CH634041A5

CH634041A5 - Derives de la pepstatine, leur preparation et composition les contenant.

Info

Publication number: CH634041A5
Application number: CH829178A
Authority: CH
Inventors: Bertrand Castro; Joel Menard; Genevieve Evin; Pierre Corvol
Original assignee: Anvar
Priority date: 1977-08-04
Filing date: 1978-08-03
Publication date: 1983-01-14
Also published as: US4185096A; IT1107964B; GB2003481B; GB2003481A; FR2399409B1; JPS5448710A; BE869261A; FR2399409A1; IT7850591A0; NL7808140A; DE2834001A1

Description

La présente invention concerne de nouveaux dérivés de la pepstatine de formule générale:

(CH3)2CHCH2CO - (NH CHCO)2 - NHCHCH(OH) CH2CONHCH - CONHCHCH(OH)CH2 - CO - (X)a(Y)b(Z)c

Il II

CH(CH3)2 CH2CH(CH3)2 CH3 CH2CH(CH3)2

3

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ou un tripeptide en présence d'un agent de condensation, ou bien après avoir transformé, à l'aide d'un réactif classique convenable, tel que le chloroformiate d'isopropyle, la fonction carboxylique de la pepstatine en un anhydride mixte carbonique/carboxylique. Comme agent de condensation, on utilise plus particulièrement le dicyclo-hexylcarbodiimide, l'hexafluorophosphate de benzotriazolyloxytris-diméthylaminophosphonium [B. Castro et al., «Tetrahedron Letters», 1219 (1975)] ou le réactif de Bâtes [A. J. Bâtes et al., «Helv. Chim. Acta», 58,633 (1975)]. Généralement, la réaction s'effectue dans un solvant organique tel que le dimêthylformamide ou le diméthylsulfoxyde, à une température voisine de 20° C.

Il est particulièrement avantageux de protéger les fonctions qui ne participent pas à la réaction par des groupements bloquants, facilement éliminables une fois la réaction de condensation terminée.

Les sels des produits de formule générale (I) peuvent être obtenus 5 en agitant une suspension aqueuse d'un dérivé de la pepstatine de formule générale (I) avec la base solubilisante convenable en quantité stœchiométrique à une température comprise entre 20 et 40° C jusqu'à dissolution complète, puis en isolant le sel par toute méthode connue de séparation, et plus particulièrement par lyophilisation, io La pepstatine utilisée comme produit de départ est l'acide isovaléryl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-méthylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-méthylheptanoïque de formule ci-après:

(CH3)2CHCH2CO - (NH - CH - CO)2 - NH - CHCH(OH) CH2 - CONHCH - CONHCHCH(OH)CH2 - COOH

CH(CH3)2

I

CH2CH(CH3)2

ch3

CH2CH(CH3)2

Elle peut être préparée selon le procédé décrit dans la demande de brevet français N° 70.21557.

Ce procédé consiste à cultiver une souche de Streptomyces producteur de pepstatine, telle que Streptomyces testaceus, Streptomyces argenteolus var. toyokensis et Streptomyces caespitosus par exemple, dans un milieu nutritif dans des conditions aérobies, jusqu'à ce qu'une activité importante d'inhibition de la pepsine soit conférée audit milieu de culture, et à récupérer ladite pepstatine dudit milieu de culture.

Les nouveaux dérivés selon la présente invention ont une solubilité dans l'eau nettement supérieure à celle de la pepstatine. Alors que la pepstatine est pratiquement insoluble dans l'eau, les produits de formule générale (I) ont généralement une solubilité supérieure à 0,4%, c'est-à-dire au moins 40 fois plus forte que celle de la pepstatine. On a en effet constaté que la solubilisation complète de la pepstatine dans l'eau est obtenue jusqu'à la concentration de 146 Par contre, la solubilité de l'ester méthylique de la pepstatine/arginine dans l'eau est 30 fois plus élevée, tandis que celle du sel d'arginine de la pepstatine est 50 fois plus élevée que celle de la pepstatine.

Les nouveaux dérivés selon l'invention présentent la propriété d'inhiber l'action de la rénine. La rénine est une enzyme protéolyti-que produite et sécrétée par le rein, qui agit sur Fangiotensinogène du plasma pour fournir un décapeptide (angiotensine I) inactif qui, à son tour, est transformé en un octapeptide (angiotensine II) qui agit sur l'organisme en provoquant une augmentation de la pression artérielle.

In vitro, l'activité inhibitrice des nouveaux produits selon l'invention peut être mise en évidence par action soit sur la rénine de porc sur un substrat synthétique constitué par un tétradécapeptide N-acéty lé ( Asp-Arg-V al-T y r-Ile-His-Pro-Phé-His-Leu-Leu-V al-T y r-Ser) en dosant le tétrapeptide libéré (Leu-Val-Tyr-Ser) par fluorimé-trie à la fluorescamine, soit sur la rénine de porc sur un substrat naturel constitué d'angiotensinogène de rat, selon la technique de J. Ménard et K. J. Catt, «Endocrinology », 90,422,1972.

Dans ces deux systèmes, la concentration molaire inhibitrice des produits de l'invention (CI50) qui diminue de 50% l'activité de la rénine est généralement comprise entre 1 • 10 -16 et 1 • 10 - ■8.

In vivo, chez le rat binéphrectomisé anesthésié, auquel on injecte 50 m UG/kg de rénine de porc purifiée, les produits selon l'invention produisent une inactivation de la rénine plasmatique et une diminution de la tension artérielle à des doses comprises entre 50 et 300 (ig/ kg par voie intraveineuse.

De plus, les nouveaux produits selon l'invention ont une faible toxicité. Chez les souris, la dose létale 50% (DL50) est généralement supérieure à 800 mg/kg par voie intrapéritonéale.

Dans ce qui suit, les produits seront désignés par le nom pepstatine suivi du nom de l'aminoacide, du dipeptide ou tripeptide auquel la pepstatine est liée.

Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique.

Exemple 1:

A 69 mg de pepstatine et 70 mg de dichlorhydrate de l'ester méthylique de l'arginine, on ajoute 5 cm3 de dimêthylformamide. On 20 ajoute ensuite 88 mg d'hexafluorophosphate benzotriazolyloxytris-diméthylaminophosphonium (dénommé ci-après BOP) et 50 mg de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 72 h à une température voisine de 20° C. On ajoute alors 15 cm3 d'eau, puis 20 cm3 d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. Après 25 refroidissement à une température voisine de 0° C, le précipité gélatineux est essoré, lavé à l'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20° C. Le résidu sec est dissous dans 50 cm3 de méthanol. La solution est filtrée et le filtrat est concentré à sec. On obtient ainsi 69 mg de l'ester méthylique de la pepstatine/arginine 30 dont les caractéristiques sont les suivantes:

— pont de fusion (banc Köfler) = 262-263° C

— pouvoir rotatoire: [a]f}= —40,1° (c=0,18; méthanol)

— analyse (aminoacides) après hydrolyse par l'acide chlorhydri-que 6N pendant 24 h à 110° C:

35 arginine: 0,95 alanine: 1 valine: 2,10

— spectre infrarouge: bande ester caractéristique à 1740 cm-1 40 Exemple 2:

Dans un mélange de 4 cm3 de dimêthylformamide et de 4 cm3 de diméthylsulfoxyde, on ajoute 100 mg de pepstatine et 100 mg de trifiuoroacétate d'ester benzylique de la nitronine. On ajoute 90 mg de BOP et 40 mg de triéthylamine. On agite le mélange réactionnel 45 pendant 6 d. On ajoute 15 cm3 d'eau, puis 20 cm3 d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium. Après refroidissement à une température voisine de 0° C, le produit est essoré, puis dissous dans un mélange eau/acide chlorhydrique/acide acétique (19/1/80 en volume). La solution est soumise à une hydrogénation à pression 50 ordinaire en présence de palladium sur charbon pendant 24 h. La solution est filtrée sur célite. Le filtrat est concentré à sec et le résidu est repris par 50 cm3 d'isopropanol. Après filtration du résidu insoluble, le filtrat est évaporé à sec et le produit obtenu est séché. On obtient ainsi 60 mg de pepstatine/arginine dont les caractéristiques 55 sont les suivantes:

— point de fusion (banc Köpfler) : supérieur à 250" C (décomposition)

60 alanine: 1 valine: 1,96 arginine: 1

Exemple 3:

65 Dans 8 cm3 d'un mélange de dimêthylformamide et de diméthylsulfoxyde (3/1 en volume), on ajoute 130 mg de pepstatine et 120 mg de chlorhydrate de diester tertiobutylique de l'acide glutamique. On ajoute ensuite 180 mg de BOP et 45 mg de triéthylamine. Après 72 h

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d'agitation, on ajoute 15 cm3 d'eau distillée. Le précipité est essoré et lavé avec 15 cm3 d'éther êthylique. Le produit est redissous dans 30 cm3 de méthanol. Le résidu insoluble est séparé par filtration et le filtrat est évaporé. On ajoute alors 10 cm3 d'un mélange de chlorure de méthylène/acide trifluoroacétique (1/1 en volume), puis on laisse pendant 30 min à une température voisine de 20° C. Le mélange est concentré presque jusqu'à siccité. On ajoute alors de l'éther. Le précipité formé est séparé par filtration et lavé à l'éther. Après séchage, on obtient 130 mg de pepstatine/acide glutamique dont les caractéristiques sont les suivantes:

— point de fusion (banc Köfler) : 230" C

— pouvoir rotatoire: [a] d'= —79,0e (c=0,55; méthanol)

— analyse (aminoacides) après hydrolyse par l'acide chlorhydri-que 6N pendant 24 h à 110e C:

alanine: 1

valine: 1,97

acide glutamique: 0,99

Exemple 4:

En opérant comme à l'exemple 3, mais à partir de 137 g de pepstatine, 98 mg de chlorhydrate de diester tertiobutylique de l'acide aspartique, 177 mg de BOP et 68 mg de triéthylamine dans 8 cm3 de dimêthylformamide, on obtient 109 mg de pepstatine/acide aspartique dont les caractéristiques sont les suivantes:

— point de fusion (banc Köpfler) : 238-240° C

— pouvoir rotatoire: [apD5= —67,6" (c=0,51 ; méthanol)

acide aspartique: 0,92 alanine: 1,12 valine: 2

La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent un dérivé de la pepstatine de formule générale (I) ou un de ses sels en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. De préférence, les compositions de l'invention sont administrées par voie parentérale et plus particulièrement par voie intraveineuse.

Comme compositions administrables par voie parentérale peuvent être plus spécialement utilisées des solutions stériles des produits de formule générale (I) dans l'eau ou dans du soluté physiologique isotonique. Il est possible également d'utiliser des solutions, des suspensions ou des émulsions des produits de formule générale (I) dans des solvants ou véhicules convenables, pharmaceutiquement acceptables. Dans ce cas, on peut employer le propylèneglycol, le polyéthylèneglycol, les huiles végétales (telles que l'huile d'olive) ou les esters organiques injectables (tels que l'oléate d'éthyle). On peut ajouter à la composition des agents mouillants, émulsifiants ou dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants ou par irradiation. Les compositions selon l'invention peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'utilisation dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.

Les compositions selon l'invention sont particulièrement utiles pour apprécier la responsabilité du système rénine/angiotensine dans l'élévation tensionnelle de malades hypertendus. Le traitement thérapeutique dépend essentiellement d'une telle analyse. Une dose unique comprise entre 1 et 30 mg/kg pourra être administrée par voie intraveineuse. L'inhibition de la rénine plasmatique qu'elle entraîne cause une chute tensionnelle si un excès de rénine est la cause de l'hypertension. Sur la base de cette donnée, un traitement bloquant le système rénine/angiotensine sera choisi. Les nouvelles compositions selon l'invention sont particulièrement utiles dans le traitement urgent de certaines causes hypertensives liées à une sécrétion excessive de rénine. En traitement aigu, les doses sont généralement comprises entre 1 et 30 mg/kg pour un adulte et peuvent être administrées en simple injection ou en perfusion. Les compositions selon l'invention peuvent aussi être utilisées à des doses plus faibles en traitement chronique.

D'une manière générale, le médecin déterminera le traitement et la posologie qu'il juge la plus appropriée en fonction du degré d'hypertension, de l'âge, du poids et de tous les facteurs propres au sujet à traiter.

L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon l'invention.

Exemple

On dissout 500 mg du produit selon l'exemple 2 (pepstatine/ arginine) dans 100 cm3 de soluté injectable. La solution est stérilisée par filtration sur filtre bactériologique et est répartie aseptiquement en ampoules à raison de 10 cm3 par ampoule. Les ampoules sont scellées et elles contiennent 50 mg du principe actif.

Résultats d'essais pharmacologiques :

A. Activité inhibitrice in vitro de l'ester méthylique de la pepstatine/arginine.

1. Sur substrat naturel

30 unités micro-Goldblatt (30 (im UG) de rénine de porc purifiée [Corvol et al., «Cir. Res.», 41, 616-622 (1977)] ont été incubées à pH 6,5 pendant 15 min à 37° C en présence d'un excès de substrat de rénine de rat obtenu à partir de rats binephrectomisês. On a mesuré l'angiotensine I produite par dosage radio-immunologique [Ménard et Catt, «Endocrinology», 90,422-430 (1972)].

On a constaté que, dans les conditions ci-dessus, l'ester méthylique de la pepstatine/arginine permettait d'obtenir une inhibition de 50% de l'activité de la rénine à la concentration d'environ 10-7 mol/1.

La pepstatine diminue également dans les mêmes conditions l'activité de la rénine de 50% à la dose d'environ 10~7 mol/1.

2. Sur substrat synthétique

On a mis à incuber 10 unités milli-Goldblatt de rénine de porc provenant de la même source que ci-dessus à pH 6 pendant 1 h à 37° C en présence d'un substrat synthétique constitué de tétradéca-peptide de rénine N-acétylé [Galen et al., «Biochem. Biophys. Acta», 523,485-493 (1978)].

La quantité de tétrapeptide produite par heure d'incubation a été mesurée par fluorométrie.

On a utilisé le tétradécapeptide à trois concentrations différentes, à savoir 2,3,4,6 et 9,3 mmol avec des concentrations croissantes de pepstatine ou de l'ester méthylique de la pepstatine/arginine à savoir 0,25, 0,5, et 0,7510-6 mol/1. Les résultats ont été exploités selon la représentation de Dixon et on a ainsi déterminé que la constante d'inhibition de l'ester méthylique de la pepstatine/arginine était de 3,1510~7 mol/1 alors que celle de la pepstatine était de 10~7 mol/1.

B. Activité inhibitrice in vivo de l'ester méthylique de la pepstatine/arginine, et de la pepstatine/arginine.

On a utilisé le modèle expérimental de l'hypertension rénale développée chez le rat par Rojo-Ortega et Genest [«Can. J. Phys. Pharm.», 46, 883-885 (1968)].

Une ligature complète de l'aorte entre les artères rénales a été effectuée chez 20 rats mâles Sprague-Dawley pesant 300 g. Ils ont été examinés entre 5 et 10 d après l'opération.

La pression artérielle a été mesurée chez les rats libres et conscients par l'intermédiaire d'une canule carotidienne insérée 24 h avant la mesure. La baisse maximale de la pression artérielle induite par l'injection de Saralasin [Sar-l/Ala-8/angiotensine II] a été comparée, chez les mêmes animaux, à la chute maximale de la pression artérielle induite par les dérivés de la pepstatine selon l'invention.

Parmi 20 rats hypertendus, dont la pression artérielle moyenne était de 157+4,37 mmHg, 13 ont eu une baisse de pression artérielle

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de 10 mmHg et plus après l'injection intraveineuse de 140 ml de Saralasin. Chez ces 13 rats, la diminution moyenne de la pression artérielle était de 44,5 + 8,5 mmHg. L'injection intraveineuse de 350 nmol de l'ester méthylique de la pepstatine/arginine chez 2 rats et de la pepstatine/arginine chez les 11 autres rats a produit une s diminution de la pression artérielle de 48,3 ±8,2 mmHg.

La chute maximale de la pression artérielle a été obtenue 5 min après l'injection de Saralasin et 6 min après l'injection des dérivés de

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pepstatine selon l'invention. La pression artérielle est revenue à la normale 10 min après l'injection des deux inhibiteurs.

La concentration de la rénine plasmatique était de 501 + 125 pmol d'angiotensine I h -1 ml -1 chez ces 13 rats par comparaison à celle des animaux normalement tendus (5,8 ± 1,8 pmol d'angiotensine I h-1 ml-1)- La concentration de la rénine plasmatique a baissé jusqu'à 289+74 pmol d'angiotensine I h-1 ml~' 5 min après l'injection intraveineuse des dérivés solubles de la pepstatine selon l'invention.

Claims

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REVENDICATIONS

1. Dérivés de la pepstatine répondant à la formule générale (I) :

(CH3)2CHCH2CO - (NH CHCO)2 - NHCHCH(OH) CH2CONHCH - CONHCHCH(OH)CH2 - CO - (X)a(Y)b(Z)c (I)

CH(CH3)2 CH2CH(CH3)2 CH3 CH2CH(CH3)2

dans laquelle X, Y et Z, qui sont identiques ou différents, représentent chacun un aminoacide choisi parmi l'arginine, l'acide glutamique, l'acide aspartique, la lysine, l'histidine ou la valine, formant avec le groupement carboxylique libre de la pepstatine une liaison peptidique — CONH—, étant entendu que la fonction carboxylique de l'aminoacide terminal peut être sous forme libre ou sous la forme d'un ester d'un alcool aliphatique contenant 1 à 4 atomes de carbone, et les indices a, b et c, sont égaux chacun à 0 ou 1, la somme a+b+c étant égale à 1,2 ou 3, ainsi que leurs sels avec des bases solubilisantes.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est l'ester méthylique de la pepstatine/arginine dont les caractéristiques sont les suivantes:

— point de fusion sur banc Köfler = 262-263° C

— pouvoir rotatoire: [a] £>= —40,1° pour c=0,18, méthanol

— analyse des aminoacides après hydrolyse par l'acide chlor-hydrique 6N pendant 24 h à 110° C;

arginine: 0,95 alanine: 1 valine: 2,10

— spectre infrarouge: bande ester caractéristique à 1740 cm-1
3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est la pepstatine/arginine dont les caractéristiques sont les suivantes:

— point de fusion sur banc Köfler: supérieur à 250° C

— analyse des aminoacides après hydrolyse par l'acide chlor-hydrique 6N pendant 24 h à 110° C:

alanine: 1 valine: 1,96 arginine: 1
4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est la pepstatine/acide glutamique, dont les caractéristiques sont les suivantes:

leurs sels, leur préparation et les compositions qui les contiennent.

Dans la formule générale (I), les symboles, X, Y et Z, qui sont identiques ou différents, représentent chacun un reste d'aminoacide choisi parmi l'arginine, l'acide glutamique, l'acide aspartique, la lysine, l'histidine ou la valine, formant avec le groupement carboxylique libre de la pepstatine ou de l'aminoacide adjacent une liaison peptidique —CONH—, étant entendu que la fonction carboxylique de l'aminoacide terminal peut exister sous forme libre ou sous la forme d'un ester d'un alcool aliphatique contenant 1 à 4 atomes de carbone, et les indices a, b, et c, sont égaux chacun à 0 ou 1, la somme a+b+c étant égale à 1,2 ou 3.

Dans ce qui précède, les aminoacides définis par X, Y et Z sont -présents de préférence sous leur forme naturelle, c'est-à-dire sous forme L.

Lorsque la fonction carboxylique terminale est libre, la présente invention concerne également les sels des produits de formule générale (I) avec des bases solubilisantes telles que la solubilité dans l'eau des sels obtenus soit supérieure ou égale à 0,4% en poids par volume. Comme bases solubilisantes, on utilise de préférence des

— point de fusion sur banc Köfler: 230° C

— pouvoir rotatoire: [a]^§= —79,0° pour c=0,55, méthanol i o — analyse des aminoacides après hydrolyse par l'acide chlor-hydrique 6N pendant 24 h à 110° C:

alanine: 1 valine: 1,97 acide glutamique: 0,99 15 5. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est la pepstatine/acide aspartique dont les caractéristiques sont les suivantes:

— point de fusion sur banc Köpfler : 238-240° C

— pouvoir rotatoire: [a]2jf= —67,6° C pour c=0,51, méthanol 2o — analyse des aminoacides après hydrolyse par l'acide chlor-

hydrique 6N pendant 24 h à 110° C :

acide aspartique: 0,92 alanine: 1,12 valine: 2

25 6. Procédé pour l'obtention d'un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir de la pepstatine avec un acide, un dipeptide ou un tripeptide correspondant dans des conditions appropriées pour la formation d'une liaison peptidique —CONH—, à isoler le composé obtenu et à le transformer éventuel-30 lement en un sel avec une base solubilisante.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la réaction entre la pepstatine et l'acide, le dipeptide ou le tripeptide, est réalisée en présence d'un agent de condensation.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la 35 pepstatine est d'abord transformée en un anhydride mixte carbonique/carboxylique.
9. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre de principe actif, un composé selon la revendication 1, en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et

40 pharmaceutiquement acceptables.

(I)

so aminoacides choisis parmi l'arginine, la lysine ou l'acide ct,y-diaminobutyrique.

Les nouveaux dérivés selon la présente invention sont des inhibiteurs de l'action de la rénine. L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique contenant, à titre 55 d'ingrédient actif, un nouveau dérivé de la pepstatine.

Cette composition peut être utilisée pour le diagnostic et/ou le traitement de crises hypertensives liées à une sécrétion excessive de la rénine.

La pepstatine, c'est-à-dire l'acide isovaléryl-L-valyl-L-valyl-4-6o amino-3-hydroxy-6-méthylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-méthylhelptanoïque, est un produit connu. A cet effet, on peut se référer au brevet FR N° 70.21557. On connaît également des dérivés de la pepstatine, notamment les butyl-, propyl- et acétylpepstatines décrites dans «Chemical Abstracts», N° 124.637p, vol. 79, 1973. 65 Selon la présente invention, les nouveaux dérivés de la pepstatine de formule générale (I) peuvent être préparés selon les méthodes habituelles utilisées en synthèse peptidique, c'est-à-dire en faisant réagir la pepstatine avec un aminoacide convenable ou un dipeptide