KR20020059694A - 성장 호르몬 방출 특성을 갖는 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 부분입체이성질체 화합물, 약학적으로 허용되는 그것의 염, 그들을 함유하는 조성물, 및 성장 호르몬 결핍으로 인한 의학적 장애를 치료하기 위한 그들의 사용에 관한 것이다.

Description

성장 호르몬 방출 특성을 갖는 화합물{COMPOUND WITH GROWTH HORMONE RELEASING PROPERTIES}
성장 호르몬은 성장가능한 모든 조직들의 성장을 자극하는 호르몬이다. 게다가. 성장 호르몬은 신진 대사 공정, 예를 들어, 단백질 합성 및 유리 지방산 유동화에 많은 효과를 가지며, 에너지 신진 대사에서 탄수화물을 지방산 대사로 전환을 일으키는 것으로 공지되어 있다. 성장 호르몬의 결핍은 여러가지 심각한 의학적 장애, 예를 들어, 왜소증을 초래할 수 있다.
성장 호르몬은 뇌하수체에서 방출된다. 방출은 직접 또는 간접적으로 다수의 호르몬 및 신경 전달 물질의 엄격한 제어하에 있다. 성장 호르몬 방출은 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH)에 의해 자극될 수 있고 소마토스타틴(성장 억제 호르몬)에 의해 억제될 수 있다. 두 가지 경우 모두, 호르몬들은 시상하부로부터 방출되지만 그들의 작용은 뇌하수체에 위치한 특정 리셉터를 통해 주로 조정된다. 뇌하수체로부터 성장 호르몬의 방출을 자극하는 다른 화합물들도 또한 설명되어 있다.예를 들어, 아르기닌, L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-Dopa), 글루카곤, 바소프레신, PACAP(뇌하수체 아데닐일 시클라제 활성 펩티드), 무스카린성 리셉터 작용물질 및 합성 헥사펩티드, GHRP(성장 호르몬 방출 펩티드)은 뇌하수체에 대한 직접적인 영향에 의해 또는 시상하부로부터 GHRH 및/또는 소마토스타틴의 방출에 작용을 함으로써 내인성 성장 호르몬을 방출한다.
증가된 수준의 성장 호르몬이 요구되는 장애 또는 상태에서, 성장 호르몬의 단백질 성질은 비경구 투여외에는 무엇이든 생육불능으로 만든다. 게다가, 직접적으로 작용하는 다른 자연 분비촉진제, 예를 들어, GHRH 및 PACAP가 보다 긴 폴리펩티드이기 때문에, 그러한 이유로 비경구 투여가 바람직하다.
포유동물에서 성장 호르몬의 수준을 증가시키기 위한 특정 화합물의 사용은 예를 들어, EP 18 072, EP 83 864, WO 8302272, WO 8907110, WO 8901711, WO 8910933, WO 8809780, WO 9118016, WO 9201711, WO 9304081, WO 9413696, WO 9517423, WO 9514666, WO 9615148, WO 9622997, WO 9635713, WO 9700894, WO 9722620, WO 9723508, WO 9740023, 및 WO 9810653에서 이전에 제안하였다.
성장 호르몬 방출 화합물의 조성물은 그들의 생체이용율 뿐만 아니라 호르몬 방출 잠재력에 있어서 중요하다. 따라서 본 발명의 목적은 성장 호르몬 방출 특성을 갖는 신규 화합물을 제공하는 것이다. 또한, 특이적 및/또는 선택적이고 실질적으로 예를 들어, LH,FSH,ACTH,바소프레신,옥시토신, 코르티솔 및 /또는 프로락틴의 방출과 같은 부작용이 없는 신규 성장 호르몬 방출 화합물(성장 호르몬 분비촉진제)을 제공하는 것이다. 또한 우수한 경구 생체이용율을 갖는 화합물을 제공하는 것이 목적이다.
본 발명은 신규 화합물, 약학적으로 허용되는 그것의 염, 그들을 함유하는 조성물 및 성장 호르몬의 결핍으로 인한 의학적 장애를 치료하기 위한 그들의 사용에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명에 따라, 생체외에서 정상 실험 조건하에서 뇌하수체 세포에 직접적으로 작용하여 거기서 성장 호르몬을 방출하는 신규 화합물이 제공된다.
성장 호르몬 방출 화합물은 특히, 성장 호르몬 분비가 뇌하수체 수준으로 어떻게 조절되는지를 이해하기 위한 유일한 연구 수단으로서 생체외에서 이용할 수 있다.
게다가, 본 발명의 성장 호르몬 방출 화합물은 또한 내인성 성장 호르몬 방출을 증가시키기 위해 생체내로 투여될 수도 있다.
발명의 상세한 설명
따라서, 본 발명은 실시예 1에서 설명한 바와 같은 과정에 의해 얻어진 화합물, 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 실시예 1에서 설명한 바와 같은 과정에 의해 얻을 수 있는 화합물에 관한 것이고, 그 화합물은
2-아미노-N-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드
또는 약학적으로 허용되는 그것의 염이다.
게다가, 본 발명은 화합물
2-아미노-N-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드
또는 약학적으로 허용되는 그것의 염에 관한 것이다.
실시예 1에서 설명한 바와 같은 과정에 의해 얻을 수 있는 화합물의 구조는 예를 들어, X선 회절 분석법(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995), 특히 페이지 160 및 561-562에 기술된 바와 같음)에 의해 확인할 수 있다.
여기서 설명된 구체예의 둘 이상의 어떠한 가능한 조합이 본 발명의 범위 내에서 포함된다.
일반적인 방법
본 특허에 사용된 과정은 당업계에 잘 공지된 펩티드 커플링에 기반하고, 어떠한 방식으로도 결코 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
이 과정에서, 아미노산 또는 펩티드 수지의 커플링에 앞서, tert 부틸옥시카르보닐(Boc)와 같은 적절한 보호기를 당업자들에게 잘 공지된 방법으로 제거할 수 있다. 또한 보호기의 사용을 피할 수도 있다. 적당한 아미노산은 당업계에 공지되고 예를 들어 T. W. Green (Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ed., John Wiley and Sons, New York 1991)에 의해 설명된 방법에 의해 보호되고 탈보호될 수 있다.
실시예 1은 자세하게 과정을 설명한다.
거울상이성질체 화합물 중 한가지를 얻기 위해 3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르의 라세미 혼합물의 분해에 의해, 이 과정에 의해 얻어진 최종 화합물은 두가지 부분입체이성질체(디에스테레오머)의 혼합물 대신, 부분입체이성질체
2-아미노-N-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드
이다.
본 발명의 화합물은 그것이 비천연이고, 특히 천연 아미드 결합이 비천연 아미드 결합 유사물로 치환되기 때문에, 효소에 의한 단백질 분해에 의한 분쇄에 대한 향상된 저항성을 나타낸다. 공지된 호르몬 방출 펩티드에 비해 향상된 본 발명의 화합물의 단백질 분해에 의한 분쇄에 대한 저항성은 앞선 문헌에서 제안된 펩티드의 그것에 비교할때, 그 생체이용율을 개선할 것으로 기대된다.
약학적 조성물
본 발명의 화합물은 선택적으로 식 I의 화합물을 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 아세트산, 인산, 락트산, 말레산, 만델릭 프탈산, 시트르산, 글루타르산, 글루콘산, 메탄술폰산, 살리실산, 숙신산, 타르타르산, 톨루엔술폰산, 트리플루오르아세트산, 술팜산 또는 푸마르산과 같은 무기 또는 유기산 및/또는 물과 반응시킴으로써 제조된 것들을 포함하는 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용되는 산 부가 염과 같은 약학적으로 허용되는 염 형태가 될 수 있다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 산 부가 염 형태 또는, 적당한 경우 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 또는 저급 알킬암모늄 염으로서 투여될 수 있다. 그러한 염 형태는 유리 염기 형태와 대략 동일한 정도의 활성을 나타내는 것으로 믿어진다.
또다른 관점에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께, 활성 성분으로서 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물은 예를 들어,Remington'sPharmaceutical Sciences,1985 또는 Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995)에서 기술한 바와 같은 종래의 기술에 의해 조제될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 캡슐, 정제, 에어로졸, 용액, 현탁액 또는 국소 용도 등의 종래의 형태로 나타날 수 있다.
채용되는 약학적 담체 또는 희석제는 종래의 고형 또는 액체 담체가 될 수 있다. 고형 담체의 예는 락토오스, 백토, 수크로스, 시클로덱스트린, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 셀룰로스의 저급 알킬 에테르이다. 액체 담체의 예는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 인지질, 지방산, 지방산 아민, 폴리옥시에틸렌 또는 물이다.
유사하게, 담체 또는 희석제는 단독의 또는 왁스와 혼합된 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같이, 당업계에 공지된 어떠한 지속 방출 물질을 포함할 수 있다.
만일 고형 담체가 경구 투여에 사용되면, 제제는 정제, 분말 또는 펠릿 형태로 경질 젤라틴 캡슐안에 들어가거나 또는 정제 또는 마름모꼴 정제의 형태로 될 수 있다. 고형 담체의 양은 크게 변하겠지만, 일반적으로 약 25mg 내지 약 1g이 될 것이다. 액체 담체가 사용된다면, 제제는 시럽, 에멀젼, 연질 젤라틴 캡슐 또는 수성 또는 비수성 액체 현탁액 또는 용액과 같은 멸균 주사액의 형태가 될 수 있다.
종래의 정제화 기술에 의해 제조될 수 있는 전형적인 정제는 다음을 함유할 수 있다:
중심부:
활성 화합물(유리 화합물 또는 그것의 염) 10mg
콜로이드 이산화규소(Aerosil) 1.5mg
셀룰로스, 미정질(Avicel) 70mg
변형된 셀룰로스 고무(Ac-Di-Sol) 7.5mg
스테아르산마그네슘
코팅:
HPMC 대략. 9mg
*Mywacett 9-40 T 대략. 0.9mg
*막 코팅을 위한 가소제로 사용된 아실화 모노글리세리드
비강 투여를 위해서, 제조는 에어로졸 용도를 위해서 액체 담체, 특히 수성 담체에 용해된 또는 현탁된 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다. 담체는 용해 보조제와 같은 첨가제, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 계면활성제, 레시틴(포스파티딜콜린)또는 시클로덱스트린과 같은 흡수 강화제 , 또는 파라벤(parabene)과 같은 방부제를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 단위 투여량 당 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 50-200mg의 활성 성분을 포함하는 단위 투여량 형태로 조제된다.
본 발명에 따른 화합물의 투여량은 사람 등의 환자에게 약제로서 투여될 때,적절하게 1일에 0.01-500mg, 예를 들어 1회 투여량 당 약 10mg과 같이, 약 5 내지 약 50mg 사이가 적절하다.
더나아간 관점에서 본 발명은 활성 성분으로서 단위 투여량 형태로 약 10 내지 약 200mg의 일반식 I의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 생체내 내인성 성장 호르몬을 방출하는 능력을 갖는다는 것이 증명되어 왔다. 따라서, 화합물은 성장 호르몬이 부족한 사람 또는 노년층 환자 또는 가축에 있어서처럼 증가된 플라즈마 성장 호르몬 수준을 필요로하는 상태의 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 특정한 관점에서, 본 발명은 뇌하수체로부터 성장 호르몬의 방출을 자극하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이며, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께, 활성 성분으로서 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 포함한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 뇌하수체로부터 성장 호르몬의 방출을 자극하는 방법에 관한 것이며, 그 방법은 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염의 효과적인 양을 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
여전히 또다른 관점에서, 본 발명은 뇌하수체로부터 성장 호르몬의 방출을 자극하기 위한 약제의 조제를 위한 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염의 사용에 관한 것이다.
당업자들에게는, 사람에 있어서 성장 호르몬의 현재 및 잠재적 용도가 변화되고 다수라는 것이 잘 공지되어 있다. 따라서,본 발명의 화합물은 뇌하수체로부터 성장 호르몬의 방출을 자극하는 목적으로 투여될 수 있으며, 그후 성장 호르몬 자체로서 유사한 효과 또는 용도를 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은 다음과 같이 유용하다: 노년기에게 있어서 성장 호르몬 방출을 자극, 글루코코르티코이드의 이화(대사) 부작용의 예방, 골다공증의 예방 및 치료, 만성 피로 증후군(CFS)의 치료, 선택적 수술후의 급성 피로 증후군 및 근육 손실의 치료, 면역 체계의 자극, 상처 치료의 촉진, 골절 회복의 촉진, 복합 골절 촉진, 예를 들어, 신연골형성, 골절에 대한 2차 소모의 치료, 발육 부진의 치료, 신장 기능 부전으로인한 발육 부진의 치료, 심근증의 치료, 만성 간 질환과 연관된 소모의 치료, 혈소판 감소증의 치료, 크론병과 연관된 발육 부진의 치료, 짧은 창자 증후군의 치료, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)과 관련된 소모의 치료, 이식과 연관된 합병증의 치료, 성장 호르몬 결핍 아동을 포함하는 생리학적 단신(작은키) 및 만성 질병과 관련된 단신의 치료, 비만 및 비만과 연관된 발육 부진의 치료, 식욕 감퇴의 치료, Prader-Willi 증후군 및 Tumer 증후군과 관련된 발육 부진의 치료, 부분 성장 호르몬 무감각 증후군을 갖는 환자의 성장속도 증가, 화상입은 환자의 회복을 촉진하고 입원 기간을 줄임; 자궁내 성장 부진의 치료, 골격 형성 장애, 하이퍼코르티솔리즘(hypercortisolism) 및 쿠싱 증후군; 박동성 성장 호르몬 방출의 유발; 스트레스 받은 환자에 있어서 성장 호르몬의 대체, 골연골이형성증, 누난 증후군, 정신분열증, 우울증, 알쯔하이머병, 지체된 상처 치료 및 정신사회적 박탈의 치료, 폐기능장애 및 인공호흡기 의존과 관련된 이화의 치료; 심부전증 또는 관련 혈관 기능장애의 치료, 손상된 심장기능의 치료, 심근 경색증의 치료 또는 예방, 혈압 저하, 심실 기능장애에 대한 보호 또는 재관류 사건의 예방; 만성 투석에 있는 성인의 치료;주요 수술 후에 단백질 이화 반응의 감쇠, 암 또는 에이즈와 같은 만성 질환으로 인한 악액질 및 단백질 감소의 저하; 랑게르한스섬모세포증을 포함하여 고인슐린혈증의 치료, 배란 자극을 위한 보조 치료; 흉선 발달의 자극 및 노화 관련 흉선 기능의 저하의 예방, 면역억제 환자의 치료; 근육감소증(sarcopenia)의 치료, 에이즈와 관련한 소모의 치료; 완력, 가동성 개선, 허약한 노인들에 있어서의 피부 두께, 대사 항상성 및 신장 항상성의 유지, 골모세포의 자극, 골 재형성 및 연골 성장; 음식물 섭취의 규제; 동반 동물에서의 면역 체계의 자극 및 동반 동물에서의 노화의 장애의 치료, 가축의 성장 촉진 및 양모의 성장 자극, 가축의 우유 생산 증가, 대사 증후군(증후군 X)의 치료, 포유동물에서, 예를 들어 사람에서의 NIDDM을 포함하여 인슐린 내성의 치료, 심장에서의 인슐린 내성의 치료, 수면 질의 개선 및 REM 수면의 높은 증가 및 REM 잠복의 감소로 인한 노년기의 상대적 성장저하의 교정, 노화와 관련된 약함의 치료, 충혈성 심장 마비의 치료, 고관절부 골절의 치료, 감소된 T4/T8 세포 비율을 갖는 개인에 있어서의 면역 결핍의 치료, 근육 쇠약의 치료, 노년기의 근골격 손상의 치료, 단백질 키나아제 B(PKB)의 활성 강화, 전반적인 폐기능의 개선, 수면 장애의 치료, 천식과 관련된 성장 부진의 치료, 연소성 류마티즈양 관절염과 관련된 성장 부진의 치료, 및 낭성섬유증과 관련된 성장 부진의 치료에 유용하다.
상기 지시에 대해서 투여량은 투여의 방식 및 원하는 치료요법에 따라 변할 것이다. 그러나, 효과적인 내인성 성장 호르몬의 방출을 얻기 위해서 일반적으로매일 0.0001 내지 100mg/kg 체중 사이의 투여량 수준을 환자 및 동물에게 투여한다. 게다가 본 발명의 화합물은 상기 투여량 수준으로 투여될 때, 실질적으로 부작용, 예를 들어, LH, FSH, TSH, ACTH, 바소프레신, 옥시토신, 코르티솔 및/또는 프로락틴의 방출과 같은 부작용을 갖지 않는다. 통상적으로, 경구, 비강, 폐 또는 경피투여에 적합한 투여량 형태는 약 0.0001mg 내지 약 100mg, 바람직하게는 약 0.001mg 내지 약 50mg의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합된 본 발명의 화합물을 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 다른 활성을 나타내는 하나 이상의 화합물 예를 들어,항생 물질 또는 약학적으로 활성 물질과 결합된 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.
투여의 경로는 경구, 비강, 폐, 경피 또는 비경구와 같이, 활성 화합물을 적당한 또는 원하는 작용 부위에 효과적으로 수송하는 어떠한 경로가 될 수 있는데, 경구 투여가 바람직하다.
본 발명의 화합물의 약학적 사용과 별도로, 그것은 성장 호르몬 방출의 규제를 연구하기 위한 유용한 생체외 수단이 될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 뇌하수체의 성장 호르몬 방출 능력을 평가하기 위한 유용한 생체내 도구가 될 수도 있다. 예를 들어, 화합물을 사람에게 투여하기 전과 후에 채취한 혈청 샘플을 성장 호르몬에 대해 분석할 수 있다. 각각의 혈청 샘플에서 성장 호르몬을 비교하면, 환자의 뇌하수체가 성장 호르몬을 방출하는 능력을 직접적으로 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 중요한 동물에게 투여하여 그들의 성장 속도 및 크기를 증가시키고, 우유 생산도 증가시킬 수 있다.
본 발명의 화합물의 더 나아간 용도는 GHRP(2또는6), GHRH 및 그것의 유사체, 성장 호르몬 및 그것의 유사체 또는 IGF-1 및 IGF-2를 포함하여 간장 호르몬과 같은 다른 분비촉진제와 조합하여 사용된다.
약리적 방법
본 발명의 화합물은 래트 뇌하수체 초기 배양에 있어서 그것의 성장 호르몬 방출 효능 및 잠재력을 평가할 것이고, 그러한 평가는 하기에 설명한 바와 같이 수행될 수 있다.
래트 뇌하수체 세포의 단리는 O. Sartor et al.,Endocrinology 116, 1985, pp. 952-957의 변형이다. 수컷 알비노 Sprague-Dawley 래트(250 +/-25 그램)는 Mollegaard, Lille Skensved, Denmark에서 구매하였다. 래트를 집단 사육장에 수용하고(한 사육장당 4마리) 12시간 광 사이클을 갖는 방안에 놓았다. 방 온도는 19-24℃에서부터 습도는 30-60%로부터 변화하였다.
래트를 단두시키고 뇌하수체를 해부하였다. 신경중재 엽을 제거하고 남아있는 조직을 즉시 빙냉 단리 완충액에 넣었다(0.25% D-글루코스, 2% 비필수 아미노산(Gibco 043-01140) 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma A-4503)으로 보충된 Gey 배지(Gibco 041-04030)). 조직을 작은 조각으로 절단하고 3.8mg/ml의 트립신(Worthington #3707 TRL-3) 및 330mg/ml의 DNase(Sigma D-4527)로 보충된 단리 완충액으로 이동시켰다. 이 혼합물을 70회전/분으로 35분 동안 37℃에서 O2/CO2의 95/5% 분위기에서 배양하였다. 그후 조직을 상기한 완충액에서 3회 세척하였다. 표준 파스퇴르 피펫을 사용하여, 그후 조직을 단일 세포안으로 흡인하였다. 분산 후에, 세포를 나일론 필터(160mm)를 통해 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하였다. 세포 현탁액을 트립신 반응 억제제(0.75mg/ml,Worthington #2829)로 보충된 단리 완충액으로 3회 세척하고 최종적으로 배양 배지; 25mM HEPES(Sigma H-3375), 4mM 글루타민(Gibco 043-05030H),0.075% 탄산수소나트륨(Sigma S-8875), 0.1% 비필수 아미노산, 2.5% 태아 송아지 혈청(FCS,Gibco 011-06290),3% 말 혈청(Gibco 034-06050),10% 신선한 래트 혈청, 1 nM T3(SigmaT-2752) 및 40mg/l 덱사메타존(Sigma D-4902)pH 7.3 으로 보충된 DMEM (Gibco 041-01965)에서, 2×105세포/ml의 밀도까지 재현탁하였다. 세포를 마이크로타이터 플레이트(Nunc, 덴마크)(200ml/웰)안으로 접종하고, 37℃ 및 8% CO2에서 3일동안 배양하였다.
화합물 시험
배양후에, 세포를 자극 완충액(1% BSA(Sigma A-4503),0.25% D-글루코스(Sigma G-5250) 및 25mM HEPES (Sigma H-3375) pH 7.3로 보충된 Hanks Balance Salt 용액 (Gibco 041-04020))으로 2회 세척하고, 37℃에서 1시간동안 선배양하였다. 완충액을 90ml 자극 완충액(37℃)으로 교환하였다. 10 ml 시험 화합물 용액을 첨가하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 15분동안 배양하였다. 배지를상층액분리시키고, rGH SPA 테스트 시스템에서 GH 함유량을 분석하였다.
화합물을 10pM 내지 100mM 범위의 투여량으로 시험하였다. Hill 방정식(Fig P,Biosoft)를 사용하여 투여량-반응 관계를 구성하였다. 효능(방출된 최대 GH,Emax)는 GHRP-6의 Emax의 %로 표현되었다. 잠재력(EC50)은 GH 방출의 절반 최대 자극을 유발하는 농도로서 결정되었다.
본 발명의 화합물은 하기의 과정을 사용하여 그것의 신진 대사 안정성을 평가할 수 있다:
화합물을 1mg/ml의 농도로 물에 용해한다. 이 용액의 25ml을 175ml의 각각의 효소-용액(결과적으로 효소:기질 비율(w/w)이 대략 1:5)에 첨가한다. 용액을 밤새 37℃에 방치한다. 10ml의 여러가지 분해 용액을 분자 이온의 선택된 이온 모니터링을 갖는 흐름 주입 전기스프레이 질량 분석법(ESMS)을 사용하여 해당 0-샘플에 대해서 분석한다. 만일 신호가 0-샘플에 비하여 20%이상 감소하였으면, 정확하게 분해의 정도 및 부위(들)을 확인하기 위해 HPLC 및 질량 분석법으로 용액의 잔류물을 분석한다.
여러가지 용액의 펩티드를 분해하는 능력을 확인하기 위하여 몇가지 표준 펩티드(ACTH 4-10, 안지오텐신 1-14 및 글루카곤)를 안정성 시험에 포함하였다.
표준 펩티드(안지오텐신 1-14, ACTH 4-10 및 글루카곤)는 미국 MO, Sigma에서 구매하였다.
효소(트립신,키모트립신,엘라스타제 아미노펩티다아제 M 및 카르복시펩티다아제 Y 및 B)는 모두 Boehririger Mannheim GmbH (Mannheim, Germany)에서 구매하였다.
췌장 효소 혼합물: 100mM 탄산수소 암모늄 pH 8.0 중의 트립신, 키모트립신 및 엘라스타제(모든 농도 0.025mg/ml).
카르복시펩티다제 혼합물: 50mM 암모늄아세테이트 pH 4.5 (모든 농도 0.025mg/ml)중의 카르복시펩티다제 Y 및 B.
아미노펩티다아제 M 용액: 100mM 탄산수소 암모늄 pH 8.0중의 아미노펩티다아제 M(0.025mg/ml).
두가지 다른 질량 분광계를 사용하여 질량 분광 분석을 수행하였다. 전자스프레이 이온-공급원이 구비된 Sciex API III 트리플 4중극 LC-MS 기구 (Sciex instruments, Thornhill, Ontario) 및 Bio-lon 20 비행시간 플라즈마 탈착 기구 (Bio-lon Nordic AB, Uppsala, Sweden).
분석물의 흐름 주입와 함께 문제의 분자 이온의 단일 이온 모니터링을 사용하여 API III 기구에서 화합물의 정량(분해 전과 후)을 수행하였다. 100ml/분의 액체 흐름(MeOH:물 1:1)을 ABI 140B HPLC 유니트 (Perkin-Elmer Applied Biosystems Divisions, Foster City, CA)으로 제어하였다. 기구 매개 변수는 표준 작동 조건으로 세팅하였고, 가장 강한 분자 이온 (대부분의 경우 이것은 두배로 하전된 분자 이온에 해당된다)을 사용하여 SIM 모니터링을 수행하였다.
분해 생성물의 확인은 또한 니트로셀룰로스 코팅된 표적과 표준 기구 세팅에 대해서 샘플을 사용하는 플라즈마 탈착 질량 분석법(PDMS)을 사용하였다. 이로써결정된 질량의 정확도는 일반적으로 0.1%보다 더 좋다.
분해 생성물의 분리 및 단리는 표준 아세토니트릴:TFA 분리 성분과 함께 HY-TACH C-18 역상 4.6x105 mm HPLC 컬럼 (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA) 을 사용하여 수행하였다. 사용된 HPLC 시스템은 HP1090M (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA)였다.
+:안정(분해 용액에서 24시간 후 SIM 신호가 20% 이하 감소)
-:불안정(분해 용액에서 24시간 후 SIM 신호가 20% 이상 감소)
약동학 방법
본 발명의 화합물은 경구 생체이용율을 평가할 수 있고, 그러한 평가는 하기와 같이 수행할 수 있다.
화합물의 약동학은 공복(fasted) Beagel 개에서 연구할 수 있다.
5% 글루코스 용액 중에 있는, 시험 화합물의 정맥내 및 경구 투여는 1주일의 유실(washout)에 의해 분리되었다.
혈액 샘플을 약물 투여 직전에 수집하였고(시간 0) 투여후 0.08, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 및 6.0 시간에 수집하였다.
플라즈마 샘플은 분석할 때까지 냉동( < -18 ℃) 보관하였다.
플라즈마 상태에 있는 화합물의 정량을 위해서 고상 추출을 갖는 HPLC 방법 및 UV 검출기를 사용하였다.
본 발명의 화합물은 약 50%의 경구 이용율을 갖는다.
화합물에 대한 약동학 매개변수는 PC 기반 약동학 소프트웨어 WinNonlin, 버전 1.1 (Scientific Consulting Inc.,Apex, NC, USA)을 사용하여 비구획적 방법으로 계산하였다.
어떠한 신규 특징 또는 여기서 설명된 특징들의 조합은 본 발명에 필수적인 것으로 간주된다.
본 발명의 화합물을 제조하는 공정 및 그 화합물을 함유하는 제제는 하기의 실시예에서 더욱 설명되지만, 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
화합물의 구조는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 핵자기공명(NMR, Bruker 400 MHz) 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)중의 한가지로 확인한다. NMR 시프트(d)는 100만 당 파트(ppm)로 주어지며 오직 선택된 피크들만이 주어진다. mp는 녹는점이고 ℃로 주어진다. 컬럼 크로마토그래피는 W. C. Still et al, J. Org. Chem. 1978, 43, 2923-2925 에 의해 기술된 기술을 사용하여 Merck 실리카 겔 60 (Art 9385)에서 수행하였다. 출발 물질로서 사용된 화합물은 공지된 화합물 또는 그 자체가 공지된 방법에 의해 손쉽게 제조될 수 있는 화합물 중의 하나이다. 사용된 메탄올/암모니아 용액은 메탄올 중에 있는 10% 암모니아 용액이다.
HPLC-분석:
방법 A1.
218TP54 4.6 mm x 250 mm 5m C-18 실리카 컬럼 (The Seperations Group, Hesperia)에 대해서 214, 254, 276, 및 301 nm에서 UV 검출기를 사용하여, RP-분석을 수행하였고, 이것은 42℃에서 1 mL/분으로 용출되었다. 컬럼은 0.1M 황산암모늄으로 이루어진 완충액 중의 5% 아세토니트릴과 평형화시키고, 이것을 4M 황산으로 pH 2.5로 조절하였다. 주입 후에 50분 동안 동일한 완충액 중에 5% 내지 60% 아세토니트릴의 구배에 의해 샘플을 용출하였다.
방법 B1.
218TP54 4.6 mm x 250 mm 5m C-18 실리카 컬럼 (The Seperations Group, Hesperia)에서의 214, 254, 276, 및 301 nm 에서 UV 검출기를 사용하여 RP-분석을수행하였고, 이것은 42℃에서 1 mL/분으로 용출되었다. 컬럼은 물 중의 TFA의 수용액(0.1%) 중에 있는 5%(아세토니트릴+0.1% TFA)와 평형화시켰다. 주입후 50분 동안 동일한 수성 완충액 중에 있는 5% 내지 60%(아세토니트릴+0.1% TFA)의 구배에 의해 샘플을 용출하였다.
방법 h8:
218TP54 4. 6 mm x 150 mm C-18 실리카 컬럼에 대해서 214 및 254nm에서 UV 검출기를 사용하여 RP-분석을 수행하였고, 이것을 42℃에서 1 mL/분으로 용출시켰다. 컬럼은 5% 아세토니트릴, 85% 물 그리고 물중의 0.5% 트리플루오로아세트산의 10%용액으로 평형화시키고, 5% 아세토니트릴, 85% 물 그리고 0.5% 트리플루오로아세트산의 10%용액에서부터 90% 아세토니트릴과 0.5% 트리플루오로아세트산의 10% 용액까지 선형 구배에 의해서 15분에 걸쳐서 용출하였다.
Chirale HPLC :
4. 6 mm x 80 mm Chiracel OJ 프리컬럼이 구비된 4. 6 mm x 250 mm Chiracel OJ 컬럼에 대해서 225 및 254 nm에서 (두가지 모두 Daicel Chemical Industries, LTD 제품) UV 검출기를 사용하여 Chirale HPLC을 수행하였고, 이것을 실온에서 0,7 mL/분으로 용출시켰다. 샘플은 헵탄(92):iPrOH(8):TFA(0,1)의 등용매 용리액에 의해 용출되었다.
LC-MS-Analysis :
Waters3 mm x 150 mm 3.5 m C-18 Symmetry 컬럼 및 20 ml/분의 유속을 갖는 포지티브 이온스프레이를 사용하여 PE Sciex API 100 LC/MS System에서 LC-MS분석을 수행하였다. 5-90% 아세토니트릴, 85-0% 물 그리고 10 % 트리플루오로아세트산 (0. 1%)/물의 선형 구배로 1 ml/분의 유속으로 15 분내에, 컬럼을 용출시켰다.
약어:
TLC : 박층 크로마토그래피
DMSO : 디메틸술폭시드
min : 분
h : 시간
Boc : tert 부틸옥시카르보닐
DMF : 디메틸포름아미드
THF : 테트라히드로푸란
EDAC : N-에틸-N'-디메틸아미노프로필카르보디이미드 염산염
HOAt : 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
DIEA : 디이소프로필에틸아민
TFA : 트리플루오로아세트 산
기본 원칙:
하기의 실시예에서 사용된 N-메틸화 아미노산은 Can.J.Chem. 1977, 55, 906에서와 같이 조제되었다.
포름산 N',N'-디메틸히드라지드
50 ml의 메틸포름산염과 50 ml의 1, 1-디메틸히드라진의 혼합물을 실온에서 3일동안 교반하였다. 진공에서 농축시켜 결정을 형성하고, 이를 EtOH(5): 헵탄(95)에서 교반하고, 밤새 냉동기에서 냉각시키고 여과하였다:
50,7g (575 mmol) (수율: 88%)
N,N,N'-트리메틸히드라진, 2염산염
자기 교반기 및 첨가 깔때기가 구비된 2-L 3구 둥근 바닥 플라스크를 20,4g의 LiAIH4로 채우고, 배기하고 질소로 플러싱하였다. 그후 첨가 깔때기에 질소 버블러를 구비하고 250ml의 건조 테트라히드로푸란을 천천히 첨가하였다(발열). 회색 현탁액을 격렬하게 교반하고, 250ml의 건조 테트라히드로푸란 중에 있는 40,0 g 의 포름산 N',N'-디메틸히드라지드의 용액을 1시간에 걸쳐 적가하였다. 실온에서 밤새 교반하였다. 반응은 TLC(CH2Cl2(100):MeOH(10):NH3(1))에 의해 체크하였다.
드라이-아이스-응축기가 구비된 또다른 2-L 3구 둥근 바닥 플라스크를 350 ml의 4,8 M HCl/CH30H로 채우고 드라이-아이스-욕(-70℃)에 넣었다. 그후 이것을 비그럭스(vigreux)-응축기를 통해 반응 플라스크로 연결하고, 반응 플라스크를 오일-욕에 넣었다. 200 ml의 테트라히드로푸란과 200 ml의 MeOH의 혼합물을 조심스럽게 반응에 첨가하였다. 130℃로 천천히 가열함으로써 생성물과 용매의 증류를 수행하고, 그 결과 트리메틸히드라진(-70℃에서)의 결정질 2염산염-염이 수집되었다. 드라이-아이스-욕을 제거하고 온도를 실온으로 올렸다. 진공에서 농축하여 엷은 무색 오일을 산출하고, 이것을 고진공 펌프를 사용하여 밤새 건조시켰다:45,2g (309mmol) (수율:68%).
매우 흡습성인 생성물을 질소하에서 유지하였다.
다른 출발 물질은 Aldrich에서 구매할 수 있다.
실시예 1
2-아미노-N-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드
또는
2-아미노-N-[(1R)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N',N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드
중의 하나인 화합물의 제조를 위한 과정
단계 a
피페리딘-1, 3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 3-에틸 에스테르
자기 교반기 및 첨가 깔때기가 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크(1l)를 NaOH-펠릿(15,6 g), 테트라히드로푸란 (400 ml) 및 에틸니페코테이트(50 ml, 324 mmol) 로 채웠다. 실온에서 교반된 혼합물에 테트라히드로푸란(ml)에 용해된 Boc2O (84, 9g, 389mmol) 용액을 적가하였다(1 시간, 백색 고체의 침전물, 용해된 NaOH-펠릿 , 발열). 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(500 ml) 및 H20 (2000 ml)에 첨가하고, 수성층을 EtOAc(2 X 500 ml)로 재추출하고, 결합된 유기층을 염수(100 ml)로 세척하고, MgSO4상에서 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 엷은 황색 오일로서 피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 3-에틸 에스테르(82,5g)를 얻었다.
'H-NMR (300 MHz, CDCl3) : δ1,25 (t, 3H, CH3) ; 1,45 (s, 9H, 3 X CH3) ; 2,05 (m, 1H) ; 2,45 (m, 1H) ; 2,85 (m, 1H) ; 3,95 (d(넓음), 1 H) ; 4,15 (q, 2H, CH2)
단계 b
3-벤질피페리딘-1, 3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 3-에틸 에스테르(라세미 혼합물)
자기 교반기, 온도계, 질소 버블러 및 첨가 깔대기가 구비된 3구 둥근 바닥 플라스크(2l)를 배기하고, 질소로 플러싱하고, 무수물 테트라히드로푸란(500ml)으로 채우고, -70℃로 냉각하였다. 그후 리튬 디이소프로필아민(테트라히드로푸란중에 2,0 M 용액의 164 ml, 327 mmol)을 첨가하였다. -70℃에서 교반된 용액에 무수물 테트라히드로푸란(50 ml) (-70 ℃ 와 -60 ℃ 사이의 온도, 선명한 적색 용액)중에 있는 피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 3-에틸 에스테르(80 g, 311 mmol)의 용액을 45분에 걸쳐서 적가하였다. 혼합물을 20분 동안 교반하고, 이어서 무수물 테트라히드로푸란(250 ml) (-70 ℃ 와 -60 ℃ 사이의 온도)중의 벤질브로마이드(37 ml, 311 mmol) 용액을 40분에 걸쳐서 적가하였다. 혼합물을 -70 ℃에서 1시간동안 교반하고, 그후 밤새 실온에 방치하였다(연한 오렌지). 반응 혼합물을 약 300ml로 진공에서 농축하고, 분리 깔때기로 이동하고, CH2Cl2(900 ml)으로 희석하고 H20(900 ml)으로 세척하였다. 불충분한 분리로 인하여 수성 층을 CH2Cl2(200 ml)으로 재추출하고, 결합된 유기 층은 수성 NaHS04(200ml, 10%), 수성 NaHCO3(200 ml, 포화됨), H20(200 ml), 염수(100 ml)로 세척하고, MgSO4상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축하여 오일을 얻고, 이것을 EtOAc(1):헵탄(10)에 용해하고 밤새 숙성하였다. 형성된 고체를 여과에 의해 제거하고, 헵탄으로 세척하고 진공에서 건조하여 3-벤질피페리딘-1, 3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 3-에틸 에스테르 (81,4 g)의 라세미 혼합물을 얻었다.
HPLC (h8) : Rt = 15,79 분.
LC-MS : Rt = 7,67 분. (m+1) = 348,0
단계 c
3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 (라세미 혼합물)
3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 3-에틸 에스테르(81g,223mmol)를 응축기 및 자기 교반기가 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크(1L)에서 EtOH (400 ml) 및 NaOH (400 ml, 16% 수용액)에 용해하였다. 혼합물을 10시간동안 질소 하에서 환류하고, 실온으로 냉각하고, 진공에서 약 600ml(고체의 침전물)로 농축하고, H2O(400ml)로 희석하고, 아이스욕에서 냉각하고, 격렬한 교반하에서 pH=3(최종 온도:28℃)이 될 때까지 4M H2SO4로 산성화하였다. 혼합물을 EtOAc (2 X 700 ml)로 추출하고, 결합된 유기층을 염수(200ml)로 세척하고, MgS04상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축하여 오일을 얻어, 이것을 EtOAc(1): 헵탄(10)에 용해하고 밤새 숙성하였다. 형성된 결정을 여과로 제거하고, 헵탄으로 세척하고 진공에서 건조하여 3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르(66,0 g)의 라세미 혼합물을 얻었다.
HPLC (h8) : Rt = 12, 85 분.
LC-MS : Rt = 5, 97 분. (m+1) = 320, 0
Chirale HPLC (Chiracel OJ, 헵탄(92): iPrOH(8): TFA (0,1)) :
Rt = 8,29 분. 46, 5 %
Rt = 13,69 분. 53, 5 %
단계 d
(3R)-3-벤질피페리딘-1, 3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 또는 (3S)-3-벤질피페리딘- 1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르
(3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르의 분해)
3-벤질피페리딘-1, 3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르(76 g, 238 mmol)을 자기 교반기가 구비된 1구 플라스크(5L)에서 EtOAc(3,0 L)에 용해하였다. 그후 H20 (30 ml), R(+)-1-펜틸아민(18,2 ml, 143 mmol) 및 Et3N (13,2 ml, 95 mmol)을 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하여 백색 결정(41, 9 g)의 침전물이 생겼고, 이것을 여과로 제거하고, EtOAc로 세척하고 진공에서 건조시켰다. 침전물을 수성 NaHS04(300 ml, 10%) 및 EtOAc(600 ml)의 혼합물에 용해하고, 층을 분리하고 수성 층을EtOAc(100 ml)로 재추출하였다. 결합된 유기층을 염수(100 ml)로 세척하고, MgS04상에서 건조하고 여과하였다. 용매를 진공에서 제거하여 무색 오일을 얻었고, 이것을 EtOAc(1):헵탄(10)에 용해하고 밤새 숙성하였다. 형성된 결정을 여과로 제거하고, 헵탄으로 세척하고 진공에서 건조하여, (3R)-3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 또는 (3S)-3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르(27,8g) 중의 한가지 화합물을 얻었다.
Chirale HPLC (Chiracel OJ, 헵탄(92):iPrOH(8):TFA(0,1)): Rt = 7,96 분. 95,8 % ee
단계 e
(3R)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 또는 (3S)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르
트리메틸히드라진 2염산염(15,3 g, 104 mmol)을 큰 자기 교반기, 그리고 첨가 깔때기/질소 버블러가 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크(1 l)에서 테트라히드로푸란(250 ml)에 현탁시켰다. 그후 플라스크를 수욕에 넣고(온도:10-20℃), 브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄-헥사플루오로포스페이트(40,4 g, 86, 7 mmol)를 첨가하고, 격렬한 교반하에서 디이소프로필에틸아민 (59 ml, 347 mmol)을 적가하였다. 혼합물(많은 침전이 일어남)을 5분동안 교반하고, 테트라히드로푸란 (250 ml)중에 있는 (3R)-3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 또는 (3S)-3-벤질피페리딘-1,3-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르(27,7 g, 86,7 mmol) 중의 하나인 단계 d로부터의 생성물의 용액을 1,5시간에 걸쳐서 천천히 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응을 EtOAc (1000 ml)로 희석하고, H20 (500 ml), 수성 NaHS04(200 ml, 10%), 수성 NaHCO3(200 ml, 포화됨), 염수(200 ml)로 세척하고, MgS04상에서 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 엷은 오렌지색 오일을 얻었다. 혼합물을 EtOAc (300 ml)에 용해시키고, SiO2(150g)에 첨가하고, 건조 분말로 농축시키고, 이것을 진공에서 Si02(150g)로 충전된 필터위에 도포하고, 헵탄(1l)으로 세척하고 원하는 화합물을 EtOAc (2,5 l)로 유리시켰다. 진공에서 농축 후에, (3R)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐)-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 또는 (3S)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐)-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (49 g) 중의 하나인 생성물을 오렌지색 오일로 얻었다.
HPLC (h8): Rt = 14,33 분.
단계 f
(3R)-3-벤질-피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드 또는(3S)-3-벤질-피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드
(3R)-3-벤질-3-(N, N', N'트리메틸히드라지노카르보닐)-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 또는 (3S)-3-벤질-3(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐)-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (56,7 g, 100,9 mmol) 중의 하나인 단계 e로부터의 생성물을 자기 교반이 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크에서 EtOAc(500 ml)(투명한 무색 용액)에 용해하였다. 그후 플라스크를 수욕(온도:10-20℃)에 넣고, 5분동안 HCl-가스를 용액에 통과시켰다(먼지같은 침전물). 1시간 동안 교반후에(다량의 백색 결정의 침전물), 용액을 N2로 플러싱하여 과도한 HCl을 제거하였다. 온건한 여과로 침전물을 제거하고, EtOAc (2 X 100 ml)로 세척하고, 진공하에서 40℃에서 밤새 건조하여, (3R)-3-벤질-피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드 또는 (3S)-3-벤질-피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드(37, 0 g) 중의 하나인 생성물을 얻었다.
HPLC (h8) : Rt = 7,84 분.
단계 g
[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-((1H-인돌-3-일)메틸)-2-옥소에틸]카르밤산 tert-부틸 에스테르 또는 [(1R)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-((1H-인돌-3-일)메틸)-2-옥소에틸] 카르밤산 tert-부틸 에스테르
Boc-D-Trp-OH (32,3 g, 106 mmol)을 자기 교반기 및 질소 버블러가 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크 (500 ml)에서 디메틸아세트아미드 (250 ml)에 용해하였다. 용액을 0-5℃로 냉각하고, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (14,4 g, 106 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염 (20,3 g, 106 mmol), N-메틸모르폴린 (11,6 ml, 106 mmol)을 첨가하였다. 20분 동안의 교반 후에, 0-5 ℃에서 (3R)-3-벤질-피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드 또는 (3S)-3-벤질-피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드(37,0 g, 106 mmol) 중의 하나인 단계 f로부터의 생성물 및 N-메틸모르폴린(24,4 ml, 223 mmol)을 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. 그후 혼합물을 EtOAc(750 ml)에 첨가하고 수성 NaHS04(300 ml, 10 %)으로 세척하였다. 층들을 분리시키고, 수성 층을 EtOAc (500 ml)로 재추출하였다. 결합된 유기 층들을 H20 (100 ml), 수성 NaHCO3(300 ml, 포화됨), H20 (100 ml), 염수(300 ml)로 세척하고, MgSO4상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축하여, 오렌지색 오일로서 [(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-((1H-인돌-3-일)메틸)-2-옥소에틸]카르밤산 tert-부틸 에스테르 또는 [(1R)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-l-((lH-인돌-3-일)메틸)-2-옥소에틸]카르밤산 tert-부틸 에스테르 (56,7g) 중의 한가지 생성물을 얻었다.
HPLC (h8) : Rt = 14,61 분.
LC-MS : Rt = 7,35 분. (m+1) = 562,6
단계 h
1-[(2R)-2-아미노-3-(1H-인돌-3-일)프로피온일]-(3R)-3-벤질피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드 또는 1-[(2R)-2-아미노-3-(1H-인돌-3-일) 프로피온일]- (3S)-3-벤질피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드
[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐) 피페리딘-1-일]-1-((1H-인돌-3-일)메틸)-2-옥소에틸] 카르밤산 tert-부틸 에스테르 또는 [(1R)-2-[(3R)-3벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐) 피페리딘-1-일]-1-((1H-인돌-3-일)메틸)-2-옥소에틸] 카르밤산 tert-부틸 에스테르 (56,7g, 100,9mmol) 중의 하나인 단계 g로부터의 생성물을 자기 교반이 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크에서 EtOAc(500 ml)(맑은 무색 용액)에 용해하였다. 그후 플라스크를 수욕(온도:10-20℃)에 넣고, 10분동안 HCl-가스를 용액에 통과시켰다.(오일이 두껍게 침전됨). 혼합물을 N2로 플러싱하여 과도한 HCl을 제거하고 그후 오일과 EtOAc-층으로 분리시켰다. EtOAc-층은 버렸다. 오일은 H20 (500 ml), CH2Cl2(1000 ml)에 용해시키고, 고체 Na2CO3를 pH > 7 될 때까지 첨가하였다. 층들을 분리하고, 유기층을 H20 (100 ml), 염수(100 ml)로 세척하고, MgS04상에서 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 오렌지 거품으로서 1-[(2R)-2-아미노-3-(1H-인돌-3-일) 프로피온일]-(3R)-3-벤질피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드 또는 1-[(2R)-2-아미노-3-(1H-인돌-3-일)프로피온일]-(3S)-3-벤질피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드(27g) 중의 한가지인 생성물을 얻었다.
HPLC (h8) : Rt = 10,03 분.
단계 i
{1-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐) 피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸카르바모일]-1-메틸에틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르 또는
{1-[(1R)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐) 피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸카르바모일]-1-메틸에틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르
Boc-Aib-OH (11,9 g, 58,4 mmol)을 자기 교반기 및 질소 버블러가 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크(500ml)에서 디메틸아세트아미드(125 ml)에 용해하였다. 실온에서 교반된 용액에 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(7,95g, 58,4 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(11,2g, 58,4 mmol), 및 디이소프로필에틸아민(13,0 ml, 75,8 mmol)을 첨가하였다. 20분 후에 (침전을 갖는 황색), 디메틸아세트아미드(125 ml)중에있는 1-[(2R)-2-아미노-3-(1H-인돌-3-일)프로피온일]-(3R)-3-벤질피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드 또는1-[(2R)-2-아미노-3-(1H-인돌-3-일)프로피온일]-(3S)-3-벤질피페리딘-3-카르복실산 트리메틸히드라지드(27,0 g, 58,4 mmol) 중의 하나인 단계 h로부터의 생성물 용액을 첨가하였다. 반응은 실온에서 3시간동안 교반되었다. 혼합물을 EtOAc (750 ml)에 첨가하고 수성 NaHS04(300 ml, 10 %)으로 세척하였다. 층들을 분리시키고, 수성 층을 EtOAc (500 ml)으로 재추출하였다. 결합된 유기 층들을 H20 (100 ml), 수성 NaHCO3(300 ml, 포화됨), H20 (100 ml), 염수(300 ml)로 세척하고, MgSO4상에서 건조하고, 여과하고 약 500 ml로 진공에서 농축하였다. 그후 Si02(150 g)을 첨가하고 남아있는EtOAc를 진공에서 제거하여 건조 분말을 얻고, 이것을 Si02(150 g)으로 충전된 필터위로 도포하고, 헵탄(1L)으로 세척하고, 원하는 화합물을 EtOAc (2,5 L)으로 유리시켰다. 진공에서 농축한 후에, {1-[(lR)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N, N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)2-옥소-에틸카르바모일]-1-메틸에틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르 또는 {1-[(lR)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-l-(lH-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸카르바모일]-1-메틸에틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르 33,9 g중의 하나인 생성물을 오렌지 거품으로 얻었다.
HPLC (h8) : Rt = 14,05 분.
단계 j
2-아미노-N-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸l-2-메틸프로피온아미드,푸마레이트 또는
2-아미노-N-[ (1 R)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N, N', N'-트리메틸히드라지노카르보닐) 피페리딘-1-일l-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드,푸마레이트
{1-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸카르바모일]-1-메틸에틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르 또는 {1-[(1R)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸카르바모일]-1-메틸에틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르 (23,8 g, 36,8 mmol)중에 하나인 단계 i로부터의 생성물을 자기 교반이 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크(1L)에서 EtOAc (800 ml) (투명 황색 용액)에 용해하였다. 그후 플라스크를 수욕(온도:10-20℃)에 넣고, HCl-가스를 5분동안 용액에 통과시켰다(먼지같은 침전물). 1시간동안 교반후에(다량의 황색 분말의 침전물), 용액을 N2로 플러싱하여 과도한 HCl을 제거하였다. 침전물을 온건한 여과로 제거하고 진공하에서 40℃에서 밤새 건조하였다.
비결정 침전물을 H2O(500 ml)에 용해하고 EtOAc (100 ml)로 세척하였다. 그후 pH > 7될 때까지 CH2Cl2(1000 ml) 및 고체 Na2CO3를 첨가하였다. 2층들을 분리시키고, 수성 층을 CH2Cl2(200 ml)로 재추출하였다. 결합된 유기층들을 염수(100 ml)로 세척하고, MgSO4상에서 건조하고, 여과하였다. 용매를 감압하에서 증발시키고 자기 교반이 구비된 1구 둥근 바닥 플라스크(1 L)에서 EtOAc (500 ml)에 재용해시켰다. 이소프로판올(20 ml) 및 EtOAc(50ml)중의 푸마르산(3,67 g)의 현탁액을 천천히 첨가하고(5분), 그 결과 백색 결정염의 침전이 생겼다. 1시간후 침전물을 여과에 의해 단리시키고 밤새 진공에서 40℃에서 건조시켜, 백색 분말으로서 2-아미노-N-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드 또는 2-아미노-N-[(1R)-2-[(3S)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1- (1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드 (13,9 g) 중의 한가지인 화합물의 푸마레이트 염을 얻었다.
HPLC (A1) : Rt = 33,61 분.
HPLC (B1) : Rt = 34,62 분.
LC-MS : Rt = 5,09 분. (m+1) = 547,4

Claims (9)

  1. 실시예 1에서 설명된 바와 같은 과정에 의해 얻을 수 있는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염.
  2. 실시예 1에서 설명된 바와 같은 과정에 의해 얻을 수 있는 화합물, 그리고 그 화합물은
    2-아미노-N-[(1R)-2-[(3R)-3-벤질-3-(N,N',N'-트리메틸히드라지노카르보닐)피페리딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]-2-메틸프로피온아미드
    또는 약학적으로 허용되는 그것의 염.
  3. 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께, 활성 성분으로서, 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 따르는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 뇌하수체로부터의 성장 호르몬의 방출을 자극하기 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 성장의 속도 및 크기를 증가시키거나, 우유 및 양모 생산을 증가시키기거나, 또는 병의 치료를 위하여 동물에게 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 포유 동물의 뇌하수체로부터 성장 호르몬의 방출을 자극하는 방법으로서, 상기한 포유동물에 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 따르는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염, 또는 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따르는 조성물의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  7. 성장의 속도 및 크기를 증가시키거나, 우유 및 양모 생산을 증가시키거나, 또는 병의 치료를 위한 방법으로서, 그 방법은 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한항에 따르는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염, 또는 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따르는 조성물의 효과적인 양을 필요로하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  8. 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 따르는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그것의 염의 사용.
  9. 제 8항에 있어서, 약제는 포유동물의 뇌하수체로부터 성장 호르몬의 방출을 자극하기 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
KR1020027005836A 1999-11-10 2000-11-10 성장 호르몬 방출 특성을 갖는 화합물 KR100907637B1 (ko)

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