CH619470A5 - Process for the preparation of 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-seryl-D-iso glutamine and 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-seryl-D-glu tamic acid - Google Patents
Process for the preparation of 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-seryl-D-iso glutamine and 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-seryl-D-glu tamic acid Download PDFInfo
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Abstract
Description
L'invention est relative à la préparation de la 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-iso-glutamine répondant à la formule: The invention relates to the preparation of 2- (2-acetamido-2-deoxy-3-0-D-glucopyrannosyl) -D-propionyl-L-seryl-D-iso-glutamine corresponding to the formula:
ch20h h, oh nh-coch, ch20h h, oh nh-coch,
© ©
h,g - ch - co - nh - ch - co - nh - ch - conh, h, g - ch - co - nh - ch - co - nh - ch - conh,
ch2oh ch2oh
A/ AT/
L L
i i
(cn2)2 (cn2) 2
c00h c00h
"sr d "sr d
désignée ci-après par l'abréviation Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, et de l'acide 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-glutamique répondant à la formule: hereinafter designated by the abbreviation Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, and 2- (2-acetamido-2-deoxy-3-0-D-glucopyrannosyl) -D-propionyl acid -L-seryl-D-glutamic corresponding to the formula:
ch20h h, oh ch20h h, oh
(n) (not)
h3C h3C
nh-cochj ch - co - nh - ch - co - nh - ch - cooh nh-cochj ch - co - nh - ch - co - nh - ch - cooh
(çh2)2 (çh2) 2
ch2oh ch2oh
-v- -v-
c00h désignée ci-après par l'abréviation Mur-NAc-L-Ser-D-Glu, ainsi que de leurs dérivés mono- et diesters, par exemple des groupes méthyliques, éthyliques ou propyliques, et de leurs dérivés amidés pouvant être substitués sur l'azote de l'amide, par exemple par des restes méthyle. Ces composés sont solubles dans l'eau et efficaces comme adjuvants immunologiques pour stimuler, chez 65 un hôte, les réponses immunitaires. Us servent notamment à renforcer l'action des immunogènes faibles. Plus particulièrement, lesdits agents sont utilisables pour l'immunisation de l'homme et des animaux à sang chaud contre des infections bactériennes, c00h hereinafter designated by the abbreviation Mur-NAc-L-Ser-D-Glu, as well as their mono- and diester derivatives, for example methyl, ethyl or propyl groups, and their amide derivatives which may be substituted on the nitrogen of the amide, for example by methyl residues. These compounds are water soluble and effective as immunological adjuvants for stimulating immune responses in a host. They serve in particular to strengthen the action of weak immunogens. More particularly, said agents can be used for the immunization of humans and warm-blooded animals against bacterial infections,
3 3
619 470 619,470
virales et parasitaires, et contre différents antigènes tissulaires d'origine normale ou pathologique. viral and parasitic, and against different tissue antigens of normal or pathological origin.
L'intérêt tout particulier des produits obtenus selon l'invention réside dans le fait qu'il n'est pas nécessaire d'avoir recours à des milieux particuliers d'administration, dont dépendrait la manifestation de l'action adjuvante, et les excipients auxquels on est conduit à les associer n'ont pour but que de faciliter l'utilisation de ces produits. En particulier, il n'est pas nécessaire, The very particular advantage of the products obtained according to the invention lies in the fact that it is not necessary to have recourse to particular administration media, on which the manifestation of the adjuvant action would depend, and the excipients we are led to associate them only for the purpose of facilitating the use of these products. In particular, it is not necessary,
lorsque l'un de ces produits est injecté, d'utiliser à cet effet une composition contenant une phase huileuse. when one of these products is injected, use for this purpose a composition containing an oily phase.
En outre, les agents adjuvants obtenus selon l'invention peuvent être administrés par voie orale ou parentérale, notamment par injection, scarification, ou par application sur des muqueuses. In addition, the adjuvants obtained according to the invention can be administered orally or parenterally, in particular by injection, scarification, or by application to mucous membranes.
Ces compositions médicamenteuses peuvent contenir un des agents obtenus selon l'invention et notamment le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln en association avec un véhicule pharmaceutique-ment acceptable. Des compositions de ce type particulièrement préférées sont constituées par des solutions injectables contenant une dose efficace d'un produit obtenu selon l'invention. On utilise avantageusement, à cet effet, des solutions stériles dans une phase aqueuse de préférence isotonique, telles que des solutions isotoniques salines ou glucosées. Cela n'est bien entendu pas limitatif; on peut également utiliser une simple solution dans de l'eau distillée. Il est également possible d'utiliser des milieux d'injection contenant une phase huileuse, et notamment des émulsions eau dans l'huile. De telles émulsions sont obtenues en particulier avec des huiles végétales métabolisables, telles que décrites dans la demande de brevet français N° 75.04003. These medicinal compositions may contain one of the agents obtained according to the invention and in particular Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle. Particularly preferred compositions of this type consist of injectable solutions containing an effective dose of a product obtained according to the invention. Advantageously, sterile solutions in an aqueous phase, preferably isotonic, are used for this purpose, such as saline or glucose isotonic solutions. This is of course not limiting; you can also use a simple solution in distilled water. It is also possible to use injection media containing an oily phase, and in particular water-in-oil emulsions. Such emulsions are obtained in particular with metabolizable vegetable oils, as described in French patent application No. 75.04003.
Ces compositions médicamenteuses peuvent être présentées encore sous des formes variées, en utilisant à cet effet des excipients appropriés au mode d'administration choisi. On utilisera, par exemple, des compositions sous forme de cachets, comprimés ou gélules, pour l'administration orale, des aérosols ou des gels pour l'application sur les muqueuses. These medicinal compositions can also be presented in various forms, using for this purpose excipients suitable for the chosen mode of administration. Use will be made, for example, of compositions in the form of cachets, tablets or capsules, for oral administration, aerosols or gels for application to the mucous membranes.
Les agents adjuvants obtenus selon l'invention peuvent encore être sous forme lyophilisée pour permettre la préparation extem-poranée de solutions injectables, ou pour scarification. The adjuvants obtained according to the invention can also be in lyophilized form to allow the extem-porane preparation of injectable solutions, or for scarification.
Une forme pharmaceutique avantageuse pour la préparation extemporanée de solutions injectables comprend une dose d'environ 2 mg d'un produit adjuvant selon l'invention, à l'état lyophilisé, en association avec environ 10 mg de lactose comme excipient. An advantageous pharmaceutical form for the extemporaneous preparation of injectable solutions comprises a dose of approximately 2 mg of an adjuvant product according to the invention, in the lyophilized state, in association with approximately 10 mg of lactose as an excipient.
Un produit obtenu selon l'invention, et en particulier le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, peut aussi être un agent immunogène, notamment à un antigène vaccinant faible. A product obtained according to the invention, and in particular the Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, can also be an immunogenic agent, in particular to a weak vaccinating antigen.
Les procédés selon l'invention sont définis dans les revendications. Selon l'un de ces procédés, on fixe à l'acide N-acétylmuramique la chaîne peptidique L-Ser-D-iso-Gln, L-Ser-D-Glu, ou à une chaîne estérifiée ou amidée correspondante dont sont bloqués les groupements réactifs, à l'exception du groupé amine devant réagir avec l'acide N-acétylmuramique. Après la fixation, on libère les fonctions protégées. The methods according to the invention are defined in the claims. According to one of these methods, the peptide chain L-Ser-D-iso-Gln, L-Ser-D-Glu, is attached to N-acetylmuramic acid, or to a corresponding esterified or amidated chain from which the reactive groups, with the exception of the amine group intended to react with N-acetylmuramic acid. After fixing, the protected functions are released.
Selon le second procédé, les deux aminoacides formant la chaîne peptidique sont fixés successivement. On fixe d'abord un dérivé adéquat de la L-sérine au dérivé de l'acide N-acétylmuramique, puis, sur le produit obtenu, on fixe le dérivé d'acide D-glutamique ou de l'isoglutamine à la L-sérine par formation d'une liaison peptidique. According to the second method, the two amino acids forming the peptide chain are successively attached. First, an adequate derivative of L-serine is attached to the derivative of N-acetylmuramic acid, then, on the product obtained, the derivative of D-glutamic acid or isoglutamine is attached to L-serine. by forming a peptide bond.
D'autres caractéristiques apparaîtront au cours de la description d'un exemple de préparation du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln selon l'invention, ainsi que des essais mettant en évidence les propriétés pharmacologiques de ce produit. Other characteristics will appear during the description of an example of preparation of the Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln according to the invention, as well as tests demonstrating the pharmacological properties of this product.
L'état de la technique est illustré par les brevets français N05 2248025 et 2292486 qui décrivent, d'une manière générale, des dérivés de muramyle efficaces comme adjuvants de l'immunité. The state of the art is illustrated by French patents N05 2248025 and 2292486 which generally describe muramyl derivatives effective as adjuvants of immunity.
La nature du premier acide aminé de la chaîne de substitution n'est pas précisée. Or, en utilisant, conformément à l'invention, des dérivés comportant un groupement 1-séryle, on obtient de remarquables agents adjuvants, ce qui n'était pas suggéré par les brevets cités. The nature of the first amino acid in the substitution chain is not specified. However, by using, in accordance with the invention, derivatives comprising a 1-seryl group, remarkable adjuvants are obtained, which was not suggested by the cited patents.
Exemple de synthèse du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln Example of synthesis of Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln
Ce composé, dont le nom suivant la nomenclature officielle est 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-séryl-D-isoglutamine, est préparé en plusieurs étapes. Dans un premier temps, la chaîne peptidique est synthétisée puis, dans un second temps, cette chaîne est fixée au résidu muramyle. Pendant cette synthèse, les fonctions ne devant pas entrer en réaction sont protégées par des groupes de protection ou de blocage qui sont ensuite éliminés. This compound, whose name according to the official nomenclature is 2- (2-acetamido-2-deoxy-3-0-D-glucopyrannosyl) -D-propionyl-L-seryl-D-isoglutamine, is prepared in several stages. First, the peptide chain is synthesized, and then, this chain is attached to the muramyl residue. During this synthesis, the functions which should not enter into reaction are protected by protection or blocking groups which are then eliminated.
Dans la suite de cet exposé, les abréviations utilisées ont les significations suivantes: In the remainder of this presentation, the abbreviations used have the following meanings:
Mur-NAc 2-acétamido-2-déoxy-3-0-(D-2-propionyl)-D-gluco- Wall-NAc 2-acetamido-2-deoxy-3-0- (D-2-propionyl) -D-gluco-
pyrannose pyrannosis
Glu acide glutamique iso-Gin isoglutamine Glu glutamic acid iso-Gin isoglutamine
Ser sérine Ser serine
4,6-O-bzi 4,6-O-benzylidène 4,6-O-bzi 4,6-O-benzylidene
ß-bzl ß-benzyl ß-bzl ß-benzyl
BOC t-butyloxycarbonyl BOC t-butyloxycarbonyl
OBzl ester benzylique OBzl benzyl ester
OSu ester succinimidique OSu succinimide ester
Bzl éther benzylique Bzl benzyl ether
BOC-L-Ser (Bzl)-D-iso-Gln-OBzl (I) BOC-L-Ser (Bzl) -D-iso-Gln-OBzl (I)
1,48 g (5 mmol) de BOC-L-Ser (Bzl) [E. Wünsch, A. Zwick, «Chem. Berg.», 97 (1964) 2497] est ajouté sous agitation à une solution dans le diméthylformamide de 1,64 g (6 mmol) du chlorhydrate de l'ester benzylique de la D-isoglutamine [P. Lefrancier, E. Bricas, «Bull. Soc. Chim. France», (1969) 3561] et de 0,66 ml (6 mmol) de N-méthylmorpholine. On ajoute 1,24 g (6 mmol) de NN'-dicyclohexylcarbodiimide, et le mélange réactionnel est laissé à la température ambiante pendant 12 h. Il est ensuite concentré et repris dans 50 ml d'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée successivement avec une solution d'acide citrique à 10%, à l'eau, avec une solution N de bicarbonate de sodium, puis à l'eau jusqu'à pH neutre. La phase acétate d'éthyle est séchée sur MgS04, puis concentrée. Le produit est cristallisé dans le mélange éther/éther de pétrole. On obtient 1,40 g de produit, soit un rendement de 55%. 1.48 g (5 mmol) BOC-L-Ser (Bzl) [E. Wünsch, A. Zwick, "Chem. Berg. ”, 97 (1964) 2497] is added with stirring to a solution in dimethylformamide of 1.64 g (6 mmol) of the hydrochloride of the benzyl ester of D-isoglutamine [P. Lefrancier, E. Bricas, “Bull. Soc. Chim. France ”, (1969) 3561] and 0.66 ml (6 mmol) of N-methylmorpholine. 1.24 g (6 mmol) of NN'-dicyclohexylcarbodiimide are added, and the reaction mixture is left at room temperature for 12 h. It is then concentrated and taken up in 50 ml of ethyl acetate and the organic phase is washed successively with a 10% citric acid solution, with water, with a solution N of sodium bicarbonate, then with 1 water to neutral pH. The ethyl acetate phase is dried over MgSO4, then concentrated. The product is crystallized from the ether / petroleum ether mixture. 1.40 g of product are obtained, ie a yield of 55%.
PF 65-66° C. Mp 65-66 ° C.
ccd25= +5,8° (méthanol absolu). ccd25 = + 5.8 ° (absolute methanol).
Analyse pour C27H35O7N3 (513,6) : Analysis for C27H35O7N3 (513.6):
Calculé: C63,l H 6,9 N8,2 % Calculated: C63, W H 6.9 N 8.2%
Trouvé: C63,2 H 7,1 N7,97% Found: C63.2 H 7.1 N7.97%
Chlorhydrate de L-Ser (Bzl)-D-iso-Gln-OBzl (II) L-Ser (Bzl) -D-iso-Gln-OBzl (II) hydrochloride
1,3 g (2 mmol) de (I) sont traités pendant 30 mn par 5 ml d'une solution environ N d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique. Le mélange réactionnel est concentré à sec et le produit cristallisé dans le mélange méthanol/éther. On obtient 765 mg de produit, soit un rendement de 85%. 1.3 g (2 mmol) of (I) are treated for 30 min with 5 ml of an approximately N solution of hydrochloric acid in acetic acid. The reaction mixture is concentrated to dryness and the product crystallized from a methanol / ether mixture. 765 mg of product is obtained, ie a yield of 85%.
PF 158-161° C. Mp 158-161 ° C.
<xd25= +8,2° (méthanol absolu). <xd25 = + 8.2 ° (absolute methanol).
Mur-NAc ($-bzl-4,6-bzi)-L-Ser (Bzl)-D-iso-Gln-OBzl (III) Wall-NAc ($ -bzl-4,6-bzi) -L-Ser (Bzl) -D-iso-Gln-OBzl (III)
Une solution de 471,43 mg (1 mmol) de Mur-NAc (ß-bzl-4,6-bzi) dans le mélange acétonitrile/diméthylformamide (2/1, v/v -10 ml) contenant 0,141 ml (1 mmol) de triéthylamine est versée dans une suspension, maintenue à 0°C, de N-éthyl-5-phénylisoxazolium-3'-sulfonate (253 mg -1 mmol) (réactif D de Woodward, Aldrich) dans 10 ml d'acétonitrile. A solution of 471.43 mg (1 mmol) of Mur-NAc (ß-bzl-4,6-bzi) in the acetonitrile / dimethylformamide mixture (2/1, v / v -10 ml) containing 0.141 ml (1 mmol ) of triethylamine is poured into a suspension, maintained at 0 ° C., of N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonate (253 mg -1 mmol) (reagent D of Woodward, Aldrich) in 10 ml of acetonitrile.
s s
10 10
15 15
20 20
25 25
30 30
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
619 470 619,470
4 4
Le mélange est agité à 0°C jusqu'à l'obtention d'une solution limpide (90 mn environ), puis sont ajoutés 450 mg (1 mmol) de (II) en solution dans 10 ml du mélange acétonitrile/diméthyl-formamide (2/1, v/v) contenant 0,141 ml (1 mmol) de triéthyl-amine. Après une nuit d'agitation à la température ambiante, les s solvants sont évaporés sous vide et le produit précipité dans le mélange diméthylformamide/eau. On obtient 818 mg de produit, The mixture is stirred at 0 ° C. until a clear solution is obtained (approximately 90 minutes), then 450 mg (1 mmol) of (II) dissolved in 10 ml of the acetonitrile / dimethyl-formamide mixture are added. (2/1, v / v) containing 0.141 ml (1 mmol) of triethylamine. After stirring overnight at room temperature, the solvents are evaporated in vacuo and the product precipitated from the dimethylformamide / water mixture. 818 mg of product are obtained,
soit un rendement de 94,3%. or a yield of 94.3%.
PF 180-186° C. Mp 180-186 ° C.
<xd25 = —17° (NN'-diméthylformamide). io <xd25 = —17 ° (NN'-dimethylformamide). io
Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (IV) Wall-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (IV)
768 mg du composé (III) (0,88 mmol) sont traités par 30 ml d'une solution d'acide acétique à 60% pendant 1 h à 100°C. 768 mg of the compound (III) (0.88 mmol) are treated with 30 ml of a 60% acetic acid solution for 1 h at 100 ° C.
Après refroidissement de la solution, l'acide acétique est évaporé is sous vide et le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (35 g) (chloroforme/méthanol, 6/2, v/v). Les fractions pures sont jointes, évaporées sous vide, donnant un résidu chromatographiquement pur (plaque de gel de silice/chloroforme/ méthanol, 6/2, v/v). On obtient 287 mg de produit, soit un 20 After cooling the solution, the acetic acid is evaporated off under vacuum and the residue is chromatographed on a column of silica gel (35 g) (chloroform / methanol, 6/2, v / v). The pure fractions are combined, evaporated under vacuum, giving a chromatographically pure residue (plate of silica gel / chloroform / methanol, 6/2, v / v). 287 mg of product are obtained, i.e. a 20
rendement de 42%. 42% yield.
Ce produit, repris dans 20 ml d'acide acétique glacial, est ensuite hydrogéné pendant 10 h en présence de palladium sur charbon. Après filtration du catalyseur et concentration à sec du mélange réactionnel, le produit est obtenu par précipitation dans 25 un mélange éthanol/acétone/éther. On obtient 140 mg de produit, soit un rendement de 74%. Le pouvoir rotatoire est aD25= +47,1° (acide acétique glacial). This product, taken up in 20 ml of glacial acetic acid, is then hydrogenated for 10 h in the presence of palladium on carbon. After filtration of the catalyst and concentration of the reaction mixture to dryness, the product is obtained by precipitation in an ethanol / acetone / ether mixture. 140 mg of product are obtained, ie a yield of 74%. The rotary power is aD25 = + 47.1 ° (glacial acetic acid).
Le produit est chromatographiquement homogène sur plaques de gel de silice dans les mélanges n-butanol/pyridine/acide 30 The product is chromatographically homogeneous on silica gel plates in n-butanol / pyridine / acid mixtures 30
acétique/eau (30/20/6/24, v/v) et n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5, v/v - phase supérieure). acetic / water (30/20/6/24, v / v) and n-butanol / acetic acid / water (4/1/5, v / v - upper phase).
Analyse pour C19H32O12N4 (508,5): Analysis for C19H32O12N4 (508.5):
Calculé: C 44,88 H 6,34 NI 1,02% 3J Calculated: C 44.88 H 6.34 NI 1.02% 3J
Trouvé: C44,8 H 6,3 Nll,l % Found: C44.8 H 6.3 Nll, l%
Propriétés pharmacologiques Pharmacological properties
I. Détermination de l'innocuité du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln I. Determination of the safety of Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln
L'innocuité, ou au contraire la toxicité du produit selon 40 The safety, or on the contrary the toxicity of the product according to 40
l'invention, est étudiée par injection intraveineuse sur des souris âgées de deux mois. En augmentant progressivement les doses administrées, on détermine celle pour laquelle la mortalité des souris d'un même lot s'établit à 50% (DL50). the invention is studied by intravenous injection in mice two months old. By gradually increasing the doses administered, it is determined that for which the mortality of the mice of the same batch is established at 50% (LD50).
Pour le produit étudié, on a montré que la DLso est supérieure à 1 g/kg d'animal, ce qui est de beaucoup supérieur aux doses pour lesquelles ce produit manifeste ses propriétés adjuvantes. For the product studied, it has been shown that the LD 50 is greater than 1 g / kg of animal, which is much higher than the doses for which this product manifests its adjuvant properties.
2. Caractère adjuvant en phase aqueuse 2. Adjuvant nature in aqueous phase
Dans les séries d'essais dont les résultats sont indiqués ci-après, on a étudié l'influence du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln sur le taux des anticorps antialbumine dans les conditions suivantes. In the series of tests, the results of which are given below, the influence of Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln on the level of anti-albumin antibodies was studied under the following conditions.
Des groupes de 8 souris Swiss âgées de deux mois reçoivent, par injection sous-cutanée, 0,5 mg d'antigène constitué par de l'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,1 mg de la substance essayée dans une solution saline isotonique. Cette dose élevée d'antigène, parce qu'elle se situe à la limite de la dose paralysante vis-à-vis de la réponse immunitaire, entraîne de ce fait une réponse faible ou nulle à l'antigène seul chez les témoins; elle constitue donc un critère sévère pour mettre en évidence l'activité d'une substance adjuvante. 30 j plus tard, les souris reçoivent un rappel contenant 0,1 mg du même antigène. Groups of 8 two-month-old Swiss mice receive, by subcutaneous injection, 0.5 mg of antigen consisting of bovine serum albumin (BSA) and 0.1 mg of the test substance in saline solution isotonic. This high dose of antigen, because it is at the limit of the paralyzing dose vis-à-vis the immune response, therefore causes a weak or zero response to the antigen alone in the controls; it therefore constitutes a severe criterion for demonstrating the activity of an adjuvant substance. 30 d later, the mice receive a booster containing 0.1 mg of the same antigen.
Le taux d'anticorps est déterminé par hémagglutination passive en utilisant des hématies de mouton traitées à la formaline et recouvertes de l'antigène étudié selon la méthode décrite par A.A. Hirata et M.W. Brandiss («J. Immunol.», 100, 641-648, 1968). Les prélèvements ont lieu 14,28, 34 et 36 j après la première injection. The level of antibody is determined by passive haemagglutination using red blood cells treated with formalin and coated with the antigen studied according to the method described by AA Hirata and MW Brandiss ("J. Immunol.", 100, 641-648 , 1968). The samples are taken 14, 28, 34 and 36 days after the first injection.
A titre de comparaison, des souris reçoivent, à la place du Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, soit des lipopolysaccharides (LPS) (extrait de S. enteritidis par la méthode eau/phénol), soit l'adjuvant désigné sous le nom WSA et décrit par Adam et coll. [«Infect. Immun.» (1973), 7, 855-861]. Les souris témoins ne reçoivent que l'antigène. For comparison, mice receive, instead of Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, either lipopolysaccharides (LPS) (extract of S. enteritidis by the water / phenol method), or adjuvant designated as WSA and described by Adam et al. ["Infect. Immun. " (1973), 7, 855-861]. Control mice receive only the antigen.
Les résultats de ces essais sont donnés dans le tableau 1. The results of these tests are given in Table 1.
Tableau 1 Table 1
Titre d'anticorps Antibody titer
14e j 14th day
28e j 28th day
34= j 34 = d
36e j 36th day
Témoin (BSA) Witness (BSA)
<3 <3
<3 <3
<3 <3
<3 <3
BSA+LPS (100 ng) BSA + LPS (100 ng)
<3 <3
6 6
50 50
1310 1310
BSA+WSA (300 |ig) BSA + WSA (300 | ig)
<3 <3
<3 <3
<3 <3
6 6
BSA+Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (100 (J.g) BSA + Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (100 (J.g)
12 12
25 25
1600 1600
1600 1600
On a renouvelé ces essais en limitant la dose d'antigène de la première injection à 0,05 mg, les autres conditions étant identiques par ailleurs. Cette dose d'antigène plus faible donne par elle-même une réponse positive chez les témoins qui ont reçu l'antigène sans adjuvant. Elle permet donc de mettre en évidence une substance qui inhibe la réponse immunitaire humorale. Par ailleurs, une substance adjuvante, dans ces conditions, élève toujours le taux d'anticorps par rapport à celui des témoins. These tests were repeated by limiting the dose of antigen from the first injection to 0.05 mg, the other conditions being identical elsewhere. This lower dose of antigen by itself gives a positive response in the controls who received the antigen without adjuvant. It therefore makes it possible to highlight a substance which inhibits the humoral immune response. In addition, an adjuvant substance, under these conditions, always raises the level of antibodies compared to that of the controls.
Dans ces essais, la détermination du taux d'anticorps a été effectuée simultanément par hémagglutination passive (PA) et par la méthode de fixation de l'antigène par le sérum (ABC), telle que décrite par P. Minden et S. Farr («Handbook of Exp. Immunol.» P 463, Weir D.M. éd., Blackwell Scient. Pub. Oxford et Edimbourg, 1967). In these tests, the determination of the antibody level was carried out simultaneously by passive hemagglutination (PA) and by the method of fixing the antigen by the serum (ABC), as described by P. Minden and S. Farr ( "Handbook of Exp. Immunol." P 463, Weir DM ed., Blackwell Scient. Pub. Oxford and Edinburgh, 1967).
55 Les résultats de ces essais figurent dans le tableau 2. The results of these tests are shown in Table 2.
Tableau enfin de brevet) Finally, patent table)
Ces résultats montrent que le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, administré en solation isotonique saline, provoque un important so accroissement du taux d'anticorps formés, alors que, dans les mêmes conditions, le WSA est pratiquement inactif. These results show that the Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, administered in saline isotonic solation, causes a significant increase in the level of antibodies formed, whereas, under the same conditions, the WSA is practically inactive. .
Dans la seconde série d'essais, pour laquelle la dose d'antigène, lors de la première injection, est faible, la présence de WSA semble même inhiber la formation d'anticorps, alors que le 65 Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln, au contraire, favorise l'apparition des anticorps. In the second series of trials, for which the dose of antigen, at the time of the first injection, is low, the presence of WSA even seems to inhibit the formation of antibodies, while the 65 Mur-NAc-L-Ser- D-iso-Gln, on the contrary, promotes the appearance of antibodies.
Le Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln peut être considéré, de façon générale, comme comparable au LPS pour sa capacité de stimula- The Wall-NAc-L-Ser-D-iso-Gln can be considered, in general, as comparable to LPS for its capacity to stimulate
5 5
619 470 619,470
tion de la formatioh des anticorps, mais, contrairement au LPS, Elles peuvent être utilisées notamment pour favoriser l'immu- the format of the antibodies, but, unlike LPS, they can be used in particular to promote immu-
il est dépourvu de toxicité. nisation de l'hôte (patients humains ou animaux) à l'égard des it is devoid of toxicity. nisation of the host (human or animal patients) with regard to
On obtient donc des compositions adjuvantes dépourvus de infections d'origine bactérienne ou virale, des antigènes des toxicité et qui peuvent être utilisées pour accroître l'efficacité de tumeurs, etc. Elles sont également efficaces pour la fabrication de vaccins d'origine bactérienne ou virale, notamment quand ceux-ci 5 sérums contenant des anticorps actifs à l'égard de ces antigènes, Adjuvant compositions are thus obtained devoid of infections of bacterial or viral origin, of antigens of toxicity and which can be used to increase the efficiency of tumors, etc. They are also effective for the manufacture of vaccines of bacterial or viral origin, in particular when these 5 sera containing antibodies active against these antigens,
sont faiblement immunogènes. are weakly immunogenic.
Tableau 2 Table 2
Titre d'anticorps Antibody titer
14e j 14th day
28e j 28th day
34e j 34th day
36e j 36th day
42e j 42nd day
PA PA
ABC ABC
PA PA
ABC ABC
PA PA
ABC ABC
PA PA
ABC ABC
PA PA
BSA (témoin) BSA (witness)
<3 <3
<20 <20
<3 <3
<20 <20
6 6
<20 <20
50 50
25 25
25 25
BSA + LPS BSA + LPS
<3 <3
<20 <20
25 25
<20 <20
400 400
300 300
3200 3200
500 500
800 800
BSA + WSA (100 ng) BSA + WSA (100 ng)
<3 <3
<20 <20
<3 <3
<20 <20
6 6
<20 <20
3 3
<20 <20
3 3
BSA + WSA (300 ng) BSA + WSA (300 ng)
<3 <3
<20 <20
<3 <3
<20 <20
<3 <3
<20 <20
<3 <3
<20 <20
<3 <3
BSA + Mur-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (100 (ig) BSA + Wall-NAc-L-Ser-D-iso-Gln (100 (ig)
<3 <3
<20 <20
3 3
<20 <20
50 50
<20 <20
800 800
230 230
260 260
R R
à at
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