CH621111A5 - - Google Patents

Description

La présente invention est relative à un procédé de préparation de tripeptides ayant une activité sur le système nerveux central.

Le principal obstacle à l'utilisation pratique de nombreux peptides présentant une activité biologique est leur brève période d'action partiellement due à leur inactivation par les enzymes protéolytiques. Un exemple d'un tel peptide est le tripeptide qui est le facteur inhibant la libération de l'hormone de stimulation des mélanocytes (MIF ou MRIH).

Ce tripeptide a été isolé du tissu hypothalamique de bovins par R. M. G. Nair et collaborateurs, «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 43, 1376 (1971) et on a établi que sa structure est le tripeptide C-terminal de l'oxytocine: H-L-prolyl-L-leucylglycina-mide.

Ce tripeptide a montré qu'il exerce une action sur le système nerveux central. Ce tripeptide renforce les effets de comportement de la (3,4-dihydroxyphényl)-L-alanine (L-Dopa), comme démontré par N.P. Plotnikoff et consorts, «Life Sciences», 10, partiel, 1279 (1971) et E. Friedman et consorts, «Science», 182, 831 (1973). Ce tripeptide contrarie aussi les effets de l'oxotrémo-

rine N.P. Plotnikoff et consorts, «Proc. Soc. Exp. Biol. Med.», 140, 811 (1972) et inverse les effets sédatifs de la déserpidine chez les souris et les singes N.P. Plotnikoff et consorts, «Neuroendo-crinology», 11, 67 (1973). Sur la base des activités biologiques précédentes, A. V. Schally et consorts, «Science», 179, 341 (1973) ont suggéré que le tripeptide H-Pro-Leu-Gly-NH2 pourrait être utile dans le traitement de patients souffrant de dépression ou de la maladie de Parkinson.

Depuis que l'on a déterminé la structure du tripeptide précédent, un nombre limité d'analogues de ce peptide ont été synthétisés par «M.E. Celis et consorts, Febs «Febs Letters», 27, 327

(1972) et S. Castensson et consorts, «Febs Letters», 44, 101 (1974). Toutefois, le triptide naturel et les analogues connus à ce jour présentent le désavantage d'avoir une courte durée d'action en raison d'une inactivation rapide dans le corps des mammifères, etT.W. Redding et consorts, «Neuroendocrinology», 11, 92

(1973),,pnt démontré que la première phase de l'inactivation du tripeptide naturel semble être une désintégration protéolytique de la liaison Pro-Leu avec formation de proline et de leucylglycina-mide.

On a déjà décrit d'autres composés analogues de la MIF, à savoir le tripeptide H-Pro-Leu-Gly-N(CH3)2 par [M.E. Celis et coll., «Febs Lettere», 37, 27 (1973)] lorsqu'ils ont fait des études de spectres de la MIF. Des peptides de formule H-Pro-Leu-Gly-NH2, dans lesquels le radical leucine a été remplacé par les radicaux des acides aminés d'isoleucine et de glycine, ont été utilisés afin de préparer les dérivés de l'oxytocine et de la Vasopressine (voir le brevet belge N° 630332 et O.A. Jaquenoud et R. A. Bois-sonnas, «Helv. Chim. Acta», 44, 113 (1961) ainsi que O.S. Pap-suevich et coll., «Chem. Abstr.», 77, 19 991 k (1972).

Certains peptides de formule 1 ayant une liaison a-hydrazide à savpir où Ri dans la formule (1) ci-dessous représente — NR4R5, sont décrits dans le brevet américain N° 3904593 au nom de la déposante, déposé le 7.2.1973 et publié le 9.9.1975.

Vu l'instabilité protéolytique mentionnée ci-dessus, il serait intéressant de disposer d'analogues du tripeptide naturel, présentant une plus grande résistance à l'hydrolyse protéolytique, tout en conservant l'activité sur le système nerveux central du tripeptide naturel. La présente invention prévoit de nouveaux analogues du tripeptide naturel, dans lesquels les restes aminoacides leucyl et glycyl peuvent être remplacés, et la liaison peptidique et l'amide terminal peuvent être substitués.

L'invention prévoit donc un procédé nouveau et direct de préparation de ces dérivés tripeptides.

Ces dérivés peptides sont représentés par la formule générale (1):

H-L-Pro-N-CH-C-Y-R3 (1)

I I II R1 R2 O

dans laquelle R1 représente de l'hydrogène, un alcoyle inférieur ou NR4R5, où R4 et R5 représentent chacun un alcoyle inférieur; R2 représente de l'hydrogène ou un alcoyle inférieur; R3 représente un radical amino, alcoyle inférieur amino, dialcoyle inférieur amino ou aminoalcoyle inférieur amino, et Y représente l'un des restes aminoacides Gly ou D-Ala, à la condition que, lorsque R1 représente NR4R5, où R4 et R5 ont la définition donnée ci-dessus, et que R2 et Y sont tels que définis, R3 représente un radical alcoyle inférieur amino, dialcoyle inférieur amino ou aminoalcoyle inférieur amino, et lorsque R1 = H et Y = Gly, R3 est un radical amino(alcoyle inférieur) amino.

Le procédé selon l'invention est défini dans la revendication 1 indépendante.

Une forme de mise en œuvre du procédé suivant l'invention passe par une série d'intermédiaires de la formule (2)

R6 — L—Pro—N(R' )CH(R2)CO—Y — R7 (2)

dans laquelle R1 est un alcoyle inférieur ou NR4R5, où R4 et R5 représentent chacun un alcoyle inférieur, R2 représente I'hydro-

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gène ou un alcoyle inférieur, R6 est un groupe protecteur d'amino tel qu'utilisé dans la synthèse des peptides, et R7 est un radical hydroxyle ou alcoxy inférieur.

Cette technique comprend la condensation d'une énamine ou d'une hydrazone de formule (3): RIN=CHR2, dans laquelle R1 et R2 ont la définition qui vient d'être donnée, avec un aminoa-cide de la formule R6-L-Pro-OH, dans laquelle R6 a la définition qui vient d'être donnée, en présence d'un isonitrile de la formule CNCH2COR7, dans laquelle R7 est un alcoxy inférieur, pour obtenir l'intermédiaire correspondant de formule (2), dans laquelle R1, R2 et R6 ont la définition qui vient d'être donnée, et R7 est un alcoxy inférieur.

Le procédé préféré utilisé dans la forme de réalisation précédente comprend la condensation d'un composé de formule (3) avec une proline protégée en amino de formule R6-L-Pro-OH, dans laquelle R6 a la définition donnée ci-dessus, en présence d'un isonitrile de formule CNCH2COR7, dans laquelle R7 a la définition donnée, pour- obtenir l'intermédiaire correspondant de formule (2), dans laquelle R1, R2, R6 et R7 ont la définition qui vient d'être donnée, avec ensuite traitement de cet intermédiaire (2) avec de l'ammoniac pour obtenir l'amide correspondant, et l'enlèvement du groupe protecteur R6 pour obtenir le dérivé peptide correspondant de formule (1), dans laquelle R1 et R2 ont la définition qui a été donnée, R3 est le radical amino et Y est le reste aminoacide Gly.

A titre de variante, l'intermédiaire de formule (2) dans laquelle R1, R2, R6 et R7 ont la définition qui vient d'être donnée, est traité avec un agent hydrolysant pour obtenir l'acide correspondant de formule (2), dans laquelle R1, R2 et R6 ont la définition qui vient d'être donnée, et R7 est le radical hydroxyle. On traite ce dernier acide avec un agent intéressant, d'une manière générale, dans la chimie des peptides pour l'activation d'un groupe car-boxyle, et la condensation du composé activé avec une alcoyle inférieur amine, une dialcoyle inférieur amine ou une aminoalcoyle inférieur amine monoprotégée donne l'intermédiaire correspondant de formule (2), dans laquelle R1, R2 et R6 ont la définition qui a été donnée ci-dessus, et R7 représente un radical alcoyle inférieur amino, dialcoyle inférieur amino ou aminoalcoyle inférieur amino protégé. Le ou les groupes protecteurs de ce dernier composé sont séparés pour obtenir le dérivé tripeptide correspondant de formule (1), dans laquelle R1 et R2 ont la définition donnée, R3 est un radical alcoylamino, dialcoyle inférieur amino ou aminoalcoyle inférieur amino, et Y est le reste aminoacide Gly.

Une autre forme de mise en œuvre de la synthèse complète comprend la préparation des dérivés tripeptides de formule (1) par l'addition graduelle d'aminoacides. Les composés préférés de formule (1), obtenus par cette variante de réalisation, sont ceux dans lesquels R1 est de l'hydrogène ou un alcoyle inférieur, R2 est de l'hydrogène ou un alcoyle inférieur, de préférence une chaîne latérale d'aminoacide, R3 est un radical amino, alcoyle inférieur amino, dialcoyle inférieur amino ou aminoalcoyle inférieur amino, et Y est le reste aminoacide Gly ou D-Ala.

Le dérivé tripeptide de formule (I), dans laquelle R1 représente CH3, R2 représente CH2CH(CHj)2, c'est-à-dire la chaîne latérale de la L-leucine, R3 représente NH2 et Y est le reste aminoacide D-Ala, se prépare facilement en combinant un ester activé de benzyloxycarbonyl-L-(N-méthyl)leucine avec de l'ester méthylique de D-alanine pour obtenir le dipeptide de formule Z-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe. Le groupe protecteur d'amino (Z) de ce dernier composé est séparé, avec ensuite combinaison avec un ester activé de benzyloxycarbonyl-L-proline pour donner le tripeptide de formule Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe. Ce dernier composé, lorsqu'on le soumet à l'action de l'ammoniac dans un solvant organique inerte, donne le tripeptide de formule Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-NH2- Le groupe protecteur d'amino (Z) de ce dernier composé est séparé pour obtenir le dérivé tripeptide correspondant de formule (1), dans laquelle R' représente CH3, c'est-à-dire H-L-Pro-L-(N-ME)-Leu-D-Ala-NH2.

Le dérivé tripeptide de formule (1), dans laquelle R1 est de l'hydrogène, R2 représente CH2CH(CH3)2, R3 représente NH(CH2)4NH2 et Y est le reste aminoacide Gly, se prépare facilement en soumettant le tripeptide de formule

Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OEt à hydrolyse pour obtenir l'acide correspondant de formule Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH. Le carboxyle de ce dernier composé est activé et condensé avec un 1,4-diaminobutane dont un radical amino est protégé, par exemple du H2N(CH2)4NHBoc, pour donner le tripeptide correspondant de formule

Z-L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH-Boc.

Les groupes protecteurs d'amino de ce dernier composé sont séparés pour obtenir le dérivé tripeptide correspondant de formule (1), à savoir

L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH2.

L'expression «alcoyle inférieur», telle qu'on l'utilise dans le cas présent, englobe des radicaux alcoyles à chaîne droite comportant de 1 à 6 atomes de carbone et des radicaux alcoyles à chaîne ramifiée, comportant de préférence 3 ou 4 atomes de carbone, à exclusion du butyle tertiaire, cette expression englobant le méthyle (Me), l'éthyle (Et), le propyle, l'isopropyle, le butyle, l'isobutyle, le pentyle, etc.

D'une manière générale, les abréviations utilisées dans le cas présent pour désigner les aminoacides et les groupes protecteurs sont basées sur les recommandations de la IUPAC-IUB [Commission on Biochemical Nomenclature, voir«Biochemistry», II, 1726-1732 (1972)]. A titre d'exemple, Pro, Leu, Ala et Gly désignent les «restes» de proline, de leucine, d'alanine et de glycine. Par le terme «reste», on désigne un radical dérivant de l'cx-ami-noacide correspondant par élimination de la portion OH du groupe carboxyle et de la portion H du groupe a-amino. L'expression «chaîne latérale d'aminoacide».est la partie d'un aminoacide, à l'exclusion de la portion — CH(NH2)COOH, comme défini par K.D. Kopple, «Peptides and Amino Acids», W. A. Benjamin Inc., New York et Amsterdam, 1966, pp. 2 et 33; des exemples de telles chaînes latérales des aminoacides classiques sont —CH2CH(CH3)2 (chaîne latérale de la leucine) ou H — (chaîne latérale de la glycine).

La configuration des aminoacides et des restes d'aminoacides est désignée ici par les symboles appropriés D, L ou DL, et, lorsque la configuration n'est pas désignée, l'aminoacide ou le reste peut avoir la configuration D, L ou DL. On notera que la structure de certains des composés de l'invention englobe des atomes de carbone asymétriques. Il doit être entendu, en conséquence, que les isomères dérivant d'une telle asymétrie sont englobés dans le cadre de l'invention. On obtient de tels isomères sous une forme pratiquement pure par des techniques classiques de séparation et par une synthèse stériquement contrôlée, et on désigne arbitrairement ces isomères par isomères A ou B.

On connaît, à l'heure actuelle, un certain nombre de procédés ou de techniques pour la préparation des peptides et on peut les retrouver dans les manuels généraux de la chimie des peptides; par exemple, K.D. supra, et pp. 33-51, et E. Schröder et K. L. Lübke, «The Peptides», vol. 1, Academic Press, New York, 1965, pp. 3-128. A titre d'exemple, les groupes fonctionnels qui ne sont pas impliqués dans la réaction de formation de liaisons peptidiques sont facultativement protégés par un ou des groupes protecteurs avant la réaction de condensation. Des exemples de groupes protecteurs pour une fonction amino d'un peptide ou d'un aminoacide, qui n'est pas impliquée dans la formation de liaisons peptidiques, sont: les alcoxycarbonyles qui sont le benzy-loxycarbonyle (représenté par Z), le t-butoxycarbonyle (Boc) ou le a,a-diméthyl-3,4-diméthoxybenzyloxycarbonyle (Ddz); les groupes protecteurs du type acyle, qui englobent le triphénylmé-thyle ou le benzyle. Les groupes protecteurs préférés sont le benzyloxycarbonyle et le t-butoxycarbonyle. La fonction acide carboxylique d'un peptide ou d'un aminoacide peut être considérée comme protégée par un ester d'alcoyle inférieur ou d'aralcoyle

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inférieur, englobant les esters de méthyle (représenté par OMe), d'éthyle (OEt), de benzyle (OBzl) ou de butyle tertiaire (OBu1).

Pour favoriser une condensation facile d'un groupe carboxyle de peptide avec un groupe amino libre d'un autre peptide en vue de former une nouvelle liaison peptidique, le groupe carboxyle terminal doit être activé. Des descriptions de groupes de ce genre, qui activent le carboxyle terminal, sont données dans les manuels généraux de la chimie des peptides, notamment par Kopple, ou par Schröder et Lübke, citations précédentes. Des exemples de la forme activée d'un carboxyle terminal sont un chlorure d'acide, un anhydride, un azoture, un imidazolide, un ester activé ou une O-acylurée d'un dialcoylcarboxydiimide. Les esters activés suivants se sont montrés particulièrement intéressants dans le procédé de l'invention : 2,4,5-trichlorophényle (représenté par OTcp), pentachlorophényle (OPcp), p-nitrophényle (ONp), ou 1-benzo-triazoyle; le dérivé succinimido est également intéressant à cet effet.

Les termes «peptide», «dipeptide», «tripeptide», etc., que l'on utilise dans le cas presentane désignent pas uniquement les peptides de départ respectifs mais également les peptides modifiés comportant des groupes fonctionnalisés ou protecteurs. Le terme «peptide» s'utilise dans le cas présent pour désigner un peptide comportant 1 à 3 restes d'aminoacide.

L'expression «acide minéral» désigne dans le cas présent des acides minéraux forts, en englobant les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique et phosphorique. Lorsqu'on utilise cette expression conjointement avec un système anhydre, l'acide chlorhydrique anhydre est l'acide mméral préféré.

L'expression «conditions faiblement acides» désigne des conditions dans lesquelles une solution aqueuse diluée d'un acide organique, par exemple une solution aqueuse à 30-90%, de préférence à 70-80% d'acide formique, acétique ou propionique, ou une solution aqueuse à 1-10% d'acide trifîûoroacétique, constitue un composant principal du milieu de réaction, habituellement à 20-50° C.

L'expression «conditions modérément acides» désigne des conditions dans lesquelles des acides organiques concentrés ou des solutions aqueuses des acides minéraux sont utilisés en tant que composant principal du milieu de réaction à des températures allant d'environ —30 à + 30° C. Des exemples de conditions préférées dans ce cas sont l'utilisation d'acide trifluoroacétique à 50-100% à 0-30° C, d'acide chlorhydrique 0,1-12N à une température de —30 à 10°C, ou d'acide chlorhydrique 0,1-6N dans un solvant organique inerte anhydre.

L'expression «base organique» désigne dans le cas présent la triéthylamine, la N-éthylmorpholine et la N-éthyldiisopropyla-mine.

L'expression «base forte» désigne dans le cas présent à la fois des bases organiques, telles que décrites précédemment, et des bases minérales fortes, notamment les hydroxydes et carbonates de sodium et de potassium.

On obtient les tripeptides par le procédé de l'invention sous la forme de la base libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide, et ce directement grâce au procédé suivant l'invention. Les tripeptides sous la forme de la base libre s'obtiennent facilement au départ du sel d'addition d'acide correspondant par des méthodes traditionnelles ; par exemple, on obtient facilement la base libre à partir du sel d'addition d'acide acétique par lyophilisation répétée de ce dernier sel à partir d'une solution aqueuse. On obtient aisément le sel d'addition d'acide acétique à partir d'un autre sel d'addition d'acide par traitement avec la résine échangeuse d'ions appropriée de la manière décrite par la suite. On obtient les tripeptides sous la forme d'un sel d'addition d'acide, acceptable en pharmacie, soit directement au départ du procédé de l'invention, soit par réaction du tripeptide avec un ou plusieurs équivalents de l'acide approprié. Des exemples de sels non toxiques préférés sont les sels avec des acides organiques acceptables en pharmacie, par exemple les acides acétique, lactique, succinique, benzoïque, salicylique, méthanesulfonique, toluènesulfonique ou pamoïque, ainsi que des sels avec des acides polymères, comme l'acide tannique ou la carboxyméthylcellulose et des sels avec des acides minéraux, tels que les acides halhy-5 driques, par exemple l'acide chlorhydrique, ou tels que l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique. Il y a lieu de noter que les tripeptides de l'invention comportent un ou deux azotes basiques, donnant lieu à des sels d'addition avec un, jusqu'à éventuellement deux équivalents d'acide. Si on le désire, on convertit un sel io d'addition d'acide particulier en un autre sel d'addition d'acide, par exemple en un sel avec un acide non toxique, acceptable en pharmacie, par traitement avec la résine appropriée d'échange d'ions, de la manière décrite par R. A. Boissonas et consorts, «Helv. Chim. Acta», 43, 1349 (1960). Des résines échangeuses îs d'ions appropriées sont les résimes échangeuses de cations à base de cellulose, par exemple la carboxyméthylcellulose, ou des résines échangeuses de cations à base de dextrane réticulé, chimiquement modifié, par exemple les résines du type Sephadex C, et aussi des résines échangeuses d'anions fortement basiques, 20 notamment celles énumérées par J.P. Greestein et M. Winitz dans «Chemistry of the Amino Acids», John Wiley and Sons, Inc., New York et London, 1961, vol. 3, p. 1456.

Les dérivés tripeptides produits par le procédé de l'invention, ainsi que leurs sels correspondants, acceptables en pharmacie, 25 sont intéressants, car ils montrent les activités pharmacologiques sur le système nerveux central des animaux à sang chaud, que présente le tripeptide naturel H-L-propyl-L-leucylglycinamide, et au moins l'un des composés de l'invention montre des activités supérieures à celles du tripeptide naturel. A titre d'exemple, les 30 composés obtenus selon l'invention renforcent les effets du L-Dopa, lorsqu'on procède à un essai par la méthode de G. M. Eve-rett, «Proc. First Internat. Sympos. Antidepr. Drugs», Excerpta Medica Internat. Congr. Sériés N° 122, 164 (1966) en suivant la variante décrite par N.P. OlotnikofFet consorts, «Life Sciences», 35 vol. 10, part 1, p. 1279 (1971). Les dérivés tripeptides de formule (1) contrecarrent également la catalepsie provoquée par la fluphénazine chez le rat, celui-ci étant un type d'animal convenant particulièrement bien pour examiner des composés intéressants dans le soulagement de troubles du type de la maladie de Parkin-40 son, et ses dérivés inversent l'effet sédatif de la déserpidine. Les dérivés tripeptides obtenus selon l'invention ont une durée prolongée d'action et ils sont utiles pour le traitement ou le soulagement de troubles du système nerveux central d'animaux à sang chaud, en particulier dans le cas de dépressions mentales ou de la 45 maladie de Parkinson. Lorsqu'on utilise un tripeptide de formule (1) ou un sel de celui-ci pour un tel traitement ou un tel soulagement, on l'administre à l'organisme, de préférence par voie parentérale, en combinaison avec un véhicule liquide ou solide, acceptable en pharmacie. Les peptides de formule (1) n'ont qu'un so ordre inférieur de toxicité. La proportion du tripeptide ou de son sel est déterminée par sa solubilité dans le véhicule donné, par le véhicule donné lui-même, par la voie choisie d'administration, et par les pratiques biologiques traditionnelles. Pour une administration par voie parentérale à des animaux, on utilise le tripeptide ou 55 son sel en solution aqueuse stérile qui peut également contenir d'autres produits dissous, tels que des tampons ou des agents de conservation, ainsi qu'une quantité suffisante de glucose ou de sel acceptable en pharmacie pour rendre la solution isotonique. La dose variera avec la forme d'administration et avec l'espèce 60 particulière d'animal à traiter, cette dose étant de préférence maintenue à un niveau de l'ordre de 0,05 à 20 mg/kg de poids de corps. Toutefois, un taux de dosage de l'ordre d'environ 0,05 à environ 2 mg/kg de poids de corps est employé de la manière la plus avantageuse pour atteindre des résultats efficaces.

65 Pour l'administration par voie orale à des animaux, la dose du tripeptide ou d'un sel de celui-ci est de préférence maintenue à un niveau de 0,25 à 100 mg/kg de poids de corps, le composé étant combiné sous la forme d'une dose unitaire avec des véhicules

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acceptables en pharmacie. On peut administrer directement le tripeptide ou un sel de celui-ci à la surface intérieure de la bouche, par exemple suivant l'une des formes de dosage décrites dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 567788 du 14 avril 1975. s

On peut également administrer le tripeptide ou un sel de celui-ci suivant l'une des formes à longue durée d'action, à libération lente ou dites dépôt, que l'on décrit par la suite, et ce de préférence par injection intramusculaire ou par implantation. Ces formes de dosage sont conçues pour libérer environ 0,05 à environ io 2 mg/kg de poids de corps par jour.

Il est souvent désirable d'administrer un tripeptide de formule (1) de manière continue sur des périodes prolongées de temps sous des formes de dosage dépôt, à libération lente ou à longue durée d'action. De telles formes de dosage peuvent conte- 15 nir un sel acceptable en pharmacie du tripeptide, ayant un faible degré de solubilité dans les fluides du corps, par exemple l'un des sels décrits par la suite, ou bien ces formes de dosage peuvent contenir le tripeptide sous la forme d'un sel soluble dans l'eau, en même temps qu'un véhicule protecteur empêchant une libération 20 rapide. Dans ce dernier cas, par exemple, on peut combiner le tripeptide avec une gélatine partiellement hydrolysée, non antigène, sous forme d'un liquide visqueux; ou .bien, le tripeptide peut être absorbé sur un véhicule solide acceptable en pharmacie, par exemple de l'hydroxyde de zinc, et il peut être administré en 25 suspension dans un véhicule liquide acceptable en pharmacie; le tripeptide peut aussi être combiné dans des gels ou des suspensions avec un hydrocolloïde protecteur, non antigène, par exemple de la sodium carboxyméthylcellulose; de la polyvinylpyrrolidone, de l'alginate de sodium, de la gélatine, des acides polygalacturo- 30 niques, par exemple de la pectine, ou certains mucopolysaccha-rides, en même temps que des véhicules, des agents de conservation ou des agents tensio-actifs liquides, acceptables en pharmacie, aqueux ou non aqueux. Des exemples de formulations de ce genre peuvent se retrouver dans les textes pharmaceutiques clas- 35 siques, par exemple dans «Pharmaceutical Sciences de Reming-ton», 14e éd., Mack Publishing Co., Easton; Pennsylvanie, 1970. On peut également obtenir des préparations à longue durée d'action et à libération lente des tripeptides produits suivant le procédé de l'invention, par micro-encapsulation dans un enrobage 40 acceptable en pharmacie, par exemple de la gélatine, de l'alcool polyvinylique ou de l'éthyle cellulose. D'autres exemples de matières d'enrobage et de prodécés utilisés pour la micro-encapsu-lation sont décrits par J. A. Herbig dans « Encyclopedia of Chemical Technology», vol. 13, 2e éd., Wiley, New York, 1967, pp. 436- 45 456. Des formulations de ce genre, ainsi que des suspensions de sels du tripeptide, qui ne sont que faiblement solubles dans les fluides du corps, par exemple le sel avec de l'acide pamoïque, sont conçues pour libérer environ 0,05 à environ 2 mg du composé actif par kilo de poids de corps par jour, et on les administre de 50 préférence par injection intramusculaire. A titre de variante,

certaines des formes de dosage solides énumérées précédemment, par exemple certains sels faiblement solubles dans l'eau ou des dispersions dans des véhicules solides ou des produits adsorbtion sur de tels véhicules solides de sels de l'agent, par exemple des 55 dispersions dans un hydrogel neutre d'un polymère de méthacry-late d'éthylèneglycol ou de monomères similaires réticulés, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3551556,

peuvent également être présentées sous la forme de pastilles libérant à peu près les mêmes quantités que celles définies précé- «1 demment, ces pastilles pouvant être implantées de manière sous-cutanée ou intramusculaire.

Les dérivés tripeptides obtenus selon l'invention renforcent l'efficacité thérapeutique de médicaments utilisés pour le traitement de la maladie de Parkinson, par exemple le L-Dopa, la <>> procyclidine, la 1-hyoscyamine ou le chlorhydrate de trihexyphéni-dyle.

Il est particulièrement remarquable que le L-Dopa, en combinaison avec un dérivé tripeptide suivant l'invention, manifeste une amélioration plus grande dans la motilité et l'activité intellectuelle que le L-Dopa seul.

Lorsqu'on utilise les dérivés de formule (1) pour renforcer les effets du L-Dopa chez les êtres humains, le dérivé de formule (1) et le L-Dopa sont administrés à l'organisme, soit séparément, soit dans la même forme de dosage unitaire, une telle combinaison étant efficace par voie orale ou par voie parentérale. La dose journalière habituelle pour le dérivé va de 50 à 2000 mg et la dose journalière du L-Dopa va de 0,5 à 8,0 g.

Des compositions pharmaceutiques typiques, préparées de la manière décrite ci-dessus pour le dérivé tripeptide seul, comprennent une combinaison du dérivé tripeptide de formule (1) et du L-Dopa, sous une forme solide ou en solutions stériles, dans un rapport en poids de 1/4 à 1/160.

Différentes formes de mise en œuvre préférées du procédé suivant l'invention sont décrites ci-après.

Un premier groupe de matières de départ nécessaires à la synthèse complète, à savoir les énamines ou hydrazones de formule (3): R1N = CHR2, où R1 est un alcoyle inférieur ou NR4R5, où R4 et R5 représentent un alcoyle inférieur et R2 est de l'hydrogène ou un alcoyle inférieur, peuvent être préparées par condensation d'une amine substituée de manière appropriée, de formule R!NH2 ou d'une hydrazine de formule R4R5NNH2, dans laquelle R1, R4 et R5 ont la définition susdite, avec un aldéhyde de formule R2CHO, où R2 a la définition donnée.

Les aminés de formule R'NH2 ou les hydrazines de formule R4R5NNH2 sont ou bien connues"ou bien préparées par des procédés connus. De même, les aldéhydes de formule R2CHO sont connus et la plupart sont disponibles sur le marché.

La condensation de l'amine de formule R!NH2 ou de l'hydra-zine de formule R4R5NNH2 avec l'aldéhyde de formule R2CHO est de préférence menée dans un solvant inerte à une température élevée, à la température de reflux ou au voisinage de la température de reflux du mélange. On peut employer ou bien un solvant hydrocarburé anhydre, non miscible à l'eau, par exemple du benzène ou du toluène, avec séparation physique simultanée de l'eau au fur et à mesure qu'elle est formée, par exemple grâce à un séparateur d'eau Dean-Stark, ou bien un solvant formé par un solvant formé par un alcanol inférieur, par exemple de l'éthanol, du propanol ou de l'isopropanol. Ensuite, l'évaporation du solvant et la purification du reste, par exemple par distillation ou cristallisation, donnent l'énamine ou hydrazone correspondante de formule (3). A titre de variante, on peut préparer l'énamine ou l'hydrazone désirée in situ au cours de la réaction essentielle, comme on le verra par la suite.

Le second groupe de matières de départ, à savoir les acides amino-protégés de formule R6-L-Pro-OH, dans laquelle R6 a la définition donnée précédemment, est connu. A titre d'exemple, la t-butoxycarbonyl-L-proline (Boc-L-Pro-OH) et la benzyloxycar-bonyl-L-proline (Z-L-Pro-OH) ont été décrites par G.R. Anderson et A.C. McGregor, «J. Amer. Chem. Soc.», 79, 6180 (1957) et par W. Grassmannand, E. Wünsch, «Chem. Ber.», 91, 462 (1958), respectivement.

Le troisième groupe de matières de départ à savoir les isoni-triles de formule CNCH2COR7, dans laquelle R7 est un alcoxy inférieur de 1 à 3 atomes de carbone, est ou bien connu, comme dans le cas de l'isocyanoacétate d'éthyle décrit par R. Appel et consorts, « Angew. Chem.», Int. ed., 10, 132 (1972), ou bien comprend des matières aisément préparées par des procédés connus.

Ensuite, l'énamine ou l'hydrazone précitée de formule (3), ou bien l'énamine ou hydrazone désirée, préparée in situ au départ de l'amine ou hydrazine et de l'aldéhyde, est condensée avec l'acide de formule R6-L-Pro-OH et l'isonitrile de formule CNCH2COR7 pour donner l'intermédiaire correspondant de la formule

R«-L-Pro-N(Ri)-CH(R2)-CO-Gly-R7(2),

dans laquelle R1, R2, R6 et R7 ont la définition donnée ci-dessus.

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Bien qu'il ne s'agisse pas d'une condition critique, il est préférable d'utiliser des quantités approximativement équimolaires des matières de départ nécessaires pour cette condensation. La condensation est réalisée de la manière la plus commode dans un solvant inerte, par exemple dans un hydrocarbure halogéné, notamment du chlorure de méthylène, du chloroforme ou du tétrachlorure de carbone, ou bien dans des éthers ou des éthers cycliques, comme le dioxanne, l'éther diéthylique et le tétrahydro-furanne, ou encore dans des alcools aliphatiques inférieurs, notamment le méthanol, l'éthanol et le propanol. Toutefois, lorsque les matières de départ sont mutuellement solubles ou lorsque leur mélange devient liquide au cours de la condensation, le solvant peut être omis sans effets nuisibles quelconques.

La température et la durée de la condensation ne sont pas non plus critiques. La réaction peut être menée à des températures allant de —20 à 100°C; toutefois, une gamme de 10 à 40°C est la plus commode. La durée de réaction peut être modifiée et dépend de la réactivité des diverses matières de départ; toutefois, on utilise généralement des durées de réaction de 15 minutes à plusieurs jours, avec une préférence pour une durée de 6 h/j.

Ensuite, l'intermédiaire de formule (2), dans laquelle R1, R2 et R7 ont la définition donnée ci-dessus, peut être isolé et purifié suivant des procédés classiques. A titre d'exemple, on extrait le produit avec un solyant non miscible à l'eau et, si nécessaire, on purifie par Chromatographie et cristallisation.

Il sera évident pour les spécialistes eh ce domaine que le reste d'aminoacide représenté dans la formule (2) par

-N(Ri)CH(R2)CO-,

tel- qu'obtenu au cours de cette réaction, doit être racémique, et ce reste est par conséquent désigné dans la présente description en utilisant le préfixe DL, sauf lorsque R2 est de l'hydrogène et que le reste d'aminoacide susdit représente le reste de glycine. En outre, il est évident que l'intermédiaire de formule (2) existe sous la forme de deux isomères géométriques qui peuvent être séparés, par exemple par Chromatographie sur gel de silice. Pour la commodité, ces deux isomères sont désignés arbitrairement par isomères A et B. Ensuite, l'un ou l'autre des isomères séparés ou leurs mélanges sont transformés en les dérivés peptides correspondants de formule (1) de la manière décrite ci-après.

Selon l'invention, on soumet l'intermédiaire susdit de formule (2) à une amidation pour obtenir l'amide intermédiaire de formule (2), dans laquelle R1, R2, R6 ont la définition donnée précédemment et R7 représente NH2. Des conditions préférées pour cette amidation sont un traitement de l'intermédiaire avec une solution essentiellement saturée d'ammoniac dans un solvant inerte, par exemple du méthanol, de l'éthanol ou du tétrahydrofu-ranne, à 0-20° C pendant 6 h à 4 j. Si on le désire, l'amide correspondant ainsi obtenu peut être séparé en deux isomères à ce stade. Cette séparation est réalisée de façon commode par Chromatographie sur gel de silice.

On traite ensuite l'amide susdit avec un agent de suppression de protection pour obtenir le dérivé tripeptide correspondant de formule (1), dans laquelle R1 est un alcoyle inférieur ou désigne NR4R5, où R4 et R5 représentent chacun un alcoyle inférieur, R2 est de l'hydrogène ou un alcoyle inférieur, R3 représente un radical amino et Y est le reste d'aminoacide Gly. Le. dérivé tripeptide de formule (1) dans laquelle R1 représente NR4R5, où R4 et R5 représentent chacun un alcoyle inférieur, R2 est de l'hydrogène ou un alcoyle inférieur, R3 est le radical amino et Y est le reste d'aminoacide Gly, a déjà été décrit dans la demande de brevet EUA N" 330352 du 7 février 1973, appartenant à la demanderesse.

La réaction précédente de suppression de la protection,

lorsque R6 représente le benzyloxycarbonyle (Z), est réalisée de façon commode en soumettant l'amide à hydrogénation en présence d'un catalyseur de métal noble. Des catalyseurs de métaux nobles préférés pour réaliser l'hydrogénation susdite et d'autres hydrogénations encore dans le cadre du procédé de l'invention

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sont les catalyseurs de palladium et de platine, par exemple du palladium à 5% sur charbon ou du platine à 5% sur charbon, l'hydrogénation elle-même étant réalisée dans un solvant inerte, par exemple de l'acide acétique, du méthanol, de l'acétate 5 d'éthyle, etc. Dans le présent cas, l'hydrogénation est de préférence réalisée avec du palladium à 5% sur charbon dans du méthanol, de sorte que l'on obtient le produit d'hydrogénation, à savoir le tripeptide correspondant de formule (1), sous la forme d' la base libre par séparation du catalyseur à partir du mélange de 10 réaction et évaporation du solvant. La réaction de suppression de la protection, lorsque R6 représente le t-butoxycarbonyle, est réalisée de façon commode en soumettant l'amide à des conditions modérément acides pour obtenir le composé correspondant débarrassé de sa protection. Dans la mise en œuvre de la réaction 15 précédente de suppression de protection, il est commode de dissoudre l'amide dans un excès d'acide trifluoroacétique ou dans un solvant organique inerte, par exemple de l'acétate d'éthyle ou du tétrahydrofuranne essentiellement saturé d'acide chlorhydriqut anhydre. A la fin de la réaction, une évaporation donne directe-20 ment le dérivé tripeptide débarrassé de sa protection, mentionné ci-dessus, de-formule (1), sous la forme du sel d'addition d'acide de l'acide correspondant. On peut convertir ce dernier sel d'addition d'acide en son dérivé tripeptide correspondant de formule (1 sous la forme de la base libre, par des moyens classiques. 25 Le dérivé tripeptide de formule (1), dans laquelle R1 représente NR4R5, où R4 et R5 représentent chacun un alcoyle inférieur; R2 représente CH2CH(CH3)2; R3 représente NH(CH2)4NH2 et Y est le reste d'aminoacide Gly, se prépare par traitement de l'intermédiaire de formule (2), dans laquelle Ri ' 30 représente NR4R5, où R4 et R5 sont chacun un alcoyle inférieur e R2 représente CH2CH(CH3)2, R6 est un groupe protecteur d'amino et R7 est un alcoxy inférieur, avec un agent hydrolysant pour obtenir l'acide correspondant de l'intermédiaire de formule (2), dans laquelle R1, R2 et R6 ont la définition donnée et R 35 est le radical hydroxyle. Pour une hydrolyse basique, une méthode préférée consiste à soumettre l'ester d'alcoyle inférieur à l'action d'une base forte, par exemple de l'hydroxyde de sodium ou de potassium, en présence d'une quantité suffisante d'eau pour réaliser l'hydrolyse de l'ester. L'hydrolyse est menée en utilisant 40 un solvant appropriée, par exemple du méthanol ou de l'éthanol. Le mélange de réaction est maintenu à une température de 0 à 50° C, de préférence de 20 à 30° C, jusqu'à ce qu'une hydrolyse se développe. Il suffit habituellement de 10 à 30 h pour cette hydrolyse. Le mélange de réaction est alors rendu acide avec un acide, 45 par exemple de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique, etc., e extrait avec un solvant organique essentiellement non miscible à l'eau, de préférence du chloroforme. Le solvant organique est évaporé pour obtenir l'acide correspondant susdit.

L'acide correspondant ci-dessus est traité avec un réactif pour 50 le transformer en un composé correspondant comportant un carboxyle activé et condensé avec du mono(t-butoxycarbonyl)-1,4-diaminobutane. Une méthode préférée pour la mise en œuvre de cette réaction consiste à faire réagir l'acide correspondant avec une quantité approximativement équimolaire de N,N'-carbonyl-55 diimidazole dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide, à une température d'environ — 20 à — 10°C, sur une période d'environ 20 à 50 mn. Le composé comportant un carboxyle activé est traité avec une solution d'une quantité essentiellement équimolaire de chlorhydrate de mono(t-butoxycarbo-60 nyl)-l,4-diaminobutane, décrit par R. Geiger, « Annalen», 750, 165 (1971), et d'une base organiqûe, de préférence de la triéthyla-mine, dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide. On agite le mélange à environ 20-30° C pendant environ 15 à 30 h et on provoque l'évapóration. Le reste est repris 65 dans un solvant essentiellement non miscible à l'eau, de préférence de l'acétate d'éthyle, puis lavé et évaporé. On soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant des mélanges d'hydrocarbures halogénés, d'alcanols inférieurs et de bases

7

621 li;

organiques, de préférence un mélange de chloroforme/métha-nol/pyridine, pour assurer l'élution en vue d'obtenir les deux isomères A et B de l'intermédiaire amino-protégé de formule (2) :

Z-L-Pro-N(NR4R5)CH[CH2CH(CH3)2]CO-Gly-

NH(CH2)4-BH-Boc,

dans laquelle R4 et R5 ont la définition donnée.

Ensuite, les groupes protecteurs Z et Boc sont séparés du composé mentionné en dernier lieu pour obtenir le dérivé tripeptide:

H-L-Pro-N(NR4R5)CH[CH2CH(CH3)2]

CO-Gly-NH(CH2)4NH2,

c'est-à-dire le composé de formule (1), dans laquelle R1 représente NR4R5, où R4 et R5 représentent chacun un alcoyle inférieur, R2 représente CH2CH(CH3)2, R3 représente NH(CH2)4NH2 et Y est le reste d'aminoacide Gly.

Les deux groupes protecteurs d'amino Z et Boc peuvent être séparés simultanément, par exemple en utilisant un acide fort, c'est-à-dire de l'acide bromhydrique dans de l'acide acétique ou de l'acide fluorhydrique, ou bien la suppression de la protection est réalisée de manière graduelle. L'intermédiaire amino-protégé ci-dessus est soumis à hydrogénation de la manière décrite précédemment en présence d'un catalyseur de métal noble dans un solvant inerte, de préférence en présence de palladium à 5% sur charbon dans de l'acide acétique; pour séparer le groupe protecteur d'amino, à savoir le benzyloxycarbonyle (Z). Lé mélange est alors filtré et refroidi jusqu'à environ 0-10° C, puis traité avec un acide modérément fort pour séparer le groupe protecteur d'amino restant, à savoir le t-butoxycarbonyle (Boc). Un exemple d'un tel acide est l'acide chlorhydrique. L'acide anhydre est ou bien ajouté directement au filtrat susdit, ou bien on ajoute une solution de l'acide dans un solvant organique inerte, par exemple de l'acétate d'éthyle, du tétrahydrofuranne, etc. On agite le mélange à environ 0-25° C pendant environ 1 à 3 h, puis on évapore. On soumet le reste à Chromatographie sur une colonne d'un absorbant de dextrane réticulé (Sephadex LH-20), en utilisant du méthanol comme éluant, pour obtenir le dérivé tripeptide susdit de formule (1) sous la forme du sel d'addition d'acide chlorhydrique. La base libre de ce dérivé tripeptide de formule (1) s'obtient par des méthodes traditionnelles, par exemple par conversion en l'acétate, suivie par une lyophilisation.

Une autre possibilité pour préparer le composé (2) consiste en la préparation des dérivés tripeptides par l'addition graduelle des aminoacides.

L'intermédiaire décrit ci-dessus : Boc-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-Gly-OEt, c'est-à-dire le composé de formule (2), dans laquelle R1 représente CH3, R2 représente CH2CH(CH3)2 et R7 représente OEt, est également préparé facilement par l'addition graduelle d'aminoacides.

Suivant une forme de mise en œuvre préférée de cette variante de préparation de l'intermédiaire mentionné en dernier lieu de formule (2), la matière de départ, à savoir la benzyloxycarbonyl-L-(N-méthyl)leucine, décrite par J.R. Coggins et N.L. Benoiton, «Can. J. Chem.», 49,1968 (1971), est convertie en son ester 2,4,5-trichlorophénylique activé par traitement de cette matière de départ avec essentiellement un équivalent molaire de 2,4,5-trichlo-rophénol dans un solvant organique inerte, de préférence du chlorure de méthylène ou du tétrahydrofuranne, en présence de 1,1 à 1,5 équivalent molaire de dicyclohexylcarbodiimide à une température de —20 à 0°C, sur une période d'environ 45 à 75 mn, et ensuite de 20 à 30° C sur une période de 1 à 3 h. L'ester activé, c'est-à-dire l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de Z-L-(N-Me)-Leu-OH, est alors combiné avec une quantité pratiquement équimolaire de chlorhydrate d'ester éthylique de glycine en présence d'une base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine,

dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylfor-mamide, à une température de 0 à 30° C sur une période de 10 à 24 h, pour obtenir le dipeptide de la formule Z-L-(N-Me)-Leu-Gly-OEt. Ensuite, le groupe protecteur d'amino, à savoir Z, du composé mentionné ci-dessus est séparé, de préférence en dissolvant le composé dans de l'acide acétique contenant environ trois équivalents molaires d'acide bromhydrique et en agitant à 20-30° C pendant 4 à 5 h pour obtenir le dipeptide de formule H-L-5 (N-Me)-Leu-Gly-OEt sous la forme de son sel d'addition d'acide bromhydrique. Ce dernier dipeptide est combiné avec l'ester 1-benzotriazolylique de Boc-L-Pro-OH, que l'on prépare en combinant du Boc-Pro-OH avec un à deux équivalents molaires du 1-hydroxybenzotriazole et 1,1 à 1,5 équivalent molaire du dicyclo-10 hexylcarbodiimide dans un solvant organique inerte, de préférence du tétrahydrofuranne, à une température d'environ —5 à 0°C. On agite le mélange à une température d'environ — 5 à 0°C pendant environ 1 h, et ensuite à 20-30° C pendant 1 h supplémentaire. Cette solution contenant l'ester l-benzotriazolylique de Boc-15 L-Pro-OH est alors combinée à une température d'environ —5 à 5°C avec une solution contenant une quantité pratiquement équimolaire du dipeptide précédent H-L-(N-Me)-Leu-Gly-OEt, sous la forme de son sel d'addition d'acide bromhydrique, et une base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine, dans un 20 solvant organique inerte, de préférence du tétrahydrofuranne. On agite le mélange pendant environ 30 mn à une température d'environ —5 à 5° C, et ensuite à une température d'environ 20 à 30° C sur une période d'environ 30 à 50 h, pour obtenir le Boc-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-Gly-OEt, c'est-à-dire l'intermédiaire de formule (2), 25 dans laquelle Ri représente CH3, R2 représente CH2CH(CH3)2, et R7 représente OEt. Ce dernier intermédiaire de formule (2) est identique sous tous les rapports à l'isomère B de l'intermédiaire de formule (2) obtenu comme décrit précédemment.

Le dérivé tripeptide de formule (1), dans laquelle R1 repré-30 sente CH3, R2 représente CH2CH(CH3)2, R3 représente NH2 et Y est le reste d'aminoacide D-Ala, se prépare aisément par condensation d'un ester activé de benzyloxycarbonyl-L-(N-méthyl)leu-cine, de préférence l'ester 1-benzotriazolylique, avec de l'ester méthylique de D-alanine pour obtenir le dipeptide de formule Z-35 L-(N-Me)-Leu-A-Ala-OMe. Le groupe protecteur d'amino (Z) de ce dernier composé est séparé, et on procède ensuite à une condensation avec un ester activé de benzyloxycarbonyl-L-pro-line, de préférence l'ester p-nitrophénylique, pour obtenir le tripeptide de formule Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe (2). 40 On soumet ce dernier composé à l'action de l'ammoniac dans un solvant organique inerte pour obtenir l'amide de tripeptide de formule Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-NH2. Le groupe protecteur d'amino (Z) de ce dernier composé est alors séparé pour obtenir le dérivé tripeptide correspondant de formule (1): 45 Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-NH2.

Dans une formule de réalisation préférée de la préparation de ce dérivé tripeptide de formule (1), des quantités pratiquement équimolaires de Z-L-(N-Me)-Leu-OH, décrit par J. R. Coggins, supra, et de H-D-Ala-OMe dans un solvant organique inerte, de 50 préférence du diméthylformamide, sont combinées à environ 0-10°C avec 0,2-1,0 équivalent molaire de 1-hydroxybenzotriazole et une quantité essentiellement équimolaire d'une base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine. On ajoute lentement une solution de quantités essentiellement équimolaires de dicyclo-55 hexylcarbodiimide dans un solvant de l'addition, on agite le mélange à environ 0-10°C pendant environ 1 h, et à 20-30'C pendant encore 1 h. Après une purification traditionnelle, on obtient le dipeptide de formule Z-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe.

Ensuite, on sépare le groupe protecteur d'amino (Z) de ce 60 dernier dipeptide, de préférence par hydrogénation en présence d'un catalyseur de métal noble, de préférence du palladium à 5% sur charbon, dans un solvant inerte, de préférence de l'acide acétique contenant une quantité pratiquement équimolaire d'un acide minéral, de préférence de l'acide chlorhydrique. La sépara-65 tion du catalyseur et l'évaporation du solvant donnent le dipeptide de formule H-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe sous la forme de son sel d'addition d'acide chlorhydrique. On condense ce dernier composé avec un ester activé de Z-L-Pro-OH. Une méthode

621 111

8

pratique et commode pour cette condensation comprend la combinaison de quantités essentiellement équimolaires de ce dernier sel d'addition d'acide de dipeptide, de 1-hydroxybenzotria-zole, d'ester p-nitrophénylique de benzyloxycarbonyl-L-proline et de N-éthylmorpholine dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide, à une température d'environ 0 à 10°C. On agite le mélange à 0-10°C pendant environ 2 à 4 j. Après évaporation du solvant, .on dissout le reste dans un solvant organique essentiellement non miscible à l'eau, de préférence de l'acétate d'éthyle, puis on lave, on dessèche et on évapore. On purifie le reste, de préférence par Chromatographie sur gel de silice, pour obtenir le tripeptide de la formule Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe.

On soumet ce dernier composé à une amidation. Les conditions préférées sont un traitement du composé en question avec une solution essentiellement saturée d'ammoniac dans un solvant organique inerte, par exemple du méthanol ou de l'éthanol, à une température de 0 à 10° C pendant 2 à 4 j. On évapore le solvant et on cristallise le reste pour obtenir le tripeptide de formule Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-NH2.

Le groupe protecteur d'amino (Z) de ce dernier composé est séparé, de préférence par hydrogénation en présence d'un catalyseur de métal noble en présence d'acide chlorhydrique de la façon décrite ci-dessus, pour obtenir le dérivé tripeptide:

H-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-NH2,

c'est-à-dire le composé de formule (1), dans laquelle R1 représente CHj, R2 représente CH2CH(CH3)2, R3 représente NH2 et Y est le reste d'aminoacide D-Ala, sous la forme du sel d'addition d'acide chlorhydrique. Le sel d'addition d'aeide acétique de ce dernier dérivé tripeptide de formule (1) s'obtient de préférence en soumettant le sel d'addition d'acide chlorhydrique susdit à une Chromatographie d'échange d'ions sur une colonne d'un absorbant de carboxyméthylcellulose (Whatmann CM-23), en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium comme éluant. Si on le désire, on soumet le sel d'addition d'acide acétique de ce dernier dérivé tripeptide de formule (1) à une lyophilisation répétée au départ d'eau, pour obtenir le dérivé tripeptide de formule (1) sous la forme de la base libre.

Le dérivé tripeptide de formule (1) dans laquelle R1 représente l'hydrogène, R2 représente CH2CH(CH3)2, R3 représente NH(CH2)4NH2 et Y représente le reste d'aminoacide Gly se prépare aisément en soumettant le composé de formule Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OEt à une hydrolyse pour obtenir l'acide correspondant de formule Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH. On transforme ce dernier acide en un ester activé, et on condense ce dernier avec du mono(t-butoxycarbonyl)-l,4-diaminobutane pour obtenir le compose de formule (2) :

Z-L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH-Boc.

Les groupes protecteurs d'amino de ce dernier composé sont séparés pour obtenir le dérivé tripeptide correspondant de formule (1), dans laquelle Ri représente l'hydrogène, R2 représente CH2CH(CH3)2, R3 représente NH(CH2)4NH2 et Y est le reste d'aminoacide Gly.

Suivant une forme de mise en œuvre préférée de la préparation de ce dernier dérivé tripeptide de formule (1), la matière de départ, à savoir le tripeptide de formule Z-L-Pro-L-Leu-GIy-OEt, décrit par W.D. Cash, «J. Org. Chem.», 26, 2136 (1961), est traité avec un agent hydrolysant pour obtenir l'acide correspondant de formule Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH. Pour une hydrolyse basique, une méthode préférée consiste à soumettre l'ester de tripeptide à l'action d'une base forte, par exemple de l'hydroxyde de sodium ou de potassium, en présence d'une quantité suffisante d'eau pour provoquer l'hydrolyse de l'ester. L'hydrolyse est réalisée en utilisant un solvant approprié, par exemple du méthanol ou de l'éthanol. On maintient le mélange de réaction à une température d'environ 10 à 30" C pendant 15 à 30 mn. Le mélange de réaction est ensuite rendu acide avec un acide, par exemple de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique, etc. On récolte le précipité et on cristallise pour obtenir l'acide correspondant de formule Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH.

On traite l'acide précédent avec un réactif pour le transformer en l'ester activé correspondant, avec ensuite condensation de l'ester activé avec une aminoalkyl inférieur amine monoprotégée. Cette réaction est réalisée en faisant réagir l'acide correspondant avec 1,1 à 1,5 équivalent molaire de dicyclohexylcarbodiimide et 1,1 à 2,1 équivalents molaires de 1-hydroxybenzotriazole, cette réaction étant suivie par l'addition d'équivalents à peu près équimolaires de chlorhydrate de mono(t-butoxycarbonyl)-l,4-diaminobutane et d'une base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine, dans un solvant organique inerte, par exemple de l'acétate d'éthyle, du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne, à une température d'environ 0 à 30° C et sur une période de réaction de 3 à 10 h. Le précipité est séparé, le filtrat est évaporé et le reste est dissous dans de l'acétate d'éthyle. La solution est lavée, séchée, évaporée, et le reste est purifié de préférence par Chromatographie sur gel de silice, pour obtenir l'intermédiaire de formule (2):

Z-L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH-Boc.

Les groupes protecteurs d'amino Z et Boc sont séparés de ce dernier composé pour obtenir le dérivé tripeptide

H-L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH2,

c'est-à-dire le composé de formule (1), dans laquelle Ri représente H, R2 représente CH2CH(CH3)2, R3 représente NH(CH2)4NH2, et Y est le reste d'aminoacide Gly. Les deux groupes protecteurs d'amino peuvent être séparés simultanément, par exemple en utilisant un acide fort, c'est-à-dire de l'acide bromhydrique dans de l'acide acétique ou de l'acide fluorhydrique, ou bien de préférence les groupes protecteurs d'amino peuvent être séparés de manière graduelle, de la façon suivante: on soumet le tripeptide amino-protégé susdit à une hydrogénation, de la façon décrite précédemment, en présence d'un catalyseur de métal noble dans un solvant inerte, de préférence du palladium à 5% sur charbon dans de l'acide acétique, afin de séparer le groupe protecteur d'amino, à savoir le benzyloxycarbonyle (Z). On filtre le mélange et on refroidit le filtrat à environ 0-10°C, puis on traite avec un acide modérément fort pour séparer le groupe protecteur d'amino restant, à savoir le t-butoxycarbonyle (Boc). Un exemple d'un tel acide est l'acide chlorhydrique anhydre que l'on ajoute directement au filtrat refroidi ci-dessus, ou bien on ajoute une solution de l'acide dans un solvant organique inerte, par exemple de l'acétate d'éthyle ou du tétrahydrofuranne. On agite le mélange à environ 0-30° C pendant environ 1 à 4 h, et on évapore pour obtenir le dérivé de tripeptide de formule (1), à savoir le

H-L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH2,

sous la forme du sel d'addition d'acide chlorhydrique. Le sel d'addition d'acide acétique de ce dernier dérivé tripeptide de formule (1) s'obtient en soumettant le sel d'addition d'acide chlorhydrique à une Chromatographie d'échange d'ions, de préférence sur une résine échangeuse d'anions (Baker CGA-540) sous la forme acétate. Si on le désire, on soumet le sel d'addition d'acide acétique susdit du dernier dérivé tripeptide mentionné de formule (1), à une lyophilisation répétée à partir d'eau pour obtenir le dérivé tripeptide de formule (1) sous la forme de la base libre.

Finalement, il sera évident pour les spécialistes en ce domaine que d'autres groupes protecteurs d'amino ou de carboxyle,

d'autres procédés de combinaison des fragments de peptides et d'autres méthodes de séparation des groupes protecteurs pourront être utilisés tout en restant dans le cadre du présent brevet.

Les exemples suivants illustreront plus complètement encore l'invention.

Exemple 1 :

A. Ester éthylique de benzyloxycarbonyl-L-propyl-DL-(N-diméth\'l-

amino)leucylglycine [Z-Pro-N[N(CH3)i~\CH[CH2CH{CH3)2]_

CO-Gly-OEt)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

621 111

a) On ajoute de la benzyloxycarbonyl-L-proIine (12,45 g;

50 mmol) dans du chlorure de méthylène sec (50 ml) à une solution à 0°C d'isovaléraldéhyde N,N-diméthylhydrazone (7,05 g; 55 mmol) et d'isocyanoacétate d'éthyle (6,21 g; 55 mmol) dans du chlorure de méthylène sec (50 ml). On agite le mélange à la température ambiante pendant 4 j, on lave avec une solution à 5% de bicarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium, on sèche, on filtre et on évapore le filtrat. On soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant du chloroforme/ méthanol (98/2) comme éluant. L'évaporation du solvant donne le composé cité en rubrique.

b) De la même manière mais en remplaçant la benzyloxy-carbonyl-L-proline par la t-butoxycarbonyl-L-proline et en remplaçant Pisovaléraldéhyde N,N-diméthylhydrazone par le méthyl-amino-N-isopentylidène, on obtient les deux isomères A et B d'ester éthylique de t-butoxycarbonyl-L-propyl-DL-(N-méthyl)leucylgly-cine (Boc-L-Pro-N(CH3)CH[CH2CH(CH3)2]CO-Gly-OEt); isomère A: [a]o5 = +31,8° (c=l, diméthylformamide), RMN (CDC13): 5 1,0 (m, 6H), 1,3 (t, J=7Hz, 3H), 1,4 (s, 9H), 3,1 (s, 3H), 4,2 (q, J = 7Hz). Isomère B : [a]o5 = — 76,7" (c = 1, diméthylformamide), spectromètre de masse (m/e): 427 (M+).

c) De la même manière mais en remplaçant la benzyloxy-carbonyl-L-proline par la t-butoxycarbonyl-L-proline et en remplaçant Pisovaléraldéhyde N,N-diméthylhydrazone par un mélange de formaldéhyde et d'isobutylamine, on obtient l'ester éthylique de t-butoxycarbonyl-L-propyl-(N-isobutyl)glycylglycine (Boc-L-Pro-N[CH2CH(CH3)2]CH2CO-Gly-OEt); RMN (CDC13)

5 0,9 (6H), 1,25 (3H), 1,40 (9H), 2,0 (5H), 3-5 (11H), 7,8 (1H).

d) De la même manière mais en remplaçant l'isovalér-aldéhyde N,N-diméthylhydrazone par un mélange de 1,1-diéthyl-hydrazine et d'acétaldéhyde, on obtient l'ester éthylique de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diéthylamino)alanylglycine

{Z-L-Pro-N[N(C2H5)2]CH(CH3)CO-Gly-OEti,

e) De la même manière mais en remplaçant l'isovaléraldéhyde N,N-diméthylhydrazone par un mélange de l,l-di-(n-propyl)-hydrazine et d'isobutyraldéhyde, on obtient l'ester éthylique de benzyloxycarbonyl-L-propyl-DL-[N-di-(n-propyl)amino]-valylglycine (Z-L-Pro-N[N(CH,CH2CH3)2]-CH[CH(CH3)2]-CO-Gly-OEt}.

f) De la même manière mais en remplaçant l'isovaléraldéhyde N,N-diméthylhydrazone par un mélange d'éthylamine et d'isobutyraldéhyde, on obtient l'ester éthylique de benzyloxy-carbonyl-L-prolyl-DL-(N-éthyl)valylglycine (Z-L-Pro-N-(C2H5)CH[CH(CH3)2]CO-Gly-OEt}.

B. Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucyl-glycinamide{Z-Pro-N[N(CH3)2]CH[CH2CH(CH3)2~]-

CO-Gly-NH.

a) L'intermédiaire, ester éthylique de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucylglycine (8,33 g; 17 mmol), décrit dans la partie A. a), est dissous à 0° C dans une solution saturée d'ammoniac anhydre dans du méthanol sec (150 ml), et on laisse au repos à 0° C pendant 3 j. On évapore le mélange sous pression réduite et on soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant du chloroforme/méthanol (95/5) comme éluant. Les deux isomères, A et B, du composé en rubrique sont élues séparément.

Isomère A: RMN (CDC13) 5 0,97 (d, J=6Hz), 2,28 (s, 6H), 5,00 (s, 2H), 7,29 (s, 5H).

Isomère B: RMN (CDC13) 5 0,95 (t, J=6Hz, 6H), 2,25 (s, 6H), 5,10 (s, 2H), 7,29 (s, 5H).

b) De la même manière mais en remplaçant l'ester éthylique de benzyloxycarbonyl-L-propyl-DL-(N-diméthylamino)leucyl-glycine par une quantité équivalente de l'isomère A d'ester éthylique de t-butoxycarbonyl-L-propyl-DL-(N-méthyl)leucyIglycine (décrit dans la partie A. b), on obtient l'isomère A de t-butoxy-carbonyl-L-propyl-DL-(N-méthyl)leucylglycinamide {Boc-L-Pro-N(CH3)CH[CH2CH(CH3)2]CO-Gly-NH2j, P.F. de

130-132° C, [a]o5= +50,2° (c=2, diméthylformamide).

De la même manière mais en remplaçant l'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucyl-glycine par une quantité équivalente de l'isomère B d'ester éthylique de t-butoxycarbonyl-L-propyl-DL-(N-méthyl)leucylglycine s (décrit dans la partie A.b), on obtient l'isomère B de t-butoxy-carbonyl-L-prolyl-DL-(N-méthyl)leucyIglycinamide ( Boc-L-Pro-N(CH3)CH[CH2CH(CH3)2]-Gly-NH2J, spectromètre de masse (m/e): 398 (M+).

c) De la même manière mais en remplaçant l'ester éthylique de 10 benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucyl-glycine avec une quantité équivalente d'ester éthylique de t-butoxy-carbonyl-L-prolyl-(N-isobutyl)glycy]glycine (décrit dans la partie A.c), on obtient le t-butoxycarbonyl-L-prolyl-(N-isobutyl)-glycylglycinamide [Boc-L-Pro-N[CH2CH(CH3)2]CH2CO-Gly-15 NH2; : P.F.: 92-95°C, RMN (CDC13) 5 0,9 et 1,03 (doublets, J = 2, 5Hz,6H), 1,4 (s, 9H).

C. Chlorhydrate de L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucyl-glycinamide (1); R' = N(CH3)2, R2 = CH2CH(CH3)2, R3 = NH2, r= Gly ; H-L-Pm-N[N(CH3)2]CH[CH2CH-(CH3)2]CO-Gly-NH2-HCl a) Un mélange de benzyloxycarbonyl-L-proIyI-DL-(N-diméthylamino)leucylglycinamide [1,595 g; 3,46 mmol, isomère A, décrit dans la partie B.a) et d'un catalyseur de palladium à 5% sur

25 charbon (0,207 g) dans du méthanol est agité sous une atmosphère d'hydrogène pendant 17 h, le récipient d'hydrogénation étant relié à un ballon contenant une solution agitée d'hydroxyde de sodium (4N, 100 ml). On sépare le catalyseur par filtration. On ajoute de l'acide chlorhydrique méthariolique (0,94N, 3,7 ml, 3,47 mmol) au 30 filtrat et on évapore ce dernier sous pression réduite. On décolore le reste avec du charbon actif dans du méthanol anhydre, on filtre, et on évapore le filtrat sous pression réduite. On triture le reste avec de l'éther diéthylique, de l'acétate d'éthyle et de l'éther diéthylique, et on sèche sous pression réduite sur du pentoxyde de phosphore pour 35 obtenir l'isomère A du composê'cité en rubrique: [a]" = —43,9° (c=2, diméthylformamide), RMN (DMSO-ds) 5 0,9 (d, J=5Hz, 6H), 2,57 (s, 6 H).

De la même manière mais en remplaçant l'isomère A par une quantité équivalente de l'isomère correspondant B de benzyloxy-40 carbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucylglycinamide [décrit dans la partie B.a)], on obtient l'isomère correspondant B du composé cité en rubrique : [oc]" = — 33° (c=2, diméthylformamide).

b) On ajoute goutte à goutte une solution d'acide chlorhydrique anhydre dans de l'acétate d'éthyle sec (1,5N, 55 ml, 82,5 mmol) sur

45 une période de 40 mn à une suspension refroidie par bain de glace de l'isomère A de t-butoxycarbonyl-L-prolyl-(N-méthyI)leucyIglycin-amide [6,56 g, 16,5 mmol, décrit dans la partie B.b)]. On agite le mélange à la température du bain de glace pendant 30 mn et à la température ambiante pendant 17 h. On décante le solvant, on triture la so matière solide avec de l'acétate d'éthyle sec et on décante le solvant. On dissout le reste dans du méthanol anhydre, on filtre la solution et on évapore le filtrat sous pression réduite. On tri ture le reste avec de l'acétate d'éthyle/éther de pétrole (1/1), de l'éther diéthylique/éther de pétrole (1/1) et de l'éther diéthylique. On sèche le reste sous pres-55 sion réduite sur du pentoxyde de phosphore et de l'hydroxyde de potassium pour obtenir l'isomère A du chlorhydrate de L-prolyl-DL-(N-méthyl)leucylglycinamide (1); R1 =CH3, R2=CH2CH-(CH3)2, R3=NH2, Y=Gly; [H-L-Pro-N(CH3)CH[CH2CH-(CH3)2]-CO-Gly-NH2J, spectromètre de masse (m/e): 298 (M+). «o De la même manière mais en remplaçant l'isomère A de t-butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-méthyl)leucylglycinamide par une quantité équivalente de l'isomère B de t-butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-méthyl)leucylglycinamide [décrit dans la partie B.b)], on obtient l'isomère B du chlorhydrate de L-prolyl-DL-65 (N-méthyl)leucylglycinamide (I); R1 =CH3, R2=CH2CH(CH3)2, R3 = NH2, Y=Gly; H-L-Pro-N(CH3)CH[CH2CH(CH3)2]CO-Gly-NH2] ; spectromètre de masse: (m/e): 298 (M+).

c) De la manière décrite dans la partie C. b) mais en rem

621 111

10

plaçant l'isomère A de t-butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-méthyl)-leucylglycinamide par une quantité équivalente de t-butoxy-carbonyl-L-prolyl-(N-isobutyl)glycylglycinamine, on obtient le chlorhydrate de L-prolyl-(N-isobutyl)glycylgIycinamide (1); R1 =CH2CH(CH3)2, R2=H, Y=GIy, R3=NH2; {H-L-Pro-N-[CH2CH(CH3)2]CH2CO-Gly-NH2] ; spectromètre de masse: (m/e): 284 (M+).

Exemple 2:

Dichlorhydrate de L-prolyl-DL-(N-diméthylaminó)leucylglycine-4-amino-n-butylamide (1); R1 =N(CH3)2, R2 = CH2CH(CH3)2, R3 = NH(CH2)4NH2. Y=Gly; [H-L-Pro-N\N{CH3)2~\CH[CH2-CH(CH3)2]CO-Gly-NH{CH2)4NH2 ■ 2HCI]

a) Une solution d'ester éthylique de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucylglycine [4,45 g, 9,07 mmol, décrit dans la partie A.a)] et d'hydroxyde de sodium IN (12,25 ml) dans 23 ml de méthanol est agitée à la température ambiante pendant 20 h. On ajoute une solution saturée de chlorure de sodium (50 ml) et on sépare le précipité par fîltration. On refroidit le filtrat à 0°C et on l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique IN (13,3 ml). On extrait le mélange au chloroforme. On lave l'extrait organique à l'eau jusqu'à neutralité, on sèche sur sulfate de magnésium et on évapore sous pression réduite pour obtenir la benzyloxycarbonylr L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)Ieucylglycine; RMN (CDC13) 8 0,93 (6H), 2,53 (6H), 8,6 (1H).

b) On ajoute du N,N'-carbonyldiimidazole (1,19 g, 7,5 mmol) à une solution agitée à —15° C de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylàmino)leucylglycine [3,477 g, 7,5 mmol, décrit dans l'exemple 2 a)] dans du diméthylformamide sec (14 ml) en entretenant une atmosphère sèche. On agite le mélange à —15° C pendant 30 mn. On ajoute une solution de chlorhydrate de mono-(t-butoxycarbonyl)-l,4-diaminobutane [1,685 g, 7,5 mmol, préparé comme décrit par R. Geiger, Annalen, 750, 165 (1971)] et de tri-éthylamine (1,26 ml) dans du diméthylformamide sec (6 ml). On agite le mélange à la température ambiante pendant 20 h et on évapore. On reprend le reste dans 200 ml d'acétate d'éthyle et on lave avec une solution à 10% de bicarbonate de sodium, une solution à 20% de chlorure de sodium, une solution à 10% d'acide citrique et une solution à 20% de chlorure de sodium. On sèche la phase organique sur sulfate de magnésium et on évapore. On soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant du chloroforme/ méthanol/pyridine (95/5/1) pour éluer séparément les deux isomères A et B de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)-leucylglycine-4-t-butoxycarbonylamino-n-butylamide:'''

Isomère A: RMN (CDC13) S 0,99 (d, J=6Hz, 6H), 1,42 (s, 9H), 2,65 (6H), 5 (s, 2H), 7,25 (5H).

Isomère B: RMN (CDC13) 8 0,95 (t, J=6Hz, 6H), 1,43 (s, 9H), 5,10 (s, 2H), 7,30 (s, 5H).

c) Un mélange d'isomère A de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucylglycine-4-t-butoxycarbonylamino-n-butylamide [2,26 g, 3,58 mmol, décrit dans l'exemple 2 b)] et d'un catalyseur à 5% de palladium sur charbon (0,250 g) dans 50 ml d'acide acétique est agité sous une atmosphère d'hydrogène pendant 21 h, le récipient d'hydrogénation étant relié à un ballon contenant une solution agitée d'hydroxyde de sodium (4N, 100 ml). On sépare le catalyseur par fîltration, on refroidit le filtrat dans de l'eau glacée et on ajoute goutte à goutte une solution d'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle sec (1,6 N, 12 ml). On agite le mélange à la température ambiante pendant 2 h en excluant l'humidité. On évapore le solvant sous pression réduite et on sépare les traces d'acide acétique par évaporation azéotropique avec du benzène sec. On soumet le reste à Chromatographie sur une colonne d'absorbant de dextrane réticulé (Sephadex LH-20)en utilisant du méthanol. On décolore l'éluant avec du charbon actif, on filtre et on évapore. On triture le reste avec de l'éther diéthylique anhydre et on sèche sous pression réduite sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir l'isomère A du composé cité en rubrique: [a]"= —43,6° (c=2, diméthylformamide).

Analyse pour Ci9H3aN603-2 HCl:

Calculé: C 47,70 H 8,52 N 17,60 Cl 14,86

Trouvé: C 47,10 H 8,55 N 17,55 Cl 15,24.

5 De la même manière mais en remplaçant l'isomère A de benzyi oxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucylglycine-4-t-butoxycarbonylamino-n-butylamide par l'isomère correspondant B [décrit dans l'exemple2b)], on obtient l'isomère B correspon dant du composé cité en rubrique : [a]n5 = — 18,6° (c=2, diméthyl-]0 formamide).

Analyse pour Ci9H38N603-2 HCIH20:

Calculé: C 46,62 H 8,64 N 17,20 Trouvé: C 46,88 H 8,50 N 17,51.

|5 d) De la même manière mais en remplaçant l'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucyl-glycine par une quantité équivalente d'ester éthylique de benzyl-oxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diéthylamino)alanylglycine [décrit dans la partie A.d)] et en remplaçant le mono-(t-butoxy-20 carbonyl)-l,4-diaminobutane HCl par une quantité équivalente de diéthylamine, on obtient le L-prolyl-DL-(N-diéthylamino)-alanylglycine diéthylamide chlorhydrate (1); [R1 =N(CH2CH3)2, R2=CH3, R3=N(CH2CH3)2j Y=Gly].

e) De la même manière mais en remplaçant l'ester éthylique de 25 benzyloxycarborryl-L-prolyl-DL-(N-diméthylamino)leucyI-glycine par une quantité équivalente d'ester éthylique de benzyl-oxycarbonyl-L-prolyl-DL-[N-di-(n-propyl)amino]valyl-glycine [décrit dans la partie A.e)] et en remplaçant le mono-(t-butoxycarbonyl)-l,4-diaminobutane HCl par une quantité équi-30 valente de n-propylamine, on obtient le chlorhydrate de L-prolyl-DL-[N-di-(n-propyl)amino]valylglycine n-propylamide (1); R1 =N(CH2CH2CH3)2, R2=CH(CH3)2, R3=NH(CH2CH2-CH3), Y=Gly; [H-L-Pro-N[N(CH2CH2CH3)2]CH(CH3)2]CO-Gly-NH(CH2CH2CH3)}.

35 f) De la même manière mais en remplaçant l'ester éthylique de benzyloxycarbonyl-L-propyI-DL-(N-diméthylamino)leucyl-glycine par une quantité équivalente d'ester éthylique de benzyl-oxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-éthyl)valylglycine [décrit dans la partie A.f)] et en remplaçant le mono-(t-butoxycarbonyl)-l,4-di-40 aminobutane HCl par une quantité équivalente de méthylamine, on obtient 1e L-prolyl-DL-(N-éthyl)valylglycine méthylamide HCl (1); R1 =CH2CH3, R2=CH(CH3)2, R>=NHCH3,'Y=Gly; {H-L-Pro-N(CH2CH3)CH[CH(CH3)2]CO-Gly-NHCH3}.

45 Variante de synthèse de l'ester éthylique de t-butoxycarbonyl-L-prolyl-L-(N-méthyl)Ieucylglycine {Boc-L-Pro-N(CH3)CH[CH2-CH(CH^^CO-Gly-OEt} [isomère B, précédemment décrit dans la partie A.b)~]

Une solution de Z-L-(N-Me)-Leu-OH [4,2 g, 15 mmol, préparé 50 comme décrit par J.R. Coggins et N. Leo Benoiton, « Can. J. Chem.», 49, 1968 (1971), de 2,4,5-trichlorophénol (2,96 g, 15 mmol) et de dicyclohexylcarbodiimide (3,09 g, 15 mmol) dans du chlorure de méthylène sec (21 ml) est agitée à — 15° C pendant 1 h et ensuite à la température ambiante pendant 2 h. On sépare le précipité par 55 fîltration et on évapore le filtrat pour obtenir le Z-L-(N-Me)-Leu-OTcp.

On ajoute une solution de Z-L-(N-Me)-Leu-OTcp (15 mmol, décrit ci-dessus) dans du diméthalformamide (10,5 ml) à une solution à 0°C de chlorhydrate d'ester éthylique de glycine (2,09 g, 15 mmol) 60 et de N-éthylmorpholine (1,92 ml, 15 mmol) dans 35 ml de diméthylformamide, et on agite le mélange à 0°C pendant 30 mn, puis à la température ambiante pendant 20 h. On sépare le solvant par évaporation et on soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant du chloroforme/acétate d'éthyle (85/15) comme éluant. 65 L'évaporation des éluats donne le Z-L-(N-Me)-Leu-Gly-OEt, RMN (CDC13) 5 0,93 (6H), 1,27 (3H), 2,85 (3H), 3,97 (2H), 4,20 (2H), 5,17 (2H), 7,34 (5H).

On ajoute une solution d'acide bromhydrique dans de l'acide

1!

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acétique (30-32%, 4,9 ml, 24 mmol) à une solution de Z-L-(N-Me)-Leu-Gly-OEt (2,9 g, 7,96 mmol, décrit ci-dessus) dans de l'acide acétique (4,7 ml) et on agite le mélange résultant à la température ambiante pendant 4 Yi h. On sépare le solvant par évaporation sous pression réduite et on soumet le reste à une distillation azéotro-pique répétée avec du benzène-méthanol. Le reste est séché sous pression réduite sur de l'hydroxyde de potassium pour obtenir le [H-L-(N-Me)-Leu-Gly-OEt]HBr.

On agite une solution de Boc-L-Pro-OH (0,645 g, 3 mmol), de 1-hydroxybenzotriazole (0,810 g, 6 mmol) et de dicyclohexyl-carbodiimide (0,680 g, 3,3 mol) dans du tétrahydrofuranne sec (15 ml) à — 5°C pendant 1 h et ensuite à 25° C pendant 1 h. On refroidit le mélange à 0° C et on le traite avec une solution à 0° C de [H-L-(N-Me)-Leu-GIy-OEt]HBr (3 mmol, décrit ci-dessus) et de N-éthylmorpholine (0,384 ml, 3 mmol) dans du tétrahydrofuranne sec (14 ml). On agite le mélange à 0°C pendant 30 mn et ensuite à la température ambiante pendant 40 h. On sépare le précipité par fîltration et on évapore le filtrat sous pression réduite. On dissout le reste dans 100 ml d'acétate d'éthyle. On lave la solution avec de l'acide citrique IN refroidi à la glace, puis avec de l'eau, une solution à 5% de bicarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. On sèche la phase organique sur sulphate de magnésium et on évapore. On soumet le reste à une Chromatographie sur gel de silice en utilisant du chloroforme/acétate d'éthyle/pyridine (50/50/10) comme éluant pour obtenir le composé cité en rubrique, à savoir l'ester éthylique de t-butoxycarbonyl-L-prolyl-L-(N-méthyl)leucylglycine; [ct]o5 = —73,1° (c= 1, diméthylformamide). Le composé en rubrique obtenu par le procédé précédent est identique à l'isomère B de l'ester éthylique de t-butoxy-carbonyl-L-prolyl-DL-(N-méthyl)leucylglycine, obtenu par le procédé décrit dans la partie A.b).

Exemple 3 :

L-Prolyl-L-(N-méthyl)leucyl-D-olaninamide [H-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-NHi] (1); [JR1 =CH3, R2 = CH 2CH(CH3)2, R3=NH2, Y= D-Ala]

On dissout de la benzyloxycarbonyl-L-(N-méthyl)leucine (14,0 g, 50 mmol), de l'ester méthylique de D-alanine (7,0 g, 50 mol) et du 1-hydroxybenzotriazole (13,5 g, 10 mmol) dans un mélange de tétrahydrofuranne sec (300 ml) et de diméthylformamide (70 ml). On refroidit la solution à 0°C et on ajoute de la N-éthylmorpholine (6,42 ml, 50 mmol), puis on ajoute goutte à goutte une solution de dicyclohexylcarbodiimide (10,3 g; 50 mmol) dans du tétrahydrofuranne sec (80 ml). On agite le mélange de réaction à 0° C pendant 1 h, à la température ambiante pendant une autre heure, puis on filtre et on sépare les solvants sous pression réduite. On reprend le reste dans de l'acétate d'éthyle et on extrait à l'eau et avec une solution saturée de chlorure de sodium. Le reste abandonné après séchage ét évaporation des couches d'acétate d'éthyle est soumis à Chromatographie sur gel de silice (1 kg; CHC13 conte-nent 2% de MeOH). L'évaporation des éluants donne le Z-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe; RMN: (CDC13) 5 2,86 (3H, s), 3,74 (3H, s), 5,25 (2H, s), 7,42 (5H, s).

On agite sous une atmosphère d'hydrogène pendant 24 h, un mélange d'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-(N-méthyl)-leucyl-D-alanine (10,5 g, 28,8 g, décrit ci-dessus) et d'un catalyseur à 5% de palladium sur charbon (1,0 g) dans de l'acide acétique (120 ml) et de l'acide chlorhydrique (2N, 14,4 ml, 28,8 mmol). On sépare le catalyseur par fîltration et on évapore le filtrat pour obtenir un reste de H-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe-HCl. On agite à 0°C pendant 3 j une solution de ce dernier composé (28,8 mmol), de 1-hydroxybenzotriazole (3,9 g, 28,8 mmol), d'ester p-nitrophény-lique de benzyloxycarbonyl-L-proline (10,7 g, 28,8 mmol) et de N-éthylmorpholine (3,7 ml, 28,8 mmol) dans 70 ml de diméthylformamide. Après évaporation des solvants sous pression réduite on dissout le reste dans de l'acétate d'éthyle et on lave à l'eau, avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, à l'eau et ensuite avec une solution saturée de chlorure de sodium. On dessèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et on évapore. On soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant du chloroforme/méthanol (98/2). On évapore les éluants pour obtenir l'ester méthylique de benzyloxycarbonyl-L-propyl-L-(N-méthyl)-s leucyl-D-alanine [Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-OMe];

RMN (CDCI3) : 5 0,95 (d, 6H), 2,87 et 3,0 (deux s, 3H), 3,72 (s, 3H), 7,4 (s, 5H). On dissout ce dernier composé (1,7 g, 3,68 mmol) à 0°C dans du méthanol saturé d'ammoniac (85 ml) et on laisse au repos à 0°C pendant 3 j. On sépare le solvant par évaporation et on cristallise le 10 reste dans de l'éther isopropylique-acétone pour obtenir le benzyl-oxycarbonyl-L-prolyl-L-(N-méthyl)Ieucyl-D-alaninamide [Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-D-Ala-NH2]; P.F.: 148-150°C.

Analyse pour C23H34N4O5:

|5 Calculé: C 61,86 H 7,67 N12,55

Trouvé: C 61,67 H 7,82 N12,66.

Un mélange de Z-L-Pro-L-{N-Me)-Leu-D-Ala-NH2 (1,29 g, 2,9 mmol, décrit ci-dessus) et d'un catalyseur à 5% de palladium sur charbon (0,13 g) dans 20 ml d'acide acétique et de l'acide 20 chlorhydrique (IN, 2,9 ml) est agité sous une atmosphère d'hydrogène pendant 20 h. On sépare le catalyseur par fîltration et on lyophilise le filtrat pour obtenir le composé cité en rubrique sous forme du sel d'addition d'acide chlorhydrique. On soumet le reste à une Chromatographie à échange d'ions sur une colonne de carboxy-25 méthylcellulose (Whatmann CM-23), en utilisant de l'acétate d'ammonium aqueux 0,04N. On lyophilise l'éluant pour obtenir le composé cité en rubrique sous forme du sel d'addition d'acide acétique, [a]" = —77,6° (c = 1, 1% d'acide acétique).

Une lyophilisation répétée de ce dernier composé à partir d'eau 30 donne le composé en rubrique sous forme de la base libre, RMN (CDCI3) 5 0,90 (s, 6H), 1,22 (d, J = 7Hz, 3H), 1,45-2,16 (m, H), 2,82 et 2,90 (singlets, 3H), 3,9-5,2 (m, 3H).

De la même manière, en utilisant de la benzyloxycarbonyl-D-(N-méthyl)leucine comme matière de départ, au lieu du L-énantio-35 mère décrit ci-dessus, on obtient le L-prolyl-D-(N-méthyl)-leucyl-D-alaninamide [H-Pro-D-fN-MeJ-Leu-D-AIa-NHî],

analyse des aminoacides: Pro: 0,88; Ala: 1,00.

Exemple 4 :

40 L-Prolyl-L-leucylglycine-4-amino-n-butvlamide (1); [R'=H, R2 = CH2CH(CH3)2, R3 = NH{CH2)4NH2, Y=Gly] [H-L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH2]

On ajoute goutte à goutte de l'hydroxyde de sodium IN (3,02 ml) à une suspension agitée à 0°C d'ester éthylique de 45 benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-leucylglycine [1,0 g, 2,24 mmol, préparé comme décrit par W.O. Cash, «J. Org. Chem.», 26,2136 (1961)] dans du méthanol (5,6 ml) et on agite la solution à 25° C pendant 20 mn. On dilue la solution avec une solution saturée de chlorure de sodium (23 ml), on refroidit à 0°C et on acidifie avec de 50 l'acide chlorhydrique IN (3,3 ml). On agite le mélange à 0° C pendant 20 mn. On récolte la matière solide, on lave à l'eau froide, on dessèche sous pression réduite sur du pentoxyde de phosphore et on cristallise dans du méthanol/eau pour obtenir le Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH; P.F.: 163-165°C, [a]ß5 = -55,8° (c=2, diméthyl-55 formamide).

Un mélange de ce dernier composé (9,48 g, 22,6 mmol), de chlorhydrate de mono-(t-butoxycarbonyl)-l,4-diaminobutane (5,06 g, 22,6 mmol), de N-éthylmorpholine (28,9 ml), de 1-hydroxybenzotriazole (6,1 g, 45 mmol) et de dicyclohexylcarbodiimide 60 (4,98 g, 24,85 mmol) dans du diméthylformamide (225 ml) est soumis à agitation à 0°C pendant 1 h et ensuite à 25° C pendant 4 h. On sépare le précipité par fîltration et on évapore le solvant. On dissout le reste dans de l'acétate d'éthyle, on sépare le précipité, et on lave le filtrat avec une solution aqueuse à 10% de bicarbonate de sodium, 65 puis avec de l'eau, une solution à 10% d'acide citrique et de l'eau.

On dessèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et on évapore le solvant. On soumet le reste à Chromatographie sui gel de silice en utilisant du chloroforme/méthanol/pyridine (98/2/1

621 108

12

à titre d'éluant, puis on évapore l'éluant pour obtenir le Z-L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH2)4NH-Boc, RMN (CDC13): 5 0,92 (6H), 1,42 (9H), 5,16 (2H), 7,36 (5H).

Un mélange de ce dernier composé (7,4 g, 12,55 mmol) et d'un catalyseur à 5% de palladium sur charbon (0,505 g) dans 50 ml 5 d'acide acétique est soumis à agitation sous une atmosphère d'azote pendant 5 h, le récipient d'hydrogénation étant relié à un ballon contenant une solution agitée d'hydroxyde de sodium (4N, 250 ml). On filtre le mélange et on refroidit le filtrat dans un bain de glace. On ajoute goutte à goutte une solution d'acide chlorhydrique 10 dans de l'acétate d'éthyle sec (4,6N, 16 ml) et on agite le mélange à 10° C pendant 30 mn, puis à la température ambiante pendant 3 h. On évapore le solvant et on dissout le reste dans du benzène, puis on évapore à nouveau le solvant. On dissout le reste dans du méthanol, on ajoute du charbon activé, on filtre et on évapore le r5 solvant du filtrat pour obtenir le composé cité en rubrique sous forme du sel d'addition d'acide chlorhydrique. On dissout ce dernier composé dans de l'acide chlorhydrique 0,1N et on soumet à Chromatographie à échange d'ions sur une résine échangeuse d'anions (Baker CGA-540) sous la forme acétate. On évapore les 10 éluants, on triture le reste avec de l'éther diéthylique et de l'éther de pétrole et on sèche pour obtenir le composé cité en rubrique sous forme du sel d'addition d'acide acétique.

Analyse pour C x 7 H3 3 N503 ■ 2CH3CO2 H ■ '/2H20 (4.84,6): Calculé: C 52,04 H 8,73 N 14,45 CH3C02H 24,78 Trouvé: C 52,13 H 8,70 N 14,35 CH3C02H23,2.

Procédé

R6-L-Pro-OH+R1N=CHR2 (3) +CNCH2COR7

i

R6-L-Pro-N(R1)CH(R2)CO-Gly-R7 (2, R7=alcoxy inférieur) i hydrolyse

R6-L-Pro-N(R1)CH(R2)CO-Gly-R7 (2, R7 = OH)

25

J. amidation

R6-L-Pro-N(R1)CH(R2)CO-Gly-R7 (2, R7 =amino, etc., comme I suppression de protection défini)

H-L-Pro-N(R1)CH(R2)CO-Gly-R3 (1)

ou

Z-L-(N-Me)-Leu-0H+H-Y-0 (alcoyle inférieur)-» Z-L-(N-Me)-Leu-Y-O (alcoyle inférieur)

1) suppression de protection

(1) amidation

->Z-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-Y-0 (alcoyle inférieur)-*

(2) suppression de protection

2) Z-L-Pro-ONp

H-L-Pro-L-(N-Me)-Leu-Y-NH2 (1, Y=Gly ou D-Ala)

Dans ces schémas, les deux dernières étapes constituent le procédé de l'invention

R

Claims (5)

621 111

1. Procédé de préparation de nouveaux tripeptides de formule H—(L—Pro)— N—CH— C—Y—R3 (1)

I ! Il R1 R2 O

dans laquelle:

R1 représente de l'hydrogène, un radical alcoyl inférieur ou un groupement de formule — N(R4)(R5) dans lequel R4 et R5 sont chacun un radical alcoyl inférieur;

R2 est de l'hydrogène ou un radical alcoyl inférieur;

R3 représente un radical amino, (alcoyl inférieur) amino, di(alcoyl inférieur) amino ou amino (alcoyl inférieur) amino, et

Y est Gly ou D-Ala,

R3 n'étant pas — NH2 lorsque R1 représente un reste —N(R4)(RS), et R3 est un radical amino (alcoyl inférieur) amino lorsque R1 = H et Y=Gly,

et de leurs sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables,

.caractérisé en ce qu'on soumet un composé de formule

R6—(L —Pro)— N—CH— C—Y—R7 (2)

I I II R1 R2 O

• dans laquelle R1, R2 et Y ont la signification donnée, R6 est un groupe protecteur du groupe amino, et R"7 est un radical hydroxy ou alcoxy inférieur, à une amidation avec de l'ammoniac ou une amine de formule R3—H dont un groupe amino peut être protégé lorsqu'il s'agit d'une amino(alcoyl inférieur) amine, on enlève le ou les groupes protecteurs du composé obtenu et, si désiré, on transforme le composé obtenu en un de ses sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptable.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prépare un sel d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptable du composé obtenu.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on dédouble un racémate obtenu pour préparer l'isomère A et B du L-prolyl-DL-(N-méthyl)leucylglycinamide.

4. Procédé selon la revendication 1 pour la préparation des isomères A et B de L-prolyI-DL-(N-diméthylamino)leucyIgly-cine-4-mino-n-butylamide.

5. Procédé selon la revendication 1 pour la préparation du L-propyl-(N-isobutyl)glycylglycinamide, du L-prolyl-L-(N-méthyl)leucyl-D-alaninamide, du L-prolyl-D-(N-méthyl)leucyI-D-alaninamide, ou du L-prolyl-L-leucyIglycine-4-amino-n-butyl-amide.