DK171483B1 - Aminosyrederivater - Google Patents

Description

DK 171483 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte aminosyrederivater, som er nyttige ved fremstilling af hidtil ukendte nona- og decapep-tidanaloge af LHRH.

Luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH) 5 frigøres fra den forreste hypofysekirtel under regulering af det frigørende hormon LHRH, der dannes i hypothalamusområdet. LH og FSH virker på kønskirtlerne til stimulering af syntesen af steroidhormoner og til stimulering af gametmodning. Den pulserende frigørelse af LHRH, og derved frigørelsen af LH og FSH, regulerer forplantnings-10 cyklen i husdyr og mennesker.

LHRH påvirker også placenta, og indirekte kønskirtlerne, ved at forårsage frigørelse af chorionisk gonadotropin (hCG).

Antagonister til LHRH er nyttige til regulering af frugtbarhed. Sådanne antagonister blokerer ægløsning i hunkønsvæsener og undertryk-15 ker spermatogenese i hankønsvæsener. Forbundet med disse virkninger er en undertrykkelse af normale kredsløbsniveauer af seksuelle steroider af kønskirteloprindelse, herunder reduktion i vægten af dermed underordnede organer hos han· og hunkønsvæsener. Hos husdyr fremmer denne virkning vægtforøgelse i en situation med en vis fødemængde, 20 stimulerer abort hos gravide dyr og virker i almindelighed som et kemisk steriliseringsmiddel.

Det naturlige hormonfrigørende hormon LHRH er et decapeptid, der omfatter naturligt forekommende aminosyrer (som har L-konfiguration med undtagelse af den achirale aminosyre glycin). Sekvensen er som 25 følger: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 123456789 10

Mange analoge af dette naturlige materiale har været studeret, og langt de fleste af dem har vist sig at have utilstrækkelig biologisk virkning til at være klinisk nyttige. Visse udvalgte modifikationer har vist sig at have en agonistvirkning på den biologiske virkning.

DK 171483 B1 2

Den allermest signifikante forstærkning fås ved at ændre resten i 6-stillingen fra Gly til en D-aminosyre.

Ud over agonister har der været fremstillet analoge, som er konkurrerende antagonister til LHRH; disse kræver alle fjernelse af eller 5 erstatning af histidinresten i 2-stillingen; Vale, W., et al., Science, 176, s. 933 (1972). I almindelighed ser det ud til, at en D-aminosyre, der er placeret i sekvensen i den stilling, giver den bedste aktivitet; Rees, R. W. A., et al., J. Med. Chea. 17, s. 1016 (1974).

Det har også været vist, at ved at tilføje en modifikation i 6-stil-10 lingen, der, uden modifikation i 2-stillingen, resulterer i den ovenfor anførte agonistvirkning, forstærkes antagonistvirkningen af de 2-modificerede analoge; Beattie, C. W., et al., J. Med. Chem., 18, s. 1247 (1975); Rivier, J., et al., Peptides 1976 s. 427, Editions de l'Universite de Bruxelles, Belgium (1976).

15 På baggrund af disse to hovedændringer, der resulterer i en potent serie af LHRH-antagonister, kan yderligere inkrementer i antagonistvirkningen fås ved at modificere stillingerne 1, 3 og/eller 10 i det allerede 2,6-modificerede peptid. Coy, D. H., et al., Peptides 1976, s. 462, Editions de l'Universite de Bruxelles, Belgium (1976); Rivi-20 er, J. E., et al., Life Sci. 23, s. 869 (1978); Dutta, A. S., et al., Biochem. Biophys. Res. Coamm. 81, s. 382 (1978), Humphries, J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun,, 85, s. 709 (1978). Det har også været vist, at N-acylering af aminosyren i stilling 1 er nyttig; Channabasavaia, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 81, s. 382 25 (1978); Coy D. H., et al., Peptides. - Structure and Biological

Function, s. 775, Pierce Chemical Co. (1979). Desuden har (N-Ac-D-P-Cl-Phe*, D-P-Cl-Phe^, D-Trp^, D-Arg®, D-Ala^)LHRH været beskrevet af D. H. Coy, Endocrinology, 110, s. 1445 (1982). 1 et andet tilfælde har D-Ala^-modifikation af LHRH været beskevet at bibeholde antago-30 nistvirkningen. Jfr. E. Pedroza, J.A. Martinez, D.H. Coy, A. Arimura og A.V. Schally; Int. J. Fert.; 23, s. 294 (1978).

Eftersom antagonister virker ved at konkurrere med LHRH om de tilsvarende receptorer, kræves der høje doser af disse forbindelser for at bortblokere det naturlige peptid. Det er i lyset af dette særlig DK 171483 B1 3 ønskelige at opnå antagonister med en meget høj grad af potens og forlænget virkning. Den egenskab, at de langsomt frigøres fra depotpræparater, vil også være vigtig. Det for tiden kendte sæt analoge kræver forholdsvis høje niveauer af forbindelsen, med de dermed føl* 5 gende problemer med forøget mulighed for toxicitet og andre bivirkninger.

Den foreliggende opfindelse angår aminosyrederivater, som er anvendelige ved fremstilling af stærkt potente nonapeptid- og decapeptidana-loge af LHRH, i hvilke en erstatning i stilling 2 (som på den måde 10 omdanner peptidet til antagonistserier) gøres mere effektiv ved erstatning af glycinresten i stilling 6 med en hidtil ukendt guanido-substitueret amidin- eller tertiær eller kvatemær amin-vandopløselig aminosyrerest, der ikke forekommer i naturen. Yderligere forstærkning ved substitutioner i 1, 2, 3, 4, 7 og/eller 10-stillingerne beskrives 15 også.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte aminosyrederivater med den almene formel II

H-N-CH-CO-H

^ ^ TT

(cb2)n

NH

l^-ONRj hvor 20 n er fra 1-5; er alkyl med 1-12 carbonatomer eller -NHR3, hvor R3 er alkyl med 1-12 carbonatomer, cycloalkyl, phenyl, benzyl, morpholino eller-(CH2)nN(R4)2. hvor “ er 1-5, og R4 er lavere alkyl; og R2 er hydrogen eller R3; eller R^ og R2 tilsammen udgør en ring 25 repræsenteret ved følgende strukturformler:

t i i A

HN^ HN^^N ffij ^ N

\j yj \_/ n DK 171483 B1 4 hvor p er fra 1-7; Y er hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer eller cycloalkyl; og X er halogen eller Y.

5 Forbindelserne ifølge opfindelsen er anvendelse til fremstilling af hidtil ukendte nonapeptid- og decapeptidanaloge af LHRH, der har den almene formel I

A-B-C-D-E-F-G-Arg-Pro-H 12345678 9 10 og farmaceutisk acceptable salte deraf, hvor 10 A er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-pyroglutamyl, D-pyroglutamyl, N-acyl-D,L-tryptophanyl, N-acyl-glycyl, N-Ac-D,L-Δ^’^-prolyl, N-Ac-D,L-prolyl, N-Ac-L-alkylprolyl, N-Ac-D,L-phenyl-alanyl, N-Ac-D,L-p-chlorphenylalanyl, N-Ac-D,L-seryl, N-Ac-D,L-threonyl, N-Ac-D,L-alanyl, 3-(1-naphthyl)-D,L-alanyl, 3-(2-naphthyl)-15 D,L-alanyl, 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D,L-alanyl, 3-(4-trifluormet-hylphenyl)-D,L-alanyl, 3-(9-anthryl)-D,L-alanyl, 3-(2-fluorenyl)-D,L-alanyl og 3-(Het)-D,L-alanyl, hvor Het er et heterocyclisk aryl-holdigt radikal valgt blandt 20 hvor A" og A' uafhængigt af hinanden er valgt fra klassen bestående af hydrogen, lavere alkyl, chlor og brom, og G er valgt fra klassen bestående af oxygen, nitrogen og svovl; B er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af D-phenylalanyl, D-p-Cl-phenylalanyl, D-p-F-phenylalanyl, D-p-nitrophenylalanyl, 25 3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-D-alanyl, 2,2-diphenylglycin, D-a-methyl-p-Cl-phenylalanin og 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl; C er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-tryptophanyl, D-tryptophanyl, D-phenylalanyl, D-Mesphenylalanyl, 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-naphthyl)-D-alanyl, 3-(2-naphthyl)-D-alanyl, 3-(2-30 pyridyl)-D-alanyl og 3-(4-pyridyl)-D-alanyl; DK 171483 B1 5 D er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-seryl og D-alanyl; E er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-phenylalanyl og L-tyrosyl; S F er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af radikaler med følgende strukturformel a) a) H-N-CH-CO.H 2 I 2 <?Vn

1JH

R1-C=NR2 hvor 10 n er fra 1-5; er alkyl med 1-12 carbonatomer eller -NHR3, hvor R3 er alkyl med 1-12 carbonatomer, cycloalkyl, phenyl, benzyl, morpholino eller-(CH2)mN (R4)2> hvor m er fra 1·5, og R4 er lavere alkyl; og R2 er hydrogen eller R3; eller R^ og R2 tilsammen udgør en ring 15 repræsenteret ved følgende strukturformler: ! tic yc\^

tf''HN^ HN"^ HN N

\J \_y w λ_.4,ρ ©

hvor X X

p er fra 1-7; Y er hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer eller cycloalkyl; og X er halogen eller Y.

20 G er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-leucyl, L-nor-leucyl og L-norvalyl; H er D-alaninamid, D-leucinamid, glycinamid eller -NHR5, hvor R5 er lavere alkyl, cycloalkyl, fluor-lavere alkyl eller NHCONH-R^, hvor DK 171483 B1 6 R10 er hydrogen eller lavere alkyl; og farmaceutisk acceptable salte deraf.

Fra DK-B-150.206 kendes LHRH-analoger, som i 6-stillingen har en i imidazolringen benzyleret histidinrest, en tryptophanrest, en glycin-5 rest, en leucinrest, eller en serinbutylesterrest. De kendte forbindelser har således i vid udstrækning naturlige aminosyrer i 6-stillingen og har i alle tilfælde ingen argininrester eller modificerede argininrester i 6-stillingen, ligesom forbindelserne med formlen I også er karakteriseret ved at have en carbon-nitrogen-10 binding i den grundlæggende argininrest, medens de fra DK-B-150.206 kendte forbindelser enten helt mangler nitrogenatomer i sidekæden i 6-stillingen eller i 6-stillingen har sådanne aminosyrerester, i hvilke de heterocycliske grupper er bundet til aminosyrerestens hoveddel ved hjælp af en carbon-carbon-binding.

15 Fra Chemical Abstract, bind 96 (1982), 174583q og den deri nævnte artikel af D.H. Coy et al., Endocrinology 1982, 110 (4), side 1445-1447, kendes LHRH-analoger, som i 6-stillingen er substitueret med D-arginin. I modsætning hertil har forbindelserne med formlen I en unaturlig modificeret argininrest, som fx er alkylsubstitueret.

20 Artiklen beskriver imidlertid, at anbringelse af hydrofile aminosyrerester i 6-stillingen, især basiske aminosyrerester, er ønskeligt med henblik på at øge forbindelsernes opløselighed. Ligeledes beskriver artiklen, at jo mere basisk og hydrofil aminosyresubstituen-ten er, jo større virkning vil forbindelsen have med hensyn til 25 inhibering af ægløsning. Det er derfor overraskende, at forbindelserne med formlen I, hvor argininens aminogruppe er substitueret, hvilket bl.a. må formodes at reducere vandopløseligheden af forbindelserne, har den konstaterede potente LHRH-analogvirkning.

De under anvendelse af forbindelserne ifølge opfindelsen fremstillede 30 forbindelser omfatter hidtil ukendte nonapeptid- og decapeptidanaloge af LHRH med den almene formel I og farmaceutisk acceptable salte deraf, hvor A er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af N-Ac-D,L-Δ^>^-prolyl, N-Ac-D,L-prolyl, N-Ac-L-alkylprolyl, N-Ac-D,L-phenylalanyl, 35 N-Ac-D,L-p-chlorphenylalanyl, N-Ac-D,L-seryl, N-Ac-D,L-threonyl, N- DK 171483 B1 7

Ac-D,L-alany1, 3-(1-naphthyl)-D,L-alanyl, 3-(2-naphthyl)-D,L-alany1, 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D,L-alanyl og 3-(4-trifluormethylphenyl)-D,L-alanyl; B er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af D-phenylalanyl, 5 D-p-Cl-phenylalanyl, D-p-F-phenylalanyl, D-p-nitrophenylalanyl, 3-(3,4,5-trImethoxypheny1)-D-alanyl, 2,2-dlphenylglyc in, D-a -methyl-p-Cl-phenylalanin og 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl; C er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af D-tryptophanyl, D-phenylalanyl, D-Mesphenylalanyl, 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-10 naphthyl)-D-alanyl og 3-(2-naphthyl)-D-alanyl; D er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-seryl og D-alanyl; E er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-phenylalanyl og L-tyrosyl; 15 F er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af radikaler repræsenteret ved følgende strukturformel a) a)

H-N-CH-CO.,H

"K1 n

NH

I TT

hvor 20 n er fra 1-5; er alkyl med 1-12 carbonatomer eller -NHR3, hvor R3 er alkyl med 1-12 carbonatomer, cycloalkyl, phenyl, benzyl, morpholino eller-(CH2)mN(R4)2, hvor m er fra 1-5, og R4 er lavere alkyl; og R2 er hydrogen eller R3; eller og R2 tilsammen udgør en ring 25 repræsenteret ved følgende strukturformler: DK 171483 B1 8 (L i q

Vj yj \_/ hvor p er fra 1-7; Y er hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer eller cycloalkyl; og X er halogen eller Y; 5 G er en aminoacylrest valgt fra klassen bestående af L-leucyl, L-nor-leucyl og L-novalyl; H er D-alaninamid, D-leucinamid, glycinamid eller -NHR5, hvor R5 er lavere alkyl eller NHCONH2; og farmaceutisk acceptable salte deraf.

10 Erstatningen af L-histidylresten, der sidder i stilling 2 i LHRH, med en af de heri specificerede rester, er nødvendigt for at omdanne peptidet til en LHRH-antagonist. Erstatningen af glycylresten i stilling 6 i LHRH med en af de af under F specificerede rester giver en dramatisk forøgelse af antagonistvirkningen. De heri beskrevne sub-15 stitutioner i stillingerne 1, 2, 3, 4, 7 og 10 er yderligere nyttige til forstærkning af antagonistvirkningen.

Som beskrevet ovenfor, og af bekvemmelighedshensyn ved beskrivelse af den foreliggende opfindelse, anvendes der for de almindelige aminosyrer de konventionelle forkortelser, der almindeligvis accepteres 20 inden for peptidteknikken som anbefalet af 1UPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11, s. 1726 (1972). Disse repræsenterer L-aminosyrer, med undtagelse af den achirale aminosyre glycin og med yderligere undtagelse af eventuelle unaturlige eller naturlige aminosyrer, der er achirale, eller er på anden måde beteg-25 net D-, og af de aminosyrer, der er substitueret heri ind i stillingerne 1, 2, 3, 4, 6, 7 og 10 i stedet for de, der normalt findes i LHRH. Alle peptidsekvenser nævnt heri er skrevet ifølge den generelt DK 171483 B1 9 accepterede konvention, hvor den N-terminale aminosyre er til venstre, og den C-terminale aminosyre er til højre.

Visse andre forkortelser vil være nyttige ved beskrivelse af opfindelsen. Ved den foreliggende opfindelse erstattes der med aminosyrer, 5 der ikke forekommer i naturen. Særlig almindeligt anvendte blandt disse er følgende:

Aminosyrerest Forkortelse 3-(2-naphthyl)-D-alanyl D-Nal (2) 10 3-(p-fluorphenyl)-D-alanyl D-p-F-Phe 3-(p-chlorphenyl)-D-alanyl D-p-Cl-Phe 3-(2,3,4,5,6-pentame thylpheny1)-D-alany1 D-MesPhe 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl D-Tmp 3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-D-alanyl D-Tmo 15 3-(4-(trifluormethylphenyl)-D-alanyl D-Ptf N,N'-guanido-dimethyl-D-homoarginin D-Dmh N.N'-guanido-diethyl-D-homoarginin D-Deh N,N-guanido-dipropy1-D-homoarginin D-Dph N,N'-guanido-diisopropyl-D-homoarginin D-Dih 20 N,N'-guanido-dihexyl-D-homoarginin D-Dhh N-guanido- isopropyl-D-homoarginin D-Iph N-guanido-heptyl-D-homoarginin D-Hha N-guanido-propyl-D-homoarginin D-Prh N,N'-guanido-dicyclohexyl-D-homoarginin D-Dch 25 N,N'-guanido-diisopropyl-D-arginin D-Dia N,N'-guanido-dicyclohexyl-D-arginin D-Dca N-guanido-(3-dimethylaminopropyl)-N'- guanido-ethyl-D-homoarginin D-Aph N'-guanido-(3-dimethylaminopropyl)-2Q N-guanido-ethyl-D-arginin D-Apa D-N-eps ilondihydroimidazolinyllysin D-Dhi 3-(2-pyridyl)-D-alanyl D-2Pal 3-(3-pyridyl)-D-alanyl D-3Pal 3*(4-pyridyl)-D-alanyl D-4Pal DK 171483 B1 10

Eftersom aminosyresekvensen af LHRH har veret vist at vare (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, 123456789 10 er nona- og decapeptider, i hvilke aminosyreresterne på specifikke steder i sekvensen er blevet erstattet med andre aminosyrerester eller andre molekyldele, for nemheds skyld forkortet ved at vise 5 naturen af substitutionen med stillingsbetegnelsen skrevet derunder, efterfulgt af LHRH som oprindelsesmolekylet.

Således vil fx sekvensen (pyro)Glu-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2» 1 2 345 6788 10 hvor Gly i stilling 6 er blevet erstattet med D-Dih og His i stilling 2 er blevet erstattet med D-p-F-Phe, repræsenteret ved [D-p-F-Phe^, 10 D-Dih®]LHRH; og sekvensen NAc-Pro-D-p-F-phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-NHEt 1 2 3456789 er repræsenteret ved: [NAc-Pro^, D-p-F-Phe^, D-Dih®, Pro^-NHEtJLHRH.

Som anvendt heri refererer udtrykket "farmaceutisk acceptable salte" til salte, der bibeholder den ønskede biologiske virkning af oprindelsesforbindelsen og ikke bibringer nogle uønskede toxicologiske 15 virkninger. Eksempler på sådanne salte er (a) syreadditionssalte dannet med uorganiske syrer, fx saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, phosphorsyre, salpetersyre og lignende; og salte dannet med organiske syrer, fx eddikesyre, oxalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumar- DK 171483 B1 11 syre, gluconsyre, citronsyre, æblesyre, ascorbinsyre, benzoesyre, garvesyre, pamoinsyre, alginsyre, polyglutarsyre, naphthalensulfon-syrer, naphthalendisulfonsyrer eller polygalacturonsyre; (b) salte med polyvalente metalkationer såsom zink, calcium, bismuth, barium, 5 magnesium, aluminium, kobber, cobolt, nikkel, cadmium eller lignende; eller med en organisk kation dannet ud fra N,N'-dibenzylethylendiamin eller ethylendiamin; eller (c) kombinationer af (a) og (b), fx et zinkgarvesyresalt, etc.

Udtrykket "lavere alkyl" refererer til en ligekædet eller forgrenet 10 mættet carbonhydridkæde med 1-4 carbonatomer, fx methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.butyl og tert.butyl.

"Alkyl med 1-6 carbonatomer" omfatter de samme substituenter som lavere alkyl, men har derudover 5 eller 6 carbonatomer, fx en n-pen-tyl-, n-hexyl- eller anden forgrenet 5- eller 6-carbonatomholdig 15 molekyldel. "Alkyl med 1-12 carbonatomer" omfatter et radikal med kun 1-12 carbonatomer og hydrogen som anført ovenfor, med undtagelse af, at radikalet kan have op til 12 carbonatomer. Udtrykket "cycloalkyl" refererer til en cyclisk mættet carbonhydridgruppe med 3-6 carbonatomer, fx cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl og cyclohexyl.

20 I nærværende sammenhæng refererer forkortelsen "alkylPro" til en cis- 5-alkyl-l-prolylrest, hvor alkyl er det samme som "lavere alkyl" defineret ovenfor. Mere specifikt er "MePro" cis-5-methyl-L-prolyl, "EtPro" er cis-5-ethyl-L-prolyl og "ButPro" er cis-5-n-butyl-L-pro-lyl.

25 Forkortelsen "N-Ac" refererer specifikt til N-acetylaminosyreresten i overensstemmelse med almindeligt accepteret nomenklatur.

Forbindelser med formlen I, som forbindelserne ifølge opfindelsen især kan anvendes til at fremstille, er sådanne, hvori A er N-Ac-L-pro, N-Ac-D-Ser, N-Ac-D-p-Cl-Phe, N-Ac-D-Nal(2); B er D-p-F-Phe eller 30 D-p-Cl-Phe; C er D-Trp, D-Nal(2), D-3Pal eller D-Phe; D er Ser; E er Tyr; F er radikalet af forbindelsen med den almene formel II, hvor n er 3 eller 4, er alkyl med 1-8 carbonatomer eller cyclohexyl, og R2 er hydrogen, eller en forbindelse med den almene formel II, hvor er -NHR3, hvor R3 er methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-hexyl DK 171483 B1 12 eller cyclohexyl og R2 er R3 eller hydrogen, eller F er en forbindelse med den almene formel II, hvor Rj^ og R2 er dihydroimidazolinyl; og H er D-AlaNH2, GlyNH2 eller NHEt.

Generelt er forbindelser, hvor F er N,N'-guanido-substitueret D-ar-5 gininyl eller D-homoargininyl blandt de foretrukne udførelsesformer.

Mere foretrukne udførelsesformer er: A er N-Ac-L-Pro, N-Ac-D-Nal(2) eller N-Ac-D-p-Cl-Phe, B er D-p-F-Phe eller D-p-Cl-Phe, C er D-Nal(2), D-Trp, D-3Pal eller D-Phe, D er Ser, E er Tyr, F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi og H er D-A-10 laNH2, GlyNH2 eller NHEt; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh eller D-Hha; N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-NHEt, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh eller D-Hha; 15 N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2, hvor F er D-Dmh, D-Dek, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh eller D-Hha; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh eller D-Hha; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, hvor F er 20 D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh, D-Dhi, D-Prh, D-Hha eller propylamidin; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi; N-Ae-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi; og N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-F-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2, hvor F er D-Dmh, D-Deh, D-Dph, D-Dhh eller D-Dhi.

De særlig foretrukne udførelsesformer er: 30 N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-NHEt; DK 171483 B1 13 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhi-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac1D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dnih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 10 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhi-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr1D1Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 20 N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhi-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-D- AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhl-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dhi-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; 35 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dinh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; og DK 171483 B1 14 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Dhi-Leu-Arg-Pro-GlyNH2· I alle de ovennævnte udførelsesformer kan forbindelsen også fremstilles som det tilsvarende farmaceutiske acceptable salt.

ANALYSEMETODER

5 Forbindelserne med formlen I og især saltene deraf udviser overraskende potent og langvarig LHRH-antagonistvirkning.

De primære mål for potensen er evnen til at inhibere ægløsning hos rotter, hvilket måles ved proceduren beskrevet af Corbin, A. og Beattie, C.W., Endocrine Res. Commm., 2, s. 1 (1975) og evnen til at 10 inhibere LH-frigørelse og ægløsning i kaniner ifølge Phelps, C. P. et al., Endocrinology 100, s. 1526 (1977).

Andre biologiske målemetoder, der anvendes til LHRH-antagonister og til forbindelserne med formlen I er: (a) inhibering af LHRH-induceret FSH- og LH-frigørelse hos rotter 15 in vivo; Vllchez-Martinez, J.A., et al., Endocrinology, 96, s. 1130 (1975); og (b) inhibering af LH- og FSH-frigørelse i dispergerede forhypofy-secellekulturer målt ved radioimmunoassay. (Vale, W., et al., Endocrinology, 91, s. 562 (1972).

20 Ud fra antagonistvirkningen hos forbindelserne med formlen I følger følgende anvendelser: 1

Antikonception i hunkønsvæsener; - undertrykkelse eller forsinkelse af ægløsning; inducering af fødsel; 25 - synkronisering af ægløsning; undertrykkelse af oestrus; fremme af vækst hos hundyr; luteolyse, inducering af menstruation; abortfremkalder tidligt i første trimester; DK 171483 B1 15 terapi for endometriose; terapi for brystsvulster og -cyster; terapi for polycystisk ovariesyndrom (Stein-Leventhal); terapi for uterin carcinoma; 5 - terapi for godartet prostata hypertrofi og for prostata car cinoma; mandlig kontraception; terapi for sygdomme, der er et resultat af for stor produktion af kønshormon hos begge køn; 10 - funktionel kastrering af kødproducerende handyr; undertrykkelse af blodigt før-proestrussekret hos hunde; • undertrykkelse af menopausesymptomer.

Særlig vigtige anvendelser af forbindelserne med formlen I er in-hibering af ægløsning og behandling af endometriose hos kvinder og 15 inhibering af spermatogenese og behandling af prostatatumorer hos mænd.

Ved behandling indgives i praksis en effektiv mængde af en forbindelse med formlen I eller et farmaceutisk præparat indeholdende forbindelsen til en patient, der har brug for eller ønsker en sådan 20 behandling. Disse forbindelser eller præparater kan indgives ved en hvilken som helst af en lang række veje, der afhænger af den specifikke slutanvendelse, deriblandt oralt, parenteralt (deriblandt subcutan, intramuskulær og intravenøs indgivelse), vaginalt (især til kontraception), rektalt, buccalt (deriblandt sublingualt), transder-25 malt eller intranasalt. Den mest hensigtsmæssige indgivelsesvej vil i et hvilket som helst tilfælde afhænge af anvendelsen, den specifikke aktive bestanddel, den aktuelle patient og lægens bedømmelse. Forbindelsen eller præparatet kan også indgives ved hjælp af langsomt frigørende depot- eller implanteringspræparater, som det er beskrevet 30 mere i detaljer i det følgende.

I almindelighed er det til de ovenstående beskrevne anvendelser formålstjenligt at indgive den aktive bestanddel i mængder på mellem 0,01 og 10 mg/kg legemsvægt pr. dag, fortrinsvis mellem ca. 0,1 og 5,0 mg/kg legemsvægt pr. dag. Denne indgivelse kan foretages ved en DK 171483 B1 16 enkelt daglig indgivelse, ved fordeling over flere indgivelser eller ved langsom frigørelse for at opnå de mest effektive resultater.

Den præcise dosis og indgivelsesmetode for disse forbindelser og præparater vil nødvendigvis afhænge af den individuelle patient, der 5 skal behandles, behandlingstypen, graden af lidelse eller nødvendighed og, selvfølgelig, lægens bedømmelse. I almindelighed kræver parenteral indgivelse lavere dosis end andre indgivelsesmetoder, der er mere afhængige af absorption.

Forbindelserne med formlen I kan indgå i farmaceutiske præparater, 10 der som aktiv bestanddel indeholder en forbindelse ifølge opfindelsen, hvilke præparater omfatter en sådan forbindelse i blanding med en farmaceutisk acceptabel ikke-toxisk bærer. Som nævnt ovenfor kan sådanne præparater fremstilles til anvendelse for parenteral (sub-cutan, intramuskulær eller intravenøs) indgivelse, især i form af 15 væskeformige opløsninger eller suspensioner; til anvendelse ved vaginal eller rektalindgivelse, især i halvfaste former såsom cremer og suppositorier; til oral eller buccal indgivelse, især i form af tabletter eller kapsler; eller intranasalt, især i form af pulvere, næsedråber eller aerosoler.

20 Præparaterne kan passende indgives i enhedsdosisform og kan fremstilles ved en hvilken som helst af de metoder, der er velkendte inden for den farmaceutiske teknik, fx som beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, Hack Publishing Company, Easton, Pennsylvania., U.S.A., 1970. Præparater til parenteral indgivelse kan som 25 almindelige excipienser indeholde sterilt vand eller saltvand, po-lyalkylenglycoler såsom polyethylenglycoler, olier af vegetabilsk oprindelse, hydrogenerede naphthalener og lignende. Præparater til vaginal eller rektal indgivelse, fx suppositorier, kan som excipienser fx indeholde polyalkylenglycoler, vaseline, cacaosmør og lignen-30 de. Præparater til inhaleringsindgivelse kan være faste og kan som excipienser fx indeholde lactose eller kan være vandige opløsninger eller olieopløsninger til indgivelse i form af næsedråber. Til buccal indgivelse omfatter typiske excipienser stikkere, calciumstearat, magneslumstearat, forgelatineret stivelse og lignende.

DK 171483 B1 17

Det er særlig ønskeligt at formidle forbindelserne med formlen 1 til patienten over forlængede tidsperioder, fx i perioder på fra 1 uge til 1 år for en enkelt indgivelse. Forskellige langsomt frigørende depot· eller implanteringsdoseringsformer kan anvendes. Fx kan en 5 doseringsform indeholde et farmaceutisk acceptabelt ikke-toxisk salt af forbindelsen, der har en lav opløselighed i kropsvæsker, fx (a) et syreadditionssalt med en polybasisk syre såsom phosphorsyre, svovlsyre, citronsyre, vinsyre, garvesyre, pamoinsyre, alginsyre, poly-glutaminsyre, naphthalen-mono- eller -disulfonsyrer, polygalacturon-10 syre og lignende; (b) et salt med en polyvalent metalkation såsom zink, calcium, bismuth, barium, magnesium, aluminium, kobber, cobalt, nikkel, cadmium og lignende, eller med en organisk kation dannet ud fra fx N,N'-dibenzylethylendiamin eller ethylendiamin; eller (c) kombinationer af (a) og (b), fx et zinktannatsalt. Desuden kan for-15 bindeiserne med formlen I eller fortrinsvis et relativt uopløseligt salt såsom de netop beskrevne formuleres i en gel, fx en aluminiummo-nostearatgel med fx sesamolie, der er nyttige til injektion. Særlig foretrukne salte er zinksalte, zinktannatsalte, pamoatsalte og lignende. En anden type depotpræparat til langsom frigørelse til brug 20 ved injektion ville indeholde forbindelsen eller saltet dispergeret eller indkapslet i en langsomt nedbrydelig, ikke-toxisk, ikke-anti-genpolymer såsom en polyactinsyre/polyglycolsyrepolymer fx som beskrevet i US patentskrift nr. 3,773,919. Forbindelserne eller fortrinsvis relativt uopløselige salte såsom de ovenfor beskrevne kan 25 også formuleres i cholesterolmatrixpellets især til brug i dyr.

Yderligere langsom frigørende depot- eller implanteringspræparater, fx liposomer, er velkendte fra litteraturen. Jfr. fx Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, redigeret af J. R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Specielt reference med 30 hensyn til de forbindelser af LHRH-typen kan fx findes i US patent-skrift nr. 4,010,125.

Polypeptideme med formlen I, som aminosyrederivateme kan anvendes til at fremstille, kan syntetiseres ved en hvilken som helst teknik, der er kendt for fagmanden inden for peptidteknikken. En foretræffe-35 lig opsummering af de mange teknikker, der på denne måde er tilgængelige, kan findes i J. M. Stewart og J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, DK 171483 B1 18

Hormonal Proteins and Peptides, bind 2, s. 46, Academic Press (New York), 1973 til peptidsyntese i fast fase og E. Schroder og K. Lubke,

The Peptides, bind 1, Academic Press (New York), 1965 til klassisk opløsningssyntese.

5 I almindelighed omfatter disse metoder sekventiel addition af én eller flere aminosyrer eller på passende måde beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkæde. Normalt er enten aminogruppen eller carboxylgruppen på den første aminosyre beskyttet ved hjælp af en passende beskyttelsesgruppe. Den beskyttede eller derivatiserede 10 aminosyre kan derefter enten fastgøres til en inert fastfasebærer eller anvendes i opløsning ved tilsætning af den næste aminosyre i sekvensen, der har den komplementære amino- eller carboxylgruppe beskyttet på passende måde tinder betingelser, der er passende til dannelse af amidbindingen. Den beskyttende gruppe fjernes derefter 15 fra denne nytilførte aminosyrerest, og den næste aminosyre (passende beskyttet) tilsættes derefter, osv. Efter at alle de ønskede aminosyrer er blevet kædet sammen i den rigtige rækkefølge, kan eventuelle tilbageværende beskyttelsesgrupper (og en eventuel fastfasebærer) fjernes sekventielt eller samtidigt, hvilket giver det endelige 20 polypeptid. Ved simpel modifikation af denne generelle procedure er det muligt at tilføre mere end én aminosyre ad gangen til en voksende kæde, fx ved kobling (under betingelser, der ikke racemiserer asymmetriske centre) af et beskyttet tripeptid med et rigtigt beskyttet dipeptid til dannelse, efter afbeskyttelse, af et pentapeptid.

25 En særlig foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med formlen I involverer peptidsyntese i fast fase.

1 denne fremgangsmåde beskyttes a-aminofunktionen på aminosyrerne ved hjælp af en syre- eller base-følsom gruppe. Sådanne beskyttelsesgrupper bør være stabile under betingelserne for peptidbindingsdan-30 nelsen, mens de let kan fjernes uden ødelæggelse af den voksende peptidkæde eller racemisering af nogen af de asymmetriske centre, der er indeholdt deri. Passende beskyttelsesgrupper er tert.butyloxycar-bonyl (Boc), benzyloxycarbonyl (Cbz), biphenylisopropyloxycarbonyl, tert.amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, DK 171483 B1 19 1,l-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrophenylsulfenyl, 2-cyano-tert.butyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl og lignende, især tert.butyloxycarbonyl (Boc).

Særlig foretrukne sidebeskyttelsesgrupper er, for arginin: Nitro, 5 p-toluensulfonyl, 4-methoxybenzensulfonyl, Cbz, Boc og adamantyl-oxycarbonyl; for tyrosin: Benzyl, o-brombenzyloxycarbonyl, 2,6-di-chlorbenzyl, isopropyl, cyclohexyl, cyclopentyl og acetyl; for serin: Benzyl og tetrahydropyranyl; for histidin: Benzyl, p-toluensulfonyl og 2,4-dinitrophenyl.

10 Den C-terminale aminosyre er forbundet til en passende fast bærer.

Passende faste bærere, der er nyttige i den ovennævnte syntese, er sådanne materialer, der er inerte over for reagenserne og reaktions-betingelserne i de trinvise kondensations-afbeskyttelsesreaktioner, foruden at de er uopløselige i de anvendte medier. Passende faste 15 bærere er chlormethylenpolystyren-divinylbenzenpolymer, hydroxyme-thylpolystyren-divinylbenzenpolymer og lignende, især chlormethyl-polystyren-ΙΧ divinylbenzenpolymer. I det specielle tilfælde, hvor C-terminalen af forbindelsen kommer til at være glycinamid, er en særlig nyttig bærer den benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzylpo-20 lymer, der er beskrevet af P. Rivaille, et al., Helv. Chim. Acta., 54, s. 2772 (1971). Tilhæftningen til harpiksen af chlormethylpo-lystyren-divinylbenzentypen foretages ved hjælp af reaktionen af den N®- beskyttede aminosyre, især Boc-aminosyren, som dens caesium-, tetramethylammonium-, triethylammonium-, l,5-diazabicyclo[5.4.0]un-25 dec-5-en- eller lignende salt i ethanol, acetonitril, N,N-dimethyl- formamid (DMF) og lignende, især cesiumsaltet i DMF, med chlormethyl-harpiksen ved en forhøjet temperatur, fx mellem ca. 40 og 60®C, især ca. 50eC i fra ca. 12 til 48 timer, fortrinsvis ca. 24 timer. Na-Boc-Aminosyren hæftes til benzhydrylaminharpiksen ved hjælp af en N,N'· 30 dicyclohexylcarbodiimd- (DCC)/l-hydroxybenzotriazol(HBT) -formidlet kobling på fra ca. 2 til ca. 24 timer, fortrinsvis ca. 12 timer ved en temperatur på mellem ca. 10 og 50®C, fortrinsvis 25°C, i et opløsningsmiddel såsom dichlormethan eller DMF, fortrinsvis dichlorme-than. Koblingen af successiv beskyttede aminosyrer kan udføres i et 35 automatisk polypeptidsynteseapparat, der er velkendt inden for teknikken. Fjernelsen af de N®-beskyttende grupper kan udføres i nær- DK 171483 B1 20 værelse af fx en opløsning af trifluoreddikesyre i methylenchlorid, hydrogenchlorid i dioxan, hydrochlorid i eddikesyre eller anden stærk syreopløsning, fortrinsvis 50Z trifluoreddikesyre i dichlormethan ved omkring stuetemperatur. Hver beskyttet aminosyre introduceres for· 5 trinsvis i ca. 2,5 gange molært overskud, og koblingen kan udføres i methylenchlorid, methylenchlorid/DMF-blandinger, DHF og lignende, især i methylenchlorid ved ca. stuetemperatur. Koblingsmidlet er normalt DCC i dichlormethan, men kan være N,N'-di-iso-propylcarbo-diimid (DIC) eller anden carbodiimid enten alene eller i nærværelse 10 af HBT, N-hydroxysuccinimid eller andre N-hydroxyimider eller -oxi-mer. Alternativt kan beskyttede aminosyre-aktive estere (fx p-nitro-phenyl-, pentafluorphenyl- og lignende) eller symmetriske anhydrider anvendes.

Ved slutningen af fastfasesyntesen fjernes det fuldt beskyttede poly-15 peptid fra harpiksen. Hvis bindingen til harpiksbæreren er af benzyl-estertypen, foretages spaltning ved hjælp af aminolyse med en alkyl-amin eller fluoralkylamin for peptider med en C-terminal prolin, eller ved aminolyse med fx ammoniakvand/methanol eller ammoniakvand-/ethanol for peptider med C-terminal glycin ved en temperatur mellem 20 ca. 10 og 50®C, fortrinsvis ca. 25eC, i mellem ca. 12 og 24 timer, fortrinsvis ca. 18 timer. Alternativt kan peptidet fjernes fra harpiksen ved transesterificering, fx ved hjælp af methanol, efterfulgt af aminolyse. Det beskyttede peptid kan på dette tidspunkt oprenses ved silicagelchromatografi. Fjernelsen af de sidekædebeskyttende 25 grupper fra polypeptidet udføres ved at behandle aminolyseproduktet med fx vandfrit flydende hydrogenchlorid i nærværelse af anisol eller en anden carboniumfjemer, behandling med hydrogenfluorid/pyridincom-plex, behandling med tris(trifluoracetyl)bor og trifluoreddikesyre, ved reduktion med hydrogen og palladium på carbon eller polyvinyl-30 pyrrolidon, eller ved reduktion med natrium i flydende ammoniak, fortrinsvis med flydende hydrogenfluorid og anisol ved en temperatur mellem ca. -10 og +10eC, fortrinsvis ca. 0eC imellem ca. 15 minuter og 1 time, fortrinsvis ca. 30 minutter. Ved glycinterminale peptider på benzyhydrylaminharpikserne kan harpiksspaltningen og afbeskyt-35 telsestrinnene kombineres i et enkelt trin ved anvendelse af flydende hydrogenfluorid og anisol som beskrevet ovenfor. Det fuldstændige afbeskyttede polypeptid oprenses derefter ved en sekvens af chroma- DK 171483 B1 21 tografiske trin, der indbefatter en hvilken som helst eller alle af følgende typer: Ionbytning på en svagt basisk harpiks på acetatform; hydrofobisk adsorptionschromatografi på uderivatiseret polystyren-di-vinylbenzen (fx Amberlite® XAD); silicageladsorptionschromatografi; S ionbytningschromatografi på carboxymethylcellulose; fordelingschroma- tografi, fx på Sephadex® G-25, eller modstrømsfordeling; højtryksvæ-skechromatografi (HPLC), især omvendt-fase HPLC på octyl- eller octadecylsilyl-silica-bundet fasesøjlepakning.

Hvis der anvendes en racemisk aminosyre i stillingerne 1,2,3 eller 10 6, adskilles de diastereomere nonapeptid- eller decapeptidslutproduk- ter, og det ønskede peptid indeholdende en D-aminosyre i den relevante stilling isoleres og oprenses, fortrinsvis under den ovenfor beskrevne chromatografiske proces.

Fremstilling af peptider, der har C-terminale azaglycinamider, fore-15 tages fortrinsvis under anvendelse af klassisk opløsningspeptidsyntese under anvendelse af kendte peptidmellemprodukter. Dette er beskrevet mere detaljeret i eksempel 6.

Forbindelserne med formlen I og farmaceutisk acceptable salte deraf kan således sammenfattede fremstilles ved, at 20 beskyttelsesgrupper og, eventuelt, covalent bundet fast bærer fjernes fra et beskyttet polypeptid, hvilket giver en forbindelse med den almene formel I eller et salt deraf; eller sammenkobling i den krævede rækkefølge af to fragmenter af den ønskede forbindelse med den almene formel I; eller 25 (a) omdannelse af en forbindelse med den almene formel I til et farmaceutisk acceptabelt salt, eller (b) omdannelse af et salt af en forbindelse med den almene formel I til et farmaceutisk acceptabelt salt, eller (c) dekomponering af et salt af en forbindelse med den almene 30 formel I til et frit polypeptid med den almene formel I.

DK 171483 B1 22 Særlig nyttige forbindelser ifølge opfindelsen omfatter sådanne med den almene formel II, hvor n er 1 eller 2, og de andre variable er som tidligere defineret; sådanne, som har den almene formel II, hvor n er 3, R3 er alkyl med 2-12 carbonatomer eller som i øvrigt defi-5 neret tidligere, og de andre variable er som tidligere defineret; og sådanne, som har den almene formel II, hvor n er 4 eller 5, og de andre variable er som tidligere defineret.

Foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen omfatter sådanne med den almene formel II, hvor n er 4, R^ er -NHR3, hvor R3 er alkyl med 1-12 10 carbonatomer, og R2 er alkyl med 1-12 carbonatomer.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan fremstilles på en hvilken som helst bekvem måde, fx ved guanylering eller amidinering af den tilsvarende amin.

Følgende fremstillinger og eksempler er givet for at gøre det muligt 15 for fagmanden bedre at forstå og udføre den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1-3 er eksempler ifølge opfindelsen, medens eksempel 4-10 illustrerer anvendelse af forbindelserne ifølge opfindelsen til fremstilling af forbindelserne med formlen I samt disse forbindelsers egenskaber.

20 FREMSTILLING A

N-Acetyl 3-(2-naphthyl)-D,L-alaninat

Fremstilling af 3-(2-naphthyl)-D,L-alanin udføres ifølge den i US patentskrift nr. 4.341.767 beskrevne fremgangsmåde.

Fremstilling af N-acetyl 3-(2-naphthyl)-D,L-alinin, dens omdannelse 25 til methyl N-acetyl 3-(2-naphthyl)-D,L-alinin og separation af £>-iso-meren udføres ved den i US patentskrift nr. 4.341.767 beskrevne fremgangsmåde.

EKSEMPEL 1 DK 171483 B1 23

En blanding af 5,24 g benzyl Na-benzyloxycarbonyl-D-lysinat-toluen-sulfonat (B. Bezus og L. Zervas, J. Am. Chem. Soc., 83, s. 719 (1961)) og 1,72 ml diisopropylethylamin i 60 ml dloxan behandles med 5 1,89 g N,N'-diisopropylcarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres ved 100*C 1 6 timer, afkøles til stuetemperatur og koncentreres til et fast stof. Det faste stof suspenderes i 20 ml varm DMF, filtreres for at fjerne N,N’-diisopropylurea, og filtratet koncentreres til et fast stof. Benzyl Na-benzyloxycarbonyl-N,N'-guanido-diisopropyl-D-homoar-10 gininat-toluensulfonat fås som et hvidt fast stof ved omkrystallisering af methanol/ethylacetat, [er]- -7,26° (c - 0,3 i MeOH).

Ved at benytte ovenstående fremgangsmåde men under anvendelse af fx: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid; N,N'-di-n-hexylcarbodiimid; 15 N,N'-diethylcarbodiimid; N,N'-di-n-propylcarbodiimid; N- i-propylcarbodi imid; N-propylcarbodiimid; N,N'-di-n-butylcarbodiimid; 20 N,N*-dimethylcarbodiimid; N,N'-di-i-butylcarbodiimid; N,N'-di-n-pentylcarbodiimid; N,N'-di-i-pentylcarbodiimid; N,N'-diphenylcarbodiimid; 25 N,N'-ditolylcarbodiimid; eller 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-HCl fås:

Benzyl i^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanidodicyclohexyl-D-homoargininat, [a]jj - 8,07“ (c - 0,9 i MeOH); 30 benzyl i^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanidodiethyl-D-homo- argininat; benzyl iP-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanido-di-n-propyl-D-homoargininat, [a)jj - 8,07° (c - 0,9 i MeOH); DK 171483 B1 24 benzyl l^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanido-n-propyl-D-homoargininat; benzyl b^-benzyloxycarbonyl-N,N'-guanido-di-n-butyl-D-homoarglninat; 5 benzyl l^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanido-di-i-butyl-D- homoargininat; benzyl l^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanido-di-n-pentyl-D-homoargininat; benzyl l^-benzyloxycarbonyl-N,N'-guanido-di-phenyl-D-10 homoargininat; benzyl l^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanido-dimethyl-D-homoargininat; benzyl l^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanido-di-n-hexyl-D-homoargininat; 15 benzyl i^-benzyloxycarbonyl-N.N'-guanido-di-isopropyl-D- argininat, [a]D - -10,5° (c - 0,5 i MeOH); benzyl l^-benzyloxycarbonyl, N-guanido-(3-dimethylami-nopropyl)-N'-guanido-ethyl-D-homoargininat som deres benzensulfonatsalte.

20 På samme måde kan der ved at erstatte D-lysinatet med benzyl Να- benzyloxycarbonyl-D-ornithinatet fås de tilsvarende argininanaloge som deres toluensulfonatsalte.

EKSEMPEL 2 jT G * 1) Benzyl Ne-benzyloxycarbonyl-NG,N -ethano-D-homoargininat 25 Til en blanding af 15 ml toluen og 15 ml tert.butanol blev sat 2,71 g benzyl N*1 -benzyloxycarbony1-D-lysinat og 1,46 g 2-methylthioimida-zolin-HI (tilgængelig fra Aldrich Chemical Company). pH af blandingen blev justeret til ca. 8 ved tilsætning af diisopropylethylamin, og opløsningen blev opvarmet under tilbagesvaling i 24 timer.

30 Opløsningen blev koncentreret i vakuum, og remanensen blev anbragt på en silicagelkolonne (250 g). Kolonnen blev elueret med en gradient fra CH2Cl2/MeOH (19:1) til CH2Cl2/MeOH (7:3). Fraktionerne indehol DK 171483 B1 25 dende produkt blev detekteret ved hjælp af TLC, blandet og koncentreret til tørhed, hvilket gav 2,9 g hvidt skum.

En portion på 2 g af det ovennævnte produkt blev opløst i 50 ml ethanol indeholdende 0,8 g 10X palladium på carbon. Opløsningen blev 5 omrørt under Hj i 8 timer. Blandingen blev filtreret på celit, og Q f filtratet blev koncentreret til tørhed, hvilket gav N”,N -etheno-D-homoarginin som et hvidt skum, 1,2 g.

På lignende måde, ved at anvende den ovenstående procedure, kan N,N'-guanidino-diethyl-D-homoarginin fremstilles som et hvidt skum, 10 [a]g5 - -5,95° (c - 0,1, MeOH).

2) i^Boc-N^.N** - Ethano-D-homoarginin

H

B OCN—CH—COOH (iH2)4

S

HN^^N

VJ

En opløsning af 2,74 g D-lysin-dihydrochlorid og 4,03 g 2-methyl-15 thio-2-imidazolin-hydroiodid i 16,5 ml 2N NaOH blev omrørt ved stuetemperatur i 6 dage. Analysen af reaktionsblandingen på en aminosyre -analysator viste, at der var blevet dannet ca. 701 af den ønskede c-dialkylguanidoforbindelse. Yderligere 0,25 g 2-methylthio-2-imida-zolin-hydroiodid og 1 ml 2N NaOH blev tilsat, og reaktionen blev 20 fortsat ved stuetemperatur i endnu 3 dage. Denne reaktionsblanding bestod af 95Z af den ubeskyttede form af aminosyren, som kan beskyttes videre som beskrevet i det følgende.

Reaktionsblandingen blev behandlet med 0,8 g HgO og 4,36 g di-tert.-butyldicarbonat i 20 ml dioxan. pH-Værdien blev justeret til 9,5 ved 25 hjælp af IN NaOH. Efter reaktion natten over var noget udgangsmateriale til stede, hvorfor der blev tilsat 1 g di-tert.butyldicarbonat.

DK 171483 B1 26

Reaktionsblandingen blev filtreret, og filtratet blev koncentreret til tørhed. Remanensen blev opløst i vand og vasket med ether, og den vandige fase blev justeret til pH-værdi 4 ved hjælp af eddikesyre.

Den sure opløsning blev vasket med ethylacetat. Den vandige fase 5 indeholdende produktet blev behandlet med ionbytterharpiks (AG-3 acetat, BioRad) og koncentreret til tørhed.

Det rå produkt blev sendt gennem en hydrofob chromatografikolonne (Amberlite® XAD-2, Rohm & Haas) ved eluering med en gradient fra Η£θ til 25X ethanol. Fraktionerne indeholdende produkt blev blandet 10 sammen, hvilket gav et 2,7 g Ι^-Βοο-Ν^,Ν -ethanol-D-homoarginin [q]25d - -19,7° (c - 1,0 i MeOH).

På samme måde, men ved at erstatte 2-methylthio-2-imidazolin-Hl med: S-Methyl-diethyl- iso-thiourea-HI; S-methyl-dipropyl-iso-thiourea-HI; 15 S-methyl-dibutyl-iso-thiourea-HI; S-methyl-dipentyl-iso-thiourea-HI; S-methyl-dihexyl- iso-thiourea-HI; S-methyl-diheptyl- iso-thiourea-HI; og S-methyl-dinonyl- iso-thiourea-HI; 20 fås: iP-Boc-N.N'-guanido-diethyl-D-homoarginin; N®-Boc-N,N'-guanido-dipropyl-D-homoarginin; N** - Boc -N, N' - guanido- dibutyl -D-homoarginin; N**- Boc -N, N' -guanido-dipentyl-D-homoarginin; 25 l^-Boc-N.N'-guanido-dihexyl-D-homoarginin; l^-Boc-N.N'-guanido-diheptyl-D-homoarginin, og N**- Boc -N, N' - guanido - dinonyl - D-homoarginin.

EKSEMPEL 3

Denne fremstilling illustrerer fremstillingen af i^-tert.butyloxycar-30 bonylderivater af N,N'-guanido-disubstituerede-D-homoargininer fra deres toluensulfonatprecursorer.

DK 171483 B1 27

En blanding af N,N'-guanido-diisopropyl-D-homoargininattoluensulfonat (3,25 g) og 100 mg 10% palladium på carbon i 50 ml iseddikesyre behandles med hydrogengas ved atmosfærisk tryk i 4 timer. Katalysatoren filteres fra på celit, og filtratet koncentreres til et fast 5 stof, N,N'-guanido-diisopropyl-D-homoarginintoluensulfonat. En opløsning af denne forbindelse (2,13 g) i 60 ml 50% dioxan/vand behandles med 10 ml IN natriumhydroxid og 0,4 g magnesiumoxid. Denne blanding behandles derefter med 1,1 g di-tert.butyldicarbonat og omrøres ved stuetemperatur i 2 timer. Magnesiumsaltet filtreres fra, og 10 filtratet koncentreres under vakuum. Den basiske opløsning vaskes med ethanol og bringes derefter til pH-værdi 2,5 ved hjælp af natriumsulfat. Den sure vandige opløsning ekstraheres med ethylacetat, der tørres over magnesiumsulfat. Tørringsmidlet filtreres fra, og filtratet koncentreres. Omkrystallisering af ethylacetat/hexan giver N01-15 tert.butyloxycarbonyl,N,N'-guanidodiisopropyl-D-homoarginintoluensul- fonat.

Ved at gå frem på samme måde, men erstatte med de passende toluen-sulfonatprecursorer, kan andre N01-tert.butyloxycarbonyl-N,N'-guanido-disubstitueret-D-homoarginin- eller -D-argininforbindelser fremstil-20 les.

FREMSTILLING B

Cis-5-alkylprolinforbindelser kan fremstilles ved følgende fremgangsmåde :

Til en 200 ml rundbundet kolbe sættes (S)-3-(benzyloxycarbonyl)-5-25 oxo-4-oxazolidinpropionsyre og 63 ml vandfri benzen. Til denne opløsning sættes 13,9 g phosphorpentachlorid ved 0°C. Reaktionsblandingen omrøres ved 0eC i 1 time, hvorunder al phosphorpentachloridet opløses. Benzenopløsningsmidlet fjernes under vakuum, og der co-inddampes med to 25 ml prøver tør benzen, og remanensen tørres under 30 vakuum, hvilket giver et lyst fast stof. Det lyse faste stof suspenderes i 30 ml hexamethylphosphoramid, og der tilsættes 9,4 ml tetra-methyltin og 40 mg pHCl^PdiPPhj^Cl. Reaktionsblandingen opvarmes til 65eC i 4 timer. Yderligere 2 ml tetramethyltin sættes til ved slut- DK 171483 B1 28 ningen af denne periode, og reaktionsblandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Efter fortynding med vand og ekstraktion med ethylacetat vaskes ethylacetatfasen med vand, 5X natriumhydrogen- carbonat, vand, 5X natriumhydrogensulfat, vand og mættet natrium- 5 chlorid og tørres over vandfri magnesiumsulfat. Opløsningen filtreres og koncentreres, hvilket giver 16 g af en gul olie, der sendes gennem en silicagelkolonne under anvendelse af ethylacetat/hexan (4:6) som eluent. Koncentration af passende fraktioner giver 15 g af en lysegul olie, der omkrystalliseres af ethylacetat/hexan, hvilket giver 14,3 g 10 (S)-3-(benzyloxycarbonyl)-4-(3-oxobutyl)-5-oxazolidinon som et hvidt 25 fast stof (udbytte 74%), med et smeltepunkt på 64-65eC, [a] jj -+102° (c - 1,1 i CH2C12).

Analyse:

Beregnet for cigH]jN05: C 61,85 H 5,84 N 4,81.

15 Fundet: C 61,54 H 5,89 N 4,84.

Ved at gentage ovenstående procedure på samme måde og ved at erstatte tetramethyltin med en støkiometrisk ækvivalent mængde af det relevante tetraalkyltin, fås følgende forbindelser: a) Med tetraethyltin: 20 (S)-3-(Benzyloxycarbonyl)-4-(3-oxopentyl)-5-oxazolidinon, smeltepunkt 45-46eC; [q)2D - 82,5° (c - 0,7 1 CH30H).

Analyse:

Beregnet for c16H19NO5(305,336): C 62,94 H 6,37 N 4,59.

25 Fundet: C 63,02 H 6,15 N 4,48.

b) Med tetrabutyltin: (S)-3-(Benzyloxycarbonyl)-4-(3-oxoheptyl)-5-oxazolidinon som en olie; [o]2jj - 67,9° (c - 0,12 i CH3OH).

Analyse: 30 Beregnet for C18h23N05 EtOAc(421,494): C 62,69 H 7,41 N 3,32.

Fundet: C 62,50 H 7,29 N 3,39.

DK 171483 B1 29 10 g (S)-3-(benzyloxycarbonyl)-4-(3-oxobutyl)-5-oxazolidinon fra eksempel 4 opløses i 480 ml destilleret tetrahydrofuran efterfulgt af 160 ml ammoniakvand ved 0eC. Reaktionsblandingen omrøres ved 0eC i 5 timer og derefter ved stuetemperatur natten over. Efter inddampning i 5 vakuum til tørhed giver reaktionsblandingen et hvidt fast stof, der omkrystalliseres af varm ethylacetat, hvilket giver 8,8 g (S)-2-(benzyloxycarbonylamino)-5-oxohexanamid som et hvidt fast stof (udbytte 82X), smeltepunkt 142-144‘C; [α]2β - -4,0* (c - 0,4 i CH30H).

10 Analyse:

Beregnet for C7H9NO2: C 60,4 H6,4 N10,0.

Fundet: C 60,44 H 6,53 N 10,05.

Ved at gentage ovenstående procedure på samme måde og erstatte med en støkiometrisk ækvivalent mængde af de tilsvarende mellemprodukter fra 15 det andet foregående afsnit fremstilles følgende forbindelser: (S)-2-Benzyloxycarbonylamino-5-oxoheptanamid, smeltepunkt 133-135eC; [q]2D - -4,17“ (c - 0,8 i CH3OH).

Analyse:

Beregnet for C15h20N2O4(292,341): C 61,63 H 6,90 N 9,58.

20 Fundet: C 61,51 H 6,75 N 9,16.

(S)-2-Benzyloxycarbonylamino-5-oxononamid, smeltepunkt 162-163eC; M2D “ -4,32° (c - 0,6 i CH3OH).

Analyse:

Beregnet for C17h24N2O4(320,395): C 63,73 H 7,55 N 8,74.

25 Fundet: C 63,62 H 7,56 N 8,82.

Til en opløsning af 2,8 g (S)-2-benzyloxycarbonylamino)-5-oxohexanamid fra det foregående afsnit i en blanding af 60 ml methanol og 7,5 ml iseddikesyre sættes under nitrogenatmosfære 1,5 g palladiumdiace-tat. Denne reaktionsblanding hydrogeneres under atmosfærisk tryk i 4 30 timer, på hvilket tidspunkt en tyndtlagschromatografisk analyse viser, at reaktionen er komplet. Reaktionsblandingen filtreres derefter gennem celit og vaskes med methanol. Reaktionsblandingen og DK 171483 B1 30 vaskefaserne koncentreres til tørhed, hvilket giver 1,7 g af en gul olie, der behandles med 1 ml af en blanding af saltsyre og ethylace-tat, hvilket giver hydrochloridsaltet. Denne olie tritureres med methanol/ethylether, hvilket giver 1,3 g af et gult fast stof, smel-5 tepunkt 174-176°C; [a]2jj - -33° (c - 0,96 i CH30H).

Det gule faste stof (S)-cis-5-methylprolinamid (som hydrochloridsaltet) sendes gennem en fiiox-Rex 70 kolonne (en svagt sur carboxylsyre-ionbytningsharpiks) med eluering først med 300 ml vand efterfulgt af 10 1% opløsning af ammoniumhydroxid. Koncentrering af passende frakti oner giver 0,9 g af et gult fast stof, der omkrystalliseres af meth-ylenchlorid, hvilket giver 0,64 g (S)-cis-S-methylprolinamid som et gult fast stof (udbytte 50%), smeltepunkt 55-56°C.

Ved at gentage ovenstående procedure på samme måde og erstatte med en 15 støkiometrisk ækvivalent mængde af det tilsvarende mellemprodukt fremstilles følgende forbindelser efter reduktion: (S)-cis-5-Ethylprolinamid, smeltepunkt 63-65eC, og (S)-cis-5-butylprolinamid, smeltepunkt 74-75eC.

FREMSTILLING C

20 4,9 g Boc-glycin blev opløst i en blanding af 50 ml ethanol og 50 ml destilleret vand. pH-Værdien af opløsningen blev justeret til 7 ved hjælp af vandigt caesiumbicarbonat. Opløsningsmidlet blev derefter fjernet under vakuum.

Efter 18 timers tørring i højvakuum blev remanensen opløst i 150 ml 25 tør DMF. 25 g chlormethyleret polystyren - 1Ϊ divinylbenzenharpiks (Merrifield) (svarende til 25 millimol chlorid) blev sat til. Blandingen blev omrystet ved 50eC i 24 timer og filtreret, og harpiksen blev derefter vasket successivt med DMF, vand og ethanol. Harpiksen blev tørret i vakuum i 3 dage, hvilket gav 28,34 g Boc-Gly-O-harpiks.

EKSEMPEL 4 DK 171483 B1 31 1 reaktionsbeholderen på en Beckman 990 Peptide Synthesizer blev placeret 7,29 g (5,5 millimol) Boc-Gly-O-harpiks fremstillet ved omsætning af ekvimolære forhold af det terre cesiumsalt af Boc-GlyOH 5 med chlormethylpolystyren/12 divinylbenzen. Til denne harpiks blev sat aminosyrer ved hjælp af et synteseprogram på følgende måde:

Trin 1 CH2CI2 vask 1 gang 1,5 min.

" 2 50X CF3C02H/CH2Cl2-afbeskyttelse 1 " 1,5 min.

10 " 3 502 CF3C02H/CH2C12-afbeskyttelse 1 30 min.

" 4 CH2CI2 vask 3 gange 1,5 min.

" 5 102 triethylamin/CH2Cl2 2 " 1,5 min.

" 6 CH2CI2 vask 3 " 1,5 min.

" 7 I^-Boc-aminosyreopløsning 1 gang tilsætning 15 " 8 N,N'-dicyclohexylcarbodiimid- opløsning 1 " tilsætning trin 9 CH2CI2 skylning og standsning 1 " koblings - kobling reaktion 2 timer 20 " 10 C^C^-skylletilsætning 1 gang 1,5 min.

" 11 CH2CI2 vask 3 gange 1,5 min.

" 12 ethanol vask 3 " 1,5 min.

" 13 CH2Cl2 vask 3 " 1,5 min.

25 Trin 1-13 fuldender en koblingscyklus for én aminosyre, og fuldførelsen af reaktionen efterprøves ved ninhydrinmetoden ifølge E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, s. 595 (1970).

Harpiksen blev koblet sekventielt med et 2,0-2,5 molært overskud af hver beskyttet aminosyre og DCC. Således blev harpiksen under succes-30 sive koblingscykler behandlet med 3,01 g Boc-Pro-OH, 5,99 g Boc-Arg(Tosyl)-OH,

3,49 g Boc-Leu-Oh-^O

DK 171483 B1 32 På dette tidspunkt blev den resulterende tetrapeptidharpiks delt ud i mindre portioner. En 1,00 g portion blev ført videre ved yderligere kobling i successive cykler med 0,456 g Boc-D-Dia-OH toluensulfonat, 5 0,44 g Boc-Tyr(2,6-dichlorbenzyl)-OH, 0,375 g Boc-Ser(benzyl)-OH, 0,315 g Boc-D-Nal(2)-OH, 0,35 g Boc-D-p-F-Phe-0H, 9,275 g Boc-L-prolin, og 10 2,5 ml eddikesyreanhydrid.

Harpiksen blev fjernet fra reaktionsbeholderen, vasket med CH2CI2 og tørret i vakuum, hvilket gav 1,66 g beskyttet polypeptidharpiks. Det beskyttede peptid blev fjernet fra harpiksen ved behandling ved stuetemperatur i 24 timer med 50 ml methanol, der var mættet ved 0°C 15 med ammoniak. Harpiksperlerne blev filtreret og vasket successivt med methanol og DMF. Opløsningsmidlet blev fjernet fra filtratet under vakuum, hvilket gav det beskyttede peptid som 0,9 g gul olie.

De beskyttende grupper blev fjernet ved behandling med 10 ml vandfri flydende HF i nærværelse af 1 ml anisol (carboniumfjerner) i en Kel-20 F-reaktionsbeholder ved 0eC i 30 minutter. HF blev afdampet under vakuum, og remanensen af N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)- Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 som dens HF-salt blev vasket med ether. Remanensen blev derefter ekstraheret med iseddike. Eddikesyreekstrakten blev lyofiliseret, hvilket gav 0,5 g råt materiale.

25 Det rå materiale blev omdannet til acetatsaltet ved i vand at blive passeret gennem en kolonne af AG3X (en svagt basisk tertiær amin-harpiks), der var blevet omdannet til acetatform. Lyofilisering af eluatet gav 0,5 g af det rå peptidacetatsalt som et hvidt fast stof.

Det rå peptid blev oprenset ved HPLC på en 2,5 x 100 cm kolonne af 30 Licroprep Rp-18 (25-40 μτα), der var i ligevægt med den løbende puffer 35% CH3CN/65XH2O (0,03 M i ammoniumacetat, pH-værdi 4,5). Den stærkest UV-absorberende (280 nm) top, der eluerede ved ca. 3 kolonnevo- DK 171483 B1 33 lumener, blev opsamlet, koncentreret til tørhed og lyofiliseret tre gange fra destilleret vand, hvilket gav 75 mg ren N-Ac-L- Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; [a]2q - -15,4° (c - 0,5 i HOAc).

5 Ved at gå frem på samme måde, men ved at erstatte de anførte aminosyrer med den passende A, B, C, D, E, G eller F-aminosyre, fås de tilsvarende GlyNH2 decapeptider eksemplificeret hertinder.

N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Iph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 10 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Iph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Iph-Leu-Arg-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 15 N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Prh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hha-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dpa-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 20 N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 25 N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Prh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hha-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 30 N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Prh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; 35 N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hha-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-propylamidin-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; DK 171483 B1 34 N-Ac-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2; N-Ac-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, og N-Ac-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2.

5 På samme måde ved at erstatte Boc-Gly-O-harpiksen med Boc-D-Ala-benzhydrylaminopolystyren/lX divlnylbenzenharpiks fremstillet af benzhydrylaminopolytyren-IX divlnylbenzenharpiks (Beckman Inst.). Boc-D-Ala-OH, DIC og HBT opnåedes de tilsvarende D-Ala^-analoge af LHRH: 10 N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Iph-Leu-Arg-D-AlaNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2, [a]2jj --21,6° (c - 4 i HoAc); N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhi*-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2! 20 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Dev-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2, og N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2.

* D-Dhi er D-N-e-dihydroimidazolinyllysin.

EKSEMPEL 5 25 Til syntesen af analoge med en C-terminal Pro-NHCH2CH3 blev anvendt et synteseprogram identisk med det i eksempel 4 beskrevne. Reaktions-beholderen fra den anvendte Beckman 990 Synthesizer blev fyldt med 2,13 g Boc-Pro-0-harpiks, fremstillet ved omsætning af ækvimolære mængder af det tørre caesiumsalt af Boc-Pro-OH med chlormethyl-po-30 lystyren/lX divinylbenzen (Lab Systems, Inc.). Den anvendte mængde Boc-Pro-0-harpiks indeholdt 1,4 millimol prolin.

DK 171483 B1 35

Harpiksen blev sekventielt koblet med et 2,0-2,5 molært overskud af hver beskyttet aminosyre og DCC. Således blev harpiksen under successive koblingscykler omsat med 1,61 g Boc-Arg(tosyl)-OH,

5 0,93 g Boc-Leu-OH-^O

0,94 g Boc-Ν,Ν'-guanido-diisopropylhomoarginin, 0,49 g 1-hydroxybenzotriazol, 1,75 g N-Boc-0-2-brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin, og 1,11 g Boc-Ser(benzyl)-0H.

10 Få dette tidspunkt i syntesen blev mængden af beskyttet polypeptid-harpiks delt i to, og den ene halvdel blev ført videre til fuldførelse ved sekventiel omsætning med 0,57 g Boc-D-Nal(2)-OH, 0,480 g Boc-D-p-F-Phe-OH, 15 0,21 g N-Ac-L-prolin.

Harpiksen blev fjernet fra reaktionsbeholderen, vasket med CH2CI2 og tørret i vakuum, hvilket gav 2,26 g beskyttet polypeptidharpiks.

Det beskyttede polypeptid blev spaltet fra harpiksen ved aminolyse med 25 ml ethylamin i 18 timer ved 2“C. Ethylaminen fik lov at for-20 dampe, og harpiksen blev ekstraheret med methanol. Methanolen blev inddampet, hvilket gav 1,39 g N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-Trp-Ser(Benzyl)-Tyr(2,6-dichlorbenzyl)-D-Dih-Leu-Arg(Tosyl)-Pro-NHC^CHg. Dette beskyttede peptid blev blandet med 3 ml anisol og 30 ml redestilleret (af C0F3) vandfri flydende HF ved 0"C i 30 minutter i en Kel-F-reak-25 tionsbeholder. HF blev afdampet i vakuum, og remanensen blev vasket med ether. Remanensen blev opløst i 2M eddikesyre og lyofiliseret, hvilket gav 0,82 g rå N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser- Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-NHCH2CH3 som dens eddikesyreadditionssalt. Endelig oprensning blev foretaget ved præparativ højtryksvæskechromatografi af en 20 mg 30 prøve på en 2,5 x 100 mm kolonne med 40-50 μπι octadecylsilyleret silica (Merck, Lichroprep C^g).

DK 171483 B1 36

Ved at gå frem på samme måde men erstatte med passende beskyttet aminosyrerester, hvor det er nødvendigt, fremstilles følgende forbindelser: N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-NHEt; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-NHEt; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Prh-Leu-Arg-Pro-NHEt; 10 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hha-Leu-Arg-Pro-NHEt, og N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dpa-Leu-Arg-Pro-NHEt.

Ved at gentage den ovenfor beskrevne fraspaltning, erstatte en støkiometrisk mængde af ethylamin med methylamin og propylamin fås det tilsvarende methylami og propylamid af det ovennævnte nonapeptid.

15 EKSEMPEL 6

Forbindelser med den almene formel I, hvor H er -NH-CONH-rA®t kan fremstilles ved klassisk opløsningssyntese.

Fx kan anvendes følgende procedure, hvor "AzaGlyNHR^g" er -NH-NH-CONH2, til fremstilling af peptidet som det fri peptid eller salt.

20 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe- Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 D-Trp-Ser-Tyr-OMe NO o (1) I (2) ν'

Boc-D-Deh-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 H+ I» 1 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe- | D-Trp-Ser-Tyr-N3 ^ H-D-Deh-

Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 1 (3> N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-Aza-GlyNH2 DK 171483 B1 37

Koblingen af de individuelle fragmenter kan foretages ved acylazid-metoden (J. Honzel, et al., Coll. Czech. Chem. Conan., 26, s. 2333 (1971), ved DCC/HBT-kobling eller andre racemiseringsfri fragment-kobl ingsteknikker. Forbindelse (2) er kendt: A.S. Dutta, et al., J.

5 Cheat. Soc. Perkin I, s. 379, (1979), og forbindelse (1) kan fremstilles ved metoder, der er analoge med de i eksempel 1 beskrevne. Forbindelse (3) fremstilles ud fra (2) ved fjernelse af Cbz- og nitrogrupper ved hydrogenolyse efterfulgt af kobling med N,N'-guanidodi-ethyl-D-homoarginin under anvendelse af DCC/HBT eller andet koblings -10 middel, der er kendt inden for teknikken. Jfr. Dutta et al., se ovenfor, med hensyn til en lignende LHRH-analog syntese.

Fragmenterne, der kobles på denne måde, vil ofte være peptider eller aminosyrer. Alternativt kan den N-terminale nonapeptidsyre fremstilles ved fastfase- eller opløsningsmetoden og derefter kobles til 15 semicarbazid-HCl ved dicyclohexylcarbodiimidhydroxybenzotriazol-metoden eller anden koblingsmetode.

EKSEMPEL 7 A. En opløsning af 0,1 g af hydrogenfluoridsaltet af N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 (jfr. eksempel 4) opløses 20 i 50 ml vand og passeres gennem en kolonne af 50 g Dowex® 3 anion- bytterharpiks, der på forhånd var blevet bragt i ligevægt med eddikesyre og vasket med deioniseret vand. Kolonnen elueres med deioniseret vand, og udløbet lyofiliseres, hvilket giver det tilsvarende eddikesyresalt af N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-Gly-25 NH2, [a]2p - -15,Ae (c - 1 i HOAc).

Ved at gentage det ovenstående og erstatte eddikesyre med andre syrer under ækvilibreringen af harpiksen kan der fx fås de tilsvarende salte med saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, phosphorsyre, salpetersyre, benzoesyre og lignende.

30 På samme måde kan der fremstilles syreadditionssaltene af de andre heri beskrevne peptider, der er analoge med LHRH.

DK 171483 B1 38 B. I tilfælde af salte med lav opløselighed i vand kan disse fremstilles ved udfældning fra vand under anvendelse af den ønskede syre.

Fx: Zinktannatsalt - en opløsning af 10 mg N-Ac-L-Pro-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 eddikesyresalt i 0,1 ml vand 5 blev behandlet med en opløsning af 8 mg garvesyre i 0,08 ml 0,25 M NaOH. En opløsning af 5 mg ZnS04 heptahydrat i 0,1 ml vand blev med det samme sat til opløsningen af LHRH-analogen.

Den resulterende suspension blev fortyndet med 1 ml vand, og bundfaldet blev centrifugeret. Supernatanten blev dekanteret fra, og 10 remanensen blev vasket to gange med 1 ml portioner vand ved centrifugering af bundfaldet og dekantering af supernatanten. Bundfaldet blev tørret i vakuum, hvilket gav 15 mg af de blandede zinktannat-salte af den ovennævnte LHRH-analog.

Pamoatsalt - til en opløsning af 50 mg N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-15 Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 eddikesyresalt i en blanding af 1,6 ml ethanol og 0,1 ml 0,25 M NaOH blev sat en opløsning af 11 mg pamoinsyre i 0,3 ml 0,25 M NaOH. Opløsningsmidlerne blev fjernet ved reduceret tryk, og remanensen blev suspenderet i 2 ml vand og centrifugeret, og supernatanten blev dekanteret. Bundfaldet blev 20 tørret i vakuum, hvilket gav 54 mg af permoatsaltet af den ovennævnte LHRH-analog.

På samme måde kan der fremstilles andre salte med lav opløselighed i vand.

C. Fremstilling af syreadditionssalte ud fra frit peptid.

25 Til en opløsning af 50 mg N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-

Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 som fri base sættes 30 ml IN eddikesyre. Den resulterende opløsning lyofiliseres, hvilket giver 50 mg af eddi- 25 kesyresaltet af ovennævnte, [a] p - -15,4° (c - 0,5 i HOAc).

På samme måde og ved at erstatte eddikesyrer med andre syrer (i 30 støkiometrisk ækvivalente mængder i forhold til peptidet) fås andre syreadditionssalte af peptiderne heri, fx saltene med saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, phosphorsyre og saltpetersyre.

DK 171483 B1 39 D. Fremstilling af salt med metalkation, fx zinksalt.

Til en opløsning af 50 mg N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 eddikesyresalt i en blanding af 0,4 ml 0,25 M NaOH, 0,3 ml vand og 1 ml ethanol blev sat en opløsning af 15 mg 5 ZnSO^ heptahydrat i 0,2 ml vand. Bundfaldet blev centrifugeret, og supernatanten blev dekanteret fra. Bundfaldet blev vasket med 1 ml vand ved centrifugering og dekantering af supernatanten. Bundfaldet blev tørret i vakuum, hvilket gav zinksaltet af den ovennævnte LHRH-analog.

10 På lignende måde kan der fremstilles salte med andre multivalente kationer, fx calcium, bismuth, barium, magnesium, aluminium, kobber, cobalt, nikkel, cadmium og lignende.

EKSEMPEL 8

En opløsning af 50 mg N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Dih-15 Leu-Arg-Pro-GlyNH2 eddikesyresalt i 25 ml vand passeres gennem en 50 g kolonne af Dowex® 1 (stærk basisk kvaternær ammoniumanionbytter-harpiks), der var blevet bragt i ligevægt med NaOH-opløsning til fremstilling af modionhydroxidet. Kolonnen elueres med 150 ml vand, og eluenten lyofiliseres, hvilket giver 45 mg af det tilsvarende 20 polypeptid som en fri base.

På samme måde kan andre syreadditionssalte af forbindelser af peptiderne heri omdannes til de tilsvarende fri baser.

EKSEMPEL 9 Biologisk virkning 25 Den nyttige virkning af forbindeisene med formlen I illustreres ved følgende resultater, der er opnået ved standard anti-ægløsningstesten DK 171483 B1 40 ifølge A. Corbin and C.W. Beattie, Endocr. Res. Commm. bind 2, s. 1, 1975.

ED50 i Mgs 5 Propylen- glycol/ saltvand Majsolie middag- middag- 10 Forbindelsesstruktur 24 timer 24 timer 1 2 3 6 10 N-Ac- D-pClPhe, D-pCIPhe, D-Trp, D-Dph, D-Ala 2,6 2,0 14 15 N-Ac- D-Nal(2), D-pFPhe, D-Trp, D-Dph - 2,4 4,7 12 N-Ac- D-Nal(2), D-pFPhe, D-Trp, D-Deh, - 1,6 1,4 3,5 N-Ac- 20 D-p-Cl-Phe, D-p-Cl-Phe, D-Trp, D-Deh, - 2,0 2,4 16 N-Ac- D-p-ClPhe, D-p-CIPhe, D-Trp, D-Dph, - 2,6 2,3 N-Ac- D-p-Cl-Phe, D-p-Cl-Phe, D-Trp, D-Deh.« 25 D-Ala1U - 1,7 1,6 >8 N-Ac- D-p-Cl-Phe, D-p-Cl-Phe, D-Trp, D-Dmh._ D-Ala 1,6 1,3 1,8 N-Ac- 30 D-p-Cl-Phe, D-p-Cl-Phe, D-Trp, D-Dhi.n D-Ala1 2,0 2,0 3,6 N-Ac- D-Nal(2), D-p-F-Phe, D-Trp, D-Dmh, - 1,7 0,8 3,3 N-Ac- 35 D-Nal(2), D-p-F-Phe, D-Trp, D-Dhi, - 1,7 1,0 2,8 N-Ac- D-Nal(2), D-p-Cl-Phe, D-Trp, D-Deh, - 2,0 1,0 1,7 N ~ Ac “ 40 D-Nal(2), D-p-Cl-Phe, D-Trp, D-Deh, D-Ala10 0,67 0,5 2,5 EKSEMPEL 10 41 DK 171483 B1

Karakteriserende data for forbindelser fremstillet i de foregående eksempler er vist herunder: 5 Forbindelse nr. Forbindelse 1 [N-Ac-D-pCl-Phe1,2,D-Trp3,D-Dih6,D-Ala10]LHRH (anden top)

2 [N-Ac-Pro*,D-pF-Phe2,D-Nal(2)3,D-monoisopropylArg^]LHRH

3 [N-Ac-Pro1,D-pF-Phe2,D-Nal(2)3,D-Dia6]LHRH

10 4 [N-Ac-Pro*,D-pF-Phe2,D-Nal(2)3,D-monoisopropylArg^,Pro9-

NHEt]LHRH

5 [N-Ac-Pro1,D-pF-Phe2,D-Nal(2)3,D-Dia6,Pro9-NHEt]LHRH

6 [N-Ac-D-Nal(2)1,3,D-pF-Phe2,D-Dph6]LHRH

7 [N-Ac-Pro*,D-pF-Phe2,D-Nal(2)3,D-Dph6]LHRH

15 8 [N-Ac-D-pCl-Phe1’2,D-Trp3,D-Dph6,D-Ala1°]LHRH

9 [N-Ac-D-pCl-Phe1’2,D-Trp3,D-Dph6]lHRH

10 [N-Ac-D-Nal(2)*,D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Dph6]LHRH (anden top) 11 [N-Ac-D-Nal(2)*,D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Dph6]LHRH (tredje top)

12 [N-Ac-D-pCl-Phe1,2,D-Trp3,D-Dhh6D-Ala10]LHRH

20 13 [N-Ac-D-Ser1-D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Dhh6]LHRH

14 [N-Ac-D-Nal(2)1-D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Dhh^]LHRH

15 [N-Ac-D-pCl-Phe1,2,D-Trp3,D-Deh6]LHRH

16 [N-Ac-D-Nal(2)1,D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Deh6]LHRH

17 [N-Ac-D-pCl-Phe1’2,D-Trp3,D-Deh6D-Ala10]LHRH

25 18 [N-Ac-D-Nal(2)1,D-pCl-Phe2,D-Trp3,D-Deh6D]LHRH

19 [N-Ac-D-Nal(2)1,D-pCl-Phe2,D-Trp3,D-Deh6D-Ala10]LHRH

20 [N-Ac-D-pCl-Phe1,2,D-Trp3,D-Wsh6]LHRH

21 [N-Ac-D-Nal(2)1,D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Wsh6]LHRH

22 [N-Ac-D-pCl-Phe1,2,D-Trp3,D-Dmh6,D-Ala10]LHRH

30 23 [N-Ac-D-Nal(2)1,D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Dmh6]LHRH

24 [N-Ac-D-pCl-Phe1’2,D-Trp3,D-Dhi6D-Ala10]LHRH

25 [N-Ac-D-Nal(2)*-D-pF-Phe2,D-Trp3,D-Dhi6D] LHRH

26 [N-Ac-D-pCl-Phe1,2,D-Trp3,D-Dma6D,D-Ala10]IHRH[NG,NGl-

r GI

dimethylarginin: Dms; N -ethyl,N -dimethylaminopropylhomo-35 arginin: Wsh].

DK 171483 B1 42

FYSISKE DATA

1. Smeltepunkt 157-160®C. Se fodnote 2. Aminosyreanalyse (909):

Ser, 0,82 (1); Pro, 1,12 (1); Ala, 1,14 (1); Leu, 1,16 (1);

Tyr, 0,83 (1); NH3, 2,58; Arg, 0,88 (1); D-pCl-Phe + Trp, 2,34 5 (3); D-Dih, 1,15 (1).

2. Smeltepunkt 144-150eC; [a]2j} - -24,0° (c - 0,3 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for C73H104N17°17F <1510>75>: C 58,04 H 6,94 N 15,76.

10 Fundet (143316): C, H lav.

Aminosyreanalyse (924): Ser, 0,87 (1); Pro, 2,08 (2); Gly, 1,01 (1); monoisopropyl Arg, 0,85 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,90 (1); NH3, 1,33 (1); Arg, 1,06 (1); D-pF-Phe, 0,91 (1); D-Nal(2), 1,09 (1).

15 3. Smeltepunkt 144-148"C; [a]2p - -15,4° (c - 0,32 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for ¢76^10^70^7^ (1552,83): C 58,78 H 7,14 N 15,33.

Fundet (144251): C, H lav.

20 Aminosyreanalyse (923): Ser, 0,94 (1); Pro, 2,05 (2); Gly, 1,00 (1); D-Dia, 0,85 (1); Leu, 1,03 (1); Tyr, 0,96 (1); NH3, 1,27; Arg, 1,01 (1); D-pF-Phe, 0,95 (1); D-Nal(2), 1,06 (1).

4. Smeltepunkt 145-150°C; [α]2ρ - -18,1° (c - 0,83 i HOAc). Se fodnote 2. Aminosyreanalyse (925): Ser, 0,91 (1); Pro, 2,09 25 (2); Leu, 1,05 (1); Tyr, 0,84 (1); NH3, 0,41; Arg, 1,11 (1); D-pF-Phe, 0,91 (1); D-Nal(2), 0,95 (1); monoisopropyl Arg, 0,74 (1).

5. Smeltepunkt 137-142eC; [α]2ρ - -16,5" (c - 0,2 i HOAc).

Analyse: 30 Beregnet for ^76H^^^N^60^6F (1523,83): C 59,90 H 7,34 N 14,71.

Fundet (143315): C, H lav.

DK 171483 B1 43

Aminosyreanalyse (926): Ser, 0,91 (1); Pro, 2,25 (2); Leu 1,05 (1) ; Tyr, 0,93 (1); NH3, 0,67; Arg, 1,01; D-pF-Phe, 1,00 (1); D-Nal(2), 1,05 (1); D-Dia, 0,86 (1).

6. Smeltepunkt 152-155eC; [α]2ρ - -15,2" (c - 0,2 i HOAc).

5 Analyse:

Beregnet for °85%16Ν17017Γ (1667): C 61,24 H 7,01 N 14,28.

Fundet (143304): C, H lav.

Aminosyreanalyse (939): Ser, 0,94 (1); Pro, 1,11 (1); Gly, 10 1,02 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,90 (1); NH3, 1,45 (1); Arg, 1,06 (1); D-pF-Phe, 0,94 (1); D-Dph, 1,06 (1); D-Nal(2), 2,32 (2) .

7. Smeltepunkt 135-142*0; [a]2p - -26,5° (c - 0,23 i HOAc).

Analyse: 15 Beregnet for ^77H^^2^17®17^ (1566,26): C 59,02 H 7,20 N 15,20.

Fundet (143303): C, H lav.

Aminosyreanalyse (940): Ser, 0,88 (1); Pro, 2,02 (2); Gly, 1,03 (1); Leu, 1,00 (1); Tyr, 0,88 (1); NH3, 1,61; Arg, 1,08 20 (1); D-pF-Phe, 0,92 (1); D-Dph, 1,08 (1); D-Nal(2), 0,91 (1).

8. Smeltepunkt 170-172eC; [a]2^ - -17,5° (c - 0,37 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for c80H1i4N18O17O17cl2 (1670,82): C 57,51 H 6,88 N 15,09.

25 Fundet (143294): C, H lav.

Aminosyreanalyse (945): Ser, 0,88 (1); Pro, 1,09 (1); Ala, 0,88 (1); Leu, 1,01 (1); Tyr, 0,92 (1); NH3, 1,76; Trp, 0,41 (1); Arg, 1,19 (1); D-pCl-Phe, 1,84 (2); D-Dph, 0,97 (1).

Fodnote: Trp skilles ikke godt fra D-pCl-Phe).

30 9. Smeltepunkt 165-170eC; [α]2ρ - -25° (c - 0,43 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for C79H112N18°17C12 (1656,2): C 57,27 H 6,81 N 15,22.

Fundet (142675): C, H lav.

DK 171483 B1 44

Aminosyreanalyse (981): Ser, 0,83 (1); Pro, 0,93 (1); Ala, 1,01 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,94 (1); NH3, 1,18 (1); Trp, 0,97 (l)1; Arg, 1,03 (1); D-pCl-Phe, 1,94 (2)1; D-Dph, 1,16 (1).

25 5 10. Smeltepunkt 142-150eC; [o] jj - opløsning uigennemsigtig i HOAc).

Analyse:

Beregnet for c82Hi13N18017F (1641,93): C 59,98 H 6,94 N 15,35.

10 Fundet (143302): C, H lav.

Aminosyreanalyse (953B): Ser, 0,95 (1); Pro, 0,93 (1); Gly, 1,10 (1); Leu, 1,09 (1); Tyr, 0,87 (1); D-pF-Phe, 0,223 (1); NH3, 2,87; Trp, 0,413 (1); Arg, 0,94 (1); D-Dph, 1,25 (1); D-Nal(2), 1,06 (1). (Note: D-pF-Phe værdier er lave).

15 11. Smeltepunkt 142-152eC. Se fodnote 2. Aminosyreanalyse (952):

Ser, 0,83 (1); Pro, 0,95 (1); Gly, 0,97 (1); Leu, 1,06 (1);

Tyr, 0,96 (1); NH3, 3,17; Trp, 0,66 (1); Arg, 1,01 (1); D-pF-Phe, 0,78 (1); D-Dph, 1,22 (1); D-Nal(2), 1,27 (1).

12. Smeltepunkt 140-142eC; [a]^j) - -14,3® (c - 0,14 i HOAc).

20 Analyse:

Beregnet for c82Hn8N18013Cl2CH3COOH>3 H2° (1929,14): C 56,03 H 7,31 N 13,07.

Fundet (141592): C 55,75 H 6,93 25 N 12,76.

Aminosyreanalyse (987): Ser, 0,87 (1); Pro, 1,09 (1); Ala, 1,08 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,94 (1); NH3, 1,43; Trp, 0,88 (1)1; Arg, 0,97 (1); D-pCl-Phe, 1,76 (2)1; D-Dhh kommer ikke af kolonne selv efter 340 minutter.

30 13. Smeltepunkt 145-148®C; [a]^ - -4,17® (c - 0,11 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for C79H^21N18°18F (i629>96): C 58,21 H 7,48 N 15,46.

Fundet (142506): C, H lav.

DK 171483 B1 45

Aminosyreanalyse (963B): Ser, 1,77 (2); Pro, 1,15 (1); Gly, 1,07 (1); Leu, 1,01 (1); Tyr, 0,96 (1); NH3, 1,26; Trp, 0,73 (1); Arg, 1,01; D-pF-Phe, 0,81 (1).

14. Smeltepunkt 147-151eC; [a]2jj - -27,3® (c - 0,51 i HOAc) .

5 Analyse:

Beregnet for ^9^27^80^ (1740,12): C 61,43 H 7,36 N 14,49.

Fundet (142505): C, H lav.

Aminosyreanalyse (964B): Ser, 1,00 (1); Pro, 1,11 (1); Gly, 10 1,03 (1); Leu, 1,03 (1); Tyr, 0,95 (1); NH3 1,24 (1); Trp, 0,80 (1); Arg, 0,99 (1); D-pF-Phe, 0,87 (1); D-Nal(2), 0,85 (1): 15. Smeltepunkt 155-158°C; [a]2fj - -26° (c - 0,44 i HOAc).

Analyse: 15 Beregnet for C77H1o8N18°17CL2 (1628>74): C 56,78 H 6,68 N 15,48.

Fundet (142479): C, H lav.

Aminosyreanalyse (975): Ser, 0,88 (1); Pro, 0,97 (1); Gly, 1,01 (1); Leu, 0,99 (1); Tyr, 0,97 (1); NH3, 1,19; Trp, 0,926 20 (l)1; Arg, 1,03 (1); D-pCl-Phe, 1,85 (2)1; D-Deh, 1,28 (1).

16. Smeltepunkt 152-155°C; [a]2fj - -32,6° (c - 0,26 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for c81HmN18°17F (1628): C 59,76 H 6,87 N 15,49.

25 Fundet (142481): C, H lav.

Aminosyreanalyse (966): Ser, 0,93 (1); Pro, 0,99 (1); Gly, 1,10 (1); Leu, 0,94 (1); Tyr, 0,94 (1); NH3, 1,19; Trp, 0,76 (1); Arg, 1,02 (1); D-pF-Phe, 0,92 (1); D-Deh, 1,23 (1); D-Nal(2), 0,95 (1).

30 17. Smeltepunkt 155-157“C; [α]2ρ - -18,4® (c - 0,27 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for C78H110N18017017Cl2 (1642,76): C 57,03 H 6,75 N 15,35.

Fundet (143293): C, H lav.

DK 171483 B1 46

Aminosyreanalyse (997): Ser, 0,89 (1); Pro, 0,97 (1); Ala, 0,98 (1); Leu, 1,03 (1); Tyr, 0,99 (1); NH3, 1,34; Trp, 0.931;

Arg, 1,00 (1); D-pCl-Phe, 1,86 (2)1; D-Deh, 1,17 (1).

18. Smeltepunkt 158-160eC; [α]2ρ - -29,3° (c - 0,41 i HOAc).

5 Analyse:

Beregnet for c81HinN18017cl (1644,36): C 59,16 H 6,80 N 15,33.

Fundet (143809): C, H lav.

Aminosyreanalyse (1014): Ser, 0,92 (1); Pro, 1,02 (1); Gly, 10 1,02 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,99 (1); NH3, 1,26; Trp, 0,83 (1); Arg, 0,98 (1); D-pCl-Phe, 0,98 (1); D-Deh, 1,16 (1); D-Nal(2), 0,96 (1).

19. Smeltepunkt 154-157°C; [a]2jj - -21,6° (c - 0,25 i HOAc).

Analyse: 15 Beregnet for ^^Η^^Ν^Ο^ΟΙ (1658,38): C 58,39 H 6,87 N 15,20.

Fundet (144272): C, H lav.

Aminosyreanalyse (1022): Ser, 0,95 (1); Pro, 1,08 (1); Ala, 0,99 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 1,01 (1); NH3, 1,34; Trp, 0,85 20 (1); Arg, 0,97 (1); D-pCl-Phe, 1,18 (1); D-Deh, 1,17 (1); D-

Nal(2), 1,00 (1).

20. Smeltepunkt 150-155°C; [α]2ρ - -17,9° (c - 0,25 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for c80H1i5N19O17C12 (1685,84): C 56,99 H 6,87 25 N 15,79.

Fundet (143292): C, H lav.

Aminosyreanalyse (995): Ser, 0,86 (1); Pro, 1,08 (1); Gly, 1,04 (1); Leu, 0,97 (1); Tyr, 0,91 (1); NH3, 1,32; Trp, 0,31 (1); Arg, 0,99 (1); D-pCl-Phe, 1,34 (2); D-Wsh kommer ikke af 30 kolonne selv efter 340 minutter.

21. Smeltepunkt 150-154°C; [a]2j) - -28,3® (c - 0,55 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for C84H118N19017 (1685): C 59,88 H 7,06 N 15,79.

Fundet (143295): C, H lav.

DK 171483 B1 47

Aminosyreanalyse (996): Ser, 0,87 (1); Pro, 0,94 (1); Gly, 1,05 (1); Leu, 0,99 (1); Tyr, 0,95 (1); D-pF-Phe, 0,90 (1); NH3, 1,34; Trp, 0,68 (1); Arg, 1,00 (1); D-Nal(2), 0,846 (1); D-Wsh kommer Ikke af kolonne selv efter 340 minutter.

5 22. Smeltepunkt 164-166eC; [0]¾ - -12,7e (c - 0,3 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for c76H106N18O17c:L2 (1614»72): c 56·53 H 6,62 N 15,61.

Fundet (143660): C, H lav.

10 Aminosyreanalyse (1011): Ser, 0,93 (1); Pro, 1,07 (1); Ala, 1,03 (1); Leu, 1,00 (1); Tyr, 0,97 (1); NH3, 1,27; Trp, 0,95 (l)1; Arg, 1,11 (1); D-pCl-Phe, 1,9 (2)1; D-Dmh, 1,11 (1).

23. Smeltepunkt 160-164eC; [α]2ρ - -26,5° (c - 0,29 i HOAc).

Analyse: 15 Beregnet for C79H107N18°17F (1600): c 59,31 H 6,74 N 15,76.

Fundet (143658): C, H lav.

Aminosyreanalyse (1012): Ser, 0,87 (1); Pro, 1,06 (1); Gly, 1.00 (1); Leu, 1,02 (1); Tyr, 0,98 (1); NH3, 1,31; Trp, 0,87 (1); Arg, 1,08 (l)1; D-pF-Phe, 1,25 (1); D-Dmh 1.081; D- 20 Nal(2), 0,89 (1).

24. Smeltepunkt 160-165eC; [a]2p - -12,2e (c - 0,29 i HOAc).

Analyse:

Beregnet for C76H104N18017C12 (1612,7): C 56,60 H 6,50 N 15,60.

25 Fundet (143659): C, H lav.

Aminosyreanalyse (1010): Ser, 0,94 (1); Pro, 1,14 (1); Ala, 1.01 (1); Leu, 0,97 (1); Tyr, 0,96 (1); NH3, 1,23; Trp, 1,001;

Arg, 1,06 (1); D-pCl-Phe, 2,00 (2)1; D-Dhi, 0,99 (1).

25. Smeltepunkt 172-174°C; [cr]2j) - -29,8" (c - 0,62 i HOAc).

30 Analyse:

Beregnet for c79H105N18O17 (1598): C 59,38 H 6,62 N 15,78.

Fundet (143657): C, H lav.

Aminosyreanalyse (1013): Ser, 0,89 (1); Pro, 1,07 (1); Gly, 1,00 (1); Leu, 0,99 (1); Tyr, 0,97 (1); NH3, 1,24 (1); Trp,

Claims (4)

1. 26. Smeltepunkt 162-164eC; [e]2^ - -18,7e (c - 0,54 i HOAc). Analyse:
2. 5 Beregnet for c75H104Ni80i7C12 (1600.69): C 56,28 H 6,55 N 15,75. Fundet (143808): C, H lav. Amlnosyreanalyse (1015): Ser, 0,86 (1); Pro, 1,14 (1); Ala, 1,01 (1); Leu, 1,01 (1); Tyr, 0,99 (1); NH3, 1,54; Trp, 1,02 10 (l)1; Arg, 0,99 (1); D-pCl-Phe, 2,04 (2)1; D-Dma, 1,02 (l)1. Fodnoter ^ Toppene adskilles Ikke godt, og de anførte værdier er gennem snittet af de to toppe.
3. 2 Optisk rotation og elementaranalyse blev ikke udført på grund 15 af mangel på tilstrækkeligt materiale. Der blev også fremstillet: N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2;
4. 20 N-Ac-D-Trp-D-p-Cl-Phe-D-Nal(2)-Ser-Tyr*D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Trp-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2. Aminosyrederivater med den almene formel II h2n-ch-co2h <CH ) I 2 n n NH R1-i=NR2 DK 171483 B1 49 hvor n er 1-5; r^ er alkyl med 1-12 carbonatomer eller -NHR3, hvor R3 er alkyl med 1-12 carbonatomer, cycloalkyl, phenyl, benzyl, morpholino eller 5 -(CH2)mN(R4)2. hvor m er fra 1-5, og R4 er lavere alkyl; og R2 er hydrogen eller R3; eller Rj^ og R2 tilsammen udgør en ring repræsenteret ved følgende strukturformler: (j, i c O *p ·& iXr © x x hvor p er fra 1-7; 10. er hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer eller cycloalkyl; og X er halogen eller Y.