関する特異性を保持しており、当然低親和力で関連インスリン受容体に結合することを示している。

実施例３
以下の突然変異を含むｈＩＧＦ−１−Ｅｃ前駆体ポリペプチドをコード化するＤＮＡ発現ベクターを構築した：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失、およびＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの突然変異；およびＲ７１の欠失およびＳ７２の欠失（すなわち、「３ｍｕｔ」）。この結果、以下の分泌タンパク質配列がもたらされる：
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk（配列番号１０）

上記実施例１記載の手順にしたがってポリペプチドを検定した。図１Ｃおよび濃度計の使用により、未開裂対開裂ＩＧＦ−１の比が約１：５であり、ｈＩＧＦ−１Ｅｃ３ｍｕｔに関する比が約１：０.９６であることがわかり、これらの修飾により安定したポリペプチドが得られることを示している。図２Ｄは、ｈＩＧＦ−１Ｅｃ３ｍｕｔが、long−Ｒ３−ＩＧＦ−１陽性対照試薬および組換えＩＧＦ−１と同様の程度までＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化し得たことを示す。さらに、図５のデータは、ｈＩＧＦ−１Ｅｃ３ｍｕｔがＡＫＴリン酸化に至ったことを直接示している。図４Ａおよび４Ｂに要約した結果は、このＩＧＦ−１前駆体ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に関する特異性を保持しており、当然低親和力で関連インスリン受容体に結合することを示している。

実施例４
ｈＩＧＦ−１−Ｅｂペプチドへの以下の修飾を含むｈＩＧＦ−１−Ｅａｂキメラ前駆体ポリペプチドをコード化するＤＮＡ発現ベクターを構築した：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失、およびＥ３の欠失；Ｒ３７のＡへの突然変異；Ｒ７１の欠失およびＳ７２の欠失（すなわち、「３ｍｕｔ」）；およびＥｂのアミノ酸９５と９６の間におけるＥａアミノ酸９３〜１０２の挿入。この挿入により、Ｎ９２において推定的Ｎ−結合グリコシル化シグナルが作成される。この結果、以下の分泌タンパク質配列がもたらされる：
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk（配列番号１１）

上記実施例１記載の手順にしたがってポリペプチドを検定した。図２Ｃは、ｈＩＧＦ−１Ｅａｂ３ｍｕｔが、long−Ｒ３−ＩＧＦ−１陽性対照試薬および組換えＩＧＦ−１と同様の程度までＩＧＦ−１Ｒ細胞経路を活性化し得たことを示す。図４Ｃおよび４Ｄに要約した結果は、このＩＧＦ−１前駆体ポリペプチドがＩＧＦ−１受容体に関する特異性を保持しており、インスリン受容体を活性化しないことを示している。

実施例５
以下の突然変異を含むｈＩＧＦ−１−Ｅｂマルチマー前駆体ポリペプチドをコード化するＤＮＡ発現ベクターを構築した：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失、Ｅ３の欠失、Ｒ３６の欠失、Ｒ３７の欠失、Ｒ７１の欠失、Ｓ７２の欠失、Ｅｂの最後の７個のＣ−末端アミノ酸の欠失、および両方ともＲ７１およびＳ７２および最後の７個のＣ−末端アミノ酸を伴わない２個の追加的ＥｂペプチドおよびＲ７１およびＳ７２を伴わない第４かつ最終のＥｂペプチドの、この前駆体のＣ−末端への挿入。図６は、この構築物の概略図である。この結果、以下の分泌タンパク質配列がもたらされる：
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk（配列番号１２）

このポリペプチドを、実施例１記載のＡＫＴリン酸化検定法にかけた。図５は、このｈＩＧＦ−１−ＥｂマルチマーがＩＧＦ−１Ｒ経路を通してシグナリングし得たことを示している。

実施例６
図６Ｂに概略を示した本発明のｈＩＧＦ−１−Ｅｂ前駆体ポリペプチドが発現され得る。この構築物は、以下の修飾を含む：Ｇ１の欠失、Ｐ２の欠失、Ｅ３の欠失、Ｒ３６の欠失、Ｒ３７の欠失、Ｒ７１の欠失、Ｓ７２の欠失、およびＥｂのアミノ酸９５と９６の間におけるＥａアミノ酸９３〜１０２の挿入。これによりＮ９２およびＮ１００位にＮ−結合グリコシル化部位が作成される。この結果、以下の分泌タンパク質配列が得られる：
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk（配列番号１３）

実施例７
以下の修飾を有する本発明のｈＩＧＦ−２−Ｅ前駆体ポリペプチドが発現され得る：Ｐ４の欠失、Ｓ５の欠失、およびＥ６の欠失；Ｒ３８のＡへの突然変異；およびＲ６８の欠失およびＤ６９の欠失。この結果、以下の分泌タンパク質配列が得られる：
ayrtlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrasrgiveeccfrscdlalletycatpaksevstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk（配列番号１４）

実施例８
以下の突然変異を有する本発明のｈＩＧＦ−１−Ｅａ前駆体ポリペプチドが発現され得る：Ｇ１の欠失およびＰ２の欠失；Ｅ３のＸ（Ｘは、ペギル化された非天然アミノ酸である）への突然変異；Ｒ３７のＡへの突然変異；およびＲ７１の欠失およびＳ７２の欠失。この結果、以下の分泌タンパク質配列が得られる：
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm（配列番号１５）

実施例９〜７８（Δ＝欠失）
９） hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号16)
10) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号17)
10) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号18)
11) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号19)
12) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号20)
13) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号21)
14) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号22)
15) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; ΔR37; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号23)
16) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号24)
17) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号25)
18) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号26)
19) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号27)

20) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号28)
21) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号29)
22) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号30)
23) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号31)
24) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号32)
25) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号33)
26) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号34)
27) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE2; R37A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号35)
28) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号36)
29) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号37)

30) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号38)
31) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号39)
32) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71; Ｅｂのアミノ酸９５と９６の間におけるEa アミノ酸93-102の挿入(すなわち"Eab")
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号40)
33) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号41)
34) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔR71
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号42)
35) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号43)
36) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号44)
37) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号45)
38) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R36A; ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号46)
39) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3, ΔR37, ΔR71, ΔS72
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号47)

40) hIGF-1-Ea: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号48)
41) hIGF-1-Eb: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号49)
42) hIGF-1-Ebマルチマー: (ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号50)
43) hIGF-1-Ebマルチマー:（ΔP2, ΔE3; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号51)
44) hIGF-1-Ec: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号52)
45) hIGF-1-Ea: ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号53)
46) hIGF-1-Eb: ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号54)
47) hIGF-1-Ebマルチマー:(ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号55)
48) hIGF-1-Ebマルチマー:(ΔE3; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号56)
49) hIGF-1-Ec: ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号57)

50) hIGF-1-Ea: ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号58)
51) hIGF-1-Eb: ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号59)
52) hIGF-1-Ec: ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号60)
53) hIGF-1-Eab: ΔE3; R37A; Δ R71, ΔS72
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号61)
54) hIGF-1-Ebマルチマー: (ΔE3; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号62)
55) hIGF-1-Ea: E3A; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号63)
56) hIGF-1-Eb: E3A; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号64)
57) hIGF-1-Ec: E3A; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号65)
58) hIGF-1-Eab: E3A; R37A; ΔR71, ΔS72
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号66)
59) hIGF-1-Ebマルチマー:(E3A; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号67)

60) hIGF-1-Ea: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号68)
61) hIGF-1-Eb: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号69)
62) hIGF-1-Ec: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号181)
63) hIGF-1-Eab: ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号70)
64) hIGF-1-Ebマルチマー:(ΔP2, ΔE3; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号71)
65) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2; E3X; R37A; ΔR71, ΔS72
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号72)
66) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2; E3X; R37A; ΔR71, ΔS72
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号73)
67) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2; E3X; R37A; ΔR71, ΔS72
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号74)
68) hIGF-1-Ebマルチマー:(ΔG1, ΔP2; E3X; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号75)
69) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (配列番号76)

70) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号77)
71) hIGF-1-Ec: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (配列番号78)
72) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71; S72X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号79)
73) hIGF-1-Ebマルチマー:(ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A)-Eb(ΔR71; S72X;ΔC-末端 7 aa)-2xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72)
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpakXsavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (配列番号80)
74) hIGF-1-Ea: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72; N92X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkXasrgsagnknyrm (配列番号81)
75) hIGF-1-Eb: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72; C142X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (配列番号82)
76) hIGF-1-Eab: ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72; C151X
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (配列番号83)
78) hIGF-1-Ebマルチマー(ΔG1, ΔP2, ΔE3; R37A)-3xEb(ΔR71, ΔS72, ΔC-末端 7 aa)-Eb(ΔR71, ΔS72; C71X)
TlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk（配列番号８４）

実施例７９：筋芽細胞増殖検定法
筋芽細胞増殖検定法は、ＩＧＦ活性の信頼できるインビトロ指標を提供するため、胚筋芽細胞および成人サテライト細胞に影響を及ぼす因子に関するモデルとして使用される。この系で活性を示す因子は、筋芽細胞の一次培養物において類似した反応を示す。本発明ペプチドによりインビトロでの筋芽細胞増殖が促進されるということは、筋芽細胞増殖の増加、従って子宮内での終極筋原線維数の増加の誘発におけるその活性を示している。さらに、筋芽細胞増殖が同様に促進されるということは、この発明のペプチドを用いて、例えばサテライト筋肉細胞増殖の刺激により、成人筋肉肥厚が促進され得ることを示す。

実施例８０：乳房上皮組織検定法
泌乳動物では、乳を生産および分泌する細胞であることから、乳房上皮組織の量が乳生産における制限因子である。インビトロ系を用いて、動物の乳腺から得た上皮細胞を本発明の修飾ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２で刺激することにより、乳成分の量を増産させることができる。さらに、上記インビトロ細胞系で増殖するように刺激を加えた乳房上皮細胞を、澄明にした乳房脂肪パッドに再移植して、刺激を加えることにより、泌乳中の雌動物において乳を増加および／または生産させ得ることが立証され得る。

実施例８１：血液または他の体液におけるＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の測定
一用量につき非経口投与されるペプチドの有効量は、用量応答曲線により測定され得る。例えば、本発明の修飾ＩＧＦペプチドを、処置すべき対象の血液または体液中で測定することにより、投与量が決定され得る。別法として、増加量のペプチドを対象に投与し、修飾ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２について対象の血清レベルをチェックすることも可能である。ペプチドの使用量は、修飾ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２のこれらの血清レベルに基づいてモル単位で計算され得る。

ペプチドの適切な投与量の一決定方法では、必然的に生物流体、例えば体液または血液中の本発明ＩＧＦペプチドを測定する。上記レベルの測定は、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡを含む任意の手段により実施され得る。ＩＧＦレベルの測定後、流体を、単または多用量を用いてペプチドと接触させる。この接触段階後、ＩＧＦレベルを液中で再測定する。液体ＩＧＦレベルが、分子を投与する際の所望の効力を生み出すのに十分な量程度低下している場合、分子の用量を調節することにより、最大効力を生じさせ得る。この方法は、インビトロでもインビボでも実施され得る。好ましくは、この方法はインビボで実施され、すなわち液体を対象から抽出し、ＩＧＦレベルを測定した後、本発明ペプチドを、単または多用量を用いて哺乳類に投与し（すなわち、動物に投与することにより接触段階を実施する）、次いでＩＧＦレベルを動物から抽出した液体から再測定する。

投与量の別の決定方法は、ペプチドに対する抗体の使用またはＬＩＦＡフォーマットでの別のペプチド検出方法である。

実施例８２：ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ３ｍｕｔのインビボ薬物動態
成体雄マウス（ｎ＝３／群）に、１ｍｇ／ｋｇでのｒｈＩＧＦ−１および１.５５ｍｇ／ｋｇでのｈＩＧＦ−１−Ｅｃ ３ｍｕｔ（実施例３に記載）の静脈内（i.v.）ボーラス注射を行った。血液試料を試験物質投与の５、１５、３０および６０分後に採取した。ｒｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−１−Ｅｃ ３ｍｕｔの血清濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。この検定法は、ｈＩＧＦ−１に特異的である。

等モル用量のｒｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−１−Ｅｃ ３ｍｕｔを、マウスに静脈内投与した。結果は、調べた全時点でｒｈＩＧＦ−１と比べてｈＩＧＦ−１−Ｅｃ ３ｍｕｔのレベルが著しく高いことを示していることから、ｈＩＧＦ−１−Ｅｃ ３ｍｕｔは、７０アミノ酸長ＩＧＦ−１よりも代謝的に安定していることがわかる。

Claims (26)

1. プロテアーゼによるＩＧＦ−１からのＥ−ペプチドの開裂を、前駆体タンパク質の修飾により低減化する、ヒトＩＧＦ−１前駆体タンパク質を含むポリペプチド。
2. 前駆体タンパク質がＥａペプチドを含む、請求項１記載のポリペプチド。
3. 前駆体タンパク質がＥｂペプチドを含む、請求項１記載のポリペプチド。
4. Ｅｂの最後の７個のＣ−末端アミノ酸が欠失している、請求項３記載のポリペプチド。
5. 前駆体タンパク質がＥｃペプチドを含む、請求項１記載のポリペプチド。
6. 前駆体タンパク質のＧ１が欠失または突然変異している、請求項１から５のいずれか１項記載のポリペプチド。
7. 前駆体タンパク質のＰ２が欠失または突然変異している、請求項１から６のいずれか１項記載のポリペプチド。
8. 前駆体タンパク質のＥ３が欠失または突然変異している、請求項１から７のいずれか１項記載のポリペプチド。
9. 前駆体タンパク質のＲ３６が欠失または突然変異している、請求項１から８のいずれか１項記載のポリペプチド。
10. Ｒ３６がアラニンに突然変異している、請求項１から９のいずれか１項記載のポリペプチド。
11. 前駆体タンパク質のＲ３７が欠失または突然変異している、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリペプチド。
12. Ｒ３７がアラニンに突然変異している、請求項１から１１のいずれか１項記載のポリペプチド。
13. さらに、Ｎ−結合グリコシル化共通配列ＮＸＳ／Ｔを含む、請求項１から１２のいずれか１項記載のポリペプチド。
14. さらに、Ｅｂのアミノ酸Ｎ９５とＴ９６の間に挿入されたＥａのアミノ酸９３〜１０２を含む、請求項３記載のポリペプチド。
15. さらに、前駆体タンパク質のアミノ酸側鎖に共有結合しているオリゴ糖を含む、請求項１から１４のいずれか１項記載のポリペプチド。
16. オリゴ糖が、前駆体タンパク質のアルギニン側鎖に共有結合している、請求項１５記載のポリペプチド。
17. 前駆体タンパク質の残基が非天然アミノ酸により置換されている、請求項１から１６のいずれか１項記載のポリペプチド。
18. 非天然アミノ酸がアセチレンまたはアジド基を含む、請求項１７記載のポリペプチド。
19. さらに、前駆体タンパク質の側鎖に共有結合しているポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項１から１８のいずれか１項記載のポリペプチド。
20. さらに、前駆体タンパク質のＣ−末端に結合されたさらなるＥ−ペプチドを含む、請求項１から１９のいずれか１項記載のポリペプチド。
21. Ｎ−末端からＣ−末端まで、
    第１Ｅｂペプチド含むＩＧＦ−１前駆体タンパク質（ただし、Ｇ１、Ｐ１およびＥ１は欠失しており、Ｒ３６およびＲ３７は欠失しており、Ｒ７１およびＳ７２は欠失しており、第１Ｅｂペプチドの最後の７個のＣ−末端アミノ酸は欠失している）、
    第２Ｅｂペプチド（ただし、Ｒ７１、Ｓ７２および第２Ｅｂペプチドの最後の７個のＣ−末端アミノ酸は欠失している）、
    第３Ｅｂペプチド（ただし、Ｒ７１、Ｓ７２および第３Ｅｂペプチドの最後の７個のＣ−末端アミノ酸は欠失している）、および
    第４Ｅｂペプチド（ただし、Ｒ７１およびＳ７２は欠失している）
    を含むポリペプチド。
22. 前駆体タンパク質のＲ７１またはＳ７２が欠失または突然変異している、請求項１から２０のいずれか１項記載のポリペプチド。
23. プロテアーゼによるＩＧＦ−２からのＥ−ペプチドの開裂を、前駆体タンパク質の修飾により低減化する、ヒトＩＧＦ−２前駆体タンパク質を含むポリペプチド。
24. 前駆体タンパク質のＲ６８またはＤ６９が欠失または突然変異している、請求項２３記載のポリペプチド。
25. 筋骨格疾患、糖尿病、神経細胞死、または貧血の処置方法であって、対象に治療有効量の請求項１から２４のいずれか１項記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
26. 筋骨格疾患、糖尿病、神経細胞死、または貧血の処置を目的とする医薬の製造における請求項１から２４のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。

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