DE3411709A1

DE3411709A1 - Gonadoliberinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE3411709A1
Application number: DE19843411709
Authority: DE
Inventors: Judit Dipl.-Chem. Dr. Budapest Erchegyi; Imre Dipl.-Chem. Dr. Mezö; János Dipl.-Chem. Dr. Seprödi; István Dipl.-Chem. Dr. Teplán
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1983-03-29
Filing date: 1984-03-29
Publication date: 1984-10-18
Also published as: DK163247C; GB2138427A; ES8606882A1; LU85270A1; IT1196064B; BE899247A; DK171884D0; FI82837B; AT389704B; ATA106084A; ES544757A0; IL71380A0; NL8400965A; HU187503B; GB8408128D0; ES8605823A1; GB2138427B; FI82837C; CA1258150A; US4600705A

Description

Die Erfindung "betrifft neue Gonadoliberinderivate, die eine ß-Aspartylgruppe aufweisen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Veruindungen enthaltende Arzneimittel, insbesondere Sexualhormone.

Das Gonadoliberin (in der Fachliteratur auch als gonadotropisch.es Hormon [gonadotrop releasing hormon], GnBH, LH-RH, luteinisierendes und follikelstimulierendes Hormon, IH- und FSH-RH bezeichnet) und seine bekannten Derivate haben die allgemeine Eigenschaft, das luteinisierende Hormon (LH) und das follikelstimulierende Hormon (FSH) freisetzen zu können.

Aus der Literatur ist bekannt (m. Monahan u.a.. Biochemistry 12_, 4616-4620 /1973/; O. Sandow u.a.. Control of Ovulation, Buttarworths, London 1978, pp. 49-70), daß diejenigen Derivata des Gonadoliberins, die statt de3 6-ständigen Glycinteils eine Aminosäure mit D-Kon figuration oder deren Derivate aufweisen, sowie diejenigen, in denen dar Ίθ-ständiga Glycinamidteil durch eine Amidgruppa mit aliphatischer Kette ersetzt ist (m. Fujino u.a., 3. Med. Chem. IB, 1144 /1973/), eine stärkere und zeitlich langer anhaltende biologische Wirkung haben als das Gonadoliberin. Demgegenüber ist abar auch bekannt, daß die on der 6-Stellung eina L-Aminosäure, zum Beispiel L-Alanin, L-Prolin, L-Valin (Monahan u.a., Biochemistry \2_, 4616 /1973/), L-Isolaucin (θ. Coy u.a.: O. Med. Chem. _16, 1140 /1973/) oder eine Aminosäure ohne Asymmatriezantrum, zum Beispiel τ-Aminobuttarsäura, ß-Alanin (3. Rlvier u.a.. Peptides: Chemistry, Structure, Biology, Ed, R. Walter, 3. Maianhofar, Ann Arbor

- 12 -

Science Publishers Inc. Michigan, p. 803 /1975/) oder Sarkosin (w. Arnold u.a., J. Mad. Chem. 17, 3l4 /1974/)^ enthaltenden Gonadolibarinderivate nur über eine minimale

Wirksamkeit verfügen.

Zum Freisetzen von LH erwies sich nur eine Verbindung mit L-Konfiguration als biologisch wirksamer Substituent in 6-Stellung geeignet, und zwar ein spezieller L-Jp-Lactamring (Veber u,a., Science 210, 656 /1980/) .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Gonadoliberinderivate mit überlegenen ph.armakologisch.en Wirkungen, insbesondere Sexualhormonwirkungen, ein Verfahren zur Herstellung derselben und diese Veroindungen enthaltende Arzneimittel zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß die biologische Wirkung der in der 6-Stellung eine D-Aminosäure aufweisenden Gonadoliberinderivate von Verbindungen, in denen die L-Asparaginsäure über ihre ß-Carboxylgruppe in die 6-Stellung der Peptidkette des Gonadoliberins eingebaut ist, während die oC-Carboxylgruppe frei bleibt oder durch verhältnismäßig kleine Gruppen substituiert beziehungsweise abgewandelt ist, erreicht oder übertroffen werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind daher Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel

1 2 3 4- 5 6 7 8 9 10

< Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X l-:L_eu__Arg_p_r0_Y I ,

- 13 -

<(Glu [=Glp] für einen Rest von L-Pyroglutaminsäure steht,

His einen Rest von L-Histidin bedeutet,

Trp einen Rest von L-Tryptophan darstellt,

Ser für einen Rest von L-Serin steht,

Tyr einen Rest von L-Tyrosin bedeutet,

Asp einen Aspartylrest darstellt,

Leu für einen Rest von L-Leucin steht,

Arg einen Rest von L-Arginin bedeutet,

Pro einen Rest von L-Prolin darstellt,

X für einen Rest der allgemeinen For

mel

341Ί709

in welchletzterer

R Wasserstoff,

einen Benzylrest
oder einen Alkylrest mit 1 bis 4-Kohlenstoffatom(en) bedeutet,

oder einen Rest der allgemeinen Formel

E₂

in welchletzterer ·

R^ und R> unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkylreste mit 1 bis 5
Kohl ens t of f at om(en), Cycloalkylreste mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Arylreste
beziehungsweise
Aralkylreste mit
1 bis 4 Kohlerstaffatom(en) im Alkylteil stehen oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind,

- 15 -

/IH-

einen Morpholino-, Indolin-1-yl-[1-Indolinyl-] oder Pyrrolidin-1-ylrest [1-Pyrrolidinylrest] darstellen,

steht und

Y einen Rest von Glycinamid (Glykokoll-

amid) oder einen Alkylamidrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) bedeutet,

sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe, insbesondere Metallkomplexe, vor allem Zinkkomplexe.

Vorzugsweise ist der Alkylrest, für den R stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 1, Kohlenstoffatomen) .

Es ist auch bevorzugt, daß der beziehungsweise die Alkylrest(e), für den beziehungsweise die R. und/oder R₂ stehen kann beziehungsweise können, ein solcher beziehungsweise solche mit 1 bis 4-, insbesondere 1 oder 2, ganz besonders 2, Kohlenstoffatom(en) ist beziehungsweise sind.

Ferner ist es bevorzugt, daß der beziehungsweise die Cycloalkylrest(e), für den beziehungsweise die R_-1 und/oder Ro stehen kann beziehungsweise können, ein solcher beziehungsweise solche mit 3 bis 5, insbesondere 4, Kohlenstoffatomen ist beziehungsweise sind.

Weiterhin ist es bevorzugt, daß der beziehungsweise die Arylrest(e), für den beziehungsweise die R. und/oder R^

- 16 -

stehen kann beziehungsweise können, [ein] Phenylrest(e) ist beziehungsweise sind.

Außerdem ist es bevorzugt, daß der beziehungsweise die Aralkylrest(e) , für den beziehungsweise die R_-1 und/oder Rp stehen kann beziehungsweise können, [ein] Phenylalkylrest(e) ist beziehungsweise sind.

Vorzugsweise ist beziehungsweise sind der beziehungsweise die Aralkylrest(e) , für den beziehungsweise die R^. und/oder Rp stehen kann beziehungsweise können, ein solcher beziehungsweise solche mit 3 oder 4, insbesondere 4-, Kohlenstoffatomen im Alkylteil.

Es ist auch bevorzugt, daß der beziehungsweise die Aralkylrest(e), für den beziehungsweise die R^ und/oder Rp stehen kann beziehungsweise können, [ein], gegebenenfalls im Alkylteil durch 1 bis 3, insbesondere 1 oder 2, ganz besonders 2, Methyl- und/oder Äthylrest(e), ganz besonders Methylrest(e), substituiertefr] Benzyl- beziehungsweise Phenyläthylrest(e) , vor allem [ein] £i ,1 -Dimethy 1-2-phenyl^- -äthylrest(e), ist beziehungsweise sind.

Ferner ist es bevorzugt, daß der Alkylamidrest, für den Y stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 2, Kohlenstoffatom(en) ist.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind

- vr -

-Hla-Trp-Ser-Tjr-Aap-O-Me ^Lau-Arg-Pro-SA ,

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Aap-DEA ^-Leu-Arg-Pro-EIA ,

(Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Aap-NHg ^L Leu-Arg-Pro-Gly-NI^ ·,

<Glu-Hi3-Trp-Ser-Tyr-Asp-I?BA ^ Lau-Arg-Pro-Gly-tlHg , < Glu-Hi3-Trp-3er-Tyr-Aap-CBA

u- Ilia-Trp-Ser-Tyr-Aap-PIR g

<(Glu- Hia-Trp-Ser-Tyr-Aap-IliD ^Leu-Arg-Pro-EA und

sowie ihre Säureadditionssalze.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß

a^) ein Tetra- beziehungsweise Pentapeptid der allgemeinen Formel

H-Asp-X keu-Arg-Pro-Y II ,

worin X und Y wie oben

festgelegt sind, mit dem Pentapeptidazid der

Formel

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N, kondensiert wird, oder

- 18 -

a₂) ein Hexapeptid der allgemeinen Formel

E
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X III ,

worin

X wie oben festgelegt ist und

E für eine Hydroxy- oder Azidogruppe oder ednen N-Succinimidoxyrest oder einen, gegebenenfalls durch eine Nitrogruppe oder Halogen substituierten, Phenoxyrest, vorzugsweise einen p-Nitrophenoxy-, 2,4-,6-Trichlorphenoxy-, Pentachlorphenoxy- oder Pentafluorphenoxyrest, steht

mit einem Tri- beziehungsweise Tetrapeptid der allgemeinen Formel

H-Leu-Arg-Pro-Y IV ,

worin Y wie oben festgelegt

ist, kondensiert wird, oder

a,) zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen Y für einen Rest von GIycinamid steht, BOC-Glycin an ein 1 bis 3%, vorzugsweise 2%, Querbindungen aufweisendes chlormethyliertes Polystyrol/Divinylbenzol-Harz gekuppelt wird, von der erhalbaisn Verbindung der Formel

- 19 -

At

BOG-GIy-O-C —Polymer ^H2

die tert«-Butyloxycarbonylgruppe [BOG-Gruppe] abgespalten wird und dann vom G-Ende [C-Terminal] ausgehend durch periodische Wiederholung von Kopplungs- und Abspaltreaktionen die entsprechenden geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge an das Peptidpolymer gekuppelt werden und das fertige Peptid vom Polymer durch Ammonolyse (mit Ammoniak) und die Schutzgruppen vom Peptid durch anschließende Behandlung mit Fluorwasserstoff abgespalten werden oder

zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen Y für einen Rest von Glycinamid steht, BOG-Glycin an ein Benzhydrylaminogruppen und 1 bis 3%, vorzugsweise 2%, Querbindungen aufweisendes Polystyrol/Divinylbenzol-Harz gekuppelt wird und "von der so erhaltenen Verbindung der Formel

Hn er

I I^{6 5}

BOC-Gly-N-G-Polymer VI

die tert.-Butyloxycarbony]gruppe abgespalten wird und dann "von C-Ende ausgehend durch periodische Wiederholung von Kopplungs- und Abspaltreaktionen die entsprechenden geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge an das Peptidpolymer gekapp elt werden ind das fertige Peptid vom

- 20 -

Polymer sowie die Schutzgruppen vom Peptid mittels Fluorwasserstoff abspalten werden oder

a^) zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen Y wie oben festgelegt ist, BOG-Prolin an ein 1 bis 3%, vorzugsweise 2%, Querbindungen aufweisendes chlormethyliertes Polystyrol/DivJnylbenzol-Harz gekuppelt wird, von der auf diese Weise erhaltenen Verbindung der Formel

BOC-Pro-O-C^-Polymer VII

die tert.-Butyloxycarbonylgruppe abgespalbai wircLuxL dann vom C-Ende ausgehend durch periodische Wiederholung von Kopplungs- und Abspaltreaktionen die entsprechenden geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge an das Peptidpolymer gekuppelt werden und das fertige Peptid vom Polymer durch Aminolyse (mit einem Alkylamin oder Glycylamin) und die Schutzgruppen vom Peptid durch anschließende Behandlung mit Fluorwasserstoff abgespalten werden,

worauf in an sich bekannter Weise die erhaltenen (jonadoliberinderivate der allgemeinen Formel I in Säureadditionssalze oder Komplexe überfuhrt werden beziehungsweise aus den erhaltenen Säureadditionssalzen die freien Basen freigesetzt
und/oder sie in andere Salze überführt werden.

Die in der obigen Formel I und in den anderen Formeln verwendeten Symbole entsprechen der in der Peptidchemie anerkannten Nomenklatur (s. z.B. J. Biol. Ghem. 241, 527 [1966]; 247, 977 [1972]). Zusätzlich werden in der Be-

- 21 -

Schreibung noch die folgenden Abkürzungen verwendet:

EA = Äthylamino-, DEA = Diäthylamino-, CBA = Cyclobutyl-

amino-, FBA = (1_t1-Dimethyl-2-phenyl)-äthylamino-,

IND = Indolin-1-yl-, PIR = Pyrrolidin-1-yl-, ANI = Phenyl-

amino- und BOC = tert. Butyloxycarbonylgruppe.

Das für das Verfahren a*) als Ausgangsstoff erforderliche Tetra- oder Pentapeptid der Formel (il) kann in an sich bekannter IVeise - durch die Azid-, Anhydrid- oder Carbodiimidmethode, die Methode des aktivierten Esters oder andere bekannte Aktivierungsmethoden - mittels Fragmentkondensation oder schrittweiser Kettenverlängerung hergestellt werden. So kann das Trioder Tetrapeptid H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-Y, worin die Bedeutung von Y die gleiche wie oben ist, mit einem an der Aminogruppe durch eine tert.-Butoxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützten Asparaginsäurederivat der allgemeinen Formel (viii)

Z-Asp-X (VIII) j

worin die Bedeutung von χ und E die gleiche wie oben ist uod Z eine tert.-Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe bedeutet , acyliert und von der erhaltenen Verbindung die Schutzgruppe entfernt werden. Das bei der Verfahrensvariante a.) als weiterer Ausgangsstoff verwendete Pentapeptidazid der Formel

<CGlu-His-Trp-Ser-Tyr-N,

kann vorteilhaft aus dem Pentapeptidhydrazid der Formel <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₅

frisch hergestellt worden sein.

Das im Verfahren a~) erforderliche Hexapeptid der Formel (ill) wird zweckmäßig hergestellt, indem man ein Asparaginsäurederivat der allgemeinen Formel (ix)

0-R
j

H-Asp-X - 22 -

,. 34.1 Up9.?· ,

DAChA¹J hai MÖNCHEN M _: '/■ , ■ ■ . ', [P ^:34-. M ?Ö9.1

MÜ?itHENtS STR. 80· r -i ". ". \. : -p

7-L^CfJ.iU;:: CACHAU 43 71 {NAOHeEREiOHTf ¹^

woria die Bedeutung von X die gleiche wie oben ist und R„ für Wasserstoff, Methyl-, Benzyl- oder tert,-Butylgruppe steht, mit dem Pentapeptidazid < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N acyliert. 5

Die im Verfahren a„) angewendete Methode zur Peptidsynthese in der festen Phase ist aus der Literatur bekannt (j.M. Steward: "Solid Phase Peptide Synthesis", Freeman and Co., San Fraucisco, 1969). 10

Mit der automatisch gesteuerten Synthese in der festen Phase (D. Coy et al. , Biochemistry JL3_, 323 /197V> D. Coy et al., J. Med. Chem. 1£, '423 /1976/) wurden schon zahlreiche Gonadoliberin-Analoge hergestellt} das Verfahren a^,) unterscheidet sich von den bekannten Verfahren darin, daß man als Aminosäure in 6-Stellun.g ein Aminosäurederivat der allgemeinen Formel (x)

_y "3

C-R,
I -

BOC-Asp-X (X)

worin die Bedeutung von X die gleiche wie oben ist und R fur Wasserstoff, p-Nitrophenyl- oder Pentafluorphenylgruppe steht, verwendet. Zum vorübergehenden Schutz der übrigen Aminosäureseitenketten des Moleküls werden Gruppen verwendet, die sich mit Fluorwasserstoff später entfernen lassen, zum Beispiel im Falle von Arginin und Histidin die p-ToluoIsulfony!gruppe, im Falle von Serin und Tyrosin die Benzy!gruppe.

Aus dem erhaltenen Nona- beziehungsweise Decapeptidamid kann gewünschtenfalls durch Umsetzen mit einer physiologisch verträglichen Säure ein Säureadditionssalz hergestellt werden. Gewünschtenfalls kann aus dem Säure-

additionssalz durch Umsetzen mit einer Base die freie Base erneut hergestellt werden. Gewünschtenfalls kann

dem Nona-beziehungsweise De cape pt id amid ein. Komplex, wie Mefcallkomplex, gebildet werden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Arzneimittel, die als ¥irkstoff die neuen. Verbindungen der allgemeinen Formel (i) oder deren Säureadditionssalze enthalten. Die Arzneimittelpräparate werden zweckmäßig hergestellt, indem man die Verbindungen, ihre Säureadditionssalze oder Komplexe zusammen mit den in der pharmazeutischen Industrie üblichen Träger- und/oder Streckmitteln beispielsweise zu Tabletten_? Dragees, Kapseln, Suppositorien, Injektionslösungen oder Nasea-

15 sprays zubereitet.

Ein besonders bevorzugter Vertreter der Verbindungen der allgemeinen Formel (i) ist die Verbindung der Formel (Xl)

< Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEALLeu-Arg-Pro-EA (Xl),

die an androgenisierten Versuchsratten mit größerer ¥irksamkeit Ovulation hervorruft als natives LH-RH, obwohl ihre LII-freisetzende Wirkung um eine Größenordnung geringer ist als die des nativen LH-RH.

In einem anderen Versuch wurden Stör- und Hechtmutterfische mit einer Dosis von 20 /Ug/kg der Verbindung (Xl) behandelt, worauf hin 80 % der Fische laichten, während bei der Kontrollgruppe, die unter den gleichen Bedingungen mit dem aus der Literatur als superaktiv bekannten D-Phe ,desGly^L0-LH-RH-äthylamid behandelt wurde, keine Ovulation eintrat,

- aft -

Die Verbindung der Formel (Xl), in einer Dosis von 100 /Ug i.m. gleichzeitig mit der Samenübertragung (insemination) verabreicht, verbesserte die Wahrscheinlichkeit der Trächtigkeit um 25-30 f°) während sich natives LH-RH in dieser Dosis als wirkungslos erwiesln einer einmaligen Dosis von 10 yug verabreicht, löste die Verbindung (Xl) bei Blau- und Silberfüchsen Paarungen außerhalb der Paarungszeit aus, während natives LH-RH auch in diesem Fall wirkungslos war.

Mit einer anderen der erfindungsgeraäßen Verbindungen, dem
<, GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-AJSH *- Leu-Arg-Prο-GIy-NH₂ i (ß-Asp-cc-anilid) -LH-RHj, konnte die Samen- und Testosteronproduktion von Truthähnen besser und anhaltender gesteigert werden als zum Beispiel mit; dem strukturanalogen D-Phe -LH-RH. Die gleiche Verbindung verkürzte die Setzzeit (die Zeit, während der die Henne bereit ist, zu brüten) von Truthennen beträchtlich, während natives LH-IiH wirkungslos war.

Diese Beispiele zeigen, daß die erfindungsgemäßen Gonadoliberinanaloge auf die Vermehrungsvorgänge der Wirbeltiere eine große Wirkung ausüben. Die Vorteile der Anwendung der Verbindungen in der Tierzucht sind durch zahlreiche Versuche belegt.

Der bedeutende Vorteil der Verbindungen der allgemeinen Formel (l) gegenüber den bisher bekannten hochwirksamen Gonadoliberinanalogen besteht darin, daß erstere ausschließlich aus L-Aminosäuren aufgebaut sind. Auch ist ihre Ovulation auslösende und Testosteron freisetzende Wirkung, wie zahlreiche biologische Experimente zeigten, besser als die der in der 6-Steilung· Glycin oder eire

D-Aminosäure enthaltenden sog. superaktiven Gonadoliberinderivate.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die in den Beispielen angegebenen Rp-Werte der Dünnschichtchromatographie wurden an Merckplatten (Kieselgel DC, Alufolie) mit den Lösungsmitte!gemischen aus den folgenden Bestandteilen in den folgenden Volumverhältnissen bestimmt:
10

1. Athylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 60:20:6:11

2. Athylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 120:20:6:11 J, Athylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 240:20:6:11 4. Athylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 480:20:6:11

5« Athylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 30:20:6:11

6. Aceton-Chloroform 1:15

7. Aceton-Toluol 1:1

8. Essigsäure-Benzol 1:7

1!

9- n-Butanol-Essigsäure-Athylacetat-Yasser 1:1:1:1

10. n-Butano!-Essigsäure-Wasser 4:1:1

11. n-Butanol-Essigsäure-Wasser 4:1:5 (Oberphase)

12. Athylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 5:5:!:3

13. Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser 60:20:6:11

Die Schmelzpunkte sind in C angegeben und

nicht korrigiert.

Beispiel 1

< Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OMe »- Leu-Arg-Pro-EA

a) Z-Asp-OMe L-Leu-Arg(NO₂)-Prο-EA

537 mg (l mMol) des Hydrobromids von H-Leu- -Arg(NOp)-Pro-EA werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird bei 0 °C mit 447 mg (l mMol) Z- -Asρ(OPFP)-OMe versetzt- Der pH-Wert des Reaktionsgemisches

- 70S -

IS

wird unter Rühren mit Triethylamin auf 8 eingestellt. Nach 6 Stunden wird die Lösung im Vakuum eingedampft.

Il

Der Rückstand wird zuerst mit <\ther, dann mit ¥asser verrieben, dann filtriert und schließlich aus methano-

Il

lischer Lösung durch Zugabe von Äther ausgefällt. Man erhält 44O mg (62 fo) einer weißen, amorphen Substanz.

SA₉VlO = ^7I9'⁶· Schmelzpunkt: 182-184 °C.

O O

C^]₀ : -58,4 "(C=I, Methanol). 10 Rf (2) = 0,5; Rf (9) = 0,85} Rf (12) = 0,9-

b) H-Asp-OMe "-Leu-Arg-Pro-EA.2AcOH 400 mg (0,56 rnMol) des Tetrapeptide

Z-Asp-OMeL-LeU-ATg(N^-O₂)-Prο-BA werden in 20 ml 50 foiger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 50 mg 10 ^iger Palladiumaktivkohle h Stunden lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, die Essigsäure im Vakuum ent-

Il

fernt, der Rückstand mit Äther verrieben, filtriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 36O mg (97 $)·

^{20 C}28^H52^H8°1O^{: 660}'⁵

Rf (1) = 0,15; Rf (9) = 0,6; Rf (10) = 0,25; Rf (5) = 0,^-

c) < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OMe L-Leu-Arg-Pro-EA 7l6 mg (l mMol) des Pentapeptid-hydrazids <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N_?H werden in 20 ml Dimethylforra-

ο amid gelöst. Die Lösung wird auf -10 C gekühlt und zuerst mit 0,7 ml 6n Salzsäure, dann mib der konzentrierten wäßrigen Lösung von 75 mg Natriumnitrit versetzt. Das Gemisch wird bei -5 C 10 Minuten lang gerührt. Dann gibt man die SiVLS 660 mg (l mMol) des Diacetats von H-Asp-OMe "—Leu- -Arg-Pro-EA, 0,7 ml Triethylamin und 5 ml Dimethylformamid bereitete, gekühlte Lösung zu dem Gemisch- Notwendigenfalls wird der pH-Wert mit Triäthylamin auf 8 eingestellt. Das Gemisch wird bei -5 C eine Stunde lang, dann bei 0 C 12 Stunden lang gerührt und anschließend das Dimethylfοrm-

amid im Vakuum entfernt- Der Rückstand wird mit Äther ver-

rieben, filtriert und dann an einer. Säule" aus Sophadex G-25 mit 0,2n Essigsäure fraktioniert. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden an einer Mitteldruck-Umkehrphasensäule (Silicagel Co, Whatman, LRP-l) mit 30 ΊΌ Wasser enthaltendem Methanol ehromatographiert. Die reinen Fraktionen werden lyophilisiert. Ausbeute: 712 mg (58 %).

^C58^H80^Nl6°lV ¹²²⁵ [öc] : -53,^° (c = 1, Wasser) 10 Rf (5) = 0,5j Rf (10) = 0,15; Rf (9) = 0,7-

Aminosäureanalyse: GIu: 1,02, His: 0,97, Ser: 0,95,

Tyr: 1,01, Asp: 1,07, Leu: 1,00, Pro: 0,93.

15 Beispiel 2

< Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEA *- Leu-Arg-Pro-

-Ea.2AcOH

a) BOC-Asρ(OBzI)-DEA

3,23 g (10 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-asparaginsäure-ß-benzylester werden bei 0 C in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der Lösung werden 1,35 g (lO mMol) N-Hydroxybenztriazol und 2,26 g (ll mMol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Das Gemisch wird bei 0 C 15 Minuten lang gerührt und dann unter Rühren tropfenweise mit der Lösung von 1,0 ml (0,73 Si 10 mMol)

11

Diethylamin in 20 ml Athylacetat versetzt- Das Reaktionsgemisch wird bei 0 C noch 30 Minuten, dann bei Raumtemperatur k Stunden lang gerührt. Der Niederschlag wird abf iltri.ert. Die Mutterlauge wird eingedampft, der tt
Rückstand in Athylacetat gelöst und die Lösung mit 10 foiger kalter Citronensäure, dann mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schlißlich mit gesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält 3,6 g (95 fo) eines

blaßgelben Öls. ' ." \ ' ~. '.:'-·-

C₂₀H₃₀N₂O₅: 378,2.

O]₀ : -58,4 (c = 1, Methanol). Rf (4) = 0,95; Rf (6) = 0,95; Itf (7) = 0,75* 5

b) BOC-Asp-DEA

3.8 g (10 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-aspartyl- -ß-benzylester-öc-diäthylamid werden in 50 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 300 mg 10 %iger Pa 1 Lad ium aktivkohle 2 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand im Exsikkator getrocknet- Man erhält 2,8 g (100 %) einer blaßgelben schaumigen Substanz.
C₁₃H₂₅N₂O₅: 289,1.

¹⁵ Ml)^{2 :} -⁶⁰J¹-⁰ (^c = 1> Methanol).

Rf (4) = 0,7; Rf (6) = 0,9; Rf (8) = 0,8.

c) BOC-ASp(OPFP)-DEA

2.9 g (10 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-asparaginsäure-cc-diäthylamid werden bei O C unter Rühren in 100 ml

Athylacetat gelöst. Zu der Lösung werden 1,84 g (10 mMol) Penfcafluorphenol und 2,26 g (ll mMol) Dicyclohexyl- -carbodiimid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 0 ⁰C 30 Minuten lang und dann bei Raumtemperatur 2h Stunden lang gerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand mit Petroläther behandelt, der ausgeschiedene Niederschlag erneut abfiltriert und die Lösung dann eingedampft. Nach dem Trocknen erhält man 4,4 g (99 ⁰Jo) eines farblosen Öls.

3° ^C ₁₉ ^H24^N2^O5^F5^: ^k55)1' op

[öc]_d = -75,0° (c = 1, Methanol).

Rf (8) = 0,95; Rf (6) = 0,9; Rf (4) = 0,75; Rf (7) = 0,8.

12

-w-

d) BOC-Asp-DEA ^eU-AJCgJNo₀ )-Pro_rEA 536 wig (l raMol) des Hydrobromids "von jl-Leu- -Pro-äthylaraid werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und zuerst mit O₃I^ ml (l tnMol) T_riäthylamin, dann mit 4-53 mg (l mMol) tert. -Butyloxycarbonyl-aspartyl-cc-diäthylamid-ß-pentafluorphenylester versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt und dabei wird der pH-Wert von Zeit zu Zeit auf neutral gestellt. Das Reaktionsgemisch wird eingedampft, der Rückstand mit

Äther verrieben und dann filtriert. Das erhaltene Rohr produkt (etwa 780 mg) wird"an einer Silicagelsäule mit dem im Volumverhältnis k:1:1 bereiteten Gemisch von Butanol, Essigsäure und Wasser chromatographisch gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Durch Verreiben des Rückstandes mit Äther erhält man 470 mg (6h %) eines weißen Pulvers,
C₃₂H₅₇N₁₀O₉: 725,6.

22 ο

20 [oc]_D : -77,2 (c = 1, Methanol).

Schmelzpunkt: 132-133 °C.

Rf (2) = 0,k; Rf (9) = 0,85} Rf (10) = 0,55.

e) BOC-Asp-DEA »-Leu-Arg-Pro-EA. AcOH

73O mg (l mMol) des Tetrapeptide BOC-Asp-DEA *-Leu- -ATg(M)₂)-Prο-EA werden in 20 ml 50 folger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 100 mg 10 ^iger PaHadiumaktivkohle 3 Stunden lang hydriert. Das durch Eindampfen des Gemisches gewonnene Produkt ist ein chromatographisch

30 einheitliches Öl.

346399
Rf (2) = 0,05} Rf (9) = 0,65; Rf (l) = 0,6.

f) H-Asp-DEA *-Leu-Arg-Pro-EA. 2TFA

74O mg (l mMol) des Tetrapeptide BOC-Asp-DEA -Arg-Pro-EA werden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst.

-JO-

DIe Lösung wird bei Raumtemperatur ;15 Minuten -lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der UiXeks-tand wird mit /Vther verrieben, filtriert und über Lauge getrocknet. Man erhält 780 mg (96 $) einer schwach hygroskopischen Substanz,
C₃₁H₅₃O₉N₉F₆: 809,2

OO «-ν

[ocü-Q : -kO,6 (c = 1, Wasser). Rf (11) = 0,2; Rf (5) = 0,k.

s) < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEA *-Leu-Arg-

-Pro-EA.2AcOH

286 mg {0,k mMol) des Pentapeptidhydrazids < Glu-IIis-Trp-Ser-Tyr-N^II« werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst, Die Lösung wird auf -10 C gekühlt und unter Rühren tropfenweise zuerst mit 0,27 ml 6n S_alzsäure, dann mit der konzentrierten wäßrigen Lösung von 30,2 mg Natriumnitrit versetzt. Nach 5 Minuten werden 353 mg des Trif luoracetats von H-Asp-DEA »-Leu-Arg-Pro- -EA in Form einer mit 1 ml Dimethylformamid und 0,27 ml Triethylamin bereiteten, auf -10 C gekühlten Lösung zugegeben. Erforderlichenfalls wird das Reaktionsgemisch mit Triethylamin neutralisiert und bei -5 C eine Stunde, bei 0 C eine weitere Stunde und schlißlich bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt Das Dimethylformamid wird im Vakuum entfernt und der Rückstand an einer Silicagelsäule mit dem im Volumverhältnis von 30:20:6:11 bereiteten Gemisch von Athylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser chromatographisch gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird mit

Äther verrieben, abfiltriert und getrocknet. Man erhält 29O mg (50 ⁰Jo) eines weißen Pulvers.

^C65^H95^N17°17^{: 1385} Schmelzpunkt: 180-181 °C.

so

- 3η. -

[oc]²² = -64,2° (c = 1, Methanol).-; .^: ' Rf (12) = 0,85; Rf (5) = 0,35; Rf (H)' = 0,25-

Aminosäureanalyse: Asp: 1,0, Ser: 0,99, GIu: 1,01, Leu: 1,10, Tyr: 1,00, His: 0,92, Arg: 0,98.

Beispiel 3

<GIu-His-Trp-Ser-Tyr-AsP-NEU^LLeu-Arg- -PrO-GIy-NH₂
a) BOC-Asρ(OBzI)-OPFP

3,23 g (lO iriMol) tert.-Butyloxycarbonyl- -asparaginsäure-ß-beazylester werden in 50 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und unter Rühren mit 1,84 g (10 mMol) Pentafluorphenol und 2,26 g (ll mMol) Dicyclohexyl-oarbodiimid versetzt, Das Gemisch wird bei 0 C 30 Minuten lang und dann bei Raumtemperatur 12 Stunden, lang gerührt. Nach dem Filtrieren wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml Äther- gelöst und durch Zusatz von 15 ml Petroläther bei -20 °C kristallisiert. Ausbeute: 3,75 S (70 %).

^C22^H2O^NO6^F5^{: 489}'3· Schmelzpunkt: 84 C.

[oc]^²: -18,1° (c = 1, Lthylacetat). 25 Rf (7) = 0,9} Rf (4) = 0,95.

b) BOG-Asρ(OBzI)-NH₂

Zu der ir.it 10 ml Methanol bereiteten Lösung von 97O mg (2 mMol) tert,-Butyloxycarbonyl-asparaginsäure-ß- -benzylester-oc-pentaf luorpheny!ester werden 10 ml bei 0 C mit Ammoniak gesättigtes Methanol gegeben. Die Lösung wird bed 0 C 30 Minuten, lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von

Il

Methanol und Äther kristallisier-t. 35

Elementaranalyse für C gHg^N^io "_:(322yl.K '.."; . berechnet, %: C 59,62, H 6,83 "N 8,69*,--' : gefunden, %: C 59,2, H 6,98, N 8,8. Schmelzpunkt: 159-I6I °C.

C⁰⁰In ^: ⁺^->^- (^{c =} ■*-> Methanol).

Rf (7) = 0,5; RC (8) = 0,75; Rf (4) = 0,9; Rf (6) = 0,95

c) ₂

480 mg (l,5 mMol) tei't. -Butyloxycarbonyl- -asparaginsäure-ß-benzylester-cc-amid werden in 10 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 50 Wg 10 $iger Palladiumaktivkohle eine Stunde lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Lös^ingsmittel im

It

Vakuum entfernt. Der Rückstand wird aus wäßrigem Äthanol kristallisiert- Ausbeute; 246 mg (93 %).

^C9^Hl6^M2°5^{: 3}'
Schmelzpunkt: 145-146 °C.

[oc]_D : -2,2 (c = 1, Methanol).

R_f (7) = 0,05; Rf (8) = 0,2; Rf (4) = 0,3; Rf (6) = 0,1. 20

d) < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-AsP-MH₂ *~ Leu-Arg-

Die Synthese des Peptids an der festen Phase, seine Abspaltung von dieser mittels Fluorwasserstoff und die chromatographische Reinigung des Peptids werden auf die unter Punkt c) des Beispiels 4 beschriebene ¥eise vorgenommen mit dem Unterschied, daß man als Aminosäure in der 6-Stellung die gemäß Punkt c) des vorliegenden Beispiels 3 hergestellte Verbindung verwendet. Man erhält

30 72 mg (12 %) reine Substanz.
C₃₇H₇₉W₁₈O₁₄: 1239.

O]²²: -55,5° (c = 1, Wasser).

Rf (5) = 0,35; Rf (ll) = 0,15; Rf (9) = 0,65; Rf (13) = 0,15-Aminosäureanalyse: GIu: 0,96, His: l,04, Ser: 0,93, Tyr: 1,02 Leu: 1,02, Pro: 0,94, GIy: 1,00, Asp: 1,1.

- 99 -

Beispiel k " _; ·

< Glu-IIis-Trp-Ser-Tyr-Asp-FBA *- Lau-Arg-Pro-

a) BOC-Asp(OBzI)-CC-[oc-(4-chlorph.eayl)-isobutylamid ]

5 g (15 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-asparagin-

Il

säure-ß-benzylester werden in 100 ml Athylacetat gelöst. Die Lös^ιn.g wird auf O C gekühlt und ucter Rühren, mit 2,1 g N-Hydroxybenztriazol, 3,75 S Dicyclohexyl-carbodiimid und der mit 20 ml Dimethylformamid bereiteten Lösung von 3>5 S 2-(^-Chlorphenyl)-isobutylamin versetzt. Das Gemisch, wix'd bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt und dann filtriert. Das FiItrat wix-d mit 10 %±ger CitroaensKure, dann mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit gesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert ur.d im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand kristallisiert langsam. Die Kristalle werden mit einem Gemisch aus Äther aund Petrοlather gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 5,5 S (75 %)♦

263325
Schmelzpunkt: 6O-6I C. [oc]^²: -12,2 ° (c = 1, Methanol). Rf (7) = 0,75,' Rf (8) = 0,6.

b) BOC-Asp-FBA

2,3 g (^,7 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl- ~asparaginsäu.re-ß-benzylester-cc-[2~(p~chlorphenyl)~ -isobutylamid] werden in 30 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 200 mg 10 %ige.r Palladiumaktivkohle 2 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand

Il

wird mit Äther verrieben, in Methanol gelöst und durch

Il

Zusatz von Äther kriatallisiert. 35 Ausbeute: 1,5 S (87 %)·

Eleraetitaranalyse für C H_ofiN₂0„ (36k, 2)1 berechnet, "/»: G 62,63 II 7,69,· gefunden, <?o: C 62,3 H 7,58.

Schmelzpunkt: 94-96 °C.

[öc]_d : -19 (c = 1, Methanol).

Rf (3) = 0,2,· Rf (2) = 0,3; Rf (7) = 0,15} Rf (9) = 0,8j

Rf (10 ) = 0 , 15 .

c) < Glu-His-Trp-S er-Tyr-Asp-FBA^LLeu-Arg-

-PrO-GIy-NH₂

1 S (0,5 tnMol) Benzhydrylaniin-Polyraer wird

in das Reaktionsgefäß eines automatischen Peptidsynthese· gerätes (ßeckman 99OB) eingebracht und k Stunden lang mit 30 ml Dichlormethan gerührt. Die geschützten Aminosäurederivate werden in der entsprechenden Reihenfolge durch zyklische Wiederholung der folgenden Schritte 1-10 an das Polymer gekuppelt;

1. Waschen mit 30 ml Dichlormethan 3x3 Minuten.

2. Waschen mit dem im Volumverhältnis von 1:2 bereiteten Gemisch von Trifluoressigsäure und Dichlormethan 5 ur.<d 25 Minuten.

3. Waschen mit 30 ml Dichlormethan 3x3 Minuten.

!I

k. Waschen n,it 30 ml Äthanol 3x3 Minuten.

5. Waschen mit 30 ml Chloroform 3x3 Minuten.

6. Waschen mit dem im Volumvex'hältnis von 1:9 bereiteten Gemisch von Triäthylatnin und Chloroform 2x1.0 Minuten.

7. Waschen mit 30 ml Chloroform 3x3 Minuten.

8. Waschen mit 30 ml Dichlormethan 3x3 Minuten.

9. Inkubieren von 1,5 mMol BOC-Arainosäurederivat und 1,5 mMol Diisopropyl-carbodiimid in 30 ml Dichlortnethan 120 Minuten.

10. Waschen mit 30 ml Diohlonnethan 3x3 Minuten.

Die Reihenfolge der geschützten Aminosäurederivate

ist folgende: DOC-GIy-OH, BOC-Pro-OH, BOC-Arg(Tos)-OH, BOC-Leu-OH, BOC-Asp-FBA, BOC-Tyr(BzI)-OH, BOC-Ser(BzI)- -OH, BOC-Trp-OH, BOC-His(Tos )-0H und < G-Iu.

Nahcdem alle Aminosäuren gekuppelt wurden, wird das fertige Peptidpolymerharz im Vakuum getrocknet und mit 50 ml verflüssigtem Fluorwasserstoff in Gegenwart von 6 ml Anisol bei 0 C 45 Minuten l£ing gerührt, Der Fluorwasserstoff wird mit wasserfreiem Stickstoff

entfernt und der Niederschlag mit Äther ausgefällt. Die abfiltrierte Substanz wird in 50 %iger Essigsäure suspendiert, erneut abfiltriert und das Filtrat im Vakwun eingedampft. Der Rückstand wird in 50 %iger Essigsäure gelöst und die Lösung über eine Säule aus Sephadex G--25 filtriert. Die reine Hauptfraktion wird mit dem Lösungsmittelgemisch 10 an einer Silicage!säule chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden eingedampft und lyophilisiert. Ausbeute: 70 mg (10 %).

^C67^H91^F18°14^{: 1371} M₀ ·' -5⁶J^ ^c (^c =Ί» Wasser)

Rf (13) = 0,25; Rf (9) = 0,7; Rf (ll) = 0,2; Rf (5) = 0,5.

Aminosäureanalyse: GIu: 0,97, His: 1,05, Ser: 0,94, Tyr: 1,02,

Asp: 1,02, Leu: 1,01, Pro: 0,95, GIy: 1,00.

Beispiel 5
< Glu-His-T_rp-Ser-Tyr-Asp-CBA *" Leu-Arg-Pro -

a) BOC-Asp(OBzI)-CBA

2,k g (5 mMol) des gemäß Beispiel 3a) hergestellten tert. -Butyloxycarbonyl-asparaginsäure-is-benzyl-

Il

estor-cc-pentafluorphenylesters werden in 20 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und tropfenweise mit der gekühlten Lösung von 0,42 ml

(5 mMol) Cyclobutylamin in 2 ml Athylacetat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, dann mit 10 folger Citronensäuxe, anschließend

mit gesättigter Natriumhydrogonearbonatlösunty und schließlieh mit gesättigter Koehsalzlösin:,g gewaschen., dann über wasserfreiem Natriutnsulfat getrocktiefc, filtriert und im Vakuum eingedampft- Der Rückstand wird

1!

in Athex^T gelöst und durch Zusatz von Petroläther kristallisiert. Ausbeute: I,l6 g (89 $>) ·

^C20^H28^N2°5^: 376,2.
Schmelzpunkt: 84-86 °C.
[cc]^²: -5,7° (c = 1, Methanol).
Rf (8) = 0,9; Kf (10) = 0,9,· Rf (7) = 0,75; Rf (Ll) = 0,95·

b) BOC-Asρ-CBA

1 g (2,65 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-

-asparaginsäure-ß-bonzylester-cc-cyclobutylamid wird in 20 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 100 mg 10 ?oiger Palladiumaktivkohle 2 Stunden lang hydriert.

Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand aus wäßrigem

Äthanol kristallisiert. Ausbeute: 6OC mg (79 %). 20 Elementaranalyse für C H₂₂N₃O (286,l)l berechnet, <fo: C 5^,5^ H 7,69j gefunden, %: G 53,9 H 7,68.

Schmelzpunkt: 1^9-150 °C.

[cc] : -9,5 (e = 1, Methanol). 25 Rf (8) = 0,2; Rf (10) = 0,75; Rf (7) = 0,05.

c) < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-CBA -Pi-O-GIy-NH₂

Die Synthese des Peptids an der festen Phase und seine Abspaltung von dieser mittels Fluorwasserstoff sowie die chromatographische Reinigung des rohen Peptids werden auf die im Punkt c) des Beispiels k beschriebene Weise vorgenommen mit dem Unterschied, daß man als Amino säure in 6-Stellung die gemäß Punkt b) des vorliegenden Beispiels 5 hergestellte Verbindung verwendet. Man. erhält 68 mg (10,5 %) reines Peptid.

^C61^H85^N18°14^:

[oc]p²: -44,88° (c = 1, Wasser).

Rf (11) = 0,2,· Rf (9) = 0,7,· Rf (13) = 0,2; Rf (5) = 0,4.

Aminosäureanalyse: GIu: 1,05, His: 0,96, Ser: 0,94,

Tyr: 0,98, Asp: 1,07, Leu: 1,02,

Pro: 0,96, GIy: 1,00.

Beispiel 6

< Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR *-L_eu-Arg-Pro- -GIy-NH₂

a) BOC-Asp(OBzI)-PIR

3,2 g (lO mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-asparaginsäure-ß-benzylester werden in 5 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird bei O C mit 1,35 S N-Hydroxyloenztriazol,

Il

2,26 g Dicyclohexyl-carbodiimid und der .mit 2 ml Athylacetat bereiteten Lösung von 0,8 ml Pyrrolidin versetzt. Das Reaktχοnsgemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und dann mit 10 folger Citronensäure, danach mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft.

Il

Der Rückstand wird in Athex· gelöst, filtriert und erneut eingedampft. 3,4 g (90 fo) eines Öls werden erhalten. C₂₀H₂₈N₂O₅: 376,2.

[oc]^²: -84,4° (c = 1, Methanol).

Rf (7) = 0,75; Rf (4) = 0,95; Rf (8) = 0,85; Rf (6) = 0,8.

b) BOC-Asp-PIR

3 S (8 mMol) tert.-ßutyloxycarbonyl-^-pyrrolidin- -l.-yl-asparaginsäure-ß-benzylester werden in 30 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 250 mg 10 folger Pa Had ium aktivkohle 2 Stunden lang hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung eingedampft. Der ölige Rückstand wird über Schwefelsäure getrocknet. Ausbeute: 2,1 g

(92 io).

C₁₃H₂₂N₂O₅: 286,2.

Schmelzpunkt: 12/(—125 °C.

[oc]^²: --39,9° (c = 1, Methanol).

Rf (8) = 0,3; Rf (7) = 0,2.

c) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR L-Leu-Arg-

Die Synthese des Peptide an der festen Phase, seine Abspaltung von dieser mittels Fluorwasserstoff und die chromatographische Reinigung des rohen Peptids werden auf die im Punkt c) des Beispiels k beschriebene Weise vorgenommen mit dem Unterschied, daß mati als Aminosäure in 6-Stellung die gemäß Punkt b) des vorliegenden Beispiels 6 hergestellte Verbindung verwendet. Man erhält 78 mg (12 $,) reines Peptid.

^{15 C}6l^H85^N18°l4^{: 1293}·

[cc]²/: -53,2° (c = 1, Wasser).

Rf (13) = 0,15; Rf (9) = 0,6,- Rf (ll) = 0,2; Rf (5) = 0,k, Aminosäure analyse: G-Iu: 0,97, His: 1,01, Ser: 0,9^,

Tyr: 1,03, Asp: 1,05, Leu: 1,00,

20 Pro: 0,94.

Beispiel 7

< Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND^LLeu-Arg- -Pro-KA.2AcOH
a) BOG-As p (OBz I)-INI)

3,23 ff (ΙΟ ΐπΜοί) tert. -Butyloxycarbonyl-

-asparaginsäurf-iB-benzylester werden in 50 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und unter Rühren mit 2,3 g Dicyclohexyl-carbodiimid und 1,19 S Indolin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, am anderen Tag filtriert und das Filtrat dreimal mit 10 "&iger Citronensäure, dreimal mit gesättigter Natriumhydcogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem

-Vf-

32

Natriumsulfat getrocknet und dann eingedampft. Das

Il

zurückbleibende Öl wird mit Wasser aus Äthanol kristallisiert .
Ausbeute: 3,7 S (89 %) .

Schmelzpunkt: 75-76 °C. [oc]²²: -70,9° (c = 1, Äthanol). Rf (7) = 0,9-

10 b) H-ASp(OBzI)-IND.TFA

800 mg (l}9 mMol) tert. -Butyloxycarbonyl-cc- -indolin-1-yl-asparaginsäure-ß-benzylester werden in 5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt. Die Trxfluoressigsaure wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird

Il

mit Äther verrieben, filtriert, getrocknet und aus

Il Il

Äthanol durch Zusatz von Äther kristallisiert, Ausbeute: 780 mg

21₂AW 20 Schmelzpunkt: 11^-115 C.

[cc]²²: -5,8° (c = 1, Methanol). Rf (7) = 0,2; Rf (k) = 0,65.

o) < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp(OBzI)-IND 716 mg (l mMol) des Pentapeptidhydrazids < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N"₂H„ werden in 10 ml Dimethyl-

ο formamid gelöst. Die Lösung wird auf -10 C gekühlt und zuerst mit 0,7 ml 6n S_alzsäure und dann mit der gesättigten wäßrigen Lösung von 75 mg Natriumnitrit versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei -5 C 10 Miauten lang gerührt. Dann wird die mit 0,7 ml Triethylamin

und 2 ml Dimethylformamid bereitete Lösung von ^38 mg (l mMol) cc-Indolin-1-yl-asparaginsäure-ß-benzylester-

-trifluoracetat £Trifluoracetat von H-Asp(OBzI)-

- zugegeben. Erforderlichenfalls wird der pH-Wert mit

1*6 -

Triethylamin, auf H eingestellt. Das Gemisch, wird bei -5 O eine Stunde lang und dann bei O G noch 12 Stunden lang gerührt- Das Dimethylformamid wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben, abfiltriert, mit Äthanol und Athylacetat gewaschen, dann in Dimethylformamid gelöst, die Lösung heiß mit Aktiv-

I!

kohle geklärt und das Produkt durch Zusatz von Äther ausgefällt. Ausbeute: όυΟ mg (6ö fo).

^C53^H56^N10°ll^{: 1O08}'⁹-10 Schmelzpunkt: 172-17^ °C.

Rf (9) = 0,7} ItC (10) = 0,k; Rf (l) = 0,35-

d) < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asρ-ΓΝΌ

500 mg (0,5 mMol) des Ilexapeptids < GIu- -His-Trp-Ser-Tyr-Asp(OBzI)-ΓΝΌ werden in einem Gemisch aus 0,5 ml Dimethylformamid und 30 ml 50 ^iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 50 mg 10 ^iger Palladiumaktivkohle 2 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Dimethylformamid durch Zusatz von Äther kristallisiert.
Ausbeute: 380 mg (83 %)-

^C46^H5O*1O°11^{: 918}'⁹·
Schmelzpunkt: 219-221 °C.

25 [cc]^ : -37,7 (c = 1, Dimethylformamid).

Rf (9) = 0,6; Rf (10) = 0,4; ItC (l) = 0,1.

e) < Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-INO -Arg-Pro-EA

Die mit 1 ml Dimethylformamid bereitete Lösung von hZ mg (O,O44 tnMol) des Ilexapeptids -< Glu-His-Trp-Ser- -Tyr-Asp-IND wird auf 0 G gekühlt und unter Rühren mit 7,8 zu! Diisopropyl-carbodiimid versetzt. Nach 10 Minuten wird die mit Dimethylformamid bereitete, mit Triäthylamin neutralisierte Lösung von 20 mg (O,O44 mMol)

HO

H-Leu-Arg-Pro-EA-hydrochlorid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird an einer Säule aus Sephadex G-25 mit 0,2n Essigsäure chromatographiert. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 28 mg (48 fo).

^C65^H85^N17°13^{: 1311}

O O r\

[<*]_D : -39,6 (c = 0,25, 25 folge Essigsäure) Rf (13) = 0,8; Rf (9) = 0,75; Rf (5) = 0,7; Rf (10) = 0,5·

Beispiel 8

< Glu-His-Trp-Ser-Tyr-AsP-ANI '-Leu-Arg-Pro-

15 a) BOC-Asp(OBzI)-ANX

3,23 g (10 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl- -asparaginsäure-ß-benzylester werden in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt und mit 0,96 g Anilin sowie 2,26 g Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird mit 10 folger Citronensäure, dann mit gesättigter Natrium-· hydrogencarbonatlösung und schließlich mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Die beim Eindampfen erhaltenen Kristalle werden mit Petroläther verrieben, filtriert und getrocknet. Ausbeute: k g (96 %

^C22^H26^N2°5^: 398,3. Schmelzpunkt: 105-106 °C.

OO «\

30 [oc]_D : -6 (c = I, Dimethylformamid).

Rf (ll) =0,8; Rf (12) = 0,95? Rf (8) = 0,k.

b) BOC-Asρ-ANI

3 g tert.-Butyloxycarbonyl-asparaginsäure- -ß-benzylester-.x-anilid werden in 20 ml Methanol gelöst

- Ji/* .

und in Gegenwart von 3°O mg 10 folger Palladiumaktivkohle hydriert. Der Katalysator wix'd abfiltriert, das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand

ti

aus Äthanol durch Zusatz von Wasser kristallisiert. Ausbeute: 2,05 ff (88 %).

Elementaranalyse für C L XO, (308,2)'. berechnet, %: C 58,4'+ H 6",'+0; gefunden, °/o: C 58,6 Ii 6,56.

Schmelzpunkt: 1*57-158 °C.

[öcjp : -12 (c = 1, Dimet JIf (Ll) = 0,7; ItC (12) = 0,85; ItC (8) = 0,05.

p
10 [öcjp : -12 (c = 1, Dimethylformamid).

c) < Glu-His -Trp-Ser-Tyr-Asp-ANI^ Leu-Arg- -Pro-Gly-MH₂

Die Synthese des Peptids an der festen Phase, seine Abtrennung von dieser mittels Fluorwasserstoff und die chromatographische Reinigung des erhaltenen rohen Peptids werden auf die im Punkt c) des Beispiels k beschriebene Weise vorgenommen mit dem Unterschied, daß man als Aminosäure in 6-Stellung die gemäß dem Punkt b) des vorliegenden Beispiels 8 hergestellte Verbindung verwendet. Man or-hält 82 mg (1.2,5 °/o) reines Produkt.

i>]f_} ²: -58,3° (<· = L, Wasser)-25 Rf (9) = 0,5 J Hf (lO) =0,2; Rf (12) =0,8.

Aminosäureanalyse: NH„: 1,23, Arg: O,95j Asp: 1,1,

GIu: 1,08, Pro: 1,01, GIy: 1,00, Leu: 1,1, Tyr: 0,85, Ser: 0,99-

Claims

Patentansprüche \ Λ.) Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel

<CGlu für einen Rest von L-Pyroglutaminsäure steht,

His einen Rest von L-Histidin bedeutet,

Trp einen Rest von L-Tryptophan darstellt,

Ser für einen Rest von L-Serin steht,

Tyr einen Rest von L-Tyrosin bedeutet,

Asp einen Aspartylrest darstellt,

Leu für einen Rest von L-Leucin steht,

Arg einen Rest von L-Arginin bedeutet,

Pro einen Rest von L-Prolin darstellt,

X für einen Rest der allgemeinen For

mel

in weichletzterer R Wasserstoff,

einen Benzylrest oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) bedeutet,

oder einen Rest der allgemeinen Formel

- N"

R₂

in weichletzterer

Ry. und Rp unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatom(en), Gycloalkylreste mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Arylreste beziehungsweise Aralkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstaffatom(en) im Alkyl-

-μ -³

teil stehen oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Morpholino-, Indolin-1-yl- oder Pyrrolidin-1-ylrest darstellen,

steht und

Y einen Rest von Glycinamid oder einen

Alkylamidrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff atom( en) bedeutet,

sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

2.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylrest, für den R stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 1, Kohlenstoffatomen) ist.

Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der beziehungsweise die Alkylrest(e), für den beziehungsweise die R,- und/oder Rp stehen kann beziehungsweise können, ein solcher beziehungsweise solche mit 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Kohlenstoffatomen) ist beziehungsweise sind.

4.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 oder 5i dadurch gekennzeichnet, daß der beziehungsweise die Cycloalkylrest(e) , für den beziehungsweise die R^, und/oder R2 stehen kann beziehungsweise können, ein solcher beziehungsweise solche mit 3 bis 5* insbesondere 4, Kohlenstoffatomen ist beziehungsweise sind.

34Ί r/ua

5.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1, 3 oder 4-, dadurch gekennzeichnet, daß der beziehungsweise die Arylrest(e), für den beziehungsweise die R. und/oder R₂ stehen kann beziehungsweise können, [ein] Phenylrest(e) ist beziehungsweise sind.

6.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 oder 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der beziehungsweise die Aralkylrest(e), für den beziehungsweise die R_x. und/oder Rp stehen kann beziehungsweise können, [ein] Phenylalkylrest(e) ist beziehungsweise sind.

7·) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 oder 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der beziehungsweise die Aralkylrest(e), für den beziehungsweise die R^ und/oder R₂ stehen kann beziehungsweise können, ein solcher beziehungsweise solche mit 3 oder 4-, insbesondere 4-, Kohlenstoffatomen im Alkylteil ist beziehungsweise sind.

8.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 oder 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der beziehungsweise die Aralkylrest(e), für den beziehungsweise die R,, und/oder R₂ stehen kann beziehungsweise können, [ein], gegebenenfalls im Alkylteil durch 1 bis 3* insbesondere 1 oder 2, Methyl- und/oder ithylrest(e), substituiertefr] Benzyl- beziehungsweise Phenyläthylrest(e) ist beziehungsweise sind.

9.) Gonadoliberinderivate nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylamidrest, für den X stehen kann, ein solcher mit 1 oder 2, insbesondere 2, Kohlenstoff atom( en) ist.

,,Ό ^lu.Hl.^p.S^r^üiT-i-L.u.^-Pr..« sowie seine S^eadditionssalse.

12.) «^-Hia-TTp-Ser-^-Ai^HT^e^-Pr.^-^ -wie seine Saureadditionssalse.

₁₅.) ^«U^-^JPST^^-^^H-, -wie seine Sa^e^iUonssa 1«

_w , <_G1u-„_is-_teP-s^-_Ai^r^-._Ars-_fro-0_1J-_SH₂ sowie seine

,7O <_G1u-H₁₃-_Trp-Se^_r-_AVSr-^Leu._Arä-P_ro-_01J-KH₂ sowie seine Säu.eadditionssalze

- 7 - Ii

18.) Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man

a.) ein Tetra- beziehungsweise Pentapeptid der allgemeinen Formel

H-Asp-XKLeu-Arg-Pro-Y II ,

worin X und Y wie in den Ansprüchen 1 bis 9 festgelegt sind, mit dem Pentapeptidazid der Formel

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N,

kondensiert, oder

ein Hexapeptid der allgemeinen Formel

E <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X III

worin

X wie in den Ansprüchen 1 bis 8 festgelegt ist und

E für eine Hydroxy- oder Azidcgruppe oder einen N-Succinimidoxyrest oder einen,

gegebenenfalls durch eine Nitrogruppe oder Halogen substituierten, Phenoxyrest, vorzugsweise einen p-Nitrophenoxy-, 2,4,6-Trichlorphenoxy-, Pentachlorphenoxy- oder Pentafluorphenoxyrest, steht _,

mit einem Tri- beziehungsweise Tetrapeptid der allgemeinen Formel

H-Leu-Arg-Pro-Y IV ,

worin Y wie im Anspruch 1 oder 9 festgelegt ist, kondensiert, oder

zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen Y für einen Rest von GIycinamid steht, BOG-Glycin an ein 1 bis 3%, vorzugsweise 2%, Querbindungen aufweisendes, chlormethyliertes Polystyrol/Divinylbenzol-Harz kuppelt, von der erhaltenen Verbindung der Formel

BOC-GIy-O-G—Polymer V H₂

die tert.-Butyloxycarbonylgruppe abspaltet und dann vom G-Ende ausgehend durch periodische V/iederholung von Kopplungs- und Abspaltreaktionen die entsprechenden geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge an das Peptidpolymer kuppelt und das fertige Peptid vom Polymer durch Ammonolyse (mit Ammoniak) und die Schutzgruppen vom Peptid durch anschließende Behandlung mit Fluorwasserstoff abspaltet oder

zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen Y für einen Rest von Glycinamid steht, BOC-Glycin an ein Benzhydrylaminogruppen und 1 bis 3%, vorzugsweise 2%, Querbindungen aufweisendes Polystyro1/Divinylbenzol-Harz kuppelt und von der so erhaltenen Verbindung der Formel

f <J6^H5

BOC-Gly-N-C-Polymer VI

die tert.-Butyloxycarbonylgruppe abspaltet und dann vom C-Ende ausgehend durch periodische Wiederholung von Kopplungs- und Abspaltreaktio nen die entsprechenden geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge an das Peptidpolymer kuppelt und das fertige Peptid vom Polymer sowie die Schutzgruppen vom Peptid mit tels Fluorwasserstoff abspaltet oder

a,-) zur Herstellung der Veroindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen Y wie im Anspruch 1 oder 9 festgelegt ist, BOC-Prolin an ein 1 bis 3%, vorzugsweise 2%, Querbindungen aufweisendes chlormethyliertes Polystyrol/Divinylbenzol-Harz kuppelt, von der auf diese Weise erhaltenen Verbindung der Formel

B0C-Pro-0-CH₂-Polymer VlI

die tert.-Butyloxycarbonylgruppe abspaltet und dann vom G-Ende ausgehend durch periodische

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Wiederholung von Kopplungs- und Abspaltreaktionen die entsprechenden geschützten Aminosäuren in der entsprechenden Reihenfolge an das Peptidpolymer kuppelt und das fertige Peptid vom Polymer durch Aminolyse (mit einem Alkylamin) oder Glycylainin) und die Schutzgruppen vom Peptid durch anschließende Behandlung mit Fluorwasserstoff abspaltet,

v/orauf man in an sich bekannter Weise die erhaltenen Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel I in Säureadditionssalze oder Komplexe überführt beziehungsweise aus den erhaltenen Säureadditionssalzen die freien Basen freisetzt und/oder sie in andere Salze überführt.

19·) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 1 oder mehr Verbindung(en) nach Anspruch 1 bis 17 als Wirkstoff(en), zweckmäßigerweise zusammen mit 1 oder mehr üblichen pharmazeutischen Konfektionierungsmittel(n).

Beschreibung