HU187503B

HU187503B - Process for preparing gonadoliberine derivatives containing beta-aspartyl group

Info

Publication number: HU187503B
Application number: HU831062A
Authority: HU
Inventors: Janos Seproedi; Istvan Teplan; Imre Mezoe; Judit Erchegyi
Original assignee: Magyar Tudomanyos Akademia,Hu
Priority date: 1983-03-29
Filing date: 1983-03-29
Publication date: 1986-01-28
Also published as: DK163247C; GB2138427A; ES8606882A1; LU85270A1; IT1196064B; BE899247A; DK171884D0; FI82837B; AT389704B; ATA106084A; ES544757A0; IL71380A0; NL8400965A; GB8408128D0; ES8605823A1; GB2138427B; FI82837C; CA1258150A; US4600705A; DK163247B

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) általános 12 3 4 5 6 7 8 9 10

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp- l-Leu-Arg-Pro-Y I képletű új gonadoliberin-származékok, azoknak a gyógyászatban felhasználható savakkal képzett addíciós sói, valamint az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, ahol a képletben

X jelentése —O—R csoport, ahol R jelentése benzil- vagy 1-4 szénatomos-alkilcsoport, — N csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogén atom, 1-5 szénatomos alkil-, fenil-, fenil- (1-4 szénatomos)-alkil-, 1-indolinil- vagy 3-6 szénatomos cikloalkil-csoport, vagy Rl és R2 3-4 szénatomos alkilcsoportot jelentenek, melyek a nitrogén atommal együtt gyűrűt képeznek,

Y jelentése glicinamid- vagy 1-4 szénatomos alkilamino-csoport.

A képletben alkalmazott rövidítések megegyeznek a peptidkémiában elfogadott nómeklatúrával, amelyet pl. a J. Bioi. Chem. ismertet [241, 527 (1966); 247, 977 (1972)]. A továbbiakban alkalmazott egyéb rövidítések: EA = etilamino-; DEA = dietilamino-; CBA = ciklobutilamino-; FBA = (l,l-dimetil-2-fenil)-etilamino-; IND= 1-indolinil-; PÍR = 1 -pirrolidinil-; ANI = fenilamino-; BOC = terc-butil-oxi-karbonilcsoport.

A gonadoliberin (a szakirodalomban ismert egyéb nevei: gonadotropin releasing hormon, GnRH, LH-RH, luteinizáló és follikulusz-stimuláló hormon, LH/FSH-RH) és e hormon ismert származékainak általános tulajdonsága, hogy képesek a luteinizáló hormon (LH) és a follikuluszstimuláló hormon (FSH) felszabadítására.

Az irodalomból ismeretes (M. Monahan et al., Biochemistry 12, 4616-4620 (1973), J. Sandow et al., Control of Ovulation, Butterworths, London, 1978,49-70 oldal), hogy a gonadoliberin azon származékai, amelyek a 6-os helyzetű glicin rész helyett D konfigurációjú aminosavakat vagy azok származékait tartalmazzák, továbbá azok, amelyekben a 10-es helyzetben levő glicin-amid részt alifás szénláncú amid-csoportok helyettesítik (M. Fujino et al., J. Med. Chem. 16, 1144 (1973)), a gonadoliberinhez viszonyítva megnövekedett és hosszabb ideig tartó biológiai hatást mutatnak. Ezzel szemben ismert az is, hogy a 6-os helyzetben L-konfigurációjú aminosavat, pl. L-alanint, L-prolint, L-valint (Monahan et al., Biochemistry 12, 4616 (1973)) L-izoleucint (D. Coy et al., J. Med Chem. 16, 1140 (1973)) vagy aszimetriacentrumot nem tartalmazó aminosavakat, pl. a gamma-aminovajsavat, bétaalanint (J. Rivier et al., Peptides: Chemistry, Structure, Biology, Ed. R. Walter, J. Meienhofer, Ann Arbor Science Publishers Inc., Michigan, p. 803, (1975)) vagy szarkozint (W. Arnold et al., J. Med. Chem. 17, 314 (1974)) tartalmazó gonadoliberinszármazékok csak minimális aktivitással rendelkeznek.

Az LH-felszabadítás szempontjából csak egyetlenegy L-konfigurációval rendelkező speciális gamma-laktám gyűrű bizonyult a biológiai hatás szem65

1Q pontjából hatékony szubsztituensnek a 6-os helyzetben (Veber et al., Sicence 210, 656 (1980)).

A találmány célja olyan új gonadoliberin-származékok egyszerű előállítása, melyek az ismert analógoknál kedvezőbb hatékonyságúak.

A találmány alapja az a felismerés, hogy ha az L-konfigurációjú aszparaginsavat béta-karboxilcsoportján keresztül építjük be a gonadoliberin peptidláncának 6-os helyzetébe, ugyanakkor alfakarboxil-csoportját szabadon hagyjuk vagy egy viszonylag kis atomcsoporthoz kapcsoljuk, akkor az így kapott gonadoliberin származékok a 6-os helyzetben D-konfigurációjú aminosavat tartalmazó gonadoliberin származékokéhoz hasonló vagy annál jobb biológiai hatással rendelkeznek.

A fentiek alapján az (I) általános képletű vegyületeket a peptidkémiában szokásos eljárásokkal állíthatjuk elő, ezek közül azonban különösen előnyösnek bizonyultak a következők:

a) valamely (II) általános képletű tetra- vagy

H-Asp-X ^Leu-Arg-Pro-Y II penta-peptidet - amely képletben X és Y jelentése a fenti - Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₃ pentapeptidaziddal kondenzálunk, vagy

b) valamely (III) általános képletű hexapeptidet 30

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-Χ III amely képletben X jelentése a fenti, és E hidroxilcsoportot, azidcsoportot, N-szukcinimid-oxicsoportot, továbbá adott esetben nitrocsoporttal vagy egy vagy több halogénatommal helyettesített fenoxicsoportot, előnyösen ρ-nitro-, 2,4,6-triklór-, pentaklór- vagy pentafluor-fenoxicsoportot jelent (IV) általános képletű tri- vagy tetrapeptiddel H-Leu-Arg-Pro-Y IV amely képletben Y jelentése a fenti - kondenzálunk, vagy

c) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, ahol a molekula C terminálisán glicinamid csoport van, valamint X csoport jelentése /Rl ^R2 , ahol Rl, R2 jelentése a fenti, benzhidril50 aminocsoportokat és 1-3%, előnyösen 2% keresztkötést tartalmazó polisztirol-divinil-benzol gyantához BOC-glicint kapcsolunk, és az így kapott (V) BOC-Gly-NH-CH-C₆H₄-Polimer V

6C

C₆H_S képletű vegyületről a BOC csoportot lehasítjuk, majd a C terminális felől kiindulva a hasítási és kapcsolási műveletek periodikus ismétlésével védőcsoportokkal ellátott aminosavakat kapcsolunk a megfelelő sorrendben a peptid-polimerhez, amelyről a kész pepiid lehasítását és a védőcsoportok eltávolítását hidrogén-fluoridos kezeléssel végezzük.

Az a) eljárásban a (II) képletű tetra- vagy pentapeptid-komponenst önmagában ismert módon fragmenskondenzációval vagy lépésenkénti lánchosszabbítással állíthatjuk elő azidos, vegyes'anhidrides, karbodiimides, aktív észteres vagy egyéb ismert aktiválási módszerrel. Célszerűen a H-Leu-2187 503

Arg(NO₂)-Pro-Y - amely képletben Y jelentése a fenti - tri- vagy tetrapeptidet az aminocsoportján terc-butiloxikarbonil vagy benziloxikarbonü védőcsoporttal ellátott (VI) általános képletű - amely képletben

E

Z-Asp-X VI

Z jelentése terc-butil-oxi-karbonil- vagy benziloxikarbonilcsoport, X és E jelentése a fenti - aszparaginsavszármazékokkal acilezzük, majd a kapott vegyületről a védőcsoportokat eltávolítjuk.

A b) eljárásban a (III) képletű nexapeptidet célszerűen úgy állítjuk elő, hogy a (VII) képletű amely

O-P₃

H-Asp-X VII képletben X jelentése a fenti, R₃ jelentése hidrogén, metil-, benzil- vagy terc-butil-csoport - aszparaginsav származékot a Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₃ peptapeptid-aziddal acilezzük.

A c) eljárásban alkalmazott szilárdfázisú peptidszintézis módszerek az irodalomban ismertek (J. M. Stewart: „Solid Phase Peptide Synthesis”, Freeman and Co., San Francisco, 1969.)

Az automatikusan vezérelt szilárd fázisú szintézismódszerrel (D. Coy et al., Biochemistry 13, 323 (1974), D. Coy et al., J. Med. Chem. 19,323 (1976)) számos gonadoliberinanalógot állítottak már elő; a c) eljárás abban különbözik az ismertektől, hogy

6-os aminosavként (VIII) általános képletű - ahol X jelentése a fenti, R, jelentése hidrogénatom, BOC-Asp-X VIII

I o-r₃ p-nitro-fenilcsoport vagy pentafluor-fenilcsoport aminosavszármazékot használunk. A molekula többi aminosavoldalláncának átmeneti védelmére olyan csoportokat használunk, amelyek hidrogénfluorid hatására utólag eltávolíthatók; például az argininnál és a hisztidinnél ρ-toluol-szulfonil-, a szerin és a tirozin esetében benzil-csoportokat.

A képződött nona-, illetve dekapeptidamidot kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható savval reagáltatva savaddíciós sóvá alakítjuk, vagy kívánt esetben a savaddíciós sóból bázissal reagáltatva felszabadítjuk a szabad bázist, és kívánt esetben a kapott nona-, illetve dekapeptidamidot valamilyen savval sóvá alakítjuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás az (I) általános képletű vegyületek gyógyászati kompozíciókká való előállítására. Ezt célszerűen úgy végezzük, hogy valamely (I) általános képletű vegyületet vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó és/vagy vivőanyagokkal összekeverve tabletta, drazsé, kapszula, kúp, injekciós oldat, orrpermet stb. alakban gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

Az (I) általános képletű vegyületek egy előnyös képviselője a (IX) képletű vegyület, amely androgenizált kísérleti l-1

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEA Leu-Arg-ProEA IX patkányokon nagyobb hatékonysággal váltott ki ovulációt, mint a natív LH-RH, annak ellenére, hogy LH-felszabadító hatását tekintve a (IX) képletű vegyület egy nagyságrenddel gyengébb hatást mutatott, mint a natív LH-RH.

Egy másik kísérletben a (IX) képletű vegyület 20 pg/kg mennyiségének hatására kecsege és harcsa anyahalak 80%-ban leadták az ikrájukat, míg a kontroll csoportnál, amely ugyanolyan körülmények között az irodalomban szuperaktívnak ismert D-Phe⁶, desGly¹⁰-LH-RH-etilamidot kapott, nem következett be ovuláció.

A (IX) képletű vegyület 100 pg mennyisége az inszeminálással egy időben im. adva 25-30%-kal megnövelte a szarvasmarhák vemhesülési arányát, ugyanakkor a natív LH-RH ilyen dózisban nem bizonyult hatékonynak.

A (IX) képletű vegyület egyszeri 10 pg-os mennyiségével kék- és ezüstrókák szezonon kívüli ivarzását tudtuk kiváltani, ugyanakkor a natív LH-RH ilyenkor is hatástalannak mutatkozott.

A találmány szerinti eljárással előállítható másik vegyület, a béta-Asp-alfa-anilid⁶ -LH-RH pulykakakasok ondó- és tesztoszteron termelését sokkál jobban és tartósabban fokozta, mint pl. a struktúranalóg D-Phe⁶-LHRH. Ugyanezen vegyület nőstény pulykák kotlási idejét lényegesen csökkentette, míg a natív LH-RH hatástalan volt.

A fenti példák azt bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított új gonadoliberin analógok nagy hatással vannak a gerincesek szaporodási folyamataira. Előnyös alkalmazásukat az állattenyésztésben számos kísérlet igazolta.

Az (I) általános képletű vegyületek jelentős előnye az eddig ismert nagyhatású gonadoliberin analógokkal szemben, hogy kizárólag L-konfigurációjú aminosavakból épülnek fel, ugyanakkor a biológiai kísérletekben vizsgált új származékok ovulációt kiváltó és tesztoszteront felszabadító hatása jobb volt, mint a 6-os helyzetben glicint vagy D-konfigurációjú aminosavat tartalmazó ún. szuperaktiv gonadoliberin-származékoké.

A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. A példákban a vékonyréteg-kromatográfiás R_r értékeket Kieselgel DC, Alufolien/Merck lemezeken az alábbi oldószerelegyekben határoztuk meg:

1. etilacetát-piridin-ecetsav-víz 60:20:6:11

2. etilacetát-piridin-ecetsav-víz 120:20:6:11

3. etilacetát-piridin-ecetsav-víz 240:20:6:11

4. etilacetát-piridin-ecetsav-víz 480:20:6:11

5. etilacetát-piridin-ecetsav-víz 30:20:6:11

6. aceton-klorofom 1:15

7. aceton-toluol 1:1

8. ecetsav-benzol 1:7

9. n-butanol-ecetsav-etilacetát-víz 1:1:1:1

10. n-butanol-ecetsav-víz 4:1:1

11. n-butanol-ecetsav-víz 4:1:5 (felső fázis)

12. etilacetát-piridin-ecetsav-víz 5:5:1:3

13. butanol-piridin-ecetsav-víz 60:20:6:11

Az olvadáspontokat °C-ban adjuk meg, az értékek nem korrigáltak.

-3187 503

1. példa (ilp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OMe ^-Leu-Arg-Pro-EA

a) Z-Asp-OMe L Leu-Arg(N0₂)-Pro-EA

537 mg (1 mmól) H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-EA híd- ⁵robromidsóját 10 ml dimetil-formamidban oldjuk, majd 0 °C-on 447 mg 1 mmól Z-Asp(OPFP) -OMe származékot adunk hozzá. Ezután keverés közben a reakcióelegye pH-ját trietil-aminnal 8-ra állítjuk, majd 6 óra elteltével az oldatot vákuumban bepá-¹⁰roljuk. A maradékot először éterrel, majd vízzel eldörzsöljük, szűrjük, végül metanolból éter hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, levegőn szárítjuk. így 440 mg (62%) fehér, amorf anyagot kapunk. ¹⁵

Összegképlet: C₃₂H₄₉N₉O₁₀ Moltömeg: 719,6

Op.: 182-184 °C [ag² ₌ -58,4° (c = 1, metanol)

R,(2) = 0,5; R_f (9) = 0,85; R_f (12) = 0,9 ²⁰

b) H-Asp-OMe ^-Leu-Arg-Pro-EA.2 AcOH

400 mg 0,56 mmól Z-Asp-OMe LeuArg(NO₂)-Pro-EA tetrapeptidet oldunk 20 ml²⁵50%-os ecetsavban, és 50 mg 10%-os palládiumcsontszén katalizátor jelenlétében 4 órán át hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük, az ecetsavat vákuumban eltávolítjuk, majd a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük és vákuumban szárítjuk. Hozam: 360 mg (97%).

összegképlet: C_2RH₅₂N₈O,₀ Moltömeg: 660,5

RXl) = 0,15; R,(9) = 0,6; R,(10) = 0,25;

R_f (5) = 0,45 ₃₅

I f

c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OMe L-Leu-Arg-Pro-EA

716 mg (1 mmól) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃pentapeptid-hidrazidot oldunk 20 ml dimetilformamidban majd ezt az oldatot — 10 °C-ra hűt-⁴jük, és 0,7 ml 6 n sósav oldatot, majd 75 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát adjuk hozzá. 10 percig -5 °C-on keverjük majd 660 mg (1 mmól)

I-1

H-Asp-OMe ^LLeu-Arg-Pro-EA diacetát-sóját^4bés 0,7 ml trietil-amin 5 ml dimetil-formamiddal készült lehűtött oldatát adjuk a reakcióelegyhez. Szükség esetén az oldat pH-ját trietil-aminnal 8-ra állítjuk. 1 órán át - 5 °C-on, 12 órán át 0 °C-on keverjük, majd a dimetil-formamidot vákuumban⁵⁰eltávolítjuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, ezután 0,2 N ecetsavban Sephadex G-25 oszlopon frakcionáljuk. A főterméket tartalmazó frakciókat középnyomású fordított fázisú Ci₈(Whatman, LRP-1) szilikagél oszlopon 30% vizes⁵⁵metanolban kromatografáljuk, majd a tiszta frakciókat llofilizáljuk. Hozam: 712 mg (58%).

összegképlet: C₅₈H₈₀Ni₆O₁₄ Móltömeg: 1225 [ag² = -53,4° (c = 1, víz) θθ

RX5) = 0,5; R^IO) = 0,15; R/9) = 0,7

Aminosavanalízis: Glu: 1,02; His: 0,97; Ser: 0,95; Tyr: 1,01; Asp: 1,07; Leu: 1,00; Pro: 0,93;

2. példa

Glp-His- Trp-Ser- Tyr-Asp-DEA ^-Leu-Arg-Pro-EA a) Boc-Asp-(OBzl)-DEA

3,23 g (10 mmol) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilésztert oldunk 100 ml 0 °C-os dimetil-formamidban. Az oldathoz 1,35 g (10 mmol) N-hidroxi-benztriazolt és 2,26 g (11 mmol) diciklohexil-karbodiimidet adunk. Í5 percen keresztül 0 °C-on keverjük majd lassan 1,0 ml (9,73 g; 10 mmol) dietil-amin 20 ml etil-acetátban készült oldatát csepegtetjük a kevert reakcióelegyhez. Ezután 30 percig még 0 °C-on, majd 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált csapadékot kiszűrjük, az anyalúgot bepárlás után etil-acetátban felvesszük és 10%-os hideg citromsav oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és telített nátrium-klorid oldattal ismételten kirázzuk. Az etil-acetátos fázist vízmentes nátrium-szulfáton megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. 3,6 g (95%) halványsárga olajat kapunk.

Összegképlet: C₂₀H₃₀N₂O₅ Móltömeg: 378,2 [ag^{2 =} ~ 58,4° (c = 1, metanol)

R/4) = 0,95; R/6) = 0,95; R/7) = 0,75

b) BOC-Asp-DEA

3.8 g (10 mmol) terc.-butiloxi-karbonil-aszpartilbéta-benzilészter-alfa-dietil-amidot oldunk 50 ml metanolban, és 300 mg 10%-os palládium-csontszén katalizátor jelenlétében 2 órán keresztül hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után az oldatot bepároljuk és exszikkátorban szárítjuk. így 2,8 g (100%) halványsárga habos anyagot kapunk.

Összegképlet: C]₃H₂₅N₂O₅ Móltömeg: 289,1 [ag² = -60,1° (c = 1, metanol)

RX4) = 0,7; R/6) = 0,9; R/8) = 0,8

c) BOC-Asp (OPFP)-DEA

2.9 g (10 mmol) terc-butiloxi-karbonil-aszparaginsav-alfa-dietil-amidot oldunk 100 ml 0 °C-os etil-acetátban keverés közben, majd 1,84 g (10 mmol) pentafluor-fenolt és 2,26 g (11 mmol) diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet 30 percig 0 °C-on, majd 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált csapadék kiszűrése után az etil-acetátos oldatot bepároljuk, a maradékot petroléterben felvesszük, a kivált csapadékot ismét kiszűrjük és az oldatot bepároljuk. Szárítás után 4,4 g (99%) színtelen olajat kapunk.

Összegképlet: C₁₉H₂₄N₂O_SF₅ Móltömeg: 455,1 [a]^{22 =} “75,0° (c = 1, metanol)

R/8) = 0,95; R/6) = 0,9; R/4) = 0,75;

RK7) = 0,8

d) BOC-Asp-DEA Leu-Arg (NO₂)-Pro-EA

536 g (1 mmol) H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-etil-amid hidrobromid-sóját oldjuk 5 ml dimetil-formamidban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, 0,14 ml (1 mmol) trietil-amint adunk hozzá, majd 453 mg (l mmol) terc-butil-oxi-karbonil-aszpartil-alfa-dietil-amidbéta-pentafluor-fenilésztert adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 5 órán át keverjük, miközben a pH-t trietil-aminnal időnként semlegesre állítjuk. A reakcióeiegy bepárlása után a visz-41 . 187 503 szamaradé anyagot éterrel eldörzsöljük, majd szűrjük. Az így kapott kb. 780 mg nyers terméket szilikagél oszlopon 4:1:1 arányú butanol-ecetsav-viz elegyben kromatográfiásan tisztítjuk. A megfelelő frakciókat begyűjtjük, vákuumban szárazra párol- ⁵juk, majd a maradék éteres eldörzsölésével 470 mg (64%) fehér port kapunk.

összegképlet: C₃₂H₅₇N₁₀O₉ Móltömeg: 725,6 [a]²² = -77,2° (c = =1, metanol) _1θ

Op. = 132-133 ’C

R/2) = 0,4; R/9) = 0,85; R,(10) = 0,55

1e) BOC-Asp-DEA

Leu-Arg-Pro-EA. AcOH

730 mg (1 mmol) BOC-Asp-DEA -LeuArg(NO₂)-Pro-EA tetrapeptidet oldunk 20 ml 50%-os ecetsavban, és 100 mg 10% palládiumcsontszén katalizátor jelenlétében 3 órán keresztül hidrogénezzük. A reakeióelegy bepárlása után kromatográfiásan egységes olajos termékhez jutunk.

összegképlet: C₃₄H₆₃N₉O₉ Móltömeg: 741,6

R/2) = 0,05 Rf(9) = 0,65; R/l) = 0,6

f) H-Asp-DEA L-Leu-Arg-Pro-EA. 2TFA 25

740 mg (1 mmol) BOC-Asp-DEA Leu-ArgPro-EA tetrapeptidet oldunk 10 ml trifluor-ecetsavban, és 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradé-30 kot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, majd lúg felett szárítjuk. így 780 mg (96%) gyengén higroszkópos anyagot kapunk.

Összegképlet: C₃₁H₅₃O₉N₉F₆ Móltömeg: 809,2 [a]²² ~ ”40,6° (c = 1, víz) ³⁵

R,(l 1) = 0,2; R/5) = 0,4

g) Glp-His-Trp-Ser- Tyr-Asp-DEA ^-Leu-ArgPro-EA. 2 AcOH ^;o

286 mg (0,4 mmol) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃penta-peptid-hidrazidot oldunk 25 ml dimetilformamidban. Az oldatot - 10 °C-ra hűtjük, és keverjük közben 0,27 ml 6 n sósavat, majd 30,2 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát csepegtetjük 45 hozzá. 5 perc elteltével hozzáadjuk 353 mg

1 (0,4 mmól) H-Asp-DEA '-Leu-Arg-Pro-EA tetrapeptid trifluoracetát-sójának 1 ml dimetil-formamidban 0,27 ml trietil-aminnal készült - 10 ’C-os50 oldatát. A reakcióelegyet szükség esetén trietilaminnal semlegesre állítjuk, majd 1 órán át -5 ’C-on, 1 órán át 0 ’C-on, 12 órán át szobahőmérsékleten keverjük.

A dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk, 55 a maradékot szilikagél oszlopon 30 : 20 : 6 : 11 arányú etilacetát-piridin-ecetsav-víz eleggyel kromatografáljuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk, éterrel eldörzsöljük, szűrjük és szárítjuk. így 290 mg (50%) fehét port ka-60 púnk.

összegképlet: C₆₅H₉₅N₁₇Oi₇ Móltömeg: 1385

Op.: 180-181 ’C [ag² = ”⁶⁴>²° (c = L metanol)

R/12) = 0,85; R,(5) = 0,35; R/ll) = 0,25 Aminosavanalízis: Asp: 1,0; Ser: 0,99; Glu: 1,01;

Lcu: 1,10; Tyr: 1,00; His: 0,92; Arg: 0,98;

3. példa

Glp-His-Trp-Ser- Tyr-Asp-NH₂ ^~Leu-A rg-ProGly-NH₂

a) BOC-Asp(OBzl)-OPFP

3,23 g (10 mmol) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzil-észtert oldunk 50 ml etilacetátban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben 1,84 g (10 mmol) pentafluor-fenolt és 2,26 g (11 mmol) diciklo-hexil-karbodiimidet adunk hozzá. 30 percen át 0 °C-on, majd 12 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Szűrés után az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot 15 ml éterben oldjuk, és 15 ml petroléter hozzáadásával -20 °C^Lon kristályosítjuk. Hozam: 3,75 g (70%).

Összegképlet: C₂₂H₂₀N₁O₆F₅ Móltömeg: 489,3

Op.: 84 ’C [ag² =| - 18,1 (c = 1, etil-acetát)

R_r(7) = 0,9; R_f(4) = 0,95

b) BOC-Asp (OBzl)-NH₂

970 mg (2 mmól) terc-butil-oxi-karbonif-aszparaginsav-béta-benzilészter-alfa-pentafluor-fenilészter 10 ml metanolos oldatához 10 ml 0 ’C-on ammóniával telített metanolt adunk, és 30 percen keresztül 0 ’C-on keverjük. Ezután az oldószert vákuumban bepároljuk, a maradékot metanol és éter elegyéből kristályosítjuk.

Összegképlet: C₁₆H₂₂N₂O₅ Móltömeg: 322,1

Elm.: C 59,62%; H 6,83%; N 8,69%;

Talált: C 59,2%; H 6,98%; N 8,8%.

Op.: 159-161 ’C [ag² = + 1,1 ° (c = 1, metanol)

R/7) = 0,5; R^8) = 0,75; R,(4) = 0,9;

R/6) = 0,95

c) BOC-Asp-NH₂

480 mg (1,5 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilészter-alfa-amidot 10 ml metanolban oldunk, és 1 órán át 50 mg 10%-os palládium-csontszén katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot vizes etanolban kristályosítjuk. Hozam: 246 mg (93%).

Összegképlet: C₉H₁₆N₂O₅ Móltömeg: 232,2

Op.: 145-146 ’C

ÍoJd² ~ ” 2,2° (c = 1 metanol)

RX7) = 0,05; R,(8) = 0,2; R,(4) = 0,3;

Rf<6) = 0,1

d) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-NH ₂ Ll_cu_

Arg-Pro-Gly-NH₂

A peptid szilárd fázison történő szintézisét, a polimerről való hidrogén-fluoridos hasítást, valamint a nyers peptid kromatográfiás tisztítását a 4. példa c) pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy 6-os számú aminosavként a 3. példa c) pontja szerint előállított vegyületet használjuk. Végül 72 mg (12%) tiszta anyagot kapunk.

-5187 503

Összegképlet: C₅₇H₇₉N_I8O₁₄ Móltömeg: 1239 [a]²² =-55,5’(c = 1, víz)

R,(5) = 0,35; R,(ll) = 0,15; R/9) = 0,65; _c

R,(I3) = 0,15 ⁵

Aminosavanalízis: Glu: 0,96; His: 1,04; Ser: 0,93; Tyr: 1,02; Leu: 1,02; Pro: 0,94; Gly: 1,00; Asp: 1,1.

4. példa

GIp-His-Trp-Ser- Tyr-Asp-FBA ^Leu-Arg-ProGly-NH₂

a) BOC-Asp(OBzl)-a-[2-(4-klór-fenil)-izobutil- ¹5 amid] g (15 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilésztert 100 ml etil-acetátban oldunk, 0 °C-ra hűtjük, és 2,1 g N-hidroxi-benztriazolt, 3,75 g diciklohexil-karbodiimidet és 3,5 g2-(4- ²⁰klór-fenil)-izobutil-amin 20 ml dimetil-formamidban készült oldatát adjuk a kevert reakcióelegyhez.

Az elegyet 12 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldatot megszűrjük. Az etil-acetátos oldatot 10%-os citromsav oldattal, telített nátrium- 25 hidrogén-karbonát oldattal, majd telített nátriumklorid oldattal kirázzuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és vákuumban bepároljuk.

A maradék színtelen olaj lassan kristályosodik.

A kristályokat éter és petroléter elegyével mossuk, 30 majd szárítjuk. Hozam: 5,5 g (75%).

Összegképlet: C₂₆H₃₃N₂O₅C1 Móltömeg: 488,2

Op.: 60-61 ’C [a]²² = -12,2’ (c = 1, metanol)

R/7) = 0,75; R,(8) = 0,6

b) BOC-Asp-FBA

2,3 g (4,7 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilészter-a-[2-(4-klór-fenil)-izobutil-amid] 30 ml metanolos oldatát 200 mg 10%-os ⁴⁰palládium-csontszén katalizátor jelenlétében 2 órán keresztül hidrogénezzük, majd a katalizátort kiszűrjük, és az oldószert vákuumban bepároljuk.

A maradékot éterben eldörzsöljük, és metanolból éterrel kristályosítjuk. ⁴⁵

Hozam: 1,5 g (87%).

Összegképlet: Ci₉H₂₈N₂O₅ Móltömeg: 364,2 elm.: C 62,63; H 7,69; talált: C 62,3; H 7,58.

Op.: = 94-96 ’C ⁵⁰ [a]§² - -19° (c = 1 metanol)

R_f (3) = 0,2; R_f (2) = 0,3; R_f (7) = 0,15; R_f(8) = 0,8; Rf(10) = 0,15

c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-FB A ^-Leu-ArgPro-Gly-NH₂ g (0,5 mmól) benzhidril-amin polimert automatikus peptidszintetizátor (Beckman 990B) reakcióedényébe helyezünk, és 4 órán keresztül 30 ml di-θθ klór-metánban kevertetjük. A védett aminosavszármazékokat a megfelelő sorrendben a következő (1-10) lépések ciklikus ismétlésével kapcsoljuk a polimerhez.

1. mosás 30 ml diklórmetánnal 3x3 perc

2. mosás 30 ml trifluor-ecetsav és diklór-metán 1 : 2 arányú elegyével 5 és 25 perc

3. mosás 30 ml diklór-metánnal 3x3 perc

4. mosás 30 ml etanollal 3x3 perc

5. mosás 30 ml kloroformmal 3x3 perc

6. mosás 30 ml trietil-amin és kloroform 1:9 arányú elegyével 2x10 perc

7. mosás 30 ml kloroformmal 3x3 perc.

8. mosás 30 ml diklór-metánnal 3x3 perc

9. 1,5 mmól BOC-aminosavszármazék és

1,5 mmól diizopropil-karbodiimid inkubálása 30 ml diklór-metánban 120 perc

10. mosás 30 ml diklór-metánnal 3x3 perc

A védett aminosavszármazékok a következők: BOC-Gly-OH, BOC-Pro-OH, BOC-Arg(Tos)-OH, BOC-Leu-OH, BOC-Asp-FBA, BOC-Tyr(Bzl)OH, BOC-Ser(Bzl)-OH, BOC-Trp-OH, BOCHis(Tos)-OH és Glp.

Az összes aminosav kapcsolása után a kész peptidpolimer gyantát vákuumban megszárítjuk, és 50 ml cseppfolyós hidrogén-fluoriddal 6 ml anizol jelenlétében 45 percen át 0 °C-on keverjük. A hidrogén-fluoridot vízmentes nitrogén gázáramban eltávolítjuk, a maradékot éterrel kicsapjuk és szűrjük. A kiszűrt anyagot 50%-os ecetsavban szuszpendáljuk, szűrjük, majd a szürletet vákuumban bepároljuk. A maradékot 50%-os ecetsavoldatban Sephadex G-25 oszlopon engedjük át. A tiszta főfrakciót szilikagél oszlopon a 10. oldószereleggyel kromatografáljuk. A tiszta anyagot tartalmazó frakciókat bepároljuk és liofilizáljuk. Hozam: 70 mg.(10%).

Összegképlet: C₆₇H₉₁N₁₈O₁₄ Móltömeg: 1371 [a]²² = -56,4 “C (c = 1, víz)

R_r (13) = 0,25; R_r (9) = 0,7; R_r (11) = 0,2; R_f (5) = 0,5

Aminosavanalízis: Glu: 0,97; His: 1,05; Ser: 0,94; Tyr: 1,02; Asp: 1,02; Leu: 1,01; Pro: 0,95; Gly: 1,00

5. példa

Glp-His- Trp-Ser- Tyr-Asp-CBA ^-Leu-Arg-ProGly-NH₂

a) BOC-Asp(OBzl)-CBA

A 3. példa a) pontja szerint előállított 2,4 g (5 mmól) terc.-butil-oxi-karbonil-aszparaginsavbéta-benzilészter-alfa-pentafluor-fenilésztert oldunk 20 ml etil-acetátban, 0 ’C-ra hütjük, és 0,42 ml (5 mmól) ciklobutil-amin 2 ml etil-acetáttal készült lehűtött oldatát csepegtetjük hozzá'. Ezután a reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 10%-os citromsav oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és telített nátriumklorid oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, és vákuumban bepároljuk. A maradékot éterből petroléterrel kristályosítjuk. Hozam: 1,16 g (89%).

Összegképlet: C₂₀H₂₈N₂O₅ Móltömeg: 376.2

Op.: 84-86 ’C [a]p² = -5,7° (c = 1, metanol)

-6187 503

R_f (8) = 0,9; R_f (10) = 0,9; R_f (7) = 0,75; R_r(11) = 0,95

b) BOC-Asp-CBA g (2,65 mmól) terc-butil-oxi-karboníl-aszpara- 5 ginsav-béta-benziíészter-alfa-ciklobutil-amidot oldunk 20 ml metanolban, és 100 mg 10%-os palládium-csontszén katalizátor jelenlétében 2 órán keresztül hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után az oldatot vákuumban bepároljuk, és a maradékot 10 vizes etanolból kristályosítjuk. Hozam: 600 mg (79%).

Összegképlet: C₁₃H₃₂N₂O₅ Móltömeg: 286,1 elm.: C 54,54; H 7,69; talált: C 53,9; H 7,68.

Op.: 149-150 ’C [a]p² = 1, metanol)

R_f (8) = 0,2; R_f (10) = 0,75; R_f (7) = 0,05

c) Glp-His- Trp-Ser- Tyr-Asp-CBA ^Leu-A rgPro-Gly-NIf

A peptid szilárd fázisú szintézisét és a polimerről történő hidrogén-fluoridos hasítást, valamint a nyers peptid kromatográfiás tisztítását a 4. példa c) 25 pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy 6-os számú aminosavként az 5. példa b) pontja szerint előállított vegyületet használjuk. így 68 mg (10,5%) tiszta pepiidet kapunk.

Összegképlet: C₆₁H₈₅Ni₈O₁₄ Móltömeg: 129130 [a]²² = ^_44>⁸⁸ (c = 1, víz)

R_f (11) = 0,2; R_r (9) = 0,7; R_f (13) = 0,2 R_f(5) = 0,4

Aminosavanalízis: Glu: 10,5; His: 0,96; Ser: 0,94; Tyr: 0,98; Asp: 1,07; Leu: 1,02: Pro: 0,96; Gly: l,00³⁵

6. példa

1-r ⁴θ

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR fiLeu-Arg-ProGly-NH₂

a) BOC-Asp(OBzl)-PIR

3,2 g (10 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszpara-₄₅ginsav-béta-benzilésztert oldunk 5 ml etil-acetátban, és 0 °C-on 1,35 g N-hidroxi-benztriazolt, 2,26 g diciklohexil-karbodiimidet és 0,8 ml pirrolidin 2 ml etil-acetátos oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten ke- _5Qverjük, majd 10%-os citromsav oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és telített nátrium-klorid oldattal kirázzuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot éterben oldjuk,₅g szűrjük és ismét bepároljuk. így 3,4 g (90%) olajat kapunk.

összegképlet: C₂₀H₂₈N₂O₅ Móltömeg: 376,2

Wd² = ^_84,4° (c — 1, metanol)

R_f (7) = 0,75; R_f (4) = 0,95; R_f (8) = 0,85; R_f60 (6) = 0,8

b) BOC-Asp-PIR g (8 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilészter-alfa-pirrolidin 30 ml méta-θ^ no Hal készült oldatát 250 mg 10%-os palládiumcsontszén katalizátor'jelenlétében 2 órán keresztül hidrogénezzük, majd a katalizátort kiszűrjük, és az oldatot bepároljuk. A maradék olajat kénsav felett szárítjuk. Hozam: 2,1 g (92%).

összegképlet: C₁₃H₂₂N₂O₅ Móltömeg: 286,2

Op.: 124-125 ’C [a]²² _ -39,9° (c = 1, metanol)

R_f (8) = 0,3; R_f (7) = 0,2

c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR^-Leu-Arg-ProGly-NH₂

A peptid szilárd fázisú szintézisét, a polimerről történő hidrogén-fluoridos hasítást, valamint a nyers peptid kromatográfiás tisztítását a 4. példa c) pontja szerint végezzük el, azzal a különbséggel, hogy 6-os aminosavként a 6. példa b) pontja szerint előállított vegyületet használjuk. így 78 mg (12%) 20 tiszta peptidet kapunk.

összegképlet: C₆iH₈₅N₁₈O₁₄ Móltömeg: 1293 [a]²² = -53,2 (c = 1, víz)

Rf (13) = 0,15; R_f (9) = 0,6; R_f (11) = 0,2; R_f(5) = 0,4

Aminosavanalízis: Glu: 0,97; His: 1,01; Ser: 0,94; Tyr: 1,03; Asp: 1,05; Leu. 1,00; Pro: 0,94

7. példa

Glp-His- Trp-Ser- Tyr-Asp-IND '^-Leu-Arg-Pro-EA

a) BOC-Asp(OBzl)-IND

3,23 g (10 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilésztert oldunk 50 ml etilacetátban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben 2,3 g diciklohexil-karbodiimidet és 1,19 g indolint adunk hozzá. A reakcióelegyet éjjelen át szobahőmérsékleten hagyjuk keveredni; másnap szűrjük, a szűrletet háromszor 10% citromsavval, háromszor telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és háromszor telített nátrium-klorid oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd bepároljuk. A visszamaradó olajat etanolból vízzel kristályosítjuk.

Hozam: 3,7 g (89%).

Összegképlet: C₂₄H₂₈N₂O₅ Móltömeg: 424,1

Op.: 75-76 ’C [α]θ² = - 70,9° (c = 1, etanol)

R_f(7) = 0,9.

b) H-Asp(OBzl)-IND.TFA

800 mg (1,9 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilészter-alfa-indolint oldunk 5 ml trifluor-ecetsavban, és 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A trifluor-ecetsavat vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, szárítjuk, majd etanolból éterrel kristályosítjuk. Hozam: 780 mg (94%).

összegképlet: C₂₄H₂₁N₂O₅F₃ Móltömeg: 438,1

Op.: 114-115 ’C [α]θ² = -5,8’ (c = 1, metanol)

-7187 503

R_f (7) = 0,2; R_r (4) = 0,65

c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp(OBzl)-IND

716 mg (1 mmól) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃pentapeptid-hidrazidot oldunk 10 ml dimetilformamidban. Az oldatot - 10 ’C-ra hűtjük, majd 0,7 ml 6 n sósavat és 75 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet 10 percen át - 5 °C-on keverjük, majd 438 mg (1 mmól) H-Asp(OBzl)-indolid trifluoracetát-sójának 0,7 ml trietil-aminnal és 2 m, dimetil-formamiddal készült oldatát adjuk hozzá. Szükség esetén a pH-t trietilaminnal 8-ra állítjuk. Az elegyet 1 órán át - 5 °C-on, 12 órán át 0 ’C-on keverjük. A dimetilformamidot vákuumban eltávolítjuk, a maradékot vízzel eldörzsöljük, szűrjük, etanollal és etil-acetáttal mossuk, majd dimetil-formamidban oldjuk, forrón csontszenezzük, és éter hozzáadásával kristályosítjuk. Hozam; 600 mg (60%).

Összegképlet; C_J3H₅₆N₁₀OiiMóltömeg; 1008,9

Op.: 172-174 ’C

R_f (9) = 0,7; R_f (10) = 0,4; R_f (1) = 0,35

d) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND

500 mg (0,5 mmól) Glp-His-Trp-Ser-TyrAsp(OBzl)-IND hexapeptid 0,5 ml dimetil-formamiddal és 30 ml 50%-os ecetsavoldattal készült oldatát 50 mg 10%-os palládium-csontszén katalizátor jelenlétében 2 órán keresztül hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a maradékot dimetil-formamidból éterrel kristályosítjuk. Hozam: 380 mg (83%).

Összegképlet: ϋ₄₆Η5₀Ν,₀Ο_η Móltömeg: 918,9

Op.: 219-221 ’C [a]p² = -37,7’ (c = 1, dimetil-formamid)

R_f (9) = 0,6; R_f (10) = 0,4; R_f (1) - 0,1

e) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND ^-Leu-Arg-Pro-EA mg (0,044 mmól) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-AspIND hexapeptid 1 ml dimetil-formamiddal készült oldatát 0 ’C-ra hűtjük, majd 7,8 μΐ diizopropilkarbodiimidet adunk hozzá, és keverjük, 10 perc elteltével 20 mg (0,044 mmól) H-Leu-Arg-Pro-EA hídroklorid trietil-aminnal semlegesített dimetilformamidos oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet 12 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldószert vákuumban bepároljuk. A maradékot Sephadex G-25 oszlopon 0,2 n ecetsavban kromatografáljuk. A főterméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. Hozam: 28 mg (48%).

összegképlet: C₆₅H₈₅N₁₇O₁₃ Móltömeg: 1311 [a]²² = 39,6’ (c = 0,25, 25%-os ecetsav)

R_f (13) = ΌΓΛ (9) = 0,75; R_f (5) = 0,7; R_f(10) = 0,5

8. példa

Glp-His- Trp-Ser- Tyr-Asp-ANI \-Leu-Arg~Pro-Gly-NH₂

a) BOC-Asp(OBzl)-ANI

3,23 g (10 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilésztert 50 ml etil-acetátban oldunk, 0 ’C-ra hűtjük, és 0,96 g anilint és 2,26 g diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. 6 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldatot szűrjük, az etil-acetátos oldatot 10%-os citromsav oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és telített nátrium-kiorid oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A bepárlás során kapott kristályokat petroléterrel eldörzsöljük, szűrjük és szárítjuk. Hozam: 4 g (96%).

összegképlet: C₂₂H₂₆N₂O₅ Móltömeg: 398,3

Op.: 105-106 ’C [a]²² = — 6° (c = 1, dimetil-formamid)

R_f (11) = 0,8; R_f (12) = 0,95; R_f (8) = 0,4

b) BOC-Asp-ANI g terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-bétabenzilészter-alfa-adnilid származékot 20 ml metanolban oldunk, és 300 mg 10%-os palládium-csontszén katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Ezután a katalizátort kiszűrjük, az oldószert vákuumban bepároljuk, és a maradékot etanolból vízzel kristályosítjuk. Hozam: 2,05 g (88%).

összegképlet: C₁₅H₂₀N₂O₅ Móltömeg: 308,2 elm.: C 58,44; H 6,49; talált: C 58,6; H 6,56 Op.: 157-158 ’C [a]²² = -12’ (c = 1, dimetil-formamid)

R_f (11) = 0,7; R_f (12) = 0,85; R_r (8) = 0,05

c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-ANI ^-Leu-Arg-Pro-GlyNH₁

A peptid szilárd fázisú szintézisét, a polimerről való hidrogén-fluoridos hasítást, valamint a nyers peptid kromatográfiás tisztítását a 4. példa c) pontja szerint végezzük el azzal a különbséggel, hogy 6-os számú aminosavként a 8. példa b) lépése szerint előállított vegyületet használjuk. így 82 mg (12,5%) tiszta terméket kaptunk.

Összegképlet: C₆₃H₈₃N₁₈Oi₄ Móltömeg: 1315 [a]²² = -58,3’ (c = 1, víz)

R_f (9) = 0,5; R_f (10) = 0,2; R_f (12) = 0,8

Aminosavanalízis: NH₃: 1,23; Arg: 0,95; Asp: 1,1; Glu: 1,08; Pro: 1,01; Gly: 1,00; Leu: 1,1; Tyr: 0,85; Ser: 0,99

9. példa

Glp-His- Trp-Ser- Tyr-Asp-OBzl ^-Leü-Arg-Pro-EA

a) BOC-Asp(OPFP)-OBzl

0,8 g (2,5 mmól) terc-butil-oxi-karboríil-aszparaginsav-a-benzilésztert oldunk 5 ml dimetil-formamidban, 0 ’C-ra hűtjük az oldatot és keverés közben 0,45 g (2,5 mmól) pentafluor-fenolt és 0,52 g (2,5 mmól) diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet 60 percig 0 ’C-on majd 24 órán át 20 ’C-on keverjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot éterben oldjuk, a kivált csapadékot kiszűrjük, és a szűrletet ismét bepároljuk. A visszamaradó olajat éter-petroléter oldószerelegyből —20 ’C-on kristályosítjuk. Hozam: 960 mg (80%).

-8187 503

Összegképlet: C₂₂H₂₁NO₆F₅ Móltömeg: 490,1

Op.: = 78-79 ’C

R_f (3) = 0,8 r--.

b) BOC-Asp-OBzl ^LLeu-Arg-Pro-EA mg (0,1 mmól) H-Leu-Arg-Pro-EA dihidrokloridsóját oldjuk 1 ml dimetil-formamidban. Az oldatot 0 ’C-ra hűtjük, 14 μΐ (0,1 mmól trietil-amint adunk hozzá, majd 50 mg 0,1 mmól) terc-butil-oxikarbonil-aszparaginsav-a-benzilészter-p-pentafluor-fenilésztert adunk hozzá 1 ml dimetil-formamidban oldva. A reakcióelegyet 60 percig 0 ’C-on, majd egy éjszakán át 20 ‘C-on keverjük. A reakcióelegy bepárlása után a visszamaradó anyagot szilikagél oszlopon 90 : 20 : 6 : 11 térfogat arányú etilacetát-piridin-ecetsav-víz elegyben kromatografáljuk. A megfelelő frakciókat begyűjtjük, vákuumban szárazra pároljuk, majd a maradékot éterrel eldörzsöljük, fehér amorf anyagot kapunk. Hozam: 35 mg (50%).

összegképlet: C₃₅H₅₆N₈O₈ Móltömeg: 716

Op.: = 124-125 ’C

R_r (1) = 0,52; R_r (9) = 0,74

c) Η-Asp-OBzl ^-Leu-Arg-Pro-EA. 2 TFA mg (0,1 mmól) BOC-Asp-OBzl ^-LeuArgPro-EA tetrapeptidet oldunk 1 ml trifluor-ecetsavban és 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk, ezt háromszor megismételjük. Majd lúg felett szárítjuk. így 65 mg (77%) enyhén higroszkópos anyagot kapunk.

összegképlet: C₃₄H₅₀N₈O₁₆F₆ Móltömeg: 844

Op.: 114-116’C [a]^{22 =} ~47° (c = 1, metilalkohol)

R_f (1) = 0,24; R_f (9) = 0,60

d) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OBzl ^-Leu-ArgPro-EA. 2 AcOH

214 mg (0,28 mmól) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃pentapeptid-hidrazidot oldunk 5 ml dimetil-formamidban. Az oldatot — 10 ’C-ra hűtjük és 0,2 ml 6 n sósav oldatot, majd 21 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát adjuk hozzá. 15 percig —10 -15 ’C-on keverjük, majd 230 mg (0,28 mffiól) i-1

Η-Asp-OBzl ^LLeu-Arg-Pro-EA di-trifluoracetátsóját és 0,16 ml trietil-amin 2 ml dimetil-formamiddal készült lehűtött oldatát adjuk a reakcióelegyhez. 1 órán át - 5 ’C-on, 12 órán át 0 ’C-on keverjük, majd a dimetilformamidot vákuumban eltávolítjuk. A maradékot 10%-os ecetsavban Sephadex G-25 oszlopon frakcionáljuk. A főterméket tartalmazó frakciókat szilikagél oszlopon 90 : 20 : 6 : 24 térfogatarányú butanol-piridin-ecetsav-víz oldószerelegyben kromatografáljuk, majd a tiszta frakciókat bepároljuk, éterrel eldörzsöljük, szűrjük és deszt. vízből liofilizáljuk. Hozam: 200 mg (55%).

összegképlet: C₆₄H₈₄N₁₆O₁₄ Móltömeg: 1301

R_f (5) = 0,60

Aminosavanalízis: Glu: 0,98; His: 1,00; Ser: 0,95; Tyr: 1,03; Asp: 0,96; Leu: 1,02; Pro: 0,95; Arg: 1,02.

10. példa

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-EA Leu-A rg-Pro-Gyl-NH₂

a) BOC-Asp(OBzl)-EA

3,23 g (10 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-aszparaginsav-béta-benzilésztert oldunk 100 ml dimetilformamidban. Az oldatot 0 ’C-ra hütjük, keverjük és 1,35 mg (10 mmol) N-hidroxibenztriazolt és 2,26 g (11 mmol) diciklohexil-karbodimidet adunk hozzá. 15 percig 0 ’C-on keverjük a reakcióelegyet, majd lassan 0,45 g (10 mmól) etil-amin 1 ml dimetil-formamidban készült és lehűtött oldatát csepegtetjük hozzá. Ezután 1 órát még 0 ’C-on, majd 12 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált csapadékot kiszűrjük, az anyalúgot bepároljuk. A maradékot etilacetátban oldjuk és 10%-os hideg citromsav oldattal, telített nátrium-hidrogénkarbonát oldattal és telített nátrium-klorid oldattal ismételten kirázzuk. Az etilacetátos fázist vízmentes nátriumszulfáton megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot éter-petroléter elegyéből -20 ’C-on kristályosítjuk. így 2 g (60%) fehér port kapunk.

összegképlet: C₁₈H₂₆N₂O₅ Moltömeg: 350,2 [a]“ = -3,7’ (c = 1, metanol)

Op.: 57-60 ’C

R_f (7) = 0,77.

b) BOC-Asp-EA

1,75 g (5 mmol) terc-butil-oxi-karbonil-aszpartilbéta-benzilészter-alfa-etilamidot 25 ml metanolban oldunk és 175 mg 10%-os palládium-csontszén katalizátorjelenlétében 4 órán keresztül hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük és az oldatot vákuumban bepároljuk, majd exszikkátorban szárítjuk. így 1,25 g (98%) halványsárga olajat kapunk.

Összegképlet: CjjH^NjOs Moltömeg: 261.1

Md² = ~⁶’²° (^c = b metanol)

R_r (2) = 0,47; R_f (7) = 0,1; R_f (8) = 0.47; R, (6) = 0,1

c) Glp-His-Trp-Ser- Tyr-A sp-EA ''~Lcu - .4 rg -Pro~Gly-NH₂

A peptid szilárd fázison történő szintézisét, a polimerről való hidrogén-fluoridos hasítást, valamint a nyers peptid kromatográfiás tisztítást ,·. 4 példa c) pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy 6-os számú aminosavként a 10. példa b) pontja szerint előállított vegyületet használjuk. 85 mg tiszta anyagot kapunk (13%).

Összegképlet: C₅₉H₈₃N₁₈O₁₄ Moltömeg: 12o7 [a]^{22 = 50}>³° (^{c =} C ^víz)

Op.: 175-177 ’C

R_r (5) = 0,35; R_f (11) = 0,2; R,(9) = 0.65; K. (13) = 0,15

Aminosavanalízis: Asp: 0.9S; Ser 0 9T (P..· 1,05; Leu: 1,00; Tyr: 0,98; His: 1,09; Arg: 0,95.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az (I) általános képletű gonadoliberinanalógok - Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X ^LeuArg-Pro-Y I ahol

X egy —O—R vagy egy —NR’R² általános képletű csoport, amelyben

R benzil- vagy egy 1-4 szénatomos alkil-csoportót és

R¹ és R² egymástól függetlenül hidrogénatomot,

1-5 szénatomos alkil-, fenil-, fenil-(l—4 szénatomos)-alkil-, 1 -indolinil- vagy 3-6 szénatomos cikloalkil-csoportot jelent, vagy ¹⁵

R¹ és R² 3—4 szénatomos alkilcsoportot jelentenek, melyek a nitrogén atommal együtt gyűrűt képeznek, és

Y glicin-amid- vagy egy 1-4 szénatomos alkilamino-csoport- ²⁰ és savaddieiós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) az (I) általános képletnek megfelelő, kívánt esetben védett aminosavakat vagy peptid-fragmenseket a megfelelő sorrendben kondenzáljuk és a ²⁵védőcsoportokat adott esetben lehasítjuk, vagy

b) Y helyén glicin-amidot és X helyén egy — NR’R² általános képletű amino-csoportot ahol R¹ és R² jelentése a fenti - tartalmazó (I) általános képletű gonadoliberin-analógok előállítá- 30 sára benzhidril-amino-csoportokat és 1-3%, előnyösen 2% keresztkötést tartalmazó polisztiroldivinil-benzol gyantához BOC-glicint kapcsolunk, a kapott gyantáról a BOC védőcsoportot lehasítjuk, majd a C-terminális felől kiindulva a kapcsolá- ³⁵si és az N-terminális védőcsoport lehasítási lépések periodikus ismétlésével, védett aminosavak felhasználásával lépésenként ráépítjük a gyantára az (I) általános képletnek megfelelő aminosav-láncot ahol az egyes aminosav-egységek adott esetben védőcsoportokat hordozhatnak - majd a gyantáról ⁵ hidrogénfluoriddal lehasítjuk az adott esetben védőcsoportot tartalmazó (I) általános képletű gonadoliberin-analógot, és adott esetben a kapott védett gonadoliberin-analógokról a védőcsoportokat ammonolízissel lehasítjuk és kívánt esetben az a, vagy b, eljárással kapott gonadoliberin-analógokat savaddiciós sóikká alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerint a) eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy peptid-fragmensekként egy kívánt esetben védett (III) általános képletű hexapeptid-származékot - ahol X jelentése az 1. igénypont tárgyi körébe megadott és E hidroxil- azid-, Ν-szukciniomid-oxi-, vagy egy adott esetben nitro-csoporttal vagy egy vagy több halogénatommal helyettesített fenoxi-csoportot jelentés egy kívánt esetben védett (IV) általános képletű tri- vagy tetrapeptidet - ahol Y jelentése az 1. igénypont tárgyi körébe megadott - alkalmazunk.

E

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp—X III

H-Leu-Arg-Pro-Y IV
3. Az 1. igénypont szerint a) eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy peptid-fragmensekként a kívánt esetben védett (V) képletű pentapeptidazidot és egy kívánt esetben védett (VI) általános képletű tetra- vagy pentapeptidet - ahol X és Y jelentése az 1. igénypont tárgyi körébe megadott - alkalmazunk.