ES2269506T3

ES2269506T3 - Terapia de regulacion genica que comprende ferritina.

Info

Publication number: ES2269506T3
Application number: ES01992721T
Authority: ES
Inventors: Robert H. Broyles; Robert A. Floyd
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-11-01
Filing date: 2001-11-01
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2021-11-01
Also published as: WO2002036634A2; PT1354032E; US20040186048A1; DE60122211D1; EP1354032B1; CA2427629A1; US7517669B2; AU2002217964B2; AU1796402A; US20020128183A1; DE60122211T2; EP1354032A2; ATE335811T1; WO2002036634A3; JP2005512941A

Abstract

Uso de (i) ferritina H que es capaz de unirse al promotor del gen de la a- globina en -150 pares de bases del sitio de comienzo de la transcripción (ii) oligonucleótidos de sentido contrario específicos para el gen que codifica la proteína de la familia de la ferritina distinta de la ferritina H y que reprime la expresión de dicha proteína de familia de la ferritina, o (iii) un gen que codifica la ferritina H como se ha definido anteriormente en (i) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de células falciformes de una a-talasemia, en el que el medicamento no es para terapia génica mediante la modificación de la línea germinal.

Description

Terapia de regulación génica que comprende ferritina.

Antecedentes Campo de la invención

La presente invención se refiere a la terapia por regulación génica que implica ferritina. Más particularmente, la invención se refiere al uso de Ferritina-H y proteínas derivadas de la misma para la regulación de genes relacionados con el metabolismo y regulación de hierro.

1. Técnica anterior Antecedentes de la enfermedad de células falciformes

La hematopoyesis, o la formación de células sanguíneas, comienza en el desarrollo del embrión humano como racimos de células del tronco llamados islas sanguíneas. Estas células aparecen en el saco vitelino aproximadamente en la tercera semana del desarrollo y, a aproximadamente el tercer mes, migran al hígado en desarrollo que llega a ser el sitio principal de la formación de células sanguíneas. Aunque el bazo, nódulos linfáticos y médula ósea hacen todas pequeñas contribuciones al desarrollo de las células sanguíneas, no hasta el cuarto mes hace la médula ósea llegue a ser el sitio principal de hematopoyesis. En el nacimiento, virtualmente todas las células sanguíneas se originan a partir de la médula sanguínea. Aunque persisten pequeños focos de células formadoras de sangre algunas veces en el hígado durante largos períodos de tiempo, la formación de células sanguíneas hepáticas ha disminuido hasta un goteo. En este momento, toda la médula está formando activamente células sanguíneas y continúa así hasta después de la pubertad cuando, a aproximadamente 18 años de edad, los sitios principales de formación de células sanguíneas llega a ser la médula de los vertebrados, costillas, esternón, cráneo, pelvis y las regiones de la epífisis próximas del fémur y húmero. Estas áreas representan solamente aproximadamente la mitad de la médula disponible. Las cavidades que permanecen se llenan con tejidos grasos amarillos.

En el adulto, la hematopoyesis implica la médula ósea, los ganglios linfáticos y el bazo. Estos órganos y tejidos asociados se dividen tradicionalmente en mieloide y tipos de tejido linfoide. Los tejidos mieloides y las células derivadas del tejido mieloide incluyen los eritrocitos, plaquetas, granulocitos y monocitos. Los tejidos linfoides y derivados de linfoides incluyen el timo, ganglios linfáticos y bazo. La división mieloide/linfoide es en cierta medida artificial ya que estos dos tipos de tejidos se cree que se originan a partir de una única célula del tronco pluripotente.

Las células del tronco linfoide y mieloide, formadas a partir de la división de la célula pluripotente, son precursores de todos los tipos de células posteriores. Los tipos de células encargadas de la célula del tronco linfoide incluyen las células pro-T que forman células T maduras y las células pro-B que se diferencian en las células de plasma. Los tipos de células intermedios se pueden distinguir basándose en el fenómeno de superficie celular tales como la expresión de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, la proteína Ia y otros marcadores de la superficie celular. Los tres tipos de células encargadas de la célula del tronco mieloide incluyen células E/mega que se diferencian en la unidad formadora del estallido de eritrocitos (BFU-E) seguido de las células de la unidad formadora de colonias de eritrocitos (CFU-E) y células megacariocitos-CFU (CFU-mega), células garnulocitos/macrófagos-CFU (CFU-G/M) que se diferencian en células CFU-G y CFU-M, y las células eosinófilos-CFU (CFU-Eo) que por último forman eosinófilos maduros. Aunque estos tipos de células encargadas residen principalmente en la médula, algunas circulan a lo largo del cuerpo en el torrente sanguíneo.

Las proporciones relativas de los tipos de células en la médula ósea tienen una relación mieloide/eritroide de aproximadamente tres a una que comprenden aproximadamente 60% de granulocitos y sus precursores, aproximadamente 10% de linfocitos y sus precursores, aproximadamente 20% de eritrocitos y sus precursores, y aproximadamente 10% de células no identificadas. Los tipos de células mieloides predominantes en la cavidad de la médula son los mielocitos, metamielocitos y granulocitos. Los tipos de células predominantes en el compartimiento de eritroides son los normoblastos policromatofílicos y ortocrómicos. En condiciones de metabolismo de hierro normal, aproximadamente el 30% a 40% de los normoblastos contienen gránulos de ferritina dispersados. Estas células se denominan sideroblastos y los gránulos de hierro que contienen son reservorios diseñados a partir de ellas ya que las células insertan hierro en protoporfirina para formar hemo. La producción de hemo y la producción de globina están de manera precisa equilibradas dentro de la célula. Si o bien se impide o se deprime, por cualquier razón, el exceso de ferritina se acumula en los sideroblastos. Es incremento de acumulación de hierro se puede visualizar en la mitocondria, el lugar de la síntesis de hemo.

La función principal de los glóbulos rojos es transportar oxígeno a los tejidos del cuerpo. Las funciones secundarios incluyen la transformación de nutrientes, mensajes intercelulares y citoquinas, y la absorción de metabolitos celulares. La anemia, o pérdida de glóbulos rojos o capacidad de glóbulos rojos, se puede definir a groso modo como una reducción en la capacidad de la sangre de transportar oxígeno y puede ser aguda o crónica. La pérdida de sangre crónica puede estar provocada por anormalidades de glóbulos rojos extrínsecas, anormalidades intrínsecas o producción alterada de glóbulos rojos. Las anormalidades intrínsecas o extracorpusculares incluyen trastornos mediados por anticuerpos tales como reacciones de transfusión y eritroblastosis, trauma mecánico a los glóbulos rojos tales como anemias hemolíticas micro-angiopáticas, púrpura trombocitopénica trombótica y coagulación intravascular diseminada. Además, las infecciones por parásitos tales como plasmodio, lesiones químicas de, por ejemplo, envenenamiento por plomo, y secuestro en el sistema mononuclear tal como por hiperesplenismo puede provocar trastornos de glóbulos rojos.

La hemoglobina comprende cuatro cadenas de proteínas, dos cadenas alfa y dos cadenas beta (\alpha_{2}\beta_{2}), entretejidas juntas, cada una con su propia molécula de hierro y con un peso molecular combinado de aproximadamente 68 kD. La macromolécula de hemoglobina está normalmente glicosilada y tras absorber oxígeno de los pulmones se transforma en oxihemoglobina (HbO_{2}). Existen al menos seis formas distintas de hemoglobina, cada una expresada en diversos momentos durante el desarrollo. La hemoglobina en el embrión se encuentra en al menos tres formas, Hb-Gower 1 (\xi_{2} \varepsilon_{2}), Hb-Gower 2 (\alpha_{2} \varepsilon_{2}), y Hb-Portland (\xi_{2} \gamma_{2}). La hemoglobina en el feto comprende casi totalmente HbF (\alpha_{2} \gamma_{2}), mientras que la hemoglobina en el adulto contiene aproximadamente 96% de HbA (\alpha_{2} \beta_{2}), aproximadamente 3% de HbA_{2} (\alpha_{2} \delta_{2}) y aproximadamente 1% de HbF fetal (\alpha_{2} \gamma_{2}). El cambio embrionario de la expresión de globina desde \xi- a \alpha- y a partir de \varepsilon- a \gamma- comienza en el saco vitelino. Sin embargo, las cadenas de \xi- y \varepsilon- embrionarias se han encontrado en el hígado fetal y la transición completa a la forma fetal no se produce hasta el final en el desarrollo fetal. El cambio fetal desde \gamma- a \beta- comienza más tarde en la eritropoyesis con la cantidad de \beta-globina producía incremento a lo largo de la gestación. En el nacimiento, \beta-globina es responsable de aproximadamente el 40% de la síntesis de la cadena no-\alpha-globina y después de esto continúa incrementándose rápidamente.

Los defectos o mutaciones en la expresión de la cadena de globina son comunes. Alguna de estas mutaciones genéticas no plantean consecuencias adversas o solamente secundarias a la persona, sin embargo, la mayoría de las mutaciones previenen la formación de una molécula de hemoglobina intacta o normal a través de una incapacidad funcional o estructural para unirse de manera eficaz a hierro, una incapacidad de las cadenas o pares de cadenas para interactuar de manera eficaz o apropiada, una incapacidad de la molécula para absorber o liberar oxígeno, un fallo para expresar cantidades suficientes de una o más cadenas de globina o una combinación de estas malfunciones. Por ejemplo, las sustituciones de valina por ácido glutámico en la posición sexta de la cadena \beta produce HbS y se encontró en aproximadamente el 30% de americanos negros. En el heterocigoto de HbS, solamente aproximadamente el 40% de la hemoglobina total en HbS siendo el resto el HbA más normal.

Tras la desoxigenación, las moléculas de HbS se someten a la agregación y polimerización conduciendo por último a la distorsión morfológica de los glóbulos rojos que adquieren un forma de hoz o de hoja de acebo. La falciformación tiene dos consecuencias principales, una anemia hemolítica crónica y una oclusión de vasos sanguíneos pequeños que da como resultado en daño isquémico a los tejidos. Además cuando se exponen a bajas tensiones, la polimerización convierte la hemoglobina HbS de un líquido fluido en un gel viscoso. Por consiguiente, el grado de una patología asociada a la anemia de células falciformes se puede correlacionar con la cantidad relativa de HbS en el sistema del paciente.

Los individuos con anemia de células falciformes severa no desarrollan ningún síntoma hasta aproximadamente cinco a seis meses después del nacimiento. En estos niños se determinó que la hemoglobina fetal no interaccionaba con HbS y, en tanto como se presenten cantidades suficientes, podrían modular los efectos de la enfermedad de HbS. este efecto modulador de la \gamma-globina también se observa con otros trastornos de \beta-globina, tales como HbC y HbD, y otras mutaciones de la cadena \beta. La polimerización de HbS está también significativamente afectada por la concentración de hemoglobina de la célula. Cuanto mayor es al concentración de HbS, mayor son los cambios para la puesta en contacto entre dos o más moléculas de HbS. La deshidratación incrementa la concentración de hemoglobina y facilita en gran medida la falciformación.

Hasta algún grado, la falciformación es un fenómeno reversible. Con tensiones crecientes de oxígeno, las células falciformes se despolimerizan. Este proceso de polimerización - despolimerización es muy dañino para las membranas de los glóbulos rojos y eventualmente conduce a células falciformes irreversiblemente (ISC) que retienen su forma anormal incluso cuando están completamente oxigenadas. Las ISC sobreviven durante aproximadamente 20 días en el cuerpo, cuando se compara con la vida útil de 120 días. Los individuos con síndromes de HbS tienen frecuentes infecciones, hemólisis crónica con una reticulocitosis asombrosa e hiperbilirrubinemia. El curso de la enfermedad está típicamente acentuada con una diversidad de crisis dolorosas llamadas crisis vaso oclusivas. Estas crisis representan episodios de lesión hipóxica e infarto en los órganos, abdomen, pecho, extremidades o articulaciones. Las úlceras en piernas son una manifestación adicional de la tendencia vaso oclusiva de esta enfermedad. La implicación del sistema nervioso central es común produciendo convulsiones e incluso accidentes cerebrovasculares. Las crisis aplásticas también comunes, representan un cese temporal de la actividad de la médula ósea y se puede desencadenar por infecciones, deficiencia de ácido fólico o ambos. Las crisis son episódicas y reversibles, pero pueden ser fatales. El daño por episodios de crisis tiende a ser acumulativa e incluso en aquellos individuos con formas más suaves de trastornos de células falciformes, las vidas útiles se pueden reducir en gran medida. Ausente una intervención alternativa, los pacientes típicamente mueren antes de la edad de 30 años.

Los compuestos anti-gelificantes que incluyen ácido clofíbrico (ClC_{6}H_{5}OC(CH_{3})_{2}COOH), ácido p-clorofenoxi acético (ClC_{6}H_{5}OCH_{2}COOH), y ácido fenoxi acético (C_{6}H_{5}OCH_{2}COOH) se ha mostrado que inhiben profilácticamente la polimerización en sangre desoxigenada artificialmente. se especuló que estos compuestos pueden ser útiles en una estrecha consideración para prevenir la falciformación de células sanguíneas en la enfermedad de células falciformes. Tales tratamientos pueden potencialmente disminuir la frecuencia de episodios sintomáticos provocados por cri-
sis vaso oclusivas si se puede administrar suficiente compuesto químico para unirse toda la hemoglobina en el cuerpo.

Los síndromes de talasemia son un grupo heterogéneo de trastornos todos caracterizados por una pérdida de o una disminución de la síntesis ce las cadenas de globina de HbA. Las deficiencias de la expresión de \beta-globina se denomina \beta-talasemias y las deficiencias de \alpha-globina, \alpha-talasemias. Las consecuencias hemolíticas de la síntesis de las cadenas de globina deficiente se producen por una disminución de síntesis de una cadena y también un exceso de la cadena complementario. Las cadenas libres tienden a agregarse en inclusiones insolubles dentro de eritrocitos provocan la destrucción prematura de la maduración de eritrocitos y sus precursores, eritropoyesis ineficaz, y la hemólisis de los glóbulos rojos maduros. Los defectos subyacentes de la síntesis de hemoglobina se han elucidado con los años y en gran cantidad residen en las secuencias de ácido nucleico que expresan o controlan la expresión de proteína \alpha- o \beta-globina.

La expresión génica de la globina de mamíferos está altamente regulada durante el desarrollo. La estructura básica de los genes de \alpha- y -\beta-globina es similar ya que son las etapas básicas en la síntesis de la \alpha- y -\beta-globina. Existen al menos cinco genes de la \alpha-globina humana localizados en el cromosoma 16 que incluye dos genes de la \alpha-globina de 141 aminoácidos que codifican polipéptidos idénticos y difieren solamente en sus regiones 3'-no traducidas, un gen \alpha embrionario Z(\zeta) y al menos dos pseudogenes \alpha, psi zeta (\PsiZ) y omega alfa (\omega\alpha).

El racimo de genes de la \beta-globina humana incluye un gen embrionario, epsilon (\varepsilon), dos genes de la beta globina de adultos, beta (\beta) y delta (\delta), dos genes de la beta globina fetal G-gamma (G-\gamma) y A-gamma (A-\gamma), que difieren en solamente un aminoácido, y al menos un gen pseudo-beta, psi beta (\Psi\beta). Todos se expresan a partir de un segmento de 43 kilobases del cromosoma 11 humano. al globina de tipo \beta fetal, o \gamma- globina, se expresa en los estados más tempranos del desarrollo de mamífero y persiste hasta aproximadamente 32 a 34 semanas de gestación. En esta fase, las formas de adulto de la \beta-globina comienzan a expresarse y sustituirse por las proteínas fetales. Los estudios que correlacionan los resultados hematológicos clínicos con las localizaciones de diversas mutaciones que corresponden a cambio indican que una región localizada cadena arriba del extremo 5' del gen \delta puede estar implicada en la supresión cis de la expresión del gen \gamma en adultos. El estímulo para este cambio de fetal a adultos es desconocido.

Cada gen de la \beta-globina comprende tres exones que codifican aproximadamente 146 aminoácidos, dos intrones y una región 5'-no traducida que contiene las secuencias promotoras y una región 3' no traducida. La biosíntesis de la \beta-globina comienza con la transcripción del gen entero seguido del procesamiento de ARN del mensaje, retirada de los intrones mediante ayuste, adición de poli A, cubrimiento y modificaciones post-transcripcionales. La molécula de ARNm madura se exporta desde el núcleo y se traduce en la \beta-globina. Los defectos en cada una de estas funciones se han encontrado asociadas a talasemias específicas. Las mutaciones identificadas incluyen supersiones de nucleósidos individuales, inserciones y sustituciones, mutaciones de cambio de marco, supresiones de segmentos enteros de regiones codificadoras o controladoras, señales de terminación inapropiadas, señales de ayuste a, y mutaciones múltiples. Las talasemias \betaº se caracterizan por una ausencia completa de cualesquiera cadenas de \beta-globina; las \beta^{+}-talasemias se caracterizan por una presencia detectable de una cantidad reducida de cadenas \beta.

Existen tres categorías principales de \beta-talasemia, talasemia mayor, talasemia intermedia y talasemia menor. Los pacientes con talasemia menor pueden ser totalmente asintomáticos y son genotípicamente \beta^{+}/\beta o \betaº/\beta. Aunque las anormalidades de glóbulos rojos se pueden detectar, los síntomas son suaves. Los pacientes con talasemia intermedia son lo más a menudo genotípicamente \beta^{+}/\beta o \betaº/\beta y presentan síntomas graves que se pueden aliviar con transfusiones de sangre infrecuentes. Por el contrario, los pacientes con talasemia mayor don genotípicamente \betaº/\betaº, \betaº/\beta^{+} o \beta^{+}/\beta^{+}, y requieren transfusiones regulares y frecuentes. Los niños sufren retraso grave en el crecimiento y mueren a una edad temprana por los efectos profundos de anemia. Los que sobreviven más tiempo sufren cambios morfológicos. La cara se llega a distorsionar debido a la expansión de la médula ósea dentro de los huesos del cráneo, sigue hepatoesplenomegalia, existe un desarrollo retrasado de los órganos endocrinos que incluyen los órganos sexuales, y una sobre carga de hierro progresiva con hematocromatosis secundaria.

Existen dos consecuencias directas de la \beta-talasemia. Primero, existe una formación inadecuada de HbA y, por lo tanto, una capacidad alterada para transportar oxígeno. Existen también múltiples efectos atribuibles a un desequilibrio entre la síntesis de las cadenas \alpha- y \beta. Sorprendentemente, las consecuencias patológicas del equilibrio de desequilibrio de la cadena de globina parece ser la más grave. Las cadenas \alpha libres forman agregados inestables que precipitan dentro de los precursores de los glóbulos rojos en la forma de inclusiones insolubles. Estas inclusiones dañan las membranas celulares que dan como resultado una pérdida de potasio. El efecto acumulativo de estas inclusiones en los glóbulos rojos es una eritropoyesis ineficaz. Un 70% a 85% estimado de normoblastos en la médula se destruyen eventualmente. Los que escapan de la destrucción inmediata están con un riesgo incrementado de eliminación por el bazo cuando los macrófagos eliminan las células anormales. Además, la hemólisis desencadena un incremento de expresión de eritropoyetina que expande las poblaciones de precursores de eritroides dentro de la médula ósea y conduce a anormalidades esqueléticas. Otra grave complicación de la \beta-talasemia es que los pacientes tienden a tener un incremento en la capacidad de absorber el hierro de la dieta. Como mucho los tratamientos para la talasemia implican transfusiones múltiples de glóbulos rojos, los pacientes a menudo tienen un grave estado de carga de hierro que daña todos los órganos y particularmente el hígado. Para reducir la cantidad de hierro en sus sistemas, los quelantes de hierro se administran típicamente. Aunque con ayuda, los pacientes sucumben a una media de entre aproximadamente 17 a 35 años de edad para los efectos acumulativos de la enfermedad y carga de hierro.

Se han identificado variaciones genotípicas en individuos sanos en los que no se forma la \beta-globina de adulto, pero se evitan complicaciones graves. Estos pacientes expresan constitutivamente la proteína fetal o \gamma-globina en cantidades suficientes para sustituir por la proteína \beta-globina. esta persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH) puede implicar uno o ambos de los genes de la \beta-globina fetal, A- \gamma y G-\gamma. Aparentemente, la producción consistente de cualquier \gamma-globina cumple las funciones necesarias de la proteína anormal o \beta-globina ausente.

Una diversidad de pequeñas moléculas se ha mostrado que efectúan la expresión de hemoglobina o globina fetal. Los experimentos tempranos demostraron que acetato (CH_{3}COOH), propionato (CH_{3}CH_{2}COOH), butirato (CH_{3}CH_{2}
CH_{2}COOH) e isobutirato (CH_{3}CH(CH_{3})COOH) todos inducen la síntesis de hemoglobina en células de leucemia de Friend cultivadas. estudios adicionales mostraron que los compuestos polares, tales como amidas de ácido, y ácidos grasos podrían estimular la expresión de los genes de globina fetal y de adultos en células de eritroleucemia de murinos. La hidroxiurea (H_{2}NCONHOH), otra molécula relativamente pequeña, se encontró que estimula la expresión de globina. Sin embargo, la estimulación, no parece ser muy específica para la globina fetal. La hidroxiurea es actualmente el único fármaco usado para tratar la enfermedad de las células falciformes. Sin embargo, existe una gran preocupación porque un inhibidor de la ribonucleótido reductasa antineoplásico sea carcinógeno, sus propiedades carcinógenas hace su uso en amplia extensión y largo plazo como un compuesto farmacéutico una práctica cuestionable. Existe una fuerte necesidad para encontrar procedimientos de tratamiento de enfermedad de células falciformes que no incluyen la exposición al paciente a otros riesgos.

La expresión de los genes de la \gamma-globina se ha manipulado con éxito in vivo e in vitro usando agentes tales como citosina arabinósido (AraC), un agente citotóxico que induce la producción de reticulocitos fetal, y 5-azacitidina (AZA), un inhibidor de la ADN metilasa bien conocido. La administración intravenosa continua de AZA producía un incremento de cinco a siete veces en el ARNm de la \gamma-globina de las células de medula ósea. Estudios adicionales han mostrado que existen alteraciones significativas en la población de células del tronco en la médula ósea después de tratamiento con AZA. Estos experimentos indican que los efectos de AZA pueden ser más atribuibles a la reprogramación y reclutamiento de células progenitoras de eritroides que a cualesquiera efectos directos en la expresión génica específica. Muchos de estos agentes incluyen AZA, AraC e hidroxiurea son mielotóxico, carcinógeno o teratogénico haciendo el uso a largo plazo impracticable.

Uno de los principales descubrimientos importantes en el tratamiento de hemoglobinopatías se realizó cuando se descubrió que el ácido butírico (ácido butanoico; CH_{3}CH_{2}CH_{2}COOH) de manera precisa y específica estimulaban la transcripción del gen de la (\gamma) globina fetal. Estos hallazgos se confirmaron rápidamente in vivo donde se mostró que dosis farmacológicas de ácido butírico incrementaban la expresión de la globina fetal en polos adultos que se hacían anémicos mediante inyecciones con fenilhidrazina. Se especuló que la acetilación de histona, un efecto conocido de ácido butírico, puede ser al menos parcialmente responsable de la expresión génica fetal aumentada.

Por encima de 50 derivados de ácido butírico se han encontrado desde entonces que son eficaces en la estimulación de la producción de la globina fetal. Alguno de éstos incluyen sales de ácido butírico tales como butirato de sodio y de arginina, ácido \alpha-amino-n-butírico (butiramida; CH_{3}CH_{2}CH_{2}CONH_{2}), e isobutiramida (CH_{3}CH(CH_{3})CONH_{2}. Aunque estudios prometedores en clínicas pilotos, los pacientes tratados eran incapaces de mantener niveles adecuados de globina fetal en su sistema. Se determinó más tarde que muchas de estas formas de ácido butírico tenían semividas extremadamente cortas. La oxidación en el suero, eliminación por hepatocitos y filtración a través de los riñones eliminaba rápidamente estos agentes de los sistemas del paciente. Con otros, los pacientes rápidamente desarrollaron tolerancia o metabolitos de los compuestos tenían el efecto opuesto del deseado.

Recientemente, un número de ácidos carboxílicos alifáticos se ensayaron para evaluar su capacidad a incrementar específicamente la expresión de la globina fetal en células de eritroleucemia humanas K562. Aunque las cadenas más largas se consideraron tóxicas para las células, propionato (CH_{3}CH_{2}COOH) y valerato (ácido pentanoico; CH_{3}CH_{2}CH_{2}CH_{2}COOH) se encontraron que eran más eficaces. Butirato (CH_{3}(CH_{2})_{2}COOH), caproato (CH_{3}
(CH_{2})_{4}COOH), caprilato (CH_{3}(CH_{2})_{6}COOH), nonanoato (CH_{3}(CH_{2})_{7}COOH), y caprato (CH_{3}(CH_{2})_{6}COOH) producían mecho menos efecto. El acetato de fenilo (C_{6}H_{5}CH_{2}COOH) y su precursor, butirato de 4-fenilo (C_{6}H_{5}CH_{2}CH_{2}
CH_{2}COOH), se encontraron que disminuían la globian fetal que expresa la proliferación de reticulocitos, pero incrementan las proporciones relativas de globina fetal por célula en células progenitoras de eritroides cultivadas. El acetato (CH_{3}COOH), un producto metabólico de catabolismo de butirato, incrementaba las poblaciones de precursores de eritrocitos cono también la síntesis de globina fetal. Sin embargo, estos estudios también demostraron que los efectos positivos se podrían solamente mantener durante períodos muy cortos de tiempo.

Otras metodologías para incrementar la expresión de la globina fetal se han centrado en el reclutamiento y reprogramación de células progenitoras de eritroides que expresan la globina fetal. Los agentes ensayados in vivo o in vitro que usan este planteamiento incluyen factores de crecimiento hematopoyético tales como eritropoyetina (EPO), factor de estimulación de la colonia de granulocitos/amacrófagso (GM-CSF), y la intereluquina-3 (IL3). Cada uno de estos factores se encontró que incrementaba la síntesis de la globina fetal en las células de cultivo de tejidos.

Otros agentes mostrados que afectan a la expresión de la globina fetal incluyen activina e inhibina. La inhibina, una hormona unida a disulfuro de dos subunidades, secreción de supresores de la hormona de estimulación de folículos a partir de la glandula pituitaria. La activina, algunas veces denominada como factor de diferenciación de eritroides (EDF) o la proteína de liberación de la hormona de estimulación de folículos (FRP), es también una hormona y ambas de estas moléculas inducían la acumulación de hemoglobina en eritrocitos humanos cultivados (S. P. Perrine y col., Blood 74: 114a, 1989). Recientemente, los estudios han mostrado que el factor de acero, un producto de locus de acero de ratón, es también capaz de influenciar la síntesis de globina fetal en progenitores de eritroides.

Varios estudios se han centrado en el mecanismo por el que el ácido butírico y otras moléculas orgánicas pequeñas han sido capaces de estimular la expresión de globina. Los experimentos con células en cultivo han indicado que el ácido butírico puede actuar incrementando el nivel de acetilación de histona mediante, posiblemente, la disminución de la actividad de una o más histona desacetilasa. La hiperacetilación de histona resultante puede producir no plegamiento de nucleosoma y por lo tanto incremento de la expresión génica. Otros estudios han indicado que la hipometilación del área de ADN alrededor del complejo del gen \beta se correlaciona con un incremento en la expresión del gen de \gamma-globina en pacientes talasémicos. Como alternativa, el ácido butírico y otras pequeñas moléculas pueden funcionar para incrementar la expresión génica específica actuando directamente en agentes que regulan la transcripción, los llamados factores de transcripción. Estos factores se unen a sitios específicos de secuencias a lo largo del genoma en áreas que controlan la expresión de genes localizados próximamente.

En contraste con el locus del gen de la \alpha-globina humana, el locus \beta se ha analizado en gran detalle debido, en parte, a la identificación de mutaciones múltiples de los genes de la \beta-globina en pacientes HPFH. El locus \beta contiene una secuencia grande cadena arriba con referencia a la región de control del locus (LCR), que se extiende 8 - 16 kbp 5' del gen epsilon. Esta secuencia se divide en cuatro sitios hipersensibles a la ADNasa, HSS 1 - 5, que contiene secuencias potenciadotas, secuencias silenciadoras sitios de unión del factor de transcripción y otras secuencias de actuación cis. Cada uno de los genes del racimo de la \beta-globina contiene su propio promotor que actúa conjuntamente con elementos potenciadotes en la LCR. De hecho, la supresión de la LCR da como resultado un síndrome talasémico con poca o ninguna expresión de la \beta-globina. Estos resultados indican que el gen de la \beta-globina expresado puede ejercer una interacción competitiva sobre la LCR de manera que su efecto potenciador está solamente disponible para un único gen en cualquier momento dado del desarrollo.

Se han identificado un número de factores de transcripción en el locus \beta que se cree que alteran el nivel de expresión génica de la \beta-globina. Un elemento potenciador de la LCR se ha mostrado que contiene un par de sitios de unión para el factor nuclear E2 (NF-E2) que solapa un conjunto en tándem de sitios de unión para el factor de transcripción AP-1. NF-E2, una proteína de cremallera de leucina básica específica hematopoyética, y los sitios de unión AP-1 se han localizado en una diversidad de elementos genéticos de globina. Recientemente, una secuencia conservada (CS) localizada cadena arriba del sitio AP-1/NF-E2 se ha propuesto que aumenta la actividad potenciadota.

Se han identificado los factores adicionales que se unen a elementos dentro de los promotores del racimo de \beta-globina. La proteína de desplazamiento de la casilla CAT (CDP) se une a la secuencia CAAT, localizada aproximadamente 50 pares de bases cadena arriba. Otro factor de transcripción medianamente ubicua, SP1, se une a las posiciones -140 y -202, y sitios adicionales posibles también. TAFII110 se ha mostrado que se une a la casilla TATA de muchos de los promotores de la \beta-globina. El factor de transcripción GATA-1, se une al sitio de iniciación de la transcripción (GATA) y se puede desplazar por TFIID cuando se forma un complejo de iniciación activo. Otro factor específico de eritroides, YY1, se une a al menos 11 sitios distribuidos a los largo de la región reguladora de
globina.

Recientemente, se ha identificado un factor que puede estar implicado en el desarrollo de la regulación de la expresión de hemoglobina. Este factor, denominada la proteína selectora de fase (SSP), se une a un sitio localizado aproximadamente 50 - 60 pares de bases cadena arriba del promotor de la gamma globina denominado el elemento selector de fase (SSE). El SSE es también el sitio en el que un número de mutaciones se ha encontrado en los pacientes con síndrome de HPFH. El SSP se ha purificado a partir de los extractos nucleares de las células K562 y su especificidad relativa fetal y eritroide se ha atribuido a una proteína de pareja heterodimérica de 40 - 45 kD denominada CP2 que selectivamente permite el ensamblaje del complejo SSP en el SSE, y también en sitios dentro del promotor \varepsilon, y posterior interacción con la ARN polimerasa.

La elucidación del cambio de la hemoglobina de desarrollo (Hb) puede permitir la reactivación de la Hb fetal en seres humanos adultos con enfermedad de células falciformes o \beta-talasemia, una manipulación que alivia las manifestaciones clínicas de estas enfermedades. La inactiva de la forma mutada del gen de la \beta-globina de adultos que provoca la enfermedad de las células falciformes es también de valor clínico, ya que da como resultado un incremento compensatorio en la expresión de la \gamma (fetal)-globina.

Está claro que la regulación del desarrollo de los genes de globina implican factores de transfección múltiples, y el mecanismo de cambio es probable que requiera remodelación de cromatina e interacciones entre los factores de proteína que se unen a una diversidad de regiones de ADN. Aunque unas pocas de las proteínas de unión a ADN conocidas muestran alguna especificidad de desarrollo (por ejemplo, el factor de tipo Kruppel, EKLF, un regulador positivo del gen de la \beta-globina; (Donze, D., Tornes, T. M.. y Bieker, J. J. (1995) J. Biol Chem 270, 1955 - 9; y KFLF-1, que activa los genes de la globina \gamma, pero también, en un grado menor activa los genes de la \varepsilon- y \beta-globina - Asano, H., Li, X. S. y Stamatoyannopoulos, G. (2000) Blood 95, 3578 - 3584.), la combinación precisa de factores que median el cambio de Hb y exactamente no están tan claros.

Las células K562 humanas tratadas con hemina muestran un fenotipo Hb similar a las células eritroides embrionarias, que expresan principalmente las e- y g-globinas pero no la \beta-globina, es decir, glóbulos rojos embrionarios de seres humanos y otros vertebrados también contienen una gran cantidad de ferritina del tipo (H) de células especializadas (que almacena hierro para uso por otras células principalmente), mientras que los eritrocitos de adultos contienen mucha menos ferritina de tipo doméstico que almacena hierro para uso propio/intracelular.

Después de una serie larga de experimentación, los inventores descubrieron que en las células CV-1, un clon de expresión de ferritina-H humana regula hacia abajo la expresión de un gen reportero de CAT dirigido por el promotor de la \beta-globina estimulada por EKLF. Los inventores además muestran que la ferritina en los extractos nucleares de células K562 se puede unir al ADN de la 5'-\beta-globina entre -153 y -148 y que una secuencia de hexanucleótidos altamente conservada CAGTGC se requiere para esta unión. Esta secuencia es esencial para la expresión de la b-globina en células MEL inducidas por DMSO (deBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L. y Grosveld, F. (1988) Embo J 7, 4203 - 4212) y es parte del sitio de unión de un represor de la b-globina propuesto en células MEL no inducidas (Macleod, K. y Pluma, M. (1991) Mol Cell Biol 11, 4324 - 32). Cuando este motivo CAGTGC está mutado, la unión in vitro se reduce en aproximadamente 20 veces. La capacidad de la ferritina H de reprimir en este sistema se suprime, pero se mantiene la estimulación de EKLF, cuando el sitio de unión a ferritina -153/-148 está mutado en el plásmido indicador de la \beta-globina co-transfectado. Esos resultados muestran que la ferritina H puede reprimir el gen de la \beta-globina humana mediante la unión del promotor de una manera específica de la secuencia. La biología de esta proteína de la familia de la ferritina y su sitio de unión, así como su función demostrada en ensayos transitorios, sugieren que en células K562 funciona de hecho como un represor de la \beta-globina. Como se ha indicado anteriormente, tal represor es útil en la mejora de las enfermedades de células falciformes y otras genéticas.

Los estudios han mostrado que la ferritina-H muestra la actividad ferroxidasa más eficaz cuando se expresa a aproximadamente los mismos niveles que la ferritina-L. Los niveles de igual expresión dan como resultado el mayor número de heteropolímeros ferritina-H/ferritina-L. La forma heteropolimérica del complejo de ferritina de 24-meros es la más eficaz en la conversión del ion ferroso en el ion férrico y en iones de hierro secuestrantes. Esto sugiere que manteniendo iguales concentraciones de ferritina-H y ferritina-L es lo más probable que dé como resultado el tratamiento de hierro apropiado. Los niveles crecientes de de ferritina H darían como resultado la formación de homopolímeros de ferritina H. Los homopolímeros de ferritina H muestran una actividad baja de ferroxidasa. Se esperaría que esto condujera a niveles más altos del ion ferroso más peligroso y tienen efectos adversos en las células. Sin embargo, los inventores han descubierto que las funciones reguladoras del gen de la ferritina H provoca justo el efecto opuesto.

Antecedentes para cáncer de piel y otros cánceres

La luz ultravioleta (UV) se sabe que daña la piel humana y está implicada en la etiología de cánceres de piel. Estudios recientes han revelado que la ferritina se eleva en células de piel cultivadas expuestas a la luz UV, y se ha postulado que el incremento de ferritina representa en intento de las células para protegerse ellas mismas del daño del radical libre mediante la unión y secuestro de hierro que podría, a su vez, provocar oxidación y daño mediado por radical libre.

La razón fundamental para otros cánceres es similar. El hierro ha estado implicado como un agente etiológico o exacerbado en cáncer de piel, hematomas (cáncer de hígado), carcinoma de células renales (cáncer de riñón), neuroblastomas, leucemias, y cáncer de mama. Los inventores proponen que la ferritina H protegerá contra episodios de cáncer en células que dan lugar a todos estos cánceres. La razón fundamental de los presentes inventores es que tratando la piel humana de tal manera que se transfecte con un péptido de la subfamilia de la ferritina H o gen que expresará el péptido, la protección del daño inducido por UV se puede proporcionar a las células. Los péptidos de la subfamilia de la ferritina H son superiores a este respecto ya que pueden secuestrar hierro y no liberarlo fácilmente y se puede hacer así sin alterar los aspectos normales del metabolismo de hierro en las células y otras funciones. Por otra parte, los péptidos de la subfamilia de la ferritina L, es probable que causen incluso más daño que proporcionan fácilmente hierro que exacerbarían el problema incrementando la generación de hierro y radical libre. De este modo, la liberación de un péptido de la subfamilia de la ferritina H o un gen (clon de expresión) para el péptido a las células diana protegerían y/o corregirían de episodios que conducen a cáncer. De manera similar, los agentes que activarían el gen o genes de la subfamilia de la ferritina H endógeno(s) sería(n) beneficioso(s) de las mismas
maneras.

Se constata que todas las ferritinas humanas, incluso las altamente enriquecidas en ferritina L, requieren una pequeña cantidad de ferritina H y su actividad asociada a ferrooxidasa para llevar a cabo las funciones de almacenamiento y liberación de hierro. Es el equilibrio entre las ferritinas L y H lo que es crítico. El incremento del equilibrio a favor de la ferritina H, incluso hasta el punto de un gran exceso de ferritina H, parece mediar un regreso de la célula al tratamiento de hierro saludable.

Antecedentes para enfermedades neurodegenerativas

La distribución de hierro libre y de ferritina cambian ambas durante el desarrollo del cerebro en animales y seres humanos. El incremento de hierro se encuentra en los ganglios basales, comenzando tempranamente en el proceso de la enfermedad, tanto en la enfermedad de parkinson como en la enfermedad de Huntington. Existe un incremento en hierro en varias áreas del cerebro en la enfermedad de Alzheimer, en otras demencias, y en el envejecimiento; y la administración de isoferritinas en una diversidad de áreas del cerebro es diferente y cambia en las enfermedades anteriores. La ferritina H, perro no la ferritina L, está presente en el núcleo de las células neuronales en el córtex del cerebros de ratas en desarrollo y pueden ser protectoras contra el daño oxidante que provocaría el hierro libre. Razón fundamental: La ferritina H disminuye en las células del cerebro críticas durante el envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas, mientras que el hierro y el hierro liberado de la ferritina L localizada están implicados en le daño oxidante en enfermedades y demencia. La ferritina H o un péptido de la subfamilia relacionado protegerá contra una diversidad de cambios neurodegenerativos asociados al envejecimiento, las enfermedades y demencias anteriores. Del mismo modo, un clon de expresión del gen de la subfamilia de la ferritina H y/o un regulador de los genes de la subfamilia de la ferritina H, si se administra al área de cerebro apropiada y a células específicas, se predice que será protectora.

Antecedentes de la ataxia de Friedreich y trastornos neuromusculares relacionados

La supresión de YDL120, el homólogo de levaduras del gen humano responsable de la ataxia de Friedreich, produce como respuesta una disminución de la respiración celular asociada a la actividad de la citocromo c oxidasa y, en ciertos antecedentes nucleares, el ADN de las mitocondrias se pierde. En los mutantes nulos, el crecimiento celular es altamente sensible a oxidantes, tales como H2O2, hierro y cobre; y el sulfato ferroso produce como respuesta la pérdida de ADN de mitocondrias. Las mitocondrias de los mutantes nulos contienen diez veces más hierro que el tipo salvaje. La neurodegeneración observada en la ataxia de Friedreich se puede explicar bien en base a una sobrecarga de hierro de mitocondrias para un incremento de la producción de radicales libres altamente tóxicos. Razón fundamental: ya que la acumulación de hierro está implicada en la etiología de la ataxia de Friedreich, tanto la aparición inicial de los síntomas como la progresión de esta enfermedad se ralentizará o se detendrá secuestrando el hierro libre. La transfección de los péptidos de la subfamilia de la ferritina H o expresión de clones y/o tratamiento con agentes que regularían hacia abajo la expresión de los genes de la subfamilia de la ferritina H endógena se
mejorará.

Antecedentes de ateroesclerosis

Una evidencia epidemiológica fuerte indica que el hierro (es decir que un exceso de hierro) es un factor importante en el proceso de aterosclerosis y que la supresión del hierro tiene beneficios cardiovasculares y protege contra enfermedad cardiaca isquémica. La generación catalizada por hierro de los radicales libres pueden contribuir al daño de la pared de los vasos, a la formación de placas y, mediante ambos mecanismos, al daño de los vasos cardiacos. Una vez más, la liberación de hierro intracelular de la ferritina L está implicada como una fuente del hierro que contribuye a esta etiología; la ferritina H puede ser protectora quelando y secuestrando el hierro libre y liberado. Razón fundamental: La transfección de la célula apropiada con un péptido de la subfamilia de la ferritina H o clon de expresión génica o con un regulador génica que activará el (los) gen (genes) de la subfamilia de la ferritina H endógeno en las células o elementos celulares de la pared de las arterias de las placas ateroscleróticas prevendrán o invertirán el bloqueo
arterial.

Antecedentes con relación a los sistemas de administración posibles y mecanismos de dirección de células

Para la administración de proteínas o péptidos en células vivas ex vivo existen varios planteamientos. Los péptidos pequeños (aproximadamente 20 kDa o más pequeños) pueden captar por células sin un sistema de administración especializado. Las proteínas más largas se pueden administrar encapsuladas en liposomas, construcciones de liposomas, o dentro de una membrana tal como un fantasma de glóbulos rojos, y las vesículas después de preparan para que se fundan con las células receptoras por medios químicos (por ejemplo, polietilen glicol [PEG] o iones de calcio). Los complejos de proteínas mayores también se pueden administrar encapsuladas, fundiendo las membranas de la cápsula a las membranas de plasma de la célula diana. Los interventores han tenido una gran cantidad de experiencia con este tipo de administración en el laboratorio de los inventores (referencias listadas más adelante). Para al administración in vivo de las proteínas o péptidos dirigidos a un tipo de célula específico, el procedimiento de elección es probablemente que sea un tipo de liposoma de administración con un anticuerpo o ligando dirigido a una proteína de superficie de célula específica o receptor incorporado en el liposoma y el péptido o proteína encapsulada dentro del liposoma. Como alternativa, una proteína de fusión constituida por el péptido deseado (por ejemplo, ferritina H) condensada con un ligando de proteína específico para el receptor de la célula diana se pudiera inyectar directamente. Un ejemplo de un ligando de proteína se podría usar para dirigir las células del tronco hematopoyético en el factor de las células del tronco (ligando c-kit) que se une a un receptor (c-kit) enriquecido en la superficie de céluls del tronco hematopoyético en la médula ósea. Los expertos en la técnica reconocerán que existe una amplia diversidad de mecanismos de administración farmacéutica adecuados para la introducción de proteínas, fragmentos de proteínas y material genético en una célula.

Para la administración de los clones de expresión que codifican los péptidos de la subfamilia de la ferritina H (por ejemplo), un número de vehículos de plásmidos y sistemas de reactivos de transfección están disponibles para transfectar células ex vivo, para generar o bien transformantes estables o células transfectadas transitoriamente, para reinfusión en el paciente o animal huésped. Los plásmidos de buena expresión están comercialmente disponibles como lo son los reactivos de transfección, siendo muchos de los últimos liposomas catiónicos de un tipo u otro. Para la transferencia génica in vivo así como ex vivo -esto es, terapia génica- los vectores disponibles incluyen vectores retrovirales (buenos solamente para células en división), vectores de adenovirus (transfectan muchos tipo de células, con muy poca especificidad de célula), vectores virales asociados a adeno, vectores lentivirales, y sistemas de electroporación. Cualquier de éstos se podría usar en un protocolo ex vivo donde las células diana se obtienen como una población pura o altamente enriquecida, a reinfundir después de la transferencia génica. Para la transferencia génica in vivo, las elecciones se limitan actualmente debido a la dificultad de dirigir eficazmente las células específicas con copias de genes suficientes. Un liposoma dirigido como se describe en el párrafo precedente es una posibilidad si un ligando para una alta afinidad, abundante pero receptor específico de célula se incorpora.

Antecedentes con relación a la inducción de la expresión del gen de la ferritina H en células humanas

La ferritina H está entre un grupo de genes que se han identificado por expresarse durante la embriogénesis. El primer sitio principal de la expresión de la ferritina H es el glóbulo rojo embrionario que se forma en el saco vitelino de mamíferos antes de que se establezca la circulación sanguínea. Esta expresión específica de célula de la ferritina H en el desarrollo temprano para el papel de los glóbulos rojos como el sitio de almacenamiento de hierro del embrión. Los glóbulos rojos de adultos expresan mucha menos ferritina, y el hierro se almacena principalmente en el hígado (en los hepatocitos) en los adultos donde la ferritina primaria expresada es ferritina L. La "inactivación genética" del gen de la ferritina H en ratones da como resultado muerte intrauterina entre los días 3,5 y 9,5 de desarrollo. De este modo, la ferritina H es un gen regulado en el desarrollo, la expresión de lo cual está en cierta medida restringida a ciertos tipos de tejido. Los inventores han descubierto que la expresión de la ferritina H en la diferenciación de células eritroides de adultos invirtieron el cambio de la hemoglobina de desarrollo, directamente reprimiendo el gen de la \beta-globina de adulto, y o bien directa o indirectamente provocando una activación del gen la gamma-globina fetal. Para activar la expresión del gen de la ferritina H endógena en células de eritroides de adultos también invierte un cambio del gen del desarrollo en este linaje celular. Llevando a cabo este cambio, a su vez, la inversión de otro cambio de desarrollo, el cambio de hemoglobina que tiene beneficios terapéuticos para las personas con enfermedad de células falciformes, \beta-talasemia y otras hemoglobinopatías. La activación de de la expresión de la ferritina H en otros tipos de células alivia y protege contra cánceres, aterosclerosis, y enfermedades neurodegenerativas.

Se debe indicar que aunque se conoce mucho sobre la regulación de la expresión de ferritina al nivel de traducción por hierro como se detecta por las proteínas de unión a IRE (por ejemplo, la cis-aconitasa citosólica que es IRP-1 [proteína-1 de unión a IRE]), este nivel y tipo de regulación no distingue entre tipos de ferritina. Para regular hacia arriba específicamente la expresión de la ferritina H se requiere la regulación del gen específico al nivel de transcripción.

Las células de cáncer de mama BT-20 rápidamente incrementan la síntesis de ARNm de la ferritina H cuando se expone a hemo exógenamente añadido pero no solamente un ligero incremento de ARNm de ferritina L. Este cambio es protector contra el daño por radical libre de carcinogénesis. En las células de cáncer de colon Caco-2, la expresión de la ferritina H conduce a un incremento de la diferenciación celular y una disminución en el fenotipo de cáncer. La expresión de la ferritina H durante la diferenciación celular de las líneas celulares de eritroleucemia (K562) y hematoma (HepG2) en cultivo. Aunque se conocen alguno de los elementos de ADN en el promotor del gen de la ferritina H y proteínas nucleares que se unen a ellos (por ejemplo P/CAF-CBP, Bbf, y NF-E2), el mecanismo de activación de la transcripción de la ferritina H no se entiende lo suficientemente para aplicarse clínicamente.

Entre los factores exógenos que se pueden administrar/aplicar a las células para activar la expresión del gen de la ferritina H son hemo, la fitohormona ácido abscísico, y las combinaciones de luz infrarroja y ultravioleta, especialmente cuando se aplica a queratinocitos y cánceres de piel.

Sumario de la invención

Los inventores han descubierto que una subfamilia de la ferritina H nuclear de proteínas secuestradoras de hierro es una proteína reguladora de genes en células humanas. Específicamente, los inventores han encontrado que la ferritina nuclear se une a una secuencia de ADN específica que está colocada centralmente en el promotor del gen de la \beta-globina humano y que el efecto de la unión de la ferritina H es reprimir la transcripción de este gen en células transfectadas. De este modo, un gen o péptido de la ferritina H dirigido a las células correctas ofrece una cura para la enfermedad de células falciformes en el que el gen de la \beta-globina está mutado, así como otras enfermedades genéticas donde existe una mala administración de hierro. La sobre expresión de la ferritina H hasta 500 x en células humanas no es peligroso, no disminuye el conjunto de hierro lábil, disminuye la proliferación en líneas de células cancerosas, y promueve apoptosis en células cancerosas.

Basado en el descubrimiento anterior procedimientos y/o composiciones que alteran el fenotipo de una célula del interior mediante la producción de un cambio en la expresión génica, es decir, terapia de expresión génica, son concebibles. Se describen procedimientos se describen para transferir un gen para la ferritina H u otros péptidos de la familia de la ferritina H en una célula de manera que el gen de la ferritina H se expresa en ella y, como resultado de esto se produce la ferritina H. esto altera el fenotipo de la célula o bien a través de la célula o bien a través de la propia ferritina que regula al expresión de otro gen asociado al fenotipo de la enfermedad (como en el ejemplo bien estudiado de los inventores de la enfermedad de células falciformes) o a través de la ferritina cambiando el balance de hierro dentro de la célula que, a su vez, da como resultado un cambio en la expresión génica que altera el fenotipo. El fenotipo de la célula efectuada también se puede alterar mediante la administración del propio péptido expresado (es decir, ferritina), o una parte del mismo (es decir, ferritina), o una parte del mismo, directamente en la célula deseada antes de que muestre el fenotipo de la enfermedad. La inducción de la expresión del gen de la ferritina H endógeno en las células apropiadas mediante la estimulación de su transcripción es un tercer planteamiento a la terapia de regulación génica; esto se realizará aplicando a las células citoquinas exógenas u otros agentes. La ferritina H se sabe que incrementa en respuesta a TNF\alpha o IL-1\beta, mientras que la ferritina selectivamente incrementa en respuesta al hierro añadido exógenamente, mientras que la ferritina L incrementa selectivamente en respuesta al hierro añadido exógenamente. Y un cuarto planteamiento es alterar el fenotipo de las células mediante terapia de regulación génica mediante la administración de un oligonucleótido de sentido contrario que evitaría la expresión de un péptido de la familia de la ferritina específica mediante la inhibición de la traducción y/o transcripción de su ARNm.

Estos planteamientos para la regulación génica serán aplicables dependiendo de la etiología de cada una de las enfermedades descritas en ellas, todas las cuales implican una mala administración de hierro. La expresión del den de ferritina puede o bien mejorar o exacerbarse dependiendo del tipo de ferritina expresada, en la enfermedad específica, o la fase de enfermedad en al que se inicia la intervención. El planteamiento de elección puede ser que incremente la ferritina H (por ejemplo, proporcionando un vector de expresión del gen de la ferritina H) o para disminuir un tipo de ferritina específico (por ejemplo, mediante oligonucleótidos de sentido opuesto). Cualquiera de estos planteamientos logrará el efecto deseado. Es el balance entre la expresión de la ferritina H y otras ferritinas que dan como resultado el cambio celular en el fenotipo. El incremento de la cantidad de la ferritina H en relación a las concentraciones de otras proteínas de ferritina logra la regulación genética deseada que mejora los efectos de enfermedades genéticas que provocan la mala administración de hierro.

La administración de la ferritina H, un gen de la ferritina H o derivados de los mismos a células precursoras o del tronco de eritroides reprime la expresión del gen de la \beta-globina de adultos en la enfermedad de células falciformes y simultáneamente estimulan la expresión del gen de la \gamma-globina fetal por lo tanto efectuando una cura fenotípica.

En las enfermedades neurodegenerativas y trastornos neuromusculares tales como enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Huntington (HD), y ataxia de Friederich, el exceso de hierro (o mala administración de hierro) es un agente etiológico o exacerbante. La ferritina H se expresa selectivamente en neuronas y también se localiza en los núcleos de neuronas. La ferritina H disminuye en el cerebro con la edad y es baja en regiones cerebrales particulares en AD, PD, y HD. La ferritina sola entre las ferritinas conocidas poseen actividad ferroxidasa, y la presencia de la ferritina H en el cerebro es protectora contra el exceso de hierro libre. El incremento de la ferritina H en neuronas específicamente localizada de esta clase de pacientes mejora los síntomas y progresión de estas enfermedades. Como alternativa, la administración de oligonucleótidos de sentido contrario de ferritina específicos a glia y otros tipos de células del SNC asociados en regiones cerebrales específicas pueden ser la ruta preferida de terapia de regulación génica, como un planteamiento para reducir los niveles de almacenes de hierro en tales células. Los expertos en la técnica entenderán que el mejor procedimiento de incremento de la ferritina H intracelular o un derivado de la misma de hierro dependerá de una diversidad de factores incluyendo, pero sin limitación a, el tipo de tejido que se está tratando, el nivel deseado de ferritina H o derivado intracelular, la enfermedad que se está tratando y el nivel actual de ferritina intracelular en las células diana.

En cánceres, está también claro que el exceso de hierro está implicado como un agente etiológico o exacerbante. La ferritina H se sabe que incrementa intracelularmente en un número de cánceres (por ejemplo, cáncer de mama), mientras que la ferritina L se incrementa en el suero de muchos pacientes de cáncer (por ejemplo, neuroblastoma). El incremento en la expresión de ferritina H observado en un número de cánceres es el intento de la célula para protegerse contra el hierro libre/en exceso; y en tal caso, la liberación muy temprana de ferritina H, un gen de la ferritina H, o estímulos pata incrementar la expresión del gen H de la ferritina H puede ser la mejor elección terapéutica. En el cáncer de piel, donde la luz UV o infrarroja inducen la ferritina H endógena, la ferritina es protectora contra algunas vías de daño oxidante.

El exceso de hierro en las placas ateroscleróticas es un agente etiológico o exacerbante; y la terapia de regulación génica para incrementar la ferritina H en las células de estas placas reduce o detiene el proceso de la enfermedad.

Un aspecto importante de la invención es el hallazgo de que la ferritina H reprime el gen de la \beta-globina de adultos mediante la unión específicamente de la secuencia SEQ ID Nº 1 de ADN, CAGTGC, en el promotor de la \beta-globina. Otros muchos genes tienen esta secuencia en sus promotores, incluyendo los genes de la \varepsilon- y \gamma-globina que son estimulados por la ferritina. De este modo, el contexto del motivo CAGTGC, que incluye el ADN circundante así como la distancia del motivo desde el sitio de partida de la transcripción, afecta a si la ferritina reprime o activa la ferritina. Alguno de estos genes que tienen este motivo de promotor se expresan en apoptosis, y otros son genes que están implicados en el metabolismo del hierro. Usando las citoquinas para empujar a las células cancerosas a la apoptosis es una vía para curar, y estimulando la expresión de la ferritina H mediante estos medios es una terapia poderosa.

El motivo CAGTGC que han descubierto los inventores comparte homología con elementos importantes, previamente descritos que incluyen el ARE (elemento de respuesta antioxidante) que tiene la secuencia RTGACCnnGC (en la que R es una pirimidina y n es cualquiera de los cuatro nucleótidos convencionales) y una secuencia RTGR que se somete preferentemente a escisión por reacciones de Fenton mediadas por Fe++. Existen numerosos otros genes implicados en la salud y enfermedad que se pueden regular a través de la unión de ferritina a estos elementos.

Las consideraciones anteriores tienen significado como tratamientos del importante descubrimiento que la ferritina nuclear (es decir, ferritina H y derivados de la misma) reprime la expresión génica del promotor de la \beta-globina humana mediante la unión al motivo CAGTGC localizado en la región de -150 pares de bases desde el sitio de comienzo de la transcripción, como se muestra por los experimentos de unión de ADN in vitro de los inventores y por los experimentos de co-transfección génica de los inventores en células CV-1.

Descripción detallada de la invención

Se ha encontrado que la ferritina es un represor del gen de la \beta-globina humana, el mismo gen que está mutado en la enfermedad de las células falciformes y en algunas formas de la \beta-talasemia. El represor es una forma nuclear de la ferritina (Broyles y col., ¡A Ferritiin-Like Protein Binds to a Highly Conserved CAGTGC Sequence in the \beta-globin promoter, In sickle Cell Disease and Thalassaemias: New Trenes in Therapy, de la subfamila de la ferritina H de los péptidos de la ferritina.

En resumen, los inventores han encontrado lo siguiente:

1) Una proteína de la familia de la ferritina de extractos nucleares de las células de eritroleucemia K562 humana (así como la ferritina H humana pura) se une al promotor del gen de la \beta-globina humana (el promotor que dirige la forma mutada del gen en la célula falciforme) a -150 pares de bases del sitio de partida de la transcripción, in vitro. La unión es muy específico a la secuencia de ADN.

2) Un clon de expresión de la ferritina H reprime este promotor de la \beta-globina en experimentos de co-transfección transitoria. Esto es muy reproducible en múltiples experimentos con dos genes indicadores diferentes, sin represión observada por plásmidos de control/nulos.

3) La ferritina H no reprime más si el promotor contiene un sitio de unión mutado. Los inventores tienen un plásmido de control perfecto un promotor de la \beta-globina mutado solamente en el sitio de unión de la ferritina H y se engancha al mismo gen indicador (CAT, en este caso). esto no es solamente el control perfecto para las transfecciones, pero también conecta el ADN in vitro que se une con la función in vivo completamente muy bien.

Ya que una disminución en la expresión de la \beta-globina está compensada por un incremento de la expresión de la gamma globina (fetal) en células de eritroide humanos, y ya que una cantidad modesta de este cambio se sabe que mejora totalmente la célula falciforme y totalmente o parcialmente mejoran las \beta-talasemias, este nuevo hallazgo hace que la ferritina sea útil para curar el fenotipo de estas enfermedades genéticas clásicas.

Las reseñas en la bibliografía científica indican que la ferritina h (ferritina de cadena pesada) disminuye en un 50% en cerebros de ratas viejas y en otras enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer y muestran que la ferritina H se encuentra en las enfermedades neurodegenerativas cuando se ha demostrado el daño oxidante mediado por hierro, como en la enfermedad de Parkinson y posiblemente la enfermedad de Huntington. Existen también estudios que indican un papel protector de la ferritina contra cánceres, tales como cánceres de hígado y piel. Se ha reseñado que la luz UV induce la producción de ferritina en células de piel y que la ferritina es protectora contra el daño por UV. De hecho, la ferritina H se puede usar para tratar cualesquiera enfermedades en las que la lesión celular está provocada por el daño oxidante mediado por hierro.

La administración del péptido de la ferritina H o una forma truncada de ella a células precursoras de eritroides es más eficaz, la forma más natural de terapia que las medidas parciales actualmente en uso para tratar la enfermedad de células falciformes y \beta-talasemia. La administración similar de péptidos derivados de ferritina proporciona tratamientos y protección eficaces en la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas. El péptido también se puede administrar como una proteína de fusión, con partes o todo el péptido de la ferritina H condensado a otra proteína tal como transferían u otro ligando para el que los receptores específicos existen sobre la superficie de células precursores de eritroides, neuronas, u otros tipos de células para cuya protección se desea. La preparación de las proteínas de fusión dirigidas a tejidos específicos es bien conocida por los expertos en la técnica. Como alternativa, un clon de expresión que codifica la ferritina H o una parte de ella, administrada a células precursoras de eritroides, a células del tronco hematopoyético, a neuronas o a otras células de tejidos en un vector apropiado, o bien en vivo o in vivo, y la proteína expresada a partir de tal vector también cura y protege contra la
enfermedad.

La ferritina H descrita en esta memoria descriptiva a partir de otras proteínas que actúan en trans en sus propiedades físicas y su función propuesta como un represor que se une principalmente al promotor de la \beta-globina. La subfamilia de la ferritina H se representa por un mayor número de genes que la subfamilia de la ferritina L e incluye un racimo de genes/pseudogenes sobre el cromosoma X. una de éstas, la ferritina X, parece que codifica un péptido idéntico en tamaño y muy similar en la estructura tridimensional predicha a la ferritina H.

Permanece la posibilidad de que la unión de ADN real del motivo CAGTGC -150 del promotor de la b-globina in vivo mediante una proteína asociada a la ferritina que estaría protegida de la proteinasa K y tratamientos de calor y reaccionan con antisuero anti-ferritina debido a su fuerte asociación con ferritina. Sin embargo, si éste es el caso, es una proteína que es ubicua en extracto nuclear humano y no habría necesidad de regular hacia arriba y es ineficaz en la ausencia de la ferritina H. La regulación hacia arriba de la ferritina H es suficiente.

A partir de los ensayos transitorios de expresión de los inventores, es evidente que la ferritina H puede representar el gen de la b-globina humana y que esta represión está mediada por la unión de la ferritina H y/o un co-represor de la región -150 del promotor que contiene un motivo CAGTGC. El sitio de unión de esta ferritina H. El sitio de unión de esta ferritina H está dentro de un ARE importante requerido para la activación de la transcripción del gen de la \beta-globina. de este modo, la unión de esta proteína y desplazamiento de otros factores podría ser importante en la represión del gen de la \beta-globina como aparentemente la proteína BB1 de ratón (que reconoce la misma secuencia) está en la represión del gen de la \beta-globina principal de ratón en células no inducidas de MEL. La posterior interacción de este sitio de unión con regiones reguladoras negativas corriente arriba crea un complejo unido estrechamente que previene la unión de otros factores positivos tales como GATA-1 así como otros factores positivos tales como GATA-1 así como dificultar estéricamente la formación de un complejo de transcripción activa sobre el promotor proximal, mediante formación de bucles de ADN.

La proteína de la ferritina H puede tener un ion de hierro unido. El sitio activo responsable de la actividad de la ferroxidasa se ha esclarecido. Sin embargo, el sitio o sitios activos de la proteína responsable de la represión de la transcripción no se ha identificado. Como con todas las otras proteínas de la regulación génica, los derivados de la ferritina h reprimirá la transcripción de ADN así como o mejor que la propia ferritina H. estos derivados incluyen fragmentos de las proteínas de la ferritina y cualesquiera proteínas de fusión en las que el sitio o sitios activos de la ferritina H responsable de la represión de la transcripción se ha ayustado. Los derivados de la ferritina H también pueden incluir productos de transcripción o traducción mayores de una proteína de la familia de la ferritina. Los derivados de la ferritina H incluyen además cualesquiera proteínas miméticas que reprimen la transcripción del ADN por medio de un sitio activo que es sustancialmente el mismo que el sitio activo de la ferritina H responsable de la unión de ADN y represión de la transcripción. Los expertos en la técnica apreciarán que el sitio o sitios activos de la ferritina responsables de la represión de la transcripción del ADN puede incluir tanto la unión de ADN como los sitios de unión de proteína. Los derivados de la ferritina H se pueden encontrar en fragmentos de cualquiera de las proteínas de la familia de la ferritina.

La ferritina H no es solamente un miembro de la familia de las proteínas de la ferritina. La ferritina H y la ferritina L son las más estudiadas. Son probablemente las proteínas de la familia de la ferritina que todavía no se han identificado. Las proteínas de la familia de la ferritina están generalmente implicadas de metabolismo de hierro. Ahora que los inventores han esclarecido la actividad reguladora de los genes de la ferritina H y sus derivados, es fácil que otras proteínas de la familia de la ferritina tendrá también funciones reguladoras génicas.

La capacidad de la familia de las proteínas de la ferritina que se unen a la región promotora 5' del gen de la beta globina se determinó solamente después de una experimentación prolongada y rigurosa como se describe más adelante. El primer ejemplo muestra que la ferritina H se une al sitio de unión de la ferritina CAGTGC, SEQ ID Nº 1, encontrado en las bases -148 a -153 de la región promotora 4' del gen de la globina beta humana. El ejemplo 2 muestra que además de la unión al sitio de unión de la ferritina, la ferritina H se une a otra proteína nuclear que se une a la región promotora 5' de la globina beta adicionalmente cadena arriba del sitio de unión de la ferritina. Estos resultados representan el trabajo en curso y muestra que la ferritina nuclear de las células K562 humanas interactúa con otras proteínas de unión a ADN para reprimir este promotor, especialmente cadena arriba de las proteínas de unión a silenciador mediante formación de bucles de ADN.

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

Líneas celulares. Células K562 (eritroleucemis humana) se hicieron crecer en suspensión en medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% o 15% (FBS) y antibióticos como se ha descrito (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. y Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833 - 52) y se recogen a una densidad de 10^{6} células/ml para preparar extractos nucleares. Células CV-1 (epiteliales de riñón de mono verde africano) (células adherentes usadas para ensayos de expresión génica de transfecciones/transitorias) se hicieron crecer en DMEM con glutamina L, FBS al 10% y antibióticos (Miller, I. J. y Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776 - 86).

Ensayos de expresión de clones, transfecciones, y genes. La región cadena arriba (-610/+20) del gen de la b-globina humana, previamente clonado en pSV2CAT (Berg, P.. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. y Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833 - 52), se subclonó a través de pGEM y pSELECT (ahora denominado pALTER) y se volvió a clonar en PCAT-básico (todos los vectores de Promega). Los mutantes del sitio -153/-148 del promotor de la b-globina se generaron mediante transcripción de oligonucleótidos mutantes que corresponden a la región -164/-128 que usa el sistema pSELECT. Las transfecciones de las células CV-1 se llevaron a cabo con reactivo de transfección DMRIE-C (Gibco/BRL) en medio libre de suero OptiMEM y se optimizaron usando el plásmido de proteína fluorescente verde pEGFP-C1 (Clontech), microscopía de fluorescencia y fluorescencia cuantitativa de lisados de células con un lector de placas de microvaloración. El gen indicador cloranfenicol acetil transferasa (CAT) se cuantificó en lisados de células transfectadas usando un ELISA (Promega) normalizado con CAT purificada. El plásmido de expresión EKLF (factor de tipo Kruppel de eritroides) tiene el gen EKLF clonado en pSG-5 (Stratagene; (Miller, I. J. y Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776 - 86) y el clo de expresión de la ferritina H está en el vector de expresión eucariótico pcEXV-1 (Wu, Y. J. y Noguchi, C. T. (1991) J. Biol Chem 266, 17566 - 72). La proteína celular toral se determinó con el ensayo de placa de microtitulación BCA (Pierce) usando albúmina sérica bovina como patrón.

Proteínas y anticuerpos. Las ferritinas del hígado humano (enriquecidas en las cadenas L)y de corazón humano (enriquecidas en cadenas H), transferrinas humanas (saturado con hierro) y apotransferrina, antisuero policlonal (conejo) a ferritina de bazo humano y suero de conejo no inmune se obtuvieron de Sigma Chemical Company.

Fragmentos de restricción y oligonucleótidos. La región 5' del gen de la b-globina humana (de -610 a +20), previamente clonado en pSV2CAT, se cortó en tres fragmentos mediante digestión secuencial con Hindi y Rsa I. Los tres fragmentos, electroeluidos en agarosa (Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York), eran 416 pares de bases
(-638/-223), 147 pares de bases (-127/+20, que contiene la región promotora proximal), y 95 pares de bases (el fragmento Rsa, -222/-128, que contiene principalmente secuencias promotoras distales). Los tres fragmentos se trataron con fenol/cloroformo, se desfosforilaron, y se marcaron en el extremo con 32-P como se ha descrito (Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; Kurien, B. T., Scofield, R. H., y Broyles, R. H. (1997) Anal Biochem 245, 126 - 126). Los oligonucleótidos sintéticos que corresponden a -232/-188 y -1647-128 se purificaron y se hibridaron como se ha descrito previamente (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. y Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833 - 52) y los oligos de doble cadena se marcaron en el extremo como se ha indica-
do anteriormente y/o usaron como competidores no marcados en ensayos de desplazamiento de movilidad en gel.

Preparación de extractos nucleares. Cada preparación de extractos nucleares se preparó a partir de dos litros de las células K562 (1 x 10^{5} células/ml) usando el procedimiento de Dignam, Lebovitz, y Roeder (Dignam, J. D., R. M. y Roeder, R. G. (1983) Nucleic Acids Res 11, 1475 - 89). El contenido en proteína se los extractos variaban entre 3 y 6 mg/ml. Los extractos enriquecidos 80 - 90% en proteína(s) de tipo ferritina se prepararon tratando los extractos brutos con proteinasa K y/o calor a 75ºC (Atkinson, B. G., R. L., Tomlinson, J. y Blaker, T. W. (1989) Biochem Cell Biol 67, 52 - 7).

Ensayos de desplazamiento de movilidad en gel. Los ensayos de retraso en gel (es decir desplazamiento en gel) se usaron para determinar la unión de ADN de las proteínas del extracto al fragmento Rsa I (95 pares de bases) y oligonucleótidos sintéticos (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. y Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833 - 52; Fried, M. y Crothers, D. M. (1981) Nucleic Acids Res 9, 6505 - 25). cada reacción contenía 0,5 - 2 ng de ADN, 1,05 - 5,0 ug de extracto de proteína, 1,0 - 5,0 ug de poli
dI : poli dC, KCl 100 mM, y tampón de unión (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. y Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833 - 52). Los oligonucleótidos competidores no marcados variaban entre 15 - 2000 veces de exceso molar y se incluyeron en la mezcla de reacción con la sonda antes de añadir la proteína. Los geles usados para los ensayos de retraso eran 4%, 5%, o 6% de acrilamida y el tampón de desarrollo era de baja resistencia iónica (Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. y Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833 - 52).

Alineaciones de secuencia e investigaciones de homología. Todas las secuencias de promotores de la \beta-globina
(-200(+1) se obtuvieron directamente del genBank y se manipularon usando el programa PILEUP seguido del programa LINEUP de la universidad de Wisconsin, paquete GCG.

Resultados

Expresión de la represión de la ferritina H dirigida por el promotor de la b-globina en ensayos de co-transfección transitorios. Un ensayo de expresión transitoria se estableció con células CV-1 en las que la expresión dirigida por el promotor de la b-globina de un gen indicador es bajo salvo que las células están co-transfectados con un clon de expresión de EKLF, un activador específico de desarrollo de transcripción. El nivel de expresión de b-CAT estimulado por EKLF se representó por encima del 60 por ciento mediante co-transfección de un clon de expresión de la ferritina de cadena H humana (es decir, ferritina H).

Los controles incluían un plásmido de control de CAT positivo (expresa CAT constitutivamente), un plásmido básico de CAT negativo (no contiene promotor), y b-CAT sin estimulación de EKLF. El experimento se ha repetido cinco veces más con b-CAT y tres veces con una construcción de b-Luc (b-promotor.luciferasa) con resultados muy similares. La represión es también evidente (aunque la actividad del indicador es inferior) cuando EKLF se omite (datos no mostrados). Otros controles han incluido la co-transfección de los plásmidos vehículos "vacíos" para todos los clones de expresión (sin efecto sobre la expresión del gen indicador) así como manteniendo la cantidad total de microgramos de ADN transfectado constante para regular la posibilidad de inhibición no específica de la expresión génica debida a un exceso de ADN o en algún aspecto de la estructura de un plásmido vehículo. La co-transfección de un clon de expresión para la ferritina L algunas veces daba como resultado alguna represión de expresión del gen indicador; pero el efecto era menos dramático y se observó de manera inconsistente.

Unión de ferritina a ADN promotor de la b-globina. Un fragmento de restricción que contiene parte del promotor distal del gen de la \beta-globina humana, de -222/-128, se une mediante ferritina derivada del hígado humano o del corazón humano, como se muestra en el ensayo de retraso de gel. En los experimentos de los inventores, la ferritina del corazón humano (que se enriquece en las subunidades de tipo H (pesadas) mostró un mayor grado de unión que la ferritina de hígado (que está enriquecida relativamente en las subunidades de tipo L). Un fragmento de restricción que contiene el promotor proximal (-127/+20) no muestra esta unión; y otra proteína de unión a hierro, transferían (conocida por ser principalmente extracelular excepto cuando se une a su receptor) no se une al fragmento distal unido por ferritina. Estas bandas de desplazamiento producidas por la unión de ferritina de hígado humano y por la ferritina de corazón humano usualmente corresponde a las bandas inferiores y superiores producidas por los extractos nucleares brutos de células K562, respectivamente. Los inventores también han encontrado que la ferritina del extracto nuclear pueden producir cualquier banda de desplazamiento y que la banda de peso molecular más alto producirá la banda inferior cuando se eluye y se vuelve a desplazar. Las múltiples bandas de desplazamiento con extractos brutos son el resultado de diferentes tamaños de agregados de las subunidades de ferritina u oligómeros del complejo de la proteína de ADN y/o complejos con otras proteínas en extractos brutos, ya que los inventores han encontrado que al menos una de las múltiples bandas contiene GATA-1.

Enriquecimiento de una proteína de tipo ferritina a partir de extractos nucleares de células K562. Un antisuero policlonal a ferritina de bazo humano (que se compone de una mezcla de cadenas pesadas y ligeras de ferritina) se encontró que provoca un sobredesplazamiento de parte de los complejos de proteína de ADN formados a partir de extracto nuclear de K562 bruto y el fragmento de restricción -222/-128, y la intensidad de la banda de sobre desplazamiento era proporcional a la cantidad de antisuero añadido. El sobredesplazamiento con antisuero antiferritina se encontró que era específico para este complejo de proteína, con poco a nada ADN se desplazó en la ausencia de extracto nuclear, ni antisuero anti-tranasferrina ni suero de conejo no inmune (no mostrado) desplazó el complejo, la IgG de anti - conejo inhibió el sobre desplazamiento, y los complejos de proteína con otros ADN tales como \beta-IVS2 no se desplazaron por el antisuero anti-ferritina.

La ferritina, a diferencia de la mayoría de las proteínas, es resistente a la digestión por la proteinasa K y se calienta a 75ºC, y se puede obtener un noventa por ciento puro a partir de extractos de células eritroides embrionarias/larvales usando estos dos tratamientos. Cuando este procedimiento se aplicó a extractos nucleares de K562, la proteína que permanece proporcionó una sola banda de desplazamiento con el fragmento de restricción -222/-128. Además, cuando el antisuero de anti-ferritina se añadió a la mezcla de reacción después de la incubación del ADN y proteína de unión, se formo un complejo mayor, dando como resultado una banda de sobre desplazamiento. Se debe indicar que la banda de desplazamiento principal con extracto nuclear tratado con la proteinasa K no se desplazó tan rápido como las bandas de gel obtenidas con extracto no tratado. Los inventores han investigado esto en una serie de digestiones reguladas y se ha encontrado que la ferritina se somete a la digestión parcial mediante la proteinasa K; que permanece después de una digestión de 10 - 15 minutos parece que es un núcleo resistente a la proteinasa K que todavía se une a ADN. Además, el incremento de la cantidad de la preparación de péptido enriquecido proporciona un incremento de intensidad para la banda de desplazamiento, y la banda gradualmente se mueve hacia arriba del gel a medida que el complejo crece en cantidad.

Una sola banda de sobredesplazamiento se obtuvo con el promotor distal de 95 pares de bases que se incrementan en intensidad con antisuero creciente. Para localizar además la unión de la proteína reactiva de anti-ferritina, el sobredesplazamiento también se realizó con oligonucleótidos de doble cadena marcado con 32-P de las secuencias -232/-188 y -164/-128. Los más de 39 oligonucleótidos proporcionaron una banda se sobredesplazamiento, mientras que los más de 59 oligonucleótidos no lo hicieron, indicando que la proteína reconocida por el antisuero se une a una secuencia de 37 pares de bases entre -164 y -128. La carencia de un sobredesplazamiento el oligonucleótido -232/-188 también sirve como un control para la especificidad del anticuerpo.

Localización de la región de unión con el ensayo de sobredesplazamiento de anticuerpo. El desplazamiento de gel de anticuerpo también se usó con oligonucleótidos de doble cadena marcado con ^{32}P que corresponden a los extremos 3' y 5' del fragmento de restricción de 95 pares de bases y con extractos nucleares de K562 brutos para localizar adicionalmente la unión de ferritina. De este modo el oligo 3' proporcionó la banda de sobredesplazamiento que indica que la proteína reconocida por el antisuero se une a una secuencia de 37 pares de bases (bp) entre -164 y -128.

Definición del sitio de unión con desplazamientos de geles de competición. Para localizar adicionalmente la unión de ferritina, los inventores mutaron el oligonucleótido de 37 pares de bases en lugares diferentes, reemplazando seis nucleótidos en un momento con todos los A, todos los V, o todos los G, con reemplazos de nucleótidos complementarios en hebras opuestas. Se realizó un ensayo de desplazamiento de gel de competición con la proteína parcialmente purificada del extracto nuclear de K562 calentado, en el que cada uno de los oligos mutantes no marcados así como la secuencia nativa se compitió contra la secuencia nativa marcada con P-32 para unión. Todos los mutantes competían para unión así como la secuencia negativa excepto las mutadas en la región -153/-148, es decir, mutados en la secuencia CAGTGC. Los inventores concluyen que estos seis pares de bases comprenden el sitio de unión de la ferritina H. La especificidad de esta unión se valora y se cuantifica en competiciones oligo con la secuencia nativa no marcada comparada con la secuencia mutada en los seis nucleótidos encontrados que eran importantes para unión, es decir, la secuencia CAGTGC (nativa) comparada con la mutante nº 4. Mientras que la unión a la secuencia nativa marcada compite significativamente con un exceso de 50 veces del mismo no marcado, lleva 1000 veces exceso del mutante no marcado oligo para comenzar a competir con la unión a la secuencia nativa, una diferencia de veinte veces.

Alineaciones de secuencias de los promotores (-162/+1) a partir de doce genes de la \beta-globina de mamíferos adultos muestran que la -150 CAGTGC del promotor \beta humano está conservado en muy alta medida. En una comparación filogenético de doce promotores de \beta-globina de mamíferos adultos desde el sitio de caperuza a -162 los inventores han encontrado que la secuencia CAGTGC en las regiones -150 está entre los elementos más conservados que actúan en cis, solamente segundo a las casillas TATA y CCAT es su grado alto de conservación, ya que se conserva en gran medida como el motivo CACC proximal y se conserva en una mayor medida que la CACC distal.

Discusión

Los resultados de los inventores muestran que en las células CV-1, un clon de expresión de ferritina H regula hacia abajo la expresión de un gen indicador de CAT dirigido por el promotor de b-globina estimulado por EKLF. Los inventores han identificado una proteína en los extractos nucleares de las células K562 que tiene propiedades únicas, es decir estabilidad a la proteinasa K y caliente (75ºC) y reactividad con antisueros antiferritina. La ferritina H se une a una región 5' del gen de la \beta-globina que se requiere para la activación del gen de la \beta en células K562 y de eritroides normales, es decir, la región entre -128 y -222 del sitio de caperuza. Esta región de ADN se ha mostrado que se une a la ferritina humana nativa en experimentos de desplazamiento de ges. la especificidad de la unión de la proteína de tipo ferritina se ha confirmado que usa segmentos diferentes de ADN y oligonucleótidos en un ensayo de desplazamiento de gel de anticuerpos, y los oligos y antisuero antiferritina se han usado para mostrar que el sitio de unión está entre -128 y -165. Los ensayos de desplazamiento de gel de competición con oligonucleótidos mutados han mostrado que la unión de ferritina requiere los nucleótidos CAGTGC, en -153/-148 del gen del la \beta-globina; y cuando este motivo CAGTGC está mutado, la unión in vitro se reduce aproximadamente veinte veces. La capacidad de la ferritina H para reprimirse en este sistema está suprimida, pero se mantiene la estimulación por EKLF, cuando el sitio de unión de ferritina -153/-148 está mutado en el plásmido del indicador de la b-globina co-transfectado. Estos resultados muestran que la ferritina H puede reprimir el gen de la b-globina de adultos humanos mediante la unión del promotor de una manera específica de la secuencia. La biología de la ferritina H y su sitio de unión altamente conservado, así como su función demostrada en ensayos transitorios, significa que en las células K562 está de hecho funcionando como un represor de la b-globina. Tal represor es útil en la mejora de las enfermedades de células falciformes y otras genéticas.

Es digno de anotación que una secuencia de ARN CAGUGN se ha encontrado que funciona en la regulación de la traducción y estabilidad de ARNm que codifica proteínas implicadas en el metabolismo de hierro, por ejemplo los ARNm para subunidades de ferritina y para el receptor de transferían. En este contexto completamente diferente, el hexanucleótido está en el vértice de una estructura de tronco-bucle denominado como IRE (elemento sensible al hierro), una estructura secundaria estable formada en las regiones no traducidas de los ARNm de cadena sencilla. La proteína reguladora que se une a la IRE (la IRE-BP) se ha identificado como la forma citosólica de aconitasa, una proteína de racimo de hierro - azufre con una masa molecular cerca de 97 kDa. Por el contrario, la ferritina H estable al calor reconoce la secuencia de CAGTGC en ADN y aparentemente tiene una masa molecular de aproximadamente 20 kDa, o menos si está parcialmente proteolizada.

Las regiones génicas de globina están enriquecidas en secuencias CAGTGC/CAGTGN con relación a la frecuencia que se esperaría para que la secuencia se produzca al azar. El genoma humano, así como la secuencia de 73.326 pares de bases del racimo del gen de la globina de tipo \beta en el cromosoma 11, es aproximadamente un cuarenta por ciento G-C. Por lo tanto, la frecuencia de ocurrencia de nucleótidos G y C será 0,2, y la frecuencia de A y T será 0,3 de cada uno. La frecuencia de ocurrencia de la secuencia CAGTGC será (0,2) (0,3) (0,2) (0,3) (0,2) (0,2) = 0,000144. Por lo tanto, la secuencia se esperaría que se produjera en una posibilidad diez a once veces en las 73.326 pares de bases del racimo de tipo \beta. La ocurrencia real es treinta y seis veces, tres a cuatro veces el número esperado por posibilidad. La función de esta secuencia, similar a otros elementos reguladores en cis, dependiente del contexto. La secuencia se produce en las regiones 5' y 3' de los genes epsilon y gamma - globina, pero estas localizaciones y sus secuencias circundantes son notablemente diferentes de la localización -153 del gen de la \beta-globina. La unión de la ferritina H a los sitios 5' y/o 3' a los genes de la epsilon- y gamma - globina tendrán en efecto estimulador en lugar de un efecto inhibidor en la transcripción.

La huella de impresión filogenética es útil para identificar los sitios de unión importantes para proteínas reguladoras. A este respecto, es interesante que la secuencia CAGTGC/CAGTGN esté muy altamente conservada en la secuencia y localización con los promotores del gen de la \beta-globina de mamífero y se encontró en los promotores \beta de pollos y ranas también. La alta conservación de esta secuencia significa que el sitio de unión tiene una función importante el gen de la \beta-globina principal de Xenopus adulto tiene la secuencia CAGTGC en -45 del sitio de caperuza, y un oligonucleótido que contiene esta secuencia se une a la ferritina H de extractos nucleares de K562 más fuertemente que la región correspondiente del promotor de la \beta-globina humana. De acuerdo con el descubrimiento de los inventores de que la ferritina H actúa como un represor de la \beta-globina de adultos en células K562 humanas es el hallazgo del inventor que el sitio de unión -150 para esta proteína compita con el sitio -160 principal de \beta- para unirse a la proteína BB1 represora.

Ejemplo 2

Materiales y procedimientos

Materiales: Se obtuvieron fosfatasa alcalina de intestino de ternera, polinucleótidoquinasa T4, y sau 96 I de Promega/Fisher. 32P-\gamma-ATP era de Dupont/NEN. Antisuero policlonal (conejo) a ferritina de bazo humano se obtuvo de Sigma Chemical Company. Los otros reactivos eran de calidad de bilogía molecular.

Fragmentos de restricción y oligonucleótidos: La región 5' del gen de la globina beta humano (de -610 a +20), clonado previamente en pSV0CAT, se cortó del plásmido purificado mediante digestiones con Hind III y Bam H I. El fragmento de 630 pares de bases se trató con fenol/cloroformo, se desfosforiló, y se marcó en el extremo, y se marcó en el extremo con 32-P. Los oligonucleótidos sintéticos correspondientes al sitio de unión núcleo/BP-1 de NCR1
(-584/-527), el más distal de los silenciadores de la 5'-\beta-globina, y región -164/-128 del promotor se purificaron y se hibridaron, y los oligos de doble cadena se marcaron en el extremo como antes y/o se usaron como competidores no marcados en ensayos de desplazamiento de movilidad en gel.

Preparación de extractos nucleares: Células K562 no adherentes se hicieron crecer en una suspensión en un medio compuesto de RPMI 1640 y suero bovino fetal al 15% como se ha descrito y se recogió a una densidad de 106 células por ml. Para cada preparación, el extracto nuclear se preparó a partir de dos litros de células. El contenido en proteína de los extractos variaban entre 3 y 6 mg/ml. Los extractos enriquecidos aproximadamente 80% en proteínas que se unen específicamente a la región promotora -150 y la región silenciadora -550 se prepararon tratando los extractos crudos con calor a 80ºC.

Ensayos de desplazamiento de movilidad en gel: Los ensayos de retraso en gel (es decir, desplazamientos en gel) se usaron para determinar la unión a ADN de las proteínas de extracto purificadas, primero los oligonucleótidos sintéticos correspondientes al silenciador -550 y a al región -150 del promotor, y posteriormente al fragmento de 630 pares de bases del gen de la \beta-globina humano que contiene las secuencias tanto el promotor como las secuencias reguladoras hacia arriba con modificaciones. Los ges usados para ensayos de retraso eran acrilamida al 4% y el tampón de desarrollo era TAE de baja resistencia iónica.

Diseño experimental: El ensayo de formación de bucle de ADN se realiza mezclando un extracto que contiene proteínas específicas para sitios reguladores que se proponen que interactúan, con ADN que contiene los sitios contiguos separados por el ADN que interviene; y la unión de las proteínas se detecta con un EMSA convencional. Si las proteínas unidas a sitios separados interactúan entre sí de una forma estable, el ADN que interviene formará un bucle que se puede cortaren un solo sitio de restricción en el bucle. El ensayo para al formación de bucles es que el complejo ADN - proteína mantenga su migración EMSA como una sola banda después del corte. Los controles incluyen rutas con alícuotas desproteinizadas de la reacción antes y después de la digestión de restricción, para probar que el bucle estaba de hecho cortado. Las condiciones usadas para cortar el complejo con bucles con Sau 96 I son como se describen a continuación.

El ensayo de formación de bucles de ADN in vitro, basado en el uso combinado del ensayo de desplazamiento de movilidad electromotora (EMSA) y una escisión de un solo sitio con una enzima de restricción apropiado. Los desplazamientos en gel (EMSA) se realizaron con un extracto nuclear parcialmente purificado de células K562 no inducidas y el ADN, antes y después de cortar con Sau 96 I. Todo el ADN se unió por proteína en un complejo, individual, desplazado que mantiene su migración como una sola banda después de el corte de restricción. Preparación de extractos nucleares: los extractos nucleares de células K562 no adherentes se prepararon mediante el procedimiento de Dignam y col., como se ha descrito previamente. Se prepararon extractos parcialmente purificados, enriquecidos al 80% en proteínas de unión de interés, calentando los extractos nucleares a 80ºC, centrifugando y conservando el fluido sobrenadante, como se ha descrito por Atkinson y col., (25). El extracto enriquecido contenía proteínas que unen los oligonucleótidos -150 (-164/-128) y el -530 (-584/-527) en el EMSA convencional. Ensayos de desplazamiento de movilidad en gel (EMSA): el procedimiento de Fried y Crothers (26) se usó, como se ha descrito por Berg y col., (19), excepto que cada reacción (que contenía 2 ng) [9000 cpm] de ADN de 630 pares de bases, 2,5 ng de extracto de proteína, 1,0 ug de poli dI: poli dC, 100 mM KCl, y tampón de unión) estaba en un volumen de 5 \mul (en lugar de los 25 \mul usuales). La proteína y ADN se dejó que interactuaran a temperatura ambiente durante 20 minutos y los ensayos de retardo se realizaron con ges de acrilamida al cuatro por ciento en resistencia iónica. Diseño de experimentos de formación de bucles de ADN: Para detectar la formación de bucles debida a la interacción de proteína unida a promotor con proteína unida cadena arriba adicionalmente (aproximadamente -300 a -600 pares de bases), el complejo ADN - proteína se hizo reaccionar con Sau 96 I, que escinde este ADN a -210/-209 usando las instrucciones del fabricante, modificado como sigue: 2 \mul de enzima y 15 \mu de tampón de enzima más BSA se usaron en un volumen total de 31 \mul que incluían los contenidos de (5 \mul) de la reacción de unión proteína - ADN, a temperatura ambiente.

Resultados

Los inventores han reseñado en un artículo preliminar que un fragmento de restricción que contiene parte del promotor distal del gen de la \beta-globina humana, de -222/-128 pares de bases, está unido por la proteína de la ferritina H en extractos nucleares de las células K562, y es específica para la región -150. Al menos dos proteínas específicas para los silenciadores definidos funcionalmente que mapean cadena arriba de l promotor proximal y distal del gen de la \beta-globina humana, en las regiones de -300 (-338/-223) y -530 (-610/-490) desde el sitio de la caperuza. Con el último objetivo de exploración de las interacciones entre estos silenciadores y el promotor \beta, los inventores diseñaron un planteamiento experimental para detectar la formación de bucles de ADN estabilizada mediante interacciones entre proteínas unidas a sitios separados mediante longitudes moderadas de ADN que interviene. Los inventores han usado un extracto nuclear de células K562 parcialmente purificado que contiene proteínas que unen estas regiones separadas.

El extracto de proteínas parcialmente purificado usado para estos experimentos se encontraron que contenían tanto la proteína de unión -150 y actividad de unión al silenciador (-530) mediante ensayos de desplazamiento de gel separados con sus oligonucleótidos respectivos (datos no mostrados).

El ADN se retarda en su migración, debido a la unión de proteínas del extracto nuclear de K562 parcialmente purificado. Cuando el material se hizo reaccionar con al enzima de restricción Sau 96 I, después de que el ADN y proteínas hayan formado un complejo; la gran mayoría de este material se retardó en su migración. Existe un solo sitio Sau 96 I en la secuencia de \beta-globina en 5', en -210, que corta el ADN entre el promotor y las regiones cadena arriba). Se mostró que una gran pieza de ADN se recuperó a partir de un complejo, mientras que todo el ADN de otro complejo se cortó, proporcionando dos bandas limpias idénticas en su migración a bandas obtenidas cuando se hizo reaccionar ADN puro con la enzima de restricción. Las longitudes de estos fragmentos son 229 pares de bases (+20/-229, que contenía el promotor) y 401 pares de bases (que contenían las secuencias cadena arriba, que incluyen silenciadores). Cuando la mezcla que contiene estos fragmentos de ADN precortados se hizo reaccionar con las proteínas parcialmente purificadas, los dos fragmentos se desplazaron independientemente pero no se formó el complejo grande (con bucles). El hecho observado de que el complejo se mantiene junto después de que el ADN se haya cortado completamente con Sau 96 I indica que un bucle se formó inicialmente entre un sitio o sitios cadena debajo de -209 y un sitio o sitios desde -210.

La ferritina se une a la región promotora en el sitio de unión de ferritina. Las proteínas que se unen a ADN también se unen a la región promotora de la \beta-globina. Todas las proteínas de unión se unen cadena arriba de l sitio de unión de la ferritina. la represión del gen de la \beta-globina por ferritina se potencia mediante una interacción proteína - proteína entre ferritina y al menos una de las proteínas de unión al promotor. Se forma un complejo proteína - proteína - ADN por ferritina con al menos una de las proteínas de unión. La región promotora tiene un sitio de unión a ferritina y cadena arriba de ese sitio de unión a proteína. Una proteína de unión se une a un sitio de unión, y la ferritina se une al sitio de unión de la ferritina. La ferritina y la proteína de unión se unen después a otro, creando por lo tanto un bucle en el ADN. La región promotora se puede cortar en dos fragmentos más pequeños y en un sitio de restricción por la enzima de restricción Sau 96 I. Debido a la interacción proteína - proteína entre la proteína de unión y ferritina, el complejo permanece intacto. De este modo, la aplicación de una enzima de restricción no da como resultado un desplazamiento de movilidad en un ensayo de gel. La retirada de las proteínas del bucle de ADN no cortado da como resultado una región promotora intacta. la retirada de las proteínas del bucle de ADN después de cortarse por una enzima de restricción da como resultado dos fragmentos de ADN.

Cuando los fragmentos promotores se combinan con un extracto nuclear que tiene ferritina y proteína de unión, se produce un desplazamiento en gel. esto muestra que el bucle de ADN está provocado por la ferritina que se une a la región promotora.

Controles: Los controles incorporados en los experimentos indicados anteriormente, incluyen la desproteinización de los complejos que muestran que el bucle se cortó por la enzima de restricción, que muestra que las secuencias de ADN no relacionados (por ejemplo, ADN de P. putida) no forman un complejo con este extracto. Como control adicional, un complejo de una sola banda se aisló, se desproteinizó, y también mostró que contenía cantidades iguales de los dos fragmentos de restricción se produjo por digestión con Sau 96 I. Los dos fragmentos Sau 96 I de la región 5' de globina beta se desplazan independientemente con este extracto y no forma el complejo grande salvo que estén unidos; además, se requiere una concentración aproximadamente ocho veces mayor de proteína para comenzar a desplazar los fragmentos de restricción que se requiere para iniciar la formación del complejo con bucles.

Discusión

Interpretaciones: Los experimentos reseñador han mostrado que la formación de bucles en ADN se pueden detectar in vitro con un ensayo de EMSA combinados con digestión con una enzima de restricción específica. En estos experimentos de formación de bucles de ADN, los resultados muestran que las secuencias las secuencias entre -209 y +20 pares de bases del gen de la \beta-globina humana interactúan con secuencias cadena arriba entre -210 y -610 pares de bases. La formación de bucles está mediada por un extracto parcialmente purificado que contiene una proteína de unión al promotor en -150 y una proteína de unión al silenciador de la \beta-globina, confirmado mediante experimentos de unión con el extracto y las secuencias de unión separadas. Cuando el complejo ADN - proteína individual, grande detectado por el EMSA de los inventores se cortó con Sau 96 I, el complejo todavía migró como un complejo individual grande alto sobre los geles. (Existía un pequeño incremento en la migración del complejo cortado que se espera ya que un corte individual de restricción de doble cadena cambiará la conformación de ADN ligeramente). Se debe indicar que la unión de las proteínas en este complejo con bucles parece ser muy estrecha; tiene un exceso de oligonucleótidos no marcados -164/-128 y -584/-527 para romper el complejo (no mostrado). Además una comparación de la afinidad de unión del ADN completo de 630 pares de bases con las afinidades de unión de una mezcla de los fragmentos generados por Sau 96 I, mostró que tiene aproximadamente ocho veces menos de proteína para formar un complejo desplazado con el ADN grande, intacto (630 pares de bases) que con una mezcla de los fragmentos separados, que muestran que la unión al ADN mayor que 630 pares de bases es cooperativa y se produce la formación de bucles.

Todos estos resultados son consistentes con los parámetros conocidos y fuerza el control de la formación de bucles de ADN, que se media por dos o más proteínas que muestran unión cooperativa (y usualmente, estrecha). Los resultados de estos experimentos también muestran que la represión del gen de la \beta-globina mediante silenciadores cadena arriba pueden mediarse por la formación de bucles de ADN. Este planteamiento no permite determinar la identidad de las proteínas implicadas y pueden no funcionar en los casos en los que el ADN esté sobreenrollado, como con ciertas construcciones de plásmido, o interacción débil proteína - proteína.

El bucle en la región promotora formada por la interacción entre ferritina y una o más proteínas de unión cadena arriba potencia la represión del gen de la \beta-globina. Las células humanas generalmente tienen suficientes cantidades de proteínas de unión cadena arriba de manera que la adición de ferritina sola a una célula humana mediante los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva es generalmente suficiente para provocar la represión del gen de la \beta-globina y otros genes regulados por esta actividad. Además, la unión de ferritina al sitio de unión de la ferritina CAGTGC es generalmente suficiente para reprimir la transcripción del gen de la \beta-globina.

Un procedimiento de expresión creciente de la ferritina H es reprimir la expresión de la ferritina L u otras proteínas de la familia de las ferritinas. Esto se puede llevar a cabo usando oligonucleótidos de ADN de sentido contrario específicos para los genes que codifican las proteínas de la familia de ferritina distinta de la ferritina. La reducción de expresión de estas proteínas de ferritina conduce a una concentración más alta y la expresión realzada de la ferritina H. desplazando las relaciones entre la ferritina H y otras proteínas de la familia de la ferritina, la \beta-globina está representada y los efectos perjudiciales de la anemia por células falciformes se reducen hasta niveles aceptables.

La expresión realzada de la ferritina H también cura la mala administración del hierro intracelular, que da como resultado niveles inferiores de iones ferrosos peligrosos. Aunque la actividad de ferritina H feroxidasa puede jugar un papel en la administración apropiada de ion intracelular, las concentraciones más altas de la ferritina H afectan a la expresión de un número de genes implicados en el metabolismo de hierro. Esta función reguladora genética de la ferritina H facilita la administración apropiada en células que afectado de manera adversa pon un amplia diversidad de enfermedades. Como se ha descrito en los antecedentes, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neuromusculares y aterosclerosis todas conducen a la administración de hierro inapropiada dentro de las células del cuerpo. El incremento de la concentración de la ferritina H y los efectos reguladores genéticos resultantes alivian los efectos deletéreos de administración de hierro inapropiada.

Los estudios muestran que la ferritina H muestra la actividad de la ferroxidasa eficaz cuando se expresa a aproximadamente los mismos niveles que la ferritina L. Niveles de expresión iguales dan como resultado el mayor número de heteropolímeros ferritina H/ferritina L. La forma heteropolimérica del complejo de ferritina de 24 meros es el más eficaz en al conversión del ion ferroso en el ion férrico y en el secuestro de los iones de hierro. Esto sugiere que el mantenimiento de las concentraciones iguales de ferritina H y ferritina L es lo más probablemente que dé como resultado la administración de hierro apropiado. Los niveles crecientes de ferritina H dan como resultado la formación de homopolímeros de ferritina H. Los homopolímeros de la ferritina H darían como resultado la formación de homopolímeros de ferritina H. Los homopolímeros de la ferritina H muestran baja actividad de ferroxidasa. Se esperaría que condujera a niveles mayores del ion ferroso perjudicial y tienen efectos adversos en las células. Sin embargo, los inventores han descubierto que las funciones reguladoras génicas de la ferritina H provoca que suceda justo lo contrario.

Los expertos en la técnica apreciarán que existe un número de formas en los que elevan los niveles de ferritina H dentro de una célula. Puede implicar la introducción de la propia proteína de la ferritina H mediante cualquier número de medios farmacéuticamente aceptables bien conocidos por lo expertos en la técnica. Esto puede incluir el uso de construcciones de liposomas que contienen la proteína de la ferritina H. Estas construcciones pueden o no pueden tener ligandos o anticuerpos.

Un procedimiento alternativo de incrementar los niveles intracelulares es regular la expresión de las moléculas de la familia de ferritina. esto se puede hacer de numerosas formas. Los oligonucleótidos de ADN de sentido contrario que dirigen los genes de la familia de la ferritina distinta de la ferritina H dará como resultado la disminución de expresión del gen dirigido y provocan mayores concentraciones de la ferritina H dentro de la célula. También es posible introducir proteínas u otros compuestos que incrementan la transcripción o traducción de un gen de la ferritina H endógena o un gen de la familia de la ferritina relacionado. estos compuestos activadores se pueden introducir en las células en procedimientos similares a la introducción de la propia proteína de la ferritina H como se ha descrito anteriormente.

Todavía otro procedimiento de incremento de los niveles intracelulares de la ferritina H es introducir un vector de expresión de la ferritina H en las células. Los expertos en la técnica apreciarán que existe un número de procedimientos para transfectar células con un número de vectores diferentes, incluyendo plásmidos, fagémidos, y cósmicos. El tipo de vector usado, la región promotora dentro del vector y cualesquiera secuencias de control usadas con el vector variará dependiendo de una diversidad de factores conocidos por lo expertos en la técnica. Estos factores incluyen pero no se limitan al tejido celular dirigido, el nivel de expresión deseada y el nivel de expresión de las proteínas de la familia de la ferritina dentro de las células dirigidas.

Todavía otro procedimiento de incremento de los niveles intracelulares de la ferritina H para incrementar los niveles de las proteínas o compuestos que elevan la transcripción o traducción de promotores de ferritina.

Procedimientos de incremento de niveles intracelulares se pueden considerar cualesquiera procedimientos de inducción intracelular, donde la célula crea su propia ferritina, o procedimientos de introducción extracelular, donde la ferritina se añade a la célula cuando se usan construcciones de liposomas.

La transfección de las células con vectores que codifican una proteína de la familia de la ferritina se puede realizar o bien ex vivo o in vivo. Cuando se realiza in vivo, los vectores se introducen en el cuerpo del paciente. Cuando se realiza ex vivo, las células se transfectan con un vector y después se implantan en el tejido del cuerpo del paciente. Las células del tronco son especialmente bien adecuadas para esto, sin embargo se pueden usar también otras células.

Referencias

1. Blau, C. A. & Stamatoyannopoulos, G. (1994) Curr Opin Hematol 1, 136-42.

2. Orkin, S. H. (1995) Eur J Biochem 231, 271-81.

3. Bieker, J. J. (1998) Curr Opin Hematol 5, 145-50.

4. Dover, G. J. & Boyer, S. H. (1987) Blood 69, 1109-13.

5. Rodgers, G. P., Dover, G. J., Noguchi, C. T., Schechter, A. N. & Nienhuis, A. W. (1989) Prog Clin Biol. Res, 281-93.

6. Andrews, N. C., Erdjument-Bromage, H., Davidson, M. B., Tempst, P. & Orkin, S. H. (1993) Nature 362, 722-8. D. L., Ney, P. A., Cunningham, J. M. & Nienhuis, A. W.

7. Jane, S. M., Gumucio, D. L., Ney, P. A., Cunningham, J. M. & Nienhuis, A. W. (1993) Mol Cell Biol 13, 3272-81.

8. Tsai, S. F., Martin, D. I., Zon, L. I., D'Andrea, A. D., Wong, G. G. & Orkin, S. H. (1989) Nature 339, 446-51.

9. Armstrong, J. A., Bieker, J. J. & Emerson, B. M. (1998) Cell 95,93-104.

10. Bieker, J. J., Ouyang, L. & Chen, X. (1998) Ann N Y Acad Sci 850, 64-9.

11. Li, Q., Clegg, C., Peterson, K., Shaw, S., Raich, N. & Stamatoyannopoulos, G. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 2444-8.

12. Donze, D., Townes, T. M. & Bieker, J. J. (1995) J Biol Chem 270, 1955-9.

13. Fordis, C. M., Nelson, N., Dean, A., Schechter, A.N., Anagnou, N. P., Nierthuis, A. W., McCormick, M., Padmanabhan, R. & Howard, B. H. (1985) Prog Clin Biol Res 191, 281-92.

14. Fordis, C. M., Nelson, N., McCormick, M., Padmanabhan, R., Howard, B. & Schechter. A. N. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134, 128-33.

15. Dean,.A., Ley, T. J., Humphries, R. K., Fordis, C. M., Jr. & Schechter, A. N. (1983) Prog Clin Biol Res 134, 323-34.

16. Dean, A., Ley, T. J., Humphries, R. K., Fordis, M. & Schechter, A. N. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80, 5515-9. Biochem 56, 289-315.

17. Theil. E. C. (1957) Ann Rev Biochem 56, 289-315.

18. Dickey, L. F., Sreedharan, S., Theil, E. C., Didsbury, J. R, Wang, Y. H., & Kaufman. R. C. (1987) J Biol Chem 262, 7901 -7907.

19. Wu, Y. J. & Noguchi, C. T. (1991) J Biol Chem 266, 17566-72.

20. Arosio, P., Yokota, M., & Drysdale, J. W. (1976) Cancer Res 36, 1735-1739.

21. Harrison, P. M., & Arosio, P. (1996) Biochim Biophys Acta 1275, 161-203.

22. Ferreira, C., Bucchini, D., Martin, M. E., Levi, S., Arosio, P., Grandchamp, B., & Beaumont, C. (2000) J Biol Chem 275, 3021-3024.

23. Broyles, R. H., Blair, F. C., Kyker, K. D., Kurien, B. T., Stewart, D. R., Hala'sz, H., Berg, P. E., & Schechter, A.N. (1995) Colloque INSERM 234, 43.51.

24. Picard, V., Renaudie, F., Porcher, C., Hentze, M. W., Grandchamp, B. & Beaumont, C. (1996) Blood 87, 2057-64

25. Cai, C. X., Birk, D. E. & Linsenmayer, T. F. (1998) Mol Biol Cell 9, 1037-51.

26. Cai, C.X., Birk, D. E. & Linsenmayer, T. F. (1997) J Biol Chem 272, 12831-9.

27. Pountney, D., Trugnan, G., Bourgeois, M. & Beaumont, C. (1999) J Cell Sci 112, 825-31.

28. Cheepsunthorn, P., Palmer, C. & Connor, J. R. (1998) J Comp Neurol 400, 73-86.

29. deBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L. & Grosveld, F. (1988) Embo J 7, 4203-4212.

30. Macleod, K. & Plumb, M. (1991) Mol Cell Biol 11, 4324-32.

31. Berg, P. E., Williams, D. M., Qian, R. L., Cohen, R. B., Cao, S. X., Mittelman, M. & Schechter, A. N. (1989) Nucleic Acids Res 17, 8833-52.

32. Miller, I. J. & Bieker, J. J. (1993) Mol Cell Biol 13, 2776-86.

\newpage

33. Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

34. Kurien, B. T., Scofield, R. H., & Broyles, R. H. (1997) Anal Biochem 245, 123-126.

35. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M. & Roeder, R. G. (1983) Nucleic Acids Res 11, 1475-89.

36. Atkinson, B. G., Dean, R. L., Tomlinson, J. & Blaker, T. W. (1989) Biochem Cell Biol 67, 52-7.

37. Fried, M. & Crothers, D. M. (1981) Nucleic Acids Res 9, 6505-25.

38. Aziz, N. & Munro, H. N. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84, 8478-82.

39. Casey, J. L., Hentze, M. W., Koeller, D. M., Caughman, S. W., Rouault, T. A., Klausner, R. D. & Harford, J. B. (1988) Science 240, 924-8.

40. Hentze, M. W., Caughman, S. W., Rouault, T. A., Barriocanal, J. G., Dancis, A., Harford, J. B. & Klausner, R. D. (1987) Science 238, 1570-3

41. Haile, D. J., Rouault, T. A., Harford, J. B., Kennedy, M. C., Blondin, G. A., Beinert, H. & Klausner, R.D. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 11735-9.

42. Kennedy, M. C., Mende-Mueller, L., Blondin, G.A. & Beinert, H. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 89, 11730-4.

43. Gumucio, D. L., Shelton, D. A., Bailey, W. J., Slightom, J. L. & Goodman, M. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90,6018-22.

44. Shterman, N., Kupfer, B. & Moroz, C. (1989) Cancer Res 49,5033-6.

45. Thomson, A. J. (1991) FEBS Letr 285, 230-6.

46. Hentze, M. W., Keim, S., Papadopoulos, P., O'Brien, S., Mod:, W., Drysdale, J., Leonard, W. J., Harford, J. B. & Klausner, R. D. (1986) Proc Nacl Acad Sci USA 83, 7226-30.

47. Chang, C. Y., Wu, D. A., Mohandas, T. K. & Chung, B. C. (1990) DNA Cell Biol 9, 205-212.

48. Papayannopoulou, T., Brice, M. & Stamatoyannopoulos, G. (1986) Cell 46, 469-76.

49. Gribnau, J., Diderich, K., Pruzina, S., Calzolari, R. & Fraser, P. (2000) Mol Cell 5, 377-86.

50. Epner, E., Reik, A., Cimbora, D., Telling. A., Bender, M. A., Fiering, S., Enver, T., Martin, D. I., Kennedy, M., Keller, G. & Groudine, M. (1998) Mol Cell 2, 447-55.

51. Higgs, D. R. (1998) Cell 95, 299-302).

52. Reik. A., Telling, A., Zitnik, G., Cimbora, D., Epner, E. & Groudine, M. (1998) Mol Cell Biol 18, 5992-6000.

53. Matsumoto, M. & Komori, N. (2000) in Enzy. (Academic Press, New York), Vol. 316 (Chap. 33), pp. 492-511.

54. Gribnau, J., Diderich, K., Pruzina, S., Calzolari, R. & Fraser, P. (2000) Mol Cell 5, 377-86.

55. Epner, E., Reik, A., Cimbora, D., Telling, A., Bender, M. A., Fiering, S., Enver, T., Martin, D. I., Kennedy, M., Keller, G. & Groudine, M. (1998) Mol Cell 2, 447-55.

56. Higgs, D. R. (1998) Cell 95, 299-302; Reik, A., Telling, A., Zitnik, G., Cimbora, D., Epner, E. & Groudine, M. (1998) Mol Cell Biol 18, 5992-6000).

57. Broyles et al., ``A Ferritin-Like Protein Binds to a Highly Conserved CAGTGC Sequence in the \beta-globin promoter, In Sickle Cell Disease and Thalassaemias: New Trends in Therapy (Y. Beuzard, B. lubin & J. rosa, eds.) colloque INSERM 234:45-51. 1995.

58. Picard et al., "Overexpression of the Ferritin H subunit in cultured erythroid cells changes the intracellular iron distribution", Blood, 87:2057-2064, 1996.

59. Cai et al., "Ferritin is a Developmentally Regulated Nuclear Protein of Avian Corneal Epithelial Cells", J. Biol. Chem., 272:12831-12839, 1997.

60. Cai et al., "Nuclear Ferritin Protects DNA from UV damage in Corneal Epithelial Cells", Molec. Biol. Cell, 9:1037-1051, 1998.

61. Cheepsunthorn et al., "Cellular Distribution of Ferritin Subunits in Postnatal Rat Braia", J Comp Neurol., 400:73-86. 1998.

62. Poumey et al., "The Identification of Ferritin in the Nucleus of K562 cells, and investigation of a possible Role in the Transcriptional Regulation of adult 3-globin gene", J. Cell Sci., 112:825-831, 1999.

63. Dover et al., "Fetal-Hemoglobin Containing Cells Have the Same Mean Corpuscular hemoglobin as Cells Without Fetal Hemoglobin: A Reciprocal Relationship Between Gamma- and Beta-Globin Gene Expression in Normal Subjects and in Those With High Fetal Hemoizlobin Production", Blood, 69: 1109-1113, 1987.

64. Rogers et al., "Hematologic Responses of Patients With Sickle Cell Disease to Treatment With Hydroxyurea", New Eng. J. Med., 322: 1037-1045.1990.

65. Ammendola et al., "Spl DNA Binding Efficiency is Highly Reduced in Nuclear Extracts from Aged Rat Tissues", J. Biol Chem. 267: 17944-17948, 1992.

66. Griffiths et al., ``Iron in the Basal Ganglia in Parkinson's Disease. An In Vitro Study Using Extended X-ray Absorption Fine Structure and Cryo-electron Microscopy. Brain, 122:667-673, 1999.

67. Kirkali et al., "Serum Ferritin as a clinical Marker for Renal Cell Carcinoma: Influence of Tumor Size and volume", Urol. Int., 62:21-25, 1999.

68. Bartzokis et al., "Increased Basal Ganglia iron Levels in Huntington Disease", Arch. Neurol., 56: 569-574.

69. Mandishona et al., "Dietary Iron Overload as a Risk Factor for Hepatocellular Carcinoma in Black Africans", Hepatology, 27: 1563-1566, 1998.

70. Applegate et al., "Evidence That Ferrin is UV Inducible in Human Skin: part of a putative Defense Mechanism", J. Invest. Dermatol., 111:159-163, 1998.

71. Lin et al., "Hemin-enhanced Resistance of Human Leukemia Cells to Oxidative Killing: antisense Determination of Ferritin Involvement", Arch. Biochem. Biophys., 352:51-58.

72. Broyles RH (1999). Sem. Cell Devel. Biol. 10: 259-265.

73. Barker-Harrel J, McBride KA, Broyles RH (1988). Exp. Cell Res. 178:435-448.

74. Bodine D. (2000). Molecular Therapy 2:101-102.

75. Somiari S, Glasspool-Malone J, Drabick JJ, Gilbert RA, Heller R, Jaroszeski MJ, Malone RW (2000) Molecular Therapy 2:178-187.

76. Hengge UR, Mirmohammadsadesh A. (2000). Molecular Therapy 2:188-194.

77. Lohr F et al. (2000). Molecular Therapy 2: 195-203.

78. Bettan M et al. (2000). Molecular Therapy 2: 204-210.

79. Bristol JA et al. (2000). Molecular Therapy 2: 223-232.

80. Gao G, Sands, MS, Haskins ME, Ponder KP (2000). Molecular Therapy 2:233-244.

81. Chen SJ, Rader DJ, Tazelaar J, Kawashiri -a, Gao G-p, Wilson JM (2000). Molecular Therapy 2: 256-261.

82. Sheridan PL et al. (2000). Molecular Therapy 2: 262-275.

83. Abruzzese RV et al. (2000). Molecular Therapy 2:276-287.

84. Wu L, Barry MA (2000). Molecular Therapy 2: 288-298.

<110> Broyles, Robert H. y Floyd, Robert A.

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<120> TERAPIA DE REGULACIÓN GÉNICA QUE IMPLICA FERRITINA

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<130> OKL010/107-00727A

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<140> No todavía asignada

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<141> Incluida en este documento

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<150> 60/245.003

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<151> 00-11-01

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<160> 2

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<170> Word Perfect 8.0 (guardado en formato ASCII)

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<210> 1

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagtgc

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6

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<210> 2

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<211> 10

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> Unión Misc

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<222> 1 .. 10

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<223> Elemento de respuesta anti oxidante

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<400> 2

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rtgacnnngc

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10

Claims

1. Uso de

(i): ferritina H que es capaz de unirse al promotor del gen de la \beta-globina en -150 pares de bases del sitio de comienzo de la transcripción

(ii): oligonucleótidos de sentido contrario específicos para el gen que codifica la proteína de la familia de la ferritina distinta de la ferritina H y que reprime la expresión de dicha proteína de familia de la ferritina, o

(iii): un gen que codifica la ferritina H como se ha definido anteriormente en (i)

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de células falciformes de una \beta-talasemia, en el que el medicamento no es para terapia génica mediante la modificación de la línea germinal.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento se formula para la introducción de la ferritina H como se ha definido en la reivindicación 1 en células que producen globina.

3. Uso de la reivindicación 1, en el que la ferritina H como se ha definido en la reivindicación 1 se proporciona como una construcción de liposomas.

4. Uso de la reivindicación 1, en el que la proteína de la familia de la ferritina distinta de la ferritina H es ferritina L.

5. Uso de la reivindicación 1, en el que el gen (iii) está en la forma de un vector.

6. Uso de la reivindicación 1, en el que el vector se proporciona como una construcción de liposoma que tiene un ligando o anticuerpo en su superficie, dicho ligando o anticuerpo es capaz de unirse a un receptor específico en la superficie de una célula.

7. Uso de la reivindicación 1, en el que la ferritina H como se ha definido en la reivindicación 1 se proporciona en un vehículo, dirigiendo dicho vehículo las células del tronco hematopoyético, células precursoras de eritroides, o células hematopoyéticas.

8. Una composición farmacéutica para tratar una enfermedad de células falciformes o una \beta-taalsemia, comprendiendo la composición: ferritina H como se ha definido en la reivindicación 1; y un ligando de dirección específico de células.

9. Una composición farmacéutica para tratar una enfermedad de células falciformes o una \beta-talasemia, comprendiendo la composición: un gen que codifica la ferritina H como se ha definido en la reivindicación 1; y un vector de transfección adecuado.