DK163247B - Gonadolibeinderivater, farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og complexer heraf samt en fremgangsmaade til fremstilling af disse og et farmaceutisk praeparat indeholdende disse - Google Patents
Gonadolibeinderivater, farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og complexer heraf samt en fremgangsmaade til fremstilling af disse og et farmaceutisk praeparat indeholdende disse Download PDFInfo
- Publication number
- DK163247B DK163247B DK171884A DK171884A DK163247B DK 163247 B DK163247 B DK 163247B DK 171884 A DK171884 A DK 171884A DK 171884 A DK171884 A DK 171884A DK 163247 B DK163247 B DK 163247B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- asp
- pro
- arg
- tyr
- ser
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/13—Luteinizing hormone-releasing hormone; related peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
i
DK 163247 B
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte gonadoliberinderiva-ter med den almene formel I
123456 789 10
Glp-Hi’s-7rp-Ser-Tyr-Asp-X t-Leu-Arg-Pro-Y i de additionssalte, som dannes med terapeutisk anvendelige syrer, og 5 complexer deraf samt farmaceutiske præparater, som indeholder dem. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af derivaterne med formlen I. I den almene formel I betegner X betegner en -0-R-gruppe, hvor R betegner benzyl eller ^-al-kyl, en 10 r! -N -gruppe, \*2 hvor R1 og R2 uafhængigt af hinanden betegner hydrogen, alkyl, aryl, C3 g-cycloalkyl eller aryl-C^g-alkyl, eller 15 sammen med det nabostillede nitrogenatom betegner morpholino, 1-indolinyl eller 1-pyrrolidinyl, og Y betegner et glycinamid eller ^-alkylamid.
De i formlen anvendte forkortelser stemmer overens med den inden for peptidkemien accepterede nomenklatur, som fx er beskrevet i J. Biol.
20 Chem. 241, 1966, s. 527 og 247, 1972 s. 977. Andre forkortelser, som anvendes i nærværende beskrivelse, er: EA = ethylamino; DEA - diethy-lamino; CBA - cyclobutylamino; FBA = (l,l-dimethyl-2-phenyl)ethylami-no; IND = 1-indolinyl; PIR - 1-pyrrolidinyl; ANI - phenylamino; BOC = tert.butyloxycarbonyl.
25 Det er en generel egenskab ved gonadoliberin (andre navne, som kendes fra litteraturen, er gonadotropi-frigivende hormon, GnRH, LH-RH, luteiniserings- og follikelstimulerende hormon, 1H/FSH-RH) og dens kendte derivater, at de er i stand til af frigive luteiniserings-hormonet (LH) og det follikelstimulerende hormon (FSH). .
2
DK 163247 B
Det kendes fra litteraturen (M. Monahan et al., Biochemistry 12, 1973, s. 4616-4620; J. Sandow et al., Control of Ovulation, Butter-worths, London, 1978 s. 49-70), at disse derivater af gonadoliberin, som i 6-stillingen i stedet for en glycindel indeholder aminosyrer 5 med D-konfiguration eller derivater deraf, og endvidere sådanne, hvor glycinamiddelen i 10-stillingen er substitueret med amidgrupper med en aliphatisk carbonkæde (M. Fujino et al., J. Med. Chem. 16, 1973, s. 1144), har en biologisk virkning, som er forøget og længere varende i forhold til gonadoliberins virkning. I modsætning hertil er 10 det også kendt, at de gonadoliberinderivater, som indeholder en aminosyre med L-konfiguration i 6-stillingen, såsom L-alanin, L-prolin, L-valin (Monahan et al., Biochemistry 12, 1973, s. 4616), L-isoleucin (D. Coy et al., J. Med. Chem. 16, 1973, s. 1140), eller aminosyrer, som ikke har noget asymmetrisk centrum såsom 7-aminosmør-15 syre, /?-alanin (J. Rivier et al., Peptides: Chemistry, Structure,
Biology, Red. R. Walter, J. Meiehhofer, Ann Arbor Science Publishers Inc., Michigan, 1975, s. 803), eller sarcosin (W. Arnold et al., J.
Med. Chem. 17, 1974, s. 314) kun har en minimal aktivitet.
Med hensyn til LH-frigivelse har kun én speciel 7-lactamring med 20 L-konfiguration vist sig at være en biologisk virksom substituent i 6-stillingen (Veber et al., Science 210, 1980, s. 656).
Opfindelsen har til formål at tilvejebringe hidtil ukendte gonadoliberinderivater, som har en mere gunstig virkning end de kendte analoger.
25 Opfindelsen er baseret på den erkendelse, at hvis L-asparaginsyre via sin β-carboxygruppe indbygges i 6-stillingen af gonadoliberinpep- tidkæden, og dens a-carboxygruppe samtidig lades fri eller forbindes i med en relativt lille atomgruppe, har de således vundne gonadoliberinderivater en biologisk virkning, som svarer til eller endnu bedre 30 end virkningen af gonadoliberinderivater, som har en D-aminosyre i 6-stillingen.
Forbindelserne med den almene formel I kan fremstilles ved en fremgangsmåde, der er kendetegnet ved, at
DK 163247 B
3
al) et tetra- eller pentapeptid med den almene formel II
H-Asp-X^Leu-Arg-Pro-Y 11 hvor X og Y har den ovenfor anførte betydning, kondenseres med penta-peptidazidet med formlen Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3, eller
5 a2) et hexapeptid med den almene formel III
E
i XXX
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-x hvor X har den ovenfor anførte betydning, og E betegner hydroxy, azid eller N-succinimidoxy eller en phenoxygruppe, som eventuelt er substitueret med en nitrogruppe eller ét eller flere halogenatomer,
10 fortrinsvis p-nitro, 2,4,6-trichlorphenoxy, pentachlorphenoxy eller pentafluorphenoxy, kondenseres med et tri- eller tetrapeptid med den almene formel IV
H-Leu-Arg-Pro-Y IV
hvor Y har den ovenfor anførte betydning, eller 15 a3) når der skal fremstilles forbindelser med den almene formel I,
hvor der sidder en glycinamidgruppe ved molekylets C-terminale del, kobles BOC-glycin til en chlormethyleret polystyren-divinylbenzenhar-piks indeholdende 1-3%, fortrinsvis 2%, tværbindinger, BOC-gruppen spaltes fra de således vundne forbindelser med formlen V
20 B0C-Gly-0-CH2-polymer V
hvorefter aminosyrer forsynet med beskyttelsesgrupper kobles i en hensigtsmæssig sekvens til peptidpolymeren startende fra den C-ter-minale ende ved periodisk gentagelse af spaltnings- og koblingsproceduren, og det færdige peptid spaltes fra peptidpolymeren .ved ammono- 4
DK 163247 B
lyse, og beskyttelsesgrupperne elimineres ved behandling med hydrogenfluorid, eller
a4) når der skal fremstilles forbindelser med den almene formel I, hvor der sidder et glycinamid ved molekylets C-terminale ende, kobles 5 BOC-glycin til en polys tyren-divinylbenzenharpiks, der indeholder benzhydrylaminogrupper og 1-3%, fortrinsvis 2%, tværbindinger, og BOC-gruppen spaltes fra den således vundne forbindelse med formlen VI
BOC-Gly-NH-CH-polymer VI
Xc6h5 10 hvorefter aminosyrer forsynet med beskyttelsesgrupper i en hensigtsmæssig sekvens kobles til peptidpolymeren startende fra den C-termi-nale ende ved periodisk gentagelse af spaltnings- og koblingsprocedurerne, og det færdige peptid spaltes fra, og beskyttelsesgrupperne elimineres fra peptidpolymeren ved behandling med hydrogenfluorid, 15 eller a5) når der skal fremstilles forbindelser med den almene formel I, hvor der sidder en -Pro-Y-gruppe ved molekylets C-terminale ende, idet Y har den ovenfor anførte betydning, fæstnes BOC-prolin til en chlormethyleret polystyren-divinylbenzenharpiks med 1-3%, fortrinsvis 20 2%, tværbindinger, og BOC-gruppen spaltes fra den således vundne
forbindelse med formlen VII
BOC-Pro-O-CH2-polymer VII
hvorefter aminosyreme forsynet med beskyttelsesgrupper kobles i en hensigtsmæssig sekvens til peptidpolymeren startende fra den C-ter-25 minale ende ved periodisk gentagelse af spaltnings- og koblingsprocedurerne, og det færdige peptid spaltes fra peptidpolymeren ved amino-lyse, og beskyttelsesgrupperne elimineres ved behandling med hydrogenfluorid.
I fremgangsmåde al) kan en tetra- eller pentapeptidbestanddel frem-30 stilles ved fragmentkondensation eller trinvis kædeforlængelse på i og for sig kendt måde ved aktivering med et azid, blandet arihydrid,
DK 163247 B
5
carbodiimid, aktiv ester eller en anden aktiverende gruppe. Hensigtsmæssigt acyleres H-Leu-Arg(NC>2)-Pro-Y tri- eller tetrapeptidet, hvor Y har den ovenfor anførte betydning, med asparaginsyrederivaterne med den almene formel VIII
5 E
!
Z-Asp-X VIII
hvor Z betegner tert.butyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl, og X og E har den ovenfor anførte betydning, hvilke asparaginsyrederivater har en tert.butyloxycarbonyl- eller benzyloxycarbonylbeskyttelses-10 gruppe ved deres aminogruppe, hvorefter beskyttelsesgrupperne elimineres fra den vundne forbindelse.
I fremgangsmåde a2) fremstilles hexapeptidet med den almene formel III hensigtsmæssigt ved acylering af asparaginsyrederivatet med den almene formel IX
15 O-Ro
H-Asp-X IX
hvor X har den ovenfor anførte betydning, og R3 betegner hydrogen, methyl, benzyl eller tert.butyl, med et Glp-His-Trp-Ser-Tyr-^-pen-tapeptidazid.
20 De i fremgangsmåde a3) anvendte fas tf asepeptidsynteseme toder er kendte fra litteraturen (J. H. Stewart, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, 1969).
Adskillige gonadoliberinanaloger blev fremstillet ved automatisk kontrolleret fastfasesyntese (D. Coy et al., Biochemistry 13, 1974, s.
25 323; D. Coy et al., J. Med. Chem. 19, 1976, s. 423); fremgangsmåde £
4) adskiller sig fra de kendte ved, at der anvendes et aminosyrede-rivat med den almene formel X
BOC-Asp-X X
O-R3 30 hvor X har den ovenfor anførte betydning, og R3 betegner .hydrogen, p-nitrophenyl eller pentafluorphenyl, som aminosyren i 6-stillingen.
6
DK 163247 B
Til midlertidig beskyttelse af de andre aminosyrer anvendes sidekæder af molekylgrupperne, der bagefter kan elimineres ved indvirkning af hydrogenfluorid; fx i tilfælde af arginin og histidin p-toluensulfo-nylgruppen, i tilfælde af serin og tyrosin benzylgruppen.
5 Om ønsket omsættes det vundne nona- eller decapeptidamid med en farmaceutisk acceptabel syre til dannelse af et syreadditionssalt, eller den frie base frigives om ønsket fra syreadditionssaltet ved omsætning med en base, og det vundne nona- eller decapeptidamid omdannes om ønsket til et metalkompleks.
10 Der kan fremstilles farmaceutiske præparater ved at blande en forbindelse med den almene formel I eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller kompleks deraf med bærer og/eller hjælpestoffer i tablet-, dragée-, kapsel-, suppositorie-, injicerbar opløsnings-, næsesprayeller anden form.
15 De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at de indeholder en aktiv mængde af en forbindelse med den almene formel I ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller complex deraf blandet med farmaceutiske bærere, fyldstoffer, fortyndingsmidler og hjælpestoffer.
20 En fordelagtig repræsentant for forbindelserne med den almene formel I er forbindelsen med formlen XI
i-1
Glp-Hls-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEA 1Leu-Arg-Pro-EA XI
der i androgeniserede testrotter forårsagede en mere effektiv ovulation end det naturlige LH-RH på trods af, at forbindelsen med formlen 25 XI havde en én størrelsesorden mindre IH-frigivende effekt end det naturlige LH-RH.
en anden test afgav sterlet- og havkat-moderfisk ved indvirkning af 20 /ig/kg af forbindelsen med formlen XI op til 80% af deres rogn, hvorimod der ikke forekom ovulation hos kontrolgruppen, der under de 30 samme betingelser var blevet administreret D-Phe®, desGly^-LH- RH-ethylamid, der i litteraturen er kendt for at være superaktivt.
DK 163247 B
7
En 100 /ig/kg dosis af forbindelsen med formlen XI, som blev administreret intramuskulært samtidig inseminationen forøgede antallet af drægtigheder hos kvæg med 25-30%, hvorimod den samme dosis af det naturlige LH-RH ikke var effektiv.
5 Med en enkelt dosis på 10 /tg af forbindelsen med formlen XI kunne man forårsage brunst hos blå- og sølvræve udenfor brunsttiden, hvorimod det naturlige LH-RH viste sig at være ineffektivt på dette tidspunkt.
En anden forbindelse ifølge opfindelsen, (/S-Asp^a-anilid)®-LH-RH, forøgede sæd- og testosterondannelsen hos kalkunhaner meget bedre og 10 i længere tid end fx D-Phe^-LH-RH, som har en analog struktur. Den samme forbindelse forkortede i det væsentlige kalkunhøners rugetid, hvorimod det naturlige LH-RH var ineffektivt.
Ovenstående eksempler viser, at de hidtil ukendte gonadoliberinanalo-ger ifølge opfindelsen har en kraftig virkning på hvirveldyrets 15 formeringsprocesser. Den gunstige anvendelse deraf er påvist ved adskillige tests inden for husdyrbrugområdet.
En væsentlig fordel ved forbindelserne med den almene formel I i modsætning til de kendte gonadoliberinanaloger med stor virkning er, at de udelukkende er opbygget af L-aminosyrer, og at deres ovulati-20 oninducerende og testeronfrigivende virkning undersøgt i biologiske tests samtidig er bedre end virkningen af de såkaldte superaktive gonadoliberinderivater, som indeholder glycin eller D-aminosyre i 6-stillingen.
Forbindelserne ifølge opfindelsen og fremstillingen deraf er beskre-25 vet i nedenstående eksempler. I eksemplerne blev de tyndtlagschroma-tografiske Rj-værdier på silicagel DC, alufolien/Merck-plader bestemt i følgende opløsningsmiddelblandinger: 1 2 3 4
Ethylacetat - pyridin - eddikesyre - vand 60:20:6:11 2 ethylacetat - pyridin - eddikesyre - vand 120:20:6:11 3 30 3. ethylacetat - pyridin - eddikesyre - vand 240:20:6:11 4 ethylacetat - pyridin - eddikesyre - vand 480:20:6:11 8
DK 163247 B
5. ethylacetat - pyridin - eddikesyre - vand 30:20:6:11 6. acetone - chloroform 1:15 7. acetone - toluen 1:1 8. eddikesyre - benzen 1:7 5 9. n-butanol - eddikesyre - ethylacetat - vand 1:1:1:1 10. n-butanol - eddikesyre - vand 4:1:1 11. n-butanol - eddikesyre - vand 4:1:5 (øvre fase) 12. ethylacetat - pyridin - eddikesyre - vand 5:5:1:3 10 13. butanol - pyridin - eddikesyre - vand 60:20:6:11
Smeltepunktsangivelserne er ikke korrigerede.
EKSEMPEL 1
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OMeLeu-Arg-Pro-EA
a) Z-Asp-OMe -Leu-Arg(N02> -Pro-EA
15 Hydrogenbromidsaltet af 537 mg (1 millimol) H-Leu-Arg(NO2)-Pro-EA
opløses i 10 ml dimethylformamid, hvorefter der ved en temperatur på 0eC tilsættes 447 mg (1 millimol) Z-Asp(OPFP)-OMe-derivat. Reaktionsblandingens pH-værdi indstilles til 8 med triethylamin under omrøring, hvorefter opløsningen inddampes i vakuum efter 6 timer. Rema-20 nensen tritureres først med ether og derefter med vand, filtreres, og udfældes til sidst af methanol ved tilsætning af ether. Herved fås 440 mg (62%) af et hvidt amorft stof.
^32^49^9^10* ^9,6.
Smeltepunkt 182-184eC.
25 [a]22D - -58,4° (c - 1 i methanol).
Rf-Værdi (2) - 0,5; Rf-værdi (9) - 0,85; Rf-værdi (12) - 0,9.
b) Η-Asp-OMe -Leu-Arg-Pro-EA.2 AcOH
400 mg (0,56 millimol) af tetrapeptidet Z-Asp-OMe -Le"u-Arg(N02)-Pro-EA opløses i 20 ml 50%'s eddikesyre og hydrogeneres i nærværelse
DK 163247 B
9 af 50 mg af en 10%'s palladium-på-kul-katalysator i 4 timer. Katalysatoren frafiltreres, eddikesyre fjernes i vakuum, og remanensen tritureres med ether, filtreres og tørres i vakuum. Udbytte 360 mg (97%).
5 C28h52N8°10: 660’5·
Rf-Værdi (1) - 0,15; Rf-værdi (9) - 0,6; Rf-værdi (10) - 0,25; Rf-værdi (5) - 0,45.
I I
c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-OMe LLeu-Arg-Pro-EA
716 mg (1 millimol) af pentapeptidhydrazidet Glp-His-Trp-Ser-Tyr-10 N2H3 opløses i 20 ml dimethylformamid. Opløsningen afkøles til -10"C, hvorefter der tilsættes 0,7 ml 6N saltsyreopløsning og derefter en koncentreret vandig opløsning af 75 mg natriumnitrit. Efter omrøring i 10 minutter ved -5°C sættes 660 mg (1 millimol) H-Aåp-OMe i-Leu-Arg-Pro-EA-diacetat og en afkølet opløsning af 0,7 ml triethylamin i 15 5 ml dimethylformamid til reaktionsblandingen. Om nødvendigt ind stilles opløsningens pH-værdi til 8 med triethylamin. Opløsningen omrøres i 1 time ved -5eC og derefter i 12 timer ved 0°C, og dimet-hylformamidet fjernes i vakuum. Remanensen tritureres med ether og filtreres, hvorefter den fraktioneres i 0,2N eddikesyre på en Sepha-20 dex® G-25 søjle. De fraktioner, som indeholder hovedproduktet, underkastes chromatografi på en søjle af reversfasemedie C^g-bundet sili-cagel (Whatman, LRP-1) i 30%'s vandig methanol, hvorefter de rene fraktioner lyofiliseres. Udbytte 712 mg (58%).
C58H80N16°14: 1225 * 25 « -53,4° (c - 1 i vand).
Rf-Værdi (5) - 0,5; Rf-værdi (10) - 0,15; Rf-værdi (9) - 0,7.
Aminosyreanalyse: Glu: 1,02; His: 0,97; Ser: 0,95; Tyr: 1,01;
Asp: 1,07; Leu: 1,00; Pro: 0,93; Arg: 1,02.
EKSEMPEL 2
DK 163247 B
10 1 [
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-DEA LLeu-Arg-Pro-EA
a) Boc-Asp (OBzl)-DEA
3,23 g (10 millimol) tert.butoxycarbonyl-asparaginsyre-)9-benzylester 5 opløses i 100 ml dimethylformamid ved en temperatur på 0°C. Til opløsningen sættes 1,35 g (10 millimol) N-hydroxybenztriazol og 2,26 g (11 millimol) dicyclohexylcarbodiimid, hvorefter den omrøres i 15 minutter ved 0°C, hvorpå en opløsning af 1,0 ml (0,73 g; 10 millimol) diethylamin i 20 ml ethylacetat dryppes til den omrørte reak-10 tionsblanding. Omrøring fortsætter i 30 minutter ved 0QC og derefter i 4 timer ved stuetemperatur. Bundfaldet filtreres, moderluden optages efter inddampning i ethylacetat og rystes gentagne gange med en 10%'s kold citronsyreopløsning, mættet natriumhydrogencarbonatop-løsning og en mættet natriumchloridopløsning. Ethylacetatfasen tørres 15 over vandfrit natriumsulfat og inddampes i vakuum. Der fås 3,6 g (95%) af en bleggul olie.
^20%0^2®5 · ®78»2 · [a]$2 = -58,4° (c - 1,0 i methanol).
Rf-Værdi (4) - 0,95; Rf-værdi (6) - 0,95; Rf-værdi (7) - 0,75.
20 b) BOC-Asp-DEA
3,8 g (10 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-β-benzylester-a-diethylamid opløses i 50 ml methanol og hydrogeneres i nærværelse af 300 mg af en 10%'s palladium-på-kul-katalysator i 2 timer. Efter frafiltrering af katalysatoren inddampes opløsningen og tørres i en 25 exsiccator. Herved fås 2,8 g (100%) af et bleggult skumagtigt stof.
C13H25N2°5: 289>^-· [a]$2 = -60,1° (c 1 i methanol).
Rf-Værdi (4) = 0,7; Rf-værdi (6) - 0,9; Rf-værdi (8) - 0,8.
DK 163247 B
11
c) BOC-Asp (OPFP)-DEA
2,9 g (10 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-a-diethylamid opløses i 100 ml ethylacetat ved 0eC under omrøring, hvorefter der tilsættes 1,84 g (10 millimol) pentafluorphenol og 2,26 g (11 milli-5 mol) dicyclohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres ved en temperatur på 0°C i 30 minutter og derefter ved stuetemperatur i 24 timer. Efter frafiltrering af det udskilte bundfald inddampes ethyla-cetatopløsningen, remanensen optages i petroleumsether, det fraskilte bundfald frafiltreres igen, og opløsningen inddampes. Efter tørring 10 fås 4,4 g (99%) af en farveløs olie.
C19H24N2°5F5: «5,1.
t«]js2 - -75,0· (c - 1 i methanol).
Rf-Værdi (8) - 0,95; Rf-værdi (6) - 0,9; Rf-værdi (4) - 0,75; Rf-værdi (7) =0,8.
15 d) BOC-Asp-DEALLeu-Arg(N02)-Pro-EA
Hydrobromidsaltet af 536 mg (1 millimol) H-Leu-Arg(N(>2)-Pro-ethylamid opløses i 5 ml dimethylformamid. Opløsningen afkøles til 0eC, der tilsættes 0,14 ml (1 millimol) triethylamin og derefter 453 mg (1 mill imo 1) ter t. butoxycarbony lasparaginsyre - a - diethy lamid-/9 - penta-20 fluorphenylester. Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 5 timer, medens pH-værdien fra tid til anden indstilles til neutral med triethylamin. Efter inddampning af reaktionsblandingen tritureres remanensen med ether og filtreres. Det vundne råprodukt p.å ca. 780 mg renses ved chromatografi på en silicagelsøjle i en 4: l:l-blanding af 25 n-butanol, eddikesyre og vand. De hensigtsmæssige fraktioner samles og inddampes til tørhed i vakuum, og remanensen tritureres med ether.
Herved fås 470 mg (64%) af et hvidt pulver.
C32H57N10°9: 725’6· [e]g2 = -77,2° (c = 1,0 i methanol).
30 Smeltepunkt: 132-133eC.
Rf-Værdi (2) = 0,4; R£-værdi (9) = 0,85; Rf-værdi (10) - 0,55.
DK 163247 B
12
e) BOC-Asp-DEA '-Leu-Arg-Pro-EA.AcOH
730 mg (1 millimol) tetrapeptid BOC-Asp-DEA ^-Leu-Arg(N02) - Pro-EA opløses i 20 ml 50%'s eddikesyre og hydrogeneres i narværelse af 100 mg af en 10%'s palladium-på-kul-katalysator i 3 timer. Efter ind-5 dampning af reaktionsblandingen fås et chromatografisk ensartet olieagtigt produkt.
C34h63N9°9: 741»6·
Rf-Værdi (2): 0,05; Rf-værdi (9) = 0,65; Rf-værdi (1) = 0,6.
1-1
f) H-Asp-DEA ^-Leu-Arg-Pro-EA^TFA
10 740 mg (1 millimol) tetrapeptid BOC-Asp-DEA i-Leu-Arg-Pro-EA opløses i 10 ml trifluoreddikesyre og omrøres ved stuetemperatur i 15 minutter. Opløsningen inddampes i vakuum. Remanensen tritureres med ether, filtreres og tørres over NaOH. Herved fås 780 mg (96%) af et lettere hygroskopisk stof.
15 C31h5309N9F6: 809,2.
[tt]g2 * .40,6° (c - 1 i vand).
Rf-Værdi (11) = 0,2; Rf-værdi (5) - 0,4.
g) Glp -His -Trp - Ser-Tyr-Asp-DEA ^-Leu-Arg- Pro -EA. 2AcOH
286 mg (0,4 millimol) af pentapeptidhydrazidet Glp-His-Trp-Ser-Tyr-20 N2H3 opløses i 25 ml dime thy lformamid. Opløsningen afkøles til -10°C, og under omrøring tildryppes 0,27 ml 6N saltsyre og derefter en koncentreret vandig opløsning af 30,2 mg natriumnitrit. Efter 5 minutter tilsættes en opløsning af trifluoracetatsalt af 353 mg (0,4 millimol) af tetrapeptidet H-Asp-DEAiLeu-Arg-Pro-EA fremstillet i 25 1 ml dimethylformamid med 0,27 ml triethylamin ved -10eC. Om nødven digt indstilles reaktionsblandingen til en neutral pH-værdi med triethylamin, hvorefter den omrøres i 1 time ved en temperatur på -5eC, i 1 time ved 0eC og i 12 timer ved stuetemperatur.
Dimethylformamidet fjernes i vakuum, og remanensen underkastes chro-30 matografi på en silicagelsøjle med en 30:20:6:ll-blanding af ethyl-
DK 163247 B
13 acetat, pyridin, eddikesyre og vand. De rette fraktioner indsamles, inddampes i vakuum, tritureres med ether, filtreres og tørres. Herved fås 290 mg (50%) af et hvidt pulver.
C65»95»17°17: 1385' 5 Smeltepunkt: 180-181°C.
[ajj^ - -64,2° (c *= 1 i methanol).
Rj-Værdi (12) -= 0,85; Rf-værdi (5) - 0,35; Rf-værdi (11) « 0,25. Aminosyreanalyse: Asp: 1,0; Ser: 0,99; Glu: 1,01; Leu: 1,10;
Tyr: 1,00; His: 0,92; Arg: 0,98.
10 EKSEMPEL 3
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-NH2 HÆU-Arg-Pro-Gly-N^
a) BOC-Asp(OBzl)-OPFP
3,23 g (10 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-/9-benzylester opløses i 50 ml ethylacetat. Opløsningen afkøles til 0eC, og under 15 omrøring tilsættes 1,84 g (10 millimol) pentafluorphenol og 2,26 g (11 millimol) dicylohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres ved 0eC i 30 minutter og ved stuetemperatur i 12 timer. Efter filtrering inddampes opløsningen i vakuum, og remanensen opløses i 15 ml ether og krystalliseres ved tilsætning af 15 ml petroleumsether ved en 20 temperatur på -20°C. Udbytte 3,75 g (70%).
C22«20HlO6F5: 489·3·
Smeltepunkt: 84°C.
[α]β2 „ -18,1° (c - 1 i ethylacetat).
Rf-Værdi (7) - 0,9; Rf-værdi (4) - 0,95.
25 b) BOC-Asp(OBzl)-NH2
Til en opløsning af 970 mg (2 millimol) tert.butoxycarbonylasparagin-syre-jS-benzylester-a-pentafluorphenylester i 10 ml methanol sættes 10 ml methanol, som er mættet med ammoniak, ved 0eC og omrores ved 0°C i
DK 163247 B
14 30 minutter. Opløsningsmidlet afdampes i vakuum, og remanensen krystalliseres af en blanding af methanol og ether.
Analyse:
Beregnet for ^^gH22^2®5 (322,1): C 59,62 Ή 6,83 N 8,69.
5 Fundet: C 59,2 H 6,98 N 8,8.
Smeltepunkt: 159-161°C.
[a]$2 “ +1,1° (c - 1 i methanol).
Rf-Vsrdi (7) = 0,5; Rf-værdi (8) = 0,75; Rf-værdi (4) =0,9; Rf-værdi (6) = 0,95.
10 c) B0C-Asp-NH2 480 mg (1,5 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-/3-benzylester-ct-amid opløses i 10 ml methanol og hydrogeneres i nærværelse af 50 mg af en 10%'s palladium-på-kul-katalysator i 1 time. Efter frafiltre-ring af katalysatoren afdampes opløsningsmidlet i vakuum, og remanen-15 sen krystalliseres af vandig ethanol. Udbytte 246 mg (93%).
C9H16N205: 232,2.
Smeltepunkt: 145-146°C.
[a]g2 - -2,2° (c - 1 i methanol).
Rf-Værdi (7) = 0,05; Rf-værdi (8) = 0,2; Rf-værdi (4) =0,3; Rf-20 værdi (6) =0,1.
d) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-NH2 Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Syntesen af peptidet i fast fase, fraspaltning fra polymeren med hydrogenfluorid og chromatografisk rensning af det rå peptid udføres som beskrevet i eksempel 4c) med undtagelse af, at der som 6-amino-25 syre anvendes den i henhold til eksempel 3c) fremstillede forbindelse. Der fås 72 mg (12%) af et rent stof.
C57H79N18°14: 1239 * [a]j52 = -55,5° (c = 1 i vand).
Rf-Værdi (5) = 0,35; Rf-værdi (11) = 0,15; Rf-værdi (9) = 0,65; 30 Rf-værdi (13) = 0,15.
DK 163247 B
15
Aminosyreanalyse: Glu: 0,96; His: 1,04; Ser: 0,93;
Tyr: 1,02; Leu: 1,02; Pro: 0,94;
Gly: 1,00; Asp: 1,1.
EKSEMPEL 4 5 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-FBA i-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 a) BOC-Asp(OBzl)-a-[2-(4-chlorphenyl)isobutylamid] 5 g (15 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-/9-benzylester opløses i 100 ml ethylacetat og afkøles til 0eC, og til den omrørte reaktionsblanding sættes 2,1 g N-hydroxybenztriazol, 3,75 g dicyclo-10 hexylcarbodiimid og en opløsning af 3,5 g 2-(4-chlorphenyl) isobutyl-amin i 20 ml dimethylformamid. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 12 timer, hvorefter opløsningen filteres. Ethylacetatopløsningen rystes ud med en 10%'s citronsyreopløsning, mættet natriumhydrogen-carbonatopløsning og mættet natriumchloridopløsning, tørres over 15 vandfrit natriumsulfat, filtreres og inddampes i vakuum. Den resterende farveløse olie udkrystalliseres langsomt. Krystallerne vaskes med en blanding af ether og petroleumsether og tørres. Udbytte 5,5 g (75%).
C26H33N2O5CI: 488,2.
20 Smeltepunkt: 60-61°C.
[a]2p - -12,2* (c - 1 i methanol).
Rf-Værdi (7) - 0,75; Rf-værdi (8)-0,6,
b) B0C-Asp-FBA
En opløsning af 2,3 g (4,7 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsy-25 re-/3-benzylester-a-[2-(p-chlorphenyl)isobutylamid] i 30 ml methanol hydrogeneres i nærværelse af 200 mg af en 10%'s palladium-på-kul-katalysator i 2 timer, hvorefter katalysatoren filtreres fra, og opløsningsmidlet afdampes i vakuum. Remanensen tritureres i ether og krystalliseres af methanol med ether. Udbytte 1,5 g (87%).
DK 163247 B
16
Analyse:
Beregnet for Cf9H2gN2°5 (364,2): C 62,63 H 7,69.
Fundet: C 62,3 H 7,58.
Smeltepunkt 94-96°C.
5 [a]f5^ = -19° (c = 1 i methanol).
Rf-Værdi (3) = 0,2; Rf-værdi (2) = 0,3; Rf-værdi (7) = 0,15; Rf-værdi (8) = 0,8; Rf-værdi (10) - 0,15.
c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-FBA LLeU_Arg-Pro-Gly-NH2 1 g (0,5 millimol) benzhydrylaminpolymer anbringes i reaktionsbehol-10 deren af et automatisk peptidsynteseapparat (Beckman 990B) og omrøres i 30 ml dichlormethan i 4 timer. De beskyttede aminosyrederivater kobles med polymeren i en hensigtsmæssig sekvens ved cyclisk gentagelse af følgende (1-10) trin: 1. Vask med 30 ml dichlormethan i 3 x 3 minutter, - 15 2. vask med 30 ml af en l:2-blanding af trifluoreddikesyre og di chlormethan i 5 og 25 minutter, 3. vask med 30 ml dichlormethan i 3 x 3 minutter, 4. vask med 30 ml ethanol i 3 x 3 minutter, 5. vask med 30 ml chloroform i 3 x 3 minutter, 20 6. vask med 30 ml af en l:9-blanding af triethylamin og chloro form i 2 x 10 minutter, 7. vask med 30 ml chloroform i 3 x 3 minutter, 8. vask med 30 ml dichlormethan i 3 x 3 minutter, 9. inkubation af 1,5 millimol BOC-aminosyrederivat og 1,5 milli- 25 mol diisopropylcarbodiimid i 30 ml dichlormethan i 120 minut ter, og 10. vask med 30 ml dichlormethan i 3 x 3 minutter.
De beskyttede aminosyrederivater er følgende: BOC-Gly-OH, BOC-Pro-OH, B0C-Arg(Tos)-0H, BOC-Leu-OH, 30 BOC-Asp-FBA, B0C-Tyr(Bzl)-0H, B0C-Ser(Bzl)-0H, BOC-Trp-OH, B0C-His(Tos)-0H og Glp.
DK 163247 B
17
Efter kobling af alle aminosyrer tørres den færdige peptidpolymerhar-piks i vakuum og omrøres med 50 ml kodenseret hydrogenfluorid ved 0°C i nærværelse af 6 ml anisol i 45 minutter. Hydrogenfluoridet elimineres i en vandfri nitrogengasstrøm, remanensen udfældes med ether og 5 filtreres. Det filtrerede stof suspenderes i 50%'s eddikesyre og filtreres, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen føres gennem en Sephadex® G-25-søjle i 50%'s eddikesyreopløsning. Den rene hovedfraktion underkastes chromatografi på en silicagelsøjle med opløsningsmiddelblanding 10. De fraktioner, som indeholder det rene stof, 10 inddampes og lyofiliseres. Udbytte 70 mg (10%).
C67h91n18°14 = 1371’ [a]g2 - -56,4° (c - 1,0 i vand).
Rf-Værdi (13) = 0,25; Rf-værdi (9) = 0,7; Rf-værdi (11) - 0,2; Rf-værdi (5) - 0,5.
15 Aminosyreanalyse: Glu: 0,97; His: 1,05; Ser: 0,94; Pro: 0,95;
Tyr: 1,02; Asp: 1,02; Leu: 1,01; Gly: 1,00.
EKSEMPEL 5
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-CBA ^Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
a) B0C-Asp(0Bzl)-CBA
20 2,4 g (5 millimol) af den i henhold til eksempel 3/a fremstillede ter t. butoxycarbonylasparaginsyre -Ø-benzylester -α-pentafluorphenyle -ster opløses i 20 ml ethylacetat og afkøles til 0°C, og den afkølede opløsning af 0,42 ml (5 millimol) cyclobutylamin i 2 ml ethylacetat tildryppes. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur, 25 hvorefter den vaskes med 10%'s citronsyreopløsning, mættet natrium-hydrogencarbonatopløsning og mættet natriumchloridopløsning, tørres over vandfrit natriumsulfat, filtreres og inddampes i vakuum. Remanensen krystalliseres af ether med petroleumse ther. Udbytte 1,16 g (89%).
30 C20H28N2°5: 376’2·
Smeltepunkt: 84-86eC.
[a]$2 - -5,7° (c - 1,0 i methanol).
DK 163247 B
18
Rf-Værdi (8) =0,9; Rf-værdi (10) =0,9; Rf-værdi (7) — 0,75; Rf-værdi (11) =0,95.
b) BOC-Asp-CBA
1 g (2,65 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-/J-benzylester-a-5 cyclobutylamid opløses i 20 ml methanol og hydrogeneres i nærværelse af 100 mg 10%'s palladium-på-kul-katalysator i 2 timer. Efter fra-filtrering af katalysatoren inddampes opløsningen i vakuum, og remanensen krystalliseres af vandig ethanol. Udbytte 600 mg (79%).
Analyse: 10 Beregnet for 0^Η22Ν2°5 (286,1): C 54,54 H 7,69.
Fundet: C 53,9 H 7,68.
Smeltepunkt: 149-150eC.
[a]$2 = -9,5® (c = 1,0 i methanol).
Rf-Værdi (8) « 0,2; Rf-værdi (10) = 0,75; Rf-værdi (7)= 0,05.
15 c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-CBA U.eu-Arg-Pro-Gly-NH2
Fastfasesyntesen af peptidet, fraspaltningen fra polymeren med hydrogenfluorid og chromatografisk rensning af det rå peptid udføres som beskrevet i eksempel 4/c med undtagelse af, at der som 6-aminosyre anvendes den i henhold til eksempel 5/b fremstillede forbindel-20 se. Herved fås 68 mg (10,5%) af det rene peptid.
C61H85N18°14: 1291 * [“]β2 “ -44,88° (c = 1,0 i vand).
Rf-Værdi (11) = 0,2; Rf-værdi (9) = 0,7; Rf-værdi (13) = 0,2; Rf-værdi (5) = 0,4.
25 Aminosyreanalyse: Glu: 1,05; His: 0,96; Ser: 0,94; Tyr: 0,98;
Asp: 1,07; Leu: 1,02; Pro: 0,96; Gly: 1,00.
EKSEMPEL 6
DK 163247 B
19
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR “Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
a) BOC-Asp(OBzl)-PIR
3,2 g (10 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-j9-benzylester 5 opløses i 5 ml ethylacetat, og der tilsættes 1,35 g N-hydroxybenztri-azol, 2,26 g dicyclohexylcarbodiimid og opløsningen af 0,8 ml pyrro-lidin i 2 ml ethylacetat ved en temperatur på 0eC. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur, hvorefter den udrystes med 10%'s citronsyreopløsning, mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og 10 mættet natriumchloridopløsning. Den organiske fase tørres over vandfrit natriumsulfat, filtreres og inddampes i vakuum. Remanensen opløses i ether, filtreres og inddampes på ny. Herved fås 3,4 g (90%) af en olie.
0¾ · 376,2.
15 [<*]$ - -84,4° (c = 1,0 i methanol).
Rf-Værdi (7) = 0,75; Rf-værdi (4) * 0,95; Rf-værdi (8) - 0,85; Rf-værdi (6) - 0,8.
b) BOC-Asp-PIR
En opløsning af 3 g (8 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-β-20 benzylester-a-pyrrolidin i 30 ml methanol hydrogeneres i nærværelse af 250 mg af en 10%'s palladium-på-kul-katalysator i 2 timer, hvorefter katalysatoren frafiltreres, og opløsningen inddampes. Den resterende olie tørres over svovlsyre. Udbytte 21,1 g (92%).
C13H22N2°5: 286,2.
25 Smeltepunkt: 124-125eC.
[“]ίΡ “ -39,9° (c ·» 1,0 i methanol).
Rf-Værdi (8) = 0,3; Rf-værdi (7) >=* 0,2.
DK 163247B
20 j-i c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR LLeu-Arg-Pro-Gly-NH2
Fastfasesyntesen af peptidet, fraspaltningen fra polymeren med hydrogenfluorid samt den chromatografiske rensning af det rå peptid udføres som beskrevet i eksempel 4/c med undtagelse af, at der som 6-5 aminosyre anvendes den i eksempel 6/b fremstillede forbindelse.
Herved fås 78 mg (12%) af det rene peptid.
C61»S5h1S°14: 1293· [e] d = -53,2° (c - 1,0 i vand).
Rf-Værdi (13) = 0,15; Rf-værdi (9) =0,6; Rf-værdi (11) =0,2; 10 Rf-værdi (5) = 0,4.
Aminosyreanalyse: Gly: 0,97; His: 1,01; Ser: 0,94; Tyr: 1,03;
Asp: 1,05; Leu: 1,00; Pos: 0,94.
EKSEMPEL 7
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND ^Leu-Arg-Pro-EA
15 a) BOC-Asp(OBzl)-IND
3,23 g (10 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-/3-benzylester opløses i 50 ml ethylacetat. Opløsningen afkøles til 0eC, og under omrøring tilsættes 2,3 g dicyclohexylcarbodiimid og 1,19 g indolin. Reaktionsblandingen omrøres natten over ved stuetemperatur, hvorefter 20 den næste dag filtreres, filtratet vaskes tre gange med hver gang 10%'s citronsyre, mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og mættet natriumchloridopløsning, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes. Den resterende olie krystalliseres af ethanol med vand.
Udbytte 3,7 g (89%).
25 C24H29N2°5: Ri smel tepunkt 75-76°C.
[«]§2 “ -70,9° (c = 1,0 i ethanol).
Rf-Værdi (7)-0,9.
DK 163247 B
21
b) H-Asp(OBzl)-IND.TFA
800 mg (1,9 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-/3-benzylesteros-indolin opløses i 5 ml trifluoreddikesyre og omrøres ved stuetemperatur i 15 minutter. Tri fluoreddikesyren fjernes i vakuum, og rema-5 nensen tritureres med ether, filtreres, tørres og krystalliseres af ethanol med ether. Udbytte 780 mg (94%).
C2lH2lN2°5F3: «8,1.
Smeltepunkt: 114-115®C.
[α]$2 --5,8° (c - 1,0 i methanol).
10 Rf-Værdi (7) - 0,2; Rf-værdi (4) - 0,65.
c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp(OBzl)-IND
716 mg (1 millimol) af pentapeptidhydrazidet Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 opløses i 10 ml dimethylformamid. Opløsningen afkøles til -10°C, hvorefter der tilsættes en koncentreret vandig opløsning af 0,7 ml 6N 15 saltsyre og 75 mg natriumnitrit. Reaktionsblandingen omrøres ved- 5eC i 10 minutter, hvorefter der tilsættes en opløsning af trifluorace-tatet af 438 mg (1 millimol) H-Asp(OBzl)indolin fremstillet med 0,7 ml triethylamin og 2 ml dime thylf ormamid. Om nødvendigt indstilles pH- værdien til 8 med triethylamin. Blandingen omrøres ved -5°C i 1 20 time og ved 0°C i 12 timer. Dimethylformamidet afdestilleres i vakuum, remanensen tritureres med vand, filtreres, vaskes med ethanol og ethylacetat og opløses derefter i dime thylf ormamid, behandles med aktivkul, medens den er varm, og krystalliseres ved tilsætning af ether. Udbytte 600 mg (60Z).
25 C53h56n10Ou: 1008'9·
Smeltepunkt 172-174°C.
Rf-Værdi (9) - 0,7; Rf-værdi (10) - 0,4; Rf-værdi (1) - 0,35.
d) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND
En opløsning af 500 mg (0,5 millimol) af hexapeptidet Glp-His-Trp-30 Ser-Tyr-Asp(OBzl)-IND i 0,5 ml dimethylformamid og 30 ml.50%'s eddikesyreopløsning hydrogeneres i nærværelse af 50 mg af en 10%'s palla-
DK 163247 B
22 dium-på-kul-katalysator i 2 timer. Efter frafiltrering af katalysatoren inddampes opløsningsmidlet i vakuum, og remanensen krystalliseres af dimethylformamid med ether. Udbytte 380 mg (83%).
Smeltepunkt: 219-221°C.
5 “ -37,7° (c - 1,0 i dimethylformamid).
Rf-Værdi (9) - 0,6; Rf-værdi (10) = 0,4;· Rf-værdi (1) = 0,1.
e) Glp -His -Trp - Ser-Tyr-Asp-IND ^Leu- Arg- Pro - EA
En opløsning af 42 mg (0,044 millimol) af hexapeptidet Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND i 1 ml dimethylformamid afkøles til 0eC, og der 10 tilsættes 7,8 μΐ diisopropylcarbodiimid. Efter omrøring i 10 minutter tilsættes en opløsning af 20 mg (0,044 millimol) H-Leu-Arg-Pro-EA-hydrochlorid i dimethylformamid neutraliseret med triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 12 timer, hvorefter opløsningsmidlet afdampes i vakuum. Remanensen underkastes chroma -15 tograf i på en Sephadex® G-25-søjle i 0,2N eddikesyre. De fraktioner, som indeholder hovedproduktet indsamles og lyofiliseres. Udbytte 28 mg (48%).
C65H85"17%3: 1311' [tt]jj2 - 39,6° (c - 0,25; 25%'s eddikesyre).
20 Rf-Værdi (13) =0,8; Rf-værdi (9) = 0,75; Rf-værdi (5) =0,7; Rf-værdi (10) =0,5.
EKSEMPEL 8 I i
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-ANI ‘-Leu-Arg-Pro-Gly-OT^
a) BOC-Asp(OBzl)-ANI
25 3,23 g (10 millimol) tert.butoxycarbonylasparaginsyre-/3-benzylester opløses i 50 ml ethylacetat og afkøles til 0°G, og der tilsættes 0,96 g anilin og 2,26 g dicyclohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 6 timer, og opløsningen filtreres og vaskes derefter med 10%'s citronsyreopløsning, mættet natriumhydro-
DK 163247 B
23 gencarbonatopløsning og måttet natriumchloridopløsning, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes i vakuum. De efter inddampningen vundne krystaller tritureres med petroleumsether, filtreres og tørres. Udbytte 4 g (96%).
5 C22H26N2°5: 398·3·
Smeltepunkt: 105-106°C.
[a]§2 « -6° (c - 1,0 i dimethylformamid).
Rf-Værdi (11) - 0,8; Rf-værdi (12) - 0,95; Rf-værdi (8) - 0,4.
b) BOC-Asp-ANI
10 3 g ter t. butyloxycarbonylasparaginsyre - β -benzy les ter-a- anil id opløses i 20 ml methanol og hydrogeneres i nærværelse af 300 mg af en 10%'s palladium-på-kul-katalysator. Katalysatoren frafiltreres, og opløsningsmidlet afdampes i vakuum, og remanensen krystalliseres af ethanol med vand. Udbytte 2,05 g (88%).
15 Analyse:
Beregnet for C^H2oN2°5 (308.2): C 58,44 H 6,49.
Fundet: C 58,6 H 6,56.
Smeltepunkt: 157-158°C.
[«]fp “ -12° (c - 1,0 i dimethylformamid).
20 Rf-Værdi (11) - 0,7; Rf-værdi (12) - 0,85; Rf-værdi (8) - 0,05.
c) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-ANI ^-Leu-Arg-Pro-Gly-NHtø
Fastfasesyntesen af peptidet, fraspaltning fra polymeren med hydrogenfluorid samt chromatografisk rensning af det rå peptid udføres som beskrevet i eksempel 4/c med undtagelse af, at der som 6-aminosyre 25 anvendes den i henhold til eksempel 8/b fremstillede forbindelse.
Herved fås 82 mg (12,5%) af det rene produkt.
G63H83N18°14: 1315' [a]J2 - -58,3° (c - 1,0 i vand).
Rf-Værdi (9) - 0,5; Rf-værdi (10) - 0,2; Rf-værdi (12) - 0,8.
Claims (4)
1. Gonadoliberinderivater med den almene formel I 123456 7 8 9 10 1 Glp-His-7rp-Ser-Tyr-Asp-X ^Leu-Arg-Pro-Y hvor X betegner en -O-R-gruppe, hvor R betegner benzyl eller alkyl, en 10 ^R1 -N -gruppe, XR2 hvor R*- og R^ uafhængigt af hinanden betegner hydrogen, 15 alkyl, aryl, C^g-cycloalkyl eller aryl-C^ ^-alkyl, eller R^ og R^ sammen med det nabostillede nitrogenatom betegner morp-holino, 1-indolinyl eller 1-pyrrolidinyl, og Y betegner et glycinamid eller ^-alkylamid, syreadditionssalte deraf med terapeutisk anvendelige syrer og com-20 plexer deraf.
2. Forbindelse ifølge krav 1 valgt blandt Glp -His -Trp-Ser- Tyr - Asp - OMe *-Leu-Arg-Pro - EA, Glp -His -Trp - Ser-Tyr-Asp -DEA 1-Leu-Arg-Pro - EA, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-NH2 ^Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,
25 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-FBA ^Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-CBA l-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-PIR ^Leu-Arg-Pro-Gly-NH.2 > I--—i Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-IND iLeu-Arg-Pro-EA, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-ANI ^Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, DK 163247 B hvor EA betyder ethylamino, DEA betyder diethylami.no, FBA betyder (l,l-dimethyl-2-phenyl)ethylamino, CBA betyder cyclobutylamino,
5 PIR betyder 1-pyrrolidinyl, IND betyder 1-indolinyl, og ANI betyder phenylamino, og terapeutisk anvendelige salte og complexer deraf.
3. Fremgangsmåde til fremstilling af gonadoliberinderivater med den 10 almene formel I 123456 789 101 Glp-His-7rp-Ser-Tyr-Asp-X ^-Leu-Arg-Pro-Y hvor X betegner en -0-R-gruppe, hvor R betegner benzyl eller alkyl, en 15 ^R1 -N -gruppe, XR2 hvor R^ og R^ uafhængigt af hinanden betegner hydrogen, 20 alkyl, aryl, g-cycloalkyl eller aryl-C^ eller R1 og r2 sammen med det nabostillede nitrogenatom betegner morp-holino, 1-indolinyl eller 1-pyrrolidinyl, og Y betegner et glycinamid eller ^-alkylamid, syreadditionssalte deraf med terapeutisk anvendelige syrer og com-25 plexer deraf, kendetegnet ved, at al) et tetra- eller pentapeptid med den almene formel II H-Asp-X -Leu-Arg-Pro-Y II hvor X og Y har den ovenfor anførte betydning, kondenseres med penta-30 peptidazidet med formlen Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3, eller DK 163247 B a2) et hexapeptid med den almene formel III E Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Asp-X III hvor X har den ovenfor anførte betydning, og E betegner hydroxy, azid 5 eller N-succinimidoxy eller en phenoxygruppe, som eventuelt er substitueret med en nitrogruppe eller ét eller flere halogenatomer, fortrinsvis med p-nitro, 2,4,6-trichlorphenoxy, pentachlorphenoxy eller pentafluorphenoxy, kondenseres med et tri- eller tetrapeptid med den almene formel IV
10 H-Leu-Arg-Pro-Y IV hvor Y har den ovenfor anførte betydning, eller a3) når der fremstilles forbindelser med den almene formel I, hvor der sidder en glycinamidgruppe ved molekylets C-terminale del, kobles BOC-glycin til en chlormethyleret polystyren- divinylbenzenharpiks 15 indeholdende 1-3%, fortrinsvis 2%, tværbindinger, BOC-gruppen spaltes fra de således vundne forbindelser med formlen V B0C-Gly-0-CH2-polymer V hvorefter der startende fra C-terminalen kobles aminosyrer med beskyttelsesgrupper i en hensigtsmæssig sekvens til peptidpolymeren 20 ved periodisk gentagelse af spaltnings- og koblingsprocedureme, og det færdige peptid spaltes fra peptidpolymeren ved ammonolyse, og beskyttelsesgrupperne elimineres ved behandling med hydrogenfluorid, eller a4) når der skal fremstilles forbindelser med den almene formel I, 25 hvor der sidder et glycinamid ved molekylets C-terminale ende, kobles BOC-glycin til en polystyren-divinylbenzenharpiks, der indeholder benzhydrylaminogrupper og 1-3%, fortrinsvis 2%, tværbindinger, og BOC-gruppen spaltes fra den således vundne forbindelse med formlen VI BOC-Gly-NH-CH-polymer - VI
30 C6H5 DK 163247 B hvorefter aminosyrer forsynet med beskyttelsesgrupper i en hensigtsmæssig sekvens kobles til peptidpolymeren startende fra den C-termi-nale ende ved periodisk gentagelse af spaltnings- og koblingsprocedurerne, og det færdige peptid spaltes fra, og beskyttelsesgrupperne 5 elimineres fra peptidpolymeren ved behandling med hydrogenfluorid, eller a5) når der skal fremstilles forbindelser med den almene formel I, hvor der sidder en -Pro-Y-gruppe ved molekylets C-terminale ende, idet Y har den ovenfor anførte betydning, fæstnes BOC-prolin til en 10 chlormethyleret polystyren-divinylbenzenharpiks med 1-3%, fortrinsvis 2%, tværbindinger, og BOC-gruppen spaltes fra den således vundne forbindelse med formlen VII B0C-Pro-0-CH2-polymer VII hvorefter aminosyreme forsynet med beskyttelsesgrupper kobles i en 15 hensigtsmæssig sekvens til peptidpolymeren startende fra den C-ter-minale ende ved periodisk gentagelse af spaltnings- og koblingsprocedurerne, og det færdige peptid spaltes fra peptidpolymeren ved amino-lyse, og beskyttelsesgrupperne elimineres ved behandling med hydrogenfluorid , 20 og om ønsket omdannes det vundne nona-, henholdsvis decapeptidamid til et terapeutisk anvendeligt syreadditionssalt eller et metalcom-plex heraf.
4. Farmaceutiske præparater med en kraftig virkning på hvirveldyrs formeringsprocesser, 25 kendetegnet ved, at de indeholder en aktiv mængde af en forbindelse med den almene formel I ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller complex deraf blandet med farmaceutiske bærere, fyldstoffer, fortyndingsmidler og hjælpestoffer.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU106283 | 1983-03-29 | ||
| HU831062A HU187503B (en) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | Process for preparing gonadoliberine derivatives containing beta-aspartyl group |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK171884D0 DK171884D0 (da) | 1984-03-28 |
| DK171884A DK171884A (da) | 1984-09-30 |
| DK163247B true DK163247B (da) | 1992-02-10 |
| DK163247C DK163247C (da) | 1992-06-29 |
Family
ID=10952693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK171884A DK163247C (da) | 1983-03-29 | 1984-03-28 | Gonadolibeinderivater, farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og complexer heraf samt en fremgangsmaade til fremstilling af disse og et farmaceutisk praeparat indeholdende disse |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4600705A (da) |
| JP (1) | JPS59219259A (da) |
| AR (1) | AR240835A1 (da) |
| AT (1) | AT389704B (da) |
| AU (1) | AU558705B2 (da) |
| BE (1) | BE899247A (da) |
| CA (1) | CA1258150A (da) |
| CH (1) | CH664573A5 (da) |
| DE (1) | DE3411709A1 (da) |
| DK (1) | DK163247C (da) |
| ES (2) | ES8605823A1 (da) |
| FI (1) | FI82837C (da) |
| FR (1) | FR2543546B1 (da) |
| GB (1) | GB2138427B (da) |
| GR (1) | GR81935B (da) |
| HU (1) | HU187503B (da) |
| IL (1) | IL71380A (da) |
| IT (1) | IT1196064B (da) |
| LU (1) | LU85270A1 (da) |
| NL (1) | NL8400965A (da) |
| SE (1) | SE464814B (da) |
| ZA (1) | ZA842352B (da) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3433010A (en) * | 1966-01-19 | 1969-03-18 | Sunbeam Corp | Electric clock |
| HU189394B (en) * | 1983-12-23 | 1986-06-30 | Koezponti Valto- Es Hitelbank Rt Innovacios Alap,Hu | Method for producing spermatozoa suitable for fertilization from mature fishes |
| US4677193A (en) * | 1985-02-22 | 1987-06-30 | The Salk Institute For Biological Studies | Peptides containing an aliphatic-aromatic ketone side chain |
| HU194280B (en) * | 1985-10-22 | 1988-01-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing new gonadoliberin analogues of high effectivity and pharmaceutical compositions containing them |
| GB9112825D0 (en) * | 1991-06-14 | 1991-07-31 | Ici Plc | Process for making peptides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2438350C3 (de) * | 1974-08-09 | 1979-06-13 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Peptide mit starker LH-RH/FSH-RH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen |
| DE2617646C2 (de) * | 1976-04-22 | 1986-07-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Nonapeptid-amide und Decapeptid-amide mit Gonadoliberin-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Präparate |
| DE3020941A1 (de) * | 1980-06-03 | 1981-12-17 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Nonapeptid, verfahren zu seiner herstellung, dieses enthaltendes mittel und seine verwendung |
| US4410514A (en) * | 1982-12-06 | 1983-10-18 | The Salk Institute For Biological Studies | GnRH Agonists |
-
1983
- 1983-03-29 HU HU831062A patent/HU187503B/hu not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-03-26 BE BE1/10986A patent/BE899247A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-03-26 CH CH1515/84A patent/CH664573A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-03-27 LU LU85270A patent/LU85270A1/fr unknown
- 1984-03-28 IL IL71380A patent/IL71380A/xx unknown
- 1984-03-28 FR FR8404845A patent/FR2543546B1/fr not_active Expired
- 1984-03-28 NL NL8400965A patent/NL8400965A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-03-28 DK DK171884A patent/DK163247C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-03-28 ES ES531071A patent/ES8605823A1/es not_active Expired
- 1984-03-28 CA CA000450712A patent/CA1258150A/en not_active Expired
- 1984-03-28 AU AU26255/84A patent/AU558705B2/en not_active Ceased
- 1984-03-28 FI FI841245A patent/FI82837C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-03-28 SE SE8401724A patent/SE464814B/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-03-29 US US06/594,880 patent/US4600705A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-29 AR AR296154A patent/AR240835A1/es active
- 1984-03-29 IT IT20286/84A patent/IT1196064B/it active
- 1984-03-29 GB GB08408128A patent/GB2138427B/en not_active Expired
- 1984-03-29 JP JP59059706A patent/JPS59219259A/ja active Pending
- 1984-03-29 ZA ZA842352A patent/ZA842352B/xx unknown
- 1984-03-29 DE DE19843411709 patent/DE3411709A1/de not_active Withdrawn
- 1984-03-29 GR GR74267A patent/GR81935B/el unknown
- 1984-03-29 AT AT0106084A patent/AT389704B/de not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-07-01 ES ES544757A patent/ES8606882A1/es not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI91075C (fi) | Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi | |
| FI92326C (fi) | LHRH:n nonapeptidi- ja dekapeptidianalogeja, jotka ovat käyttökelpoisia LHRH:n antagonisteina | |
| JP4249806B2 (ja) | ５位および６位で修飾されているＧｎＲＨ拮抗物質 | |
| DK171483B1 (da) | Aminosyrederivater | |
| JP4191259B2 (ja) | ＧｎＲＨ拮抗物質 | |
| JP2542362B2 (ja) | 新規ハロ低級アルキルグアニジノ置換アミノ酸化合物およびその製法 | |
| DK162649B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af pgrf eller pgrf-analoge peptider, farmaceutisk acceptable additionssalte heraf samt mellemprodukt til brug ved fremgangsmaaden | |
| US5502035A (en) | N-terminus modified analogs of LHRH | |
| KR900007864B1 (ko) | GnRH 길항제 IX의 제조방법 | |
| EP0328090A2 (en) | LHRH analogs | |
| FI82255B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya gonadoliberinderivat som paoverkar djurens foeroekningsprocesser. | |
| FI85866C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya gonadoliberinderivat vilka foermaor frigoera luteniserande eller follikelstimulerande hormon. | |
| DK163247B (da) | Gonadolibeinderivater, farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og complexer heraf samt en fremgangsmaade til fremstilling af disse og et farmaceutisk praeparat indeholdende disse | |
| JP3662926B2 (ja) | Ｌｈｒｈのｎ末端改変類似体 | |
| US5508383A (en) | Cyclic peptide LHRH antagonists | |
| KiSFALUDY et al. | Pentagastrin Analogs Containing α-Aminooxy Acids, I Synthesis of Analogs Substituted at the N-Terminus | |
| JP2672677B2 (ja) | Ｌｈｒｈ同族体 | |
| US4491579A (en) | Peptides | |
| FI96115B (fi) | Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on T-soluavustaja-aktiivisuutta | |
| HU190207B (en) | Process for production of new gonadoliberine derivatives | |
| HU195234B (en) | Process for production of nonapeptide and dekapeptide hormone-analogs freeing lutheining hormones with antagonizing hormone effect and medical preparatives containing them | |
| CS246162B1 (cs) | Peptid s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed | ||
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |