LU85270A1 - Derives de gonadoliberine contenant un groupe beta-aspartyle,procede pour leur preparation et preparations pharmceutiques les contenant - Google Patents

Description

La présente invention est relative à de nouveaux dérivés de la gonadolibërine, représentés par la formule générale (I) ci-après, , * 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 v, 5 ,-,

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X LLeu-Arg-Pro-Y (I) a leurs sels d'addition formés avec des acides utilisables du point de vue thérapeutique et à leurs complexes, ainsi qu'a des compositions pharmaceutiques les contenant. Dans 10 la formule générale (I) : X représente un groupe -O-R, (dans lequel R est un groupe benzyle ou alcoyle en Cj^), un 9rouPe _N/R1 (dans

Xr2 I lequel R^ et R^ sont indépendamment un atome d'hydrogène, 15 un groupe alcoyle en C^j., aryle, aryl-alcoyle (en ou bien, ils forment conjointement avec l'atome d'azote

V

adjacent un groupe morpholino, 1-indolmyle ou 1-pyrro-lidinyle^ ou le groupe Cn c cycloalkyle.

il ô U

;i Y est un groupe glycinë-amide ou alcoyl (en ClS.)-amide.

y 20 Les abréviations utilisées dans la"‘formule sont ' identiques § celles de la nomenclature acceptée dans la L chimie des peptides, qui est décrite par exemple, dans J..

i '

Biol. Chem. /241, 527 (1966) ; 247, 977 (1972)/. D'autres , abréviations utilisées dans cette spécification, sont les j 25 suivantes : ΕΆ = groupe éthylamino ; DEA = groupe diëthvla- mino; CBA = groupe cyclobutylamino; FBA = groupe (1,1-diméthyl-2-phényl)-éthylamino; IND = groupe 1-indolinyle ; PIR = groupe 1-pyrrolidinyle, ANI = groupe phënylamino ; i BOC = groupe butyloxy-carbonyle, < La çonaaolibérine (autres noms connus dans la littérature : hormone libérant les hormones gonadotropes, GmRH, LH-RE, hormone lutéinisante et folliculostimulante, LH/FSH-RH, et ses dérivés connus, présentent une propriété générale, en ce qu’ils sont capables de libérer l'hormone $ 35 lutéinisante (LH) et l'hormone folliculostimulante (FSH).

On sait, d'après la littérature (M. Monahan et coll. Biochemistry 12^ 4616-4620 (1973); J. Sandow et coll.

Control of Ovulation, Butterworths, London, 1978, pp.49-70), 2 j

Ique les dérivés de la gonadolibërine qui contiennent en v 5 position 6, à la place d'une partie glycine, des acides - = aminés de configuration D ou les dérivés de ceux-ci et 'x de plus, les dérivés dans lesquels la partie glycinë-amide en position 10 est remplacée par des groupes amides avec une chaîne carbonée aliphatique (M. Fujino et coll., J. Med.

10 Chem. l£, 1144 (1973)), exercent un effet biologique plus élevé et de plus longue durée par rapport a celui de la gonadolibërine. Contrairement a ceci, on sait également que les dérivés de la gonadolibërine contenant un acide aminé de configuration L en position 6, comme la L-alanine, la j 15 L-proline, la L-valine (Monahan et coll., Biochemistry, 12, | ‘«r 4616 (1973)), la L-isoleucine (D. Coy et coll. J. Med. Chem, î p 16, 1140 (1973)), ou bien des acides amines n'ayant aucun - centre d'asymétrie, comme l'acide gamma-amino butyrique, jj la ß-alanine (J. River et coll., Peptides : Chemistry, j 20 Structure, Biology, Ed. R. Walter, J. Meienhofer, Ann Arbor IJ Science Publishers Inc., Michigan, p. 803 (1975)) ou la sarcosine (W. Arnold et coll. J. Med. Chem. 12, 314 (1974)) ne présentent qu'une activité minimum, ün cycle garnma-lactame spécial de configuration L se révèle constituer un 25 substituant en position 6 efficace du point de vue biologigue 1 en ce qui concerne seulement la libération de LH (Veber et coll., Science 210, 656 (1980').

La présente invenrion a pour objet de fournir de nouveaux dérivés de la gonadolibërine qui exercent un effet ^ 30 plus avantageux que celui ces analogues connus, b La présente invention repose sur la constatation * que dans le cas où l'acide L-aspartique est placé par l'in termédiaire de son groupe ß-carboxyle en position 6 de la chaîne peptidique ce la gonadolibërine et qu'en même temps, 35 son groupe alpha-carboxyle est laissé libre ou fixé a un ! > 3 groupe d'atomes relativement petit, les dérivés de gona-dolibërine ainsi obtenus exercent un effet biologique semblable ou même supérieur à celui que présentent les dérivés de gonadolibërine contenant un D-acide aminé en position 6.

5 Les composés de formule générale (I) peuvent être préparés de la façon suivante : ^ a^) un tétra- ou pentapeptide représenté par la formule générale (II) ci-après , 10 H-Asp-X ^Leu-Arg-Pro-Y (II) où X et Y sont tels que définis plus haut, est condensé avec l'azide de pentapeptide représenté par la formule

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N^ r ou cL,) un hexapeptide représenté par la formule 15 générale (III), ci-après,

E

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Àsp-X (III) où X est tel que défini plus haut et E est un groupe hydroxy azide ou N-succinimide-oxy ou un groupe phénoxy êventuelle-2Γ ment substitué avec un groupe nitro ou un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence un groupe p-nitro, 2,4,6-trichlo-;rophënoxy, pentachlorophënoxy ou pentafluorophénoxy, est condensé avec un tri- ou tétrapeptide représenté par la formule générale (IV) ci-après r 25 H-Leu-Arg-Pro-Y (IV) où Y est tel que défini plus haut, ou a^) pour préparer des composés de formule générale (I) dans laquelle un groupe glycinë-amide se trouve sur le C-terminal de la molécule, de la BOC-glycine est 30 couplée à une résine de polystyrène-divinylbenzène chloro- •v * méthylée contenant 1 à 3 %, de préférence 2 %, de réticula tion, puis le groupe BOC est détaché des composés de formule (V) ainsi obtenus : B0C-Gly-0-CH2-polymère (V) 35 et à partir du C-terminal, des amino-acides ayant des groutes

N

4 protecteurs sont couplés selon une séquence appropriée au peptide-polymère par répétition périodique des opérations de coupure et de couplage, puis le peptide terminé est détaché â partir du peptide-polymère par ammonolyse et les groupes ^ 5 protecteurs sont éliminés par ammonolyse suivie d'un trai- u tement avec l'acide fluorhydrigue, ou 1 a^) pour préparer des composés de formule générale (I) dans laquelle un groupe glycine-amide est sur le C-terminal de la molécule, la BOC-glycine est associée 10 à une résine de polystyrène-divinylbenzène contenant des groupes benshydryl-amino et 1 à 3 %, de préférence 2 % de réticulation et le groupe BOC est détaché à partir du composé de formule (VI) ci-après, I BOC-Gly-NH-CH-polymêre !15 * (VI) 65 ainsi obtenu, ensuite, à partir du C-terminal, des amino-acides pourvus de groupes protecteurs sont couplés en une séquence appropriée au peptide-polymère par répétition S20 périodique des opérations de coupure et de couplage, puis le peptide terminé est détaché du peptide-polymère et les groupes protecteurs sont éliminés par traitement avec de l'acide fluorhydrique, ou !;j aj.) pour préparer des composés de formule 25 générale (I) dans laguelle un groupe -Pro-Y se trouve sur le C-terminal de la molécule, oû Y est tel que défini plus haut, de la BOC-proline est attachée â une résine de poly-styrène-divinylbenzëne chlorométhylêe contenant 1 à 3 %, de préférence 2 % de réticulation, et le groupe BOC est détaché 30 du composé de formule (VII) ci-après, ^ B0C-Pro-0-CE2-pclymêre (VII) I * ainsi obtenu, puis à partir du C-terminal, les aminoacides pourvus de groupes protecteurs sont couplés en une séquence appropriée au peptide-polymère par une répétition périodique 35 des opérations de coupure et ce couplage et le peptide ! I 5 déterminé est détaché à partir du peptide-polymère par aminolyse et les groupes protecteurs sont éliminés par traitement avec l'acide fluorhydrigue.

Dans le procédé a^), on peut préparer un compo-5 sant tétra- ou pentapeptide par condensation par fragment ou allongement de chaînes par étape, selon une méthode i connue en elle-même, par activation avec un azide, un anhydre I mixte, un carbodiimide, un ester actif ou un autre groupe d'activation. Il est convenable d'acyler le tri- ou tétra-10 peptide H-Leu-Arg(NC^)-Pro-Y, où Y est tel que défini plus haut, avec les dérivés d'acide aspartique de formule générale (VIII) ci-après :

E

Z-Asp-X (VIII) 115 dans laquelle Z est un groupe t-butyloxy-carbonyle ou benzyl- ' oxycarbonyle et X et E sont tels que définis plus haut, dont y le groupe amino porte un groupe t-butyloxy-carbonyle ou j benzyloxycarbonyle de protection et d'ensuite éliminer les groupes protecteurs à partir du composé obtenu.

;ï i 20 Dans le procédé a„), l'hexapeptide de formule P z 1 (III) est convenablement prépare par acylation du dérive d'acide aspartique représenté par la formule (IX) ci-après: I 0-Ro I 3 ' H-Asp-X (IX) 25 où X est tel que défini plus haut, R^ est un atome d’hydrogène, un groupe méthyle, benzyle ou t-butyle-, avec un penta-peptide-azide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N^·

Les méthodes de synthèse des peptides en phase 30 solide, utilisées dans le procédé a,) sont connues dans la littérature (J.M. Stewart: "Solid Phase Peptide Synthesis”, * Freeman et Co., San Francisco, 1969).

!,

De nombreux analogues de la gonadolibérine sont préparés par une synthèse en phase solide à commande anto-35 matique (D, Coy et coli. Biochemistry 13, 323 (1974) ; 6 D. Coy et coli. J. Med. Chem. .19, 423 (1976) ; le procédé a^) diffère des procédés connus en ce qu’il met en oeuvre un dérivé d'aminoacide représenté par la formule générale (X) ci-après,

* 5 BOC-Asp-X

* I (x) 0-r3

V

dans laquelle X est tel que défini plus haut, R^ est un atome d'hydrogène, un groupe p-nitro-phënyle ou pentafluoro-10 phényle, en tant qu'aminoacide en position 6. Pour protéger temporairement les autres chaînes latérales des amino-acides de la molécule, on utilise des groupes qui peuvent être ensuite éliminés par l'action de l'acide fluorhydrique; par exemple , le groupe p-toluène-sulfonyle dans le cas 15 de l'arginine et de l’histidine et le groupe benzyle dans - le cas de la sérine et de la tyrosine.

- Si cela est désiré, on fait réagir la nona- V ' et resp. le décapeptide-amide ainsi obtenu avec un acide acceptable du point de vue pharmaceutique pour former un 20 sel d'addition acide, ou, si cela est désiré, on libère la base libre à partir du sel d'addition acide en faisant réagir celui-ci avec une base et, si cela est désiré, on transforme en un complexe métallique le nona- et resp. le décapeptide-amide ainsi obtenu.

2‘j Conformément à la présente invention, on peut préparer des compositions pharmaceutiques en mélangeant un composé de formule générale (I) ou un sel ou un complexe acceptable du point de vue pharmaceutique de celui-ci, avec un véhicule et/ou des agents de support, en forme de compri-*7 30 me, de dragée, de capsule, de suppositoire, ce solution ^ injectable, de pulvérisation nasale, etc..

* Un représentant avantageux des composés de formule générale (I) est le composé représenté par la formule (XI) ci-après , 35 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEA ^Leu-Arg-Pro-EA (XI) 7 gui produit chez des rats d'essai androgénisës, une ovulation de plus grande efficacité que la LH-RH naturelle, en dépit du fait que le composé de formule (XI) exerce un effet de libération de LH d'un ordre de grandeur inférieur à celui ~ 5 de la LH-RH naturelle.

lk ‘ Dans un autre essai portant sur l'effet de 20 yg/kg du composé de formule (XI) , des sterlets et des poissons-chats femelles ont déposé leurs oeufs à 80 %, tandis que dans un groupe témoin auquel on a administré 6 X0 10 dans les mêmes conditions, le D-Phe , desGly -LH-RH- éthylamide, connu dans la littérature comme étant superactif, aucune ovulation ne s'est produite.

Une dose de 100 Ug du composé de formule (XI) administrée par voie intramusculaire (i.m.) simultanément 15 à l'insémination, a augmenté le taux de gestation du bétail ~ de 25 à 30 %, alors que la même dose de LH-RH naturelle n'a pas été efficace.

V

Avec une seule dose de 10 yg du composé de formule (XI), on a pu provoquer un rut extra-saisonnier des 20 renards bleus et argentés, tandis que la LH-RH s'est avérée inefficace à ce moment.

ün autre composé conforme à la présente invention, la (ß-Asp-alpha-anilide)^-LH-RH a accru la production de sperme et de testostérone des dindons d'une fgçôn bien 25 meilleure et plus logique, par exemple, le D-Phe^-LE-RH ayant une structure analogue. Le même composé a réduit essentiellement le temps de couvaison des dindons femelles, alors que la LH-RH naturelle était inefficace.

Les exemples ci-dessus prouvent que les nouveaux ^ 30 analogues de la gonadolibérins conformes a la présente invention, exercent un effet puissant sur le processus ce reproduction des vertébrés. Leur application avantageuse est prouvée par de nombreux tests effectués en élevage.

ün avantage essentiel des composés conformes à 35 la présente invention, représentés par la formule générale ! δ (I), contrairement aux analogues connus de la gonadolibërine gui exercent un effet élevé, réside en ce qu'ils sont faits exclusivement de L-amino-acides, gu*en même temps, leurs effets d'induction de l'ovulation et de libération de la ~ 5 testérone étudiés dans des tests biologiques, sont supé- * · rieurs à ceux des dérivés de la gonadolibërine dits "super- 5 actifs", contenant de la glycine ou un D-amino acide en position 6,

Dans les exemples ci-après, les valeurs de 10 de chromatographie sur couche mince, sur plagues Kieselgel DC, Alufolien/Merck sont déterminées dans les mélanges de solvants suivants : 1. acétate d'éthyle - pyridine - acide acétique - eau . 60:20:6:11 | 2. acétate d'éthyle - pyridine - acide acétique - eau 120:20:6:11

II

115 3. acétate d'éthyle - pyridine - acide acétique - eau 240:20:6:11 4. acétate d'éthyle - pyridine - acide acêtigue - eau 480:20:6:11 5. acétate d'éthyle - pyridine - acide acétique - eau 30:20:6:11

‘V

6. acétone - chloroforme 1:15 Π jij 7. acétone - toluène 1:1 i 20 8. acide acétique - benzène 1:7 j 9. n-butanol - acide acétique - acétate d'éthyle - eau 1:1:1:1 'i 10, n-butanol - acide acétique - eau 4:1:1 i · !; 11. n-butanol - acide acétique — eau 4:1:5 J; (phase supérieure) !‘ 12. acétate d'éthyle - pyridine - acide acétique - eau 5:5:1:3 i /3 13. butanol - pyridine - acide acétique - eau 60:20:6:11

Les points de fusion sont donnés en °C et les * valeurs ne sont pas corrigées.

Outre les dispositions gui précèdent, l'inven-·*' 30 tion comprend encore d'autres dispositions, gui ressortiront t, de la description gui va suivre.

î ^ L'invention sera mieux comprise à l’aide du complément de description gui va suivre, gui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé, objet de la 35 présente invention.

9

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l’invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation, 5 Exemple 1 _

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OMe ^-Leu-Arg-Pro-EA

V

a) Z-Asp-OMe ^-Leu-Arg (NC^) -Pro-EA

On dissout le bromhydrate de 537 mg (1 mmole) 10 de L-Leu-Arg(NO^)-Pro-EA dans 10 mg de dimëthylformamide, puis on ajoute 447 mg (1 mmole) d'un dérivé Z-Asp(OPFP-OMe à une température de 0°C, Le pH du mélange réactionnel est ajusté à 8 avec de la triëthylamine sous agitation, puis après 6 heures, la solution est évaporée sous vide. Le 15 résidu est d'abord trituré avec de l'éther, puis avec de l'eau, filtré et enfin précipité à partir du mëthanol par ' addition d'éther. On obtient ainsi 440 mg (62 %) d'une sustance amorphe, blanche.

^32^49^9^10* ^

20 p.f.: 182-184°C

[a]22 = -58,4° (c = 1, méthanol)

Rf (2) = 0,5? Rf (9) = 0,85; Rf (12) = 0,9.

b) H-A^p-OMe -Leu-Arg-ProEA.2 AcOH

- 25 On dissout 400 mg (0,56 mmole) du tétrapeptide Z-AiJp-OMe ^-Leu-Arg -Pro-EA dans 20 ml d'acide acétique à 50 % et on l'hydrogène en présence de 50 mg d'un catalyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon, 30 pendant 4 heures. Le catalyseur est sépare par filtration, yi l'acide acétique est éliminé sous vide et le résidu est trituré avec de l'éther, filtré et séché sous vide.

Rendement : 360 mg (97%).

C28H52N8°10 : 660'5 t 10

Rf (1) = 0,15; Rf (9) = 0,6; Rf (10) = 0,25; Rf (5) = 0,45

c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-A^p-OMe Ï-Leu-Arg-Pro-EA

716 mg (1 mmole) du pentapeptide-hydrazide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-^H^ sont dissous dans 20 ml de dimé-5 thylformamide. La solution est refroidie à -10°C, puis 0,7 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 6N et ensuite ' une solution aqueuse concentrée de 75 mg de nitrate de sodium sont ajoutés. Après 10 minutes d'agitation à -5°C, on ajoute 660mg (Immole) de diacëtate de : 10 H-Asp-OMe^-Leu-Arg-Pro-EA et une solution refroidie de 0,7 ml de triëthylamine dans 5 ml de diméthylformamide en mélange réactionnel. Si cela est nécessaire, on ajuste le pH de la solution â 8 avec de la triëthylamine, La solution est agitée à -5°C pendant 1 heure, puis à 0°C pendant 12 15 heures et le diméthylformamide est éliminé sous vide. Le résidu est trituré avec de l'éther, filtré, puis fractionné dans de l'acide acétique 0,2N sur une colonne Sephadex G-25. les fractions contenant le principal produit sont soumises a une chromatographie sur une colonne de gel de silice 20 (Whatman, LRP-1) contenant des milieux en C^g en phase inverse ä pression moyenne et phase inverse dans du méthanol aqueux à 30 I, puis les fractions pures sont lyophilisées. Rendement : 712 mg (58 %).

C58H80N16°14: 1225 25 [et]22 = 53,4 6 (c = 1, eau)

Rf (5) =0,5; Rf (10) = 0,15; Rf (9) =0,7

Analyse des amino-acides : Glu: 1,02; His: 0,97; Ser: 0,95;

Tyr: 1,01; Asp: 1,07; Leu: 1,00; 30 Pro: 0,93; Arg: 1,02

Exemple 2

Glp-Hi s-Trp- S er-Tyr-Asp-DEA ^-Leu-Ar g-Pro-EA a) Boc-Asm (QBzl)-DEA

3,23 g (10 mmoles) de l'ester benzylique en 6 ce 35 l'acide t-butyloxy-carbonyl-aspartique sont dissous dans 11 100 ml de dimëthylformamide à une température de 0°C. On ajoute à cette solution 1,35 g (10 iranoles) de N-hydroxy-benztriazole et 2,26 g (11 iranoles) de dicyclohexyl-carbodi-imide, puis on 1'agitependant 15 minutes à 0°C, ensuite, on ç, , 5 ajoute goutte-à-goutte la solution de 1,0 ml (0,73 g; 10 mmole * de diëthylamine dans 20 ml d’acétate d'ëhtyle, au mélange réactionnel agité. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à 0°C, puis pendant 4 heures à la température ambiante. Le précipité est filtré, la ligueur-mère est 10 reprise après évaporation dans de l'acétate d’éthyle et secouée de façon répétée avec une solution d’acide citrique froid à 10 %, une solution saturée de carbonate acide de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. La I phase d'acétate d'éthyle est séchée sur du sulfate de sodium 15 anhydre et évaporée sous vide. On obtient 3,6 g (95 %) d'huile jaune pale.

C20H30S2°5: 378'2 I la]“ = -58,4° (c = 1, méthanol) 1 20 Rf (4) = 0,95; Rf (6) = 0,95; Rf (7) = 0,75

ji b) BOC-Asp-DEA

! 3,8g (10 mmoles) de trbutyloxy-carbonyl-aspartyl- il beta-(estenbenzylique)-alpha-diéthyl-amide sont dissous Π dans 50 ml de méthanol et hydrogénés en présence de 300 mg 25 de catalyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon, pendant 2 heures. On sépare le catalyseur en le filtrant, puis on évapore et sèche la solution dans un dessicateur.

On obtient ainsi 2,8 g (100 %) d'une substance jaune pâle ·- mousseuse.

30 C.-H^-N^Oc: 289,1 ' j 1 -60,1 0 (c = 1, méthanol)

Rf (4) = 0,7? Rf (6) = 0,9; Rf (8) = 0,8.

12

c) BOC-Asp (OPFP)-DEA

2,9 g (10 mmoles d'alpha-diéthylamide d'acide t.-butyloxycarbonyl-aspartique sont dissous dans 100 ml d'acétate d'éthyle à 0°C, sous agitation, puis 1,84 g 5 (10 mmoles) de pentafluoro-phénol et 2,26 g (11 mmoles) de ‘ ' dicyclohexylcarbodiimide sont ajoutés. Le mélange réaction- ·_ nel est agité à une température de 0°C pendant 30 minutes, puis à la température ambiante pendant 24 heures. Le prêci-

Ipitë séparé est éliminé par filtration, puis la solution 10 d'acétate d'éthyle est évaporée, le résidu est repris dans de l'éther de pétrole, le précipité est à nouveau séparé par filtration et la solution est évaporée. Après séchage, on obtient 4,4 g (99 %) d'une huile incolore.

?19H24N2°5F5: 455^ 15 „ [aj^= 75,0 ° (c = 1, mêthanol)

Rf (8) = 0,95; Rf (6) = 0,9; Rf (4) = 0,75; Rf (7) = 0,8.

d) BOC-Asp-DEA LLeu_Arg (NC>2)-Pro-EA 20 Le bromhydrate de 536 mg (1 xnmole) de H-Leu-Arg- p (N02)-Pro-éthyl-amide est dissous dans 5 ml de diméthyl- formamide. La solution est refroidie à 0°C, 0,14 ml (Immole) i 1 de triéthylamine est ajouté, puis 453 mg (1 mmole) -de I t-butyloxy-carbonyl-aspartoyl-a-diéthylamide-β-(ester- 25 pentafluoro-phênylique sont introduits. Le mélange réac tionnel est agité à la température ambiante pendant 5 heures tandis que le pH est ajusté de temps en temps à la valeur ; neutre, à l'aide de triéthylamine. Après évaporation du

L

mélange réactionnel, la substance restante est triturée " 30 avec de l'éther, puis filtrée. Le produit brut ainsi obtenu h :> (environ 780 mg) est purifié par chromatographie sur colonne ~ de gel de silice, dans un mélange 4:1:1 de n-butanol, i acide acétique et eau. Les fractions convenables sont collectées, évaporées à siccitë sous vide et le résidu est 35 trituré avec de l'éther. Oh obtient ainsi 470 mg (64 %) 13 d'une poudre blanche.

C32H57N10°9: 725'5 [a]22 = -11,2 ° (c = 1 méthanol)

- 5 p.f. = 132-133°C

" * Rf (2) = 0,4; Rf (9) = 0,85; Rf (10) = 0,55.

e) BOC-Asp-DEA ^-Leu-Arg-Pro-EA.AcOH 730 mg (1 iranole) du tëtrapeptide 10 BOC-Aép-DEA LLeu-Arg(NO^)-Pro-EA sont dissous dans 20 ml d'acide acétique à 50 % et hydrogénés en présence de 100 mg du catalyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon, pendant 3 heures. Après évaporation du mélange réactionnel, on obtient un produit huileux, uniforme du point de vue 15 chromatographique.

C34H63N9°9: 741'6

Rf (2) = 0,05; Rf (9) = 0,65; Rf (1) = 0,6,

f) Η-Αέρ-DEA i-Leu-Arg-Pro-EA.2TFA

20 740 mg (1 mmole) du tëtrapeptide DOC-A^p-DEA Ï-Leu-Arg-Pro-EA sont dissous dans 10 ml d'acide trifluoroacëtique et agités a la température ambiante, pendant 15 minutes. La solution est évaporée sous vide. Le résidu est trituré avec de l'éther, filtré et 25 séché sur une lessive. On recueille ainsi 780 mg (96 %) d'une substance légèrement hygroscopique.

C31H53°9N9F6: 809'2 jjxJ22 = -40,6 ° (c = 1, eau)

Rf (11) = 0,2; Rf (5) = 0,4.

^ 30

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEA ^Leu-Arg-Pro-EA. 2AcQH

286 mg (0,4 mmoie) lu pentapeptide-hydrazide

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-ÎÎ2^3 sont dissous dans 25 ml de ciraé-thylformamide, La solution est refroidie à -10°C et, sous 35 agitation, additionnée goutte-a-goutte de 0,27 ml d'acide Λ 14 chlorhydrique 6N, puis de la solution aqueuse concentrée de 30,2 mg de nitrite de sodium.

Cinq minutes après, on ajoute la solution du sel trifluoroacëtique de 353 mg (0,4 mmole)- du tétrapeptide s" 5 H-A^p-DEA LLeu_Arg--Pro-EA, préparée dans 1 ml de dimë- ' ‘ thylformamide, avec 0,27 ml de triéthyl amine à -10°C. Si - cela est nécessaire, on ajuste le pH du mélange réactionnel ' à la valeur neutre, à l’aide de triëthylamine, puis on l’agite pendant 1 heure à une température de -5°C, pendant 10 1 heure â 0°C et pendant 12 heures à la température ambiante.

Le dimêthylformamide est éliminé sous vide, le résidu est soumis ä une chromatographie sur une colonne de gel de silice, avec un mélange 30:20:6:11 d’acétate d’éthyle, pyrridine, acide acétique et eau. Les fractions appropriées 15 sont collectées, évaporées sous vide, triturées avec de l’éther, filtrées et séchées. On obtient ainsi 290 mg (50 %) d’une poudre blanche.

C65H95N17°17 : 1385 p.f.: 180-181°C .

20 r -J 22 ! [aJD ~ ”64,2° (c = 1, mêthanol) '

Rf (12) = 0,85; ’Rf (5) = 0,35; Rf (11) = 0,25.

! Analyse des acides : Asp: 1,0; Ser: 0,99; Glu: 1,01;

Leu: 1,10; Tyr: 1,00; His: 0,92; 1 25 Arg: 0,98.

Exemple 3 | Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aip-NH2 *-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

a) BOC-Asp(OBzl)-OPFP

30 3,23 g (10 mmoles) d'ester benzylicne en E de : 0 l'acide t-butoxycarbonyl-aspartique sont dissous dans 50 ml ! ' d'acétate d'éthyle. La solution est refroidie à -0°C et sous f: agitation, additionnée de 1,84 g (10 mmoles) ce pentafluoro- phënol et de 2,26 g (11 mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide.

35 Le mélange réactionnel est agité ä 0°C pendant 30 minutes, i 15 et à la température ambiante pendant 12 heures. Après filtration, la solution est évaporée sous vide, le résidu est dissous dans 15 ml d’éther et, par addition de 15 ml d'éther de pétrole, cristallisé à une température de -20°C.

^ 5 Rendement : 3,75 g (70 %).

C22H20N1°6F5: 489'3 " p.f.: 84 °C

[aj22 = -18,1 ° (c = 1, acétate d’éthyle) 10 Rf (7) = 0,9; Rf (4) = 0,95.

b) B0C-Asp(0Bzl)-NH2

La solution de 970 mg (2 mmoles) de t-butyloxy-carbonyl-aspartoyl-8 (ester-benzyligue) -d-(esterpentaf luoro-phénylique) dans 10 ml de mëthanol, est additionnée de 15 10 ml de méthanol saturé d'ammoniac, à 0°C, puis agitée à 51 0°C pendant 30 minutes. Le solvant est évaporé sous vide.

î Le résidu est cristallisé à partir d'un mélange de méthanol et d'éther.

Analyse pour la formule ^6^22^2^5 (322,1) ; 2Π

Valeurs calculées : C 59,62; H 6,83; N 8,69;

Valeurs trouvées : C 59,2; H 6,98; N 8,8.

p.f.: 159-161°C

[a]p2 = +1,1 6 (c = 1, méthanol) 25 Rf (7) = 0,5; Rf (8) = 0,75; Rf (4) = 0,9; Rf (6) = 0,95.

c) BOC-Asp-NH2 480 mg (1,5 mmoles) de t-butyloxy-carbonyl-aspar-toyl-6-(esterbenzylique)-α-amide sont dissous dans 10 ml 30 de méthanol et hydrogénés en présence de 50 mg d'un estait lyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon, pendant 1 heure. Le catalyseur est séparé par filtration, le solvant est évaporé sous vide et le résidu est cristallisé à partir d'éthanol aqueux.

35 Rendement : 246 mg (93 %).

16

^9^16^2^5 : 2^2,2 p.f.: 145-146°C

r\ r\ [aJjj = -2,2 __ (c = 1, inéthanol) ' 5 Rf (7) = 0,05; Rf (8) = 0,2; Rf (4) = 0,3; Rf (6) = 0,1 d)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-NH^ ^-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^

La synthèse du peptide en phase solide, sa sêpa-10 ration du polymère avec de l'acide fluorhydrigue, ainsi que la purification chromatographique du peptide brut, sont effectuées selon la procédure qui est décrite dans l'exemple 4 c) , sauf que le composé préparé selon l'exemple 3 c) est utilisé en tant que 6-ramino-acide. On obtient 72 mg 15 (12 %) d'une substance pure, ^ C57H79N18°14 = 1239 [αΐρ2 = -55,5 ° (c = 1, eau)

Rf (5) = 0,35; Rf (11) = 0,15; Rf (9) = 0,65; Rf (13= 0,15.

20 Analyse des acides : G-lu; 0,96; His: 1,04; Ser; 0,93;

Tyr; 1,02; Leu: 1,02; Pro: 0,94;

Gly: 1,00; Asp: 1,1.

Exemple 4 25 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-FBA bxJeu_Arg_pro_Giy_NH2 a) 'BOC-Asp (OBzl)-α-Γ2-(4-chlorophênyl)-isobutyl- amide] 5 g (15 mmoles) d'ester benzylique en 8de l'acide t-butoxy-carbonyl-aspartique sont dissous dans 100 ml 30 d'acétate d'éthyle, refroidis à 0°C et additionnés de ]v 2,1 g de N-hydroxy-benztriazoie, 3,75 g de dicyclohexyl-carbodiimide et d'une solution de 3,5 g de 2-(4-chlorophé-nyl)-isobutylamine dans 20 ml de diméthylformamide, sous agitation. Le mélange est agité a la température ambiante 35 pendant 12 heures, puis la solution est filtrée. La solution 17 d'acétate d'éthyle est séparée par secousses avec une solution à 10 % d'acide citrique, une solution saturée de carbonate acide de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur du sulfate de sodium anhydre, 5 filtrée et évaporée sous vide. L'huile incolore restante r “ cristallise lentement. Les cristaux sont lavés avec un mélange d'éther et d'éther de pétrole, puis séchés.

Rendement î 5,5 g (75 %)

C26H33N2°5C1 Σ 488'2 10 p.f.s 60-61 °C

[a]"- -12,2 0 (c = 1, méthanol)

Rf (7) = 0,75? Rf (8) = 0,6

15 b) BOC-Asp-FBA

j La solution de 2,3 g (4,7 mmoles) de t-butyloxy- [ r, carbonyl-aspartique-3-(esterbenzylique)-alpha r2~chloro- ! ^ ! phényl)-isobutyl-amide] dans 30 ml de méthanol est hydrogéné en présence de 200 mg d'un catalyseur comprenant 10 % de 20 palladium sur du charbon, pendant 2 heures, puis le catalyseur est séparé par filtration et le solvant évaporé ! sous vide. Le résidu est trituré dans de l'éther et cris- i tallisë à partir du méthanol, avec de l’éther, i Rendement : 1,5 g (87 %).

25 Analyse pour la formule : C^H 28N2°5 (364f2):

Valeurs calculées : C 62,63 H 7,69

Valeurs trouvées : C 62,3 H 7,58

| p.f.: 94-95 °C

[aj^2 = ~19°c (c = 1, méthanol) ^ Rf (3) = 0,2; Rf (2) = 0,3; Rf (7) = 0,15; Rf (8) = 0,8; • ‘ Rf (10) =0,15 c) Glp-His-Trp-Ser-lÿr-Asp-IBA ^leu-Arg-Pro-Gly-ïî^ 35 1 g (0,5 mmole) de polymère de benzhydryl-amine 18 , est introduit dans le réacteur d'un synthétiseur de peptide automatique (Beckman 900 B) et agité dans 30 ml de dichlo-romëthane pendant 4 heures. Les dérivés d'aminoacides protégés sont couplés au polymère en une séquence appropriée 5 par une répétition cyclique des étapes (1 à 10) suivants : 1. lavage avec 30 ml de dichloromêthane - 3x3 minutes 2. lavage avec 30 ml d'un mélange 1:2 d'acide trifluoro- acétique et de dichloromêthane - 5 et 25 minutes 3. lavage avec 30 ml de dichloro-méthane - 3x3 minutes 10 4. lavage avec 30 ml d'éthanol - 3x3 minutes 5. lavage avec 30 ml de chloroforme - 3x3 minutes 6. lavage avec 30 ml d'un mélange 1:9 de triéthyl amine et de chloroforme - 2x10 minutes 7. lavage avec 30 ml de chloroforme - 3x3 minutes 15 8. lavage avec 30 ml de dichloromêthane - 3x3 minutes -9i incubation de 1,5 mmoles de dérivés de BOC-aminoacide et de 1,5 mmole de diisopropyl-carbodiimide dans 130 ml de dichloro-méthane - 120 minutes 10. lavage avec 30 ml de dichloro-méthane - 3x3 minutes.

20 Les dérivés d'aminoacides protégés sont les suivants : !: B0C-Gly-0H, BOC-Pro-OH, BOC-Arg (Tos)-OH, BOC-Leu-OH, j BOC-Asp-FBA,3B0C-Tyr(Bzl)-OH, BOC-Ser(Bzl)-OH, J BOC-Trp-OH, BOC-His(Tos)-OH et Glp.

25 Après couplage de tous les aminoacides, la résine polymère portant le peptide fini est séchée sous vide et agitée avec 50 ml d'acide fluorhydrique condensé à 0°C, en présence de 6 ml d'anisole pendant 45 minutes. L'acide fluorhydrique est éliminé dans un courant d'azote gazeux 30 anhydre, le résidu est précipité avec de l'éther et filtré.

La substance filtrée est mise en suspension dans de l'acide acétique à 50 %, filtrée et le filtrat est évaporé sous i v:de. Le résidu est envoyé à travers une colonne Sephadex i G-25 dans une solution d'acide acétique a 50 %. La princi- t 1 35 pale fraction pure est soumise à une chromatographie sur i 19 une colonne de gel de silice, avec le mélange solvant 10.

Les fractions contenant la substance pure sont évaporées et lyophilisées.

Rendement : 70 mg (10 %).

5 C67H91N18°14 = 1371 * Wp2 =~56»4 ° (c = 1/ eau)

Rf (13) = 0,25; Rf (9) = 0,7; Rf (11) = 0,2; Rf (5) = 0,5 Analyse des amino acides: Glu: 0,97; His: 1,05; Ser: 0,94 10 Pro: 0,95; Tyr: 1,02; Asp: 1,02;

Leu: 1,01; Gly: 1,00.

Exemple 5

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-CBA l-Leu-Arg-Pro-Gly-NI^ 15

a) BOC-Αερ(OBzl)-CBA

2,4 g (5 mmoles) du t.-butyloxy-carbonylaspatoyl-^“ (ester-benzyligue)-alpha-esterpentafluoro-phénylique préparé ! conformément à la procédure de l'exemple 3 a), sont dissous I 20 dans 20 ml d’acétate d'éthyle, refroidis à 0°C et la || ; solution refroidie de 0,42 ml (5 mmoles) de cyclobutyl-amine dans 2 ml d'acétate d'éthyle est ajoutée goutte-à-goutte dans cette solution.- Le mélange réactionnel est agité pendant | 2 heures à la température ambiante, puis lavé avec une 25 solution d'acide citrique à 10 %, une solution saturée de carbonate acide de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur du sulfate de sodium anhydre, filtré et évaporé sous vide. Le résidu est cristallisé avec de l'éther de pétrole à partir de l'éther.

fc" * j.

t 30 Rendement : 1,16 g (89 %) ijj , C20H28N2°5: 376'2

:| p.f.: 84-86 °C

! Mn2 = “5,7 ° (c = 1, méthanol)

L

! . 1' 20

Rf (8) = 0,9,- Rf (10) = 0,9; Rf (7) = 0,75; Rf (11) = 0,95 b) BOC-Asp-CBA

i 1 g (2,65 rnmoles) de t.-butyloxy-carbonylaspartoyl- t 5 -ß-(ester-benzylique)-alpha-cyclobutyl-amide est dissous ^ ‘ dans 20 ml de mëthanol et hydrogéné en présence de 100 mg de catalyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon pendant 2 heures. Le catalyseur est séparé par filtration, la solution est évaporée sous vide et le résidu est cristal-10 lise à partir du méthanol aqueux.

Rendement : 600 mg (79 %).

Analyse pour la formule : ^^^^22^2^5 (286,1) :

Valeurs calculées : C 54,54 H 7,69

Valeurs trouvées : C 53,9 H 7,68

15 p.f.: 149-150 °C

lajiP = -9,5° (c = 1, méthanol) k' I Rf (8) = 0,2; Rf (10) = 0,75; Rf (7) = 0,05 20 c) G lp-H i s - Tr p- S er-Tyr-Asp- CB A ^-Leu-Arg-Pro-Gly-NHL,

La séparation en phase solide du peptide, le détachement de celui-ci à partir du polymère avec de l’acide fluorhydrique, ainsi que la purification chromatographique | du peptide brut, sont effectués selon la procédure qui est ! 25 décrite dans l’exemple 4c), sauf que le composé préparé dans l’exemple 5 b) est utilisé en tant que 6-amino-acide.

| On obtient ainsi 68 mg (10,5 %) du peptide pur, C61H85N18°14: 30 Hd2 = -«-88 » (c = 1, eau) ; * Rf (11) = 0,2; Rf (9) = 0,7; Rf (13) = 0,2; Rf (5) = 0,4

Analyse des amino acides: Glu: 1,05; His: 0,96; Ser: 0,94

Tyr : 0,98; Asp: 1,07; Leu: 1,02;

Pro: 0,96; Gly: 1,00.

i: I

21

Exemple 6

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aép-PIR ^Leu-Arg-Pro-Gly-NH^

a) BOC-Asp(OBzl)-PIR

3,2 g (10 mmoles) de l'ester benzyligue en ß de 5 l'acide t-butyloxycarbonyl-aspartique sont dissous dans 5 ml ^ ” d'acétate d'éthyle et â une température de 0°C, ils sont - additionnés de 1,35 g de N-hydroxy-benztriazole, 2,26 g de dicyclohexyl-carbodiimide et d'une solution de 0,8 ml de pyrrolidine dans 2 ml d'acétate d'éthyle. Le mélange 10 réactionnel est agité pendant 2 heures à la température ambiante, puis séparé par secousses avec une solution d'acide citrique à 10 %..une solution saturée de carbonate acide de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre, jj 15 filtrée et évaporée sous vide. Le résidu est dissous dans l'éther, filtré et évaporé à nouveau. On obtient ainsi k 3,4 g (90 %) d'une huile.

? ' C H^qN^Oj.: 376,2 || 20 28 2 5 j 20 [a]22 = -84,4 ° (c = 1, méthanol) \ Rf (7) = 0,75; Rf (4) = 0,95; Rf (8) = 0,85; Rf (6) = 0,8.

b) BOC-Asp-PIR

La solution de 3 g (8 mmoles) de t.-butyloxy--25 carbonyl-aspartoyl-ß- (ester-benzylique)-alpha-pyrrolidine dans 30 ml de méthanol est hydrogénée en la présence de 250 mg d'un catalyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon pendant 2 heures, puis le catalyseur est séparé par filtration et la solution est évaporée. L'huile restante est 30 séchée sur de l'acide sulfurique.

v' Rendement : 21,1 g (92 %) .

; C13H22N2°5: 286'2

p. f.: 124-125°C

( i 22 [α]2^ = -39t9°C (c = 1, mëthanol)

Rf (8) = 0,3; Rf (7) = 0,2.

c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR ^Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ v 5 La synthèse en phase solide du peptide, le déta- * = chement de celui-ci à partir du polymère avec l’acide fluorhydrique, ainsi que la purification chromatographique du peptide brut sont effectués selon la procédure qui est décrite dans l’exemple 4c), sauf que le composé préparé 10 dans l'exemple 6 b) est utilisé en tant que 6-amino acide.

On obtient ainsi 78 mg (12 %) du peptide pur, C61H85N18°14 : 1293 [a]22= -53,2 (c = 1, eau) 15 Rf (13) = 0,15; Rf (9) = 0,6; Rf (11) = 0,2; Rf (5) = 0,4 i ^ Analyse des amino acides: Gly: 0,97; His: 1,01; Ser: 0,94; j p Tyr: 1,03; Asp: 1,05; Leu: 1,00;

Pos: 0,94.

] Exemple 7 _

] 20 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND J-Leu-Arg-Pro-EA

I a) BOC-Asp(OBzl)-INO

3,23 g (10 mmoles)de l'ester benzylique en 3 de j l'acide t-butyloxy-carbonyl-aspartique sont dissous dans

; 50 ml d'acétate d'éthyle. La solution est refroidie à 0°C

25 et, sous agitation, additionnée de 2,3 g de dicyclohexyl-; carbodiimide et de 1, 19 g d'indoline. Le mélange réactionnel j est agitée pendant une nuit à la température ambiante, puis il est filtré le jour suivant ; le filtrat est lavé à trois reprises à chaque fois avec de l'acide citrique à 10 %, une 30 solution saturée carbonate acide de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur du sulfate de ] sodium anhydre et évaporé. L'huile restante est cristallisée j avec de l’eau à partir de l'éthanol.

Rendement : 3,7 g (89 %) C24H28N2°5: 424 || 23

p.f.s 75-76 °C

[ajp = -70,9° (c = 1, mëthanol)

Rf (7) = 0,9

5 b) H-Asp(OBzl)-IND.TFA

* 800 mg (1,9 mmoles)de t.-butyloxy-carbonyl- aspartoyle-fS-(ester-benzyligue)-alpha-indoline sont dissous dans 5 ml d'acide trifluoroacëtique et agités à la température ambiante pendant 15 minutes. L'acide trifluoro-10 acétique est éliminé sous vide et le résidu est trituré avec de l'éther, filtré, séché, puis cristallisé avec de l'éther à partir de l'éthanol.

Rendement : 780 mg (94 %)

C21H21N2°5F3: 438'1 15 p.f. 114-115 °C

j t· Hp2 = "5,8° (c = 1, méthanol) ! Rf (7) = 0,2; Rf (4) = 0,65 i

i 20 c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp(OBzl)-IND

t j 716 mg (1 mmole) du pentapeptide-hydrazide * Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N„H sont dissous dans 10 ml de dimé- ! 1 6 j thylformamide. La solution est refroidie à -10°C, puis ad- [ ditionnëe d'une solution aqueuse concentrée de 0,7 ml 25 d'acide chlorhydrique 6N et de 75 mg de nitrite de sodium.

Le mélange réactionnel est agité a -5°C pendant 10 minutes, puis, additionné de la solution du sel trifluoroacëtique | · de 4 38 mg (1 mmole) de H-Asp (OBzl)-inâoline préparée avec { 0,7 ml de triéthylamine et 2 ml de diméthylformamide. Si 1 30 cela est nécessaire, on ajuste le pH à 8 avec de la triéthy- : t Λ .

i‘ lamine. Le mélange est agite a -5°C pendant 1 heure et à 0°C pendant 12 heures. Le diméthylformamide est chassé par ! distillation sous vide, le résidu est trituré avec de l'eau, filtré, lavé avec de l'éthanol et de l'acétate d’éthyle, ! 35 puis dissous dans du diméthylformamide, traité à chaud avec » 24 du charbon et cristallisé par addition d'éther.

Rendement : 600 mg (60 %)

C53H56N10°11 : 1008'9 p.f.: 172-174°C

~ 5 Rf (9) = 0,7; Rf (10) = 0,4; Rf (1) = 0,35.

d) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND

La solution de 500 mg (0,5 mmole) de l'hexapeptide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp(OBzl)-IND dans 0,5 ml de dimêthyΙ-ΙΟ formamide et 30 ml d'une solution d'acide acétique à 50 % est hydrogéné en présence de 50 mg d'un catalyseur comprenant 10 % de palladium sur du charbon, pendant 2 heures.

Le catalyseur est séparé par filtration, puis le solvant est évaporé sous vide et le résidu est cristallisé avec 15 de l'éther à partir du diméthylformamide.

Rendement : 380 mg ( 83 %). p. f. : 219-221°C

]Ja]^ = -37,7 ° (c = 1,diméthyl formamide) 20 Rf (9) = 0,6; Rf (10) = 0,4; Rf (1) = 0,1 e) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND LLeu_£rgwpro_EA La solution de 42 mg (0,044 mmole) de l'hexapeptide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND dans 1 ml de diméthyl- 25 formamide est refroidie à 0°C et additionnée de 7,8 yl de disopropylcarbodiimide. Après 10 minutes d'agitation, on ajoute une solution dans du diméthylformamide, de 20 mg (0,044 mmole) de chlorhydrate de H-Leu-Arg-Pro-EA neutralisé avec de la triëthylamine. Le mélange réactionnel est agité 30 à la température ambiante pendant 12 heures, puis le

. Y

i 1 solvant est évaporé sous vide. Le résidu est soumis ê une ; chromatographie sur une colonne Sephadex G-25 dans de f ! l'acide acétique 0,2K. Les fractions contenant le principal : produit sont collectées et lyophilisées.

\ 35 Rendement : 28 mg (48 %)- i 1 î 25 .

C65H85N17°13: 1311 Λ Λ [α|ρ - 39f6 ° (c = 0,25; acide acétique à 25 %).

Rf (13) = 0,8; Rf (9) = 0,75, Rf (5) = 0,7; Rf (10) = 0,5 I*'*' 5 Exemple 8

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-ANI ^-Leu- Arg-Pro-Gly-NH

a) BOC-Asp(OBzl)-ANI

3,23 g (10 mmoles)de l'ester benzyligue en (3 d'acide t-butyloxy-carbonyl-aspartique sont dissous dans 10 50 ml d'acétate d'éthyle, refroidi à 0°C et additionnés de 0,95 g d'aniline et de 2,26 g de dicyclohexyl-carbodiimide Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante I pendant 6 heures, la solution est séparée par filtration, puis lavée avec une solution d'acide citrique à 10 %, une 15 solution saturée de carbonate acide de sodium et une Xv solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur du sul- ! fate de sodium anhydre et évaporée sous vide. Les cristaux I obtenus après évaporation sont triturés avec de l’éther I de pétrole, filtrés et séchés, s 20 Rendement ; 4g (96 %) | C22H26N2°5‘‘ 398'3

:| p.f. : 105-106°C

1 i~t22 = -6° (c = 1, diméthyl formamide) 25 Rf(il) = 0,8; Rf (12) = 0,95; Rf (8) = 0,4

b) BOC-Asp-ANI

^ 3 g de t.-butyloxy-carbonyl-aspartoyl-bëta-(ester- benzyliqueralpha-anilide sont dissous dans 20 ml de !i 30 méthanol et hydrogénés en présence de 300 mg d’un cataly- ! seur comprenant 10 % de palladium sur du charbon. On sépare le catalyseur en le filtrant, on évapore le solvant sous vide et cristallise le résidu avec de l'eau â partir jj d’éthanol.

35 Rendement :2,05g(88%). j 26

Analyse pour la formule ci5H2oN2°5 : (308r2):

Valeurs calculées : C 58,44 H 6,49

Valeurs trouvées : C 58,6 H 6,56

p.f.s 157-158°C

w 5 i - [ail2 = -12° (c = 1, diméthyl formamide)

wi. L JD

Rf (11) = 0,7; Rf (12) = 0,85; Rf (8) = 0,05 c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aip-ANI ^Ieu-Arg-Pro-Gly-N^ 10 La synthèse en phase solide du peptide, le détachement de celui-ci à partir du polymère avec de l'acide fluorhydrique, ainsi que la purification chromatographique du peptide brut, sont effectués selon la procédure qui est décrite dans l’exemple 4 c), sauf que le composé qui 15 est préparé selon l'exemple 8 b) est utilisé en tant que ~ 6-aminoacide. On obtient ainsi 82 mg (12,5 %) du produit '' pur.

| C63H83N18°14 : 1315 ! 20 Wl2 = "58,3 0 (c = 1, eau) * Rf (9) = 0,5; Rf (10) = 0,2; Rf (12) = 0,8 t Analyse des amino acides : NH^: 1,23; Arg: 0,95; Asp: 1:1; !· i

Glu: 1,08; Pro: 1,01; Gly: 1,00; l; Leu: 1,1; Tyr: 0,85; Ser: 0^99 25

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de i mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse 30 au contraire toutes les variantes qui peuvent venir a ; , l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter au | cadre, ni de la portée de la présente invention.

Y

: »

Claims (5)

27

1. Dérivés de la gonadolibérine, caractérisés en ce qu'ils sont représentés par la formule générale (I) ci-après : ^ 5123456 789 10 {I) -T Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X LLeu_£.rg_pro_y J dans laquelle, X représente un groupe -O-R,(oü R est un groupe benzyle ou un groupe alcoyle en C.^^), et un groupe 1 ^ ^ 10 ’ ° 12 R et R sont indépendamment un atome d'hydrogène, un groupe alcoyle en C^^, aryle, aryl-alcoyle (en C·^^) ou bien, ils forment conjointement avec l'atome d'azote adjacent un groupe morpholino, 1-indolinyle ou 1-pyrro-w 15 lidinyle), ou le groupe ^ cycloalkyle. X est un groupe glycine-amide ou un alcoyl (en C^^iamide, les sels d'addition formés avec des acides utilisables en thérapeutique et des complexes de ceux-ci, ainsi que des compositions pharmaceutiques les contenant. 20

2. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant : Glp-His-T rp-S e r-Tyr-As p-OHe l-Leu-Arg-Pro-EA, Glp-His-T rp-Ser-Tyr-Asp-DEA LLeu-Arg-Pro~EA,

25 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-iNH2 Li_eu-Arg-Pro-Gly-NH2, Glp-His-T rp-Ser-Tyr-Asp-FBA LLeu_Arg-Pro-Gly~NH2, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-CBA LLeu-Arg-Pro-Gly-NH2. ^ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR ^Leu-Arg-Pro-Gly-m2, V Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND ’-Leu-Arg-rro-^A, l. -__ Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-ANI l-Leu-Arq-Pro-Gly-NHg, et les -sels et complexes de ceux-ci, utilisables en thérapeutique.

3, Préparation pour la préparation de dérivés de gonadolibërine représentés par la formule générale (I) A ! ' 28 ci-après : 123 456 789 10 1-î (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X *-Leu-Arg-Pro-Y dans laquelle, ΐ- 5 X représente un groupe -O-R (où R est un groupe benzyle ou r. - Jjl alcoyle en C^^), un groupe _N ^ (dans lequel 12 ""R2 R et R sont indépendamment un atome d'hydrogène, un groupe alcoyle en C·^,., aryle, aryl-alcoyle (en · 110 ou ils forment conjointement avec l'atome d'azote adja cent, un groupe morpholino, 1-indolinyle ou 1-pyrro-lidinyle) , ou le groupe cycloalkyle. Y est un groupe glycine-amide ou alcoyl (en C^^î-amide J leurs sels d'addition formés avec des acides utilisables 15 en thérapeutique et leurs complexes, caractérisée en ce que : v a^) un tëtra- ou pentapeptide représenté par la formule générale (II) ci-après : H-Asp-X ^-Leu-Arg-Pro-Y (II) 20 où X et Y sont tels que définis plus haut, est condensé avec le pentapeptide-azide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N^, ou | a£) un hexapeptide représenté par la formule 1 générale (III) ci-après :

25. E i (III) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X .où X est tel que défini plus haut et E est un groupe i r hydroxy, azide ou K-succinimice ou un groupe phénoxy 30 éventuellement substitué avec un croupe nitro ou un ou ; ' plusieurs atomes d’halogène, de préférence avec un groupe p-nitro, 2,4,6-trichloro-phénoxy, pentachloro-phénoxy ou pentafluorophonoxy, est condensé avec un tri- ou têtrapep-tide représenté par la formule générale (IV) ci-après : 35 fi-Leu-Arg-Pro-Y ( N i * 29 où Y est tel que défini plus haut, ou a^) pour préparer des composés de formule générale (I) dans laquelle un groupe glycinë-amide est sur le C-terminal de la molécule, de la BOC-glycine est ^ 5 couplée à une résine de polystyrêne-divinyl-benzêne -, - chloromëthylëe contenant 1 à 3 %, de préférence 2 % de réticulations, le groupe BOC est détaché des composés ainsi obtenus représentés par la formule (V) ci-après : BOC-Gly-O-CI^-polymère (V) 10 puis, à partir du C-terminal, des aminoacides ayant des groupes protecteurs sont couplés en une séquence appro-1 priée au peptide-polymère par une répétition périodique d'opérations de coupure et de couplage et le peptide prêt Iest détaché du peptide-polymère par ammonolyse et les 15 groupes protecteurs sont éliminés par traitement avec ^ de l'acide fluorhydrique, ou a^) pour préparer des composés de formule générale (I) dans laquelle un groupe glycinë-amide est i; sur le C-terminal de la molécule, de la BOC-glycine est i.j 2. couplée à une résine de polystyrène-divinyl-benzëne conte- i nant des groupes benzhydryl-amino et 1 ä 3 %, de préférence 2. de réticulation et le groupe BOC est détaché du | composé ainsi obtenu représenté par la formule générale ij (VI) ci-après ; i ' . 25 BOC-Gly-NH-CH-polymère C6H5 puis, à partir du C-terminal, des aminoacides pourvus de groupes protecteurs sont couplés en une séquence appropriée ^ 30 par une répétition périodique ces opérations de coupure - et de couplage, et le peptide prêt est détaché du peptide- polymère et les groupes protecteurs sont éliminés par traitement avec de l'acide fluorhydrique, ou a_) pour préparer des composés de formule gêné-35 raie (I) dans laquelle il y a un groupe -Pro-Y sur le 4k 30 A C-terminal de la molécule, où Y est tel gue défini plus haut, la BOC-proline est attachée ä une résine de poly-styrène-divinylbenzène chloromêthylëe contenant 1 à 3 %, de préférence 2 % de réticulations et le groupe BOC est 5= 5 détaché du composé ainsi obtenu représenté par la formule u ' (VII) ci-après : BOC-Gly-O-C^-polymère (VII) puis, à partir du C-terminal, des aminoacides pourvus de groupes protecteurs sont couplés en une séquence 10 appropriée au peptide-polymère par une répétition périodique des opérations de coupure et de couplage et, le peptide prêt est détaché du peptide-polymère par amino-lyse et les groupes protecteurs sont éliminés par traitement avec l'acide fluorhydrique et, si cela est désiré, 15 le nona- et resp, le décapeptide-amide ainsi obtenu est ~ traité avec un acide acceptable du point de vue pharma- -1 ceutique pour former un sel d'addition acide, ou, si cela est désiré, la base libre est séparée à partir du sel d'addition acide par réaction de celui-ci avec une base 20 et, si cela est désiré, le nona- et resp. le décapeptide- amide ainsi obtenu est transformé en un complexe métallique.

4, Préparations pharmaceutiques exerçant un puissant effet sur le processus de la reproduction des vertèbres, caractérisées en ce qu'elles comprennent une 25 quantité active d'un composé de formule générale (I) suivant la revendication 1, ou d'un sel ou complexe acceptable du point de vue pharmaceutique de celui-ci, en mélange avec des supports, charges, diluants et agents , adiuvants oharr.aceutioues. ' f . „ . .

5. Procédé pour la préparation ce compositions ;v pharmaceutiques suivant la revendication 4, caractérise en ce qu'on mélange un composé de formule générale (I) ou un complexe ou un sel acceptable du point de vue pharmaceutique de celui-ci, avec des supports et/ou adjuvants pharma-35 ceutiques. j ψ